TW202332456A - 以經修飾之ｂ細胞來增強ｔ細胞活性之方法及組成物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於使用經基因修飾之B細胞用於增強非B細胞免疫細胞(諸如T細胞)的活性及功能之方法及組合療法。這些方法及組合可用於例如治療各種疾病及病症，其包括癌症、心臟病、發炎疾病、肌肉耗損疾病(muscle wasting disease)、神經系統疾病、及類似者。

Description

以經修飾之Ｂ細胞來增強Ｔ細胞活性之方法及組成物

本發明係關於使用經基因修飾之B細胞用於增強非B細胞免疫細胞(諸如T細胞)的活性及功能之方法及組合療法。

B細胞，也被稱為B淋巴細胞，係一種白血球，除此之外，也負責幫助身體抵抗感染及疾病。它們是我們適應性免疫系統的一部分，且能夠進行各種免疫反應，例如，對經辨識之抗原反應分泌抗體。此外，B細胞能夠呈現抗原，且也能分泌細胞介素。

許多B細胞成熟為漿細胞，其製造生能夠抵禦感染的抗體(蛋白質)。其他B細胞成熟為記憶B細胞。所有從單一B細胞所分化之漿細胞製造相同的抗體，該抗體係針對刺激其成熟的抗原。記憶B細胞的原理也是如此。因此，所有漿細胞及記憶細胞都"記得"導致其形成的刺激。B細胞，或B淋巴細胞，不為胸腺依賴性，具有短的壽命，且負責製造免疫球蛋白。參見例如https://www. medicinenet.com/script/main/art.asp?articlekey=2413。

B細胞表現表面版本之抗體，其具有抗原特異性。因此，B細胞可辨識細胞上的抗原，導致對抗原的攝入。B細胞受體結構提供在遇到抗原時，B細胞變為經活化，並進一步地，抗原係經內吞。抗原係被送至降解區室(degradation compartment)，在該處，抗原係經蛋白酶處理成片段，其中一些片段在移動至細胞表面前，與MHC II前驅體分子聯合。已負載胜肽之MHC II分子可被CD4 ⁺T細胞辨識，導致抗原特異性方式之T細胞活化。

B細胞顯然與患者的癌症治療的結果有關。例如，三級淋巴結構(TLS)的存在與較佳的患者結果有關。參見例如Helmink、B.A.等人，Nature, 2020, 577(7791), 549-555；Petitprez F等人，Nature, 2020, 577(7791), 556-560。TLS係免疫細胞(主要是T細胞及B細胞)的聚集，其產生以對免疫學刺激反應。雖然圍繞腫瘤細胞的TLS包括B細胞，但B細胞在抗腫瘤反應中的作用一直不清楚。在腫瘤中所發現的B細胞可製造抑制因子，其阻礙免疫細胞的功能。參見例如，Kessel, A.等人，Autoimmun Rev., 2012, 11(9), 670-677；Khan, A.R., 等人，Nature Commun., 2015, 6, 5997。進一步，目前的證據表明，在許多癌症的小鼠模式中，B細胞阻礙抗腫瘤反應。Affara, N.I., 等人，Cancer Cell, 2014, 25(6), 809-821；Shalapour, S.等人，Nature, 2017, 551, 340-345；Ammirante, M.等人，Nature, 2010, 464, 302-305。

T細胞，特別是嵌合抗原受體的T細胞(CAR-T)，已被證明針對一些造血腫瘤(hematopoietic tumor)有效。CAR-T係經設計以模擬天然T細胞受體元件的經工程之T細胞。在CAR-T細胞中，特異性抗原辨識元件，通常是scFv，係位於CAR-T的胞外域中，經錨定在跨膜域，接以一個或多個傳訊元件。共刺激分子經常包括在CAR構築體中，通常在胞外域、及/或跨膜域、及/或胞內域。一旦CAR-T細胞由同族抗原(cognate antigen)銜接(engage)，訊號係經傳導至細胞中，導致細胞溶解程序的活化，並最終導致標靶細胞死亡。CAR-T細胞必須長期維持在宿主中，以消除腫瘤細胞，並保持持續監控。儘管在血液惡性腫瘤有進展，但CAR-T細胞也有某些缺點，例如，迄今為止，它們經證明對實性腫瘤相對無效。

針對利用T細胞療法(諸如併用經工程化之B細胞之治療)以治療各種疾病及病症的經改善之治療存有需求，疾病及病症包括癌症、心臟病、發炎疾病、肌肉耗損疾病(muscle wasting disease)、神經系統疾病、及類似者。

現在已經發現，B細胞(包括但不限於在本文中的CAR-B細胞)可用來增強T細胞療法。例如，根據本發明，已經發現經修飾之CAR B細胞呈現抗原並活化CD4 ⁺及CD8 ⁺T細胞。此外，已經發現此效果可藉由共同表現CD80來增強。

在某些實施態樣中，本發明係關於治療患者之方法，其包含將有效量之下列者投予該患者：(i)複數個分離之T細胞，及(ii)有效量的複數個分離之經修飾之B細胞(isolated modified B cell)：其中該分離之經修飾之B細胞能夠表現嵌合受體(CAR-B)，並且其中該嵌合受體包含： a)胞外域，其中該胞外域包含胞外結合域及鉸鏈域； b)跨膜域；及 c)胞質域，其包含至少一個傳訊域。

在某些實施態樣中，該分離之T細胞及該CAR-B細胞按順序或同時投予。在某些實施態樣中，該胞外結合域辨識至少一種表現於標靶細胞表面上之抗原或蛋白質。

在一些實施態樣中，該胞外結合域辨識至少一種抗原，其係分泌性蛋白。

在某些實施態樣中，該標靶細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、血球細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、內皮細胞、肝細胞、肺上皮細胞、及纖維母細胞。

在一些實施態樣中，該B細胞表現多於一個CAR-B受體構築體。

在某些實施態樣中，該胞外結合域係單鏈可變片段(scFv)，或全長抗體或抗體片段，或受體或配體的胞外域。在一些實施態樣中，該胞外結合域能夠與選自由下列所組成之群組之抗原或蛋白質結合：PSMA、GPC3、ASGR1、ASGR2、肌膜蛋白聚醣(Sarcoglycan)、Corin、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1、LAF-1、及Her2。

在某些實施態樣中，該胞質域包含選自由下列所組成之群組之域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ及BLNK。

在一些實施態樣中，該胞質域包含CD79a。在一些實施態樣中，該分離之經修飾之B細胞能夠表現及分泌負載藥物(payload)，其中該負載藥物係(i)不天然表現於B細胞中，抑或(ii)以高於天然表現於B細胞中的量來表現。在一些態樣中，該負載藥物可係抗體或其片段。在本發明之某些態樣中，該負載藥物係至少一個選自細胞介素、趨化介素、T細胞共刺激分子、及檢查點分子之負載藥物，該群組由以下組成：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT (TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗體、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD86、CD40L、IFNα A2、LIGHT、4-1BBL、MDGF(C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白(agrin)、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗體、抗TGF-β抗體；TGF-β阱(trap)、誘餌(decoy)或其他抑制分子；抗BMP抗體；BMP阱、誘餌或其他抑制分子。

在某些實施態樣中，該分離之經修飾之B細胞係腫瘤內、靜脈內、皮下、皮內、或於發炎病灶內投予。在某些實施態樣中，該方法進一步包含具有或未有另外化學治療劑下，將一種或多種檢查點抑制劑投予該患者。

在其他態樣中，本發明係關於治療患者之方法，其包含將有效量之下列者投予該患者：(i)複數個分離之非B細胞經修飾之免疫細胞，及(ii)有效量的複數個分離之經修飾之B細胞；其中該分離之經修飾之B細胞能夠表現嵌合受體(CAR-B)，並且其中該嵌合受體包含： a)胞外域，其中該胞外域包含胞外結合域及鉸鏈域； b)跨膜域；及 c)胞質域，其包含至少一個傳訊域。

在某些實施態樣中，該非B細胞經修飾之免疫細胞係CAR-T細胞、TIL、及TCR細胞中的至少一者。在某些實施態樣中，該胞外結合域辨識至少一種表現於標靶細胞表面上之抗原或蛋白質。

在某些實施態樣中，該胞外結合域辨識至少一種抗原，其係分泌性蛋白。在某些態樣中，該標靶細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、血球細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、內皮細胞、肝細胞、肺上皮細胞、及纖維母細胞。

在某些實施態樣中，本發明係關於一種組合療法，其包含： 分離之經修飾之非B細胞免疫細胞，及分離之經修飾之B細胞，其能夠表現嵌合受體，其中該嵌合受體包含： a)胞外域，其中該胞外域包含胞外結合域及鉸鏈域； b)跨膜域；及 c)胞質域，其包含至少一個傳訊域， 其中該經修飾之B細胞係視需要進一步能夠表現負載藥物。在某些實施態樣中，該負載藥物包含CD80、或CD86中的至少一者。

在某些實施態樣中，該非B細胞經修飾之免疫細胞係CAR-T細胞、TIL、及TCR細胞中的至少一者。

根據本發明，開發一種3組分系統(3-component system)，其包含CAR B細胞，其與特定抗原來源(抗原呈現細胞，或APC)及抗原特異性T細胞共培養。

如下所述，B細胞受體(BCR)在B細胞中的傳訊的結果不僅導致抗體的分泌，而且還導致經由B胞內的處理而呈現來自標靶抗原的抗原片段。Wennhold及同事以及Kitamura提出的資料表明，疫苗誘導的抗原特異性B細胞過繼轉移到帶有腫瘤小鼠時具有抗腫瘤利益。事實上，抗原呈現可在促進抗腫瘤T細胞反應中起作用。現在已經發現，抗原呈現是CAR B介導的抗腫瘤活性的作用機制。

CAR-B細胞可與其他攜帶CAR的細胞類型共同轉移，以增強其活性和持續性。此種細胞可包括T細胞、NK細胞及骨髓(單核球/巨噬細胞)細胞。大多數CAR經由scFv樣結構辨識抗原，導致傳訊傳遞，促進細胞溶解或吞噬活性。這些帶有CAR的細胞可藉由提供CAR-B細胞衍生的細胞介素而得到強化，從而導致傳訊和持續性的改善。這可例如用小鼠CAR T細胞與CAR B細胞共同處理帶有同源腫瘤(syngeneic tumor)的免疫勝任宿主(immune competent host)來證實。例如，CAR B細胞的抗原特異性可與CAR T相同。另外，它也可以是不同的，儘管最大的好處是在相同腫瘤細胞中所表現的標靶。此外，針對腫瘤細胞上的MHC/胜肽複體的CAR細胞，可藉由呈現相同的胜肽來活化，這些胜肽是源自在CAR B細胞中攝入抗原後的處理。

使用但不限於mRNA電穿孔、重組腺病毒轉導、CRISPR編輯方法或其組合，CAR B細胞可經工程化以表現CAR及負載藥物構築體。

現在還發現，經工程化之B細胞可在治療本文所述的各種疾病和病症中具有療效。因此，本發明關於能夠活化或增強T細胞活性的分離之經修飾之B細胞。適合的T細胞類型包括CAR-T、TIL、TCR，及類似者。

CD79(也被稱為"分化簇79")是一種跨膜蛋白，其與B細胞受體形成複體，且能夠在B細胞受體辨識抗原後產生傳訊。參見Chu PG, Arber DA (June 2001); CD79: a review; Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (2): 97-106. doi:10.1097/00022744-200106000-00001. PMID 11396639。亦參見https://en.wikipedia.org/ wiki/CD79。CD79包含二條不同的鏈，稱為CD79a及CD79b(也被稱為Igα和Igβ)。CD79a和CD79b都是免疫球蛋白超家族的成員。它們在B細胞表面形成異二聚體，藉由二硫鍵穩定。兩條CD79鏈在其胞內尾部區域都含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體("ITAM")，在B細胞中傳遞訊息。參見Müller B, Cooper L, Terhorst C (Jan. 1995), Interplay between the human TCR/CD3 epsilon and the B-cell antigen receptor associated Ig-beta (B29); Immunology Letters. 44 (2-3): 97-103. doi:10.1016/0165-2478(94)00199-2. PMID 7541024。

已發現，當CD79a(免疫球蛋白-α)被併入本發明之CAR-B構築體的胞內傳訊域時，表現出比CD79b(免疫球蛋白-β)更優越的品質。此外，還進一步發現，當用於本文所述的CAR-B構築體時，胞內CD79b(免疫球蛋白-β)顯示在療效未有(甚至是負)影響。因此，本發明尤其係關於包含CD79a胞內傳訊域的CAR-B構築體。

在某些實施態樣中，本發明關於一種分離之經修飾之B細胞("CAR-B細胞")，其能夠表現嵌合受體("CAR-B受體")，其中該嵌合受體包含(a)胞外域；(b)跨膜域；及(c)胞質域，其包含至少一個傳訊域。該胞質域較佳的是包含CD79a。在各種實施態樣中，該胞外域包含胞外結合域及鉸鏈域。在各種實施態樣中，該胞外結合域辨識至少一種表現於標靶細胞表面上之抗原或蛋白質。在各種實施態樣中，該標靶細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、血球細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、及內皮細胞。在各種實施態樣中，該B細胞表現多於一個CAR-B受體構築體。在各種實施態樣中，該CAR-B受體包含多於一個胞外結合域。在各種實施態樣中，該胞外結合域係單鏈可變片段(scFv)，或全長抗體，或受體或配體的胞外域。在各種實施態樣中，該胞外結合域能夠與選自由下列所組成之群組之抗原或蛋白質結合：PSMA、GPC3、ASGR1、ASGR2、肌膜蛋白聚醣(Sarcoglycan)、Corin、FAP(纖維母細胞活化蛋白)及Her2。在各種實施態樣中，該鉸鏈域係衍生自由IgG、CD28及CD8組成的群組。在各種實施態樣中，該鉸鏈域係包含選自由SEQ ID No: 27、29、31所組成之群組之核酸序列。在各種實施態樣中，該胞質域包含至少一個源生於(native to)B細胞受體的傳訊域。在各種實施態樣中，該胞質域包含選自由下列所組成之群組之域：CD79a (免疫球蛋白α)、CD79b (免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ及BLNK。在各種實施態樣中，該胞質域包含進一步包含共刺激域。

在各種實施態樣中，本發明包含分離之經修飾之B細胞，其中該B細胞能夠表現及分泌負載藥物(payload)，其中該負載藥物係不天然表現於B細胞中，抑或以高於天然表現於B細胞中的量來表現。在各種實施態樣中，該負載藥物係抗體或其片段。在各種實施態樣中，該抗體係是分泌抗體(secreted antibody)，並可包括阻斷抗體(blocking antibody)(例如抗PD-1)或促效抗體(抗CD137、GITR、OX40)，該等抗體係經設計以含有原態或經工程化之Fc區域，且可是可溶性的或與膜結合的。在各種實施態樣中，該負載藥物可為免疫調節劑，諸如趨化介素或細胞介素。在各種實施態樣中，該負載藥物係選自由下列所組成之群組：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL18、IL-21、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗體、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD86、CD40L、IFNα A2、LIGHT、4-1BBL、MDGF (C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白(agrin)、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗體、抗TGF-β抗體；TGF-β阱(trap)、誘餌(decoy)或其他抑制分子；抗BMP抗體；BMP阱、誘餌或其他抑制分子。在各種實施態樣中，B細胞能夠表現多於一個種負載藥物。在各種實施態樣中，該B細胞能夠表現多於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個負載藥物。

在各種實施態樣中，本發明係關於治療患者之方法，其包含投予本發明之經修飾之B細胞。在各種實施態樣中，該經修飾之B細胞係腫瘤內、靜脈內、皮下、或皮內投予。在各種實施態樣中，該方法進一步包含投予檢查點抑制劑。在各種實施態樣中，該檢查點抑制劑係選自由下列所組成之群組之檢查點分子：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3及NKG2A蛋白。在各種實施態樣中，該檢查點抑制劑係單株抗體。

在各種實施態樣中，本發明關於分離之經修飾之B細胞，其能夠表現嵌合受體，其中該嵌合受體包含(a)胞外域，其中該胞外域包含胞外結合域及鉸鏈域；(b)跨膜域；及(c)胞質域，其包含至少一個傳訊域，其中該經修飾之B細胞係進一步能夠表現負載藥物，其中該負載藥物係不天然表現在細胞的表面上。在各種實施態樣中，該胞外結合域辨識表現於標靶細胞表面上之抗原或蛋白質。在各種實施態樣中，該標靶細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、血球細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚細胞及內皮細胞。在各種實施態樣中，該B細胞表現多於一個CAR-B受體構築體。在各種實施態樣中，該CAR-B受體包含多於一個胞外結合域。在各種實施態樣中，該胞外結合域係單鏈可變片段(scFv)、抗體、或受體或配體的胞外域。在各種實施態樣中，該胞外結合域能夠與選自由下列所組成之群組之抗原或蛋白質結合：PSMA、GP3、ASGR1、ASGR2、肌膜蛋白聚醣、Corin、FAP及Her2。在各種實施態樣中，該鉸鏈域係衍生自由IgG、CD28及CD8組成的群組。在各種實施態樣中，該鉸鏈域係包含選自由SEQ ID No: 27、29、及31所組成之群組之核酸序列。在各種實施態樣中，該胞質域包含至少一個源生於(native to)B細胞的傳訊域。在各種實施態樣中，該胞質域包含選自由下列所組成之群組之域：CD79a (免疫球蛋白α)、CD79b (免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ及BLNK。在各種實施態樣中，該胞質域包含進一步包含共刺激域。在各種實施態樣中，該負載藥物係分泌抗體或與膜結合之抗體或其片段。在各種實施態樣中，該負載藥物係選自由下列所組成之群組：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗體、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD86、CD40L、IFNα A2、LIGHT、4-1BBL、MDGF (C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白(agrin)、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗體、抗TGF-β抗體；TGF-β阱(trap)、誘餌(decoy)或其他抑制分子；抗BMP抗體；BMP阱、誘餌或其他抑制分子。在各種實施態樣中，B細胞能夠表現多於一個種負載藥物。在各種實施態樣中，該B細胞能夠表現多於1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個負載藥物。在各種實施態樣中，該經修飾之B細胞進一步編碼至少一種選自由下列所組成之群組之蛋白質：CD79a、CD79b、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、CD3ζ及MyD88之胞質域。在各種實施態樣中，本發明係關於治療患者之方法，其包含投予該經修飾之B細胞。在各種實施態樣中，該方法進一步包含投予檢查點抑制劑。在各種實施態樣中，該檢查點抑制劑係選自由下列所組成之群組之對一個或多個檢查點分子的抑制劑：PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3及NKG2A。在各種實施態樣中，該檢查點抑制劑係單株抗體。在各種實施態樣中，本發明關於一種分離之經修飾之B細胞，其能夠表現嵌合受體，其中該嵌合受體包含胞外域，其中該胞外域包含鉸鏈域及胞外結合域，其中該胞外結合域係不天然表現在B細胞上；且其中該胞外結合域能夠辨識所關注之標靶。在各種實施態樣中，該結合域係單鏈可變片段(scFv)、抗體、配體或受體。在各種實施態樣中，該結合域係scFv。在各種實施態樣中，該結合域係受體、配體或其片段。在各種實施態樣中，該B細胞進一步能夠表現負載藥物。在各種實施態樣中，本發明包含治療患者之方法，其包含將該經修飾之B細胞投予患者。

在各種實施態樣中，本發明包含能夠表現嵌合B細胞受體之核酸，其中該嵌合受體包含：(a)胞外域，其中該胞外域包含至少一個胞外結合域及鉸鏈域；(b)跨膜域；及(c)胞質域，其包含至少一個傳訊域。在各種實施態樣中，該胞外結合域，辨識表現於標靶細胞表面上之抗原或蛋白質。在各種實施態樣中，該胞外結合域係單鏈可變片段(scFv)、抗體、受體或配體。在各種實施態樣中，該標靶細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、血球細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚細胞及內皮細胞。在各種實施態樣中，該載體表現多於一個CAR-B受體。在各種實施態樣中，該CAR-B受體表現多於一個胞外結合域。在各種實施態樣中，該胞外結合域能夠與選自由下列所組成之群組之抗原或蛋白質結合：PSMA、GP3、ASGR1、ASGR2、肌膜蛋白聚醣、Corin、Her2、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1、及LFA-1。在各種實施態樣中，該鉸鏈域係衍生自由IgG、CD28及CD8組成的群組。在各種實施態樣中，該鉸鏈域係包含選自由SEQ ID No: 27、29、及31所組成之群組之核酸序列。在各種實施態樣中，該胞質域包含至少一個源生於(native to)B細胞受體的傳訊域。在各種實施態樣中，該胞質域包含選自由下列所組成之群組之域：CD79a (免疫球蛋白α)、CD79b (免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ及BLNK。在各種實施態樣中，該胞質域包含進一步包含共刺激域。

在各種實施態樣中，本發明係關於一種載體，其包含能夠表現嵌合B細胞受體之核酸，其中該嵌合受體包含：(a)胞外域，其中該胞外域包含至少一個胞外結合域及鉸鏈域；(b)跨膜域；及(c)胞質域，其包含至少一個傳訊域。在各種實施態樣中，該胞外結合域辨識抗原或蛋白質。在各種實施態樣中，該標靶細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、血球細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚細胞及內皮細胞。在各種實施態樣中，該載體表現多於一個CAR-B受體。在各種實施態樣中，該CAR-B表現多於一個胞外結合域。在各種實施態樣中，該胞外結合域係單鏈可變片段(scFv)、抗體、受體或配體。在各種實施態樣中，該胞外結合域能夠與選自由下列所組成之群組之抗原或蛋白質結合：PSMA、GPC3、ASGR1、ASGR2、肌膜蛋白聚醣、Corin、Her2、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1、及LFA-1。在各種實施態樣中，該鉸鏈域係衍生自由IgG、CD28及CD8組成的群組。在各種實施態樣中，該鉸鏈域係包含選自由SEQ ID No: 27、29、及31所組成之群組之核酸序列。在各種實施態樣中，該胞質域包含至少一個源生於(native to)B細胞的傳訊域。在各種實施態樣中，該胞質域包含選自由下列所組成之群組之傳訊域：CD79a (免疫球蛋白α)、CD79b (免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ及BLNK。在各種實施態樣中，該胞質域包含進一步包含共刺激域。在各種實施態樣中，該胞質區域係包含多個、2個或更多個域，其係相同抑或獨特。

在各種實施態樣中，本發明關於一種分離之經修飾之B細胞，其能夠表現整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、受體、或其組合，其中該整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、或受體係不天然表現於B細胞中，或以高於天然表現於B細胞中的量來表現；且其中該整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、受體、或其組合係經吸引至所關注之位點或標靶。在各種實施態樣中，該整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、及受體係選自CLA (PSGL-1醣型(Glycoform))、CLA (PSGL-1醣型)、CCR10、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR9、CD43E、CD44、c-Met、CXCR3、CXCR4、LFA-1、LFA-1(αLβ2)、選滯蛋白配體(selectin ligand)、VLA-4、VLA-4(α4β1)、及α4β7，或其組合。在各種實施態樣中，所關注之位點係歸巢或標靶組織、特定位置或組織的發炎位點、或腫瘤或腫瘤微環境，其中負載藥物遞輸係有利的。在各種實施態樣中，歸巢或標靶組織係選自皮膚、腸道(小腸、結腸、腸繫膜淋巴結(mLN)、派亞氏斑(PP)、小腸)、肝、肺、骨髓、心、周邊淋巴結(LN)、CNS、胸腺、及骨髓。在各種實施態樣中，所關注之標靶係選自CXCL16、CCL17、CCL17(22)、CCL20(MIP-3α)、CCL21、CCL25、CCL27、CCL28、CCL4、CCL5、CD62E、CD62P、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL16、CXCL9/CXCL10、CXCR3、E/P-選滯蛋白、E-選滯蛋白、GPR15L、HGF、玻尿酸、ICAM-1、CCR1、2、5配體、MAdCAM、MAdCAM-1、PNAd、VAP-1、VCAM、及VCAM-1，或其組合。在各種實施態樣中，該方法包含藉由投予該經分離修飾之B細胞來治療患者。在各種實施態樣中，該方法涉及進一步投予化合物或其衍生物，其中該化合物或其衍生物能夠增加整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、受體、或其組合的表現。在各種實施態樣中，該化合物或其衍生物能夠改變患者的B細胞運輸至所關注之位點或標靶。在各種實施態樣中，該化合物是全反式視網酸(ATRA)或其衍生物。

在各種實施態樣中，本發明關於一種分離之經修飾之B細胞，其能夠表現免疫抑制分子，其中該免疫抑制分子係不天然表現於B細胞中，或以高於天然表現於B細胞中的量來表現。在各種實施態樣中，該免疫抑制分子係選自IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3、及TIM-3，或其組合。在各種實施態樣中，該免疫抑制分子係能夠降低患者的所關注之位點或標靶的B細胞的發炎及自體免疫活性。在各種實施態樣中，本發明係關於治療患者之方法，其包含投予該分離之經修飾之B細胞。在各種實施態樣中，該免疫抑制分子係選自IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3、及TIM-3，或其組合。在各種實施態樣中，該免疫抑制分子係能夠降低該患者的所關注之位點或標靶的B細胞的發炎及自體免疫活性。在各種實施態樣中，本發明涉及進一步投予化合物或其衍生物，其能夠增加B細胞中的整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、受體、或其組合的表現。在各種實施態樣中，該化合物或其衍生物能夠改變患者的B細胞運輸至所關注之位點或標靶。在各種實施態樣中，該化合物是全反式視網酸(ATRA)或其衍生物。在各種實施態樣中，本發明涉及一種分離之經修飾之B細胞，其中該分離之經修飾之B細胞係以化合物或其衍生物來處理，其中該化合物或其衍生物能夠增加B細胞中的整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、受體、或其組合的表現。在各種實施態樣中，該化合物或其衍生物能夠改變患者的B細胞運輸至所關注之位點或標靶。在各種實施態樣中，該化合物是全反式視網酸(ATRA)或其衍生物。在各種實施態樣中，該化合物或其衍生物能夠(i)增加B細胞中的整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、受體、或其組合的表現，及(ii)改變患者的B細胞運輸至所關注之位點或標靶。在各種實施態樣中，該化合物是全反式視網酸(ATRA)或其衍生物。

在各種實施態樣中，本發明關於一種分離之經修飾之B細胞，其能夠表現至少一種或多種持續性活性類鐸受體(TLR)，其中該TLR係不天然表現於B細胞中，或以高於天然表現於B細胞中的量來表現。在各種實施態樣中，該TLR係選自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、及TLR13，或其組合。在各種實施態樣中，該TLR能夠強化B細胞以供增加患者的免疫反應。在各種實施態樣中，該TLR能夠製造強效的效應B細胞(effector B cell)以供增加患者的免疫反應。在各種實施態樣中，該免疫抑制分子係能夠降低患者的所關注之位點或標靶的B細胞的發炎及自體免疫活性。在各種實施態樣中，該TLR係選自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、及TLR13，或其組合。在各種實施態樣中，該TLR能夠(i)強化B細胞，及(ii)製造強效的效應B細胞，以供增加患者的免疫反應。在各種實施態樣中，至少一種或多種的TLR促效劑係經投予至該患者。在各種實施態樣中，該分離之經修飾之B細胞係以至少一種或多種的TLR促效劑來處理。在各種實施態樣中，該TLR促效劑能夠(i)強化B細胞，及(ii)製造強效的效應B細胞，以供增加患者的免疫反應。在各種實施態樣中，該TLR促效劑結合至一或多種選自下列之TLR ：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、及TLR13，或其組合。在各種實施態樣中，該TLR促效劑係選自富含C pG的寡核苷酸、雙股RNA模擬物、聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)。在各種實施態樣中，該TLR促效劑包含CpG寡核苷酸。在各種實施態樣中，該TLR促效劑能夠(i)強化B細胞，及(ii)製造強效的效應B細胞，以供增加該患者的免疫反應。在各種實施態樣中，該TLR促效劑結合至一或多種選自下列之TLR：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12、及TLR13，或其組合。在各種實施態樣中，該TLR促效劑係選自富含CpG的寡核苷酸、雙股RNA模擬物、聚肌苷酸：聚胞苷酸(聚I：C)。在各種實施態樣中，該TLR促效劑包含CpG寡核苷酸。

在各種實施態樣中，本發明關於一種分離之經修飾之B細胞，其中該B細胞係經mRNA電穿孔，該mRNA編碼至少一種或多種抗原，其經融合至靶向訊息(靶向訊息(靶向signal)。在各種實施態樣中，該抗原係(i)不天然由B細胞所呈現，(ii)並非天然同時由B細胞呈現在HLA I類及II類分子兩者，或(iii)並非天然由B細胞以高效率呈現於HLA I類及II類分子兩者。在各種實施態樣中，該靶向訊息係溶體蛋白之靶向訊息。在各種實施態樣中，該靶向訊息係溶體相關膜蛋白-1(LAMP1)之靶向訊息。在各種實施態樣中，該抗原能夠經靶向至溶體且同時並有效率呈現於HLA I類及II類分子兩者。在各種實施態樣中，該B細胞能夠增加患者的抗原特異性免疫反應。在各種實施態樣中，該抗原係(i)不天然由B細胞所呈現，(ii)並非天然同時由B細胞呈現在HLA I類及II類分子兩者，或(iii)並非天然由B細胞以高效率呈現於HLA I類及II類分子兩者。在各種實施態樣中，該靶向訊息係溶體蛋白之靶向訊息。在各種實施態樣中，該靶向訊息係溶體相關膜蛋白-1(LAMP1)之靶向訊息。在各種實施態樣中，該抗原能夠經靶向至溶體且同時並有效率呈現於HLA I類及II類分子兩者。在各種實施態樣中，該B細胞能夠增加患者的抗原特異性免疫反應。

本發明關於利用本文所述的經工程化之B細胞增強T細胞療法。這些T細胞療法可為自體的或同種異體的。

經工程化之B細胞可與各種T細胞療法一起使用(例如共同投予)、或用於增強T細胞的功能。此等T細胞療法可針對例如CD19、CD20、CD22、BCMA、CD123、PSMA、CLL-1、Her2、Her3、EGFR、ANG2、HGF、TNF、c-Met、IL-13、及類似者的至少一者(或組合)。

此種T細胞療法的實例包括但不限於：tisagenlecleucel (tisa-cel, Kymriah®)、axicabtagene ciloleucel (axi-cel, Yescarta®)、brexucabtagene autoleucel (brexu-cel, Tecartus®)、lisocabtagene maraleucel (liso-cel, Breyanzi®)、idecabtagene vicleucel (ide-cel, Abecma®)。可以理解的是，本文所述的方法及組合可進一步與T細胞受體(TCR)療法結合起來使用。

各種類型的各種CAR的清單係列於下面的多個表格中。這些可見於https://bluematterconsulting.com/ 2021-outlook-cell-based-therapies-in-oncology/)，其全部內容以引用方式併入。例如，一些同種異體細胞療法目前正在開發中，其包括但不限於：

另外的靶向BCMA針對例如多發性骨髓瘤的細胞療法包括但不限於：

另外的細胞療法包括：

另外的T細胞療法包括：

另外的在美國近期發明中的CAR-T細胞療法包括：

如所述，上述清單可在以下網站上找到更詳細的內容 https://bluematterconsulting.com/2021-outlook-cell-based-therapies-in-oncology/ 。

在本文中所揭示之發明進一步關於經工程化或經修飾之B細胞的數種實施態樣： 1.   使用例如結合域，諸如scFv、抗體、配體、受體、或其片段，已經修飾成歸巢至所關注之位點/標靶之B細胞； 2.   經修飾之B細胞，具有歸巢域，其進一步包含活化域、及視需要之共刺激域，從而使B細胞在與所欲標靶交互作用時可歸巢及活化； 3.   經工程處理以能夠產生合需之蛋白質負載藥物，諸如抗體、治療性蛋白質、多肽、核酸序列(例如RNAi)，等之B細胞； 4.   經工程處理之包含歸巢/結合域、活化域、可選擇之共刺激域的經工程處理之B細胞，其進一步經工程處理以表現合需之蛋白質負載藥物，諸如抗體、治療性蛋白質、多肽、核酸序列(諸如RNAi)，等； 5.   已經過修飾以表現整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質或受體之B細胞，此使得該B細胞被吸引至在特定部位之特定配體、趨化因子或引誘劑/所欲標靶(例如歸巢組織處)，且可藉此歸巢至所欲之部位/標靶，例如以遞送合需之負載藥物； 6.   已經過修飾以表現免疫抑制分子之B細胞，從而使該定位於所欲部位/標靶之B細胞的發炎和自體免疫活性降低，從而導致正向治療反應； 7.   已使用化合物或其衍生物處理之B細胞，從而藉由表現特定之B細胞整聯蛋白和/或歸巢受體來改變該等B細胞之運輸； 8.   已(i)使用Toll樣受體(TLR)促效劑處理和/或(ii)經工程處理以表現組成上活性之TLR的B細胞，以增強B細胞和/或產生有效之效應B細胞以增加個體之免疫反應； 9.   已使用編碼特定之所欲抗原的mRNA進行電穿孔之B細胞，該mRNA係與溶酶體蛋白之靶向信號融合，從而使該等B細胞可同時且有效地將所欲之特定抗原和/或抗原衍生之表位呈遞在HLA第I類和第II類分子中； 10.  已使用編碼上述第1至9部分中提及之任何項目的自行擴增RNA進行電穿孔的B細胞。

應理解的是，本申請案之經工程處理或修飾之B細胞的各種實施態樣並不交互排斥，且除非明確指出，可以任何方式彼此組合，而無任何限制，以實現促進本文考慮之任何結果和/或治療反應。

腫瘤抗原。在某些實施態樣中，所關注之位點/標靶係腫瘤抗原。本發明之抗原結合域(部分)的選擇將取決於待治療之特定癌症類型。一些腫瘤抗原可能為與膜結合的，而其他可能為分泌型的。例如，腫瘤抗原可能分泌出並積聚在胞外基質中，或者該腫瘤抗原可能以MHC複合物之一部分表現。腫瘤抗原為本技藝所周知且可包括，例如CD19、KRAS、HGF、CLL、與神經膠質瘤相關之抗原、癌胚抗原(CEA)；β-人絨毛膜促性腺激素、α胎兒蛋白(AFP)、凝集素(lectin)反應性AFP、甲狀腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2(AS)、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、蛋白質、PSMA、Her2/neu、生存素(survivin)和端粒酶(端粒酶)、前列腺癌腫瘤抗原1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒細胞彈性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰島素生長因數(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受體、間皮素(中皮素)、EGFR、BCMA、KIT和IL-13。

傳染病抗原。於某些實施態樣中，所欲之部位/標靶為針對可能需要免疫反應之傳染病抗原。傳染病抗原為本技藝所周知且可包括，但不限於病毒、細菌、原生生物和寄生蟲抗原，諸如寄生蟲、真菌、酵母菌、支原體、病毒蛋白、細菌蛋白和碳水化合物，以及真菌蛋白和碳水化合物。另外，傳染病抗原之傳染病類型並無特別限定，可包括，但不限於病毒性傳染病中之頑固性疾病，諸如AIDS、B型肝炎、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)(EBV)感染、HPV感染、HCV感染，SARS、SARS-CoV2等。寄生蟲抗原可包括，但不限於瘧原蟲孢子體蛋白。

於某些實施態樣中，該等經修飾之B細胞表現經工程處理之B細胞受體(CAR-B)，該B細胞受體(CAR-B)包含胞外域、跨膜域和胞內域。於某些實施態樣中，該胞外域包含結合域和鉸鏈域。於某些實施態樣中，該胞外域包含結合域，諸如scFv、配體、抗體、受體或其片段，其允許該經修飾之B細胞藉由與表現在那些細胞表面上之蛋白質結合來靶向特定之靶細胞。於某些實施態樣中，該經修飾之腫瘤細胞靶向表現在腫瘤細胞表面上之蛋白質/抗原並與其結合。於某些實施態樣中，該經修飾之B細胞進一步表現負載藥物。於某些實施態樣中，該負載藥物能夠增加腫瘤中之交叉呈遞的樹突細胞(DC)之數量。於某些實施態樣中，該負載藥物能夠活化並吸引T細胞進入腫瘤中。於某些實施態樣中，該負載藥物能夠促進腫瘤中之三級淋巴結構(TLS)的形成。於本發明之某些實施態樣中，該經修飾之B細胞表現CAR-B和負載藥物二者。於某些實施態樣中，該CAR-B包含刺激性域，當其與表現在腫瘤細胞表面上之抗原或蛋白質結合時會活化該負載藥物之表現。 B 細胞中之嵌合抗原受體 (CAR-B) 的設計和域取向

於各種實施態樣中，本發明提供嵌合B細胞受體(CAR-B)。應瞭解的是，嵌合B細胞受體(CAR-B)為經遺傳工程處理之受體。根據本技藝已知之技術，這些經工程處理之受體可輕易地插入B細胞中並由B細胞表現。藉由CAR-B可對單一受體進行編程以識別表現在腫瘤細胞上之特定蛋白質或抗原，且當與該蛋白質或抗原結合時可引發抗腫瘤反應。於各種實施態樣中，該CAR-B係部分作為歸巢機制以將B細胞遞送至標靶組織。

應瞭解的是，相對於攜帶該受體之細胞，本發明之嵌合B細胞受體將包含胞外域(其將包含抗原結合域並可包含胞外信號傳導域和/或鉸鏈域)、跨膜域和胞內域。該胞內域包含至少一個活化域，其較佳為由CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a和/或MyD88所組成。應進一步理解的是，該抗原結合域係經工程處理，從而使其位於該分子/構築體之胞外部分，從而能夠識別並與其標靶或標靶們結合。

在結構上，應理解的是，這些域對應於和該免疫細胞相關之位置。根據本發明之示例性CAR-B構築體列於表1中：

於各種實施態樣中，嵌合B細胞受體係由胞外域、跨膜域和胞質域組成。於各種實施態樣中，該胞質域包含活化域。於各種實施態樣中，該胞質結構亦可包含共刺激域。於各種實施態樣中，該胞外域包含抗原結合域。於各種實施態樣中，該胞外域進一步包含介於該抗原結合域與跨膜域之間的鉸鏈區。圖1提供本發明各種實施態樣的嵌合B細胞受體的示意圖。

胞外域。本發明可使用之胞外域有許多。於各種實施態樣中，該胞外域包含抗原結合域。於各種實施態樣中，該胞外域亦可包含鉸鏈區和/或信號傳導域。於各種實施態樣中，該含有IgG1恆定域之胞外域亦可包含IgG1(孔)或IgG1(鈕)以促進定向之CAR-B形成。

抗原結合域及結合域。如本文所使用者，“抗原結合域”、“抗原-結合域”或“結合域”係指該B-CAR能與表現在細胞表面上之抗原或蛋白質結合的一部分。於一些實施態樣中，該抗原-結合域與涉及過度增殖性疾病之細胞上的抗原或蛋白質結合。於較佳之實施態樣中，該抗原-結合域與表現在腫瘤細胞表面上之抗原或蛋白質結合。該抗原-結合分子可鑑於下列定義和描述進一步理解。

當該解離常數(K _d)為1x10 ^-7M時，抗原結合域被稱為與其標靶抗原或蛋白質“特異性結合”。當該K _d為1至5x10 ^-9M時，該抗原結合域以“高親和力”與抗原特異地結合，而當該K _d為1至5x10 ^-10M時，該抗原結合域以“非常高之親和力”與抗原特異地合結。於一實施態樣中，該抗原結合域之K _d為10 ^-9M。於一實施態樣中，該解離速率＜1x10 ^-5。於其他實施態樣中，該抗原結合域將以介於約10 ^-7M至10 ^-13M之間的K _d與抗原或蛋白質結合，且再於另一實施態樣中，該抗原結合域將以1.0至5.0x ¹⁰之K _d結合。

當抗原結合域與一個標靶的結合較與第二個標靶的結合更緊密時，該抗原結合域被稱為“選擇性”。

術語“中和”係指與配體結合並防止或降低該配體之生物學效果的抗原結合域。此可，例如藉由直接阻斷配體上之結合部位或透過間接方式藉由與配體結合並改變該配體之結合能力(諸如配體中之結構或能量改變)來完成。於一些實施態樣中，該術語亦可表示防止與其結合之蛋白質執行生物學功能之抗原結合域。

術語“標靶”或“抗原”係指能夠與抗原結合分子結合之分子或分子的一部分。於某些實施態樣中，標靶可具有一或多個表位。

術語“抗體”係指所謂的免疫球蛋白，由免疫系統產生以識別特定抗原之Y形蛋白質。術語“抗體片段”係指抗體之抗原結合片段和Fc片段。抗原結合片段之類型包括：F(ab')2、Fab、Fab'和scFv分子。Fc片段完全從免疫球蛋白之重鏈恆定區產生。

胞外傳訊域。該胞外域有利於信號傳導及淋巴細胞對抗原之有效反應。本發明中具有特定用途之胞外域可源自(即，包含)CD28、CD28T(參見，例如美國專利申請案US2017/0283500A1)、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激物(ICOS)、淋巴細胞功能相關之抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、DAP-10、Fcγ受體、第1類MHC分子、TNF受體蛋白及免疫球蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 la、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96(觸覺)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/CBP、CD19a、與CD83特異地結合之配體或彼等之任意組合。該胞外域可源自天然或合成來源。

鉸鏈域。如本文所描述者，胞外域通常包含鉸鏈部分。此為靠近細胞膜之胞外域的一部分。該胞外域可進一步包含間隔子區。根據本發明可使用各種鉸鏈，包括如上文討論之共刺激分子，以及免疫球蛋白(Ig)序列，3Xstrep II間隔子或其他合適分子，以實現與靶細胞之合需特殊距離。於一些實施態樣中，該鉸鏈區包含如本文所描述之CD28或CD8或其部分之胞外域。

跨膜域。該CAR-B可經過設計以包含與該CAR-B之胞外域融合或以其他方式連接之跨膜域。其可以類似方法與CAR-B之胞內域融合。於一實施態樣中，使用與CAR-B中的域之一天然聯結的跨膜域。在一些情況下，可藉由胺基酸取代來選擇或修飾該跨膜域，以避免該等域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜域結合以將與該受體複合物之其他成員的交互作用減至最少。該跨膜域可源自天然來源或合成來源。其中該來源為天然之情況下，該域可以源自任何膜結合或跨膜蛋白。本發明中具特定用途之跨膜區可源自(即，包含)CD28、CD28T、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激物(ICOS)、淋巴細胞功能相關之抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、DAP-10、Fcγ受體、第1類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細因數受體、整聯蛋白、傳訊細胞胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 la、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELLPG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/CBP、CD19a、與CD83特異地配之體或結等之任意組合。

視需要地，短連接子可在CAR-B之胞外、跨膜和胞內域其中任一或某些域之間形成連接。

於某些實施態樣中，本發明之CAR-B中的跨膜域為CD28跨膜域。在一個實施態樣中，該CD28跨膜域包含SEQ ID NO： 1之核酸序列。在一個實施態樣中，該CD28跨膜域包含核酸序列，其編碼SEQ ID NO：2之胺基酸序列。在一個實施態樣中，該CD28跨膜域包含SEQ ID NO：3之核酸序列。在另一實施態樣中，該CD28跨膜域包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列。

於某些實施態樣中，本發明之CAR-B中的跨膜域為CD8跨膜域。

胞內 ( 胞質 ) 域。本發明之CAR-B受體的胞內(IC或胞質)域可活化該免疫細胞之正常效應子功能至少一者。

應理解的是，合適之胞內分子包括，但不限於CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、CD3ζ和MyD88。胞內分子可進一步包括CD28、CD28T、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡-1(PD-1)、誘導性T細胞共刺激物(ICOS)、淋巴細胞功能相關之抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受體、第1類MHC分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、傳訊淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、Toll配體受體、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 la、LFA-1、 ITGAM、CD1 lb、ITGAX、CD1 lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96 (觸覺)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/CBP、CD19a、與CD83特異地合之配體或結等之任何組合。本發明之CAR-B的細胞質傳訊部分內的細胞質傳訊序列可以隨機或具體指定之順序彼此連接。

如本所使用之術語“共刺激”域或分子係指用於擴增或抵消細胞之初始活化信號的細胞表面分子之異質基團。

於一較佳之實施態樣中，該胞質域係經過設計以包含hCD19之傳訊域，其中該hCD19域包含如SEQ ID NO. 5中所示之核酸序列。於另一實施態樣中，該胞質域係經過設計以包含hCD40之傳訊域，其中該hCD40域包含如SEQ ID NO. 7中所示之核酸序列。於另一實施態樣中，該胞質域係經過設計以包含hCD40和hCD79b之傳訊域，其中該hCD40域包含如SEQ ID NO. 7中所示之核酸序列且該hCD79b域包含如SEQ ID NO. 25中所示之核酸序列。於另一實施態樣中，該胞質域係經過設計以包含hCD40和hCD137之傳訊域，其中該hCD40域包含如SEQ ID NO. 7中所示之核酸序列且該hCD137域包含如SEQ ID NO. 13中所示之核酸序列。於另一實施態樣中，該胞質域係經過設計以包含hCD40和hFcγr2a之傳訊域，其中該hCD40域包含如SEQ ID NO. 7中所示之核酸序列且該hFcγr2a域包含如SEQ ID NO. 17中所示之核酸序列。於另一實施態樣中，該胞質域係經過設計以包含hCD40和hMyd88之傳訊域，其中該hCD40域包含如SEQ ID NO. 7中所示之核酸序列且該hMyd88域包含如SEQ ID NO. 21中所示之核酸序列。於另一實施態樣中，該胞質域係經過設計以包含hCD79a之傳訊域，其中該hCD79a域包含如SEQ ID NO. 23中所示之核酸序列。於另一實施態樣中，該胞質域係經過設計以包含hCD79b之傳訊域，其中該hCD79b域包含如SEQ ID NO. 25中所示之核酸序列。這些實施態樣較佳為源自人，但可源自其他物種。在各種實施態樣中，傳訊域包含hCD79a與hCD79b或另一個hCD79a域串聯在一起。在各種實施態樣中，傳訊域包含hCD79b與hCD79a或另一個hCD79b域串聯在一起。 經修飾之 B 細胞

表現負載藥物之經修飾之 B 細胞。於本發明之各種實施態樣中，提供能夠表現負載藥物之經修飾的B細胞。如本文所使用之術語“負載藥物”係指作為治療劑之胺基酸序列、編碼肽或蛋白質之核酸序列或RNA分子。於某些實施態樣中，該負載藥物係用於遞送至腫瘤或腫瘤微環境或引流淋巴結。於某些實施態樣中，B細胞將能夠，例如增加腫瘤中交叉呈遞樹突細胞(DC)之數量的負載藥物遞送至腫瘤或腫瘤微環境或引流淋巴結是合需的。交叉呈遞DC將允許改善腫瘤抗原之呈遞。於各種實施態樣中，該負載藥物可能能夠活化T細胞並將其吸引入腫瘤中。活化腫瘤中更多之T細胞將補充交叉呈遞DC以重塑該腫瘤環境，使其具有更強之抗腫瘤免疫能力。負載藥物亦可能促進腫瘤中之三級淋巴結構(TLS)形成。臨床研究表明B細胞、TLS和對免疫檢查點阻斷的反應之間存在關係。

本發明之負載藥物之非排他性實例包括：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗體、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD86、CD40L、IFNα A2、LIGHT、4-1BBL、MDGF (C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白(agrin)、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗體、抗TGF-β抗體；TGF-β阱(trap)、誘餌(decoy)或其他抑制分子；抗BMP抗體；BMP阱、誘餌或其他抑制分子。

負載藥物傳訊。在本發明的各個實施態樣中，負載藥物在啟動的轉錄途徑的控制下以DNA構築體的形式在修飾的B細胞中表現。在某些實施態樣中，負載藥物的表現由活化T細胞的核因數(“NFAT”)途徑控制。NFAT通路是在免疫反應期間啟動的轉錄因數通路，由NF啟動κB。在不同的實施態樣中，修飾的B單元表現負載藥物和CAR-B。在各種實施態樣中，其中修飾的B細胞同時表現負載藥物和CAR-B，CAR-B may進一步編碼誘導NF途徑啟動的信號分子κB。這些分子包括但不限於：CD79a(免疫球蛋白α)、CD79b(免疫球蛋白β)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、CD3ζ和MyD88。

在不同的實施態樣中，所述誘導涉及表現至少一個負載藥物的分離B細胞。在不同的實施態樣中，本發明涉及表現一個以上負載藥物的分離B細胞。在不同的實施態樣中，本發明涉及表現1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12不同負載藥物的分離B細胞。

B 細胞的修飾用於歸巢。在本發明的各種實施態樣中，工程化的B細胞可以用歸巢結構域進行修飾(例如，如圖2所示)，使得B細胞可以歸巢於感興趣的位點/靶標並在與靶標相互作用時啟動。此外，在B細胞膜上表現的B細胞歸巢受體可識別靶組織上的位址素和配體，改變B細胞向特定位點的化合物或其衍生物，以及抑制分子發炎和B細胞的自身免疫活性，可以在B細胞歸巢和特定免疫反應的發展中發揮作用。

表現目標整聯蛋白的經修飾之 B 細胞。淋巴細胞表現的主要歸巢受體是整聯蛋白，整聯蛋白是一大類分子，其特徵是β鏈α的異二聚體結構。在屬l中，整聯蛋白的特異性α鏈和β鏈的配對決定了歸巢受體的類型。例如，α4鏈與7β鏈配對表徵了負責淋巴細胞與黏膜α地址n細胞黏附分子1 (MAdCAM-1)結合的主要整聯蛋白分子(α4β7)，該分子在Peyer貼片(PP)和胃腸道固有層內皮小靜脈(LPV)中的高內皮小靜脈(HEV)上表現。類似地，α4鏈與1β鏈配對表徵了皮膚歸巢受體(α4β1)。

在本發明的各種實施態樣中，可以預先選擇待修飾的B細胞，具有介導優選定位的特定性狀。例如，表現CXCR3的記憶B細胞可以被富集，然後進行工程設計。CXCR3細胞可能被吸引到發炎部位表現的配體上。因此，修飾的B細胞可以優先定位到這些位點。

在本發明的各個實施態樣中，修飾的B細胞被修飾，其表現整聯蛋白的α4鏈和β7鏈。希望α4β7整聯蛋白的表現將促進修飾的B細胞歸巢到結腸。在不同的實施態樣中，提供了一種修飾的B細胞，其表現整聯蛋白的α4和β1鏈。希望α4β1整聯蛋白的表現將促進修飾的B細胞歸巢到皮膚。在不同的實施態樣中，提供了一種修飾的B細胞，其表現整聯蛋白的α鏈和β鏈的所需配對，表明所表現的整聯蛋白促進修飾的B細胞歸巢到感興趣的所需位點/靶標。因此，在不同的實施態樣中，整聯蛋白的任何期望的β鏈組合α都考慮在B細胞中表現，即表現特定整聯蛋白的經修飾之B細胞靶向目標位點/靶標。

表現目標歸巢受體的經修飾之 B 細胞。B細胞具有成為發炎組織家園的能力，改變其歸巢反應eptor表現可以補充其天然歸巢傾向。B細胞定位還由引誘劑分子(例如，配體和趨化介素等靶標)在特定位置或組織的發炎部位的表現驅動。這些分子還包括抗體，例如靶向細胞到外周節點位址蛋白(PNAd)的MECA79抗體。Bahmani等人，J Clin Invest. 2018;128(11):4770-4786；Azzi等人，Cell Rep. 2016;15(6):1202-13。因此，可以設計B細胞以表現某些促進B細胞歸巢到感興趣的位點/靶標以及此類B細胞與所需靶標相互作用的某些抗體，蛋白質和受體。在某些情況下，這種受體的表現將B細胞重定向到感興趣的組織。

在 本發明的各個實施態樣中，提供了一種修飾的B細胞，其能夠表現歸巢抗體、蛋白質或受體，其表現能夠將B細胞引導至感興趣的特定位點/靶標。表2列出了使用特異性歸巢受體/配體對將T細胞歸巢到特定歸巢組織(靶組織)的示例性歸巢。相同的特異性歸巢受體/配體對也能夠促進B細胞歸巢到特定的歸巢組織(靶組織)。因此，在本發明的各個實施態樣中，使用表2中列出的相應的歸巢受體/配體對有助於將修飾的B細胞歸巢到示例性歸巢組織(靶組織)。

根據本發明的示例性歸巢組織(靶組織)類型和配體或趨化介素，其能夠限制組織的B細胞歸巢，列於表3中。

在本發明的各種實施態樣中，提供了一種修飾的B細胞，其負現一種或多種抗體、蛋白質或受體，其使用表2中列出的特定歸巢受體/配體對促進修飾的B細胞歸巢到示例性目標/歸巢組織。在本發明的各種實施方案中，提供了一種修飾的B細胞，該細胞負現一種或多種歸巢受體，該受體利用表2和/或表3中列出的配體或趨化因子促進修飾的B細胞歸巢到示例性的目標/歸巢組織。如本文所用，術語 "B細胞歸巢"是指將本申請的B細胞定位、定向、運輸、引導或重新定向到感興趣的部位/目標，例如，歸巢或目標組織、特定位置或組織中的發炎部位，或腫瘤或腫瘤微環境，其中希望交付治療性負載藥物。在B細胞歸巢方面，術語 "抗體"、"蛋白質 "或 "受體 "是指作為治療劑使用的胺基酸序列、編碼肽或蛋白質的核酸序列或RNA分子，當其在本發明的改良B細胞中表現時將引導B細胞到感興趣的部位/目標。

在某些實施態樣中，歸巢抗體、蛋白質或受體分子用於將表現這種分子的經修飾之B細胞歸巢/靶向到感興趣的位點/靶標。在某些實施態樣中，歸巢抗體、蛋白質或受體分子用於將表現這種分子的經修飾之B細胞歸巢/靶向到特定位置或組織中的發炎部位。在某些實施態樣中，歸巢抗體、蛋白質或受體用於將B細胞靶向腫瘤或腫瘤r微環境以及腫瘤引流淋巴結在某些實施態樣中，將B細胞靶向特定位置是期望的，以便本發明的工程化或修飾的B細胞能夠將治療負載藥物遞送到所需位置 感興趣的，例如，歸巢或靶組織、特定位置或組織中的發炎部位、或腫瘤或腫瘤微環境。因此，在某些實施態樣中，期望將B細胞送回感興趣的位點/靶標，例如腫瘤或腫瘤微環境和腫瘤引流淋巴結，並且向感興趣的位點/靶標遞送負載藥物，例如，增加感興趣位點/靶標處交叉呈遞的樹突細胞(DC)的數量(例如，在腫瘤中)。

在不同的實施態樣中，歸巢抗體、蛋白質或受體在修飾或工程化的B細胞中表現為DNA構築體。在不同的實施態樣中，歸巢抗體、蛋白質或受體在修飾的B細胞中表現為在組成型活化轉錄途徑控制下的DNA構築體。在不同的實施態樣中，參與B細胞歸巢/靶向的歸巢抗體、蛋白質或受體要麼不在B細胞中自然表現，要麼以比在B細胞中自然表現的高量表現。根據本發明，使用特定的歸巢受體/配體對將修飾的B細胞歸巢到特異性歸巢/靶組織的示例性歸巢見表4。應當指出的是，儘管表4中規定了示例性的歸巢組織、歸巢受體和配體對，但本發明的經修飾之B細胞可以被設計成表現任何歸巢抗體、蛋白質或受體(例如，表2中設置的任何歸巢受體)，使得修飾的B細胞可以定向到感興趣的特定位點/靶標。

用於本發明的特定歸巢受體/配體對的歸巢(靶標)組織類型的非排他性實例包括：皮膚、腸道(腸、結腸、腸系膜淋巴結(mLN)、佩氏貼片(PP)、小腸)、肝、肺、骨髓、心臟、外周淋巴結(LN)、中樞神經系統、胸腺和骨髓。

可與本發明的特異性或相應的引誘劑/配體/趨化介素配對的歸巢受體的非排他性例子包括：CLA(PSGL-1 glycoform)、CLA(PSGL-1糖型)、CCR10、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR9、CD43E、CD44、c-Met、CXCR3、CXCR4、LFA-1、LFA-1(αLβ2)、選擇素配體、VLA-4、VLA-4(α4β1)和α4β7。

可與本發明的特異性或相應的歸巢受體配對的配體/趨化介素的非排他性例子包括：CXCL16，CCL17，CCL17(22)，CCL20(MIP-3α)，CCL21，CCL25，CCL27，CCL28，CCL4，CCL5，CD62E，CD62P，CXCL10，CXCL12，CXCL13，CXCL16，CXCL9/CXCL10，CXCR3，E/P-選擇素，E-選擇素，GPR15L，HGF，Hyaluronate，ICAM-1，CCR1，2，5的配體，MAdCAM，MAdCAM-1、PNAd、VAP-1、VCAM和VCAM-1。

在本發明的某些實施態樣中，提供修飾的B細胞，其表現或具有增加表現的示例性B細胞歸巢受體( 例如，如表2所述)，使得修飾的B細胞靶向表現相應配體/趨化介素的相應目標歸巢組織(例如，如表2和/或3中所述)。在本發明離子的某些實施態樣中，提供了一種修飾的B細胞，其與特異性α和β鏈配對以及特定的B細胞歸巢受體( 例如，如表2和/或3中所述)共表現整聯蛋白，其表現促進或促進修飾的B細胞的歸巢/靶向感興趣的地點/目標。在一些實施態樣中，提供修飾的B細胞，其共表現α4β整聯蛋白7和CCR9。希望α4β7和CCR9的共表現將促進本發明修飾的B細胞的小腸歸巢。在一些實施態樣中，提供修飾的B細胞，其共表現α4β1整聯蛋白和CCR4。希望α4β1和CCR4的共表現將促進本發明修飾的B細胞的小腸歸巢。

表現免疫抑制分子的經修飾之 B 細胞。B細胞是許多自身免疫性疾病的關鍵貢獻者。然而，B細胞可用於治療性地拮抗自身免疫。具體來說，B細胞可以被工程化以表現至少一個或多個免疫抑制分子，這可能會降低B細胞的自身免疫活性，導致自身免疫性疾病的減少。免疫抑制分子是本領域公知的。這種抑制分子可以包括但不限於IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3。在本發明的某些實施態樣中，提供了一種修飾的B細胞，其被設計成表現選自IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其任意組合的至少一種或多種抑制分子，使得位於該部位的B細胞的發炎和自身免疫活性降低，從而導致積極的治療反應。

改變 B 細胞運輸的化合物。在本發明的某些實施態樣中，提供了一種修飾的B細胞，該修飾的B細胞用至少一種或多種化合物或其衍生物處理，這些化合物或其衍生物通過誘導特定的B胞內酯和/或歸巢受體的表現來改變B細胞的運輸。改變B細胞運輸的化合物或其衍生物是本領域公知的。在某些實施態樣中，由於α4β整聯蛋白和CCR9歸巢受體的表現增加，提供了用全反式維甲酸(ATRA)或其衍生物處理的經修飾之B細胞，其促進B細胞歸巢到腸道(小腸)。如本文所用，術語「化合物」是指化學、藥物、治療劑或其衍生物，其替代物是以期望的方式運輸B細胞。

在本發明的各種實施態樣中，修飾的B細胞被工程化為共表現特定的整聯蛋白(例如，具有特異性α和β鏈配對)和特定的B細胞歸巢受體，用至少一種或多種化合物或其衍生物處理，這些化合物或其衍生物改變修飾的B細胞的運輸並促進細胞歸巢到感興趣的特定位點/靶標，因為表現增加特異性整聯蛋白和/或歸巢受體。在不同的實施態樣中，修飾為與特異性α和β鏈配對共表現整聯蛋白的B細胞以及特定的B細胞歸巢受體進一步表現至少一個或多個免疫抑制分子，使得靶向特定發炎部位的經修飾之B細胞的自身特異性降低，導致自身免疫性疾病的減少。在一些實施態樣中，將修飾的B細胞工程化為表現一種或多種免疫抑制分子，用於檢查IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其組合，用ATRA或其衍生物處理指定的時間段，使得α4β7整聯蛋白和CCR9歸巢受體的表現被誘導以促進B細胞歸巢到一個感興趣的特定部位/靶標(例如腸道)，但該部位的發炎和定位於該部位的B細胞的自身免疫活性降低，導致積極的治療反應。在一個實施態樣中，被改造為表現一種或多種免疫抑制分子(例如IL-10、TGF-β或其組合)的經修飾之B細胞用ATRA或其衍生物處理指定的時間段，使得α4β7整聯蛋白和CCR9歸巢受體的表現被誘導到PROMote B細胞歸巢到感興趣的特定部位/靶標(例如腸道)，但該部位的發炎和定位於該部位的B細胞的自身免疫活性降低，導致積極的治療反應。

可以理解，本發明的任何B細胞修飾 為共表現特定的B細胞整聯蛋白和歸巢受體，該B細胞靶向感興趣的特定歸巢/靶組織，可以進一步設計為表現一種或多種免疫抑制分子，用於誘導發炎和自身免疫活性。定位在該位點的B細胞，和/或用化合物處理，該化合物通過誘導特異性B細胞整聯蛋白和/或歸巢受體的表現來改變修飾的B細胞的歸巢/靶向。

用 TLR 促效劑和 TLR 作用 B 細胞。B細胞具有攝取和呈遞其特異性B細胞受體(BCR)識別的抗原的天然能力。由Toll樣受體(TLR)啟動的B細胞導致有效的效應B細胞在免疫反應中防禦身體。TLR在B細胞中的表現或增加表現可以提供一種機制，以增強B細胞調節適應性免疫反應的先天信號。

用 TLR 促效劑啟動 B 細胞。在本發明的各種裝置中，提供了B細胞，其中B細胞用至少一種TLR促效劑在體外處理。在不同的實施態樣中，TLR可以是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和/或TLR13。在不同的實施態樣中，TLR促效劑優先結合選自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13組成的組中的一個或多個TLR。TLR促效劑是本領域公知的，可以包括但不限於富含CpG的寡核苷酸和雙鏈RNA類比物，聚肌苷酸：聚胞苷酸(poly-I：C)。在不同的實施態樣中，TLR促效劑可以是CpG寡核苷酸。

在不同的實施態樣中，每個B細胞可以用一種TLR促效劑進行震顫。在不同的實施態樣中，每個B細胞可以用一種以上的TLR促效劑治療。例如，每個B細胞可以處理1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12種不同的TLR促效劑。或者，患者可以投予異質的B細胞群，每個B細胞用獨特的TLR促效劑或TLR促效劑的組合處理。在一些實施態樣中，使用治療劑的B細胞同時或提前e將所述TLR細胞投予於治療的個體或患者。在某些實施態樣中，用一種或多種TLR促效劑治療能夠產生更有效的效應B細胞，用於在免疫反應中保護身體。在某些EMB中，用一種或多種TLR促效劑治療能夠增強B細胞的免疫反應。在一些實施態樣中，用至少一種或多種TLR促效劑處理本發明的B細胞誘導一種或多種TLR的表現或活化。

用 TLR 表現啟動 B 細胞。在本發明的各種實施態樣中，提供了一種修飾的B細胞，其能夠表現組成型活性TLR。在不同的實施態樣中，TLR在組成型激活的轉錄途徑的控制下作為DNA構築體在修飾或Engi的B細胞中表現。在不同的實施態樣中，TLR要麼不是在B細胞中自然表現，要麼以高於在B細胞中自然表現的水平表現。在不同的實施態樣中，TLR可以是TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和/或TLR13。

在不同的實施態樣中，每個B細胞可以表現一個以上的組成活性TLR。例如，每個B細胞可以產生1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12或13個不同的組成活性TLR。或者，患者可以投予異質的B細胞群，每個B細胞能夠表現和/或分泌獨特的TLR或T LR的組合，其具有組成活性。在不同的實施態樣中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13種不同的組成活性TLR可以通過異質的B細胞群投予於個體或患者。

在本發明的某些實施態樣中，所述B細胞是表現至少一種組成型活性TLR的經修飾之B細胞。在某些實施態樣中，表現至少一種組成活性TLR的經修飾之B細胞用一種或多種TLR促效劑處理。在某些實施態樣中，表現構成活性TLR能夠產生更有效的效應B細胞，用於在免疫反應中保護身體。在某些實施態樣中，組成型活性TLR的表現是增強B細胞的免疫反應。在某些實施態樣中，修飾的B細胞既表現構成活性的TLR又表現本申請的任何CAR-B。在不同的實施態樣中，表現is組成活性的TLR和/或CAR-B的經修飾之B細胞在向需要的個體或患者投予修飾的B細胞的同時或之前用一種或多種TLR促效劑進一步處理。在某些實施態樣中，B細胞可以在沒有CAR-B的情況下被設計成t表現負載藥物和修飾劑，例如TLR，用於腫瘤內給藥。

經修飾之 B 細胞 B細胞除了其抗體產生的功能外，亦表現高量的人白血球抗原(HLA)II類分子，並可呈現抗原給CD4+ T細胞(Hong等人，2018, Immunity 49, 695-708)。在本發明之各種實施態樣中，所提供之經修飾之B細胞係能夠同時呈現所關注之特異性抗原及/或抗原衍生之表位，諸如腫瘤抗原或感染疾病抗原，修飾的B細胞能夠在HLA I類和II類分子中同時呈遞特異性抗原和/或抗原衍生的表位。腫瘤抗原和傳染病抗原是本領域公知的，在前幾節中進行了描述。在某些實施態樣中，將感興趣的特定抗原(例如腫瘤抗原或傳染病抗原)融合到溶酶體蛋白的靶向信號上，該信號將抗原靶向溶酶體，並在HLA I類和II類分子中同時有效地呈遞antig en。在一些實施態樣中，靶向信號是溶酶體相關膜蛋白-1(LAMP1)的靶向信號。在一些實施態樣中，靶向信號能夠進入內體回收隔室。Clec9A的c端序列就是這樣一個靶向部分。本文所用的特定腫瘤抗原或融合到靶向信號的傳染病抗原是指胺基酸序列、編碼肽或蛋白質的核酸序列或RNA分子(例如mRNA分子)，用作治療劑。在一個實施態樣中，與靶向信號融合的特定腫瘤抗原或傳染病抗原是指用作治療劑的mRNA分子。在某些實施態樣中，希望與靶向信號(例如LAMP1或Clec9A的靶向信號)融合的特定腫瘤抗原和/或傳染病抗原靶向溶酶體或內體，並在HLAI類和II類分子中同時有效地預先引入。在某些實施態樣中，希望在成熟之前或之後對B細胞(例如人B細胞)進行電穿孔，使用編碼特定腫瘤抗原和/或目標傳染病抗原的mRNA融合到靶向信號，例如LAMP1或Clec9A的靶向信號，能夠同時有效地呈遞HLA I類和/或抗原衍生表位。ss II分子。在不同的實施態樣中，感興趣的特定腫瘤抗原和/或感染性疾病抗原要麼不是由B細胞自然呈遞的，要麼不是由B細胞同時呈遞在HLA I類和II類分子中自然呈遞的，要麼不是由B細胞在HLA I類和II類分子中自然呈遞。可以設想，將這種電穿孔B細胞引入個體(例如人宿主)將通過同時有效地在HLA I類和II類分子中呈遞感興趣的特定抗原和/或抗原衍生表位來促進抗原特異性免疫反應的發展或有效的iate抗原特異性免疫反應。

在不同的實施態樣中，本發明涉及編碼至少一種目標特異性抗原的mRNA序列，例如腫瘤抗原或傳染病抗原，融合到靶向信號，例如LAMP1的靶向信號，用作B細胞電正值n中的治療劑，以同時有效地呈遞HLA I類和/或抗原衍生的表位II類分子。在不同的實施態樣中，本發明涉及核酸序列，例如mRNA序列，將一個以上的(例如，1、2、3、4、5或更多)特異性腫瘤抗原和/或與靶向信號融合的感染性疾病抗原。在不同的實施態樣中，本發明涉及不同核酸序列的池，例如，不同mRNA序列的池，用於如上所述的B細胞電穿孔中的治療劑，其中每個池編碼至少一種感興趣的特定抗原，例如，腫瘤抗原或傳染病抗原，融合到靶向sig與mRNA序列的其他池不同。因此，在一些實施態樣中，個體可以投予均勻的B細胞群，其中每個B細胞用編碼至少一種特定目標抗原的mRNA電穿孔，融合到靶向信號上。在一些實施態樣中，個體可以投予均質的B細胞群，其中每個B細胞用編碼一種以上的特定目標抗原融合到靶向si gnal的mRNA電穿孔。在一些實施態樣中，個體可以投予異質的B細胞群，其中每個B細胞用mRNA的組合電穿孔，每個mRNA編碼至少一種特定的目標抗原融合到不同的靶向信號。

在一些實施態樣中，如上所述用於電穿孔的B細胞可以是本申請的任何修飾的B細胞。在一些實施態樣中，修飾的B細胞包含用於B細胞的嵌合抗原受體(CAR-B)。在各種結構中，修飾的B細胞可以表現CAR-B，並同時有效地在HLA I類和II類分子中呈現感興趣的特異性抗原和/或抗原衍生的表位。

在不同的實施態樣中，本發明涉及向有需要的患者投予分離的B細胞的甲基。在不同的實施態樣中，可以將B細胞群投予於患者。在不同的實施態樣中，每個B細胞可以表現一種以上的負載藥物肽或蛋白質。例如，每個B單元可以表現1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個不同的負載藥物。或者，可以給予患者異質的B細胞群，每個B細胞能夠表現和/或分泌獨特的負載藥物或負載藥物的組合。在不同的實施態樣中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12不同的負載藥物可以通過異質的B細胞群投予於患者。 治療方法

因此，在某些方面，本發明包括用於治療或預防腫瘤或癌組織的方法，包括向有需要的患者投予有效量的至少一種CAR-B本文公開的方法。

提供了治療疾病或病症(包括癌症)的方法。在一些實施態樣中，所述i涉及在個體中產生B細胞介導的免疫反應，包括向個體投予有效量的本申請的工程免疫細胞。在一些實施態樣中，B細胞介導的免疫反應是針對靶細胞或多細胞的。在一些實施態樣中，工程免疫細胞包含用於B細胞的嵌合抗原受體(CAR-B)。在一些實施態樣中，靶細胞是腫瘤細胞。在某些方面，本發明包括治療或預防惡性腫瘤的方法，所述方法包括向有需要的個體投予有效量的至少一種分離的抗原結合分子。在某些方面，本發明包括治療或預防惡性腫瘤的方法，所述方法包括向有需要的個體投予有效量的至少一個免疫細胞，其中免疫細胞包含至少一個嵌合抗原受體。

在某些方面，本發明包含 至少一種如本文所述的抗原結合分子和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。在一些實施態樣中，藥物組合物還包括另外的活性劑。

在一些植入物中，個體被診斷出患有局限於肝臟的轉移性疾病。在其它實施態樣中，轉移性疾病是癌症。在還有其它實施態樣中，癌症從乳腺、結腸、直腸、食道、侖g、胰腺和/或胃中的原發性腫瘤轉移而來。在還有其它實施態樣中，個體被診斷為不可切除的轉移性肝腫瘤。在又其它實施態樣中，個體被診斷為來自原發性結直腸癌的不可切除的轉移性肝腫瘤。在一些實施態樣中，個體被診斷為肝細胞癌。

可以理解，經修飾之B細胞的目標劑量範圍可以是1x10 ⁶-2x10 ¹⁰個細胞/kg，優選2x10 ⁶個細胞/kg，更優選。可以理解的是，高於和低於此範圍的劑量可能適用於某些個體，並且醫療保健提供者可以根據需要確定適當的劑量水準。另外，可以根據本發明提供多劑量的細胞。

還提供了用於減小個體中腫瘤大小的方法，包括向個體投予本發明的經修飾之B細胞，其中該細胞包括CAR-B受體g的抗原結合結構域，其與腫瘤上的抗原結合，負載藥物或CAR-B和負載藥物兩者結合。在一些實施態樣中，個體具有實體瘤，或血液惡性腫瘤如淋巴瘤或白血病。淋巴瘤包括但不限於霍德格金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。白血病包括但不限於ALL、CLL、AML和CML。骨髓瘤包括但不限於多發性骨髓瘤。其他腫瘤類型包括但不限於導致肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、腦癌(如膠質瘤和膠質母細胞瘤)、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、腎癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌和肝癌的腫瘤。

在一些實施態樣中，修飾的 B細胞被遞送到腫瘤床。在一些實施態樣中，癌症存在於個體的骨髓中。

還提供了將B細胞歸巢到個體感興趣的位點/靶標的方法，包括向個體投予本發明的修飾的B cell，其中細胞包括整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質或受體，該受體被吸引到配體、趨化介素或感興趣的位點/靶標的引誘劑。在一些實施態樣中，感興趣的位點/靶標是，例如歸巢或靶組織、特定位置或組織中的發炎位點、或腫瘤或腫瘤微環境，其中需要遞送治療負載藥物。

還提供了用於在個體感興趣的位點/靶點處減少發炎和自身免疫性B細胞的方法，包括向個體投予本發明的經修飾之B細胞，其中該細胞包含免疫抑制分子。在一些實施態樣中，感興趣的位點/靶標是，例如歸巢或靶組織、特定位置或組織中的發炎位點、或腫瘤或腫瘤微環境，其中需要遞送治療負載藥物。

還提供了將B細胞轉運改變為個體感興趣的目標的方法，包括用適合改變B細胞轉運的化合物或其衍生物處理本發明的B細胞，並將處理過的B細胞投予於需要它的個體。在一些實例中，化合物或其衍生物通過增加由B細胞表現的整聯蛋白、歸巢抗體、蛋白質、受體或其組合的表現來改變B細胞的運輸。

還提供了用於增強B細胞和/或產生有效效應B細胞以增加個體免疫反應的方法，包括用至少一種或多種TLR促效劑治療本發明的B細胞，並將治療後的B細胞投予於需要它的個體。在一些植入物中，用至少一種或多種TLR促效劑處理本發明的B細胞誘導一種或多種TLR的表現或活化。在一些實施態樣中，用於增強B細胞和/或產生有效的效應B細胞以增加個體免疫反應的方法，還包括向個體投予表現至少一個或多個組成型活性TLR的本發明修飾的B細胞。還提供了用於增強B細胞和/或產生有效的效應B細胞以增加個體免疫反應的方法，包括向個體投予本發明的經修飾之B細胞，其中該細胞表現CAR-B受體，該受體包括與腫瘤上的抗原結合結構域，組成活性TLR或CAR-B和組成活性TLR，其中細胞在同時或在向個體投予細胞之前用至少一種或多種TLR促效劑處理。

還提供了用於增加個體抗原特異性免疫反應的方法，包括向個體投予本發明的經修飾之B細胞，其中該細胞用核酸序列電穿孔，例如mRNA，編碼特異性抗原或抗原和/或感染性疾病抗原融合到靶向信號，例如LAMP1或Clec9A的靶向信號，用於同時有效地呈遞HLA I類和I類分子中的特異性抗原和/或抗原衍生表位。在一些實施態樣中，個體具有實體瘤，或血液惡性腫瘤如淋巴瘤或白血病。

可以理解，使用本應用的工程化或修飾的B細胞的治療方法的各種實施態樣不是相互排斥的，並且可以以任何方式相互組合，並且沒有任何限制，除非明確指出，以實現促進本文所考慮的任何結果和/或治療反應。

在一些實施態樣中，修飾的B細胞是自體B細胞。在一些實施態樣中，修飾的B細胞是同種異體B細胞。在一些實施態樣中，修飾的B細胞是異源B細胞。在一些實施態樣中，本申請的經修飾之B細胞在體內被tectation或轉導。在其它實施態樣中，工程細胞被轉染或離體轉導。

如本文所用，術語“個體”或“患者”是指個體。在某些方面，個體是哺乳動物，例如人。在某些方面，個體可以是非人靈長類動物。非人靈長類動物包括狨猴、猴子、黑猩猩、大猩猩、猩猩和長臂猿，僅舉幾例。術語「主體」還包括家養動物，如貓、狗 等、牲畜( 如美洲駝、鸚鵡、奶牛)、野生動物( 如鹿、麋鹿、駝鹿等)，實驗動物( 如小鼠，兔子，大鼠，沙鼠，豚鼠 等。)和鳥類( 例如，雞、火雞、鴨 等。)。優選地，個體是人個體。更優選地，所述個體是人患者。

所述方法還可以包括投予一種或多種化療劑。在某些實施態樣中，所述化療劑是淋巴細胞耗竭(precondition)化療劑。有益的預處理治療方案以及相關的有益生物標誌物描述於例如美國臨時專利申請62/262, 143和62/167, 750，以及美國專利9, 855, 298中，其特此作為參考併入本文全文。這些描述了例如，調理需要T細胞療法的患者的方法，包括向患者投予指定有益劑量的環磷醯胺(200mg/m ²/天和2000mg/m ²/天)和指定劑量的氟達拉濱(20mg/m ²/天和900mg/m ²/天)。優選的劑量方案包括治療患者，包括在向患者投予治療有效量的工程B細胞之前，每天向患者投予約500mg/m ²/天的環磷醯胺和約60mg/m ²/天的氟達拉濱三天。

在其它實施態樣中，抗原結合分子、轉導(或以其他方式工程化)的細胞(例如CAR)和化療劑每次投予的量對治療個體中的疾病或病症有效。

於某些實施態樣中，包含本文揭示之表現CAR的免疫效應細胞之組成物可與任何數量之化療劑聯合投予。化療劑之實例包括烷化劑，諸如噻替派(thiotepa)和環磷醯胺(CYTOXAN™)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、異丙硫丹(improsulfan)和哌泊硫丹(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)類藥物，諸如苯多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥多巴(meturedopa)和烏多巴(uredopa)；乙烯亞胺和甲基三聚氰胺(methylamelamine)，包括阿曲他明(altretamine)、三乙烯三聚氰胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷醯胺(trietylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷醯胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羥甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氯乙胺(mechlorethamine)、鹽酸氧甲氯乙胺、美法崙(melphalan)、諾維貝辛(novembichin)、芬乃斯特(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷醯胺(trofosfamide)、尿嘧啶芥；亞硝基脲類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲佐菌素(chlorozotocin)、氟替莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，諸如阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、紅黴素(authramycin)、氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素(cactinomycin)、加利車黴素(calicheamicin)、卡比星(carabicin)、胭脂紅黴素(carminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、去托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正白胺酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、埃柔比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、馬賽黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(pque-lamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如胺甲喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如地喋呤(denopterin)、胺甲喋呤、喋喋呤(pteropterin)、三胺甲喋呤(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫胺嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮雜尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿苷(doxifluridine)、依西他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，諸如鈣固酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾酮內酯(testolactone)；抗腎上腺素，諸如胺基麩胺醯胺(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸(frolinic acid)；乙醯丙酮(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；吖啶(amsacrine)；苯丁酸(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；去氧麻黃鹼(defofamine)；去甲高辛(demecolcine)；二嗪酮(diaziquone)；二甲雙胍(elformithine)；醋酸艾立替銨(elliptinium acetate)；胃泌素(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多醣(lentinan)；氯尼達胺(lonidamine)；米托胍(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹達莫(mopidamol)；硝化鈉(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®；雷佐生(razoxane)；西佐非蘭(sizofiran)；螺鍺(spirogermanium)；肌鬆酸(tenuazonic acid)；三嗪酮(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；聚胺酯(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；米托溴醇(mitobronitol)；米託內酯(mitolactol)；双溴丙基呱嗪(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環磷醯胺；噻替哌(thiotepa)；紫杉醇類(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(TAXOL®)，Bristol-Myers Squibb)和多西紫杉醇(doxetaxel)(TAXOTERE®，Rhone-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春鹼；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；絲裂黴素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；長春瑞濱(vinorelbine)；溫諾平(navelbine)；諾萬龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；視黃酸衍生物，諸如TARGRETINTM(貝沙羅汀(bexarotene))、PANRETINTM(阿利維A酸(alitretinoin))；ONTAKTM(地尼介白素(denileukin diftitox))；埃斯派拉黴素(esperamicin)；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。該定義亦包括用於調節或抑制激素對腫瘤之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素，包括，例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制4(5)-咪唑之芳香酶、4-羥基他莫昔芬、曲昔芬(trioxifene)、柯昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。當適當時，亦投予化療劑之組合，包括，但不限於CHOP，即，環磷醯胺(CYTOXAN®)、多柔比星(羥基多柔比星)、氟達拉濱、長春新鹼(ONCOVIN®)和潑尼松。

在一些實施態樣I中，化療劑在給予工程細胞或核酸的同時或在一周內投予。在其它實施態樣中，所述化療藥在投予工程細胞或核酸後投予1至4周或1周至1個月、1周至2個月、1周至3個月、1周至6個月、1周至9個月或1周至12個月。在其他栓塞中，化療劑在給予細胞或核酸之前至少1個月投予。在一些實施態樣中，所述方法還包括投予兩種或多種化療劑。

多種附加的治療性agents可以與本文描述的組合物結合使用。例如，可能有用的附加治療劑包括PD-1(或PD-L1)抑製劑，例如納武利尤單抗(Opdivo®)、帕博利珠單抗(Keytruda®)、帕博利珠單抗、吡地利珠單抗和替佐利珠單抗(Tecentriq ^®)。其他其他療法包括抗CTLA-4抗體(例如伊匹木單抗)、抗®LAG-3抗體(例如Relatlimab、BMS)、單獨使用或與PD-1和/或PD-L1抑製劑聯合使用。

適於與本發明組合使用的其他治療劑包括但不限於伊布替尼(Imbruvica®)、ofatumumab(Arzerra®)、利妥昔單抗(Rituxan®)、貝伐珠單抗(Avastin®)、曲妥珠單抗(Herceptin®)、曲妥珠單抗(KADCYLA)、®伊馬替尼(Gleevec®)、西妥昔單抗(Erbitux®)、panitumumab (Vectibix®)、catumaxomab、ibritumomab、ofatumumab、tositumomab、brentuximab、alemtuzumab、吉妥珠單抗、厄洛替尼、吉非替尼、凡德他尼、阿法替尼、拉帕替尼、奈拉替尼、阿昔替尼、馬西替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、托塞拉尼、來司替尼、阿昔替尼、西地尼布、侖伐替尼、尼達尼布、帕唑帕尼、瑞戈非尼、司馬沙尼、索拉非尼、舒尼替尼、替沃扎尼、托塞拉尼布、凡德他尼、恩曲替尼、卡博替尼、伊馬替尼、達沙替尼、尼洛替尼、帕納替尼、拉多替尼、博舒替尼、來司替尼、蘆可替尼、派克替尼、考比替尼、塞魯美替尼、曲美替尼、比尼替尼、阿瑞替尼、色瑞替尼，克唑替尼，阿柏西普，阿迪波特肽，地尼介素地夫替托克斯，mTOR抑製劑如依維莫司和替西羅莫司，刺蝟抑製劑如索尼吉布和vismodegib，CDK抑製劑如CDK抑製劑(palbociclib)。

在附加的實施態樣中，包含含CAR的B細胞的組合物可以與抗炎劑一起投予。抗炎劑或藥物包括但不限於類固醇和糖皮質激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安奈德)、非甾體抗炎藥(NSAIDS)，包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲胺蝶呤、柳氮磺吡啶、來氟米特、抗腫瘤壞死因數藥物、環磷醯胺和麥考酚酯。示例性非甾體抗炎藥包括布洛芬、萘普生、萘普生鈉、Cox-2抑製劑和唾液化物。示例性鎮痛藥包括對乙醯胺基酚、羥考酮、鹽酸丙泊昔芬曲馬多。示例性糖皮質激素包括可的松、地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍或潑尼松龍。示例性生物反應調節劑包括直接針對細胞表面標誌物的分子(例如，CD4、CD5等)、細胞介素抑製劑，例如TNF拮抗劑(例如依那西普(ENBREL®)、阿達木單抗(HUMIRA®)和英夫利昔單抗(REMICADE®))、趨化介素抑製劑和黏附分子抑製劑。生物修飾劑包括單克隆抗體以及重組形式的分子。示例性DMARD包括硫唑嘌呤、環磷醯胺、環孢素、甲胺蝶呤、青黴胺、來氟米特、柳氮磺吡啶、羥氯喹、金(口服(auranofin)和肌內注射)和米諾環素。

在某些實施態樣中，本文中描述的組合物與細胞介素一起投予。本文所用的“細胞介素”是指由一個細胞群釋放的蛋白質，其作為細胞間介質作用於另一個細胞。細胞介素的例子是淋巴因數、單因數和傳統的多肽激素。細胞介素包括生長激素，如人生長激素，N-蛋醯基人生長激素，和牛生長激素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體生成素(LH)；肝生長因數(HGF)；纖維母細胞生長H因子(FGF)；催乳素；胎盤泌乳素；苗勒管抑制物質；小鼠促性腺激素相關肽；抑制素；啟動素；血管內皮生長因數；整聯蛋白；血小板生成素(TPO)；神經生長因子(NGF)，例如NGF-β；平板ET-生長因數；轉化生長因數(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因數-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因數；干擾素，如干擾素-α、β和-γ；集落刺激因數(CSF S)，例如巨噬細胞-CSF(M-CSF)；粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)；和粒細胞CSF(G-CSF)；白細胞介素(IL)，例如IL-1、IL-lα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，一種腫瘤壞死因數，如TNF-α或TNF-β；和其他多肽因數，包括LIF和套組配體(KL)。如本文所用，術語細胞介素包括來自天然來源或重組細胞培養物的蛋白質，以及天然細胞基蛋白序列的生物活性等價物。 製作方法

可以利用多種已知的技術來製造本發明所述的多核苷酸、多肽、載體、抗原結合分子、免疫細胞、組合物等。

在對本文所述的免疫細胞進行體外操作或遺傳修飾之前，可以從個體獲得這些細胞。在一些實施態樣中，所述免疫細胞包含B細胞。B細胞可從多種來源獲得，包括外側血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、感染部位組織、腹水、胸腔積液、脾組織和腫瘤。在某些實施態樣中，B細胞可以使用本領域技術人員已知的任何數量的技術(例如FICOLL™分離)從個體收集的血液單元中獲得。細胞可以優選通過單采從個體的迴圈血液中獲得。單采產品通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他有核白細胞、紅細胞和血小板。在某些實施態樣中，通過單采收集的細胞可以被洗滌以除去血漿級分，並置於適當的緩衝液或培養基中以進行後續處理。細胞可以用PBS洗滌。如將要理解的，可以使用洗滌步驟，例如通過使用半自動流通離心機例如Cobe™ 2991細胞處理器、Baxter Cyto-Mate™等。洗滌後，可以將細胞重懸於各種生物相容性緩衝液或其他含或不帶緩衝液的鹽溶液中。在某些實施態樣中，可除去單採樣品中不需要的組分。

免疫細胞，如B細胞，可以在使用已知方法分離後進行基因修飾，或者免疫細胞可以在進行基因修飾之前在體外被啟動和擴增(或在祖細胞的情況下分化)。在另一個實施態樣中，免疫細胞，例如B細胞，用本文所述的嵌合B細胞受體進行基因修飾(例如，用包含一個或多個編碼CAR-B的核苷酸序列的病毒載體轉導)，然後在體外被啟動和/或擴增。用於啟動和擴增B細胞的Metho ds是本領域已知的，例如在美國專利號6, 905, 874;6, 867, 041; 6, 797, 514；和PCT WO 2012/079000中描述，其內容在此全文引用。通常，此類方法包括在具有適當細胞介素(例如IL-2)的培養基中將PBMC或分離的B細胞與刺激劑和通常附著在磁珠或其他表面上的共刺激劑接觸。

在其他實施態樣中，B細胞可以啟動並刺激細胞與飼養層細胞和適當的抗體和細胞介素增殖，其方法如美國專利號6, 040, 177; 5, 827, 642；和WO/2012129514中描述的那些，其內容在此作為參考全部併入。

PCT申請PCT/US2015/14520中描述了製造本發明的構築體和工程免疫細胞的某些方法，其內容在此全文併入作為參考。製造結構和細胞的附加方法可以在美國臨時專利申請No. 62/244，036中找到，其內容在此作為參考全文併入。

對於多核苷酸的克隆，可以將載體引入宿主細胞(分離的宿主細胞)中，以允許載體本身的複製，從而擴增其中包含的多核苷酸的拷貝。克隆載體可包含序列組分，通常包括但不限於複製起源、啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列和可選標記。這些要素可由本領域普通技術人員酌情選擇。例如，可以選擇複製的起源以促進宿主細胞中載體的autonomos複製。

在某些實施態樣中，本公開提供了含有本文提供的載體的分離宿主細胞。含有載體的宿主細胞可用於表現或克隆載體中所含的多核苷酸。合適的宿主細胞可以包括但不限於原核細胞、真菌細胞、酵母細胞或高級真核細胞如哺乳動物細胞。用於此目的的合適的原核細胞包括，無限制地，真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科，例如埃希氏菌，例如大腸桿菌， 腸桿菌，歐文氏菌，克雷伯菌，變形桿菌，沙門氏菌，例如 鼠傷寒沙門氏菌，沙雷氏菌，例如，沙雷氏菌和 志賀氏菌，以及枯草芽孢桿菌和 地衣芽孢桿菌等桿菌，銅 綠假單胞菌和 鏈黴菌。

可以使用本領域已知的任何合適的方法將載體引入宿主細胞，包括但不限於DEAE-葡聚糖介導的遞送、磷酸鈣沉澱法、陽離子脂質介導的遞送、脂質體介導的轉染、電穿孔、微彈丸轟擊、受體介導的基因遞送、由聚賴胺酸介導的遞送、組蛋白、chi東山和肽。用於表現目標載體的細胞轉染和轉化的標準方法在本領域是公知的。在進一步的實施態樣中，不同表現載體的混合物可用於對免疫效應細胞的donor群體進行基因修飾，其中每個載體編碼本文所公開的不同CAR-B。由此產生的轉導免疫效應細胞形成混合的工程細胞群，其中一定比例的工程細胞表現的比一種不同的CAR-B不同。

在一個實施態樣中，本發明提供了一種儲存表現靶向蛋白質的CAR-B的基因工程細胞的方法。這涉及冷凍保存免疫細胞，使細胞在解凍後保持活力。表現CAR-Bs的免疫細胞的一部分可以通過本領域已知的方法冷凍保存，為未來治療惡性腫瘤患者提供此類細胞的永久來源。當需要時，冷凍保存的轉化免疫細胞可以被解凍，格羅和擴增為更多這樣的細胞。

如本文所用，「冷凍保存」是指通過將細胞冷卻到零下的溫度，例如(通常)77開爾文或196℃(液氮的沸點)來保存細胞。冷凍保護劑通常在零下溫度下使用，以防止細胞因低溫冷凍或升溫至室溫而受到損害。冷凍保存劑和最佳冷卻速率可以防止細胞損傷。可用於本發明的冷凍保護劑包括但不限於：二甲基亞硯(DMSO)(Lovelock & Bishop, Nature, 1959, 183, 1394-1395；阿什伍德-史密斯，自然，1961, 190, 1204-1205)，甘油，聚乙烯吡咯烷(林弗雷特，紐約州阿卡德。Sci., 1960, 85, 576)和聚乙二醇(Sloviter & Ravdin, Nature, 1962, 196, 48)。首選冷卻速率為1°-3℃/分鐘。

術語「基本純淨」用於表示給定元件以高水準存在。該組分理想地是組合物中存在的主要組分。優選以超過30%、超過50%、超過75%、超過90%或甚至超過95%的水準存在，所述水準是在干重/干重的基礎上相對於所考慮的總組合物確定的。在非常高的水準( 例如，在超過90%，超過95%或超過99%的水準)時，該成分可以被視為“純形式”。“本物質的生物活性物質(包括多肽、核酸分子、抗原結合分子、部分)可以以基本上不含一種或多種污染物的形式提供，否則該物質可能與之相關。當組合物在亞物質上不含給定污染物時，污染物將處於低水準( 例如，在上述幹重/干重基礎上低於10%、小於5%或低於1%的水準)。

在一些實施態樣中，通過首先將它們從其培養基中取出，然後以治療有效量洗滌和濃縮細胞在適合給藥的培養基和容器系統(“藥學上可接受的”載體)中來配製細胞。合適的輸液介質可以是任何等滲培養基製劑，通常是生理鹽水、Normosol TM R(Abbott)或Plasma-Lyte ^TMA(Baxter)，也可以利用5%葡萄糖的水溶液或乳酸林格氏液。輸注培養基可以補充人血清白蛋白。

所需處理的amo組合物中的細胞通常為至少2個細胞或更典型地大於10 ²個細胞，以及最多10 ⁶個、最多和包括10 ⁸個細胞或10 ⁹個細胞以及可以超過10 ¹⁰個細胞。細胞的數量將取決於組合物的預期用途，以及其中包含的細胞類型。所需細胞的密度通常大於10 ⁶個細胞/ml，並且通常大於10 ⁷個細胞/ml，通常為10 ⁸個細胞/ml或更大。臨床相關的immune細胞數量可以分攤到累積等於或超過10 ⁵, 10 ⁶, 10 ⁷, 10 ⁸, 10 ⁹, 10 ¹⁰, 10 ¹¹或10 ¹²細胞的多次輸注中。在本發明的某些方面，特別是由於所有輸注的細胞將被重定向到r靶抗原的特異性上，因此可以投予較少數量的細胞，在10 ⁶/kg(每個患者10 ⁶-10 ¹¹)的範圍內。CAR-B治療可以在這些範圍內的劑量下多次投予。這些細胞可能是自體的、同種異體的或接受治療的患者的異源細胞。在某些方面，在單個產品中發現了不同的CAR-B細胞。組合物可以少至2、3、4、5、6、7、8、9或多達10個不同的CAR-B細胞。這些可以由表現嵌合CAR蛋白的細胞和表現其他CAR和/或負載藥物的B細胞組成。

本發明的B細胞可以單獨投予，也可以作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其它組分如IL-2或其它細胞介素或細胞群組合投予。本發明的藥物組合物可包含表現CAR-B的細胞群，如本文所述的B細胞，與一種或多種藥學或生理學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合。這樣的組合物可包含緩衝液如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物，如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖，甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，如甘胺酸；抗氧劑；螯合劑，如EDTA或穀胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；和防腐劑。本發明的組合物優選配製用於靜脈內給藥。治療還可能包括一種或多種皮質類治療，例如地塞米松和/或甲潑尼龍。

本申請的組合物可以包括、基本上由所公開的組分組成或由所公開的組分組成。

本發明的藥物組合物(溶液、懸離子等)，可以包括以下一種或多種：無菌稀釋劑如注射用水、生理鹽水溶液、優選生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉、固定油如合成甘油單酯或甘油二酯可作為溶劑或懸浮介質，有聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑，如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑SuCH為乙二胺四乙酸；緩衝劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用於調節張力的試劑如氯化鈉或葡萄糖。該腸胃外製劑可密封於由玻璃或塑膠製成的安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。可注射藥物組合物優選無菌。

可以理解的是，通過用自殺基因轉導免疫細胞(含有一個或多個CAR-B)可以最大限度地減少不良事件。還可能希望將可誘導的「開啟」或「加速器」開關摻入免疫細胞中。這些技術可以採用使用二聚結構域和這種二聚結構域的任選活化劑。這些技術包括，例如，由Wu等人描述的那些，Science 2014, 350(6258)在某些細胞中使用FKBP/Rapalog二聚化系統，其內容通過引用全部併入本文。另外的二聚化技術描述於例如Fegan 等人。化學修訂版2010, 110, 3315-3336以及美國專利號5, 830, 462; 5, 834, 266; 5, 869, 337；和6, 165, 787，其內容也通過引用全部併入本文。其他二聚對可包括環孢素-A/親環蛋白、受體、雌激素/雌激素受體(任選使用他莫昔芬)、糖皮質激素/糖皮質激素樣受體、四環素/四環素受體、維生素D/維生素D受體。二聚化技術的進一步實例可以在例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US 2015/0266973、US 2016/0046700、美國專利No. 8, 486, 693、US 2014/0171649和US 2012/0130076中找到，其內容通過引用進一步併入本文全文。

合適的技術包括在用本發明的CAR-B構築體轉導細胞之前、之後或t時間使用誘導性半胱天冬酶-9(美國申請Pub.No. 2011/0286980)或胸苷激酶。引入自殺基因和/或“開啟”開關的其他方法包括CRISPR、TALENS、MEGATALEN、鋅指、RNAi、siRNA、shRNA、反義技術以及本領域已知的其他技術。

抗CD20或抗CD19代表減少或消除工程化B細胞的附加方法，如果這些細胞是不良事件或病理的原因。

可以理解，本文中的描述僅是示例性的和解釋性的，並且不限制所要求保護的發明。在本申請中，除非另有特別說明，否則單數的使用包括複數。

此處使用的章節標題僅用於組織目的, 不得解釋為限制所描述的主題。本申請中引用的所有檔或部分檔，包括但不限於專利、專利申請、文章、書籍和論文，特此明確 通過引用全文納入任何目的。根據本公開使用時，除非另有說明，否則以下術語應理解為具有以下含義：

在本申請中，除非另有說明，否則使用“或”表示“和/或”。此外，“包括”一詞以及“包括”和“包括”等其他形式的使用並不具有限制性。此外，除非另有特別說明，否則諸如「元素」或「元件」之類的術語既包括構成一個單元的元素和元件，也包括構成一個以上亞單元的組成部分。

術語“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”包括單鏈和雙鏈核苷酸聚合物。包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型的核苷酸的修飾形式。所述修飾包括鹼性修飾如溴哌啶和肌苷衍生物、核糖修飾如2'，3'-二去氧核糖和核苷酸間連接修飾如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、亞硒酸磷酸酯、二硒酸磷酸酯、茴香酸磷酸酯、膦並烷酸酯和胺基磷酸酯。

術語「寡核苷酸」是指包含200個或更少核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸可以是單鏈或雙鏈的，例如，用於構建突變基因。寡核苷酸可以是義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可以包括用於檢測測定的標記物，包括放射性標記物、螢游標記物、半抗原標記物或抗原標記物。例如，寡核苷酸可用作PCR引物、克隆Pri-mers或雜交探針。

術語「對照序列」是指可以影響其連接的編碼序列的表現和處理的多核苷酸序列。這種控制序列的性質可以取決於宿主生物。在具體實施態樣中，原核生物的控制序列可以包括啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止序列。例如，用於真核生物的控制序列可以包括包括一個或多個用於轉錄因數的再認知位點、轉錄增強子序列和轉錄終止序列的啟動子。“對照序列”可以包括先導序列(信號肽)和/或融合伴侶序列。

如本文所用，「可操作地連接」是指應用該術語的元件處於允許它們在適當條件下執行其固有功能的關係中。

術語「載體」是指用於將蛋白質編碼信息轉移到宿主細胞中的任何分子或實體( 例如，核酸、質粒、噬菌體或病毒)。術語「表現載體」或「表現構築體」是指適用於宿主細胞轉化的載體，並且包含指導和/或控制(與宿主細胞一起)一個或多個可操作連接的異源編碼區域的表現的核酸序列。表現構築體可以包括但不限於影響或控制tr轉錄、轉譯的序列，如果存在內含子，則影響可操作地與其連接的編碼區域的RNA剪接。

術語「宿主細胞」是指已經轉化或能夠被轉化的具有核酸序列且reby表現目的基因的細胞。該術語包括親本細胞的後代，無論後代在形態或基因組成上是否與原始親本細胞相同，只要存在目的基因。

術語「transformation」是指細胞遺傳特徵的變化，當細胞被修飾為包含新的DNA或RNA時，它已經被轉化。例如，通過轉染、轉導或其他技術引入新的基因材料，將細胞從其天然狀態進行基因改造。轉染或轉導後，轉化的DNA可以通過物理整合到細胞的染色體中與細胞的DNA重新結合，或者可以暫時維持在遊離體元件上而不被複製，或者可以作為質粒獨立複製。當轉化的DNA隨著細胞的分裂被複製時，細胞被認為是「穩定轉化的」。

術語「轉染」是指細胞對外來或外源DNA的攝取。許多轉染技術是本領域公知的，並在此公開。 參見，例如，格雷厄姆 等人，病毒學，1973，52：456；桑布魯克 等 .《分子克隆：實驗室手冊》，2001年，同上；D·阿維斯 等 .，分子生物學基本方法，1986年，愛思唯爾；朱 等 ., 基因, 1981, 13：197.

術語「轉導」是指通過病毒載體將外源DNA引入細胞的過程。 參見，例如，鐘斯 等人。遺傳學：原理與分析，1998年，波士頓：鐘斯和巴特利特出版社。

術語「多肽」或「蛋白質」是指具有蛋白質的胺基酸序列的大分子，包括從天然序列的一個或多個胺基酸的缺失、添加和/或取代。術語「多肽」和「蛋白質」具體包括抗原結合分子、抗體或序列，這些分子、抗體或序列從抗原結合蛋白的一種或多種胺基酸中缺失、添加和/或取代。術語“息肉潮汐片段”是指與全長天然蛋白相比具有胺基末端缺失、羧基末端缺失和/或內部缺失的多肽。與天然蛋白質相比，這些片段還可以含有修飾的胺基酸。有用的多肽片段包括抗原結合分子的免疫功能片段。

術語「分離」意味著(i)不含至少一些通常與之相關的其他蛋白質，(ii)基本上不含來自同一來源的其他蛋白質，例如來自同一物種，(iii)從至少約50%的多核苷酸，脂質，碳水化合物或與其自然界相關的其他物質中分離出來，(iv)可操作地(通過共價或N共價相互作用)與多肽結合，而多肽在自然界中不相關，或(v)在自然界中不發生。

多肽( 例如，抗原結合分子)的“變異體”包括胺基酸序列，其中一個或多個胺基酸殘基相對於另一個多肽序列入、刪除和/或取代到胺基酸序列中。變異體包括融合蛋白。

術語「同一性」是指通過對齊和比較序列確定的兩個或多個多肽分子或兩個或多個核酸分子的序列之間的關係。“同一性百分比”是指比較分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，並根據被比較的最小分子的si ze計算得出。對於這些計算，對齊中的間隙(如果有的話)最好由特定的數學模式或計算機程式( 即“演算法”)來解決。

為了計算百分比恆等式，比較的序列通常以序列之間最大匹配的方式對齊。可用於確定百分比身份的計算機程式的一個例子是GCG程式包，其中包括GAP(Devereux et al.，核。酸性研究，1984, 12, 387；威斯康星大學遺傳學計算機組，威斯康星州麥迪森)。計算機演算法GAP用於對齊要確定百分比序列同一性的兩種多肽或多核苷酸。這些序列通過其各自胺基酸或核苷酸的最佳匹配(由演算法確定的“匹配跨度”)進行對齊。在某些實施態樣中，標準比較基質( 參見，例如，Dayhoff 等人，1978，蛋白質序列和結構圖譜，1978，5：345-352用於PAM 250比較矩陣；海尼科夫 等 ., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992, 89, 10915-10919用於BLO-SUM 62 比較矩陣)也被演算法使用。

如本文所使用者，該二十種常規(例如天然存在的)胺基酸及其縮寫係遵循常規用法。參見，例如Immunology A Synthesis(2nd Edition, Golub and Green, Eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass.(1991))(其以引用方式併入本文以用於任何目的)。該二十種常規胺基酸、非天然胺基酸，諸如α-,α-二取代之胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸及其他非常規胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)亦可為本發明多肽之合適組分。非常規胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基-麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、e-N-乙醯離胺酸、0-磷酸絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似之胺基酸和亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。按照標準使用和慣例，本文所使用之多肽符號中，左手方向為胺基端方向，右手方向為羧基端方向。

保守性胺基酸取代可包含非天然存在之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成方法納入，而非藉由在生物系統中合成納入。這些包括肽模擬物及胺基酸部分之其他反轉或倒轉形式。天然存在之殘基可基於共通之側鏈性質分成幾類： a)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； b)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； c)酸性：Asp、Glu； d)鹼性：His、Lys、Arg； e)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；和 f)芳香族：Trp、Tyr、Phe。

例如，非保守替換可能涉及將其中一個類的成員交換為另一個類的成員。

根據某些實施態樣，在對抗原結合分子、經工程處理之T細胞的共刺激或活化域進行改變時，可考慮胺基酸之親水指數。各胺基酸均已基於其疏水性和電荷特性而被指定親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩胺醯胺(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；和精胺酸(-4.5)。參見，例如Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol., 157, 105-131。已知某些胺基酸可取代具有類似親水指數或分數的其他胺基酸且仍然保留類似之生物活性。本技藝亦理解相似胺基酸可基於親水性有效地進行取代，特別是當由此創建之生物學上的功能性蛋白質或肽係意圖用於免疫學實施態樣時(如同本案例中者)。示例性胺基酸取代列於表5中。

術語“衍生物”係指包括除胺基酸(或核酸)之插入、缺失或取代以外的化學修飾之分子。於某些實施態樣中，衍生物包含共價修飾，包括，但不限於與聚合物、脂質或其他有機或無機部分化學鍵結。於某些實施態樣中，經化學修飾之抗原結合分子可具有較未經化學修飾之抗原結合分子更長的循環半衰期。於一些實施態樣中，衍生性抗原結合分子係經共價修飾以包括一或多種水溶性聚合物連接物，包括，但不限於聚乙二醇、聚氧基乙二醇或聚丙二醇。

肽類似物通常以具有類似於模板肽之性能的非肽藥物形式用於製藥工業中。這些類型之非肽化合物被稱為“肽模擬物(peptide mimetic)”或“肽模擬物(peptidomimetic)”。Fauchere, J. L., 1986, Adv. Drug Res., 1986, 15, 29；Veber, D. F. & Freidinger, R. M., 1985, Trends in Neuroscience, 8, 392-396；和Evans, B. E., et al., 1987, J. Med. Chem., 30, 1229-1239(其以引用方式併入本文以用於任何目的)。

術語「治療有效量」 是指確定在哺乳動物中產生治療反應的CAR-B細胞的量。這種治療有效量很容易通過本領域普通技術人員之一確定。

術語「患者」和「個體」可以互換使用，包括人和非人動物個體以及患有正式診斷疾病的個體、沒有正式認可的疾病的人、接受醫療護理的人、有患疾病風險的人等。

術語“ 治療 (treat)”和“ 治療 (treatment)”包括治療性治療、預防性治療，以及其中降低個體發展出疾病或其他風險因素之風險的應用。治療不需要完全治癒疾病且包含其中個體減輕症狀或潛在風險因素的實施態樣。“預防”一詞並不要求100%排除事件發生的可能性。相反地，其表示在化合物或方法存在之情況下，事件發生的可能性已降低。

標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成以及組織培養和轉形(例如電穿孔、脂質轉染)。酶催化性反應和純化技術可根據製造商之說明書或依本技藝中通常熟練的或依本文之描述進行。前述技術和程序通常可根據本技藝所周知之常規方法進行及依本專利說明書全文中所引用和討論之各種一般和更具體的參考文獻中之描述執行。參見，例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989))(其以引用方式併入本文以用於任何目的)。 序列

下列序列將進一步例示本發明： CD28跨膜域-小鼠 CD28跨膜域-小鼠 CD28跨膜域-人 CD28跨膜域-人 CD19胞質域-人 CD19胞質域-人 CD40胞質域-人 CD40胞質域-人 CD40+CD79b胞質域-人 CD40+CD79b胞質域-人 CD40+CD137胞質域-人 CD40+CD137胞質域-人 CD137胞質域-人 CD137胞質域-人 CD40及Fcγ受體2a胞質域-人 CD40及Fcγ受體2a胞質域-人 Fcγ受體2a胞質域-人 Fcγ受體2a胞質域-人 Myd88+CD40胞質域-人 Myd88+CD40胞質域-人 Myd88胞質域-人 Myd88胞質域-人 CD79a胞質域-人 CD79a胞質域-人 CD79b胞質域-人 CD79b胞質域-人 CD8鉸鏈域-人 CD8鉸鏈域-人 具有3X strep II標籤之間隔子 具有3X strep II標籤之間隔子 人IgG1 Fc(跨膜形式) 人IgG1 Fc(跨膜形式) 抗huPSMA scFv 抗huPSMA scFv 抗肌膜蛋白聚醣scFv 抗肌膜蛋白聚醣scFv 抗hu GPC3 scFv 抗hu GPC3 scFv pWF-82 pWF-82 pWF-83 pWF-83 pWF-84： pWF-84： pWF-85： pWF-85： pWF-86 pWF-86： pWF-87： pWF-87： pWF-88： pWF-88： pWF-89： pWF-89： pWF-391： pWF-391： pWF-394： pWF-394： pWF-396： pWF-396： pWF-397： pWF-397： pWF-460： pWF-460： pWF-428： pWF-428： pWF-429： pWF-429： mu CXCL13 mu CXCL13 mu FLT3LG mu FLT3LG mu XCL1 mu XCL1 mu Tim4(ECD)-muIgG2a Fc mu Tim4(ECD)-muIgG2a Fc mu 4-1BB-L mu 4-1BB-L mu LIGHT(缺少切割突變異體) mu LIGHT(缺少切割突變異體) mu IL12(跨膜形式) mu IL12(跨膜形式) mu IL12(分泌形式) mu IL12(分泌形式) mu IFNα A2 mu IFNα A2 mu CD80 mu CD80 mu CD40-L mu CD40-L mu IL21 mu IL21 mu CCL21 mu CCL21 抗mu CD3 scFv-跨膜 抗mu CD3 scFv-跨膜 mu TSLP mu TSLP mu GM-CSF mu GM-CSF mu IFNγ mu IFNγ mu IL7 mu IL7 mu ICOS-L mu ICOS-L mu CD47 mu CD47 Mu肌膜蛋白聚醣α： Mu肌膜蛋白聚醣α： Mu FGF10 Mu FGF10 Mu集聚蛋白 Mu集聚蛋白 Mu IL10 Mu IL10 Mu MYDGF (C19orf10) Mu MYDGF (C19orf10) pWF-521 pWF-521 pWF-533 pWF-533 pWF-534 pWF-534 mu IL15 mu IL15 抗人GPC3 CAR(79a) 抗人GPC3 CAR(79a) 抗人PSMA(XENP14484) CAR 79a 抗人PSMA(XENP14484) CAR 79a 小鼠IL 12a-小鼠IgG2a Fc 小鼠IL 12a-小鼠IgG2a Fc 小鼠IL 12b-小鼠IgG2a Fc 小鼠IL 12b-小鼠IgG2a Fc 小鼠IL 12a-小鼠IgG2a Fc(緘默(Silent)) 小鼠IL 12a-小鼠IgG2a Fc(緘默(Silent)) 小鼠IL 12b-小鼠IgG2a Fc(緘默(Silent)) 小鼠IL 12b-小鼠IgG2a Fc(緘默(Silent)) CD3ζ胞質域-人 CD3ζ胞質域-人 pWF-506 pWF-506 pWF-507： pWF-507： pWF-508： pWF-508： pWF-509： pWF-509： pWF-510： pWF-510： 在本文中所使用之選殖株GPC3-TM-OVA之核酸及胺基酸序列列示如下。 huGPC3 胞外域 - 小鼠 CD80 ( 跨膜 + 胞質域 )+OVA(MHC I, MHC II) 表位 以引用方式併入

本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請在此通過引用而納入，其程度與每個單獨的出版物、專利或專利申請被具體和單獨地指出為通過引用而納入一樣。然而，在此引用參考文獻不應理解為承認該參考文獻是本發明的現有技術。如果在參考文獻中提供的任何定義或術語與本文提供的術語和討論不同，則以本術語和定義為準。 等效物

上述書面說明被認為足以使本領域的技術人員實施本發明。前述描述和實例詳細說明了本發明的某些優選實施態樣，並描述了發明人所設想的最佳模式。然而，可以理解的是，無論前述內容在文本中顯得多麼詳細，本發明可以以多種方式實施，並且本發明應根據所附的申請專利範圍及其任何等效物來解釋。

以下實施例，包括所進行的實驗和取得的結果，僅用於說明目的，不應理解為對本發明的限制。 實施例 實施例 1- 結合 PSMA 的 B 細胞嵌合抗原受體 (CAR-B) 構築體

DNA 構築體。例示性的CAR-B構築體係經設計以辨識前列腺特異性膜抗原(“PSMA”)。PSMA是一種抗原，其在前列腺癌細胞上比在其他非癌細胞上表現得更高。所製造的各種構築體，包含胞外域，其包含對PSMA具特異性之scFv、來自CD8之胞外鉸鏈區、CD28跨膜域、及各種胞內傳訊域。構築體的清單係提供於表6中。

抗 PSMA CAR-B 在 HEK-293 細胞上之表現。編碼pWF82至pWF89的構築體，係使用Takara慢病毒製備套組，用以在Lentix細胞中製備慢病毒。各種CAR-B構築體的表現，係使用流式細胞分析技術、使用對PSMA具特異性的抗體(生物素-PSMA，Sinobiological)來測量，並描繪於圖5中。

抗 PSMA CAR-B 在人 B 細胞中的表現。為了測量抗PSMA CAR-B在B細胞中的表現和結合，另外進行了兩種構築體：

基於MMLV的載體用於製備反轉錄病毒。反轉錄病毒用於感染從脾臟分離的小鼠B細胞。轉導後，B細胞在表現CD40L和可溶性IL-4的飼養層細胞上進一步擴增。使用重組生物素-PSMA檢測抗PSMA CAR-B的表現。PE標記的抗生物素蛋白鏈黴菌素(streptavidin)用於檢測HEK-293細胞中的PSMA結合。

結果。該實驗的結果如圖6所示，並證明可以產生表現CAR-B的小鼠B細胞，該CAR-B可以特異性地與抗原結合。例如，表現pWF396或pWF397的B細胞與PSMA結合，而表現pWF394的B細胞不結合PSMA pWF398被設計為結合肌膜蛋白聚醣而不是PSMA)。 實施例 2- 結合 GPC3 的嵌合抗原受體 B 細胞 (CAR-B) 構築體

DNA 構築體。典型的CAR構體被設計成識別磷酯醯肌醇蛋白聚醣(glypican-3(GPC-3))。磷酯醯肌醇蛋白聚醣-3，不只在其他腫瘤類型中、在肝細胞癌細胞上表現，但在大多數非癌細胞上不表現。GPC3可用於靶向抗GPC3 CAR至肝細胞癌，以及表現GPC3的其他癌症(例如卵巢透明細胞癌、兒科癌症、肺癌(即肺腺癌和肺鱗狀細胞癌)、尿路上皮癌、甲狀腺癌、胃癌等)。製備了各種構築體，包括胞外域，該域包括GPC-3特異性scFv，CD8的胞外鉸鏈域，CD28跨膜域和各種胞內傳訊域。構建了額外的抗PSMA CAR-B作為這些實驗的對照。表8中提供了構築體的清單。

抗 GPC-3 在 HEK-293 細胞上的表現。慢病毒轉導用於在HEK293細胞表面表現GPC3 CAR-B蛋白。以針對GPC-3的抗獨特型抗體(Eureka Therapeutics)藉由流式細胞分析技術來測定表現。

抗 GPC-3 CAR-B 在人 B 細胞中的表現。使用pWF 396、397和398(編碼CAR構築體)製備MMLV反轉錄病毒。該反轉錄病毒用於轉導藉由負向選擇(Stem Cell Technologies)分離的小鼠B細胞，並藉由與表現CD40L的HeLa細胞共培養並加入可溶性IL-4來活化24小時。轉導後48小時，使用流式細胞分析技術確認表現。使用針對人GPC-3的抗獨特型抗體來測定CAR-B的表現。抗獨特型抗體是從Eureka Therapeutics獲得的。

結果。表現抗GPC-3 CAR-B，pWF-396和397，的小鼠B細胞經表現，且被抗GPC3獨特型抗體特異性結合。 實施例 3- 表現 GFP 的腺病毒變異體 F35

表現GFP的腺病毒變異體F35被證明可以有效地感染人B細胞。從周邊血液中分離出人B細胞。以編碼GFP的腺病毒來感染B細胞，體積為0、1、3、10μL。腺病毒製劑的效價約為1 x e ¹²個顆粒/ml。 實施例 4- 向腫瘤細胞遞送負載藥物

進行了一項大型篩選研究，以檢驗負載藥物對CT26模式中NIH3T3纖維母細胞的影響。負載藥物包括各種免疫調節劑，包括細胞介素和趨化介素。首先，將BALB/c小鼠的CT26腫瘤注射到其左側腹和右側腹。參見圖8。12天和16天後，注射4-5種負載藥物的各種組合，至小鼠右側腹腫瘤中。測量腫瘤體積長達35天。

生成 BALB/C CT26 腫瘤模式。共有139隻小鼠以CT26腫瘤注射到它們的左右兩側腹。

負載藥物的選擇。鑑定了12種胜肽的潛力：(i)募集和活化樹突細胞；(ii)啟動樹突細胞和T細胞進入腫瘤部位的歸巢和引導；(iii)活化效應T細胞。篩選的負載藥物列於表9中。

各給予4-5個負載藥物的組合、或所有12個負載藥物、抑或給予3T3細胞(無負載藥物)或食鹽水作為對照。總共有二十七組(n=5隻小鼠/組)。實驗組如表10所示。

給劑。第一次注射時，腫瘤體積在100mm ³和150mm ³之間。對於接受4個負載藥物的組，每次注射以2.5 x 10 ⁵個細胞遞輸每個負載藥物，總共10 ⁶個細胞。對於接受5個負載藥物的組，每次注射以[x]個細胞輸送每個負載藥物，總共3 x 10 ⁶個細胞。第五負載藥物與Poly(I：C)共同投予，Poly(I：C)是一種ds-RNA類似物。負載藥物通過腫瘤內注射投予。除聚(I：C)組和大的12種組外，所有組的投予體積均為50 μL，其中體積為150 μL。

負載投予程序。用versene收穫細胞(不在胰蛋白酶存在下)。收集後，將細胞計數、瞬時離心並重懸浮，體積可在細胞計數後調節至20 x 10 ⁶/ml。TLR促效劑(Invivogen Cat# ODN:1826)通過在提供的水中重懸浮凍乾粉末。將TLR促效劑重懸浮於10mg/ml並加熱至70℃，然後在使用前在室溫下靜置1小時。TLR促效劑的劑量為50μl中為50μg。

結果。結果如圖9-11所示。同側注射的負載藥物的幾種組合在該模式中表現出對側腫瘤的抗腫瘤活性，表現為腫瘤生長延遲。第3、8和21組在30天內顯示出最顯著的腫瘤生長損傷。 實施例 5- 表現和分泌負載藥物的經修飾之 B 細胞

試驗設計。採用BALB/c小鼠CT26腫瘤模式評價表現各種負載藥物的經修飾之B細胞對腫瘤體積和存活率的療效。以100μL的體積向小鼠注射腫瘤細胞。在第6天，一旦腫瘤達到175mm ³的體積，小鼠注射表現如下所述各種負載藥物的經修飾之B細胞。測量腫瘤體積和存活共17天。

小鼠PBMC或脾細胞分別從血液或脾臟中分離。PBMC使用淋巴細胞-M(CedarLane，Cat#CL5030)分離。通過70微米尼龍手動細胞過濾器來分離脾細胞。然後使用EasySep®小鼠B細胞分離套組(Stem Cell Technologies, Cat #19854)通過免疫磁陰性選擇從PBMC或脾細胞中分離B細胞。

負載藥物的篩選。表現負載藥物肽或蛋白質的核酸序列被轉染或轉導到分離的B細胞中。鑒定了以下十二種肽的潛力：(i)募集和活化樹突細胞；(ii)啟動樹突細胞和T細胞進入腫瘤部位的歸巢和引導；(iii)活化效應T細胞。篩選的負載藥物列於表9中。

每隻小鼠給予4-5個負載藥物的組合，或分離B細胞(無負載藥物)或鹽水作為對照。總共有27組(n=5隻小鼠/組)。實驗組如表11所示。

表現負載藥物的B細胞之產生。對於轉染，將純化或培養的B細胞以每毫升5 x 10 ⁶至25 x 10 ⁶cells洗滌並懸浮在Cytoporation Medium T (BTX, Cat # 47-0002)中，並與7.5μg至50μgRNA混合(RNA構築體在內部設計和製備或使用CleanCap®從TriLink購買並完全替換為偽U(Pseudo-U))。使用BTX Agilpulse®電穿孔系統來電穿孔，200 μL細胞/RNA懸浮液。

給劑。第一次注射時，腫瘤體積在100 mm ³和150 mm ³之間。對於接受4個負載藥物的組，每次注射以2.5 x 10 ⁵個細胞遞輸每個負載藥物，總共10 ⁶個細胞。對於接受5個負載藥物的組，每次注射以2.5 x 10 ⁵個細胞輸送每個負載藥物，總共1.25 x 10 ⁶個細胞。。負載藥物在腫瘤內注射。接受4個負載藥物的組的投予體積為50μL，接受5個負載藥物的組的投予體積為100 μ L。

有效負載投了程序。用versene收穫細胞(不在胰蛋白酶存在下)。收集後，將細胞計數、瞬時離心並重懸浮，體積可在細胞計數後調節至20 x 10 ⁶/ml。TLR促效劑(Invivogen Cat# ODN:1826)通過在提供的水中重懸浮凍乾粉末。將TLR促效劑重懸浮於10mg/ml並加熱至70℃，然後在使用前在室溫下靜置1小時。TLR促效劑的劑量為50μl中為50μg。 實施例 6- 瘤內注射 B 細胞的抗腫瘤活性

通過使用70微米尼龍手動細胞過濾器來分離獲得小鼠脾細胞。使用自體(BALB/c)或同種異體(C57Bl/6)供體小鼠(顯示的數據利用了同種異體B細胞)。通過EasySep®小鼠B細胞分離套組(Stem Cell Technologies®, Cat #19854)使用免疫磁性陰性細胞從上述脾細胞中分離B細胞。

然後將B細胞注射(i)新鮮或(ii)首先在生長培養基(RPMI，10%FBS，1%Pen/Strep，5ng/ml重組小鼠IL-4，100uM β-巰基乙醇)中刺激16-24小時，含5μg/ ml脂多糖。接著，5X10 ⁶個B細胞係經腫瘤內注射到CT26小鼠模式中，並測量遠端(abscopal)腫瘤的抗腫瘤反應。腫瘤在第0天被植入，在第6天觀察到可觸摸到的腫瘤塊。在第6天開始腫瘤內治療。結果如圖12所示。 實施例 7- 使用 RNA 電穿孔製造 CAR B 細胞的嵌合抗原受體 (CAR) 在 B 細胞中的表現

從血液或脾臟中分離小鼠PBMC或脾細胞如下。使用淋巴細胞-M(CedarLane，Cat#CL5030)分離小鼠PBMC，並通過70微米70微米尼龍手動細胞過濾器來分離脾細胞。然後，使用EasySep®小鼠B細胞分離套組(Stem Cell Technologies,，Cat#19854)通過免疫磁陰性選擇分別從PBMC或脾細胞中分離B細胞。

然後將B細胞在生長培養基(RPMI，10%FBS，1%Pen/Strep，5ng/ml重組小鼠IL-4和100uUM β-巰基乙醇)中與5-15ug/ml脂多糖一起進行S滴定16-24小時。然後使用已知技術(病毒轉染或電穿孔)轉導或轉染B細胞，以實現CAR-B的穩定或暫態表現。加入strepII標籤用於轉譯後檢測。所描繪的具有代表性的CAR-B如下： 1. XENP PSMA CBCR (3X strep II標籤) 2. HyHEL10 CBCR (3X strep II標籤) 3. D1.3-M3 HEL CBCR (3X strep II標籤)

對於轉染，將純化或培養的B細胞洗滌並懸浮在細胞穿孔培養基T(BTX，Cat #47-0002)中，每毫升5x10 ⁶至25x10 ⁶個細胞，並與7.5ug至50ug RNA混合(RNA構築體在內部設計和製備或使用CleanCap®從TriLink購買，並完全用偽U取代)。獲得200ul細胞/RNA懸浮液並使用BTX敏捷脈衝®電穿孔系統進行電穿孔。然後將細胞在PBS中洗滌並準備IV注射到具有表現各自抗原的已建立HepG2腫瘤細胞(例如GPC3，HEL，PSMA)的免疫功能不全的小鼠中。然後使用抗鏈球菌II標籤抗體測量目標蛋白的轉譯和表現。結果重新列於圖13中。如圖13所示，X軸顯示通過流式細胞術測量的表現信號強度，Y軸表示表現所需目標蛋白質(PSMA，HEL)的細胞百分比。

該實驗表明，所欲RNA序列成功轉染或轉導(相應地)，RNA成功轉譯，並且感興趣的目標蛋白質在細胞表面表現。 實施例 8- 表現整聯蛋白和歸巢受體的經修飾之 B 細胞

表現整聯蛋白、歸巢受體或兩者的N核酸構築體是使用已知技術構建的。小鼠和人B細胞用核酸構築體轉染或轉導(相應地)以表現整聯蛋白，歸巢接收或兩者兼而有之。這些修飾的細胞通過靜脈注射到小鼠或人宿主中。延時成像將測量修飾的B細胞在感興趣的位點/靶標的積累，例如歸巢或靶組織，特定位置或組織中的炎症部位，或腫瘤或腫瘤微環境，以確定整聯蛋白和/或具有確定歸巢特異性的歸巢受體的表現賦予B細胞在位點/靶點和在位點/靶點積累的能力t需要輸送治療負載藥物的地方。根據實施例5的技術進行篩選研究，以檢查負載藥物在目標地點/目標的傳遞和效果。 實施例 9- 改變 B 細胞運輸

分離的B細胞用特定濃度的全反式維甲酸(ATRA)或其衍生物培養，誘導α4β7整聯蛋白和歸巢受體CCR9的表現。此後，收穫B細胞並靜脈內投予到小鼠體內。受體小鼠有兩個實驗組。第一組小鼠用DSS或TNBS預處理以誘導腸道炎症。第二組小鼠不用DSS或TNBS治療。類似於在腸碗疾病中觀察到的炎症是通過DSS或TNBS預處理引起的。用ATRA或其衍生物處理的B細胞將位於與其歸巢潛力一致的炎症區域，這是由於α4β7整聯蛋白和歸巢受體CCR9的表現增加。 實施例 10- 表現免疫抑制分子的經修飾之 B 細胞

表現選自IL-10、TGF-β、PD-L1、PD-L2、LAG-3和TIM-3或其任何組合的免疫抑制分子的核酸構築體是使用已知技術構建的。小鼠和人B細胞用核酸構築體轉染或轉導(相應地)以表現上述一種或多種免疫抑制分子。這些修飾的細胞在靜脈內投予到小鼠或人宿主或炎症部位附近或其他地方。延時成像將測量修飾的B細胞在感興趣的位點/靶標的積累，例如歸巢或靶組織，特定位置或組織中的炎症部位，或腫瘤或腫瘤微環境，以確定該部位的炎症和定位於該部位的B細胞的自身免疫活性降低，從而導致積極的治療反應。 實施例 11- 使用 TLR 啟動 B 細胞

用TLR促效劑處理B細胞和/或修飾以表現組成活性TLR，用於增強B細胞的免疫反應和產生有效的效應B細胞以增加個體的抗原特異性免疫反應。分離的I小鼠或人B細胞在體 外用TLR促效劑在體外處理，同時或在投予B細胞之前。在某些情況下，用一種以上的TLR促效劑處理小鼠或人B細胞。

修飾的B細胞，反式或轉導有或沒有上述示例的CAR-B構築體，被設計成表現一個或多個組成活性TLR。在組成型啟動的轉錄途徑的控制下，將每個TLR作為DNA指導引入修飾的B細胞(使用已知技術轉導或轉染)。表現一個或多個組成活性TLR(有或沒有CAR-B構築體)的經修飾之B細胞也在同時或在將修飾的B細胞投予於需要的個體或患者之前用一種或多種TLR促效劑治療。延時成像和其他已知技術將測量修飾的B細胞在所需位置的積累，並確認TLR和任何具有確定特異性的表現CAR-B的表現。

該實驗將證明編碼特定目標TLR的所需DNA序列成功轉染或轉導(相應地)到B細胞中，有或沒有CAR-B構築體，有或沒有TLR促效劑處理，RNA成功轉譯，所需的TLR在B細胞中表現，以產生有效的效應B細胞增強B細胞的免疫反應。 實施例 12- 使用 RNA 電穿孔 B 細胞在 HLA I 類和 II 類分子中呈遞抗原

mRNA 構築體。通過將特定抗原(例如腫瘤抗原或傳染病抗原)融合到溶酶體蛋白LAMP1的靶向信號來設計示例性mRNA構築體，以將特異性抗原靶向溶酶體，並在HLA I類和II類分子中同時有效地呈遞抗原。腫瘤抗原和傳染病抗原是本領域公知的，並且可以包括任何需要免疫反應的抗原。由各種mRNA構築體編碼至少一種與LAMP1靶向信號融合的目標特異性抗原，當轉染到合適的免疫細胞中時，HLA I類和II類分子能夠同時有效地呈遞特異性抗原。

試驗設計。使用已知的mRNA電穿孔技術，用上述mRNA構築體在體 外電穿孔分離的小鼠或人B細胞(即，編碼融合到LAMP1靶向信號的特定抗原)。在某些情況下，小鼠或人B細胞也根據上述任何檢查要求使用具有CAR-B構築體的已知技術進行轉導或轉染。將mRNA電穿孔B細胞，轉導有或沒有感興趣的CAR-B構築體，靜脈內引入小鼠或人宿主。延時成像將測量修飾的B細胞在所需位置的積累，以及具有確定特異性的CAR-B的堅定表現。使用已知技術測量特定腫瘤抗原或感興趣的傳染病抗原的轉譯和表現，以確定目標抗原靶向裂解卵小體，並通過HLA I類和II類分子同時有效地呈遞。

該實驗將證明編碼與靶向信號融合的特定目標抗原的所需mRNA序列成功轉染到B細胞中(如果需要，也可以用CAR-B構築體轉導)，mRNA成功轉譯，電轉和修飾的B細胞同時有效地通過HLA I類和dII類分子，用於增加個體的抗原特異性免疫反應。 實施例 13- 表現 PSMA 特異性 CAR 的 B 細胞減少 CT26-PSMA 腫瘤中的腫瘤生長

小鼠腫瘤模式。使用BALB/c CT26-PSMA腫瘤模式來表現人PSMA，用於評估PSMA特異性CAR工程鼠B細胞對腫瘤體積和存活率的療效。將8周齡BALB/c小鼠注射在後側的一個後側，體積為50μl的1.0x10 ⁶CT26-PSMA腫瘤細胞。在第5天，當腫瘤體積達到約60mm ³時，將小鼠平均分配到3組10隻小鼠中。在第6天開始使用編碼兩種不同PSMA特異性CAR形式的mRNA改造的小鼠B細胞或以100μl中的1.5x10 ⁶細胞或鹽水的劑量靜脈內投予的非工程B細胞在第6天開始治療小鼠。在第5、9、11和13天使用卡尺測量腫瘤體積。在第13天，PSMA-CAR組(形式79a)相對於saline的腫瘤減少了57%，具有統計學意義。相對於生理鹽水，PSMA-CAR治療組(形式79b)在第13天腫瘤體積沒有顯著減少(圖14)。

小鼠 B 細胞工程。通過70微米尼龍細胞過濾器手動細胞分離，從BALB/c供體脾中分離小鼠脾細胞。然後使用EasySep小鼠B細胞分離套組(Stem Cell Technologies,Cat#19854)通過免疫磁性陰性選擇從脾細胞中分離B細胞。用抗CD40(250ng/ml)在growth培養基(RPMI，10%FBS，25mM HEPES，1%Pen/Strep，5ng/ml重組小鼠IL-4，100μMβ-巰基乙醇)中刺激B細胞24小時。然後使用BTX AgilePulse電孔在設置為280V的系統上，每3.6x10 ⁶B細胞用20μgCAR mRNA構築體電穿孔細胞1ms。將細胞洗滌並以15x10 ⁶B細胞/ ml的濃度重懸於PBS中。每劑使用100μl細胞懸液。 PSMA構築體CD79a：pmRNA_d7_13_抗hPSMA (XENP14484) scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79aE #ab-1 PSMA構築體CD79b：pmRNA_d7_13_抗hPSMA (XENP14484) scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79bE #ac-1 實施例 14- 表現 PSMA 特異性 CAR 的同種異體 B 細胞減少 CT26-PSMA 腫瘤中的腫瘤生長

小鼠腫瘤模式。使用BALB/c CT26-PSMA腫瘤模式用於評估PSMA特異性CAR工程異基因鼠B細胞對腫瘤體積和存活率的療效。將8周齡BALB/c小鼠注射在後側的一個後側，體積為50μl的1.0x10 ⁶CT26-PSMA腫瘤細胞。在第5天，當腫瘤體積達到約70mm ³時，將小鼠平均分配到3組10隻小鼠中。在第6天開始使用編碼PSMA特異性CAR的mRNA改造的自體鼠B細胞和編碼CCR7的mRNA或用編碼PSMA特異性CAR的mRN A改造的同種異體鼠B細胞，以1.5x10 ⁶細胞的劑量在100μl或鹽水中靜脈內投予。在第5、8和10天使用卡尺測量腫瘤體積。在第10天，相對於鹽水，同種異體和自體工程B細胞組的腫瘤減少了51%)圖15)。(p＜0.005)。

小鼠 B 細胞工程。通過70微米尼龍細胞篩檢程式手動細胞分離，從自體BALB/c和同種異體C57Bl/6供體脾中分離小鼠脾細胞。然後使用EasySep小鼠B細胞分離套組(Stem Cell Technologies,Cat#19854)通過免疫磁性陰性選擇從脾細胞中分離B細胞。用抗CD40(250ng/ml)在生長培養基)RPMI，10%FBS，25mM HEPES，1%Pen/Strep，5ng/ml重組小鼠IL-4，100μM β-巰基乙醇)中刺激B細胞24小時。然後使用設置為280V的BTX AgilePulse電穿孔系統，每3.6x10 ⁶B細胞用20ug CAR mRNA構築體電穿孔細胞1ms。洗滌細胞並以15x10 ⁶B細胞/ ml的濃度重懸於PBS中。每劑使用100μl細胞懸液。 實施例 15-PSMA-CAR 工程 B 細胞的抗腫瘤活性取決於完整的宿主免疫系統

小鼠腫瘤模式。在WT和免疫功能低下的NSG小鼠中研究了抗腫瘤PSMA-CAR B細胞的有效性。

WT 老鼠。使用設計用於表現人PSMA的BALB/c CT26-PSMA腫瘤模式來評估PSMA特異性CAR工程鼠B細胞對WT小鼠腫瘤體積和存活率的療效。將8周齡BALB/c小鼠注射在後側的一個後側，體積為50μl的1.0x10 ⁶CT26-PSMA腫瘤細胞。在第5天，當腫瘤體積達到約60mm ³時，將小鼠平均分配到4組10mice。在第6天開始使用編碼兩種不同PSMA特異性CAR形式的mRNA改造的小鼠B細胞或以100μl中的1.5x10 ⁶細胞或鹽水的劑量靜脈內投予的非工程B細胞在第6天開始治療小鼠。在第5、9、11和13天使用卡尺測量腫瘤體積。在第13天，PSMA-CAR組(形式79a)相對於生理鹽水的腫瘤減少了57%，具有統計學意義。相對於生理鹽水，PSMA-C AR治療組(形式79b)或未工程B細胞在第13天沒有顯著減少腫瘤體積(圖14)。

核供應國集團老鼠。使用設計用於表現人PSMA的BALB/c CT26-PSMA腫瘤模式來評估PSMA特異性CAR工程鼠B細胞對免疫功能低下小鼠腫瘤體積和存活率的療效。將8周齡NSG小鼠注射在後側的一個後側，體積為50μl的1.0x10 ⁶CT26-PSMA腫瘤細胞。在第5天，當腫瘤體積達到約60mm ³時，將小鼠平均分配到2組10隻小鼠中。在第6天使用編碼PSMA特異性CAR形式的mRNA改造的小鼠B細胞在第6天以100μl中的1.5x10 ⁶細胞或鹽水的劑量靜脈內投予小鼠B細胞。在第5、8、10和13天使用卡尺測量腫瘤體積。在第13天，PSMA-CAR組(形式79a)相對於生理鹽水的腫瘤體積沒有顯著減少(圖16B)。

小鼠 B 細胞工程。通過70微米尼龍手動細胞過濾器來分離細胞，從自體BALB/c和同種異體ic C57Bl/6供體脾中分離小鼠脾細胞。然後使用EasySep小鼠B細胞分離套組(Stem Cell Technologies,Cat#19854)通過免疫磁性陰性選擇從脾細胞中分離B細胞。在生長培養基(RPMI，10%FBS，25mM HEPES，1%Pen/Strep，5ng/ml重組小鼠IL-4，100μMβ-巰基乙醇)中用抗CD40(250ng/ml)刺激B細胞24小時。然後使用設置為280V的BTX AgilePulse電穿孔系統，每3.6x10 ⁶B細胞用20ug CAR mRNA構築體電穿孔細胞1ms。將細胞洗滌並以15x10 ^6B細胞/ml的濃度重懸於PBS中。每劑量使用100μl細胞懸液。 PSMA構築體CD79a：pmRNA_d7_13_抗hPSMA (XENP14484) scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79aE #ab-1 PSMA構築體CD79b：pmRNA_d7_13_抗hPSMA (XENP14484) scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79bE #ac-1 實施例 16- 表現 GPC3 特異性 CAR 的 B 細胞減少 HEPA 1-6 GPC3 腫瘤中的腫瘤生長

小鼠腫瘤模式。用於表現人GPC3(HEPA 1-6-GPC3)的C57Bl/6 HEPA 1-6腫瘤模式用於評估鼠B細胞對腫瘤體積和存活率的功效。將8周齡C57Bl/6小鼠注射在後側，以200μl的體積注射5.0x10 ⁶個HEPA 1-6-GPC3腫瘤細胞。在第19天，當腫瘤體積達到約250mm ³時，將小鼠平均分配到3組，每組10隻小鼠。在第20天使用編碼GPC3特異性CAR或PSMA規格ific CAR的mRNA改造的小鼠B細胞在第20天和第27天以100μl中的1.5x10 ⁶細胞或鹽水的劑量靜脈內投予小鼠B細胞。在第19、23、26和30天使用卡尺測量腫瘤體積。在第30天，GPC3-CAR組相對於生理鹽水的腫瘤減少了68%，具有統計學意義。相對於生理鹽水，PSMA-CAR治療組在第30天的腫瘤體積沒有顯著減少。(注：本研究於2021年1月19日仍在進行中)(圖17)。

小鼠 B 細胞工程。通過70微米尼龍手動細胞過濾器來分離細胞，從C57Bl/6供體脾中分離小鼠脾細胞。然後使用EasySep小鼠B細胞分離套組(Stem Cell Technologies,，Cat#19854)通過免疫磁陰性選擇從脾細胞中分離B細胞。B細胞在生長培養基(RPMI，10%FBS，25mM HEPES，1%Pen/Strep，5ng/ml重組小鼠IL-4，100μMβ-巰基乙醇)中刺激24小時，抗CD40(250ng/ml)。然後使用設置為280V的BTX AgilePulse電穿孔系統對每3.6x10 ⁶B細胞進行20μgCAR mRNA結構電穿孔，持續1ms。洗滌細胞並以15x106 B細胞/ml的濃度重懸於PBS中。每劑使用100μl細胞懸液。 GPC3 mRNA構築體：pmRNA_d7_13_抗-hGPC3 scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79aE #15-1 PSMA構築體：pmRNA_d7_13_抗hPSMA) XENP14484) scFv-mCD8H-mCD28M-mCD79aE #ab-1 實施例 17- 多聚體化之 GPC3 可在表現 GPC3 CAR 的細胞中以劑量反應方式活化 NFB 表現螢光素酶 κ

CAR-B構築體設計：使用三種基本形式，設計五種CAR-B構築體：(i) CAR 2(scFv、鉸鏈域、跨膜域及傳訊域(見圖XA))；(ii) CAR 3(多聚體化受體複體，具有以下各項中的2個：scFv、鉸鏈域、FC域、跨膜域及胞質尾)見圖XB))；(iii) CAR 4(多聚體化受體複體，具有以下各項中的2個：(FAB域、鉸鏈域、FC域、跨膜域及胞質尾(見圖XC)。五種CAR-B構築體係如下：

NFκ B 報導檢定：抗原誘導傳訊。Ramos NF B-κ螢光素酶報導細胞係以編碼上述CAR-B構築體之一者的mRNA來轉染。Ramos NFκB-螢光素酶報導細胞在280 V及1 msec下，以10 μ g的RNA在200μL的電穿孔緩衝液中來轉染，接以在生長培養基中培養過夜。細胞在室溫下放置4小時，使細胞靜止以減少背景值。將30,000個經轉染之細胞轉移到多孔盤的每個孔中，每孔體積為30μL。接著，經轉染之Ramos細胞與GPC3蛋白(其與抗生物素蛋白鏈黴菌素多聚體化)、抗生物素蛋白鏈黴菌素對照或GPC3-Fc蛋白在生長培養基中培育3小時。在每個孔中加入30 μL的Bioglo®受質(Promega)，且孔盤在5分鐘內用光度計來讀取。如圖18中所證實，除了pWF-509(GPC3-CD79b)以外，在表現四種GPC3 CAR-B中的三種的細胞中，多聚體化之GPC3能夠活化螢光素酶的NFκB表現。在FACS檢定中，所有四種構築體都展現與GPC3的良好結合。因此，CD79b是具有良好的結合親和力的CAR未傳訊的實例。

NFκB報導檢定：低量持續傳訊。亦使用NFκB報導檢定評估低量持續傳訊。產生CAR構築體，其在沒有同族抗原結合下誘導低量持續傳訊升高。圖19顯示，四種CAR-B構築體在人B細胞報導株中表現，且在沒有同源標靶抗原下測量NFκB螢光素酶活性。每個構築都展現明顯的低量持續傳訊活性。具有低量持續傳訊的經工程化之B細胞，CAR B在體內保持高的數量，並導致替代因子或其他負載藥物的高度及持久表現。 實施例 18-CD80 負載藥物增強抗 GPC3CAR-CD79a B 細胞的抗腫瘤活性

實驗設計。同系C57Bl/6小鼠HEPA1-6GPC3腫瘤是一種人HCC模式，旨在表現人GPC3。該模式用於評估用抗GPC3CAR-CD79a和CD80負載藥物mRNA電穿孔的鼠B細胞的功效。將小鼠注射在基質膠中體積為200ul的5.0x10 ⁶HEPA1-6GPC3腫瘤細胞的一側。在第11、14和17天給予小鼠200ul IV劑量的1.5x10 ⁶個B細胞、用抗GPC3CAR-CD79a改造的B細胞、用抗GPC3CAR-CD79a改造的B細胞、或如圖20所示的鹽水。如下所述用mRNA改造B細胞。如圖20所示，在多天監測腫瘤體積。

如圖20所示，抗GPC3 CAR-CD79a和抗GPC3CAR-CD79a加CD80組合在第44天和多個早期時間點相對於鹽水或非工程B細胞顯示出統計學上的顯著效果。此外，到第44天，鹽水對照組或B細胞對照組沒有完全緩解，但抗GPC3CAR-CD79a和抗GPC3CAR-CD79a加CD80組合分別產生4和7完全緩解，如圖21A-21C所示。這些數據表明，將CD80負載藥物作為mRNA的加入增強了B細胞與抗原特異性GPC3 CAR共電穿孔的抗腫瘤活性。

B細胞製備。通過70微米尼龍手動細胞過濾器來分離機械細胞分離從C57Bl/6供體脾中分離小鼠脾細胞。然後使用EasySep小鼠B細胞分離套組(幹細胞技術，Cat #19854)通過i毫米磁陰性選擇從脾細胞中分離B細胞。B細胞在生長培養基(RPMI，10%FBS，1%Pen/Strep，5ng/ml重組小鼠IL-4，100uM β-巰基乙醇)中刺激24小時，250ng/ml CD40抗體(抗鼠CD40 Ab)。然後使用BTX AgilePulse電穿孔系統在400V下設置1ms，2ms間隔設置為5個脈衝，每1.0x10 ⁷個B細胞用20ug mRNA電穿孔細胞。當兩個mRNA共轉染時，每個mRNA使用20ug。電穿孔後立即在PBS中洗滌細胞，並以每200ul1.0x10 ⁷的劑量製備IV給藥。電穿孔後90分鐘內將電穿孔細胞投予於小鼠。

電穿孔後12小時，對少量等分試樣進行染色以表現抗GPC3CAR-CD79a和CD80表現。為了檢測抗GPC3CAR-CD79a表現，使用GPC3-Avitag和鏈霉親和素-BV421。用抗CD80-PE FACS抗體測量CD80表現。圖中的FACS圖。22A-22C顯示GPC3 CAR電穿孔後的表現。CD80在未工程化的B細胞中以基礎水平表現，因此佔~10%陽性。該水準在CAR樣本中保持不變，但在CAR+CD80樣品中顯著增加。後者提示CD80的有效表現。 實施例 19- 藉由 B細胞 活化 T 細胞

根據本發明，開發了3組分組成的系統，其包含與特定抗原來源(抗原呈現細胞或APC)和抗原特異性T細胞共同培養的CAR B細胞。方法如下。

T細胞活化係藉由測定與B細胞共培養後CD4和CD8 T細胞上CD69的表現來測量。簡而言之，CAR-B細胞是藉由用編碼CAR-B基因的mRNA轉染B細胞而製備的。在300uL電穿孔緩衝液中，B細胞在280V下電穿孔1毫秒，其中包括10ug的CAR-B mRNA和9ug的CD80 mRNA。電穿孔緩衝液中的B細胞濃度為每毫升450萬個B細胞。電穿孔後，B細胞在生長培養基中培養4至5小時。然後將B細胞與表現抗原的目標細胞共同培養。靶細胞是表現GPC3與卵清蛋白連接的293細胞或表現GPC3與卵清蛋白連接的CHO細胞。目標細胞(CHO或293)在24孔板中以每孔25萬個細胞計數，並培養24小時。第二天除去培養基，加入25萬個表現CAR-B的B細胞。培養1至2小時後，加入用T細胞分離套組(Stemcell Inc.)進行負選擇純化的CD4或CD8 T細胞。多株T細胞是從野生型C57小鼠純化，且OVA特異性CD4及CD8 T細胞分別從OT-2及OT-1小鼠純化。CAR-B細胞、標靶細胞及T細胞的共培養係在37 ^oC下培育12至18 hr。

為了測試及測量T細胞活化，細胞的混合物係經收取，並以BV421抗小鼠CD4或CD8標記(BV421)及抗CD69(FITC)來染色，接以流式細胞分析技術。

細胞表面的標靶抗原是嵌合的，其中胞外域係經CAR辨識。C端序列含有由共培養的T細胞所辨識的胺基酸序列。T細胞對目標抗原的辨識需要抗原從APC轉移到MHC匹配的B細胞，藉由MHC II進行處理和呈現。這種3成分的方法導致抗原(HEL=hen雞蛋溶菌酶)以抗原特異性的方式呈遞給T細胞，導致CD69(一種活化標誌物)的上調。使用未修飾的B細胞進行對照，以及採用表現具有不同抗原特異性的CAR的B細胞，導致CD69的背景表現，進一步支持了根據本發明的CAR B細胞以類似於本地BCR的方式行事的發現。此外，已經確定，對於在共培養中活化CD4 T細胞的效力，CD79a是比CD79b更優越的傳訊元件。

在此，HEL特異性CAR B細胞與OTII細胞一起以1：1：1的比例來共培養。約24小時後，細胞係藉由離心來回收，並予以流式細胞分析技術，使用抗CD69-PE(供應商)，對CD4細胞分群(gating)。結果以CD4 ⁺/CD69 ⁺T細胞的百分比列示於圖23。 實施例 20-CAR- 細胞的抗原特異性啟動刺激免疫增強細胞介素的產生

現在已經證明，CAR參與還導致蛋白質的分泌，包括(但不限於)IL-2，GM-CSF和TNF-α以抗原特異性方式。在體內，IL-2和其他蛋白質能夠促進局部抗原特異性T細胞的存活和活化。事實上，這可能是B細胞抗原呈遞的有效補充。一種或兩種機制可以解釋過繼轉移到荷瘤小鼠的CAR-B細胞的抗腫瘤活性。

在這裡，表現GPC3-TM-OVA的293細胞作為抗原呈遞細胞。GPC3特異性CAR B細胞與GPC3-TM-OVA-293細胞共培養。~20小時後，回收上清液並使用Cytokine A rray面板在EVE技術中測定細胞因子表現。該設計利用了CD79a共刺激域。如圖所示，與使用類似的CD79b共刺激設計相比，使用CD79a作為CAR-B中的共刺激域會產生更多的IL-2，GM-CSF和TNF-α。結果在圖24A和24B中設置。 實施例 21-B 細胞對腫瘤抗原處理及呈現

在此，測試具有及未有CD80負載藥物的B細胞對腫瘤抗原處理。抗原特異性T細胞活化，係針對對照組(多株B細胞+/-CD80)與抗原B特異性B細胞+/-CD80)相比來測量。

此實驗的結果證實B細胞的抗原特異性活化。抗原B-抗原A融合勝肽係由抗原B特異性B細胞呈現給抗原A特異性T細胞。可看出，CD80強化抗原呈現及CD4+細胞活化。CD80在抗原呈現細胞、B細胞、樹突細胞及T細胞之間提供共刺激訊息，導致T及B細胞的活化、增生及分化。結果係列於圖25中。 實施例 22-B 細胞對腫瘤抗原處理及呈現

在此，測試具有及未有CD80負載藥物的B細胞對腫瘤抗原處理。抗原特異性T細胞活化，係針對對照組(多株B細胞+/-CD80)與HEL抗原特異性B細胞+/-CD80)相比來測量。

此實驗的結果證實B細胞的抗原特異性活化。HEL-OVA融合勝肽係由HEL特異性B細胞呈現給OVA特異性T細胞。可看出，CD80強化抗原呈現及CD4+細胞活化。CD80在抗原呈現細胞、B細胞、樹突細胞及T細胞之間提供共刺激訊息，導致T及B細胞的活化、增生及分化。結果係列於圖26中。 實施例23-通過CAR-B啟動T細胞。

通過與B細胞共培養後測定CD4和CD8 T細胞上的CD69豐度來測量T細胞活化。簡而言之，CAR-B細胞是通過用編碼CAR-B基因的mRNA轉染B細胞來製備的。然後將B細胞在300 uL電穿孔緩衝液中以280V fo r 1msec電穿孔，同時將10ug CAR-B mRNA和9 ug CD80 mRNA電穿孔。電穿孔緩衝液中B細胞的濃度為每毫升450萬個B細胞。電穿孔後，將B細胞在生長培養基f或4-5小時中培養。然後將B細胞與表現目標抗原的靶細胞共培養。靶細胞是表現與卵清蛋白連接的GPC3的293個細胞或表現與卵清蛋白連接的GPC3的CHO細胞。將靶細胞(CHO或293)以每孔250,000個細胞接種在24孔板中並培養24小時。第二天，除去培養基並加入250,000個表現CAR-B的B細胞。孵育1-2小時後。然後加入純化的CD4或CD8 T細胞。使用來自Stemcell Inc.的T細胞分離套組通過陰性選擇純化T細胞，然後從野生型C57小鼠中純化多克隆T細胞，並從OT-2和OT-1小鼠中純化OVA特異性CD4和CD8 T細胞。然後將CAR-B細胞，靶細胞和T細胞的共培養物在37C下孵育12-18小時。為了測量T細胞活化，用抗小鼠CD4或CD8標記物(BV421)和抗CD69(FITC)染色細胞混合物。在某些實驗中，CAR-B是通過去諾病毒轉導製備的。在這裡，新鮮分離的B細胞被編碼CAR基因的腺病毒轉導。然後使用抗小鼠CD40適配器來提高病毒轉導效率。結果係列於圖27中。 實施例 24- 體內 T 細胞刺激

小鼠B細胞將用mRNA電穿孔以表現HEL-CARB，CD80和HEL抗原。這些修飾的B細胞將在第7天IV引入具有表現HEL和Ova的已建立HEL-293腫瘤細胞的小鼠中。HEL和Ova在腫瘤模式中共價連接。CAR將參與腫瘤抗原，攝取共價連接的卵子，然後將其在MHC的背景下呈遞給T細胞。過繼轉移的T細胞對Ova具有特異性。在給予B細胞的前一天，將在第6天投予Ova特異性T細胞。在第10天，將收集脾臟和TDLN，並通過CD69或ELISPOT分析測定T細胞活化狀態。例示性結果係列於圖28中。 實施例 25- 使用 CRISPR-Cas9 的 MHCI 及 MHCII 剔除 (KO)

針對小鼠β2m和I-A/I-E基因的化學修飾的sgRNAs寡聚物由IDT(Integrated DNA Technologies，美國愛荷華州Coralville)製造。重組化 膿性鏈球菌Cas9酶購自IDT(Integrated DNA Technologies，Coralville，Iowa，USA)。Cas9在與B細胞混合之前在室溫下與sgRNA一起孵育10分鐘。小鼠B細胞的工程是在具有DI-100程式(瑞士巴塞爾龍沙)的P4核連接溶液中使用Amaxa™ 4D-核細胞進行的。100 pmol RNP用於電穿孔，100萬或500000個細胞活化的小鼠B細胞™，體積為20 μl。 MHCI 及 MHCII 剔除效率之評估

使用Attune NxT流式細胞儀(Invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州，美國)通過流式細胞術測量細胞表面 MHC I和MHC II的表現，以評估剔除效率。使用PE-MHC I(H2)(Biolegend，Cat#125506)和PE-MHC II(I-A/I-E)(Biolegend，Cat#107608)檢測表面標記物。此外，用LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色細胞，以根據製造商的說明區分活細胞和死細胞。結果列於圖30中。 實施例 26- 抗 GPC3 CAR B 及對 T 細胞計數的效果之評估

對照組細胞為第I型MHC無效(β2微球蛋白刪除)及第II型MHC無效(CTIIA刪除)。在此，就經由BCR介導的攝入的抗原呈現以刺激抗原特異性T細胞方面，比較上述細胞的活性(Cd69上調是T細胞活化之量測)。

抗原是GPC3-OVA(跨膜蛋白)；BCR是抗GPC3-CAR-B(79a形式)及cd80；及所測量之B細胞及T細胞的量如下：B細胞=0.25百萬個細胞；T細胞=1百萬個細胞。結果顯示於圖31中。 實施例 27- 小鼠 B 細胞

在這裡，使用的對照細胞如下：第I型MHC無效(β2微球蛋白刪除)；第II型MHC無效(CTIIA刪除)。

比較上述細胞的活性與通過BCR介導的攝取刺激抗原特異性T細胞的抗原呈遞。CD69上調是T細胞活化的量度。使用的抗原是GPC3-OVA(CHO細胞中的跨膜蛋白)。CAR-B used是抗GPC3-CAR-B(CD79a形式)和CD80。B細胞和T細胞測量如下：B細胞：0.25百萬個細胞；T細胞=0.25百萬個細胞。B細胞和T細胞進一步測量如下：B細胞：0.25百萬個細胞；T細胞=0.75百萬個細胞。結果係列於圖32及33中。

[ 圖 1]列出本發明之嵌合B細胞受體(CAR-B)的實施例。在某些實施態樣中，CAR-B構築體將包含胞外域、跨膜域、及胞質域。如圖1中所描繪，在某些實施態樣中，胞外域可包含結合域及鉸鏈區。在某些實施態樣中，結合區域可為scFv。CAR-B構築體係經選殖至載體來表現。

[ 圖 2A-2C]顯示具有歸巢域之經工程化之B細胞之實施例。在各種實施態樣中，該經工程化之B細胞可包含(a)scFv結合域及視需要之鉸鏈區；(b)scFv結合域，其透過跨膜域直接連接至細胞，或(c)配體/受體結合域，其透過跨膜域直接連接至細胞。

[ 圖 3]顯示本發明的某些CAR-B構築體的實例。(A)結合GPC3之CAR-B。(B)結合PSMA之CAR-B。

[ 圖 4]顯示本發明的CAR-B受體實例，其能夠結合(A)GPC3及(B)PSMA。“C”域對應原態BCR C端。

[ 圖 5]列出HEK-293細胞表面上各種抗PSMA CAR的表現。

[ 圖 6A-6C]列出FACS圖，其描繪說明探詢(interrogation)抗PSMA CAR及抗肌膜蛋白聚醣CAR與PSMA結合。表現抗PSMA CAR-B的B細胞構築體pWF396及pWF397結合PSMA，而表現pWF398(抗肌膜蛋白聚醣CAR-B)的B細胞不結合PSMA。

[ 圖 7]說明編碼GFP的腺病毒F35轉導人B細胞的能力。人B細胞是從周邊血液分離。B細胞係以編碼GFP的腺病毒來感染。0、1、3、10 ul，代表用於感染人B細胞的腺病毒製劑的微升體積。腺病毒製劑的效價約為1 x e ¹²個顆粒/ml。

[ 圖 8]描述在第零天BALB/c小鼠係以CT26兩側腫瘤來注射的實驗。在第12天及第16天，帶有腫瘤的小鼠係以表現載藥物之細胞在50 μL中10 ⁶個的體積下來腫瘤內注射。

[ 圖 9]說明與食鹽水和3T3細胞(無負載藥物)相比，隨著30-35天的時間，12種不同組合的負載藥物腫瘤內注射對腫瘤體積的效果。

[ 圖 10]說明與食鹽水和3T3細胞(無負載藥物)相比，隨著30-35天的時間，12種不同組合的負載藥物腫瘤內注射對腫瘤體積的效果。

[ 圖 11A-11C]說明與食鹽水和3T3細胞(無負載藥物)相比，隨著35天的時間，最高的三種組合的負載藥物腫瘤內注射對腫瘤體積的效果。

[ 圖 12]說明腫瘤內注射B細胞的遠端效應(abscopal effect)。接著，B細胞係(i)新鮮注射，或(ii)先在具有5 μg/ml脂多醣的生長培養基(RPMI，10%的FBS，1%的Pen/Strep，5 ng/ml的重組小鼠IL-4，100 uM的β-巰基乙醇)中刺激16-24小時。接著，5X10 ⁶個B細胞係經腫瘤內注射到CT26小鼠模式中，並測量遠端(abscopal)腫瘤的抗腫瘤反應。腫瘤在第0天被植入，在第6天觀察到可觸摸到的腫瘤塊。在第6天開始腫瘤內治療。

[ 圖 13A-13C]說明三種CAR-B受體(也被稱為CAR-B受體)在小鼠B細胞中轉染後24小時的表現。

[ 圖 14]說明PSMA特異性CAR經工程化之小鼠B細胞對具有CT26-PSMA腫瘤的BALB/c小鼠的腫瘤體積及生存率的療效。

[ 圖 15]說明PSMA特異性CAR經工程化之同種異體B細胞對具有CT26-PSMA腫瘤的BALB/c小鼠的腫瘤體積及生存率的療效。

[ 圖 16A 及 16B]說明PSMA特異性CAR經工程化之小鼠B細胞對具有CT26-PSMA腫瘤的免疫功能不全BALB/c小鼠的療效。

[ 圖 17]說明小鼠B細胞對具有HEPA 1-6 GPC3腫瘤的C57B1/6小鼠的腫瘤體積及生存率的療效。

[ 圖 18]說明B細胞中螢光素酶報導細胞的NFKb傳訊，該B細胞以四種不同的辨識GPC3的CAR構築體來工程化，用GFP作為對照。

[ 圖 19]說明在未有同族標靶抗原下，在人B細胞報導株中所表現的CAR構築體的基底(basal)或低量持續(tonic)NFKb活性。

[ 圖 20]說明以抗GPC3CAR-CD79a及CD80負載藥物mRNA電穿孔的小鼠B細胞在具有HEPA1-6GPC3腫瘤的同源C57B1/6小鼠中的療效。

[ 圖 21A-21C]說明食鹽水對照組、抗GPC3CAR-CD79a及抗GPC3CAR-CD79a加CD80組合B細胞組的反應。

[ 圖 22A-22C]使用FACS圖說明電穿孔後GPC3 CAR的表現。

[ 圖 23]說明24小時的T細胞活化。在此圖中，293細胞顯示表現HEL，作為抗原呈現細胞。HEL特異性CAR B細胞係與HEL抗原呈現細胞以及OTII細胞以1：1：1的比例來共培養。約24小時後，細胞係藉由離心來回收，並予以流式細胞分析技術，使用抗CD69-PE(供應商)，對CD4細胞分群(gating)。

[ 圖 24A]顯示單獨使用B細胞及具有對GPC3及PSMA抗原的CAR(具有CD79a及和CD79b)的B細胞的IL-2測量。

[ 圖 24B]圖中顯示，CAR B細胞的抗原特異性活化刺激免疫增強細胞介素的製造。

[ 圖 25]顯示藉由CD80負載藥物強化之B細胞的腫瘤抗原處理及呈現。

[ 圖 26]顯示藉由CD80負載藥物強化之B細胞的腫瘤抗原處理及呈現，係以經活化之T細胞的百分比來顯示。

[ 圖 27]顯示，HEL特異性CAR-B細胞可從共培養之細胞攝入HEL-OVA-抗原，以特異性活化OVA特異性CD4及CD8 T細胞。

[ 圖 28]為體內T細胞刺激之圖解表示。

[ 圖 29]為經修飾之B細胞從腫瘤捕捉抗原並透過抗原呈現活化T細胞之圖解表示。

[ 圖 30]顯示小鼠B細胞在抗CD40及IL-4存在下經活化24小時，並與野生型(WT)Cas9複體與I-A/I-E及B2m SGRNA電穿孔。靶向後三天或六天，用流式細胞分析技術評估b2m及IA-IE的表現。

[ 圖 31]顯示具有無剔除引導(knockout guide)、第I型的剔除引導、及第II型的剔除引導，藉由GPC3 CAR B細胞與CD80的T細胞活化(由OVA特異性CD4+/CD69+及CD8+/CD69 ⁺來測量)。

[ 圖 32]顯示與圖31相關的研究#2結果，其顯示具有無剔除引導、第I型的剔除引導、及第II型的剔除引導，藉由GPC3 CAR B細胞與CD80的T細胞活化(由OVA特異性CD4+/CD69 ⁺來測量)。

[ 圖 33]顯示具有無剔除引導、第I型的剔除引導、及第II型的剔除引導，藉由GPC3 CAR B細胞與CD80的T細胞活化(由OVA特異性CD8+/CD69 ⁺來測量)。

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Claims (24)

1. 一種治療患者之方法，其包含將有效量之下者投予該患者：(i)複數個分離之T細胞，及(ii)有效量的複數個分離之經修飾之B細胞(isolated modified B cell)： 其中該分離之經修飾之B細胞能夠表現嵌合受體(CAR-B)，並且其中該嵌合受體包含 d)胞外域，其中該胞外域包含胞外結合域及鉸鏈域； e)跨膜域；及 f)胞質域，其包含至少一個傳訊域。
2. 如請求項1之方法，其中該分離之T細胞及該CAR-B細胞按順序或同時投予。
3. 如請求項1之方法，其中該胞外結合域辨識至少一種表現於標靶細胞表面上之抗原或蛋白質。
4. 如請求項1之方法，其中該胞外結合域辨識至少一種抗原，其係分泌性蛋白。
5. 如請求項4之分離之經修飾之B細胞，其中該標靶細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、血球細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、內皮細胞、肝細胞、肺上皮細胞、及纖維母細胞。
6. 如請求項1之方法，其中該B細胞表現多於一個CAR-B受體構築體。
7. 如請求項1之方法，其中該胞外結合域係單鏈可變片段(scFv)，或全長抗體或抗體片段，或受體或配體的胞外域。
8. 如請求項1之方法，其中該胞外結合域能夠與選自由下列所組成之群組之抗原或蛋白質結合：PSMA、GPC3、ASGR1、ASGR2、SGCA、Corin、FAP、MUC1、CEA153、JAM-1、LAF-1、Her2、AFP、及MAGE。
9. 如請求項1之方法，其中該胞質域包含選自由下列所組成之群組之域：CD79a(免疫球蛋白α)、CD40、CD19、CD137、Fcγr2a、MyD88、CD21、Syk、FYN、LYN、PI3K、BTK、PLCγ2、CD3ζ及BLNK。
10. 如請求項1之方法，其中該胞質域包含CD79a。
11. 如請求項1之方法，其中該分離之經修飾之B細胞能夠表現及分泌負載藥物(payload)，其中該負載藥物不天然表現於B細胞中，或以高於天然表現於B細胞中的量來表現。
12. 如請求項1之方法，其中該負載藥物係抗體或其片段。
13. 如請求項1之方法，其中該負載藥物係至少一個選自細胞介素、趨化介素、T細胞共刺激分子、及檢查點分子之負載藥物，該群組由以下組成：IL-1、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IL-21、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、TSLP、CCL21、FLT3L、XCL1、LIGHT(TNFSF14)、OX40L、CD137L、CD40L、ICOSL、抗CD3抗體、CD47、TIM4-FC、CXCL13、CCL21、CD80、CD86、CD40L、IFNαA2、LIGHT、4-1BBL、MDGF(C19orf10)、FGF10、PDGF、集聚蛋白(agrin)、TNF-α、GM-CSF、抗FAP抗體、抗TGF-β抗體；TGF-β阱(trap)、誘餌(decoy)或其他抑制分子；抗BMP抗體；BMP阱、誘餌或其他抑制分子。
14. 如請求項1之方法，其中該分離之經修飾之B細胞係腫瘤內、靜脈內、皮下、皮內、或於發炎病灶內投予。
15. 如請求項1之方法，其進一步包含具有或未有另外化學治療劑下，將一種或多種檢查點抑制劑投予該患者。
16. 一種治療患者之方法，其包含將有效量之下者投予該患者：(i)複數個分離之非B細胞經修飾之免疫細胞，及(ii)有效量的複數個分離之經修飾之B細胞； 其中該分離之經修飾之B細胞能夠表現嵌合受體(CAR-B)，並且其中該嵌合受體包含 g)胞外域，其中該胞外域包含胞外結合域及鉸鏈域； h)跨膜域；及 i)胞質域，其包含至少一個傳訊域。
17. 如請求項1之方法，其中該分離之T細胞及該CAR-B細胞按順序或同時投予。
18. 如請求項16之方法，其中該非B細胞經修飾之免疫細胞係CAR-T細胞、TIL、及TCR細胞中的至少一者。
19. 如請求項16之方法，其中該胞外結合域辨識至少一種表現於標靶細胞表面上之抗原或蛋白質。
20. 如請求項16之方法，其中該胞外結合域辨識至少一種抗原，其係分泌性蛋白。
21. 如請求項19之分離之經修飾之B細胞，其中該標靶細胞係選自由下列所組成之群組：腫瘤細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、骨細胞、血球細胞、神經細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、內皮細胞、肝細胞、肺上皮細胞、及纖維母細胞。
22. 一種組合療法，其包含： a)分離之經修飾之非B細胞免疫細胞，及 b)分離之經修飾之B細胞，其能夠表現嵌合受體，其中該嵌合受體包含： j)胞外域，其中該胞外域包含胞外結合域及鉸鏈域； k)跨膜域；及 l)胞質域，其包含至少一個傳訊域， 其中該經修飾之B細胞係視需要進一步能夠表現負載藥物。
23. 如請求項22之療法，其中該負載藥物包含CD80或CD86中的至少一者。
24. 如請求項22之療法，其中該非B細胞經修飾之免疫細胞係CAR-T細胞、TIL、及TCR細胞中的至少一者。

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