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TW202317629A - 抗ｏｘ４０單株抗體及其使用方法 - Google Patents

抗ｏｘ４０單株抗體及其使用方法 Download PDF

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TW202317629A
TW202317629A TW111124135A TW111124135A TW202317629A TW 202317629 A TW202317629 A TW 202317629A TW 111124135 A TW111124135 A TW 111124135A TW 111124135 A TW111124135 A TW 111124135A TW 202317629 A TW202317629 A TW 202317629A
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antibody
antigen
cells
human
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TW111124135A
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安德列斯 勞伊
乾 張
陸筠月
弗朗西斯科 阿德里安
連恩 施魏策爾
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香港商高誠生物醫藥（香港）有限公司
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Abstract

本發明係關於包括抗OX40抗體之組合物在內的新穎抗OX40抗體、編碼該抗OX40抗體之多核苷酸、製備該抗OX40抗體之方法以及使用該抗OX40抗體之方法。

Description

抗OX40單株抗體及其使用方法
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年6月29日申請之美國臨時專利申請案第63/216,189號之優先權及申請日的權益，其全部內容(包括以任何語言之其所有附圖及序列表)均以引用方式併入本文中。
本發明係關於包含抗OX40抗體之組合物在內的新穎抗OX40抗體、編碼該抗OX40抗體之多核苷酸、製備該抗OX40抗體之方法以及使用該抗OX40抗體治療性治療疾病之方法。 序列表之參考
本申請案含有序列表，其已以電子方式提交且以引用方式整體併入本文中。2022年6月3日創建之序列表複本名為Sequence_List_131206-00920，且大小為33,735位元組。
生物製劑之使用改善了實體瘤患者之抗腫瘤免疫反應。例如，兩種抗PD-1單株抗體：納武單抗(nivolumab) (OPDIVO®)及派姆單抗(pembrolizumab) (KEYTRUDA®)已在美國及歐洲獲批用於治療諸如不可切除、轉移性黑色素瘤及轉移性非小細胞肺癌等疾病。傳統上，此等藥物之抗腫瘤反應係藉由改善患者之無進展存活期及/或總存活期來評估。隨著醫療保健標準及期望的提高，存在對更好抗癌產品及策略之新出現的需求。
PD-1及CTLA-4在T細胞活化過程中發揮免疫抑制作用，從而抑制T細胞對腫瘤細胞之免疫功能。單株抗體可藉由阻斷此兩個免疫抑制靶標來恢復T細胞之抗腫瘤免疫反應。除了抑制該等免疫抑制檢查點外，刺激性檢查點的活化正成為新藥開發之目標。
刺激性免疫檢查點分子主要係指對T細胞活化發揮刺激作用之配位體-受體對。此等分子包括但不限於OX40、CD40、4-1BB及GITR，其屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族且在T細胞增殖、活化及分化中起作用。
OX40受體亦稱為CD134及TNFRSF4 (腫瘤壞死因子受體超家族成員4)，係TNFR超家族受體之成員。與其他組成型T細胞共刺激受體，諸如CD28不同，OX40不表現於初始T細胞上。OX40係一種次級共刺激免疫檢查點分子，其在活化後24至72小時主要表現於活化之T細胞上。類似地，OX40之配位體OX40L (CD252或TNFSF4)不在靜止的抗原呈遞細胞上表現，而是在活化後表現。OX40之表現依賴於T細胞之完全活化。
OX40與其配位體OX40L結合且藉由將TNFR分子募集至細胞內區域以形成IKKα-IKKβ及PI3k-PKB(Akt)信號傳導複合物來活化共刺激信號。OX40及TCR藉由經未知機制增加細胞內Ca 2+水準，導致NFAT進入核內而在活化核因子活化之T細胞(NFAT)信號方面具有協同作用。OX40亦經由活化PI3k/PKB及NFAT途徑、經典NF-κB1途徑或非經典NF-κB2途徑而在T細胞之活化、增強、增殖及存活中發揮關鍵作用。另外，OX40下調CTLA-4及Foxp3之表現。
OX40-OX40L複合物增強免疫反應之機制有兩個方面。首先，其藉由增強效應T細胞及記憶T細胞之活力及擴增來增加細胞介素，諸如IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ之分泌。其次，其降低調節性T細胞之免疫抑制活性，從而增加T細胞活化。在腫瘤微環境中，免疫系統之活化增加了OX40之表現、增強了效應T細胞之活化及增殖且抑制了調節性T細胞，其共同促成了複雜的抗腫瘤免疫反應。目前，臨床試驗(Clinical Trials)網站上有許多抗OX40抗體用於癌症治療之臨床試驗。
然而，仍需要更多新穎抗OX40抗體來開發新的癌症療法。
本發明提供一種新穎抗OX40抗體，其特異性結合且活化OX40以用於癌症治療。
在一個實施例中，本發明係關於一種抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含：具有重鏈CDR1域(SEQ ID NO: 1)、重鏈CDR2域(SEQ ID NO: 2)及重鏈CDR3域(SEQ ID NO: 3)之重鏈可變區；以及具有輕鏈CDR1域(SEQ ID NO: 9)、輕鏈CDR2域(SEQ ID NO: 10)及輕鏈CDR3域(SEQ ID NO: 11)之輕鏈可變區。
在另一實施例中，本發明提供一種抗體-藥物結合物，其包含本文所述之OX40抗體或其抗原結合片段及額外治療劑；較佳地，抗OX40抗體或其抗原結合片段藉由連接子與額外治療劑連接。
在一個態樣中，本發明提供編碼本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段之多核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供一種表現載體，其包含序列表中所述之多核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供一種包含本文所述之多核苷酸或本文所述之表現載體的宿主細胞。
在另一實施例中，本發明提供一種產生本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段之方法，其包括在適合於表現該抗體或其抗原結合片段之條件下培養本文所述之宿主細胞，及自培養基中回收表現之抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述之抗體-藥物結合物，或本文所述之多核苷酸，或本文所述之表現載體，及醫藥學上可接受之載劑。
在一個態樣中，本發明提供用於治療癌症的本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、本文所述之抗體-藥物結合物或本文所述之醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供治療癌症之方法，其包括向有需要之個體投與治療有效量之本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、本文所述之抗體-藥物結合物或本文所述之醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、或本文所述之抗體-藥物結合物、或本文所述之醫藥組合物在製造用於治療癌症之藥劑中的用途。
在另一態樣中，本發明提供本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、或本文所述之抗體-藥物結合物、或本文所述之醫藥組合物在製造用於治療癌症之藥物中的用途。
在一個實施例中，本發明提供本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述之抗體-藥物結合物，或本文所述之醫藥組合物，用於以下中之一或多者：抑制Treg功能(例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞(例如表現高水準OX40之細胞)、增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫性、增強T細胞功能及/或耗盡表現OX40之細胞。
在另一實施例中，本發明提供本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述之抗體-藥物結合物，或本文所述之醫藥組合物，用於製造具有以下治療機制中之一者或其組合的藥物：抑制Treg功能(例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞(例如表現高水準OX40之細胞)、增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫性、及增強T細胞功能及/或耗盡表現OX40之細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、本文所述之抗體-藥物結合物或本文所述之醫藥組合物、及一或多種額外治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述之抗體-藥物結合物，或本文所述之醫藥組合物，較佳進一步包括投藥裝置。
在某些實施例中，本發明之抗體含有其胺基酸序列之一或多個點突變，該一或多個點突變設計用於提高抗體之可開發性。在一較佳實施例中，一或多個點突變使抗體在宿主細胞中表現、製備及/或調配中之純化及/或投與至個體的過程中更穩定。在另一較佳實施例中，一或多個點突變使抗體在製備及/或調配過程中不太可能聚集。在一些其他實施例中，本發明提供具有最小化或減少的可開發性問題之治療抗體，例如，藉由替換其序列之一或多個胺基酸( 例如在其一或多個CDR中)以移除或降低疏水性及/或最佳化電荷。
本發明之一個實施例為一種單株抗體或其抗原結合片段，其可特異性結合至對應於SEQ ID NO: 33之胺基酸殘基56-74 (SEQ ID NO: 34：CSRSQNTVCRPCGPGFYN)的OX40表位。
本發明之另一實施例係關於能夠特異性結合至OX40之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段不干擾OX40與OX40配位體之結合。
本發明之另一個實施例涉及該單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段之結合不干擾OX40與OX40配位體在三聚體或多聚體聚集狀態下之結合。
本發明之另一實施例為能夠特異性結合至OX40之單株抗體或其抗原結合片段，其中抗體與OX40及內源性OX40配位體之結合一起活化刺激性信號傳導途徑。
本發明之另一實施例為根據上述實施例中任一項之的單株抗體或其抗原結合片段，其中OX40為人類OX40。
本發明之另一實施例為上述實施例中之單株抗體或其抗原結合片段，其中該表位包含SEQ ID NO:2。
本發明之另一實施例為上述實施例中之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體以約1 nM至約10 nM之K D結合至OX40。
本發明之另一實施例為根據上述實施例之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段與OX40之結合不會下調OX40之表現或降低存在於細胞表面上之OX40的量。
本發明之另一實施例為用該單株抗體治療癌症之方法，其中該癌症為實體瘤、非實體瘤或在腫瘤浸潤性T細胞之細胞表面上具有OX40表現之癌症類型。
本發明之另一實施例為經由OX40與單株抗體或其抗原結合片段之結合來偵測樣品中之OX40的方法。
本發明之另一實施例為用於確定個體中之OX40水準的方法，該方法包括： a)    自該個體獲取樣品； b)   將樣品與本發明之單株抗體或其抗原結合片段混合；及 c)    確定個體中之OX40水準， 其中樣品為組織樣品、血液樣品或腫瘤/癌症樣品。
在一個實施例中，本發明係關於一種抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含：具有重鏈CDR1域(SEQ ID NO: 1)、重鏈CDR2域(SEQ ID NO: 2)及重鏈CDR3域(SEQ ID NO: 3)之重鏈可變區；以及具有輕鏈CDR1域(SEQ ID NO: 9)、輕鏈CDR2域(SEQ ID NO: 10)及輕鏈CDR3域(SEQ ID NO: 11)之輕鏈可變區。
在另一實施例中，本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 4所示之重鏈可變區，或與SEQ ID NO: 4具有至少80%、81%、82%、83、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之重鏈可變區；以及SEQ ID NO: 12所示之輕鏈可變區，或與SEQ ID NO: 12具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性之輕鏈可變區。
在另一實施例中，本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段，其進一步包含重鏈恆定區及輕鏈恆定區；較佳地，重鏈恆定區為SEQ ID NO: 5，或與SEQ ID NO: 5具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90% 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性；及/或較佳地，輕鏈恆定區為SEQ ID NO: 13，或與SEQ ID NO: 13具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。
在另一實施例中，本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段進一步包含與重鏈可變區連接之重鏈信號肽及/或與輕鏈可變區連接之輕鏈信號肽；較佳地，重鏈信號肽為SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性；及/或較佳地，輕鏈信號肽SEQ ID NO: 14，或與SEQ ID NO: 14具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性。
在另一實施例中，本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段為IgG抗體或其抗原結合片段，或較佳IgG1抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段為單株抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，本文所述之抗OX40抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或sdAb。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段作為OX40促效劑在包含SEQ ID NO: 34、基本上由其組成或由其組成之表位處特異性結合至OX40 ( 例如人類OX40)，且基本上不影響OX40-OX40L相互作用/結合。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段在存在或不存在OX40L之情況下誘導NF-kB介導之OX40信號傳導。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段不抑制或增強(內源性) OX40L誘導之OX40信號傳導( 例如NF-kB信號傳導)，視情況，OX40信號傳導由至少約50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM或更高濃度之OX40L誘導。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段以約0.01-5 nM、0.1-0.3 nM或0.5-1.5 nM ( 例如0.65或1.36 nM)之EC50值結合至活化之原代(人類或食蟹獼猴) CD4 +CD3 +T細胞。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段以劑量依賴性方式增加活性( 例如CD3/CD28刺激之)周邊人類CD4 +T細胞上之總表面水準OX40表現( 例如具有由約1 nM之該抗體或其片段刺激之最大OX40表現)。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段劑量依賴性地增強T細胞活化。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段增加經活化人類PBMC中之細胞介素( 例如IL-2)產生；視情況，該等人類PBMC經1或10 ng/mL之 金黃色葡萄球菌腸毒素A (SEA)刺激。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段在表現OX-40之目標細胞存在下在效應細胞中劑量依賴性地誘導CD16介導之ADCC， 例如，在12:1至1:1之效應細胞與目標細胞(E:T)比下以約0.3-1.2 nM之EC50。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段在至多300 μg/mL下不會在原代PBMC中誘導顯著細胞介素釋放。
在某些實施例中，分離之單株抗體或其抗原結合片段在至少約100 mg/kg之最大可耐受劑量下不會在小鼠中誘導顯著毒性。
在一個態樣中，本發明係關於一種抗體-藥物結合物，其包含本文所述之OX40抗體或其抗原結合片段及一些額外治療劑；較佳地，抗OX40抗體或其抗原結合片段藉由連接子與額外治療劑連接。
在一個態樣中，本發明包含編碼本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段之多核苷酸。
在一個實施例中，本文所述之多核苷酸包含SEQ ID NO: 20之重鏈可變區多核苷酸編碼序列及/或SEQ ID NO: 28之輕鏈可變區多核苷酸編碼序列；較佳地，該多核苷酸進一步包含SEQ ID NO: 21之重鏈恆定區多核苷酸編碼序列及/或SEQ ID NO: 29之輕鏈恆定區多核苷酸編碼序列。
在另一實施例中，本發明係關於包含本文所述之多核苷酸的表現載體。
在另一實施例中，本發明提供一種包含本文所述之多核苷酸或本文所述之表現載體的宿主細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種產生本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段之方法，其包括在適合於表現該抗體或其抗原結合片段之條件下培養本文所述之宿主細胞，及自培養基中回收表現之抗體或其抗原結合片段。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、本文所述之抗體-藥物結合物、本文所述之多核苷酸或本文所述之表現載體，及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、本文所述之抗體-藥物結合物或本文所述之醫藥組合物用於治療癌症。在一實施例中，癌症選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌( 例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌及胃腸間質癌)、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘤、乳癌、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散黑色素瘤、惡性痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤及B細胞淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病、慢性骨髓胚細胞性白血病及移植後淋巴增生性病症(PTLD)，以及與瘢痕痣、水腫(例如與腦腫瘤相關)及梅格斯症候群(Meigs syndrome)相關之異常血管增殖、腦腫瘤及腦癌、頭頸癌，以及相關癌轉移。
在另一態樣中，本發明提供治療患有癌症之個體之方法，其包括向該個體投與治療有效量之本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、本文所述之抗體-藥物結合物或本文所述之醫藥組合物，從而治療該個體。在一個實施例中，癌症選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌( 例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌及胃腸間質癌)、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘤、乳癌、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散黑色素瘤、惡性痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤及B細胞淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病、慢性骨髓胚細胞性白血病及移植後淋巴增生性病症(PTLD)，以及與瘢痕痣、水腫(例如與腦腫瘤相關)及梅格斯症候群(Meigs syndrome)相關之異常血管增殖、腦腫瘤及腦癌、頭頸癌，以及相關癌轉移。
在一個態樣中，本發明提供本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、或本文所述之抗體-藥物結合物、或本文所述之醫藥組合物在製造另一用於治療癌症之醫藥組合物中的用途。在一個實施例中，癌症選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌( 例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌及胃腸間質癌)、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘤、乳癌、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散黑色素瘤、惡性痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤及B細胞淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病、慢性骨髓胚細胞性白血病及移植後淋巴增生性病症(PTLD)，以及與瘢痕痣、水腫(例如與腦腫瘤相關)及梅格斯症候群(Meigs syndrome)相關之異常血管增殖、腦腫瘤及腦癌、頭頸癌，以及相關癌轉移。
在一個態樣中，本發明係關於本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述之抗體-藥物結合物，或本文所述之醫藥組合物，用於以下中之一或多者：抑制Treg功能(例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞(例如表現高水準OX40之細胞)、增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫性、及增強T細胞功能及/或耗盡表現OX40之細胞。
在一個實施例中，本發明提供本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、本文所述之抗體-藥物結合物或本文所述之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療以下中之一或多者的另一醫藥組合物：抑制Treg功能(例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞(例如表現高水準OX40之細胞)、增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫性、增強T細胞功能及/或耗盡表現OX40之細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合，其包含本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、或本文所述之抗體-藥物結合物、或本文所述之醫藥組合物及一或多種額外治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包含本文所述之抗OX40抗體或其抗原結合片段、本文所述之抗體-藥物結合物或本文所述之醫藥組合物，較佳進一步包括投藥裝置。
本發明之某些實施例涉及OX40促效性抗體，其對獨特OX40表位具有特異性，因此使得與其他OX40促效性抗體相比，OX-40受體下調極少或無下調。與市場上其他已知的促效性抗體相比，所揭示之促效性抗體可展現更好的結合動力學。
所揭示之發明或相關申請可由熟習此項技術者實現以理解及組合本發明所揭示之資訊中之一者、一些或全部。以下揭示內容提供了當前發明及其相關應用之詳細描述。
若兩個序列中之核苷酸或胺基酸序列在比對完全匹配時相同，則稱兩個多核苷酸或多肽序列為「同一的」。兩個序列之間的比較通常藉由在比較窗口上比較序列以識別及比較一些局部區域之序列相似性來進行。如本文所用，「比較窗口」係指至少約20個、通常30至約75個、或40至約50個連續位置之片段，其中在兩個序列最佳比對後，一個序列可與具有相同數量之連續位置的參考序列進行比較。
完整的序列比對可使用Lasergene®生物資訊學套裝軟體(DNASTAR®, Inc., Madison, Wl)中之MegAlign®程式的預設參數進行。該程式體現了以下參考文獻中所述之若干比對方案：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff, M.O. (編) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC 第5卷, 第3增刊, 第345- 358頁；Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes 第626-645頁 Methods in Enzymology 第183卷, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins, D.G.及Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5: 151-153；Myers, E.W.及Muller W., 1988, CABIOS 4: 11-17；Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 1 1: 105；Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A.及Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J.及Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
在一些實施例中，「序列同一性百分比」係藉由比較至少20個連續核酸或胺基酸殘基上之完整序列比對來確定，其中與參考序列(不包括添加或缺失)相比，比較窗口中之多核苷酸或多肽序列部分可包含20%或更少、通常5%至15%、或10%至12%之添加或缺失( 亦即缺口)。藉由將匹配位置之數量除以參考序列中之位置總數( 亦即窗口大小)且將結果乘以100以產生序列同一性百分比來計算百分比。
或者，變異體可與天然基因或其部分或補體基本上同源。此類多核苷酸變異體能夠在中等嚴格條件下與編碼天然抗體(或互補序列)之天然存在之DNA序列雜交。
該等「中等嚴格條件」包括在5X SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃-65℃下在5X SSC中雜交隔夜；接著在65℃下用含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC洗滌兩次，持續20分鐘。
如本文所用，「高度嚴格條件」或「高嚴格度條件」為如下之彼等：(1)使用低離子強度及高溫進行洗滌，例如在50℃下使用0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交過程中使用變性劑，諸如在42℃下使用甲醯胺，例如50% (v/v)甲醯胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50 mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)及50%之750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉；或(3)在42℃下使用50%甲醯胺、5X SSC (0.75 M NaCl、0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5X鄧哈特氏溶液(Denhardt's solution)、超音波處理之鮭魚精DNA (50 Mg/mL)、0.1% SDS及10%硫酸聚葡萄糖，及在42℃下用0.2X SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)且在55℃下用50%甲醯胺洗滌，然後在55℃下用含有EDTA之0.1X SSC進行高嚴格度洗滌。熟習此項技術者將根據需要最佳化實驗條件，諸如溫度及離子強度，以適應諸如探針長度等變數。
一般熟習此項技術者將理解，由於遺傳密碼之簡併性，有許多核苷酸序列可編碼如本文所述之多肽。此等多核苷酸中之一些與任何天然基因之核苷酸序列具有最小同源性。儘管如此，本發明特別考慮了由於密碼子使用之差異而變化的多核苷酸。此外，包含本文提供之多核苷酸序列之基因的等位基因亦在本發明之範疇內。等位基因係由於一或多種突變，諸如核苷酸之缺失、添加及/或取代而改變的內源基因。所得mRNA及蛋白質可能但不必具有改變的結構或功能。可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)鑑定等位基因。
本發明之多核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學多核苷酸合成之方法為此項技術中熟知的且不需要在本文中詳細描述。熟習此項技術者可使用本文提供之序列及商業DNA合成儀來產生所需DNA序列。
對於使用重組方法製備多核苷酸，可將包含所需序列之多核苷酸插入合適的載體中，且轉而可將載體引入合適的宿主細胞中用於復制及擴增，如本文進一步所論述。可藉由此項技術中已知之任何方式將多核苷酸插入宿主細胞中。藉由直接攝取、內吞作用、轉染、F-交配或電穿孔引入外源多核苷酸來轉化該等宿主細胞。一旦引入，外源多核苷酸可作為非整合載體(諸如質體)維持在細胞內或整合至宿主細胞基因體中。如此擴增之多核苷酸可藉由此項技術中熟知的方法自宿主細胞中分離出來。參見 例如Sambrook 等人, 1989。
或者，PCR允許複製DNA序列。
RNA可藉由在適當載體中使用分離之DNA且將其插入至合適的宿主細胞中來獲得。當細胞複製且DNA被轉錄為RNA時，然後可使用熟習此項技術者熟知的方法分離RNA。
合適的選殖及表現載體可包括多種組分，諸如啟動子、增強子及其他轉錄調節序列。亦可構築載體以允許隨後將抗體可變域選殖至不同載體中。
合適的選殖載體可根據標準技術構築，或者可選自此項技術中可用之大量選殖載體。雖然所選選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞而變化，但有用的選殖載體通常具有自我複制能力，可具有特定限制性內切核酸酶之單一靶標，及/或可攜帶可用於選擇含有該載體之純系。合適的實例包括質體及細菌病毒， 例如pUC18、pUC19、Bluescript ( 例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體，諸如pSA3及pAT28。此等及許多其他選殖載體可自商業供應商，諸如BioRad、Strategene及Invitrogen處獲得。
進一步提供了表現載體。表現載體通常為含有根據本發明之多核苷酸的可複制多核苷酸構築體。隱含的表現載體必須能夠在宿主細胞中作為游離基因體或作為染色體DNA之組成部分進行複制。合適的表現載體包括但不限於質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒)、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中揭示之表現載體。載體組分通常可包括但不限於以下中之一或多者：信號序列；複製起點；一或多種標記基因；合適的轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子及終止子)。對於表現( 亦即轉譯)，通常亦需要一或多種轉譯控制元件，諸如核醣體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
含有所關注多核苷酸及/或多核苷酸本身之載體可藉由任何合適的方式引入宿主細胞中，包括電穿孔；使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他物質(諸如微粒轟擊)之轉染；脂轉染；及感染( 例如當載體為傳染性病原體，諸如牛痘病毒時)。引入載體或多核苷酸之選擇通常將取決於宿主細胞之特徵。
本發明之抗體包括藉由重組方法製備、表現、產生或分離之人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體(在下文第II部分中進一步描述)、自重組組合人類抗體文庫中分離之抗體(在下文第III部分中進一步描述)、自人類免疫球蛋白基因轉殖基因動物( 例如小鼠)中分離之抗體，參見 例如(Taylor, LD 等人. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295)；或關於藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列之任何其他方法製備、表現、產生或分離的抗體。此類重組人類抗體具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區(參見Kabat, EA 等人. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, USDepartment of Health and Human Services, NIH公開號91-3242)。
本發明之抗體或抗體部分可藉由在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈基因及重鏈基因來製備。為了重組表現抗體，用一或多種重組表現載體轉染宿主細胞，該一或多種重組載體攜帶編碼抗體之免疫球蛋白輕鏈及重鏈之DNA片段，使輕鏈及重鏈在宿主細胞中表現，且較佳分泌至培養宿主細胞之培養基中，從中可回收抗體。使用標準重組DNA方法獲得抗體重鏈基因及抗體輕鏈基因，將此等基因引入重組表現載體中，且接著將載體引入宿主細胞中。例如，標準方法為以下文獻中所述之方法：Sambrook, Fritsch及Maniatis (編者), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989)，Ausubel, FM 等人(編者) Current Protocols in Molecuar Biology, Greene Publishing Associates, (1989)及Boss 等人. 美國專利第4,816,397號。
可使用合適的宿主細胞重組製備抗體或其抗原結合片段。可將編碼抗體或其抗原結合片段之多核苷酸選殖至表現載體中，然後可將其引入宿主細胞，諸如大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，其中該細胞不另外產生免疫球蛋白以在重組宿主細胞中實現抗體合成。較佳宿主細胞包括此項技術中熟知的許多細胞中之CHO細胞、人類胎腎(HEK) 293細胞或Sp2.0細胞。
抗體片段可藉由全長抗體之蛋白水解或其他降解、重組方法或化學合成來產生。抗體之多肽片段，尤其是至多約50個胺基酸之較短多肽，可藉由化學合成方便地製備。蛋白質及肽之化學合成方法係此項技術中已知的且為可商購的。
本發明之抗體或其抗原結合片段可為親和力成熟的。例如，親和力成熟的抗體可藉由此項技術中已知的程序產生(Marks 等人, 1992, Bio/Technology, 10:779-783；Barbas 等人, 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91 :3809-3813；Schier 等人, 1995, Gene, 169: 147-155；Yelton 等人, 1995, J. Immunol., 155:1994-2004；Jackson 等人, 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9；Hawkins 等人, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896；及WO2004/058184)。 抗體變異體
在某些實施例中，考慮了本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。例如，可能需要提高抗體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼抗體之核苷酸序列中，或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內殘基之缺失、插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，條件為最終構築體具有所需特徵， 例如抗原結合。
在某些實施例中，本發明之抗體含有其胺基酸序列之一或多個點突變，該一或多個點突變設計用於提高抗體之可開發性。例如，Raybould 等人, 「Five computational developability guidelines for therapeutic antibody profiling」, PNAS, 2019年3月5日, 116 (10) 4025-4030描述了其治療性抗體分析工具(TAP)，該工具係一個為可變域序列之可下載同源模型建立之計算工具，其根據五個可開發性指南進行測試，且報告潛在的序列責任及規範形式。作者進一步提供了TAP，其可在opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/TAP.php免費獲得。除了獲得所需抗原親和力外，治療性單株抗體之開發亦存在許多障礙，包括先天免疫原性、化學及構形不穩定性、自締合、高黏度、多特異性及不佳表現。例如，高水準之疏水性(尤其在高度可變的互補決定區(CDR)中)反復與聚集、黏度及多特異性有關。重鏈及輕鏈可變域之淨電荷不對稱亦與高濃度下之自締合及黏度有關。CDR中帶正電及帶負電的斑塊與高清除率及低表現量有關。產物異質性(例如藉由氧化、異構化或醣基化)通常由易於轉譯後或共轉譯修飾之特定序列模體引起。計算工具可用於促進序列責任的識別。Warszawski亦描述了經由可變輕鏈-重鏈界面之自動化設計來最佳化抗體親和力及穩定性的方法。Warszawski 等人. (2019) Optimizing antibody affinity and stability by the automated design of the variable light-heavy chain interfaces, PLoS Comput Biol 15 (8): e1007207, https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1007207。可使用其他方法來識別候選抗體之潛在可開發性問題，且在本發明之一個較佳實施例中，可藉由習知方法將一或多個點突變引入候選抗體以解決此類問題，從而獲得本發明之最佳化治療抗體。 a) 取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供了具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。取代突變誘發之所關注位點包括HVR及FR。保守取代顯示在表A中之「較佳取代」標題下。在表A中之「例示性取代」標題下提供了更多實質性變化，且如下文參考胺基酸側鏈類別所進一步描述。可將胺基酸取代引入所關注抗體，且篩選產物以獲得所需活性， 例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。 表A
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據其共同側鏈特徵進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin； (3) 酸性：Asp、Glu； (4) 鹼性：His、Lys、Arg； (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將此等類別中之一個成員替換為另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體( 例如人類化或人類抗體)之一或多個高變殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物學特性( 例如增加的親和力、降低的免疫原性)方面具有修飾( 例如改良)及/或將基本上保留親本抗體之某些生物學特性。例示性取代變異體為親和力成熟的抗體，其可方便地產生， 例如使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術，諸如本文所述之彼等。簡言之，一或多個HVR殘基經突變，且變異體抗體將展示於噬菌體上且針對特定生物活性( 例如結合親和力)進行篩選。
可在HVR中進行改變( 例如取代)， 例如以提高抗體親和力。此類改變可在HVR「熱點」中進行， 亦即由在體細胞成熟過程中經歷高頻突變之密碼子編碼的殘基(參見 例如Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207: 179-196 (2008))，及/或接觸抗原之殘基，且測試所得變異體VH或VL之結合親和力。藉由自二級文庫構築及重新選擇進行之親和力成熟已描述於 例如Hoogenboom 等人. Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien 等人編, Human Press, Totowa, NJ, (2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法( 例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)將多樣性引入選擇用於成熟之可變基因中。接著創建輔助文庫。接著篩選文庫以鑑定具有所需親和力之任何抗體變異體。另一種引入多樣性之方法涉及HVR定向方法，其中若干HVR殘基( 例如一次4-6個殘基)係隨機的。可特異性鑑定參與抗原結合之HVR殘基， 例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化。CDR-H3及CDR-L3尤其經常成為目標。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可在一或多個HVR內發生，只要此類改變不會顯著降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可在HVR中進行不會顯著降低結合親和力之保守改變( 例如本文提供之保守取代)。例如，此類改變可在HVR中之抗原接觸殘基之外。在上文提供之變異體VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑定可作為突變誘發目標之抗體殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989) Science, 244: 1081-1085所述。在此方法中，一個殘基或一組目標殘基( 例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)被鑑定且經中性或帶負電胺基酸( 例如丙胺酸或聚丙胺酸)替換，以確定抗體-抗原相互作用是否受到影響。可在展現對初始取代之功能敏感性的胺基酸位置處引入另外的取代。或者或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構可用於鑑定抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及相鄰殘基可作為取代候選物被靶向或消除。可篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽範圍內的胺基及/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺酰基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N或C末端與增加抗體血清半衰期之酶( 例如用於ADEPT)或多肽的融合物。 b) 醣基化變異體
在某些實施例中，改變本文提供之抗體以增加或減少抗體醣基化之程度。對抗體之醣基化位點的添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以產生或移除一或多個醣基化位點來方便地完成。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物。哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支的雙觸角寡醣，該寡醣通常藉由N鍵連接至Fc區之CH2域的Asn297。參見 例如Wright 等人. TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物， 例如甘露糖、N-乙酰葡萄胺糖(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及在雙觸角寡醣結構之「莖」中與GlcNAc連接之岩藻醣。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以產生具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個實施例中，所提供之抗體變異體具有碳水化合物結構，該碳水化合物結構缺乏對Fc區之直接或間接岩藻醣連接能力。例如，此類抗體中岩藻醣之量可在1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%範圍內。岩藻醣之量由Asn297糖鏈內岩藻醣之平均量與連接至Asn297之所有糖結構(例如複合、雜合及高甘露糖結構)之和的比率確定，如藉由例如WO 2008/077546中所述之MALDI-TOF質譜法量測。Asn297係指位於Fc區中約位置297處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，由於抗體之微小序列變異，Asn297亦可能位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處， 亦即位置294與300之間。此類岩藻醣基化變異體可具有改良之ADCC功能。參見 例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)；US2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去岩藻醣基化」或「岩藻醣缺陷」抗體變異體相關之出版物之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki 等人. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki 等人. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)。能夠產生去岩藻醣基化抗體之細胞株之實例包括蛋白質岩藻醣基化缺陷的Led 3 CHO細胞(Ripka 等人. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 Al號, Presta, L；及WO 2004/056312 Al, Adams 等人)，及剔除細胞株，諸如α-l,6-岩藻糖基轉移酶基因、FUT8、剔除CHO細胞(參見 例如Yamane-Ohnuki 等人. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. 等人., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及WO2003/085107)。
抗體變異體進一步具有二等分的寡醣， 例如其中與抗體之Fc區連接之雙觸角寡醣被GlcNAc二等分。此類抗體變異體可具有減少之岩藻醣基化及/或改良之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於 例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)；美國專利第6,602,684號(Umana 等人)；及US 2005/0123546 (Umana 等人)中。亦提供在與Fc區連接之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變異體。此類抗體變異體可具有改良之CDC功能且描述於 例如WO 1997/30087(Patel 等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)中。 c) Fc 區變異體
在某些實施例中，可將一或多種胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含具有一或多個胺基酸修飾( 例如取代)之人類Fc區序列( 例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明考慮一種抗體變異體，該抗體變異體具有一些但並非所有效應功能，此使其成為以下應用之理想候選者：其中抗體之 活體內半衰期係重要的，但某些效應功能(諸如補體及ADCC)係不必要或有害的。可進行 活體外及/或 活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。例如，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上FcR之表現總結於Rav etch及Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)之第464頁的表3中。用於評估所關注分子之ADCC活性之 活體外分析的非限制性實例描述於以下各者中：美國專利第5,500,362號(參見 例如Hellstrom, I. 等人. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I 等人., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82: 1499- 1502 (1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann, M. 等人., Exp. Med. 166: 1351-1361 (1987))。或者，可使用非放射性分析方法(參見例如流式細胞分析技術之ACT I™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及CytoTox 96非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI)))。用於此類分析之有用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可在 活體內評估所關注分子之ADCC活性， 例如在諸如Clynes 等人Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中揭示之動物模型中。亦可進行Clq結合分析以確認抗體不能結合Clq且因此缺乏CDC活性。參見 例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之Clq及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro 等人, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)；Cragg, M.S. 等人, Blood 101 : 1045-1052 (2003)；以及Cragg, M.S.及M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004))。FcRn結合及 活體內清除/半衰期測定亦可使用此項技術中已知之方法進行(參見 例如Petkova, S.B. 等人, Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006))。
效應子功能降低之抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代之彼等(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處之取代，包括將殘基265及297取代為丙胺酸之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
描述了與FcR結合能力提高或降低之某些抗體變異體。(參見 例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields 等人, Biol. Chem. 9(2): 6591- 6604 (2001))。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代， 例如在Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號)的Fc區。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變，從而導致改變的( 亦即提高的或降低的) Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)， 例如在美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie 等人. J.Tmmunol. 164: 4178-4184 (2000)中所述。
具有增加的半衰期及改良的與新生兒Fc受體(FcRn)之結合的抗體描述於US2005/0014934A1 (Hinton 等人). The FcRn is responsible for the transfer of maternal IgGs to the fetus (Guyer 等人, Immunol. 117:587 (1976)及Kim 等人, Immunol. 24:249 (1994))中。彼等抗體包含具有一或多個取代之Fc區，該一或多個取代提高Fc區與FcRn之結合能力。此類Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者處具有取代之彼等：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434， 例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。
亦參見Duncan及Winter, Nature 322:738-40 (1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351中Fc區變異體之實例。 d) 半胱胺酸工程化抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程化抗體， 例如「thioMAb」，其中該等抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在一個實施例中，經取代之殘基存在於抗體之一些可接近位點。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此定位於抗體之可接近位點且可用於將抗體結合至其他部分，諸如藥物部分或連接子-藥物部分以產生免疫結合物，如本文進一步所描述。在另一實施例中，以下殘基中之任何一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。半胱胺酸工程化抗體可如 例如美國專利第7,521,541號中所述地產生。 e) 抗體衍生物
在某些實施例中，本文提供之抗體可進一步經修飾以含有此項技術中已知且容易獲得的額外非蛋白質部分。適用於抗體衍生化之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-l,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、聚葡萄糖或聚(η-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇( 例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中之穩定性而在製造中可能具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為支鏈或非支鏈的。連接至抗體之聚合物的數量可能不同，且若連接之聚合物超過一種，則其可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物的數量及/或類型可基於包括但不限於以下之考慮因素確定：待改良之特定抗體特性或功能、抗體衍生物是否將用於限定條件下之治療 等。
在一個實施例中，提供了抗體及非蛋白質部分之結合物，其中非蛋白質部分可藉由暴露於輻射而選擇性地加熱。在另一實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。輻射可為任何波長，包括但不限於不損害正常細胞但可將抗體-非蛋白質部分之溫度升高至殺死抗體-非蛋白質部分附近之細胞的溫度。 分析
本文提供之抗OX40抗體可藉由此項技術中已知之各種分析來鑑定、篩選或表徵其物理/化學特性及/或生物活性。 1. 結合分析及其他分析
在一個態樣中，本文所述之抗體的抗原結合活性係藉由已知方法，諸如ELISA、西方墨點法 等量測。OX40結合能力可使用此項技術中已知之方法確定，且例示性方法揭示於本文中。在一個實施例中，例示性放射免疫分析用於量測抗原-抗體結合。OX40抗體經碘化，且製備含有固定濃度之碘化抗體及遞減濃度之連續稀釋、未標記OZ X40抗體的競爭反應混合物。將表現OX40之細胞( 例如用人類OX40穩定轉染之BT474細胞)添加至反應混合物中。培育後，將游離的碘化OX40抗體洗掉。細胞結合之碘化OX40抗體係藉由 例如計數與細胞相關之放射性及使用標準方法確定之結合親和力來量測。在另一實施例中，用流式細胞分析技術量測OX40抗體與OX40表面表現細胞( 例如T細胞亞群)之結合能力。獲得周邊白血球( 例如自人類、食蟹獼猴、大鼠或小鼠)，且用血清封閉細胞。以連續稀釋形式添加標記之OX40抗體，且對T細胞進行染色以鑑定T細胞亞群(使用此項技術中已知之方法)。在培育及洗滌之後，藉由流式細胞分析技術分選細胞，且使用此項技術中熟知之方法分析資料。在另一實施例中，可使用表面電漿子共振來分析OX40結合能力。舉例說明了例示性表面電漿子共振方法。
在另一態樣中，競爭分析可用於鑑定與本文揭示之抗OX40抗體中之任一者競爭的OX40結合抗體。在某些實施例中，此類競爭抗體結合至與本文揭示之抗OX40抗體相同的表位( 例如線性或構形表位)。用於抗體結合表位作圖之詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」, Methods in Molecular Biology 第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。舉例說明了競爭分析。
在例示性競爭ELISA分析中，將固定化OX40在包含第一經標記抗OX40抗體( 例如mab 1A7.gr.1、mab 3C8.gr5)及正在測試其與第一抗OX40抗體競爭之能力的第二未標記抗體的溶液中培育。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，將固定OX40在包含第一經標記抗OX40抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中培育。培育後，在允許OX40結合第一經標記抗OX40抗體之適當條件下，移除過量的未結合抗體，且量測與固定OX40相關之信號量。若測試樣品中偵測到的信號顯著低於對照，則表明第二抗體與第一抗體競爭結合至固定OX40。參見Harlow及Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。 2. 活性分析
在一個實施例中，提供了一種偵測具有生物活性之抗OX40抗體之方法。生物活性可包括 例如結合OX40( 例如結合人類及/或食蟹獼猴OX40)；增加OX40介導之信號轉導( 例如增加NFkB介導之轉錄)；耗盡表現人類OX40之細胞( 例如T細胞)；藉由ADCC及/或吞噬作用耗盡表現人類OX40之細胞；增強T效應細胞功能( 例如CD4 +效應T細胞)， 例如藉由增加效應T細胞增殖及/或增加效應T細胞產生之細胞介素( 例如γ干擾素)；增強記憶T細胞功能( 例如CD4 +記憶T細胞)， 例如藉由增加記憶T細胞增殖及/或增加記憶T細胞產生之細胞介素( 例如γ干擾素)；抑制調節性T細胞功能， 例如藉由減少效應T細胞功能( 例如CD4 +效應T細胞功能)之Treg抑制；及結合人類效應細胞。本文亦提供在 活體內及/或 活體外具有此類生物活性之抗體。
在某些實施例中，測試本發明之抗體的此類生物活性。
本文舉例說明了此項技術中已知的用於量測T細胞共刺激之方法。例如，T細胞( 例如記憶或效應T細胞)可自周邊白血球獲得( 例如使用Ficoll梯度離心自人類全血中分離)。記憶T細胞( 例如CD4 +記憶T細胞)或效應T細胞( 例如CD4 +Teff細胞)可使用此項技術中已知之方法自PBMC中分離。例如，可使用Miltenyi CD4 +記憶T細胞分離套組或Miltenyi初始CD4 +T細胞分離套組。分離之T細胞在抗原呈遞細胞( 例如表現CD32及CD80之輻照L細胞)存在下培養，且在存在或不存在OX40促效劑抗體之情況下藉由補充抗CD3抗體而活化。可藉由使用此項技術中熟知之方法量測促效劑OX40抗體對T細胞增殖的效應。例如，可使用CellTiter Glo套組(Promega)，且在Multimode Plate Reader (Perkin Elmer)上讀取結果。或者，促效劑OX40抗體對T細胞功能之效應亦可藉由分析T細胞產生之細胞介素來確定。在一個實施例中，CD4 +T細胞產生之干擾素γ 例如藉由量測細胞培養上清液中之干擾素γ來確定。用於量測干擾素γ之方法係此項技術中熟知的。
本文舉例說明了此項技術中已知的用於量測Treg細胞功能之方法。在一個實施例中，分析了Treg抑制效應T細胞增殖的能力。使用此項技術中已知之方法( 例如分離記憶T細胞或初始T細胞)自人類全血中分離T細胞。純化之CD4 +初始T細胞經標記( 例如用CFSE)，且純化之Treg細胞用不同的試劑標記。輻照抗原呈遞細胞( 例如表現CD32及CD80之L細胞)與經標記純化初始CD4 +T細胞及純化Treg共培養。使用抗CD3抗體活化共培養物，且在存在或不存在促效劑OMO抗體之情況下進行測試。在合適的時間( 例如共培養6天)後，使用FACS分析藉由染料稀釋在減少之標記染色( 例如減少之CFSE標記染色)中追蹤CD4 +初始T細胞增殖水準。
本文舉例說明了此項技術中已知的用於量測OX40信號傳導之方法。在一個實施例中，產生了表現OX40及其報導基因(包括與報導基因( 例如β螢光素酶)融合之NFkB啟動子的轉殖基因細胞。可使用報導基因分析來量測由增加之OX40促效劑抗體引起的增加之NFkB轉錄。
例如，吞噬作用可藉由使用單核球衍生之巨噬細胞或U937細胞(具有成熟巨噬細胞之形態及特徵的人類組織細胞淋巴瘤細胞株)來量測。在存在或不存在抗OX40促效劑抗體之情況下，將表現OX40之細胞添加至單核球衍生之巨噬細胞或U937細胞中。在將細胞培養合適的時段後，吞噬作用之百分比由具有1)巨噬細胞或U937細胞及2)表現OX40之細胞之雙重染色標記之細胞數與具有OX40表現標記( 例如GFP)之細胞總數的比率確定。可藉由流式細胞分析技術或螢光顯微術進行分析。
用於量測ADCC之方法為此項技術中熟知的且在定義部分中舉例說明。在一些實施例中，表現OX40之細胞中之OX40水準係藉由ADCC分析來表徵。可用經標記抗OX40抗體( 例如經PE標記)對細胞進行染色，然後使用流式細胞分析技術測定螢光水準，且將結果呈現為中值螢光強度(MFI)。在另一實施例中，ADCC可藉由CellTiter Glo分析套組進行分析，且細胞活力/細胞毒性可藉由化學發光來確定。
各種抗體對Fc γ RIA、Fc γ RIIA、Fc γ RIIB及Fc γ RIIIA (F158及V158)之結合親和力可藉由使用各別重組Fc受體的基於ELISA之配位體結合分析來量測。純化人類Fcγ受體以融合蛋白之形式表現，該融合蛋白含有受體γ鏈之胞外域，該鏈與C末端之Gly/6xHis/麩胱甘肽S-轉移酶(GST)多肽標籤相連。如下評估抗體與彼等人類Fcγ受體之結合親和力。對於低親和力受體， 亦即Fc γRIIA(CD32A)、Fc γRIIB(CD32B)及Fe γRIIIA(CD16)，以及Fe γRIIIA (CD 16)之兩種同種異型F-158及V-158，抗體可藉由與山羊抗人類κ鏈(ICN Biomedical; Irvine, CA)之F(ab')2片段以約1:3之抗體:交聯F(ab')2莫耳比交聯而作為多聚體進行測試。盤塗有抗GST抗體(Genentech)且用牛血清白蛋白(BSA)封閉。使用ELx405™盤洗滌器(Biotek Instruments; Winooski, VT)用含有0.05% Tween-20之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌後，將Fcγ受體以25 ng/孔添加至盤中，且在室溫下培育1小時。洗滌後，以多聚體複合物之形式添加一系列稀釋測試抗體，且將盤在室溫下培育2小時。在洗滌盤以移除未結合抗體後，用山羊抗人類F(ab')2 (Jackson ImmunoResearch Laboratories; West Grove, PA)之辣根過氧化物酶(HRP)結合之F(ab')2片段，然後添加受質四甲基聯苯胺(TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories; Gaithersburg, MD)來偵測與Fcγ受體結合之抗體。取決於所測試之Fcγ受體，將盤在室溫下培育5-20分鐘，以允許顯色。用1 M H3P04終止反應，且用酶標儀(SpectraMax® 190, Molecular Devices; Sunnyvale, CA)量測450 nm處之吸光度。劑量-反應結合曲線係藉由針對抗體濃度繪製抗體稀釋液複本之平均吸光度值而生成。在使用SoftMax Pro (Molecular Devices)用四參數方程式擬合結合曲線後，確定與Fcγ受體結合之半最大有效濃度(EC50)。
與對照相比，藉由例如碘化丙啶(PI)、台盼藍或7AAD攝取量測之細胞膜完整性損失來選擇誘導細胞死亡之抗體。可在不存在補體及免疫效應細胞之情況下進行PI攝取分析。將表現OX40之細胞與單獨的培養基或含有約10μg/ml適當單株抗體之培養基一起培育。將細胞培育一段時間( 例如1或3天)。每次處理後，洗滌細胞且分裝。在一些實施例中，將細胞等分至蓋有35 mm過濾器蓋之12×75管(每管1ml，每個處理組3個管)中以移除細胞團。將PI溶液以10 μg/ml添加至各管中。可使用FACSCAN™流式細胞儀及FACSCONVERT™ CellQuest軟體(Becton Dickinson)分析樣品。
用於任何上述 活體外分析之細胞包括天然表現OX40或已經工程改造以表現OX40之細胞或細胞株。此類細胞包括天然表現OX40之活化T細胞、Treg細胞及活化記憶T細胞。此類細胞亦包括表現OX40之細胞株及通常不表現OX40但已用編碼OX40之多核苷酸轉染之細胞株。本文提供的用於任何上述 活體外分析之例示性細胞株包括表現人類OX40之轉殖基因BT474細胞(人類乳癌細胞株)。
應理解，本發明之免疫結合物可用於替代或補充用於任何上述分析之抗OX40抗體。
應理解，抗OX40抗體及一些其他治療劑可用於任何上述分析。 調配物及用途
本發明之抗體或其抗原結合片段可調配為醫藥組合物。醫藥組合物可進一步包含呈凍乾調配物或水溶液形式之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑(Remington: The Science and practice of Pharmacy第20版, 2000, Lippincott Williams and Wilkins, K. E. Hoover編)。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在給定劑量及濃度下對接受者無毒，且可包含緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲氯銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物( 例如鋅-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。本文進一步描述醫藥學上可接受之賦形劑。
本發明之抗體或其抗原結合片段可用於各種治療或診斷目的。例如，本發明之抗體或其抗原結合片段可用作親和純化劑( 例如用於 活體外純化)及診斷劑( 例如用於偵測特定細胞、組織或血清中之表現)。
本發明之抗體或其抗原結合片段之例示性治療用途包括治療癌症。本發明之抗體或其抗原結合片段亦可用於預防疾病。
對於治療應用，本發明之抗體或其抗原結合片段可藉由習知技術投與至哺乳動物，尤其是人類，諸如靜脈內(作為推注或藉由在一段時間內之連續輸注)、肌內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或藉由吸入。本發明之抗體或其抗原結合片段亦可藉由腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內或病灶周圍途徑投與。
在某些實施例中，皮下投與本發明之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，靜脈內投與本發明之抗體或其抗原結合片段。
醫藥組合物可以可隨疾病嚴重程度變化之頻率投與至有需要之個體。在預防性治療的情況下，頻率可根據個體對疾病之易感性或傾向性而變化。
可將組合物作為推注或藉由連續輸注投與至有需要之患者。例如，以Fab片段形式呈現之抗體的推注投與量可為0.0025至100 mg/kg體重、0.025至0.25 mg/kg、0.010至0.10 mg/kg或0.10-0.50 mg/kg。對於連續輸注，呈現為Fab片段之抗體可以0.001至100 mg/kg體重/分鐘、0.0125至1.25 mg/kg/min、0.010至0.75 mg/kg/min、0.010至1.0 mg/min或0.10-0.50 mg/kg/min投與，持續1-24小時、1-12小時、2-12小時、6-12小時、2-8小時或1-2小時之時段。
對於全長抗體(具有完整恆定區)，投與劑量範圍可為約1 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約3 mg/kg至約10 mg/kg、約4 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約2 mg/kg至約20 mg/kg、約3 mg/kg至約20 mg/kg、約4 mg/kg至約20 mg/kg、約5 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg或更大、約2 mg/kg或更大、約3 mg/kg或更大、約4 mg/kg或更大、約5 mg/kg或更大、約6 mg/kg或更大、約7 mg/kg或更大、約8 mg/kg或更大、約9 mg/kg或更大、約10 mg/kg或更大、約11 mg/kg或更大、約12 mg/kg或更大、約13 mg/kg或更大、約14 mg/kg或更大、約15 mg/kg或更大、約16 mg/kg或更大、約17 mg/kg或更大、約19 mg/kg或更大、或約20 mg/kg或更大。根據病況之嚴重程度，投與頻率範圍可為每週三次至每二或三週一次。
另外，組合物可皮下投與。例如，可每週兩次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、每月兩次、每月一次、每兩個月一次、或每三個月一次地向個體皮下或靜脈內投與1至100 mg抗OX40抗體之劑量。
在某些實施例中，抗OX40抗體在人體中之半衰期為約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天、約5天至約40天、約5天至約35天、約5天至約30天、約5天至約25天、約10天至約40天、約10天至約35天、約10天至約30天、約10天至約25天、約15天至約40天、約15天至約35天、約15天至約30天、或約15天至約25天。
在某些實施例中，醫藥組合物可以如下劑量每2-6週皮下或靜脈內投與：約0.1 mg/kg至約10 mg/kg、約0.5 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1.5 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約0.1 mg/kg至約8 mg/kg、約0.5 mg/kg至約8 mg/kg、約1 mg/kg至約8 mg/kg、約1.5 mg/kg至約8 mg/kg、約2 mg/kg至約8 mg/kg、約0.1 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約1.5 mg/kg至約5 mg/kg、約2 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1.0 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2.0 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3.0 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4.0 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5.0 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6.0 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7.0 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8.0 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9.0 mg/kg、約9.5 mg/kg、或約10.0 mg/kg。
在一個實施例中，醫藥組合物以約2.0 mg/kg之劑量每2-6週皮下或靜脈內投與。在另一實施例中，醫藥組合物以約2.0 mg/kg至約10.0 mg/kg之劑量每2-6週皮下或靜脈內投與。
在一個例示性實施例中，醫藥組合物每2週皮下投與。
本發明之抗體或其抗原結合片段可單獨使用或與其他療法組合用於治療癌症。 定義
除非本文另有定義，否則與本發明結合使用之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常理解的含義。此外，除非說明書中另有說明，否則單數術語應包括複數，且複數術語應包括單數。一般而言，如本文所述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、蛋白質及核酸化學以及雜交相關的術語及技術為一般熟習此項技術者熟知及常用的。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」(或簡稱為「抗體部分」或「抗體片段」)係指全長抗體之一或多個片段，其保留特異性結合至抗原之能力(較佳具有基本相同的結合親和力)。抗原結合片段之實例包括(i) Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，一種包含在鉸鏈區藉由二硫鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段，(v) dAb片段(Ward 等人, (1989) Nature 341 :544-546)，其由VH域組成；及(vi)分離之互補決定區(CDR)、二硫鍵連接之Fv (dsFv)及抗獨特型(anti-Id)抗體及內體。此外，儘管Fv片段之兩個域VL及VH由兩個不同的基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接子連接，使其能夠成為單一蛋白質鏈，其中VL及VH區配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv))；參見 例如Bird 等人. Science 242:423- 426 (1988)及Huston 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)。亦包括其他形式之單鏈抗體，諸如雙抗體。雙抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域在單一多肽鏈上表現，但使用之連接子太短而無法在同一鏈上之兩個域之間配對，從而迫使該等域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點(參見 例如Holliger 等人. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)；Poljak 等人, 1994, Structure 2: 1121-1123)。
如本文所用，術語抗體之「可變域」係指單獨或組合之抗體輕鏈可變區(VL)或抗體重鏈可變區(VH)。如此項技術中已知的，重鏈及輕鏈的可變區各自由三個互補決定區(CDR)組成且藉由四個框架區(FR)連接，其有助於形成抗體之抗原結合位點。
可變域中之殘基係根據Kabat編號進行編號，Kabat編號為用於抗體之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號方案。參見Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)。使用此編號系統，實際線性胺基酸序列可含有更少或額外的對應於可變域之FR或CDR之縮短或插入的胺基酸。對於給定抗體，殘基之Kabat編號可經由抗體與「標準」Kabat序列之比對由一或多個同源區確定。可使用各種分配Kabat編號之演算法。除非另有說明，否則本文使用之演算法為2012年發布的Abysis (abysis dot org)。
抗體之某些特定胺基酸殘基(諸如互補位殘基)之位置亦由Kabat編號確定。
術語「互補決定區」(CDR)可藉由熟知的Kabat、Chothia、Kabat及Chothia之累積、AbM、接觸及/或構形之定義或任何CDR量測方法之定義來識別。參見 例如Kabat 等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版(高度可變區)；Chothia 等人, 1989, Nature 342:877-883 (結構環結構)。CDR之AbM定義係Kabat及Chothia與Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體(Accelrys®)之使用之間的折衷。CDR之「接觸」定義係基於觀測到的抗原接觸，如MacCallum 等人, 1996, J. Mol. Biol., 262:732- 745中所闡述。CDR之「構形」定義係基於對抗原結合產生焓貢獻之殘基(參見 例如Makabe 等人, 2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1 156-1 166)。其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍將與Kabat CDR定義之至少一部分重疊。若特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合，則此等區域可基於預測或實驗結果縮短或延長。如本文所用，CDR可基於此項技術中已知之任何定義方法，包括不同方法之組合。
術語「表位」係指抗體特異性結合之抗原(Ag)區域或區， 例如包含與抗體(Ab)相互作用之胺基酸殘基之區域或區。表位可為線性的或非線性的( 例如構形的)。
當對應抗體或其抗原結合片段之結合相互排斥時，抗體或其抗原結合片段基本上結合至另一抗體或其抗原結合片段之相同表位。亦即，一種抗體或其抗原結合片段之結合排除了其他抗體或其抗原結合片段之同時或連續結合。若抗原能夠同時結合至對應抗體或其抗原結合片段，則稱表位為獨特的或基本不相同的。
術語「互補位」源自上述「表位」之定義，且係指抗原結合之抗體區域或區， 例如包含與抗原相互作用之殘基之區域或區。互補位可為線性的或構形的(例如CDR中之不連續殘基)。
給定抗體/抗原結合對之表位/互補位可使用多種實驗及計算表位作圖方法在不同的細節水準上定義及表徵。此等方法包括突變誘發、X射線結晶學、核磁共振(NMR)光譜法、氫/氘交換質譜法(HX-MS)及各種競爭性結合方法。由於此等方法中之每一者均依賴於獨特的抗體-抗原結合，因此表位之描述與確定其之方法密切相關。因此，給定抗體/抗原對之表位/互補位將根據所採用之作圖方法而不同地定義。
在最詳細層面上，抗體(Ab)與抗原(Ag)之間相互作用之表位/互補位可基於Ag-Ab結合過程中原子相互作用之空間座標，以及關於其對結合熱力學之相對貢獻的資訊。在一個層面上，表位/互補位殘基可藉由Ag與Ab之間原子相互作用之空間座標來表徵。在一個態樣中，表位/互補位殘基可藉由特定標准， 例如Ab與Ag之間的原子距離( 例如等於或小於同源抗體之重原子與抗原之重原子之間的距離之距離)來定義。在另一態樣中，表位/互補位殘基可基於其參與氫鍵與同源抗體/抗原或亦與同源抗體/抗原氫鍵合(水介導之氫鍵合)之水分子之間的相互作用來表徵。在另一態樣中，表位/互補位殘基可表徵為與同源抗體/抗原之殘基形成鹽橋。在另一態樣中，表位/互補位殘基可表徵為由於與同源抗體/抗原相互作用而在埋藏表面積(BSA)中具有非零變化之殘基。在不太詳細的層面上，表位/互補位可基於其功能， 例如藉由與其他Ab之競爭結合來表徵。表位/互補位亦可更一般地定義為包含胺基酸殘基，其經另一胺基酸取代將改變Ab與Ag之間相互作用的特徵( 例如丙胺酸掃描)。
自表位之描述及定義取決於用於表位作圖之方法及不同細節層面之資訊的事實來看，因此相同Ag上不同Ab之表位比較可類似地在不同細節層面上進行。例如，在胺基酸層面上，自X射線結構確定的具有相同胺基酸殘基組之表位據稱係相同的。
若對應抗體之結合係互斥的， 亦即一種抗體之結合排除了另一抗體之同時或連續結合，則以競爭性結合為特徵之表位據稱係重疊的；且若抗原可同時與兩種對應抗體結合，則表位據稱係獨立的(獨特的)。
可經由一些常規方法鑑定給定抗體/抗原對之表位及互補位。例如，表位之一般位置可藉由評估抗體與不同片段或變異體多肽結合之能力來確定，如前文其他地方所更全面描述。OX40內與抗體內之其他特定殘基接觸之特定殘基亦可使用常規方法確定。例如，抗體/抗原複合物可為結晶的。晶體結構可經確定且用於識別抗體與抗原之間的特定相互作用位點。
術語「特異性地結合」及「特異性結合」在此項技術中係熟知的，確定此類特異性結合之方法亦如此。若一個分子與特定細胞或物質的反應或結合比其與替代細胞或物質的反應或結合更頻繁、更迅速、持續時間更長及/或親和力更大，則稱其表現出「特異性結合」。若抗體或其抗原結合片段以比其與其他物質結合更大的親和力、親合力、更容易及/或更長的持續時間結合，則其「特異性結合」至靶標。
例如，特異性結合至OX40之抗體或其抗原結合片段為以比其結合至其他抗原更大的親和力、親合力、更容易及/或更長的持續時間結合至其同源抗原的抗體或其抗原結合片段。更特定而言，抗OX40抗體可特異性結合人類OX40，但在標準結合分析條件下基本上不識別或結合至樣品中之其他分子。亦應理解，特異性結合第一靶標的抗體或其抗原結合片段可或可不特異性結合至第二靶標。因此，「特異性結合」不一定需要(儘管其可包括)排他性結合。通常但並非必須地，提及之「結合」意謂特異性結合。
可使用多種方法來選擇特異性結合所關注分子之抗體或其抗原結合片段。例如，固相ELISA免疫分析、免疫沉澱、Biacore™ (GE Healthcare)、KinExA、螢光活化細胞分選(FACS)、Octet™ (ForteBio, Inc.)及西方墨點法分析在可用於鑑定特異性結合至抗原之抗體或其抗原結合片段的許多方法之列。通常，特異性結合將產生至少兩倍於背景信號或雜訊的信號，更通常為背景的至少10倍、背景的至少50倍、背景的至少100倍、背景的至少500倍，背景的至少1000倍、或背景的至少10,000倍。
抗體結合之特異性可藉由比較抗體與OX40之間特異性結合之K D值與OX40-對照結合之K D值來評估，其中已知對照不與OX40結合。一般而言，當K D為約×10 -5M或更小時，抗體被稱為「特異性地結合」至抗原。
當抗體或其抗原結合片段不以比其結合至其他抗原更大的親和力、親合力、更容易及/或更長的持續時間結合至抗原時，其「基本上不結合」至該抗原。通常，結合將產生不大於背景信號或雜訊兩倍的信號。通常，其以1×10 -4M或更大、1×10 -3M或更大、1×10 -2M或更大或1×10 -1M或更大的K D結合至抗原。
本文中關於抗體所用之術語「競爭」意謂第一抗體或其抗原結合部分與抗原之結合減少了相同抗原隨後與第二抗體其抗原結合部分之結合。一般而言，第一抗體之結合產生空間位阻、構形變化或降低第二抗體與共同表位(或其部分)之結合。標準競爭性結合分析可用於確定兩種抗體是否相互競爭。
用於抗體競爭分析之一種適當分析涉及使用Biacore技術，該技術可使用表面電漿子共振(SPR)技術量測相互作用程度，通常使用生物感測器系統(諸如BIACORE®系統)。例如，SPR可用於 活體外競爭性結合抑制分析，以確定一種抗體對第二種抗體結合之抑制能力。另一抗體競爭量測係基於ELISA方法。此外，WO2003/48731中描述了一種基於抗體競爭之抗體「分箱」的高通量方法。若一種抗體或其抗原結合片段減少另一抗體或其抗原結合片段與OX40之結合，則存在競爭。例如，可藉由依序添加不同抗體來使用順序結合競爭分析。特定而言，可將第一抗體添加至接近結合飽和之水準。然後，添加第二抗體。若與不存在第一抗體之平行分析(其值可設定為100%)相比，第二抗體與OX40之結合不可偵測或顯著降低( 例如降低至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%)，則兩種抗體被視為相互競爭的。
亦可進行競爭性結合分析，其中將抗體與抗原之結合與靶標之另一結合配偶體對該靶標之結合進行比較，該結合配偶體諸如另一抗體或另外結合至靶標之可溶性受體。發生50%抑制之濃度被稱為K i。在理想條件下，K i等同於K D。因此，一般而言，K i之量測值可方便地經取代以提供K D之上限。與不同分子相互作用相關之結合親和力， 例如不同抗體對給定抗原之結合親和力的比較可藉由比較個別抗體/抗原複合物之K D值來評估。抗體或其他結合配偶體之K D值可使用此項技術中充分確立之方法來確定。
術語「Fc融合」蛋白質係一種蛋白質，其中一或多種多肽可操作地連接至Fc多肽。Fc融合將免疫球蛋白之Fc區與融合配偶體組合。「Fc區」可為Fc區之天然序列或Fc區之變異體。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可能不同，但人類IgG重鏈Fc區通常被定義為自Cys226或Pro230位之胺基酸殘基 延伸至其羧基末端。Fc區中之殘基的編號為如Kabat 等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991中所述之EU索引編號。免疫球蛋白之Fc區通常包含兩個恆定域，CH 2及CH 3。如此項技術中已知的，Fc區可以二聚體或單體形式存在。
術語「治療有效量」意謂足以達成預期目的之抗OX40抗體或其抗原結合片段或包含此類抗體或其抗原結合片段之組合的量。精確量將取決於許多因素，包括但不限於治療組合物之組分及物理特徵、預期患者群體、個別患者規格及其類似因素，且可由熟習此項技術者確定。
術語「治療」包括預防性及/或治療性治療。若在疾病、病症或病況之任何臨床徵象或症狀出現之前投與，則該治療被視為預防性的。治療性治療包括 例如改善或降低疾病、病症或病況之嚴重程度，或縮短疾病、病症或病況之持續時間。
如本文所用，術語「約」係指值之+/-10%。 治療方法及組合物
本文提供之任何抗人類OX40抗體可用於給定治療方法。
在一個態樣中，本文提供之抗人類OX40促效劑抗體用於醫藥組合物。在另一態樣中，本文提供之抗人類OX40促效劑抗體用於治療癌症。在一些實施例中，本文提供之抗人類OX40促效劑抗體用作治療方法。在其他實施例中，本發明提供治療患有癌症之個體之方法，其包括向該個體投與治療有效量之抗人類促效劑OX40抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與治療有效量之至少一種額外治療劑， 例如如下所述。
在一個態樣中，提供了用於增強患有癌症之個體之免疫功能( 例如藉由上調細胞介導之免疫反應)的抗人類OX40促效劑抗體，包含向個體投與治療有效量之抗人類OX40促效劑抗體。在另一態樣中，提供了用於增強患有癌症之個體中之T細胞功能的抗人類OX40促效劑抗體，包含向個體投與治療有效量之抗人類OX40促效劑抗體。在另一態樣中，提供了用於耗盡表現人類OX40之細胞( 例如表現OX40之T細胞， 例如表現OX40之Treg)之抗人類OX40促效劑抗體，包含向個體投與治療有效量之抗人類OX40促效劑抗體。在一些實施例中，耗盡係經由ADCC完成的。在其他實施例中，耗盡係經由吞噬作用完成的。提供了一種用於治療具有腫瘤免疫性之個體的抗人類OX40促效劑抗體。
在另外的態樣中，提供了用於治療感染( 例如細菌或病毒或其他病原體誘導之感染)之抗人類OX40促效劑抗體。在一些實施例中，本發明提供一種治療患有感染之個體的方法，其包括向個體投與治療有效量之抗人類促效劑OX40抗體。在一個實施例中，感染係藉由病毒及/或細菌誘導的。在另一實施例中，感染係藉由其他病原體誘導的。
在另一實施例中，本發明提供醫藥組合物之用途，其包括製造或製備抗OX40抗體。在一個實施例中，該醫藥組合物用於治療癌症。在另一實施例中，本發明提供一種治療患有癌症之個體的方法，其包括向個體投與治療有效量之醫藥組合物。在一個此類實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種額外治療劑， 例如如下所述。
在一個態樣中，醫藥組合物用於增強患有癌症之個體的免疫功能( 例如藉由上調細胞介導之免疫反應)，其包括向個體投與治療有效量之醫藥組合物。在另一態樣中，醫藥組合物用於增強患有癌症之個體中之T細胞功能，其包括向該個體投與治療有效量之醫藥組合物。在一些實施例中，T細胞功能障礙性病症為癌症。在一個態樣中，醫藥組合物用於耗盡表現人類OX40之細胞( 例如表現高水準OX40之細胞， 例如表現OX40之T細胞)，其包括向個體投與治療有效量之醫藥組合物。在一個實施例中，耗盡係經由ADCC完成的。在另一實施例中，耗盡係經由吞噬作用完成的。在另一態樣中，該醫藥組合物用於治療具有腫瘤免疫性之個體。
在另外的態樣中，提供用於治療感染( 例如由細菌、病毒或其他病原體誘導之感染)之醫藥組合物。在某些實施例中，醫藥組合物用於治療患有感染之個體，其包括向個體投與治療有效量之醫藥組合物。在一個實施例中，感染係藉由病毒及/或細菌誘導的。在另一實施例中，感染係藉由一些其他病原體誘導的。
在另一態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法。在一個實施例中，該方法包括向患有癌症之個體投與治療有效量之抗OX40抗體。在一個此類實施例中，該方法進一步包括向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，如下所述。根據任何上述實施例之「個體」可為人類。
在一個態樣中，提供一種增強患有癌症之個體中之免疫功能( 例如藉由上調細胞介導之免疫反應)的方法，其包括向個體投與治療有效量之抗人類促效劑OX40抗體。在一個態樣中，提供一種增強患有癌症之個體中之T細胞功能的方法，其包括向個體投與治療有效量之抗人類促效劑OX40抗體。在另一態樣中，提供一種耗盡表現人類OX40之細胞( 例如表現高水準OX40之細胞， 例如表現OX40之T細胞)之方法，其包括向個體投與治療有效量之抗人類促效劑OX40抗體。在一個實施例中，耗盡係經由ADCC完成的。在另一實施例中，耗盡係經由吞噬作用完成的。在另一實施例中，提供一種治療具有腫瘤免疫性之個體的抗人類OX40促效劑抗體。
在一些實施例中，本文所述之癌症進一步包括但不限於B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中級/濾泡性NHL；中級瀰漫性NHL ；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小非裂解細胞NHL；大塊疾病NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；及瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia))；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓胚細胞性白血病；及移植後淋巴增殖性病症(PTLD)，以及與瘢痣病、水腫(諸如與腦腫瘤相關)、B細胞增殖性病症及梅格斯症候群相關之異常血管增殖。更特定實例包括但不限於復發性或難治性NHL、前線低級NHL、III/IV期NHL、化療耐藥性NHL、前驅體B淋巴球性白血病及/或淋巴瘤、小淋巴球性淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病及/或幼淋巴球性白血病及/或小淋巴球性淋巴瘤、B細胞幼淋巴球性淋巴瘤、免疫細胞瘤及/或淋巴漿細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、結外邊緣區—MALT淋巴瘤、淋巴結邊緣區淋巴瘤、毛細胞白血病、漿細胞瘤及/或漿細胞骨髓瘤、低級/濾泡性淋巴瘤、中級/濾泡性NHL、套細胞淋巴瘤、濾泡中心淋巴瘤(濾泡性)、中級瀰漫性NHL、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、侵襲性NHL (包括侵襲性前線NHL及侵襲性複發性NHL)、自體幹細胞移植後復發或難治性NHL、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、高級免疫母細胞NHL、高級淋巴母細胞NHL、高級小非裂解細胞NHL、大塊疾病NHL、伯基特氏淋巴瘤、前驅體(周邊)大顆粒淋巴球性白血病、蕈樣肉芽腫及/或塞扎里症候群(Sezary syndrome)、皮膚(skin/cutaneous)淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤及血管中心性淋巴瘤。
在其他實施例中，癌症之實例進一步包括但不限於B細胞增殖性病症，其進一步包括但不限於淋巴瘤( 例如B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL))及淋巴球性白血病。此類淋巴瘤及淋巴球性白血病包括 例如a)濾泡性淋巴瘤，b)小非裂細胞淋巴瘤/伯基特氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤、散發性伯基特氏淋巴瘤及非伯基特氏淋巴瘤)，c)邊緣區淋巴瘤(包括結外邊緣區B細胞淋巴瘤(黏膜相關淋巴組織淋巴瘤，MALT)、淋巴結邊緣區B細胞淋巴瘤及脾邊緣區淋巴瘤)，d)套細胞淋巴瘤(MCL)，e)大細胞淋巴瘤(包括B細胞瀰漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)、瀰漫性混合細胞淋巴瘤、免疫母細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤-肺B細胞淋巴瘤)，f)毛細胞白血病，g)淋巴球性淋巴瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症，h)急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)/小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、B細胞幼淋巴球性白血病，i)漿細胞贅瘤、漿細胞骨髓瘤、多發性骨髓瘤、漿細胞瘤及/或j)霍奇金氏病。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，癌症為B細胞增殖性病症。在其他實施例中，B細胞增殖性病症為淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、侵襲性NHL、復發性侵襲性NHL、復發性惰性NHL、難治性NHL、難治性惰性NHL、慢性淋巴球性白血病(CLL)、小淋巴球性淋巴瘤、白血病、毛細胞白血病(HCL)、急性淋巴球性白血病(ALL)或套細胞淋巴瘤。在一些實施例中，B細胞增殖性病症為NHL，諸如惰性NHL及/或侵襲性NHL。在另一實施例中，B細胞增殖性病症為惰性濾泡性淋巴瘤或瀰漫性大B細胞淋巴瘤。
在另一態樣中，本發明提供一些醫藥調配物，其包含任何上述治療方法中所述之任何抗OX40抗體。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗OX40抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任何抗OX40抗體及至少一種額外治療劑， 例如如下所述。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體藉由抑制Treg功能( 例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞( 例如表現高水準OX40之細胞)及增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能來抑制腫瘤免疫性。在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體藉由抑制Treg功能( 例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞( 例如表現高水準OX40之細胞)及增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能來治療癌症。在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體藉由抑制Treg功能( 例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞( 例如表現高水準OX40之細胞)及增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能來增強免疫功能。在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體藉由抑制Treg功能( 例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞( 例如表現高水準OX40之細胞)、增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能來增強T細胞功能。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體為抑制性抗人類促效劑抗體。在一些實施例中，用抗人類OX40促效劑抗體治療導致細胞耗盡( 例如耗盡表現OX40之細胞或表現高水準OX40之細胞)。在一個實施例中，耗盡係經由ADCC完成的。在另一實施例中，耗盡係經由吞噬作用完成的。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體藉由抑制效應及/或記憶T細胞功能(在一些實施例中，效應T細胞及/或記憶T細胞增殖及/或細胞介素分泌)之Treg抑制來抑制Treg功能。在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增加效應T細胞增殖。在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增加記憶T細胞增殖。在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增加效應T細胞細胞介素產生( 例如干擾素γ-產生)。在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增加記憶T細胞細胞介素產生( 例如干擾素γ-產生)。在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增加CD 4+效應T細胞增殖及/或CD8 +效應T細胞增殖。在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增加記憶T細胞增殖( 例如CD4 +記憶T細胞增殖)。在一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增強個體中CD4 +效應T細胞之增殖、細胞介素分泌及/或溶細胞活性。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的數量相比，CD4 +效應T細胞之數量增加。在一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的水準相比，CD4 +效應T細胞細胞介素分泌升高。在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增強個體中CD8 +效應T細胞之增殖、細胞介素分泌及/或溶細胞活性。在一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的數量相比，CD8 +效應T細胞之數量增加。在一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的水準相比，CD8 +效應T細胞細胞介素分泌升高。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體結合至人類效應細胞， 例如結合至人類效應細胞中表現之FcγR。在一個實施例中，人類效應細胞執行ADCC效應功能。在另一實施例中，人類效應細胞執行吞噬效應功能。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，與具有IgG1Fc區天然序列之抗人類OX40促效劑抗體相比，包含IgG1Fc多肽變異體之抗人類OX40促效劑抗體， 例如消除其與人類效應細胞之結合的突變( 例如DANA或N297G突變)具有降低的活性( 例如CD4 +效應T細胞功能， 例如增殖)。在一些實施例中，包含IgGl Fc多肽變異體之抗人類OX40促效劑抗體， 例如消除其與人類效應細胞之結合的突變( 例如DANA或N297G突變)不具有實質活性( 例如CD4 +效應T細胞功能， 例如增殖)。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體之功能需要抗體交聯。在一些實施例中，功能為刺激CD4 +效應T細胞增殖。在一些實施例中，抗體交聯能力係藉由量測黏附至固體表面( 例如細胞培養盤)之抗人類OX40促效劑抗體的量來確定。在一些實施例中，抗體交聯能力係藉由在抗體之IgGl Fc區中引入突變( 例如DANA或N297S突變)且測試突變抗體之功能來確定。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增強個體中記憶T細胞之增殖及/或細胞介素分泌。在一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增加記憶T細胞之數量。在一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體增加記憶T細胞之細胞介素分泌(水準)。在本文所述之任何方法的一些實施例中，投與抗人類OX40促效劑抗體降低個體中效應T細胞之Treg抑制( 例如增殖及/或細胞介素分泌)。在一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的數量相比，效應T細胞之數量增加。在一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的水準相比，效應T細胞細胞介素分泌(水準)升高。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的數量相比，腫瘤內(浸潤) CD4 +效應T細胞之數量( 例如CD4 +效應T細胞之總數，或 例如CD45 +細胞中CD4 +細胞之百分比)增加。在本文所述之任何方法的一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的水準相比，表現干擾素γ-之腫瘤內(浸潤性) CD4 +效應T細胞的數量( 例如總表現干擾素γ-之CD4 +細胞，或 例如總CD4 +細胞中表現干擾素γ-之CD4 +細胞的百分比)增加。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的數量相比，腫瘤內(浸潤) CD8 +效應T細胞之數量( 例如CD8 +效應T細胞之總數，或 例如CD45 +細胞中CD8 +之百分比)增加。在本文所述之任何方法的一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的數量相比，表現干擾素γ-之腫瘤內(浸潤性) CD8 +效應T細胞的數量( 例如總CD8 +細胞中表現干擾素γ-之CD8 +細胞的百分比)增加。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，與投與抗人類OX40促效劑抗體之前的數量相比，腫瘤內(浸潤) Treg之數量( 例如Treg之總數或 例如CD4 +細胞中Fox3p+細胞之百分比)降低。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體之投與係與腫瘤抗原之投與組合。在一些實施例中，腫瘤抗原包含蛋白質。在一些實施例中，腫瘤抗原包含核酸。在一些實施例中，腫瘤抗原為腫瘤細胞。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，癌症具有人類效應細胞( 例如被人類效應細胞浸潤)。用於偵測人類效應細胞之方法係此項技術中熟知的，包括 例如IHC。在一些實施例中，癌症之特徵在於高水準之人類效應細胞。在一些實施例中，人類效應細胞為NK細胞、巨噬細胞及單核球中之一或多者。在一些實施例中，癌症為本文描所述之任何癌症。在一些實施例中，癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)、神經膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳癌( 例如三陰性乳癌)、胃癌、大腸直腸癌(CRC)或肝細胞癌。
在本文所述之任何方法的一些實施例中，癌症具有表現FcR之細胞( 例如被表現FcR之細胞浸潤)。用於FcR偵測之方法係此項技術中熟知的，包括 例如IHC。在一些實施例中，癌症具有高水準之表現FcR之細胞。在一些實施例中，FcR為FcγR。在一些實施例中，FcR為活性FcγR。在一些實施例中，癌症為非小細胞肺癌(NSCLC)、神經膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、黑色素瘤、乳癌( 例如三陰性乳癌)、胃癌、大腸直腸癌(CRC)或肝細胞癌。
根據任何上述實施例之「個體(individual/subject)」較佳為人類。
本發明之抗體可單獨使用或與其他治療劑組合使用。例如，本文所述之抗體可與至少一種額外治療劑共同投與。
上述此類組合療法包括組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於相同或單獨的調配物中)及單獨投與，其中本文所述抗體之投與可在投與一或多種額外治療劑之前、與其同時及/或在其之後進行。在一個實施例中，抗OX40抗體之投與及額外治療劑之投與發生在彼此之約一個月內，或約一、二或三週內，或約一、二、三、四、五或六天內。本發明之抗體亦可與放射療法組合使用。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與化學療法或化學治療劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與放射療法或放射治療劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向療法或靶向治療劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與免疫療法或免疫治療劑，例如單株抗體組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與以下各者組合投與：PARP抑制劑( 例如奧拉帕尼(Olaparanib)、魯卡帕尼(Rucaparib)、尼拉帕尼(Niraparib)、西地拉尼(Cediranib)、BMN673、維利帕尼(Veliparib))、曲貝替定(Trabectedin)、白蛋白結合型紫杉醇(nab-paclitaxel/albumen-bound paclitaxel，ABRAXANE)、曲巴尼布(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕博西尼(Palbociclib)、依維莫司(everolimus)、氟嘧啶( 例如FOLFOX、FOLFIRI)、IFL、瑞格非尼(regorafenib)、Reolysin、Alimta、Zykadia、Sutent、Torisel (替西羅莫司(temsirolimus))、Inlyta (阿西替尼，Pfizer)、Afinitor (依維莫司，Novartis)、Nexavar (索拉非尼(sorafenib)，Onyx / Bayer)、維全特(Votrient)、帕唑帕尼、阿昔替尼(axitinib)、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、長春氟寧(Vinflunine)、Hsp90抑制劑( 例如阿帕托星(apatorsin))、Ad-GM-CSF (CT-0070)、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、長春鹼(vinblastine)、沙洛米德(Thalomid)、達卡巴嗪(dacarbazine)、環磷醯胺、來那度胺(lenalidomide)、氮雜胞苷(azacytidine)、來那度胺、硼替佐胺(bortezomid) (VELCADE)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)及/或恩扎司他林(enzastaurin)。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與PD-1軸結合拮抗劑組合投與，該拮抗劑包括但不限於PD-1結合拮抗劑、PD-L1結合拮抗劑及PD-L2結合拮抗劑。「PD-1」之替代名稱包括CD279及SLEB2。「PD-L1」之替代名稱包括B7-H1、B7-4、CD274及B7-H。「PD-L2」之替代名稱包括B7-DC、Btdc及CD273。在一些實施例中，PD-1、PD-L1及PD-L2為人類PD-1、PD-L1及PD-L2。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抑制PD-1與其配位體結合配偶體結合之分子。在一特定態樣中，PD-1配位體結合配偶體為PD-L1及/或PD-L2。在另一實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抑制PD-L1與其結合配偶體結合之分子。在一特定態樣中，PD-L1結合配偶體為PD-1及/或B7-1。在另一實施例中，PD-L2結合拮抗劑為抑制PD-L2與其結合配偶體結合之分子。在一特定態樣中，PD-L2結合配偶體為PD-1。拮抗劑可為抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抗PD-1抗體( 例如人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體)。在一些實施例中，抗PD-1抗體選自MDX-1106 (納武單抗，OPDIVO)、Merck 3475 (MK-3475，派姆單抗)及KEYTRUDAWPCT-011 (匹地利珠單抗(Pidilizumab))。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為免疫黏附素( 例如包含PD-L1之細胞外或PD-1結合部分的免疫黏附素，或融合至恆定區( 例如免疫球蛋白之Fc區)之PD-L2序列)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為AMP-224。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抗PD-Ll抗體。在一些實施例中，抗PD-L1結合拮抗劑選自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI4736及MDX-1105。MDX-1105亦稱為BMS-936559，係一種描述於WO2007/005874中之抗PD-Ll抗體。抗體YW243.55.S70係一種描述於WO2010/077634 Al中之抗PD-Ll抗體。MDX-1106亦稱為MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或納武單抗，係一種描述於WO2006/121168中之抗PD-1抗體。Merck 3475亦稱為MK-3475、SCH-900475或派姆單抗，係一種描述於WO2009/114335 中之抗PD-1抗體。CT-011亦稱為hBAT、hBAT-1或匹地利珠單抗，係一種描述於WO2009/101611中之抗PD-1抗體。AMP-224亦稱為B7-DCIg，係一種描述於WO2010/027827及WO201 1/066342中之PD-L2-Fc融合可溶性受體。在一些實施例中，抗PD-1抗體為MDX-1106。「MDX-1106」之替代名稱包括MDX-1 106-04、ONO-4538、BMS-936558及納武單抗。在一些實施例中，抗PD-1抗體為納武單抗(CAS寄存編號：946414-94-4)。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向活化共刺激分子之促效劑組合投與。在一些實施例中，活化共刺激分子可包括CD40、CD226、CD28、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127。在一些實施例中，活化共刺激分子靶向之促效劑為與CD40、CD226、CD28、OX40、GITR、CD137、CD27、HVEM或CD127結合之促效劑抗體。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向抑制性共刺激分子之拮抗劑組合投與。在一些實施例中，抑制性共刺激分子可包括CTLA-4 (亦稱為CD152)、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精胺酸酶。在一些實施例中，抑制性共刺激分子靶向之拮抗劑為與CTLA-4、PD-1、TIM-3、BTLA、VISTA、LAG-3 ( 例如LAG-3-IgG融合蛋白(IMP321))、B7-H3、B7-H4、IDO、TIGIT、MICA/B或精胺酸酶結合之拮抗劑抗體。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CTLA-4 (亦稱為CD152)之拮抗劑， 例如阻斷抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與伊匹單抗(ipilimumab) (亦稱為MDX-010、MDX-101或Yervoy®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與曲美木單抗(tremelimumab) (亦稱為替西木單抗(ticilimumab)或CP-675,206)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向B7- H3 (亦稱為CD276)之拮抗劑， 例如阻斷抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與MGA271組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向TGFβ之拮抗劑， 例如美特木單抗(metelimumab) (亦稱為CAT-192)、非蘇木單抗(fresolimumab) (亦稱為GC1008)或LY2157299組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與包含授受轉移表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞( 例如細胞毒性T細胞或CTL)的治療組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與UCART19組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與WT128z組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與KTE-C19 (Kite)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與CTL019 (Novartis)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與包含授受轉移包含顯性失活TGFβ受體，例如顯性失活TGFβ II型受體之T細胞的治療一起投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與包含HERCREEM試驗之治療組合投與(參見 例如ClinicalTrials.gov標識符NCT00889954)。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD19之拮抗劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與M0R00208組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與針對CD38之拮抗劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與達雷木單抗(daratumumab)組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD137 (亦稱為TNFRSF9、4-1BB或ILA)之促效劑， 例如活化抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與烏瑞蘆單抗(urelumab) (亦稱為BMS-663513)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD40之促效劑， 例如活化抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與CP-870893組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向OX40 (亦稱為CD134)之促效劑， 例如活化抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與不同的抗OX40抗體( 例如AgonOX)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD27之促效劑， 例如活化抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與CDX-1127組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)之拮抗劑組合投與。在一些實施例中，IDO拮抗劑為1-甲基-D-色胺酸(亦稱為1-D-MT)。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD137 (亦稱為TNFRSF9、4-1BB或ILA)之促效劑， 例如活化抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與烏瑞蘆單抗(urelumab) (亦稱為BMS-663513)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD40之促效劑， 例如活化抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與CP-870893或R07009789組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與促效劑組合OX40 (亦稱為CD134)， 例如活化抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD27之促效劑， 例如活化抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與CDX-1127 (亦稱為伐立魯單抗(varlilumab))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)之拮抗劑組合投與。在一個實施例中，IDO拮抗劑為1-甲基-D-色胺酸(亦稱為1-D-MT)。在另一實施例中，IDO拮抗劑為WO2010/005958 (其內容以記錄方式明確併入本文中)中所述之一種拮抗劑。在另一實施例中，IDO拮抗劑為4-({2-[(胺基磺酰基)胺基]乙基}胺基)-N-(3-溴-4-氟苯基)-N'-羥基-1,2,5-噁二唑-3-甲脒( 例如，如本文在WO2010/005958之實例23中所述)。在一些實施例中，IDO拮抗劑為
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在一些實施例中，IDO拮抗劑為INCB24360。在一些實施例中，IDO拮抗劑為吲哚莫德(Indoximod) (1-甲基-色胺酸之D異構體)。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與抗體-藥物結合物組合投與。在一些實施例中，抗體-藥物結合物包含美坦辛(mertansine)或單甲基奧瑞他汀(auristatin) E (MMAE)。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與抗NaPi2b抗體-MMAE結合物(亦稱為DNIB0600A、RG7599或利法妥珠單抗-維多汀(lifastuzumab vedotin))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可以與曲妥珠單抗恩坦新(trastuzumab emtansine) (亦稱為T-DM1，阿多-曲妥珠單抗恩坦新(ado-trastuzumab emtansine)，或KADCYLA®，Genentech)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與抗MUC16抗體-MMAE結合物DMUC5754A組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與抗MUC16抗體-MMAE結合物DMUC4064A一起投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向內皮素B受體(EDNBR)之抗體-藥物結合物組合投與， 例如與MMAE結合之靶向EDNBR之抗體。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向淋巴球抗原6複合物，基因座E (Ly6E)之抗體-藥物結合物， 例如靶向Ly6E之抗體與MMAE之結合物(亦稱為DLYE5953A)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與泊洛妥珠單抗維多汀(polatuzumab vedotin)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD30之抗體-藥物結合物組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與ADCETRIS (亦稱為維布妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與泊洛妥珠單抗維多汀(polatuzumab vedotin)組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與血管生成抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向VEGF之抗體， 例如VEGF-A組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗(bevacizumab) (亦稱為AVASTIN®，Genentech)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向血管生成素2 (亦稱為Ang2)之抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與MEDI3617組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與針對VEGFR2之抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可以與雷莫蘆單抗(ramucirumab)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與VEGF受體融合蛋白組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與阿柏西普(aflibercept)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與齊夫-阿柏西普(ziv-aflibercept) (亦稱為VEGF Trap或Zaltrap®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向VEGF及Ang2之雙特異性抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與RG7221 (亦稱為伐努賽珠單抗(vanucizumab))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與血管生成抑制劑及PD-1軸結合拮抗劑( 例如PD-1結合拮抗劑，諸如抗PD-1抗體；PD-L1結合拮抗劑，諸如抗PD-Ll抗體；及PD-L2結合拮抗劑，諸如抗PD-L2抗體)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗及PD-1軸結合拮抗劑( 例如PD-1結合拮抗劑，諸如抗PD-1抗體；PD-L1結合拮抗劑，諸如抗PD-Ll抗體；及PD-L2結合拮抗劑，諸如抗PD-L2抗體)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗及MDX-1106 (納武單抗，OPDIVO)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗及Merck 3475 (MK-3475、派姆單抗、KEYTRUDA)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗及CT- Oi l (匹地利珠單抗)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗及YW243.55.S70組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗及MPDL3280A組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗及MEDI4736組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與貝伐單抗及MDX- 1105組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與抗贅瘤劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CSF-1R (亦稱為M-CSFR或CD115)之藥劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與抗CSF-lR抗體(亦稱為IMC-CS4或LY3022855)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與抗CSF-lR抗體RG7155 (亦稱為RO5509554或依米妥珠單抗(emactuzumab))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與干擾素，例如干擾素-α或干擾素-γ組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與Roferon-A (亦稱為重組干擾素α-2a)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與GM-CSF (亦稱為重組人類顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、rhu GM-CSF、沙格司亭(sargramostim)或Leukine®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL-2 (亦稱為阿地介白素(aldesleukin)或Proleukin®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL-12組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL27組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL-15組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與ALT-803組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD20之抗體組合投與。在一些實施例中，靶向CD20之抗體為阿托珠單抗(obinutuzumab) (亦稱為GA101或Gazyva®)或利妥昔單抗。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向GITR之抗體組合投與。在一些實施例中，靶向GITR之抗體為TRX518。在一些實施例中，靶向GITR之抗體為MK04166 (Merck)。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與依魯替尼(Ibrutinib)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與異檸檬酸脫氫酶1 (IDH1)及/或異檸檬酸脫氫酶2 (IDH2)之抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與AG- 120 (Agios)組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與阿托珠單抗及PD-1軸結合拮抗劑( 例如PD-1結合拮抗劑，諸如抗PD-1抗體；PD-L1結合拮抗劑，諸如抗PD-Ll抗體；及PD-L2結合拮抗劑，諸如抗PD-L2抗體)組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與癌症疫苗組合投與。在一些實施例中，癌症疫苗為基於肽之癌症疫苗。在其他實施例中，癌症疫苗為個人化肽疫苗。在一些實施例中，基於肽之癌症疫苗為多價長肽、多肽、肽混合液、雜合肽或肽脈衝之樹突狀細胞疫苗(參見 例如Yamada 等人, Cancer Sci, 104: 14-21, 2013)。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與佐劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與包含TLR促效劑， 例如Poly-ICLC (亦稱為Hiltonol®)、LPS、MPL或CpG ODN之治療組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與腫瘤壞死因子α (TNFα)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL-1組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與HMGBl組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL-10拮抗劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL-4拮抗劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL-13拮抗劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL-17拮抗劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與HVEM拮抗劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與ICOS促效劑組合投與， 例如投與ICOS-L或靶向ICOS之促效抗體。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CX3CL1之治療組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CXCL9之治療組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CXCL10之治療組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CCL5之治療組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與LFA-1或ICAMl促效劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與選擇素促效劑組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與B-Raf抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與維莫非尼(vemurafenib) (亦稱為Zelboraf®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與達拉非尼(dabrafenib) (亦稱為Tafinlar®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與康奈非尼 (LGX818)組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與EGFR抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與埃羅替尼(erlotinib) (亦稱為Tarceva®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與EGFR-T790M抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與吉非替尼(gefitinib)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與阿法替尼(afatinib)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與西妥昔單抗(cetuximab) (亦稱為Erbitux®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與帕尼單抗(panitumumab) (亦稱為Vectibix®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與羅西替尼(rociletinib)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與AZD9291組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與MEK抑制劑，諸如MEK1 (亦稱為MAP2K1)及/或MEK2 (亦稱為MAP2K2)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與考比替尼(cobimetinib) (亦稱為CDC-0973或XL-518)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與曲美替尼(trametinib) (亦稱為Mekinist®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與比美替尼(binimetinib)組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與B-Raf抑制劑( 例如維莫非尼或達拉非尼)及MEK抑制劑( 例如MEK1及/或MEK2 ( 例如考比替尼或曲美替尼))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與ERK抑制劑( 例如ERK1/2)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與GDC-0994組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與B-Raf抑制劑、MEK抑制劑及ERK1/2抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與EGFR抑制劑、MEK抑制劑及ERK1/2抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與一或多種MAP激酶途徑抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與CK127組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與K-Ras抑制劑組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與c-Met抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與奧那妥珠單抗(onartuzumab) (亦稱為MetMAb)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與AF802 (亦稱為CH5424802或阿來替尼(alectinib))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與克唑替尼(crizotinib)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與色瑞替尼(ceritinib)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與布帕西布(buparlisib) (B KM-120)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與匹替西布(pictilisib) (亦稱為GDC-0941)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與布帕西布(亦稱為B KM-120)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與呱立福新(perifosine) (亦稱為KRX-0401)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與δ-選擇性磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與艾代拉里斯(idelalisib) (亦稱為GS-1101或CAL-101)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與他賽利布(taselisib) (亦稱為GDC-0032)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與BYL-719組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與Akt抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與MK2206組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與GSK690693組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與帕他色替(ipatasertib) (亦稱為CDC-0068)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與mTOR抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與西羅莫司(sirolimus) (亦稱為雷帕黴素(rapamycin))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與替西羅莫司(亦稱為CCI-779或Torisel®)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與依維莫司(亦稱為RADOOl)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與瑞達福莫司(ridaforolimus) (亦稱為AP-23573、MK-8669或德福莫司(deforolimus))組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與OSI-027組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與AZD8055組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與INK128組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與雙重PBK/mTOR抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與XL765組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與GDC -0980組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與BEZ235 (亦稱為NVP-BEZ235)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與BGT226組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與GSK2126458組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與PF-04691502組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與PF-05212384 (亦稱為PKI-587)組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與選擇性降解雌激素受體之藥劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與GDC-0927組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與HER3抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與度戈妥珠單抗(duligotuzumab)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與LSD1抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與MDM2抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與BCL2抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與維奈托克(venetoclax)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與CHK1抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與CDC-0575組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與活化刺猬信號傳導途徑抑制劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與ERIVEDGE組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與放射療法組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與吉西他濱(gemcitabine)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與白蛋白結合型紫杉醇(ABRAXANE)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與曲妥珠單抗組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與TVEC組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與IL27組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與環磷醯胺組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與將T細胞募集至腫瘤之藥劑組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與利瑞魯單抗(IPH2102/BMS-986015)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與艾代拉里斯組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD3及CD20之抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與REGN1979組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與靶向CD3及CD19之抗體組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與博納吐單抗(blinatumomab)組合投與。
在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與溶瘤病毒一起投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與卡鉑及白蛋白結合型紫杉醇組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與卡鉑及紫杉醇組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與順鉑及培美曲塞(pemetrexed)組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與順鉑及吉西他濱組合投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與FOLFOX一起投與。在一些實施例中，抗人類OX40促效劑抗體可與F0LFIRI一起投與。
上述此類組合療法包含組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於相同或單獨的調配物中)及單獨投與，在該情況下，本發明中所述之抗體的投與可在投與額外治療劑及/或佐劑之前、與其同時及/或在其之後進行。本發明之抗體亦可與放射療法組合使用。
本發明之抗體(及任何額外治療劑)可藉由任何合適的方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內投與，且若需要局部治療，則可藉由病灶內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任何合適的投與途徑進行給藥， 例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分取決於投與係短暫的抑或長期的。本文提供之各種給藥方案包括但不限於單次或多次投與( 例如推注投與)及在不同時間點之脈衝輸注。
本發明之抗體將以符合良好醫學實踐之方式調配、給藥及投與。在此情況下考慮之因素包括正在治療之特定病症、正在治療之特定哺乳動物、各個別患者之臨床狀況、病症之原因、醫藥組合物之遞送部位、投與方法、投與時間安排以及開業醫師已知之其他因素。抗體可與但不必與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量取決於調配物中存在之抗體量、病症及治療之類型以及上述其他因素。此等其他藥劑通常以與本文所述相同之劑量及投與途徑，或以本文所述劑量之約1%至99%，或以經驗/臨床認為適當的任何劑量及投與途徑使用。
對於疾病之預防或治療，本發明中所述之抗體之適當劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、出於預防抑或治療目的而投與抗體、先前的療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師的判斷。抗體可一次性或在一系列投與內投與至患者。取決於疾病類型及嚴重程度，約1 μg/kg至40 mg/kg抗體可為初始候選劑量，例如藉由一或多次單獨投與，或藉由向患者連續輸注。取決於上述因素，典型日劑量範圍可為約1 μg/kg至100 mg/kg或更多。對於幾天或更長時間之重複投與，取決於病況，治療通常會持續直至達成所需結果， 例如抑制疾病進展。可間歇地投與醫藥組合物， 例如每週或每三週( 例如使得患者接受約二至約二十劑，或 例如約六劑抗體)。可投與初始較高負載劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，其他劑量方案可能係有用的。治療進展易於藉由習知技術及方法監測。
應理解，任何上述調配物或治療方法均可使用本發明之免疫結合物替代或補充抗OX40抗體進行。
在某些實施例中，每3、4、5、6、7或8周向患者投與如本文揭示之抗OX40抗體的靜脈內(IV)輸注。各患者之抗OX40抗體劑量可為5 mg、10 mg、15 mg、30 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、300 mg或500 mg。在某些實施例中，患者可能患有腎細胞癌、肝細胞癌或頭頸部鱗狀細胞癌。
在某些實施例中，以一定劑量及給藥方案向患者投與抗OX40抗體以達成該患者血液及腫瘤微環境(TME)中之免疫細胞的一或多種以下所需改變，例如： ● 藉由流式細胞分析技術量測的來自患者周邊血液之CD4 +或CD8 +T細胞上之增殖( 例如Ki67)及活化( 例如CD69、CD25)標記的百分比增加； ● 藉由流式細胞分析技術量測的來自患者周邊血液之CD4 +CD25 +T細胞上之OX40受體水準及抗OX40抗體佔據水準；及 ● 藉由多重免疫組織化學(mIHC)或多重免疫螢光(mIF)在來自患者之匹配的治療前及治療後腫瘤活檢組織上量測目標接合( 例如OX40下調)、CD8 +及CD4 +T細胞增殖( 例如Ki67上調)。
在某些實施例中，選擇或確定本文之抗OX40抗體之劑量及給藥頻率以確保在患者中重複給藥後具有足夠峰谷比及最少累積之暴露曲線，從而防止延長的受體飽和及隨後的T細胞耗竭，以在患者中達成持續的免疫介導之抗腫瘤活性。
在其他實施例中，本文中抗OX40抗體之劑量及/或給藥頻率係藉由暴露曲線連同藥效學(PD)發現，諸如如上所述之患者免疫細胞及/或TME之期望變化來選擇或確定。 實例 實例 1 抗 OX40 抗體 HFB10-1E1hG1 之製備
合成抗OX40抗體HFB10-1E1hG1之重鏈及輕鏈編碼核苷酸序列(SEQ ID NO: 24及32) (JinWeizhi Company)，且分別選殖至pFUSE載體中。使用PEI以1:1之比率將含有重鏈及輕鏈核苷酸編碼序列之質體瞬時共轉染至293F懸浮細胞中以表現全長抗體。培育1週後，在AKTA系統上使用Superdex™ 200 Increase預裝管柱純化抗體。 實例 2  HFB10-1E1hG1 之結合特性 實例 2.1      HFB10-1E1hG1 與 OX40 蛋白之結合特性
對於預測試ELISA，96孔盤用5 μg/ml抗OX40抗體，包括參考1、參考2、參考3、參考4、HFB10-1E1hG1及同型對照塗佈隔夜。第二天，將盤在37℃下用含1% BSA (Sangon Biotech，目錄號A600332-0100)之PBST封閉2小時，且接著添加規定濃度之生物素化OX40重組蛋白。
EC80係基於生物素化OX40重組蛋白與抗OX40抗體之結合來量測。參考1之EC80為0.09 nM；參考2之EC80為0.22 nM；參考3之EC80為0.16 nM；參考4之EC80為0.24 nM；HFB10-1E1hG1之EC80為0.71 nM；OX40L之EC80為1.6 nM。如圖1A中所示。 實例 2.2      HFB10-1E1hG1 與 293T 細胞表面上表現之 OX40 蛋白的結合特性
對於OX40過度表現，包括人類-OX40 (Sinobiological，目錄號HG10481-UT)、食蟹獼猴-OX40 (Sinobiological，目錄號CG90846-UT)、小鼠-OX40 (Sinobiological，目錄號MG50808-UT)或人類CD40 (Sinobiological，目錄號HG10774-UT)，根據Lipusectamine LTX Reagent及PLUS Reagent (Thermo，目錄號15338100)之說明書將編碼此等靶標之DNA質體瞬時轉染至293T細胞中。在轉染後48小時收穫293T細胞以供使用。為了確定結合親和力，將收穫之細胞與規定濃度之一級抗體HFB10-1E1hG1一起在4℃下培育1小時。接著，在用PBS洗滌兩次後，將細胞與山羊抗人類IgG PE二級抗體(1:200；Abcam，目錄號ab98596)一起在室溫下培育30分鐘。藉由Beckman CytoFLEX流式細胞儀進行HFB10-1E1hG1結合偵測。
HFB10-1E1hG1與293T細胞表面上表現之人類OX40蛋白結合的EC50為2 nM (MFI)，如圖1B中所示。
HFB10-1E1hG1與293T細胞表面上表現之食蟹獼猴OX40蛋白結合的EC50為2.9 nM (MFI)，如圖1C中所示。
HFB10-1E1hG1不與在293T細胞表面上表現之小鼠OX40蛋白結合(MFI)，如圖1D中所示。
HFB10-1E1hG1不與在293T細胞表面上表現之人類CD40蛋白結合(MFI)，如圖1E中所示。
HFB10-1E1hG1、參考1、參考2、參考3及參考4與在293T細胞表面表現之人類OX40蛋白結合之EC50展示於圖1F中。HFB10-1E1hG1之EC50為2.02 nM (MFI)；參考1之EC50為2.67 nM (MFI)；參考2之EC50為4.17 nM (MFI)；參考3之EC50為1.92 nM (MFI)；參考4之EC50為2.11 nM (MFI)。
HFB10-1E1hG1、參考1、參考2、參考3及參考4與在293T細胞表面表現之食蟹獼猴OX40蛋白結合之EC50展示於圖1G中。HFB10-1E1hG1之EC50為2.94 nM (MFI)；參考1之EC50為2.91 nM (MFI)；參考2之EC50為6.13 nM (MFI)；參考3之EC50為2.57 nM (MFI)；參考4之EC50為3.54 nM (MFI)。 實例 3  HFB10-1E1hG1 之促效活性 實例 3.1      HFB10-1E1hG1 在 Jurkat 報導細胞中之促效活性
抗OX40抗體根據其作用方式可分為兩類。第一類OX40促效活性不依賴於Fc受體之交聯，而另一類需要Fc受體交聯才能具有OX40促效活性。腫瘤組織及周圍引流淋巴結存在更多腫瘤相關炎性細胞，且Fc受體FcγR2b在腫瘤細胞周圍聚集更多。因此，「交聯抗體」促效劑具有更大的組織選擇性。此等抗體促效劑僅在腫瘤微環境中產生明顯促效作用，且在正常機體組織中維持低水準，從而增加了治療安全性。
為了確定HFB10-1E1hG1之促效活性，將96孔盤用5 μg/ml Fc特異性抗人類IgG抗體(Sigma，目錄號SAB3701275)塗佈隔夜。使用重組Jurkat報導細胞，該等細胞在NF-kb反應元件控制下表現GFP基因，且組成型表現人類OX40。將規定濃度之HFB10-1E1hG1及1×10 5個Jurkat報導細胞添加至一個孔中。在另一實驗中，將50 nM OX40L (Acrobiosystems，目錄號OXL-H52Q8)與HFB10-1E1hG1一起添加以確定協同效應。培育24小時後，收穫Jurkat報導細胞，且使用Beckman CytoFLEX流式細胞儀藉由GFP陽性信號量測Jurkat報導細胞中HFB10-1E1hG1之促效活性。
HFB10-1E1hG1之促效活性係抗人類IgG交聯依賴性的。當與抗人類IgG交聯時，HFB10-1E1hG1之EC50為2.9 nM (GFP之MFI)，如圖2A中所示。在不存在抗人類IgG交聯之情況下，HFB10-1E1hG1之EC50大得多，且單獨的三聚體OX40L重組蛋白可以EC50=45nM (GFP MFI)來活化NF-kb信號傳導，如圖2B中所示。
當與抗人類IgG交聯時，HFB10-1E1hG1顯示出與OX40L之協同促效作用。與單獨起作用之各個別組分相比，HFB10-1E1hG1及OX40L之組合一起增加了GFP之MFI，如圖2C中所示。 實例 3.2      HFB10-1E1hG1 在原代 CD4 +T 細胞中之促效活性
為了確定HFB10-1E1hG1在原代CD4 +T細胞中之促效活性，將96孔盤用0.3 μg/ml或1 μg/ml抗CD3抗體(Thermo，目錄號16-0037-81)及5 μg/ml Fc特異性抗人類IgG抗體(Sigma，目錄號SAB3701275)塗佈隔夜。第二天，根據CD4 +T細胞分離套組(Miltenyi，目錄號130-045-101)說明書收穫原代CD4 +T細胞。將規定濃度之HFB10-1E1hG1及2 μg/ml抗CD28抗體(Thermo，目錄號16-0289-81)與1×10 5個原代CD4 +T細胞一起添加至一個孔中。在另一實驗中，將50 nM OX40L (Acrobiosystems，目錄號OXL-H52Q8)與HFB10-1E1hG1一起添加以確定HFB10-1E1hG1與OX40L之間的協同效應。培育3天後，根據人類IL-2 DuoSet ELISA套組(R&D，目錄號DY202-05)說明書量測上清液中之IL-2分泌水準，以評估HFB10-1E1hG1在原代CD4 +T細胞中之促效活性。
為了確定HFB10-1E1hG1在原代CD4 +T細胞中之促效活性，用1 μg/ml抗CD3抗體及2 μg/ml抗CD28抗體預活化經純化CD4 +T細胞。將盤用5 μg/ml抗人類IgG預塗佈以促進其與HFB10-1E1hG1之交聯。培育三天後，藉由IL-2分泌量測HFB10-1E1hG1在原代CD4 +T細胞中之促效活性，且得到的EC50為0.2 nM，如圖2D中所示。
在原代CD4 +T細胞中，HFB10-1E1hG1顯示出與OX40L之協同促效作用。與單獨起作用之個別組分相比，HFB10-1E1hG1與50 nM OX40L之培育增強了IL-2分泌，如圖2E中所示。 實例 4  HFB10-1E1hG1 之藥物動力學測試
384孔盤用含1 μg/ml F(ab')2 (Fc特異性)山羊抗人類IgG抗體(Jackson IR，目錄號109-006-098)之30 μl/孔PBS塗佈隔夜。用PBST緩衝液洗滌三次後，將盤在37℃下用在PBS中含有1 mM EDTA、0.05% Tween及2% BSA之封閉緩衝液封閉1小時。然後，自1/150開始，以15 µL/孔添加三倍連續稀釋之小鼠血清樣品，且將盤在37℃下培育2小時。用PBST緩衝液洗滌三次後，添加1/5000稀釋度之過氧化物酶山羊抗人類IgG二級抗體(Jackson IR，目錄號109-035-003)且在37℃下培育半小時。添加TMB受質(Biolegend，目錄號421101)且再培育15分鐘。最後添加ELISA終止液(Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd.)，且用Multiskan Sky Microplate Spectrophotometer (ThermoFisher)在450 nm處讀盤。
向hOX40基因敲入小鼠(131、132、133，購自Shanghai Southern Model Biology Research Center)靜脈內注射10 mg/kg HFB10-1E1hG1。在投與後1小時、24小時、48小時、72小時、96小時及196小時收集小鼠血清。hOX40-KI小鼠血清中HFB10-1E1hG1之半衰期被確定為24小時，如圖3中所示。0小時處之資料點自上而下分別為131、132、133。 實例 5  HFB10-1E1hG1 之 活體內抗腫瘤功效
hOX40基因敲入小鼠購自Shanghai Southern Model Biology Research Center。隔離5天後，向各小鼠皮下接種含8×10 5個MC38腫瘤細胞(由Nankai University的Professor Zhang Hongkai提供)之100 μl PBS。當腫瘤大小達到70-100 mm 3時，藉由以100 μl PBS中之10 mg/kg及Q3D×5向小鼠腹膜內投與抗OX40抗體來開始抗OX40抗體治療。每週兩次量測腫瘤大小及小鼠體重。藉由卡尺量測各腫瘤之長徑及短徑。使用以下公式計算以mm 3為單位之腫瘤體積：V = 0.5a×b2，其中a及b分別代表腫瘤之長徑及短徑。
第7天：35隻8週齡小鼠接種MC38腫瘤細胞 - 自Professor Zhang Hongkai處獲得MC38細胞 - 每隻小鼠接種8×10 5個MC38細胞
第0天：平均腫瘤大小為75 mm 3(40-120 mm 3) - 每組5隻小鼠，4組： ● PBS ● 參考抗體1 ● HFB10-1E1hG1 ● 參考抗體2 - 藉由腹膜內投與10 mg/kg Q3D×5抗體開始。
第18天：PBS對照組之腫瘤大小達到2000 mm 3。處死小鼠。 - 組織：血液、LN、肝臟、脾臟、腫瘤 - 表型分析：T細胞CD3/CD4/CD8；Treg CD4/CD25/Foxp3；NK CD3/CD16/CD56
實驗表明，與PBS對照相比，HFB10-1E1hG1顯著抑制腫瘤生長而不會引起以體重減輕為特徵之副作用，如圖4A及圖4B中所示。在圖4A中，最右側資料點從上往下為PBS、參考抗體1、HFB10-1E1hG1及參考抗體2。在圖4B中，從左往右之第二組資料從上往下為PBS、參考抗體1、參考抗體2及HFB10-1E1hG1。
對hOX40基因敲入小鼠進行抗體劑量-反應功效。各治療組之資訊如下： 第1組：PBS：Q3D×5，腹膜內； 第2組：HFB10-1E1hG1：1 mg/kg，腹膜內，Q3/4D×5，腹膜內； 第3組：HFB10-1E1hG1：0.1 mg/kg，腹膜內，Q3/4D×5，腹膜內； 第4組：參考抗體：1：1 mg/kg，腹膜內，Q3D×5，腹膜內。
共20隻hOX40基因敲入小鼠，4組，每個治療組5隻小鼠。
向小鼠接種MC38腫瘤細胞。自平均腫瘤大小為75 mm 3開始，在第0天、第3天、第6天、第10天及第13天總共進行了5次抗體注射。每週量測腫瘤大小及小鼠體重兩次，持續至多三週或直至腫瘤大小大於2000 mm 3。
不同HFB10-1E1hG1治療劑量下之腫瘤大小及體重記錄展示於圖4C及圖4D中。結果表明，用1 mg/kg HFB10-1E1hG1治療在 活體內表現出最佳抗腫瘤功效。 實例 6  HFB10-1E1hG1 之 活體外表徵 實例 6.1      HFB10-1E1hG1 之加速穩定性評估
經由離心過濾裝置(Millipore，目錄號UFC503096)將抗體樣品(HFB10-1E1hG1，3.1 mg/mL，批號CP181130004)濃縮至10 mg/mL (批號JW20181203，批號20190624)。將適量濃縮抗體轉移至潔淨的600 μl管中，且分別在25℃及40℃下培育7、14及30天。
藉由SEC-HPLC及SDS-PAGE分析培育之樣品： 對於SEC-HPLC，注入50 μg各經處理樣品且在1×PBS緩衝液，pH 7.4 (使用來自10×PBS緩衝液(Sangon，目錄號E607016) -0500之Milli-Q純水稀釋)中以0.7 mL/min之流速運行，40分鐘/測試，且在UV 280 nm處偵測吸光度(儲存於4℃下之未處理樣品亦被負載用於分析)。結果展示於表1中。在25℃及40℃下培育至多30天後，在SEC曲線上未觀測到HFB10-1E1hG1之聚集或降解峰顯著增加，表明HFB10-1E1hG1在處理條件下具有良好穩定性。在40℃下培育30天後觀測到的輕微降解可能表明在高溫下長時間培育之不穩定性。 表 1. SEC 分析 - 溫度
抗體名稱 條件 聚集% 單體 小片段%
HFB10-1E1hG1 儲存於4℃下 1.70 98.31 0
25℃，7天 2.01 97.99 0
25℃，14天 1.96 98.04 0
25℃，30天 2.06 97.94 0
40℃，7天 3.99 96.00 0
40℃，14天 3.75 96.10 0
40℃，30天 3.6 95.18 1.22
在非還原及還原條件下，將4 μg各經處理樣品負載至4%-20%梯度凝膠上進行SDS-PAGE。凝膠在150V之tris-甘胺酸緩衝液中運行1小時，且在染色溶液(TaKaRa，目錄號T9320A)中染色超過1小時。接著將其在蒸餾水中脫色數次且在白光板上成像(亦將儲存於4℃下之未處理樣品用於分析)，如圖5A中所示。
在25℃及40℃下培育30天後，在SDS-PAGE影像上未觀測到HFB10-1E1hG1之明顯聚集或降解帶，表明HFB10-1E1hG1在此類處理條件下具有良好穩定性；在40℃下培育30天後，非還原凝膠上之輕微降解帶及還原凝膠上之聚集帶可能表明HFB10-1E1hG1在高溫下長時間培育之不穩定性。 實例 6.2      HFB10-1E1hG1 之降解實驗 1. 低 pH 壓力測試：
將適量抗體(HFB10-1E1hG1，3.1 mg/mL)轉移至600 μl管中，且接著以1:20 (v/v，酸相對於抗體樣品，最終pH被調節至約3.5)之比率添加2M乙酸。將樣品徹底混合且在室溫下培育0、3或6小時。培育後，用中和緩衝液將抗體溶液之pH調節至7.4 (1M Tris-HCl，pH 9.0係以13:100，v/v之比率添加至培育樣品中)。如前所述，藉由SEC-HPLC及SDS-PAGE分析樣品(參見加速穩定性實驗，注意：儲存於4℃下之未處理樣品亦被負載用於分析)。 2. 高 pH 壓力測試：
將適量抗體(HFB10-1E1hG1，3.1 mg/mL)轉移至600 μl管中，且接著以1:25 (v/v，最終pH被調節至約8.5)之比率添加1M pH 8.5 Tris-HCl。將樣品徹底混合且在室溫下培育0或6小時。如前所述，藉由SEC-HPLC及SDS-PAGE (僅分析還原條件)分析樣品。
SEC分析展示於表2中。在對應pH 3.5及pH 8.5溶液中培育至多6小時後，在SEC曲線上未觀測到HFB10-1E1hG1之聚集或降解峰增加，表明HFB10-1E1hG1在此類處理條件下具有良好穩定性。 表 2. SEC 分析 -pH
抗體名稱 條件 聚集% 單體% 小片段%
HFB10-1E1hG1 儲存於4℃下 1.47 97.57 0.96
pH3.5，0小時 1.21 97.49 1.3
pH3.5，3小時 1.15 97.63 1.22
pH3.5，6小時 1.25 97.62 1.13
pH8.5，0小時 2.16 97.48 0.37
pH8.5，6小時 2.11 97.53 0.36
SDS-PAGE分析示於圖5B中。在低pH及高pH緩衝液中培育至多6小時後，在SDS-PAGE凝膠上未觀測到HFB10-1E1hG1的變化，表明HFB10-1E1hG1在此類處理條件下具有良好穩定性。 實例 6.3      HFB10-1E1hG1 之氧化應激實驗
將適量抗體(HFB10-1E1hG1，3.1 mg/mL)轉移至600 μl管中，且接著添加H 2O 2(分別為0.1%及1%)或t-BHP (至最終0.1%)。在徹底混合且在室溫下培育0或6小時後，如前所述地藉由SEC-HPLC及SDS-PAGE分析樣品。
注：1)儲存於4℃下之未處理樣品被負載用於分析；2)以100 mM NaH2PO4、150 mM NaCl，pH 6.8形式製備SEC運行緩衝液。
SEC分析示於表3中。在對應0.1% H 2O 2、1% H 2O 2及0.1% t-BHP (三級丁基過氧化氫)溶液中培育6小時後，在SEC曲線上未觀測到顯著HFB10-1E1hG1變化，表明HFB10-1E1hG1在此等處理條件下具有良好穩定性。 表 3. SEC 分析 - 氧化應激
抗體名稱 條件 聚集% 單體% 小片段%
HFB10-1E1hG1 儲存於4℃下 2.99 96.89 0.12
0.1% H 2O 2，0小時 2.75 97.11 0.14
0.1% H 2O 2，6小時 2.78 97.05 0.17
1% H 2O 2，0小時 2.81 96.99 0.20
1% H 2O 2，6小時 2.56 97.13 0.31
0.1% t-BHP，0小時 3.02 96.81 0.18
0.1% t-BHP，6小時 2.82 96.96 0.23
SDS-PAGE分析示於圖5C中。在0.1% H 2O 2、1% H 2O 2及0.1% t-BHP (三級丁基過氧化氫)溶液中培育6小時後，在SDS-PAGE凝膠上未觀測到HFB10-1E1hG1之顯著變化，除了在非還原凝膠上略有降解，表明HFB10-1E1hG1在此類處理條件下具有良好穩定性。 實例 6.4      HFB10-1E1hG1 之凍融實驗
經由離心過濾裝置(Millipore，目錄號UFC503096)將抗體樣品(HFB10-1E1hG1，3.1 mg/mL，批號CP181130004)濃縮至10 mg/mL (批號JW20181203)。將適量濃縮抗體樣品轉移至潔淨的600 μl管(3×管)中，且將樣品在液氮中冷凍2分鐘，且在室溫下之水浴中解凍。重複相同程序2或4次或甚至更多次。
如前所述，藉由SEC-HPLC及SDS-PAGE分析樣品。注：1) 對儲存於4℃下之未處理樣品進行分析；2) SEC運行緩衝液由100 mM NaH2PO4、150 mM NaCl，pH 6.8自行製備。
對於基於DSF之熱穩定性分析：根據製造商說明書，將3 μg各經處理樣品用於PCR盤(Bio-Rad盤，目錄號HSP9655；Bio-Rad膜，目錄號MSB1001)中ProteoStat分析套組(Enzo Life Sciences，目錄號ENZ-51027-K400)之各25 μl反應物。Bio-Rad PCR儀(C1000 touch，CFX96即時系統)上之加熱程序如下：25℃持續2分鐘，每10秒增加0.5℃，直至95℃。在德克薩斯紅模式下讀取螢光吸光度。Tm值與-dF/dT之最低點有關。
SEC分析示於表4中。DSF分析描述於表5中。SEC分析顯示，在凍融處理至多5個循環後，在SEC曲線上未觀測到HFB10-1E1hG1之顯著變化。DSF分析顯示，HFB10-1E1hG1之Tm值在相同處理後無顯著變化，表明HFB10-1E1hG1在此類處理條件下具有良好穩定性。 表 4. SEC 凍融分析
抗體名稱 條件 聚集% 單體% 小片段%
HFB10-1E1hG1 儲存於4℃下 3.15 96.85 0
F/T週期1 3.03 96.97 0
F/T週期3 3.03 96.96 0
F/T週期5 2.95 97.05 0
表 5. DSF 凍融分析
抗體名稱 條件 Tm (℃)
HFB10-1E1hG1 儲存於4℃下 74.5
F/T週期1 74.5
F/T週期3 74.25
F/T週期5 74.25
SDS-PAGE分析示於圖5D中。凍融處理至多5個循環後，在SDS-PAGE凝膠上未觀測到HFB10-1E1hG1之顯著變化，表明HFB10-1E1hG1在此類處理條件下具有良好穩定性。 實例 7
已顯示，促效性抗體與OX-40之結合在 活體外及臨床試驗中均可導致受體下調(Wang 等人, Cancer Research 2019)。進一步假設，在第一次注射後在患者中觀測到的靶標表現隨後喪失可能會限制OX-40促效性抗體在臨床試驗中之應用(Wang 等人, Cancer Research 2019)。藉由使用自PBMC分離之離體活化初始T細胞，本發明顯示，與傳統的促效性抗體治療相比，用HFB10-1E1hG1治療導致OX-40減少較少。獨特結合表位及最佳化結合動力學最大限度地減少了靶標降解，從而避免了第一次注射後靶標表現的喪失，從而允許對患者進行連續投藥。 實例 8 HFB10-1E1hG1 之人類 PK 預測
將食蟹獼猴之PK資料擬合至2室模型中。擬合之PK曲線及觀測資料示於圖6A-6F中。擬合之均方根誤差為0.17，且R 2為0.99，表明與觀測資料擬合良好。
人類2室PK參數係基於對應猴子參數之指數規則(ROE)預測的(Dong等人, 2011)。
接著使用預測參數模擬人類PK曲線。圖7顯示在單劑量靜脈內輸注1 mg/kg HFB10-1E1hG1後1小時之人類PK曲線的實例。 基於 hOX40 KI 小鼠之 HFB10-1E1hG1 PK 資料的最小人類 PAD 預測
hOX40 KI小鼠中10 mg/kg HFB10-1E1hG1之C 最大及AUC (0-72h)值分別為160.5 μg/mL及2591 μg/mL*h。假設線性PK，1 mg/kg HFB10-1E1hG1之C 最大及AUC (0-72h)值將分別為16 μg/mL及259 μg/mL*h。
在1 mg/kg HFB10-1E1hG1下預測之人類C 最大及AUC (0-72h)值為23.7 μg/mL及1213 μg/mL*h。假設人類中之線性PK，預計最小PAD為0.68 mg/kg (基於C 最大)或0.21 mg/kg (基於AUC (0-72h))。為保守起見，假設人類最小PAD為0.21 mg/kg或15 mg之固定劑量(假設標準體重為70 kg)。 考慮人類之給藥頻率
為了最大化腫瘤微環境中之OX40促效作用及隨後的效應T細胞擴增及調節性T細胞耗盡，應注意不要使OX40受體長時間飽和。確保OX40促效之間有足夠時間的一種策略為避免所關注促效劑之顯著累積。吾人以每2週一次(Q2W)、每3週一次(Q3W)或每4週一次(Q4W)計劃模擬HFB10-1E1hG1之PK曲線。Q4W之模擬PK曲線示於圖8中。
吾人接著計算各計劃之C 最大及C 最小累積指數，以及在穩態下之C 最大/C 最小比。結果列於表2中。
基於計算之AI及C最大/C最小比，除了實際考慮外，亦選擇Q4W計劃之15 mg初始劑量用於HFB10-1E1hG1之首次人體研究。
預計HFB10-1E1hG1之人類PK與典型IgG1單株抗體(mAb)類似，具有低清除率(CL，0.084 mL/h/kg)、低分佈容積(Vdss，0.084 L/kg)及典型mAb半衰期(T 1/2，731 h，約30天)。
HFB10-1E1hG1之最小人類PAD係基於與食蟹獼猴PK對應的經調節人類PK、hOX40 KI小鼠之MC38腫瘤功效研究的最小有效劑量及hOX40 KI小鼠之HFB10-1E1hG1暴露資料預測的。基於KI小鼠中之暴露與功效關係，推斷出人類中之最小PAD為0.21 mg/kg。為方便起見，建議將15 mg之等效固定劑量作為人類之起始劑量。基於不同給藥頻率下預測之穩態PK曲線，建議的給藥頻率為每4週一次(Q4W)。
此處，吾人使用流式細胞分析技術評估了HFB10-1E1hG1與活化原代猴T細胞之結合。
CD4 +T細胞用作與Bmk 1結合之陽性對照。HFB10-1E1hG1被證明與分離自三個不同供體(批號200107、M20Z013009及M20Z025008)之活化CD3/CD28原代猴T細胞結合。自各結合分析之MFI劑量反應曲線計算之EC50值分別為0.09 nM、0.19 nM及0.17 nM。
ELISA分析之線性偵測範圍在實驗A中為125至1000 pg/ml，且在實驗B中為125至2000 pg/ml。兩個實驗中之LLOQ均為18.75 ng/ml。
此處，吾人評估了Bmk 1及HFB10-1E1hG1在以下各者中之藥物動力學：1)經由i.v.向WT小鼠投與10 mg/kg及1 mg/kg之單劑量，及2)向hOX40-KI小鼠投與10 mg/kg之單劑量。Bmk 1及HFB10-1E1hG1隨時間之平均濃度繪製於如圖7及8中所呈現之半對數圖上。
在所有經治療小鼠中均達成HFB10-1E1hG1及Bmk 1之全身暴露。在WT小鼠(圖7)中，HFB10-1E1hG1及Bmk 1表現出相似的劑量依賴性線性清除率。HFB10-1E1hG1與Bmk 1之劑量比為1:10。HFB10-1E1hG1之C最大與AUC(0-72h)之比分別為1:6.8及1:7.9，而Bmk 1之比分別為1:11.8及1:8.6。
HFB10-1E1hG1之血清清除率在1 mg/kg及10 mg/kg下在WT小鼠中分別為0.71 ± 0.34及1.06 ± 0.77 ml/h/kg，而其在10 mg/kg下在hOX40-KI小鼠中為3.09 ± 0.27 ml/h/kg。對於Bmk 1 PK，觀測到類似的血清清除率差異。Bmk 1之血清清除率在1 mg/kg及10 mg/kg下在野生型小鼠中分別為0.45 ± 0.13及0.62 ± 0.10 ml/h/kg，而其在10 mg/kg下在hOX40-KI小鼠中為7.24 ± 2.24 ml/h/kg。由於hOX40僅在hOX40-KI小鼠中表現，因此hOX40-KI小鼠中之較高HFB10-1E1hG1清除率可能係由於靶標介導之藥物處置(TMDD)。
HFB10-1E1hG1之穩態分佈容積(Vdss)值在1 mg/kg及10 mg/kg下在WT小鼠中分別為0.21 ± 0.03及0.26 ± 0.02 L/kg，而其在10 mg/kg下在hOX40-KI小鼠中為0.14 ± 0.01 L/kg。類似地，Bmk1之Vdss值在1 mg/kg及10 mg/kg下在WT小鼠中分別為0.19 ± 0.02及0.21 ± 0.01 L/kg，且其在10 mg/kg下在hOX40-KI小鼠中為0.08 ± 0.03 L/kg。
對於兩種抗體，在WT與hOX40 KI小鼠之間亦觀測到終末半衰期(T 1/2)之明顯差異。在WT小鼠中，HFB10-1E1hG1在10 mg/kg及1 mg/kg下之T 1/2分別為239.72 ± 140.48 h及274.52 ± 193.12 h，而Bmk1在10 mg/kg及1 mg/kg下之彼等值分別為252.04 ± 51.82 h及321.05 ± 75.89 h。然而，在hOX40 KI小鼠中，10 mg/kg下之T 1/2值相當短，對於HFB10-1E1hG1為38.65 ± 4.84 h且對於Bmk 1為5.45 ± 1.09 h。 實例 9 藥效學研究
方法：30隻雌性人類OX40基因敲入小鼠(C57BL/6背景)在右側腹皮下接種MC-38腫瘤細胞用於腫瘤發育。腫瘤接種後九天，選擇20隻腫瘤大小範圍為76-226 mm 3(平均腫瘤大小為155 mm 3)之小鼠，且基於其腫瘤體積隨機分為4組。每組有5隻小鼠。各小鼠自隨機分組之日(定義為第0天(D0))開始接受四種治療中之一者。四個治療為：10 mg/kg同型對照；0.1 mg/kg HFB10-1E1hG1；1 mg/kg HFB10-1E1hG1及10 mg/kg HFB1-1E1hG1。所有治療均在D0、D3及D7經由i.p.注射投與。每周至少量測三次腫瘤大小及動物體重。第三次注射後6小時，收集腫瘤樣品進行流式細胞分析技術(FCM)分析，收集血液樣品進行受體佔用(RO)分析，且將血漿樣品送至HiFiBiO進行進一步分析。
結果：在攜帶MC-38腫瘤之hOX40 KI小鼠中測試了HFB10-1E1hG1之PD效應。在血液及腫瘤微環境中(主要在腫瘤中)，HFB10-1E1hG1均導致T細胞上(主要為CD4 +T細胞上)之OX40陽性百分比及MFI表現降低。同時，HFB10-1E1hG1亦顯著降低了Treg群體。在腫瘤微環境中，CD4 +T細胞之減少主要由Treg (CD25 +FOXP3 +細胞)之減少驅動，且CD4 +T細胞(Ki67 +細胞)之增殖增加，同時CD69 + T細胞減少。同時，腫瘤微環境中CD8 +T細胞上之PD1表現降低。在治療組中，所有此等觀測結果均為HFB10-1E1hG1劑量依賴性的。總之，此等資料表明HFB10-1E1hG1治療活化了OX40信號傳導途徑，其有助於在腫瘤微環境中觀測到的持久免疫反應，以用於功效研究。
使用與HFB10-1E1hG1無競爭性之小鼠抗hOX40抗體(純系ACT35)分析HFB10-1E1hG1對血液樣品中之OX40表現的效應。量測了CD4 +、CD4 +CD25 +及CD11b +單核球上之總OX40表現(資料未示出)。HFB10-1E1hG1治療導致CD4 +及CD4 +CD25 +T細胞(包括Treg)上之OX40表現(陽性百分比及MFI)顯著下調。CD11b +細胞上之OX40表現未觀測到變化。
為了評估HFB10-1E1hG1治療後的目標接合，在FCM分析中將抗人類IgG (hIgG)與非競爭性Ab ACT35組合使用。OX40 +CD4 +T細胞及OX40 +CD4 +CD25 +T細胞上之hIgG +群體百分比較低。然而，OX40 +CD4 +CD25 +細胞(包括Treg)上hIgG +之MFI已以HFB10-1E1hG1劑量依賴性方式顯著增加。
在OX40 +CD11b +細胞上，在同型及10 mg/kg HFB10-1EhG1治療組中觀測到劑量依賴性的高水準hIgG+信號，表明hIgG被CD11b +細胞上之FcgR捕獲。
藉由流式細胞分析技術(「FCM」)分析腫瘤組織中之浸潤性免疫細胞群體。對於此處例示之所有FCM分析圖： ● G1：同型對照組；G2：0.1 mg/kg HFB10-1E1hG1治療組；G3：1 mg/kg HFB10-1E1hG1治療組；G4：10 mg/kg HFB10-1E1hG1治療組 ● 各點代表來自個別動物之資料，矩形條代表組平均值，且誤差條代表SEM。
量測了T細胞(CD3+)、CD4 +T、CD8 +T細胞及Treg (CD3 +CD4 +CD25 +Foxp3+)之百分比，且所選結果示於圖9及10中。亦量測了初始T細胞(CD3 +CD44 -CD62L +)、記憶T細胞(CD3 +CD44 +CD62L +)及效應T細胞(CD3 +CD44 +CD62L -)之百分比(資料未示出)。結果，與同型對照(G1)治療相比，HFB10-1E1hG1 (G3及G4，但並非G2)治療顯著降低CD4 +T細胞、Treg、初始T細胞及初始CD4 +T細胞之百分比。此外，與對照治療相比，所有HFB10-1E1hG1治療均顯著降低記憶T細胞及記憶CD4 +T細胞之百分比。儘管所有HFB10-1E1hG1治療組均降低記憶CD8 +T細胞之百分比，但僅G2及G3治療組具有統計顯著性。在治療組中對T細胞(CD3 +)、CD8 +T細胞及效應T細胞群體未觀測到顯著變化。
檢查了HFB10-1EhG1治療對腫瘤中不同T細胞亞型之OX40表現、活化及增殖的效應。使用與HFB10-1E1hG1無競爭性之小鼠抗hOX40抗體(純系ACT35)分析HFB10-1E1hG1對總OX40表現的效應。量測了CD3 +、CD4 +、CD8 +T細胞及Treg (CD4 +CD25 +FoxP3 +)上之OX40表現(資料未示出)。與同型對照組(G1)相比，HFB10-1E1hG1治療在百分比及MFI兩者中顯著降低了CD3 +及CD4 CDT細胞上之OX40表現(左圖上為OX40表現之陽性百分比且右圖上為OX40之MFI)。此外，HFB10-1E1hG1治療在MFI方面，但未在Treg百分比方面顯著降低OX40表現(資料未示出)。此外，HFB10-1E1hG1治療在百分比方面，但未在CD8 +T細胞上之MFI方面顯著降低OX40表現。
與同型對照組(G1)相比，HFB10-1E1hG1 (G3及G4)治療顯著降低了CD69 +CD4 +T細胞及PD-1 +CD8 +T細胞之百分比(圖12)，且增加了增殖(Ki67 +) CD4 +T細胞之百分比(圖11)。
以上觀測結果係HFB10-1E1hG1劑量依賴性的。 實例 10 表位作圖
HFB301001被開發為一種促效性單株抗OX40抗體。表1顯示了HFB301001之CDR、VH/VL及HC/LC序列。
結合表位係藉由使用競爭性ELISA分析之表位組合來表徵，以相對於先前公佈的已選擇抗體及OX40配位體結合表位探索不同抗OX40抗體之OX40結合表位。簡言之，將盤用50 µl 1 µg/ml抗OX40捕獲抗體、OX40L或同型對照塗佈，且在4℃下培育隔夜。然後，將盤在室溫下用含1% BSA之PBST封閉2小時。接下來，添加50 µl/孔之生物素-OX40 (批號160921111，ChemPartner；Tokyo, JP)。生物素-OX40以自0.5 µg/mL進行8點稀釋，稀釋1至3倍之濃度使用，且在37℃下培育1小時。添加HRP結合之抗生蛋白鏈菌素(1/5000稀釋度；50 ul/孔)且在37℃下培育1小時，接著添加100 µl/孔之TMB且在室溫下培育15分鐘。藉由添加50 µl/孔之ELISA終止溶液終止反應。OD值用Thermo Multiscan天空分光光度計在450 nm波長處測定。
藉由使用氫氘交換質譜法獲得了結合表位之更詳細解析度。簡言之，質譜法(HDX-MS)用於H/D交換表位作圖以確定與HFB301001相互作用之OX40(重組人類OX40)的胺基酸殘基。H/D交換方法之一般闡述於例如Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259；以及Engen及Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A中。His標記之OX40抗原蛋白購自Sinobiological (目錄號10481-H08H；Sinobiological, Inc.; Beijing, CN)。在Novabioassays LLC提供之整合HDX/MS平台及Thermo Q Exactive HF質譜儀上進行HDX-MS實驗以量測肽質量。將4.5 µL所有樣品與75 µL氧化氘標記緩衝液(1X PBS，pD 7.4)一起在20℃下培育300秒、600秒、1800秒及3600秒。藉由添加80 µL 4 M鹽酸胍、0.85 M TCEP緩衝液(最終pH值為2.5)淬滅氫/氘交換。隨後，對淬滅之樣品進行管柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化，然後進行LC-MS分析。質譜資料僅在MS模式下記錄。胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化、LC-MS及資料分析。HDX標記後，藉由添加80 µL 4 M鹽酸胍、0.85 M TCEP緩衝液(最終pH 2.5)且在20℃下培育3分鐘使樣品變性。接著使用內部填充的胃蛋白酶/蛋白酶XIII (w/w，1:3)管柱對混合物進行管柱上胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化。使用UPLC-MS系統分析所得肽，該系統由連接至Q Exactive™ plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap質譜儀(Thermo；Waltham, MA)之Waters Acquity UPLC組成。肽在50×1 mm C8管柱上以自2%開始至33%溶劑B (含0.2%甲酸之乙腈)之20.5分鐘梯度進行分離。溶劑A為0.1%甲酸之水溶液。進樣閥、酶管柱及相關連接管位於保持在15℃下之冷卻箱中。第二開關閥、C8管柱及相關不銹鋼連接管件位於保持在-6℃下之冷凍回收箱中。肽鑑定係藉由使用改良之Byonics (Protein Metrics; San Carlos, CA)軟體搜尋HFB301001序列之MS/MS資料進行，該軟體將非特異性酶消化及人類醣基化作為共同變數。前驅離子及產物離子之質量公差分別為10 ppm及0.02 Da。HDX WorkBench軟體(3.3版)用於處理原始MS資料，以分析H/D交換MS資料(J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2012, 23 (9), 1512-1521)。氘化肽與其未標記形式(t0)之間的平均質量差用於計算氘吸收水準。比較了單一抗原樣品及抗原抗體複合物樣品中相同肽之氘吸收水準。大於5%之相對差異被視為顯著的。表位區域被定義為具有顯著氘吸收之多個重疊肽。自單獨的hOX40.his及hOX40-his-HFB301001複合物中鑑定出總共46個來自hOX40-his之肽，代表hOX40之70%序列覆蓋率(圖13)。任何表現出大於5%之D吸光度百分比差異的肽均被定義為受到顯著保護。對於hOX40-his，對應於胺基酸56-74 CSRSQNTVCRPCGPGFYND之區域中之多肽被視為受到HFB301001顯著保護之表位。如圖13中所示，表位區域映射至OX40/OX40L複合物之3D模型，該模型改編自Compaan及Hymowitz. Structure. 2006, 14 (8), 1321-30。HFB301001之表位定義為SEQ ID NO: 33之胺基酸56-74，CSRSQNTVCRPCGPGFYND (SEQ ID NO: 34)。 實例 11 OX40 配位體之促效活性
為了評估OX40配位體(OX40L)之促效活性，根據製造商說明書使用OX40生物分析套組(Promega，目錄號CS197704；Promega；Madison, WI)。該分析使用基因工程化Jurkat T細胞株，該細胞株表現人類OX40 (OX40效應細胞)及由反應元件驅動之螢光素酶報導基因。簡而言之，OX40效應細胞在使用前一天在分析緩衝液中培養。在分析當天，將連續稀釋之OX40L添加至盤中。誘導5小時後，使用Bio-Glo螢光素酶分析系統對生物發光信號進行量化。結果顯示OX40L以劑量依賴性方式誘導OX40效應細胞之生物發光信號(圖14A)。
為了研究抗OX40抗體對OX40-L促效活性的效應，在10 nM OX40L存在下，將OX40效應細胞與連續稀釋之抗OX40抗體(HFB301001，基準1或基準2)一起培育。基準1及基準2係先前公佈之抗OX40抗體，且係因為抗體表位在OX40上離細胞膜最遠而被選擇，而其他基準被描述為在OX40之配位體結合口袋附近結合。在誘導後5小時使用Bio-Glo螢光素酶分析系統對生物發光信號進行量化。基準1及基準2 (但並非HFB301001)均以劑量依賴性方式阻斷OX40L之阻斷效應(圖14B)。結果表明，與基準1及基準2相比，HFB301001識別OX40上之不同結合位點，且該等結合位點不干擾OX40L之促效功能。 實例 12 OX40 受體調節
為了研究抗OX40抗體與OX40受體結合之調節作用，使用Miltenyi之人類CD4 +T分離套組(目錄號130-096-533；Miltenyi Biotec; Bergisch Gladbach, Germany)自人類周邊血液單核細胞(PBMC)中分離CD4 +T細胞。原代CD4 +T細胞與連續稀釋之基準抗體或HFB301001一起培育，且同時被0.5 μg/mL盤結合抗CD3抗體(純系OKT3，eBioscience，目錄號16-0037-81)及2 μg/mL可溶性抗CD28抗體(純系CD28.2，eBioscience，目錄號16-0289-81；eBioscience, Inc.; San Diego, CA)活化。培育3天後，藉由用抗OX40抗體(PerCP-Cy5.5，純系ACT35，Thermo Fisher，目錄號17-1347-42)染色來偵測總表面OX40之表現。與同型對照相比，HFB301001增強了細胞表面上之穩定OX40表現(圖15A)。在所有基準治療組中，隨著抗體濃度增加，OX40之表面表現呈U形：OX40之水準最初下降，在約1 nM時達到最低點，且接著再次上升。 實例 13 結合親和力評估
在Octet QKe儀器上進行生物膜層干擾(BLI)實驗，以確定在HFB301001與人類OX40蛋白之間形成之重組二聚體(經mFc標記)的結合親和力。在解離階段之後，在pH 7.4及25℃下，將各種濃度之重組人類OX40蛋白與感測器捕獲之測試抗體及同型對照混合。記錄結合信號的變化，且結合參數之動力學分析使用具有傳質限制之模型：1:1確定。運行緩衝溶液用含有0.1% BSA及0.1% Tween 20之PBS，pH 7.4製備。在動力學結合實驗之前，用運行緩衝液沖洗抗人類Fc捕獲感測器，且將儀器預熱至25℃。用運行緩衝液將測試抗體及同型對照抗體稀釋至200 nM。用運行緩衝液將OX40-mFc蛋白稀釋至250、125、62.5、31.25及15.125 nM。OX40蛋白與其抗體之結合使用pH 7.4及25℃下之運行緩衝液重複進行。簡言之，首先將抗人類Fc捕獲感測器浸入運行緩衝液中300秒，以設定第一基線。接著將感測器與200 nM測試抗體溶液混合600秒以負載抗體。將感測器再次浸入運行緩衝液中300秒以設定第二基線，且接著與各種濃度之OX40抗原締合900秒。接著藉由再將感測器浸入運行緩衝液中900秒進行解離。同時，選擇一個感測器作為參考，其中所有負載、締合及解離步驟均在運行緩衝液中進行。選擇另一感測器作為陰性對照實驗，其中HFB-TT-hG1同型對照抗體用於負載步驟，且500 nM OX40-mFc蛋白用於締合步驟。藉由Fortebio資料分析軟體8.2版(ForteBio; Fremont, CA)分析感測圖。首先，自陰性對照實驗中減去信號，且與基線進行比較。藉由將此等具有不同抗原濃度之特定感測圖完全擬合至結合模型：1:1來獲得動力學參數。平衡解離常數(KD)係基於解離速率常數與締合速率常數之比計算(KD = kd/ka)。使用BLI技術確定HFB301001與人類OX40蛋白相互作用之動力學結合參數。該分析在25℃及pH 7.4下量測一定濃度範圍內之OX40蛋白與捕獲之HFB10-1E1及其他抗體之間的相互作用。以下結合親和力表總結了計算之動力學結合參數。HFB301001對重組人類OX40 (hOX40.mFc)具有高親和力，在25℃及pH 7.4下之KD值為4.5 nM。另外兩種抗體顯示出較慢解離速度，導致KD值較小，基準1為0.49 nM，且基準2為0.58 nM。HFB301001與人類OX40-mFc之間的相互作用之動力學結合參數係藉由BLI技術在25℃及pH 7.4下確定。與其他測試抗體相比，HFB301001與重組人類OX40-mFc蛋白特異性結合，具有更高的親和力及更快的解離速率。 結合親和力表
抗體 動力學結合參數
實驗A 實驗 B
k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M) k a(1/Ms) k d(1/s) K D(M)
HFB301001 9.7E+04 4.3E-04 4.5E-09 9.7E+04 4.3E-04 4.4E-09
基準 1 1.5E+05 7.4E-05 4.9E-10 9.8E+04 5.9E-05 6.0E-10
基準 2 1.1E+05 6.1E-05 5.8E-10 1.5E+05 7.6E-05 5.1E-10
實例 14 活體內 腫瘤模型
MC-38鼠類大腸癌模型用於人類OX40 (hOX40)基因敲入(KI)小鼠(目錄號NM-HU-00041，Shanghai Model Organisms Center, Inc.)。為了評估HFB301001在MC-38鼠類大腸直腸癌模型中之藥效學(PD)作用，在45隻雌性hOX40 KI小鼠之右側皮下接種MC-38腫瘤細胞(每隻小鼠8×105個細胞)用於腫瘤發育。腫瘤接種後八天，選擇腫瘤大小在104-243 mm 3之間(平均腫瘤大小為181 mm3)的12隻小鼠，且基於其腫瘤體積隨機分為3組，各組4隻小鼠。各治療組接受10 mg/kg抗OX40抗體HFB301001或抗OX40抗體基準1，或IgG1同型對照注射。所有治療均在隨機分組當天(D0)腹膜內(i.p)投與。
在第三次注射10 mg/kg抗OX40抗體後24小時，藉由流式細胞分析技術量測CD4 +T細胞上之OX40表現。基準1，但並非HFB301001誘導了血液中CD4 +T細胞上之OX40表現的顯著下調(圖15B)。
為了評估HFB301001在MC-38鼠類大腸直腸癌模型中之 活體內抗腫瘤活性，在26隻雌性hOX40 KI小鼠之右側皮下接種MC-38腫瘤細胞(每隻小鼠8×10 5個細胞)用於腫瘤發育。腫瘤接種後七天，選擇20隻腫瘤大小在101-175 mm3之間(平均腫瘤大小為133 mm 3)的小鼠，且根據其腫瘤體積隨機分為4個治療組，各組5隻小鼠。四個治療組為：1 mg/kg及0.1 mg/kg劑量之抗OX40抗體HFB301001、1 mg/kg劑量之抗OX40抗體基準1及10 mg/kg劑量之IgG1同型對照。所有治療均在D0、D3、D6、D10及D13腹膜內投與。箭頭代表治療時間點，誤差條代表平均值之標準誤差，且顯著性水準係藉由最後一個時間點處之單因素方差分析計算(*：p值＜0.05，**：p值＜0.01)。在隨機分組後D0、D3、D6、D10、D12及D15用數位卡尺量測由腫瘤直徑(寬度及長度)代表之腫瘤大小。圖16表明HFB301001與對照相比顯著抑制腫瘤生長，且比基準1具有更大的抗腫瘤生長作用。
為了評估HFB301001在MC-38鼠類大腸直腸癌模型中之 活體內抗腫瘤活性，在80隻hOX40 KI小鼠之右側皮下接種MC-38腫瘤細胞(每隻小鼠8×10 5個細胞)用於腫瘤發育。腫瘤接種後七天，選擇65隻腫瘤大小在42-147 mm 3之間(平均腫瘤大小為82 mm3)的小鼠，且根據其腫瘤體積隨機分為7個治療組，每組10隻小鼠(除了PBS組中僅有5隻小鼠)。治療在隨機分組當天(定義為第0天(D0))開始。七個治療組為：10 mg/kg、1 mg/kg及0.1 mg/kg劑量之抗OX40抗體HFB301001、10 mg/kg及1 mg/kg劑量之抗OX40抗體基準1、10 mg/kg劑量之IgG1同型對照及PBS。所有治療均在D0、D3、D6、D10及D13腹膜內投與。自治療開始至第61天，每周至少量測腫瘤大小及動物體重三次。藉由對數秩檢驗計算顯著性水準(*：p值＜0.05，**：p值＜0.01)。隨機分組後監測存活率60天。用10 mg/kg HFB301001治療之小鼠的存活率顯著高於用10 mg/kg基準1治療之小鼠(圖17)。
為進一步研究抗OX40抗體HFB301001之功效，藉由流式細胞分析技術量測第三次抗OX40抗體治療後24小時腫瘤T細胞誘導之變化。腫瘤接種後八天，選擇腫瘤大小在104-243 mm 3之間(平均腫瘤大小為181 mm 3)的12隻小鼠，且根據其腫瘤體積隨機分為3組，各組4隻小鼠。HFB301001治療顯著增加了CD4 +及CD8 +T細胞中之KI67 +細胞(圖18A至圖18B)且減少了PD-1+細胞(圖18C至圖18D)。另外，基準治療及HFB301001治療均使得腫瘤Treg顯著降低，其中HFB301001組之降低更為明顯(圖18E)。 實例 15 HFB301001 有效誘導 OX40 信號傳導
在使用工程化Jurkat T細胞(亦稱為NF-kB-Luc2/OX40報導Jurkat細胞，其中Luc2報導基因在OX40活化後由NF-kB途徑活化之啟動子的轉錄控制下，參見實例3.1)作為OX40效應細胞且使用表現FcγRIIb之CHO-K1細胞提供抗體交聯的基於報導細胞之實驗中，HFB301001 (HFB10-1E1hG1)顯示出一致的劑量依賴性促效活性。
基於EC50值，HFB301001促效活性不如基準1有效，但具有類似的E 最大值(參見圖19)。該實驗再重複2次，結果類似。資料顯示HFB301001有效誘導OX40信號傳導。 實例 16 HFB301001 響應 OX40 配位體對 OX40 信號傳導的效應
OX40報導細胞(NF-kB-Luc2/OX40報導Jurkat細胞)在缺乏表現FcγRIIb之細胞的情況下用於研究OX40抗體是否阻斷OX40 +細胞中之OX40L結合及信號傳導。簡言之，OX40報導細胞與一定濃度範圍之抗體及OX40L一起培育，且螢光素酶信號為OX40信號之讀數。
基準1及基準2抗體在不同OX40L濃度下對OX40L誘導之OX40信號傳導顯示出劑量依賴性抑制作用(參見圖20C及20D)。然而，HFB301001 (HFB10-1E1hG1)對OX40L在OX40報導細胞中誘導之信號傳導顯示出最小抑制或無抑制，尤其是在80 nM濃度之OX40L下(圖20A)。
此實驗表明HFB301001不會干擾內源性OX40L信號傳導。此等資料與結合表位資料一致。由於內源性OX40L信號傳導可能在免疫網路之調節中發揮重要作用，因此與配位體阻斷對應物相比，保持完整性可能代表HFB301001之優勢。 實例 17 HFB301001 與人類 CD4 +CD3 +T 細胞之結合
使用分離自使用CD3/CD28 Dynabeads預活化之兩個人類供體之周邊血液單核細胞(hPBMC)的CD3 +T細胞評估人類T細胞之活化。CD3/CD28誘導之OX40主要在CD3 +CD4 +T細胞上表現。HFB301001與來自各供體之經活化原代人類CD4 +CD3 +T細胞結合，EC50值分別為0.65及1.36 nM (參見圖21B及21D)。
HFB301001表現出與使用CD3/CD28抗體預活化之猴PBMC中分離之原代CD4 +T細胞類似的結合，結合EC50值計算自三個獨立實驗之MFI劑量反應曲線，範圍為0.09至0.19 nM (資料未示出)。
此等資料表明HFB301001與經活化人類或猴CD4 +T細胞結合。對猴T細胞之結合親和力更高的事實表明猴毒理學研究不太可能低估人類中潛在的安全問題。 實例 18 OX40 在用 HFB301001 處理後在原代 CD4 +T 細胞中之表現
檢查了OX40單株抗體對經活化人類T細胞的效應。T細胞分離自兩個不同供體，#191223-B及#190061。藉由用抗OX40抗體(純系ACT35)染色來確定T細胞上之OX40表現。
HFB301001以劑量依賴性方式增加了在CD3/CD28刺激之周邊人類CD4 + T細胞上表現之OX40的總表面水準，且在約1 nM濃度處達到平穩期。相比之下，其他抗OX40抗體(均在臨床開發中；由Bmk 1代表)誘導此等CD4 + T細胞上之表面OX40水準降低(參見圖22A及22B)。
OX40抗體所致之T細胞上之OX40水準的降低可能會降低OX40促效性抗體達到最佳臨床益處的潛力。鑑於在HFB301001中未觀測到此效應，預期臨床功效會更好。 實例 19 OX40 抗體對 T 細胞功能的效應
在 活體外共刺激活性實驗中研究了OX40單株抗體對人類T細胞功能的效應，其中在超抗原 金黃色葡萄球菌腸毒素A (SEA)存在下測試了抗OX40抗體。刺激70小時後，對培養上清液中之人類IL-2進行定量。
使用基準1 (Bmk 1)抗體，尤其是當使用1 ng/mL (SEA)時未觀測到明顯的劑量依賴性(圖23B)。在較低SEA水準下，在所有4個供體PBMC中均在較高Bmk 1抗體濃度下產生較低IL-2產生水準。
相比之下，HFB301001 (0.5-50 nM)以劑量依賴性方式增加由SEA (1或10 ng/mL)刺激之人類PBMC中的細胞介素IL-2水準(圖23A及23B)。用來自另外4個供體之PBMC重複該實驗一次，結果類似(資料未示出)。
雖然不希望受任何特定理論束縛，但HFB301001更好的劑量依賴性可能至少部分係由於缺乏受體下調以及無內源性配位體阻斷。
資料表明，HFB301001劑量依賴性地增強了T細胞活化，且表明與臨床開發中之其他OX40單株抗體相比，HFB301001更有可能在臨床環境中達成最佳功效。 實例 20 HFB301001 對抗體依賴性細胞毒性 (ADCC) 之效應
由於T-reg耗盡係OX40促效劑抗體抗腫瘤功效之潛在機制之一，因此在存在目標細胞(hOX40轉染之Expi293F細胞)及OX40單株抗體之情況下使用CD16-NF-AT-Luc報導Jurkat細胞來研究此等抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)潛力。
在存在表現hOX40之目標細胞的情況下，HFB301001在效應細胞中劑量依賴性地誘導CD16信號傳導(其代表潛在ADCC活性)。在1:1、3:1、6:1及12:1之效應細胞與目標細胞(E:T)比下分別得到1.2、0.7、0.5及0.3 nM之EC50值(表1)。
Bmk 1亦以劑量依賴性方式表現出ADCC活性，在1:1、3:1及6:1之E:T比下之EC50值分別為2、0.8及0.5 nM；作為IgG2同型之Bmk 2未顯示出預期的可偵測ADCC活性(表1)。
在重複實驗中，用3:1及6:1之E:T比測試了OX40抗體在CD16-NF-AT-Luc報導Jurkat細胞中誘導之潛在ADCC活性，結果類似(資料未示出)。
此等資料表明HFB301001維持ADCC效應功能。 表 1 不同 E:T 比下之抗 OX40 mAb 的 EC 50 值
mAb EC 50(nM)
1:1 3:1 6:1 12:1
HFB301001 1.2 0.7 0.5 0.3
Bmk 1 2 0.8 0.5 NM
Bmk 2 NS NS NS NM
NS：不顯著；NM：未量測 實例 21 HFB301001 對細胞介素釋放之效應
使用來自6個不同供體之新鮮hPBMC以及呈可溶性及盤結合形式之抗體在 活體外評估HFB301001對細胞介素釋放之效應。
不同濃度(3、30或300 µg/ml)之HFB301001或培養基/對照抗體/有絲分裂原在4℃下塗佈隔夜或新鮮添加至96孔U底盤中。將100 μl新鮮PBMC懸浮液(2×10 5個細胞/孔)添加至各孔中。將盤在37℃ 5% CO 2培養箱中培育48小時。自各孔收集上清液，且在分析前保存於-80℃下。根據製造商說明書，使用BDTM CBA人類Th1/Th2細胞介素套組II測定培養上清液中不同細胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNFα及IFNγ)之濃度。
當以可溶形式測試時，在來自所有供體之PBMC中之所有分析物的陰性對照空白(僅完全培養基)或hIgG1同型對照中偵測到最小信號，而陽性對照5 μg/ml之PHA或10 μg/ ml之LPS在所有或大部分供體之PBMC中誘導顯著增加的IL-2 (僅PHA)、IL-4 (僅PHA)、IL-6、IL-10、TNFα (僅PHA)及IFNγ (僅PHA)釋放。與陰性對照類似，在來自所有6個供體之PBMC中，在3、30或300 μg/ml濃度之HFB301001存在下偵測到最小信號，表明在可溶形式 活體外細胞介素釋放分析中測試之濃度下，HFB301001誘導之細胞介素釋放的風險較低。
當以盤結合形式進行測試時，在空白對照中偵測到最小信號。然而，在存在hIgG1同型對照之情況下，在所有供體之PBMC中誘導IL-4、IL-6及TNFα，但不誘導IL-2、IL-10或IFNγ，其可能係由於hIgG1與Fc受體的結合。兩種抗hCD3抗體(10 μg/ml之OKT3及5 μg/ml之UCHT1)用作陽性對照，且與所有或大多數供體之PBMC中之空白對照相比誘導顯著更高的細胞介素釋放。在來自所有6個供體或其中大部分之PBMC中，在3 μg/ml濃度之HFB301001存在下偵測到最小信號，而在30或300 μg/ml之HFB301001存在下劑量依賴性地偵測到IL-4、IL-6及TNFα釋放。重要的是，與相同濃度之hIgG1同型對照相比，300 μg/ml之HFB301001誘導之細胞介素釋放水準及模式顯示出相當或更低的細胞介素釋放水準，表明在盤結合形式 活體外細胞介素釋放分析中，與同型對照hIgG1相比，HFB301001誘導之細胞介素釋放的風險未增加。
在當前實驗條件下，3至300 μg/ml濃度之可溶性HFB301001不會在來自所有6個供體之PBMC中誘導顯著細胞介素釋放，而與相同濃度之hIgG1同型對照相比，300 μg/ml之盤結合HFB301001顯示出相當或更低的細胞介素釋放水準。 實例 22 HFB301001 之毒理學研究
在迄今為止進行之所有小鼠研究中，HFB301001之耐受性良好，無任何與治療相關毒性的跡象。相比於WT小鼠，在hOX40基因敲入小鼠中針對HFB301001觀測到更高清除率及更短T1/2，表明可能存在靶標介導之藥物處置。
在食蟹獼猴之單劑量毒理學研究中，HFB301001在所有劑量水準下均具有良好耐受性，且在100 mg/kg之最高劑量下未觀測到明顯的發現，表明100 mg/kg低於最大耐受劑量(MTD)。在HFB301001之全身暴露中未觀測到與性別相關的差異。AUC 0-t及C 最終值在1至100 mg/kg範圍內以劑量成比例方式增加。HFB301001表現出典型的mAb藥物動力學曲線。儘管與給藥前相比，在1隻100 mg/kg下之雌性中觀測到延長的活化部分促凝血酶原激酶時間及凝血酶原時間以及總膽紅素濃度增加，且在所有動物中亦注意到總蛋白濃度適度增加，但此等變化由於缺乏同時對照組且未觀測到劑量-反應關係，因此可能不被視為與試驗品相關的效應。類似地，HFB301001誘導之較低抗KLH免疫球蛋白滴度之模棱兩可的結果低於或處於歷史對照值的下限，由於缺乏同時對照組，可能不被視為與試驗品相關的效應。
在重複給藥中，對雄性及雌性食蟹獼猴進行GLP毒理學研究，該等猴持續4週每週接受1小時靜脈內輸注，隨後恢復4週。兩隻10 mg/kg下之雄性在給藥期結束時偵測到潛在抗藥物抗體(ADA)，導致其中一隻的HFB301001暴露量顯著減少。給藥期結束時在其他動物中未偵測到ADA。HFB301001之每週投與在所有動物中均具有良好耐受性，且未引起任何相關的毒性跡象。因此，在本研究之實驗條件下，HFB301001之未觀測到不良反應水準(NOAEL)在兩性中均被視為100 mg/kg，其為最高測試劑量，對應於給藥期結束時380500 μg·h/mL之雄性及雌性平均AUC 最後。
總之，在劑量至多為100 mg/kg最高劑量之所有小鼠研究或NHP非GLP單劑量及1個月重複劑量GLP毒性研究中，HFB301001均未誘導顯著毒性發現。HFB301001對建議的FIH起始劑量(每月5 mg平劑量)具有廣泛安全邊際(MOS)。 參考文獻
Wang, R., Gao, C., Raymond, M., Dito, G., Kabbabe, D., Shao, X., Hilt, E., Sun, Y., Pak, I., Gutierrez, M., Melero, I., Spreafico, A., Carvajal, R., Ong, M., Olszanski, A., Milburn, C., Thudium, K., Yang, Z., Feng, Y., Fracasso, P., Korman, A., Aanur, P., Huang, S., Quigley, M.(2019). An Integrative Approach to Inform Optimal Administration of OX40 Agonist Antibodies in Patients with Advanced Solid Tumors, Clinical Cancer Research, dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-19-0526。
如此描述了本發明主題，顯然可以多種方式對其進行修改或改變。此類修改及改變不應被視為背離本發明主題之精神及範疇，且所有此類修改及改變意欲包括於所附申請專利範圍之範疇內。 序列表：
SEQ ID 名稱 序列
SEQ ID NO: 1 HFB10-1E1hG1重鏈可變區之CDR1域的胺基酸序列 GFTFSSYA
SEQ ID NO: 2 HFB10-1E1hG1重鏈可變區之CDR2域的胺基酸序列 ISGSGGST
SEQ ID NO: 3 HFB10-1E1hG1重鏈可變區之CDR3域的胺基酸序列 ARDLSSSWYLDAFDI
SEQ ID NO: 4 HFB10-1E1hG1重鏈可變區之胺基酸序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA ISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDLSSSWYLDAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 5 HFB10-1E1hG1重鏈恆定區之胺基酸序列 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 6 HFB10-1E1hG1重鏈信號肽之胺基酸序列 MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS
SEQ ID NO: 7 HFB10-1E1hG1重鏈之全長胺基酸序列(不含信號肽) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA ISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDLSSSWYLDAFDIWGQGTMVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 8 HFB10-1E1hG1重鏈之全長胺基酸序列(含信號肽) MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA ISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC ARDLSSSWYLDAFDIWGQGTMVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 9 HFB10-1E1hG1輕鏈可變區之CDR1域的胺基酸序列 QGISSW
SEQ ID NO: 10 HFB10-1E1hG1輕鏈可變區之CDR2域的胺基酸序列 AAS
SEQ ID NO: 11 HFB10-1E1hG1輕鏈可變區之CDR3域的胺基酸序列 QQANSFPLT
SEQ ID NO: 12 HFB10-1E1hG1輕鏈可變區之胺基酸序列 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRAS QGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQANSFPLTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 13 HFB10-1E1hG1輕鏈恆定區之胺基酸序列 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 14 HFB10-1E1hG1輕鏈信號肽之胺基酸序列 MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS
SEQ ID NO: 15 HFB10-1E1hG1輕鏈之全長胺基酸序列(不含信號肽) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRAS QGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQANSFPLTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 16 HFB10-1E1hG1輕鏈之全長胺基酸序列(含信號肽) MDLLHKNMKHLWFFLLLVAAPRWVLS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRAS QGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QQANSFPLTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 17 HFB10-1E1hG1重鏈可變區之CDR1域的核苷酸編碼序列 GGCTTCACCTTCTCCTCTTACGCC
SEQ ID NO: 18 HFB10-1E1hG1重鏈可變區之CDR2域的核苷酸編碼序列 ATCTCCGGCTCTGGCGGATCTACC
SEQ ID NO: 19 HFB10-1E1hG1重鏈可變區之CDR3域的核苷酸編碼序列 GCCAGAGATCTGTCCTCCTCCTGGTATCTGGACGCCTTTGATATC
SEQ ID NO: 20 HFB10-1E1hG1重鏈可變區之核苷酸編碼序列 GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGCTCTTTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTCACCTTCTCCTCTTACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGCTATCTCCGGCTCTGGCGGATCTACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCTGTCCTCCTCCTGGTATCTGGACGCCTTTGATATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTGTCCTCT
SEQ ID NO: 21 HFB10-1E1hG1重鏈恆定區之核苷酸編碼序列 GCTTCTACCAAGGGACCCTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCCTCTAAATCCACCTCTGGTGGCACCGCTGCTCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTCGTGACCGTGCCTTCTAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCAGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTTTACACCCTGCCTCCAAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTTAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO: 22 HFB10-1E1hG1重鏈信號肽之核苷酸編碼序列 ATGGACCTGCTGCACAAGAACATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCT
SEQ ID NO: 23 HFB10-1E1hG1重鏈之全長核苷酸編碼序列(不含信號肽) GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGCTCTTTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTCACCTTCTCCTCTTACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGCTATCTCCGGCTCTGGCGGATCTACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCTGTCCTCCTCCTGGTATCTGGACGCCTTTGATATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCTACCAAGGGACCCTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCCTCTAAATCCACCTCTGGTGGCACCGCTGCTCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTCGTGACCGTGCCTTCTAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCAGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTTTACACCCTGCCTCCAAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTTAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO: 24 HFB10-1E1hG1重鏈之全長核苷酸編碼序列(含信號肽) ATGGACCTGCTGCACAAGAACATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCT GAAGTTCAGCTGCTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGCTCTTTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCTGGCTTCACCTTCTCCTCTTACGCCATGTCCTGGGTCCGACAGGCTCCTGGAAAAGGACTGGAATGGGTGTCCGCTATCTCCGGCTCTGGCGGATCTACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGATCTGTCCTCCTCCTGGTATCTGGACGCCTTTGATATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCTACCAAGGGACCCTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCCTCTAAATCCACCTCTGGTGGCACCGCTGCTCTGGGCTGTCTGGTCAAGGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCTGGTGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCTGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTCGTGACCGTGCCTTCTAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCAGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCAGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAACCTCAGGTTTACACCCTGCCTCCAAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTTAAGGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGTTCTGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO: 25 HFB10-1E1hG1輕鏈可變區之CDR1域的核苷酸編碼序列 CAGGGCATCTCTAGCTGG
SEQ ID NO: 26 HFB10-1E1hG1輕鏈可變區之CDR2域的核苷酸編碼序列 GCCAGTTCT
SEQ ID NO: 27 HFB10-1E1hG1輕鏈可變區之CDR3域的核苷酸編碼序列 CAGCAGGCCAACAGCTTCCCTCTGACC
SEQ ID NO: 28 HFB10-1E1hG1輕鏈可變區之核苷酸編碼序列 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCGTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAGGGCATCTCTAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGTTCTCTGCAGTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGGCCAACAGCTTCCCTCTGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAG
SEQ ID NO: 29 HFB10-1E1hG1輕鏈恆定區之核苷酸編碼序列 AGAACCGTGGCTGCCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCATCTGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGTCTTTCAACAGAGGCGAGTGC
SEQ ID NO: 30 HFB10-1E1hG1輕鏈信號肽之核苷酸編碼序列 ATGGACCTGCTGCACAAGAACATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCT
SEQ ID NO: 31 HFB10-1E1hG1輕鏈之全長核苷酸編碼序列(不含信號肽) GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCGTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAGGGCATCTCTAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGTTCTCTGCAGTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGGCCAACAGCTTCCCTCTGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGAGAACCGTGGCTGCCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCATCTGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGTCTTTCAACAGAGGCGAGTGC
SEQ ID NO: 32 HFB10-1E1hG1輕鏈之全長核苷酸編碼序列(含信號肽) ATGGACCTGCTGCACAAGAACATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCT GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCGTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCTCTCAGGGCATCTCTAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGAAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACGCTGCCAGTTCTCTGCAGTCTGGCGTGCCCTCTAGATTCTCTGGCTCTGGATCTGGCACCGACTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGGCCAACAGCTTCCCTCTGACCTTTGGCGGCGGAACAAAGCTGGAAATCAAGAGAACCGTGGCTGCCCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCATCTGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCTAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAAGTGACCCACCAGGGACTGTCTAGCCCCGTGACCAAGTCTTTCAACAGAGGCGAGTGC
SEQ ID NO: 33   MCVGARRLGRGPCAALLLLGLGLSTVTGLHCVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLRSGSERKQLCTATQDTVCRCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGKHTLQPASNSSDAICEDRDPPATQPQETQGPPARPITVQPTEAWPRTSQGPSTRPVEVPGGRAVAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
SEQ ID NO: 34   CSRSQNTVCRPCGPGFYND
無
圖1A顯示HFB10-1E1hG1與OX40蛋白之結合。HFB10-1E1hG1之EC80為0.71 nM。 圖1B顯示HFB10-1E1hG1與在293T細胞表面上表現之人類OX40蛋白的結合。EC50為2 nM (平均螢光強度(MFI))。 圖1C顯示HFB10-1E1hG1與在293T細胞表面上表現之食蟹獼猴OX40蛋白的結合。EC50為2.9 nM (MFI)。 圖1D顯示HFB10-1E1hG1與在293T細胞表面上表現之小鼠OX40蛋白的結合。HFB10-1E1hG1不與在293T細胞表面上表現之小鼠OX40蛋白結合(MFI)。 圖1E顯示HFB10-1E1hG1與在293T細胞表面上表現之人類CD40蛋白的結合。HFB10-1E1hG1不與在293T細胞表面上表現之人類CD40蛋白結合(MFI)。 圖1F顯示表現於293T細胞表面上之人類OX40蛋白與HFB10-1E1hG1、參考1、參考2、參考3及參考4中之每一者的結合。HFB10-1E1hG1之EC50為2.02 nM (MFI)；參考1之EC50為2.67 nM (MFI)；參考2之EC50為4.17 nM (MFI)；參考3之EC50為1.92 nM (MFI)；參考4之EC50為2.11 nM (MFI)。 圖1G顯示表現於293T細胞表面上之食蟹獼猴OX40蛋白與HFB10-1E1hG1、參考1、參考2、參考3及參考4中之每一者的結合。HFB10-1E1hG1之EC50為2.94 nM (MFI)；參考1之EC50為2.91 nM (MFI)；參考2之EC50為6.13 nM (MFI)；參考3之EC50為2.57 nM (MFI)；參考4之EC50為3.54 nM (MFI)。 圖2A顯示HFB10-1E1hG1在Jurkat報導細胞中之促效活性。當與抗人類IgG交聯時，HFB10-1E1hG1之EC50為2.9 nM (GFP之MFI)。 圖2B顯示HFB10-1E1hG1在Jurkat報導細胞中之促效活性。當HFB10-1E1hG1不與抗人類IgG交聯時，其EC50大得多。在不與抗人類IgG交聯之情況下，單獨的三聚體OX40L重組蛋白可在EC50等於45 nM時活化NF-kb信號傳導途徑。MFI：螢光(GFP)強度之量度。 圖2C顯示HFB10-1E1hG1及OX40L在與抗人類IgG交聯中之協同促效效應。與各個別組分單獨起作用之效應相比，HFB10-1E1hG1及OX40L一起增加了GFP之MFI。 圖2D顯示HFB10-1E1hG1在原代CD4 +T細胞中之促效活性。藉由IL-2分泌水準量測HFB10-1E1hG1在原代CD4 +T細胞中之促效活性，且獲得之EC50為0.2 nM。 圖2E顯示HFB10-1E1hG1在原代CD4 +T細胞中之促效活性。HFB10-1E1hG1及OX40L在刺激原代CD4 +T細胞中之IL-2分泌方面具有協同促效效應。 圖3顯示HFB10-1E1hG1之藥物動力學測試。在治療後的100小時內，IgG水準自100+ µg/mL降至低於10 µg/mL。 圖4A顯示HFB10-1E1hG1在 活體內之抗腫瘤功效。與PBS對照相比，HFB10-1E1hG1顯著減小了腫瘤大小。 圖4B顯示HFB10-1E1hG1在 活體內之抗腫瘤功效。HFB10-1E1hG1未展示引起小鼠體重顯著減輕之不良副作用。 圖4C顯示0.1 mg/kg之HFB10-1E1hG1、1 mg/kg之HFB10-1E1hG1、1 mg/kg之參考1及10 mg/kg之對照的 活體內抗腫瘤功效(腫瘤大小)。1 mg/kg之HFB10-1E1hG1治療在量測之15天期間在控制腫瘤大小方面最有效。 圖4D顯示0.1 mg/kg之HFB10-1E1hG1、1 mg/kg之HFB10-1E1hG1、1 mg/kg之參考1及10 mg/kg之對照的 活體內抗腫瘤功效(體重)。HFB10-1E1hG1未展示導致小鼠體重顯著減輕之不良副作用。 圖5A顯示溫度對HFB10-1E1hG1穩定性之效應。SDS-PAGE結果表明，HFB10-1E1hG1在不同溫度下具有良好穩定性。 圖5B顯示pH對HFB10-1E1hG1穩定性之效應。SDS-PAGE結果表明，HFB10-1E1hG1在不同pH條件下展示良好穩定性。 圖5C顯示HFB10-1E1hG1之氧化應激測試。SDS-PAGE結果表明，HFB10-1E1hG1在不同氧化應激條件下具有良好穩定性。 圖5D顯示凍融對HFB10-1E1hG1穩定性之效應。SDS-PAGE結果表明，HFB10-1E1hG1在不同凍融條件下具有良好穩定性。 圖6A-6F描繪HFB10-1E1hG1與分離自三隻不同猴子之活化CD4 +T細胞的結合。各曲線代表使用四參數模型擬合之非線性曲線。曲線上之各點代表一個實際資料點。#200107 (圖6A：陽性細胞百分比及圖6B：MFI)、#M20Z013009 (圖6C：陽性細胞百分比及圖6D：MFI)及#M20Z025008 (圖6E：陽性細胞百分比及圖6F：MFI)。 圖7顯示野生型(WT)小鼠中Bmk 1 (1 mg/kg及10 mg/kg)及HFB10-1E1hG1 (1 mg/kg及10 mg/kg)之平均抗體濃度相對於時間之曲線。符號：資料點之平均值，HFB10-1E1hG1投與在兩個量測劑量下產生之抗體濃度均高於Bmk 1。 圖8顯示hOX40-KI小鼠中Bmk 1及HFB10-1E1hG1之平均抗體濃度相對於時間之曲線。符號：資料點之平均值，相比於Bmk 1 (投與後約70小時處小於0.1 µg/mL)，以10 mg/kg投與HFB10-1E1hG1具有持久效果(投與後200小時處超過1 µg/mL)。 圖9顯示CD8 +T細胞在腫瘤組織之CD45 +細胞中之百分比。 圖10顯示Treg腫瘤組織之CD4 +T細胞中之百分比。 圖11顯示Ki67在腫瘤組織之CD4 +及CD8 +T細胞中之表現。 圖12顯示PD-1在腫瘤組織之CD4 +及CD8 +T細胞中之表現。 圖13顯示HFB301001作為抗OX40抗體之表位，其映射至OX40及OX40L複合物之3D晶體結構。 圖14A-14B顯示使用基於細胞之生物發光分析量測之OX40配位體之促效活性。圖14A顯示單獨OX40配位體之報導基因活性；圖14B顯示在抗OX40抗體HFB301001、基準1或基準2存在下OX40配位體之報導基因活性。Y軸顯示相對發光(RLU)。 圖15A-15B顯示抗體治療後CD4 +T細胞中之OX40表現量。圖15A顯示用不同濃度之抗OX40抗體治療後自人類PBMC分離之OX40陽性CD4 +T細胞的百分比，如藉由流式細胞分析技術所量測。在人類OX40 (hOX40)基因敲入MC-38鼠類大腸直腸癌模型中，在第三次用10 mg/kg抗OX40抗體治療後24小時量測CD4 +T細胞中之OX40表現(圖15B)。MFI代表平均螢光強度。 圖16顯示在用同型對照(10 mg/kg)、抗OX40抗體基準1 (1 mg/kg)或抗OX40抗體HFB301001 (0.1 mg/kg及1 mg/kg)治療後，hOX40基因敲入MC-38鼠類腫瘤模型中之腫瘤大小。箭頭表示治療時間點，且誤差條表示標準誤差。在最後一個時間點藉由單因素方差分析計算顯著性(*： P＜0.05，**： P＜0.01)。 圖17顯示在用抗OX40抗體HFB301001 (10mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kg)、抗OX40抗體基準1 (10 mg/kg或1 mg/kg)、對照(10 mg/kg)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)治療後，MC-38鼠類大腸直腸癌模型中人類OX40 (hOX40)基因敲入小鼠之存活百分比。藉由對數秩檢驗計算顯著性(*： P＜0.05，**： P＜0.01)。 圖18A-18E顯示在用對照(IgG1)、OX40抗體基準1或抗OX40抗體HFB301001治療後，hOX40基因敲入MC-38小鼠大腸直腸癌模型之腫瘤微環境中特異性免疫細胞群體的百分比。圖18A顯示活CD45 +CD3 +CD4 +細胞中CD3 +CD4 +Ki67 +T細胞之百分比。圖18B顯示活CD45 +CD3 +CD8 +細胞中CD3 +CD8 +Ki67 +T細胞之百分比。圖18C顯示活CD45 +CD3 +CD4 +細胞中CD3 +CD4 +PD-1 +T細胞之百分比。圖18D顯示活CD45 +CD3 +CD8 +細胞中CD3 +CD8 +PD-1 +T細胞之百分比。圖18E顯示活CD45 +CD3 +CD4 +細胞中CD3 +CD4 +CD25 +Foxp 3+細胞之百分比。 圖19顯示在與HFB10-1E1hG1、基準1 (Bmk1)或基準2 (Bmk2)抗體一起培育後，來自OX40信號傳導報導Jurkat T細胞(NF-kB-Luc2/OX40報導Jurkat細胞)之螢光素酶信號。 圖20A-20D顯示在HFB10-1E1hG1 (圖20A)、同型對照(圖20B)、基準1 (圖20C)及基準2 (圖20D)抗體存在下經OX40配位體(OXL40)刺激之OX40報導細胞(NF-kB-Luc2/OX40報導Jurkat細胞)的螢光素酶信號。 圖21A-21D顯示HFB10-1E1hG1與經活化人類CD4 +CD3 +T細胞之結合。T細胞分離自兩個供體，#190055 (圖21A：陽性細胞百分比；圖21B：MFI)及#190061 (圖21C：陽性細胞百分比；圖21D：MFI)。亦在實驗中測試了同型對照及基準1抗體(Bmk1)。 圖22A-22B顯示用HFB10-1E1hG1處理後原代CD4 +T細胞上之OX40表現。T細胞分離自兩個不同供體，#191223-B (圖22A)及#190061 (圖22B)。藉由用抗OX40抗體染色來確定T細胞上之OX40表現。 圖23A-23B顯示用SEA及抗OX40抗體HFB10-1E1hG1及基準1 (Bmk1)刺激人類PBMC後的IL-2水準。刺激70小時後，對培養上清液中之人類IL-2進行定量。用10ng/mL (圖23A)或1ng/mL (圖23B) SEA刺激PBMC。一式兩份地測試各實驗條件。符號顯示平均值，且誤差條代表標準偏差(SD)。 
               
          <![CDATA[<110> 香港商高誠生物醫藥(香港)有限公司(HIFIBIO (HK) LIMITED)]]>
          <![CDATA[<120> 抗OX40單株抗體及其使用方法]]>
          <![CDATA[<140> TW 111124135]]>
          <![CDATA[<141> 2022-06-28]]>
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          <![CDATA[<170> BiSSAP 1.3.6]]>
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          Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 
          1               5               
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          <![CDATA[<400> 2]]>
          Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 
          1               5               
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          Ala Arg Asp Leu Ser Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Ala Phe Asp Ile 
          1               5                   10                  15  
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          <![CDATA[<400> 4]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Leu Ser Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210> 5]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> ]]>HFB10-1E1hG1 HC恆定區A.A.序列
          <![CDATA[<400> 5]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
              290                 295                 300                 
          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 26]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Arti]]>ficial Sequence)
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 HC信號肽序列]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          Met Asp Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210> 7]]>
          <![CDATA[<211> 452]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 HC全長A.A.序列(不含信號肽)]]>
          <![CDATA[<400> 7]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Leu Ser Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210]]>> 8]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;211&gt; 478]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;212&gt; PRT]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt; ]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt; HFB10-1E1hG1 HC全長A.A.序列(含信號肽)]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt; 8]]&gt;
          <br/><![CDATA[Met Asp Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 
                      20                  25                  30          
          Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 
                  35                  40                  45              
          Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg 
              50                  55                  60                  
          Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 
                      100                 105                 110         
          Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          Ser Trp Tyr Leu Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 
              130                 135                 140                 
          Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 
                          165                 170                 175     
          Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 
                  195                 200                 205             
          Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 
              210                 215                 220                 
          Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 
                          245                 250                 255     
          Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 
                      260                 265                 270         
          Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 
                  275                 280                 285             
          Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 
              290                 295                 300                 
          Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 
                      340                 345                 350         
          Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 
                  355                 360                 365             
          Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 
              370                 375                 380                 
          Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 
                          405                 410                 415     
          Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 
                      420                 425                 430         
          Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 
                  435                 440                 445             
          Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 
              450                 455                 460                 
          Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
          465                 470                 475             
          <![CDATA[<210> 9]]>
          <![CDATA[<211> 6]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VL CDR1 A.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 9]]>
          Gln Gly Ile Ser Ser Trp 
          1               5       
          <![CDATA[<210> 10]]>
          <![CDATA[<211> 3]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VL CDR2 A.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 10]]>
          Ala Ala Ser 
          1               
          <![CDATA[<210> 11]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VL CDR3 A.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 107]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VL A.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 107]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 LC恆定區A.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 26]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 LC信號肽序列]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Met Asp Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser 
                      20                  25      
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 214]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 LC全長A.A.序列(不含信號肽)]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 240]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 LC全長序列(含信號肽)]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Met Asp Leu Leu His Lys Asn Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 
                      20                  25                  30          
          Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 
                  35                  40                  45              
          Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 
              50                  55                  60                  
          Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 
              130                 135                 140                 
          Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 
                          165                 170                 175     
          Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 
                      180                 185                 190         
          Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 
              210                 215                 220                 
          Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
          225                 230                 235                 240 
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VH CDR1 N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          ggcttcacct tctcctctta cgcc                                           24
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 24]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VH CDR2 N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          atctccggct ctggcggatc tacc                                           24
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 45]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VH CDR3 N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          gccagagatc tgtcctcctc ctggtatctg gacgcctttg atatc                     45
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 366]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VH N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          gaagttcagc tgctggaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggctc tttgagactg      60
          tcttgtgccg cctctggctt caccttctcc tcttacgcca tgtcctgggt ccgacaggct     120
          cctggaaaag gactggaatg ggtgtccgct atctccggct ctggcggatc tacctactac     180
          gccgactccg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac     240
          ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagagatctg     300
          tcctcctcct ggtatctgga cgcctttgat atctggggcc agggcaccat ggtcaccgtg     360
          tcctct                                                                366
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 990]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 HC恆定區N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          gcttctacca agggaccctc tgtgttccct ctggctcctt cctctaaatc cacctctggt      60
          ggcaccgctg ctctgggctg tctggtcaag gattacttcc ctgagcctgt gaccgtgtct     120
          tggaactctg gtgctctgac ctccggcgtg cacacattcc ctgctgtgct gcagtcctct     180
          ggcctgtact ctctgtcctc tgtcgtgacc gtgccttcta gctctctggg cacccagacc     240
          tacatctgca acgtgaacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc     300
          aagtcctgcg acaagaccca cacctgtcct ccatgtccag ctccagaact gctcggcgga     360
          ccttccgtgt tcctgtttcc tccaaagcct aaggacaccc tgatgatctc tcggacccct     420
          gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct cacgaggacc cagaagtgaa gttcaattgg     480
          tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ctagagagga acagtacaac     540
          tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa     600
          gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgaaaa gaccatctct     660
          aaggccaagg gccagcctcg cgaacctcag gtttacaccc tgcctccaag ccgggaagag     720
          atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggttaagg gcttctaccc ctccgatatc     780
          gccgtggaat gggagtctaa cggccagcct gagaacaact acaagacaac ccctcctgtg     840
          ctggactccg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtccagatgg     900
          cagcagggca acgtgttctc ctgttctgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacaca     960
          cagaagtccc tgtctctgtc ccctggcaag                                      990
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 78]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-]]>1E1hG1 HC信號肽N.A.序列
          <![CDATA[<400> 22]]>
          atggacctgc tgcacaagaa catgaagcac ctgtggttct ttctgctgct ggtggccgct     60
          cctagatggg tgctgtct                                                   78
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 1356]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 HC全長N.A.序列(不含信號肽)]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          gaagttcagc tgctggaatc tggcggagga ctggttcagc ctggcggctc tttgagactg      60
          tcttgtgccg cctctggctt caccttctcc tcttacgcca tgtcctgggt ccgacaggct     120
          cctggaaaag gactggaatg ggtgtccgct atctccggct ctggcggatc tacctactac     180
          gccgactccg tgaagggcag attcaccatc agccgggaca actccaagaa caccctgtac     240
          ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgtgc cagagatctg     300
          tcctcctcct ggtatctgga cgcctttgat atctggggcc agggcaccat ggtcaccgtg     360
          tcctctgctt ctaccaaggg accctctgtg ttccctctgg ctccttcctc taaatccacc     420
          tctggtggca ccgctgctct gggctgtctg gtcaaggatt acttccctga gcctgtgacc     480
          gtgtcttgga actctggtgc tctgacctcc ggcgtgcaca cattccctgc tgtgctgcag     540
          tcctctggcc tgtactctct gtcctctgtc gtgaccgtgc cttctagctc tctgggcacc     600
          cagacctaca tctgcaacgt gaaccacaag ccttccaaca ccaaggtgga caagaaggtg     660
          gaacccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgtcctccat gtccagctcc agaactgctc     720
          ggcggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatctctcgg     780
          acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtctcacg aggacccaga agtgaagttc     840
          aattggtacg tggacggcgt ggaagtgcac aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag     900
          tacaactcca cctacagagt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ttggctgaac     960
          ggcaaagagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ctgctcctat cgaaaagacc    1020
          atctctaagg ccaagggcca gcctcgcgaa cctcaggttt acaccctgcc tccaagccgg    1080
          gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg ttaagggctt ctacccctcc    1140
          gatatcgccg tggaatggga gtctaacggc cagcctgaga acaactacaa gacaacccct    1200
          cctgtgctgg actccgacgg ctcattcttc ctgtactcca agctgacagt ggacaagtcc    1260
          agatggcagc agggcaacgt gttctcctgt tctgtgatgc acgaggccct gcacaaccac    1320
          tacacacaga agtccctgtc tctgtcccct ggcaag                              1356
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 1434]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 HC全長N.A.序列(含信號肽)]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          atggacctgc tgcacaagaa catgaagcac ctgtggttct ttctgctgct ggtggccgct      60
          cctagatggg tgctgtctga agttcagctg ctggaatctg gcggaggact ggttcagcct     120
          ggcggctctt tgagactgtc ttgtgccgcc tctggcttca ccttctcctc ttacgccatg     180
          tcctgggtcc gacaggctcc tggaaaagga ctggaatggg tgtccgctat ctccggctct     240
          ggcggatcta cctactacgc cgactccgtg aagggcagat tcaccatcag ccgggacaac     300
          tccaagaaca ccctgtacct gcagatgaac tccctgagag ccgaggacac cgccgtgtac     360
          tactgtgcca gagatctgtc ctcctcctgg tatctggacg cctttgatat ctggggccag     420
          ggcaccatgg tcaccgtgtc ctctgcttct accaagggac cctctgtgtt ccctctggct     480
          ccttcctcta aatccacctc tggtggcacc gctgctctgg gctgtctggt caaggattac     540
          ttccctgagc ctgtgaccgt gtcttggaac tctggtgctc tgacctccgg cgtgcacaca     600
          ttccctgctg tgctgcagtc ctctggcctg tactctctgt cctctgtcgt gaccgtgcct     660
          tctagctctc tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga accacaagcc ttccaacacc     720
          aaggtggaca agaaggtgga acccaagtcc tgcgacaaga cccacacctg tcctccatgt     780
          ccagctccag aactgctcgg cggaccttcc gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac     840
          accctgatga tctctcggac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtggatgt gtctcacgag     900
          gacccagaag tgaagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc     960
          aagcctagag aggaacagta caactccacc tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg    1020
          caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct    1080
          gctcctatcg aaaagaccat ctctaaggcc aagggccagc ctcgcgaacc tcaggtttac    1140
          accctgcctc caagccggga agagatgacc aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtt    1200
          aagggcttct acccctccga tatcgccgtg gaatgggagt ctaacggcca gcctgagaac    1260
          aactacaaga caacccctcc tgtgctggac tccgacggct cattcttcct gtactccaag    1320
          ctgacagtgg acaagtccag atggcagcag ggcaacgtgt tctcctgttc tgtgatgcac    1380
          gaggccctgc acaaccacta cacacagaag tccctgtctc tgtcccctgg caag          1434
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 18]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VL CDR1 N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          cagggcatct ctagctgg                                                  18
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 9]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VL CDR2 N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
          gccagttct                                                       9
          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<211> 27]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VL CDR3 N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
          cagcaggcca acagcttccc tctgacc                                        27
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 321]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 VL N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc gtgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc      60
          atcacctgta gagcctctca gggcatctct agctggctgg cctggtatca gcagaagcct     120
          ggaaaggccc ctaagctgct gatctacgct gccagttctc tgcagtctgg cgtgccctct     180
          agattctctg gctctggatc tggcaccgac ttcaccctga caatctctag cctgcagcct     240
          gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag gccaacagct tccctctgac ctttggcggc     300
          ggaacaaagc tggaaatcaa g                                               321
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 321]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequen]]>ce)
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 LC恆定區N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          agaaccgtgg ctgccccttc cgtgttcatc ttcccaccat ctgacgagca gctgaagtcc      60
          ggcacagctt ctgtcgtgtg cctgctgaac aacttctacc ctcgggaagc caaggtgcag     120
          tggaaggtgg acaatgccct gcagtccggc aactcccaag agtctgtgac cgagcaggac     180
          tccaaggact ctacctacag cctgtcctcc acactgaccc tgtctaaggc cgactacgag     240
          aagcacaagg tgtacgcctg tgaagtgacc caccagggac tgtctagccc cgtgaccaag     300
          tctttcaaca gaggcgagtg c                                               321
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 78]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 LC信號肽N.A.序列]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          atggacctgc tgcacaagaa catgaagcac ctgtggttct ttctgctgct ggtggccgct     60
          cctagatggg tgctgtct                                                   78
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 642]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 LC全長N.A.序列(不含信號肽)]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc gtgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc      60
          atcacctgta gagcctctca gggcatctct agctggctgg cctggtatca gcagaagcct     120
          ggaaaggccc ctaagctgct gatctacgct gccagttctc tgcagtctgg cgtgccctct     180
          agattctctg gctctggatc tggcaccgac ttcaccctga caatctctag cctgcagcct     240
          gaggacttcg ccacctacta ctgtcagcag gccaacagct tccctctgac ctttggcggc     300
          ggaacaaagc tggaaatcaa gagaaccgtg gctgcccctt ccgtgttcat cttcccacca     360
          tctgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac     420
          cctcgggaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaatgccc tgcagtccgg caactcccaa     480
          gagtctgtga ccgagcagga ctccaaggac tctacctaca gcctgtcctc cacactgacc     540
          ctgtctaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gtgaagtgac ccaccaggga     600
          ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac agaggcgagt gc                        642
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 720]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> HFB10-1E1hG1 LC全長N.A.序列(含信號肽)]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          atggacctgc tgcacaagaa catgaagcac ctgtggttct ttctgctgct ggtggccgct      60
          cctagatggg tgctgtctga catccagatg acccagtctc catcctccgt gtctgcctct     120
          gtgggcgaca gagtgaccat cacctgtaga gcctctcagg gcatctctag ctggctggcc     180
          tggtatcagc agaagcctgg aaaggcccct aagctgctga tctacgctgc cagttctctg     240
          cagtctggcg tgccctctag attctctggc tctggatctg gcaccgactt caccctgaca     300
          atctctagcc tgcagcctga ggacttcgcc acctactact gtcagcaggc caacagcttc     360
          cctctgacct ttggcggcgg aacaaagctg gaaatcaaga gaaccgtggc tgccccttcc     420
          gtgttcatct tcccaccatc tgacgagcag ctgaagtccg gcacagcttc tgtcgtgtgc     480
          ctgctgaaca acttctaccc tcgggaagcc aaggtgcagt ggaaggtgga caatgccctg     540
          cagtccggca actcccaaga gtctgtgacc gagcaggact ccaaggactc tacctacagc     600
          ctgtcctcca cactgaccct gtctaaggcc gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgt     660
          gaagtgaccc accagggact gtctagcccc gtgaccaagt ctttcaacag aggcgagtgc     720
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  277]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人(H. sapien)]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu 
          1               5                   10                  15      
          Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro 
                  35                  40                  45              
          Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys 
              50                  55                  60                  
          Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys 
                          85                  90                  95      
          Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys 
                  115                 120                 125             
          Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp 
              130                 135                 140                 
          Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro 
                          165                 170                 175     
          Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr 
                      180                 185                 190         
          Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val 
              210                 215                 220                 
          Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser 
                      260                 265                 270         
          Thr Leu Ala Lys Ile 
                  275         
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人(H. sapien)]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Asn Asp
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Claims (36)

  1. 一種分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體或其抗原結合片段作為OX40促效劑在包含SEQ ID NO: 34、基本上由其組成或由其組成之表位處特異性結合至OX40 ( 例如人類OX40)，且基本上不影響OX40-OX40L相互作用/結合。
  2. 如請求項1之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其在存在或不存在OX40L之情況下誘導NF-kB介導之OX40信號傳導。
  3. 如請求項1或2之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其不抑制或增強(內源性) OX40L誘導之OX40信號傳導( 例如NF-kB信號傳導)。
  4. 如請求項3之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中OX40L為至少約50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM或更多。
  5. 如請求項1至4中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其以約0.01-5 nM、0.1-0.3 nM或0.5-1.5 nM ( 例如0.65或1.36 nM)之EC50值結合至活化之原代(人類或食蟹獼猴) CD4 +CD3 +T細胞。
  6. 如請求項1至5中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其以劑量依賴性方式增加活性( 例如CD3/CD28刺激之)周邊人類CD4 +T細胞上之總表面水準OX40表現( 例如具有由約1 nM之該抗體或其片段刺激之最大OX40表現)。
  7. 如請求項1至6中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其劑量依賴性地增強T細胞活化。
  8. 如請求項6之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其增加活化之人類PBMC中之細胞介素( 例如IL-2)產生；視情況，該等人類PBMC經1或10 ng/mL之 金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)腸毒素A (SEA)刺激。
  9. 如請求項1至8中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其在表現OX-40之目標細胞存在下在效應細胞中劑量依賴性地誘導CD16介導之ADCC， 例如，在12:1至1:1之效應細胞與目標細胞(E:T)比下以約0.3-1.2 nM之EC50。
  10. 如請求項1至9中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其在至多300 μg/mL下不會在原代PBMC中誘導顯著細胞介素釋放。
  11. 如請求項1至10中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其在至少約100 mg/kg之最大可耐受劑量下不會在小鼠中誘導顯著毒性。
  12. 如請求項1至11中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其包含： a)      重鏈可變區(VH)，其包含SEQ ID NO: 1之重鏈CDR1、SEQ ID NO: 2之重鏈CDR2及SEQ ID NO: 3之重鏈CDR3，以及 b)      輕鏈可變區(VL)，其包含SEQ ID NO: 9之輕鏈CDR1、SEQ ID NO: 10之輕鏈CDR2及SEQ ID NO: 11之輕鏈CDR3。
  13. 如請求項12之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中： a)      該VH包含SEQ ID NO: 4之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 4具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列；及 b)      該VL包含SEQ ID NO: 12之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 12具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列。
  14. 如請求項12或13之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其進一步包含重鏈恆定區(CH)及輕鏈恆定區(CL)。
  15. 如請求項14之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中： 1)      該CH包含SEQ ID NO: 5之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 5具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列；及/或 2)      該CL包含SEQ ID NO: 13之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 13具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列。
  16. 如請求項12至15中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其進一步包含在該VH之N末端的重鏈信號序列，及/或在該VL之N末端的輕鏈信號序列。
  17. 如請求項16之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中： 1)      該重鏈信號序列包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 6具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列；及/或 2)      該輕鏈信號序列包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 14具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性之胺基酸序列。
  18. 如請求項12至17中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為IgG，諸如IgG1。
  19. 如請求項12至18中任一項之分離之單株抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、scFv或sdAb。
  20. 一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含如請求項1至17中任一項之單株抗體或其抗原結合片段及治療部分，視情況，該單株抗體或其抗原結合片段融合至作為蛋白質之該治療部分。
  21. 一種編碼如請求項1至19中任一項之單株抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。
  22. 如請求項21之多核苷酸，其包含具有SEQ ID NO: 20之多核苷酸序列之重鏈可變區的編碼序列，及/或具有SEQ ID NO: 28之多核苷酸序列之輕鏈可變區的編碼序列。
  23. 如請求項21或22之多核苷酸，其進一步包含具有SEQ ID NO: 21之多核苷酸序列之重鏈恆定區的編碼序列，及/或具有SEQ ID NO: 29之多核苷酸序列之輕鏈恆定區的編碼序列。
  24. 一種包含如請求項21至23中任一項之多核苷酸的載體(諸如用於哺乳動物表現之表現載體)。
  25. 一種宿主細胞，其包含如請求項21至23中任一項之多核苷酸，或如請求項24之載體。
  26. 一種產生如請求項1至19中任一項之單株抗體或其抗原結合片段之方法，該方法包括在適合於抗體在該宿主細胞中表現之條件下在培養基中培養如請求項25之宿主細胞，視情況進一步包括自該培養基收穫、收集、分離或純化該單株抗體或其抗原結合片段。
  27. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至19中任一項之單株抗體或其抗原結合片段、如請求項20之ADC、如請求項21至23中任一項之多核苷酸或如請求項24之載體；及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
  28. 如請求項27之醫藥組合物，其進一步包含第二治療劑，或用於與第二治療劑一起投與。
  29. 一種治療有需要之患者之癌症的方法，該方法包括向該患者投與治療有效量之OX40促效劑抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段作為OX40促效劑在包含SEQ ID NO: 34、基本上由其組成或由其組成之表位處特異性結合至OX40 ( 例如人類OX40)，且基本上不影響OX40-OX40L相互作用/結合。
  30. 一種治療有需要之患者之癌症的方法，該方法包括向該患者投與如請求項1至19中任一項之單株抗體或其抗原結合片段、如請求項20之ADC、如請求項21至23中任一項之多核苷酸、如請求項24之載體或如請求項27或28之醫藥組合物。
  31. 一種如請求項1至19中任一項之單株抗體或其抗原結合片段、如請求項20之ADC、如請求項21至23中任一項之多核苷酸、如請求項24之載體或如請求項27或28之醫藥組合物在製造用於治療癌症之藥劑中之用途。
  32. 如請求項29或30之方法或如請求項31之用途，其中該癌症選自由以下組成之群：鱗狀細胞癌( 例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌及胃腸間質癌)、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝腫瘤、乳癌、大腸癌、直腸癌、大腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散黑色素瘤、惡性痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤及B細胞淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、毛細胞白血病、慢性骨髓胚細胞性白血病、移植後淋巴增生性病症(PTLD)、與瘢痕痣、水腫(例如與腦腫瘤相關)及梅格斯症候群(Meigs syndrome)相關之異常血管增殖、腦腫瘤及腦癌、頭頸癌，以及相關癌轉移。
  33. 一種如請求項1至19之抗OX40單株抗體或其抗原結合片段、或如請求項20之抗體-藥物結合物、或如請求項27或28之醫藥組合物中之任一者在以下中之一或多者中之用途：抑制Treg功能(例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞(例如表現高水準OX40之細胞)、增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫力、增強T細胞功能及/或耗盡表現OX40之細胞。
  34. 一種如請求項1至19之抗OX40單株抗體或其抗原結合片段、或如請求項20之抗體-藥物結合物、或如請求項27或28之醫藥組合物中之任一者在製造用於以下中之一或多者之藥劑中之用途：抑制Treg功能(例如抑制Treg之抑制功能)、殺死表現OX40之細胞(例如表現高水準OX40之細胞)、增加效應T細胞功能及/或增加記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫性、增強T細胞功能及/或耗盡表現OX40之細胞。
  35. 一種套組，其包含如請求項1至19中任一項之抗OX40抗體或其抗原結合片段、如請求項20之抗體-藥物結合物或如請求項27或28之醫藥組合物，較佳進一步包括投藥裝置。
  36. 一種活化T細胞(諸如CD4 +T細胞)、抑制Treg細胞、殺死表現OX40之目標細胞、增強效應或記憶T細胞功能或降低腫瘤誘導之免疫抑制的方法，其包括使該T細胞、該Treg細胞、該表現OX40之目標細胞、該效應或記憶T細胞分別與OX40促效劑抗體，諸如如請求項1至19中任一項之單株抗體或其抗原結合片段接觸，其中該促效劑抗體結合至包含SEQ ID NO: 34之胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成之人類OX40表位。
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