[go: up one dir, main page]

TW202302848A - 以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法 - Google Patents

以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202302848A
TW202302848A TW111107015A TW111107015A TW202302848A TW 202302848 A TW202302848 A TW 202302848A TW 111107015 A TW111107015 A TW 111107015A TW 111107015 A TW111107015 A TW 111107015A TW 202302848 A TW202302848 A TW 202302848A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
seq
sgrna
guide
Prior art date
Application number
TW111107015A
Other languages
English (en)
Inventor
阮國祥
建明 劉
都鐸 傅爾加
艾瑞克 甘納爾 安德森
饒靈均
瑪南 諾爾茲漢 阿布杜爾
瑪西亞斯 海登瑞屈
葛雷高里 艾力克桑卓維奇 多克辛
傑斯柏 葛羅瑪達
Original Assignee
美商維泰克斯製藥公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 美商維泰克斯製藥公司 filed Critical 美商維泰克斯製藥公司
Publication of TW202302848A publication Critical patent/TW202302848A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • General Preparation And Processing Of Foods (AREA)

Abstract

本發明涵蓋用於治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的組合物及方法。

Description

以CRISPR/SACAS9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法
第1型肌強直性營養不良(DM1)為一種體染色體顯性肌肉病症，其起因於人類 DMPK基因之3'非轉譯區(UTR)中存在CTG重複序列擴增，導致對於肌肉功能具有重要作用的基因產生RNA病灶及誤剪接。該病症影響骨骼肌及平滑肌以及眼、心臟、內分泌系統及中樞神經系統，且導致肌無力、消瘦、身體失能及壽命縮短。
使用Cas9及嚮導RNA進行基於CRISPR的基因體編輯，可使得基因體DNA達成序列特異性裂解。舉例而言，可將編碼Cas9酶的核酸及根據適當嚮導RNA編碼的核酸設置於不同載體上或一起設置於單個載體上且活體內或活體外投與以剔除或校正基因突變。位於嚮導RNA 5'端的約20個核苷酸充當嚮導或間隔子序列，其可為與基因體目標位置的一個股互補的任何序列，該股具有相鄰的原間隔子相鄰模體(PAM)。PAM序列為Cas9分子進行適當結合所需要的短序列，該短序列鄰接於Cas9核酸酶切割位點。嚮導RNA之嚮導或間隔子序列的3'核苷酸充當與Cas9相互作用的支架序列。當表現嚮導RNA及Cas9時，嚮導RNA將結合至Cas9且將其導引至與嚮導序列互補的序列，接著，其將在該序列中起始雙股斷裂(DSB)。為了修復此等斷裂，細胞典型地利用容易出錯的非同源末端接合機制(NHEJ)，該機制可經由密碼子插入或缺失、閱讀框架移位而引起目標基因功能中斷，或促使過早終止密碼子觸發無義股介導的衰減。參見例如Kumar等人(2018) Front. Mol. Neurosci.第11卷, 論文413。
由於早期不斷地成功完成AAV載體設計、製造及基因療法的臨床階段投與，因此在活體內或活體外經由腺相關病毒(AAV)投與CRISPR-Cas組分具有吸引力。參見例如Wang等人(2019) Nature Reviews Drug Discovery 18:358-378; Ran等人(2015a) Nature 520: 186-101。然而，常用的釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes，spCas9)非常大，且當在基於AAV之CRISPR/Cas系統中使用時，需要兩個AAV載體：一個載體攜載編碼spCas9的核酸，且另一個攜載編碼嚮導RNA的核酸。克服此技術障礙的一種可能方式為利用來源於不同原核生物物種之Cas9的較小直系同源物。較小的Cas9's能夠隨同編碼嚮導RNA的核酸一起在單一AAV載體上製成，藉此降低製造成本且減小投藥途徑及方案之複雜度。
本文提供使用來自金黃色葡萄球菌(SaCas9)的較小Cas9治療DM1的組合物及方法。提供的組合物包含：i)包含編碼SaCas9之核酸分子及一或多個嚮導RNA的單一AAV載體；及ii)視情況存在的DNA-PK抑制劑。亦提供使用所揭示之組合物治療DM1的方法。本文所揭示之組合物及方法可以用於切除CTG重複區域的一部分以治療DM1、減少RNA病灶且/或校正DM1患者細胞中的誤剪接。舉例而言，本文揭示特別適合與saCas9一起使用的嚮導RNA及嚮導RNA組合，其用於在DNA-PK抑制劑存在或不存在下切除DMPK之3' UTR中之CTG重複序列的方法中。
本文亦提供包含超過一個載體的系統，其中一或多個嚮導RNA隨同較小SaCas9一起併入單個載體中且另一載體包含編碼嚮導RNA之多個複本的核酸。此類系統允許在需要超過一個嚮導RNA達成最佳效能的情形下實現極大的設計靈活性。舉例而言，一個載體可用於表現SaCas9及靶向一或多個基因體目標的一或多個嚮導RNA，且第二載體可用於表現靶向相同或不同基因體目標之相同或不同嚮導RNA的多個複本。本文提供利用此等雙載體組態之組合物及方法且該等組合物及方法的益處為降低製造成本、減少投藥途徑及方案的複雜度，及就利用相同或不同嚮導RNA的多個複本靶向相同或不同基因體目標序列而言實現最大靈活性。在一些情形下，提供相同嚮導RNA的多個複本改良了嚮導RNA的效率，從而改良已成功的系統。
相應地，提供以下非限制性實施例： [實施例01]一種組合物，其包含編碼一或多個嚮導RNA的單一核酸分子及Cas9，其中該單一核酸分子包含： a.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； b.     編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸； c.     編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致； d.     編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者； e.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12及20中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； f.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8及20中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； g.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1、101及102中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； h.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； i.      編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者之第一及第二間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； j.      編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對與選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列至少90%一致：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； k.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；8與25；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；8與19；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；4與14；7與19；4與26；8與26；7與25；1與21；3與26；2與26；8與14；1與14；2與14；3與14；1與26；7與21；7與14；及7與26； l.      編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；及4與25； m.    編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；7與19；7與25；1與21；3與26；3與14；7與21；及7與14； n.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與10；4與28；8與12；4與13；3與10；7與12；7與13；4與28；及7與18； o.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與10；1與12；8與12；4與13；7與12；7與28；7與18； p.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 7與12之第一及第二間隔子序列； q.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 4與12之第一及第二間隔子序列；或 r.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 4與18之第一及第二間隔子序列；或 s.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 2與12之第一及第二間隔子序列；或 t.      編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 4與13之第一及第二間隔子序列；或 u.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 8與12之第一及第二間隔子序列；或 v.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 7與23之第一及第二間隔子序列。 [實施例02]   如實施例1之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑。 [實施例03]   如實施例1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物6。 [實施例04]   如實施例1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物1。 [實施例05]   如實施例1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物2。 [實施例06]   如實施例1至5中任一例之組合物，其中該嚮導RNA為sgRNA。 [實施例07]   如實施例1至6中任一例之組合物，其中該嚮導RNA經修飾。 [實施例08]   如實施例7之組合物，其中該修飾改變一或多個2'位置及/或磷酸二酯鍵聯。 [實施例09]   如實施例7至9中任一例之組合物，其中該修飾改變嚮導RNA之前三個核苷酸中的一或多者或全部。 [實施例10]   如實施例7至9中任一例之組合物，其中該修飾改變嚮導RNA之最後三個核苷酸中的一或多者或全部。 [實施例11]   如實施例7至10中任一例之組合物，其中該修飾包括以下中之一或多者：硫代磷酸酯修飾、2'-OMe修飾、2'-O-MOE修飾、2'-F修飾、2'-O-次甲基-4'橋修飾、3'-硫代膦醯基乙酸酯修飾或2'-去氧修飾。 [實施例12]   如前述實施例中之任一例的組合物，其中該單一核酸分子與脂質奈米粒子(LNP)締合。 [實施例13]   如實施例1至12中任一例之組合物，其中該單一核酸分子為病毒載體。 [實施例14]   如實施例13之組合物，其中該病毒載體為腺相關病毒載體、慢病毒載體、整合酶缺乏型慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、α病毒載體，或單純疱疹病毒載體。 [實施例15]   如實施例13之組合物，其中該病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。 [實施例16]   如實施例15之組合物，其中該AAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10、AAVrh74或AAV9載體，其中AAV後之數字指示AAV血清型。 [實施例17]   如實施例16之組合物，其中該AAV載體為AAV血清型9載體。 [實施例18]   如實施例16之組合物，其中該AAV載體為AAVrh10載體。 [實施例19]   如實施例16之組合物，其中該AAV載體為AAVrh74載體。 [實施例20]   如實施例11至19中任一例之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含組織特異性啟動子。 [實施例21]   如實施例11至19中任一例之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含肌肉特異性啟動子，視情況其中該肌肉特異性啟動子為肌肉肌酸激酶啟動子、結蛋白啟動子、MHCK7啟動子、SPc5-12啟動子或CK8e啟動子。 [實施例22]   如實施例11至19中任一項之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含U6、H1或7SK啟動子。 [實施例23]   如實施例1至22中任一例之組合物，其包含編碼SaCas9的核酸，其中該SaCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 711。 [實施例24]   如實施例1至22中任一例之組合物，其包含編碼SaCas9的核酸，其中該SaCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 711之變異體。 [實施例25]   如實施例1至22中任一例之組合物，其包含編碼SaCas9的核酸，其中該SaCas9包含選自SEQ ID NO: 715-717中之任一者的胺基酸序列。 [實施例26]   如實施例1至25中任一例之組合物，及醫藥學上可接受之賦形劑。 [實施例27]   一種組合物，其包含含有SEQ ID NO: 1-8、10-28與101-154中之任一者的嚮導RNA。 [實施例28]   如實施例1至27中任一例之組合物，其用於治療第1型肌強直性營養不良(DM1)。 [實施例29]   如實施例1至27中任一例之組合物，其用於在DMPK基因中製造雙股斷裂。 [實施例30]   如實施例1至27中任一例之組合物，其用於切除DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。 [實施例31]   一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將如實施例1至27中任一例之組合物及視情況存在之DNA-PK抑制劑遞送至細胞。 [實施例32]   一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.     一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者的間隔子序列； b.     一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c.     與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； 編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例33]   一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.     選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； 編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例34]   一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將如實施例1至27中任一例之組合物遞送至細胞。 [實施例35]   一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.     一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者的間隔子序列； b.     一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c.     與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； 編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例36]   如實施例35之方法，其中該一或多個間隔子序列： 選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者； 選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12、18及20中之任一者； 選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8及20中之任一者；或 選自SEQ ID NO: 4、12及18中之任一者；或 選自SEQ ID NO: 1、101及102中之任一者。 [實施例37]   一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.     選自以下的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； 編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例38]   如實施例37之方法，其中該第一及第二間隔子序列： 選自SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；8與25；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；8與19；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；4與14；7與19；4與26；8與26；7與25；1與21；3與26；2與26；8與14；1與14；2與14；3與14；1與26；7與21；7與14；及7與26； 選自以下中的任一者：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；及4與25； 選自以下中的任一者：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；7與19；7與25；1與21；3與26；3與14；7與21；及7與14； 選自以下中的任一者：SEQ ID NO: 4與12；4與18；2與10；4與28；8與12；4與13；3與10；7與12；7與13；4與28；及7與18； 選自以下中的任一者：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與10；1與12；8與12；4與13；7與12；7與28；7與18；或 選自以下中的任一者：SEQ ID NO: 7與12；4與12；4與18；8與12；及7與23；或 選自以下中的任一者：SEQ ID NO: 4與12；4與18；及8與12。 [實施例39]   如實施例32至38中任一例之方法，其中該單一核酸分子於單一載體上遞送至細胞。 [實施例40]   如實施例32至39中任一例之方法，包含投與DNA-PK抑制劑。 [實施例41]   如實施例40之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物6。 [實施例42]   如實施例40之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物1。 [實施例43]   如實施例40之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物2。 [實施例44]   如實施例32至43中任一例之方法，其中SaCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 711。 [實施例45]   如實施例32至43中任一例之方法，其中SaCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 711之變異體。 [實施例46]   如實施例32至43或45中任一例之方法，其中SaCas9包含選自SEQ ID NO: 715-717中之任一者的胺基酸序列。 [實施例47]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，並且其中該AAV載體包含hU6c啟動子。 [實施例48]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含選自以下之啟動子： a.     包含SEQ ID NO: 705、901、902、903或904之序列的核酸；及 b.     與序列SEQ ID NO: 705、901、902、903或904至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列。 [實施例49]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，並且其中該AAV載體包含7SK2啟動子。 [實施例50]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含選自以下之啟動子： a.     包含SEQ ID NO: 706、906、907、908或909之序列的核酸；及 b.     與SEQ ID NO: 706、906、907、908或909之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列。 [實施例51]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，並且其中該AAV載體包含H1m啟動子。 [實施例52]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，並且其中該AAV載體包含含有SEQ ID NO: 709之序列的5' ITR。 [實施例53]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，並且其中該AAV載體包含含有SEQ ID NO: 710之序列的3' ITR。 [實施例54]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該一或多個嚮導RNA或嚮導RNA對為包含選自SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921之支架序列的sgRNA。 [實施例55]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該一或多個嚮導RNA或嚮導RNA對為包含選自SEQ ID NO: 910、911、912、920或921之支架序列的sgRNA。 [實施例56]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該一或多個嚮導RNA或嚮導RNA對為包含支架序列SEQ ID NO: 921的sgRNA。 [實施例57]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該核酸分子至少編碼第一嚮導RNA及第二嚮導RNA。 [實施例58]   如實施例57之組合物或方法，其中該核酸分子編碼第一嚮導RNA的間隔子序列、第一嚮導RNA的支架序列、第二嚮導RNA的間隔子序列，及第二嚮導RNA的支架序列。 [實施例59]   如實施例58之組合物或方法，其中第一嚮導RNA的間隔子序列與第二嚮導RNA的間隔子序列相同。 [實施例60]   如實施例58之組合物或方法，其中第一嚮導RNA的間隔子序列與第二嚮導RNA的間隔子序列不同。 [實施例61]   如實施例59或60之組合物或方法，其中第一嚮導RNA的支架序列與第二嚮導RNA的支架序列相同。 [實施例62]   如實施例59或60之組合物或方法，其中第一嚮導RNA的支架序列與第二嚮導RNA的支架序列不同。 [實施例63]   如實施例61或實施例62之組合物或方法，其中第一嚮導RNA的支架序列包含選自由SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921組成之群的序列，並且其中第二嚮導RNA的支架序列包含選自由SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921組成之群的不同序列。 [實施例64]   如實施例61至63中任一例之組合物或方法，其中第一嚮導RNA的支架序列為SEQ ID NO: 921。 [實施例65]   如實施例61至63中任一例之組合物或方法，其中第二嚮導RNA的支架序列為SEQ ID NO: 921。 [實施例66]   如實施例61之組合物或方法，其中第一嚮導RNA的支架序列為SEQ ID NO: 921並且其中第二嚮導RNA的支架序列為SEQ ID NO: 921。 [實施例67]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。 [實施例68]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之啟動子的反向互補序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、以與SaCas9之啟動子相同的方向表現第二sgRNA的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。 [實施例69]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、用於表現第二sgRNA的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。 [實施例70]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、以與SaCas9之啟動子相同的方向表現編碼第一嚮導RNA之核酸用的啟動子、編碼第一嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、以與SaCas9之啟動子相同的方向表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。 [實施例71]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、用於表現第二sgRNA的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。 [實施例72]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其中單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、用於表現第二sgRNA的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。 [實施例73]   如實施例67至72中任一例之組合物或方法，其中第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。 [實施例74]   如實施例67至72中任一例之組合物或方法，其中第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。 [實施例75]   如實施例67至74中任一例之組合物或方法，其中第一sgRNA嚮導序列與第二sgRNA嚮導序列相同。 [實施例76]   如實施例67至74中任一例之組合物或方法，其中第一sgRNA嚮導序列與第二sgRNA嚮導序列不同。 [實施例77]   如實施例67至76中任一例之組合物或方法，其中第一sgRNA支架序列與第二sgRNA支架序列相同。 [實施例78]   如實施例67至76中任一例之組合物或方法，其中第一sgRNA支架序列與第二sgRN支架序列不同。 [實施例79]   如實施例77或實施例78之組合物或方法，其中第一sgRNA支架序列包含選自由SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921組成之群的序列，且其中第二sgRNA支架序列包含選自由SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921組成之群的不同序列。 [實施例80]   如實施例77至79中任一例之組合物或方法，其中第一sgRNA支架序列為SEQ ID NO: 921。 [實施例81]   如實施例77至79中任一例之組合物或方法，其中第二sgRNA支架序列為SEQ ID NO: 921。 [實施例82]   如實施例77之組合物或方法，其中第一sgRNA支架序列為SEQ ID NO: 921且其中第二sgRNA支架序列為SEQ ID NO: 921。 [實施例83]   一種減少病灶陽性細胞數目的方法，該方法包含將一或多個核酸分子遞送至細胞，該一或多個核酸分子包含： 編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.     一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者的間隔子序列； b.     一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c.     與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； 編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例84]   一種減少病灶陽性細胞數目的方法，該方法包含將一或多個核酸分子遞送至細胞，該一或多個核酸分子包含： 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.     選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NOs: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； 編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例85]   如前述實施例中任一例之組合物或方法，其包含嚮導RNA對，其中該嚮導RNA對具有切除功能且亦充當單一嚮導切割器。 [實施例86]   如實施例83或84之方法，其中第一核酸與第二核酸處於同一核酸分子中。 [實施例87]   如實施例83或84之方法，其中第一核酸與第二核酸處於不同的核酸分子中。 [實施例88]   如實施例87之方法，其中各別核酸分子各自處於不同載體中。 [實施例89]   如實施例83至88中任一例之方法，其中編碼SaCas9的核酸不編碼嚮導RNA。 [實施例90]   如實施例84至89中任一例之方法，其中編碼SaCas9的核酸編碼一或多個嚮導RNA，該一或多個嚮導RNA包含： a.     選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與a.或b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列。 [實施例91]   一種包含第一核酸分子及第二核酸分子的組合物，其中核酸分子編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)且第二核酸分子編碼一或多個嚮導RNA，該一或多個嚮導RNA包含： a.     選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與a.或b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列。 [實施例92]   如實施例91之組合物，其中該第一核酸分子不編碼嚮導RNA。 [實施例93]   如實施例91之組合物，其中該第一核酸分子編碼： a.     選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與a.或b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列。 [實施例94]   如實施例91至93中任一例之組合物，其中第一核酸分子處於第一載體中，且第二核酸分子處於不同的第二載體中。 [實施例95]   如實施例94之組合物，其中第一及第二載體為AAV載體。 [實施例96]   如實施例95之組合物，其中AAV載體為AAV9載體。 [實施例97]   一種包含AAV載體的組合物，其中該AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸，以及聚腺苷酸化序列。 [實施例98]   一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸以及聚腺苷酸化序列。 [實施例99]   一種包含AAV載體的組合物，其中該AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。 [實施例100] 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列以及第二sgRNA支架序列。 [實施例101] 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA支架序列之序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA之序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之7SK2或hU6c啟動子的反向互補序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列以及第二sgRNA支架序列。 [實施例102] 如實施例97至101中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 7，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。 [實施例103] 如實施例97至101中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。 [實施例104] 如實施例97至101中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 18。 [實施例105] 如實施例97至101中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 2，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。 [實施例106] 如實施例97至101中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 13。 [實施例107] 如實施例97至101中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 8，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。 [實施例108] 如實施例97至101中任一例之組合物，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 7，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 23。 [實施例109] 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 7，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。 [實施例110] 一種包含核酸分子的組合物，其包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。 [實施例111] 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 18。 [實施例112] 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 2，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。 [實施例113] 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 13。 [實施例114] 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 8，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。 [實施例115] 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 7，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 23。 [實施例116] 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將如實施例109至115中任一例之組合物及視情況存在之DNA-PK抑制劑遞送至細胞。 [實施例117] 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將如實施例109至115中任一例之組合物遞送至細胞。 [實施例118] 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： 編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； b.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； c.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 18； d.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 2，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； e.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 13； f.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 8，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； g.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 23； ii)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 iii)   視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例119] 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i)     編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； b.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； c.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 18； d.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 2，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； e.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 13； f.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 8，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； g.     第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 23； ii)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 iii)   視情況存在的DNA-PK抑制劑。 [實施例120] 如實施例109至115中任一例之組合物，其中該組合物進一步包含金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。 [實施例121] 如實施例109至115或120中任一例之組合物，其中該組合物與脂質奈米粒子締合。 [實施例122] 如實施例1至26中任一例之組合物，或如技術方案31至108或116至121中任一方案之方法，其中SV40核定域信號(NLS)與Cas9的N端融合且核質蛋白NLS與Cas9蛋白的C端融合。 [實施例123] 如實施例1至26中任一例之組合物，或如技術方案31至108或116至121中任一方案之方法，其中c-myc核定域信號(NLS)與Cas9的N端融合且SV40 NLS及/或核質蛋白NLS與Cas9的C端融合。 [實施例124] 如實施例1至26中任一例之組合物，或如技術方案31至108或116至121中任一方案之方法，其中c-myc NLS與Cas9的N端融合(例如藉助於連接子，諸如GSVD (SEQ ID NO: 940))，SV40 NLS與Cas9的C端融合(例如藉助於連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))，且核質蛋白NLS與SV-40 NLS的C端融合(例如藉助於連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))。
本申請案主張以下臨時申請案的優先權：2021年2月26日申請的美國臨時申請案第63/154,442號；2021年3月11日申請的美國臨時申請案第63/159,815號；2021年5月5日申請的美國臨時專利申請案第63/184,462號；2021年11月5日申請的美國臨時申請案第63/276,003號；及2022年2月4日申請的美國臨時專利申請案第63/306,883號，此等所有臨時申請案皆以全文引用之方式併入。
現將詳細參考本發明之某些實施例，其實例在附圖中加以說明。儘管本發明結合所說明之實施例加以描述，但應瞭解不希望將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋所有替代例、潤飾及等效物，其可包括於如隨附申請專利範圍及所包括之實施例所定義的本發明內。
在詳細描述本發明教示內容之前，應瞭解，本發明不限於特定組合物或方法步驟，因此可加以改變。應注意，除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「一嚮導」包括複數個嚮導，及提及「一細胞」包括複數個細胞及其類似者。
數值範圍包括限定該範圍之數字。考慮到有效數位及與量測相關之誤差，實測值及可量測值應理解為近似值。此外，「包含(comprise/comprises/comprising)」、「含有(contain/contains/containing)」及「包括(include/includes/including)」之使用不希望具有限制性。應瞭解，前文一般描述與詳細說明僅具有例示性及解釋性且不限制教示內容。
除非說明書中具體指出，否則本說明書中敍述「包含」各種組分之實施例亦考慮為「由所述組分組成」或「基本上由所述組分組成」；本說明書中敍述「由各種組分組成」之實施例亦考慮為「包含」所述組分或「基本上由所述組分組成」；且本說明書中敍述「基本上由各種組分組成」之實施例亦考慮為「由所述組分組成」或「包含」所述組分(此互換性不適用於此等術語在申請專利範圍中之使用)。除非上下文另外明確指示，否則術語「或(or)」以包括性意義使用，亦即等效於「及/或(and/or)」。
本文所用之章節標題僅出於組織目的，且不應解釋為以任何方式限制所需標的物。在以引用之方式併入之任何材料與本說明書中所定義之任何術語或本說明書之任何其他表述內容相矛盾之情況下，以本說明書為準。雖然本發明教示內容結合多個實施例描述，但不希望本發明教示內容限於此類實施例。相反，如熟習此項技術者將瞭解，本發明教示內容涵蓋各種替代例、潤飾及等效物。 I.     定義
除非另外說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：
「聚核苷酸」、「核酸」及「核酸分子」在本文中用於指包含核苷或核苷類似物的多聚體化合物，該等核苷或核苷類似物具有沿著主鏈連接在一起的含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習知RNA、DNA、混合型RNA-DNA，及作為其類似物的聚合物。核酸「主鏈」可由多個鍵聯構成，其包括糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖，或具有取代(例如2'甲氧基或2'鹵基取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾之尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他)、肌苷、嘌呤或嘧啶之衍生物(例如N 4-甲基去氧鳥苷、去氮嘌呤或氮雜嘌呤、去氮嘧啶或氮雜嘧啶、在5位或6位處具有取代基之嘧啶鹼基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2位、6位或8位處具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲胺基嘌呤、O 6-甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶，及O 4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。對於一般論述，參見 The Biochemistry of the Nucleic Acids5-36, Adams等人編, 第11版, 1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈在聚合物位置不包括含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習知組分與取代(例如具有2'甲氧基鍵聯之習知鹼基，或含有習知鹼基與一或多個鹼基類似物的聚合物)。核酸包括「鎖定核酸」(LNA)，含有一或多個LNA核苷酸單體之類似物，其中雙環呋喃醣單元被鎖定於模擬糖構形之RNA中，由此增強針對互補RNA及DNA序列之雜交親和力(Vester及Wengel, 2004, Biochemistry43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分且不同之處可為RNA中存在尿嘧啶或其類似物及DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物。
「嚮導RNA (Guide RNA)」、「嚮導RNA (guide RNA)」及簡稱「嚮導(guide)」在本文中互換使用且指crRNA (亦稱為CRISPR RNA)，或crRNA與trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。crRNA與trRNA可締合為單一RNA分子(單嚮導RNA，sgRNA)或兩種不同RNA分子(雙嚮導RNA，dgRNA)。「嚮導RNA (Guide RNA)」或「嚮導RNA (guide RNA)」係指各種類型。trRNA可為天然存在之序列或與天然存在之序列相比具有修飾或變異之trRNA序列。
如本文所用，「間隔子序列」在本文中及文獻中有時亦稱為「間隔子」、「原間隔子」、「嚮導序列」或「目標序列」，係指嚮導RNA內之與目標序列互補且用於將嚮導RNA導引至目標序列以被Cas9裂解的序列。嚮導序列的長度可為24、23、22、21、20個或更少個鹼基對，例如在金黃色葡萄球菌(亦即，SaCas9)及相關Cas9同源物/直系同源物的情況下。亦可使用更短或更長的序列作為嚮導，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸的長度。在特定實施例中，在SaCas9情況下的嚮導/間隔子序列具有至少20個鹼基對的長度，或更具體言之，長度在20-25個鹼基對內(參見例如Schmidt等人, 2021, Nature Communications,「Improved CRISPR genome editing using small highly active and specific engineered RNA-guided nucleases」)。舉例而言，在一些實施例中，嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28或101-154之序列的至少17、18、19、20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154的序列。在一些實施例中，目標序列位於例如基因中或染色體上，且與嚮導序列互補。在一些實施例中，嚮導序列與其相應目標序列之間的互補性或一致性程度可為約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。舉例而言，在一些實施例中，嚮導序列包含與選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154之序列的至少17、18、19、20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列。在一些實施例中，嚮導序列包含與選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154之序列具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列。在一些實施例中，嚮導序列與目標區域可100%互補或一致。在其他實施例中，嚮導序列與目標區域可含有至少一個錯配。舉例而言，嚮導序列及目標序列可含有1、2、3或4個錯配，其中目標序列之總長度為至少17、18、19、20或更多個鹼基對。在一些實施例中，嚮導序列及目標區域可含有1至4個錯配，其中嚮導序列包含至少17、18、19、20或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及目標區域可含有1、2、3或4個錯配，其中嚮導序列包含20個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及目標區域不含有任何錯配。
在一些實施例中，嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154之序列，其中若5'端核苷酸不為鳥嘌呤，則將一或多個鳥嘌呤(g)添加至該序列的5'端。在一些情況下轉錄可能需要5' g或gg，例如RNA聚合酶III依賴性U6啟動子或T7啟動子的表現需要。在一些實施例中，5'鳥嘌呤添加至本文所揭示之任一嚮導序列或嚮導序列對中。
Cas9s之目標序列包括基因體DNA之正股及負股(亦即，指定的序列及該序列之反向互補序列)，因為Cas9之核酸受質為雙股核酸。因此，在稱嚮導序列「與目標序列互補」之情況下，應瞭解，嚮導序列可導引嚮導RNA結合至目標序列之反向互補序列。因此，在一些實施例中，在嚮導序列結合目標序列之反向互補序列的情況下，嚮導序列與目標序列(例如不包括PAM之目標序列)之某些核苷酸一致，但嚮導序列中的T被U取代。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指嚮導RNA以及Cas9。在一些實施例中，嚮導RNA將Cas9(諸如Cas9)導引至目標序列，且嚮導RNA與該目標序列雜交且該藥劑結合至目標序列，隨後其可發生裂解或切割(在經修飾之「切口酶」Cas9的情形下)。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多位置與第一序列匹配，則第一序列視為「包含與第二序列具有至少X%一致性的序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，原因為由於第二序列之全部三個位置均存在匹配，因此比對將得到100%一致性。RNA與DNA之間的差異(一般而言，尿苷交換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾之尿苷)的存在不會造成聚核苷酸之間一致性或互補性的差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷)具有相同互補序列(例如對於胸苷、尿苷或經修飾之尿苷全體而言，為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，兩者具有鳥苷或經修飾之鳥苷作為互補序列)。因此，舉例而言，序列5'-AXG (其中X為經修飾之任何尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)視為與AUG具有100%一致性，因為兩者均與同一序列(5'-CAU)完全互補。例示性比對算法為此項技術中熟知的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)及尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法。熟習此項技術者將瞭解，算法選擇及參數設置適於待比對之指定序列對；對於長度大體相似且預期一致性＞50% (胺基酸)或＞75% (核苷酸)的序列而言，EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供的具有尼德曼-翁施算法介面預設值設置的尼德曼-翁施算法通常為適當的。
「mRNA」在本文中用於指一種聚核苷酸，其不為DNA且包含可轉譯成多肽(亦即，可充當供核糖體及胺基醯基化tRNA轉譯的受質)之開放閱讀框架。mRNA可包含包括磷酸酯-糖主鏈，其包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈中之糖類基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。
適用於本文所述之嚮導RNA組合物及方法的嚮導序列顯示於 表 1A及 表 1B及整個說明書中。
如本文所用，「目標序列」係指目標基因中之與嚮導RNA之嚮導序列的至少一部分具有互補性的核酸序列。目標序列與嚮導序列的相互作用導引Cas9結合，且潛在地在目標序列內進行切割或裂解(視藥劑活性而定)。
如本文所用，「治療(treatment)」係指在個體中針對疾病或病症之治療劑的任何投與或施用，且包括抑制疾病或疾病發展(其可發生在正式診斷出疾病之前或之後，例如在個體之基因型可能或有可能引起疾病發展的情況下)、遏制其發展、減輕疾病之一或多種症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀復發。舉例而言，DM1治療可包含緩解DM1症狀。
如本文所用，「緩解(ameliorating)」係指對於表型或症狀產生任何有益作用，諸如降低其嚴重程度、減慢或延遲其發展、遏制其發展或部分或完全逆轉或消除其。在定量表型(諸如表現量)之情況下，緩解涵蓋改變表現量，使得其更接近於健康或未感染細胞或個體中所見之表現量。
「醫藥學上可接受之賦形劑」係指醫藥調配物中所包括之不為活性成分的藥劑。醫藥學上可接受之賦形劑可例如有助於藥物遞送或支持或增強穩定性或生物可用性。
術語「約」或「大致」意謂如一般熟習此項技術者所確定的可接受之特定值誤差，其部分取決於如何量測或測定該值。
如本文所用，「金黃色葡萄球菌Cas9」亦可稱為SaCas9，且包括野生型SaCas9 (例如SEQ ID NO: 711)及其變異體。SaCas9變異體包含相較於SEQ ID NO: 711的一或多個胺基酸變化，包括一或多個胺基酸的插入、缺失或取代，或對一或多個胺基酸的化學修飾。 II.    組合物
本文提供適用於治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的組合物，該等組合物例如使用單一核酸分子，該單一核酸分子編碼：1)包含表 1A及表 1B之一或多個嚮導序列的一或多個嚮導RNA；及2) SaCas9。此類組合物可投與患有或疑似患有DM1之個體。本文揭示的任一個嚮導序列可存在於本文揭示的任一對組合中，且可存在於包含本文所揭示之任一種Cas9蛋白或編碼本文所揭示之任一種Cas9蛋白之核酸的組合物中。此類組合物可存在於本文所揭示之任一種載體(例如本文所揭示之任一種AAV載體)或與脂質奈米粒子締合。
在一些實施例中，本發明提供編碼一或多個嚮導RNA組分(例如本文所揭示之間隔子及支架序列中的任一者)之特定核酸序列。本發明涵蓋本文所提供之任一種DNA序列的RNA等效物(亦即，其中「T」置換成「U」)，或本文所提供之任一種RNA序列的DNA等效物(例如其中「U」置換成「T」)，以及本文所揭示之任一種序列的互補序列(包括反向互補序列)。
在一些實施例中，一或多個嚮導RNA將Cas9導引至DM1蛋白激酶(DMPK)基因之3' UTR中的CTG重複序列中或附近。舉例而言，可將Cas9導引至目標序列之10、20、30、40或50個核苷酸內進行切割。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含編碼一或多個嚮導RNA及Cas9的單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含： a.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； b.     編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中任一者之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸； c.     編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致。 在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含編碼一或多個嚮導RNA及Cas9的單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含： a.     編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； b.     編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者之第一及第二間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； c.     編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對與選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列至少90%一致：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸；或 d.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與10；1與12；8與12；4與13；7與12；7與28；7與18。 在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
在一些實施例中，編碼嚮導RNA的核酸與編碼Cas9的核酸設置於單一核酸分子上。在一些實施例中，單一核酸分子包含編碼一或多個嚮導RNA的核酸及編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，兩個嚮導RNA及一個Cas9設置於單一核酸分子上。在一些實施例中，編碼三個嚮導RNA的核酸與一個編碼SaCas9的核酸設置於單一核酸分子上。在一些實施例中，單一核酸分子包含編碼一個Cas9的核酸及編碼兩個嚮導RNA的核酸，其中核酸分子編碼不超過兩個嚮導RNA。在一些實施例中，單一核酸分子包含編碼第一嚮導RNA的核酸、編碼第二嚮導RNA的核酸及編碼SaCas9的核酸，其中第一嚮導RNA與第二嚮導RNA可相同或不同。在一些實施例中，單一核酸分子包含編碼第一嚮導RNA的核酸、編碼第二嚮導RNA的核酸、編碼第三嚮導RNA的核酸及編碼SaCas9的核酸，其中第一、第二及第三嚮導RNA可相同或不同。在一些實施例中，第一與第二嚮導RNA的間隔子序列一致。在一些實施例中，第一與第二嚮導RNA的間隔子序列不一致(例如嚮導RNA對)。在一些實施例中，所提供的系統包含兩種載體，其中相較於第二載體中的其他嚮導RNA或相較於第一載體中的其他嚮導RNA，第一載體包含一或多個(例如1、2、3、4、5或6種)可相同或不同的嚮導RNA，且第二載體包含一或多個(例如1、2或3種)可相同或不同的嚮導RNA；以及編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，第一核酸分子編碼Cas9分子且亦編碼第一嚮導RNA的一或多個複本及第二嚮導RNA的一或多個複本。在一些實施例中，第一核酸分子編碼Cas9分子，但不編碼任何嚮導RNA。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的一或多個複本及第二嚮導RNA的一或多個複本，其中第二核酸分子不編碼Cas9分子。
在一些實施例中，本發明提供包含兩個核酸分子的組合物，其中第一核酸分子包含編碼SaCas9蛋白的序列，且其中第二核酸分子編碼第一嚮導RNA。在一些實施例中，第一核酸分子亦編碼第一嚮導RNA。在其他實施例中，第一核酸分子不編碼任何嚮導RNA。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第二嚮導RNA。在一些實施例中，第一核酸分子亦編碼第二嚮導RNA。在特定實施例中第一嚮導RNA與第二嚮導RNA不一致。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的兩個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第二嚮導RNA的兩個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的三個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第二嚮導RNA的三個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的兩個複本及第二嚮導RNA的兩個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的兩個複本及第二嚮導RNA的一個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的一個複本及第二嚮導RNA的兩個複本。在一些實施例中，第二核酸分子編碼第一嚮導RNA的三個複本及第二嚮導RNA的三個複本。在特定實施例中第一嚮導RNA與第二嚮導RNA不一致。在一些實施例中，第一核酸存在於第一病毒載體中且第二核酸存在於不同的第二病毒載體中。在一些實施例中，第一嚮導RNA包含選自SEQ ID No: 1-8、10-28及101-154中之任一者的序列，且第二嚮導RNA包含選自SEQ ID No: 1-8、10-28及101-154中之任一者的序列。在一些實施例中，第二核酸編碼第一嚮導RNA (例如包含SEQ ID No: 1-8、10-28及101-154中之任一者之序列的嚮導RNA)的一或多個複本，且不編碼任何其他不同嚮導RNA。在一些實施例中，第二核酸編碼包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154之第一嚮導RNA的一或多個複本，且不編碼任何其他不同嚮導RNA。
在一些實施例中，單一核酸分子為單一載體。在一些實施例中，單一載體表現一或兩個或三個嚮導RNA及Cas9。在一些實施例中，一或多個嚮導RNA及一個Cas9設置於單一載體上。在一些實施例中，單一載體包含編碼嚮導RNA的核酸及編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，兩個嚮導RNA及一個Cas9設置於單一載體上。在一些實施例中，三個嚮導RNA及一個Cas9設置於單一載體上。在一些實施例中，單一載體包含編碼第一嚮導RNA的核酸、編碼第二嚮導RNA的核酸及編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，單一載體包含編碼第一嚮導RNA的核酸、編碼第二嚮導RNA的核酸、編碼第三嚮導RNA的核酸，及編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，第一、第二及第三嚮導RNA的間隔子序列若存在，則為一致的。在一些實施例中，第一、第二及第三嚮導RNA的間隔子序列若存在，則為不一致的(例如嚮導RNA對)。
表 1A 及表 1B中所示之嚮導序列各自可進一步包含其他核苷酸以形成或編碼crRNA，例如使用適於正使用之Cas9的任何已知序列來形成或編碼crRNA。在一些實施例中，crRNA包含(5'至3')至少一個間隔子序列及第一互補域。第一互補域與第二互補域充分互補，第二互補域可為相同分子之一部分(在sgRNA之情況下)或存在於tracrRNA中(在雙重或模組化gRNA之情況下)以形成雙股體。關於包括第一及第二互補域之crRNA及gRNA域的詳細論述，參見例如US 2017/0007679。
單分子嚮導RNA (sgRNA)可以5'至3'方向包含視情況存在之間隔子延長序列、間隔子序列、最小CRISPR重複序列、單分子嚮導連接子、最小tracrRNA序列、3' tracrRNA序列及/或視情況存在之tracrRNA延長序列。視情況存在之tracrRNA延長序列可以包含向嚮導RNA貢獻其他功能(例如穩定性)的元件。單分子嚮導連接子可使最小CRISPR重複序列與最小tracrRNA序列連接而形成髮夾結構。視情況存在之tracrRNA延長序列可以包含一或多個髮夾。在特定實施例中，本發明提供包含間隔子序列及tracrRNA序列的sgRNA。
在5'至3'取向上，位於嚮導序列之3'端之後、適於聯合SaCas9使用的例示性支架序列為：GTTTAAGTACTCTGTGCTGGAAACAGCACAGAATCTACTTAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGA (SEQ ID NO: 500)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SaCas9使用的例示性支架序列為與SEQ ID NO: 500至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 500差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
在一些實施例中，可使用SaCas9支架序列之變異體。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後的SaCas9支架稱為「Sa支架V1」且在5'至3'取向上，為：GTTTTAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTAAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGAT (SEQ ID NO: 910)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SaCas9使用的例示性支架序列為與SEQ ID NO: 910至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 910差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
在一些實施例中，可使用SaCas9支架序列之變異體。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後的SaCas9支架稱為「Sa支架V2」且在5'至3'取向上，為：GTTTAAGTACTCTGTGCTGGAAACAGCACAGAATCTACTTAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGAT (SEQ ID NO: 911)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SaCas9使用的例示性支架序列為與SEQ ID NO: 911至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 911差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
在一些實施例中，可使用SaCas9支架序列之變異體。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後的SaCas9支架稱為「Sa支架V3」且在5'至3'取向上，為：GTTTAAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTTAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGAT (SEQ ID NO: 912)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SaCas9使用的例示性支架序列為與SEQ ID NO: 912至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 912差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
在一些實施例中，可使用SaCas9支架序列之變異體。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後的SaCas9支架稱為「Sa支架V4」且在5'至3'取向上，為：GTTTCAGTACTCTGTGCTGGAAACAGCACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGAT (SEQ ID NO: 920)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SaCas9使用的例示性支架序列為與SEQ ID NO: 920至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 920差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
在一些實施例中，可使用SaCas9支架序列之變異體。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後的SaCas9支架稱為「Sa支架V5」且在5'至3'取向上，為：GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGAT (SEQ ID NO: 921)。在一些實施例中，位於嚮導序列之3'端之後、聯合SaCas9使用的例示性支架序列為與SEQ ID NO: 921至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列，或與SEQ ID NO: 921差異不超過1、2、3、4、5、10、15、20或25個核苷酸的序列。
在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 500的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 910的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 911的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 912的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 920的序列。在一些實施例中，編碼gRNA的核酸或編碼gRNA對的核酸包含含有SEQ ID NO: 921的序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，gRNA之一包含選自SEQ ID NO: 500、910、911、912、920及921中之任一者的序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，兩種gRNA均包含選自SEQ ID NO: 500、910、911、912、920及921中之任一者的序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，該對中的第一gRNA包含選自SEQ ID No: 500、910、911、912、920及921中之任一者的序列，且該對中的第二gRNA包含選自SEQ ID No: 500、910、911、912、920及921中之任一者的不同序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，gRNA之嚮導序列3'的核苷酸為相同序列。在一些實施例中，在包含gRNA對的核酸分子中，gRNA之嚮導序列3'的核苷酸為不同序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921。
在一些實施例中，相較於野生型SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 500之支架)或參考SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 921之支架)的莖環1，支架序列的莖環1包含一或多個變化。在一些實施例中，相較於野生型SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 500之支架)或參考SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 921之支架)的莖環2，該支架序列的莖環2包含一或多個變化。在一些實施例中，相較於野生型SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 500之支架)或參考SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 921之支架)的四環，該支架序列的四環包含一或多個變化。在一些實施例中，相較於野生型SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 500之支架)或參考SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 921之支架)，該支架序列的重複序列區域包含一或多個變化。在一些實施例中，相較於野生型SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 500之支架)或參考SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 921之支架)的抗重複序列區域，支架序列的抗重複序列區域包含一或多個變化。在一些實施例中，相較於野生型SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 500之支架)或參考SaCas9支架序列(例如包含序列SEQ ID NO: 921之支架)的連接子區域，該支架序列的連接子區域包含一或多個變化。關於支架區域的描述，參見例如Nishimasu等人, 2015, Cell, 162:1113-1126。
在使用tracrRNA的情況下，在一些實施例中，其包含(5'至3')第二互補域及近端域。在sgRNA的情況下，嚮導序列連同其他核苷酸(例如SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921)一起形成或編碼sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含(5'至3')至少一個間隔子序列、第一互補域、連接域、第二互補域及近端域。sgRNA或tracrRNA可進一步包含尾域。連接域可為髮夾形成域。關於crRNA及gRNA域(包括第二互補域、連接域、近端域及尾域)的詳細論述及實例，參見例如US 2017/0007679。
一般而言，在DNA核酸構築體編碼嚮導RNA的情況下，本文所述之任一RNA序列中的U殘基可經T殘基置換，且在DNA編碼嚮導RNA構築體的情況下，T殘基可經U殘基置換。
本文提供組合物，其包含一或多個嚮導RNA或編碼一或多個嚮導RNA的一或多個核酸，該一或多個嚮導RNA包含本文在 表 1A及 表 1B中及通篇說明書中所揭示的嚮導序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含本文在 表 1A及 表 1B及通篇說明書中所揭示之任一個嚮導序列的17、18、19、20或21個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含與 表 1A及 表 1B及通篇說明書中所示之嚮導序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含與 表 1A及 表 1B及通篇說明書中所示之嚮導序列約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個嚮導RNA或編碼至少一個嚮導RNA的核酸，其中至少一個嚮導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者的間隔子序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個嚮導RNA或編碼至少一個嚮導RNA的核酸，其中至少一個嚮導RNA包含選自SEQ ID NO: 1-9、10-28及101-154中之任一者的間隔子序列。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個嚮導RNA或編碼至少一個嚮導RNA的核酸，其中至少一個嚮導RNA包含選自以下中之任一者的間隔子序列：SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個嚮導RNA或編碼至少一個嚮導RNA的核酸，其中至少一個嚮導RNA包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12及20中之任一者的間隔子序列。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個嚮導RNA或編碼至少一個嚮導RNA的核酸，其中至少一個嚮導RNA包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8及20中之任一者的間隔子序列。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 20。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 21。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 27。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含至少一個嚮導RNA或編碼至少一個嚮導RNA的核酸，其中至少一個嚮導RNA包含選自以下中之任一者的間隔子序列：SEQ ID NO: 101、102、103、104、105、106、107、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、133、134、135、136、137、138、139、140、143、144、147、148、149、150、151、152、153及154。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 102。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 103。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 105。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 106。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 107。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 113。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 114。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 115。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 116。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 118。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 119。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 120。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 121。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 122。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 123。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 124。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 126。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 127。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 128。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 133。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 134。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 135。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 136。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 137。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 138。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 139。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 140。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 144；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 147；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 148；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 149；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 150；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 151；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 152；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 153；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 154。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA對或編碼嚮導RNA對的核酸，其中該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；8與25；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；8與19；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；4與14；7與19；4與26；8與26；7與25；1與21；3與26；2與26；8與14；1與14；2與14；3與14；1與26；7與21；7與14；及7與26。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA對或編碼嚮導RNA對的核酸，其中該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；及4與25。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，提供包含超過一個載體的組合物或系統，其中第一載體包含單一核酸分子，該單一核酸分子編碼：1)包含SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154之任一個或多個間隔子序列的一或多個嚮導RNA；及2)SaCas9；且第二載體包含編碼嚮導RNA之多個複本的核酸。在一些實施例中，提供包含超過一個載體的組合物或系統，其中第一載體包含編碼SaCas9而不編碼任何嚮導RNA的單一核酸分子，且第二載體包含編碼一或多個嚮導RNA的核酸，該等嚮導RNA包含SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154之任一個或多個間隔子序列。在編碼多個嚮導RNA的此類組合物或系統中，嚮導RNA可為相同或不同的。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA對或編碼嚮導RNA對的核酸，其中該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；7與19；7與25；1與21；3與26；3與14；7與21；及7與14。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供包含嚮導RNA對或編碼嚮導RNA對之核酸的組合物，其中該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與10；4與28；8與12；4與13；3與10；7與12；7與13；4與28；及7與18。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供包含嚮導RNA對或編碼嚮導RNA對之核酸的組合物，其中該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與10；1與12；8與12；4與13；7與12；7與28；7與18。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4及12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 2及12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 3及12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4及20。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4及18。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 2及10。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4及10。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 1及12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 8及12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4及13。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7及12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7及28。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7及18。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA對或編碼嚮導RNA對的核酸，其中嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 7與12；4與12；以及7與23。在一些實施例中，嚮導RNA對包含SEQ ID NO:7與12的第一及第二間隔子序列。在一些實施例中，嚮導RNA對包含SEQ ID NO:4與12的第一及第二間隔子序列。在一些實施例中，嚮導RNA對包含SEQ ID NO:7與23的第一及第二間隔子序列。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種組合物，其包含嚮導RNA或編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA進一步包含trRNA。在本文所述之各組合物及方法實施例中，crRNA (包含間隔子序列)及trRNA可結合為單一RNA (sgRNA)或可處於不同RNA (dgRNA)上。在sgRNA之情形下，crRNA與trRNA組分可共價連接，例如經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵共價連接。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)一或多個嚮導RNA，其包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者的嚮導序列；及2) SaCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)一或多個嚮導RNA，其包含與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的嚮導序列；以及2) SaCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在另一態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)一或多個包含嚮導序列的嚮導RNA，該嚮導序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；以及2) SaCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)嚮導RNA對，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及2) SaCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一個態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)嚮導RNA對，該嚮導RNA對包含與以下中之任一者至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及2) SaCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在另一態樣中，提供包含單一核酸分子的組合物，該單一核酸分子編碼1)包含第一及第二間隔子序列的嚮導RNA對，該第一及第二間隔子序列包含選自以下中之任一者之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及2) SaCas9。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在包含編碼嚮導RNA及/或Cas9之核酸分子的任何實施例中，核酸分子可為載體。在一些實施例中，提供一種組合物，其包含編碼嚮導RNA及Cas9之單一核酸分子，其中核酸分子為載體。
可使用任何類型之載體，諸如本文所述之彼等載體中的任一者。在一些實施例中，載體為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為非整合型病毒載體(亦即，不將來自載體之序列插入宿主染色體中)。在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒載體(AAV)、慢病毒載體、整合酶缺乏型慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、α病毒載體或單純疱疹病毒載體。在一些實施例中，載體包含肌肉特異性啟動子。例示性肌肉特異性啟動子包括肌肉肌酸激酶啟動子、結蛋白啟動子、MHCK7啟動子或SPc5-12啟動子。參見US 2004/0175727 A1; Wang等人, Expert Opin Drug Deliv. (2014) 11, 345-364; Wang等人, Gene Therapy(2008) 15, 1489-1499。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8e啟動子。在任一前述實施例中，載體可為腺相關病毒載體(AAV)。在一些實施例中，載體為AAV9載體。
在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8啟動子。CK8啟動子具有以下序列(SEQ ID NO. 700)：
Figure 02_image001
在一些實施例中，肌肉細胞的細胞特異性啟動子為CK8啟動子變異體，稱為CK8e。在一些實施例中，CK8e啟動子的尺寸為436 bp。CK8e啟動子具有以下序列(SEQ ID NO. 701)：
Figure 02_image003
在一些實施例中，載體包含U6、H1或7SK啟動子中的一或多者。在一些實施例中，U6啟動子為人類U6啟動子(例如U6L啟動子或U6S啟動子)。在一些實施例中，啟動子為鼠類U6啟動子。在一些實施例中，7SK啟動子為人類7SK啟動子。在一些實施例中，7SK啟動子為7SK1啟動子。在一些實施例中，7SK啟動子為7SK2啟動子。在一些實施例中，H1啟動子為人類H1啟動子(例如H1L啟動子或H1S啟動子)。在一些實施例中，載體包含多個嚮導序列，其中各嚮導序列處於不同啟動子的控制下。在一些實施例中，多個嚮導序列中之每一者包含不同序列。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含相同序列(例如多個嚮導序列中的每一者包含相同的間隔子序列)。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含相同間隔子序列及相同支架序列。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含不同間隔子序列及不同支架序列。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含相同間隔子序列，但包含不同支架序列。在一些實施例中，多個嚮導序列中的每一者包含不同間隔子序列及不同支架序列。在一些實施例中，不同啟動子各自包含相同核苷酸序列(例如U6啟動子序列)。在一些實施例中，不同啟動子各自包含不同核苷酸序列(例如U6、H1及/或7SK啟動子序列)。
在一些實施例中，提供包含至少兩種gRNA的單一核酸分子，其中選擇啟動子以使得gRNA的編輯動力學大約相等。在一些實施例中，提供包含gRNA對的單一核酸分子，其中選擇啟動子以使得gRNA的編輯動力學大約相等。在一些實施例中，嚮導RNA對包含第一嚮導RNA及第二嚮導RNA，其中當在相同條件下測試時，第一嚮導的插入缺失效率高於第二嚮導(參見例如 實例 1及 圖 3)。在一些實施例中，插入缺失效率較高的第一嚮導RNA可操作地置放於第一啟動子的控制下且插入缺失效率較低的第二嚮導RNA可操作地置放於第二啟動子的控制下，其中第二啟動子比第一啟動子強(亦即，驅動更強的表現)。在一些實施例中，插入缺失效率較低的第一嚮導RNA可操作地置放於第一啟動子的控制下且插入缺失效率較高的第二嚮導RNA可操作地置放於第二啟動子的控制下，其中第二啟動子所述第一啟動子強(亦即，驅動更強的表現)。舉例來說，在一些實施例中，7SK2為比hU6c啟動子弱的啟動子(亦即，驅動更弱的表現)。在一些實施例中，插入缺失效率較高的嚮導RNA處於7SK啟動子的控制下且插入缺失效率較低的嚮導處於hU6啟動子的控制下。在一些實施例中，插入缺失效率較低的嚮導RNA處於7SK啟動子的控制下且插入缺失效率較高的嚮導處於hU6啟動子的控制下。在一些實施例中，處於較弱啟動子(例如7SK2啟動子)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 4，且處於較強啟動子(例如hU6c)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，處於較弱啟動子(例如7SK2啟動子)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 4，且處於較強啟動子(例如hU6c)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，處於較弱啟動子(例如7SK2啟動子)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 8，且處於較強啟動子(例如hU6c)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，處於較弱啟動子(例如7SK2啟動子)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 2，且處於較強啟動子(例如hU6c)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，處於較弱啟動子(例如7SK2啟動子)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 13，且處於較強啟動子(例如hU6c)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，處於較弱啟動子(例如7SK2啟動子)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 4，且處於較強啟動子(例如hU6c)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，處於較弱啟動子(例如7SK2啟動子)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 7，且處於較強啟動子(例如hU6c)控制下的嚮導RNA包含序列SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，插入缺失效率較高的嚮導RNA處於7SK2啟動子的控制下且插入缺失效率較低的嚮導處於hU6c啟動子的控制下。在一些實施例中，插入缺失效率較低的嚮導RNA處於7SK2啟動子的控制下且插入缺失效率較高的嚮導處於hU6c啟動子的控制下。
在一些實施例中，U6啟動子包含與如下序列SEQ ID NO: 702至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image005
在一些實施例中，H1啟動子包含與如下序列SEQ ID NO: 703至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image007
在一些實施例中，7SK啟動子包含與如下序列SEQ ID NO: 704至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image009
Figure 02_image011
在一些實施例中，U6啟動子為hU6c啟動子且包含與如下序列SEQ ID NO: 705至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image013
在一些實施例中，U6啟動子為hU6c啟動子之變異體。在一些實施例中，相較於序列SEQ ID NO: 705，hU6c啟動子之變異體包含替代核苷酸。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體包含的核苷酸比SEQ ID NO: 705之249個核苷酸少。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體在SEQ ID NO: 705之hU6c啟動子的核小體結合序列中具有較少核苷酸。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 705之核苷酸96-125對應的所有核苷酸或至少一部分核苷酸(例如至少5、10、15、20、25或30個核苷酸)。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 705之核苷酸81-140對應的所有核苷酸或至少一部分核苷酸(例如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60個核苷酸)。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 705之核苷酸66-150對應的所有核苷酸或至少一部分核苷酸(例如至少10、20、30、40、50、60、65、70、75、80或85個核苷酸)。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 705之核苷酸51-170對應的所有核苷酸或至少一部分核苷酸(例如至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120個核苷酸)。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 705之核苷酸96-125對應的核苷酸。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體包含129-219個核苷酸。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體包含219個核苷酸。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體包含189個核苷酸。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體包含159個核苷酸。在一些實施例中，hU6c啟動子之變異體包含129個核苷酸。
在一些實施例中，U6啟動子為hU6d30且包含與如下序列SEQ ID NO: 901至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image015
Figure 02_image017
在一些實施例中，U6啟動子為hU6d60且包含與如下序列SEQ ID NO: 902至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image019
在一些實施例中，U6啟動子為hU6d90且包含與如下序列SEQ ID NO: 903至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image021
在一些實施例中，U6啟動子為hU6d120且包含與如下序列SEQ ID NO: 904至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image023
在一些實施例中，7SK啟動子為7SK2啟動子且包含與如下序列SEQ ID NO: 706至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image025
在一些實施例中，7SK啟動子為7SK2啟動子之變異體。在一些實施例中，相較於SEQ ID NO: 706之序列，7SK2啟動子中的變異體包含替代核苷酸。在一些實施例中，相較於SEQ ID NO: 706之243個核苷酸，7SK2啟動子之變異體例如包含更少的核苷酸。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體在SEQ ID NO: 706之7SK2啟動子之核小體結合序列中具有較少的核苷酸。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 706之核苷酸95-124對應的所有核苷酸或至少一部分核苷酸(例如至少5、10、15、20、25或30個核苷酸)。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 706之核苷酸81-140對應的所有核苷酸或至少一部分核苷酸(例如至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60個核苷酸)。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 706之核苷酸67-156對應的所有核苷酸或至少一部分核苷酸(例如至少10、20、30、40、50、60、65、70、75、80、85或90個核苷酸)。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體缺乏與SEQ ID NO: 706之核苷酸52-171對應的所有核苷酸或至少一部分核苷酸(例如至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120個核苷酸)。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體包含123-213個核苷酸。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體包含213個核苷酸。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體包含183個核苷酸。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體包含153個核苷酸。在一些實施例中，7SK2啟動子之變異體包含123個核苷酸。
在一些實施例中，7SK啟動子為7SKd30且包含與如下序列SEQ ID NO: 906至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image027
在一些實施例中，7SK啟動子為7SKd60且包含與如下序列SEQ ID NO: 907至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image029
在一些實施例中，7SK啟動子為7SKd90且包含與如下序列SEQ ID NO: 908至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image031
在一些實施例中，7SK啟動子為7SKd120且包含與如下序列SEQ ID NO: 909至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image033
在一些實施例中，H1啟動子為H1m或mH1啟動子且包含與如下序列SEQ ID NO: 707至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image035
在一些實施例中，Ck8e啟動子包含與如下序列SEQ ID NO: 701至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列：
Figure 02_image037
在一些實施例中，載體包含多個反向末端重複序列(ITR)。此等ITR可為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型。在一些實施例中，ITR為AAV2血清型。在一些實施例中，5' ITR包含序列SEQ ID NO: 709：
Figure 02_image039
在一些實施例中，3' ITR包含序列SEQ ID NO: 710：
Figure 02_image041
在一些實施例中，提供包含單一核酸分子的載體，該單一核酸分子編碼1)一或多個嚮導RNA，其包含SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154之間隔子序列中的任一者或多者；以及2) SaCas9。在一些實施例中，載體為AAV載體。在一些實施例中，載體為AAV9載體。在一些實施例中，將AAV載體投與個體以治療DM1。在一些實施例中，由於使用適用於SaCas9之背景下的特定嚮導序列，因此僅需一種載體。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供包含單一核酸分子的載體，該單一核酸分子編碼1)嚮導RNA對，其包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及2) SaCas9。在一些實施例中，載體為AAV載體。在一些實施例中，將AAV載體投與個體以治療DM1。在一些實施例中，由於使用適用於SaCas9之背景下的特定嚮導序列，因此僅需一種載體。在一些實施例中，組合物進一步包含DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，載體包含編碼Cas9蛋白(例如SaCas9蛋白)的核酸且進一步包含編碼一或多個單嚮導RNA的核酸。在一些實施例中，編碼Cas9蛋白的核酸處於CK8e啟動子的控制下。在一些實施例中，編碼嚮導RNA序列的核酸處於hU6c啟動子的控制下。在一些實施例中，載體為AAV9。在較佳實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於5 kb。在特定實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.9 kb。在其他實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.85 kb。在其他實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.8 kb。在其他實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.75 kb。在其他實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.7 kb。在一些實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸介於3.9-5 kb、4-5 kb、4.2-5 kb、4.4-5 kb、4.6-5 kb、4.7-5 kb、3.9-4.9 kb、4.2-4.9 kb、4.4-4.9 kb、4.7-4.9 kb、3.9-4.85 kb、4.2-4.85 kb、4.4-4.85 kb、4.6-4.85 kb、4.7-4.85 kb、4.7-4.9 kb、3.9-4.8 kb、4.2-4.8 kb、4.4-4.8 kb或4.6-4.8 kb之間。在一些實施例中，AAV9載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸介於4.4-4.85 kb之間。
在一些實施例中，載體包含編碼超過一個嚮導RNA之多個核酸。在一些實施例中，載體包含編碼兩個嚮導RNA序列的兩個核酸。
在一些實施例中，載體包含編碼Cas9蛋白(例如SaCas9蛋白)的核酸、編碼第一嚮導RNA的核酸，及編碼第二嚮導RNA的核酸。在一些實施例中，載體不包含編碼超過兩個嚮導RNA之核酸。在一些實施例中，編碼第一嚮導RNA之核酸與編碼第二嚮導RNA之核酸相同。在一些實施例中，編碼第一嚮導RNA之核酸不同於編碼第二嚮導RNA之核酸。在一些實施例中，載體包含單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含編碼Cas9蛋白的核酸、編碼第一嚮導RNA的核酸，及作為第二嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸。在一些實施例中，載體包含單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含編碼Cas9蛋白的核酸、作為第一嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸，及作為第二嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸。在一些實施例中，編碼Cas9蛋白(例如SaCas9)的核酸處於CK8e啟動子的控制下。在一些實施例中，第一嚮導處於7SK2啟動子的控制下，且第二嚮導處於H1m啟動子的控制下。在一些實施例中，第一嚮導處於H1m啟動子之控制下，且第二嚮導處於7SK2啟動子之控制下。在一些實施例中，第一嚮導處於hU6c啟動子之控制下，且第二嚮導處於H1m啟動子之控制下。在一些實施例中，第一嚮導處於H1m啟動子之控制下，且第二嚮導處於hU6c啟動子之控制下。在一些實施例中，編碼Cas9蛋白的核酸：a)介於編碼嚮導RNA的核酸之間；b)介於作為嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸之間；c)介於編碼第一嚮導RNA的核酸與作為第二嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸之間；d)介於編碼第二嚮導RNA之核酸與作為第一嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列的核酸之間；e)位於編碼嚮導RNA之核酸的5'；f)位於作為嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列之核酸的5'；g)位於編碼嚮導RNA之一之核酸的5'及作為其他嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列之核酸的5'；h)位於編碼嚮導RNA之核酸的3'；i)位於作為嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列之核酸的3'；或j)位於編碼嚮導RNA之一之核酸的3'及作為其他嚮導RNA之編碼序列之反向互補序列之核酸的3'。在一些實施例中，利用自ITR至ITR (包括兩個ITR)的核苷酸長度量測AAV載體尺寸。在一些實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於5 kb。在特定實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.9 kb。在其他實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.85 kb。在其他實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.8 kb。在其他實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.75 kb。在其他實施例中，AAV載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸小於4.7 kb。在一些實施例中，載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸介於3.9-5 kb、4-5 kb、4.2-5 kb、4.4-5 kb、4.6-5 kb、4.7-5 kb、3.9-4.9 kb、4.2-4.9 kb、4.4-4.9 kb、4.7-4.9 kb、3.9-4.85 kb、4.2-4.85 kb、4.4-4.85 kb、4.6-4.85 kb、4.7-4.85 kb、4.7-4.9 kb、3.9-4.8 kb、4.2-4.8 kb、4.4-4.8 kb或4.6-4.8 kb之間。在一些實施例中，載體自ITR至ITR (包括兩個ITR)的尺寸介於4.4-4.85 kb之間。在一些實施例中，載體為AAV9。
在一些實施例中，本發明提供一種核酸，其就正股而言自5'至3'包含：第一嚮導RNA支架序列(支架包含核苷酸序列SEQ ID NO: 500、910、911、912、920及921)的反向互補序列、編碼第一嚮導RNA序列之核苷酸序列的反向互補序列、編碼第一嚮導RNA序列之核苷酸序列表現用之啟動子(例如hU6c)的反向互補序列、應與內切核酸酶之啟動子相同的方向表現第二嚮導RNA用的啟動子(例如7SK2)、第二嚮導RNA序列及第二嚮導RNA支架序列(支架包含核苷酸序列SEQ ID NO: 500、910、911、912、920及921)、編碼內切核酸酶之核苷酸序列表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼內切核酸酶的核苷酸序列(例如SaCas9)、聚腺苷酸化序列。
在一些實施例中，本文中所揭示之任一種載體包含至少編碼第一嚮導RNA及第二嚮導RNA的核酸。在一些實施例中，核酸包含第一嚮導RNA的間隔子編碼序列、第一嚮導RNA的支架編碼序列、第二嚮導RNA的間隔子編碼序列，及第二嚮導RNA的支架編碼序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的間隔子編碼序列(例如編碼本文中所揭示的任一個間隔子序列)與第二嚮導RNA的間隔子編碼序列一致。在一些實施例中，第一嚮導RNA的間隔子編碼序列(例如編碼本文中所揭示的任一個間隔子序列)不同於第二嚮導RNA的間隔子編碼序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列與第二嚮導RNA的支架編碼序列一致。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列不同於編碼第二嚮導RNA之核酸的支架編碼序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含選自由SEQ ID No: 500、910、911、912、920及921組成之群的序列，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含選自由SEQ ID No: 500、910、911、912、920及921組成之群的不同序列。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 500。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 910。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 911。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 912。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 920。在一些實施例中，第一嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921，且第二嚮導RNA的支架編碼序列包含序列SEQ ID NO: 921。在一些實施例中，第一嚮導RNA的間隔子編碼序列與第二嚮導RNA的間隔子編碼序列相同，且第一嚮導RNA的支架編碼序列不同於編碼第二嚮導RNA之核酸的支架編碼序列。
本發明提供新穎的AAV載體組態。本文提供此等新穎AAV載體組態的一些實例，且此等例示性載體中的元件次序根據正股、以5'至3'方式提及。對於此等組態而言，應瞭解，所述元件可以不直接鄰接，並且所述元件之間可存在一或多個核苷酸或一或多個其他元件。然而，在一些實施例中，所述元件之間可不存在核苷酸或其他元件。此外，除非另有說明，否則「用於表現元件X的啟動子」意謂啟動子以促進所述元件X表現的方式定向。在一些實施例中，本發明提供編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，核酸編碼所編碼之SaCas9之C端上的核定域信號(例如SV40 NLS)。在一些實施例中，核酸編碼所編碼之SaCas9之C端上的NLS (例如SV40 NLS)，且核酸不編碼所編碼之SaCas9之N端上的NLS。在一些實施例中，核酸編碼所編碼之SaCas9之N端上的核定域信號(例如SV40 NLS)。在一些實施例中，核酸編碼所編碼之SaCas9之N端上的NLS (例如SV40 NLS)，且核酸不編碼所編碼之SaCas9之C端上的NLS。在一些實施例中，核酸編碼所編碼之SaCas9之C端上的核定域信號(例如SV40 NLS)且亦編碼所編碼之SaCas9之N端上的NLS。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現SaCas9用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。參見 圖 10A的「設計1」。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，SaCas9的啟動子為CK8e啟動子。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 500。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 910。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 911。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 912。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 920。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 921。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的H1m啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之啟動子的反向互補序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。參見 圖 10A的「設計2」。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為本文中所揭示的任一種7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，SaCas9的啟動子為CK8e啟動子。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 500。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 910。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 911。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 912。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 920。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 921。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之hU6c啟動子的反向互補序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、第二sgRNA表現用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之hU6c啟動子的反向互補序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、第二sgRNA表現用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之hU6c啟動子的反向互補序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的H1m啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之7SK2啟動子的反向互補序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)且第二sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、SaCas9的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。參見 圖 10A的「設計3」。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，SaCas9的啟動子為CK8e啟動子。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 500。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 910。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 911。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 912。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 920。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 921。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 910的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 910的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 912的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 912的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6d30啟動子(SEQ ID NO: 901)、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6d60啟動子(SEQ ID NO: 902)、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6d90啟動子(SEQ ID NO: 903)、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6d120啟動子(SEQ ID NO: 904)、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SKd30啟動子(SEQ ID NO: 906)、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SKd60啟動子(SEQ ID NO: 907)、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SKd90啟動子(SEQ ID NO: 908)、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SKd120啟動子(SEQ ID NO: 909)、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、SV40核定域序列(NLS)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、SV40核定域序列(NLS)，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的H1m啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 911的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 911的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU8 (SEQ ID NO: 8)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU2 (SEQ ID NO: 2)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD5 (SEQ ID NO: 13)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU1 (SEQ ID NO: 1)且第二sgRNA包含SaU1 (SEQ ID NO: 1)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6d30啟動子(SEQ ID NO: 901)、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6d60啟動子(SEQ ID NO: 902)、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6d90啟動子(SEQ ID NO: 903)、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6d120啟動子(SEQ ID NO: 904)、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SKd30啟動子(SEQ ID NO: 906)、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SKd60啟動子(SEQ ID NO: 907)、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SKd90啟動子(SEQ ID NO: 908)、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、包含SEQ ID NO: 921的第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SKd120啟動子(SEQ ID NO: 909)、第二sgRNA嚮導序列及包含SEQ ID NO: 921的第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)且第二sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。參見 圖 10A的「設計4」。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子為7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為hU6c啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 901。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 902。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 903。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 904。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子為7SK2啟動子。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 906。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 907。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 908。在一些實施例中，編碼第二sgRNA之核酸表現用的啟動子包含SEQ ID NO: 909。在一些實施例中，SaCas9的啟動子為CK8e啟動子。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 500。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 910。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 911。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 912。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 920。在一些實施例中，sgRNA支架為SEQ ID NO: 921。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域。在一些實施例中，第一sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增下游的核酸區域，且第二sgRNA靶向三核苷酸重複序列擴增上游的核酸區域。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在一些實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的H1m啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
在特定實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列、第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在特定實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
在特定實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在特定實施例中，AAV載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一嚮導RNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
在一些實施例中，編碼SaCas9的核酸編碼包含與如下序列SEQ ID NO: 711至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之胺基酸序列的SaCas9：
Figure 02_image043
在一些實施例中，編碼SaCas9的核酸包含SEQ ID NO: 914之核酸：
Figure 02_image045
Figure 02_image047
Figure 02_image049
在一些實施例中，組合物包含編碼SaCas9的核酸，SaCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 711。
在一些實施例中，SaCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 711之變異體。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置781的位置處，SaCas9包含除E之外的胺基酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置967的位置處，SaCas9包含除N之外的胺基酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置1014的位置處，SaCas9包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置781的位置處，SaCas9包含K。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置967的位置處，SaCas9包含K。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置1014的位置處，SaCas9包含H。在一些實施例中，SaCas9在對應於SEQ ID NO: 711之位置781的位置處包含除E之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 711之位置967的位置處包含除N之外的胺基酸；且在對應於SEQ ID NO: 711之位置1014的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SaCas9在對應於SEQ ID NO: 711之位置781的位置處包含K；在對應於SEQ ID NO: 711之位置967的位置處包含K；且在對應於SEQ ID NO: 711之位置1014的位置處包含H。
在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置244的位置處，SaCas9包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置412的位置處，SaCas9包含除N之外的胺基酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置418的位置處，SaCas9包含除N之外的胺基酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置653的位置處，SaCas9包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SaCas9在對應於SEQ ID NO: 711之位置244的位置處包含除R之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 711之位置412的位置處包含除N之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 711之位置418的位置處包含除N之外的胺基酸；且在對應於SEQ ID NO: 711之位置653的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置244的位置處，SaCas9包含A。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置412的位置處，SaCas9包含A。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置418的位置處，SaCas9包含A。在一些實施例中，在對應於SEQ ID NO: 711之位置653的位置處，SaCas9包含A。在一些實施例中，SaCas9在對應於SEQ ID NO: 711之位置244的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 711之位置412的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 711之位置418的位置處包含A；且在對應於SEQ ID NO: 711之位置653的位置處包含A。
在一些實施例中，SaCas9在對應於SEQ ID NO: 711之位置244的位置處包含除R之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 711之位置412的位置處包含除N之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 711之位置418的位置處包含除N之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 711之位置653的位置處包含除R之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 711之位置781的位置處包含除E之外的胺基酸；在對應於SEQ ID NO: 711之位置967的位置處包含除N之外的胺基酸；且在對應於SEQ ID NO: 711之位置1014的位置處包含除R之外的胺基酸。在一些實施例中，SaCas9在對應於SEQ ID NO: 711之位置244的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 711之位置412的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 711之位置418的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 711之位置653的位置處包含A；在對應於SEQ ID NO: 711之位置781的位置處包含K；在對應於SEQ ID NO: 711之位置967的位置處包含K；且在對應於SEQ ID NO: 711之位置1014的位置處包含H。
在一些實施例中，SaCas9包含與如下序列SEQ ID NO: 715 (在本文中稱為SaCas9-KKH或SACAS9KKH)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image051
Figure 02_image053
在一些實施例中，SaCas9包含與如下序列SEQ ID NO: 716 (在本文中稱為SaCas9-HF)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image055
在一些實施例中，SaCas9包含與如下序列SEQ ID NO: 717 (在本文中稱為SaCas9-KKH-HF)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image057
Figure 02_image059
在一些實施例中，Cas蛋白為以下文獻中所揭示之任一種工程化Cas蛋白：Schmidt等人, 2021, Nature Communications,「Improved CRISPR genome editing using small highly active and specific engineered RNA-guided nucleases」。
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 708 (在本文中稱為sRGN1)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image061
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 712 (在本文中稱為sRGN2)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image063
在一些實施例中，Cas9包含與序列SEQ ID NO: 718 (在本文中稱為sRGN3)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image065
Figure 02_image067
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 719 (在本文中稱為sRGN3.1)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image069
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 720 (在本文中稱為sRGN3.2)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image071
Figure 02_image073
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 721 (在本文中稱為sRGN3.3)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image075
在一些實施例中，Cas9包含與如下序列SEQ ID NO: 722 (在本文中稱為sRGN4)至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：
Figure 02_image077
Figure 02_image079
經修飾之嚮導RNA
在一些實施例中，嚮導RNA經化學修飾。包含一或多個經修飾之核苷或核苷酸的嚮導RNA稱為「經修飾」之嚮導RNA或「經化學修飾」之嚮導RNA，以描述替代典型A、G、C及U殘基使用或除其之外使用的非天然及/或天然存在之一或多種組分或組態的存在。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA係由非典型核苷或核苷酸合成，在此稱為「經修飾」。經修飾之核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i)磷酸二酯主鏈鍵聯中之一或兩個非鍵聯磷酸酯氧及/或一或多個鍵聯磷酸酯氧的變化，例如置換(例示性主鏈修飾)；(ii)核糖成分(例如核糖上之2'羥基)的變化，例如置換(例示性糖修飾)；(iii)用「去磷酸化」連接子成批置換磷酸酯部分(例示性主鏈修飾)；(iv)天然存在之核鹼基的修飾或置換，包括用非典型核鹼基修飾或置換(例示性鹼基修飾)；(v)核糖-磷酸酯主鏈之置換或修飾(例示性主鏈修飾)；(vi)寡核苷酸之3'端或5'端之修飾，例如末端磷酸酯基團之移除、修飾或置換，或部分、帽或連接子之結合(此類3'或5'帽修飾可包含糖及/或主鏈修飾)；及(vii)糖之修飾或置換(例示性糖修飾)。
化學修飾(諸如上文所列的化學修飾)可加以組合，以提供經修飾之嚮導RNA，其包含可具有兩個、三個、四個或更多個修飾的核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)。舉例而言，經修飾之殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基，或經修飾之糖及經修飾之磷酸二酯。在一些實施例中，嚮導RNA中的每個鹼基經修飾，例如所有鹼基具有經修飾之磷酸酯基團，諸如硫代磷酸酯基團。在某些實施例中，嚮導RNA分子中的所有或基本上所有磷酸酯基團經硫代磷酸酯基團置換。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA在RNA之5'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA在RNA之3'端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。
在一些實施例中，嚮導RNA包含一個、兩個、三個或更多個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之嚮導RNA中的至少5% (例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)位置為經修飾之核苷或核苷酸。
未經修飾之核酸可容易藉由例如細胞內核酸酶或血清中所發現之彼等核酸酶降解。舉例而言，核酸酶可使核酸磷酸二酯鍵水解。因此，在一個態樣中，本文所述之嚮導RNA可含有一或多個經修飾之核苷或核苷酸，例如以向細胞內核酸酶或基於血清之核酸酶引入穩定性。在一些實施例中，本文所述之經修飾的嚮導RNA分子當引入細胞群中時，在活體內與離體均可展現降低之先天免疫反應。術語「先天免疫反應」包括針對包括單股核酸之外源核酸的細胞反應，包括誘導細胞介素(特定言之，干擾素)表現及釋放以及細胞死亡。
在主鏈修飾的一些實施例中，經修飾之殘基中的磷酸酯基團可藉由用不同取代基置換一或多個氧而經修飾。另外，經修飾之殘基，例如存在於經修飾之核酸中的經修飾之殘基，可包括用如本文所述之經修飾之磷酸酯基團成批置換未修飾之磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之主鏈修飾可包括產生不帶電連接子或電荷分佈不對稱之帶電連接子的變化。
經修飾之磷酸酯基團實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、膦酸烷酯或膦酸芳酯，及磷酸三酯。未修飾之磷酸酯基團中的磷原子呈非對掌性。然而，用上述原子或原子基團之一置換非橋連氧之一可使得磷原子呈對掌性。立體對稱磷原子可具有「R」組態(本文中為Rp)或「S」組態(本文中為Sp)。主鏈亦可藉由用氮(橋連胺基磷酸酯)、硫(橋連硫代磷酸酯)及碳(橋連亞甲基膦酸酯)置換橋連氧(亦即，連接磷酸酯與核苷之氧)而加以修飾。置換可發生在任一連接氧或兩個連接氧處。
磷酸酯基團可在某些主鏈修飾中經不含磷之連接基團置換。在一些實施例中，帶電磷酸酯基團可經中性部分置換。可置換磷酸酯基之部分之實例可包括但不限於例如膦酸甲酯、羥胺基、矽氧烷、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲縮醛、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基肼、亞甲基二甲基肼及亞甲氧基甲基亞胺基。
亦可構築可模擬核酸之支架，其中磷酸酯連接子及核糖經核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置換。此類修飾可包含主鏈及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可藉由替代主鏈繫拴。實例可包括(但不限於) N-嗎啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷替代物。
經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括一或多個針對糖基之修飾，亦即糖修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可經修飾，例如經多個不同「氧基」或「去氧」取代基置換。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，原因為羥基不可再發生去質子化而形成2'-烷醇鹽離子。
2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)；O(CH 2CH 2O) nCH 2CH 2OR，其中R可為例如H或視情況經取代之烷基，且n可為0至20之整數(例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，其為氟置換2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「鎖定」核酸(LNA)，其中2'羥基可藉由例如C 1-6伸烷基或C 1-6伸雜烷基橋連接至同一核糖之4'碳，其中例示性橋可包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋；O-胺基(其中胺基可為例如NH 2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)及胺基烷氧基、O(CH 2) n-胺基(其中胺基可為例如NH 2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「未鎖定」核酸(unlocked nucleic acid；UNA)，其中核糖環缺乏C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(methoxyethyl group；MOE)(OCH 2CH 2OCH 3，例如PEG衍生物)。
「去氧」2'修飾可包括氫(亦即，去氧核糖，例如位於部分dsRNA之突出部分)；鹵基(例如溴、氯、氟或碘)；胺基(其中胺基可為例如NH 2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH 2CH 2NH) nCH2CH 2-胺基(其中胺基可例如如本文所述)、-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；及可視情況經例如如本文所述之胺基取代的烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基。
糖修飾可包含亦可含有一或多個碳之糖基，該一或多個碳具有與核糖中之相應碳相反的立體化學組態。因此，經修飾之核酸可包括含有例如阿拉伯糖作為糖的核苷酸。經修飾之核酸亦可包括無鹼基糖。此等無鹼基糖亦可進一步在一或多個組成性糖原子處經修飾。經修飾之核酸亦可包括一或多種呈L形式之糖，例如L-核苷。
可併入經修飾之核酸中的本文所述之經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括經修飾之鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括(但不限於)腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。此等核鹼基可經修飾或全部被置換以提供可併入經修飾之核酸中的經修飾之殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如天然存在之鹼基衍生物及合成的鹼基衍生物。
在使用雙重嚮導RNA的實施例中，crRNA及tracr RNA中的每一者可含有修飾。此類修飾可位於crRNA及/或tracr RNA之一端或兩端。在包含sgRNA之實施例中，sgRNA之一端或兩端的一或多個殘基可經化學修飾，且/或內部核苷可經修飾，且/或整個sgRNA可經化學修飾。某些實施例包含5'端修飾。某些實施例包含3'端修飾。
涵蓋2'-O-甲基之修飾。
已顯示可影響核苷酸糖環之另一化學修飾為鹵素取代。舉例而言，核苷酸糖環上之2'-氟(2'-F)取代可增加寡核苷酸結合親和力及核酸酶穩定性。涵蓋2'-氟(2'-F)之修飾。
硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指一鍵，其中磷酸二酯鍵聯(例如核苷酸鹼基之間的鍵)中的一個非橋接磷酸酯氧被硫取代。當硫代磷酸酯用於產生寡核苷酸時，經修飾之寡核苷酸亦可被稱作S-寡核苷酸。
無鹼基核苷酸係指缺乏含氮鹼基之彼等核苷酸。
反向鹼基係指鍵聯相對於正常5'至3'鍵聯(亦即，5'至5'鍵或3'至3'鍵聯)呈反向之彼等鹼基。
無鹼基核苷酸可經由反向鍵聯連接。舉例而言，無鹼基核苷酸可經由5'至5'鍵聯連接至末端5'核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3'至3'鍵聯連接至末端3'核苷酸。末端5’或3’核苷酸處之反向無鹼基核苷酸亦可稱為反向無鹼基端帽。
在一些實施例中，對5'末端之前三、四或五個核苷酸中的一或多者及3'末端之最後三、四或五個核苷酸中的一或多者進行修飾。在一些實施例中，修飾為2'-O-Me、2'-F、反向無鹼基核苷酸、PS鍵，或此項技術中熟知可增強穩定性及/或效能的其他核苷酸修飾。
在一些實施例中，5'末端之前四個核苷酸，及3'末端之最後四個核苷酸經由硫代磷酸酯(PS)鍵連接。
在一些實施例中，5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之最後三個核苷酸包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'末端之前三個核苷酸及3'末端之最後三個核苷酸包含經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。 核糖核蛋白複合物
在一些實施例中，涵蓋組合物，該組合物包含：a)一或多個嚮導RNA，包括 表 1A及 表 1B的一或多個嚮導序列；以及b) saCas9，或本文所揭示之任一種變異型Cas9蛋白。在一些實施例中，嚮導RNA連同Cas9一起稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。
在一些實施例中，本發明提供一種RNP複合物，其中嚮導RNA(例如本文所揭示之任一個嚮導RNA)結合至或能夠結合至DMPK基因中的目標序列，或 表 1A及 表 1B中所揭示之任一種序列所結合的目標序列，其中DMPK基因包含目標序列上游位置的PAM識別序列，且其中RNP在DMPK基因中之PAM上游3個核苷酸的位置(-3)處進行切割。在一些實施例中，RNP亦在DMPK基因中之PAM上游2個核苷酸(-2)、上游4個核苷酸(-4)、上游5個核苷酸(-5)或上游6個核苷酸(-6)的位置處切割。在一些實施例中，RNP在DMPK基因中之PAM上游3個核苷酸(-3)及上游4個核苷酸(-4)的位置處切割。
在一些實施例中，使用嵌合Cas9 (SaCas9)核酸酶，其中蛋白質之一個域或區域經不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas9核酸酶域可經來自不同核酸酶(諸如Fok1)之域置換。在一些實施例中，Cas9核酸酶可為經修飾之核酸酶。
在一些實施例中，Cas9經修飾以僅含一個核酸酶功能域。舉例而言，藥劑蛋白質可經修飾以使得一個核酸酶域發生突變或完全或部分缺失以減少其核酸裂解活性。
在一些實施例中，Cas9蛋白核酸酶域內的保守胺基酸經取代以減少或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas9核酸酶可在RuvC或RuvC樣核酸酶域中包含胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見例如Zetsche等人, (2015) CellOct 22:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas9核酸酶可在HNH或HNH樣核酸酶域中包含胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。參見例如Zetsche等人(2015)。其他例示性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A (基於新兇手弗朗西斯氏菌( Francisella novicida) U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。其他例示性胺基酸取代包括D10A及N580A (基於金黃色葡萄球菌Cas9蛋白)。參見例如Friedland等人, 2015, Genome Biol., 16:257。
在一些實施例中，Cas9缺乏裂解酶活性。在一些實施例中，Cas9包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽為dCas9多肽。在一些實施例中，缺乏裂解酶活性之Cas9或dCas DNA結合多肽為Cas核酸酶的一種形式(例如上文論述的Cas9核酸酶)，其中其內切核酸酶活性位點不活化，例如藉由其催化域之一或多種變化(例如點突變)而不活化。參見例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。
在一些實施例中，Cas9包含一或多個異源功能域(例如為融合多肽或包含融合多肽)。
在一些實施例中，異源功能域可促進Cas9轉運至細胞核中。舉例而言，異源功能域可為核定域信號(NLS)。在一些實施例中，Cas9可與1至10個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與1至5個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與一個NLS融合。在使用一個NLS的情況下，NLS可在Cas9序列之N端或C端處連接，且可直接連接。在一些實施例中，在使用超過一個NLS的情況下，一或多個NLS可在N端連接且/或一或多個NLS可在C端連接。在一些實施例中，一或多個NLS直接連接至Cas9。在一些實施例中，一或多個NLS藉由連接子連接至Cas9。在實施例中，連接子的長度在3至25個胺基酸之間。在實施例中，連接子的長度在3至6個胺基酸之間。在一些實施例中，連接子包含甘胺酸及絲胺酸。在一些實施例中，連接子包含序列GSVD (SEQ ID NO: 940)或GSGS (SEQ ID NO: 941)。其亦可插入Cas9序列內。在其他實施例中，Cas9可與超過一個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與兩個NLS融合。在某些環境中，兩個NLS可相同(例如兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中，Cas9蛋白與SV40 NLS融合。在一些實施例中，SV40 NLS包含胺基酸序列SEQ ID NO: 713 (PKKKRKV)。在一些實施例中，Cas9蛋白(例如SaCas9)與核質蛋白NLS融合。在一些實施例中，核質蛋白NLS包含胺基酸序列SEQ ID NO: 714 (KRPAATKKAGQAKKKK)。在一些實施例中，Cas9蛋白與c-Myc NLS融合。在一些實施例中，c-Myc NLS為SEQ ID NO: 942 (PAAKKKKLD)且/或由核酸序列SEQ ID NO: 943 (CCGGCAGCTAAGAAAAAGAAACTGGAT)編碼。在一些實施例中，Cas9與在羧基端連接的兩個SV40 NLS序列融合。在一些實施例中，Cas9可與兩個NLS融合，一個在N端連接且一個在C端連接。在一些實施例中，Cas9可與3個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可不與NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與一個NLS融合。在一些實施例中，Cas9可與NLS在C端融合且不包含在N端融合的NLS。在一些實施例中，Cas9可與NLS在N端融合且不包含在C端融合的NLS。在一些實施例中，Cas9蛋白與SV40 NLS融合且與核質蛋白NLS融合。在一些實施例中，SV40 NLS與Cas9的C端融合，而核質蛋白NLS與Cas9蛋白的N端融合。在一些實施例中，SV40 NLS與Cas9的N端融合，而核質蛋白NLS與Cas9蛋白的C端融合。在一些實施例中，c-myc NLS與Cas9的N端融合且SV40 NLS及/或核質蛋白NLS與Cas9的C端融合。在一些實施例中，c-myc NLS與Cas9的N端(例如藉由連接子，諸如GSVD (SEQ ID NO: 940))融合，SV40 NLS與Cas9的C端(例如藉由連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))融合，且核質蛋白NLS與SV-40 NLS的C端(例如藉由連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))融合。在一些實施例中，SV40 NLS藉由連接子與Cas9蛋白融合。在一些實施例中，核質蛋白NLS藉由連接子與Cas9蛋白融合。
在一些實施例中，異源功能域能夠調節Cas9的細胞內半衰期。在一些實施例中，可延長Cas9半衰期。在一些實施例中，可縮短Cas9半衰期。在一些實施例中，異源功能域能夠增強Cas9穩定性。在一些實施例中，異源功能域能夠減小Cas9穩定性。在一些實施例中，異源功能域可充當蛋白質降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶介導，諸如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或鈣蛋白酶(calpain proteases)。在一些實施例中，異源功能域可包含PEST序列。在一些實施例中，可藉由添加泛素或聚泛素鏈來修飾Cas9。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白(UBL)。泛素樣蛋白之非限制性實例包括小泛素樣調節因子(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦稱為干擾素刺激基因-15 (ISG15))、泛素相關調節因子-1 (URM1)、神經元前驅體細胞表現之發育下調蛋白-8(NEDD8，在釀酒酵母( S. cerevisiae)中亦稱作Rub1)、人類白血球F相關抗原(FAT10)、自體吞噬-8 (ATG8)及自體吞噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素摺疊調節因子-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源功能域可為標記域。標記域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、抗原決定基標籤及報導基因序列。在一些實施例中，標記域可為螢光蛋白。適合螢光蛋白之非限制實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami綠(Azami Green)、單體Azami綠、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、氰基螢光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed單體、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)，及橙色螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira橙、單體Kusabira橙、mTangerine、tdTomato)或任何其他適合螢光蛋白。在其他實施例中，標記域可為純化標籤及/或抗原決定基標籤。非限制性例示性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)、殼質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(tandem affinity purification，TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚His及調鈣蛋白。非限制性之例示性報導基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在其他實施例中，異源功能域可使Cas9靶向特定細胞器、細胞類型、組織或器官。在一些實施例中，異源功能域可使Cas9靶向肌肉。
在其他實施例中，異源功能域可為效應域。當Cas9針對其目標序列時，例如當Cas9藉由嚮導RNA針對目標序列時，效應域可修飾或影響目標序列。在一些實施例中，效應域可選自核酸結合域或核酸酶域(例如非Cas核酸酶域)。在一些實施例中，異源功能域為核酸酶，諸如FokI核酸酶。參見例如美國專利第9,023,649號。 測定嚮導RNA的功效
在一些實施例中，當嚮導RNA連同形成RNP之其他組分一起遞送或表現時，測定該嚮導RNA的功效。在一些實施例中，嚮導RNA連同SaCas9一起表現。在一些實施例中，嚮導RNA遞送至或表現於已穩定表現SaCas9的細胞株中。在一些實施例中，嚮導RNA作為RNP之一部分遞送至細胞。在一些實施例中，嚮導RNA連同編碼SaCas9的核酸(例如mRNA)一起遞送至細胞。
在一些實施例中，基於活體外模型來測定特定嚮導RNA的功效。在一些實施例中，活體外模型為細胞株。
在一些實施例中，根據嚮導RNA選擇過程，跨越多種活體外細胞模型測定特定嚮導RNA的功效。在一些實施例中，對細胞株使用所選嚮導RNA的資料進行比較。在一些實施例中，對多種細胞模型進行交叉篩選。
在一些實施例中，基於活體內模型來測定特定嚮導RNA的功效。在一些實施例中，活體內模型為嚙齒動物模型。在一些實施例中，嚙齒動物模型為表現包含擴增之三核苷酸重複序列或自身互補區域之基因的小鼠。基因可為表1中所列之任一種基因的人類形式或嚙齒動物(例如鼠類)同源物。在一些實施例中，基因為人類 DMPK。在一些實施例中，基因為 DMPK之嚙齒動物(例如鼠類)同源物。在一些實施例中，活體內模型為非人類靈長類動物，例如食蟹獼猴。參見例如Huguet等人, 2012, PLoS Genet, 8(11):e1003043中所述的小鼠模型。在一些實施例中，活體內模型為非人類靈長類動物，例如食蟹獼猴。 III.  基因編輯、CTG重複序列切除及治療DM1的方法
本發明提供治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法及用途。在一些實施例中，本文所述的任一種組合物或系統可投與有需要之個體用於在DMPK基因中產生雙股斷裂。在一些實施例中，本文所述之組合物或系統中的任一者可投與有需要之個體用於切除DMPK基因之3'非轉譯區(UTR)中的CTG重複序列。在一些實施例中，本文所述之組合物或系統中的任一者可投與有需要之個體用於治療DM1。在一些實施例中，將核酸分子投與個體以治療DM1，該核酸分子包含編碼 表 1A 及表 1B中之一或多個嚮導RNA的第一核酸及編碼SaCas9的第二核酸。在一些實施例中，將單一核酸分子(其可為載體，包括AAV載體)投與個體以治療DM1，該單一核酸分子包含編碼 表 1A 及表 1B中之一或多個嚮導RNA的第一核酸及編碼SaCas9的第二核酸。
在一些實施例中，將本文所述之任一種組合物投與有需要之個體以治療第1型肌強直性營養不良(DM1)。
為了治療個體(例如人類)，本文所揭示之任一種組合物可以與劑型相容的方式且以治療上有效的量投與。組合物可容易以多種劑型(諸如可注射溶液)投與。舉例而言，以水溶液非經腸投與時，溶液通常宜緩衝，且首先用例如足夠的生理鹽水或葡萄糖來賦予液體稀釋劑等張性。此類水溶液可用於例如靜脈內、肌肉內、皮下及/或腹膜內投與。
在一些實施例中，將本文所述之任一種組合物投與有需要之個體以誘導DMPK基因中發生雙股斷裂。
在一些實施例中，將本文所述之任一種組合物投與有需要之個體以切除DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。
在一些實施例中，將本文所述之任一種組合物投與有需要之個體以治療DM1，例如投與DMPK基因之3' UTR中具有CTG重複序列的個體。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，所述方法包含將本文所述之任一種組合物遞送至細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
特定而言，在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含向細胞中遞送：1)核酸分子，其包含：編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28或101-154之間隔子序列的核酸；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28或101-154之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼間隔子序列的核酸，該間隔子序列與SEQ ID NO: 1-8、10-28或101-154中之任一者至少90%一致；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，細胞包含位於DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
特定而言，在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含向細胞中遞送：1)核酸分子，其包含：編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-9、10-28或101-154之間隔子序列的核酸；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-9、10-28或101-154之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1-9、10-28或101-154中之任一者至少90%一致；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，細胞包含位於DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者至少90%一致；以及2)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者至少90%一致；以及2)編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 21。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 27。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列選自SEQ ID NO: 101、102、103、104、105、106、107、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、133、134、135、136、137、138、139、140、143、144、147、148、149、150、151、152、153及154中之任一者；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 101、102、103、104、105、106、107、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、133、134、135、136、137、138、139、140、143、144、147、148、149、150、151、152、153及154中之任一者之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 101、102、103、104、105、106、107、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、133、134、135、136、137、138、139、140、143、144、147、148、149、150、151、152、153及154中之任一者至少90%一致；以及2)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列選自SEQ ID NO: 101、102、103、104、105、106、107、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、133、134、135、136、137、138、139、140、143、144、147、148、149、150、151、152、153及154中之任一者；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 101、102、103、104、105、106、107、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、133、134、135、136、137、138、139、140、143、144、147、148、149、150、151、152、153及154中之任一者之一或多個間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 101、102、103、104、105、106、107、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、133、134、135、136、137、138、139、140、143、144、147、148、149、150、151、152、153及154中之任一者至少90%一致；以及2)編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 102。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 103。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 105。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 106。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 107。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 113。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 114。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 115。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 116。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 118。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 119。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 120。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 121。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 122。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 123。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 124。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 125。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 126。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 127。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 128。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 133。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 134。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 135。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 136。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 137。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 138。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 139。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 140。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 143。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 144；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 147；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 148；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 149；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 150；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 151；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 152；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 153；在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 154。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：i)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；b)包含i) a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a)或i) b)之第一及第二間隔子序列中的任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：i)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；8與25；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；8與19；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；4與14；7與19；4與26；8與26；7與25；1與21；3與26；2與26；8與14；1與14；2與14；3與14；1與26；7與21；7與14；及7與26；b)包含i) a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a)或i) b)之第一及第二間隔子序列中的任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：i)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；及4與25；b)包含i) a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a)或i) b)之第一及第二間隔子序列中的任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：i)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；7與19；7與25；1與21；3與26；3與14；7與21；及7與14；b)包含i) a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a.或i) b)之第一及第二間隔子序列中的任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：i)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與10；4與28；8與12；4與13；3與10；7與12；7與13；4與28；以及7與18；b)包含i) a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a)或i) b)之第一及第二間隔子序列中的任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：i)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與10；1與12；8與12；4與13；7與12；7與28；以及7與18；b)包含i) a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a)或i) b)之第一及第二間隔子序列中的任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 2與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 3與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與20。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與18。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 2與10。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與10。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 1與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 8與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與13。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與28。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與18。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：i)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自SEQ ID NO: 7與12；4與12；或7與23中之任一者的第一及第二間隔子序列；b)包含i) a)之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a)或i) b)之第一及第二間隔子序列中的任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與23。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)核酸分子，該核酸分子包含：編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28或101-154之間隔子序列的核酸；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28或101-154之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1-8、10-28或101-154中之任一者至少90%一致；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)核酸分子，該核酸分子包含：編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12或20之間隔子序列的核酸；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12或20之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12或20中之任一者至少90%一致；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 20。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)核酸分子，該核酸分子包含：編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1、101及102之間隔子序列的核酸；編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1、101及102之間隔子序列的至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸；或編碼一或多個間隔子序列的核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1、101及102中之任一者至少90%一致；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，間隔子序列為SEQ ID NO: 102。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，僅投與一個嚮導RNA且切除3' UTR中的CTG重複序列。在一些實施例中，投與嚮導RNA對且切除3' UTR中的CTG重複序列。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼嚮導RNA對的核酸分子，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；b)包含選自1) a)中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與1) a)或1) b)中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼嚮導RNA對的核酸分子，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；8與25；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；8與19；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；4與14；7與19；4與26；8與26；7與25；1與21；3與26；2與26；8與14；1與14；2與14；3與14；1與26；7與21；7與14；及7與26；b)包含選自1) a)中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與1) a)或1) b)中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼嚮導RNA對的核酸分子，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；及4與11；b)包含選自1) a)中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與1) a)或1) b)中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼嚮導RNA對的核酸分子，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；7與19；7與25；1與21；3與26；3與14；7與21；及7與14；b)包含選自1) a)中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與1) a)或1) b)中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼嚮導RNA對的核酸分子，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與10；4與28；8與12；4與13；3與10；7與12；7與13；4與28；以及7與18；b)包含選自1) a)中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與1) a)或1) b)中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與10；1與12；8與12；4與13；7與12；7與28；以及7與18；b)包含i) a)中之第一及第二間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與i) a)或i) b)中之第一及第二間隔子序列至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及ii)編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 2與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 3與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與20。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與18。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 2與10。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與10。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 1與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 8與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與13。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與28。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與18。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，提供一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含：1)編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含：a)選自SEQ ID NO: 7與12、4與12及7與23中之任一者的第一及第二間隔子序列；b)選自i) a)中之任一者之間隔子序列之至少17、18、19、20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列；或c)與1) a)或1) b)與中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列；以及2)金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 4與12。在一些實施例中，第一及第二間隔子序列為SEQ ID NO: 7與23。在一些實施例中，該方法進一步包含投與DNA-PK抑制劑。
在一些實施例中，方法包含將編碼SaCas9的核酸分子遞送至細胞，其中該SaCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 711。在一些實施例中，方法包含將編碼SaCas9的核酸分子遞送至細胞，其中該SaCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 711的變異體。在一些實施例中，方法包含將編碼SaCas9的核酸分子遞送至細胞，其中該SaCas9包含選自SEQ ID NO: 715-717中之任一者的胺基酸序列。
在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。 IV.          DNA-PK抑制劑
在本文所揭示之組合物或方法中使用DNA-PK抑制劑的情況下，其可為此項技術中已知之任何DNA-PK抑制劑。DNA-PK抑制劑詳細論述於例如WO2014/159690；WO2013/163190；WO2018/013840；WO2019/143675；WO 2019/143677；WO 2019/143678；US2014275059；US2013281431；US2020361877；US2020353101及Robert等人, Genome Medicine(2015) 7:93，其各自以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為NU7441、KU-0060648，或化合物1、2、3、4、5或6 (結構在下文顯示)中之任一者，其各自亦描述於至少一個前述引文中。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物1。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物2。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物6。在一些實施例中，DNA-PK抑制劑為化合物3。例示性DNA-PK抑制劑結構如下。除非另外指示，否則以名稱或結構提及DNA-PK抑制劑涵蓋其醫藥學上可接受之鹽。
DNA-PK抑制劑 結構
NU7441
Figure 02_image081
KU-0060648
Figure 02_image083
化合物1
Figure 02_image085
化合物2
Figure 02_image087
化合物3
Figure 02_image089
化合物4
Figure 02_image091
化合物5
Figure 02_image093
化合物6
Figure 02_image095
在使用DNA-PK抑制劑的任一前述實施例中，其可與僅一種gRNA或編碼僅一種gRNA的載體組合使用以促進切除，亦即，該方法並非始終包括提供兩種或更多種促進在CTG重複序列附近裂解的嚮導。
在使用DNA-PK抑制劑的一些實施例中，其可與gRNA對或編碼嚮導RNA對的載體組合使用以促進切除。在一些實施例中，gRNA對包含不相同的gRNA。在特定實施例中，gRNA對共同靶向與細胞基因體中之CTG重複序列區域側接的序列。 V.    組合療法
在一些實施例中，本發明包含組合療法，其包含本文所述之任一種方法或用途以及適於緩解DM1的另一種療法。 VI.   嚮導RNA組合物的遞送
本文所揭示的方法及用途可使用用於遞送本文所述之嚮導RNA及組合物的任何適合方法。例示性遞送方法包括載體，諸如病毒載體；脂質奈米粒子；轉染；及電穿孔。在一些實施例中，與本文所揭示之單一載體嚮導RNA/Cas9結合的載體或LNP用於製備供治療DM1用的藥劑。
在使用載體的情況下，其可為病毒載體，諸如非整合性病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒載體、慢病毒載體、整合酶缺乏型慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、α病毒載體或單純疱疹病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，AAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10 (參見例如US 9,790,472之SEQ ID NO: 81，該文獻以全文引用之方式併入本文中)、AAVrh74 (參見例如US 2015/0111955之SEQ ID NO: 1，該文獻以全文引用之方式併入本文中)或AAV9載體，其中AAV後之數字指示AAV血清型。通用術語AAV載體、AAV1載體等涵蓋AAV載體或其血清型之任何變異體，諸如自互補AAV (scAAV)載體。關於各種AAV載體的詳細論述，參見例如McCarty等人, Gene Ther. 2001;8:1248-54, Naso等人, BioDrugs2017; 31:317-334，及其中所引述的參考文獻。
在一些實施例中，載體(例如病毒載體，諸如腺相關病毒載體)包含組織特異性(例如肌肉特異性)啟動子，例如其可操作地連接至編碼嚮導RNA的序列。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為肌肉肌酸激酶啟動子、結蛋白啟動子、MHCK7啟動子或SPc5-12啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8啟動子。在一些實施例中，肌肉特異性啟動子為CK8e啟動子。肌肉特異性啟動子詳細描述於例如US2004/0175727 A1; Wang等人, Expert Opin Drug Deliv. (2014) 11, 345-364; Wang等人, Gene Therapy(2008) 15, 1489-1499。在一些實施例中，組織特異性啟動子為神經元特異性啟動子，諸如烯醇酶啟動子。關於組織特異性啟動子(包括神經元特異性啟動子)的詳細論述，參見例如Naso等人, BioDrugs2017; 31:317-334; Dashkoff等人, Mol Ther Methods Clin Dev. 2016;3:16081及其中所引述之參考文獻。
在一些實施例中，除嚮導RNA及Cas9序列之外，載體進一步包含不編碼嚮導RNA之核酸。不編碼嚮導RNA及Cas9的核酸包括(但不限於)啟動子、增強子及調控序列。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。
脂質奈米粒子(LNP)為用於遞送核苷酸及蛋白質負荷之已知方式，且可用於遞送本文所揭示之嚮導RNA、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP遞送核酸、蛋白質，或核酸以及蛋白質。
電穿孔為遞送負荷之熟知方式，且任何電穿孔方法可用於遞送本文所揭示之單一載體。
在一些實施例中，本發明包含一種將本文所揭示之任一種單一載體遞送至離體細胞的方法，其中嚮導RNA係由與LNP結合或處於水溶液中的載體編碼。在一些實施例中，嚮導RNA/LNP或嚮導RNA亦與Cas9或編碼Cas9的序列結合(例如處於同一載體、LNP或溶液中)。 實例
以下實例係為了說明所揭示的某些實施例而提供且不應解釋為以任何方式限制本發明之範疇。 實例1：DM1 sgRNA的評價  A.    材料及方法  1.     sgRNA選擇
針對有義股或反義股上的典型NNGRRT PAM序列，掃描人類 DMPK基因的3' UTR，且鑑別出28種與典型PAM鄰接的sgRNA原間隔子序列(長度為22個核苷酸)( 表 1A)。選擇27種sgRNA，以便基於電腦模擬的脫靶評估來針對DM1患者原代肌母細胞作出評價。 其他例示性嚮導序列展示於 表 1B中。 表 1A ： 人類 DMPK 基因之 3' UTR 區域中具有典型 NNGRRT PAM 序列的 SaCas9 sgRNA
SaCas9 sgRNA 名稱 SEQ ID NO 股 原間隔子序列 (22 bp) 原間隔子 起點 原間隔子 終點 PAM 序列 PAM 起點 PAM 終點 預測的脫靶位點數目
SaU1            1 + GCCCCGGAGTCGAAGACAGTTC 45770460 45770481 TAGGGT 45770482 45770487 3
SaU2            2 + ACTCAGTCTTCCAACGGGGCCC 45770442 45770463 CGGAGT 45770464 45770469 2
SaU3            3 - ACTCCGGGGCCCCGTTGGAAGA 45770448 45770469 CTGAGT 45770442 45770447 3
SaU4            4 - CCAGTTCACAACCGCTCCGAGC 45770383 45770404 GTGGGT 45770377 45770382 0
SaU5            5 + CCCCGGCCGCTAGGGGGCGGGC 45770326 45770347 CCGGAT 45770348 45770353 8
SaU6            6 - CTAGCGGCCGGGGAGGGAGGGG 45770317 45770338 CCGGGT 45770311 45770316 28
SaU7            7 - CGCGGCCGGCGAACGGGGCTCG 45770288 45770309 AAGGGT 45770282 45770287 9
SaU8            8 - GGCTCGAAGGGTCCTTGTAGCC 45770272 45770293 GGGAAT 45770266 45770271 2
SaD1*            9 - ctgctgctgctgctgctgctgG 45770204 45770225 GGGGAT 45770198 45770203 1123
SaD2            10 - TCGGCCAGGCTGAGGCCCTGAC 45770157 45770178 GTGGAT 45770151 45770156 6
SaD3            11 + CAACGATAGGTGGGGGTGCGTG 45770074 45770095 GAGGAT 45770096 45770101 1
SaD4            12 + ACTTTGCGAACCAACGATAGGT 45770063 45770084 GGGGGT 45770085 45770090 2
SaD5            13 + GGGTTTGGCAAAAGCAAATTTC 45769972 45769993 CCGAGT 45769994 45769999 5
SaD6            14 - CTTTTGCCAAACCCGCTTTTTC 45769964 45769985 GGGGAT 45769958 45769963 5
SaD7            15 + GGGGCGCGGGATCCCCGAAAAA 45769948 45769969 GCGGGT 45769970 45769975 0
SaD8            16 + AGCGCAAGTGAGGAGGGGGGCG 45769932 45769953 CGGGAT 45769954 45769959 10
SaD9            17 - CGGCTCCGCCCGCTTCGGCGGT 45769893 45769914 TTGGAT 45769887 45769892 4
SaD10           18 + TTGGGGGTCCTGTAGCCTGTCA 45769838 45769859 GCGAGT 45769860 45769865 4
SaD11           19 + CAAAACGTGGATTGGGGTTGTT 45769818 45769839 GGGGGT 45769840 45769845 2
SaD12          20 + TCAGTGCATCCAAAACGTGGAT 45769808 45769829 TGGGGT 45769830 45769835 1
SaD13           21 - CCCAACAACCCCAATCCACGTT 45769821 45769842 TTGGAT 45769815 45769820 7
SaD14           22 + GGGGTCTCAGTGCATCCAAAAC 45769802 45769823 GTGGAT 45769824 45769829 0
SaD15           23 + GACAATAAATACCGAGGAATGT 45769779 45769800 CGGGGT 45769801 45769806 4
SaD16           24 + TGGGGACAGACAATAAATACCG 45769771 45769792 AGGAAT 45769793 45769798 8
SaD17           25 + TTTATTCGCGAGGGTCGGGGGT 45769737 45769758 GGGGGT 45769759 45769764 2
SaD18           26 + GGGCCTTTTATTCGCGAGGGTC 45769731 45769752 GGGGGT 45769753 45769758 13
SaD19           27 - AGGACCCCCACCCCCGACCCTC 45769746 45769767 GCGAAT 45769740 45769745 2
SaD20           28 + AGATGGAGGGCCTTTTATTCGC 45769724 45769745 GAGGGT 45769746 45769751 3
*  SaD1由於在DM1患者原代肌母細胞中存在大量預測的脫靶位點而不予以評價。 表 1B ： 人類 DMPK 基因之 3' UTR 區域中具有典型 NNGRRT PAM 序列的例示性 SaCas9 sgRNA
SEQ ID NO 股 嚮導序列
1 + GCCCCGGAGTCGAAGACAGTTC
101 + CCCCGGAGTCGAAGACAGTTC
102 + CCCGGAGTCGAAGACAGTTC
2 + ACTCAGTCTTCCAACGGGGCCC
103 + CTCAGTCTTCCAACGGGGCCC
104 + TCAGTCTTCCAACGGGGCCC
3 - ACTCCGGGGCCCCGTTGGAAGA
105 - ACTCCGGGGCCCCGTTGGAAG
106 - ACTCCGGGGCCCCGTTGGAA
4 - CCAGTTCACAACCGCTCCGAGC
107 - CCAGTTCACAACCGCTCCGAG
108 - CCAGTTCACAACCGCTCCGA
5 + CCCCGGCCGCTAGGGGGCGGGC
109 + CCCGGCCGCTAGGGGGCGGGC
110 + CCGGCCGCTAGGGGGCGGGC
6 - CTAGCGGCCGGGGAGGGAGGGG
111 - CTAGCGGCCGGGGAGGGAGGG
112 - CTAGCGGCCGGGGAGGGAGG
7 - CGCGGCCGGCGAACGGGGCTCG
113 - CGCGGCCGGCGAACGGGGCTC
114 - CGCGGCCGGCGAACGGGGCT
8 - GGCTCGAAGGGTCCTTGTAGCC
115 - GGCTCGAAGGGTCCTTGTAGC
116 - GGCTCGAAGGGTCCTTGTAG
10 - TCGGCCAGGCTGAGGCCCTGAC
117 - TCGGCCAGGCTGAGGCCCTGA
118 - TCGGCCAGGCTGAGGCCCTG
11 + CAACGATAGGTGGGGGTGCGTG
119 + AACGATAGGTGGGGGTGCGTG
120 + ACGATAGGTGGGGGTGCGTG
12 + ACTTTGCGAACCAACGATAGGT
121 + CTTTGCGAACCAACGATAGGT
122 + TTTGCGAACCAACGATAGGT
13 + GGGTTTGGCAAAAGCAAATTTC
123 + GGTTTGGCAAAAGCAAATTTC
124 + GTTTGGCAAAAGCAAATTTC
14 - CTTTTGCCAAACCCGCTTTTTC
125 - CTTTTGCCAAACCCGCTTTTT
126 - CTTTTGCCAAACCCGCTTTT
15 + GGGGCGCGGGATCCCCGAAAAA
127 + GGGCGCGGGATCCCCGAAAAA
128 + GGCGCGGGATCCCCGAAAAA
16 + AGCGCAAGTGAGGAGGGGGGCG
129 + GCGCAAGTGAGGAGGGGGGCG
130 + CGCAAGTGAGGAGGGGGGCG
17 - CGGCTCCGCCCGCTTCGGCGGT
131 - CGGCTCCGCCCGCTTCGGCGG
132 - CGGCTCCGCCCGCTTCGGCG
18 + TTGGGGGTCCTGTAGCCTGTCA
133 + TGGGGGTCCTGTAGCCTGTCA
134 + GGGGGTCCTGTAGCCTGTCA
19 + CAAAACGTGGATTGGGGTTGTT
135 + AAAACGTGGATTGGGGTTGTT
136 + AAACGTGGATTGGGGTTGTT
20 + TCAGTGCATCCAAAACGTGGAT
137 + CAGTGCATCCAAAACGTGGAT
138 + AGTGCATCCAAAACGTGGAT
21 - CCCAACAACCCCAATCCACGTT
139 - CCCAACAACCCCAATCCACGT
140 - CCCAACAACCCCAATCCACG
22 + GGGGTCTCAGTGCATCCAAAAC
141 + GGGTCTCAGTGCATCCAAAAC
142 + GGTCTCAGTGCATCCAAAAC
23 + GACAATAAATACCGAGGAATGT
143 + ACAATAAATACCGAGGAATGT
144 + CAATAAATACCGAGGAATGT
24 + TGGGGACAGACAATAAATACCG
145 + GGGGACAGACAATAAATACCG
146 + GGGACAGACAATAAATACCG
25 + TTTATTCGCGAGGGTCGGGGGT
147 + TTATTCGCGAGGGTCGGGGGT
148 + TATTCGCGAGGGTCGGGGGT
26 + GGGCCTTTTATTCGCGAGGGTC
149 + GGCCTTTTATTCGCGAGGGTC
150 + GCCTTTTATTCGCGAGGGTC
27 - AGGACCCCCACCCCCGACCCTC
151 - AGGACCCCCACCCCCGACCCT
152 - AGGACCCCCACCCCCGACCC
28 + AGATGGAGGGCCTTTTATTCGC
153 + GATGGAGGGCCTTTTATTCGC
154 + ATGGAGGGCCTTTTATTCGC
2.     電腦模擬脫靶評估
基於與hg38人類參考基因體的序列相似性，用電腦預測各sgRNA的脫靶位點，具體而言，鑑別出具有PAM序列且相對於原間隔子序列具有至多3個錯配或至多2個錯配及1個DNA/RNA隆突的任何位點。 3.     基因體DNA提取、PCR擴增及TapeStation
使用Kingfisher Flex純化系統(Thermal Fisher)，依循製造商說明書，在96孔格式中分離出DM1肌母細胞的基因體DNA。使用GoTaq綠色預混液(Promega)及側接3' UTR區域的PCR引子來擴增DMPK 3' UTR區域。正向引子序列為CGCTAGGAAGCAGCCAATGA (SEQ ID NO: 723)，且反向引子序列為TAGCTCCTCCCAGACCTTCG (SEQ ID NO: 724)。利用以下循環參數執行擴增：1個循環：95℃下歷時2分鐘；40個循環：95℃下歷時30秒、63℃下歷時30秒及72℃下歷時90秒；1個循環：72℃下歷時5分鐘。僅野生型對偶基因藉由PCR反應擴增。在具有高靈敏度D5000 ScreenTape的TapeStation系統(Agilent Technologies)上分析PCR產物。 4.     桑格定序(Sanger sequencing)及ICE分析
將PCR產物送至GeneWiz用於純化及桑格定序。使用定序引子UTRsF3 (AATGACGAGTTCGGACGG)(SEQ ID NO: 725)對上游sgRNA進行定序，且使用反向PCR引子(TAGCTCCTCCCAGACCTTCG)(SEQ ID NO: 724)對下游sgRNA進行定序。利用ICE分析算法(Synthego)以及獲自桑格定序的層析圖檔案來估算插入缺失值。 5.     原代肌母細胞培養
自Cook MyoSite獲得原代健康肌母細胞(P01431-18F)及DM1患者肌母細胞(03001-32F)。肌母細胞於肌母細胞生長培養基中培養，該生長培養基由肌強直性基礎培養基(Cook MyoSite, MB-2222)及肌強直性生長增補劑(Cook MyoSite, MS-3333)組成。核轉染之前的三天，使用EasySep人類CD56正向選擇套組II (StemCell Tech, 17855)，依循製造商說明書進一步純化人類原代肌母細胞，且接著在肌母細胞生長培養基中維持直至核轉染。 6.     RNP製備
使用重組SaCas9蛋白(Aldevron)與經化學修飾之sgRNA (Synthego)，以1:3比率(蛋白質:sgRNA)組裝RNP。對於單切篩選而言，在P5原代細胞核轉染溶液(Lonza)中，用30 pmol SaCas9及90 pmol sgRNA組裝RNP複合物。在室溫下培育20分鐘之後，將10 µL RNP複合物與再懸浮於10 µL P5核轉染溶液中的二十萬個原代肌母細胞混合。對於雙切篩選而言，在5 µL P5核轉染溶液中，用20 pmol SaCas9蛋白及60 pmol sgRNA首先組裝個別sgRNA的RNP複合物。在室溫下培育20分鐘之後，將兩種RNP複合物(一種含有上游sgRNA且一種含有下游sgRNA)以1:1比率混合且接著進一步與再懸浮於10 µL P5核轉染溶液中的二十萬個原代肌母細胞混合。 7.     RNP核轉染至原代DM1肌母細胞中
使用核轉染儀96孔穿梭系統(Lonza)，利用核轉染程式CM138將SaCa9/sgRNA RNP遞送至DM1患者原代肌母細胞中。核轉染之後，將來自核轉染穿梭系統各孔的肌母細胞分離至經基質膠塗佈之96孔細胞培養盤(Greiner, 655090)的六個孔中。前三個孔用DMSO處理48小時，隨後更換成新鮮的肌母細胞生長培養基，且其他三個孔用3 µM DNA-PKi化合物6處理48小時，隨後更換成新鮮的肌母細胞生長培養基。核轉染後的第72小時，使用Kingfisher Flex純化系統(Thermal Fisher)收集兩個孔的經DMSO處理之肌母細胞及兩個孔的經DNA-PKi處理之各肌母細胞(各經核轉染)用於基因體DNA提取，而一個孔的經DMSO處理之肌母細胞及一個孔的經DNA-PKi處理之肌母細胞藉由FISH染色進行RNA病灶染色。 8.     ddPCR
使用線上引子設計軟體Primer3Plus (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)設計ddPCR的引子及探針。使用兩組目標引子/探針偵測CTG重複序列切除，且使用參考引子/探針組擴增位於人類 DMPK基因之外顯子1中的區域且其充當目標組的參考對照。ddPCR引子及探針序列列於 表 2中。24 µL ddPCR反應物由以下組成：12 µL探針超混合液(無dUTP)(Bio-Rad Laboratories)、1 µL參考引子混合物(21.6 µM)、1 µL參考探針(6 µM)、1 µL目標引子混合物(21.6 µM)、1 µL目標探針(6 µM)及8 µL樣品基因體DNA。使用探針油，用QX200微滴產生器(Bio-Rad Laboratories)產生微滴。將微滴轉移至96孔PCR盤中，密封且在C1000深孔熱循環儀(Bio-Rad Laboratories)中依據以下循環方案循環：1個循環：95℃下歷時10分鐘；40個循環：94℃下歷時30秒及58℃下歷時1分鐘；1個循環：98℃下歷時10分鐘(用於酶不活化)。接著轉移循環的培養盤且使用Bio-Rad QX200微滴讀取器(Bio-Rad Laboratories)在FAM及HEX通道中讀取。藉由Bio-Rad QuantaSoft Pro軟體執行ddPCR分析。 表 2 ： 信號丟失 ddPCR 分析用的引子及探針序列
ddPCR 組 寡核苷酸類型 名稱 序列 (5’ 至 3’)
目標_下游 正向引子 UTRF1 GGGGATCACAGACCATTTCT
反向引子 UTRR14 TGGAGGATGGAACACGGAC
探針 UTRP2-FAM TTCTTTCGGCCAGGCTGAGGCCCT
目標_上游 正向引子 UpExcisionF CTAGCGGCCGGGGAG
反向引子 UpExcisionR AGCAGCATTCCCGGCTA
探針 UpExcisionP-FAM CGAACGGGGCTCGAAGGGTCCTTG
參考 正向引子 DMPKF8 GGATATGTGACCATGCTACC
反向引子 DMPKR7 GGGTTGTATCCAGTACCTCT
探針 DMPKP6-HEX TGTCCTGTTCCTTCCCCCAGCCCCA
9.     RNA病灶的FISH染色
原代肌母細胞用4%多聚甲醛(PFA)固定15分鐘且在室溫下用1x PBS洗滌五次，每次10分鐘。染色之前，細胞在室溫下用含有0.5% triton X-100的1x PBS滲透5分鐘，且接著在室溫下用30%甲醯胺及2x生理鹽水-檸檬酸鈉(SSC)混合物洗滌10分鐘。細胞接著在80℃下用1 ng/µL於30%甲醯胺中稀釋的Cy3-PNA(CAG) 5探針(PNA Bio, F5001)、2x SSC、2 µg/mL BSA、66 µg/mL酵母tRNA及2 mM釩醯基複合物染色15分鐘。探針染色之後，細胞接著在42℃下用30%甲醯胺及2x SSC混合物洗滌30分鐘，接著在37℃下用30%甲醯胺及2x SSC混合物洗滌30分鐘，且接著在室溫下用1x SSC溶液洗滌10分鐘，且最後在室溫下用1x PBS洗滌10分鐘。細胞接著在4℃用1%牛血清白蛋白(BSA)中稀釋的抗MBNL1抗體(Santa Cruz, 3A4)染色隔夜，且在室溫下用1x PBS洗滌兩次，每次10分鐘。細胞接著與1% BSA中稀釋的二級抗體山羊抗兔Alexa 647 (Thermo Fisher, A32728)一起在室溫下培育1小時，且在室溫下用1x PBS洗滌兩次，每次10分鐘。接著，細胞用0.1 mg/ml Hoechst溶液(Thermo Fisher, H3569)染色5分鐘，且用1x PBS洗滌一次歷時5分鐘。抽出PBS且向各孔中添加新鮮的100 µl新鮮PBS。使用ImageXpress微共焦高內涵成像系統(Molecular Devices)完成影像的高通量擷取。使用定製的MetaXpress程式分析模組(Molecular Devices)完成RNA病灶定量。 B.   結果
選擇二十八種SaCas9 sgRNA及典型的NNGRRT原間隔子相鄰模體(PAM)序列用於編輯人類DMPK基因中的CTG重複序列擴增( 表 1A及 圖 2)。為了避免干擾DMPK編碼序列及mRNA成熟，所有選定的SaCas9 sgRNA均位於DMPK基因的3' UTR內、介於終止密碼子與最後一個外顯子之末端之間。在此等28種sgRNA中，8種sgRNA (SaU1-SaU8)(SEQ ID NO: 1-8)定位於CTG重複序列擴增的上游(在終止密碼子與CTG重複序列擴增之間)；20種sgRNA (SaD1-SaD20)(SEQ ID NO: 9-28)定位於CTG重複序列擴增的下游(在CTG重複序列擴增與DMPK之最後一個外顯子的末端之間)。一種sgRNA (SaD1)(SEQ ID NO: 9)由於其存在大量預測的脫靶位點( 表 1)而自進一步評價中排除。
為了評估插入缺失編輯及CTG重複序列切除的效率，執行單切篩選，其中將個別SaCas9 sgRNA與重組SaCas9蛋白一起組裝成核糖核蛋白(RNP)且經由Amaxa 4D核轉染儀遞送至DM1患者原代肌母細胞中。核轉染的肌母細胞用DMSO (媒劑)或3 µM DNA依賴型蛋白激酶抑制劑(DNA-PKi)化合物6處理48小時。核轉染後72小時，藉由螢光原位雜交(FISH)對肌母細胞進行基因體DNA分離或RNA病灶染色。
藉由PCR自所提取之基因體DNA擴增涵蓋CTG重複序列擴增及sgRNA目標區域的1174 bp序列。接著，使用桑格定序及ICE分析來定量各sgRNA所誘導之插入缺失的頻率。在所評價的27種sgRNA中，21種sgRNA (6種上游sgRNA及15種下游sgRNA)誘導大於10%的插入缺失且選用於進一步的雙切篩選( 圖 3及 表 3)(SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27、28)。應注意，SaU1 (SEQ ID NO: 1)進行的單切誘導最有效的較大插入缺失，從而引起CTG重複序列切除( 圖 4A、 圖 4B)。DNA-PKi處理進一步增強SaU1 (SEQ ID NO: 1)所誘導的CTG重複序列切除效率( 圖 4C)。
RNA病灶的FISH染色展示個別sgRNA使DM1患者肌母細胞中的CUG病灶(由DMPK mRNA中的CUG重複序列擴增形成)減少( 圖 5及 表 3)。在所評價的27種sgRNA中，8種sgRNA使經媒劑處理之超過10%肌母細胞核中的CUG RNA病灶完全消除(SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12、20)，且7種sgRNA使經DNA-PKi處理之超過20%肌母細胞核中的CUG RNA病灶完全消除(SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、20)，其中SaU1 (SEQ ID NO: 1) sgRNA聯合DNA-PKi處理使45.59%肌母細胞核中的CUG RNA病灶消除。RNA病灶分佈分析表明，SaU1 (SEQ ID NO: 1)不僅排除大部分肌母細胞核中的CUG病灶，而且使含有超過3個CUG病灶之肌母細胞核的頻率降低( 圖 6A 、圖 6B)。 表 3 ： 27 種所選 SaCas9 sgRNA 在 DM1 患者原代肌母細胞中誘導的插入缺失編輯效率 ( 藉由對 經媒劑處理之 DM1 肌母細胞進行的 ICE 分析 ) 及 RNA 病灶減少效率 ( 藉由 FISH 分析 )
SaCas9 sgRNA 名稱 SEQ ID NO 插入缺失分數 _ 平均值 插入缺失分數 __SEM 不含 CUG 病灶之細胞核 %( 媒劑 ) 不含 CUG 病灶之細胞核 %(DNA-PKi)
SaU1            1 55.50 2.50 19.90 45.59
SaU2            2 57.00 16.50 13.46 27.06
SaU3            3 60.25 16.25 17.21 30.03
SaU4            4 51.75 1.75 18.87 28.65
SaU5            5 1.75 0.75 1.81 2.63
SaU6            6 6.75 0.25 2.15 14.53
SaU7            7 70.75 0.25 11.62 34.12
SaU8            8 51.50 3.00 16.60 30.17
SaD2            10 41.25 10.75 8.50 9.58
SaD3            11 50.25 11.25 5.18 11.36
SaD4            12 37.00 1.00 10.93 12.28
SaD5            13 62.25 4.25 6.87 9.74
SaD6            14 28.75 1.75 3.55 9.20
SaD7            15 40.75 1.25 4.59 9.80
SaD8            16 5.25 1.75 1.70 4.10
SaD9            17 2.75 1.75 1.73 15.45
SaD10           18 51.75 4.75 6.97 11.26
SaD11           19 35.50 5.50 4.48 8.87
SaD12          20 55.25 1.75 11.04 23.40
SaD13           21 16.50 0.00 4.47 9.12
SaD14           22 7.50 3.50 2.08 7.99
SaD15           23 74.00 7.50 6.73 11.08
SaD16           24 9.25 0.25 4.06 9.84
SaD17           25 48.50 1.50 5.79 9.50
SaD18           26 17.25 5.75 3.11 12.89
SaD19           27 37.25 3.75 5.14 9.27
SaD20           28 38.50 1.00 6.59 14.65
接著，執行雙切篩選以評估成對sgRNA誘導之CTG重複序列切除及RNA病灶減少的效率。將一種上游sgRNA及一種下游sgRNA形成的90個SaCas9 sgRNA對與重組SaCas9蛋白組裝成RNP複合物且核轉染至DM1患者原代肌母細胞中。核轉染的肌母細胞用DMSO (媒劑)或3 µM化合物6 (DNA-PKi)處理48小時。核轉染後第72小時，對肌母細胞進行基因體DNA分離或RNA病灶染色。
利用一種上游信號丟失型及一種下游信號丟失型微滴式數位PCR (ddPCR)分析測定CTG重複序列切除效率。在此等信號丟失型ddPCR分析中，CTG重複序列擴增切除後，ddPCR信號將消除。利用兩次ddPCR分析所得的平均切除功效將sgRNA對排序( 圖 7及 表 4)。應注意由於此等個別sgRNA誘導的插入缺失會干擾ddPCR引子及/或探針對PCR模板的結合，因此ddPCR分析不能夠量測兩個sgRNA對(SaU7 + SaD2 (SEQ ID NO: 7與10)及SaU8 + SaD2 (SEQ ID NO: 8與10))的CTG重複序列切除效率。在其餘88個sgRNA對中，10個sgRNA對在媒劑處理下誘導大於50%的CTG重複序列切除效率，其中SaU7 + SaD4對(SEQ ID NO: 7與12)誘導最高的CTG重複序列切除效率(57.96%)。在對DM1肌母細胞進行DNA-PKi處理的情況下，76個sgRNA對誘導大於50%的CTG重複序列切除效率，其中SaU7 + SaD4對(SEQ ID NO: 7與12)誘導最高的CTG重複序列切除效率(73.99%)( 表 4)。總體而言，相較於對彼等更高效sgRNA對之影響，DNA-PKi處理就CTG重複序列切除效率而言，對低效sgRNA對具有更高影響( 圖 7)。
RNA病灶之FISH染色展示媒劑處理與DNA-PKi處理均使DM1患者原代肌母細胞中的CUG病灶穩定減少( 圖 8)。在對DM1肌母細胞進行媒劑處理的情況下，45個sgRNA對使超過60%肌母細胞核中的CUG RNA病灶消除，其中SaU4 + SaD4對(SEQ ID NO: 4與12)誘導最高百分比的不含CUG病灶之肌母細胞核(86.81%)。在對DM1肌母細胞進行DNA-PKi處理的情況下，所有90個sgRNA對使超過60%肌母細胞核中的CUG RNA病灶消除，其中SaU7 + SaD15對(SEQ ID NO: 7與23)誘導最高百分比的不含CUG病灶之肌母細胞核(89.69%)。類似於CTG重複序列切除，相較於對彼等更高效sgRNA對之影響，DNA-PKi處理就RNA病灶減少效率而言，對低效sgRNA對具有更高影響。RNA病灶分佈分析表明，SaU4 + SaD4對(SEQ ID NO: 4與12)使經媒劑或DNA-PKi處理之大多數肌母細胞中的CUG病灶消除，其中少數細胞展示1個剩餘病灶( 圖 9A 及圖 9B)。 表 4 ： 90 個 SaCas9 sgRNA 對在 DM1 患者原代肌母細胞中誘導的 CTG 重複序列切除效率 ( 藉由 ddPCR) 及 RNA 病灶減少效率 ( 藉由 FISH 分析 )
SaCas9 sgRNA 對 SEQ ID NO 根據 ddPCR 的 CTG 重複序列切除效率 % ( 媒劑 ) 根據 ddPCR 的 CTG 重複序列切除效率 % (DNA-PKi) 不含 CUG 病灶之細胞核 % ( 媒劑 ) 不含 CUG 病灶之細胞核 % (DNA-PKi)
SaU4 + SaD4 SEQ ID NO: 4與12 54.65 66.15 86.81 88.43
SaU2 + SaD4 SEQ ID NO: 2與12 41.89 59.76 85.13 88.39
SaU3 + SaD4 SEQ ID NO: 3與12 47.22 64.28 83.67 87.42
SaU4 + SaD12 SEQ ID NO: 4與20 42.13 59.06 82.10 87.22
SaU4 + SaD10 SEQ ID NO: 4與18 49.44 67.61 82.01 84.75
SaU2 + SaD2 SEQ ID NO: 2與10 52.26 56.39 81.76 83.29
SaU4 + SaD20 SEQ ID NO: 4與28 52.49 59.19 81.47 83.56
SaU1 + SaD4 SEQ ID NO: 1與12 41.92 61.00 81.45 87.86
SaU8 + SaD4 SEQ ID NO: 8與12 55.89 69.71 81.32 88.35
SaU4 + SaD5 SEQ ID NO: 4與13 52.75 63.28 81.08 85.34
SaU4 + SaD15 SEQ ID NO: 4與23 39.70 58.99 79.84 85.73
SaU3 + SaD2 SEQ ID NO: 3與10 50.85 54.49 77.08 82.73
SaU8 + SaD12 SEQ ID NO: 8與20 36.64 55.46 76.92 85.37
SaU1 + SaD2 SEQ ID NO: 1與10 47.82 54.31 76.74 84.27
SaU2 + SaD15 SEQ ID NO: 2與23 41.70 60.64 76.57 85.85
SaU2 + SaD12 SEQ ID NO: 2與20 36.47 58.68 76.56 83.77
SaU8 + SaD15 SEQ ID NO: 8與23 39.47 57.24 76.50 86.21
SaU8 + SaD2 SEQ ID NO: 8與10 NA NA 76.39 82.91
SaU1 + SaD10 SEQ ID NO: 1與18 37.72 61.44 75.91 84.12
SaU2 + SaD5 SEQ ID NO: 2與13 38.64 59.19 75.82 83.71
SaU2 + SaD10 SEQ ID NO: 2與18 38.02 66.52 75.56 82.97
SaU3 + SaD10 SEQ ID NO: 3與18 44.56 69.50 75.19 86.88
SaU2 + SaD20 SEQ ID NO: 2與28 36.35 61.08 74.86 82.08
SaU7 + SaD4 SEQ ID NO: 7與12 57.96 73.99 74.84 87.34
SaU8 +SaD10 SEQ ID NO: 8與18 48.45 69.07 74.46 82.92
SaU3 + SaD12 SEQ ID NO: 3與20 38.05 59.96 74.46 83.21
SaU3 + SaD15 SEQ ID NO: 3與23 37.42 65.28 74.00 86.64
SaU3 + SaD5 SEQ ID NO: 2與13 43.61 60.74 73.56 84.63
SaU1 + SaD15 SEQ ID NO: 1與23 37.54 64.96 72.80 85.70
SaU8 + SaD5 SEQ ID NO: 8與13 49.47 58.77 72.77 84.28
SaU3 + SaD20 SEQ ID NO: 3與28 40.12 64.44 72.56 83.99
SaU8 +SaD20 SEQ ID NO: 8與28 39.72 62.59 71.20 81.21
SaU7 + SaD2 SEQ ID NO: 7與10 NA NA 70.29 81.28
SaU1 + SaD5 SEQ ID NO: 1與13 30.65 53.67 70.23 82.90
SaU1 + SaD12 SEQ ID NO: 1與20 37.77 63.43 69.78 84.94
SaU1 + SaD20 SEQ ID NO: 1與28 39.94 61.37 69.61 83.73
SaU4 + SaD19 SEQ ID NO: 4與27 36.41 50.21 67.92 80.80
SaU7 + SaD12 SEQ ID NO: 7與20 39.71 62.84 66.41 86.06
SaU7 + SaD15 SEQ ID NO: 7與23 36.65 66.66 64.62 89.69
SaU7 + SaD5 SEQ ID NO: 7與13 50.76 69.71 64.24 82.27
SaU7 +SaD20 SEQ ID NO: 7與28 39.72 67.93 63.33 83.24
SaU2 + SaD19 SEQ ID NO: 2與27 49.08 56.62 62.27 80.94
SaU8 + SaD19 SEQ ID NO: 8與27 28.95 46.04 61.41 83.45
SaU4 + SaD3 SEQ ID NO: 4與11 44.46 56.38 60.98 80.39
SaU4 + SaD17 SEQ ID NO: 4與25 35.01 55.51 60.96 79.31
SaU4 + SaD20 SEQ ID NO: 4與28 53.12 65.25 59.76 84.77
SaU4 + SaD11 SEQ ID NO: 4與19 36.98 54.55 58.71 78.29
SaU4 + SaD7 SEQ ID NO: 4與15 39.17 55.59 58.50 78.79
SaU8 +SaD3 SEQ ID NO: 8與11 48.19 59.28 57.67 82.41
SaU3 + SaD19 SEQ ID NO: 3與27 32.67 53.36 57.16 81.67
SaU2 + SaD17 SEQ ID NO: 2與25 31.11 52.34 55.20 78.68
SaU2 + SaD3 SEQ ID NO: 2與11 36.75 56.04 55.11 80.14
SaU7 +SaD10 SEQ ID NO: 7與18 54.86 70.47 55.03 83.49
SaU3 + SaD17 SEQ ID NO: 3與25 31.18 56.80 53.10 77.22
SaU8 + SaD7 SEQ ID NO: 8與15 38.19 53.42 52.92 82.90
SaU8 + SaD17 SEQ ID NO: 8與25 30.50 49.09 52.34 79.35
SaU3 + SaD3 SEQ ID NO: 3與11 36.25 57.46 51.28 78.72
SaU3 + SaD11 SEQ ID NO: 3與19 32.84 58.33 50.28 73.87
SaU1 + SaD7 SEQ ID NO: 1與15 34.21 56.69 49.51 80.16
SaU3 + SaD7 SEQ ID NO: 3與15 35.98 58.50 49.49 76.54
SaU1 + SaD19 SEQ ID NO: 1與27 32.74 52.62 49.44 76.49
SaU2 + SaD7 SEQ ID NO: 2與15 29.62 52.12 49.05 76.74
SaU2 + SaD11 SEQ ID NO: 2與19 26.90 52.97 48.38 73.23
SaU1 + SaD3 SEQ ID NO: 1與11 33.47 52.18 47.32 81.32
SaU1 + SaD17 SEQ ID NO: 1與25 26.29 53.66 45.51 75.32
SaU8 +SaD11 SEQ ID NO: 8與19 31.52 47.57 44.65 70.97
SaU4 + SaD13 SEQ ID NO: 4與21 32.38 54.46 43.83 73.71
SaU8 +SaD13 SEQ ID NO: 8與21 29.46 51.64 43.66 77.05
SaU7 + SaD19 SEQ ID NO: 7與27 28.45 56.22 42.75 81.47
SaU7 + SaD7 SEQ ID NO: 7與15 32.55 64.88 41.68 85.03
SaU1 + SaD11 SEQ ID NO: 1與19 26.52 52.38 41.32 74.03
SaU2 + SaD13 SEQ ID NO: 2與21 30.92 51.47 39.86 75.83
SaU7 +SaD3 SEQ ID NO: 7與11 41.26 61.82 39.24 80.45
SaU3 + SaD13 SEQ ID NO: 3與21 30.34 57.82 38.07 74.02
SaU4 + SaD6 SEQ ID NO: 4與14 28.23 48.99 37.76 67.36
SaU7 +SaD11 SEQ ID NO: 7與19 25.10 51.90 36.96 73.38
SaU4 + SaD18 SEQ ID NO: 4與26 26.25 45.55 36.81 69.76
SaU8 + SaD18 SEQ ID NO: 8與26 18.17 44.51 36.66 70.76
SaU7 + SaD17 SEQ ID NO: 7與25 27.41 55.97 36.12 75.53
SaU1 + SaD13 SEQ ID NO: 1與21 25.67 54.59 35.75 74.44
SaU3 + SaD18 SEQ ID NO: 3與26 21.51 50.13 33.15 71.73
SaU2 + SaD18 SEQ ID NO: 2與26 19.28 48.16 32.87 69.93
SaU8 + SaD6 SEQ ID NO: 8與14 23.57 40.19 32.43 65.28
SaU1 + SaD6 SEQ ID NO: 1與14 32.51 49.69 31.66 70.98
SaU2 + SaD6 SEQ ID NO: 2與14 24.88 45.77 31.53 65.23
SaU3 + SaD6 SEQ ID NO: 3與14 24.10 50.32 31.37 64.84
SaU1 + SaD18 SEQ ID NO: 1與26 19.40 47.64 29.85 69.94
SaU7 +SaD13 SEQ ID NO: 7與21 25.62 55.97 28.69 78.52
SaU7 + SaD6 SEQ ID NO: 7與14 22.54 55.71 24.89 67.73
SaU7 + SaD18 SEQ ID NO: 7與26 19.71 48.08 23.22 73.07
 DM383模擬對照組    0.53 0.49 1.69 1.71
健康對照組    NA NA 97.94 97.82
實例2：AAV載體組態
一系列「一體式」載體組態如 圖 10A中所描繪來設計且如 圖 10B中所描繪來合成。構築四種代表性載體設計( 圖 10A)。
設計1 (「Cas9位於中間，直列」就正股而言以5'至3'次序包括：以與SaCas9的啟動子相同方向表現編碼第一sgRNA之核酸用的啟動子、第一sgRNA嚮導序列及支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、以與SaCas9的啟動子相同方向表現編碼第二sgRNA之核酸用的啟動子，以及第二sgRNA嚮導序列及支架序列。設計1組態的特定變型展示於 圖 10B中，包括例如AlO-AA1、AlO-AAV2及AIO-AAV3。
設計2 (「Cas9位於中間，發散」就正股而言以5'至3'次序包括：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之啟動子的反向互補序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、以SaCas9的啟動子相同的方向表現編碼第二sgRNA之核酸用的啟動子，以及第二sgRNA嚮導序列及支架序列。設計2組態的變型展示於 圖 10B中，包括例如AlO-AAV4、AlO-AAV5、AIO-AAV6及AlO-AAV17。
設計3 (「Cas9位於右側」就正股而言自5'至3'依次包括：以與SaCas9的啟動子相同方向表現編碼第一sgRNA之核酸用的啟動子、第一sgRNA嚮導序列及支架序列、以與SaCas9的啟動子相同方向表現編碼第二sgRNA之核酸用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。設計3組態的變型展示於 圖 10B中，包括例如AlO-AAV7、AlO-AAV8及AlO-AAV9。
設計4 (「Cas9位於左側」就正股而言自5'至3'依次包括：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、以與SaCas9的啟動子相同方向表現編碼第一sgRNA之核酸用的啟動子、第一sgRNA嚮導序列及支架序列、以與SaCas9的啟動子相同方向表現編碼第二sgRNA之核酸用的啟動子，以及第二sgRNA嚮導序列及支架序列。設計4組態的變型展示於 圖 10B中，包括例如AlO-AAV10、AlO-AAV11及AIO-AAV12。
載體組態之各組分的序列展示於 表 5中。 表 5 ： AAV 載體 組分的序列
組分 SEQ ID NO 尺寸(bp) 序列
hU6c 705 249 GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC
7SK2 706 243 CTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC
H1m 707 100 AATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTCTTTCCC
SaU7 sgRNA 7 22 CGCGGCCGGCGAACGGGGCTCG
SaD10 sgRNA 18 22 TTGGGGGTCCTGTAGCCTGTCA
SaCas9支架V2 911 87 GTTTAAGTACTCTGTGCTGGAAACAGCACAGAATCTACTTAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGAT
SV40 NLS (N端) 915 21 CCAAAGAAGAAGCGGAAGGTC (SEQ ID NO: 915) (胺基酸序列為：PKKKRKV; SEQ ID NO: 916)
核質蛋白NLS (C端) 917 48 AAGCGACCTGCCGCCACAAAGAAGGCTGGACAGGCTAAGAAGAAGAAA (SEQ ID NO: 917) (胺基酸序列為：KRPAATKKAGQAKKKK; SEQ ID NO: 918)
聚(A)序列 919 49 AATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTG
5’ ITR 709 143 GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
3’ ITR 710 137 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA
測定代表性載體組態之尺寸。AIO-AAV7、AIO-AAV8、AIO-AA10、AIO-AAV11及AIO-AAV17之尺寸分別為4771、4765、4771、4765及4765個鹼基對(bp)( 圖 11)。
SaCas9支架之變異體的設計如 下表 6中所示。
表 6 ： SaCas9 支架變異體
標識 SEQ ID NO 序列 尺寸
Sa支架V1 910 GTTT T AGTACTCTGGAAACAGAATCTAC T AAAA CAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTT GTTGGCGAGAT 77
Sa支架V2 911 GTTT A AGTACTCTG TGCTG GAAA CAGCA CAGAA TCTACT T AAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATC TCGTCAACTTGTTGGCGAGAT 87
Sa支架V3 912 GTTT A AGTACTCTGGAAACAGAATCTACT T AAA CAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTT GTTGGCGAGAT 77
* 加粗、加下劃線的核苷酸展示三種變異體的變化；三種變異體的所有其他序列一致
為了進一步減少AAV載體尺寸，藉由縮短核小體結合序列內的序列來設計hU6c啟動子( 表 7；SEQ ID NO: 901-904)及7SKs啟動子( 表 8；SEQ ID NO: 906-909)的變異體。 圖 12及 圖 13分別展示hU6c及7SK啟動子之示意圖。
表 7 ： hU6c 啟動子變異體
標識 SEQ ID NO 序列 尺寸
hU6c 705 GAGGGCCTA TTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCAT ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATG CTTACCGTAACTTGAAAGTA TTTCGATTTCTTGGC TTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC 249
hU6d30 901 GAGGGCCTA TTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCAT ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATG CTTACCGTAACTTGAAAGTA TTTCGATTTCTTGGC TTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC 219
hU6d60 902 GAGGGCCTA TTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCAT ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATG CTTACCGTAACTTGAAAGTA TTTCGATTTCTTGGC TTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC 189
hU6d90 903 GAGGGCCTA TTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCAT ATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATG CTTACCGTAACTTGAAAGTA TTTCGATTTCTTGGC TTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC 159
hU6d120 904 GAGGGCCTA TTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCAT ATACGATACAAGGCGGACTATCATATG CTTACCGTAACTTGAAAGTA TTTCGATTTCTTGGC TTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC 129
* 粗體表示啟動子之SPH區域中的核苷酸；加框核苷酸表示啟動子之OCT區域中的核苷酸；加下劃線的核苷酸表示啟動子之核小體結合序列中的核苷酸；加粗斜體表示啟動子之PSE區域中的核苷酸；且加粗、加框的核苷酸表示啟動子之TATA區域中的核苷酸。
表 8 ： 7Sk2 啟動子變異體
標識 SEQ ID NO 序列 尺寸
7SK2 706 CTGCAGT ATTTAGCATGCCCCACCCAT CTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAA CTTGACCTAAGTGTAAAGTTG AGACTTCCTTCAGG TTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC 243
7SKd30 906 CTGCAGT ATTTAGCATGCCCCACCCAT CTGCAAGGCATTCTGGATA GTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAA CTTGACCTAAGTGTAAAGTTG AGACTTCCTTCAGG TTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC 213
7SKd60 907 CTGCAGT ATTTAGCATGCCCCACCCAT CTGCAAGGCATTCTGGATA GTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAA CTTGACCTAAGTGTAAAGTTG AGACTTCCTTCAGG TTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC 183
7SKd90 908 CTGCAGT ATTTAGCATGCCCCACCCAT CTGCAAGGCATTCTGGATA GTGTCAAAACAGCCGGAAATAGCTCTAGTACGATAAGCAA CTTGACCTAAGTGTAAAGTTG AGACTTCCTTCAGG TTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC 153
7SKd120 909 CTGCAGT ATTTAGCATGCCCCACCCAT CTGCAAGGCATTCTGGATA GTGTCAGCAA CTTGACCTAAGTGTAAAGTTG AGACTTCCTTCAGG TTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTC 123
* 粗體表示啟動子之OCT區域中的核苷酸；加框的核苷酸表示啟動子之CACCC方框中的核苷酸；斜體表示啟動子之SPH區域中的核苷酸；加下劃線的核苷酸表示啟動子之核小體結合序列中的核苷酸；加粗斜體表示啟動子之PSE區域中的核苷酸；且加粗、加框的核苷酸表示啟動子之TATA區域中的核苷酸。
利用hU6c啟動子的變異體( 表 7)、7SK2啟動子的變異體( 表 8)及SaCas9支架變異體( 表 6)設計其他載體組態( 圖 14B)。舉例而言，基於AIO-AAV8 (AlO-AAV8示意圖展示於 圖 14A中)設計載體組態AlO-AA31及AlO-AAV32。基於AlO-AA31設計其他載體組態，包括AIO-AAV33、AIO-AAV34、AIO-AAV-35、AIO-AAV36、AIO-AAV-37、AIO-AAV-38、AIO-AAV39、AIO-AAV40、AIO-AAV41、AIO-AAV42、AIO-AAV43、AIO-AAV44、AIO-AAV45。
為了在載體組態中測試，選擇某些sgRNA對，包括選自以下中之某些sgRNA對：SaU1 (SEQ ID NO: 1)、SaU2 (SEQ ID NO: 2)、SaU3 (SEQ ID NO: 3)、SaU4 (SEQ ID NO: 4)、SaU7 (SEQ ID NO: 7)、SaU8 (SEQ ID NO: 8)、SaD2 (SEQ ID NO: 10)、SaD4 (SEQ ID NO: 12)、SaD5 (SEQ ID NO: 13)、SaD10 (SEQ ID NO: 18)、SaD12 (SEQ ID NO: 20)及SaD20 (SEQ ID NO: 28)。舉例而言，將SaU7 (SEQ ID NO: 7)及SaD10 (SEQ ID NO: 18)併入AlO-AA8中，且將SaU4 (SEQ ID NO: 4)及SaD4 (SEQ ID NO: 12)併入AIO-AAV31中。 實例3：使用不同支架的編輯效率
為了評估使用不同支架的編輯效率，利用脂染胺2000將攜帶SaCas9及SaU4 ( 圖 15A)或SaD4 ( 圖 15B)的質體轉染至HEK293T細胞中。支架序列展示於 表 6及 表 9中。轉染後第48小時提取基因體DNA，且藉由PCR擴增涵蓋CTG重複序列擴增及sgRNA目標位點的1174 bp序列。接著，使用桑格定序及TIDE分析來定量各sgRNA所產生之插入缺失的頻率。結果顯示為平均值±標準誤差(n=4)。
表 9 ： 其他 SaCas9 支架變異體
標識 SEQ ID NO 序列 尺寸
Sa支架V4 920 GTTTCAGTACTCTGTGCTGGAAACAGCACAGAA TCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATC TCGTCAACTTGTTGGCGAGAT 87
Sa支架V5 921 GTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAA CAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTT GTTGGCGAGAT 77
進一步評估人類原代肌母細胞中發生的編輯效率。將SaCas9蛋白及具有不同支架的合成SaU4或SaD4 sgRNA (關於支架序列，參見 表 6及 表 9)以1:3之比率核轉染至人類原代肌母細胞中。評價三種劑量：高劑量：30 pmol SaCas9蛋白；中等劑量：15 pmol SaCas9蛋白；以及低劑量：7.5 pmol SaCas9蛋白。轉染後第72小時提取基因體DNA，且藉由PCR擴增涵蓋CTG重複序列擴增及sgRNA目標位點的1195 bp序列。接著，使用桑格定序及ICE分析來定量各sgRNA所產生之插入缺失的頻率。結果作為平均值±標準誤差(n=4)展示於 圖 16中。以上具有「*」的條柱含有R 2較低的一些資料點。 實例4：其他AAV載體組態
使用Sa支架V5 ( 表 9)，設計其他載體組態( 圖 17A)。舉例而言，基於AlO-AAV8 (AlO-AAV8示意圖展示於 圖 17A中)，設計載體組態AlO-AA51、AlO-AAV52、AlO-AAV53、AlO-AAV-54、AlO-AAV55、AlO-AAV-56、AlO-AAV-57、AlO-AAV58、AlO-AAV59及AlO-AAV60。載體序列展示於下 表 10中。
基於AlO-AA51，使用hU6c啟動子之變異體( 表 7)、7SK2啟動子之變異體( 表 8)，包括如 圖 17B中所示的AlO-AlO-AAV-35'、AlO-AAV36'、AIO-AAV-37'、AlO-AAV-38'、AlO-AAV39'、AlO-AAV40'、AlO-AAV41'及AlO-AAV42'，設計其他載體組態。載體序列展示於下 表 10中。
表 10 ：例示性載體序列
AAV # SEQ ID NO 序列
AIO-AAV51 922 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV52 923 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTTGGGGGTCCTGTAGCCTGTCAGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV53 924 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGGCTCGAAGGGTCCTTGTAGCCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV54 925 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGACTCAGTCTTCCAACGGGGCCCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV55 926 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGGGTTTGGCAAAAGCAAATTTCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV56 927 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV57 928 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV58 929 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCGCGGCCGGCGAACGGGGCTCGGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGTTGGGGGTCCTGTAGCCTGTCAGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV59 930 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGCCCCGGAGTCGAAGACAGTTCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCCCGGAGTCGAAGACAGTTCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV60 931 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCAACATCCTGGGGCACAAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGGCAACATCCTGGGGCACAAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV35′ 932 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV36′ 933 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV37′ 934 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV38′ 935 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTTGGGAATAAATGATATTTGCTATGCTGGTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV39′ 936 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTCAAACTTTAGCATTTAAATTAGATTTTAGTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV40′ 937 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATCAAGTCCGTTTATCTTAAATTTCCTGCTGAAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV41′ 938 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAAAACAGCCGGAAATAGCTCTAGTACGATAAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
AIO-AAV42′ 939 TGTACTAGTGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGACTTTGCGAACCAACGATAGGTGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTCTGCAGTATTTAGCATGCCCCACCCATCTGCAAGGCATTCTGGATAGTGTCAGCAACTTGACCTAAGTGTAAAGTTGAGACTTCCTTCAGGTTTATATAGCTTGTGCGCCGCTTGGGTACCTCGCCAGTTCACAACCGCTCCGAGCGTTTCAGTACTCTGGAAACAGAATCTACTGAAACAAGGCAAAATGCCGTGTTTATCTCGTCAACTTGTTGGCGAGATTTTTTTAGATCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAA
實例4：一體式AAV載體開發
許多參數可對更強效AAV載體有貢獻，包括轉殖基因表現量高、病毒封裝效率高、病毒基因體截斷及重組水準低等。此等特徵可受以下因素影響：AAV載體尺寸、所用啟動子的特異性及穩固性、sgRNA支架序列，及轉殖基因表現卡匣的配置。使用相同sgRNA對SaU7 (SEQ ID NO: 7) + SaD10 (SEQ ID NO: 18)設計三十五(35)個不同AAV載體組態( 表 11)，以評價此等參數。一般而言，將兩輪評價建構至最佳化程序中( 圖 18A)。在第一輪中，經由C2C12細胞中之質體轉染來評估sgRNA表現且經由AAV 293細胞中之小規模封裝來評估AAV封裝效率。利用第一輪選擇選出前5種AAV組態且命名為AAV-v1-5 ( 表 11)。「AAV-v1」具有如 圖 10B中所示的「設計3：Cas9位於右側」幾何結構，具體而言，hU6c-U7-hU6c-D10-Cas9。「AAV-v2」具有如 圖 10B中所示的「設計3：Cas9位於右側」幾何結構，具體而言，hU6c-U7-7SK2-D10-Cas9。「AAV-v3」具有如 圖 10B中所示的「設計4：Cas9位於左側」幾何結構，具體而言，Cas9-hU6c-U7-hU6c-D10。「AAV-v4」具有如 圖 10B中所示的「設計4：Cas9位於左側」幾何結構，具體而言，Cas9-hU6c-U7-7SK2-D10。「AAV-v5」具有如 圖 10B中所示的「設計2：Cas9位於中間」幾何結構，具體而言，7SK2-D10-Cas9-hU6c-U7 (但其中7SK2與D10的取向相反，參見圖10A)。在5種組態中，儘管所有組態均展示良好表現，但AAV-v1及AAV-v2展示相對較高的sgRNA表現( 圖 18B)。
在第二輪評價中，根據所有5種組態，以相對較大規模產生ssAAV病毒，藉由ddPCR評估AAV效價，且藉由鹼性凝膠來評估AAV基因體完整性，接著使用所有5種ssAAV轉導活體外分化的DM1患者肌管( 圖 18C)。一般而言，使DM1患者原代肌母細胞分化5天以形成分裂期後的多核肌管，且第5天在神經胺糖酸苷酶(3.33個單位/毫升)處理下進行AAV轉導。感染的肌管接著用DMSO (媒劑)或3 µM化合物6 (DNA-PKi)處理72小時。在感染後的第3天、第5天、第10天及第15天，在分化培養基中保存肌管樣品直至固定，且進行RNA病灶染色( 圖 18D(媒劑)及 18E(DNA-PKi))。
在媒劑組中，RNA病灶染色展示無病灶肌細胞核增加及感染後的培養時間延長( 圖 18D)。截至感染後第15天，除了AAV-v5 (21%)之外，所有AAV組態均達成約30%無病灶肌細胞核。與先前對肌母細胞進行的雙切篩選一致，DNA-PKi處理組展示病灶減少比媒劑組更穩固(第10天，AAV-v2達成48%無病灶肌細胞核的最高效率)，此可在相對較早的時間點(感染後約第5天)觀測到。在DNA-PKi組與媒劑組之間亦觀測到不同的病灶減少動力學，且在DNA-PKi組中，所有5種組態在第10天似乎達到平穩狀態，而媒劑組的大部分組態繼續增加直至第15天，但其中AAV-v5除外。
為了評估得自雙切篩選之前5個sgRNA對的病灶減少效率，利用所有5對(SaD4 + SaU4；SaD10 + SaU4；SaD4 + SaU8；SaD4 + SaU2；以及SaU4 + SaD5)連同第六對：SaU7 (SEQ ID NO: 7) + SaD10 (SEQ ID NO: 18)來產生ssAAV病毒，此先前已用於最佳化方法( 圖 19A)。如本文所述執行AAV感染且此分析不包括DNA-PKi處理。作為對照組，除未處理之對照組(NTC)之外，亦包括使用相同AAV-v2組態作為CK8e-SaCas9的GFP對照組(GFP)，但其中靶向GFP序列的嚮導不應結合至任何人類序列，且其中肌管僅在轉導後的第15天固定以便進行病灶染色( 圖 19B)。與雙切sgRNA篩選排序一致，在分裂期後肌管中進行的AAV轉導方面，SaU7 (SEQ ID NO: 7) + SaD10 (SEQ ID NO: 18)展示的病灶減少效率(第15天，無病灶肌細胞核為19.9%)低於前5個嚮導對中之每一者( 圖 19C)。在前5種sgRNA對中，SaD4+SaU4 (分別為SEQ ID NO: 12+4)及SaD10+SaU4 (分別為SEQ ID NO: 18+4)展示最高的病灶減少效率，第15天達成接近50%的無病灶肌細胞核(SaD4+SaU4 [SEQ ID NO: 12+4]為48.0%，SaD10+SaU4 [SEQ ID NO: 18+4]為46.3%])，繼之為SaD4+SaU2 (33.7%)(分別為SEQ ID NO: 12+2)、SaU4+SaD5 (33.0%)(分別為SEQ ID NO: 4+13)及SaD4+SaU8 (27.6%)(分別為SEQ ID NO: 12+8)。自每個肌細胞核之平均病灶數目的定量觀測到類似傾向( 圖 19D)。
利用融合體捕捉方法聯合超深度定序來評價若干例示性SaCas9 sgRNA對的安全性(其皆以電腦預測與12種SaCas9 sgRNA相關的脫靶位點)：6種上游sgRNA：SaU1、SaU2、SaU3、SaU4、SaU7、SaU8 (分別為SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8)以及6種下游sgRNA：SaD2、SaD4、SaD5、SaD10、SaD12、SaD20 (分別為SEQ ID NO: 10、12、13、18、20、28)。SaCas9/sgRNA對RNP複合物以嚮導篩選中所用的劑量對來自三位健康供者的HSMM細胞進行核轉染，以展示CTG切除及RNA病灶減少的治療相關功效。為了確保對相關細胞類型的分析，在基因體DNA分離之前，利用肌母細胞特異性細胞表面標記物對核轉染的肌母細胞進行純化及富集。使經編輯的基因體DNA樣品與寡核苷酸探針雜交以便捕捉及富集圍繞脫靶位點的區域。藉由超深度定序來測定經電腦預測之脫靶位點的編輯效率。分析結果證實SaD2 (SEQ ID NO: 10)在區域chr4 52837941-52837969處存在一個脫靶位點，p=0.032。分析亦偵測到SaD5 (SEQ ID NO: 13)的另一脫靶位點，其0.21的p值不顯著。脫靶分析的概述說明於圖20中。
表 11
啟動子配置 嚮導啟動子組合 載體尺寸(bp)* ， 包括ITR 前 5 個候選物
Cas9位於中間 (直列) (圖10B的「設計1」幾何結構) hU6c-U7-Cas9-hU6c-D10 4771   
hU6c-U7-Cas9-7SK2-D10 4765   
hU6c-U7-Cas9-H1m-D10 4623   
Cas9位於中間 (發散) (圖10B的「設計2」幾何結構) hU6c-U7-Cas9-hU6c-D10 4771   
hU6c-U7-Cas9-7SK2-D10 4765   
hU6c-U7-Cas9-H1m-D10 4623   
7SK2-D10-Cas9-hU6c-U7 4765 AAV-v5
M11-D10-Cas9-hU6c-U7 4622   
M11-U7-Cas9-hU6c-D10 4622   
M11-U7-Cas9-7SK-D10 4616   
M11-U7-Cas9-H1m-D10 4473   
Cas9位於右側 (直列) (圖10B的「設計3」幾何結構) hU6c-U7-hU6c-D10-Cas9 4771 AAV-v1
hU6c-U7-7SK2-D10-Cas9 4765 AAV-v2
hU6c-U7-H1m-D10-Cas9 4623   
hU6c-U7(v5)-7SK2-D10(v5)-Cas9 4766   
hU6c-U7(v2)-7SK2-D10(v2)-Cas9 4790   
hU6c(d30)-7SK2-Cas9 4736   
hU6c(d60)-7SK2-Cas9 4706   
hU6c(d90)-7SK2-Cas9 4676   
hU6c(d120)-7SK2-Cas9 4646   
hU6c-7SK2(d30)-Cas9 4736   
hU6c-7SK2(d60)-Cas9 4706   
hU6c-7SK2(d90)-Cas9 4676   
hU6c-7SK2(d120)-Cas9 4646   
Cas9位於左側 (直列) (圖10B的「設計4」幾何結構) Cas9-hU6c-U7-hU6c-D10 4771 AAV-v3
Cas9-hU6c-U7-7SK2-D10 4765 AAV-v4
Cas9-hU6c-U7-H1m-D10 4623   
Cas9-hU6m-U7-hU6c-D10 4633   
Cas9-hU6m-U7-7SK2-D10 4627   
Cas9-hU6m-U7-H1m-D10 4485   
Cas9-hU6c-U7-M11-D10 4622   
Cas9-M11-D10-hU6c-U7 4619   
Cas9-7SK2-D10-hU6c-U7 4762   
Cas9-7SK2-U7-M11-D10 4613   
Cas9-M11-D10-7SK2-U7 4613   
本說明書及例示性實施例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外說明，否則表示數量、百分比或比例的所有數字，及說明書及申請專利範圍中所用之其他數值均應理解為在所有情況下藉由術語「約」修飾(就其尚未如此修飾而言)。因此，除非有相反說明，否則以下說明書及所附申請專利範圍中所述之數值參數為可根據設法獲得之所需特性而變的近似值。至少，且不試圖將均等論(doctrine of equivalents)之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用一般捨入技術來解釋。
應注意，除非明確地且肯定地限於一個提及物，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」與「該」及任何詞之任何單數使用形式包括複數個提及物。如本文所用，術語「包括」及其文法變化形式意欲具有非限制性，因此清單中之各項的敍述不排除可以取代或添加至所列項中的其他類似項。
圖1描繪DM1基因編輯治療方法。利用單一sgRNA (單切)或成對sgRNA (雙切)聯合Cas9內切核酸酶切除人類 DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列擴增。
圖2顯示27種所選SaCas9 sgRNA的位置。選擇八種上游sgRNA及19種下游sgRNA供單切篩選用。
圖3顯示27種所選SaCas9 sgRNA在DM1患者原代肌母細胞中的編輯效率。編輯效率係藉由桑格定序(Sanger sequencing)及ICE分析來評估且按照平均值±標準誤差(n=4)顯示。將sgRNA依最高效率至最低效率排序。21種sgRNA (實心條)顯示大於10%的插入缺失效率且選用於進一步的雙切篩選。
圖4A-4C顯示嚮導RNA SaU1 (SEQ ID NO: 1)誘導的CTG重複序列切除。圖4a顯示SaU1 sgRNA位置及由SaU1單切誘導的370 bp序列缺失。圖4B顯示未處理之DM1肌母細胞及經SaU1處理之DM1肌母細胞的層析圖跡線。DMPK 3' UTR區域的野生型對偶基因以PCR擴增，隨後進行桑格定序，且顯示切割位點附近的層析圖跡線。基於層析圖跡線，側接CTG重複序列的370 bp序列在經SaU1處理的肌母細胞中為缺失的。圖4C顯示TapeStation對自DMPK 3' UTR區域之野生型對偶基因擴增之PCR產物的分析。箭頭指向自未編輯之野生型對偶基因或具有少量插入缺失之野生型對偶基因擴增的PCR產物。圓圈表示自具有370 bp缺失之野生型對偶基因擴增的PCR產物。DNA-PKi增大了370 bp缺失序列的缺失頻率。DM1模擬物為僅接受SaCas9蛋白(無sgRNA)核轉染的DM1患者肌母細胞。
圖5顯示個別SaCas9 sgRNA在DM1患者原代肌母細胞中誘導之不含CUG病灶之肌母細胞核的頻率。所示為不含CUG病灶之肌母細胞核的百分比(平均值±標準差(n=2))。虛線表示20%肌母細胞核中的CUG病灶消除。白色條表示媒劑處理的病灶減少效率，且實心條表示DNA-PKi處理的病灶減少效率。sgRNA依DNA-PKi處理組中的最高效率至最低效率排序。DM1模擬物充當陰性對照，且健康對照充當陽性對照。
圖6A-6B顯示SaU01 sgRNA使DM1患者原代肌母細胞的CUG病灶減少。圖6A顯示免疫螢光影像，其顯示經媒劑或DNA-Pki處理之SaU1核轉染DM1肌母細胞或經媒劑處理之模擬物核轉染DM1肌母細胞中的CUG病灶染色。CUG病灶顯現為DAPI染色之肌母細胞內的較亮斑點。圖6B顯示具有不同數目個CUG病灶之肌母細胞核的頻率分佈。SaU1 sgRNA不僅使不含CUG病灶之肌母細胞核(每個核的病灶數目=0)的頻率增大，而且使含有超過三個CUG病灶之肌母細胞核的頻率降低。
圖7顯示SaCas9 sgRNA對在DM1患者原代肌母細胞中誘導的CTG重複序列切除效率。所示為上游及下游ddPCR分析所量測之切除CTG重複序列的平均效率。白色條表示媒劑處理的CTG重複序列切除效率，且實心條表示DNA-PKi處理的CTG重複序列切除效率。sgRNA依媒劑處理組中的最高效率至最低效率排序。關於個別sgRNA對誘導的CTG重複序列切除效率，參見 表 4。
圖8顯示SaCas9 sgRNA對在DM1患者原代肌母細胞中誘導之不含CUG病灶之肌母細胞的頻率。白色條表示媒劑處理的病灶減少效率，且實心條表示DNA-PKi處理的病灶減少效率。sgRNA依媒劑處理組中的最高效率至最低效率排序。關於個別sgRNA對誘導之不含CUG病灶之肌母細胞核的效率，參見 表 4。
圖9A-9B顯示SaU4 + SaD4對大大減少了DM1患者原代肌母細胞中的CUG病灶。圖9A顯示免疫螢光影像，其顯示經媒劑處理之健康或DM1肌母細胞或經媒劑或DNA-PKi處理之SaU4+SaD4核轉染DM1肌母細胞中的CUG病灶染色。圖9B顯示具有不同數目個CUG病灶之肌母細胞核的頻率分佈。SaU4 + SaD4對消除了經媒劑或DNA-PKi處理之大多數肌母細胞中的CUG病灶。
圖10A-B顯示若干代表性「一體式」載體組態。圖10A為顯示四種代表性載體設計的示意圖。白色箭頭指示sgRNA表現方向，而黑色箭頭指示Cas9蛋白的方向。在一個特定實施例中，Cas9啟動子可為CK8e。「Pol III」係指表現sgRNA用的代表性啟動子，「g1」及「g2」各指嚮導序列，「支架」係指嚮導RNA的支架，且「pa」係指聚腺苷酸化序列。圖10B顯示其他載體組態，包括表現sgRNA用的代表性啟動子，且表示為「U7」及「D10」的代表性sgRNA。
圖11為稱為AlO-AAV7、AlO-AA8、AlO-AAV10、AlO-AAV11及AlO-AAV17之代表性載體組態的示意圖，其顯示鹼基對(bp)之AAV尺寸。
圖12顯示hU6c啟動子示意圖。
圖13顯示7SK2啟動子示意圖。
圖14A-B顯示由AIO-AAV8修飾的其他代表性「一體式」載體組態。圖14A顯示AlO-AAV8示意圖，其中經修飾的區域用括號指示。圖14B列舉與AlO-AAV8相比存在變化的載體組態，以及與AlO-AAV31相比存在變化的載體組態(由AIO-AAV8經修飾而成)。
圖15A-B顯示具有不同SaCas9支架的sgRNAs SaU4 (圖15A)及SaD4 (圖15B)在293 T細胞中的編輯效率。
圖16顯示具有不同SaCas9支架之sgRNA SaU4及SaD4在三種劑量(30、15及7.5 pmol)下、在人類原代肌母細胞中的編輯效率。
圖17A-B顯示由AIO-AAV8修飾的其他代表性「一體式」載體組態。圖17A列舉與AlO-AAV8相比存在變化的載體組態。圖17B列舉與AlO-AAV51相比存在變化的載體組態(由AlO-AAV8經修飾而成)。
圖18A-E顯示DM1單一載體ssAAV設計最佳化。圖18A顯示活體外AAV載體最佳化程序的示意圖。圖18B顯示上游及下游sgRNA在AAV質體轉染之C2C12細胞中的相對表現量(相對於mHPRT表現標準化)。圖18C顯示DM1患者源肌管中之肌原性分化及AAV轉導的示意圖。圖18D-E顯示(D)在DNA-PKi處理不存在下及(E)在DNA-PKi處理存在下、在不同時間點對AAV感染之肌管中之不含CUG病灶之肌細胞核的定量。
圖19A-D顯示DM1患者肌母細胞分化肌管中的AAV轉導。圖19A顯示用於AAV感染之sgRNA對在雙切篩選評級中的位置。圖19B顯示DM1患者源肌管中之肌原性分化及AAV轉導的示意圖。圖19C顯示不含CUG病灶之肌細胞核的定量且圖19D顯示經AAV感染之肌管中的每個肌細胞核之平均CUG病灶數目(底部)。
圖20顯示可成對用於活體內編輯評價的例示性SaCas9 sgRNA。
 

          <![CDATA[<110>  美商維泰克斯製藥公司(VERTEX PHARMACEUTICALS INCORPORATED)]]>
          <![CDATA[<120>  以CRISPR/SACAS9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法]]>
          <![CDATA[<130>  01245-0025-00PCT]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/154,442]]>
          <![CDATA[<151>  2021-02-26]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/159,815]]>
          <![CDATA[<151>  2021-03-11]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/184,462]]>
          <![CDATA[<151>  2021-05-05]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/276,003]]>
          <![CDATA[<151>  2021-11-05]]>
          <![CDATA[<150>  US 63/306,883]]>
          <![CDATA[<151>  2022-02-04]]>
          <![CDATA[<160>  943   ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          gccccggagt cgaagacagt tc                                                22
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          actcagtctt ccaacggggc cc                                                22
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          actccggggc cccgttggaa ga                                                22
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          ccagttcaca accgctccga gc                                                22
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          ccccggccgc tagggggcgg gc                                                22
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          ctagcggccg gggagggagg gg                                                22
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          cgcggccggc gaacggggct cg                                                22
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          ggctcgaagg gtccttgtag cc                                                22
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          ctgctgctgc tgctgctgct gg                                                22
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          tcggccaggc tgaggccctg ac                                                22
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          caacgatagg tgggggtgcg tg                                                22
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          actttgcgaa ccaacgatag gt                                                22
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          gggtttggca aaagcaaatt tc                                                22
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          cttttgccaa acccgctttt tc                                                22
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          ggggcgcggg atccccgaaa aa                                                22
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          agcgcaagtg aggagggggg cg                                                22
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          cggctccgcc cgcttcggcg gt                                                22
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          ttgggggtcc tgtagcctgt ca                                                22
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          caaaacgtgg attggggttg tt                                                22
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          tcagtgcatc caaaacgtgg at                                                22
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          cccaacaacc ccaatccacg tt                                                22
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          ggggtctcag tgcatccaaa ac                                                22
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          gacaataaat accgaggaat gt                                                22
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          tggggacaga caataaatac cg                                                22
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          tttattcgcg agggtcgggg gt                                                22
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          gggcctttta ttcgcgaggg tc                                                22
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          aggaccccca cccccgaccc tc                                                22
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          agatggaggg ccttttattc gc                                                22
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          000
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          000
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          000
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          000
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          000
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          000
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          000
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          000
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          000
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          000
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          000
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          000
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          000
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          000
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          000
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          000
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          000
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          000
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          000
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          000
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          000
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          000
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          000
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          000
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          000
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          000
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          000
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          000
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          000
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          000
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          000
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          000
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          000
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          000
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          000
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          000
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          000
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          000
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          000
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          000
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          000
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          000
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          000
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          000
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          000
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          000
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          000
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          000
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          000
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          000
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          000
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          000
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          000
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          000
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<400>  83]]>
          000
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          000
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          000
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          000
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          000
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          000
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          000
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          000
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          000
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          000
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          000
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          000
          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          000
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          000
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          000
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          000
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<400>  99]]>
          000
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<400>  100]]>
          000
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          ccccggagtc gaagacagtt c                                                 21
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          cccggagtcg aagacagttc                                                   20
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          ctcagtcttc caacggggcc c                                                 21
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          tcagtcttcc aacggggccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          actccggggc cccgttggaa g                                                 21
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          actccggggc cccgttggaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          ccagttcaca accgctccga g                                                 21
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          ccagttcaca accgctccga                                                   20
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          cccggccgct agggggcggg c                                                 21
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          ccggccgcta gggggcgggc                                                   20
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          ctagcggccg gggagggagg g                                                 21
          <![CDATA[<210>  112]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          ctagcggccg gggagggagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          cgcggccggc gaacggggct c                                                 21
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          cgcggccggc gaacggggct                                                   20
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          ggctcgaagg gtccttgtag c                                                 21
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          ggctcgaagg gtccttgtag                                                   20
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  117]]>
          tcggccaggc tgaggccctg a                                                 21
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  118]]>
          tcggccaggc tgaggccctg                                                   20
          <![CDATA[<210>  119]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  119]]>
          aacgataggt gggggtgcgt g                                                 21
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          acgataggtg ggggtgcgtg                                                   20
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  121]]>
          ctttgcgaac caacgatagg t                                                 21
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  122]]>
          tttgcgaacc aacgataggt                                                   20
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          ggtttggcaa aagcaaattt c                                                 21
          <![CDATA[<210>  124]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  124]]>
          gtttggcaaa agcaaatttc                                                   20
          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          cttttgccaa acccgctttt t                                                 21
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          cttttgccaa acccgctttt                                                   20
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          gggcgcggga tccccgaaaa a                                                 21
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          ggcgcgggat ccccgaaaaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  129]]>
          gcgcaagtga ggaggggggc g                                                 21
          <![CDATA[<210>  130]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  130]]>
          cgcaagtgag gaggggggcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  131]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  131]]>
          cggctccgcc cgcttcggcg g                                                 21
          <![CDATA[<210>  132]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  132]]>
          cggctccgcc cgcttcggcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  133]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  133]]>
          tgggggtcct gtagcctgtc a                                                 21
          <![CDATA[<210>  134]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  134]]>
          gggggtcctg tagcctgtca                                                   20
          <![CDATA[<210>  135]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  135]]>
          aaaacgtgga ttggggttgt t                                                 21
          <![CDATA[<210>  136]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  136]]>
          aaacgtggat tggggttgtt                                                   20
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  137]]>
          cagtgcatcc aaaacgtgga t                                                 21
          <![CDATA[<210>  138]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  138]]>
          agtgcatcca aaacgtggat                                                   20
          <![CDATA[<210>  139]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  139]]>
          cccaacaacc ccaatccacg t                                                 21
          <![CDATA[<210>  140]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  140]]>
          cccaacaacc ccaatccacg                                                   20
          <![CDATA[<210>  141]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  141]]>
          gggtctcagt gcatccaaaa c                                                 21
          <![CDATA[<210>  142]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  142]]>
          ggtctcagtg catccaaaac                                                   20
          <![CDATA[<210>  143]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  143]]>
          acaataaata ccgaggaatg t                                                 21
          <![CDATA[<210>  144]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  144]]>
          caataaatac cgaggaatgt                                                   20
          <![CDATA[<210>  145]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  145]]>
          ggggacagac aataaatacc g                                                 21
          <![CDATA[<210>  146]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  146]]>
          gggacagaca ataaataccg                                                   20
          <![CDATA[<210>  147]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  147]]>
          ttattcgcga gggtcggggg t                                                 21
          <![CDATA[<210>  148]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  148]]>
          tattcgcgag ggtcgggggt                                                   20
          <![CDATA[<210>  149]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  149]]>
          ggccttttat tcgcgagggt c                                                 21
          <![CDATA[<210>  150]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  150]]>
          gccttttatt cgcgagggtc                                                   20
          <![CDATA[<210>  151]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  151]]>
          aggaccccca cccccgaccc t                                                 21
          <![CDATA[<210>  152]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  152]]>
          aggaccccca cccccgaccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  153]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  153]]>
          gatggagggc cttttattcg c                                                 21
          <![CDATA[<210>  154]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  154]]>
          atggagggcc ttttattcgc                                                   20
          <![CDATA[<210>  155]]>
          <![CDATA[<400>  155]]>
          000
          <![CDATA[<210>  156]]>
          <![CDATA[<400>  156]]>
          000
          <![CDATA[<210>  157]]>
          <![CDATA[<400>  157]]>
          000
          <![CDATA[<210>  158]]>
          <![CDATA[<400>  158]]>
          000
          <![CDATA[<210>  159]]>
          <![CDATA[<400>  159]]>
          000
          <![CDATA[<210>  160]]>
          <![CDATA[<400>  160]]>
          000
          <![CDATA[<210>  161]]>
          <![CDATA[<400>  161]]>
          000
          <![CDATA[<210>  162]]>
          <![CDATA[<400>  162]]>
          000
          <![CDATA[<210>  163]]>
          <![CDATA[<400>  163]]>
          000
          <![CDATA[<210>  164]]>
          <![CDATA[<400>  164]]>
          000
          <![CDATA[<210>  165]]>
          <![CDATA[<400>  165]]>
          000
          <![CDATA[<210>  166]]>
          <![CDATA[<400>  166]]>
          000
          <![CDATA[<210>  167]]>
          <![CDATA[<400>  167]]>
          000
          <![CDATA[<210>  168]]>
          <![CDATA[<400>  168]]>
          000
          <![CDATA[<210>  169]]>
          <![CDATA[<400>  169]]>
          000
          <![CDATA[<210>  170]]>
          <![CDATA[<400>  170]]>
          000
          <![CDATA[<210>  171]]>
          <![CDATA[<400>  171]]>
          000
          <![CDATA[<210>  172]]>
          <![CDATA[<400>  172]]>
          000
          <![CDATA[<210>  173]]>
          <![CDATA[<400>  173]]>
          000
          <![CDATA[<210>  174]]>
          <![CDATA[<400>  174]]>
          000
          <![CDATA[<210>  175]]>
          <![CDATA[<400>  175]]>
          000
          <![CDATA[<210>  176]]>
          <![CDATA[<400>  176]]>
          000
          <![CDATA[<210>  177]]>
          <![CDATA[<400>  177]]>
          000
          <![CDATA[<210>  178]]>
          <![CDATA[<400>  178]]>
          000
          <![CDATA[<210>  179]]>
          <![CDATA[<400>  179]]>
          000
          <![CDATA[<210>  180]]>
          <![CDATA[<400>  180]]>
          000
          <![CDATA[<210>  181]]>
          <![CDATA[<400>  181]]>
          000
          <![CDATA[<210>  182]]>
          <![CDATA[<400>  182]]>
          000
          <![CDATA[<210>  183]]>
          <![CDATA[<400>  183]]>
          000
          <![CDATA[<210>  184]]>
          <![CDATA[<400>  184]]>
          000
          <![CDATA[<210>  185]]>
          <![CDATA[<400>  185]]>
          000
          <![CDATA[<210>  186]]>
          <![CDATA[<400>  186]]>
          000
          <![CDATA[<210>  187]]>
          <![CDATA[<400>  187]]>
          000
          <![CDATA[<210>  188]]>
          <![CDATA[<400>  188]]>
          000
          <![CDATA[<210>  189]]>
          <![CDATA[<400>  189]]>
          000
          <![CDATA[<210>  190]]>
          <![CDATA[<400>  190]]>
          000
          <![CDATA[<210>  191]]>
          <![CDATA[<400>  191]]>
          000
          <![CDATA[<210>  192]]>
          <![CDATA[<400>  192]]>
          000
          <![CDATA[<210>  193]]>
          <![CDATA[<400>  193]]>
          000
          <![CDATA[<210>  194]]>
          <![CDATA[<400>  194]]>
          000
          <![CDATA[<210>  195]]>
          <![CDATA[<400>  195]]>
          000
          <![CDATA[<210>  196]]>
          <![CDATA[<400>  196]]>
          000
          <![CDATA[<210>  197]]>
          <![CDATA[<400>  197]]>
          000
          <![CDATA[<210>  198]]>
          <![CDATA[<400>  198]]>
          000
          <![CDATA[<210>  199]]>
          <![CDATA[<400>  199]]>
          000
          <![CDATA[<210>  200]]>
          <![CDATA[<400>  200]]>
          000
          <![CDATA[<210>  201]]>
          <![CDATA[<400>  201]]>
          000
          <![CDATA[<210>  202]]>
          <![CDATA[<400>  202]]>
          000
          <![CDATA[<210>  203]]>
          <![CDATA[<400>  203]]>
          000
          <![CDATA[<210>  204]]>
          <![CDATA[<400>  204]]>
          000
          <![CDATA[<210>  205]]>
          <![CDATA[<400>  205]]>
          000
          <![CDATA[<210>  206]]>
          <![CDATA[<400>  206]]>
          000
          <![CDATA[<210>  207]]>
          <![CDATA[<400>  207]]>
          000
          <![CDATA[<210>  208]]>
          <![CDATA[<400>  208]]>
          000
          <![CDATA[<210>  209]]>
          <![CDATA[<400>  209]]>
          000
          <![CDATA[<210>  210]]>
          <![CDATA[<400>  210]]>
          000
          <![CDATA[<210>  211]]>
          <![CDATA[<400>  211]]>
          000
          <![CDATA[<210>  212]]>
          <![CDATA[<400>  212]]>
          000
          <![CDATA[<210>  213]]>
          <![CDATA[<400>  213]]>
          000
          <![CDATA[<210>  214]]>
          <![CDATA[<400>  214]]>
          000
          <![CDATA[<210>  215]]>
          <![CDATA[<400>  215]]>
          000
          <![CDATA[<210>  216]]>
          <![CDATA[<400>  216]]>
          000
          <![CDATA[<210>  217]]>
          <![CDATA[<400>  217]]>
          000
          <![CDATA[<210>  218]]>
          <![CDATA[<400>  218]]>
          000
          <![CDATA[<210>  219]]>
          <![CDATA[<400>  219]]>
          000
          <![CDATA[<210>  220]]>
          <![CDATA[<400>  220]]>
          000
          <![CDATA[<210>  221]]>
          <![CDATA[<400>  221]]>
          000
          <![CDATA[<210>  222]]>
          <![CDATA[<400>  222]]>
          000
          <![CDATA[<210>  223]]>
          <![CDATA[<400>  223]]>
          000
          <![CDATA[<210>  224]]>
          <![CDATA[<400>  224]]>
          000
          <![CDATA[<210>  225]]>
          <![CDATA[<400>  225]]>
          000
          <![CDATA[<210>  226]]>
          <![CDATA[<400>  226]]>
          000
          <![CDATA[<210>  227]]>
          <![CDATA[<400>  227]]>
          000
          <![CDATA[<210>  228]]>
          <![CDATA[<400>  228]]>
          000
          <![CDATA[<210>  229]]>
          <![CDATA[<400>  229]]>
          000
          <![CDATA[<210>  230]]>
          <![CDATA[<400>  230]]>
          000
          <![CDATA[<210>  231]]>
          <![CDATA[<400>  231]]>
          000
          <![CDATA[<210>  232]]>
          <![CDATA[<400>  232]]>
          000
          <![CDATA[<210>  233]]>
          <![CDATA[<400>  233]]>
          000
          <![CDATA[<210>  234]]>
          <![CDATA[<400>  234]]>
          000
          <![CDATA[<210>  235]]>
          <![CDATA[<400>  235]]>
          000
          <![CDATA[<210>  236]]>
          <![CDATA[<400>  236]]>
          000
          <![CDATA[<210>  237]]>
          <![CDATA[<400>  237]]>
          000
          <![CDATA[<210>  238]]>
          <![CDATA[<400>  238]]>
          000
          <![CDATA[<210>  239]]>
          <![CDATA[<400>  239]]>
          000
          <![CDATA[<210>  240]]>
          <![CDATA[<400>  240]]>
          000
          <![CDATA[<210>  241]]>
          <![CDATA[<400>  241]]>
          000
          <![CDATA[<210>  242]]>
          <![CDATA[<400>  242]]>
          000
          <![CDATA[<210>  243]]>
          <![CDATA[<400>  243]]>
          000
          <![CDATA[<210>  244]]>
          <![CDATA[<400>  244]]>
          000
          <![CDATA[<210>  245]]>
          <![CDATA[<400>  245]]>
          000
          <![CDATA[<210>  246]]>
          <![CDATA[<400>  246]]>
          000
          <![CDATA[<210>  247]]>
          <![CDATA[<400>  247]]>
          000
          <![CDATA[<210>  248]]>
          <![CDATA[<400>  248]]>
          000
          <![CDATA[<210>  249]]>
          <![CDATA[<400>  249]]>
          000
          <![CDATA[<210>  250]]>
          <![CDATA[<400>  250]]>
          000
          <![CDATA[<210>  251]]>
          <![CDATA[<400>  251]]>
          000
          <![CDATA[<210>  252]]>
          <![CDATA[<400>  252]]>
          000
          <![CDATA[<210>  253]]>
          <![CDATA[<400>  253]]>
          000
          <![CDATA[<210>  254]]>
          <![CDATA[<400>  254]]>
          000
          <![CDATA[<210>  255]]>
          <![CDATA[<400>  255]]>
          000
          <![CDATA[<210>  256]]>
          <![CDATA[<400>  256]]>
          000
          <![CDATA[<210>  257]]>
          <![CDATA[<400>  257]]>
          000
          <![CDATA[<210>  258]]>
          <![CDATA[<400>  258]]>
          000
          <![CDATA[<210>  259]]>
          <![CDATA[<400>  259]]>
          000
          <![CDATA[<210>  260]]>
          <![CDATA[<400>  260]]>
          000
          <![CDATA[<210>  261]]>
          <![CDATA[<400>  261]]>
          000
          <![CDATA[<210>  262]]>
          <![CDATA[<400>  262]]>
          000
          <![CDATA[<210>  263]]>
          <![CDATA[<400>  263]]>
          000
          <![CDATA[<210>  264]]>
          <![CDATA[<400>  264]]>
          000
          <![CDATA[<210>  265]]>
          <![CDATA[<400>  265]]>
          000
          <![CDATA[<210>  266]]>
          <![CDATA[<400>  266]]>
          000
          <![CDATA[<210>  267]]>
          <![CDATA[<400>  267]]>
          000
          <![CDATA[<210>  268]]>
          <![CDATA[<400>  268]]>
          000
          <![CDATA[<210>  269]]>
          <![CDATA[<400>  269]]>
          000
          <![CDATA[<210>  270]]>
          <![CDATA[<400>  270]]>
          000
          <![CDATA[<210>  271]]>
          <![CDATA[<400>  271]]>
          000
          <![CDATA[<210>  272]]>
          <![CDATA[<400>  272]]>
          000
          <![CDATA[<210>  273]]>
          <![CDATA[<400>  273]]>
          000
          <![CDATA[<210>  274]]>
          <![CDATA[<400>  274]]>
          000
          <![CDATA[<210>  275]]>
          <![CDATA[<400>  275]]>
          000
          <![CDATA[<210>  276]]>
          <![CDATA[<400>  276]]>
          000
          <![CDATA[<210>  277]]>
          <![CDATA[<400>  277]]>
          000
          <![CDATA[<210>  278]]>
          <![CDATA[<400>  278]]>
          000
          <![CDATA[<210>  279]]>
          <![CDATA[<400>  279]]>
          000
          <![CDATA[<210>  280]]>
          <![CDATA[<400>  280]]>
          000
          <![CDATA[<210>  281]]>
          <![CDATA[<400>  281]]>
          000
          <![CDATA[<210>  282]]>
          <![CDATA[<400>  282]]>
          000
          <![CDATA[<210>  283]]>
          <![CDATA[<400>  283]]>
          000
          <![CDATA[<210>  284]]>
          <![CDATA[<400>  284]]>
          000
          <![CDATA[<210>  285]]>
          <![CDATA[<400>  285]]>
          000
          <![CDATA[<210>  286]]>
          <![CDATA[<400>  286]]>
          000
          <![CDATA[<210>  287]]>
          <![CDATA[<400>  287]]>
          000
          <![CDATA[<210>  288]]>
          <![CDATA[<400>  288]]>
          000
          <![CDATA[<210>  289]]>
          <![CDATA[<400>  289]]>
          000
          <![CDATA[<210>  290]]>
          <![CDATA[<400>  290]]>
          000
          <![CDATA[<210>  291]]>
          <![CDATA[<400>  291]]>
          000
          <![CDATA[<210>  292]]>
          <![CDATA[<400>  292]]>
          000
          <![CDATA[<210>  293]]>
          <![CDATA[<400>  293]]>
          000
          <![CDATA[<210>  294]]>
          <![CDATA[<400>  294]]>
          000
          <![CDATA[<210>  295]]>
          <![CDATA[<400>  295]]>
          000
          <![CDATA[<210>  296]]>
          <![CDATA[<400>  296]]>
          000
          <![CDATA[<210>  297]]>
          <![CDATA[<400>  297]]>
          000
          <![CDATA[<210>  298]]>
          <![CDATA[<400>  298]]>
          000
          <![CDATA[<210>  299]]>
          <![CDATA[<400>  299]]>
          000
          <![CDATA[<210>  300]]>
          <![CDATA[<400>  300]]>
          000
          <![CDATA[<210>  301]]>
          <![CDATA[<400>  301]]>
          000
          <![CDATA[<210>  302]]>
          <![CDATA[<400>  302]]>
          000
          <![CDATA[<210>  303]]>
          <![CDATA[<400>  303]]>
          000
          <![CDATA[<210>  304]]>
          <![CDATA[<400>  304]]>
          000
          <![CDATA[<210>  305]]>
          <![CDATA[<400>  305]]>
          000
          <![CDATA[<210>  306]]>
          <![CDATA[<400>  306]]>
          000
          <![CDATA[<210>  307]]>
          <![CDATA[<400>  307]]>
          000
          <![CDATA[<210>  308]]>
          <![CDATA[<400>  308]]>
          000
          <![CDATA[<210>  309]]>
          <![CDATA[<400>  309]]>
          000
          <![CDATA[<210>  310]]>
          <![CDATA[<400>  310]]>
          000
          <![CDATA[<210>  311]]>
          <![CDATA[<400>  311]]>
          000
          <![CDATA[<210>  312]]>
          <![CDATA[<400>  312]]>
          000
          <![CDATA[<210>  313]]>
          <![CDATA[<400>  313]]>
          000
          <![CDATA[<210>  314]]>
          <![CDATA[<400>  314]]>
          000
          <![CDATA[<210>  315]]>
          <![CDATA[<400>  315]]>
          000
          <![CDATA[<210>  316]]>
          <![CDATA[<400>  316]]>
          000
          <![CDATA[<210>  317]]>
          <![CDATA[<400>  317]]>
          000
          <![CDATA[<210>  318]]>
          <![CDATA[<400>  318]]>
          000
          <![CDATA[<210>  319]]>
          <![CDATA[<400>  319]]>
          000
          <![CDATA[<210>  320]]>
          <![CDATA[<400>  320]]>
          000
          <![CDATA[<210>  321]]>
          <![CDATA[<400>  321]]>
          000
          <![CDATA[<210>  322]]>
          <![CDATA[<400>  322]]>
          000
          <![CDATA[<210>  323]]>
          <![CDATA[<400>  323]]>
          000
          <![CDATA[<210>  324]]>
          <![CDATA[<400>  324]]>
          000
          <![CDATA[<210>  325]]>
          <![CDATA[<400>  325]]>
          000
          <![CDATA[<210>  326]]>
          <![CDATA[<400>  326]]>
          000
          <![CDATA[<210>  327]]>
          <![CDATA[<400>  327]]>
          000
          <![CDATA[<210>  328]]>
          <![CDATA[<400>  328]]>
          000
          <![CDATA[<210>  329]]>
          <![CDATA[<400>  329]]>
          000
          <![CDATA[<210>  330]]>
          <![CDATA[<400>  330]]>
          000
          <![CDATA[<210>  331]]>
          <![CDATA[<400>  331]]>
          000
          <![CDATA[<210>  332]]>
          <![CDATA[<400>  332]]>
          000
          <![CDATA[<210>  333]]>
          <![CDATA[<400>  333]]>
          000
          <![CDATA[<210>  334]]>
          <![CDATA[<400>  334]]>
          000
          <![CDATA[<210>  335]]>
          <![CDATA[<400>  335]]>
          000
          <![CDATA[<210>  336]]>
          <![CDATA[<400>  336]]>
          000
          <![CDATA[<210>  337]]>
          <![CDATA[<400>  337]]>
          000
          <![CDATA[<210>  338]]>
          <![CDATA[<400>  338]]>
          000
          <![CDATA[<210>  339]]>
          <![CDATA[<400>  339]]>
          000
          <![CDATA[<210>  340]]>
          <![CDATA[<400>  340]]>
          000
          <![CDATA[<210>  341]]>
          <![CDATA[<400>  341]]>
          000
          <![CDATA[<210>  342]]>
          <![CDATA[<400>  342]]>
          000
          <![CDATA[<210>  343]]>
          <![CDATA[<400>  343]]>
          000
          <![CDATA[<210>  344]]>
          <![CDATA[<400>  344]]>
          000
          <![CDATA[<210>  345]]>
          <![CDATA[<400>  345]]>
          000
          <![CDATA[<210>  346]]>
          <![CDATA[<400>  346]]>
          000
          <![CDATA[<210>  347]]>
          <![CDATA[<400>  347]]>
          000
          <![CDATA[<210>  348]]>
          <![CDATA[<400>  348]]>
          000
          <![CDATA[<210>  349]]>
          <![CDATA[<400>  349]]>
          000
          <![CDATA[<210>  350]]>
          <![CDATA[<400>  350]]>
          000
          <![CDATA[<210>  351]]>
          <![CDATA[<400>  351]]>
          000
          <![CDATA[<210>  352]]>
          <![CDATA[<400>  352]]>
          000
          <![CDATA[<210>  353]]>
          <![CDATA[<400>  353]]>
          000
          <![CDATA[<210>  354]]>
          <![CDATA[<400>  354]]>
          000
          <![CDATA[<210>  355]]>
          <![CDATA[<400>  355]]>
          000
          <![CDATA[<210>  356]]>
          <![CDATA[<400>  356]]>
          000
          <![CDATA[<210>  357]]>
          <![CDATA[<400>  357]]>
          000
          <![CDATA[<210>  358]]>
          <![CDATA[<400>  358]]>
          000
          <![CDATA[<210>  359]]>
          <![CDATA[<400>  359]]>
          000
          <![CDATA[<210>  360]]>
          <![CDATA[<400>  360]]>
          000
          <![CDATA[<210>  361]]>
          <![CDATA[<400>  361]]>
          000
          <![CDATA[<210>  362]]>
          <![CDATA[<400>  362]]>
          000
          <![CDATA[<210>  363]]>
          <![CDATA[<400>  363]]>
          000
          <![CDATA[<210>  364]]>
          <![CDATA[<400>  364]]>
          000
          <![CDATA[<210>  365]]>
          <![CDATA[<400>  365]]>
          000
          <![CDATA[<210>  366]]>
          <![CDATA[<400>  366]]>
          000
          <![CDATA[<210>  367]]>
          <![CDATA[<400>  367]]>
          000
          <![CDATA[<210>  368]]>
          <![CDATA[<400>  368]]>
          000
          <![CDATA[<210>  369]]>
          <![CDATA[<400>  369]]>
          000
          <![CDATA[<210>  370]]>
          <![CDATA[<400>  370]]>
          000
          <![CDATA[<210>  371]]>
          <![CDATA[<400>  371]]>
          000
          <![CDATA[<210>  372]]>
          <![CDATA[<400>  372]]>
          000
          <![CDATA[<210>  373]]>
          <![CDATA[<400>  373]]>
          000
          <![CDATA[<210>  374]]>
          <![CDATA[<400>  374]]>
          000
          <![CDATA[<210>  375]]>
          <![CDATA[<400>  375]]>
          000
          <![CDATA[<210>  376]]>
          <![CDATA[<400>  376]]>
          000
          <![CDATA[<210>  377]]>
          <![CDATA[<400>  377]]>
          000
          <![CDATA[<210>  378]]>
          <![CDATA[<400>  378]]>
          000
          <![CDATA[<210>  379]]>
          <![CDATA[<400>  379]]>
          000
          <![CDATA[<210>  380]]>
          <![CDATA[<400>  380]]>
          000
          <![CDATA[<210>  381]]>
          <![CDATA[<400>  381]]>
          000
          <![CDATA[<210>  382]]>
          <![CDATA[<400>  382]]>
          000
          <![CDATA[<210>  383]]>
          <![CDATA[<400>  383]]>
          000
          <![CDATA[<210>  384]]>
          <![CDATA[<400>  384]]>
          000
          <![CDATA[<210>  385]]>
          <![CDATA[<400>  385]]>
          000
          <![CDATA[<210>  386]]>
          <![CDATA[<400>  386]]>
          000
          <![CDATA[<210>  387]]>
          <![CDATA[<400>  387]]>
          000
          <![CDATA[<210>  388]]>
          <![CDATA[<400>  388]]>
          000
          <![CDATA[<210>  389]]>
          <![CDATA[<400>  389]]>
          000
          <![CDATA[<210>  390]]>
          <![CDATA[<400>  390]]>
          000
          <![CDATA[<210>  391]]>
          <![CDATA[<400>  391]]>
          000
          <![CDATA[<210>  392]]>
          <![CDATA[<400>  392]]>
          000
          <![CDATA[<210>  393]]>
          <![CDATA[<400>  393]]>
          000
          <![CDATA[<210>  394]]>
          <![CDATA[<400>  394]]>
          000
          <![CDATA[<210>  395]]>
          <![CDATA[<400>  395]]>
          000
          <![CDATA[<210>  396]]>
          <![CDATA[<400>  396]]>
          000
          <![CDATA[<210>  397]]>
          <![CDATA[<400>  397]]>
          000
          <![CDATA[<210>  398]]>
          <![CDATA[<400>  398]]>
          000
          <![CDATA[<210>  399]]>
          <![CDATA[<400>  399]]>
          000
          <![CDATA[<210>  400]]>
          <![CDATA[<400>  400]]>
          000
          <![CDATA[<210>  401]]>
          <![CDATA[<400>  401]]>
          000
          <![CDATA[<210>  402]]>
          <![CDATA[<400>  402]]>
          000
          <![CDATA[<210>  403]]>
          <![CDATA[<400>  403]]>
          000
          <![CDATA[<210>  404]]>
          <![CDATA[<400>  404]]>
          000
          <![CDATA[<210>  405]]>
          <![CDATA[<400>  405]]>
          000
          <![CDATA[<210>  406]]>
          <![CDATA[<400>  406]]>
          000
          <![CDATA[<210>  407]]>
          <![CDATA[<400>  407]]>
          000
          <![CDATA[<210>  408]]>
          <![CDATA[<400>  408]]>
          000
          <![CDATA[<210>  409]]>
          <![CDATA[<400>  409]]>
          000
          <![CDATA[<210>  410]]>
          <![CDATA[<400>  410]]>
          000
          <![CDATA[<210>  411]]>
          <![CDATA[<400>  411]]>
          000
          <![CDATA[<210>  412]]>
          <![CDATA[<400>  412]]>
          000
          <![CDATA[<210>  413]]>
          <![CDATA[<400>  413]]>
          000
          <![CDATA[<210>  414]]>
          <![CDATA[<400>  414]]>
          000
          <![CDATA[<210>  415]]>
          <![CDATA[<400>  415]]>
          000
          <![CDATA[<210>  416]]>
          <![CDATA[<400>  416]]>
          000
          <![CDATA[<210>  417]]>
          <![CDATA[<400>  417]]>
          000
          <![CDATA[<210>  418]]>
          <![CDATA[<400>  418]]>
          000
          <![CDATA[<210>  419]]>
          <![CDATA[<400>  419]]>
          000
          <![CDATA[<210>  420]]>
          <![CDATA[<400>  420]]>
          000
          <![CDATA[<210>  421]]>
          <![CDATA[<400>  421]]>
          000
          <![CDATA[<210>  422]]>
          <![CDATA[<400>  422]]>
          000
          <![CDATA[<210>  423]]>
          <![CDATA[<400>  423]]>
          000
          <![CDATA[<210>  424]]>
          <![CDATA[<400>  424]]>
          000
          <![CDATA[<210>  425]]>
          <![CDATA[<400>  425]]>
          000
          <![CDATA[<210>  426]]>
          <![CDATA[<400>  426]]>
          000
          <![CDATA[<210>  427]]>
          <![CDATA[<400>  427]]>
          000
          <![CDATA[<210>  428]]>
          <![CDATA[<400>  428]]>
          000
          <![CDATA[<210>  429]]>
          <![CDATA[<400>  429]]>
          000
          <![CDATA[<210>  430]]>
          <![CDATA[<400>  430]]>
          000
          <![CDATA[<210>  431]]>
          <![CDATA[<400>  431]]>
          000
          <![CDATA[<210>  432]]>
          <![CDATA[<400>  432]]>
          000
          <![CDATA[<210>  433]]>
          <![CDATA[<400>  433]]>
          000
          <![CDATA[<210>  434]]>
          <![CDATA[<400>  434]]>
          000
          <![CDATA[<210>  435]]>
          <![CDATA[<400>  435]]>
          000
          <![CDATA[<210>  436]]>
          <![CDATA[<400>  436]]>
          000
          <![CDATA[<210>  437]]>
          <![CDATA[<400>  437]]>
          000
          <![CDATA[<210>  438]]>
          <![CDATA[<400>  438]]>
          000
          <![CDATA[<210>  439]]>
          <![CDATA[<400>  439]]>
          000
          <![CDATA[<210>  440]]>
          <![CDATA[<400>  440]]>
          000
          <![CDATA[<210>  441]]>
          <![CDATA[<400>  441]]>
          000
          <![CDATA[<210>  442]]>
          <![CDATA[<400>  442]]>
          000
          <![CDATA[<210>  443]]>
          <![CDATA[<400>  443]]>
          000
          <![CDATA[<210>  444]]>
          <![CDATA[<400>  444]]>
          000
          <![CDATA[<210>  445]]>
          <![CDATA[<400>  445]]>
          000
          <![CDATA[<210>  446]]>
          <![CDATA[<400>  446]]>
          000
          <![CDATA[<210>  447]]>
          <![CDATA[<400>  447]]>
          000
          <![CDATA[<210>  448]]>
          <![CDATA[<400>  448]]>
          000
          <![CDATA[<210>  449]]>
          <![CDATA[<400>  449]]>
          000
          <![CDATA[<210>  450]]>
          <![CDATA[<400>  450]]>
          000
          <![CDATA[<210>  451]]>
          <![CDATA[<400>  451]]>
          000
          <![CDATA[<210>  452]]>
          <![CDATA[<400>  452]]>
          000
          <![CDATA[<210>  453]]>
          <![CDATA[<400>  453]]>
          000
          <![CDATA[<210>  454]]>
          <![CDATA[<400>  454]]>
          000
          <![CDATA[<210>  455]]>
          <![CDATA[<400>  455]]>
          000
          <![CDATA[<210>  456]]>
          <![CDATA[<400>  456]]>
          000
          <![CDATA[<210>  457]]>
          <![CDATA[<400>  457]]>
          000
          <![CDATA[<210>  458]]>
          <![CDATA[<400>  458]]>
          000
          <![CDATA[<210>  459]]>
          <![CDATA[<400>  459]]>
          000
          <![CDATA[<210>  460]]>
          <![CDATA[<400>  460]]>
          000
          <![CDATA[<210>  461]]>
          <![CDATA[<400>  461]]>
          000
          <![CDATA[<210>  462]]>
          <![CDATA[<400>  462]]>
          000
          <![CDATA[<210>  463]]>
          <![CDATA[<400>  463]]>
          000
          <![CDATA[<210>  464]]>
          <![CDATA[<400>  464]]>
          000
          <![CDATA[<210>  465]]>
          <![CDATA[<400>  465]]>
          000
          <![CDATA[<210>  466]]>
          <![CDATA[<400>  466]]>
          000
          <![CDATA[<210>  467]]>
          <![CDATA[<400>  467]]>
          000
          <![CDATA[<210>  468]]>
          <![CDATA[<400>  468]]>
          000
          <![CDATA[<210>  469]]>
          <![CDATA[<400>  469]]>
          000
          <![CDATA[<210>  470]]>
          <![CDATA[<400>  470]]>
          000
          <![CDATA[<210>  471]]>
          <![CDATA[<400>  471]]>
          000
          <![CDATA[<210>  472]]>
          <![CDATA[<400>  472]]>
          000
          <![CDATA[<210>  473]]>
          <![CDATA[<400>  473]]>
          000
          <![CDATA[<210>  474]]>
          <![CDATA[<400>  474]]>
          000
          <![CDATA[<210>  475]]>
          <![CDATA[<400>  475]]>
          000
          <![CDATA[<210>  476]]>
          <![CDATA[<400>  476]]>
          000
          <![CDATA[<210>  477]]>
          <![CDATA[<400>  477]]>
          000
          <![CDATA[<210>  478]]>
          <![CDATA[<400>  478]]>
          000
          <![CDATA[<210>  479]]>
          <![CDATA[<400>  479]]>
          000
          <![CDATA[<210>  480]]>
          <![CDATA[<400>  480]]>
          000
          <![CDATA[<210>  481]]>
          <![CDATA[<400>  481]]>
          000
          <![CDATA[<210>  482]]>
          <![CDATA[<400>  482]]>
          000
          <![CDATA[<210>  483]]>
          <![CDATA[<400>  483]]>
          000
          <![CDATA[<210>  484]]>
          <![CDATA[<400>  484]]>
          000
          <![CDATA[<210>  485]]>
          <![CDATA[<400>  485]]>
          000
          <![CDATA[<210>  486]]>
          <![CDATA[<400>  486]]>
          000
          <![CDATA[<210>  487]]>
          <![CDATA[<400>  487]]>
          000
          <![CDATA[<210>  488]]>
          <![CDATA[<400>  488]]>
          000
          <![CDATA[<210>  489]]>
          <![CDATA[<400>  489]]>
          000
          <![CDATA[<210>  490]]>
          <![CDATA[<400>  490]]>
          000
          <![CDATA[<210>  491]]>
          <![CDATA[<400>  491]]>
          000
          <![CDATA[<210>  492]]>
          <![CDATA[<400>  492]]>
          000
          <![CDATA[<210>  493]]>
          <![CDATA[<400>  493]]>
          000
          <![CDATA[<210>  494]]>
          <![CDATA[<400>  494]]>
          000
          <![CDATA[<210>  495]]>
          <![CDATA[<400>  495]]>
          000
          <![CDATA[<210>  496]]>
          <![CDATA[<400>  496]]>
          000
          <![CDATA[<210>  497]]>
          <![CDATA[<400>  497]]>
          000
          <![CDATA[<210>  498]]>
          <![CDATA[<400>  498]]>
          000
          <![CDATA[<210>  499]]>
          <![CDATA[<400>  499]]>
          000
          <![CDATA[<210>  500]]>
          <![CDATA[<211>  86]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  500]]>
          gtttaagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctactt aaacaaggca aaatgccgtg       60
          tttatctcgt caacttgttg gcgaga                                            86
          <![CDATA[<210>  501]]>
          <![CDATA[<400>  501]]>
          000
          <![CDATA[<210>  502]]>
          <![CDATA[<400>  502]]>
          000
          <![CDATA[<210>  503]]>
          <![CDATA[<400>  503]]>
          000
          <![CDATA[<210>  504]]>
          <![CDATA[<400>  504]]>
          000
          <![CDATA[<210>  505]]>
          <![CDATA[<400>  505]]>
          000
          <![CDATA[<210>  506]]>
          <![CDATA[<400>  506]]>
          000
          <![CDATA[<210>  507]]>
          <![CDATA[<400>  507]]>
          000
          <![CDATA[<210>  508]]>
          <![CDATA[<400>  508]]>
          000
          <![CDATA[<210>  509]]>
          <![CDATA[<400>  509]]>
          000
          <![CDATA[<210>  510]]>
          <![CDATA[<400>  510]]>
          000
          <![CDATA[<210>  511]]>
          <![CDATA[<400>  511]]>
          000
          <![CDATA[<210>  512]]>
          <![CDATA[<400>  512]]>
          000
          <![CDATA[<210>  513]]>
          <![CDATA[<400>  513]]>
          000
          <![CDATA[<210>  514]]>
          <![CDATA[<400>  514]]>
          000
          <![CDATA[<210>  515]]>
          <![CDATA[<400>  515]]>
          000
          <![CDATA[<210>  516]]>
          <![CDATA[<400>  516]]>
          000
          <![CDATA[<210>  517]]>
          <![CDATA[<400>  517]]>
          000
          <![CDATA[<210>  518]]>
          <![CDATA[<400>  518]]>
          000
          <![CDATA[<210>  519]]>
          <![CDATA[<400>  519]]>
          000
          <![CDATA[<210>  520]]>
          <![CDATA[<400>  520]]>
          000
          <![CDATA[<210>  521]]>
          <![CDATA[<400>  521]]>
          000
          <![CDATA[<210>  522]]>
          <![CDATA[<400>  522]]>
          000
          <![CDATA[<210>  523]]>
          <![CDATA[<400>  523]]>
          000
          <![CDATA[<210>  524]]>
          <![CDATA[<400>  524]]>
          000
          <![CDATA[<210>  525]]>
          <![CDATA[<400>  525]]>
          000
          <![CDATA[<210>  526]]>
          <![CDATA[<400>  526]]>
          000
          <![CDATA[<210>  527]]>
          <![CDATA[<400>  527]]>
          000
          <![CDATA[<210>  528]]>
          <![CDATA[<400>  528]]>
          000
          <![CDATA[<210>  529]]>
          <![CDATA[<400>  529]]>
          000
          <![CDATA[<210>  530]]>
          <![CDATA[<400>  530]]>
          000
          <![CDATA[<210>  531]]>
          <![CDATA[<400>  531]]>
          000
          <![CDATA[<210>  532]]>
          <![CDATA[<400>  532]]>
          000
          <![CDATA[<210>  533]]>
          <![CDATA[<400>  533]]>
          000
          <![CDATA[<210>  534]]>
          <![CDATA[<400>  534]]>
          000
          <![CDATA[<210>  535]]>
          <![CDATA[<400>  535]]>
          000
          <![CDATA[<210>  536]]>
          <![CDATA[<400>  536]]>
          000
          <![CDATA[<210>  537]]>
          <![CDATA[<400>  537]]>
          000
          <![CDATA[<210>  538]]>
          <![CDATA[<400>  538]]>
          000
          <![CDATA[<210>  539]]>
          <![CDATA[<400>  539]]>
          000
          <![CDATA[<210>  540]]>
          <![CDATA[<400>  540]]>
          000
          <![CDATA[<210>  541]]>
          <![CDATA[<400>  541]]>
          000
          <![CDATA[<210>  542]]>
          <![CDATA[<400>  542]]>
          000
          <![CDATA[<210>  543]]>
          <![CDATA[<400>  543]]>
          000
          <![CDATA[<210>  544]]>
          <![CDATA[<400>  544]]>
          000
          <![CDATA[<210>  545]]>
          <![CDATA[<400>  545]]>
          000
          <![CDATA[<210>  546]]>
          <![CDATA[<400>  546]]>
          000
          <![CDATA[<210>  547]]>
          <![CDATA[<400>  547]]>
          000
          <![CDATA[<210>  548]]>
          <![CDATA[<400>  548]]>
          000
          <![CDATA[<210>  549]]>
          <![CDATA[<400>  549]]>
          000
          <![CDATA[<210>  550]]>
          <![CDATA[<400>  550]]>
          000
          <![CDATA[<210>  551]]>
          <![CDATA[<400>  551]]>
          000
          <![CDATA[<210>  552]]>
          <![CDATA[<400>  552]]>
          000
          <![CDATA[<210>  553]]>
          <![CDATA[<400>  553]]>
          000
          <![CDATA[<210>  554]]>
          <![CDATA[<400>  554]]>
          000
          <![CDATA[<210>  555]]>
          <![CDATA[<400>  555]]>
          000
          <![CDATA[<210>  556]]>
          <![CDATA[<400>  556]]>
          000
          <![CDATA[<210>  557]]>
          <![CDATA[<400>  557]]>
          000
          <![CDATA[<210>  558]]>
          <![CDATA[<400>  558]]>
          000
          <![CDATA[<210>  559]]>
          <![CDATA[<400>  559]]>
          000
          <![CDATA[<210>  560]]>
          <![CDATA[<400>  560]]>
          000
          <![CDATA[<210>  561]]>
          <![CDATA[<400>  561]]>
          000
          <![CDATA[<210>  562]]>
          <![CDATA[<400>  562]]>
          000
          <![CDATA[<210>  563]]>
          <![CDATA[<400>  563]]>
          000
          <![CDATA[<210>  564]]>
          <![CDATA[<400>  564]]>
          000
          <![CDATA[<210>  565]]>
          <![CDATA[<400>  565]]>
          000
          <![CDATA[<210>  566]]>
          <![CDATA[<400>  566]]>
          000
          <![CDATA[<210>  567]]>
          <![CDATA[<400>  567]]>
          000
          <![CDATA[<210>  568]]>
          <![CDATA[<400>  568]]>
          000
          <![CDATA[<210>  569]]>
          <![CDATA[<400>  569]]>
          000
          <![CDATA[<210>  570]]>
          <![CDATA[<400>  570]]>
          000
          <![CDATA[<210>  571]]>
          <![CDATA[<400>  571]]>
          000
          <![CDATA[<210>  572]]>
          <![CDATA[<400>  572]]>
          000
          <![CDATA[<210>  573]]>
          <![CDATA[<400>  573]]>
          000
          <![CDATA[<210>  574]]>
          <![CDATA[<400>  574]]>
          000
          <![CDATA[<210>  575]]>
          <![CDATA[<400>  575]]>
          000
          <![CDATA[<210>  576]]>
          <![CDATA[<400>  576]]>
          000
          <![CDATA[<210>  577]]>
          <![CDATA[<400>  577]]>
          000
          <![CDATA[<210>  578]]>
          <![CDATA[<400>  578]]>
          000
          <![CDATA[<210>  579]]>
          <![CDATA[<400>  579]]>
          000
          <![CDATA[<210>  580]]>
          <![CDATA[<400>  580]]>
          000
          <![CDATA[<210>  581]]>
          <![CDATA[<400>  581]]>
          000
          <![CDATA[<210>  582]]>
          <![CDATA[<400>  582]]>
          000
          <![CDATA[<210>  583]]>
          <![CDATA[<400>  583]]>
          000
          <![CDATA[<210>  584]]>
          <![CDATA[<400>  584]]>
          000
          <![CDATA[<210>  585]]>
          <![CDATA[<400>  585]]>
          000
          <![CDATA[<210>  586]]>
          <![CDATA[<400>  586]]>
          000
          <![CDATA[<210>  587]]>
          <![CDATA[<400>  587]]>
          000
          <![CDATA[<210>  588]]>
          <![CDATA[<400>  588]]>
          000
          <![CDATA[<210>  589]]>
          <![CDATA[<400>  589]]>
          000
          <![CDATA[<210>  590]]>
          <![CDATA[<400>  590]]>
          000
          <![CDATA[<210>  591]]>
          <![CDATA[<400>  591]]>
          000
          <![CDATA[<210>  592]]>
          <![CDATA[<400>  592]]>
          000
          <![CDATA[<210>  593]]>
          <![CDATA[<400>  593]]>
          000
          <![CDATA[<210>  594]]>
          <![CDATA[<400>  594]]>
          000
          <![CDATA[<210>  595]]>
          <![CDATA[<400>  595]]>
          000
          <![CDATA[<210>  596]]>
          <![CDATA[<400>  596]]>
          000
          <![CDATA[<210>  597]]>
          <![CDATA[<400>  597]]>
          000
          <![CDATA[<210>  598]]>
          <![CDATA[<400>  598]]>
          000
          <![CDATA[<210>  599]]>
          <![CDATA[<400>  599]]>
          000
          <![CDATA[<210>  600]]>
          <![CDATA[<400>  600]]>
          000
          <![CDATA[<210>  601]]>
          <![CDATA[<400>  601]]>
          000
          <![CDATA[<210>  602]]>
          <![CDATA[<400>  602]]>
          000
          <![CDATA[<210>  603]]>
          <![CDATA[<400>  603]]>
          000
          <![CDATA[<210>  604]]>
          <![CDATA[<400>  604]]>
          000
          <![CDATA[<210>  605]]>
          <![CDATA[<400>  605]]>
          000
          <![CDATA[<210>  606]]>
          <![CDATA[<400>  606]]>
          000
          <![CDATA[<210>  607]]>
          <![CDATA[<400>  607]]>
          000
          <![CDATA[<210>  608]]>
          <![CDATA[<400>  608]]>
          000
          <![CDATA[<210>  609]]>
          <![CDATA[<400>  609]]>
          000
          <![CDATA[<210>  610]]>
          <![CDATA[<400>  610]]>
          000
          <![CDATA[<210>  611]]>
          <![CDATA[<400>  611]]>
          000
          <![CDATA[<210>  612]]>
          <![CDATA[<400>  612]]>
          000
          <![CDATA[<210>  613]]>
          <![CDATA[<400>  613]]>
          000
          <![CDATA[<210>  614]]>
          <![CDATA[<400>  614]]>
          000
          <![CDATA[<210>  615]]>
          <![CDATA[<400>  615]]>
          000
          <![CDATA[<210>  616]]>
          <![CDATA[<400>  616]]>
          000
          <![CDATA[<210>  617]]>
          <![CDATA[<400>  617]]>
          000
          <![CDATA[<210>  618]]>
          <![CDATA[<400>  618]]>
          000
          <![CDATA[<210>  619]]>
          <![CDATA[<400>  619]]>
          000
          <![CDATA[<210>  620]]>
          <![CDATA[<400>  620]]>
          000
          <![CDATA[<210>  621]]>
          <![CDATA[<400>  621]]>
          000
          <![CDATA[<210>  622]]>
          <![CDATA[<400>  622]]>
          000
          <![CDATA[<210>  623]]>
          <![CDATA[<400>  623]]>
          000
          <![CDATA[<210>  624]]>
          <![CDATA[<400>  624]]>
          000
          <![CDATA[<210>  625]]>
          <![CDATA[<400>  625]]>
          000
          <![CDATA[<210>  626]]>
          <![CDATA[<400>  626]]>
          000
          <![CDATA[<210>  627]]>
          <![CDATA[<400>  627]]>
          000
          <![CDATA[<210>  628]]>
          <![CDATA[<400>  628]]>
          000
          <![CDATA[<210>  629]]>
          <![CDATA[<400>  629]]>
          000
          <![CDATA[<210>  630]]>
          <![CDATA[<400>  630]]>
          000
          <![CDATA[<210>  631]]>
          <![CDATA[<400>  631]]>
          000
          <![CDATA[<210>  632]]>
          <![CDATA[<400>  632]]>
          000
          <![CDATA[<210>  633]]>
          <![CDATA[<400>  633]]>
          000
          <![CDATA[<210>  634]]>
          <![CDATA[<400>  634]]>
          000
          <![CDATA[<210>  635]]>
          <![CDATA[<400>  635]]>
          000
          <![CDATA[<210>  636]]>
          <![CDATA[<400>  636]]>
          000
          <![CDATA[<210>  637]]>
          <![CDATA[<400>  637]]>
          000
          <![CDATA[<210>  638]]>
          <![CDATA[<400>  638]]>
          000
          <![CDATA[<210>  639]]>
          <![CDATA[<400>  639]]>
          000
          <![CDATA[<210>  640]]>
          <![CDATA[<400>  640]]>
          000
          <![CDATA[<210>  641]]>
          <![CDATA[<400>  641]]>
          000
          <![CDATA[<210>  642]]>
          <![CDATA[<400>  642]]>
          000
          <![CDATA[<210>  643]]>
          <![CDATA[<400>  643]]>
          000
          <![CDATA[<210>  644]]>
          <![CDATA[<400>  644]]>
          000
          <![CDATA[<210>  645]]>
          <![CDATA[<400>  645]]>
          000
          <![CDATA[<210>  646]]>
          <![CDATA[<400>  646]]>
          000
          <![CDATA[<210>  647]]>
          <![CDATA[<400>  647]]>
          000
          <![CDATA[<210>  648]]>
          <![CDATA[<400>  648]]>
          000
          <![CDATA[<210>  649]]>
          <![CDATA[<400>  649]]>
          000
          <![CDATA[<210>  650]]>
          <![CDATA[<400>  650]]>
          000
          <![CDATA[<210>  651]]>
          <![CDATA[<400>  651]]>
          000
          <![CDATA[<210>  652]]>
          <![CDATA[<400>  652]]>
          000
          <![CDATA[<210>  653]]>
          <![CDATA[<400>  653]]>
          000
          <![CDATA[<210>  654]]>
          <![CDATA[<400>  654]]>
          000
          <![CDATA[<210>  655]]>
          <![CDATA[<400>  655]]>
          000
          <![CDATA[<210>  656]]>
          <![CDATA[<400>  656]]>
          000
          <![CDATA[<210>  657]]>
          <![CDATA[<400>  657]]>
          000
          <![CDATA[<210>  658]]>
          <![CDATA[<400>  658]]>
          000
          <![CDATA[<210>  659]]>
          <![CDATA[<400>  659]]>
          000
          <![CDATA[<210>  660]]>
          <![CDATA[<400>  660]]>
          000
          <![CDATA[<210>  661]]>
          <![CDATA[<400>  661]]>
          000
          <![CDATA[<210>  662]]>
          <![CDATA[<400>  662]]>
          000
          <![CDATA[<210>  663]]>
          <![CDATA[<400>  663]]>
          000
          <![CDATA[<210>  664]]>
          <![CDATA[<400>  664]]>
          000
          <![CDATA[<210>  665]]>
          <![CDATA[<400>  665]]>
          000
          <![CDATA[<210>  666]]>
          <![CDATA[<400>  666]]>
          000
          <![CDATA[<210>  667]]>
          <![CDATA[<400>  667]]>
          000
          <![CDATA[<210>  668]]>
          <![CDATA[<400>  668]]>
          000
          <![CDATA[<210>  669]]>
          <![CDATA[<400>  669]]>
          000
          <![CDATA[<210>  670]]>
          <![CDATA[<400>  670]]>
          000
          <![CDATA[<210>  671]]>
          <![CDATA[<400>  671]]>
          000
          <![CDATA[<210>  672]]>
          <![CDATA[<400>  672]]>
          000
          <![CDATA[<210>  673]]>
          <![CDATA[<400>  673]]>
          000
          <![CDATA[<210>  674]]>
          <![CDATA[<400>  674]]>
          000
          <![CDATA[<210>  675]]>
          <![CDATA[<400>  675]]>
          000
          <![CDATA[<210>  676]]>
          <![CDATA[<400>  676]]>
          000
          <![CDATA[<210>  677]]>
          <![CDATA[<400>  677]]>
          000
          <![CDATA[<210>  678]]>
          <![CDATA[<400>  678]]>
          000
          <![CDATA[<210>  679]]>
          <![CDATA[<400>  679]]>
          000
          <![CDATA[<210>  680]]>
          <![CDATA[<400>  680]]>
          000
          <![CDATA[<210>  681]]>
          <![CDATA[<400>  681]]>
          000
          <![CDATA[<210>  682]]>
          <![CDATA[<400>  682]]>
          000
          <![CDATA[<210>  683]]>
          <![CDATA[<400>  683]]>
          000
          <![CDATA[<210>  684]]>
          <![CDATA[<400>  684]]>
          000
          <![CDATA[<210>  685]]>
          <![CDATA[<400>  685]]>
          000
          <![CDATA[<210>  686]]>
          <![CDATA[<400>  686]]>
          000
          <![CDATA[<210>  687]]>
          <![CDATA[<400>  687]]>
          000
          <![CDATA[<210>  688]]>
          <![CDATA[<400>  688]]>
          000
          <![CDATA[<210>  689]]>
          <![CDATA[<400>  689]]>
          000
          <![CDATA[<210>  690]]>
          <![CDATA[<400>  690]]>
          000
          <![CDATA[<210>  691]]>
          <![CDATA[<400>  691]]>
          000
          <![CDATA[<210>  692]]>
          <![CDATA[<400>  692]]>
          000
          <![CDATA[<210>  693]]>
          <![CDATA[<400>  693]]>
          000
          <![CDATA[<210>  694]]>
          <![CDATA[<400>  694]]>
          000
          <![CDATA[<210>  695]]>
          <![CDATA[<400>  695]]>
          000
          <![CDATA[<210>  696]]>
          <![CDATA[<400>  696]]>
          000
          <![CDATA[<210>  697]]>
          <![CDATA[<400>  697]]>
          000
          <![CDATA[<210>  698]]>
          <![CDATA[<400>  698]]>
          000
          <![CDATA[<210>  699]]>
          <![CDATA[<400>  699]]>
          000
          <![CDATA[<210>  700]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  700]]>
          ctagactagc atgctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt       60
          tataattaac ccagacatgt ggctgccccc ccccccccaa cacctgctgc ctctaaaaat      120
          aaccctgcat gccatgttcc cggcgaaggg ccagctgtcc cccgccagct agactcagca      180
          cttagtttag gaaccagtga gcaagtcagc ccttggggca gcccatacaa ggccatgggg      240
          ctgggcaagc tgcacgcctg ggtccggggt gggcacggtg cccgggcaac gagctgaaag      300
          ctcatctgct ctcaggggcc cctccctggg gacagcccct cctggctagt cacaccctgt      360
          aggctcctct atataaccca ggggcacagg ggctgccctc attctaccac cacctccaca      420
          gcacagacag acactcagga gccagccagc                                       450
          <![CDATA[<210>  701]]>
          <![CDATA[<211>  436]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  701]]>
          tgcccatgta aggaggcaag gcctggggac acccgagatg cctggttata attaacccag       60
          acatgtggct gccccccccc ccccaacacc tgctgcctct aaaaataacc ctgcatgcca      120
          tgttcccggc gaagggccag ctgtcccccg ccagctagac tcagcactta gtttaggaac      180
          cagtgagcaa gtcagccctt ggggcagccc atacaaggcc atggggctgg gcaagctgca      240
          cgcctgggtc cggggtgggc acggtgcccg ggcaacgagc tgaaagctca tctgctctca      300
          ggggcccctc cctggggaca gcccctcctg gctagtcaca ccctgtaggc tcctctatat      360
          aacccagggg cacaggggct gccctcattc taccaccacc tccacagcac agacagacac      420
          tcaggagcca gccagc                                                      436
          <![CDATA[<210>  702]]>
          <![CDATA[<211>  472]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  702]]>
          cgagtccaac acccgtggga atcccatggg caccatggcc cctcgctcca aaaatgcttt       60
          cgcgtcgcgc agacactgct cggtagtttc ggggatcagc gtttgagtaa gagcccgcgt      120
          ctgaaccctc cgcgccgccc cggccccagt ggaaagacgc gcaggcaaaa cgcaccacgt      180
          gacggagcgt gaccgcgcgc cgagcgcgcg ccaaggtcgg gcaggaagag ggcctatttc      240
          ccatgattcc ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata attagaatta      300
          atttgactgt aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc      360
          ttgggtagtt tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa      420
          cttgaaagta tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aa              472
          <![CDATA[<210>  703]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  703]]>
          gctcggcgcg cccatatttg catgtcgcta tgtgttctgg gaaatcacca taaacgtgaa       60
          atgtctttgg atttgggaat cttataagtt ctgtatgaga ccacggta                   108
          <![CDATA[<210>  704]]>
          <![CDATA[<211>  251]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  704]]>
          tgacggcgcg ccctgcagta tttagcatgc cccacccatc tgcaaggcat tctggatagt       60
          gtcaaaacag ccggaaatca agtccgttta tctcaaactt tagcattttg ggaataaatg      120
          atatttgcta tgctggttaa attagatttt agttaaattt cctgctgaag ctctagtacg      180
          ataagtaact tgacctaagt gtaaagttga gatttccttc aggtttatat agcttgtgcg      240
          ccgcctgggt a                                                           251
          <![CDATA[<210>  705]]>
          <![CDATA[<211>  249]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  705]]>
          gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag       60
          ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga      120
          aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat      180
          atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga      240
          cgaaacacc                                                              249
          <![CDATA[<210>  706]]>
          <![CDATA[<211>  243]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  706]]>
          ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt caaaacagcc       60
          ggaaatcaag tccgtttatc tcaaacttta gcattttggg aataaatgat atttgctatg      120
          ctggttaaat tagattttag ttaaatttcc tgctgaagct ctagtacgat aagcaacttg      180
          acctaagtgt aaagttgaga cttccttcag gtttatatag cttgtgcgcc gcttgggtac      240
          ctc                                                                    243
          <![CDATA[<210>  707]]>
          <![CDATA[<211>  100]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  707]]>
          aatatttgca tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat gtctttggat       60
          ttgggaatct tataagttct gtatgagacc actctttccc                            100
          <![CDATA[<210>  708]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  708]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Asp Arg Val Lys His Leu Leu Ala Glu Tyr Asp Leu Leu Asp Leu Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ile Pro Lys Ser Thr Asn Pro Tyr Gln Thr Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Glu Lys Leu Ser Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His Ile 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Lys Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Glu Gly Asn Ile Lys Lys Trp Phe Glu Gln Met Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ser Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Glu Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile 
                      260                 265                 270         
          Thr Arg Asp Glu Asp Ala Lys Leu Asn Tyr Gly Glu Lys Phe Gln Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Thr Pro Asn Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Ile Glu Ile Gly Val His Glu Thr Glu Ile Lys Gly Tyr Arg Val 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Ser Ile Val Phe Asp Lys Ser Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile 
                      340                 345                 350         
          Leu Asp Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Glu Gln Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Lys Glu Glu Leu Asn Lys Leu Pro Glu Ile Leu Asn Glu Gln Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Ala Glu Ile Ala Lys Leu Ile Gly Tyr Asn Gly Thr His Arg Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Ile His Leu Ile Asn Glu Glu Leu Trp Gln Thr Ser 
                          405                 410                 415     
          Arg Asn Gln Met Glu Ile Phe Asn Tyr Leu Asn Ile Lys Pro Asn Lys 
                      420                 425                 430         
          Val Asp Leu Ser Glu Gln Asn Lys Ile Pro Lys Asp Met Val Asn Asp 
                  435                 440                 445             
          Phe Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Lys 
              530                 535                 540                 
          Asp Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asn Tyr Asp Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asp Ser Met His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Arg Arg Glu Gln Asn Ala Lys Lys Asn Asn Gln Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Leu Thr Ser Gly Tyr Ala Asp Ile Lys Tyr Ser Val 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Val Leu Asn Leu Ala Glu Asn Lys Asp Arg Met Thr 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Arg Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asn Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Glu Ile Glu Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn 
                      740                 745                 750         
          Tyr Ser Glu Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp 
                  755                 760                 765             
          Phe Arg Asn Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Thr Tyr Ile Val Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Thr Leu Lys Lys Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln His Asp Pro Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ala Asn Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Ser Leu Lys Tyr Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          His Gln Phe Lys Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Pro Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ser Tyr Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Glu Gln Lys Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys 
          945                 950                 955                 960 
          Asn Ala Lys Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asp Gly Glu Ile Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Met Ile Glu Leu Asp Leu Pro Asp  Ile Arg Tyr Lys Glu  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Leu Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Val Asn Ser Ile Glu  Lys Leu Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Val  Phe Thr Asn Thr Gln  Tyr Thr Lys Pro Gln  Leu Leu Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Asn 
              1055         
          <![CDATA[<210>  709]]>
          <![CDATA[<211>  143]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  709]]>
          ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg       60
          acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc      120
          caactccatc actaggggtt cct                                              143
          <![CDATA[<210>  710]]>
          <![CDATA[<211>  137]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  710]]>
          aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg       60
          ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc      120
          gagcgcgcag agaggga                                                     137
          <![CDATA[<210>  711]]>
          <![CDATA[<211>  1052]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  711]]>
          Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr Gly 
                  115                 120                 125             
          Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr Val 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln Leu 
                      180                 185                 190         
          Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg Arg 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys Asp 
              210                 215                 220                 
          Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr Asn 
                          245                 250                 255     
          Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn Glu 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe Lys 
                  275                 280                 285             
          Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Val 
              290                 295                 300                 
          Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr Ala 
                          325                 330                 335     
          Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala Lys 
                      340                 345                 350         
          Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser Asn 
              370                 375                 380                 
          Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala Ile 
                          405                 410                 415     
          Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln Gln 
                      420                 425                 430         
          Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val 
                  435                 440                 445             
          Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile Ile 
              450                 455                 460                 
          Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys Arg 
                          485                 490                 495     
          Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr Gly 
                      500                 505                 510         
          Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp Met 
                  515                 520                 525             
          Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu Asp 
              530                 535                 540                 
          Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys Gln 
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu Ser 
                      580                 585                 590         
          Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile Leu 
                  595                 600                 605             
          Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu Tyr 
              610                 615                 620                 
          Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu Met 
                          645                 650                 655     
          Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp Lys 
                  675                 680                 685             
          Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp Ala 
              690                 695                 700                 
          Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys Leu 
          705                 710                 715                 720 
          Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys Gln 
                          725                 730                 735     
          Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu Ile 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp Tyr 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu Ile 
          785                 790                 795                 800 
          Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu Lys 
                          805                 810                 815     
          Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His Asp 
                      820                 825                 830         
          Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly Asp 
                  835                 840                 845             
          Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr Leu 
              850                 855                 860                 
          Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp Tyr 
                          885                 890                 895     
          Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr Arg 
                      900                 905                 910         
          Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val Lys 
                  915                 920                 925             
          Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser Lys 
              930                 935                 940                 
          Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala Glu 
          945                 950                 955                 960 
          Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly Glu 
                          965                 970                 975     
          Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile Glu 
                      980                 985                 990         
          Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr  Arg Glu Tyr Leu Glu  Asn Met Asn 
                  995                 1000                 1005             
          Asp Lys  Arg Pro Pro Arg Ile  Ile Lys Thr Ile Ala  Ser Lys Thr 
              1010                 1015                 1020             
          Gln Ser  Ile Lys Lys Tyr Ser  Thr Asp Ile Leu Gly  Asn Leu Tyr 
              1025                 1030                 1035             
          Glu Val  Lys Ser Lys Lys His  Pro Gln Ile Ile Lys  Lys Gly 
              1040                 1045                 1050         
          <![CDATA[<210>  712]]>
          <![CDATA[<211>  1053]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  712]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Ser Leu Leu Ser Glu Tyr Lys Ile Ile Ser Gly Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Pro Thr Asn Asn Gln Pro Tyr Asn Ile Arg Val Lys Gly Leu Thr 
                          85                  90                  95      
          Glu Gln Leu Thr Lys Asp Glu Leu Ala Val Ala Leu Leu His Ile Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Ile His Lys Ile Asp Val Ile Asp Ser Asn Asp Asp 
                  115                 120                 125             
          Val Gly Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Leu Asn Lys Asn Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Lys Asp Lys Phe Val Cys Gln Ile Gln Leu Glu Arg Met Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Gly Gln Val Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Ala Asp Ile 
                          165                 170                 175     
          Ile Lys Glu Ile Ile Gln Leu Leu Asn Val Gln Lys Asn Phe His Gln 
                      180                 185                 190         
          Leu Asp Glu Asn Phe Ile Asn Lys Tyr Ile Glu Leu Val Glu Met Arg 
                  195                 200                 205             
          Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro Phe Gly Trp Asn 
              210                 215                 220                 
          Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Asp Leu 
                          245                 250                 255     
          Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile Gln Arg Asp Asn 
                      260                 265                 270         
          Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu Asn Val 
                  275                 280                 285             
          Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile 
              290                 295                 300                 
          Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys Ser Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Pro Glu Phe Thr Glu Phe Lys Leu Tyr His Asp Leu Lys Ser Val 
                          325                 330                 335     
          Leu Phe Asp Gln Ser Ile Leu Glu Asn Glu Asp Val Leu Asp Gln Ile 
                      340                 345                 350         
          Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser Ile Lys Ser Lys 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Glu Leu Asp Ile Leu Leu Asn Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ile 
              370                 375                 380                 
          Ala Gln Leu Thr Gly Tyr Asn Gly Thr His Arg Leu Ser Leu Lys Cys 
          385                 390                 395                 400 
          Ile Arg Leu Val Leu Glu Glu Gln Trp Tyr Ser Ser Arg Asn Gln Met 
                          405                 410                 415     
          Glu Ile Phe Thr His Leu Asn Ile Lys Pro Lys Lys Ile Asn Leu Thr 
                      420                 425                 430         
          Ala Ala Asn Lys Ile Pro Lys Ala Met Ile Asp Glu Phe Ile Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn Val Ile Asn Lys 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala 
          465                 470                 475                 480 
          Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile Asn Asn Leu Gln 
                          485                 490                 495     
          Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu Ile Ile Gly Gln 
                      500                 505                 510         
          Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys Ile Arg Leu His 
                  515                 520                 525             
          Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile Ala Leu 
              530                 535                 540                 
          Met Asp Leu Leu Asn Asn Pro Gln Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Arg Ser Val Ala Phe Asp Asn Ser Ile His Asn Lys Val Leu Val 
                          565                 570                 575     
          Lys Gln Ile Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Tyr Gln Tyr 
                      580                 585                 590         
          Leu Asn Ser Ser Asp Ala Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys Gln His 
                  595                 600                 605             
          Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Lys Asp Arg Ile Ser Lys Lys Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Asp Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val Gln Lys 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Glu 
                          645                 650                 655     
          Leu Thr Ser Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Met Asp Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asn His Leu Arg Lys Val 
                  675                 680                 685             
          Trp Arg Phe Asp Lys Tyr Arg Asn His Gly Tyr Lys His His Ala Glu 
              690                 695                 700                 
          Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu Asn Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro Glu Ile Glu Thr 
                          725                 730                 735     
          Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn Tyr Ser Glu Met 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp Phe Arg Asn Phe 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Gln Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser Thr Tyr Ile Val 
          785                 790                 795                 800 
          Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Thr Leu Lys Lys 
                          805                 810                 815     
          Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln His Asp Pro 
                      820                 825                 830         
          Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala Asn Glu 
                  835                 840                 845             
          Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr Leu Thr 
              850                 855                 860                 
          Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Leu Lys Tyr 
          865                 870                 875                 880 
          Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr His Gln Phe Lys 
                          885                 890                 895     
          Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Pro Tyr Arg Phe 
                      900                 905                 910         
          Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile Thr Ile Ser Tyr 
                  915                 920                 925             
          Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile Pro Glu Gln Lys 
              930                 935                 940                 
          Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys Asn Ala Lys Phe 
          945                 950                 955                 960 
          Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Glu Ile 
                          965                 970                 975     
          Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn Met Ile Glu Leu 
                      980                 985                 990         
          Asp Leu Pro Asp Ile Arg Tyr Lys  Glu Tyr Cys Glu Leu  Asn Asn Ile 
                  995                 1000                 1005             
          Lys Gly  Glu Pro Arg Ile Lys  Lys Thr Ile Gly Lys  Lys Val Asn 
              1010                 1015                 1020             
          Ser Ile  Glu Lys Leu Thr Thr  Asp Val Leu Gly Asn  Val Phe Thr 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Thr  Gln Tyr Thr Lys Pro  Gln Leu Leu Phe Lys  Arg Gly Asn 
              1040                 1045                 1050             
          <![CDATA[<210>  713]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  713]]>
          Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  714]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  714]]>
          Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  715]]>
          <![CDATA[<211>  1052]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  715]]>
          Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr Gly 
                  115                 120                 125             
          Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr Val 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln Leu 
                      180                 185                 190         
          Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg Arg 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys Asp 
              210                 215                 220                 
          Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr Asn 
                          245                 250                 255     
          Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn Glu 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe Lys 
                  275                 280                 285             
          Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Val 
              290                 295                 300                 
          Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr Ala 
                          325                 330                 335     
          Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala Lys 
                      340                 345                 350         
          Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser Asn 
              370                 375                 380                 
          Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Asn Gln Ile Ala Ile 
                          405                 410                 415     
          Phe Asn Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln Gln 
                      420                 425                 430         
          Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val 
                  435                 440                 445             
          Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile Ile 
              450                 455                 460                 
          Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys Arg 
                          485                 490                 495     
          Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr Gly 
                      500                 505                 510         
          Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp Met 
                  515                 520                 525             
          Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu Asp 
              530                 535                 540                 
          Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys Gln 
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu Ser 
                      580                 585                 590         
          Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile Leu 
                  595                 600                 605             
          Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu Tyr 
              610                 615                 620                 
          Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg Gly Leu Met 
                          645                 650                 655     
          Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp Lys 
                  675                 680                 685             
          Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp Ala 
              690                 695                 700                 
          Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys Leu 
          705                 710                 715                 720 
          Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys Gln 
                          725                 730                 735     
          Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu Ile 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp Tyr 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Lys Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu Ile 
          785                 790                 795                 800 
          Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu Lys 
                          805                 810                 815     
          Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His Asp 
                      820                 825                 830         
          Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly Asp 
                  835                 840                 845             
          Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr Leu 
              850                 855                 860                 
          Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp Tyr 
                          885                 890                 895     
          Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr Arg 
                      900                 905                 910         
          Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val Lys 
                  915                 920                 925             
          Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser Lys 
              930                 935                 940                 
          Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala Glu 
          945                 950                 955                 960 
          Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly Glu 
                          965                 970                 975     
          Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile Glu 
                      980                 985                 990         
          Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr  Arg Glu Tyr Leu Glu  Asn Met Asn 
                  995                 1000                 1005             
          Asp Lys  Arg Pro Pro His Ile  Ile Lys Thr Ile Ala  Ser Lys Thr 
              1010                 1015                 1020             
          Gln Ser  Ile Lys Lys Tyr Ser  Thr Asp Ile Leu Gly  Asn Leu Tyr 
              1025                 1030                 1035             
          Glu Val  Lys Ser Lys Lys His  Pro Gln Ile Ile Lys  Lys Gly 
              1040                 1045                 1050         
          <![CDATA[<210>  716]]>
          <![CDATA[<211>  1052]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  716]]>
          Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr Gly 
                  115                 120                 125             
          Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr Val 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln Leu 
                      180                 185                 190         
          Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg Arg 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys Asp 
              210                 215                 220                 
          Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Glu Leu Ala Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr Asn 
                          245                 250                 255     
          Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn Glu 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe Lys 
                  275                 280                 285             
          Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Val 
              290                 295                 300                 
          Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr Ala 
                          325                 330                 335     
          Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala Lys 
                      340                 345                 350         
          Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser Asn 
              370                 375                 380                 
          Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ile 
                          405                 410                 415     
          Phe Ala Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln Gln 
                      420                 425                 430         
          Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val 
                  435                 440                 445             
          Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile Ile 
              450                 455                 460                 
          Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys Arg 
                          485                 490                 495     
          Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr Gly 
                      500                 505                 510         
          Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp Met 
                  515                 520                 525             
          Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu Asp 
              530                 535                 540                 
          Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys Gln 
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu Ser 
                      580                 585                 590         
          Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile Leu 
                  595                 600                 605             
          Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu Tyr 
              610                 615                 620                 
          Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Ala Gly Leu Met 
                          645                 650                 655     
          Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp Lys 
                  675                 680                 685             
          Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp Ala 
              690                 695                 700                 
          Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys Leu 
          705                 710                 715                 720 
          Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys Gln 
                          725                 730                 735     
          Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu Ile 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp Tyr 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Glu Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu Ile 
          785                 790                 795                 800 
          Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu Lys 
                          805                 810                 815     
          Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His Asp 
                      820                 825                 830         
          Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly Asp 
                  835                 840                 845             
          Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr Leu 
              850                 855                 860                 
          Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp Tyr 
                          885                 890                 895     
          Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr Arg 
                      900                 905                 910         
          Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val Lys 
                  915                 920                 925             
          Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser Lys 
              930                 935                 940                 
          Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala Glu 
          945                 950                 955                 960 
          Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Asn Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly Glu 
                          965                 970                 975     
          Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile Glu 
                      980                 985                 990         
          Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr  Arg Glu Tyr Leu Glu  Asn Met Asn 
                  995                 1000                 1005             
          Asp Lys  Arg Pro Pro Arg Ile  Ile Lys Thr Ile Ala  Ser Lys Thr 
              1010                 1015                 1020             
          Gln Ser  Ile Lys Lys Tyr Ser  Thr Asp Ile Leu Gly  Asn Leu Tyr 
              1025                 1030                 1035             
          Glu Val  Lys Ser Lys Lys His  Pro Gln Ile Ile Lys  Lys Gly 
              1040                 1045                 1050         
          <![CDATA[<210>  717]]>
          <![CDATA[<211>  1052]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  717]]>
          Lys Arg Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Ile Ile Asp Tyr Glu Thr Arg Asp Val Ile Asp Ala Gly Val 
                      20                  25                  30          
          Arg Leu Phe Lys Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg Ser 
                  35                  40                  45              
          Lys Arg Gly Ala Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Arg His Arg Ile Gln 
              50                  55                  60                  
          Arg Val Lys Lys Leu Leu Phe Asp Tyr Asn Leu Leu Thr Asp His Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Ser Gly Ile Asn Pro Tyr Glu Ala Arg Val Lys Gly Leu Ser 
                          85                  90                  95      
          Gln Lys Leu Ser Glu Glu Glu Phe Ser Ala Ala Leu Leu His Leu Ala 
                      100                 105                 110         
          Lys Arg Arg Gly Val His Asn Val Asn Glu Val Glu Glu Asp Thr Gly 
                  115                 120                 125             
          Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Ser Arg Asn Ser Lys Ala Leu 
              130                 135                 140                 
          Glu Glu Lys Tyr Val Ala Glu Leu Gln Leu Glu Arg Leu Lys Lys Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Glu Val Arg Gly Ser Ile Asn Arg Phe Lys Thr Ser Asp Tyr Val 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Ala Lys Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Ala Tyr His Gln Leu 
                      180                 185                 190         
          Asp Gln Ser Phe Ile Asp Thr Tyr Ile Asp Leu Leu Glu Thr Arg Arg 
                  195                 200                 205             
          Thr Tyr Tyr Glu Gly Pro Gly Glu Gly Ser Pro Phe Gly Trp Lys Asp 
              210                 215                 220                 
          Ile Lys Glu Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly His Cys Thr Tyr Phe Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Glu Leu Ala Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Asn Ala Asp Leu Tyr Asn 
                          245                 250                 255     
          Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Thr Arg Asp Glu Asn Glu 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Tyr Tyr Glu Lys Phe Gln Ile Ile Glu Asn Val Phe Lys 
                  275                 280                 285             
          Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Val 
              290                 295                 300                 
          Asn Glu Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Val Thr Ser Thr Gly Lys Pro 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Phe Thr Asn Leu Lys Val Tyr His Asp Ile Lys Asp Ile Thr Ala 
                          325                 330                 335     
          Arg Lys Glu Ile Ile Glu Asn Ala Glu Leu Leu Asp Gln Ile Ala Lys 
                      340                 345                 350         
          Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Ser Ser Glu Asp Ile Gln Glu Glu Leu Thr 
                  355                 360                 365             
          Asn Leu Asn Ser Glu Leu Thr Gln Glu Glu Ile Glu Gln Ile Ser Asn 
              370                 375                 380                 
          Leu Lys Gly Tyr Thr Gly Thr His Asn Leu Ser Leu Lys Ala Ile Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Ile Leu Asp Glu Leu Trp His Thr Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ile 
                          405                 410                 415     
          Phe Ala Arg Leu Lys Leu Val Pro Lys Lys Val Asp Leu Ser Gln Gln 
                      420                 425                 430         
          Lys Glu Ile Pro Thr Thr Leu Val Asp Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val 
                  435                 440                 445             
          Val Lys Arg Ser Phe Ile Gln Ser Ile Lys Val Ile Asn Ala Ile Ile 
              450                 455                 460                 
          Lys Lys Tyr Gly Leu Pro Asn Asp Ile Ile Ile Glu Leu Ala Arg Glu 
          465                 470                 475                 480 
          Lys Asn Ser Lys Asp Ala Gln Lys Met Ile Asn Glu Met Gln Lys Arg 
                          485                 490                 495     
          Asn Arg Gln Thr Asn Glu Arg Ile Glu Glu Ile Ile Arg Thr Thr Gly 
                      500                 505                 510         
          Lys Glu Asn Ala Lys Tyr Leu Ile Glu Lys Ile Lys Leu His Asp Met 
                  515                 520                 525             
          Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Pro Leu Glu Asp 
              530                 535                 540                 
          Leu Leu Asn Asn Pro Phe Asn Tyr Glu Val Asp His Ile Ile Pro Arg 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Lys Gln 
                          565                 570                 575     
          Glu Glu Asn Ser Lys Lys Gly Asn Arg Thr Pro Phe Gln Tyr Leu Ser 
                      580                 585                 590         
          Ser Ser Asp Ser Lys Ile Ser Tyr Glu Thr Phe Lys Lys His Ile Leu 
                  595                 600                 605             
          Asn Leu Ala Lys Gly Lys Gly Arg Ile Ser Lys Thr Lys Lys Glu Tyr 
              610                 615                 620                 
          Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Arg Phe Ser Val Gln Lys Asp Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Ala Gly Leu Met 
                          645                 650                 655     
          Asn Leu Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Val Asn Asn Leu Asp Val Lys Val 
                      660                 665                 670         
          Lys Ser Ile Asn Gly Gly Phe Thr Ser Phe Leu Arg Arg Lys Trp Lys 
                  675                 680                 685             
          Phe Lys Lys Glu Arg Asn Lys Gly Tyr Lys His His Ala Glu Asp Ala 
              690                 695                 700                 
          Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Ile Phe Lys Glu Trp Lys Lys Leu 
          705                 710                 715                 720 
          Asp Lys Ala Lys Lys Val Met Glu Asn Gln Met Phe Glu Glu Lys Gln 
                          725                 730                 735     
          Ala Glu Ser Met Pro Glu Ile Glu Thr Glu Gln Glu Tyr Lys Glu Ile 
                      740                 745                 750         
          Phe Ile Thr Pro His Gln Ile Lys His Ile Lys Asp Phe Lys Asp Tyr 
                  755                 760                 765             
          Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Lys Leu Ile Asn 
              770                 775                 780                 
          Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Asp Asp Lys Gly Asn Thr Leu Ile 
          785                 790                 795                 800 
          Val Asn Asn Leu Asn Gly Leu Tyr Asp Lys Asp Asn Asp Lys Leu Lys 
                          805                 810                 815     
          Lys Leu Ile Asn Lys Ser Pro Glu Lys Leu Leu Met Tyr His His Asp 
                      820                 825                 830         
          Pro Gln Thr Tyr Gln Lys Leu Lys Leu Ile Met Glu Gln Tyr Gly Asp 
                  835                 840                 845             
          Glu Lys Asn Pro Leu Tyr Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly Asn Tyr Leu 
              850                 855                 860                 
          Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asp Asn Gly Pro Val Ile Lys Lys Ile Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Tyr Tyr Gly Asn Lys Leu Asn Ala His Leu Asp Ile Thr Asp Asp Tyr 
                          885                 890                 895     
          Pro Asn Ser Arg Asn Lys Val Val Lys Leu Ser Leu Lys Pro Tyr Arg 
                      900                 905                 910         
          Phe Asp Val Tyr Leu Asp Asn Gly Val Tyr Lys Phe Val Thr Val Lys 
                  915                 920                 925             
          Asn Leu Asp Val Ile Lys Lys Glu Asn Tyr Tyr Glu Val Asn Ser Lys 
              930                 935                 940                 
          Cys Tyr Glu Glu Ala Lys Lys Leu Lys Lys Ile Ser Asn Gln Ala Glu 
          945                 950                 955                 960 
          Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Ile Asn Gly Glu 
                          965                 970                 975     
          Leu Tyr Arg Val Ile Gly Val Asn Asn Asp Leu Leu Asn Arg Ile Glu 
                      980                 985                 990         
          Val Asn Met Ile Asp Ile Thr Tyr  Arg Glu Tyr Leu Glu  Asn Met Asn 
                  995                 1000                 1005             
          Asp Lys  Arg Pro Pro His Ile  Ile Lys Thr Ile Ala  Ser Lys Thr 
              1010                 1015                 1020             
          Gln Ser  Ile Lys Lys Tyr Ser  Thr Asp Ile Leu Gly  Asn Leu Tyr 
              1025                 1030                 1035             
          Glu Val  Lys Ser Lys Lys His  Pro Gln Ile Ile Lys  Lys Gly 
              1040                 1045                 1050         
          <![CDATA[<210>  718]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  718]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu Tyr Asp Leu Ile Asn Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Thr Ser Asn Asn Pro Tyr Gln Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ile Leu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ile Ala Leu Leu His Leu 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Asn Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asp Asn Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Lys Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Val Ala Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Gln Ser Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser 
                          405                 410                 415     
          Met Asn Gln Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Leu Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu 
              530                 535                 540                 
          Ser Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asn Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Glu Ile Glu Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn 
                      740                 745                 750         
          Tyr Ser Glu Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp 
                  755                 760                 765             
          Phe Arg Asn Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Thr Tyr Ile Val Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Thr Leu Lys Lys Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln His Asp Pro Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ala Asn Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Ser Leu Lys Tyr Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          His Gln Phe Lys Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Pro Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ser Tyr Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Glu Gln Lys Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys 
          945                 950                 955                 960 
          Asn Ala Lys Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asp Gly Glu Ile Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Met Ile Glu Leu Asp Leu Pro Asp  Ile Arg Tyr Lys Glu  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Leu Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Val Asn Ser Ile Glu  Lys Leu Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Val  Phe Thr Asn Thr Gln  Tyr Thr Lys Pro Gln  Leu Leu Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Asn 
              1055         
          <![CDATA[<210>  719]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  719]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu Tyr Asp Leu Ile Asn Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Thr Ser Asn Asn Pro Tyr Gln Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ile Leu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ile Ala Leu Leu His Leu 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Asn Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asp Asn Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Lys Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Val Ala Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Gln Ser Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser 
                          405                 410                 415     
          Met Asn Gln Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Leu Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu 
              530                 535                 540                 
          Ser Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asn Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Glu Ile Glu Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn 
                      740                 745                 750         
          Tyr Ser Glu Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp 
                  755                 760                 765             
          Phe Arg Asn Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Thr Tyr Ile Val Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Thr Leu Lys Lys Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln His Asp Pro Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ala Asn Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Ser Leu Lys Tyr Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          His Gln Phe Lys Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Asn Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Glu Lys Gly Tyr Lys Phe Val 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ala Tyr Leu Asn Val Phe Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Lys Asp Lys Tyr Gln Glu Leu Lys Glu Lys Lys Lys Ile Lys Asp 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Asp Gln Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asn Gly Asp Leu Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Asp Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Ile Ile Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp  Ile Lys Tyr Lys Asp  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Thr Glu Ser Ile Glu  Lys Phe Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Leu  Tyr Leu His Ser Thr  Glu Lys Ala Pro Gln  Leu Ile Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Leu 
              1055         
          <![CDATA[<210>  720]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  720]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu Tyr Asp Leu Ile Asn Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Thr Ser Asn Asn Pro Tyr Gln Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ile Leu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ile Ala Leu Leu His Leu 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Asn Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asp Asn Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Lys Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Val Ala Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Gln Ser Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser 
                          405                 410                 415     
          Met Asn Gln Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Leu Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu 
              530                 535                 540                 
          Ser Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asn Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Glu Ile Glu Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn 
                      740                 745                 750         
          Tyr Ser Glu Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp 
                  755                 760                 765             
          Phe Arg Asn Phe Lys Phe Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Met Lys Asp Glu His 
          785                 790                 795                 800 
          Asp Tyr Ile Val Gln Thr Ile Thr Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Asn Leu Lys Lys Gln Phe Asn Lys Asn Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln Asn Asp Pro Lys Thr Phe Glu Lys Leu Ser Ile Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ser Asp Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Lys Ile Lys Leu Leu Gly Asn Lys Val Gly Asn His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          Asn Lys Tyr Glu Asn Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Asn Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Glu Lys Gly Tyr Lys Phe Val 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ala Tyr Leu Asn Val Phe Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Lys Asp Lys Tyr Gln Glu Leu Lys Glu Lys Lys Lys Ile Lys Asp 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Asp Gln Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asn Gly Asp Leu Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Asp Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Ile Ile Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp  Ile Lys Tyr Lys Asp  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Thr Glu Ser Ile Glu  Lys Phe Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Leu  Tyr Leu His Ser Thr  Glu Lys Ala Pro Gln  Leu Ile Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Leu 
              1055         
          <![CDATA[<210>  721]]>
          <![CDATA[<211>  1057]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  721]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu Tyr Asp Leu Ile Asn Lys Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Thr Ser Asn Asn Pro Tyr Gln Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ile Leu Ser Lys Asp Glu Leu Ala Ile Ala Leu Leu His Leu 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Val Asp Val Ala Ala Asp Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Glu Thr Ala Ser Asp Ser Leu Ser Thr Lys Asp Gln Ile Asn Lys Asn 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Phe Leu Glu Ser Arg Tyr Val Cys Glu Leu Gln Lys Glu Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Glu Asn Glu Gly His Val Arg Gly Val Glu Asn Arg Phe Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Asp Ile Val Arg Glu Ala Lys Lys Ile Ile Asp Thr Gln Met Gln 
                      180                 185                 190         
          Tyr Tyr Pro Glu Ile Asp Glu Thr Phe Lys Glu Lys Tyr Ile Ser Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Thr Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Gln Gly Ser Pro 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Trp Asn Gly Asp Leu Lys Lys Trp Tyr Glu Met Leu Met Gly 
          225                 230                 235                 240 
          His Cys Thr Tyr Phe Pro Gln Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr 
                          245                 250                 255     
          Ser Ala Asp Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Ile Ile 
                      260                 265                 270         
          Gln Arg Asp Asn Ser Glu Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile 
                  275                 280                 285             
          Ile Glu Asn Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile 
              290                 295                 300                 
          Ala Lys Glu Ile Gly Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile 
          305                 310                 315                 320 
          Thr Lys Ser Gly Thr Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp 
                          325                 330                 335     
          Leu Lys Lys Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu 
                      340                 345                 350         
          Leu Asn Gln Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser 
                  355                 360                 365             
          Ile Val Ala Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp 
              370                 375                 380                 
          Lys Gln Ser Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Leu Lys Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser 
                          405                 410                 415     
          Met Asn Gln Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys 
                      420                 425                 430         
          Tyr Glu Leu Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp 
                  435                 440                 445             
          Ala Ile Leu Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Ile Asn Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Leu Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile 
                          485                 490                 495     
          Asn Asn Leu Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu 
                      500                 505                 510         
          Ile Ile Gly Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys 
                  515                 520                 525             
          Ile Arg Leu His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu 
              530                 535                 540                 
          Ser Ile Pro Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val 
          545                 550                 555                 560 
          Asp His Ile Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn 
                          565                 570                 575     
          Lys Val Leu Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr 
                      580                 585                 590         
          Pro Tyr Gln Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln 
                  595                 600                 605             
          Phe Lys Gln His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser 
              610                 615                 620                 
          Lys Lys Lys Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe 
          625                 630                 635                 640 
          Glu Val Gln Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr 
                          645                 650                 655     
          Ala Thr Arg Glu Leu Thr Ser Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn 
                      660                 665                 670         
          Asn Met Asp Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asn His 
                  675                 680                 685             
          Leu Arg Lys Val Trp Arg Phe Asp Lys Tyr Arg Asn His Gly Tyr Lys 
              690                 695                 700                 
          His His Ala Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Glu Asn Lys Lys Leu Gln Asn Thr Asn Lys Ile Leu Glu Lys Pro 
                          725                 730                 735     
          Thr Ile Glu Asn Asn Thr Lys Lys Val Thr Val Glu Lys Glu Glu Asp 
                      740                 745                 750         
          Tyr Asn Asn Val Phe Glu Thr Pro Lys Leu Val Glu Asp Ile Lys Gln 
                  755                 760                 765             
          Tyr Arg Asp Tyr Lys Phe Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg 
              770                 775                 780                 
          Gln Leu Ile Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Met Lys Asp Glu His 
          785                 790                 795                 800 
          Asp Tyr Ile Val Gln Thr Ile Thr Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Asn Thr 
                          805                 810                 815     
          Asn Leu Lys Lys Gln Phe Asn Lys Asn Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr 
                      820                 825                 830         
          Gln Asn Asp Pro Lys Thr Phe Glu Lys Leu Ser Ile Ile Met Lys Gln 
                  835                 840                 845             
          Tyr Ser Asp Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr Tyr Glu Glu Thr Gly 
              850                 855                 860                 
          Glu Tyr Leu Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Lys Ile Lys Leu Leu Gly Asn Lys Val Gly Asn His Leu Asp Val Thr 
                          885                 890                 895     
          Asn Lys Tyr Glu Asn Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys 
                      900                 905                 910         
          Asn Tyr Arg Phe Asp Val Tyr Leu Thr Glu Lys Gly Tyr Lys Phe Val 
                  915                 920                 925             
          Thr Ile Ala Tyr Leu Asn Val Phe Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile 
              930                 935                 940                 
          Pro Lys Asp Lys Tyr Gln Glu Leu Lys Glu Lys Lys Lys Ile Lys Asp 
          945                 950                 955                 960 
          Thr Asp Gln Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu 
                          965                 970                 975     
          Asn Gly Asp Leu Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Asp Arg Asn 
                      980                 985                 990         
          Ile Ile Glu Leu Asp Tyr Tyr Asp  Ile Lys Tyr Lys Asp  Tyr Cys Glu 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Asn  Asn Ile Lys Gly Glu  Pro Arg Ile Lys Lys  Thr Ile Gly 
              1010                 1015                 1020             
          Lys Lys  Thr Glu Ser Ile Glu  Lys Phe Thr Thr Asp  Val Leu Gly 
              1025                 1030                 1035             
          Asn Leu  Tyr Leu His Ser Thr  Glu Lys Ala Pro Gln  Leu Ile Phe 
              1040                 1045                 1050             
          Lys Arg  Gly Leu 
              1055         
          <![CDATA[<210>  722]]>
          <![CDATA[<211>  1054]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  722]]>
          Met Asn Gln Lys Phe Ile Leu Gly Leu Asp Ile Gly Ile Thr Ser Val 
          1               5                   10                  15      
          Gly Tyr Gly Leu Ile Asp Tyr Glu Thr Lys Asn Ile Ile Asp Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Val Arg Leu Phe Pro Glu Ala Asn Val Glu Asn Asn Glu Gly Arg Arg 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Arg Gly Ser Arg Arg Leu Lys Arg Arg Arg Ile His Arg Leu 
              50                  55                  60                  
          Glu Arg Val Lys Lys Leu Leu Glu Asp Tyr Asn Leu Leu Asp Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Ile Pro Gln Ser Thr Asn Pro Tyr Ala Ile Arg Val Lys Gly Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Ala Leu Ser Lys Asp Glu Leu Val Ile Ala Leu Leu His Ile 
                      100                 105                 110         
          Ala Lys Arg Arg Gly Ile His Asn Ile Asn Val Ser Ser Glu Asp Glu 
                  115                 120                 125             
          Asp Ala Ser Asn Glu Leu Ser Thr Lys Glu Gln Ile Asn Arg Asn Asn 
              130                 135                 140                 
          Lys Leu Leu Lys Asp Lys Tyr Val Cys Glu Val Gln Leu Gln Arg Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Glu Gly Gln Ile Arg Gly Glu Lys Asn Arg Phe Lys Thr Thr Asp 
                          165                 170                 175     
          Ile Leu Lys Glu Ile Asp Gln Leu Leu Lys Val Gln Lys Asp Tyr His 
                      180                 185                 190         
          Asn Leu Asp Ile Asp Phe Ile Asn Gln Tyr Lys Glu Ile Val Glu Thr 
                  195                 200                 205             
          Arg Arg Glu Tyr Phe Glu Gly Pro Gly Lys Gly Ser Pro Tyr Gly Trp 
              210                 215                 220                 
          Glu Gly Asp Pro Lys Ala Trp Tyr Glu Thr Leu Met Gly His Cys Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Phe Pro Asp Glu Leu Arg Ser Val Lys Tyr Ala Tyr Ser Ala Asp 
                          245                 250                 255     
          Leu Phe Asn Ala Leu Asn Asp Leu Asn Asn Leu Val Ile Gln Arg Asp 
                      260                 265                 270         
          Gly Leu Ser Lys Leu Glu Tyr His Glu Lys Tyr His Ile Ile Glu Asn 
                  275                 280                 285             
          Val Phe Lys Gln Lys Lys Lys Pro Thr Leu Lys Gln Ile Ala Asn Glu 
              290                 295                 300                 
          Ile Asn Val Asn Pro Glu Asp Ile Lys Gly Tyr Arg Ile Thr Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Pro Glu Phe Thr Ser Phe Lys Leu Phe His Asp Leu Lys Lys 
                          325                 330                 335     
          Val Val Lys Asp His Ala Ile Leu Asp Asp Ile Asp Leu Leu Asn Gln 
                      340                 345                 350         
          Ile Ala Glu Ile Leu Thr Ile Tyr Gln Asp Lys Asp Ser Ile Val Ala 
                  355                 360                 365             
          Glu Leu Gly Gln Leu Glu Tyr Leu Met Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ser 
              370                 375                 380                 
          Ile Ser Glu Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Thr His Ser Leu Ser Leu Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Cys Met Asn Met Ile Ile Asp Glu Leu Trp His Ser Ser Met Asn Gln 
                          405                 410                 415     
          Met Glu Val Phe Thr Tyr Leu Asn Met Arg Pro Lys Lys Tyr Glu Leu 
                      420                 425                 430         
          Lys Gly Tyr Gln Arg Ile Pro Thr Asp Met Ile Asp Asp Ala Ile Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Val Val Lys Arg Thr Phe Ile Gln Ser Ile Asn Val Ile Asn 
              450                 455                 460                 
          Lys Val Ile Glu Lys Tyr Gly Ile Pro Glu Asp Ile Ile Ile Glu Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Ala Arg Glu Asn Asn Ser Asp Asp Arg Lys Lys Phe Ile Asn Asn Leu 
                          485                 490                 495     
          Gln Lys Lys Asn Glu Ala Thr Arg Lys Arg Ile Asn Glu Ile Ile Gly 
                      500                 505                 510         
          Gln Thr Gly Asn Gln Asn Ala Lys Arg Ile Val Glu Lys Ile Arg Leu 
                  515                 520                 525             
          His Asp Gln Gln Glu Gly Lys Cys Leu Tyr Ser Leu Glu Ser Ile Pro 
              530                 535                 540                 
          Leu Glu Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asn His Tyr Glu Val Asp His Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Ile Pro Arg Ser Val Ser Phe Asp Asn Ser Tyr His Asn Lys Val Leu 
                          565                 570                 575     
          Val Lys Gln Ser Glu Asn Ser Lys Lys Ser Asn Leu Thr Pro Tyr Gln 
                      580                 585                 590         
          Tyr Phe Asn Ser Gly Lys Ser Lys Leu Ser Tyr Asn Gln Phe Lys Gln 
                  595                 600                 605             
          His Ile Leu Asn Leu Ser Lys Ser Gln Asp Arg Ile Ser Lys Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Lys Glu Tyr Leu Leu Glu Glu Arg Asp Ile Asn Lys Phe Glu Val Gln 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Glu Phe Ile Asn Arg Asn Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Thr Arg 
                          645                 650                 655     
          Glu Leu Thr Asn Tyr Leu Lys Ala Tyr Phe Ser Ala Asn Asn Met Asn 
                      660                 665                 670         
          Val Lys Val Lys Thr Ile Asn Gly Ser Phe Thr Asp Tyr Leu Arg Lys 
                  675                 680                 685             
          Val Trp Lys Phe Lys Lys Glu Arg Asn His Gly Tyr Lys His His Ala 
              690                 695                 700                 
          Glu Asp Ala Leu Ile Ile Ala Asn Ala Asp Phe Leu Phe Lys Glu Asn 
          705                 710                 715                 720 
          Lys Lys Leu Lys Ala Val Asn Ser Val Leu Glu Lys Pro Glu Ile Glu 
                          725                 730                 735     
          Thr Lys Gln Leu Asp Ile Gln Val Asp Ser Glu Asp Asn Tyr Ser Glu 
                      740                 745                 750         
          Met Phe Ile Ile Pro Lys Gln Val Gln Asp Ile Lys Asp Phe Arg Asn 
                  755                 760                 765             
          Phe Lys Tyr Ser His Arg Val Asp Lys Lys Pro Asn Arg Gln Leu Ile 
              770                 775                 780                 
          Asn Asp Thr Leu Tyr Ser Thr Arg Lys Lys Asp Asn Ser Thr Tyr Ile 
          785                 790                 795                 800 
          Val Gln Thr Ile Lys Asp Ile Tyr Ala Lys Asp Asn Thr Thr Leu Lys 
                          805                 810                 815     
          Lys Gln Phe Asp Lys Ser Pro Glu Lys Phe Leu Met Tyr Gln His Asp 
                      820                 825                 830         
          Pro Arg Thr Phe Glu Lys Leu Glu Val Ile Met Lys Gln Tyr Ala Asn 
                  835                 840                 845             
          Glu Lys Asn Pro Leu Ala Lys Tyr His Glu Glu Thr Gly Glu Tyr Leu 
              850                 855                 860                 
          Thr Lys Tyr Ser Lys Lys Asn Asn Gly Pro Ile Val Lys Ser Leu Lys 
          865                 870                 875                 880 
          Tyr Ile Gly Asn Lys Leu Gly Ser His Leu Asp Val Thr His Gln Phe 
                          885                 890                 895     
          Lys Ser Ser Thr Lys Lys Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Pro Tyr Arg 
                      900                 905                 910         
          Phe Asp Val Tyr Leu Thr Asp Lys Gly Tyr Lys Phe Ile Thr Ile Ser 
                  915                 920                 925             
          Tyr Leu Asp Val Leu Lys Lys Asp Asn Tyr Tyr Tyr Ile Pro Glu Gln 
              930                 935                 940                 
          Lys Tyr Asp Lys Leu Lys Leu Gly Lys Ala Ile Asp Lys Asn Ala Lys 
          945                 950                 955                 960 
          Phe Ile Ala Ser Phe Tyr Lys Asn Asp Leu Ile Lys Leu Asp Gly Glu 
                          965                 970                 975     
          Ile Tyr Lys Ile Ile Gly Val Asn Ser Asp Thr Arg Asn Met Ile Glu 
                      980                 985                 990         
          Leu Asp Leu Pro Asp Ile Arg Tyr  Lys Glu Tyr Cys Glu  Leu Asn Asn 
                  995                 1000                 1005             
          Ile Lys  Gly Glu Pro Arg Ile  Lys Lys Thr Ile Gly  Lys Lys Val 
              1010                 1015                 1020             
          Asn Ser  Ile Glu Lys Leu Thr  Thr Asp Val Leu Gly  Asn Val Phe 
              1025                 1030                 1035             
          Thr Asn  Thr Gln Tyr Thr Lys  Pro Gln Leu Leu Phe  Lys Arg Gly 
              1040                 1045                 1050             
          Asn 
          <![CDATA[<210>  723]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  723]]>
          cgctaggaag cagccaatga                                                   20
          <![CDATA[<210>  724]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  724]]>
          tagctcctcc cagaccttcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  725]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  725]]>
          aatgacgagt tcggacgg                                                     18
          <![CDATA[<210>  726]]>
          <![CDATA[<400>  726]]>
          000
          <![CDATA[<210>  727]]>
          <![CDATA[<400>  727]]>
          000
          <![CDATA[<210>  728]]>
          <![CDATA[<400>  728]]>
          000
          <![CDATA[<210>  729]]>
          <![CDATA[<400>  729]]>
          000
          <![CDATA[<210>  730]]>
          <![CDATA[<400>  730]]>
          000
          <![CDATA[<210>  731]]>
          <![CDATA[<400>  731]]>
          000
          <![CDATA[<210>  732]]>
          <![CDATA[<400>  732]]>
          000
          <![CDATA[<210>  733]]>
          <![CDATA[<400>  733]]>
          000
          <![CDATA[<210>  734]]>
          <![CDATA[<400>  734]]>
          000
          <![CDATA[<210>  735]]>
          <![CDATA[<400>  735]]>
          000
          <![CDATA[<210>  736]]>
          <![CDATA[<400>  736]]>
          000
          <![CDATA[<210>  737]]>
          <![CDATA[<400>  737]]>
          000
          <![CDATA[<210>  738]]>
          <![CDATA[<400>  738]]>
          000
          <![CDATA[<210>  739]]>
          <![CDATA[<400>  739]]>
          000
          <![CDATA[<210>  740]]>
          <![CDATA[<400>  740]]>
          000
          <![CDATA[<210>  741]]>
          <![CDATA[<400>  741]]>
          000
          <![CDATA[<210>  742]]>
          <![CDATA[<400>  742]]>
          000
          <![CDATA[<210>  743]]>
          <![CDATA[<400>  743]]>
          000
          <![CDATA[<210>  744]]>
          <![CDATA[<400>  744]]>
          000
          <![CDATA[<210>  745]]>
          <![CDATA[<400>  745]]>
          000
          <![CDATA[<210>  746]]>
          <![CDATA[<400>  746]]>
          000
          <![CDATA[<210>  747]]>
          <![CDATA[<400>  747]]>
          000
          <![CDATA[<210>  748]]>
          <![CDATA[<400>  748]]>
          000
          <![CDATA[<210>  749]]>
          <![CDATA[<400>  749]]>
          000
          <![CDATA[<210>  750]]>
          <![CDATA[<400>  750]]>
          000
          <![CDATA[<210>  751]]>
          <![CDATA[<400>  751]]>
          000
          <![CDATA[<210>  752]]>
          <![CDATA[<400>  752]]>
          000
          <![CDATA[<210>  753]]>
          <![CDATA[<400>  753]]>
          000
          <![CDATA[<210>  754]]>
          <![CDATA[<400>  754]]>
          000
          <![CDATA[<210>  755]]>
          <![CDATA[<400>  755]]>
          000
          <![CDATA[<210>  756]]>
          <![CDATA[<400>  756]]>
          000
          <![CDATA[<210>  757]]>
          <![CDATA[<400>  757]]>
          000
          <![CDATA[<210>  758]]>
          <![CDATA[<400>  758]]>
          000
          <![CDATA[<210>  759]]>
          <![CDATA[<400>  759]]>
          000
          <![CDATA[<210>  760]]>
          <![CDATA[<400>  760]]>
          000
          <![CDATA[<210>  761]]>
          <![CDATA[<400>  761]]>
          000
          <![CDATA[<210>  762]]>
          <![CDATA[<400>  762]]>
          000
          <![CDATA[<210>  763]]>
          <![CDATA[<400>  763]]>
          000
          <![CDATA[<210>  764]]>
          <![CDATA[<400>  764]]>
          000
          <![CDATA[<210>  765]]>
          <![CDATA[<400>  765]]>
          000
          <![CDATA[<210>  766]]>
          <![CDATA[<400>  766]]>
          000
          <![CDATA[<210>  767]]>
          <![CDATA[<400>  767]]>
          000
          <![CDATA[<210>  768]]>
          <![CDATA[<400>  768]]>
          000
          <![CDATA[<210>  769]]>
          <![CDATA[<400>  769]]>
          000
          <![CDATA[<210>  770]]>
          <![CDATA[<400>  770]]>
          000
          <![CDATA[<210>  771]]>
          <![CDATA[<400>  771]]>
          000
          <![CDATA[<210>  772]]>
          <![CDATA[<400>  772]]>
          000
          <![CDATA[<210>  773]]>
          <![CDATA[<400>  773]]>
          000
          <![CDATA[<210>  774]]>
          <![CDATA[<400>  774]]>
          000
          <![CDATA[<210>  775]]>
          <![CDATA[<400>  775]]>
          000
          <![CDATA[<210>  776]]>
          <![CDATA[<400>  776]]>
          000
          <![CDATA[<210>  777]]>
          <![CDATA[<400>  777]]>
          000
          <![CDATA[<210>  778]]>
          <![CDATA[<400>  778]]>
          000
          <![CDATA[<210>  779]]>
          <![CDATA[<400>  779]]>
          000
          <![CDATA[<210>  780]]>
          <![CDATA[<400>  780]]>
          000
          <![CDATA[<210>  781]]>
          <![CDATA[<400>  781]]>
          000
          <![CDATA[<210>  782]]>
          <![CDATA[<400>  782]]>
          000
          <![CDATA[<210>  783]]>
          <![CDATA[<400>  783]]>
          000
          <![CDATA[<210>  784]]>
          <![CDATA[<400>  784]]>
          000
          <![CDATA[<210>  785]]>
          <![CDATA[<400>  785]]>
          000
          <![CDATA[<210>  786]]>
          <![CDATA[<400>  786]]>
          000
          <![CDATA[<210>  787]]>
          <![CDATA[<400>  787]]>
          000
          <![CDATA[<210>  788]]>
          <![CDATA[<400>  788]]>
          000
          <![CDATA[<210>  789]]>
          <![CDATA[<400>  789]]>
          000
          <![CDATA[<210>  790]]>
          <![CDATA[<400>  790]]>
          000
          <![CDATA[<210>  791]]>
          <![CDATA[<400>  791]]>
          000
          <![CDATA[<210>  792]]>
          <![CDATA[<400>  792]]>
          000
          <![CDATA[<210>  793]]>
          <![CDATA[<400>  793]]>
          000
          <![CDATA[<210>  794]]>
          <![CDATA[<400>  794]]>
          000
          <![CDATA[<210>  795]]>
          <![CDATA[<400>  795]]>
          000
          <![CDATA[<210>  796]]>
          <![CDATA[<400>  796]]>
          000
          <![CDATA[<210>  797]]>
          <![CDATA[<400>  797]]>
          000
          <![CDATA[<210>  798]]>
          <![CDATA[<400>  798]]>
          000
          <![CDATA[<210>  799]]>
          <![CDATA[<400>  799]]>
          000
          <![CDATA[<210>  800]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  800]]>
          ggggatcaca gaccatttct                                                   20
          <![CDATA[<210>  801]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  801]]>
          tggaggatgg aacacggac                                                    19
          <![CDATA[<210>  802]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  802]]>
          ttctttcggc caggctgagg ccct                                              24
          <![CDATA[<210>  803]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  803]]>
          ctagcggccg gggag                                                        15
          <![CDATA[<210>  804]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  804]]>
          agcagcattc ccggcta                                                      17
          <![CDATA[<210>  805]]>
          <![CDATA[<211>  24]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  805]]>
          cgaacggggc tcgaagggtc cttg                                              24
          <![CDATA[<210>  806]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  806]]>
          ggatatgtga ccatgctacc                                                   20
          <![CDATA[<210>  807]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  807]]>
          gggttgtatc cagtacctct                                                   20
          <![CDATA[<210>  808]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  808]]>
          tgtcctgttc cttcccccag cccca                                             25
          <![CDATA[<210>  809]]>
          <![CDATA[<400>  809]]>
          000
          <![CDATA[<210>  810]]>
          <![CDATA[<400>  810]]>
          000
          <![CDATA[<210>  811]]>
          <![CDATA[<400>  811]]>
          000
          <![CDATA[<210>  812]]>
          <![CDATA[<400>  812]]>
          000
          <![CDATA[<210>  813]]>
          <![CDATA[<400>  813]]>
          000
          <![CDATA[<210>  814]]>
          <![CDATA[<400>  814]]>
          000
          <![CDATA[<210>  815]]>
          <![CDATA[<400>  815]]>
          000
          <![CDATA[<210>  816]]>
          <![CDATA[<400>  816]]>
          000
          <![CDATA[<210>  817]]>
          <![CDATA[<400>  817]]>
          000
          <![CDATA[<210>  818]]>
          <![CDATA[<400>  818]]>
          000
          <![CDATA[<210>  819]]>
          <![CDATA[<400>  819]]>
          000
          <![CDATA[<210>  820]]>
          <![CDATA[<400>  820]]>
          000
          <![CDATA[<210>  821]]>
          <![CDATA[<400>  821]]>
          000
          <![CDATA[<210>  822]]>
          <![CDATA[<400>  822]]>
          000
          <![CDATA[<210>  823]]>
          <![CDATA[<400>  823]]>
          000
          <![CDATA[<210>  824]]>
          <![CDATA[<400>  824]]>
          000
          <![CDATA[<210>  825]]>
          <![CDATA[<400>  825]]>
          000
          <![CDATA[<210>  826]]>
          <![CDATA[<400>  826]]>
          000
          <![CDATA[<210>  827]]>
          <![CDATA[<400>  827]]>
          000
          <![CDATA[<210>  828]]>
          <![CDATA[<400>  828]]>
          000
          <![CDATA[<210>  829]]>
          <![CDATA[<400>  829]]>
          000
          <![CDATA[<210>  830]]>
          <![CDATA[<400>  830]]>
          000
          <![CDATA[<210>  831]]>
          <![CDATA[<400>  831]]>
          000
          <![CDATA[<210>  832]]>
          <![CDATA[<400>  832]]>
          000
          <![CDATA[<210>  833]]>
          <![CDATA[<400>  833]]>
          000
          <![CDATA[<210>  834]]>
          <![CDATA[<400>  834]]>
          000
          <![CDATA[<210>  835]]>
          <![CDATA[<400>  835]]>
          000
          <![CDATA[<210>  836]]>
          <![CDATA[<400>  836]]>
          000
          <![CDATA[<210>  837]]>
          <![CDATA[<400>  837]]>
          000
          <![CDATA[<210>  838]]>
          <![CDATA[<400>  838]]>
          000
          <![CDATA[<210>  839]]>
          <![CDATA[<400>  839]]>
          000
          <![CDATA[<210>  840]]>
          <![CDATA[<400>  840]]>
          000
          <![CDATA[<210>  841]]>
          <![CDATA[<400>  841]]>
          000
          <![CDATA[<210>  842]]>
          <![CDATA[<400>  842]]>
          000
          <![CDATA[<210>  843]]>
          <![CDATA[<400>  843]]>
          000
          <![CDATA[<210>  844]]>
          <![CDATA[<400>  844]]>
          000
          <![CDATA[<210>  845]]>
          <![CDATA[<400>  845]]>
          000
          <![CDATA[<210>  846]]>
          <![CDATA[<400>  846]]>
          000
          <![CDATA[<210>  847]]>
          <![CDATA[<400>  847]]>
          000
          <![CDATA[<210>  848]]>
          <![CDATA[<400>  848]]>
          000
          <![CDATA[<210>  849]]>
          <![CDATA[<400>  849]]>
          000
          <![CDATA[<210>  850]]>
          <![CDATA[<400>  850]]>
          000
          <![CDATA[<210>  851]]>
          <![CDATA[<400>  851]]>
          000
          <![CDATA[<210>  852]]>
          <![CDATA[<400>  852]]>
          000
          <![CDATA[<210>  853]]>
          <![CDATA[<400>  853]]>
          000
          <![CDATA[<210>  854]]>
          <![CDATA[<400>  854]]>
          000
          <![CDATA[<210>  855]]>
          <![CDATA[<400>  855]]>
          000
          <![CDATA[<210>  856]]>
          <![CDATA[<400>  856]]>
          000
          <![CDATA[<210>  857]]>
          <![CDATA[<400>  857]]>
          000
          <![CDATA[<210>  858]]>
          <![CDATA[<400>  858]]>
          000
          <![CDATA[<210>  859]]>
          <![CDATA[<400>  859]]>
          000
          <![CDATA[<210>  860]]>
          <![CDATA[<400>  860]]>
          000
          <![CDATA[<210>  861]]>
          <![CDATA[<400>  861]]>
          000
          <![CDATA[<210>  862]]>
          <![CDATA[<400>  862]]>
          000
          <![CDATA[<210>  863]]>
          <![CDATA[<400>  863]]>
          000
          <![CDATA[<210>  864]]>
          <![CDATA[<400>  864]]>
          000
          <![CDATA[<210>  865]]>
          <![CDATA[<400>  865]]>
          000
          <![CDATA[<210>  866]]>
          <![CDATA[<400>  866]]>
          000
          <![CDATA[<210>  867]]>
          <![CDATA[<400>  867]]>
          000
          <![CDATA[<210>  868]]>
          <![CDATA[<400>  868]]>
          000
          <![CDATA[<210>  869]]>
          <![CDATA[<400>  869]]>
          000
          <![CDATA[<210>  870]]>
          <![CDATA[<400>  870]]>
          000
          <![CDATA[<210>  871]]>
          <![CDATA[<400>  871]]>
          000
          <![CDATA[<210>  872]]>
          <![CDATA[<400>  872]]>
          000
          <![CDATA[<210>  873]]>
          <![CDATA[<400>  873]]>
          000
          <![CDATA[<210>  874]]>
          <![CDATA[<400>  874]]>
          000
          <![CDATA[<210>  875]]>
          <![CDATA[<400>  875]]>
          000
          <![CDATA[<210>  876]]>
          <![CDATA[<400>  876]]>
          000
          <![CDATA[<210>  877]]>
          <![CDATA[<400>  877]]>
          000
          <![CDATA[<210>  878]]>
          <![CDATA[<400>  878]]>
          000
          <![CDATA[<210>  879]]>
          <![CDATA[<400>  879]]>
          000
          <![CDATA[<210>  880]]>
          <![CDATA[<400>  880]]>
          000
          <![CDATA[<210>  881]]>
          <![CDATA[<400>  881]]>
          000
          <![CDATA[<210>  882]]>
          <![CDATA[<400>  882]]>
          000
          <![CDATA[<210>  883]]>
          <![CDATA[<400>  883]]>
          000
          <![CDATA[<210>  884]]>
          <![CDATA[<400>  884]]>
          000
          <![CDATA[<210>  885]]>
          <![CDATA[<400>  885]]>
          000
          <![CDATA[<210>  886]]>
          <![CDATA[<400>  886]]>
          000
          <![CDATA[<210>  887]]>
          <![CDATA[<400>  887]]>
          000
          <![CDATA[<210>  888]]>
          <![CDATA[<400>  888]]>
          000
          <![CDATA[<210>  889]]>
          <![CDATA[<400>  889]]>
          000
          <![CDATA[<210>  890]]>
          <![CDATA[<400>  890]]>
          000
          <![CDATA[<210>  891]]>
          <![CDATA[<400>  891]]>
          000
          <![CDATA[<210>  892]]>
          <![CDATA[<400>  892]]>
          000
          <![CDATA[<210>  893]]>
          <![CDATA[<400>  893]]>
          000
          <![CDATA[<210>  894]]>
          <![CDATA[<400>  894]]>
          000
          <![CDATA[<210>  895]]>
          <![CDATA[<400>  895]]>
          000
          <![CDATA[<210>  896]]>
          <![CDATA[<400>  896]]>
          000
          <![CDATA[<210>  897]]>
          <![CDATA[<400>  897]]>
          000
          <![CDATA[<210>  898]]>
          <![CDATA[<400>  898]]>
          000
          <![CDATA[<210>  899]]>
          <![CDATA[<400>  899]]>
          000
          <![CDATA[<210>  900]]>
          <![CDATA[<400>  900]]>
          000
          <![CDATA[<210>  901]]>
          <![CDATA[<211>  219]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  901]]>
          gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag       60
          ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatataat ttcttgggta gtttgcagtt      120
          ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat      180
          ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacacc                             219
          <![CDATA[<210>  902]]>
          <![CDATA[<211>  189]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  902]]>
          gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag       60
          ataattggaa ttaatttgac gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat      120
          atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga      180
          cgaaacacc                                                              189
          <![CDATA[<210>  903]]>
          <![CDATA[<211>  159]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  903]]>
          gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag       60
          ataatattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat      120
          ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacacc                             159
          <![CDATA[<210>  904]]>
          <![CDATA[<211>  129]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  904]]>
          gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc ggactatcat       60
          atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga      120
          cgaaacacc                                                              129
          <![CDATA[<210>  905]]>
          <![CDATA[<400>  905]]>
          000
          <![CDATA[<210>  906]]>
          <![CDATA[<211>  213]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  906]]>
          ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt caaaacagcc       60
          ggaaatcaag tccgtttatc tcaaacttta gcatttaaat tagattttag ttaaatttcc      120
          tgctgaagct ctagtacgat aagcaacttg acctaagtgt aaagttgaga cttccttcag      180
          gtttatatag cttgtgcgcc gcttgggtac ctc                                   213
          <![CDATA[<210>  907]]>
          <![CDATA[<211>  183]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  907]]>
          ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt caaaacagcc       60
          ggaaatcaag tccgtttatc ttaaatttcc tgctgaagct ctagtacgat aagcaacttg      120
          acctaagtgt aaagttgaga cttccttcag gtttatatag cttgtgcgcc gcttgggtac      180
          ctc                                                                    183
          <![CDATA[<210>  908]]>
          <![CDATA[<211>  153]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  908]]>
          ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt caaaacagcc       60
          ggaaatagct ctagtacgat aagcaacttg acctaagtgt aaagttgaga cttccttcag      120
          gtttatatag cttgtgcgcc gcttgggtac ctc                                   153
          <![CDATA[<210>  909]]>
          <![CDATA[<211>  123]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  909]]>
          ctgcagtatt tagcatgccc cacccatctg caaggcattc tggatagtgt cagcaacttg       60
          acctaagtgt aaagttgaga cttccttcag gtttatatag cttgtgcgcc gcttgggtac      120
          ctc                                                                    123
          <![CDATA[<210>  910]]>
          <![CDATA[<211>  77]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  910]]>
          gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt       60
          caacttgttg gcgagat                                                      77
          <![CDATA[<210>  911]]>
          <![CDATA[<211>  87]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  911]]>
          gtttaagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctactt aaacaaggca aaatgccgtg       60
          tttatctcgt caacttgttg gcgagat                                           87
          <![CDATA[<210>  912]]>
          <![CDATA[<211>  77]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  912]]>
          gtttaagtac tctggaaaca gaatctactt aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt       60
          caacttgttg gcgagat                                                      77
          <![CDATA[<210>  913]]>
          <![CDATA[<400>  913]]>
          000
          <![CDATA[<210>  914]]>
          <![CDATA[<211>  3156]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  914]]>
          aagcgcaatt acatcctggg cctggatatc ggcatcacct ccgtgggcta cggcatcatc       60
          gactatgaga cacgggatgt gatcgacgcc ggcgtgagac tgttcaagga ggccaacgtg      120
          gagaacaatg agggccggcg gagcaagagg ggagcaaggc gcctgaagcg gagaaggcgc      180
          cacagaatcc agagagtgaa gaagctgctg ttcgattaca acctgctgac cgaccactcc      240
          gagctgtctg gcatcaatcc ttatgaggcc cgggtgaagg gcctgtccca gaagctgtct      300
          gaggaggagt tttctgccgc cctgctgcac ctggcaaaga ggagaggcgt gcacaacgtg      360
          aatgaggtgg aggaggacac cggcaacgag ctgagcacaa aggagcagat cagccgcaat      420
          tccaaggccc tggaggagaa gtatgtggcc gagctgcagc tggagcggct gaagaaggat      480
          ggcgaggtga ggggctccat caatcgcttc aagacctctg actacgtgaa ggaggccaag      540
          cagctgctga aggtgcagaa ggcctaccac cagctggatc agagctttat cgatacatat      600
          atcgacctgc tggagaccag gcgcacatac tatgagggac caggagaggg ctcccccttc      660
          ggctggaagg acatcaagga gtggtacgag atgctgatgg gccactgcac ctattttcca      720
          gaggagctga gatccgtgaa gtacgcctat aacgccgatc tgtacaacgc cctgaatgac      780
          ctgaacaacc tggtcatcac cagggatgag aacgagaagc tggagtacta tgagaagttc      840
          cagatcatcg agaacgtgtt caagcagaag aagaagccta cactgaagca gatcgccaag      900
          gagatcctgg tgaacgagga ggacatcaag ggctaccgcg tgaccagcac aggcaagcca      960
          gagttcacca atctgaaggt gtatcacgat atcaaggaca tcacagcccg gaaggagatc     1020
          atcgagaacg ccgagctgct ggatcagatc gccaagatcc tgaccatcta tcagagctcc     1080
          gaggacatcc aggaggagct gaccaacctg aatagcgagc tgacacagga ggagatcgag     1140
          cagatcagca atctgaaggg ctacaccggc acacacaacc tgtccctgaa ggccatcaat     1200
          ctgatcctgg atgagctgtg gcacacaaac gacaatcaga tcgccatctt taacaggctg     1260
          aagctggtgc caaagaaggt ggacctgagc cagcagaagg agatcccaac cacactggtg     1320
          gacgatttca tcctgtcccc cgtggtgaag cggagcttca tccagagcat caaagtgatc     1380
          aacgccatca tcaagaagta cggcctgccc aatgatatca tcatcgagct ggccagggag     1440
          aagaactcta aggacgccca gaagatgatc aatgagatgc agaagaggaa ccgccagacc     1500
          aatgagcgga tcgaggagat catcagaacc acaggcaagg agaacgccaa gtacctgatc     1560
          gagaagatca agctgcacga tatgcaggag ggcaagtgtc tgtatagcct ggaggccatc     1620
          cctctggagg acctgctgaa caatccattc aactacgagg tggatcacat catcccccgg     1680
          agcgtgagct tcgacaattc ctttaacaat aaggtgctgg tgaagcagga ggagaactct     1740
          aagaagggca ataggacccc tttccagtac ctgtctagct ccgattctaa gatcagctac     1800
          gagaccttca agaagcacat cctgaatctg gccaagggca agggccgcat ctctaagacc     1860
          aagaaggagt acctgctgga ggagcgggac atcaacagat tcagcgtgca gaaggacttc     1920
          atcaaccgga atctggtgga caccagatac gccacacgcg gcctgatgaa tctgctgcgg     1980
          tcctatttca gagtgaacaa tctggatgtg aaggtgaaga gcatcaacgg cggcttcacc     2040
          tcctttctgc ggagaaagtg gaagtttaag aaggagagaa acaagggcta taagcaccac     2100
          gccgaggatg ccctgatcat cgccaatgcc gacttcatct ttaaggagtg gaagaagctg     2160
          gacaaggcca agaaagtgat ggagaaccag atgttcgagg agaagcaggc cgagagcatg     2220
          cccgagatcg agaccgagca ggagtacaag gagattttca tcacacctca ccagatcaag     2280
          cacatcaagg acttcaagga ctacaagtat tcccacaggg tggataagaa gcccaaccgc     2340
          gagctgatca atgacaccct gtattctaca aggaaggacg ataagggcaa taccctgatc     2400
          gtgaacaatc tgaacggcct gtacgacaag gataatgaca agctgaagaa gctgatcaac     2460
          aagagccccg agaagctgct gatgtaccac cacgatcctc agacatatca gaagctgaag     2520
          ctgatcatgg agcagtacgg cgacgagaag aacccactgt ataagtacta tgaggagacc     2580
          ggcaactacc tgacaaagta ttccaagaag gataatggcc ccgtgatcaa gaagatcaag     2640
          tactatggca acaagctgaa tgcccacctg gacatcaccg acgattaccc caacagccgg     2700
          aataaggtgg tgaagctgag cctgaagcca tacaggttcg acgtgtacct ggacaacggc     2760
          gtgtataagt ttgtgacagt gaagaatctg gatgtgatca agaaggagaa ctactatgaa     2820
          gtgaatagca agtgctacga ggaggccaag aagctgaaga agatcagcaa ccaggccgag     2880
          ttcatcgcct ctttttacaa caatgacctg atcaagatca atggcgagct gtatagagtg     2940
          atcggcgtga acaatgatct gctgaaccgc atcgaagtga atatgatcga catcacctac     3000
          cgggagtatc tggagaacat gaatgataag aggccccctc gcatcatcaa gaccatcgcc     3060
          tctaagacac agagcatcaa gaagtactct acagacatcc tgggcaacct gtatgaggtg     3120
          aagagcaaga agcaccctca gatcatcaag aagggc                               3156
          <![CDATA[<210>  915]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  915]]>
          ccaaagaaga agcggaaggt c                                                 21
          <![CDATA[<210>  916]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  916]]>
          Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  917]]>
          <![CDATA[<211>  48]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  917]]>
          aagcgacctg ccgccacaaa gaaggctgga caggctaaga agaagaaa                    48
          <![CDATA[<210>  918]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  918]]>
          Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  919]]>
          <![CDATA[<211>  49]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  919]]>
          aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtg                   49
          <![CDATA[<210>  920]]>
          <![CDATA[<211>  87]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  920]]>
          gtttcagtac tctgtgctgg aaacagcaca gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg       60
          tttatctcgt caacttgttg gcgagat                                           87
          <![CDATA[<210>  921]]>
          <![CDATA[<211>  77]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  921]]>
          gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt       60
          caacttgttg gcgagat                                                      77
          <![CDATA[<210>  922]]>
          <![CDATA[<211>  773]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  922]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      480
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      540
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      600
          gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      660
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      720
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             773
          <![CDATA[<210>  923]]>
          <![CDATA[<211>  773]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  923]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccgt tgggggtcct gtagcctgtc agtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      480
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      540
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      600
          gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      660
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      720
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             773
          <![CDATA[<210>  924]]>
          <![CDATA[<211>  772]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  924]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      480
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      540
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      600
          gtacctcggc tcgaagggtc cttgtagccg tttcagtact ctggaaacag aatctactga      660
          aacaaggcaa aatgccgtgt ttatctcgtc aacttgttgg cgagattttt ttagatctgc      720
          ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct ggttataatt aa              772
          <![CDATA[<210>  925]]>
          <![CDATA[<211>  773]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  925]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      480
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      540
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      600
          gtacctcgac tcagtcttcc aacggggccc gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      660
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      720
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             773
          <![CDATA[<210>  926]]>
          <![CDATA[<211>  772]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  926]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccgc cagttcacaa ccgctccgag cgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      480
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      540
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      600
          gtacctcggg tttggcaaaa gcaaatttcg tttcagtact ctggaaacag aatctactga      660
          aacaaggcaa aatgccgtgt ttatctcgtc aacttgttgg cgagattttt ttagatctgc      720
          ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct ggttataatt aa              772
          <![CDATA[<210>  927]]>
          <![CDATA[<211>  773]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  927]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccgc cagttcacaa ccgctccgag cgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      480
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      540
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      600
          gtacctcgac tttgcgaacc aacgataggt gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      660
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      720
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             773
          <![CDATA[<210>  928]]>
          <![CDATA[<211>  779]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  928]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttgagggc ctatttccca tgattccttc atatttgcat atacgataca aggctgttag      420
          agagataatt ggaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa atacgtgacg      480
          tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta aaatggacta      540
          tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata tcttgtggaa      600
          aggacgaaac accgccagtt cacaaccgct ccgagcgttt cagtactctg gaaacagaat      660
          ctactgaaac aaggcaaaat gccgtgttta tctcgtcaac ttgttggcga gattttttta      720
          gatctgccca tgtaaggagg caaggcctgg ggacacccga gatgcctggt tataattaa       779
          <![CDATA[<210>  929]]>
          <![CDATA[<211>  773]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  929]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccgc gcggccggcg aacggggctc ggtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      480
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      540
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      600
          gtacctcgtt gggggtcctg tagcctgtca gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      660
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      720
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             773
          <![CDATA[<210>  930]]>
          <![CDATA[<211>  771]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  930]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccgc cccggagtcg aagacagttc gtttcagtac tctggaaaca      300
          gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt      360
          tttctgcagt atttagcatg ccccacccat ctgcaaggca ttctggatag tgtcaaaaca      420
          gccggaaatc aagtccgttt atctcaaact ttagcatttt gggaataaat gatatttgct      480
          atgctggtta aattagattt tagttaaatt tcctgctgaa gctctagtac gataagcaac      540
          ttgacctaag tgtaaagttg agacttcctt caggtttata tagcttgtgc gccgcttggg      600
          tacctcgccc cggagtcgaa gacagttcgt ttcagtactc tggaaacaga atctactgaa      660
          acaaggcaaa atgccgtgtt tatctcgtca acttgttggc gagatttttt tagatctgcc      720
          catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta a               771
          <![CDATA[<210>  931]]>
          <![CDATA[<211>  771]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  931]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccgg caacatcctg gggcacaagc gtttcagtac tctggaaaca      300
          gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt      360
          tttctgcagt atttagcatg ccccacccat ctgcaaggca ttctggatag tgtcaaaaca      420
          gccggaaatc aagtccgttt atctcaaact ttagcatttt gggaataaat gatatttgct      480
          atgctggtta aattagattt tagttaaatt tcctgctgaa gctctagtac gataagcaac      540
          ttgacctaag tgtaaagttg agacttcctt caggtttata tagcttgtgc gccgcttggg      600
          tacctcggca acatcctggg gcacaagcgt ttcagtactc tggaaacaga atctactgaa      660
          acaaggcaaa atgccgtgtt tatctcgtca acttgttggc gagatttttt tagatctgcc      720
          catgtaagga ggcaaggcct ggggacaccc gagatgcctg gttataatta a               771
          <![CDATA[<210>  932]]>
          <![CDATA[<211>  743]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  932]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatataatt tcttgggtag      120
          tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag      180
          tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac      240
          caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt      300
          gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt ttttctgcag tatttagcat gccccaccca      360
          tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac      420
          tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat      480
          ttcctgctga agctctagta cgataagcaa cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct      540
          tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc      600
          gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt      660
          caacttgttg gcgagatttt tttagatctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac      720
          ccgagatgcc tggttataat taa                                              743
          <![CDATA[<210>  933]]>
          <![CDATA[<211>  713]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  933]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgacg tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      120
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      180
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      240
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      300
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      360
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      420
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      480
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      540
          gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      600
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      660
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             713
          <![CDATA[<210>  934]]>
          <![CDATA[<211>  683]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  934]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taatattatg ttttaaaatg gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag      120
          tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac      180
          caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt      240
          gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt ttttctgcag tatttagcat gccccaccca      300
          tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac      360
          tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat      420
          ttcctgctga agctctagta cgataagcaa cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct      480
          tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc      540
          gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt      600
          caacttgttg gcgagatttt tttagatctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac      660
          ccgagatgcc tggttataat taa                                              683
          <![CDATA[<210>  935]]>
          <![CDATA[<211>  653]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  935]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggcg       60
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      120
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      180
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      240
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      300
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt tgggaataaa tgatatttgc      360
          tatgctggtt aaattagatt ttagttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      420
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      480
          gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      540
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      600
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             653
          <![CDATA[<210>  936]]>
          <![CDATA[<211>  743]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  936]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatctcaaac tttagcattt aaattagatt ttagttaaat      480
          ttcctgctga agctctagta cgataagcaa cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct      540
          tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc      600
          gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt      660
          caacttgttg gcgagatttt tttagatctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac      720
          ccgagatgcc tggttataat taa                                              743
          <![CDATA[<210>  937]]>
          <![CDATA[<211>  713]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  937]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat caagtccgtt tatcttaaat ttcctgctga agctctagta cgataagcaa      480
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      540
          gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      600
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      660
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             713
          <![CDATA[<210>  938]]>
          <![CDATA[<211>  683]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  938]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcaaaac      420
          agccggaaat agctctagta cgataagcaa cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct      480
          tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc      540
          gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt      600
          caacttgttg gcgagatttt tttagatctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac      660
          ccgagatgcc tggttataat taa                                              683
          <![CDATA[<210>  939]]>
          <![CDATA[<211>  653]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  939]]>
          tgtactagtg agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct       60
          gttagagaga taattggaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg      120
          tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg      180
          gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg      240
          tggaaaggac gaaacaccga ctttgcgaac caacgatagg tgtttcagta ctctggaaac      300
          agaatctact gaaacaaggc aaaatgccgt gtttatctcg tcaacttgtt ggcgagattt      360
          ttttctgcag tatttagcat gccccaccca tctgcaaggc attctggata gtgtcagcaa      420
          cttgacctaa gtgtaaagtt gagacttcct tcaggtttat atagcttgtg cgccgcttgg      480
          gtacctcgcc agttcacaac cgctccgagc gtttcagtac tctggaaaca gaatctactg      540
          aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt tttagatctg      600
          cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac ccgagatgcc tggttataat taa             653
          <![CDATA[<210>  940]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  940]]>
          Gly Ser Val Asp 
          1               
          <![CDATA[<210>  941]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  941]]>
          Gly Ser Gly Ser 
          1               
          <![CDATA[<210>  942]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  942]]>
          Pro Ala Ala Lys Lys Lys Lys Leu Asp 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  943]]>
          <![CDATA[<211>  27]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  943]]>
          ccggcagcta agaaaaagaa actggat                                           27
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054
Figure 12_A0101_SEQ_0055
Figure 12_A0101_SEQ_0056
Figure 12_A0101_SEQ_0057
Figure 12_A0101_SEQ_0058
Figure 12_A0101_SEQ_0059
Figure 12_A0101_SEQ_0060
Figure 12_A0101_SEQ_0061
Figure 12_A0101_SEQ_0062
Figure 12_A0101_SEQ_0063
Figure 12_A0101_SEQ_0064
Figure 12_A0101_SEQ_0065
Figure 12_A0101_SEQ_0066
Figure 12_A0101_SEQ_0067
Figure 12_A0101_SEQ_0068
Figure 12_A0101_SEQ_0069
Figure 12_A0101_SEQ_0070
Figure 12_A0101_SEQ_0071
Figure 12_A0101_SEQ_0072
Figure 12_A0101_SEQ_0073
Figure 12_A0101_SEQ_0074
Figure 12_A0101_SEQ_0075
Figure 12_A0101_SEQ_0076
Figure 12_A0101_SEQ_0077
Figure 12_A0101_SEQ_0078
Figure 12_A0101_SEQ_0079
Figure 12_A0101_SEQ_0080
Figure 12_A0101_SEQ_0081
Figure 12_A0101_SEQ_0082
Figure 12_A0101_SEQ_0083
Figure 12_A0101_SEQ_0084
Figure 12_A0101_SEQ_0085
Figure 12_A0101_SEQ_0086
Figure 12_A0101_SEQ_0087
Figure 12_A0101_SEQ_0088
Figure 12_A0101_SEQ_0089
Figure 12_A0101_SEQ_0090
Figure 12_A0101_SEQ_0091
Figure 12_A0101_SEQ_0092
Figure 12_A0101_SEQ_0093
Figure 12_A0101_SEQ_0094
Figure 12_A0101_SEQ_0095
Figure 12_A0101_SEQ_0096
Figure 12_A0101_SEQ_0097
Figure 12_A0101_SEQ_0098
Figure 12_A0101_SEQ_0099
Figure 12_A0101_SEQ_0100
Figure 12_A0101_SEQ_0101
Figure 12_A0101_SEQ_0102
Figure 12_A0101_SEQ_0103
Figure 12_A0101_SEQ_0104
Figure 12_A0101_SEQ_0105
Figure 12_A0101_SEQ_0106
Figure 12_A0101_SEQ_0107
Figure 12_A0101_SEQ_0108
Figure 12_A0101_SEQ_0109
Figure 12_A0101_SEQ_0110
Figure 12_A0101_SEQ_0111
Figure 12_A0101_SEQ_0112
Figure 12_A0101_SEQ_0113
Figure 12_A0101_SEQ_0114
Figure 12_A0101_SEQ_0115
Figure 12_A0101_SEQ_0116
Figure 12_A0101_SEQ_0117
Figure 12_A0101_SEQ_0118
Figure 12_A0101_SEQ_0119
Figure 12_A0101_SEQ_0120
Figure 12_A0101_SEQ_0121
Figure 12_A0101_SEQ_0122
Figure 12_A0101_SEQ_0123
Figure 12_A0101_SEQ_0124
Figure 12_A0101_SEQ_0125
Figure 12_A0101_SEQ_0126
Figure 12_A0101_SEQ_0127
Figure 12_A0101_SEQ_0128
Figure 12_A0101_SEQ_0129
Figure 12_A0101_SEQ_0130
Figure 12_A0101_SEQ_0131
Figure 12_A0101_SEQ_0132
Figure 12_A0101_SEQ_0133
Figure 12_A0101_SEQ_0134
Figure 12_A0101_SEQ_0135
Figure 12_A0101_SEQ_0136
Figure 12_A0101_SEQ_0137
Figure 12_A0101_SEQ_0138
Figure 12_A0101_SEQ_0139
Figure 12_A0101_SEQ_0140
Figure 12_A0101_SEQ_0141
Figure 12_A0101_SEQ_0142
Figure 12_A0101_SEQ_0143
Figure 12_A0101_SEQ_0144
Figure 12_A0101_SEQ_0145
Figure 12_A0101_SEQ_0146
Figure 12_A0101_SEQ_0147
Figure 12_A0101_SEQ_0148
Figure 12_A0101_SEQ_0149
Figure 12_A0101_SEQ_0150
Figure 12_A0101_SEQ_0151
Figure 12_A0101_SEQ_0152
Figure 12_A0101_SEQ_0153
Figure 12_A0101_SEQ_0154
Figure 12_A0101_SEQ_0155
Figure 12_A0101_SEQ_0156
Figure 12_A0101_SEQ_0157
Figure 12_A0101_SEQ_0158
Figure 12_A0101_SEQ_0159
Figure 12_A0101_SEQ_0160
Figure 12_A0101_SEQ_0161
Figure 12_A0101_SEQ_0162
Figure 12_A0101_SEQ_0163
Figure 12_A0101_SEQ_0164
Figure 12_A0101_SEQ_0165
Figure 12_A0101_SEQ_0166
Figure 12_A0101_SEQ_0167
Figure 12_A0101_SEQ_0168
Figure 12_A0101_SEQ_0169
Figure 12_A0101_SEQ_0170
Figure 12_A0101_SEQ_0171
Figure 12_A0101_SEQ_0172
Figure 12_A0101_SEQ_0173
Figure 12_A0101_SEQ_0174
Figure 12_A0101_SEQ_0175
Figure 12_A0101_SEQ_0176
Figure 12_A0101_SEQ_0177
Figure 12_A0101_SEQ_0178
Figure 12_A0101_SEQ_0179
Figure 12_A0101_SEQ_0180
Figure 12_A0101_SEQ_0181
Figure 12_A0101_SEQ_0182
Figure 12_A0101_SEQ_0183
Figure 12_A0101_SEQ_0184
Figure 12_A0101_SEQ_0185
Figure 12_A0101_SEQ_0186
Figure 12_A0101_SEQ_0187
Figure 12_A0101_SEQ_0188
Figure 12_A0101_SEQ_0189

Claims (124)

  1. 一種組合物，其包含編碼一或多個嚮導RNA及Cas9的單一核酸分子，其中該單一核酸分子包含： a.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； b.     編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸； c.     編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致； d.     編碼一或多個間隔子序列的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該一或多個間隔子序列選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者； e.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12及20中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； f.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8及20中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； g.     編碼一或多個選自SEQ ID NO: 1、101及102中之任一者之間隔子序列的第一核酸，及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； h.     編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； i.      編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者之第一及第二間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； j.      編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對與選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列至少90%一致：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； k.     編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；8與25；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；8與19；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；4與14；7與19；4與26；8與26；7與25；1與21；3與26；2與26；8與14；1與14；2與14；3與14；1與26；7與21；7與14；及7與26；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； l.      編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID No: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與12；8與27；4與11；及4與25；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； m.    編碼嚮導RNA對的第一核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；7與19；7與25；1與21；3與26；3與14；7與21；及7與14；以及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸； n.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與10；4與18；4與28；8與12；4與13；3與10；7與12；7與13；4與28；及7與18； o.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與10；1與12；8與12；4與13；7與12；7與28；7與18； p.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 7與12之第一及第二間隔子序列； q.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 4與12之第一及第二間隔子序列；或 r.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 4與18之第一及第二間隔子序列；或 s.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 2與12之第一及第二間隔子序列；或 t.      編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 4與13之第一及第二間隔子序列；或 u.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 8與12之第一及第二間隔子序列；或 v.     編碼嚮導RNA對的第一核酸及編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的第二核酸，該嚮導RNA對包含SEQ ID NO: 7與23之第一及第二間隔子序列。
  2. 如請求項1之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑。
  3. 如請求項1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物6。
  4. 如請求項1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物1。
  5. 如請求項1或2之組合物，其進一步包含DNA-PK抑制劑，其中該DNA-PK抑制劑為化合物2。
  6. 如請求項1至5中任一項之組合物，其中該嚮導RNA為sgRNA。
  7. 如請求項1至6中任一項之組合物，其中該嚮導RNA經修飾。
  8. 如請求項7之組合物，其中該修飾改變一或多個2'位置及/或磷酸二酯鍵聯。
  9. 如請求項7至9中任一項之組合物，其中該修飾改變該嚮導RNA之前三個核苷酸中的一或多者或全部。
  10. 如請求項7至9中任一項之組合物，其中該修飾改變該嚮導RNA之最後三個核苷酸中的一或多者或全部。
  11. 如請求項7至10中任一項之組合物，其中該修飾包括以下中之一或多者：硫代磷酸酯修飾、2'-OMe修飾、2'-O-MOE修飾、2'-F修飾、2'-O-次甲基-4'橋修飾、3'-硫代膦醯基乙酸酯修飾或2'-去氧修飾。
  12. 如前述請求項中任一項之組合物，其中該單一核酸分子與脂質奈米粒子(LNP)締合。
  13. 如請求項1至12中任一項之組合物，其中該單一核酸分子為病毒載體。
  14. 如請求項13之組合物，其中該病毒載體為腺相關病毒載體、慢病毒載體、整合酶缺乏型慢病毒載體、腺病毒載體、牛痘病毒載體、α病毒載體，或單純疱疹病毒載體。
  15. 如請求項13之組合物，其中該病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。
  16. 如請求項15之組合物，其中該AAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh10、AAVrh74或AAV9載體，其中AAV後之數字指示AAV血清型。
  17. 如請求項16之組合物，其中該AAV載體為AAV血清型9載體。
  18. 如請求項16之組合物，其中該AAV載體為AAVrh10載體。
  19. 如請求項16之組合物，其中該AAV載體為AAVrh74載體。
  20. 如請求項11至19中任一項之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含組織特異性啟動子。
  21. 如請求項11至19中任一項之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含肌肉特異性啟動子，視情況其中該肌肉特異性啟動子為肌肉肌酸激酶啟動子、結蛋白啟動子、MHCK7啟動子、SPc5-12啟動子或CK8e啟動子。
  22. 如請求項11至19中任一項之組合物，其包含病毒載體，其中該病毒載體包含U6、H1或7SK啟動子。
  23. 如請求項1至22中任一項之組合物，其包含編碼SaCas9的核酸，其中該SaCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 711。
  24. 如請求項1至22中任一項之組合物，其包含編碼SaCas9的核酸，其中該SaCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 711之變異體。
  25. 如請求項1至22中任一項之組合物，其包含編碼SaCas9之核酸，其中該SaCas9包含選自SEQ ID NO: 715至717中之任一者的胺基酸序列。
  26. 如請求項1至25中任一項之組合物，及醫藥學上可接受之賦形劑。
  27. 一種組合物，其包含含有SEQ ID NO: 1-8、10-28與101-154中之任一者的嚮導RNA。
  28. 如請求項1至27中任一項之組合物，其用於治療第1型肌強直性營養不良(DM1)。
  29. 如請求項1至27中任一項之組合物，其用於在DMPK基因中產生雙股斷裂。
  30. 如請求項1至27中任一項之組合物，其用於切除DMPK基因之3' UTR中的CTG重複序列。
  31. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將如請求項1至27中任一項之組合物及視情況存在之DNA-PK抑制劑遞送至細胞。
  32. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i)     編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.  一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c.  與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； ii)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 iii)   視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  33. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i)     編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b. 包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.  與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； ii)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 iii)   視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  34. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將如請求項1至27中任一項之組合物遞送至細胞。
  35. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i)     編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.  一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c.  與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； ii)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 iii)   視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  36. 如請求項35之方法，其中該一或多個間隔子序列： a.     選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、23、25、26、27及28中之任一者； b.     選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8、12、18及20中之任一者； c.     選自SEQ ID NO: 1、2、3、4、7、8及20中之任一者；或 d.     選自SEQ ID NO: 4、12及18中之任一者；或 e.     選自SEQ ID NO: 1、101及102中之任一者。
  37. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i)     編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  選自以下的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b. 包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.  與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； ii)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 iii)   視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  38. 如請求項37之方法，其中該第一及第二間隔子序列： a.     選自SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；8與25；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；8與19；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；4與14；7與19；4與26；8與26；7與25；1與21；3與26；2與26；8與14；1與14；2與14；3與14；1與26；7與21；7與14；及7與26； b.     選自以下中之任一者：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；8與10；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；7與10；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；8與27；4與11；及4與25； c.     選自以下中之任一者：SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與28；1與12；8與12；4與13；4與23；3與10；8與20；1與10；2與23；2與20；8與23；1與18；2與13；2與18；3與18；2與28；7與12；8與18；3與20；3與23；2與13；1與23；8與13；3與28；8與28；1與13；1與20；1與28；4與27；7與20；7與23；7與13；7與28；2與27；4與11；4與25；4與28；4與19；4與15；8與11；3與27；2與25；2與11；7與18；3與25；8與15；3與11；3與19；1與15；3與15；1與27；2與15；2與19；1與11；1與25；4與21；8與21；7與27；7與15；1與19；2與21；7與11；3與21；7與19；7與25；1與21；3與26；3與14；7與21；及7與14； d.     選自SEQ ID NO: 4與12；4與18；2與10；4與28；8與12；4與13；3與10；7與12；7與13；4與28；及7與18中之任一者； e.     選自SEQ ID NO: 4與12；2與12；3與12；4與20；4與18；2與10；4與10；1與12；8與12；4與13；7與12；7與28；7與18中之任一者；或 f.     選自SEQ ID NO: 7與12；4與12；4與18；8與12；或7與23中之任一者；或 g.     選自SEQ ID NO: 4與12；4與18；8與12中之任一者。
  39. 如請求項32至38中任一項之方法，其中該單一核酸分子在單一載體上遞送至該細胞。
  40. 如請求項32至39中任一項之方法，包含投與DNA-PK抑制劑。
  41. 如請求項40之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物6。
  42. 如請求項40之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物1。
  43. 如請求項40之方法，其中該DNA-PK抑制劑為化合物2。
  44. 如請求項32至43中任一項之方法，其中該SaCas9包含胺基酸序列SEQ ID NO: 711。
  45. 如請求項32至43中任一項之方法，其中該SaCas9為胺基酸序列SEQ ID NO: 711之變異體。
  46. 如請求項32至43或45中任一項之方法，其中該SaCas9包含選自SEQ ID NO: 715至717中之任一者的胺基酸序列。
  47. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含hU6c啟動子。
  48. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含選自以下的啟動子： a.     包含SEQ ID NO: 705、901、902、903或904之序列的核酸；及 b.     與序列SEQ ID NO: 705、901、902、903或904至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列。
  49. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含7SK2啟動子。
  50. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含選自以下的啟動子： a.     包含SEQ ID NO: 706、906、907、908或909之序列的核酸；及 b.     與SEQ ID NO: 706、906、907、908或909之序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的核苷酸序列。
  51. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含H1m啟動子。
  52. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含含有序列SEQ ID NO: 709的5' ITR。
  53. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，且其中該AAV載體包含含有序列SEQ ID NO: 710的3' ITR。
  54. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該一或多個嚮導RNA或嚮導RNA對為包含選自SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921之支架序列的sgRNA。
  55. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該一或多個嚮導RNA或嚮導RNA對為包含選自SEQ ID NO: 910、911、912、920或921之支架序列的sgRNA。
  56. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該一或多個嚮導RNA或嚮導RNA對為包含SEQ ID NO: 921之支架序列的sgRNA。
  57. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該核酸分子至少編碼第一嚮導RNA及第二嚮導RNA。
  58. 如請求項57之組合物或方法，其中該核酸分子編碼該第一嚮導RNA的間隔子序列、該第一嚮導RNA的支架序列、該第二嚮導RNA的間隔子序列，及該第二嚮導RNA的支架序列。
  59. 如請求項58之組合物或方法，其中該第一嚮導RNA的該間隔子序列與該第二嚮導RNA的該間隔子序列相同。
  60. 如請求項58之組合物或方法，其中該第一嚮導RNA的該間隔子序列與該第二嚮導RNA的該間隔子序列不同。
  61. 如請求項59或60之組合物或方法，其中該第一嚮導RNA的該支架序列與該第二嚮導RNA的該支架序列相同。
  62. 如請求項59或60之組合物或方法，其中該第一嚮導RNA的該支架序列與該第二嚮導RNA的該支架序列不同。
  63. 如請求項61或請求項62之組合物或方法，其中該第一嚮導RNA的該支架序列包含選自由SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921組成之群的序列，且其中該第二嚮導RNA的該支架序列包含選自由SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921組成之群的不同序列。
  64. 如請求項61至63中任一項之組合物或方法，其中該第一嚮導RNA的該支架序列為SEQ ID NO: 921。
  65. 如請求項61至63中任一項之組合物或方法，其中該第二嚮導RNA的該支架序列為SEQ ID NO: 921。
  66. 如請求項61之組合物或方法，其中該第一嚮導RNA的該支架序列為SEQ ID NO: 921且其中該第二嚮導RNA的該支架序列為SEQ ID NO: 921。
  67. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  68. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：第一sgRNA支架序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA嚮導序列之核酸的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之啟動子的反向互補序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、以與SaCas9之該啟動子相同的方向表現第二sgRNA的啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  69. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
  70. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸、聚腺苷酸化序列、以與SaCas9之該啟動子相同的方向表現編碼第一嚮導RNA之核酸用的啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、以與SaCas9之該啟動子相同的方向表現第二sgRNA用的啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  71. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
  72. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該單一核酸分子為AAV載體，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼SaCas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼SaCas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
  73. 如請求項67至72中任一項之組合物或方法，其中該第一sgRNA包含SaU4 (SEQ ID NO: 4)且該第二sgRNA包含SaD4 (SEQ ID NO: 12)。
  74. 如請求項67至72中任一項之組合物或方法，其中該第一sgRNA包含SaU7 (SEQ ID NO: 7)且該第二sgRNA包含SaD10 (SEQ ID NO: 18)。
  75. 如請求項67至74中任一項之組合物或方法，其中該第一sgRNA嚮導序列與該第二sgRNA嚮導序列相同。
  76. 如請求項67至74中任一項之組合物或方法，其中該第一sgRNA嚮導序列與該第二sgRNA嚮導序列不同。
  77. 如請求項67至76中任一項之組合物或方法，其中該第一sgRNA支架序列與該第二sgRNA支架序列相同。
  78. 如請求項67至76中任一項之組合物或方法，其中該第一sgRNA支架序列與該第二sgRN支架序列不同。
  79. 如請求項77或請求項78之組合物或方法，其中該第一sgRNA支架序列包含選自由SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921組成之群的序列，且其中該第二sgRNA支架序列包含選自由SEQ ID NO: 500、910、911、912、920或921組成之群的不同序列。
  80. 如請求項77至79中任一項之組合物或方法，其中該第一sgRNA支架序列為SEQ ID NO: 921。
  81. 如請求項77至79中任一項之組合物或方法，其中該第二sgRNA支架序列為SEQ ID NO: 921。
  82. 如請求項77之組合物或方法，其中該第一sgRNA支架序列為SEQ ID NO: 921且其中該第二sgRNA支架序列為SEQ ID NO: 921。
  83. 一種減少病灶陽性細胞數目的方法，該方法包含將一或多個核酸分子遞送至細胞，該一或多個核酸分子包含： i)     編碼嚮導RNA的核酸，其中該嚮導RNA包含： a.  一或多個選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者的間隔子序列； b. 一或多個間隔子序列，該一或多個間隔子序列包含選自SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者之間隔子序列的至少20或21個鄰接核苷酸；或 c.  與SEQ ID NO: 1-8、10-28及101-154中之任一者至少90%一致的一或多個間隔子序列； ii)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 iii)   視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  84. 一種減少病灶陽性細胞數目的方法，該方法包含將一或多個核酸分子遞送至細胞，該一或多個核酸分子包含： i)     編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b. 包含i) a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.  與i) a.或i) b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列； iv)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 v)     視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  85. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其包含嚮導RNA對，其中該嚮導RNA對具有切除功能且亦充當單一嚮導切割器。
  86. 如請求項83或84之方法，其中該第一核酸與該第二核酸存在於同一核酸分子中。
  87. 如請求項83或84之方法，其中該第一核酸與該第二核酸存在於不同的核酸分子中。
  88. 如請求項87之方法，其中該等各別核酸分子各自存在於不同載體中。
  89. 如請求項83至88中任一項之方法，其中編碼該SaCas9的該核酸不編碼嚮導RNA。
  90. 如請求項84至89中任一項之方法，其中編碼該SaCas9的該核酸編碼一或多個嚮導RNA，該一或多個嚮導RNA包含： a.     選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與a.或b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列。
  91. 一種包含第一核酸分子及第二核酸分子的組合物，其中該第一核酸分子編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)且該第二核酸分子編碼一或多個嚮導RNA，該一或多個嚮導RNA包含： a.     選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與a.或b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列。
  92. 如請求項91之組合物，其中該第一核酸分子不編碼嚮導RNA。
  93. 如請求項91之組合物，其中該第一核酸分子編碼： a.     選自以下中之任一者的第一及第二間隔子序列：SEQ ID NO: 1與10；1與11；1與12；1與13；1與14；1與15；1與16；1與17；1與18；1與19；1與20；1與21；1與22；1與23；1與24；1與25；1與26；1與27；1與28；2與10；2與11；2與12；2與13；2與14；2與15；2與16；2與17；2與18；2與19；2與20；2與21；2與22；2與23；2與24；2與25；2與26；2與27；2與28；3與10；3與11；3與12；3與13；3與14；3與15；3與16；3與17；3與18；3與19；3與20；3與21；3與22；3與23；3與24；3與25；3與26；3與27；3與28；4與10；4與11；4與12；4與13；4與14；4與15；4與16；4與17；4與18；4與19；4與20；4與21；4與22；4與23；4與24；4與25；4與26；4與27；4與28；5與10；5與11；5與12；5與13；5與14；5與15；5與16；5與17；5與18；5與19；5與20；5與21；5與22；5與23；5與24；5與25；5與26；5與27；5與28；6與10；6與11；6與12；6與13；6與14；6與15；6與16；6與17；6與18；6與19；6與20；6與21；6與22；6與23；6與24；6與25；6與26；6與27；6與28；7與10；7與11；7與12；7與13；7與14；7與15；7與16；7與17；7與18；7與19；7與20；7與21；7與22；7與23；7與24；7與25；7與26；7與27；7與28；8與10；8與11；8與12；8與13；8與14；8與15；8與16；8與17；8與18；8與19；8與20；8與21；8與22；8與23；8與24；8與25；8與26；8與27；及8與28； b.     包含a.之第一及第二間隔子序列中之任一者之至少20或21個鄰接核苷酸的第一及第二間隔子序列； c.     與a.或b.之第一及第二間隔子序列中之任一者至少90%一致的第一及第二間隔子序列。
  94. 如請求項91至93中任一項之組合物，其中該第一核酸分子存在於第一載體中，且該第二核酸分子存在於不同的第二載體中。
  95. 如請求項94之組合物，其中該第一及第二載體為AAV載體。
  96. 如請求項95之組合物，其中該AAV載體為AAV9載體。
  97. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
  98. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列及第二sgRNA支架序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸，及聚腺苷酸化序列。
  99. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  100. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸、聚腺苷酸化序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用的hU6c啟動子、編碼第一sgRNA嚮導序列的核酸、第一sgRNA支架序列、表現第二sgRNA用的7SK2啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  101. 一種包含AAV載體的組合物，其中該載體就正股而言自5'至3'包含：編碼第一sgRNA支架序列之序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA之序列的反向互補序列、編碼第一sgRNA之核酸表現用之7SK2或hU6c啟動子的反向互補序列、編碼Cas9之核酸表現用的啟動子(例如CK8e)、編碼Cas9的核酸、聚腺苷酸化序列、表現第二sgRNA用的hU6c啟動子、第二sgRNA嚮導序列，及第二sgRNA支架序列。
  102. 如請求項97至101中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。
  103. 如請求項97至101中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。
  104. 如請求項97至101中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 18。
  105. 如請求項97至101中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 2，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。
  106. 如請求項97至101中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 13。
  107. 如請求項97至101中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 8，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。
  108. 如請求項97至101中任一項之組合物，其中該第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 23。
  109. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 7，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。
  110. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。
  111. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 18。
  112. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 2，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。
  113. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 4，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 13。
  114. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 8，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 12。
  115. 一種包含核酸分子的組合物，該核酸分子包含編碼兩種不同sgRNA嚮導序列的核酸，其中第一sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 7，且第二sgRNA嚮導序列包含SEQ ID NO: 23。
  116. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將如請求項109至115中任一項之組合物、金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)蛋白或編碼SaCas9蛋白的核酸及視情況存在的DNA-PK抑制劑遞送至細胞。
  117. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將如請求項109至115中任一項之組合物及金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)蛋白或編碼SaCas9蛋白的核酸遞送至細胞。
  118. 一種治療第1型肌強直性營養不良(DM1)的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： iv)    編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； b. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； c.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 18； d. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 2，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； e.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 13； f.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 8，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； g. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 23；或 d. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； v)     編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 vi)    視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  119. 一種切除DMPK基因之3' UTR中之CTG重複序列的方法，該方法包含將單一核酸分子遞送至細胞，該單一核酸分子包含： i)     編碼嚮導RNA對的核酸，該嚮導RNA對包含： a.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； b. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； c.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 18； d. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 2，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； e.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 4，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 13； f.  第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 8，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 12； g. 第一及第二間隔子序列，其中該第一間隔子序列包含SEQ ID NO: 7，且該第二間隔子序列包含SEQ ID NO: 23； ii)    編碼金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)的核酸；及 iii)   視情況存在的DNA-PK抑制劑。
  120. 如請求項109至115中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)或編碼SaCas9的核酸。
  121. 如請求項109至115或120中任一項之組合物，其中該組合物與脂質奈米粒子締合。
  122. 如請求項1至26中任一項之組合物或如請求項31至108或116至121中任一項之方法，其中SV40核定域信號(NLS)與該Cas9的N端融合且核質蛋白NLS與該Cas9蛋白的C端融合。
  123. 如請求項1至26中任一項之組合物或如請求項31至108或116至121中任一項之方法，其中c-myc核定域信號(NLS)與該Cas9的N端融合且SV40 NLS及/或核質蛋白NLS與該Cas9的C端融合。
  124. 如請求項1至26中任一項之組合物或如請求項31至108或116至121中任一項之方法，其中c-myc NLS與該Cas9的N端融合(例如藉助於連接子，諸如GSVD (SEQ ID NO: 940))，SV40 NLS與該Cas9的C端融合(例如藉助於連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))，且核質蛋白NLS與該SV-40 NLS的C端融合(例如藉助於連接子，諸如GSGS (SEQ ID NO: 941))。
TW111107015A 2021-02-26 2022-02-25 以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法 TW202302848A (zh)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163154442P 2021-02-26 2021-02-26
US63/154,442 2021-02-26
US202163159815P 2021-03-11 2021-03-11
US63/159,815 2021-03-11
US202163184462P 2021-05-05 2021-05-05
US63/184,462 2021-05-05
US202163276003P 2021-11-05 2021-11-05
US63/276,003 2021-11-05
US202263306883P 2022-02-04 2022-02-04
US63/306,883 2022-02-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202302848A true TW202302848A (zh) 2023-01-16

Family

ID=80820277

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111107015A TW202302848A (zh) 2021-02-26 2022-02-25 以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240181081A1 (zh)
EP (1) EP4298222A1 (zh)
TW (1) TW202302848A (zh)
WO (1) WO2022182957A1 (zh)

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
WO1993013121A1 (en) 1991-12-24 1993-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
WO1995032305A1 (en) 1994-05-19 1995-11-30 Dako A/S Pna probes for detection of neisseria gonorrhoeae and chlamydia trachomatis
SG10202108118RA (en) 2001-11-13 2021-08-30 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
AU2003295366B2 (en) 2002-11-04 2011-11-24 Advisys, Inc. Synthetic muscle promoters with activities exceeding naturally occurring regulatory sequences in cardiac cells
JP6373763B2 (ja) 2012-02-17 2018-08-22 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアＴｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ａａｖベクター成分、及び、細胞、臓器並びに組織への遺伝子導入のための方法
NZ731797A (en) 2012-04-24 2018-08-31 Vertex Pharma Dna-pk inhibitors
PL2931898T3 (pl) 2012-12-12 2016-09-30 Le Cong Projektowanie i optymalizacja systemów, sposoby i kompozycje do manipulacji sekwencją z domenami funkcjonalnymi
KR20150095861A (ko) 2012-12-17 2015-08-21 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 Rna-가이드된 인간 게놈 조작
CA2901676C (en) * 2013-02-25 2023-08-22 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
RU2676259C2 (ru) 2013-03-12 2018-12-27 Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед Ингибиторы днк-пк
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
EP3129484A1 (en) 2014-03-25 2017-02-15 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for treating hiv infection and aids
ES2847252T3 (es) * 2016-02-22 2021-08-02 Caribou Biosciences Inc Procedimientos de modulación de resultados de reparación de ADN
US11427838B2 (en) * 2016-06-29 2022-08-30 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Materials and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 (DM1) and other related disorders
JP7033583B2 (ja) 2016-07-13 2022-03-10 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ゲノム編集効率を高めるための方法、組成物及びキット
CN110337493B (zh) * 2016-10-28 2024-03-12 吉尼松公司 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法
CN111757876B (zh) 2018-01-17 2024-03-22 沃泰克斯药物股份有限公司 Dna-pk抑制剂
AU2019209290B2 (en) 2018-01-17 2024-03-07 Vertex Pharmaceuticals Incorporated DNA-PK inhibitors
JP7483612B2 (ja) 2018-01-17 2024-05-15 バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ゲノム編集効率を増加するためのキノキサリノン化合物、組成物、方法、およびキット
EP4022057A1 (en) * 2019-08-27 2022-07-06 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of disorders associated with repetitive dna
WO2022098933A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of dm1 with slucas9 and sacas9

Also Published As

Publication number Publication date
EP4298222A1 (en) 2024-01-03
WO2022182957A1 (en) 2022-09-01
US20240181081A1 (en) 2024-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220010313A1 (en) Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus
EP3126497B1 (en) Crispr/cas-related methods and compositions for treating herpes simplex virus type 1 (hsv-1)
JP2024099582A (ja) アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法
US20220096606A1 (en) Compositions and Methods for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
BR112020005287A2 (pt) composições e métodos para edição de gene ttr e tratar amiloidose attr
JP2021519071A (ja) シュードウリジン化のための核酸分子
US20230414648A1 (en) Compositions and Methods for Treatment of DM1 with SLUCAS9 and SACAS9
CA3134544A1 (en) Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
US20240173432A1 (en) Compositions and Methods for Treatment of Myotonic Dystrophy Type 1 with CRISPR/SluCas9
US20240252683A1 (en) Precise Excisions of Portions of Exon 51 for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
US20230073008A1 (en) Antisense nucleic acid that induces skipping of exon 50
TW202302848A (zh) 以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法
WO2022229851A1 (en) Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
WO2022248879A1 (en) Composition and method for adar-mediated rna editing
US20240415984A1 (en) Precise Excisions of Portions of Exons for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
US20250090686A1 (en) Precise Excisions of Portions of Exon 44, 50, and 53 for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
US20240344059A1 (en) Gene Editing of Regulatory Elements
JP2023540783A (ja) デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のための組成物及び方法
WO2022234519A1 (en) Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
US10443057B2 (en) Multi-targets interfering RNA molecules and their applications
KR20220155585A (ko) Sirt1 발현을 사용하는 진단 방법