TW202334409A - 新穎之酯酶及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於新穎酯酶，更特別地係關於與SEQ ID N°1或SEQ ID N°2之親本酯酶相比具有改良之活性及/或改良之熱穩定性的酯酶變異體，及其用於使含聚酯材料(諸如塑膠產品)降解之用途。本發明之酯酶尤其適用於使聚對苯二甲酸乙二酯及含有聚對苯二甲酸乙二酯之材料降解。

Description

新穎之酯酶及其用途

本發明係關於新穎之酯酶，更特別地係關於與親本酯酶相比具有改良之活性及/或改良之熱穩定性的酯酶。本發明亦係關於該等新穎酯酶用於使含有聚酯之材料(諸如塑膠產品)降解之用途。本發明之酯酶尤其適合於使聚對苯二甲酸乙二酯及含有聚對苯二甲酸乙二酯之材料降解。

酯酶能夠催化包括聚酯在內的各種聚合物之水解。在此上下文中，酯酶已展現在許多工業應用中具有有前景的效果，該等工業應用包括作為用於洗碗及洗衣應用之清潔劑，作為用於處理生物質及食物之降解酶，作為環境污染物之去毒的生物催化劑，或用於處理紡織工業中之聚酯織品。酯酶作為用於使聚對苯二甲酸乙二酯(PET)水解之降解酶的用途尤其受到關注。實際上，PET用於許多技術領域中，諸如用於製作衣服、地毯，或以熱固性樹脂之形式用於製造封裝或汽車塑膠等，使得填埋場中之PET積聚成為逐漸增加的生態問題。

聚酯且特別地，PET之酶促降解被視為用於減少塑膠及織物廢料積聚的受關註解決方案。實際上，酶可加快含聚酯材料，且更特別地塑膠及織物產品的水解，甚至高達單體水準。此外，水解產物(亦即，單體及寡聚物)可再循環作為用於合成新聚合物之材料。

在此上下文中，已鑑定出若干酯酶為用於聚酯之候選降解酶，且已研發出此類酯酶的一些變異體。在酯酶當中，角質酶(亦被稱作角皮質水解酶(EC 3.1.1.74))尤其受到關注。已自各種真菌(P.E. Kolattukudy，「Lipases」，B. Borg- strόm及H.L. Brockman編，Elsevier 1984，471-504)、細菌及植物花粉中鑑定出角質酶。最近，環境基因體學方法已鑑定出其他酯酶。

然而，仍需要與已知酯酶相比具有改良之活性及/或改良之熱穩定性的酯酶，以尤其在酸性條件下，亦即在3與6之間的pH下提供更高效且從而更具有競爭性的聚酯降解過程。

本發明提供展現與具有如SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列之親本或野生型酯酶相比增加之活性及/或增加之熱穩定性的新酯酶。此野生型酯酶對應於 Sulaiman等人，Appl Environ Microbiol.2012年3月中所描述之總基因體衍生之角質酶的胺基酸序列之胺基酸36至293，且在SwissProt中參考G9BY57且描述為具有聚酯降解活性。本發明之酯酶尤其適用於使塑膠產品，更特別地含有PET之塑膠產品降解的過程。

因此，本發明之目標為提供一種酯酶，其(i)與SEQ ID N°1中所列之全長胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；(ii)具有相對於SEQ ID N°1的至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、D158C、T160C、R138K/D/E/L、N211F、S13L、A14Y及S206N；及/或在對應於選自以下之殘基之至少一個胺基酸位置處的一個胺基酸取代：G7、S57、T136、E141、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191，其中該等位置係參考SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列進行編號；(iii)具有聚酯降解活性；及(iv)與SEQ ID N°1之酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。

較佳地，該酯酶包含至少一個選自以下之取代或取代組合：V219E、N243Y、L15Q、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180L/I/C/N/A/T、F250N/L/V/Y/A、L15V + R89L、N204S + N105D、E141C + R138K、R138K及V219E + Q182E + R12E。

本發明之另一目標為提供酯酶，其：(i)與SEQ ID N°2中所列之全長胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；(ii)具有相對於SEQ ID N°2的至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、D158C、T160C、R138K/D/E/L、N211F、S13L、A14Y及S206N；及/或在對應於選自以下之殘基之至少一個胺基酸位置處的一個胺基酸取代：G7、S57、T136、E141、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191，其中該等位置係參考SEQ ID N°2中所列之胺基酸序列進行編號；(iii)具有聚酯降解活性；及(iv)與SEQ ID N°2之酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。較佳地，該酯酶具有至少一個選自V219E、V180I/C/N/A/T/L/及F250N/L/V/Y/A之胺基酸取代，較佳選自V219E、V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y/A。特別地，該酯酶與SEQ ID N°1之酯酶相比亦展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。

本發明之另一目標為提供一種編碼本發明之酯酶的核酸。本發明亦係關於一種包含該核酸之表現卡匣或表現載體，以及一種包含該核酸、表現卡匣或載體之宿主細胞。

本發明亦提供一種組合物，其包含本發明之酯酶、本發明之宿主細胞或其提取物。

本發明之另一目標為提供一種產生本發明之酯酶的方法，其包含： (a)       在適合於表現編碼酯酶之核酸的條件下培養根據本發明之宿主細胞；以及視情況 (b)       自細胞培養物回收該酯酶。

本發明之另一目標為提供一種使聚酯或含聚酯材料之聚酯降解之方法，其包含 (a)       使該聚酯與根據本發明之酯酶或根據本發明之宿主細胞或根據本發明之組合物接觸；以及視情況 (b)       回收單體及/或寡聚物。

特別地，本發明提供一種使PET降解的方法，其包含使PET與本發明之至少一種酯酶接觸，以及視情況回收PET之單體及/或寡聚物。

本發明亦係關於本發明之酯酶用於使PET或含有PET之塑膠產品降解的用途。

本發明亦係關於一種含聚酯材料，其中包括本發明之酯酶或宿主細胞或組合物。

本發明亦係關於一種清潔劑組合物，其包含根據本發明之酯酶或宿主細胞或包含本發明之酯酶的組合物。

定義

本發明將藉由參考以下定義得到最佳理解。

本文中，術語「肽( peptide)」、「多肽( polypeptide)」、「蛋白質( protein)」、「酶( enzyme)」係指由肽鍵連接之胺基酸鏈，而不管形成該鏈之胺基酸的數目如何。胺基酸在本文中根據以下命名法藉由其一個字母或三個字母之代碼表示：A：丙胺酸(Ala)；C：半胱胺酸(Cys)；D：天冬胺酸(Asp)；E：麩胺酸(Glu)；F：苯丙胺酸(Phe)；G：甘胺酸(Gly)；H：組胺酸(His)；I：異白胺酸(Ile)；K：離胺酸(Lys)；L：白胺酸(Leu)；M：甲硫胺酸(Met)；N：天冬醯胺(Asn)；P：脯胺酸(Pro)；Q：麩醯胺酸(Gln)；R：精胺酸(Arg)；S：絲胺酸(Ser)；T：蘇胺酸(Thr)；V：纈胺酸(Val)；W：色胺酸(Trp)；及Y：酪胺酸(Tyr)。

術語「酯酶( esterase)」係指屬於根據酶命名法(Enzyme Nomenclature)分類為EC 3.1.1的一類水解酶的酶，其催化酯水解成酸及醇。術語「角質酶( cutinase)」或「角皮質水解酶( cutin hydrolase)」係指根據酶命名法分類為EC 3.1.1.74的酯酶，其能夠催化由角皮質及水產生角皮質單體的化學反應。

術語「野生型蛋白( wild-type protein)」係指如天然存在之多肽的非突變型式。在本發明之情況下，野生型酯酶係指具有如SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列的酯酶。

術語「親本蛋白( parent protein)」係指參考多肽。在本發明之情況下，親本酯酶係指具有如SEQ ID N°1中所列或如SEQ ID N°2中所列之胺基酸序列的酯酶。

術語「突變體( mutant)」及「變異體( variant)」係指衍生自SEQ ID N°1或SEQ ID N°2且分別在一或多個(例如若干個)位置包含相對於SEQ ID N°1或SEQ ID N°2的至少一個修飾或改變(亦即取代、插入及/或缺失)且具有聚酯降解活性的多肽。變異體可藉由此項技術中熟知之各種技術獲得。特別地，用於改變編碼野生型蛋白之DNA序列的技術之實例包括(但不限於)定點突變誘發、隨機突變誘發及合成性寡核苷酸構築。因此，如本文中關於特定位置所使用之術語「修飾( modification)」及「改變( alteration)」意謂此特定位置中之胺基酸與野生型蛋白中此特定位置中之胺基酸相比已經修飾。

「取代( substitution)」意謂胺基酸殘基經另一胺基酸殘基置換。較佳地，術語「取代」係指胺基酸殘基經選自以下之另一胺基酸殘基置換：天然存在之20種標準胺基酸殘基；天然存在之稀有胺基酸殘基(例如，羥基脯胺酸、羥基離胺酸、別羥基離胺酸、6-N-甲基離胺酸、N-乙基甘胺酸、N-甲基甘胺酸、N-乙基天冬醯胺、別異白胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、焦麩醯胺酸、胺基丁酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸)；及通常以合成方式製備的非天然存在之胺基酸殘基(例如，環己基-丙胺酸)。較佳地，術語「 取代」係指胺基酸殘基經選自天然存在之20種標準胺基酸殘基(G、P、A、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、K、R、Q、N、E、D、S及T)之另一胺基酸殘基置換。符號「+」指示取代基之組合。在本文件中，以下術語用於表示取代：L82A表示親本序列之位置82處的胺基酸殘基(白胺酸，L)經丙胺酸(A)取代。A121V/I/M表示親本序列之位置121處的胺基酸殘基(丙胺酸，A)經以下胺基酸中之一者取代：纈胺酸(V)、異白胺酸(I)或甲硫胺酸(M)。取代可為保守性或非保守性取代。保守性取代之實例在以下之群內：鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸及組胺酸)，酸性胺基酸(麩胺酸及天冬胺酸)，極性胺基酸(麩醯胺酸、天冬醯胺及蘇胺酸)，疏水性胺基酸(甲硫胺酸、白胺酸、異白胺酸、半胱胺酸及纈胺酸)，芳族胺基酸(苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸)，及較小胺基酸(甘胺酸、丙胺酸及絲胺酸)。

除非另外規定，否則本申請案中所揭示之胺基酸位置係參考SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列進行編號。

如本文所使用，術語「序列一致性( sequence identity)」或「一致性( identity)」係指兩個多肽序列之間的匹配者(相同胺基酸殘基)之數目(或表示為百分比%之分數)。序列一致性藉由在對序列進行比對以最大化重疊及一致同時最小化序列間隙的情況下比較該等序列而判定。特別地，視兩個序列之長度而定，可使用多種數學全域或局域比對演算法中之任一者來判定序列一致性。具有相似長度之序列較佳使用在整個長度內最佳比對序列之全域比對演算法(例如，Needleman及Wunsch演算法；Needleman及Wunsch，1970)來進行比對，而具有實質上不同長度之序列較佳使用局域比對演算法(例如，Smith及Waterman演算法(Smith及Waterman，1981)或Altschul演算法(Altschul等人，1997；Altschul等人，2005))來進行比對。用於判定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術中之技能內的各種方式達成，例如使用可在諸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/之網際網路網站上獲得的公開可用的電腦軟體。熟習此項技術者可判定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係指使用逐對序列比對程式EMBOSS Needle產生的值，該程式EMBOSS Needle使用Needleman-Wunsch演算法來產生兩個序列之最佳全域比對，其中所有搜尋參數均設定成預設值，亦即計分矩陣(Scoring matrix) = BLOSUM62，空位開口(Gap open) = 11，空位延伸(Gap extend) = 1。

「聚合物( polymer)」係指結構係由藉由共價化學鍵連接之多個單體(重複單元)構成的化合物或化合物混合物。在本發明之上下文內，術語聚合物包括天然或合成聚合物，其由單一類型之重複單元構成(亦即，均聚物)或由不同重複單元之混合物構成(亦即，共聚物或雜聚物)。根據本發明，「寡聚物( oligomer)」係指含有2至約20個單體之分子。

在本發明之上下文中，「含聚酯材料( polyester containing material)」或「含聚酯產品( polyester containing product)」係指包含呈結晶形式、半結晶形式或完全非晶形式之至少一種聚酯的產品，諸如塑膠產品。在一特定實施例中，含聚酯材料係指由含有至少一種聚酯且可能含有其他物質或諸如塑化劑、礦物質或有機填充劑之添加劑的至少一種塑膠材料製成的任何物品，該至少一種塑膠材料諸如係塑膠片材、管、棒、型材、成型件、薄膜、大塊體、纖維等。在另一特定實施例中，含聚酯材料係指適合於製造塑膠產品的呈熔融或固體狀態的塑膠化合物或塑膠調配物。在另一特定實施例中，含聚酯材料係指包含至少一種聚酯之織物、織品或纖維。在另一特定實施例中，含聚酯材料係指包含至少一種聚酯之塑膠廢料或纖維廢料。

在本說明書中，術語「聚酯」涵蓋(但不限於)聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚異山梨醇對苯二甲酸乙二酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃二甲酸乙二酯(PEF)、聚己內酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯) (PEA)、聚萘二甲酸乙二酯(PEN)及此等聚合物之摻合物/混合物。聚酯亦可涵蓋「聚烯烴類」聚酯，較佳「聚乙烯類」聚酯，其對應於已引入酯片段(通常藉由長鏈α,ω-雙官能單體之聚縮合來達成)之聚烯烴(較佳聚乙烯)，如Lebarbé等人Green Chemistry Issue 4 2014中所定義。 新酯酶

本發明提供與親本酯酶相比具有改良之活性及/或改良之熱穩定性之新穎酯酶。更特別地，本發明人已設計出尤其適合於在工業過程中使用的新穎酶。本發明之酯酶尤其適合於使聚酯，更特別地PET，包括含PET材料，且特別地含有PET之塑膠產品降解。在一特定實施例中，酯酶同時展現增加之活性及增加之熱穩定性。

因此，本發明之目標為提供與具有如SEQ ID N°1或SEQ ID N°2中所列之胺基酸序列之酯酶(亦稱為親本酯酶)相比展現增加之活性的酯酶。

特別地，本發明人已鑑別出SEQ ID N°1中之特定胺基酸殘基，其意欲與X射線晶體結構(亦即摺疊的3D結構)中或酯酶之MNR結構中之聚合物受質接觸，該等酯酶可經有利修飾以促進受質與酯酶之接觸且有利地使聚合物之吸附增加及/或由此使此聚合物上酯酶之活性增加。

在本發明之上下文中，術語「增加之活性」或「增加之降解活性」指示酯酶在給定條件(例如溫度、pH、濃度)下使聚酯降解之能力及/或吸附於聚酯上之能力與在相同條件下SEQ ID N°1或SEQ ID N°2之酯酶使同一聚酯降解及/或吸附於同一聚酯上之能力相比增加。此類增加之活性可比SEQ ID N°1或SEQ ID N°2之酯酶之聚酯降解活性大至少10%，較佳至少15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%或更大。特別地，降解活性為產生聚酯之單體及/或寡聚物的解聚合活性，可進一步重新得到該等單體及/或寡聚物且視情況再使用。特別地，本發明之酯酶具有增加之PET降解活性。

酯酶之「降解活性」可藉由熟習此項技術者根據此項技術中本身已知的方法來進行評估。舉例而言，可藉由量測特定聚合物之解聚合活性率、量測使分散於瓊脂盤中之固體聚合物化合物降解之速率或量測反應器中之聚合物之解聚合活性率來評定降解活性。特別地，可藉由量測酯酶之「比降解活性」來評估降解活性。酯酶針對PET之「比降解活性」對應於在反應之初始時段(亦即，第一段24小時)期間每毫克酯酶每分鐘水解的PET之微莫耳數或每小時產生的當量TA之毫克數，且係根據反應之水解曲線的線性部分判定，此曲線係藉由在第一段24小時期間之不同時間處進行的若干取樣建立。作為另一實例，可藉由以下方式評估「降解活性」：當使聚合物或含有聚合物之塑膠產品與降解酶接觸時，在所限定之時間段之後(例如在24h、48h、72h或96h之後)，量測在合適的溫度、pH及緩衝液條件下釋放的寡聚物及/或單體之速率及/或產率。

酶吸附在受質上之能力可藉由熟習此項技術者根據此項技術中本身已知的方法來進行評估。舉例而言，酶吸附在受質上之能力可自含有該酶且其中該酶先前已與受質在合適條件下一起培育的溶液量測。

本發明人亦鑑別出SEQ ID N°1或SEQ ID N°2中之目標胺基酸殘基，其可有利地經修飾以改良相應酯酶在高溫下之穩定性(亦即改良之熱穩定性)，且有利地改良在50℃或高於50℃及90℃或低於90℃、較佳60℃或高於60℃及80℃或低於80℃、更佳65℃或高於65℃及75℃或低於75℃之溫度下的穩定性。

因此，本發明之目標為提供與具有SEQ ID N°1或SEQ ID N°2中所列之胺基酸序列之酯酶(亦即親本酯酶)的熱穩定性相比展現增加之熱穩定性的新酯酶。

在本發明之上下文中，術語「增加之熱穩定性」指示與SEQ ID N°1或SEQ ID N°2之酯酶相比，酯酶在高溫下且尤其在50℃與90℃之間的溫度下抵抗其化學及/或物理結構之變化的能力增加。在特定實施例中，與親本酯酶之熱穩定性相比，該等酯酶之熱穩定性在50℃與90℃之間、50℃與80℃之間、50℃與75℃之間、50℃與70℃之間、50℃與65℃之間、55℃與90℃之間、55℃與80℃之間、55℃與75℃之間、55℃與70℃之間、55℃與65℃之間、60℃與90℃之間、60℃與80℃之間、60℃與75℃之間、60℃與70℃之間、60℃與65℃之間、65℃與90℃之間、65℃與80℃之間、65℃與75℃之間、65℃與70℃之間的溫度下改良。較佳地，與親本酯酶之熱穩定性相比，該等酯酶之熱穩定性至少在50℃與65℃之間的溫度下改良。在本發明之上下文中，以+/-1℃給定溫度。

特別地，可經由評定酯酶之熔化溫度(Tm)來評估熱穩定性。在本發明之上下文中，「熔化溫度」係指所考慮的酶群體中之一半展開或錯誤摺疊的溫度。通常，與親本酯酶之Tm相比，本發明之酯酶顯示Tm增加約0.8℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃或更高。特別地，與親本酯酶相比，本發明之酯酶在50℃與90℃之間的溫度下可具有增加之半衰期。特別地，與SEQ ID N°1之酯酶相比，本發明之酯酶在50℃與90℃之間、50℃與80℃之間、50℃與75℃之間、50℃與70℃之間、50℃與65℃之間、55℃與90℃之間、55℃與80℃之間、55℃與75℃之間、55℃與70℃之間、55℃與65℃之間、60℃與90℃之間、60℃與80℃之間、60℃與75℃之間、60℃與70℃之間、60℃與65℃之間、65℃與90℃之間、65℃與80℃之間、65℃與75℃之間、65℃與70℃之間的溫度下可具有增加之半衰期。較佳地，與親本酯酶相比，本發明之酯酶至少在50℃與65℃之間的溫度下具有增加之半衰期。

酯酶之熔化溫度(Tm)可藉由熟習此項技術者根據此項技術中本身已知的方法來進行量測。舉例而言，可使用DSF來量化酯酶之熱變性溫度之改變，且由此判定該酯酶之Tm。替代地，可藉由使用圓二色性來分析蛋白質摺疊而評定Tm。較佳地，使用DSF或圓二色性來量測Tm，如實驗部分中所揭露。在本發明之上下文中，將Tm與在相同條件(例如，聚酯之pH、性質及量等)下量測之Tm進行比較。

替代地，可藉由量測在不同溫度下培育之後酯酶之酯酶活性及/或聚酯解聚合活性且與親本酯酶之酯酶活性及/或聚酯解聚合活性進行比較來評估熱穩定性。亦可評估在不同溫度下進行多輪聚酯解聚合分析之能力。快速且有價值的測試可由藉由暈圈直徑量測來評估酯酶在不同溫度下培育之後使分散於瓊脂盤中之固體聚酯化合物降解的能力組成。

本發明之目標為提供一種酯酶，其(i)與SEQ ID N°1中所列之全長胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；(ii)具有相對於SEQ ID N°1的至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、D158C、T160C、R138K/D/E/L、N211F、S13L、A14Y及S206N；及/或在對應於選自以下之殘基之至少一個胺基酸位置處的一個胺基酸取代：G7、S57、T136、E141、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191，其中該等位置係參考SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列進行編號；(iii)具有聚酯降解活性；及(iv)與SEQ ID N°1之酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。

在一實施例中，該酯酶包含至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、R138K、N211F、S13L、A14Y及S206N；及/或在對應於選自以下之殘基的至少一個胺基酸位置處的一個胺基酸取代：G7、S57、T136、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250及R251。

在特定實施例中，該酯酶包含至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、R138K、N211F、S13L、A14Y及S206N；及/或在對應於選自V180及F250之殘基的至少一個胺基酸位置處的一個胺基酸取代。

特別地，該酯酶包含在選自以下之位置處之至少一個取代：G7、S57、T136、E141、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250及R251，較佳選自G7、S57、T136、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、D249、F250及R251。更佳地，該酯酶包含在選自V180及F250之位置處之至少一個胺基酸取代。

在實施例中，該酯酶包含至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、D158C、T160C、R138K/D/E/L、E141C/K/R、G171C、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180I/C/N/A/T/L及F250N/L/V/Y/A。較佳地，該酯酶包含至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、R138K、E141C、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y/A，更佳選自V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、R138K、E141C、N211F、S13L、A14Y及S206N，甚至更佳選自V219E、N243Y、L15Q、N211F、S13L、A14Y、S206N及R138K。

舉例而言，該酯酶包含至少一個選自V219E、N204S、N243Y及L15V，更佳選自V219E、N204S及L15V之胺基酸取代，甚至更佳為取代V219E。或者，該酯酶包含至少一個選自L15Q、N211F、S13L、A14Y及S206N之胺基酸取代，較佳S13L。

或者或另外，該酯酶可包含至少一個選自D158C、T160C、R138K/D/E、E141C/K/R、G171C及V180C之胺基酸取代。

或者或另外，該酯酶可包含至少一個選自V180I/C/N/A/T/L及F250N/L/V/Y/A、較佳選自V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y之胺基酸取代。

在一實施例中，該酯酶包含至少兩個選自V219E、N204S、N243Y、L15V、D158C、T160C及R138K/D/E之取代及/或在選自以下之位置處之取代：G7、S57、T136、E141、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191，較佳地至少兩個選自V219E、N204S、N243Y、L15V之取代及/或在選自以下之位置處的取代：G7、S57、T136、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250及R251。

特別地，該酯酶包含至少兩個選自以下之取代：V219E、N204S、N243Y、L15V、D158C、T160C、R138K/D/E、E141C/K/R、G171C及V180C。

舉例而言，該酯酶包含在選自以下之位置處之至少一個取代組合：E141 + D158、E141 + T160、E141 + R138、D158 + T160及G171 + V180，較佳地至少一個選自以下之取代組合：E141C/K/R + D158C、E141C/K/R + T160C、E141C/K/R + R138K/D/E、D158C + T160C及G171C + V180C，更佳選自E141C + D158C、E141C + T160C、E141C + R138K/D/E、D158C + T160C及G171C + V180C，甚至更佳地R138K + E141C。

根據本發明，該酯酶可進一步包含在至少一個選自以下之位置處的至少一個取代：S1、Y4、Q5、R6、N9、P10、T11、R12、S13、A14、L15、T16、A17、D18、S22、T25、Y26、T27、V28、S29、R30、L31、S32、V33、S34、G35、F36、G37、G38、G39、Y43、S48、T50、G53、I54、M56、P58、G59、Y60、T61、A62、D63、A64、S65、S66、L67、A68、W69、L70、R72、R73、L74、L82、I84、N85、T86、N87、S88、R89、F90、D91、Y92、P93、D94、S95、R96、S98、Q99、A103、L104、N105、L107、R108、S113、L119、A121、N122、L124、A125、A127、G128、H129、M131、G132、G133、G134、G135、R138、A140、N143、S145、K147、A149、V150、L152、T153、P154、W155、H156、T157、D158、K159、T160、N162、S164、V167、L168、V170、A172、E173、A174、T176、V177、A178、P179、S181、Q182、H183、F187、Q189、N190、S193、T194、P196、V198、V200、L202、D203、N204、A205、S206、F208、A209、P210、N211、S212、N213、N214、A215、A216、I217、S218、V219、Y220、T221、S223、W224、M225、N231、T233、R236、Q237、F238、L239、N241、V242、N243、D244、P245、A246、L247、S248、T252、N253、N254、R255、H256、Q258、F161及T163，該取代較佳在至少一個選自以下之位置處：Y4、T50、M56、P58、G59、Y60、Y61、A62、D63、A64、 I84、N85、T86、Y92、H129、M131、G132、G133、G134、G135、K147、T153、P154、W155、H156、T157、D158、K159、T160、F161、N162、T163、A172、E173、A174、T176、V177、A178、P179、Q182、H183、N190、V200、L202、D203、N204、A205、S206、F208、A209、P210、N211、S212、N213、N214、A215、M225、T233、S248、N254、H256、T11、R12、S13、A14、T16、D18、S65、S66、A68、W69、R73、R89、F90、D91、P93、D94、N105、A216、I217、S218、Y220、Q237、F238、L239、N241、V242、N243、D244、A246、L247、V167及V170。

舉例而言，該酯酶進一步包含至少一個、較佳至少兩個、至少三個或至少四個在選自F208、D203、S248、V170、Y92、G135、V167、Q182及N213之位置處之取代。特別地，該酯酶進一步包含至少一個選自以下之取代：F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W、D203C/K/R、S248C、V170I、Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、G135A、V167Q/T、Q182D/E及N213D/E/R/K/P，較佳選自F208I/W、D203C、S248C、V170I、Y92G、G135A、V167Q、Q182E及N213P。

根據本發明，該酯酶可進一步包含在位置D203 + S248處之取代組合，較佳地取代組合D203C + S248C。

根據本發明，該酯酶與親本酯酶(亦即SEQ ID N°1之酯酶)一樣可進一步包含至少一個選自D203K/R之取代且至少包含胺基酸殘基S248。

或者，該酯酶可進一步包含在位置F208 + D203 + S248處之至少一種取代組合，較佳為選自F208I + D203C + S248C或F208W + D203C + S248C之取代組合。

舉例而言，該酯酶進一步包含在位置F208 + D203 + S248處之至少一種取代組合及一個或兩個在選自以下之位置處的取代：Y92、G135、V167、V170、Q182及N213。特別地，該酯酶包含選自F208I + D203C + S248C或F208W + D203C + S248C之至少一種取代組合及一個選自以下之取代：Y92A/G/P/N/Q/T/F/C/D、G135A、V167Q/T、V170I、Q182E/D及N213D/E/R/K/P，較佳選自V170I、Y92G、G135A、V167Q、Q182E及N213P。

在一實施例中，該酯酶進一步至少包含選自以下之取代組合：D203C + S248C、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203C + S248C、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203C + S248C + V170I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + N213P + Q182E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W  + D203K/R、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203K/R + V170I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203K/R + V170I + Y92D/E/G及F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + N213P + Q182E，較佳選自D203C + S248C、F208I/W/M + D203C + S248C、F208I/W/M + D203C + S248C + V170I、F208I/W/M + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G、F208I/W/M + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + N213P + Q182E、F208I/W + D203K/R + V170I、F208I/W/M + D203K/R + V170I + Y92D/E/G及F208I/W/M + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + N213P + Q182E，更佳選自D203C + S248C、F208I/M + D203C + S248C、F208I/M + D203C + S248C + V170I、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E。

或者或另外，該酯酶可進一步包含至少一個在選自以下之位置處的取代：T11、R12、S13、A14、T16、D18、G59、Y60、T61、A62、D63、S65、S66、A68、W69、R72、R73、R89、F90、D91、P93、D94、N105、H129、W155、T157、D158、T176、V177、A178、P179、L202、S206、 P210、N211、S212、N214、A215、A216、I217、S218、Y220、Q237、F238、L239、N241、V242、N243、D244、A246及L247，較佳選自T11、R12、S13、A14、T16、W69、R73、A216、S218、Y220、Q237、F238、V242、N243、D244、A246及L247。較佳地，該酯酶包含至少一個選自以下之取代：T11Q/E/N、R12D/Q/G/E、S13D、A14D、T16E、W69E/D/M、R73E/G/M/Q、R89T/F/H/Q/L/K、N105D/E/R/K、A216Q、S218A/E、Y220F、Q237D、F238E、V242Y、N243P、D244E/C、A246E及L247T。

根據本發明，該酯酶可進一步包含至少一個選自R89T/F/H/Q/L/K及N105D/E/R/K，較佳選自R89L及N105D之取代。在一實施例中，該酯酶包含選自L15V + R89T/F/H/Q/L/K及N204S + N105D/E/R/K，較佳選自L15V + R89L及N204S + N105D之至少一個取代組合。在一實施例中，該酯酶至少包含選自以下之取代組合：F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + V219E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + V219E + Q182D/E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + V219E + N213P/L/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + V219E + R12D/N/Q/E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + V219E + Q182D/E + R12D/N/Q/E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + V219E + Q182D/E + N213P/L/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + V219E + Q182D/E + N213P/L/D + R12D/N/Q/E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + V219E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + V219E + Q182D/E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + V219E + N213P/L/D、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + V219E + R12D/N/Q/E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + V219E + Q182D/E + R12D/N/Q/E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + V219E + Q182D/E + N213P/L/D及F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + V219E + Q182D/E + N213P/L/D + R12D/N/Q/E，較佳選自F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G、F208I + D203C + S248C + V170I + Y92G + V219E、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G + V219E + Q182E、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G + V219E + N213D、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G + V219E + R12E、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G + V219E + Q182E + R12E、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G + V219E + Q182E + N213D及F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G + V219E + Q182E + N213D + R12E。

在一實施例中，該酯酶包含選自以下之至少一個胺基酸取代或一個取代組合：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180L/I/C/N/A/T、F250N/L/V/Y/A、L15V + R89L、N204S + N105D、E141C + D158C、E141C + T160C、E141C + R138K/D/E/L、D158C + T160C、G171C + V180C、R138K/D/E/L及V219E + Q182E + R12E，較佳地選自以下之至少一個取代或取代組合：V219E、N243Y、L15Q、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180L/I/C/N/A/T、F250N/L/V/Y/A、L15V + R89L,N204S + N105D、E141C + R138K、R138K及V219E + Q182E + R12E。

特別地，該酯酶包含選自V219E、L15V + R89T/F/H/Q/L/K及N204S + N105D/E/R/K、較佳選自V219E、L15V + R89L及N204S + N105D之至少一個取代或取代組合。

在一實施例中，該酯酶至少包含取代V219E或至少包含取代組合N204S + N105D，且在包含於pH 6與9之間的pH下，較佳在包含於pH 6.5與9之間的pH下，更佳在包含於7與9之間的pH下，甚至更佳在包含於7.5與9之間的pH下，例如在pH 8下展現增加之聚酯降解活性。

特別地，該酯酶包含選自V219E、L15Q、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180L/I/C/N、F250N/L/V/Y及R138K之至少一個胺基酸取代或選自R138K + E141C及V219E + Q182E + R12E之至少一種取代組合，且與SEQ ID N°1之酯酶相比，尤其在包含於pH 6與9之間的pH下，較佳在包含於pH 6.5與9之間的pH下，更佳在包含於7與9之間的pH下，甚至更佳在包含於7.5與9之間的pH下，例如在pH 8下展現增加之比降解活性。

或者，該酯酶至少包含胺基酸取代N243Y、F250L/A、V180A/T或至少包含取代組合N204S + N105D，且與SEQ ID N°1之酯酶相比，在24h後或在96h之後，尤其在包含於pH 6與9之間的pH下、較佳在包含於pH 6.5與9之間的pH下、更佳在包含於7與9之間的pH下、甚至更佳在包含於7.5與9之間的pH下，例如在pH 8下展現增加之PET解聚合產率。根據一實施例，該酯酶至少包含胺基酸取代N243Y或至少包含取代組合N204S + N105D，且與SEQ ID N°1之酯酶相比，在96h之後展現增加之PET解聚合產率。

在另一實施例中，該酯酶至少包含取代組合L15V + R89L，且尤其在包含於pH 6與9之間的pH下，較佳在包含於pH 6.5與9之間的pH下，更佳在包含於7與9之間的pH下，甚至更佳在包含於7.5與9之間的pH下，例如在pH 8下展現增加之熱穩定性。

在一特定實施例中，該酯酶具有SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列，且在選自以下之位置處具有一個至十七個取代：G7、S57、T136、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191，較佳在選自以下之位置處具有一個至十五個取代：G7、S57、T136、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250及R251。

在一特定實施例中，該酯酶具有SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列，且在選自G7、S57、T136、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191之位置處，較佳在選自G7、S57、T136、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250及R251之位置處具有單一胺基酸取代。

在一實施例中，該酯酶在於SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列，且具有一至三個選自V219E、N204S及L15V之取代，較佳具有單一胺基酸取代V219E。

在另一實施例中，該酯酶在於如SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列，且具有選自L15V + R89L及N204S + N105D之取代組合。

在另一實施例中，該酯酶在於SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列，且具有選自以下之取代或取代組合：V219E、N243Y、L15Q、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180L/I/C/N/A/T、F250N/L/V/Y/A、L15V + R89L、N204S + N105D、E141C + R138K、R138K及V219E + Q182E + R12E。

根據本發明，該酯酶與SEQ ID N°1之親本酯酶一樣較佳包含至少一個選自S130、D175、H207、C240或C275之胺基酸殘基，亦即，本發明之酯酶在此等位置中之一者、兩者、三者等或全部處未經修飾。較佳地，該酯酶與SEQ ID N°1之酯酶一樣包含組合S130 + D175 + H207。

特別地，該酯酶與親本酯酶一樣可至少包含形成酯酶催化位點之胺基酸S130、D175及H207，及/或形成二硫鍵之胺基酸C240及C275。較佳地，該酯酶與親本酯酶中一樣包含選自S130 + D175 + H207、C240 + C275及S130 + D175 + H207 + C240 + C275之至少一胺基酸殘基組合。

在本發明之上下文內，在於SEQ ID N°1且具有取代組合F208I + D203C + S248C + V170I + Y92G的胺基酸序列被用作SEQ ID N°2。參考SEQ ID N°2描述之所有變異體均必定含有相對於SEQ ID N°1的取代組合F208I + D203C + S248C + V170I + Y92G。

本發明之另一目標為提供酯酶，其：(i)與SEQ ID N°2中所列之全長胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；(ii)具有相對於SEQ ID N°2的至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、D158C、T160C、R138K/D/E/L、N211F、S13L、A14Y及S206N；及/或在對應於選自以下之殘基之至少一個胺基酸位置處的一個胺基酸取代：G7、S57、T136、E141、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191，其中該等位置係參考SEQ ID N°2中所列之胺基酸序列進行編號；(iii)具有聚酯降解活性；及(iv)與SEQ ID N°2之酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。

在本發明之上下文內，SEQ ID N°2之酯酶變異體與SEQ ID N°2中所列之全長胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性，始終包含殘基組合C203 + C248 + G92。換言之，以上一致性%內之序列的任何變化不影響此殘基組合。另外，變異體進一步包含殘基I208及I170中之一者或兩者。在一特定實施例中，變異體始終包含殘基組合I208 + C203 + C248 + I170 + G92。

較佳地，與SEQ ID N°2之酯酶相比及視情況與SEQ ID N°1之酯酶相比，該酯酶在包含於pH 6與9之間的pH下，較佳在包含於pH 6.5與9之間的pH下，更佳在包含於7與9之間的pH下，甚至更佳在包含於7.5與9之間的pH下，例如在pH 8下展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。

此外，與SEQ ID N°2之酯酶及視情況與SEQ ID N°1之酯酶相比，該酯酶在50℃與90℃之間、較佳50℃與72℃之間、更佳50℃與65℃之間的溫度下展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。

有利的是，該酯酶與SEQ ID N°1之酯酶相比進一步展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。

在一實施例中，該酯酶具有至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、V180I/C/N/A/T/L/及F250N/L/V/Y/A，較佳選自V219E、V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y/A，更佳選自V180I/C/N/A/T 及F250N/L/V/Y/A，且與SEQ ID N°2之酯酶相比，展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。在一實施例中，該酯酶具有選自V180I/C/N及F250N/V/Y/L之至少一個胺基酸取代，且與SEQ ID N°2之酯酶相比展現增加之比降解活性。或者，該酯酶具有選自V180A/T及F250A/L之至少一個胺基酸取代，且與SEQ ID N°2之酯酶相比展現增加之PET解聚合產率。

在一實施例中，該酯酶具有選自V219E、Q182D/E及R12D/N/Q/E之至少一個胺基酸取代，且與SEQ ID N°2之酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。

舉例而言，該酯酶至少具有選自V219E + Q182D/E + R12D/N/Q/E之取代組合，較佳地組合V219E + Q182E + R12E。有利的是，與SEQ ID N°2之酯酶相比，該酯酶展現增加之聚酯降解活性。

根據本發明，該酯酶與SEQ ID N°2之親本酯酶一樣可包含至少一個選自S130、D175、H207、C240或C275之胺基酸殘基，亦即，本發明之酯酶在此等位置中之一者、兩者、三者等或全部處未經修飾。

特別地，該酯酶與SEQ ID N°2之酯酶一樣至少包含形成酯酶之催化位點的胺基酸S130、D175及H207及/或形成二硫鍵之胺基酸C240及C275，及/或與SEQ ID N°2之酯酶一樣包含形成二硫鍵之胺基酸C203及C248。較佳地，該酯酶與SEQ ID N°2之酯酶一樣至少包含選自以下之胺基酸殘基組合：S130 + D175 + H207、C240 + C275、 S130 + D175 + H207 + C240 + C275及S130 + D175 + H207 + C240 + C275 + C203 + C248。另外，該酯酶與親本酯酶一樣至少包含胺基酸I208、I170及G92。在較佳實施例中，該酯酶與親本酯酶一樣至少包含胺基酸S130、D175、H207、C240、C275、C203、C248、I208、C203、C248、I170及G92。

在另一實施例中，該酯酶在於如SEQ ID N°2中所列之胺基酸序列，其具有選自以下之取代或取代組合：V219E、V180I/C/N/A/T/L/及F250N/L/V/Y/A，較佳選自V219E、V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y/A，更佳選自V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y/A。

有利的是，與SEQ ID N°1及/或SEQ ID N°2之酯酶相比，本發明之酯酶變異體在5至11之間的pH下、較佳在6至9之間的pH下、更佳在6.5至9之間的pH下、甚至更佳在6.5至8之間的pH下、甚至更佳在包含於7與9之間的pH下展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。特別地，與親本酯酶(亦即SEQ ID N°1或SEQ ID N°2)相比，本發明之酯酶變異體在pH 8下展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。 變異體之聚酯降解活性

本發明之一目標為提供具有酯酶活性之新酶。在一特定實施例中，本發明之酶展現角質酶活性。

有利的是，本發明之酯酶具有聚酯降解活性，較佳聚對苯二甲酸乙二酯(PET)降解活性及/或聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)降解活性及/或聚己內酯(PCL)降解活性及/或聚丁二酸丁二酯(PBS)活性，更佳聚對苯二甲酸乙二酯(PET)降解活性及/或聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)降解活性。甚至更佳地，本發明之酯酶具有聚對苯二甲酸乙二酯(PET)降解活性。

有利的是，本發明之酯酶展現在20℃至90℃、較佳30℃至90℃、更佳40℃至90℃、更佳50℃至90℃、54℃至90℃、甚至更佳60℃至90℃、68℃至90℃之溫度範圍內之聚酯降解活性。特別地，本發明之酯酶展現在68℃與90℃之間、65℃與90℃之間、65℃與85℃之間、65℃與80℃之間、70℃與90℃之間、70℃與85℃之間、70℃與80℃之間的溫度範圍內之聚酯降解活性。特別地，本發明之酯酶展現在40℃與80℃之間、較佳50℃與72℃之間、更佳50℃與65℃之間的溫度下的聚酯降解活性。在一實施例中，本發明之酯酶展現在55℃與60℃之間、50℃與55℃之間、55℃與65℃之間、60℃與72℃之間、60℃與70℃之間的溫度下的聚酯降解活性。在一特定實施例中，該酯酶展現在至少50℃下、在54℃下、在60℃下、在65℃下、在68℃下或在70℃下之聚酯降解活性。有利的是，仍可在55℃與70℃之間的溫度下量測聚酯降解活性。在本發明之上下文中，以+/-1℃給定溫度。

根據本發明，與SEQ ID N°1及/或SEQ ID N°2之酯酶相比，本發明之酯酶在給定溫度下且更特別地在40℃與90℃之間、更佳50℃與90℃之間的溫度下可具有增加之聚酯降解活性。有利的是，與SEQ ID N°1及/或SEQ ID N°2之酯酶相比，本發明之酯酶在40℃與90℃之間、在40℃與80℃之間、在40℃與70℃之間、在50℃與70℃之間、在55℃與70℃之間、在60℃與70℃之間、在65℃與75℃之間、在65℃與80℃之間、在65℃與90℃之間、在68℃與90℃之間、在68℃與80℃之間、在72℃與90℃之間、在72℃與85℃之間的整個溫度範圍內具有增加之聚酯降解活性。特別地，本發明之酯酶在40℃與80℃之間、較佳50℃與72℃之間、更佳50℃與65℃之間的溫度下展現增加之聚酯降解活性。在一實施例中，本發明之酯酶在55℃與60℃之間、50℃與55℃之間、55℃與65℃之間、60℃與72℃之間、60℃與70℃之間的溫度下展現增加之聚酯降解活性。更特別地，本發明之酯酶至少在50℃、54℃、60℃、65℃或68℃下，較佳在54℃及/或60℃下展現增加之聚酯降解活性。有利的是，酯酶之聚酯降解活性比SEQ ID N°1及/或SEQ ID N°2之酯酶之聚酯降解活性高至少5%，較佳至少10%、20%、50%、100%或更多。

較佳地，酯酶在65℃下之聚酯降解活性比SEQ ID N°1及/或SEQ ID N°2之酯酶之聚酯降解活性高至少5%，較佳至少10%、20%、30%、50%、100%或更多。

有利的是，本發明之酯酶至少在5至11，較佳6至9的pH範圍內，更佳在6.5至9之pH範圍內，甚至更佳在6.5至8之pH範圍內，甚至更佳在包含於7與9之間的pH下，尤其在pH 8下展現可量測之酯酶活性。 核酸、表現卡匣、載體、宿主細胞

本發明之另一目標為提供編碼如上文所定義之酯酶的核酸。

如本文所使用，術語「核酸( nucleic acid)」、「核酸序列( nucleic sequence)」、「聚核苷酸( polynucleotide)」、「寡核苷酸( oligonucleotide)」及「核苷酸序列( nucleotide sequence)」係指去氧核糖核苷酸及/或核糖核苷酸之序列。核酸可為DNA (cDNA或gDNA)、RNA或其混合物。核酸可呈單股形式或呈雙螺旋體形式或為其混合物。其可具有重組、人工及/或合成來源，且可包含經修飾之核苷酸，包含例如經修飾之鍵、經修飾之嘌呤或嘧啶鹼基或經修飾之糖。本發明之核酸可呈經分離或純化形式，且藉由此項技術中本身已知的技術來分離及/或操縱，該等技術例如cDNA文庫之選殖及表現、擴增、酶促合成或重組技術。核酸亦可藉由眾所周知的化學合成技術在活體外合成，如例如Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444中所描述。

本發明亦涵蓋在嚴格條件下與編碼如上文所定義之酯酶的核酸雜合的核酸。較佳地，此類嚴格條件包括於2 X SSC/0.1%SDS中將雜合濾紙在約42℃下培育約2.5小時，接著在65℃下於1 X SSC/0.1% SDS中洗滌濾紙四次，每次15分鐘。所使用方案描述於諸如Sambrook等人(Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor N.Y. (1988))及Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology (1989))之參考文獻中。

本發明亦涵蓋編碼本發明酯酶之核酸，其中該核酸之序列或至少該序列的一部分已使用經最佳化之密碼子使用來工程改造。

替代地，根據本發明之核酸可由根據本發明之酯酶的序列推斷，且密碼子使用可根據核酸將在其中轉錄之宿主細胞調適。此等步驟可根據熟習此項技術者熟知的方法進行，且其中一些描述於參考手冊Sambrook等人(Sambrook等人, 2001)中。

本發明之核酸可進一步包含其他核苷酸序列，諸如調節區，亦即啟動子、強化子、沈默子、終止子、信號肽及可用於引起或調節多肽在所選擇宿主細胞或系統中之表現的類似者。

本發明進一步係關於包含可操作地連接至一或多個控制序列的根據本發明之核酸的表現卡匣，該一或多個控制序列引導該核酸在合適宿主細胞中之表現。

如本文所使用，「表現( expression)」係指涉及多肽之產生的任何步驟，包括(但不限於)轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。

術語「表現卡匣( expression cassette)」表示包含編碼區(亦即，本發明之核酸)及可操作地連接之調節區(亦即，包含一或多個控制序列之區)的核酸構築體。

通常，表現卡匣包含以下或由以下組成：可操作地連接至控制序列的根據本發明之核酸，該控制序列諸如轉錄啟動子及/或轉錄終止子。控制序列可包括啟動子，其由宿主細胞或活體外表現系統識別以用於表現編碼本發明酯酶之核酸。啟動子含有介導酶之表現的轉錄控制序列。啟動子可為在宿主細胞中展現轉錄活性之任何聚核苷酸，包括突變、截短及雜合啟動子，且可自將同源或異源之細胞外或細胞內多肽編碼成宿主細胞之基因獲得。控制序列亦可為轉錄終止子，其由宿主細胞識別以終止轉錄。終止子可操作地連接至編碼酯酶之核酸的3'端。在宿主細胞中具有功能之任何終止子可用於本發明中。通常，表現卡匣包含以下或由以下組成：可操作地連接至轉錄啟動子及轉錄終止子的根據本發明之核酸。

本發明亦係關於包含如上文所定義之核酸或表現卡匣的載體。

如本文所使用，術語「載體( vector)」或「表現載體( expression vector)」係指包含本發明之表現卡匣的DNA或RNA分子，其用作將重組遺傳物質轉移至宿主細胞中之載體。主要類型之載體為質體、噬菌體、病毒、黏質體及人工染色體。載體自身通常為由插入序列(異源核酸序列，轉殖基因)及充當載體之「主鏈」的較大序列組成的DNA序列。將遺傳資訊轉移至宿主的載體之目的通常為在目標細胞中分離、倍增或表現插入序列。被稱為表現載體(表現構築體)之載體經特定調適以用於在目標細胞中表現異源序列，且通常具有驅動編碼多肽之異源序列之表現的啟動子序列。通常，存在於表現載體中之調節元件包括轉錄啟動子、核糖體結合位點、終止子，且視情況存在操縱子。較佳地，表現載體亦含有用於在宿主細胞中之自主複製的複製起點、可選標記物、有限數目個有效限制酶位點及高複本數之潛能。表現載體之實例為選殖載體、經修飾之選殖載體、經特定設計之質體及病毒。在不同宿主中提供合適水準之多肽表現的表現載體為此項技術中所熟知。載體之選擇將通常取決於載體與待引入載體之宿主細胞的相容性。較佳地，表現載體為線性或圓形的雙股DNA分子。

本發明之另一目標為提供包含如上文所描述之核酸、表現卡匣或載體的宿主細胞。由此，本發明係關於根據本發明之核酸、表現卡匣或載體用於轉化、轉染或轉導宿主細胞之用途。載體之選擇將通常取決於載體與必須引入載體之宿主細胞的相容性。

根據本發明，宿主細胞可以暫時或穩定方式經轉化、轉染或轉導。將本發明之表現卡匣或載體引入宿主細胞中，使得該卡匣或載體作為染色體組成部分或作為自我複製的染色體外載體維持。術語「宿主細胞( host cell)」亦涵蓋親本宿主細胞的因複製期間發生之突變而與親本宿主細胞不一致之任何後代。宿主細胞可為適用於產生本發明之變異體的任何細胞，例如原核細胞或真核細胞。原核宿主細胞可為任何革蘭氏陽性(Gram-positive)或革蘭氏陰性(Gram-negative)細菌。宿主細胞亦可為真核細胞，諸如酵母菌、真菌、哺乳動物、昆蟲或植物細胞。在一特定實施例中，宿主細胞係選自以下之群：大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌(Bacillus)、鏈黴菌(Streptomyces)、木黴菌(Trichoderma)、曲黴菌(Aspergillus)、酵母菌(Saccharomyces)、畢赤酵母菌(Pichia)、弧菌(Vibrio)或耶氏酵母菌(Yarrowia)。

根據本發明之核酸、表現卡匣或表現載體可藉由熟習此項技術者已知的任何方法而引入宿主細胞中，該方法諸如電穿孔、結合、轉導、勝任細胞轉化、原生質體轉化、原生質體融合、基因槍「基因槍(gene gun)」轉化、PEG介導之轉化、脂質輔助之轉化或轉染、以化學方式介導之轉染、乙酸鋰介導之轉化、脂質體介導之轉化。

視情況，可將本發明之核酸、卡匣或載體之超過一個複本插入宿主細胞中以增加變異體之產生。

在一特定實施例中，宿主細胞為重組微生物。實際上，本發明允許將微生物工程改造成具有改良的使含聚酯材料降解的能力。舉例而言，本發明之序列可用於補充已知能夠使聚酯降解的真菌或細菌之野生型菌株，以改良及/或增加菌株能力。 酯酶之產生

本發明之另一目標為提供一種產生本發明酯酶之方法，其包含表現編碼該酯酶之核酸以及視情況回收該酯酶。

特別地，本發明係關於產生本發明酯酶之活體外方法，其包含：(a)使本發明之核酸、卡匣或載體與活體外表現系統接觸；及(b)回收所產生的酯酶。活體外表現系統為熟習此項技術者所熟知，且為市售的。

較佳地，該產生方法包含 (a)在適合於表現核酸之條件下培養包含編碼本發明酯酶之核酸的宿主細胞；以及視情況 (b)自細胞培養物回收該酯酶。

有利的是，宿主細胞為重組芽孢桿菌、重組大腸桿菌、重組曲黴菌、重組木黴菌、重組鏈黴菌、重組酵母菌、重組畢赤酵母菌、重組弧菌或重組耶氏酵母菌。

使用此項技術中已知之方法，在適合於產生多肽之營養物培養基中培養宿主細胞。舉例而言，可藉由在合適的培養基中且在允許表現及/或分離酶的條件下進行的搖瓶培養或者實驗室或工業醱酵器中之小規模或大規模醱酵(包括連續、分批、分批補料或固體狀態醱酵)來培養細胞。培養在合適的營養物培養基中進行，該營養物培養基來自商業供應商或可根據公佈之組成(例如於美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)之目錄中)製備。

若酯酶分泌至營養物培養基中，則可直接自培養物上清液回收酯酶。相反，可自細胞溶解物或在通透化之後回收酯酶。可使用此項技術中已知之任何方法來回收酯酶。舉例而言，可藉由習知程序自營養物培養基回收酯酶，該等程序包括(但不限於)收集、離心、過濾、萃取、噴霧乾燥、蒸發或沈澱。視情況，酯酶可藉由此項技術中已知之各種程序部分或完全純化以獲得實質上純的多肽，該等程序包括(但不限於)層析(例如，離子交換、親和性、疏水性、層析聚焦及尺寸排阻)、電泳程序(例如，製備型等電聚焦)、差分溶解度(例如，硫酸銨沈澱)、SDS-PAGE或萃取。

酯酶本身可以純化形式單獨或與其他酶組合使用，以催化涉及聚酯及/或含聚酯材料(諸如，含有聚酯之塑膠製品)降解及/或再循環的酶促反應。酯酶可呈可溶形式或在固相上。特別地，酯酶可結合至細胞膜或脂質囊泡，或結合至合成性支撐物，諸如玻璃、塑膠、聚合物、濾紙、膜，例如呈珠粒、管柱、培養盤形式，及其類似者。 組合物

本發明之另一目標為提供一種包含本發明之酯酶或宿主細胞或其含有酯酶之提取物之組合物。在本發明之上下文中，術語「組合物」涵蓋包含本發明之酯酶或宿主細胞或其含有酯酶之提取物的任何種類之組合物。

按組合物之總重量計，本發明之組合物可包含0.1重量%至99.9重量%、較佳0.1重量%至50重量%、更佳0.1重量%至30重量%、甚至更佳0.1重量%至5重量%之酯酶。替代地，組合物可包含5重量%至10重量%之本發明酯酶。

組合物可呈液體或乾物形式，例如呈粉末之形式。在一些實施例中，組合物為凍乾物。

組合物可進一步包含賦形劑及/或試劑等。適當的賦形劑涵蓋：通常用於生物化學中之緩衝劑；用於調整pH之試劑；防腐劑，諸如苯甲酸鈉、山梨酸鈉或抗壞血酸鈉；保存劑、保護劑或穩定劑，諸如澱粉、糊精、阿拉伯膠、鹽、糖(例如，山梨糖醇、海藻糖或乳糖)、甘油、聚乙二醇、聚丙二醇、丙二醇；螯合劑，諸如EDTA；還原劑；胺基酸；載劑，諸如溶劑或水溶液；及其類似者。本發明之組合物可藉由混合酯酶與一種或若干種賦形劑而獲得。

舉例而言，按組合物之總重量計，組合物包含0.1重量%至99.9重量%、較佳50重量%至99.9重量%、更佳70重量%至99.9重量%、甚至更佳95重量%至99.9重量%之賦形劑。替代地，該組合物可包含90重量%至95重量%之賦形劑。

該組合物可進一步包含展現酶促活性之其他多肽。本發明酯酶之量將容易由熟習此項技術者例如取決於需降解之聚酯及/或組合物中所含有之其他酶/多肽的性質而調整。

本發明之酯酶可與一種或若干種賦形劑(尤其能夠使多肽穩定或保護多肽不降解的賦形劑)一起溶解於水性介質中。舉例而言，本發明之酯酶可最終與其他組分一起溶解於水中，該等其他組分諸如甘油、山梨糖醇、糊精、澱粉、二醇(諸如丙二醇)、鹽等。所得混合物隨後可經乾燥以獲得粉末。用於乾燥此類混合物之方法為熟習此項技術者所熟知，且包括(但不限於)凍乾、冷凍乾燥、噴霧乾燥、超臨界乾燥、下吸式蒸發、薄層蒸發、離心蒸發、帶式乾燥、流體化床乾燥、滾筒乾燥或其任何組合。

該組合物可呈粉末形式，且可包含酯酶及穩定/增溶量之甘油、山梨糖醇或糊精(諸如，麥芽糖糊精及/或環糊精)、澱粉、二醇(諸如，丙二醇)及/或鹽。

本發明之組合物可包含表現本發明酯酶之至少一個重組細胞或其提取物。「細胞提取物」表示藉由化學、物理及/或酶促處理而自細胞獲得之任何部分，諸如細胞上清液、細胞碎片、細胞壁、DNA提取物、酶或酶製劑或衍生自細胞之任何製劑，其基本上不含活細胞。較佳提取物為具有酶促活性的提取物。本發明之組合物可包含本發明之一個或若干個重組細胞或其提取物以及視情況存在之一個或若干個其他細胞。

舉例而言，該組合物由以下組成或包含以下：表現且分泌本發明酯酶之重組微生物之培養介質。在一特定實施例中，組合物包含凍乾的此類培養介質。 酯酶之用途

本發明之另一目標為提供使用本發明之酯酶以在好氧或厭氧條件中使聚酯或含聚酯材料降解及/或再循環的方法。本發明之酯酶尤其適用於使PET及含PET材料降解。

因此，本發明之一目標為使用本發明之酯酶或對應的重組細胞或其具有酯酶活性之提取物或者組合物來對聚酯進行酶促降解。

有利的是，酯酶所靶向之聚酯係選自聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚異山梨醇對苯二甲酸乙二酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃二甲酸乙二酯(PEF)、聚己內酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯) (PEA)、聚萘二甲酸乙二酯(PEN)、「聚烯烴類」聚酯及此等材料之摻合物/混合物，較佳為聚對苯二甲酸乙二酯。

在一較佳實施例中，聚酯為PET，且視情況回收至少單體(例如，單乙二醇或對苯二甲酸)及/或寡聚物(例如，對苯二甲酸甲基-2-羥基乙酯(MHET)、對苯二甲酸雙(2-羥基乙酯) (BHET)、對苯二甲酸1-(2-羥基乙酯) 4-甲酯(HEMT)及對苯二甲酸二甲酯(DMT))。

本發明之又一目標為使用本發明之酯酶或對應的重組細胞或其提取物或者組合物以對含聚酯材料中的至少一種聚酯進行酶促降解。

本發明之另一目標為提供一種用於使含聚酯材料中之至少一種聚酯降解的方法，其中使該含聚酯材料與本發明之酯酶或宿主細胞或其提取物或者組合物接觸，從而使含聚酯材料中之該至少一種聚酯降解。

有利的是，聚酯解聚合直至得到單體及/或寡聚物。

特別地，本發明提供一種用於使含有PET之材料中之PET降解的方法，其中使含有PET之材料與本發明之酯酶或宿主細胞或組合物接觸，從而使該PET降解。

有利的是，至少一種聚酯降解成可再聚合的單體及/或寡聚物，可有利地重新得到該等單體及/或寡聚物以再使用。重新得到的單體/寡聚物可用於再循環(例如，使聚酯再聚合)或甲烷化。在一特定實施例中，至少一種聚酯為PET，且重新得到單乙二醇、對苯二甲酸、對苯二甲酸甲基-2-羥基乙酯(MHET)、對苯二甲酸雙(2-羥基乙酯) (BHET)、對苯二甲酸1-(2-羥基乙酯) 4-甲酯(HEMT)及/或對苯二甲酸二甲酯(DMT)。

較佳地，含聚酯材料中之聚酯充分降解。

使含聚酯材料降解所需的時間可視含聚酯材料自身(亦即，含聚酯材料之性質及來源、其組成、形狀等)、所使用酯酶之類型及量以及各種過程參數(亦即，溫度、pH、其他製劑等)而變化。熟習此項技術者可容易地使過程參數適於含聚酯材料及所設想降解時間。

有利的是，降解過程係在包含於20℃與90℃之間、較佳40℃與90℃之間、更佳50℃與70℃之間的溫度下進行。在一特定實施例中，降解係過程在60℃下進行。在另一特定實施例中，降解過程係在65℃下進行。在另一特定實施例中，降解過程係在70℃下進行。更一般而言，維持溫度低於不活化溫度，其對應於酯酶不活化的溫度(亦即，酯酶與其在最佳溫度下之活性相比喪失超過80%的活性時的溫度)及/或重組微生物不再合成酯酶之溫度。特別地，維持溫度低於所靶向聚酯之玻璃轉化溫度(Tg)。

有利的是，該過程在酯酶可使用若干次及/或再循環之溫度下以連續流程之形式實現。

有利的是，降解過程係在包含於5至9之間的pH下、較佳在6至9之pH範圍內、更佳在6.5至9之pH範圍內、甚至更佳在6.5至8之pH範圍內、甚至更佳在包含於7與9之間的pH下、尤其在pH 8下進行。

含聚酯材料可在與酯酶接觸之前經預處理，以便以物理方式改變其結構，從而增加聚酯與酯酶之間的接觸表面。

本發明之另一目標為提供一種自含聚酯材料產生單體及/或寡聚物的方法，其包含：使含聚酯材料暴露於本發明之酯酶或對應的重組細胞或其提取物或者組合物；及視情況回收單體及/或寡聚物。

由解聚合產生之單體及/或寡聚物可依序或連續地回收。視起始的含聚酯材料而定，可回收單一類型之單體及/或寡聚物或若干不同類型之單體及/或寡聚物。

本發明之方法尤其適用於自PET及/或包含PET之塑膠製品產生選自單乙二醇及對苯二甲酸之單體，及/或選自對苯二甲酸甲基-2-羥基乙酯(MHET)、對苯二甲酸雙(2-羥基乙酯) (BHET)、對苯二甲酸1-(2-羥基乙酯) 4-甲酯(HEMT)及對苯二甲酸二甲酯(DMT)之寡聚物。

回收的單體及/或寡聚物可使用所有合適的純化方法進一步純化且調節成可再聚合形式。

回收的可再聚合的單體及/或寡聚物可例如再用於合成聚酯。有利的是，再聚合出具有相同性質的聚酯。然而，有可能將回收的單體及/或寡聚物與其他單體及/或寡聚物混合，例如以合成新共聚物。替代地，回收的單體可用作化學中間物以產生感興趣的新化合物。

作為實例，使包括本發明酯酶的此類含聚酯材料降解之方法揭示於專利申請案WO 2014/079844、WO 2015/173265、WO 2017/198786、WO 2020/094661、WO 2020/094646、WO 2021/123299、WO 2021/123301及WO 2021/123328中。本發明亦係關於一種使含聚酯材料表面水解或表面官能化的方法，其包含使含聚酯材料暴露於本發明之酯酶或對應的重組細胞或其提取物或者組合物。本發明之方法尤其適用於增加聚酯材料之親水性或吸水性。此增加之親水性可在紡織物製造、電子裝置及生物醫學應用中受到特別關注。

本發明亦係關於一種處理水、廢水或污水之方法。在廢水或污水處理應用中，根據本發明之酯酶可用於使由聚酯(較佳PET)組成之微塑膠粒子降解，諸如聚合物長絲、纖維或其他類型之基於聚酯之產物碎片及片段，較佳基於PET之產物碎片及片段。本發明之另一目標為提供一種含聚酯材料，其中包括本發明之酯酶及/或表現且分泌該酯酶之重組微生物。作為實例，用於製備包括本發明酯酶的此類含聚酯材料的方法揭示於專利申請案WO2013/093355、WO 2016/198650、WO 2016/198652、WO 2019/043145及WO 2019/043134中。

由此，本發明之一目標為提供一種含聚酯材料，其含有本發明之酯酶及/或重組細胞及/或組合物或其提取物以及至少PET。根據一實施例，本發明提供一種塑膠製品，其包含PET及具有PET降解活性之本發明酯酶。

由此，本發明之另一目標為提供一種含聚酯材料，其含有本發明之酯酶及/或重組細胞及/或組合物或其提取物以及至少PBAT。根據一實施例，本發明提供一種塑膠製品，其包含PBAT及具有PBAT降解活性之本發明酯酶。

由此，本發明之另一目標為提供一種含聚酯材料，其含有本發明之酯酶及/或重組細胞及/或組合物或其提取物以及至少PBS。根據一實施例，本發明提供一種塑膠製品，其包含PBS及具有PBS降解活性之本發明酯酶。

由此，本發明之另一目標為提供一種含聚酯材料，其含有本發明之酯酶及/或重組細胞及/或組合物或其提取物以及至少PCL。根據一實施例，本發明提供一種塑膠製品，其包含PCL及具有PCL降解活性之本發明酯酶。

傳統地，本發明之酯酶可用於清潔劑、食物、動物飼料、造紙、紡織及醫藥應用中。更特別地，本發明之酯酶可用作清潔劑組合物之組分。清潔劑組合物包括(但不限於)手洗或機器洗衣清潔劑組合物，諸如適合於前處理染色織品之洗衣添加劑組合物及沖洗添加的織品軟化劑組合物、用於一般家庭硬表面清洗操作之清潔劑組合物、用於手洗或機器洗碗操作之清潔劑組合物。舉例而言，本發明之酯酶可用作清潔劑添加劑。由此，本發明提供包含本發明酯酶之清潔劑組合物。特別地，本發明之酯酶可用作清潔劑添加劑以減少紡織物清洗期間的起球及變灰效應。

本發明亦係關於在動物飼料中使用本發明酯酶之方法，以及包含本發明酯酶之飼料組合物及飼料添加劑。術語「飼料」及「飼料組合物」係指適合於或既定用於由動物攝入的任何化合物、製劑、混合物或組合物。本發明之酯酶亦可用於使蛋白質水解，且用於產生包含肽之水解產物。此類水解產物可用作飼料組合物或飼料添加劑。

本發明之另一目標為提供一種在造紙工業中使用本發明酯酶的方法。更特別地，本發明之酯酶可用於自造紙機之紙漿及水管線移除黏性物質。 實例 實例 1 - 酯酶之構築、表現及純化 構築

使用質體構築來產生根據本發明之酯酶pET26b-LCC-His。此質體在於選殖編碼SEQ ID N°1之酯酶的基因，其經最佳化以用於 NdeI與 XhoI限制位點之間的大腸桿菌( Escherichia coli)表現。已根據供應商之建議使用兩個定點突變誘發套組來產生酯酶變異體：來自Agilent (Santa Clara, California, USA)之QuikChange II定點突變誘發套組及QuikChange Lightning多定點。 酯酶之表現及純化

在50 mL LB-Miller培養基或ZYM自動誘導培養基(Studier等人, 2005- Prot. Exp. Pur. 41, 207-234)中，依次採用菌株Stellar™ (Clontech, California, USA)及大腸桿菌One Shot® BL21 DE3 (Life technologies, Carlsbad, California, USA)來進行選殖及重組表現。在16℃下利用0.5 mM異丙基β-D-1-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG, Euromedex, Souffelweyersheim, France)來進行LB-Miller培養基中之誘導。藉由在Avanti J-26 XP離心機(Beckman Coulter, Brea, USA)中離心(8000 rpm，10℃下20分鐘)來終止培養。將細胞懸浮於20 mL Talon緩衝液(Tris-HCl 20 mM，NaCl 300 mM，pH 8)中。隨後藉由FB 705音波處理器(Fisherbrand, Illkirch, France)在2分鐘期間利用30%振幅(2秒開啟及1秒斷開循環)對細胞懸浮液進行音波處理。隨後，實現離心步驟：在Eppendorf離心機中，11000 rpm，10℃，30分鐘。收集可溶性溶離份且經受親和性層析。此純化步驟已藉由Talon®金屬親和樹脂(Clontech, CA, USA)完成。藉由補充有咪唑之Talon緩衝液步驟來進行蛋白質溶離。經純化之蛋白質已針對Talon緩衝液透析，接著使用Bio-Rad蛋白質分析根據製造商說明(Lifescience Bio-Rad, France)定量且在+4℃下儲存。 實例 2 - 評估酯酶之降解活性

已測定酯酶之降解活性且與SEQ ID N°1之酯酶之活性進行比較。

使用用於評定比活性之多種方法： (1)基於PET水解之比活性 (2)基於聚酯在固體形式下之降解的降解活性 (3)基於超過100 mL之反應器中之PET水解的降解活性 (4)基於PET水解及紫外光吸光度(UV測定)分析之比活性 2.1.基於PET水解之比活性

稱取100 mg呈粉末形式之非晶形PET (根據WO 2017/198786製備以達到低於20%之結晶度)，且將其引入100 mL玻璃瓶中。將在Talon緩衝液(Tris-HCl 20 mM，NaCl 0.3M，pH 8)中以0.69µM製備的包含SEQ ID N°1之酯酶(作為參考對照)或本發明之酯酶的1 mL酯酶製劑引入玻璃瓶中。最後，添加pH為8的49 mL 0.1 M磷酸鉀緩衝液。

藉由在Max Q 4450培育箱(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA)中在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或72℃及150 rpm下培育各玻璃瓶而開始解聚合。

以每小時產生的當量TA之毫克數為單位，藉由在第一段24小時期間的不同時間處進行且藉由超高效液相層析(UHPLC)分析的取樣來測定解聚合反應之初始速率。視需要，將樣本稀釋於pH 8的0.1 M磷酸鉀緩衝液中。隨後，向150 µL樣本或稀釋液中添加150 µL甲醇及6.5 µL之6 N HCl。在混合且經由0.45 µm針筒過濾器過濾之後，將樣本加載在UHPLC上以監測對苯二甲酸(TA)、MHET及BHET之釋放。所使用層析系統為Ultimate 3000 UHPLC系統(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA)，其包括泵模組、自動取樣器、恆溫在25℃的管柱烘箱及240 nm下之UV偵測器。所使用管柱為Discovery® HS C18 HPLC管柱(150 × 4.6 mm，5 µm，配備有前置管柱，Supelco，Bellefonte，USA)。在1 mM H ₂SO ₄中使用MeOH梯度(30%至90%)以1 mL/min分離TA、MHET及BHET。注入20 µL樣本。根據在與樣本相同的條件下由市售TA及BHET以及內部合成的MHET所製備之標準曲線來量測TA、MHET及BHET。在反應之水解曲線之線性部分中(亦即在反應開始時)測定PET水解之比活性(當量TA的毫克數/小時/酶的毫克數)，該曲線係由在第一段24、48、72、96小時期間不同時間進行之取樣建立。當量TA對應於所量測TA與所量測MHET及BHET中含有之TA的總和。當量TA之該量測亦可用於計算在給定時間及/或在所限定之時間段(例如24h、48h、72h或96h)之後PET解聚合測定法之產率。 2.2.基於聚酯在固體形式下之降解的活性

將20 µL酶製劑沈積於含有PET之瓊脂盤中所形成之孔中。藉由使500 mg PET溶解於六氟-2-丙醇(HFIP)中且將此培養基傾倒在250 mL水溶液中來實現瓊脂盤之製備。在140毫巴下在52℃下進行HFIP蒸發之後，將溶液與pH 8的含有3%瓊脂之0.2 M磷酸鉀緩衝液v/v混合。使用大約30 mL混合物來製備每一培養盤，且儲存在4℃下。

量測由於野生型酯酶及變異體對聚酯之降解而形成的暈圈之直徑或表面積且在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下2至24小時之後進行比較。 2.3.基於反應器中PET水解之活性

在500 mL Minibio生物反應器(Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands)中，將在80 mL的100 mM pH為8的磷酸鉀緩衝液中製備之0.69 µmol至2.07 µmol經純化之酯酶與20 g非晶形PET (根據WO 2017/198786製備以達到低於20%之結晶度)混合。藉由水浴浸沒來進行40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃或70℃之溫度調節，且使用單一船用式葉輪來維持在250 rpm下不斷攪拌。PET解聚合測定之pH係藉由添加6N NaOH調節為pH 8，且藉由my-Control生物控制器系統(Applikon Biotechnology, Delft, The Netherlands)確保。在測定期間記錄鹼消耗，且該鹼消耗可用於表徵PET解聚合測定。

藉由測定殘餘PET重量或藉由測定所產生的當量TA或者經由鹼消耗來測定PET解聚合測定法之最終產率。藉由在反應結束時經由12至15 µm級11無灰濾紙(Dutscher SAS, Brumath, France)來過濾反應體積且對此保留物進行乾燥，之後對其進行稱重，從而評定殘餘PET之重量測定。使用2.1中所描述之UHPLC方法來實現所產生的當量TA之測定，且基於給定時間處之莫耳濃度比率(TA + MHET + BHET)相比於初始樣本中所含有的TA總量來計算水解百分比。PET解聚合產生之酸單體將經鹼中和，此能夠維持反應器中之pH。使用對應的莫耳鹼消耗來計算所產生的當量TA之測定，且基於給定時間處當量TA之莫耳濃度比率相比於初始樣本中含有的TA總量來計算水解百分比。 2.4基於PET水解及紫外光吸光度(UV測定)分析之比活性

稱取100 mg呈粉末形式之非晶形PET (根據WO 2017/198786製備以達到低於20%之結晶度)，且將其引入100 mL玻璃瓶中。將在Talon緩衝液(Tris-HCl 20 mM，NaCl 0.3M，pH 8，或100 mM磷酸鉀緩衝液，pH 8.0)中以0.69µM製備的包含SEQ ID N°1之酯酶(作為參考對照)或本發明之酯酶的1 mL酯酶製劑引入玻璃瓶中。最後，添加pH為8.0的49 mL 100mM磷酸鉀緩衝液。

藉由在Max Q 4450培育箱(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA)中在50℃、54℃、60℃或65℃及150 rpm下培育各玻璃瓶而開始解聚合。

或者，反應可以在deepwell(ThermoScientific, Abgene, AB-0661, Illkirch, France)中微型化，稱取22 mg呈粉末形式之非晶形PET (根據WO 2017/198786製備以達到低於20%之結晶度)且將其引入deepwell培養盤之各孔中。將在Talon緩衝液(Tris-HCl 20 mM，NaCl 0.3M，pH 8，或100 mM磷酸鉀緩衝液，pH 8.0)中以0.138µM製備的包含SEQ ID N°1之酯酶(作為參考對照)或本發明之酯酶的0.1 mL酯酶製劑引入deepwell之各孔中。最後，添加pH為8.0的0.9 mL 100mM磷酸鉀緩衝液。

藉由在Infors HT multitron振盪培育箱(Infors HT, Bottmingen, Suisse)中在50℃、54℃、55℃、60℃或65℃及600 rpm下培育各deepwell而開始解聚合。

初始解聚合反應速率(以所產生之可溶性降解產物之微莫耳數/小時為單位)係藉由在第一段24小時期間不同時間進行之取樣測定，且藉由使用Eon微量培養盤分光光度計(BioTek, USA)在242 nm處讀取吸光度進行分析。在光譜之紫外光區域中(在242 nm下)反應混合物之吸光度增加指示可溶TA或其酯(BHET及MHET)自不溶PET受質釋放。此波長下之吸光度值可用於根據朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law)計算PET水解產物之整體總和，且酶比活性經測定為所產生的總當量TA。視需要，將樣本稀釋於pH8.0的100mM磷酸鉀緩衝液中。在反應之水解曲線之線性部分中(亦即在反應開始時)測定PET水解之比活性(可溶產物之微莫耳數/小時/酶之毫克數)，該曲線係藉由在第一段24小時期間不同時間進行之取樣建立。當量TA之該量測亦可用於計算在給定時間及/或在所限定之時間段之後PET解聚合測定法之產率。 結果 與 SEQ ID N°1 之酯酶相比 ， 基於 PET 水解在鹼性條件下之比降解活性

如實例2.1中所揭露，在反應開始時，在65℃，pH 8下量測本發明之酯酶(變異體)之比降解活性。

結果顯示於下表1中。SEQ ID N°1之酯酶之比降解活性用作參考且被視為100%比降解活性。 表1：與SEQ ID N°1相比，本發明之酯酶在pH 8下之比降解活性

變異體	與SEQ ID N°1 相比之相對比降解活性(%)
V1: V219E	128 %
V5 : L15Q	110%
V6: N211F	117 %
V7 : S13L	109 %
V8: A14Y	128 %
V9: S206N	121 %

除表1中所列之取代之外，變異體具有SEQ ID N°1之精確胺基酸序列。 與 SEQ ID N°1 之酯酶相比在鹼性條件下之 PET 解聚合產率

在65℃、pH 8下96小時之後根據實例2.1量測本發明之酯酶(變異體)之PET解聚合產率。在本發明之上下文中，使用PET解聚合產率來評估降解活性。

結果顯示於下表2中。在65℃、pH 8下96小時之後的SEQ ID N°1之酯酶之PET解聚合產率用作參考且被視為100%降解活性。 表2：96小時之後本發明之酯酶之PET解聚合產率

變異體	與SEQ ID N°1 相比在96 小時之後的PET 解聚合產率(%)
V2: N204S+N105D	137 %
V11: N243Y	114%

除表2中所列之取代之外，V2及V11具有SEQ ID N°1之精確胺基酸序列。 與 SEQ ID N°1 之酯酶相比 ， 基於 PET 水解在鹼性條件下之比降解活性

如實例2.4中所揭露，在反應開始時在pH 8.0下且在65℃下量測比降解活性。

本發明之酯酶(變異體)之比降解活性顯示於下表3中。SEQ ID N°1之酯酶之比降解活性用作參考且被視為100%比降解活性。 表3：與SEQ ID N°1相比，本發明之酯酶在pH 8.0及在65℃下之比降解活性

變異體	與 SEQ ID N°1 相比之相對比降解活性 (%)
V12 : R138K	110 %
V13 : R138K+E141C	115 %

除分別在表3中所列之取代之外，以上列出之變異體具有SEQ ID N°1之精確胺基酸序列。 與 SEQ ID N°2 之酯酶相比 ， 基於 PET 水解在鹼性條件下之比降解活性

如實例2.1中所揭露，在65℃下且在pH 8下96小時之後量測本發明之變異體之比降解活性。該變異體衍生於SEQ ID N°2，其具有比SEQ ID N°1之酯酶高1.4倍之比降解活性。換言之，與SEQ ID N°2相比顯示增加之降解活性的SEQ ID N°2之變異體與SEQ ID N°1相比亦具有增加之降解活性。

結果顯示於下表4中。SEQ ID N°2之酯酶之比降解活性用作參考且被視為100%比降解活性。 表4：與SEQ ID N°2相比，在65℃下且在pH 8下96小時之後本發明之酯酶之比降解活性

變異體	與SEQ ID N°2 相比之比降解活性(%)
V4: V219E + Q182E + R12E	126 %

除表4中所列之取代之外，V4具有SEQ ID N°2之精確胺基酸序列。 與 SEQ ID N°2 之酯酶相比 ， 基於 PET 水解在鹼性條件下之比降解活性

如實例2.4中所揭露，在反應開始時量測在pH 8.0下及在65℃下(變異體V14-V18)性或在55℃下(變異體V19-V21)的比降解活性。

本發明之酯酶(變異體)之比降解活性顯示於下表5中。SEQ ID N°2之酯酶之比降解活性用作參考且被視為100%比降解活性。 表5：本發明之酯酶之比降解活性

變異體	與SEQ ID N°2 相比之比降解活性(%)
V14: F250N	179 %
V15: F250L	151 %
V16: F250V	166 %
V17: F250Y	150 %
V18 : V180L	123%
V19: V180I	107 %
V20: V180C	111 %
V21: V180N	135 %

除表5中所列之取代之外，變異體具有SEQ ID N°2之精確胺基酸序列。 與 SEQ ID N°2 之酯酶相比在鹼性條件下之 PET 解聚合產率

根據實例2.4在pH 8下及在65℃下(變異體V15)或50℃下(變異體V22-V24)反應24h之後量測本發明之酯酶(變異體)之PET解聚合產率。在本發明之上下文中，使用PET解聚合產率來評估降解活性。

結果顯示於下表6中。在pH 8下及在65℃下(變異體V15)或50℃下(變異體V22至V24)反應24h之後的SEQ ID N°2之酯酶之PET解聚合產率用作參考且視為100%降解活性。 表6：24h之後本發明之酯酶之PET解聚合產率。

變異體	與SEQ ID N°2 相比之PET 解聚合產率(%)
V15: F250L	141 %
V22: V180A	141 %
V23: V180T	125 %
V24: F250A	121 %

除表6中所列之取代之外，變異體具有SEQ ID N°2之精確胺基酸序列。 實例 3 - 評估本發明酯酶之熱穩定性

已測定本發明之酯酶之熱穩定性且將其與SEQ ID N°1或SEQ ID N°2之酯酶之熱穩定性進行比較。

使用不同方法來估計熱穩定性： (1)溶解狀態之蛋白質之圓二色性； (2)在給定溫度、時間及緩衝液條件中進行蛋白質培育之後的殘餘酯酶活性； (3)在給定溫度、時間及緩衝液條件中進行蛋白質培育之後的殘餘聚酯解聚合活性； (4)在給定溫度、時間及緩衝液條件中進行蛋白質培育之後使分散於瓊脂盤中之固體聚酯化合物(諸如PET或PBAT或類似物)降解的能力； (5)在給定溫度、緩衝液、蛋白質濃度及聚酯濃度條件中進行多輪聚酯解聚合測定之能力； (6)差示掃描螢光測定法(DSF)。

下文給出關於此類方法之方案的細節。 3.1 圓二色性

藉由Jasco 815裝置(Easton, USA)進行圓二色性(CD)，以比較SEQ ID N°1之酯酶之熔化溫度( T _m )與本發明酯酶之Tm。技術上，400µL蛋白質樣本係在Talon緩衝液中以0.5 mg/mL製備且用於CD。實施280至190 nm之第一掃描，以測定對應於蛋白質之正確摺疊的CD之兩個最大強度。隨後在對應於此類最大強度之波長下進行25℃至110℃之第二掃描，且得到特定曲線(S型3參數y=a/(1+e^((x-x0)/b)))，藉由Sigmaplot版本11.0軟體分析該等曲線，判定x=x0時之 Tm。所獲得 T _m 反映給定蛋白質之熱穩定性。 T _m 愈高，變異體在高溫下愈穩定。 3.2殘餘酯酶活性

將1 mL SEQ ID N°1之酯酶或本發明之酯酶的40 mg/L溶液(於Talon緩衝液中)在不同溫度(40、50、60、65、70、75、80及90℃)下培育長達10天。定期採集樣本，將其在0.1M pH 8.0的磷酸鉀緩衝液中稀釋1至500倍且實施對硝基苯酚-丁酸酯(pNP-B)測定。將20µL樣本與175µL 0.1M pH 8.0的磷酸鉀緩衝液及5µL含pNP-B溶液之2-甲基-2丁醇(40 mM)混合。在攪拌下在30℃下在15分鐘內進行酶促反應，且藉由微量培養盤分光光度計(Versamax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)獲取405 nm下之吸光度。使用在水解曲線之線性部分中的經釋放對硝基苯酚的標準曲線來測定pNP-B水解之活性(以pNPB微莫耳數/分鐘表示之初始速度)。 3.3殘餘聚酯解聚合活性

將10 mL SEQ ID N°1之酯酶及本發明之酯酶的40 mg/L溶液(於Talon緩衝液中)分別在不同溫度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃及90℃)下培育長達30天。定期獲取1 mL樣本，且將其轉移至含有100 mg的以250-500 µm微粉化之非晶形PET (根據WO 2017/198786製備以達到低於20%之結晶度)及49 mL 0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 8.0)之瓶中，且在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下培育。定期取樣150 µL之緩衝液。必要時，將樣本稀釋於0.1 M磷酸鉀緩衝液(pH 8)中。隨後，向150 µL樣本或稀釋液中添加150 µL甲醇及6.5 µL之6 N HCl。在混合且經由0.45 µm針筒過濾器過濾之後，將樣本加載在UHPLC上以監測對苯二甲酸(TA)、MHET及BHET之釋放。所使用層析系統為Ultimate 3000 UHPLC系統(Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA)，其包括泵模組、自動取樣器、恆溫在25℃的管柱烘箱及240 nm下之UV偵測器。所使用管柱為Discovery® HS C18 HPLC管柱(150 × 4.6 mm，5 µm，配備有前置管柱，Supelco，Bellefonte，USA)。在1 mM H ₂SO ₄中使用MeOH梯度(30%至90%)以1 mL/min分離TA、MHET及BHET。注入20 µL樣本。根據在與樣本相同的條件下由市售TA及BHET以及內部合成的MHET所製備之標準曲線來量測TA、MHET及BHET。在水解曲線之線性部分中測定PET水解之活性(每分鐘水解的PET之微莫耳數或每小時產生的當量TA之毫克數)，此曲線係藉由在第一段24小時期間之不同時間處進行的取樣建立。當量TA對應於所量測TA與所量測MHET及BHET中含有之TA的總和。 3.4呈固體形式之聚酯之降解

將1 mL SEQ ID N°1之酯酶及本發明之酯酶的40 mg/L溶液(於Talon緩衝液中)分別在不同溫度(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃及90℃)下培育長達30天。將20 µL酶製劑定期沈積於含有PET之瓊脂盤中所形成之孔中。藉由使500 mg PET溶解於六氟-2-丙醇(HFIP)中且將此培養基傾倒在250 mL水溶液中來實現含有PET之瓊脂盤之製備。在140毫巴下在52℃下進行HFIP蒸發之後，將溶液與pH 8的含有3%瓊脂之0.2 M磷酸鉀緩衝液v/v混合。使用大約30 mL混合物來製備各omnitray，且儲存在4℃下。

量測由於野生型酯酶及本發明之變異體對聚酯之降解而形成的暈圈之直徑或表面積且在50℃、55℃、60℃、65℃或70℃下2至24小時之後進行比較。給定溫度下酶之半衰期對應於暈圈之直徑減小2倍係數所需之時間。 3.5多輪聚酯解聚合

在酶促反應器中評估酯酶進行連續輪次之聚酯解聚合測定之能力。藉由3 g非晶形PET (根據WO 2017/198786製備以達至低於20%之結晶度)及100 mL的含有3 mg酯酶的pH為8的10 mM磷酸鉀緩衝液來起始Minibio 500生物反應器(Applikon Biotechnology B.V., Delft, The Netherlands)。使用船用式葉輪將攪拌設定在250 rpm。生物反應器藉由浸沒於外部水浴中而恆溫於50℃、55℃、60℃、65℃或70℃。藉由添加3 M KOH將pH調節為8。藉由BioXpert軟體V2.95監測不同參數(pH、溫度、攪拌、鹼之添加)。每20 h添加1.8 g非晶形PET (根據WO 2017/198786製備以達到低於20%之結晶度)。定期取樣500 µL反應介質。

藉由HPLC測定TA、MHET及BHET之量，如實例2.3中所描述。使用恆溫在65℃之Aminex HPX-87K管柱(Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, California, United States)來測定EG之量。溶離劑為5 mM K ₂HPO ₄，0.6 mL.min ^-1。注入20 µL。使用折射器來監測乙二醇。

基於給定時間處之莫耳濃度比率(TA + MHET + BHET)相比於初始樣本中所含有的TA總量，或基於給定時間處之莫耳濃度比率(EG +MHET + 2 × BHET)相比於初始樣本中所含有的EG總量來計算水解百分比。以每小時釋放的TA總毫克數或以每小時EG的總毫克數來計算降解速率。

將酶半衰期評估為獲得50%降解速率損失所需的培育時間。 3.6差示掃描螢光測定法(DSF)

使用DSF以藉由測定野生型蛋白質(SEQ ID N°1)及其變異體之熔化溫度(Tm) (蛋白質群體中之一半展開的溫度)來評估其熱穩定性。以6.25 µM之濃度製備蛋白質樣本且儲存於由100 mM磷酸鉀緩衝液(pH 8)組成之緩衝液A中。用水將於DMSO中之SYPRO橙色染料5000×儲備溶液首次稀釋至250×。將蛋白質樣本加載至白色透明96孔PCR培養盤(Bio-Rad目錄號HSP9601)上，其中各孔含有25 µL最終體積。各孔中蛋白質及SYPRO橙色染料之最終濃度分別為6 µM (0.17 mg/ml)及10×。每孔所加載體積如下：24 μL的6.25 µM蛋白質溶液及1 μL的250x Sypro Orange稀釋溶液。隨後用光學品質密封膠帶密封PCR培養盤，且使其在室溫下以1000 rpm旋轉1 min。隨後使用設定成使用450/490激勵及560/580發射濾光器之CFX96即時PCR系統來進行DSF實驗。將樣本以0.3℃/秒之速率由25℃加熱至100℃。每0.03秒進行單次螢光量測。使用Bio-Rad CFX Manager軟體自熔化曲線之一階導數之峰值判定熔化溫度。可使用緩衝液類型或緩衝液濃度之變化，其中對本發明之酯酶與野生型之間的△Tm無影響，只要相同緩衝液用於野生型酯酶。

隨後基於Tm值比較SEQ ID N°1或SEQ ID N°2之酯酶與本發明之酯酶。歸因於來自不同產生批次之相同蛋白質之實驗之間的高再現性，將0.8℃之∆Tm視為比較變異體之有效值。Tm值對應於至少3次量測之平均值。在84.7℃下評估SEQ ID N°1之酯酶之Tm。 結果 與 SEQ ID N°1 之酯酶相比在 pH 8 下增加之熱穩定性

根據實例3.6評估本發明之酯酶(變異體)之熱穩定性。以Tm值表示之結果概述於下表7中。括號中比哦是與SEQ ID N°1之酯酶相比Tm之增加。 表7：與之SEQ ID N°1相比在pH 8下本發明之酯酶之Tm

變異體	Tm
V3: L15V+R89L	85.5℃ (+0.8℃)

除表7中所列之取代之外，V3具有SEQ ID N°1之精確胺基酸序列。

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Claims (25)

1. 一種酯酶變異體，其(i)與SEQ ID N°1中所列之全長胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；(ii)具有相對於SEQ ID N°1的至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、D158C、T160C、R138K/D/E/L、N211F、S13L、A14Y及S206N；及/或在對應於選自以下之殘基的至少一個胺基酸位置處的個胺基酸取代：G7、S57、T136、E141、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191，其中該等位置係參考SEQ ID N°1中所列之胺基酸序列進行編號；(iii)具有聚酯降解活性；及(iv)與SEQ ID N°1之酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。
2. 如請求項1之酯酶變異體，其中該酯酶包含至少一個胺基酸取代，其選自V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、D158C、T160C、R138K/D/E/L、E141C/K/R、G171C、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180I/C/N/A/T/L及F250N/L/V/Y/A，較佳選自V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、R138K、E141C、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y/A ，更佳選自V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、R138K、E141C、N211F、S13L、A14Y及S206N，甚至更佳選自V219E、N243Y、L15Q、N211F、S13L、A14Y、S206N及R138K。
3. 如請求項1或2之酯酶變異體，其中該酯酶進一步包含在至少一個選自以下之位置處的至少一個取代：S1、Y4、Q5、R6、N9、P10、T11、R12、S13、A14、L15、T16、A17、D18、S22、T25、Y26、T27、V28、S29、R30、L31、S32、V33、S34、G35、F36、G37、G38、G39、Y43、S48、T50、G53、I54、M56、P58、G59、Y60、T61、A62、D63、A64、S65、S66、L67、A68、W69、L70、R72、R73、L74、L82、I84、N85、T86、N87、S88、R89、F90、D91、Y92、P93、D94、S95、R96、S98、Q99、A103、L104、N105、L107、R108、S113、L119、A121、N122、L124、A125、A127、G128、H129、M131、G132、G133、G134、G135、R138、A140、N143、S145、K147、A149、V150、L152、T153、P154、W155、H156、T157、D158、K159、T160、N162、S164、V167、L168、V170、A172、E173、A174、T176、V177、A178、P179、S181、Q182、H183、F187、Q189、N190、S193、T194、P196、V198、V200、L202、D203、N204、A205、S206、F208、A209、P210、N211、S212、N213、N214、A215、A216、I217、S218、V219、Y220、T221、S223、W224、M225、N231、T233、R236、Q237、F238、L239、N241、V242、N243、D244、P245、A246、L247、S248、T252、N253、N254、R255、H256。
4. 如前述請求項中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶包含選自以下之至少一個胺基酸取代或一個取代組合：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180L/I/C/N/A/T、F250N/L/V/Y/A、L15V + R89L、N204S + N105D、E141C + D158C、E141C + T160C、E141C + R138K/D/E/L、D158C + T160C、G171C + V180C、R138K/D/E/L及V219E + Q182E + R12E，較佳地為選自以下之至少一個取代或取代組合：V219E、N243Y、L15Q、N211F、S13L、A14Y、S206N、V180L/I/C/N/A/T、F250N/L/V/Y/A、L15V + R89L、N204S + N105D、E141C + R138K、R138K及V219E + Q182E + R12E。
5. 如請求項1至4中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶包含選自V219E、L15Q、N211F、S13L、A14Y、S206N、 V180L/I/C/N、F250N/L/V/Y及R138K之至少一個胺基酸取代或選自R138K + E141C及V219E + Q182E + R12E之至少一個取代組合，且與SEQ ID N°1之酯酶相比展現增加之比降解活性。
6. 如請求項1至4中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶至少包含胺基酸取代N243Y、F250L/A、V180A/T或至少包含取代組合N204S + N105D，且與SEQ ID N°1之酯酶相比，在24h之後或在96h之後展現增加之PET解聚合產率。
7. 如請求項1至4中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶至少包含取代組合L15V + R89L且展現增加之熱穩定性。
8. 如前述請求項中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶進一步包含至少一個、較佳至少兩個、至少三個、四個在選自以下之位置處之取代：F208、D203、S248、V170、Y92、G135、V167、Q182及N213，較佳地為至少包含選自以下之取代組合：D203C + S248C、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203C + S248C、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203C + S248C + V170I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + N213P + Q182E、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W  + D203K/R、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203K/R + V170I、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203K/R + V170I + Y92D/E/G、F208G/N/R/I/A/Q/L/S/M/T/E/W + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + N213P + Q182E，較佳選自D203C + S248C、F208I/W/M + D203C + S248C、F208I/W/M + D203C + S248C + V170I、F208I/W/M + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G、F208I/W/M + D203C + S248C + V170I + Y92D/E/G + N213P + Q182E、F208I/W/M + D203K/R + V170I、F208I/W/M + D203K/R + V170I + Y92D/E/G及F208I/W/M + D203K/R + V170I + Y92D/E/G + N213P + Q182E，更佳選自D203C + S248C、F208I/M + D203C + S248C、F208I/M + D203C + S248C + V170I、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G、F208I/M + D203C + S248C + V170I + Y92G + N213P + Q182E。
9. 如前述請求項中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶包含如SEQ ID N°1之酯酶中之至少一個選自S130、D175或H207之胺基酸殘基，較佳地包含如SEQ ID N°1之酯酶中之組合S130 + D175 + H207。
10. 如前述請求項中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶包含如SEQ ID N°1之酯酶中至少一個選自S130、D175、H207、C240或C275之胺基酸殘基，較佳地包含如SEQ ID N°1之酯酶中之組合S130 + D175 + H207 + C240 + C275。
11. 一種酯酶，其(i)與SEQ ID N°2中所列之全長胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；(ii)具有相對於SEQ ID N°2的至少一個選自以下之胺基酸取代：V219E、N204S、N243Y、L15V/Q、D158C、T160C、R138K/D/E/L、N211F、S13L、A14Y及S206N，及/或在對應於選自以下之殘基之至少一個胺基酸位置處的相對於SEQ ID N°1的一個胺基酸取代：G7、S57、T136、E141、I169、G171、V180、A184、I185、P186、Y188、E201、R234、D249、F250、R251、H77及L191，其中該等位置係參考SEQ ID N°2中所列之胺基酸序列進行編號；(iii)具有聚酯降解活性；及(iv)與SEQ ID N°2之酯酶相比展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。
12. 如請求項11之酯酶，其中該酯酶進一步包含如親本酯酶，如SEQ ID N°2中之殘基組合C203 + C248 + G92，尤其是殘基組合I208 + C203 + C248 + I170 + G92。
13. 如請求項11或12之酯酶，其中該酯酶具有至少一個胺基酸取代，其選自V219E、V180I/C/N/A/T/L/及F250N/L/V/Y/A，較佳選自V219E、V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y/A，更佳選自V180I/C/N/A/T及F250N/L/V/Y/A。
14. 如請求項11至13中任一項之酯酶，其中該酯酶具有選自V180I/C/N及F250N/V/Y/L之至少一個胺基酸取代，且與SEQ ID N°2之酯酶相比展現增加之比降解活性。
15. 如請求項11至13中任一項之酯酶，其中該酯酶具有選自V180A/T及F250A/L之至少一個胺基酸取代，且與SEQ ID N°2之酯酶相比，在24h之後展現增加之PET解聚合產率。
16. 如請求項11至15中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶與SEQ ID N°1之酯酶相比進一步展現增加之熱穩定性及/或增加之聚酯降解活性。
17. 如請求項11至16中任一項之酯酶變異體，其中該酯酶包含如SEQ ID N°1之酯酶中之至少一個選自S130、D175、H207、C240、C275、C203、C248之胺基酸殘基，較佳地包含如SEQ ID N°2之酯酶中之組合S130 + D175 + H207 + C240 + C275 + C203 + C248。
18. 一種核酸，其編碼如請求項1至17中任一項中所定義之酯酶。
19. 一種表現卡匣或載體，其包含如請求項18之核酸。
20. 一種宿主細胞，其包含如請求項18之核酸或如請求項19之表現卡匣或載體。
21. 一種組合物，其包含如請求項1至17中任一項之酯酶或如請求項20之宿主細胞或其具有酯酶活性之提取物。
22. 一種使聚酯或含聚酯材料之至少一種聚酯降解之方法，其包含： a. 使該聚酯或該含聚酯材料與如請求項1至17中任一項之酯酶或如請求項20之宿主細胞或如請求項21之組合物接觸；及視情況 b. 回收單體及/或寡聚物。
23. 如請求項22之方法，其中該聚酯係選自聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)、聚異山梨醇對苯二甲酸乙二酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚羥基烷酸酯(PHA)、聚丁二酸丁二酯(PBS)、聚丁二酸己二酸丁二酯(PBSA)、聚己二酸對苯二甲酸丁二酯(PBAT)、聚呋喃二甲酸乙二酯(PEF)、聚己內酯(PCL)、聚(己二酸乙二酯) (PEA)、聚萘二甲酸乙二酯(PEN)、「聚烯烴類」聚酯及此等材料中之至少兩者的任何摻合物/混合物，較佳為聚對苯二甲酸乙二酯。
24. 一種含聚酯材料，其含有如請求項1至17中任一項之酯酶或如請求項20之宿主細胞或如請求項21之組合物。
25. 一種清潔劑組合物，其包含如請求項1至17中任一項之酯酶或如請求項20之宿主細胞或如請求項21之組合物。