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TW202319070A - 用於製造cmv載體的方法 - Google Patents

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TW202319070A
TW202319070A TW111132760A TW111132760A TW202319070A TW 202319070 A TW202319070 A TW 202319070A TW 111132760 A TW111132760 A TW 111132760A TW 111132760 A TW111132760 A TW 111132760A TW 202319070 A TW202319070 A TW 202319070A
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cmv
mrna
mrna molecule
deletion
Prior art date
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TW111132760A
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艾瑞克 布魯寧
珍妮特 Ｌ 道格拉斯
莎拉 雷道斯
克里斯汀 Ｒ 邁耶
Original Assignee
美商維爾生物科技股份有限公司
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Abstract

本揭露內容提供用於製造巨細胞病毒(CMV)病毒載體之方法。本揭露內容亦提供用於修飾用於製造CMV病毒載體之宿主細胞之方法。

Description

用於製造CMV載體的方法
關於序列表之陳述
以文本格式代替紙張複本提供與本申請案相關之序列表，且特此以引用之方式併入本說明書中。含有序列表之正文檔案之名稱為930485_436TW_SequenceListing.xml。正文檔案為99,639位元組，創建於2022年8月26日且經由EFS-Web以電子方式提交。
本發明係有關於用於製造CMV載體的方法。
發明背景
基於巨細胞病毒(CMV)之疫苗載體利用此病毒之天然能力來引發及維持循環及組織滯留效應物分化T細胞，包括早期HIV感染之潛在位點。舉例而言，編碼猿猴免疫缺陷病毒(SIV)抗原插入物之恆河猴CMV (RhCMV)載體可(1)超感染RhCMV免疫靈長類動物且引發淋巴及器官組織兩者中之高頻率效應物分化、SIV特異性CD4+及CD8+ T細胞，(2)無限地維持此等反應，且(3)顯現對高度病原性SIVmac239株之感染之早期嚴格控制及最終清除。目前CMV製造製程限於生產中且不可直接擴展。自疫苗載體缺失必需病毒基因為確保臨床安全性之習用實踐。然而，為了製造具有必需基因缺失之載體，必須採用一些基因互補方法。標準方法涉及產生表現必需病毒基因或其功能等效物之穩定細胞株，然而，HCMV之製造由於其需要用於病毒產生之初級正常二倍體細胞而複雜化。因此，仍需要能夠產生以CMV載體為主之疫苗的製造方法，該等疫苗可以臨床及商業用途所必需的量產生疫苗。本文描述一種利用mRNA轉染以將必需病毒基因遞送至宿主細胞以便可擴展製造CMV載體的方法。
發明概要
在某些態樣中，本揭露內容提供一種製造CMV病毒載體之方法，其包含：(a)將編碼pp71蛋白質之mRNA分子引入細胞(例如，MRC-5細胞)中；(b)用CMV感染該細胞；(c)培育該細胞；及(d)收集該CMV病毒載體。
在某些態樣中，本揭露內容亦提供一種藉由前述方法中之任一者製造的CMV病毒載體。
較佳實施例之詳細說明
本揭露內容提供用於製造CMV載體之方法，其藉由經由將編碼缺失蛋白質之mRNA轉染至宿主細胞中來提供已在CMV載體中缺失之必需病毒基因的互補來進行。 I. 詞彙表
以下部分提供用於製造CMV載體之方法的詳細描述。在更詳細地闡述本揭露內容之前，提供將在本文中使用之某些術語的定義可能有助於對本揭示內容之理解。額外定義闡述於整個本揭露內容中。
在本說明書中，除非另外指示，否則術語「約」或「大致」意謂指定範圍、值或結構之± 20%。
術語「包含」意謂存在如申請專利範圍中所提及之所陳述特徵、整數、步驟或組分，但其不排除存在或添加一或多個其他特徵、整數、步驟、組分或其群組。術語「基本上由……組成」將申請專利範圍之範疇限制於指定材料或步驟及不實質上影響所主張發明之基本及新穎特徵之材料或步驟。
應理解，如本文中所使用之術語「一(a/an)」係指所列舉組分中之「一或多者」。替代方案(例如「或」)之使用應理解為意謂替代方案中之一者、兩者或其任何組合，且可與「及/或」同義地使用。如本文中所使用，術語「包括」及「具有」同義地使用，該等術語及其變化形式意欲理解為非限制性的。
字語「實質上」不排除「完全」；例如「實質上不含」Y之組成物可完全不含Y。必要時，字語「實質上」可自本文所提供之定義省略。
術語「核苷酸序列」及「核酸序列」係指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列，包括(但不限於)信使RNA (mRNA)、DNA/RNA混合物或合成核酸。核酸可為單股，或部分或完全雙股(雙螺旋)。雙螺旋核酸可為同雙螺旋或異雙螺旋。
特定序列之核酸分子可併入至載體中，接著將該載體引入宿主細胞中，藉此製造轉型宿主細胞。載體可包括准許其在宿主細胞中複製之核酸序列，諸如複製起點。載體亦可包括一或多種可選標記基因及此項技術中已知之其他遺傳元件，包括引導核酸表現之啟動子元件。載體可為病毒載體，諸如CMV載體。病毒載體可由野生型或減毒病毒構築，包括複製缺陷型病毒。
如本文中所使用，術語「信使RNA」(mRNA)係指編碼至少一種感興趣之肽或多肽且能夠轉譯以在活體外、活體內、原位或離體產生經編碼之感興趣之肽多肽的任何聚核苷酸。mRNA可藉由RNA聚合酶自DNA序列轉錄，且與核糖體相互作用以合成由DNA編碼之遺傳資訊。一般而言，mRNA分類為二個子類：前驅mRNA及成熟mRNA。前驅mRNA (Precursor mRNA/pre-mRNA)為已藉由RNA聚合酶轉錄但尚未經歷任何轉錄後處理(例如，5'封端、剪接、編輯及聚腺苷酸化)之mRNA。成熟mRNA已經由轉錄後處理(例如，剪接以移除內含子及聚腺苷酸化)修飾且能夠與核糖體相互作用以進行蛋白質合成。可藉由多種方法自組織或細胞分離mRNA。舉例而言，可對細胞或細胞裂解物進行總RNA提取且可純化(例如，在包含寡dT珠粒之管柱上)所得提取之總RNA以獲得提取之mRNA。
替代地，mRNA可在無細胞環境中，例如藉由活體外轉錄(IVT)合成。如本文中所使用，「活體外轉錄模板」係指適合用於產生信使RNA (mRNA)之IVT反應的脫氧核糖核酸(DNA)。在一些實施例中，IVT模板編碼5'非轉譯區，含有開放閱讀框架，且編碼3'非轉譯區及polyA尾。
IVT模板之特定核苷酸序列組成及長度將視由模板編碼之感興趣的mRNA而定。
「5'非轉譯區(UTR)」係指mRNA的直接位於不編碼蛋白質或肽之起始密碼子(亦即，由核糖體轉譯之mRNA轉錄物之第一密碼子)之上游(亦即，5')的區域。
「3'非轉譯區(UTR)」係指mRNA的直接位於不編碼蛋白質或肽之終止密碼子(亦即，傳訊轉譯終止之mRNA轉錄物之密碼子)之下游(亦即，3')的區域。
「polyA尾」為mRNA的位於含有多個連續腺苷單磷酸酯之3'UTR下游，例如直接位於其下游(亦即，3')之區域。polyA尾可含有10至300個腺苷單磷酸酯。舉例而言，polyA尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300個腺苷單磷酸酯。在一些實施例中，polyA尾含有50至250個腺苷單磷酸酯。在相關生物環境中(例如在細胞中、在活體內等)，poly(A)尾用以保護mRNA免於酶促降解(例如在細胞質中)，且有助於轉錄終止、mRNA自細胞核輸出及轉譯。
如本文中所使用，術語「抗原」係指能夠誘導個體之免疫反應之物質，通常為蛋白質。該術語亦指為免疫活性(亦稱為「免疫原性」)之蛋白質，其意義在於在向個體投予(直接地或藉由向個體投予編碼蛋白質之核苷酸序列或載體)後，蛋白質能夠誘發針對該蛋白質之體液及/或細胞型之免疫反應。
如本文中所使用，術語「微小RNA」係指參與控制基因表現之生物分子之主要類別。舉例而言，在人類心臟、肝臟或腦中，miRNA在組織規格或細胞譜系決定中起作用。另外，miRNA影響多種過程，包括早期發育、細胞增殖及細胞死亡，以及細胞凋亡及脂肪代謝。大量miRNA基因、不同表現模式及潛在miRNA目標之豐度表明miRNA可為基因多樣性之重要來源。成熟miRNA通常為調節包括與miRNA互補之序列之mRNA之表現的8至25個核苷酸非編碼RNA。已知此等小RNA分子藉由調節mRNA之穩定性及/或轉譯來控制基因表現。舉例而言，miRNA結合於目標mRNA之3' UTR且抑制轉譯。miRNA亦可結合於目標mRNA且經由RNAi路徑介導基因沉默。miRNA亦可藉由引起染色質凝聚來調節基因表現。
miRNA藉由結合於miRNA識別元件(MRE)使一或多個特異性mRNA分子之轉譯沉默，該miRNA識別元件定義為直接與mRNA轉錄物上某處之miRNA鹼基配對且與其相互作用的任何序列。通常，MRE存在於mRNA之3'非轉譯區(UTR)中，但其亦可存在於編碼序列或5'UTR中。MRE不一定與miRNA完美互補，通常僅具有與miRNA互補之幾個鹼基且通常在互補之彼等鹼基內含有一或多個錯配。MRE可為能夠經miRNA充分結合以使得MRE可操作地連接之基因(諸如活體內生長所必需或強化之CMV基因)之轉譯由諸如RISC之miRNA沉默機制抑制的任何序列。
如本文中所使用，術語「異源抗原」係指並非來源於CMV之任何蛋白質或其片段。異源抗原可為病原體特異性抗原、腫瘤病毒抗原、腫瘤抗原、宿主自體抗原或任何其他抗原。
蛋白質之異種同源物之特徵通常在於具有大於75%序列一致性，其係經由使用設定為預設參數之ALIGN對特定蛋白質之胺基酸序列進行全長比對來計算。當藉由此方法評定時，與參考序列具有甚至更大相似性之蛋白質將展示逐漸增加之一致性百分比，諸如至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%或至少98%序列一致性。另外，可在所揭露肽之特定域之全長上比較序列一致性。
術語「同源」或「同源物」係指宿主細胞、物種或菌株中發現或來源於宿主細胞、物種或菌株之分子或活性。舉例而言，異源或外源分子或編碼分子之基因可分別與天然宿主或宿主細胞分子或編碼分子之基因同源，但可具有改變之結構、序列、表現位準或其組合。
如本文中所使用，二個或更多個核酸序列或二個或更多個胺基酸序列之間的一致性/相似性係依據序列之間的一致性或相似性來表現。序列一致性可依據一致性百分比量測；百分比愈高，序列愈一致。序列相似性可依據一致性或相似性百分比(其考慮守恆的胺基酸取代)量測；百分比愈高，序列愈相似。具有大量序列一致性以及彼此功能相同或類似之多肽或其蛋白域(例如，在不同物種中提供相同功能之蛋白質或不改變蛋白質之功能或其量值之蛋白質的突變體形式)可稱為「同源物」。
用於比較之序列比對方法為此項技術中熟知的。不同程式及比對演算法描述於以下中：Smith & Waterman, Adv Appl Math 2, 482 (1981)；Needleman & Wunsch, J Mol Biol 48, 443 (1970)；Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444 (1988)；Higgins & Sharp, Gene 73, 237-244 (1988)；Higgins & Sharp, CABIOS 5, 151-153 (1989)；Corpet等人, Nuc Acids Res 16, 10881-10890 (1988)；Huang等人, Computer App Biosci 8, 155-165 (1992)；及Pearson等人, Meth Mol Bio 24,307-331 (1994)。另外，Altschul等人, J Mol Biol 215, 403-410 (1990)呈現序列比對方法及同源性計算之詳細考量。
NCBI鹼基局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST) (Altschul等人, (1990)見上文)可自若干來源，包括國家生物資訊中心(National Center for Biological Information；NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894)及在網際網路上獲得，其與序列分析程式blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx結合使用。額外資訊可見於NCBI網站。
BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。若二個比較序列共有同源性，則指定之輸出檔案將存在與比對序列同源之彼等區域。若二個比較序列不共有同源性，則指定之輸出檔案將不存在比對序列。
一旦比對，匹配數目藉由對兩個序列中呈現一致的核苷酸或胺基酸殘基之位置數目進行計數來判定。序列一致性百分比係藉由將匹配數目除以所鑑別序列中闡述之序列之長度或鉸接長度(諸如來自所鑑別序列中闡述之序列的100個連續核苷酸或胺基酸殘基)，接著將所得值乘以100來測定。舉例而言，當與具有1154個核苷酸之測試序列比對時具有1166個匹配之核酸序列與測試序列75.0%一致(1166÷1554*100=75.0)。序列一致性百分比值四捨五入至最接近的十分之一。舉例而言，75.11、75.12、75.13及75.14向下四捨五入至75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18及75.19向上四捨五入至75.2。長度值將始終為整數。在另一實例中，含有與來自如下鑑別之序列的20個連續核苷酸比對之20個核苷酸區域的目標序列含有與該所鑑別序列共有75%序列一致性之區域(亦即，15÷20*100=75)。
為比較大於約30個胺基酸之胺基酸序列，使用設定為預設參數之預設BLOSUM62矩陣(空位存在罰分(gap existence cost)為11，且每殘基空位罰分為1)採用Blast 2序列功能。同源物之特徵通常在於具有至少70%序列一致性，其係經由使用NCBI基本Blast 2.0、有空位的blastp與諸如nr資料庫、swissprot資料庫及專利序列資料庫之資料庫對胺基酸序列進行全長比對來計算。利用blastn程式檢索之查詢用DUST過濾(Hancock & Armstrong, Comput Appl Biosci 10, 67-70 (1994)。其他程式使用SEG。另外，可進行手動比對。當藉由此方法評定時，具有甚至更大相似性之蛋白質將展示逐漸增加之一致性百分比，諸如與蛋白質具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性。
當比對短肽(少於約30個胺基酸)時，比對係使用Blast 2序列功能，採用設定為預設參數之PAM30矩陣(開放空位9，擴展空位1罰分)進行。當藉由此方法評定時，與參考序列具有甚至更大相似性之蛋白質將展示逐漸增加之一致性百分比，諸如與蛋白質具有至少約60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性。當比較小於完整序列之序列一致性時，同源物將通常在10至20個胺基酸之短窗(short window)內具有至少75%序列一致性，且視其與參考序列之一致性而定可具有至少85%、90%、95%或98%之序列一致性。用於測定此類短窗內之序列一致性的方法描述於NCBI網站。
二個核酸分子緊密相關之一個指示為二個分子在嚴格條件下彼此雜交，如上文所描述。歸因於遺傳密碼之簡併，不顯示高度一致性之核酸序列可仍然編碼相同或類似(守恆的)胺基酸序列。核酸序列之變化可使用此簡併進行以產生全部編碼實質上相同之蛋白質之多個核酸分子。此類同源核酸序列可例如與編碼蛋白質之核酸具有至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%序列一致性。
人類巨細胞病毒UL82基因編碼pp71，其為位於病毒粒子之外被域(tegument domain)中之蛋白質。CMV TR株之UL82基因為Genbank寄存編號KF021605.1之SEQ ID NO:1，118811至120490。如本文中所使用，UL82係指SEQ ID NO:1及其異種同源物或同源物。
如本文中所使用，「pp71」係指位於CMV病毒粒子之外被域中之蛋白質。pp71可執行一或多個功能，包括抑制病毒基因轉錄之Daxx抑制、負調節STING及避免細胞抗病毒反應(Kalejta RF等人, Expanding the Known Functional Repertoire of the Human Cytomegalovirus pp71 Protein. Front Cell Infect Microbiol. 2020年3月12日;10:95)。UL82之缺失或藉由在UL82基因座處插入外源基因破壞UL82導致不存在pp71蛋白質，且因此減少纖維母細胞、內皮細胞、上皮細胞及星形膠質細胞之複製(Caposio P等人, Characterization of a live-attenuated HCMV-based vaccine platform. Sci Rep. 2019年12月17日;9(1):19236)。UL82缺失或破壞之作用可藉由細胞激酶抑制劑逆轉。恆河猴巨細胞病毒(RhCMV)基因RhCMV 110與人類CMV UL82同源(Hansen SG等人, Complete sequence and genomic analysis of rhesus cytomegalovirus. J Virol. 2003年6月;77(12):6620-36)。 II. 使用mRNA轉染之補充
用於製造具有所要疫苗特性之HCMV載體的挑戰為載體通常經設計以具有減少之病毒複製或生長。舉例而言，一些減毒活HCMV-HIV疫苗載體經工程改造以藉由缺失編碼外被蛋白pp71 (SEQ ID NO:2，Genbank寄存編號：AGL96671.1；SEQ ID NO:3，UniProtKB-R4SH92)之HCMV基因UL82 (SEQ ID NO:1，Genbank寄存編號：KF021605.1 (118815至120494))而具有生長缺陷，從而導致病毒產率較低。商業製造藉由pp71缺失減毒之以活HCMV為主之HIV疫苗最終需要在優良製造規範(good manufacturing practices；GMP)下容許載體生長之補充細胞株。
pp71對於野生型HCMV感染至關重要，因為此外被蛋白易位至細胞核，其中其抑制細胞Daxx功能，因此允許觸發複製週期之CMV即刻早期(IE)基因表現。一些製造製程依賴於使用靶向DAXX之siRNA短暫轉染MRC-5細胞的功能補充，該siRNA模擬HCMV pp71之功能中之一者。此方法允許載體生長，但涉及不易於擴展用於商業製造之複雜操縱且補充許多pp71功能中之僅一者。另外，在pp71補充細胞中生長之RhCMV載體已證實效力之增加，經誘導免疫反應所需之每劑量病灶形成單位(FFU)的減少所量測。此等觀測表明，細胞衍生之pp71蛋白質可包裝於其中缺失此基因之載體之病毒粒子中，且含有pp71蛋白質之病毒疫苗可由於其增加效力而以較低劑量投予，藉此提供臨床益處且減少製造需求。
在一些實施例中，重組RhCMV或HCMV載體包含複製所必需或強化複製之RhCMV或HCMV基因之缺失(例如UL82)。CMV必需基因及強化已在此項技術中充分描述(參見例如Dunn等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(24): 14223-14228, 2003；及Dong等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(21): 12396-12401, 2003)。必需CMV基因包括(但不限於)UL32、UL34、UL37、UL44、UL46、UL48、UL48.5、UL49、UL50、UL51、UL52、UL53、UL54、UL55、UL56、UL57、UL60、UL61、UL70、UL71、UL73、UL75、UL76、UL77、UL79、UL80、UL82、UL84、UL85、UL86、UL87、UL89、UL90、UL91、UL92、UL93、UL94、UL95、UL96、UL98、UL99、UL100、UL102、UL104、UL105、UL115及UL122。在一些實施例中，CMV必需或強化基因為UL82、UL94、UL32、UL99、UL115或UL44，或其同源物(亦即，RhCMV中之同源基因)。其他必需或強化基因為此項技術中已知的且描述於本文中。在特定實例中，必需基因為UL82或其同源物。
mRNA轉染可用於使宿主細胞能夠表現必需病毒基因。用於表現必需病毒基因之mRNA之轉染可能夠提供基因之所有功能，該等功能可能增強感染過程，諸如細胞週期刺激、有效病毒粒子包裝及病毒穩定性。另外，存在感染晚期之蛋白質有可能包裝於後代病毒中，其可藉由更高效的第一輪感染及持續感染之建立而降低疫苗之所需劑量。
在一些實施例中，將必需病毒基因mRNA轉染至宿主細胞中提供功能補充，引起基因缺失型HCMV病毒載體之成功繁殖。在一些實施例中，功能補充引起HCMV擴散加速、最大效價增加、最大病毒效價較早及/或來自BAC DNA之病毒復原增強。
在一些實施例中，mRNA之短暫轉染用於藉由用來自已知生長至高效價之實驗室株之mRNA的組合文庫補充感染來鑑別准許HCMV生長至較高效價的功能。
在天然感染中，感染性親本CMV粒子經由與細胞受體相互作用進入細胞，且將衣殼及外被蛋白遞送至胞溶質中。衣殼進入細胞核且遞送CMV基因體，而外被蛋白參與引發病毒基因表現及調節宿主細胞反應。將病毒基因體複製且囊封至已組裝於細胞核中之衣殼中，且將含基因體之衣殼轉運至胞溶質，其中其與外被蛋白締合且獲得病毒組裝複合物中之病毒套膜。隨後自細胞釋放包裹之感染性後代CMV粒子(Jean Beltran PM及Cristea IM. The life cycle and pathogenesis of human cytomegalovirus infection: lessons from proteomics. Expert Rev Proteomics. 2014年12月;11(6):697-711)。親本病毒粒子及後代粒子可結構上及基因上相同，或可不同，例如在細胞藉由多個親本株共感染時在病毒重組的情況下。在CMV病毒粒子之實驗室製造中利用天然感染之製程，其中細胞株感染親本CMV，細胞產生後代CMV，且接著收集後代CMV。在此等製程中，「親本」係指感染細胞之病毒粒子，且「後代」係指所產生病毒粒子。
在一些實施例中，將經轉染之mRNA施加至細胞株以用於測定病毒儲備液之感染性效價。
MRC-5細胞為充分表徵之適合於HCMV製造之初級正常二倍體纖維母細胞。在一些實施例中，MRC-5細胞用於本文所揭露之方法中以產生表現pp71之細胞。
在一些實施例中，用UL82 mRNA轉染天然容許之MRC-5細胞導致相較於BJ-5ta細胞或pp71 BJ-5ta細胞株之轉染高得多的表觀效價。此可能提供物質之更精確效價且允許更好地定量劑量範圍研究中使用之經稀釋物質。pp71 mRNA之轉染可允許以更高的分析再現性及信賴度測試更低效價的病毒(例如，小於5e4 FFU/mL)。
在一些實施例中，提供一種製造CMV病毒載體之方法，其包含：(a)將編碼pp71蛋白質之mRNA分子引入細胞中；(b)用CMV感染細胞；(c)培育細胞；及(d)收集CMV病毒載體。在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10之序列。在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子係使用假尿苷(pseudoU)及5-甲基胞苷(5meC)，例如SEQ ID NO:14至20之完全取代產生。在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子係使用5-甲氧基尿苷(5moU)，例如SEQ ID NO:21至27之完全取代產生。在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子使用轉染遞送至細胞。在一些實施例中，細胞為MRC-5細胞。
mRNA分子可藉由通常使用緩衝液中之雙股DNA模板與RNA聚合酶及NTP之混合物的活體外轉錄製造。聚合酶可合成mRNA分子。可接著酶促降解DNA。可自聚合酶、游離NTP及降解DNA純化掉mRNA分子。
用未經修飾之mRNA分子轉染細胞可由於先天性免疫路徑之活化而導致細胞死亡。對mRNA分子之修飾可充當自體RNA之標記以減少對內源性細胞RNA之先天性免疫反應且增強穩定性。此類修飾包括(但不限於)經修飾之核苷、聚-腺苷(poly(A))尾之伸長及經修飾之5'帽結構。此外，經由高效液相層析(HPLC)純化移除dsRNA污染物亦可增強穩定性且減少免疫識別。
術語「RNA」或「mRNA」或「mRNA分子」不僅涵蓋含有天然核糖核苷酸之RNA分子，且亦涵蓋包含一或多個如本文所描述或如此項技術中已知之核苷酸/核苷或核糖核苷酸/核苷類似物或衍生物的RNA之類似物及衍生物。嚴格而言，「核苷」包括核苷鹼基及去氧核糖，且「核苷酸」為具有一個、二個或三個磷酸酯部分之核苷。嚴格而言，「核糖核苷」包括核苷鹼基及核糖，且「核糖核苷酸」為具有一個、二個或三個磷酸酯部分之核糖核苷。
RNA分子之核鹼基結構或核糖-磷酸酯主鏈結構可經修飾，例如如下文更詳細地描述。作為非限制性實例，RNA分子亦可包括至少一個經修飾之核苷，包括(但不限於)經5-甲氧基尿苷(5moU)修飾之核苷、經5-甲基胞苷(5meC)修飾之核苷、經N6-甲基腺苷(m6A)修飾之核苷、經5-甲基尿苷(m5U)修飾之核苷、經假尿苷(pseudoU)修飾之核苷、經2-硫尿苷(s2U)修飾之核苷或其任何組合。在另一實例中，RNA分子可包含至少二個經修飾之核糖核苷，至少25、至少50、至少100、至少500、至少1000、至少2000個或更多個，直至整個長度之mRNA分子。RNA分子中此類多個經修飾之核苷/核糖核苷中之各者的修飾無需相同。
在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子係使用假尿苷(pseudoU)、5-甲基胞苷(5meC)、5-甲氧基尿苷(5moU)或其任何組合之完全取代產生。在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子係使用假尿苷(pseudoU)及5-甲基胞苷(5meC)，例如SEQ ID NO:14至20之完全取代產生。在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子係使用5-甲氧基尿苷(5moU)，例如SEQ ID NO:21至27之完全取代產生。在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子係使用假尿苷(pseudoU)之完全取代產生。在一些實施例中，編碼pp71蛋白質之mRNA分子係使用5-甲基胞苷(5meC)之完全取代產生。
在一些實施例中，可將可變或預定長度之聚-腺苷(poly(A))尾添加至編碼pp71蛋白質之mRNA分子之3'端。在一些實施例中，poly(A)尾之長度為大致60至100個核苷酸。poly(A)尾可在轉錄期間以模板依賴性方式添加及/或可轉錄後酶促添加。在某些實施例中，poly(A)尾藉由poly(A)聚合酶轉錄後酶促添加，此可變地添加大致60至100個核苷酸之尾部。在某些其他實施例中，poly(A)尾由雙股DNA模板，例如線性化質體模板(「失控轉錄(Run-off Transcription)」(TriLink))合成，其中轉錄在RNA聚合酶離開DNA時停止。在其他實施例中，質體編碼預定長度為大致80 nt之poly(A)尾。
可將mRNA分子轉錄以含有5'帽結構。在一些實施例中，mRNA分子用7-甲基鳥苷酸帽轉錄，產生cap0結構。在一些實施例中，mRNA分子用經修飾之5'-甲氧基尿苷(5moU)核苷轉錄，產生cap1結構。
在一些實施例中，mRNA可經轉錄以含有全長病毒pp71 5' UTR及3' UTR (非轉譯區)，從而能夠核定位。
可使用多種不同方法中之任一者將RNA引入目標細胞中，例如包括(但不限於)脂質介導之轉染、電穿孔、多穿孔(multiporation)、聚合物囊封、肽介導之轉染或基因槍粒子遞送系統之市售方法。
在一些實施例中，使用以脂質為主之轉染將mRNA分子遞送至細胞。市售的脂質介導之轉染試劑包括Lipofectamine 2000 (ThermoFisher)、MessengerMax (ThermoFisher)、Jet-mRNA (PolyPlus)及Trans-IT (Mirus Bio)。在某些實施例中，將mRNA引入具有MessengerMax之細胞中，此提供高轉染效率及低毒性。在一些實施例中，mRNA分子以5 ng/cm 2至500 ng/cm 2之劑量遞送。在一些實施例中，mRNA分子以50 ng/cm 2至100 ng/cm 2之劑量遞送。在一些實施例中，mRNA分子以50 ng/cm 2之劑量遞送。在一些實施例中，mRNA分子以100 ng/cm 2之劑量遞送。在一些實施例中，mRNA分子以至少5 ng/cm 2、至少50 ng/cm 2、至少100 ng/cm 2、至少150 ng/cm 2、至少200 ng/cm 2、至少250 ng/cm 2、至少300 ng/cm 2、至少350 ng/cm 2、至少400 ng/cm 2、至少450 ng/cm 2或至少500 ng/cm 2之劑量遞送。在一些實施例中，mRNA分子以100 ng/cm 2之劑量遞送。在一些實施例中，mRNA分子以不超過50 ng/cm 2、不超過100 ng/cm 2、不超過150 ng/cm 2、不超過200 ng/cm 2、不超過250 ng/cm 2、不超過300 ng/cm 2、不超過350 ng/cm 2、不超過400 ng/cm 2、不超過450 ng/cm 2或不超過500 ng/cm 2之劑量遞送。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為0.01 µl至1000 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為0.1 µl至100 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為0.1 µl至50 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為0.1 µl至10 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為0.5 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為0.75 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為1 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為1.25 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為1.5 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為2 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為2.5 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為3 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為3.6 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為至少0.01 µl、至少0.1 µl、至少0.5 µl、至少1 µl、至少2 µl、至少3 µl、至少4 µl、至少5 µl、至少10 µl、至少50 µl、至少100 µl或至少1000 µl。在一些實施例中，轉染中使用之脂質介導之轉染試劑量為不超過0.01 µl、不超過0.1 µl、不超過0.5 µl、不超過1 µl、不超過2 µl、不超過3 µl、不超過4 µl、不超過5 µl、不超過10 µl、不超過50 µl、不超過100 µl或不超過1000 µl。 III. CMV載體及抗原
在前述方法及組成物中之任一者中，CMV可為HCMV或RhCMV。在一些實施例中，CMV為HCMV。在一些實施例中，CMV為HCMV之經基因修飾之TR株。在一些實施例中，CMV包含TR3主鏈。
在一些實施例中，重組CMV載體為或來源於HCMV TR3。如本文中所提及，「HCMV TR3」或「TR3」係指來源於臨床分離株HCMV TR之HCMV-TR3載體主鏈，如Caposio, P等人(Characterization of a live attenuated HCMV-based vaccine platform. Scientific Reports 9, 19236 (2019))中所描述。
在一些實施例中，重組CMV載體(例如，包含TR3主鏈之重組HCMV載體)包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列。在一些實施例中，HCMV載體包含編碼MRE之核酸序列，該MRE含有在內皮細胞中表現之微小RNA之目標位點。內皮細胞中表現之miRNA之實例為miR126、miR-126-3p、miR-130a、miR-210、miR-221/222、miR-378、miR-296及miR-328。在一些實施例中，HCMV載體缺乏UL18、UL128、UL130、UL146及UL147 (及任擇地UL82)且表現UL40及US28，且MRE含有在內皮細胞中表現之微小RNA之目標位點。
在一些實施例中，重組CMV載體(例如，包含TR3主鏈之重組HCMV載體)包含編碼MRE之核酸序列，該MRE含有在骨髓細胞中表現之微小RNA之目標位點。骨髓細胞中表現之miRNA之實例為miR-142-3p、miR-223、miR-27a、miR-652、miR-155、miR-146a、miR-132、miR-21、miR-124及miR-125。
可包括於本文所揭露之重組CMV載體中之MRE可為在由內皮細胞表現之miRNA的存在下使表現沉默之任何miRNA識別元件，或在由骨髓細胞表現之miRNA的存在下使表現沉默之任何miRNA識別元件。此類MRE可為miRNA之精確互補序列。替代地，其他序列可用作給定miRNA之MRE。舉例而言，可使用公開可用之資料庫自序列預測MRE。在一個實例中，可在網站microRNA.org (www.microrna.org)上檢索miRNA。繼而，將列舉miRNA之mRNA目標之清單。對於頁面上之各所列目標，可訪問『比對細節』且訪問假定的MRE。一般熟習此項技術者可自文獻選擇驗證、假定或突變的MRE序列，該文獻將預測在骨髓細胞(諸如巨噬細胞)中表現之miRNA的存在下誘導沉默。一個實例涉及上文提及之網站。一般熟習此項技術者可隨後獲得表現構築體，藉以報導基因(諸如螢光蛋白、酶或其他報導基因)具有由啟動子(諸如組成性活化啟動子或細胞特異性啟動子)驅動之表現。可隨後將MRE序列引入表現構築體中。可將表現構築體轉染至適當細胞中，且細胞用感興趣的miRNA轉染。缺乏報導基因之表現指示MRE在miRNA之存在下使基因表現沉默。
在一些實施例中，CMV載體包含不編碼任何MRE之核酸序列。
在前述方法及組成物中之任一者中，可基因修飾CMV。在一些實施例中，CMV包含基因之缺失，或不表現活性基因，其中該基因為UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。在一些實施例中，CMV包含基因之缺失，或不表現活性基因，其中該基因為UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。在一些實施例中，CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，且不表現活性UL147或其同源物。在一些實施例中，CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，且不表現活性UL82或其同源物。在一些實施例中，CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，不表現活性UL82或其同源物，且不表現活性UL18或其同源物。在一些實施例中，CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，且不表現活性UL82或其同源物，其中CMV另外表現mir124之目標序列。在一些實施例中，CMV不表現活性UL82或其同源物。在一些實施例中，CMV包含UL128、UL130、UL146及UL147，或其同源物之缺失。在一些實施例中，CMV包含UL128、UL130、UL146、UL147及UL82，或其同源物之缺失。在一些實施例中，CMV包含UL128、UL130、UL146、UL147、UL82及UL18，或其同源物之缺失。在一些實施例中，CMV包含UL128、UL130、UL146、UL147及UL82，或其同源物之缺失，其中CMV另外表現mir124之目標序列。在一些實施例中，CMV包含UL82或其同源物之缺失。在一些實施例中，編碼異源抗原之核酸置換UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。在一些實施例中，編碼異源抗原之核酸置換UL82。
在前述方法及組成物中之任一者中，CMV可包含編碼異源抗原之核酸。在一些實施例中，異源抗原包含病原體特異性抗原或腫瘤抗原。在一些實施例中，異源抗原包含病原體特異性抗原，其包含人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)抗原、人類巨細胞病毒(HCMV)抗原、B型肝炎病毒(HBV)抗原、C型肝炎病毒(HCV)抗原、乳頭狀瘤病毒抗原(例如，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原)、瘧原蟲(Plasmodium)抗原、卡波西氏肉瘤相關之疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)抗原、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)抗原、伊波拉病毒(Ebola virus)、結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis)抗原、屈公病毒(Chikungunya virus)抗原、登革熱病毒(dengue virus)抗原、猴痘病毒抗原、單純疱疹病毒(HSV) 1抗原、單純疱疹病毒(HSV) 2抗原、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus；EBV)抗原、脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)抗原、流感病毒抗原或破傷風梭菌( Clostridium tetani)抗原。在一些實施例中，異源抗原包含HIV抗原。在一些實施例中，異源抗原包含HIV抗原，其中HIV抗原為Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif或Vpu，或其抗原決定基或抗原片段。在一些實施例中，異源抗原包含HIV抗原，其中HIV抗原包含以下中之多於一者：Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif及Vpu，或其抗原決定基或抗原片段。在一些實施例中，異源抗原包含HIV抗原，其中HIV抗原包含以下中之多於一者：Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif及Vpu，或其抗原決定基或抗原片段，其包含於融合分子中。在一些實施例中，異源抗原包含結核分枝桿菌抗原。在一些實施例中，異源抗原包含結核分枝桿菌抗原，其中結核分枝桿菌抗原為Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA或RpfD，或其抗原決定基或抗原片段。在一些實施例中，結核分枝桿菌抗原包含以下中之多於一者：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA及RpfD，或其抗原決定基或抗原片段。在一些實施例中，結核分枝桿菌抗原包含以下中之多於一者：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA及RpfD，或其抗原決定基或抗原片段，其包含於融合分子中。
在一些實施例中，異源抗原包含前列腺癌抗原。
在一些態樣中，本揭露內容提供一種藉由前述方法中之任一者製造的CMV病毒載體。 VI. 實例實施例在一些實施例中，本揭露內容提供：
1. 一種製造一後代巨細胞病毒(CMV)之方法，其包含： (a)  向一細胞中引入編碼為CMV複製所必需或強化CMV複製之一基因的一mRNA分子； (b)  用一親本CMV感染該細胞； (c)  培育該細胞；以及 (d)  收集該後代CMV。
2. 一種製造一後代CMV之方法，其包含： (a)  將編碼一pp71蛋白質之一mRNA分子引入一細胞中； (b)  用一親本CMV感染該細胞； (c)  培育該細胞；以及 (d)  收集該後代CMV。
3. 一種製造一後代CMV之方法，其包含： (a)  首先，將編碼一pp71蛋白質之一mRNA分子引入一細胞中； (b)  其次，用一親本CMV感染該細胞； (c)  第三，培育該細胞；以及 (d)  第四，收集該後代CMV。
4. 一種製造一CMV病毒載體之方法，其包含： (a)  將編碼一pp71蛋白質之一mRNA分子引入一細胞中； (b)  用一CMV感染該細胞； (c)  培育該細胞；以及 (d)  收集該CMV病毒載體。
5. 如實施例1之方法，其中為CMV複製所必需或強化CMV複製之該基因為UL82、UL32、UL34、UL37、UL44、UL46、UL48、UL48.5、UL49、UL50、UL51、UL52、UL53、UL54、UL55、UL56、UL57、UL60、UL61、UL70、UL71、UL73、UL75、UL76、UL77、UL79、UL80、UL84、UL85、UL86、UL87、UL89、UL90、UL91、UL92、UL93、UL94、UL95、UL96、UL98、UL99、UL100、UL102、UL104、UL105、UL115或UL122，或其同源物。
6. 如實施例1至3及5中任一項之方法，其中該後代CMV包含pp71蛋白質。
7. 如實施例4之方法，其中該CMV病毒載體包含pp71蛋白質。
8. 如實施例1至7中任一項之方法，其中該細胞為MRC-5細胞。
9. 如實施例1至8中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:14之序列。
10.  如實施例1至8中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:14至20中之一者的序列。
11.  如實施例1至8中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10中之一者的序列。
12.  如實施例1至8中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4之序列。
13.  如實施例1至8、11及12中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO: 4至10中之一者的序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代。
14.  如實施例1至8、11及12中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10中之一者的序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代。
15.  如實施例1至8中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:21至27中之一者的序列。
16.  如實施例1至15中任一項之方法，其中該mRNA分子進一步包含poly(A)尾。
17.  如實施例1至16中任一項之方法，其中poly(A)尾已添加至編碼該pp71蛋白質之該mRNA分子的3'端。
18.  如實施例16或實施例17之方法，其中該mRNA分子係使用編碼該poly(A)尾之雙股DNA模板製造。
19.  如實施例18之方法，其中該雙股DNA模板為質體。
20.  如實施例16至19中任一項之方法，其中該poly(A)尾之長度為大致60至100個核苷酸。
21.  如實施例16至19中任一項之方法，其中該poly(A)尾之長度為80個核苷酸。
22. 如實施例1至10及16至21中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:14至20中之一者的序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代，且具有長度為80個核苷酸之poly(A)尾。
23.  如實施例1至8、11至13及16至21中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10中之一者的序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代，且具有長度為80個核苷酸之poly(A)尾；且其中該poly(A)尾係使用質體模板製造。
24.  如實施例1至8、11、14及16至21中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10之序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代，且具有長度為80個核苷酸之poly(A)尾；其中該poly(A)尾係使用質體模板製造。
25.  如實施例1至8及15至21中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:21至27之序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代，且具有長度為80個核苷酸之poly(A)尾。
26.  如實施例16或實施例17之方法，其中該poly(A)尾在轉錄之後藉由或已藉由酶添加。
27.  如實施例26之方法，其中該poly(A)尾之長度為大致50至100個核苷酸。
28.  如實施例1至27中任一項之方法，其中該mRNA分子係使用轉染引入。
29.  如實施例28之方法，其中該轉染係使用脂質轉染試劑實現。
30.  如實施例29之方法，其中該脂質轉染試劑包含MessengerMax、Lipofectamine 2000、Jet-mRNA或Trans-IT。
31.  如實施例1至30中任一項之方法，其中該mRNA分子係以5 ng/cm2至500 ng/cm2之劑量遞送。
32.  如實施例1至31中任一項之方法，其中該mRNA分子係以50 ng/cm2至100 ng/cm2之劑量遞送。
33.  如實施例1至32中任一項之方法，其中該mRNA分子係以50 ng/cm2之劑量遞送。
34.  如實施例1至33中任一項之方法，其中該mRNA分子係以100 ng/cm2之劑量遞送。
35.  如實施例4、7及8至34中任一項之方法，其中該CMV為HCMV。
36.  如實施例1至3、5、6及8至34中任一項之方法，其中該親本CMV為HCMV。
37.  如實施例1至3、5、6、8至34及36中任一項之方法，其中該後代CMV為HCMV。
38.  如實施例35之方法，其中該CMV為HCMV之經基因修飾之TR株。
39.  如實施例36或實施例37之方法，其中該親本CMV為HCMV之經基因修飾之TR株。
40.  如實施例36、37及39中任一項之方法，其中該後代CMV為HCMV之經基因修飾之TR株。
41.  如實施例4、7、8至35及37中任一項之方法，其中該CMV包含TR3主鏈。
42.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39及40中任一項之方法，其中該親本CMV包含TR3主鏈。
43.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40及42中任一項之方法，其中該後代CMV包含TR3主鏈。
44.  如實施例4、7、8至34、35、38及41中任一項之方法，其中該CMV包含編碼異源抗原之核酸。
45.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42及43中任一項之方法，其中該親本CMV包含編碼異源抗原之核酸。
46.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43及45中任一項之方法，其中該後代CMV包含編碼異源抗原之核酸。
47.  如實施例44至46中任一項之方法，其中該異源抗原包含病原體特異性抗原或腫瘤抗原。
48.  如實施例44至46中任一項之方法，其中該異源抗原包含病原體特異性抗原，其包含人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)抗原、人類巨細胞病毒(HCMV)抗原、B型肝炎病毒(HBV)抗原、C型肝炎病毒(HCV)抗原、乳頭狀瘤病毒抗原(例如，人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原)、瘧原蟲抗原、卡波西氏肉瘤相關之疱疹病毒抗原、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)抗原、伊波拉病毒、結核分枝桿菌抗原、屈公病毒抗原、登革熱病毒抗原、猴痘病毒抗原、單純疱疹病毒(HSV) 1抗原、單純疱疹病毒(HSV) 2抗原、埃-巴二氏病毒(EBV)抗原、脊髓灰白質炎病毒抗原、流感病毒抗原或破傷風梭菌抗原。
49.  如實施例44至46中任一項之方法，其中該異源抗原包含HIV抗原。
50.  如實施例49之方法，其中該HIV抗原為Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif或Vpu，或其抗原決定基或抗原片段。
51.  如實施例49之方法，其中該HIV抗原包含以下中之多於一者：Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif及Vpu，或其抗原決定基或抗原片段。
52.  如實施例49之方法，其中該HIV抗原為包含以下中之多於一者的融合蛋白：Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif及Vpu，或其抗原決定基或抗原片段。
53.  如實施例49之方法，其中該HIV抗原包含SEQ ID NO: 11或12。
54.  如實施例44至46中任一項之方法，其中該異源抗原包含結核分枝桿菌抗原。
55.  如實施例54之方法，其中該結核分枝桿菌抗原為Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA或RpfD，或其抗原決定基或抗原片段。
56.  如實施例54之方法，其中該結核分枝桿菌抗原包含以下中之多於一者：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA及RpfD，或其抗原決定基或抗原片段。
57.  如實施例54之方法，其中該結核分枝桿菌抗原包含以下中之多於一者：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA及RpfD，或其抗原決定基或抗原片段，其包含於融合分子中。
58. 如實施例54之方法，其中該結核分枝桿菌抗原包含SEQ ID NO:13。
59.  如實施例44至46中任一項之方法，其中該異源抗原包含前列腺癌抗原。
60.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至59中任一項之方法，其中該CMV不表現活性UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。
61.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至60中任一項之方法，其中該CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，且不表現活性UL147或其同源物。
62.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至61中任一項之方法，其中該CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，且不表現活性UL82或其同源物。
63.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至62中任一項之方法，其中該CMV包含UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物之缺失。
64.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至63中任一項之方法，其中該CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失及UL147或其同源物之缺失。
65.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至64中任一項之方法，其中該CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失及UL82或其同源物之缺失。
66.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至65中任一項之方法，其中該CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，不表現活性UL82或其同源物，且不表現活性UL18或其同源物。
67.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至66中任一項之方法，其中該CMV進一步包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞或骨髓細胞中表現之miRNA之目標位點。
68.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至67中任一項之方法，其中該CMV不表現活性UL82或其同源物。
69.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至68中任一項之方法，其中該CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失、UL82或其同源物之缺失及UL18或其同源物之缺失。
70.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至68中任一項之方法，其中該CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失及UL82或其同源物之缺失，其中該CMV進一步包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞或骨髓細胞中表現之miRNA之目標位點。
71.  如實施例4、7、8至34、35、38、41、44及47至70中任一項之方法，其中該CMV包含UL82或其同源物之缺失。
72.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43及45至59中任一項之方法，其中該親本CMV不表現活性UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。
73.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72中任一項之方法，其中該親本CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，且不表現活性UL147或其同源物。
74.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59、72及73中任一項之方法，其中該親本CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，且不表現活性UL82或其同源物。
75.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至74中任一項之方法，其中該親本CMV包含UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物之缺失。
76.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至75中任一項之方法，其中該親本CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失及UL147或其同源物之缺失。
77.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至76中任一項之方法，其中該親本CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失及UL82或其同源物之缺失。
78.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至77中任一項之方法，其中該親本CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，不表現活性UL82或其同源物，且不表現活性UL18或其同源物。
79.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至78中任一項之方法，其中該親本CMV進一步包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞或骨髓細胞中表現之miRNA之目標位點。
80.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至79中任一項之方法，其中該親本CMV不表現活性UL82或其同源物。
81.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至80中任一項之方法，其中該親本CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失、UL82或其同源物之缺失及UL18或其同源物之缺失。
82.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59、72至77及79至81中任一項之方法，其中該親本CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失及UL82或其同源物之缺失，其中該親本CMV進一步包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞或骨髓細胞中表現之miRNA之目標位點。
83.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至82中任一項之方法，其中該親本CMV包含UL82或其同源物之缺失。
84.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至83中任一項之方法，其中該後代CMV不表現活性UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。
85.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至84中任一項之方法，其中該後代CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，且不表現活性UL147或其同源物。
86.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至85中任一項之方法，其中該後代CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，且不表現活性UL82或其同源物。
87.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至86中任一項之方法，其中該後代CMV包含UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物之缺失。
88.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至87中任一項之方法，其中該後代CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失及UL147或其同源物之缺失。
89.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至88中任一項之方法，其中該後代CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失及UL82或其同源物之缺失。
90.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至89中任一項之方法，其中該後代CMV不表現活性UL128或其同源物，不表現活性UL130或其同源物，不表現活性UL146或其同源物，不表現活性UL147或其同源物，不表現活性UL82或其同源物，且不表現活性UL18或其同源物。
91.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至90中任一項之方法，其中該後代CMV進一步包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞或骨髓細胞中表現之miRNA之目標位點。
92.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至91中任一項之方法，其中該後代CMV不表現活性UL82或其同源物。
93.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至92中任一項之方法，其中該後代CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失、UL82或其同源物之缺失及UL18或其同源物之缺失。
94.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59、72至77、79至89及91至94中任一項之方法，其中該後代CMV包含UL128或其同源物之缺失、UL130或其同源物之缺失、UL146或其同源物之缺失、UL147或其同源物之缺失及UL82或其同源物之缺失，其中該後代CMV進一步包含編碼微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞或骨髓細胞中表現之miRNA之目標位點。
95.  如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至94中任一項之方法，其中該後代CMV包含UL82或其同源物之缺失。
96.  如實施例44至95中任一項之方法，其中編碼該異源抗原之該核酸置換UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。
97.  如實施例44至96中任一項之方法，其中編碼該異源抗原之該核酸置換UL82或其同源物。
98.  一種後代CMV，其藉由如實施例1至3、5、6、8至34、36、37、39、40、42、43、45至59及72至97中任一項之方法製造。
99.  一種CMV病毒載體，其藉由如實施例4、7、8至34、35、38、41、44、47至71、96或97中任一項之方法製造。
100.    一種mRNA分子，其包含SEQ ID NO:14至20之核苷酸序列。
101.    一種mRNA分子，其包含SEQ ID NO:4至10之核苷酸序列。
102. 如實施例101之mRNA分子，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代。
103. 如實施例101之mRNA分子，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代。
104.    一種mRNA分子，其包含SEQ ID NO:21至27之核苷酸序列。
105. 如實施例100至104中任一項之mRNA分子，其中該mRNA分子進一步包含poly(A)尾。
106. 如實施例100至104中任一項之mRNA分子，其中poly(A)尾已添加至該mRNA分子之3'端。
107. 如實施例100至106中任一項之mRNA分子，其中該mRNA分子係使用編碼該poly(A)尾之雙股DNA模板製造。
108. 如請求項107之mRNA分子，其中該雙股DNA模板為質體。
109. 如實施例100至108中任一項之mRNA分子，其中該poly(A)尾之長度為大致60至100個核苷酸。
110. 如實施例100至109中任一項之mRNA分子，其中該poly(A)尾之長度為80個核苷酸。
111. 一種mRNA分子，其包含根據SEQ ID NO:14至20之一序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代，及長度為80個核苷酸之一poly(A)尾。
112. 一種mRNA分子，其包含根據SEQ ID NO:4至10之一序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代，及長度為80個核苷酸之一poly(A)尾，其中該mRNA分子係使用一質體模板製造。
113. 一種mRNA分子，其包含根據SEQ ID NO:4至10之一序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代及該mRNA分子之長度為80個核苷酸之一poly(A)尾，其中該mRNA分子係使用一質體模板製造。
114. 一種mRNA分子，其包含根據SEQ ID NO:21至27之一序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代，及長度為80個核苷酸之一poly(A)尾。
115. 如實施例105之mRNA分子，其中該poly(A)尾已在轉錄之後由酶添加。
116. 如實施例115之mRNA分子，其中該poly(A)尾之長度為大致50至100個核苷酸。 實例 實例1 初級纖維母細胞中之UL82 mRNA之短暫轉染補充UL82缺失型HCMV載體
自疫苗載體缺失必需病毒基因為確保臨床安全性之習用實踐。然而，為製造載體，必須採用一些補充方法。標準方法涉及產生表現必需病毒基因或其功能等效物之穩定細胞株。此在諸如需要初級正常二倍體細胞用於病毒產生之HCMV的情形中為複雜的。替代性方法為利用mRNA轉染來將必需病毒基因遞送至宿主細胞。在此研究中，將UL82 mRNA短暫轉染至初級纖維母細胞(MRC-5細胞)中以補充UL82缺失之HCMV載體。
HCMV UL82表現主要外被蛋白pp71。pp71之主要功能中之一者出現在感染起始時，其中其參與細胞基因產物Daxx之降解。在不存在pp71之情況下，Daxx使由組蛋白去乙醯酶介導之病毒即刻早期(IE)基因表現沉默。然而，當將pp71轉運至細胞核時，此細胞保護機制得到有效中和，其中其可介導Daxx之蛋白酶體降解，從而釋放對IE基因表現之阻斷。pp71缺失之HCMV載體展示防止病毒在靈長類動物模型中擴散及排出之顯著生長缺陷。結合其他安全性修飾，pp71缺失在初級RhCMV感染之直接注射模型中保護胎兒恆河猴。
為能夠製造UL82缺失之HCMV載體，靶向DAXX之siRNA可轉染至宿主細胞中，以便在功能上補充pp71之不存在。雖然此方法足以產生病毒，但其主要抑制新生Daxx產生，且不提供可能增強感染過程(諸如細胞週期刺激、有效病毒粒子包裝及病毒穩定性)之pp71之其他功能中之任一者。
結果表明，必需病毒基因UL82之mRNA轉染可提供功能補充，引起UL82缺失型HCMV病毒載體之成功繁殖。UL82 mRNA轉染之使用在與藉由抗DAXX siRNA轉染進行之模擬轉染或功能補充相比時加速HCMV擴散，如 圖 1中所示。HCMV載體感染之MRC-5培養物比抗DAXX siRNA轉染之培養物早6至9天達至100%細胞病變效應(CPE)。另外，與用抗DAXX siRNA轉染之培養物相比，在UL82 mRNA轉染之培養物中早6至9天達成最大病毒效價( 圖2)。如 圖 3中所示，UL82 mRNA轉染引起pp71蛋白質表現持續至少6天，經免疫墨點分析所量測。此等資料指示，與使用抗DAXX siRNA之補充方法相比，UL82 mRNA轉染可有效地補充UL82缺失型HCMV且顯著加速病毒產生。
此等結果亦表明UL82 mRNA轉染可增強來自BAC DNA之病毒之復原。使用Δpp71-GFP (UL82缺失型)病毒構築體之實驗指示自純系BAC DNA復原之更快速進展。 圖 4展示在轉染後12天，來自6孔盤之拼接顯微圖中之此效應的可視化。綠色細胞之數目指示在各條件，抗DAXX siRNA及pp71 mRNA下病毒復原之效率。使用pp71 mRNA似乎提高效率，此應導致較早之收穫時間。
將mRNA轉染用於補充不限於UL82且可擴展至其他必需HCMV基因。mRNA之短暫轉染亦可用於藉由用來自已知生長至高效價之實驗室株之mRNA的組合文庫補充感染來鑑別准許HCMV生長至較高效價的功能。另外，存在感染晚期之pp71蛋白質有可能包裝於後代病毒中，其可藉由更高效的第一輪感染及持續感染之建立而降低疫苗之所需劑量。
經轉染之UL82 mRNA之效用亦可應用於細胞株以用於測定病毒儲備液之感染性效價。當前用於病毒滴定之方法涉及使用所產生之細胞株以在藉由添加外源性化學物質誘導時產生pp71。此等細胞株之產生為人工及時間密集的，且藉由轉染mRNA補充功能之能力可潛在地節省發育時間。用UL82 mRNA轉染之MRC -5及BJ-5ta細胞在廣泛的病毒稀釋系列中呈現病毒效價恆定( 圖5A、 圖5B)。此與pp71 BJ-5ta多西環素誘導性細胞株形成鮮明對比，其中病毒效價似乎在較低接種物下降低，其效應可解釋為pp71之水準不足( 圖 5C)。
另外，用UL82 mRNA轉染天然容許之MRC-5細胞導致相較於BJ-5ta細胞或pp71 BJ-5ta細胞株之轉染高得多的表觀效價。此可能提供物質之更精確效價且允許更好地定量劑量範圍研究中使用之經稀釋物質。UL82 mRNA之轉染應允許以更高的分析再現性及信賴度測試更低效價的病毒(例如，小於5e4 FFU/mL)。 實例2 用於補充UL82缺失型HCMV載體的UL82 mRNA之短暫轉染
在另一實例中，評估藉由使用pp71 mRNA轉染提供反式蛋白質對UL82 (pp71)缺失型載體進行補充。此方法可顯著地減少劑量且潛在地穩定具有外被蛋白之完全補充的病毒產物。此等研究證實額外操作者之再現性，證實mRNA轉染量之滴定，且評估生產製程中使用HYPERStacks®之pp71 mRNA轉染。
當pp71 mRNA在感染之前轉染至MRC-5細胞中時，觀測到pp71缺失型病毒之加速生長動力學。藉由將100 ng/cm 2之pp71 mRNA轉染至以6.7×10 3個細胞/平方公分接種之細胞中來進行此等實驗。為了進一步改良病毒生長動力學，研究介於5 ng/cm 2至500 ng/cm 2之pp71 mRNA之劑量範圍( 圖 6)。即使在5 ng/cm 2下，與使用抗DAXX siRNA之前述生產製程相比，觀測到達到峰值效價(peak titer)之天數減少。
在劑量範圍實驗結束之後，選擇100 ng/cm 2條件以使用HYPERStacks®向前移動至生產製程中。在HYPERStack-12或HYPERStack-36中進行使用pp71 mRNA之七次運行以確認製程可擴展性( 圖 7)。
免疫墨點研究用於評估在一系列pp71 mRNA濃度範圍內之病毒粒子中之pp71蛋白質併入( 圖8)。此等資料表明，需要50至100 ng/cm 2之間的mRNA濃度以經由免疫墨點偵測病毒粒子中之pp71。
為評估負載至病毒粒子中之pp71 mRNA表現之蛋白質是否為功能性的，將初級MRC-5細胞(無pp71補充)中pp71缺失型病毒之效價與pBJ5TA纖維母細胞株(+pp71補充)之效價相比較。組織培養物感染劑量50 (TCID50)效價分析用於未經補充之MRC-5細胞且晚期抗原免疫螢光分析(LA IFA)用於補充pp71之BJ5TA纖維母細胞株。在初步實驗中，在兩個效價分析中評估用抗DAXX siRNA或pp71 mRNA產生之病毒儲備液(表1)。對於用pp71 mRNA產生之pp71缺失型病毒，未經補充之TCID50效價比經補充之LA IFA效價低＜1 log，類似於野生型TR3病毒，表明功能性pp71併入病毒粒子中。相比之下，用抗DAXX siRNA產生之pp71缺失型病毒的未經補充之TCID50效價比經補充之LA IFA效價低＞2 log，指示缺乏功能性pp71。此等結果表明，此比較效價分析可用於確認pp71 mRNA產生之病毒儲備液中之pp71蛋白質功能且用於效能分析中。 表 1.評估pp71蛋白質功能之比較效價分析。
病毒 LA IFA FFU/mL 1 對數效價 LA IFA TCID50 FFU/mL 2 對數效價 TCID50 對數差異
TR3 WT 1.4E+06 6.1 4.1E+05 5.6 0.5
抗 DAXX 產生之 CMV 載體 1 1.7E+06 6.2 1.0E+04 4.0 2.2
pp71 產生之 CMV 載體 1 1.2E+06 6.1 4.9E+05 5.7 0.4
抗 DAXX 產生之 CMV 載體 2 6.9E+05 5.8 1.4E+03 3.1 2.7
pp71 產生之 CMV 載體 2 4.0E+06 6.6 5.6E+05 5.7 0.9
1在補充pp71之pBJ5TA纖維母細胞中測定LA IFA效價。 2在未經補充之初級MRC-5纖維母細胞中測定TCID50效價。 實例3 研發pp71缺失型HCMV產生之pp71 mRNA轉染製程 1.0 背景
HCMV pp71 (UL82 ORF)可自疫苗缺失以減弱病毒複製以便改良安全性。pp71為在病毒進入之後遞送至細胞之71 kDa外被磷蛋白。pp71具有若干作用，包括即刻早期調節病毒基因表現、促進蛋白質轉譯及藉由抑制固有細胞因子之免疫逃避(Kalejta 2020)。對於活體外高效病毒產生，pp71缺失型載體需要直接或功能性pp71補充。功能補充方法使用siRNA轉染來抑制細胞Daxx表現。DAXX之減弱(Knockdown)補償固有細胞防禦之pp71抑制之不存在(Cantrell 2006, Preston 2006, Saffert 2006, Woodhall 2006)。然而，需要直接pp71補充，其與抗DAXX siRNA減弱以及與補充pp71之其他功能相比，可能增強即刻早期(IE)活化。
如此實例中所示，與利用抗DAXX siRNA之前述轉染製程相比，在轉染pp71 mRNA後，加速pp71缺失型主鏈載體之生長。直接pp71補充亦具有負載具有pp71蛋白質之HCMV病毒粒子的潛能，此可藉由增加第一輪載體複製之效率來降低疫苗劑量。藉由提供反式蛋白質補充pp71 (UL82)缺失型載體已證實恆河猴CMV模型之免疫原性劑量減少的潛能(Marshall 2019)。藉由使抗DAXX siRNA轉染製程適於pp71 mRNA補充，可顯著地減少劑量，從而提供製造及臨床益處，且潛在地穩定具有外被蛋白之完全補充的病毒產物。疫苗培養系統可利用pp71補充生產細胞株，或抗DAXX siRNA轉染可經pp71 mRNA之短暫轉染置換，其研發及實施將描述於此報導中。 2.0 方法原理
經由抗DAXX siRNA或pp71 mRNA之pp71缺失型HCMV產生均基於使用以脂質為主之轉染試劑轉染細胞，允許核酸進入細胞中，隨後感染。用於使用抗DAXX siRNA製造pp71缺失型HCMV之製程流程如下： 1)在感染後-1天(DPI)，使用Lipofectamine 2000之10 µM抗DAXX siRNA轉染 2)在0 DPI，以MOI 0.01進行感染 3)在10 ±1 DPI，第2抗DAXX siRNA轉染 4)在11 ±1 DPI，培養基交換以減少血清 5)在完全CPE 20至24 DPI時收穫
pp71蛋白質實現之對病毒複製之改良允許省略第二轉染步驟，其為用於產生之製程改良，因為其移除製程之完整步驟。pp71 mRNA轉染實現之另一製程改良為在較早DPI，大致一週進行培養物收穫。用於使用pp71 mRNA製造pp71缺失型HCMV之製程流程如下： 1)在-1 DPI使用Lipofectamine MessengerMax之pp71 mRNA轉染 2)在0 DPI，以MOI 0.01進行感染 3)在5 DPI，培養基交換以減少血清 4)在完全CPE 12至16 DPI時收穫。 3.0 方法概述
在T-燒瓶中，當細胞以6.7×10 3個細胞/平方公分接種時，在接種後第3天(＞70%融合)轉染MRC-5纖維母細胞。在HYPERStacks中，當細胞以6.7×10 3個細胞/平方公分接種時，在接種後第4天(＞85%融合)轉染MRC-5纖維母細胞。 用於轉染pp71 mRNA之方案如下： 1. 判定待轉染之血管且計算總培養體積(Vf) 2. 標記二個管，一個用於轉染試劑MessengerMax且一個用於核酸 3. 向各管中添加1/16 Vf無血清培養基(SFM) 4. 向轉染試劑管中添加每毫升Vf 1.9 μL MessengerMax，藉由倒置混合且培育10分鐘 5. 向核酸管中添加100 ng/cm 2pp71 mRNA且藉由倒置混合 6. 將轉染試劑管之內容物添加至核酸管中，藉由倒置混合且培育5分鐘 7. 將轉染混合物添加至待轉染之容器中之完全生長培養基(complete growth media；CGM)中且搖動以分配
轉染後當天，血管以0.01之MOI感染pp71缺失型HCMV。在感染後第5天，完全生長培養基(CGM；含有9% FBS及2 mM GlutaMax之DMEM)經還原血清培養基(reduced serum media，RSM；含有0.2% FBS及2 mM GlutaMax之DMEM)置換。
用於製造中之GMP產生之pp71 mRNA構築體經假尿苷(pseudoU)及5-甲基胞苷(5meC)完全取代，含有天然HCMV UL82 ORF5'及3' UTR，且用質體模板80核苷酸poly-A尾產生(參見 圖 16，構築體B，SEQ ID NO:4)。 4.0 定義
術語 / 首字母縮寫 定義
BDS 原料藥物質
CGM 完全生長培養基(DMEM、9% FBS、2 mM GlutaMax)
CPE 細胞病變效應
DAXX 死亡相關蛋白6
DPI 感染後天數
DPT 轉染後天數
EGFP 增強之綠色螢光蛋白
FFU 病灶形成單位
HCMV 人類巨細胞病毒
IE 即刻早期
IFA 免疫螢光分析
gB 醣蛋白B
LA 晚期抗原
MOI 感染倍率
mRNA 信使RNA
MFI 平均螢光強度
ORF 開放閱讀框架
RNA 核糖核酸
RSM 還原血清培養基(DMEM、0.2% FBS、2 mM GlutaMax)
siRNA 小干擾RNA
SFM 無血清培養基(DMEM、2 mM GlutaMax)
TB 結核
TCID50 組織培養物感染劑量50
TFF 切向流過濾(Tangential flow filtration)
UTR 非轉譯區
WT 野生型
5.0 方法研發 5.1 產生 V5 標記之 pp71 mRNA 構築體及偵測細胞裂解物中之 V5 表現
自HCMV UL82開放閱讀框架之起始密碼子至具有V5標籤、合成5'UTR及小鼠α-血球蛋白3'UTR之終止密碼子設計pp71 mRNA構築體( 圖16，構築體A)。使用抗V5抗體偵測pp71蛋白質表現。
為判定在轉染pp71-V5 mRNA之後，可在MRC-5纖維母細胞中是否偵測到pp71蛋白質，進行免疫墨點及免疫螢光分析。MRC-5纖維母細胞使用轉染試劑Lipofectamine 2000 (用於抗DAXX siRNA轉染)用50 ng/cm 2之pp71-V5 mRNA轉染。對於免疫墨點，細胞集結粒時程自轉染後第1天至第6天收集且將其再懸浮於裂解緩衝液改質之RIPA緩衝液加蛋白酶抑制劑中。進行BCA蛋白質分析以使蛋白質負載標準化，且在NuPAGE™ 4-12% Bis-Tris凝膠上每個樣品負載50 μg總蛋白質。MRC-5細胞裂解物用作陰性細胞對照樣品。使用V5抗體之細胞裂解物之免疫墨點分析展示在轉染後第6天表現pp71-V5蛋白質( 圖 9A)。pp71為71 kDa磷蛋白且如 圖 9A中所見，pp71-V5蛋白質在50-60 kDa範圍內運行。進行分子量蛋白質階梯研究以確定60-80 kDa目標範圍內之準確度。結果展示，用於 圖 9A中之SeeBlue™ Plus2預染色蛋白質標準物的執行不如Fisher BioReagents™ EZ-Run™預染色Rec蛋白質階梯(ANT-010, NB35)。因此，在所有其他免疫墨點中，使用EZ-Run階梯。
在轉染後48小時，對用50 ng/cm 2之pp71-V5 mRNA轉染之MRC-5纖維母細胞進行免疫螢光分析(IFA)。細胞用含4%甲醛之PBS固定且用初級抗V5標籤抗體，隨後用Cy5標記之二級抗體染色。pp71-V5蛋白質經表現且定位至核區，其用核染料DAPI複染( 圖 9B)。
在確認經轉染之pp71-V5 mRNA在MRC-5纖維母細胞中表現pp71-V5蛋白質之後，經由pp71缺失型HCMV複製評定進行pp71-V5蛋白質之功能分析。初步感染資料指示，與抗DAXX siRNA相比，病毒細胞病變效應(CPE)在轉染pp71 mRNA之情況下進展更快。使用抗DAXX siRNA進行補充之pp71缺失型HCMV生產製程由二次10 µM抗DAXX siRNA轉染(在感染之前一天(DPI -1))及在DPI 10的第二抗DAXX siRNA轉染組成。考慮到免疫墨點分析展示pp71蛋白質含量在轉染後第6天降低( 圖 9A)，在DPI 5或轉染後第6天較早引入第二pp71 mRNA轉染。在處於4×下之相位影像中捕獲在13 DPI之CPE進展，從而比較模擬轉染、在-1及10 DPI用10 µM抗DAXX siRNA轉染或在-1及5 DPI用50 ng/cm 2pp71-V5 mRNA轉染且以MOI 0.01感染pp71缺失型HCMV的MRC-5纖維母細胞( 圖 10)。補充有pp71 mRNA之MRC-5纖維母細胞與補充有抗DAXX siRNA之MRC-5纖維母細胞相比在13 DPI展現晚期CPE。
為進一步評估及定量pp71 mRNA補充對病毒複製之作用，執行病毒生長曲線。簡言之，在以MOI 0.01感染pp71缺失型HCMV之前，MRC-5纖維母細胞用10 µM抗DAXX siRNA (-1及10 DPI)轉染或用40 ng/cm 2pp71-V5 mRNA (-1及6 DPI)轉染。在感染後多天收穫病毒上清液且使用HCMV LA免疫螢光滴定分析(TMD-QC-0061 v4.0)進行滴定。當與使用抗DAXX siRNA轉染生長之病毒相比時，較早偵測到具有pp71 mRNA補充(7 DPI對比於9 DPI)之病毒，且較早出現峰值效價(14 DPI對比於17 DPI) ( 圖 11)。另外，與抗DAXX siRNA補充相比，在pp71 mRNA之情況下之峰值效價高大致0.5 log。CPE評估( 圖 10)以及病毒生長曲線( 圖 11)兩者均展示pp71 mRNA之轉染改良pp71缺失型HCMV產生。
接著，判定來自轉染之pp71蛋白質是否併入至HCMV病毒粒子中。為分析病毒粒子中所含有之蛋白質，在完全CPE時收集經感染細胞上清液。病毒上清液首先在低速(2,500×g，15 min)下離心以移除細胞碎片，隨後高速離心(24,000 RPM，1小時)以經由20%山梨糖醇墊集結病毒粒子。將病毒粒子集結粒再懸浮於裂解緩衝液(經修飾之RIPA緩衝液加蛋白酶抑制劑)中且藉由免疫墨點分析。前述資料展示當MRC-5纖維母細胞在-1及6 DPI用40 ng/cm 2pp71-V5 mRNA轉染且以MOI 0.01感染pp71缺失型HCMV時缺乏pp71-V5蛋白質表現，此可能歸因於 圖 9A中所展示的在轉染後第6天pp71-V5蛋白質之表現降低。為了增加pp71表現位準，在11 DPI添加40 ng/cm 2pp71-V5 mRNA之額外轉染且在13 DPI收集病毒粒子。即使使用三種mRNA轉染，在藉由使用V5抗體進行免疫墨點之經感染細胞裂解物(色帶3)或病毒粒子裂解物(色帶4)中未偵測到pp71-V5蛋白質( 圖 12)。僅來自用pp71 mRNA轉染的未經感染之細胞(pp71陽性對照)之細胞裂解物展示pp71表現(色帶2)，表明感染可抑制來自外源性mRNA之pp71表現。pp71陽性對照之裂解物為 圖 9A中所使用之轉染後第2天的裂解物。使用針對醣蛋白B (gB)之抗體展示感染之存在。病毒粒子裂解物樣品中之肌動蛋白之存在可能歸因於共分離蛋白質。藉由蛋白酶K處理病毒粒子製劑移除非特異性結合蛋白之細胞污染，經包括肌動蛋白及微管蛋白之豐富細胞蛋白質的減少所指示(Turner 2020)。藉由超速離心使15 ml體積之澄清病毒上清液集結且再懸浮於200 µL裂解緩衝液中。
為研究在病毒感染期間的後期細胞裂解物中pp71蛋白質表現之缺乏，採用以下動作： • 測試不同轉染試劑 • 利用GFP mRNA及野生型病毒感染 • 測試不同mRNA穩定核苷修飾 • 設計替代性pp71 mRNA構築體 5.2 轉染試劑選擇
評估若干轉染劑在MRC-5纖維母細胞中之轉染效率。與pp71-V5 mRNA類似構築之EGFP mRNA用於測試。細胞用三種量之mRNA (低、中等、高)，使用四種轉染試劑(包括Lipofectamine 2000 (ThermoFisher)、MessengerMax (ThermoFisher)、Jet-mRNA (PolyPlus)及Trans-IT (Mirus Bio))以四種脂質水準轉染，且藉由流式細胞測量術評估EGFP表現( 圖13A 至圖9B； 表3)。MessengerMax產生最高百分比之經轉染細胞( 圖13A)、最高平均螢光強度(MFI) ( 圖13B)及最高細胞生存力( 圖13C)。脂質量在各脂質之最佳範圍之參數內且基於製造商方案中公開之範圍選取條件。 表 3 .MRC5細胞中之EGFP mRNA轉染試劑最佳化。
  (µg) (µl)
EGFP mRNA Lipofectamine 2000 Messenger Max Jet-mRNA Trans-IT
0 0 0 0 0
「低」 A 0.5 1 0.75 0.5 0.5
B 1
C 1.5
「中等」 D 0.5 1.5 1 1 1
E 1
F 1.5
「高」 G 0.5 2 1.25 2 1.5
H 1
I 1.5
「較高」 J 0.5 2.5 1.5 3.6 2
k 1
所有轉染均根據製造商說明書進行。用於病毒產生之MRC-5纖維母細胞中之所有後續mRNA轉染使用MessengerMax轉染試劑。 5.3 額外 pp71 mRNA 構築體
為解決在HCMV感染期間的後期，甚至在多次轉染pp71 mRNA之後可偵測pp71蛋白質之缺乏，考慮HCMV感染抑制以脂質為主之mRNA轉染的可能性。利用與亦含有Cy5標籤之pp71 mRNA類似構築的EGFP mRNA允許目測經轉染之mRNA以及EGFP蛋白。MRC-5纖維母細胞在DPI -1及DPI 6用50 ng/cm 2EGFP-Cy5 mRNA轉染，且在DPI 0以0.01之MOI感染WT TR3。在感染期間存在Cy5信號，但EGFP信號在感染期間的後期丟失( 圖 14)。因此，似乎HCMV感染可抑制來自經轉染mRNA之一些蛋白質表現。亦在感染過程期間之不同時間進行多次轉染，其中EGFP偵測無明顯加強。歸因於與抗DAXX siRNA相比使用pp71 mRNA之CPE進展更快、改良之轉染試劑(MessengerMax)及缺乏來自第二轉染之信號，在感染之前進行的pp71 mRNA之單一轉染用於其他實驗。
用未經修飾之RNA轉染細胞可由於先天性免疫路徑之活化而導致細胞死亡(Devoldere 2016)。以下實驗解決pp71 mRNA構築體之修飾是否可穩定mRNA以在MRC-5纖維母細胞中更好地表現。穩定劑可包括(Devoldere 2016)： • poly-A尾之伸長率 • 經修飾之帽結構 • 經修飾之核苷：5-甲基胞苷(5meC)、N6-甲基腺苷(m6A)、5-甲基尿苷(m5U)、假尿苷(pseudoU)、2-硫尿苷(s2U)、5-甲氧基尿苷(5moU) • 經由HPLC純化移除dsRNA污染物。
舉例而言，已展示，尿苷及胞苷殘基經假尿苷及5-甲基胞苷取代降低先天性免疫識別且更有效地轉譯假尿苷修飾之RNA (McCaffrey 2017, Kariko 2008)。 圖9 至圖14中所使用之所有pp71 mRNA構築體均用pseudoU及5meC穩定。
利用EGFP mRNA，但使用不同核苷修飾，在具有及不具有HCMV感染(處於MOI 0.01下之WT TR3)之經轉染細胞中比較EGFP之表現。在DPI -1在MRC-5纖維母細胞中轉染以下EGFP mRNA構築體。 1) 無修飾 2) 5moU 3) pseudoU/5meC 4) Cy5-UTP:5moU
注意，Cy5-UTP:5moU為與5moU為1:3比率之經Cy-5標記之三磷酸尿苷，且轉譯效率與Cy5-UTP取代成反比。EGFP mRNA以100 ng/cm 2轉染，使先前使用之量加倍( 圖15A 至圖15B)，以評定轉染增加量之mRNA是否將在病毒感染期間的後期導致蛋白質偵測。在DPI 7收集細胞集結粒，且代表性免疫墨點( 圖15A)展示在病毒感染期間用5moU穩定之mRNA中之EGFP表現增加(色帶4及5)。細胞死亡在用不含核苷修飾之mRNA轉染的單層中尤其顯而易見。pp65表現之陽性對照及EGFP表現之陰性對照為TR3感染之細胞裂解物(色帶1)。上述條件在DPI 6成像；此處展示的為僅轉染( 圖15B中之「B」)及具有MRC-5纖維母細胞之WT TR3感染MOI 0.01的轉染( 圖15B中之「C」)之5moU EGFP表現。相同場之相位影像展示僅轉染MRC-5纖維母細胞( 圖15B中之「D」)或經感染MRC-5纖維母細胞( 圖15B中之「D」)中之CPE之存在。在所測試之核苷修飾中，與此組條件中之pseudoU/5meC修飾相比，5moU修飾展示EGFP表現及病毒擴散增加。
為探究缺乏pp71蛋白質併入至病毒粒子中係歸因於外源性pp71未定位至正確細胞位置之可能性，設計額外pp71構築體( 圖16)。新構築體包括具有全長病毒pp71 5'及3' UTR之mRNA (b)，從而可能實現正確定位。包括pp65 (UL83)之雙順反子mRNA (e)及pp65中具有終止密碼子之額外雙順反子mRNA (f)。雙順反子mRNA亦轉錄於天然HCMV感染(Ruger 1987)中，從而可能實現正確定位。在pp65中添加終止密碼子將防止過量pp65蛋白質表現及對病毒感染之潛在額外作用。pp71短構築體(d)含有在TATA盒之後開始的截短5'UTR，而3'UTR在假定poly(A)信號序列之前結束。最終構築體含有HCMV IE1 5'UTR及小鼠α-血球蛋白3'UTR (c)，與pp71起始-終止構築體(a)之3'UTR一致。構築體不含有V5抗原決定基標籤。所有新構築體均用5moU修飾之核苷製備。構築體(b) (具有全長病毒5'及3' UTR之pp71 mRNA)亦用pseudoU/5meC修飾之核苷製備，與pp71 mRNA起始-終止構築體(a)相同。
所有構築體在使用pp71缺失型載體以0.01之MOI進行或不進行感染之MRC-5纖維母細胞中以100 ng/cm 2轉染，且藉由免疫墨點分析細胞裂解物之pp71蛋白質表現( 圖 17A 至圖 17C)。在轉染後1、6及10或13天(DPT)收穫僅轉染樣品以顯示隨時間推移之表現，而在晚期CPE 9或12 DPI (分別為10或13 DPT)收穫pp71缺失型感染樣品。在12 DPI收穫的以MOI 0.01感染WT TR3之MRC-5纖維母細胞充當陽性對照。即使在僅轉染裂解物中，偵測到pp71蛋白質之最小表現至無表現。在用具有病毒5'及3'UTR且具有pseudoU/5meC修飾之核苷之全長pp71 mRNA轉染的MRC-5纖維母細胞中偵測到pp71蛋白質之最高表現( 圖 17A，色帶2至4)。儘管在此免疫墨點之前在具有病毒感染( 圖 17A，色帶5)之裂解物中偵測到極少pp71蛋白質表現，但未偵測到pp71蛋白質。先前用與WT TR3感染組合之5moU EGFP mRNA偵測到之增加表現在與TR3Δpp71感染系統組合之pp71 mRNA中未轉譯。可能使用與野生型病毒感染偶合之非病毒mRNA與使用與複製缺陷型病毒偶合之病毒mRNA的轉染不相當，因為整體感染生命週期不同。後續實驗使用具有病毒5'及3' UTR之全長pp71 mRNA構築體(「構築體B」)，其中病毒5'及3' UTR用pseudoU/5meC修飾。
存在二種經由(1)經設計以添加80個核苷酸之質體模板編碼尾或(2)酶促(其可變地添加大致60至100個核苷酸)將poly-A尾添加至pp71 mRNA構築體中之製造方法(TriLink Biotechnologies)。經由質體模板將poly(A)尾添加至具有及不具有V5標籤之起始-終止pp71 mRNA構築體(構築體A)中。由於製造誤差，在不具有poly-A尾之情況下產生第一批具有用pseudoU/5meC修飾之病毒5'及3' UTR的全長pp71 mRNA。藉由免疫墨點( 圖18A)及生長曲線( 圖 19)，此批次之mRNA加尾，內部酶促合成未知尾長但有功能的蛋白質。在具有酶促100核苷酸尾部之情況下產生後續批次。由於需要增加量，因此使用TriLink PD製程，以較大規模利用酶促添加之poly-A尾產生下一批次。然而，TriLink PD製程僅產生50核苷酸尾部。為自製造製程消除可變poly-A尾長度，在具有模板化80核苷酸poly-A尾之情況下產生下一批次之pp71 mRNA。由於pp71 mRNA構築體對HCMV產生之重要性，進行免疫墨點，比較來自MRC-5細胞裂解物中不同批次之pp71 mRNA的pp71蛋白質之表現，其中poly(A)尾由不同方法產生( 圖18A)。MRC-5纖維母細胞用不同批次之pp71 mRNA以100 ng/cm 2轉染，且在轉染後5天收集細胞集結粒。藉由任何方法得到的含有poly-A尾之所有批次之pp71 mRNA展示至轉染後第5天之pp71蛋白質表現。在無poly-A尾之情況下產生之pp71 mRNA展示於 圖 18A，色帶4中。 圖 18B展示在轉染後2天、4天、6天及8天測試「模板pA 80bp規模放大」 (使用GMP製造製備中之質體模板poly-A生產製程的PD規模放大運行)與標準規模運行「模板pA 80bp」 (其亦具有模板化80核苷酸poly-A尾)的pp71蛋白質表現。MRC-5纖維母細胞用pp71 mRNA以100 ng/cm 2轉染，且收集細胞集結粒。兩個批次均展示相等的pp71蛋白質表現。
亦進行多種生長曲線，比較在具有poly-A尾之情況下藉由模板或酶促產生之pp71 mRNA批次( 圖19)。在 圖 19中組合之各別生長曲線中，MRC-5纖維母細胞在DPI -1用指定批次之pp71 mRNA以100 ng/cm 2轉染且以0.01之MOI感染pp71缺失型載體。在感染後多天，藉由LA IFA測定以FFU/mL為單位之病毒效價。結果顯示，所有批次之pp71 mRNA可成功地補充產生MRC-5纖維母細胞中之pp71缺失型病毒。在具有80核苷酸poly(A)尾之情況下使用質體模板產生後續pp71 mRNA。 5.4 pp71 mRNA 滴定
考慮到對pp71 mRNA轉染製程進行之變化以及藉由免疫墨點在pp71缺失型感染細胞裂解物中觀察到之正pp71蛋白質信號( 圖 17A 至圖17C)，研究所轉染之pp71 mRNA之量。在前述實驗中，每平方公分組織培養物面積轉染40-100 ng pp71 mRNA。 圖 20展示在MRC-5纖維母細胞中轉染增加量(200、500及1000 ng/cm 2)之pp71 mRNA與處於MOI 0.01下之pp71缺失型病毒(結核缺失：TR3 mir124 ΔUL128-130 ΔUL146-147 ΔUL82 Ag85A-ESAT-6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD)感染組合之後，藉由免疫墨點在16 dpi細胞裂解物中的pp71蛋白質表現。MRC-5細胞裂解物用作陰性細胞對照(色帶1)，其中以MOI 0.01感染pp71缺失型病毒的未經轉染之MRC-5纖維母細胞作為陰性病毒對照(色帶2)且以MOI 0.01感染WT TR3之MRC-5纖維母細胞作為陽性對照(色帶3)。僅以1000 ng/cm 2轉染pp71 mRNA之細胞裂解物展示至16 DPI (17 DPT，色帶4)之pp71表現。類似地，用200 ng/cm 2或500 ng/cm 2pp71 mRNA轉染且以MOI 0.01感染pp71缺失型病毒之MRC-5纖維母細胞展示在16 DPI (17 DPT)之pp71蛋白質表現。
為進一步改良pp71缺失型病毒產生，進行生長曲線，比較5 ng/cm 2至500 ng/cm 2的所轉染之pp71 mRNA之範圍以及比較起始-終止構築體(SS)與具有病毒5'及3' UTR之全長構築體(FT) ( 圖21)。MRC-5纖維母細胞用pp71 mRNA (5至500 ng/cm 2之FT或SS)或抗DAXX siRNA (10 µM)轉染，隨後以0.01之MOI感染pp71缺失型病毒，且在感染後多天藉由LA IFA測定以FFU/mL為單位之病毒效價。資料顯示，與使用抗DAXX siRNA之前述生產製程相比，即使在5 ng/cm 2的所轉染之FT pp71 mRNA下，達到峰值效價之天數明顯降低。在所轉染之FT pp71 mRNA的量較低(15 ng/cm 2及更小)時，與mRNA量相關之峰值效價延遲，而在FT pp71 mRNA量超過25 ng/cm 2時，生長曲線相等。資料亦顯示，當甚至以至多500 ng/cm 2之量轉染起始-終止pp71 mRNA (SS)時，與使用全長pp71 mRNA (FT)相比，延遲峰值效價，表明原生UTR對病毒產生之益處。利用數量為100 ng/cm 2之pp71 mRNA的轉染用於以HCMV pp71缺失型生產製程為主之病毒生長曲線動力學( 圖21)、藉由免疫墨點進行之pp71蛋白質表現( 圖 17A 至圖17C及 圖 20)及藉由TCID50 (參見 表 2)進行之包裝病毒粒子之pp71蛋白質之證據中。 表 2 .評估pp71蛋白質功能之比較效價分析。
病毒 LA IFA FFU/mL 1 對數效價 LA IFA TCID50 FFU/mL 2 對數效價 TCID50 對數差異
TR3WT 1.4E+06 6.1 4.1E+05 5.6 0.5
TB 缺失型 DAXX 1.7E+06 6.2 2.5E+03 3.4 2.8
TB 缺失型 pp71 200 1.3E+06 6.1 4.8E+04 4.7 1.4
TB 缺失型 pp71 100 1.2E+06 6.1 4.8E+04 4.7 1.4
TB 缺失型 pp71 50 6.8E+05 5.8 3.5E+03 3.5 2.3
TB 缺失型 pp71 25 1.9E+06 6.3 4.8E+03 3.7 2.6
1在補充pp71之pBJ5TA纖維母細胞中測定LA IFA效價。 2在未經補充之初級MRC-5纖維母細胞中測定TCID50效價。 5.5 製造之規模放大
為確認100 ng/cm 2下之pp71 mRNA轉染方法可擴展成HYPERStack格式，在HYPERStack-12或HYPERStack-36中進行七次運行。在該製程在T-燒瓶中研發之後，在HYPERStack-12中進行三種生長曲線( 圖22)。在接種後第3天轉染HS-12，且在接種後第4天，以0.01之MOI感染pp71缺失型病毒。在感染後多天，藉由LA IFA測定以FFU/mL為單位之病毒效價。在遵循此格式之初始實驗中，在接種後3天之轉染時間揭露HYPERStack-12僅為70-75%融合。基於觀測之較低持續峰值效價(小於1×10 6FFU/mL)，吾等改變接種後4天之轉染程序以達成後續生長曲線之大於85%融合。
在接種後第4天轉染或大於85%融合且在接種後第5天以0.01之MOI感染pp71缺失型病毒的在HYPERStack-12及HYPERStack-36中進行之四種生長曲線使得12至14 DPI之LA IFA效價大於1×10 6FFU/mL ( 圖22)。此確認在以6.67×103個細胞/平方公分接種後4天進行轉染時，pp71 mRNA轉染方法在100 ng/cm 2下對HYPERStack容器之可擴展性。
在用於表現異源基因(諸如抗原)之一些HCMV載體中，感興趣之基因置換UL82 ORF。進行免疫墨點以研究製程變化(經由pp71 mRNA轉染製造pp71缺失型載體)是否影響來自UL82 (pp71)基因座之抗原表現( 圖23)。在以0.5之MOI感染載體5 (TR3 Δ146-147 Δ128-130 ΔUL82 M守恆的gag/nef/pol融合表觀1)病毒之後，在8 DPI收穫未經補充之MRC-5纖維母細胞，該病毒用在17或20 DPI收穫之pp71 mRNA以100 ng/cm 2產生。5 ng純化p24蛋白質用作陽性對照樣品(p24，M守恆的gag/nef/pol融合表觀1之組分)，且MRC-5細胞裂解物用作陰性對照樣品(MRC-5)。在感染用pp71 mRNA產生之載體5之MRC-5纖維母細胞細胞裂解物中確認M守恆的gag/nef/pol融合表觀1抗原(SEQ ID NO:11至12)表現。 5.6 外源性 pp71 蛋白質功能
下一組實驗經設計以評定負載至病毒粒子中之pp71 mRNA表現蛋白是否為功能性的。四種病毒儲備液藉由用25、50、100及200 ng/cm 2之pp71 mRNA轉染MRC-5纖維母細胞且以0.01之MOI感染pp71缺失型病毒來製造。利用抗DAXX siRNA製程產生用於感染此等培養物之病毒儲備液，因此用於感染之病毒粒子不含任何pp71蛋白質。
首先，未經補充之MRC-5纖維母細胞在一系列MOI內感染pp71缺失型病毒，該等病毒在10 µM抗DAXX siRNA或200 ng/cm 2之pp71 mRNA的存在下生長( 圖24A 至圖24B)。監測培養物之擴散及斑塊數目。相位影像顯示以0.01之MOI感染用抗DAXX siRNA (上部圖)或pp71 mRNA (下部圖)產生之pp71缺失型病毒的未經補充之MRC-5纖維母細胞在13 DPI的CPE ( 圖24A)。在14 DPI，對斑塊進行目測計數。在pp71 mRNA (200 ng/cm 2)之存在下生長之病毒在較低MOI下之斑塊數目增加( 圖24B)。
同時，未經補充之MRC-5纖維母細胞中之組織培養物感染劑量50 (TCID50)效價分析係使用藉由25、50、100或200 ng/cm 2pp71 mRNA產生之病毒儲備液與藉由抗DAXX siRNA製程產生之病毒儲備液以及WT TR3進行比較來評估( 表2)。將TCID50效價與來自pp71補充之BJ-5TA纖維母細胞株中之晚期抗原免疫螢光分析(TMD-QC-0061)之效價進行比較。效價分析之間的對數差異顯示，隨著pp71 mRNA轉染之量減少，功能補充亦減少。用25 ng/cm 2pp71 mRNA產生之病毒儲備液的對數差異與用抗DAXX siRNA (＞2 log)產生之病毒儲備液的對數差異更類似，而用至少100ng/cm 2pp71 mRNA產生之病毒儲備液的對數差異小於2 log。
為了進一步測試TCID50分析結果，對二種用DAXX抗siRNA產生之病毒及二種用100 ng/cm 2pp71 mRNA產生之病毒進行5次重複TCID50。二個載體為TB缺失：TR3 mir124 ΔUL128-130 ΔUL146-147 ΔUL82 Ag85A-ESAT-6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD及載體2：TR3 Δ146-147 Δ128-130 ΔUL82 M守恆的gag/nef/pol融合表觀1 ΔUL18。使用pp71補充之BJ5TA纖維母細胞株比較未經補充之MRC-5纖維母細胞中之TCID50與當前LA IFA之間的平均效價。在用pp71 mRNA產生之pp71缺失型病毒中，未經補充之TCID50效價比經補充之LA IFA低少於1 log，類似於WT TR3 (參見 表 1)，表明功能性pp71併入病毒粒子中。相比之下，用抗DAXX siRNA產生之pp71缺失型病毒的未經補充之TCID50效價比經補充之LA IFA效價低大於2 log，指示缺乏功能性pp71。此等結果表明，此比較效價分析可用於確認pp71 mRNA產生之病毒儲備液中之pp71蛋白質功能。TCID50效價之範圍對於pp71產生之TB缺失為3.5×10 5至7.4×10 5FFU/mL且對於pp71產生之載體2為4.1×10 5至7.4×10 5FFU/mL。然而，TCID50效價之範圍對於DAXX產生之TB缺失為8.7×10 3至1.1×10 4FFU/mL且對於DAXX產生之載體2為1.2×10 3至1.9×10 3FFU/mL。 部分 5.7 藉由免疫墨點偵測病毒粒子 pp71 蛋白質
進行一系列實驗以尋找免疫墨點分析偵測HCMV載體病毒粒子中之外源性pp71蛋白質之對照及條件。迄今為止，在用pp71 mRNA轉染MRC-5纖維母細胞之後，藉由免疫墨點偵測之病毒粒子pp71蛋白質無法區別於藉由超速離心用病毒粒子集結之細胞膜片段或囊泡。進行若干嘗試以產生超速離心之未經感染之轉染對照樣品，從而確認pp71蛋白質併入至病毒粒子中。
自未經感染之pp71 mRNA轉染之MRC-5單層釋放可忽略的蛋白質。三個冷凍/解凍循環用於模擬經感染之裂解MRC-5單層。研發在免疫墨點分析之前分離病毒粒子之替代性方法。
二步驟蔗糖梯度用於自T-燒瓶生產製程分離病毒粒子以及轉染對照樣品及藉由免疫墨點對pp71蛋白質進行分析之樣品(Dai 2014)。
藉由在T-燒瓶中遵循pp71 mRNA生產製程，但省略感染來獲得pp71 mRNA轉染對照梯度純化之裂解物。將單層在DPI 14刮於培養基中，收集且經受三個冷凍/解凍循環。藉由在T-燒瓶中遵循pp71 mRNA生產製程獲得感染樣品，在DPI 14自細胞集結粒各別收集上清液。合併每樣品類型之三個T150以允許足夠的材料負載至梯度上。藉由以5,000×g離心15 min來澄清兩個上清液樣品。將澄清上清液在15℃下以21,000 RPM超速離心1 h且再懸浮於2 mL之pH 7.4之PBS中。
蔗糖梯度方案如下。在SW41 Ti Beckman超轉子中，5 mL含50%蔗糖之PBS重疊有5 mL含15%蔗糖之PBS。接著，重疊2 mL含各樣品類型之PBS。將樣品在15℃下以21,000 RPM自旋1小時，且將超速離心機減速度設定為滑行(coast)。二個條帶見於蔗糖層之間的界面處之感染樣品梯度中。下部條帶比上部條帶更窄，且條帶太靠近在一起而不能各別收集。預測上部條帶含有更多病毒粒子，而下部條帶可能含有更多緻密體，但兩個條帶中之大部分粒子可能為具有DNA填充衣殼之病毒粒子(Dai 2014)。在轉染對照梯度純化之樣品中目測存在一個帶，其亦在蔗糖層之界面處。自各梯度收集大致1 mL且用PBS稀釋至12 mL之總體積。在SW41 Ti中在15C下以21,000 RPM進行濃縮樣品之最終旋轉，持續1 h。將集結粒再懸浮於100 μL裂解緩衝液中。
免疫墨點顯示存在於僅轉染細胞裂解物對照中之pp71蛋白質( 圖25，色帶3)。可能由於3×冷凍/解凍程序，觀測到一些蛋白質降解。在僅轉染梯度純化之裂解物對照中不存在pp71蛋白質( 圖25，色帶4)。在前述免疫墨點中，可見超速離心對照樣品pp71蛋白質。在超速離心之前澄清速度增加潛在地自上清液移除更多細胞碎片。
重複梯度免疫墨點，其中增加之澄清速度在10,000×g下(資料未展示)。此使得自對照僅轉染梯度純化之樣品回收的總蛋白質較少。雖然此等實驗並未提供pp71併入病毒粒子中之證據，但最佳化細胞碎片與病毒粒子之分離及/或使用替代性分析可提供其他資訊。 參考文獻
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序列 SEQ ID NO:1(UL82基因-人類疱疹病毒5株TR (Genbank寄存編號KF021605.1:118811-120490)) CTAGATGCGGGGTCGACTGCGTGGGGTGCTGGAAGTGGAAGCGGTGCTGATGGGTGAGGGTCGTGGCGCGGGCACGGACCGCAACGTGCTGCTGATGTCTGCCGCGGTACGCACGTCGCCGTCCATGTCGCTGCGCAGATAAGAGGTAGGTCGTAATGCGGCGTGCTGCACGCTCACCGTTAATGGTACCAAGTCGTCAAGGCTCGCAAAGACGTGCCACGAGGGGATGACGAGCGTGAGAGCCCCGTTGTTACCGCTTCGACGTCTTTGTCCGGTCAGGATCAGTGCCCGGGACAGTCCGGCTTGGGTGTCCGAGTCCTCGTCGCCGCTGGCCTCCTCGAAGCCGGCAAACATGGCTTCGGACAGGGGGGTCGGCGTCGGTGTGGAGGAGAGGTCATCTTCGTCGTCCTCTTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCGGTGGGTGGTAATCCGGGGGACTGCGGGAGAAACTCGGAGACGGCGCCGCGCACGACGTCGCTCCGTGGAAAGAGACCGGCGCGCAGCTGCACCTGGGGACGCTTGATTTTGTCCGGTTTACCGGGTGTGAGAGTCCAAAACCCACGGCGGAAAAAGTGGATGCGGCCTAGCGGCTGTCGGTGTTCCAAATGAACGGCCTGGTCGCCGGTCAGCGTGACGCGGAGGGTGATTCGCACACGATCGGGTAGCGGGCCGGCTTCTATGGAGACGCCCGGGATGTTTTCCGGGAAAAAGATGGTGTCGTGAGTCTGATTGGTTTCGAAAGCATTCTGGATCTGCACGATGTACTCGGGATGTATGCGCGTCAGCGTAAAACTTTTGGGAATCAACAGCTGGAAGCCGTTGTCCGGCAAGCGTCGTAGGTGCGGGTACGGATTGTGTCGCGCCACCACCTCGGCGCGATGCGTGTAAACCGAAAAGTGCAGAAACACGCTGGTCGGCGGGTGCGGTGAGTCGTGATGCAGAAACAGCATGATCCATTGGCCTCGTTCGTCCGTCTCCGTTTTGTGGATGTACGTGTTAGGGTCCGAACAGGCCAGCTGCTCCAGGGCGTCTACCAGCGTCAGCGGGATGGCGCCGGCGCGAAAGGCGAACTGGCTGACAAAGATCTGCCCTGCCTCCAAACTGCTGTCGGTTCTGCGGCGCCAGTTCGGCGTCACGGTCAGTCGCACGGCCCAGTGGTGAGCCGTGCGGCGGATGATGGCGCGCGCCTCCATTCGCGGCCGATTTTCTTCGCCGCCGCGCCGCTGGCTCTGAAAGAGGTGCAGTCCGCTAACGGGCACGCGGTCTAGCGGCAGCGCAAAGGCCAGCACCGAGACCGTGTTGTTTTCTGAGCCTGGCGTCAGGCGTCGTGGGCCAAAGTTGTTGAGGTCCACCAGCAGTCGGTCCCGTTCGCCCACCACGCAGCGGCCCTTGATGTTTAGGTCGGTCAGGTCTACGGTGTCGTGCGGAGATTTGTTCTCCTGAAAACAGCAGAGAACCGAGGGTCGGCTCACCTCTATGTTGGTACGCAGGTCCAGGAGTCGCAGACGACCGGCTTCCAGCGAGCCGCCTTCCACGTTGGTGATGAGCCGAAGCACCTGGCAGTGCAGGCGACCAAAGCTGCCGCTGGCGGCTTCGGCCTCGCTGATCGCGGCCGCTTCCGACGAGGGTCCCTCACCGGGCGAGGACGATGCCTGAGACAT SEQ ID NO:2(外被蛋白pp71-人類β疱疹病毒5 (Genbank寄存編號AGL96671.1)) MSQASSSPGEGPSSEAAAISEAEAASGSFGRLHCQVLRLITNVEGGSLEAGRLRLLDLRTNIEVSRPSVLCCFQENKSPHDTVDLTDLNIKGRCVVGERDRLLVDLNNFGPRRLTPGSENNTVSVLAFALPLDRVPVSGLHLFQSQRRGGEENRPRMEARAIIRRTAHHWAVRLTVTPNWRRRTDSSLEAGQIFVSQFAFRAGAIPLTLVDALEQLACSDPNTYIHKTETDERGQWIMLFLHHDSPHPPTSVFLHFSVYTHRAEVVARHNPYPHLRRLPDNGFQLLIPKSFTLTRIHPEYIVQIQNAFETNQTHDTIFFPENIPGVSIEAGPLPDRVRITLRVTLTGDQAVHLEHRQPLGRIHFFRRGFWTLTPGKPDKIKRPQVQLRAGLFPRSDVVRGAVSEFLPQSPGLPPTEEEEEEEEEDDEDDLSSTPTPTPLSEAMFAGFEEASGDEDSDTQAGLSRALILTGQRRRSGNNGALTLVIPSWHV FASLDDLVPLTVSVQHAALRPTSYLRSDMDGDVRTAADISSTLRSVPAPRPSPISTASTSSTPRSRPRI SEQ ID NO:3(外被蛋白pp71-人類β疱疹病毒5 (UniProtKB-R4SH92)) MSQASSSPGEGPSSEAAAISEAEAASGSFGRLHCQVLRLITNVEGGSLEAGRLRLLDLRTNIEVSRPSVLCCFQENKSPHDTVDLTDLNIKGRCVVGERDRLLVDLNNFGPRRLTPGSENNTVSVLAFALPLDRVPVSGLHLFQSQRRGGEENRPRMEARAIIRRTAHHWAVRLTVTPNWRRRTDSSLEAGQIFVSQFAFRAGAIPLTLVDALEQLACSDPNTYIHKTETDERGQWIMLFLHHDSPHPPTSVFLHFSVYTHRAEVVARHNPYPHLRRLPDNGFQLLIPKSFTLTRIHPEYIVQIQNAFETNQTHDTIFFPENIPGVSIEAGPLPDRVRITLRVTLTGDQAVHLEHRQPLGRIHFFRRGFWTLTPGKPDKIKRPQVQLRAGLFPRSDVVRGAVSEFLPQSPGLPPTEEEEEEEEEDDEDDLSSTPTPTPLSEAMFAGFEEASGDEDSDTQAGLSRALILTGQRRRSGNNGALTLVIPSWHVFASLDDLVPLTVSVQHAALRPTSYLRSDMDGDVRTAADISSTLRSVPAPRPSPISTASTSSTPRSRPRI SEQ ID NO:4(pp71構築體B-全長(FT)) AGGGCCACCCGCCGCGCACGCGCUUAAGACGACUCUAUAAAAACCCACGUCCACUCAGACACGCGACUUUUGGGCGCCACACCUGUCGCCGCUGCUAUAUUUGCGACAGUUGCCGGAACCCUUCCCGACCUCCCACGAAGACCCGUUCACCUUUGCGCAUCCCCUGACCCUCCCCCCAUCCCGCCUUCGCAAUGUCUCAGGCAUCGUCCUCGCCCGGUGAGGGACCCUCGUCGGAAGCGGCCGCGAUCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCUUUGGUCGCCUGCACUGCCAGGUGCUUCGGCUCAUCACCAACGUGGAAGGCGGCUCGCUGGAAGCCGGUCGUCUGCGACUCCUGGACCUGCGUACCAACAUAGAGGUGAGCCGACCCUCGGUUCUCUGCUGUUUUCAGGAGAACAAAUCUCCGCACGACACCGUAGACCUGACCGACCUAAACAUCAAGGGCCGCUGCGUGGUGGGCGAACGGGACCGACUGCUGGUGGACCUCAACAACUUUGGCCCACGACGCCUGACGCCAGGCUCAGAAAACAACACGGUCUCGGUGCUGGCCUUUGCGCUGCCGCUAGACCGCGUGCCCGUUAGCGGACUGCACCUCUUUCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAUCGGCCGCGAAUGGAGGCGCGCGCCAUCAUCCGCCGCACGGCUCACCACUGGGCCGUGCGACUGACCGUGACGCCGAACUGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGUUUGGAGGCAGGGCAGAUCUUUGUCAGCCAGUUCGCCUUUCGCGCCGGCGCCAUCCCGCUGACGCUGGUAGACGCCCUGGAGCAGCUGGCCUGUUCGGACCCUAACACGUACAUCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAUGGAUCAUGCUGUUUCUGCAUCACGACUCACCGCACCCGCCGACCAGCGUGUUUCUGCACUUUUCGGUUUACACGCAUCGCGCCGAGGUGGUGGCGCGACACAAUCCGUACCCGCACCUACGACGCUUGCCGGACAACGGCUUCCAGCUGUUGAUUCCCAAAAGUUUUACGCUGACGCGCAUACAUCCCGAGUACAUCGUGCAGAUCCAGAAUGCUUUCGAAACCAAUCAGACUCACGACACCAUCUUUUUCCCGGAAAACAUCCCGGGCGUCUCCAUAGAAGCCGGCCCGCUACCCGAUCGUGUGCGAAUCACCCUCCGCGUCACGCUGACCGGCGACCAGGCCGUUCAUUUGGAACACCGACAGCCGCUAGGCCGCAUCCACUUUUUCCGCCGUGGGUUUUGGACUCUCACACCCGGUAAACCGGACAAAAUCAAGCGUCCCCAGGUGCAGCUGCGCGCCGGUCUCUUUCCACGGAGCGACGUCGUGCGCGGCGCCGUCUCCGAGUUUCUCCCGCAGUCCCCCGGAUUACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAUGACCUCUCCUCCACACCGACGCCGACCCCCCUGUCCGAAGCCAUGUUUGCCGGCUUCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACUCGGACACCCAAGCCGGACUGUCCCGGGCACUGAUCCUGACCGGACAAAGACGUCGAAGCGGUAACAACGGGGCUCUCACGCUCGUCAUCCCCUCGUGGCACGUCUUUGCGAGCCUUGACGACUUGGUACCAUUAACGGUGAGCGUGCAGCACGCCGCAUUACGACCUACCUCUUAUCUGCGCAGCGACAUGGACGGCGACGUGCGUACCGCGGCAGACAUCAGCAGCACGUUGCGGUCCGUGCCCGCGCCACGACCCUCACCCAUCAGCACCGCUUCCACUUCCAGCACCCCACGCAGUCGACCCCGCAUCUAGAGAGAGACUUCUUUGUUUUUCCCCCGCGUGUUUUUCCCAUUCCCUGUAUUUAUUUCUAAAUAAUAAAAACACAGAGACGUUGAUAAUAACCGCAGUGUGCUUUAUUAGGGUAUCACGGUGUAGAAAAAAAAAAGAGAGGGAAACCCUAAAUAUAGCGUCUCUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:5(pp71構築體B.2 -全長(FT)) GCCACCCGCCGCGCACGCGCUUAAGACGACUCUAUAAAAACCCACGUCCACUCAGACACGCGACUUUUGGGCGCCACACCUGUCGCCGCUGCUAUAUUUGCGACAGUUGCCGGAACCCUUCCCGACCUCCCACGAAGACCCGUUCACCUUUGCGCAUCCCCUGACCCUCCCCCCAUCCCGCCUUCGCAAUGUCUCAGGCAUCGUCCUCGCCCGGUGAGGGACCCUCGUCGGAAGCGGCCGCGAUCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCUUUGGUCGCCUGCACUGCCAGGUGCUUCGGCUCAUCACCAACGUGGAAGGCGGCUCGCUGGAAGCCGGUCGUCUGCGACUCCUGGACCUGCGUACCAACAUAGAGGUGAGCCGACCCUCGGUUCUCUGCUGUUUUCAGGAGAACAAAUCUCCGCACGACACCGUAGACCUGACCGACCUAAACAUCAAGGGCCGCUGCGUGGUGGGCGAACGGGACCGACUGCUGGUGGACCUCAACAACUUUGGCCCACGACGCCUGACGCCAGGCUCAGAAAACAACACGGUCUCGGUGCUGGCCUUUGCGCUGCCGCUAGACCGCGUGCCCGUUAGCGGACUGCACCUCUUUCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAUCGGCCGCGAAUGGAGGCGCGCGCCAUCAUCCGCCGCACGGCUCACCACUGGGCCGUGCGACUGACCGUGACGCCGAACUGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGUUUGGAGGCAGGGCAGAUCUUUGUCAGCCAGUUCGCCUUUCGCGCCGGCGCCAUCCCGCUGACGCUGGUAGACGCCCUGGAGCAGCUGGCCUGUUCGGACCCUAACACGUACAUCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAUGGAUCAUGCUGUUUCUGCAUCACGACUCACCGCACCCGCCGACCAGCGUGUUUCUGCACUUUUCGGUUUACACGCAUCGCGCCGAGGUGGUGGCGCGACACAAUCCGUACCCGCACCUACGACGCUUGCCGGACAACGGCUUCCAGCUGUUGAUUCCCAAAAGUUUUACGCUGACGCGCAUACAUCCCGAGUACAUCGUGCAGAUCCAGAAUGCUUUCGAAACCAAUCAGACUCACGACACCAUCUUUUUCCCGGAAAACAUCCCGGGCGUCUCCAUAGAAGCCGGCCCGCUACCCGAUCGUGUGCGAAUCACCCUCCGCGUCACGCUGACCGGCGACCAGGCCGUUCAUUUGGAACACCGACAGCCGCUAGGCCGCAUCCACUUUUUCCGCCGUGGGUUUUGGACUCUCACACCCGGUAAACCGGACAAAAUCAAGCGUCCCCAGGUGCAGCUGCGCGCCGGUCUCUUUCCACGGAGCGACGUCGUGCGCGGCGCCGUCUCCGAGUUUCUCCCGCAGUCCCCCGGAUUACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAUGACCUCUCCUCCACACCGACGCCGACCCCCCUGUCCGAAGCCAUGUUUGCCGGCUUCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACUCGGACACCCAAGCCGGACUGUCCCGGGCACUGAUCCUGACCGGACAAAGACGUCGAAGCGGUAACAACGGGGCUCUCACGCUCGUCAUCCCCUCGUGGCACGUCUUUGCGAGCCUUGACGACUUGGUACCAUUAACGGUGAGCGUGCAGCACGCCGCAUUACGACCUACCUCUUAUCUGCGCAGCGACAUGGACGGCGACGUGCGUACCGCGGCAGACAUCAGCAGCACGUUGCGGUCCGUGCCCGCGCCACGACCCUCACCCAUCAGCACCGCUUCCACUUCCAGCACCCCACGCAGUCGACCCCGCAUCUAGAGAGAGACUUCUUUGUUUUUCCCCCGCGUGUUUUUCCCAUUCCCUGUAUUUAUUUCUAAAUAAUAAAAACACAGAGACGUUGAUAAUAACCGCAGUGUGCUUUAUUAGGGUAUCACGGUGUAGAAAAAAAAAGAGAGGGAAACCCUAAAUAUAGCGUCUCUCAGCCUGAGUAGGAAG SEQ ID NO:6(pp71構築體B.3 -全長(FT)) GCCACCCGCCGCGCACGCGCUUAAGACGACUCUAUAAAAACCCACGUCCACUCAGACACGCGACUUUUGGGCGCCACACCUGUCGCCGCUGCUAUAUUUGCGACAGUUGCCGGAACCCUUCCCGACCUCCCACGAAGACCCGUUCACCUUUGCGCAUCCCCUGACCCUCCCCCCAUCCCGCCUUCGCAAUGUCUCAGGCAUCGUCCUCGCCCGGUGAGGGACCCUCGUCGGAAGCGGCCGCGAUCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCUUUGGUCGCCUGCACUGCCAGGUGCUUCGGCUCAUCACCAACGUGGAAGGCGGCUCGCUGGAAGCCGGUCGUCUGCGACUCCUGGACCUGCGUACCAACAUAGAGGUGAGCCGACCCUCGGUUCUCUGCUGUUUUCAGGAGAACAAAUCUCCGCACGACACCGUAGACCUGACCGACCUAAACAUCAAGGGCCGCUGCGUGGUGGGCGAACGGGACCGACUGCUGGUGGACCUCAACAACUUUGGCCCACGACGCCUGACGCCAGGCUCAGAAAACAACACGGUCUCGGUGCUGGCCUUUGCGCUGCCGCUAGACCGCGUGCCCGUUAGCGGACUGCACCUCUUUCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAUCGGCCGCGAAUGGAGGCGCGCGCCAUCAUCCGCCGCACGGCUCACCACUGGGCCGUGCGACUGACCGUGACGCCGAACUGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGUUUGGAGGCAGGGCAGAUCUUUGUCAGCCAGUUCGCCUUUCGCGCCGGCGCCAUCCCGCUGACGCUGGUAGACGCCCUGGAGCAGCUGGCCUGUUCGGACCCUAACACGUACAUCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAUGGAUCAUGCUGUUUCUGCAUCACGACUCACCGCACCCGCCGACCAGCGUGUUUCUGCACUUUUCGGUUUACACGCAUCGCGCCGAGGUGGUGGCGCGACACAAUCCGUACCCGCACCUACGACGCUUGCCGGACAACGGCUUCCAGCUGUUGAUUCCCAAAAGUUUUACGCUGACGCGCAUACAUCCCGAGUACAUCGUGCAGAUCCAGAAUGCUUUCGAAACCAAUCAGACUCACGACACCAUCUUUUUCCCGGAAAACAUCCCGGGCGUCUCCAUAGAAGCCGGCCCGCUACCCGAUCGUGUGCGAAUCACCCUCCGCGUCACGCUGACCGGCGACCAGGCCGUUCAUUUGGAACACCGACAGCCGCUAGGCCGCAUCCACUUUUUCCGCCGUGGGUUUUGGACUCUCACACCCGGUAAACCGGACAAAAUCAAGCGUCCCCAGGUGCAGCUGCGCGCCGGUCUCUUUCCACGGAGCGACGUCGUGCGCGGCGCCGUCUCCGAGUUUCUCCCGCAGUCCCCCGGAUUACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAUGACCUCUCCUCCACACCGACGCCGACCCCCCUGUCCGAAGCCAUGUUUGCCGGCUUCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACUCGGACACCCAAGCCGGACUGUCCCGGGCACUGAUCCUGACCGGACAAAGACGUCGAAGCGGUAACAACGGGGCUCUCACGCUCGUCAUCCCCUCGUGGCACGUCUUUGCGAGCCUUGACGACUUGGUACCAUUAACGGUGAGCGUGCAGCACGCCGCAUUACGACCUACCUCUUAUCUGCGCAGCGACAUGGACGGCGACGUGCGUACCGCGGCAGACAUCAGCAGCACGUUGCGGUCCGUGCCCGCGCCACGACCCUCACCCAUCAGCACCGCUUCCACUUCCAGCACCCCACGCAGUCGACCCCGCAUCUAGAGAGAGACUUCUUUGUUUUUCCCCCGCGUGUUUUUCCCAUUCCCUGUAUUUAUUUCUAAAUAAUAAAAACACAGAGACGUUGAUAAUAACCGCAGUGUGCUUUAUUAGGGUAUCACGGUGUAGAAAAAAAAAAGAGAGGGAAACCCUAAAUAUAGCGUCUCUC SEQ ID NO:7(pp71構築體C -即刻早期(IE1)) AGGUCGUUUAGUGAACCGUCAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACAUGUCUCAGGCAUCGUCCUCGCCCGGUGAGGGACCCUCGUCGGAAGCGGCCGCGAUCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCUUUGGUCGCCUGCACUGCCAGGUGCUUCGGCUCAUCACCAACGUGGAAGGCGGCUCGCUGGAAGCCGGUCGUCUGCGACUCCUGGACCUGCGUACCAACAUAGAGGUGAGCCGACCCUCGGUUCUCUGCUGUUUUCAGGAGAACAAAUCUCCGCACGACACCGUAGACCUGACCGACCUAAACAUCAAGGGCCGCUGCGUGGUGGGCGAACGGGACCGACUGCUGGUGGACCUCAACAACUUUGGCCCACGACGCCUGACGCCAGGCUCAGAAAACAACACGGUCUCGGUGCUGGCCUUUGCGCUGCCGCUAGACCGCGUGCCCGUUAGCGGACUGCACCUCUUUCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAUCGGCCGCGAAUGGAGGCGCGCGCCAUCAUCCGCCGCACGGCUCACCACUGGGCCGUGCGACUGACCGUGACGCCGAACUGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGUUUGGAGGCAGGGCAGAUCUUUGUCAGCCAGUUCGCCUUUCGCGCCGGCGCCAUCCCGCUGACGCUGGUAGACGCCCUGGAGCAGCUGGCCUGUUCGGACCCUAACACGUACAUCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAUGGAUCAUGCUGUUUCUGCAUCACGACUCACCGCACCCGCCGACCAGCGUGUUUCUGCACUUUUCGGUUUACACGCAUCGCGCCGAGGUGGUGGCGCGACACAAUCCGUACCCGCACCUACGACGCUUGCCGGACAACGGCUUCCAGCUGUUGAUUCCCAAAAGUUUUACGCUGACGCGCAUACAUCCCGAGUACAUCGUGCAGAUCCAGAAUGCUUUCGAAACCAAUCAGACUCACGACACCAUCUUUUUCCCGGAAAACAUCCCGGGCGUCUCCAUAGAAGCCGGCCCGCUACCCGAUCGUGUGCGAAUCACCCUCCGCGUCACGCUGACCGGCGACCAGGCCGUUCAUUUGGAACACCGACAGCCGCUAGGCCGCAUCCACUUUUUCCGCCGUGGGUUUUGGACUCUCACACCCGGUAAACCGGACAAAAUCAAGCGUCCCCAGGUGCAGCUGCGCGCCGGUCUCUUUCCACGGAGCGACGUCGUGCGCGGCGCCGUCUCCGAGUUUCUCCCGCAGUCCCCCGGAUUACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAUGACCUCUCCUCCACACCGACGCCGACCCCCCUGUCCGAAGCCAUGUUUGCCGGCUUCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACUCGGACACCCAAGCCGGACUGUCCCGGGCACUGAUCCUGACCGGACAAAGACGUCGAAGCGGUAACAACGGGGCUCUCACGCUCGUCAUCCCCUCGUGGCACGUCUUUGCGAGCCUUGACGACUUGGUACCAUUAACGGUGAGCGUGCAGCACGCCGCAUUACGACCUACCUCUUAUCUGCGCAGCGACAUGGACGGCGACGUGCGUACCGCGGCAGACAUCAGCAGCACGUUGCGGUCCGUGCCCGCGCCACGACCCUCACCCAUCAGCACCGCUUCCACUUCCAGCACCCCACGCAGUCGACCCCGCAUCUAGGCGGCCGCUUAAUUAAGCUGCCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAG SEQ ID NO:8(pp71構築體D –短) AGGGCGCCACACCUGUCGCCGCUGCUAUAUUUGCGACAGUUGCCGGAACCCUUCCCGACCUCCCACGAAGACCCGUUCACCUUUGCGCAUCCCCUGACCCUCCCCCCAUCCCGCCUUCGCAAUGUCUCAGGCAUCGUCCUCGCCCGGUGAGGGACCCUCGUCGGAAGCGGCCGCGAUCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCUUUGGUCGCCUGCACUGCCAGGUGCUUCGGCUCAUCACCAACGUGGAAGGCGGCUCGCUGGAAGCCGGUCGUCUGCGACUCCUGGACCUGCGUACCAACAUAGAGGUGAGCCGACCCUCGGUUCUCUGCUGUUUUCAGGAGAACAAAUCUCCGCACGACACCGUAGACCUGACCGACCUAAACAUCAAGGGCCGCUGCGUGGUGGGCGAACGGGACCGACUGCUGGUGGACCUCAACAACUUUGGCCCACGACGCCUGACGCCAGGCUCAGAAAACAACACGGUCUCGGUGCUGGCCUUUGCGCUGCCGCUAGACCGCGUGCCCGUUAGCGGACUGCACCUCUUUCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAUCGGCCGCGAAUGGAGGCGCGCGCCAUCAUCCGCCGCACGGCUCACCACUGGGCCGUGCGACUGACCGUGACGCCGAACUGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGUUUGGAGGCAGGGCAGAUCUUUGUCAGCCAGUUCGCCUUUCGCGCCGGCGCCAUCCCGCUGACGCUGGUAGACGCCCUGGAGCAGCUGGCCUGUUCGGACCCUAACACGUACAUCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAUGGAUCAUGCUGUUUCUGCAUCACGACUCACCGCACCCGCCGACCAGCGUGUUUCUGCACUUUUCGGUUUACACGCAUCGCGCCGAGGUGGUGGCGCGACACAAUCCGUACCCGCACCUACGACGCUUGCCGGACAACGGCUUCCAGCUGUUGAUUCCCAAAAGUUUUACGCUGACGCGCAUACAUCCCGAGUACAUCGUGCAGAUCCAGAAUGCUUUCGAAACCAAUCAGACUCACGACACCAUCUUUUUCCCGGAAAACAUCCCGGGCGUCUCCAUAGAAGCCGGCCCGCUACCCGAUCGUGUGCGAAUCACCCUCCGCGUCACGCUGACCGGCGACCAGGCCGUUCAUUUGGAACACCGACAGCCGCUAGGCCGCAUCCACUUUUUCCGCCGUGGGUUUUGGACUCUCACACCCGGUAAACCGGACAAAAUCAAGCGUCCCCAGGUGCAGCUGCGCGCCGGUCUCUUUCCACGGAGCGACGUCGUGCGCGGCGCCGUCUCCGAGUUUCUCCCGCAGUCCCCCGGAUUACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAUGACCUCUCCUCCACACCGACGCCGACCCCCCUGUCCGAAGCCAUGUUUGCCGGCUUCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACUCGGACACCCAAGCCGGACUGUCCCGGGCACUGAUCCUGACCGGACAAAGACGUCGAAGCGGUAACAACGGGGCUCUCACGCUCGUCAUCCCCUCGUGGCACGUCUUUGCGAGCCUUGACGACUUGGUACCAUUAACGGUGAGCGUGCAGCACGCCGCAUUACGACCUACCUCUUAUCUGCGCAGCGACAUGGACGGCGACGUGCGUACCGCGGCAGACAUCAGCAGCACGUUGCGGUCCGUGCCCGCGCCACGACCCUCACCCAUCAGCACCGCUUCCACUUCCAGCACCCCACGCAGUCGACCCCGCAUCUAGAGAGAGACUUCUUUGUUUUUCCCCCGCGUGUUUUUCCCAUUCCCUGUAUUUAUUUCUAAAUAAUAAAAACACAGAGACGUUGAUAAUAACCGCAGCCUGAGUAGGAAG SEQ ID NO:9(pp71構築體E - pp65) 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SEQ ID NO:10(pp71構築體F -終止pp65) AGGACAGAGGACCCUGGUGUUGGGAAACGGACACUAGGCGUCCGCGCGAUACGGGGUUAAAACAAAAAAAAUCGGUGGUGGUGUGUGCUGGGGUGUGGUGACGGUGGGGCUUUGCCUCUUUUUUUUUGUAAUAAAAAAAGACACUCAAUAAUCCGCGGUUGUCUCUGUGUAGAACGUUUUUAUUUCGGGUUCCGCGUUUGGUCGCCUGCCUGUGUAAGGCGGCGGCCGCAAAGGGCGCGCCGCUCAGUCGCCUACACCCGUACGCGCAGGCAGCAUGGAGUCGCGCGGUCGCCGUUGUCCCGAAUAGUGAUCCGUACUGGGUCCCAUUUCGGGGCACGUGCUGAAAGCCGUGUUUAGUCGCGGCGACACGCCGGUGCUGCCGCACGAGACGCGACUCCUGCAGACGGGUAUCCACGUACGCGUGAGCCAGCCCUCGCUGAUCCUGGUGUCGCAGUACACGCCCGACUCGACGCCAUGCCACCGCGGCGACAAUCAGCUGCAGGUGCAGCACACGUACUUUACGGGCAGCGAGGUGGAGAACGUGUCGGUCAACGUGCACAACCCCACGGGCCGAAGCAUCUGCCCCAGCCAGGAGCCCAUGUCGAUCUAUGUGUACGCGCUGCCGCUCAAGAUGCUGAACAUCCCCAGCAUCAACGUGCACCACUACCCGUCGGCGGCCGAGCGCAAACACCGACACCUGCCCGUAGCUGACGCUGUGAUUCACGCGUCGGGCAAGCAGAUGUGGCAGGCGCGUCUCACGGUCUCGGGACUGGCCUGGACGCGUCAGCAGAACCAGUGGAAAGAGCCCGACGUCUACUACACGUCAGCGUUCGUGUUUCCCACCAAGGACGUGGCACUGCGGCACGUGGUGUGCGCGCACGAGCUGGUUUGCUCCAUGGAGAACACGCGCGCAACCAAGAUGCAGGUGAUAGGUGACCAGUACGUCAAGGUGUACCUGGAGUCCUUCUGCGAGGACGUGCCCUCCGGCAAGCUCUUUAUGCACGUCACGCUGGGCUCUGACGUGGAAGAGGACCUGACGAUGACCCGCAACCCGCAACCCUUCAUGCGCCCCCACGAGCGCAACGGCUUUACGGUGUUGUGUCCCAAAAAUAUGAUAAUCAAACCGGGCAAGAUCUCGCACAUCAUGCUGGAUGUGGCUUUUACCUCACACGAGCAUUUUGGGCUGCUGUGUCCCAAGAGCAUCCCGGGCCUGAGCAUCUCAGGUAACCUGUUGAUGAACGGGCAGCAGAUCUUCCUGGAGGUACAAGCGAUACGCGAGACCGUGGAACUGCGUCAGUACGAUCCCGUGGCUGCACUCUUCUUUUUCGAUAUCGACUUGCUGCUGCAGCGCGGGCCUCAGUACAGCGAGCACCCCACCUUCACCAGCCAGUAUCGCAUCCAGGGCAAGCUUGAGUACCGACACACCUGGGACCGGCACGACGAGGGUGCCGCCCAGGGCGACGACGACGUCUGGACCAGCGGAUCGGACUCCGACGAAGAACUCGUAACCACCGAGCGCAAGACGCCCCGCGUUACCGGCGGCGGCGCCAUGGCGGGCGCCUCCACUUCCGCGGGCCGCAAACGCAAAUCAGCAUCCUCGGCGACGGCGUGCACGGCGGGCGUUAUGACACGCGGCCGCCUUAAGGCCGAGUCCACCGUCGCGCCCGAAGAGGACACCGACGAGGAUUCCGACAACGAAAUCCACAAUCCGGCCGUGUUCACCUGGCCGCCCUGGCAGGCCGGCAUCCUGGCCCGCAACCUGGUGCCCAUGGUGGCUACGGUUCAGGGUCAGAAUCUGAAGUACCAGGAGUUCUUCUGGGACGCCAACGACAUCUACCGCAUCUUCGCCGAAUUGGAAGGCGUAUGGCAGCCCGCUGCGCAACCCAAACGUCGCCGCCACCGGCAAGAAGCCCUGCCCGGGCCAUGCAUCGCCUCGACGCCCAAAAAGCAUCGAGGUUGAGCCACCCGCCGCGCACGCGCUUAAGACGACUCUAUAAAAACCCACGUCCACUCAGACACGCGACUUUUGGGCGCCACACCUGUCGCCGCUGCUAUAUUUGCGACAGUUGCCGGAACCCUUCCCGACCUCCCACGAAGACCCGUUCACCUUUGCGCAUCCCCUGACCCUCCCCCCAUCCCGCCUUCGCAAUGUCUCAGGCAUCGUCCUCGCCCGGUGAGGGACCCUCGUCGGAAGCGGCCGCGAUCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCUUUGGUCGCCUGCACUGCCAGGUGCUUCGGCUCAUCACCAACGUGGAAGGCGGCUCGCUGGAAGCCGGUCGUCUGCGACUCCUGGACCUGCGUACCAACAUAGAGGUGAGCCGACCCUCGGUUCUCUGCUGUUUUCAGGAGAACAAAUCUCCGCACGACACCGUAGACCUGACCGACCUAAACAUCAAGGGCCGCUGCGUGGUGGGCGAACGGGACCGACUGCUGGUGGACCUCAACAACUUUGGCCCACGACGCCUGACGCCAGGCUCAGAAAACAACACGGUCUCGGUGCUGGCCUUUGCGCUGCCGCUAGACCGCGUGCCCGUUAGCGGACUGCACCUCUUUCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAUCGGCCGCGAAUGGAGGCGCGCGCCAUCAUCCGCCGCACGGCUCACCACUGGGCCGUGCGACUGACCGUGACGCCGAACUGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGUUUGGAGGCAGGGCAGAUCUUUGUCAGCCAGUUCGCCUUUCGCGCCGGCGCCAUCCCGCUGACGCUGGUAGACGCCCUGGAGCAGCUGGCCUGUUCGGACCCUAACACGUACAUCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAUGGAUCAUGCUGUUUCUGCAUCACGACUCACCGCACCCGCCGACCAGCGUGUUUCUGCACUUUUCGGUUUACACGCAUCGCGCCGAGGUGGUGGCGCGACACAAUCCGUACCCGCACCUACGACGCUUGCCGGACAACGGCUUCCAGCUGUUGAUUCCCAAAAGUUUUACGCUGACGCGCAUACAUCCCGAGUACAUCGUGCAGAUCCAGAAUGCUUUCGAAACCAAUCAGACUCACGACACCAUCUUUUUCCCGGAAAACAUCCCGGGCGUCUCCAUAGAAGCCGGCCCGCUACCCGAUCGUGUGCGAAUCACCCUCCGCGUCACGCUGACCGGCGACCAGGCCGUUCAUUUGGAACACCGACAGCCGCUAGGCCGCAUCCACUUUUUCCGCCGUGGGUUUUGGACUCUCACACCCGGUAAACCGGACAAAAUCAAGCGUCCCCAGGUGCAGCUGCGCGCCGGUCUCUUUCCACGGAGCGACGUCGUGCGCGGCGCCGUCUCCGAGUUUCUCCCGCAGUCCCCCGGAUUACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAUGACCUCUCCUCCACACCGACGCCGACCCCCCUGUCCGAAGCCAUGUUUGCCGGCUUCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACUCGGACACCCAAGCCGGACUGUCCCGGGCACUGAUCCUGACCGGACAAAGACGUCGAAGCGGUAACAACGGGGCUCUCACGCUCGUCAUCCCCUCGUGGCACGUCUUUGCGAGCCUUGACGACUUGGUACCAUUAACGGUGAGCGUGCAGCACGCCGCAUUACGACCUACCUCUUAUCUGCGCAGCGACAUGGACGGCGACGUGCGUACCGCGGCAGACAUCAGCAGCACGUUGCGGUCCGUGCCCGCGCCACGACCCUCACCCAUCAGCACCGCUUCCACUUCCAGCACCCCACGCAGUCGACCCCGCAUCUAGAGAGAGACUUCUUUGUUUUUCCCCCGCGUGUUUUUCCCAUUCCCUGUAUUUAUUUCUAAAUAAUAAAAACACAGAGACGUUGAUAAUAACCGCAGUGUGCUUUAUUAGGGUAUCACGGUGUAGAAAAAAAAAGAGAGGGAAACCCUAAAUAUAGCGUCUCUCAGCCUGAGUAGGAAG SEQ ID NO:11(M守恆的gag/nef/pol融合表觀1，DNA) ACCATGCCAATTGTGCAGAATTTGCAGGGACAGATGGTGCATCAGGCTATCTCCCCCCGCACGCTCAATGCCTGGGTGAAGGTAGTGGAGGAGAAAGCCTTTTCACCAGAAGTTATCCCTATGTTCTCTGCTCTGAGTGAGGGGGCCACCCCCCAAGACTTGAATACCATGCTGAACACCGTGGGTGGGCACCAGGCAGCCATGCAAATGCTGAAGGAGACTATTAACGAGGAGGCTGCTGAGTGGGATAGGCTGCACCCAGTCCATGCAGGACCAATCGCGCCAGGCCAAATGAGAGAACCACGGGGGAGCGACATCGCAGGGACAACCTCCACACTTCAAGAGCAGATCGGATGGATGACCAACAACCCCCCAATCCCCGTCGGCGAGATCTACAAGCGCTGGATAATCCTTGGCCTGAACAAGATTGTGCGGATGTATAGCCCCGTTTCAATCCTGGATATTCGCCAGGGCCCAAAGGAGCCTTTCCGCGATTATGTGGATAGGTTTTACAAGACCCTTCGGGCCGAACAGGCCACACAGGAGGTGAAGAACTGGATGACAGAGACTCTGCTGGTTCAGAATGCAAATCCCGACTGTAAGACCATCCTGAAGGCCCTGGGACCAGCAGCGACTCTGGAAGAGATGATGACGGCCTGTCAGGGCGTGGGCGGACCAGGCCATAAAGCACGGGTGCTCGTGGGGTTTCCAGTGAGGCCTCAGGTCCCACTGCGCCCCATGACATACAAGGGGGCCCTGGACCTGTCACACTTCCTTAAAGAAAAAGGCGGCTTGGAGGGCCTGATCTATAGTAAAAAGAGACAAGAAATCCTGGATCTTTGGGTTTACCACACACAGGGGTACTTCCCCGATTGGCAGAATTACACTCCCGGCCCCGGCATTAGGTACCCCCTCACATTTGGCTGGTGCTTCAAACTGGTGCCTCCCCAAATTACCCTTTGGCAGAGACCCCTTGTGACCATCAAAATCGGCGGTCAGCTGAAAGAGGCACTGCTGGCAGATGACACCGTGCTTGAGGATATCAACCTGCCTGGGAAATGGAAACCCAAGATGATAGGCGGAATCGGTGGGTTCATCAAAGTGAGACAGTACGATCAAATCCTGATTGAGATCTGCGGCAAGAAGGCGATCGGGACCGTACTGGTCGGGCCAACTCCAGTGAATATCATAGGCCGCAACCTCCTGACTCAGATAGGCTGTACCCTTAATTTTCCGATATCTCCAATCGAAACCGTGCCCGTTAAACTCAAGCCTGGTATGGATGGACCCAAAGTCAAGCAATGGCCACTGACCGAGGAGAAGATAAAGGCCCTGGTGGAAATCTGCACCGAAATGGAAAAGGAGGGAAAAATCTCTAAAATCGGACCCGAGAACCCTTATAATACTCCCGTCTTTGCCATTAAAAAGAAAGACAGCACAAAGTGGCGGAAACTCGTAGACTTTAGAGAGTTGAATAAAAGAACTCAGGACTTTTGGGAGGTGCAGCTTGGAATTCCCCACCCCGCCGGTCTGAAAAAGAAGAAATCCGTGACAGTGCTCGATGTTGGCGACGCCTATTTTAGTGTGCCTCTTGACAAAGACTTTCGGAAATACACCGCCTTCACCATTCCAAGCATTAATAACGAAACCCCAGGTATTAGATATCAATACAACGTGCTGCCCCAGGGGTGGAAAGGCAGCCCAGCTATTTTTCAGAGCAGCATGACAAAAATTTTGGAGCCCTTCAGAAAGCAGAATCCAGATATCGTCATTTACCAGCTGTATGTGGGGTCCGATCTGGAGATTGGCCAGCACCGAACTAAGATCGAAGAACTGCGCCAGCACCTGCTCAAATGGGGATTCACGACACCTGATAAAAAACATCAGAAGGAACCCCCTTTCCTTTGGATGGGCTACGAGCTTCACCCCGATAAATGGACTGTTCAGCCAATTGTCCTCCCTGAGAAGGACTCTTGGACAGTCAACGACATCCAAAAACTGGTGGGGAAACTCAATTGGGCCAGTCAGATCTACCACGGCCAGGTGGACTGCTCACCGGGGATCTGGCAGCTTTGTACACATCTGGAGGGGAAAGTGATCCTGGTCGCTGTTCATGTTGCCAGCGGCTACATTGAAGCAGAGGTTATTCCCGCCGAGACTGGCCAGGAGACAGCTTACTTCTTGCTGAAGCTGGCTGGTCGGTGGCCCGTGAAGGTAATTCACACAAATGGCTCTAACTTTACCTCTGCCGCAGTTAAGGCCGCCTGCTGGTGGGCCGGAATTAAGCAGGAATTCGGGATTCCTTACAATCCACAGTCACAGGGTGTAGTAAGCATGAATAAGGAATTGAAGAAAATTATAGGACAGGTTCGCGACCAGGCCGAGCACCTGAAGACCGCCGTTCAAATGGCCGTATTCATCCACAATTTTAAGCGCAAAGGCGGGATTGGGGGTTACTCTGCCGGGGAGAGAATAATAGACATCATTGCCACCGATATCCAGACAAAACTGCAGAAACAGATAACAAAGATACAGAACTTTAGGGTATACTATCGGGATTCCAGGGACCCTATCTGGAAGGGGCCAGCGAAACTGCTTTGGAAGGGAGAAGGAGCCGTGGTCATACAGGACAATTCAGACATCAAAGTGGTACCGAGAAGGAAGGCCAAGATTATTAGAGATTACGGAAAACAGATGGCGGGGGACGACTGCGTTGCCGGGAGGCAGGACGAAGATCAATGA SEQ ID NO:12(M守恆的gag/nef/pol融合表觀1，蛋白質) MPIVQNLQGQMVHQAISPRTLNAWVKVVEEKAFSPEVIPMFSALSEGATPQDLNTMLNTVGGHQAAMQMLKETINEEAAEWDRLHPVHAGPIAPGQMREPRGSDIAGTTSTLQEQIGWMTNNPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPVSILDIRQGPKEPFRDYVDRFYKTLRAEQATQEVKNWMTETLLVQNANPDCKTILKALGPAATLEEMMTACQGVGGPGHKARVLVGFPVRPQVPLRPMTYKGALDLSHFLKEKGGLEGLIYSKKRQEILDLWVYHTQGYFPDWQNYTPGPGIRYPLTFGWCFKLVPPQITLWQRPLVTIKIGGQLKEALLADDTVLEDINLPGKWKPKMIGGIGGFIKVRQYDQILIEICGKKAIGTVLVGPTPVNIIGRNLLTQIGCTLNFPISPIETVPVKLKPGMDGPKVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKDSTKWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKKKSVTVLDVGDAYFSVPLDKDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLKWGFTTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYHGQVDCSPGIWQLCTHLEGKVILVAVHVASGYIEAEVIPAETGQETAYFLLKLAGRWPVKVIHTNGSNFTSAAVKAACWWAGIKQEFGIPYNPQSQGVVSMNKELKKIIGQVRDQAEHLKTAVQMAVFIHNFKRKGGIGGYSAGERIIDIIATDIQTKLQKQITKIQNFRVYYRDSRDPIWKGPAKLLWKGEGAVVIQDNSDIKVVPRRKAKIIRDYGKQMAGDDCVAGRQDEDQ* SEQ ID 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SEQ ID NO:14(pp71構築體B -全長(FT) + pseudoU/5meC) 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SEQ ID NO:22(pp71構築體B.2 -全長(FT) + 5moU) GCCACCCGCCGCGCACGCGCmo5umo5uAAGACGACmo5uCmo5uAmo5uAAAAACCCACGmo5uCCACmo5uCAGACACGCGACmo5umo5umo5umo5uGGGCGCCACACCmo5uGmo5uCGCCGCmo5uGCmo5uAmo5uAmo5umo5umo5uGCGACAGmo5umo5uGCCGGAACCCmo5umo5uCCCGACCmo5uCCCACGAAGACCCGmo5umo5uCACCmo5umo5umo5uGCGCAmo5uCCCCmo5uGACCCmo5uCCCCCCAmo5uCCCGCCmo5umo5uCGCAAmo5uGmo5uCmo5uCAGGCAmo5uCGmo5uCCmo5uCGCCCGGmo5uGAGGGACCCmo5uCGmo5uCGGAAGCGGCCGCGAmo5uCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCmo5umo5umo5uGGmo5uCGCCmo5uGCACmo5uGCCAGGmo5uGCmo5umo5uCGGCmo5uCAmo5uCACCAACGmo5uGGAAGGCGGCmo5uCGCmo5uGGAAGCCGGmo5uCGmo5uCmo5uGCGACmo5uCCmo5uGGACCmo5uGCGmo5uACCAACAmo5uAGAGGmo5uGAGCCGACCCmo5uCGGmo5umo5uCmo5uCmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5umo5uCAGGAGAACAAAmo5uCmo5uCCGCACGACACCGmo5uAGACCmo5uGACCGACCmo5uAAACAmo5uCAAGGGCCGCmo5uGCGmo5uGGmo5uGGGCGAACGGGACCGACmo5uGCmo5uGGmo5uGGACCmo5uCAACAACmo5umo5umo5uGGCCCACGACGCCmo5uGACGCCAGGCmo5uCAGAAAACAACACGGmo5uCmo5uCGGmo5uGCmo5uGGCCmo5umo5umo5uGCGCmo5uGCCGCmo5uAGACCGCGmo5uGCCCGmo5umo5uAGCGGACmo5uGCACCmo5uCmo5umo5umo5uCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAmo5uCGGCCGCGAAmo5uGGAGGCGCGCGCCAmo5uCAmo5uCCGCCGCACGGCmo5uCACCACmo5uGGGCCGmo5uGCGACmo5uGACCGmo5uGACGCCGAACmo5uGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGmo5umo5umo5uGGAGGCAGGGCAGAmo5uCmo5umo5umo5uGmo5uCAGCCAGmo5umo5uCGCCmo5umo5umo5uCGCGCCGGCGCCAmo5uCCCGCmo5uGACGCmo5uGGmo5uAGACGCCCmo5uGGAGCAGCmo5uGGCCmo5uGmo5umo5uCGGACCCmo5uAACACGmo5uACAmo5uCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAmo5uGGAmo5uCAmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCAmo5uCACGACmo5uCACCGCACCCGCCGACCAGCGmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCACmo5umo5umo5umo5uCGGmo5umo5umo5uACACGCAmo5uCGCGCCGAGGmo5uGGmo5uGGCGCGACACAAmo5uCCGmo5uACCCGCACCmo5uACGACGCmo5umo5uGCCGGACAACGGCmo5umo5uCCAGCmo5uGmo5umo5uGAmo5umo5uCCCAAAAGmo5umo5umo5umo5uACGCmo5uGACGCGCAmo5uACAmo5uCCCGAGmo5uACAmo5uCGmo5uGCAGAmo5uCCAGAAmo5uGCmo5umo5umo5uCGAAACCAAmo5uCAGACmo5uCACGACACCAmo5uCmo5umo5umo5umo5umo5uCCCGGAAAACAmo5uCCCGGGCGmo5uCmo5uCCAmo5uAGAAGCCGGCCCGCmo5uACCCGAmo5uCGmo5uGmo5uGCGAAmo5uCACCCmo5uCCGCGmo5uCACGCmo5uGACCGGCGACCAGGCCGmo5umo5uCAmo5umo5umo5uGGAACACCGACAGCCGCmo5uAGGCCGCAmo5uCCACmo5umo5umo5umo5umo5uCCGCCGmo5uGGGmo5umo5umo5umo5uGGACmo5uCmo5uCACACCCGGmo5uAAACCGGACAAAAmo5uCAAGCGmo5uCCCCAGGmo5uGCAGCmo5uGCGCGCCGGmo5uCmo5uCmo5umo5umo5uCCACGGAGCGACGmo5uCGmo5uGCGCGGCGCCGmo5uCmo5uCCGAGmo5umo5umo5uCmo5uCCCGCAGmo5uCCCCCGGAmo5umo5uACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAmo5uGACCmo5uCmo5uCCmo5uCCACACCGACGCCGACCCCCCmo5uGmo5uCCGAAGCCAmo5uGmo5umo5umo5uGCCGGCmo5umo5uCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACmo5uCGGACACCCAAGCCGGACmo5uGmo5uCCCGGGCACmo5uGAmo5uCCmo5uGACCGGACAAAGACGmo5uCGAAGCGGmo5uAACAACGGGGCmo5uCmo5uCACGCmo5uCGmo5uCAmo5uCCCCmo5uCGmo5uGGCACGmo5uCmo5umo5umo5uGCGAGCCmo5umo5uGACGACmo5umo5uGGmo5uACCAmo5umo5uAACGGmo5uGAGCGmo5uGCAGCACGCCGCAmo5umo5uACGACCmo5uACCmo5uCmo5umo5uAmo5uCmo5uGCGCAGCGACAmo5uGGACGGCGACGmo5uGCGmo5uACCGCGGCAGACAmo5uCAGCAGCACGmo5umo5uGCGGmo5uCCGmo5uGCCCGCGCCACGACCCmo5uCACCCAmo5uCAGCACCGCmo5umo5uCCACmo5umo5uCCAGCACCCCACGCAGmo5uCGACCCCGCAmo5uCmo5uAGAGAGAGACmo5umo5uCmo5umo5umo5uGmo5umo5umo5umo5umo5uCCCCCGCGmo5uGmo5umo5umo5umo5umo5uCCCAmo5umo5uCCCmo5uGmo5uAmo5umo5umo5uAmo5umo5umo5uCmo5uAAAmo5uAAmo5uAAAAACACAGAGACGmo5umo5uGAmo5uAAmo5uAACCGCAGmo5uGmo5uGCmo5umo5umo5uAmo5umo5uAGGGmo5uAmo5uCACGGmo5uGmo5uAGAAAAAAAAAGAGAGGGAAACCCmo5uAAAmo5uAmo5uAGCGmo5uCmo5uCmo5uCAGCCmo5uGAGmo5uAGGAAG SEQ ID NO:23(pp71構築體B.3 -全長(FT) + 5moU) GCCACCCGCCGCGCACGCGCmo5umo5uAAGACGACmo5uCmo5uAmo5uAAAAACCCACGmo5uCCACmo5uCAGACACGCGACmo5umo5umo5umo5uGGGCGCCACACCmo5uGmo5uCGCCGCmo5uGCmo5uAmo5uAmo5umo5umo5uGCGACAGmo5umo5uGCCGGAACCCmo5umo5uCCCGACCmo5uCCCACGAAGACCCGmo5umo5uCACCmo5umo5umo5uGCGCAmo5uCCCCmo5uGACCCmo5uCCCCCCAmo5uCCCGCCmo5umo5uCGCAAmo5uGmo5uCmo5uCAGGCAmo5uCGmo5uCCmo5uCGCCCGGmo5uGAGGGACCCmo5uCGmo5uCGGAAGCGGCCGCGAmo5uCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCmo5umo5umo5uGGmo5uCGCCmo5uGCACmo5uGCCAGGmo5uGCmo5umo5uCGGCmo5uCAmo5uCACCAACGmo5uGGAAGGCGGCmo5uCGCmo5uGGAAGCCGGmo5uCGmo5uCmo5uGCGACmo5uCCmo5uGGACCmo5uGCGmo5uACCAACAmo5uAGAGGmo5uGAGCCGACCCmo5uCGGmo5umo5uCmo5uCmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5umo5uCAGGAGAACAAAmo5uCmo5uCCGCACGACACCGmo5uAGACCmo5uGACCGACCmo5uAAACAmo5uCAAGGGCCGCmo5uGCGmo5uGGmo5uGGGCGAACGGGACCGACmo5uGCmo5uGGmo5uGGACCmo5uCAACAACmo5umo5umo5uGGCCCACGACGCCmo5uGACGCCAGGCmo5uCAGAAAACAACACGGmo5uCmo5uCGGmo5uGCmo5uGGCCmo5umo5umo5uGCGCmo5uGCCGCmo5uAGACCGCGmo5uGCCCGmo5umo5uAGCGGACmo5uGCACCmo5uCmo5umo5umo5uCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAmo5uCGGCCGCGAAmo5uGGAGGCGCGCGCCAmo5uCAmo5uCCGCCGCACGGCmo5uCACCACmo5uGGGCCGmo5uGCGACmo5uGACCGmo5uGACGCCGAACmo5uGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGmo5umo5umo5uGGAGGCAGGGCAGAmo5uCmo5umo5umo5uGmo5uCAGCCAGmo5umo5uCGCCmo5umo5umo5uCGCGCCGGCGCCAmo5uCCCGCmo5uGACGCmo5uGGmo5uAGACGCCCmo5uGGAGCAGCmo5uGGCCmo5uGmo5umo5uCGGACCCmo5uAACACGmo5uACAmo5uCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAmo5uGGAmo5uCAmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCAmo5uCACGACmo5uCACCGCACCCGCCGACCAGCGmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCACmo5umo5umo5umo5uCGGmo5umo5umo5uACACGCAmo5uCGCGCCGAGGmo5uGGmo5uGGCGCGACACAAmo5uCCGmo5uACCCGCACCmo5uACGACGCmo5umo5uGCCGGACAACGGCmo5umo5uCCAGCmo5uGmo5umo5uGAmo5umo5uCCCAAAAGmo5umo5umo5umo5uACGCmo5uGACGCGCAmo5uACAmo5uCCCGAGmo5uACAmo5uCGmo5uGCAGAmo5uCCAGAAmo5uGCmo5umo5umo5uCGAAACCAAmo5uCAGACmo5uCACGACACCAmo5uCmo5umo5umo5umo5umo5uCCCGGAAAACAmo5uCCCGGGCGmo5uCmo5uCCAmo5uAGAAGCCGGCCCGCmo5uACCCGAmo5uCGmo5uGmo5uGCGAAmo5uCACCCmo5uCCGCGmo5uCACGCmo5uGACCGGCGACCAGGCCGmo5umo5uCAmo5umo5umo5uGGAACACCGACAGCCGCmo5uAGGCCGCAmo5uCCACmo5umo5umo5umo5umo5uCCGCCGmo5uGGGmo5umo5umo5umo5uGGACmo5uCmo5uCACACCCGGmo5uAAACCGGACAAAAmo5uCAAGCGmo5uCCCCAGGmo5uGCAGCmo5uGCGCGCCGGmo5uCmo5uCmo5umo5umo5uCCACGGAGCGACGmo5uCGmo5uGCGCGGCGCCGmo5uCmo5uCCGAGmo5umo5umo5uCmo5uCCCGCAGmo5uCCCCCGGAmo5umo5uACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAmo5uGACCmo5uCmo5uCCmo5uCCACACCGACGCCGACCCCCCmo5uGmo5uCCGAAGCCAmo5uGmo5umo5umo5uGCCGGCmo5umo5uCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACmo5uCGGACACCCAAGCCGGACmo5uGmo5uCCCGGGCACmo5uGAmo5uCCmo5uGACCGGACAAAGACGmo5uCGAAGCGGmo5uAACAACGGGGCmo5uCmo5uCACGCmo5uCGmo5uCAmo5uCCCCmo5uCGmo5uGGCACGmo5uCmo5umo5umo5uGCGAGCCmo5umo5uGACGACmo5umo5uGGmo5uACCAmo5umo5uAACGGmo5uGAGCGmo5uGCAGCACGCCGCAmo5umo5uACGACCmo5uACCmo5uCmo5umo5uAmo5uCmo5uGCGCAGCGACAmo5uGGACGGCGACGmo5uGCGmo5uACCGCGGCAGACAmo5uCAGCAGCACGmo5umo5uGCGGmo5uCCGmo5uGCCCGCGCCACGACCCmo5uCACCCAmo5uCAGCACCGCmo5umo5uCCACmo5umo5uCCAGCACCCCACGCAGmo5uCGACCCCGCAmo5uCmo5uAGAGAGAGACmo5umo5uCmo5umo5umo5uGmo5umo5umo5umo5umo5uCCCCCGCGmo5uGmo5umo5umo5umo5umo5uCCCAmo5umo5uCCCmo5uGmo5uAmo5umo5umo5uAmo5umo5umo5uCmo5uAAAmo5uAAmo5uAAAAACACAGAGACGmo5umo5uGAmo5uAAmo5uAACCGCAGmo5uGmo5uGCmo5umo5umo5uAmo5umo5uAGGGmo5uAmo5uCACGGmo5uGmo5uAGAAAAAAAAAAGAGAGGGAAACCCmo5uAAAmo5uAmo5uAGCGmo5uCmo5uCmo5uC SEQ ID NO:24(pp71構築體C -即刻早期(IE1) + 5moU) AGGmo5uCGmo5umo5umo5uAGmo5uGAACCGmo5uCAGAmo5uCGCCmo5uGGAGACGCCAmo5uCCACGCmo5uGmo5umo5umo5umo5uGACCmo5uCCAmo5uAGAAGACACCGGGACCGAmo5uCCAGCCmo5uCCGCGGCCGGGAACGGmo5uGCAmo5umo5uGGAACGCGGAmo5umo5uCCCCGmo5uGCCAAGAGmo5uGACAmo5uGmo5uCmo5uCAGGCAmo5uCGmo5uCCmo5uCGCCCGGmo5uGAGGGACCCmo5uCGmo5uCGGAAGCGGCCGCGAmo5uCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCmo5umo5umo5uGGmo5uCGCCmo5uGCACmo5uGCCAGGmo5uGCmo5umo5uCGGCmo5uCAmo5uCACCAACGmo5uGGAAGGCGGCmo5uCGCmo5uGGAAGCCGGmo5uCGmo5uCmo5uGCGACmo5uCCmo5uGGACCmo5uGCGmo5uACCAACAmo5uAGAGGmo5uGAGCCGACCCmo5uCGGmo5umo5uCmo5uCmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5umo5uCAGGAGAACAAAmo5uCmo5uCCGCACGACACCGmo5uAGACCmo5uGACCGACCmo5uAAACAmo5uCAAGGGCCGCmo5uGCGmo5uGGmo5uGGGCGAACGGGACCGACmo5uGCmo5uGGmo5uGGACCmo5uCAACAACmo5umo5umo5uGGCCCACGACGCCmo5uGACGCCAGGCmo5uCAGAAAACAACACGGmo5uCmo5uCGGmo5uGCmo5uGGCCmo5umo5umo5uGCGCmo5uGCCGCmo5uAGACCGCGmo5uGCCCGmo5umo5uAGCGGACmo5uGCACCmo5uCmo5umo5umo5uCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAmo5uCGGCCGCGAAmo5uGGAGGCGCGCGCCAmo5uCAmo5uCCGCCGCACGGCmo5uCACCACmo5uGGGCCGmo5uGCGACmo5uGACCGmo5uGACGCCGAACmo5uGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGmo5umo5umo5uGGAGGCAGGGCAGAmo5uCmo5umo5umo5uGmo5uCAGCCAGmo5umo5uCGCCmo5umo5umo5uCGCGCCGGCGCCAmo5uCCCGCmo5uGACGCmo5uGGmo5uAGACGCCCmo5uGGAGCAGCmo5uGGCCmo5uGmo5umo5uCGGACCCmo5uAACACGmo5uACAmo5uCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAmo5uGGAmo5uCAmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCAmo5uCACGACmo5uCACCGCACCCGCCGACCAGCGmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCACmo5umo5umo5umo5uCGGmo5umo5umo5uACACGCAmo5uCGCGCCGAGGmo5uGGmo5uGGCGCGACACAAmo5uCCGmo5uACCCGCACCmo5uACGACGCmo5umo5uGCCGGACAACGGCmo5umo5uCCAGCmo5uGmo5umo5uGAmo5umo5uCCCAAAAGmo5umo5umo5umo5uACGCmo5uGACGCGCAmo5uACAmo5uCCCGAGmo5uACAmo5uCGmo5uGCAGAmo5uCCAGAAmo5uGCmo5umo5umo5uCGAAACCAAmo5uCAGACmo5uCACGACACCAmo5uCmo5umo5umo5umo5umo5uCCCGGAAAACAmo5uCCCGGGCGmo5uCmo5uCCAmo5uAGAAGCCGGCCCGCmo5uACCCGAmo5uCGmo5uGmo5uGCGAAmo5uCACCCmo5uCCGCGmo5uCACGCmo5uGACCGGCGACCAGGCCGmo5umo5uCAmo5umo5umo5uGGAACACCGACAGCCGCmo5uAGGCCGCAmo5uCCACmo5umo5umo5umo5umo5uCCGCCGmo5uGGGmo5umo5umo5umo5uGGACmo5uCmo5uCACACCCGGmo5uAAACCGGACAAAAmo5uCAAGCGmo5uCCCCAGGmo5uGCAGCmo5uGCGCGCCGGmo5uCmo5uCmo5umo5umo5uCCACGGAGCGACGmo5uCGmo5uGCGCGGCGCCGmo5uCmo5uCCGAGmo5umo5umo5uCmo5uCCCGCAGmo5uCCCCCGGAmo5umo5uACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAmo5uGACCmo5uCmo5uCCmo5uCCACACCGACGCCGACCCCCCmo5uGmo5uCCGAAGCCAmo5uGmo5umo5umo5uGCCGGCmo5umo5uCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACmo5uCGGACACCCAAGCCGGACmo5uGmo5uCCCGGGCACmo5uGAmo5uCCmo5uGACCGGACAAAGACGmo5uCGAAGCGGmo5uAACAACGGGGCmo5uCmo5uCACGCmo5uCGmo5uCAmo5uCCCCmo5uCGmo5uGGCACGmo5uCmo5umo5umo5uGCGAGCCmo5umo5uGACGACmo5umo5uGGmo5uACCAmo5umo5uAACGGmo5uGAGCGmo5uGCAGCACGCCGCAmo5umo5uACGACCmo5uACCmo5uCmo5umo5uAmo5uCmo5uGCGCAGCGACAmo5uGGACGGCGACGmo5uGCGmo5uACCGCGGCAGACAmo5uCAGCAGCACGmo5umo5uGCGGmo5uCCGmo5uGCCCGCGCCACGACCCmo5uCACCCAmo5uCAGCACCGCmo5umo5uCCACmo5umo5uCCAGCACCCCACGCAGmo5uCGACCCCGCAmo5uCmo5uAGGCGGCCGCmo5umo5uAAmo5umo5uAAGCmo5uGCCmo5umo5uCmo5uGCGGGGCmo5umo5uGCCmo5umo5uCmo5uGGCCAmo5uGCCCmo5umo5uCmo5umo5uCmo5uCmo5uCCCmo5umo5uGCACCmo5uGmo5uACCmo5uCmo5umo5uGGmo5uCmo5umo5umo5uGAAmo5uAAAGCCmo5uGAGmo5uAGGAAG SEQ ID NO:25(pp71構築體D –短+ 5moU) AGGGCGCCACACCmo5uGmo5uCGCCGCmo5uGCmo5uAmo5uAmo5umo5umo5uGCGACAGmo5umo5uGCCGGAACCCmo5umo5uCCCGACCmo5uCCCACGAAGACCCGmo5umo5uCACCmo5umo5umo5uGCGCAmo5uCCCCmo5uGACCCmo5uCCCCCCAmo5uCCCGCCmo5umo5uCGCAAmo5uGmo5uCmo5uCAGGCAmo5uCGmo5uCCmo5uCGCCCGGmo5uGAGGGACCCmo5uCGmo5uCGGAAGCGGCCGCGAmo5uCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCmo5umo5umo5uGGmo5uCGCCmo5uGCACmo5uGCCAGGmo5uGCmo5umo5uCGGCmo5uCAmo5uCACCAACGmo5uGGAAGGCGGCmo5uCGCmo5uGGAAGCCGGmo5uCGmo5uCmo5uGCGACmo5uCCmo5uGGACCmo5uGCGmo5uACCAACAmo5uAGAGGmo5uGAGCCGACCCmo5uCGGmo5umo5uCmo5uCmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5umo5uCAGGAGAACAAAmo5uCmo5uCCGCACGACACCGmo5uAGACCmo5uGACCGACCmo5uAAACAmo5uCAAGGGCCGCmo5uGCGmo5uGGmo5uGGGCGAACGGGACCGACmo5uGCmo5uGGmo5uGGACCmo5uCAACAACmo5umo5umo5uGGCCCACGACGCCmo5uGACGCCAGGCmo5uCAGAAAACAACACGGmo5uCmo5uCGGmo5uGCmo5uGGCCmo5umo5umo5uGCGCmo5uGCCGCmo5uAGACCGCGmo5uGCCCGmo5umo5uAGCGGACmo5uGCACCmo5uCmo5umo5umo5uCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAmo5uCGGCCGCGAAmo5uGGAGGCGCGCGCCAmo5uCAmo5uCCGCCGCACGGCmo5uCACCACmo5uGGGCCGmo5uGCGACmo5uGACCGmo5uGACGCCGAACmo5uGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGmo5umo5umo5uGGAGGCAGGGCAGAmo5uCmo5umo5umo5uGmo5uCAGCCAGmo5umo5uCGCCmo5umo5umo5uCGCGCCGGCGCCAmo5uCCCGCmo5uGACGCmo5uGGmo5uAGACGCCCmo5uGGAGCAGCmo5uGGCCmo5uGmo5umo5uCGGACCCmo5uAACACGmo5uACAmo5uCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAmo5uGGAmo5uCAmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCAmo5uCACGACmo5uCACCGCACCCGCCGACCAGCGmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCACmo5umo5umo5umo5uCGGmo5umo5umo5uACACGCAmo5uCGCGCCGAGGmo5uGGmo5uGGCGCGACACAAmo5uCCGmo5uACCCGCACCmo5uACGACGCmo5umo5uGCCGGACAACGGCmo5umo5uCCAGCmo5uGmo5umo5uGAmo5umo5uCCCAAAAGmo5umo5umo5umo5uACGCmo5uGACGCGCAmo5uACAmo5uCCCGAGmo5uACAmo5uCGmo5uGCAGAmo5uCCAGAAmo5uGCmo5umo5umo5uCGAAACCAAmo5uCAGACmo5uCACGACACCAmo5uCmo5umo5umo5umo5umo5uCCCGGAAAACAmo5uCCCGGGCGmo5uCmo5uCCAmo5uAGAAGCCGGCCCGCmo5uACCCGAmo5uCGmo5uGmo5uGCGAAmo5uCACCCmo5uCCGCGmo5uCACGCmo5uGACCGGCGACCAGGCCGmo5umo5uCAmo5umo5umo5uGGAACACCGACAGCCGCmo5uAGGCCGCAmo5uCCACmo5umo5umo5umo5umo5uCCGCCGmo5uGGGmo5umo5umo5umo5uGGACmo5uCmo5uCACACCCGGmo5uAAACCGGACAAAAmo5uCAAGCGmo5uCCCCAGGmo5uGCAGCmo5uGCGCGCCGGmo5uCmo5uCmo5umo5umo5uCCACGGAGCGACGmo5uCGmo5uGCGCGGCGCCGmo5uCmo5uCCGAGmo5umo5umo5uCmo5uCCCGCAGmo5uCCCCCGGAmo5umo5uACCACCCACCGAGGAAGAGGAGGAAGAAGAGGAAGAGGACGACGAAGAmo5uGACCmo5uCmo5uCCmo5uCCACACCGACGCCGACCCCCCmo5uGmo5uCCGAAGCCAmo5uGmo5umo5umo5uGCCGGCmo5umo5uCGAGGAGGCCAGCGGCGACGAGGACmo5uCGGACACCCAAGCCGGACmo5uGmo5uCCCGGGCACmo5uGAmo5uCCmo5uGACCGGACAAAGACGmo5uCGAAGCGGmo5uAACAACGGGGCmo5uCmo5uCACGCmo5uCGmo5uCAmo5uCCCCmo5uCGmo5uGGCACGmo5uCmo5umo5umo5uGCGAGCCmo5umo5uGACGACmo5umo5uGGmo5uACCAmo5umo5uAACGGmo5uGAGCGmo5uGCAGCACGCCGCAmo5umo5uACGACCmo5uACCmo5uCmo5umo5uAmo5uCmo5uGCGCAGCGACAmo5uGGACGGCGACGmo5uGCGmo5uACCGCGGCAGACAmo5uCAGCAGCACGmo5umo5uGCGGmo5uCCGmo5uGCCCGCGCCACGACCCmo5uCACCCAmo5uCAGCACCGCmo5umo5uCCACmo5umo5uCCAGCACCCCACGCAGmo5uCGACCCCGCAmo5uCmo5uAGAGAGAGACmo5umo5uCmo5umo5umo5uGmo5umo5umo5umo5umo5uCCCCCGCGmo5uGmo5umo5umo5umo5umo5uCCCAmo5umo5uCCCmo5uGmo5uAmo5umo5umo5uAmo5umo5umo5uCmo5uAAAmo5uAAmo5uAAAAACACAGAGACGmo5umo5uGAmo5uAAmo5uAACCGCAGCCmo5uGAGmo5uAGGAAG SEQ ID NO:26(pp71構築體E - pp65 + 5moU) AGGACAGAGGACCCmo5uGGmo5uGmo5umo5uGGGAAACGGACACmo5uAGGCGmo5uCCGCGCGAmo5uACGGGGmo5umo5uAAAACAAAAAAAAmo5uCGGmo5uGGmo5uGGmo5uGmo5uGmo5uGCmo5uGGGGmo5uGmo5uGGmo5uGACGGmo5uGGGGCmo5umo5umo5uGCCmo5uCmo5umo5umo5umo5umo5umo5umo5umo5umo5uGmo5uAAmo5uAAAAAAAGACACmo5uCAAmo5uAAmo5uCCGCGGmo5umo5uGmo5uCmo5uCmo5uGmo5uGmo5uAGAACGmo5umo5umo5umo5umo5uAmo5umo5umo5uCGGGmo5umo5uCCGCGmo5umo5umo5uGGmo5uCGCCmo5uGCCmo5uGmo5uGmo5uAAGGCGGCGGCCGCAAAGGGCGCGCCGCmo5uCAGmo5uCGCCmo5uACACCCGmo5uACGCGCAGGCAGCAmo5uGGAGmo5uCGCGCGGmo5uCGCCGmo5umo5uGmo5uCCCGAAAmo5uGAmo5uAmo5uCCGmo5uACmo5uGGGmo5uCCCAmo5umo5umo5uCGGGGCACGmo5uGCmo5uGAAAGCCGmo5uGmo5umo5umo5uAGmo5uCGCGGCGACACGCCGGmo5uGCmo5uGCCGCACGAGACGCGACmo5uCCmo5uGCAGACGGGmo5uAmo5uCCACGmo5uACGCGmo5uGAGCCAGCCCmo5uCGCmo5uGAmo5uCCmo5uGGmo5uGmo5uCGCAGmo5uACACGCCCGACmo5uCGACGCCAmo5uGCCACCGCGGCGACAAmo5uCAGCmo5uGCAGGmo5uGCAGCACACGmo5uACmo5umo5umo5uACGGGCAGCGAGGmo5uGGAGAACGmo5uGmo5uCGGmo5uCAACGmo5uGCACAACCCCACGGGCCGAAGCAmo5uCmo5uGCCCCAGCCAGGAGCCCAmo5uGmo5uCGAmo5uCmo5uAmo5uGmo5uGmo5uACGCGCmo5uGCCGCmo5uCAAGAmo5uGCmo5uGAACAmo5uCCCCAGCAmo5uCAACGmo5uGCACCACmo5uACCCGmo5uCGGCGGCCGAGCGCAAACACCGACACCmo5uGCCCGmo5uAGCmo5uGACGCmo5uGmo5uGAmo5umo5uCACGCGmo5uCGGGCAAGCAGAmo5uGmo5uGGCAGGCGCGmo5uCmo5uCACGGmo5uCmo5uCGGGACmo5uGGCCmo5uGGACGCGmo5uCAGCAGAACCAGmo5uGGAAAGAGCCCGACGmo5uCmo5uACmo5uACACGmo5uCAGCGmo5umo5uCGmo5uGmo5umo5umo5uCCCACCAAGGACGmo5uGGCACmo5uGCGGCACGmo5uGGmo5uGmo5uGCGCGCACGAGCmo5uGGmo5umo5umo5uGCmo5uCCAmo5uGGAGAACACGCGCGCAACCAAGAmo5uGCAGGmo5uGAmo5uAGGmo5uGACCAGmo5uACGmo5uCAAGGmo5uGmo5uACCmo5uGGAGmo5uCCmo5umo5uCmo5uGCGAGGACGmo5uGCCCmo5uCCGGCAAGCmo5uCmo5umo5umo5uAmo5uGCACGmo5uCACGCmo5uGGGCmo5uCmo5uGACGmo5uGGAAGAGGACCmo5uGACGAmo5uGACCCGCAACCCGCAACCCmo5umo5uCAmo5uGCGCCCCCACGAGCGCAACGGCmo5umo5umo5uACGGmo5uGmo5umo5uGmo5uGmo5uCCCAAAAAmo5uAmo5uGAmo5uAAmo5uCAAACCGGGCAAGAmo5uCmo5uCGCACAmo5uCAmo5uGCmo5uGGAmo5uGmo5uGGCmo5umo5umo5umo5uACCmo5uCACACGAGCAmo5umo5umo5umo5uGGGCmo5uGCmo5uGmo5uGmo5uCCCAAGAGCAmo5uCCCGGGCCmo5uGAGCAmo5uCmo5uCAGGmo5uAACCmo5uGmo5umo5uGAmo5uGAACGGGCAGCAGAmo5uCmo5umo5uCCmo5uGGAGGmo5uACAAGCGAmo5uACGCGAGACCGmo5uGGAACmo5uGCGmo5uCAGmo5uACGAmo5uCCCGmo5uGGCmo5uGCACmo5uCmo5umo5uCmo5umo5umo5umo5umo5uCGAmo5uAmo5uCGACmo5umo5uGCmo5uGCmo5uGCAGCGCGGGCCmo5uCAGmo5uACAGCGAGCACCCCACCmo5umo5uCACCAGCCAGmo5uAmo5uCGCAmo5uCCAGGGCAAGCmo5umo5uGAGmo5uACCGACACACCmo5uGGGACCGGCACGACGAGGGmo5uGCCGCCCAGGGCGACGACGACGmo5uCmo5uGGACCAGCGGAmo5uCGGACmo5uCCGACGAAGAACmo5uCGmo5uAACCACCGAGCGCAAGACGCCCCGCGmo5umo5uACCGGCGGCGGCGCCAmo5uGGCGGGCGCCmo5uCCACmo5umo5uCCGCGGGCCGCAAACGCAAAmo5uCAGCAmo5uCCmo5uCGGCGACGGCGmo5uGCACGGCGGGCGmo5umo5uAmo5uGACACGCGGCCGCCmo5umo5uAAGGCCGAGmo5uCCACCGmo5uCGCGCCCGAAGAGGACACCGACGAGGAmo5umo5uCCGACAACGAAAmo5uCCACAAmo5uCCGGCCGmo5uGmo5umo5uCACCmo5uGGCCGCCCmo5uGGCAGGCCGGCAmo5uCCmo5uGGCCCGCAACCmo5uGGmo5uGCCCAmo5uGGmo5uGGCmo5uACGGmo5umo5uCAGGGmo5uCAGAAmo5uCmo5uGAAGmo5uACCAGGAGmo5umo5uCmo5umo5uCmo5uGGGACGCCAACGACAmo5uCmo5uACCGCAmo5uCmo5umo5uCGCCGAAmo5umo5uGGAAGGCGmo5uAmo5uGGCAGCCCGCmo5uGCGCAACCCAAACGmo5uCGCCGCCACCGGCAAGAAGCCCmo5uGCCCGGGCCAmo5uGCAmo5uCGCCmo5uCGACGCCCAAAAAGCAmo5uCGAGGmo5umo5uGAGCCACCCGCCGCGCACGCGCmo5umo5uAAGACGACmo5uCmo5uAmo5uAAAAACCCACGmo5uCCACmo5uCAGACACGCGACmo5umo5umo5umo5uGGGCGCCACACCmo5uGmo5uCGCCGCmo5uGCmo5uAmo5uAmo5umo5umo5uGCGACAGmo5umo5uGCCGGAACCCmo5umo5uCCCGACCmo5uCCCACGAAGACCCGmo5umo5uCACCmo5umo5umo5uGCGCAmo5uCCCCmo5uGACCCmo5uCCCCCCAmo5uCCCGCCmo5umo5uCGCAAmo5uGmo5uCmo5uCAGGCAmo5uCGmo5uCCmo5uCGCCCGGmo5uGAGGGACCCmo5uCGmo5uCGGAAGCGGCCGCGAmo5uCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCmo5umo5umo5uGGmo5uCGCCmo5uGCACmo5uGCCAGGmo5uGCmo5umo5uCGGCmo5uCAmo5uCACCAACGmo5uGGAAGGCGGCmo5uCGCmo5uGGAAGCCGGmo5uCGmo5uCmo5uGCGACmo5uCCmo5uGGACCmo5uGCGmo5uACCAACAmo5uAGAGGmo5uGAGCCGACCCmo5uCGGmo5umo5uCmo5uCmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5umo5uCAGGAGAACAAAmo5uCmo5uCCGCACGACACCGmo5uAGACCmo5uGACCGACCmo5uAAACAmo5uCAAGGGCCGCmo5uGCGmo5uGGmo5uGGGCGAACGGGACCGACmo5uGCmo5uGGmo5uGGACCmo5uCAACAACmo5umo5umo5uGGCCCACGACGCCmo5uGACGCCAGGCmo5uCAGAAAACAACACGGmo5uCmo5uCGGmo5uGCmo5uGGCCmo5umo5umo5uGCGCmo5uGCCGCmo5uAGACCGCGmo5uGCCCGmo5umo5uAGCGGACmo5uGCACCmo5uCmo5umo5umo5uCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAmo5uCGGCCGCGAAmo5uGGAGGCGCGCGCCAmo5uCAmo5uCCGCCGCACGGCmo5uCACCACmo5uGGGCCGmo5uGCGACmo5uGACCGmo5uGACGCCGAACmo5uGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGmo5umo5umo5uGGAGGCAGGGCAGAmo5uCmo5umo5umo5uGmo5uCAGCCAGmo5umo5uCGCCmo5umo5umo5uCGCGCCGGCGCCAmo5uCCCGCmo5uGACGCmo5uGGmo5uAGACGCCCmo5uGGAGCAGCmo5uGGCCmo5uGmo5umo5uCGGACCCmo5uAACACGmo5uACAmo5uCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAmo5uGGAmo5uCAmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCAmo5uCACGACmo5uCACCGCACCCGCCGACCAGCGmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCACmo5umo5umo5umo5uCGGmo5umo5umo5uACACGCAmo5uCGCGCCGAGGmo5uGGmo5uGGCGCGACACAAmo5uCCGmo5uACCCGCACCmo5uACGACGCmo5umo5uGCCGGACAACGGCmo5umo5uCCAGCmo5uGmo5umo5uGAmo5umo5uCCCAAAAGmo5umo5umo5umo5uACGCmo5uGACGCGCAmo5uACAmo5uCCCGAGmo5uACAmo5uCGmo5uGCAGAmo5uCCAGAAmo5uGCmo5umo5umo5uCGAAACCAAmo5uCAGACmo5uCACGACACCAmo5uCmo5umo5umo5umo5umo5uCCCGGAAAACAmo5uCCCGGGCGmo5uCmo5uCCAmo5uAGAAGCCGGCCCGCmo5uACCCGAmo5uCGmo5uGmo5uGCGAAmo5uCACCCmo5uCCGCGmo5uCACGCmo5uGACCGGCGACCAGGCCGmo5umo5uCAmo5umo5umo5uGGAACACCGACAGCCGCmo5uAGGCCGCAmo5uCCACmo5umo5umo5umo5umo5uCCG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SEQ ID NO:27(pp71構築體F -終止pp65 + 5moU) AGGACAGAGGACCCmo5uGGmo5uGmo5umo5uGGGAAACGGACACmo5uAGGCGmo5uCCGCGCGAmo5uACGGGGmo5umo5uAAAACAAAAAAAAmo5uCGGmo5uGGmo5uGGmo5uGmo5uGmo5uGCmo5uGGGGmo5uGmo5uGGmo5uGACGGmo5uGGGGCmo5umo5umo5uGCCmo5uCmo5umo5umo5umo5umo5umo5umo5umo5umo5uGmo5uAAmo5uAAAAAAAGACACmo5uCAAmo5uAAmo5uCCGCGGmo5umo5uGmo5uCmo5uCmo5uGmo5uGmo5uAGAACGmo5umo5umo5umo5umo5uAmo5umo5umo5uCGGGmo5umo5uCCGCGmo5umo5umo5uGGmo5uCGCCmo5uGCCmo5uGmo5uGmo5uAAGGCGGCGGCCGCAAAGGGCGCGCCGCmo5uCAGmo5uCGCCmo5uACACCCGmo5uACGCGCAGGCAGCAmo5uGGAGmo5uCGCGCGGmo5uCGCCGmo5umo5uGmo5uCCCGAAmo5uAGmo5uGAmo5uCCGmo5uACmo5uGGGmo5uCCCAmo5umo5umo5uCGGGGCACGmo5uGCmo5uGAAAGCCGmo5uGmo5umo5umo5uAGmo5uCGCGGCGACACGCCGGmo5uGCmo5uGCCGCACGAGACGCGACmo5uCCmo5uGCAGACGGGmo5uAmo5uCCACGmo5uACGCGmo5uGAGCCAGCCCmo5uCGCmo5uGAmo5uCCmo5uGGmo5uGmo5uCGCAGmo5uACACGCCCGACmo5uCGACGCCAmo5uGCCACCGCGGCGACAAmo5uCAGCmo5uGCAGGmo5uGCAGCACACGmo5uACmo5umo5umo5uACGGGCAGCGAGGmo5uGGAGAACGmo5uGmo5uCGGmo5uCAACGmo5uGCACAACCCCACGGGCCGAAGCAmo5uCmo5uGCCCCAGCCAGGAGCCCAmo5uGmo5uCGAmo5uCmo5uAmo5uGmo5uGmo5uACGCGCmo5uGCCGCmo5uCAAGAmo5uGCmo5uGAACAmo5uCCCCAGCAmo5uCAACGmo5uGCACCACmo5uACCCGmo5uCGGCGGCCGAGCGCAAACACCGACACCmo5uGCCCGmo5uAGCmo5uGACGCmo5uGmo5uGAmo5umo5uCACGCGmo5uCGGGCAAGCAGAmo5uGmo5uGGCAGGCGCGmo5uCmo5uCACGGmo5uCmo5uCGGGACmo5uGGCCmo5uGGACGCGmo5uCAGCAGAACCAGmo5uGGAAAGAGCCCGACGmo5uCmo5uACmo5uACACGmo5uCAGCGmo5umo5uCGmo5uGmo5umo5umo5uCCCACCAAGGACGmo5uGGCACmo5uGCGGCACGmo5uGGmo5uGmo5uGCGCGCACGAGCmo5uGGmo5umo5umo5uGCmo5uCCAmo5uGGAGAACACGCGCGCAACCAAGAmo5uGCAGGmo5uGAmo5uAGGmo5uGACCAGmo5uACGmo5uCAAGGmo5uGmo5uACCmo5uGGAGmo5uCCmo5umo5uCmo5uGCGAGGACGmo5uGCCCmo5uCCGGCAAGCmo5uCmo5umo5umo5uAmo5uGCACGmo5uCACGCmo5uGGGCmo5uCmo5uGACGmo5uGGAAGAGGACCmo5uGACGAmo5uGACCCGCAACCCGCAACCCmo5umo5uCAmo5uGCGCCCCCACGAGCGCAACGGCmo5umo5umo5uACGGmo5uGmo5umo5uGmo5uGmo5uCCCAAAAAmo5uAmo5uGAmo5uAAmo5uCAAACCGGGCAAGAmo5uCmo5uCGCACAmo5uCAmo5uGCmo5uGGAmo5uGmo5uGGCmo5umo5umo5umo5uACCmo5uCACACGAGCAmo5umo5umo5umo5uGGGCmo5uGCmo5uGmo5uGmo5uCCCAAGAGCAmo5uCCCGGGCCmo5uGAGCAmo5uCmo5uCAGGmo5uAACCmo5uGmo5umo5uGAmo5uGAACGGGCAGCAGAmo5uCmo5umo5uCCmo5uGGAGGmo5uACAAGCGAmo5uACGCGAGACCGmo5uGGAACmo5uGCGmo5uCAGmo5uACGAmo5uCCCGmo5uGGCmo5uGCACmo5uCmo5umo5uCmo5umo5umo5umo5umo5uCGAmo5uAmo5uCGACmo5umo5uGCmo5uGCmo5uGCAGCGCGGGCCmo5uCAGmo5uACAGCGAGCACCCCACCmo5umo5uCACCAGCCAGmo5uAmo5uCGCAmo5uCCAGGGCAAGCmo5umo5uGAGmo5uACCGACACACCmo5uGGGACCGGCACGACGAGGGmo5uGCCGCCCAGGGCGACGACGACGmo5uCmo5uGGACCAGCGGAmo5uCGGACmo5uCCGACGAAGAACmo5uCGmo5uAACCACCGAGCGCAAGACGCCCCGCGmo5umo5uACCGGCGGCGGCGCCAmo5uGGCGGGCGCCmo5uCCACmo5umo5uCCGCGGGCCGCAAACGCAAAmo5uCAGCAmo5uCCmo5uCGGCGACGGCGmo5uGCACGGCGGGCGmo5umo5uAmo5uGACACGCGGCCGCCmo5umo5uAAGGCCGAGmo5uCCACCGmo5uCGCGCCCGAAGAGGACACCGACGAGGAmo5umo5uCCGACAACGAAAmo5uCCACAAmo5uCCGGCCGmo5uGmo5umo5uCACCmo5uGGCCGCCCmo5uGGCAGGCCGGCAmo5uCCmo5uGGCCCGCAACCmo5uGGmo5uGCCCAmo5uGGmo5uGGCmo5uACGGmo5umo5uCAGGGmo5uCAGAAmo5uCmo5uGAAGmo5uACCAGGAGmo5umo5uCmo5umo5uCmo5uGGGACGCCAACGACAmo5uCmo5uACCGCAmo5uCmo5umo5uCGCCGAAmo5umo5uGGAAGGCGmo5uAmo5uGGCAGCCCGCmo5uGCGCAACCCAAACGmo5uCGCCGCCACCGGCAAGAAGCCCmo5uGCCCGGGCCAmo5uGCAmo5uCGCCmo5uCGACGCCCAAAAAGCAmo5uCGAGGmo5umo5uGAGCCACCCGCCGCGCACGCGCmo5umo5uAAGACGACmo5uCmo5uAmo5uAAAAACCCACGmo5uCCACmo5uCAGACACGCGACmo5umo5umo5umo5uGGGCGCCACACCmo5uGmo5uCGCCGCmo5uGCmo5uAmo5uAmo5umo5umo5uGCGACAGmo5umo5uGCCGGAACCCmo5umo5uCCCGACCmo5uCCCACGAAGACCCGmo5umo5uCACCmo5umo5umo5uGCGCAmo5uCCCCmo5uGACCCmo5uCCCCCCAmo5uCCCGCCmo5umo5uCGCAAmo5uGmo5uCmo5uCAGGCAmo5uCGmo5uCCmo5uCGCCCGGmo5uGAGGGACCCmo5uCGmo5uCGGAAGCGGCCGCGAmo5uCAGCGAGGCCGAAGCCGCCAGCGGCAGCmo5umo5umo5uGGmo5uCGCCmo5uGCACmo5uGCCAGGmo5uGCmo5umo5uCGGCmo5uCAmo5uCACCAACGmo5uGGAAGGCGGCmo5uCGCmo5uGGAAGCCGGmo5uCGmo5uCmo5uGCGACmo5uCCmo5uGGACCmo5uGCGmo5uACCAACAmo5uAGAGGmo5uGAGCCGACCCmo5uCGGmo5umo5uCmo5uCmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5umo5uCAGGAGAACAAAmo5uCmo5uCCGCACGACACCGmo5uAGACCmo5uGACCGACCmo5uAAACAmo5uCAAGGGCCGCmo5uGCGmo5uGGmo5uGGGCGAACGGGACCGACmo5uGCmo5uGGmo5uGGACCmo5uCAACAACmo5umo5umo5uGGCCCACGACGCCmo5uGACGCCAGGCmo5uCAGAAAACAACACGGmo5uCmo5uCGGmo5uGCmo5uGGCCmo5umo5umo5uGCGCmo5uGCCGCmo5uAGACCGCGmo5uGCCCGmo5umo5uAGCGGACmo5uGCACCmo5uCmo5umo5umo5uCAGAGCCAGCGGCGCGGCGGCGAAGAAAAmo5uCGGCCGCGAAmo5uGGAGGCGCGCGCCAmo5uCAmo5uCCGCCGCACGGCmo5uCACCACmo5uGGGCCGmo5uGCGACmo5uGACCGmo5uGACGCCGAACmo5uGGCGCCGCAGAACCGACAGCAGmo5umo5umo5uGGAGGCAGGGCAGAmo5uCmo5umo5umo5uGmo5uCAGCCAGmo5umo5uCGCCmo5umo5umo5uCGCGCCGGCGCCAmo5uCCCGCmo5uGACGCmo5uGGmo5uAGACGCCCmo5uGGAGCAGCmo5uGGCCmo5uGmo5umo5uCGGACCCmo5uAACACGmo5uACAmo5uCCACAAAACGGAGACGGACGAACGAGGCCAAmo5uGGAmo5uCAmo5uGCmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCAmo5uCACGACmo5uCACCGCACCCGCCGACCAGCGmo5uGmo5umo5umo5uCmo5uGCACmo5umo5umo5umo5uCGGmo5umo5umo5uACACGCAmo5uCGCGCCGAGGmo5uGGmo5uGGCGCGACACAAmo5uCCGmo5uACCCGCACCmo5uACGACGCmo5umo5uGCCGGACAACGGCmo5umo5uCCAGCmo5uGmo5umo5uGAmo5umo5uCCCAAAAGmo5umo5umo5umo5uACGCmo5uGACGCGCAmo5uACAmo5uCCCGAGmo5uACAmo5uCGmo5uGCAGAmo5uCCAGAAmo5uGCmo5umo5umo5uCGAAACCAAmo5uCAGACmo5uCACGACACCAmo5uCmo5umo5umo5umo5umo5uCCCGGAAAACAmo5uCCCGGGCGmo5uCmo5uCCAmo5uAGAAGCCGGCCCGCmo5uACCCGAmo5uCGmo5uGmo5uGCGAAmo5uCACCCmo5uCCGCGmo5uCACGCmo5uGACCGGCGACCAGGCCGmo5umo5uCAmo5umo5umo5uGGAACACCGACAGCCGCmo5uAGGCCGCAmo5uCCACmo5umo5umo5umo5umo5uCCG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雖然已說明且描述特定實施例，但應容易瞭解，可組合上文所描述之各種實施例以提供其他實施例，且可組合上文所描述之各種實施例以提供其他實施例。
除非另外明確陳述，否則本說明書中提及及/或本申請案資料表中所列之所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利公開案，包括2021年8月31日申請之美國臨時專利申請案第63/239,269號均以全文引用之方式併入本文中。必要時，可修改實施例之態樣以採用各種專利、申請案及公開案之概念，從而提供又其他實施例。
可鑒於上文詳細描述對實施例進行此等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍中，所使用之術語不應解釋為將申請專利範圍限制於本說明書及申請專利範圍中所揭露之特定實施例，而應解釋為包括所有可能之實施例以及此類申請專利範圍有權要求的等效物之全部範疇。因此，申請專利範圍不受本揭露內容限制。
無
圖 1 展示在pp71-V5 mRNA轉染之存在下加速HCMV細胞病變效應(cytopathic effect；CPE)。MRC-5細胞(1)經模擬轉染，(2)用抗DAXX siRNA轉染，或在以MOI 0.01感染HCMV載體之前一天用UL82 mRNA轉染。在感染後13天拍攝圖像。
圖 2 展示在UL82 mRNA轉染之存在下加速HCMV產生。在以MOI 0.01感染HCMV載體之前一天，用抗DAXX siRNA或UL82 mRNA轉染MRC-5細胞。在感染後指定日(DPI)收穫且滴定病毒上清液。使用免疫螢光病灶形成分析進行滴定。ffu=病灶形成單位(focus forming unit)。
圖 3 展示由UL82 mRNA轉染引起之pp71表現。MRC-5細胞用UL82 mRNA轉染且在轉染後指定日收穫。在SDS-PAGE之後對細胞溶解物進行pp71之免疫墨點。包括未經轉染之MRC-5細胞作為陰性對照。將墨點條紋化且再探測用於內參考物之細胞肌動蛋白。
圖 4 展示在藉由mRNA轉染或抗DAXX siRNA轉染提供之pp71表現之存在下的BAC DNA復原。MRC-5細胞用Δpp71-GFP TR-3 BAC轉染且在轉染後數天用顯微鏡觀測。在12 DPI，表現GFP之細胞之數目在用pp71 mRNA轉染之細胞中顯著更大。
圖 5A 至圖 5C 展示用UL82 mRNA (A=MRC5；B=BJ-5ta)轉染或使用多西環素(doxycycline) (10C)誘導以表現pp71，且以1:81、1:243、1:729及1:2187病毒稀釋感染CMV儲備病毒的細胞株。誤差槓為來自三個重複之平均值的一個標準差。 圖 5A展示MRC5細胞株。 圖 5B展示BJ-5ta細胞株。 圖 5C展示pp71多西環素誘導性細胞株。
圖 6 展示在T150燒瓶中比較使用pp71 mRNA與抗DAXX siRNA之製造的病毒生長曲線。
圖 7 展示在製造容器HYPERStack12中利用pp71 mRNA轉染的病毒生長曲線。
圖 8 為展示病毒粒子中負載之pp71蛋白質的免疫墨點。進行蛋白質分析且每個樣品負載30 µg總蛋白質。MRC-5細胞裂解物用作陰性對照樣品(細胞)。藉由在4℃下以24,000 RPM使澄清上清液經由山梨糖醇墊離心1小時來獲得病毒粒子樣品。野生型TR3病毒粒子(WT)為陽性對照且UL82缺失型病毒粒子補充有指定pp71 mRNA濃度(ng/cm 2)。用抗pp71抗體探測上部墨點，且隨後剝離且再探測肌動蛋白作為內參考物(下部墨點)。
圖 9A 至圖 9B 展示由pp71-V5 mRNA轉染引起之pp71表現。MRC-5細胞使用Lipofectamine 2000經50 ng/cm 2之pp71-V5 mRNA轉染。 圖 9A展示在轉染後指定日收穫之細胞溶解物中之pp71在SDS-page之後的免疫墨點。包括未經轉染之MRC-5細胞作為陰性對照。將墨點剝離且再探測作為內參考物之細胞肌動蛋白。 圖 9B展示來自在轉染後48小時細胞之免疫螢光分析(IFA)的影像。細胞用初級抗V5標籤抗體，隨後用經Cy-5標記之二級抗體染色。pp71-V5蛋白質經表現且定位至核區，其用核染料DAPI複染(counterstained)。
圖 10 展示在pp71-V5 mRNA轉染之存在下加速HCMV CPE。MRC-5細胞(1)經模擬轉染，(2)在感染前一天及感染後10天(DPI)用10 µM抗DAXX siRNA轉染，或(3)用攜帶V5標籤之pp71 mRNA (由UL82編碼)構築體(pp71-V5 mRNA)轉染(1及5 DPI)，其中pp71缺失型HCMV處於MOI 0.01。在感染後13天拍攝圖像。
圖 11 展示在pp71-V5 mRNA轉染之存在下加速HCMV製造。在以MOI 0.01感染pp71缺失型HCMV載體之前一天，MRC-5細胞用抗DAXX siRNA (在-1及10 DPI為10 µM)或pp71-V5 mRNA (在-1及6 DPI為40 ng/cm 2)轉染。在感染後指定日(DPI)收穫且滴定病毒上清液。使用免疫螢光病灶形成分析進行滴定。ffu=病灶形成單位。
圖 12 為展示在三種mRNA轉染之後在細胞及病毒粒子集結粒(pellet)中在13 DPI缺乏pp71-V5蛋白質的免疫墨點。MRC-5纖維母細胞在-1、6及11 DPI用pp71-V5 mRNA (40 ng/cm 2)轉染，且以MOI 0.01感染pp71缺失型HCMV。對於各樣品，負載27 μg總蛋白質。經感染之細胞裂解物及病毒粒子裂解物分別展示於色帶3及4中。MRC-5細胞裂解物用作陰性對照樣品(色帶1)。pp71-V5轉染之MRC-5細胞裂解物用作陽性對照樣品(色帶2)。將上部墨點用抗V5抗體探測，剝離，且再探測醣蛋白B (gB)以展示HCMV (中間墨點)之存在且接著剝離並且再探測肌動蛋白(下部墨點)。
圖 13A 至圖 13C 展示在用EGFP mRNA轉染後，四種以脂質為主之mRNA轉染試劑對MRC-5細胞中之EGFP表現及生存力的影響。MRC-5細胞使用處於四種量(「低」、「中等」、「高」及「較高」；對於脂質體積，參見表3)下之四種以脂質為主之轉染試劑(Lipofectamine 2000、MessengerMax、Jet-mRNA或Trans-IT)，用三種量之mRNA (0.5 μg、1.0 μg或1.5 μg)轉染，且藉由流式細胞測量術評估轉染後一天的EGFP表現。 圖 13A展示綠色(經轉染，EGFP陽性)細胞之分率。 圖 13B展示平均螢光強度(MFI)。 圖 13C展示活細胞之分率。
圖 14 展示用EGFP-Cy5轉染且在9 DPI感染HCMV之MRC-5纖維母細胞中之EGFP的損失。MRC-5纖維母細胞在DPI -1及DPI 6用50 ng/cm 2EGFP-Cy5 mRNA轉染，且在DPI 0以0.01之MOI感染WT TR3。相位影像展示CPE之存在，而Cy5信號指示經轉染mRNA之存在且EGFP信號指示來自經轉譯mRNA之蛋白質之存在。
圖 15A 至圖 15B 展示用5moU修飾之EGFP mRNA轉染且感染HCMV WT TR3之MRC-5纖維母細胞中的穩定EGFP表現。 圖 15A為代表性免疫墨點。EGFP mRNA構築體不含修飾(色帶2及3)，或由5-甲氧基尿苷(5moU，色帶4及5)、假尿苷加5-甲基胞苷(pseudoU/5meC，色帶6及7)或與5moU為1:3比率的經Cy-5標記之三磷酸尿苷(色帶7及8)產生。色帶1展示無轉染，其中WT TR3感染MOI 0.01作為pp65表現之陽性對照及EGFP表現之陰性對照。色帶2、4、6、8僅轉染，而色帶3、5、7、9在0 DPI感染WT TR3 MOI 0.01。對於各樣品，除非指出(色帶2及3：25 μg)，否則負載40 µg總蛋白質。將上部墨點用展示存在TR3之抗pp65抗體探測，剝離，且再探測GFP (下部墨點)且接著剝離並且再探測肌動蛋白(中間墨點)。 圖 15B展示用5moU EGFP轉染(經標記之「B」)且用5moU EGFP轉染並且以MOI 0.01感染WT TR3 (經標記之「C」)的MRC-5纖維母細胞在6 DPI的免疫螢光影像。相同場之相位影像展示僅轉染MRC-5纖維母細胞(經標記之「D」)或經感染MRC-5纖維母細胞(經標記之「D」)中之CPE之存在。
圖 16 展示用於測試蛋白質定位之若干pp71 mRNA構築體的結構。構築體A包括合成5'UTR及小鼠α-血球蛋白3'UTR (「起始-終止(start-to-stop)」)，其在前述圖式中亦稱為「pp71-V5 mRNA」。構築體B包括全長病毒pp71 5'及3' UTR。構築體C含有HCMV IE1 5'UTR及小鼠α-血球蛋白3'UTR。構築體E為包括pp65之雙順反子mRNA。構築體F為pp65中具有終止密碼子之雙順反子mRNA。構築體D含有在TATA盒之後開始的截短5'UTR及在假定poly(A)信號序列之前結束的3'UTR。所有構築體均不含V5抗原決定基且用5moU (5-甲氧基尿苷)修飾之核苷製備。構築體A及B另外用假尿苷及5-甲基胞苷修飾之核苷製備。
圖 17A 至圖 17C 展示比較在MRC-5細胞溶解物中具有5moU修飾之不同pp71 mRNA構築體(參見 圖 16)之表現的免疫墨點。對於 圖 17A 至圖 17C中之各墨點：感染WT TR3且在12 DPI收穫之未經轉染之MRC-5纖維母細胞展示於色帶1中；在1、6及10或13 DPI收集具有指定mRNA之未經感染但經轉染之樣品；如所指示在9 DPI或12 DPI收穫用指定mRNA轉染且感染pp71缺失型病毒(經標記之「Δpp71」)之樣品。對於各樣品，負載30 μg總蛋白質。將墨點用抗pp71抗體(中間墨點)探測，剝離且用抗gB抗體(上部墨點)再探測且剝離並且再探測肌動蛋白(下部墨點)。 圖 17C亦經剝離且用抗pp65抗體再探測。 圖 17A展示利用經pseudoU/5meC (色帶2至5)或5moU (色帶6至9)修飾之全長病毒5'及3'UTR pp71 mRNA構築體(構築體B)的轉染。 圖 17B展示利用經5moU修飾之即刻早期(構築體C，色帶2至5)或短(構築體D，色帶6至9) pp71 mRNA構築體的轉染。 圖 17C展示利用經5moU修飾之pp65 (構築體E，色帶2至5)或終止(構築體F，色帶6至9) pp71 mRNA構築體的轉染。
圖 18A 至圖 18B 展示比較來自用具有不同poly-A尾長度之pp71 mRNA (100 ng/cm 2)轉染的MRC-5細胞裂解物之pp71蛋白質之表現的免疫墨點。 圖 18A展示用構築體B mRNA轉染之在5 DPI收集之細胞裂解物的免疫墨點，該等構築體B mRNA藉由以下產生：酶促50nt poly-A尾(經標記之「(2)」)，藉由酶促100nt poly-A尾(色帶3)產生，無添加之poly-A尾(色帶4)或藉由具有未知長度的酶促添加之poly-A尾(色帶5)產生。亦展示藉由模板之80nt poly-A尾產生之構築體A (「起始-終止pp71 mRNA構築體」) (色帶6)。未經轉染之MRC-5細胞用作陰性對照(色帶1)。對於各樣品，負載40 μg總蛋白質。用抗pp71抗體探測上部墨點，且隨後剝離且再探測肌動蛋白(下部墨點)。 圖 18B展示與使用GMP製造製備中之質體模板poly-A生產製程用模板之80nt poly-A尾(經標記之「模板pA 80bp規模放大」)產生的構築體B pp71 mRNA相比，在經用模板之80nt poly-A尾(經標記之「模板pA 80bp」)產生的構築體B pp71 mRNA轉染之後在2、4、6及8 DPI收集之細胞裂解物的免疫墨點。對於各樣品，負載40 μg總蛋白質。用抗pp71抗體探測上部墨點，且隨後剝離且再探測B-微管蛋白(下部墨點)。
圖 19 展示比較使用poly-A尾至構築體B pp71 mRNA之以模板或酶為主之添加產生的病毒之效價的生長曲線。MRC-5細胞在-1 DPI以100 ng/cm 2經以下轉染：無添加之poly-A尾之構築體B pp71 mRNA (經標記之「A」)、用酶促50nt poly-A尾產生之構築體B pp71 mRNA (標記為「B-1」及「B-2」之二個重複)、用模板之80nt poly-A尾產生的構築體B pp71 mRNA (二個重複，經標記之「C-1」及「C-2」)或用GMP製造之模板之80nt poly-A尾規模放大產生的構築體B pp71 mRNA (經標記之「D」)，且以0.01之MOI感染pp71缺失型載體。在感染後多天藉由晚期抗原免疫螢光分析(LA IFA)測定以FFU/mL為單位之病毒效價。
圖 20 展示在轉染增加量之構築體B pp71 mRNA且感染pp71缺失型CMV之後，MRC-5纖維母細胞中之pp71蛋白質表現的免疫墨點。MRC-5以500 ng/cm 2或200 ng/cm 2轉染且感染pp71缺失型病毒(結核缺失：TR3 mir124 ΔUL128-130  ΔUL146-147  ΔUL82 Ag85A-ESAT-6-Rv3407-Rv2626c-RpfA-RpfD，MOI 0.01)。以MOI 0.01感染WT TR3之MRC-5細胞(色帶3)及以1000 ng/cm 2轉染之未經感染之MRC-5細胞(色帶4)用作陽性對照。未經轉染之MRC-5細胞(色帶1)及感染pp71缺失型病毒之未經轉染之MRC-5細胞用作陰性對照(色帶2)。對於各樣品，負載40 μg總蛋白質。將墨點用抗pp71抗體(中間墨點)探測，剝離且用抗gB抗體(上部墨點)再探測且剝離並且再探測肌動蛋白(下部墨點)。
圖 21 展示比較用不同量之SS (起始-終止，構築體A)或FT (具有5'及3' UTR之全長構築體，構築體B) pp71 mRNA與抗DAXX siRNA轉染的MRC-5纖維母細胞中之病毒效價的生長曲線。MRC-5纖維母細胞用pp71 mRNA (5-500 ng/cm 2之FT或SS)或抗DAXX siRNA (10 µM)轉染，隨後以0.01之MOI感染pp71缺失型病毒。在感染後指定日，藉由LA IFA測定以FFU/mL為單位之病毒效價。
圖 22 展示表明最佳化pp71 mRNA轉染方法在100 ng/cm 2下對HYPERStack格式之製造可擴展性的生長曲線。在HYPERStack-12 (HS-12)或HYPERStack-36 (HS-36)中進行七次運行。在該製程在T-燒瓶中研發之後，在HS-12中進行三種生長曲線。HS-12以6.67×10 3個細胞/平方公分接種，在接種後第3天用構築體B pp71 mRNA轉染，且在接種後第4天以0.01之MOI感染pp71缺失病毒。在HS-12及HS-36 (點線)中進行四種生長曲線，其中細胞在接種後第4天轉染或大於85%融合度且在接種後第5天以0.01之MOI感染pp71缺失病毒。在感染後多天，藉由LA IFA測定以FFU/mL為單位之病毒效價。
圖 23 展示來自感染載體5 (TR3 Δ146-147  Δ128-130 ΔUL82 M守恆的gag/nef/pol融合表觀(episensus) 1)之未經補充之MRC-5纖維母細胞之M守恆的gag/nef/pol融合表觀1抗原表現的免疫墨點。載體5病毒在藉由以100 ng/cm 2轉染構築體B pp71 mRNA補充之MRC-5纖維母細胞中產生且在17或20 DPI收穫。對於各樣品，負載40 μg總蛋白質。純化p24蛋白質用作陽性對照樣品(5 ng，「p24」)。MRC-5細胞裂解物用作陰性對照樣品(「MRC-5」)。將墨點用抗p24抗體(中間墨點)探測，剝離且用抗gB抗體(上部墨點)再探測，且剝離並且再探測肌動蛋白(下部墨點)。
圖 24A 至圖 24B 展示相較於抗DAXX siRNA轉染，在較低MOI下使用藉由pp71 mRNA轉染(200 ng/cm 2)產生之病毒增加的斑塊數目。未經補充(未經轉染)之MRC-5纖維母細胞以0.01之MOI感染用抗DAXX siRNA (上部圖)或200 ng/cm 2構築體B pp71 mRNA (下部圖)產生的pp71缺失型病毒。監測培養物之擴散及斑塊數目。 圖 24A展示在13 DPI之CPE的相位影像。 圖 24B為展示各組測試之MOI之範圍及在14 DPI之對應斑塊計數的表。對斑塊進行目測計數。
圖 25 為展示來自僅轉染對照樣品之超速離心及蔗糖梯度純化的上清液裂解物之pp71蛋白質表現的免疫墨點。進行BCA (二喹啉甲酸)蛋白質分析且每個樣品負載30 µg總蛋白質。色帶3及4展示構築體B pp71 mRNA轉染對照細胞裂解物及藉由遵循T-燒瓶生產製程但省略感染獲得之「病毒粒子」裂解物。將單層在14 DPI刮於上清液中，且在澄清及超速離心(色帶3)或蔗糖梯度純化(色帶4)之前經受三個冷凍/解凍(3× F/T)循環。MRC-5細胞裂解物用作陰性對照樣品(色帶1及7)。陽性對照係僅使用pp71 mRNA轉染(色帶2，轉染後一天)展示，感染細胞裂解物(色帶5，DPI 12)及蔗糖梯度純化的病毒粒子裂解物(色帶6，DPI 12)分別展示於色帶8及9中。
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Claims (81)

  1. 一種製造一後代巨細胞病毒(CMV)之方法，其包含： (a)  向一細胞中引入編碼為CMV複製所必需或強化CMV複製之一基因的一mRNA分子； (b)  用一親本CMV感染該細胞； (c)  培育該細胞；以及 (d)  收集該後代CMV。
  2. 一種製造一後代CMV之方法，其包含： (a)  將編碼一pp71蛋白質之一mRNA分子引入一細胞中； (b)  用一親本CMV感染該細胞； (c)  培育該細胞；以及 (d)  收集該後代CMV。
  3. 一種製造一後代CMV之方法，其包含： (a)  首先，將編碼一pp71蛋白質之一mRNA分子引入一細胞中； (b)  其次，用一親本CMV感染該細胞； (c)  第三，培育該細胞；以及 (d)  第四，收集該後代CMV。
  4. 如請求項1之方法，其中為CMV複製所必需或強化CMV複製之該基因為UL82、UL32、UL34、UL37、UL44、UL46、UL48、UL48.5、UL49、UL50、UL51、UL52、UL53、UL54、UL55、UL56、UL57、UL60、UL61、UL70、UL71、UL73、UL75、UL76、UL77、UL79、UL80、UL84、UL85、UL86、UL87、UL89、UL90、UL91、UL92、UL93、UL94、UL95、UL96、UL98、UL99、UL100、UL102、UL104、UL105、UL115或UL122，或其同源物。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該後代CMV包含pp71蛋白質。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該細胞為一MRC-5細胞。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:14之序列。
  8. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:14至20中之一者的序列。
  9. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10中之一者的序列。
  10. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4之序列。
  11. 如請求項1至6、9及10中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO: 4至10中之一者的序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代。
  12. 如請求項1至6、9及10中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10中之一者的序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代。
  13. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:21至27中之一者的序列。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該mRNA分子進一步包含一poly(A)尾。
  15. 如請求項1至14中任一項之方法，其中一poly(A)尾已添加至編碼該pp71蛋白質之該mRNA分子的3'端。
  16. 如請求項14或請求項15之方法，其中該mRNA分子係使用編碼該poly(A)尾之一雙股DNA模板製造。
  17. 如請求項16之方法，其中該雙股DNA模板為一質體。
  18. 如請求項14至17中任一項之方法，其中該poly(A)尾之長度為大致60至100個核苷酸。
  19. 如請求項14至17中任一項之方法，其中該poly(A)尾之長度為80個核苷酸。
  20. 如請求項1至8及14至19中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:14至20中之一者的序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代，且具有長度為80個核苷酸之一poly(A)尾。
  21. 如請求項1至6、9至11及14至19中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10中之一者的序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代，且具有長度為80個核苷酸之一poly(A)尾；且其中該poly(A)尾係使用一質體模板製造。
  22. 如請求項1至6、9、12及14至19中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:4至10之序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代，且具有長度為80個核苷酸之一poly(A)尾；其中該poly(A)尾係使用一質體模板製造。
  23. 如請求項1至6及13至19中任一項之方法，其中該mRNA分子包含根據SEQ ID NO:21至27之一序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代，且具有長度為80個核苷酸之一poly(A)尾。
  24. 如請求項14或請求項15之方法，其中該poly(A)尾在轉錄之後藉由或已藉由一酶添加。
  25. 如請求項24之方法，其中該poly(A)尾之長度為大致50至100個核苷酸。
  26. 如請求項1至25中任一項之方法，其中該mRNA分子係使用轉染引入。
  27. 如請求項26之方法，其中該轉染係使用一脂質轉染試劑實現。
  28. 如請求項27之方法，其中該脂質轉染試劑包含MessengerMax、Lipofectamine 2000、Jet-mRNA或Trans-IT。
  29. 如請求項1至28中任一項之方法，其中該mRNA分子係以5 ng/cm2至500 ng/cm2之一劑量遞送。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該mRNA分子係以50 ng/cm2至100 ng/cm2之一劑量遞送。
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中該mRNA分子係以50 ng/cm2之一劑量遞送。
  32. 如請求項1至31中任一項之方法，其中該mRNA分子係以100 ng/cm2之一劑量遞送。
  33. 如請求項1至32中任一項之方法，其中該親本或後代CMV為一HCMV。
  34. 如請求項33之方法，其中該親本或後代CMV為HCMV之一經基因修飾之TR株。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該親本或後代CMV包含一TR3主鏈。
  36. 如請求項1至35中任一項之方法，其中該親本或後代CMV包含編碼一異源抗原之一核酸。
  37. 如請求項36之方法，其中該異源抗原包含一病原體特異性抗原或一腫瘤抗原。
  38. 如請求項36之方法，其中該異源抗原包含一病原體特異性抗原，其包含一人類免疫缺陷病毒(HIV)抗原、一猿猴免疫缺陷病毒(SIV)抗原、一人類巨細胞病毒(HCMV)抗原、一B型肝炎病毒(HBV)抗原、一C型肝炎病毒(HCV)抗原、一乳頭狀瘤病毒抗原(例如，一人類乳頭狀瘤病毒(HPV)抗原)、一瘧原蟲( Plasmodium)抗原、一卡波西氏肉瘤相關之疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)抗原、一水痘帶狀疱疹病毒(VZV)抗原、一伊波拉病毒(Ebola virus)、一結核分枝桿菌( Mycobacterium tuberculosis)抗原、一屈公病毒(Chikungunya virus)抗原、一登革熱病毒(dengue virus)抗原、一猴痘病毒抗原、一單純疱疹病毒(HSV) 1抗原、一單純疱疹病毒(HSV) 2抗原、一埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus；EBV)抗原、一脊髓灰白質炎病毒(poliovirus)抗原、一流感病毒抗原或一破傷風梭菌( Clostridium tetani)抗原。
  39. 如請求項36之方法，其中該異源抗原包含一HIV抗原。
  40. 如請求項39之方法，其中該HIV抗原為Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif或Vpu，或其一抗原決定基或抗原片段。
  41. 如請求項39之方法，其中該HIV抗原包含以下中之多於一者：Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif及Vpu，或其一抗原決定基或抗原片段。
  42. 如請求項39之方法，其中該HIV抗原為包含以下中之多於一者的一融合蛋白：Gag、Pol、Nef、Env、Tat、Rev、Tat、Vpr、Vif及Vpu，或其一抗原決定基或抗原片段。
  43. 如請求項39之方法，其中該HIV抗原包含SEQ ID NO: 11或12。
  44. 如請求項36之方法，其中該異源抗原包含一結核分枝桿菌抗原。
  45. 如請求項44之方法，其中該結核分枝桿菌抗原為Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA或RpfD，或其一抗原決定基或抗原片段。
  46. 如請求項44之方法，其中該結核分枝桿菌抗原包含以下中之多於一者：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA及RpfD，或其一抗原決定基或抗原片段。
  47. 如請求項44之方法，其中該結核分枝桿菌抗原包含以下中之多於一者：Ag85A、ESAT-6、Rv3407、Rv2626c、Rv2626c、RpfA及RpfD，或其一抗原決定基或抗原片段，其包含於一融合分子中。
  48. 如請求項44之方法，其中該結核分枝桿菌抗原包含SEQ ID NO:13。
  49. 如請求項36之方法，其中該異源抗原包含一前列腺癌抗原。
  50. 如請求項1至49中任一項之方法，其中該親本或後代CMV不表現一活性UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。
  51. 如請求項1至50中任一項之方法，其中該親本或後代CMV不表現一活性UL128或其同源物，不表現一活性UL130或其同源物，不表現一活性UL146或其同源物，且不表現一活性UL147或其同源物。
  52. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該親本或後代CMV不表現一活性UL128或其同源物，不表現一活性UL130或其同源物，不表現一活性UL146或其同源物，不表現一活性UL147或其同源物，且不表現一活性UL82或其同源物。
  53. 如請求項1至52中任一項之方法，其中該親本或後代CMV包含UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物之一缺失。
  54. 如請求項1至53中任一項之方法，其中該親本或後代CMV包含UL128或其同源物之一缺失、UL130或其同源物之一缺失、UL146或其同源物之一缺失及UL147或其同源物之一缺失。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法，其中該親本或後代CMV包含UL128或其同源物之一缺失、UL130或其同源物之一缺失、UL146或其同源物之一缺失、UL147或其同源物之一缺失及UL82或其同源物之一缺失。
  56. 如請求項1至55中任一項之方法，其中該親本或後代CMV不表現一活性UL128或其同源物，不表現一活性UL130或其同源物，不表現一活性UL146或其同源物，不表現一活性UL147或其同源物，不表現一活性UL82或其同源物，且不表現一活性UL18或其同源物。
  57. 如請求項1至56中任一項之方法，其中該親本或後代CMV進一步包含編碼一微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之一核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞或骨髓細胞中表現之一miRNA的一目標位點。
  58. 如請求項1至57中任一項之方法，其中該親本或後代CMV不表現一活性UL82或其同源物。
  59. 如請求項1至58中任一項之方法，其中該親本或後代CMV包含UL128或其同源物之一缺失、UL130或其同源物之一缺失、UL146或其同源物之一缺失、UL147或其同源物之一缺失、UL82或其同源物之一缺失及UL18或其同源物之一缺失。
  60. 如請求項1至55及57至59中任一項之方法，其中該親本或後代CMV包含UL128或其同源物之一缺失、UL130或其同源物之一缺失、UL146或其同源物之一缺失、UL147或其同源物之一缺失及UL82或其同源物之一缺失，其中該親本或後代CMV進一步包含編碼一微小RNA (miRNA)識別元件(MRE)之一核酸序列，其中該MRE含有在內皮細胞或骨髓細胞中表現之一miRNA的一目標位點。
  61. 如請求項1至60中任一項之方法，其中該親本或後代CMV包含UL82或其同源物之一缺失。
  62. 如請求項36至61中任一項之方法，其中編碼該異源抗原之該核酸置換UL128、UL130、UL146、UL147、UL82或UL18，或其同源物。
  63. 如請求項36至62中任一項之方法，其中編碼該異源抗原之該核酸置換UL82或其一同源物。
  64. 一種後代CMV，其藉由如請求項1至63中任一項之方法製造。
  65. 一種mRNA分子，其包含SEQ ID NO:14至20之核苷酸序列。
  66. 一種mRNA分子，其包含SEQ ID NO:4至10之核苷酸序列。
  67. 如請求項66之mRNA分子，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代。
  68. 如請求項66之mRNA分子，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代。
  69. 一種mRNA分子，其包含SEQ ID NO:21至27之核苷酸序列。
  70. 如請求項65至69中任一項之mRNA分子，其中該mRNA分子進一步包含一poly(A)尾。
  71. 如請求項65至69中任一項之mRNA分子，其中一poly(A)尾已添加至該mRNA分子之3'端。
  72. 如請求項65至71中任一項之mRNA分子，其中該mRNA分子係使用編碼該poly(A)尾之一雙股DNA模板製造。
  73. 如請求項72之mRNA分子，其中該雙股DNA模板為一質體。
  74. 如請求項65至73中任一項之mRNA分子，其中該poly(A)尾之長度為大致60至100個核苷酸。
  75. 如請求項65至74中任一項之mRNA分子，其中該poly(A)尾之長度為80個核苷酸。
  76. 一種mRNA分子，其包含根據SEQ ID NO:14至20之一序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代，及長度為80個核苷酸之一poly(A)尾。
  77. 一種mRNA分子，其包含根據SEQ ID NO:4至10之一序列，其中各尿苷經假尿苷取代且各胞苷經5-甲基胞苷取代，及長度為80個核苷酸之一poly(A)尾，其中該mRNA分子係使用一質體模板製造。
  78. 一種mRNA分子，其包含根據SEQ ID NO:4至10之一序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代及該mRNA分子包含長度為80個核苷酸之一poly(A)尾，其中該mRNA分子係使用一質體模板製造。
  79. 一種mRNA分子，其包含根據SEQ ID NO:21至27之一序列，其中各尿苷經5-甲氧基尿苷取代，及長度為80個核苷酸之一poly(A)尾。
  80. 如請求項70之mRNA分子，其中該poly(A)尾已在轉錄之後由一酶添加。
  81. 如請求項80之mRNA分子，其中該poly(A)尾之長度為大致50至100個核苷酸。
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