TW202237818A

TW202237818A - 成熟化劑

Info

Publication number: TW202237818A
Application number: TW110143209A
Authority: TW
Inventors: 佐久間健介; 松本寛和; 豊田太郎; 小長谷周平
Original assignee: 日商千紙鶴治療公司
Priority date: 2020-11-20
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-10-01
Also published as: WO2022107877A1; EP4249587A1; CN116391028A; EP4249587A4; JPWO2022107877A1; US20230399607A1

Abstract

本發明之目的為提供一種用以從多能性幹細胞分化誘導出胰島素陽性細胞集團之新穎方法，本發明係提供一種胰島素陽性細胞集團之製造方法，該製造方法包括下列步驟：使胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團在包含CDK8/19抑制劑之培養基中分化的步驟。

Description

成熟化劑

本發明關於從多能性幹細胞(pluripotent stem cell)製造胰島素陽性細胞集團之方法。更詳細而言，係關於一種胰島素陽性細胞集團之製造方法，該製造方法之特徵為：使從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團，與對於週期蛋白依存型激酶8及/或週期蛋白依存型激酶19(以下有時記載為「CDK8/19」)具有抑制活性之因子進行作用。

目前正進行著從iPS細胞或ES細胞等多能性幹細胞分化誘導出胰島素陽性細胞或胰臟β細胞並應用於治療糖尿病之研究。

迄今已開發報導過各種用以使多能性幹細胞分化誘導為胰島素陽性細胞集團之手法(非專利文獻1)。惟，在分化誘導所得之胰島素陽性細胞集團中，除了作為標的之胰島素陽性細胞(特別是胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞等)以外，還包含各式各樣的細胞。在將胰島素陽性細胞集團應用於糖尿病治療時，從安全性之觀點而言，極為重要的是嚴格地控制細胞集團所含有的細胞的種類。因此，期盼能有可包含更多之標的細胞之新穎的胰島素陽性細胞集團之分化誘導方法。

[先前技術文獻]

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Stem Cell Research(2015)14, 185-197

本發明之目的為提供用以從多能性幹細胞分化誘導出胰島素陽性細胞集團之新穎方法。

本案發明人們為了解決上述課題而積極檢討，結果在從多能性幹細胞誘導出胰島素陽性細胞集團之過程中，發現藉由使胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團與具有CDK8/19抑制活性之因子(以下有時記載為「CDK8/19抑制劑」)進行作用，可有效率地分化誘導出胰島素陽性細胞(特別是胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)，與以往方法相比，可得到包含更多該細胞之胰島素陽性細胞集團。

本發明為根據此等新穎知識而得者，並包含下列發明。

[1]一種胰島素陽性細胞集團之製造方法，係包括下列步驟：使胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團在包含CDK8/19抑制劑之培養基中分化之步驟。

[2]如[1]之方法，其中，前述培養基實質上不具有ALK5抑制活性。

[3]如[1]或[2]之方法，其中，前述CDK8/19抑制劑對於ALK5之IC₅₀為1μM以上。

[4]如[1]至[3]中任一項之方法，其中，CDK8/19抑制劑為選自由磷酸(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯醯胺)苯甲基)二乙酯、2-(4-(4-(異喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙醯胺、4-((2-(6-(4-甲基哌

-1-羰基)萘-2-基)乙基)胺基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氫苯并[b][1,4]二氧雜環己二烯-6-基(Dioxin-6-yl))-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]嗒

-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺醯基)-3,4-二氫喹

啉-2(1H)-酮、及(E)-3-(4-(1-環丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(嗎啉基甲基)苯基)丙烯醯胺所組成群組中之一個或複數個。

[5]如[1]至[4]中任一項之方法，其中，胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團為藉由將多能性幹細胞進行分化誘導而製成者。

[6]一種胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團之分化培養基，係包含CDK8/19抑制劑。

[7]如[6]之培養基，係實質上不具有ALK5抑制活性。

[8]如[6]或[7]之培養基，其中，CDK8/19抑制劑對於ALK5之IC₅₀為1μM以上。

[9]如[6]至[8]中任一項之培養基，其中，CDK8/19抑制劑為選自由磷酸(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯醯胺)苯甲基)二乙酯、2-(4-(4-(異喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙醯胺、4-((2-(6-(4-甲基哌

-1-羰基)萘-2-基)乙基)胺基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氫苯并[b][1,4]二氧雜環己二烯-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]嗒

-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺醯基)-3,4-二氫喹

本說明書包含屬於本申請案之優先權基礎之2020年11月20日所申請之日本專利申請案特願2020-193454號說明書及/或圖示所述之內容。

本說明書中引用之所有出版物、專利及專利申請案係直接作為參考而併入本說明書中。

藉由本發明，可提供一種用以從多能性幹細胞分化誘導出胰島素陽性細胞集團之新穎方法。亦即，根據本發明，在從多能性幹細胞誘導出胰島素陽性細胞集團之過程中，可有效率地分化誘導出胰島素陽性細胞(特別是胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)，與以往方法相比，可得到包含更多該細胞之胰島素陽性細胞集團。

圖1係顯示，在將胰臟前驅細胞集團利用包含ALK5抑制劑II或CDK8/19抑制劑(化合物1、化合物2或化合物3)之分化誘導培養基進行處理而得到之胰島素陽性細胞集團中，胰島素陽性且NKX6.1陽性(表示為「INS+/NKX+」)之細胞率、及胰島素陽性且NKX6.1陰性(表示為「INS+/NKX-」)之細胞率的圖表。

圖2係顯示，在將胰臟前驅細胞集團利用包含預定濃度之ALK5抑制劑II或CDK8/19抑制劑(化合物1、化合物2或化合物3)之分化誘導培養基進行處理而得到之胰島素陽性細胞集團中，該胰島素陽性細胞集團的胰島素及NKX6.1的以流式細胞分析儀所測得之表現分析結果。

1.用語

以下針對本說明書中所記載之用語進行說明。

於本說明書中，所謂的「約」或「大約」係表示相對於基準值而分別增加或減少變動至25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%為止之值。「約」或「大約」之用語較佳為表示相對於基準值而分別增加或減少15%、10%、5%、或1%之範圍。

於本說明書中，所謂的「包含(comprise(s)或comprising)...」意指包含該語句後續之要素，但不限於此。因此，雖教示包含該語句後續之要素，但並未教示排除其它任意要素。

於本說明書中，所謂的「由...所組成(consist(s) of或consisting of)」意指包含該語句後續之所有要素，且限定於此等要素。因此，「由...所組成」之語句表示所列舉之要素為其所要求者或必須者，並且實質上不存在其他要素。

於本說明書中，所謂的「不使用餵養細胞(feeder cell)」意指基本上不包含餵養細胞、不使用藉由培養餵養細胞而預處理(preconditioning)之培養基等。因此，培養基中不包含從餵養細胞所分泌之成長因子及細胞激素等物質。

此外，所謂的「餵養細胞」或「餵養」意指與其他種類之細胞共同培養並提供可支持該細胞且使其成長之環境之細胞。餵養細胞與其所支持之細胞可源自同種，亦可源自不同種。例如，人類細胞之餵養可使用人類皮膚纖維母細胞或人類胚胎幹細胞，亦可使用小鼠胚纖維母細胞之初代培養物、及永生化小鼠胚纖維母細胞。餵養細胞可藉由放射線照射或絲裂霉素(Mitomycin)C處理等進行不活化。

於本說明書中，所謂的「貼附(adherent)」係指細胞附著於容器，例如，細胞在合適的培養基存在下附著於已滅菌之塑膠(或經塗覆之塑膠)之細胞培養皿或燒瓶。於細胞之中，亦有若未貼附於細胞培養容器就無法在培養物中維持或無法生長者。相對於此，非貼附性細胞係不須與容器貼附就可維持在培養物中且增殖。

於本說明書中，所謂的「培養」係指細胞於試管內(in-vitro)環境維持、成長及/或分化。所謂的「進行培養」意指於組織或體外，例如於細胞培養皿或瓶中使細胞維持、增殖、及/或分化。培養包含二維培養(平面培養)及三維培養(懸浮培養)。

於本說明書中，所謂的「進行富集化(enrich)」及「富集化(enrichment)」係指使細胞之組成物等組成物中之特定構成成分的量增加，所謂的「經富集化(enriched)」，在為了說明細胞之組成物(例如細胞集團)而使用時，係指特定構成成分的量相較於富集化前之細胞集團中之該構成成分之比例而為增加的細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型進行富集化，因此，相較於富集化前之細胞集團內所存在之標的細胞之比例，標的細胞型之比例增加。細胞集團也可藉由本技術領域中習知之細胞選擇及篩選方法而針對標的細胞型進行富集化。細胞集團亦可藉由本說明書所述之特定之篩選或選擇流程進行富集化。於本發明之特定實施形態中，依據將標的細胞集團進行富集化之方法，使細胞集團中關於標的細胞集團至少被富集化20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。

於本說明書中，所謂的「進行耗乏(deplete)」及「耗乏(depletion)」係指使細胞之組成物等組成物中之特定構成成分的量減少，所謂的「經耗乏 (depleted)」，在為了說明細胞之組成物(例如細胞集團)而使用時，係指特定構成成分的量相較於耗乏前之細胞集團中之該構成成分之比例而為減少之細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型進行耗乏，因此，相較於耗乏前之細胞集團內所存在之標的細胞之比例，標的細胞型之比例減少。細胞集團也可藉由本技術領域中習知之細胞選擇及篩選方法而針對標的細胞型進行耗乏。細胞集團亦可藉由本說明書所述之特定之篩選或選擇流程進行耗乏。於本發明之特定實施形態中，依據將標的細胞集團進行耗乏之方法，使細胞集團中關於標的細胞集團而減少(耗乏)至少50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。

於本說明書中，所謂的「進行純化(purify)」及「純化(purification)」，係指去除細胞之組成物等組成物中之雜質，而使特定構成成分成為純粹者，所謂的「經純化(purified)」，在為了說明細胞之組成物(例如細胞集團)而使用時，係指使雜質量相較於純化前之細胞集團中之該構成成分之比例而為減少且使特定構成成分之純度提升之細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型進行純化，因此，相較於純化前之細胞集團內所存在之標的細胞之比例，標的細胞型之比例增加。細胞集團也可藉由本技術領域中習知之細胞選擇及篩選方法而針對標的細胞型進行純化。細胞集團亦可藉由本說明書所述之特定之篩選或選擇流程進行純化。於本發明之特定實施形態中，依據將標的細胞集團進行純化之方法，使標的細胞集團之純度變成至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%，或是可變成無法檢測到雜質(包含汙染細胞(contaminating cell))之程度。

於本說明書中，所謂的「標記(marker)」意指「標記蛋白質」、「標記基因」等藉由預定細胞型而特異性地表現之細胞抗原或其基因。標記較佳為細胞表面標記，此時，可實施生存細胞之濃縮、分離、及/或檢測。標記可為陽性選擇標記或陰性選擇標記。

標記蛋白質之檢測，係可利用經使用該標記蛋白質之特異性抗體之免疫學分析法，例如ELISA、免疫染色、流式細胞分析儀而進行。標記基因之檢測，係可利用該領域中習知之核酸增幅方法及/或核酸檢測方法，例如RT-PCR、微陣列、生物晶片等而進行。於本說明書中，所謂的標記蛋白質為「陽性」意指以流式細胞分析儀檢測為陽性，所謂的「陰性」意指為流式細胞分析儀之檢測極限以下。又，於本說明書中，所謂的標記基因為「陽性」意指經RT-PCR檢測出，所謂的「陰性」意指為RT-PCR之檢測極限以下。

於本說明書中，所謂的「表現(expression)」係定義為藉由細胞內之啟動子所驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。

於本說明書中，所謂的「具有CDK8/19抑制活性之因子」或「CDK8/19抑制劑」意指具有CDK8/19抑制活性之所有物質。相對於同為CDK家族之其他蛋白質，CDK8對細胞增殖而言並非必要，CDK8之抑制在一般條件下並無太大的效果。CDK19與CDK8類似，CDK8之抑制通常亦伴隨著CDK19之抑制。

於本說明書中，「增殖因子」為促進特定細胞之分化及/或增殖之內源性蛋白質。「增殖因子」可舉例如：上皮成長因子(EGF)、酸性纖維母細胞增殖因子(aFGF)、鹼性纖維母細胞增殖因子(bFGF)、肝細胞增殖因子(HGF)、類胰島素增殖因子1(IGF-1)、類胰島素增殖因子2(IGF-2)、角質細胞增殖因子(KGF)、神經增殖因子(NGF)、血小板衍生增殖因子(PDGF)、轉化增殖因子β(TGF-β)、血管內皮細胞增殖因子(VEGF)、運鐵蛋白、各種介白素(例如IL-1至IL-18)、各種菌落刺激因子(例如顆粒球/巨噬細胞-菌落刺激因子(GM-CSF))、各種干擾素(例如IFN-γ等)及對幹細胞有效果之其他細胞激素，例如幹細胞因子(SCF)及紅血球生成素(Epo)。

於本說明書中，所謂的「ROCK抑制劑」意指抑制Rho激酶(ROCK：Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase)之物質，可為抑制ROCK I與ROCK II之任一者之物質。ROCK抑制劑只要具有上述功能則無特別限制，可舉例如：N-(4-吡啶基)-4 β-[(R)-1-胺基乙基]環己烷-1 α-羧醯胺(本說明書中有時亦稱為Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基]磺醯基]六氫-1H-1,4-二氮呯(H-1152)、4 β-[(1R)-1-胺基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1 α-羧醯胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-胺基乙基]環己烷-1 α-羧醯胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-胺基-1,2,5-

二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-嗎啉基)乙基]-氧基}苯甲醯胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-1H-吡啶-5-羧醯胺(GSK429286A)。ROCK抑制劑不限定於此等，亦可使用ROCK之mRNA之反義寡核苷酸或siRNA、與ROCK結合之抗體、顯性負ROCK突變體等作為ROCK抑制劑，可商業購入或可藉由習知方法合成。

於本說明書中，所謂的「GSK3 β抑制劑」係對GSK3 β(肝醣合成酶激酶3 β)具有抑制活性之物質。GSK3(肝醣合成酶激酶3)為絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶的一種，參與肝醣之產生、細胞凋亡、幹細胞之維持等許多的訊息傳遞路徑。GSK3中存在α與β之2個同功型(Isoform)。本發明中所用之「GSK3 β抑制劑」只要具有GSK3 β抑制活性則無特別限制，可為具有GSK3 β抑制活性並兼具有GSK3 α抑制活性之物質。

GSK3 β抑制劑可例示：CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-胺基吡啶-2-基)胺基]乙基]胺基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]菸鹼甲腈)、TDZD-8(4-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯基-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]酚)、肯帕羅酮(kenpaullone)、1-氮肯帕羅酮(azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯基-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯基-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-環戊二烯釕複合體、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、鋰等。GSK3 β不限定於此等，亦可使用GSK3 β之mRNA之反義寡核苷酸或siRNA、與GSK3 β結合之抗體、顯性負GSK3 β突變體等作為GSK3 β抑制劑，可商業購入或可藉由習知方法合成。

於本說明書中，所謂的「血清替代物」可舉例如：KnockOut^TM血清替代物(KSR：賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific))、StemSure(註冊商標)血清替代物(和光純藥)、B-27添加劑、N2-添加劑、白蛋白(例如富脂質白蛋白)、胰島素、運鐵蛋白、脂肪酸、原膠原、微量元素(例如鋅、硒(例如亞硒酸鈉))、2-巰基乙醇、3’硫基甘油或此等之混合物(例如ITS-G)。血清替代物較佳為B-27添加劑、KSR、StemSure(註冊商標)血清替代物、ITS-G。於培養基中添加血清替代物時，其在培養基中之濃度為0.01至10重量%，較佳為0.1至2重量%。於本發明中，較佳為使用「血清替代物」取代血清。

2.胰島素陽性細胞集團之製造方法

本發明提供一種胰島素陽性細胞集團之製造方法，該製造方法包括下列步驟：在CDK8/19抑制劑之存在下，使胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團分化的步驟。

CDK8/19抑制劑係作用於胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團，而生成使胰島素陽性細胞(特別是胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)經富集化之胰島素陽性細胞集團。

本發明中所使用之「CDK8/19抑制劑」只要具有CDK8/19之抑制活性則無特別限制，可使用直接或間接地抑制CDK8/19之功能之所有因子。本發明中之「CDK8/19抑制劑」較佳係指抑制50%以上CDK8/19之因子。觀察有無CDK8/19抑制活性之方法係可選自習知方法，可舉例如下述詳細描述之本說明書實施例1之方法。

本發明中之「CDK8/19抑制劑」亦可使用以往習知者，如此之CDK8/19抑制劑可從專利文獻或非專利文獻找到。例如US2012/0071477、WO2015/159937、WO2015/159938、WO2013/116786、WO2014/0038958、WO2014/134169、JP2015/506376、US2015/0274726、US2016/0000787、WO2016/009076、WO2016/0016951、WO2016/018511、WO2016/100782及WO2016/182904所述之化合物中，可將具有CDK8/19抑制活性之化合物(或其鹽)作為本發明之「CDK8/19抑制劑」利用。特別是上述化合物中，可適宜利用對於CDK8/19具有選擇性抑制活性之化合物(或其鹽)。

當「CDK8/19抑制劑」具有對ALK5(活化素類受體激酶5，亦即activin receptor-like kinase 5)之抑制活性時，CDK8/19抑制劑較佳為對ALK5顯示抑制率50%所需之濃度(IC₅₀值)為1μM以上者。藉由利用如此之CDK8/19抑制劑，可使經添加CDK8/19抑制劑之培養基成為實質上不具有ALK5抑制活性者。所謂「實質上不具有ALK5抑制活性」，不只意指培養基完全不具有ALK5抑制活性之情形，還包括對ALK5之抑制率未達50%(較佳為40%以下，更佳為30%以下，再更佳為20%以下，又再更佳為10%以下，特佳為5%以下)之情形。

更具體而言，本發明中，可利用之CDK8/19抑制劑並無特別限制，可舉例如下列化合物或其鹽。又，此等化合物只要具有CDK8/19抑制活性，亦可具有一個或複數個取代基，也可變換一部分之部分結構(取代基、環等)。

[表1]

又，本發明中，可利用之CDK8/19抑制劑並無特別限制，例如可使用下述之化合物7至13或其鹽。化合物7至11以游離態為佳，化合物12及13以三氟醋酸鹽為佳。

[表2]

本發明之CDK8/19抑制劑不限定於以上所示之化合物，亦可使用CDK8/19之mRNA之反義寡核苷酸或siRNA、與CDK8/19結合之抗體、顯性負CDK8/19突變體等作為CDK8/19抑制劑。

上述CDK8/19抑制劑可利用商業購入者或藉由習知方法所合成者。

本發明之「胰島素陽性細胞集團」意指從多能性幹細胞分化誘導所得之包含胰島素陽性細胞之細胞集團。「胰島素陽性細胞」意指藉由胰島素之標記表現被識別而附加特徵之細胞。「胰島素陽性細胞」可表現NK6同源異型匣(homebox)1(NKX6.1)之標記，較佳為表現胰島素及NKX6.1兩者標記之細胞(亦即胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)。

與依據以往習知之手法(亦即包括在ALK5抑制劑(例如ALK5抑制劑II)之存在下培養胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團之步驟之手法(Nature Biotechnology,2014；32：1121-1133等))從多能性幹細胞分化誘導所得之胰島素陽性細胞集團相比，本發明之「胰島素陽性細胞集團」為胰島素陽性細胞(特別是胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)經富集化之細胞集團。本發明之胰島素陽性細胞集團中之「胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞」的含有率為33%以上，較佳為34%以上，更佳為35%以上，再更佳為36%以上，特佳為37%以上。該含有率上限無特別限制，係70%以下、60%以下、或50%以下。關於該含有率，係可使用從前述上限及下限之數值所分別選擇之2個數值來表示，例如，該含有率為33%至50%，較佳為34%至50%，更佳為35%至50%，再更佳為36%至50%，特佳為37%至50%。

本發明之「胰島素陽性細胞集團」，可藉由將從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團利用CDK8/19抑制劑進行處理而得到。藉由將胰臟前驅細胞集團或處於其後的如分化階段之預定分化階段中之細胞集團以CDK8/19抑制劑進行處理，可得到胰島素陽性細胞(較佳為胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)經富集化之胰島素陽性細胞集團。於胰島素陽性細胞集團中，除了胰島素陽性細胞，亦可包含其他細胞(例如內分泌前驅細胞；表現升糖素、體抑素、及胰臟多肽之至少一種標記之其他產生胰臟激素的細胞；Ki67陽性細胞；CHGA陰性細胞等)。

本發明中的「胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團」意指胰臟前驅細胞集團、或內分泌前驅細胞集團、或是胰臟前驅細胞集團及內分泌前驅細胞集團之兩細胞集團。

於本說明書中，所謂的「多能性(pluripotency)」，意指可分化為具備各種不同形態或功能之組織或細胞，亦可分化成3胚層之任何系統之細胞的能力。「多能性(pluripotency)」係以因無法分化為胎盤而沒有形成個體之能力的特點而言，可與能分化成包含胎盤之生體所有組織的「全能性(totipotency)」區別。

於本說明書中，所謂的「多潛能性(multipotency)」意指可分化成複數個限定數量之系統之細胞的能力。例如，間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞為多潛能性(multipotent)，但非多能性(pluripotent)。

於本說明書中，所謂的「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」係指胚胎幹細胞(ES細胞)及與其具有同樣的分化多能性，亦即，具有分化成生體之各種組織(內胚層、中胚層、外胚層之全部)之潛在能力的細胞。與ES細胞具有同樣的分化多能性之細胞可列舉「人工多能性幹細胞」(本說明書中，有時亦稱為「iPS細胞(induced pluripotent stem cell)」)。於本發明中，多能性幹細胞較佳為人類多能性幹細胞。

就「ES細胞」而言，若是小鼠ES細胞，可利用inGenious公司、理化學研究所(理研)等所建構之各種小鼠ES細胞株，若是人類ES細胞，可利用美國國立衛生研究所(NIH)、理研、京都大學、Cellartis公司所建構之各種人類ES細胞株。例如，ES細胞株可利用：NIH之CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等、WiCell Research Institute之H1株、H9株、理研之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。

所謂的「人工多能性幹細胞」係指藉由對哺乳動物體細胞或未分化幹細胞導入特定因子(核初期化因子)而進行再程序化(reprogramming)所得之細胞。目前，有各式各樣的「人工多能性幹細胞」，除了由山中氏等所製之藉由對小鼠纖維母細胞中導入Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc之4因子所建構之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.，Cell,(2006)126：663-676)之外，亦可使用：將同樣的4因子導入人類纖維母細胞所建構之衍生自人類細胞之PS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131：861-872.)；導入上述4因子後，以Nanog之表現為指標進行篩選所建構之Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)；以不含c-Myc之方法所製作之iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,101-106))；以無病毒方式導入6因子所建構之iPS細胞(Okita K et al.,Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al.,Stem Cells.31(3)：458-66.)。又，亦可使用：Thomson等所製作之導入OCT3/4、SOX2、NANOG及LIN28之4因子而建構之人工多能性幹細胞(Yu J, Thomson JA．et al,Science(2007)318：1917-1920.)；Daley等所製作之人工多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451：141-146)；櫻田氏等所製作之人工多能性幹細胞(日本特開第2008-307007號)等。

除此之外，亦可使用已公開之所有論文(例如Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)或是專利(例如日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)所述之該技術領域中習知之人工多能性幹細胞之任意者。

人工多能性細胞株可利用NIH、理化學研究所(理研)、京都大學等所建構之各種iPS細胞株。例如，若是人類iPS細胞株，可列舉：理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株；京都大學之Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株；CDI公司之MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。

於本說明書中，所謂的「胰臟前驅細胞集團」意指包含胰臟前驅細胞之細胞集團。於本說明書中，胰臟前驅細胞係藉由標記NKX6.1之表現而附加特徵(亦即NKX6.1陽性)。胰臟前驅細胞進一步可表現PDX-1、PTF-1 α、GATA4及SOX9之至少一種標記。胰臟前驅細胞較佳為藉由NKX6.1及PDX-1之表現而附加特徵(亦即NKX6.1陽性且PDX-1陽性)。

於一實施形態中，本發明之「胰臟前驅細胞集團」係在下述詳細描述之將多能性幹細胞分化誘導成胰臟β細胞之步驟中，相當於步驟4)結束後之培養物、或步驟5)中之培養物的細胞集團。

於本發明之「胰臟前驅細胞集團」中，胰臟前驅細胞係以30%以上，較佳為40%以上，更佳為50%以上，再更佳為60%以上，又再更佳為70%以上之比例而包含。於胰臟前驅細胞集團中，除了胰臟前驅細胞以外，還可包含其他細胞(例如內分泌前驅細胞、胰島素陽性細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。

此外，本說明書中所述之細胞集團中之特定細胞之比例，係可根據如流式細胞分析儀等可計算出細胞數之習知手法而求得。

於本說明書中，所謂的「內分泌前驅細胞集團」意指包含內分泌前驅細胞之細胞集團。於本說明書中，內分泌前驅細胞意指藉由「CHGA、NeuroD及NGN3之至少一種標記的表現」及「胰臟關聯之激素系(例如胰島素等)之標記的不表現」而附加特徵之細胞。內分泌前驅細胞亦可表現PAX-4、NKX2.2、Islet-1、PDX-1等標記。

於一實施形態中，本發明之「內分泌前驅細胞集團」係在下述詳細描述之將多能性幹細胞分化誘導成胰臟β細胞之步驟中，相當於步驟5)結束後之培養物、或步驟6)中之培養物的細胞集團。

於本發明之「內分泌前驅細胞集團」中，內分泌前驅細胞係以30%以上，較佳為40%以上，更佳為50%以上，再更佳為60%以上，又再更佳為70%以上之比例而包含。於內分泌前驅細胞集團中，除了內分泌前驅細胞以外，還可包含其他細胞(例如胰臟前驅細胞、胰島素陽性細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。

在從多能性幹細胞分化成胰島素陽性細胞之過程中，已知因應分化階段而會出現具有不同特徵之細胞(WO2009/012428、WO2016/021734)。例如，此分化階段中，係依據較未分化之順序，可大致分類為多能性幹細胞、胚胎內胚層細胞、原腸胚細胞、後方前腸細胞、胰臟前驅細胞、內分泌前驅細胞、胰島素陽性細胞。

胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團，係可使用將多能性幹細胞分化誘導成胰島素陽性細胞之習知手法而得。亦即，可利用下列分化誘導步驟，而獲得處於各目標之分化階段中之細胞集團：

步驟1)將多能性幹細胞分化誘導成胚胎內胚層細胞；

步驟2)將胚胎內胚層細胞分化誘導成原腸胚細胞；

步驟3)將原腸胚細胞分化誘導成後方前腸(Posterior Foregut)細胞；

步驟4)將後方前腸細胞分化誘導成胰臟前驅細胞；

步驟5)將胰臟前驅細胞分化誘導成內分泌前驅細胞；

步驟6)將內分泌前驅細胞分化誘導成胰島素陽性細胞。

以下說明各步驟，但各細胞之分化誘導不限定於此等手法。

步驟1)分化成胚胎內胚層細胞

首先，使多能性幹細胞分化成胚胎內胚層細胞。從多能性幹細胞誘導出胚胎內胚層之方法係為已知，可用其中任意方法。較佳為於包含活化素A之培養基中，更佳為於包含活化素A、ROCK抑制劑、GSK3 β抑制劑之培養基中，將多能性幹細胞進行培養而分化成胚胎內胚層細胞。培養開始時之細胞數並無特別限制，可為22000至150000個細胞/cm²，較佳為22000至100000個細胞/cm²，更佳為22000至80000個細胞/cm²。培養期間為1日至4日，較佳為1日至3日，特佳為3日。

培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。培養可藉由二維培養及三維培養之任意者進行。

本步驟中使用之培養基可使用：RPMI 1640培養基、MEM培養基、iMEM培養基、DMEM/F12培養基、Improved MEM Zinc Option培養基、Improved MEM/1%B-27/青黴素鏈黴素培養基、MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO₃/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAXTM/抗壞血酸/青黴素鏈黴素培養基等哺乳類細胞之培養所使用之基本培養基。

活化素A之在培養基中之濃度通常為30至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，更佳為70至120ng/mL，特佳為約100ng/mL。

就另一態樣而言，於培養基中可包含低用量之活化素A，例如可為5至100ng/mL，較佳為5至50ng/mL，更佳為5至10ng/mL之量。

就更另一態樣而言，活化素A之在培養基中之濃度為約0.1至100ng/mL，較佳為約1至50ng/mL，更佳為約3至10ng/mL。

GSK3 β抑制劑之在培養基中之濃度係根據使用之GSK3 β抑制劑種類而適當地設定，例如CHIR99021作為GSK3 β抑制劑使用時之濃度通常為2至5μM，較佳為2至4μM，特佳為約3μM。

ROCK抑制劑之在培養基中之濃度係根據使用之ROCK抑制劑種類而適當地設定，例如Y27632作為ROCK抑制劑使用時之濃度通常為5至20μM，較佳為5至15μM，特佳為約10μM。

培養基中可進一步添加胰島素。培養基中可包含0.01至20μM，較佳為0.1至10μM，更佳為0.5至5μM之量之胰島素。培養基中之胰島素之濃度可為經添加之B-27添加劑所含之胰島素之濃度，但不限於此。

於特定態樣中，在包含活化素A、ROCK抑制劑、GSK3 β抑制劑之培養基中培養1日後，以只含活化素A之培養基每日交換培養基並進一步培養2日。或是，在低用量之活化素A存在下，將多能性幹細胞於包含胰島素0.01至20μM之培養基中進行第1培養，繼而在不含胰島素之培養基中進行第2培養，藉此而製造。

步驟2)分化成原腸胚細胞

將步驟1)所得之胚胎內胚層細胞進一步於包含增殖因子之培養基中進行培養，分化誘導成原腸胚細胞。培養期間為2日至8日，較佳為約4日。

培養基係與步驟1)同樣地可使用培養哺乳類細胞所用之基本培養基。培養基中，除了增殖因子之外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生素等。

增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為EGF及/或KGF，再更佳為KGF。

增殖因子之在培養基中之濃度係根據使用之增殖因子種類而適當地設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。使用EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約 0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。使用FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF作為增殖因子時之濃度通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。

步驟3)分化成後方前腸細胞

將步驟2)所得之原腸胚細胞進一步於包含增殖因子、環杷胺(cyclopamine)、頭蛋白(Noggin)等之培養基進行培養，分化誘導成後方前腸細胞。培養期間為1日至5日，較佳為約2日左右。培養可藉由二維培養及三維培養之任意者進行。

培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。

增殖因子之在培養基中之濃度係根據使用之增殖因子種類而適當地設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM，使用EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。使用FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF作為增殖因子時之濃度通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。

環杷胺之在培養基中之濃度並無特別限制，通常為0.5至1.5μM，較佳為0.3至1.0μM，特佳為約0.5μM。

頭蛋白(Noggin)之在培養基中之濃度並無特別限制，通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。

步驟4)分化成胰臟前驅細胞

將步驟3)所得之後方前腸細胞進一步於包含具有CDK8/19抑制活性之因子之培養基，較佳為於包含具有CDK8/19抑制活性之因子與增殖因子之培養基進行培養，分化誘導成胰臟前驅細胞。培養期間為2日至10日，較佳為約5日左右。培養可藉由二維培養及三維培養之任意者進行。

二維培養時，依據已報導者(Toyoda et al.,Stem cell Research(2015)14,185-197)，將步驟3)所得之後方前腸細胞以0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液進行處理，藉由吸量(pipetting)而分散於該液中並得到細胞分散液，將所得之分散液施以離心，將回收之細胞再懸浮於少量之新培養基中，將該細胞懸浮液再播種於步驟4)之新培養基。

具有CDK8/19抑制活性之因子可使用前述之各種化合物或其鹽，依據使用之化合物或其鹽適當地決定添加至培養基之量，通常為約0.00001μM至5μM，較佳為0.00001μM至1μM。具有CDK8/19抑制活性之因子之在培養基中之濃度，較佳為相對於CDK8/19而達成50%以上之抑制活性的濃度。

增殖因子較佳為EGF、KGF、FGF10，更佳為KGF及/或EGF，再更佳為KGF及EGF。

增殖因子之在培養基中之濃度係根據使用之增殖因子種類而適當地設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。使用EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即約1.6至160nM)。使用FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即約0.6至58nM)。例如使用KGF及EGF作為增殖因子時之濃度，EGF通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL，KGF通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。

在步驟4)中，培養之最初1日係在ROCK抑制劑之存在下進行，之後可在不含ROCK抑制劑之培養基中培養。

又，培養基中可包含蛋白激酶C(PKC)活性化劑。PKC活性化劑係使用PDBu(PKC活化劑II)、TPB(PKC活化劑V)等，但不限於此等。PKC活性化劑之濃度係以約0.1至100ng/mL，較佳為以約1至50ng/mL，更佳為以約3至10ng/mL添加。

又，培養基中可添加二甲基亞碸及/或活化素(1至50ng/mL)。

於任意步驟中，培養基中除了添加上述成分以外，亦可添加血清替代物(例如B-27添加劑、ITS-G)。又，依據需要，可添加胺基酸、L-麩醯胺酸、GlutaMAX(製品名)、非必須胺基酸、維生素、菸鹼醯胺、抗生素(例如抗生素-抗黴菌劑(Antibiotic-Antimycotic)、青黴素、鏈黴素、或此等之混合物)、抗菌劑(例如雙性黴素B(amphotericin B))、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。於培養基中添加抗生素時，其在培養基中之濃度通常為0.01至20重量%，較佳為0.1至10重量%。培養可藉由二維培養及三維培養之任意者進行。

又，細胞培養係二維培養時，不使用餵養細胞，以貼附培養進行。培養時使用皿(dish)、瓶、微量多孔盤、OptiCell(製品名)(Nunc公司)等細胞培養片等培養容器。對於培養容器，較佳為施行用於提升與細胞之貼附性(親水性)之表面處理，或以膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白(laminin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、Matrigel基質凝膠(例如BD Matrigel基質凝膠(日本Becton Dickinson公司))、玻璃體結合蛋白(vitronectin)等細胞貼附用基質所塗覆。就培養容器而言，較佳為經I型膠原蛋白、Matrigel基質凝膠、纖維連接蛋白、玻璃體結合蛋白或聚-D-離胺酸等所塗覆之培養容器，更佳為經Matrigel基質凝膠或聚-D-離胺酸所塗覆之培養容器。

步驟4)所得之胰臟前驅細胞，係可利用習知的屬於表面標記之糖蛋白質2(GP2)等而進一步純化。上述純化可使用本身已為習知之方法，例如可使用將抗GP2抗體經固定化之珠粒(beads)進行。

步驟5)分化成內分泌前驅細胞

將步驟4)所得之胰臟前驅細胞進一步於包含增殖因子之培養基中進行培養，分化誘導成內分泌前驅細胞。培養可藉由二維培養及三維培養之任意者進行。二維培養時，將步驟4)所得之胰臟前驅細胞以0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液進行處理，藉由吸量(pipetting)而分散於該液中並得到細胞分散液，將所得之分散液施以離心，將經回收之細胞再懸浮於少量之新培養基中，將該細胞懸浮液再播種於步驟5)之新培養基。培養期間為2日至3日，較佳為約2日。

培養基係與步驟1)同樣地可使用培養哺乳類細胞所用之基本培養基。於培養基中，依據已報導者(Nature Biotechnology,2014；32：1121-1133)，添加SANT1、視網酸、ALK5抑制劑II、T3、LDN，並可進一步適當地添加Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生素等。此外，於本發明中，在步驟5)中使用CDK8/19抑制劑時，可不使用ALK5抑制劑(ALK5抑制劑II等)，較佳為不使用ALK5抑制劑(ALK5抑制劑II等)。

培養係不使用餵養細胞，以非貼附培養進行。培養時使用皿、瓶、微量多孔盤、多孔盤(Nunc公司)等或是生物反應器。對於培養容器，較佳為施行用以降低與細胞之貼附性之表面處理。

步驟5)所得之內分泌前驅細胞，係可利用習知的屬於表面標記之糖蛋白質2(GP2)等而進一步純化。上述純化可使用本身已為習知之方法，例如可使用將抗GP2抗體經固定化之珠粒而進行。

步驟6)分化成胰島素陽性細胞

將步驟5)所得之內分泌前驅細胞進一步於包含增殖因子之培養基中進行培養，分化誘導成胰島素陽性細胞。培養期間為10日至30日，較佳為約10至20日。

培養基係與步驟1)同樣地可使用培養哺乳類細胞所用之基本培養基。於培養基中，依據已報導者(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑XX、γ-分泌酶抑制劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血酸，並可進一步適當地添加Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生素等。例如，培養基中可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、及抗壞血酸，或是可添加T3、ALK5抑制劑II、ZnSO4、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、Trolox、及R428。此外，於本發明中，在步驟6)中使用CDK8/19抑制劑時，可不使用ALK5抑制劑(ALK5抑制劑II等)，較佳為不使用ALK5抑制劑(ALK5抑制劑II等)。

培養可藉由二維培養及三維培養之任意者進行。培養係不使用餵養細胞。三維培養時，以非貼附培養進行。培養時使用皿、瓶、微量多孔盤、多孔盤(Nunc公司)等或是生物反應器。對於培養容器，較佳為施行用以降低與細胞之貼附性之表面處理。

以CDK8/19抑制劑進行之「從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團之處理」，係可藉由使該細胞集團與CDK8/19抑制劑接觸而進行。例如，可藉由將該細胞集團於經添加CDK8/19抑制劑之培養基中進行培養而進行。於培養基中，能以可抑制CDK8/19活性之任意量來包含CDK8/19抑制劑，例如可包含10μM以下、5μM以下、4μM以下、3μM以下、2μM以下、或1μM以下之量。特別是當CDK8/19抑制劑對於ALK5具有抑制活性、並且對ALK5顯示抑制率50%所需之濃度(IC₅₀值)為1μM以上時，能以未達1μM之量來包含CDK8/19抑制劑。CDK8/19抑制劑之添加量之下限並無特別限制，可為0.1μM以上、0.2μM以上、0.3μM以上、0.4μM以上、或0.5μM以上。例如，CDK8/19抑制劑之添加量為10μM以下0.1μM以上，較佳為5 μM以下0.1μM以上，更佳為1μM以下0.1μM以上，例如為未達1μM且0.1μM以上。

又，「從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團」的在CDK8/19抑制劑存在下之培養，係可進行至少12小時，較佳為24小時以上、2日以上、4日以上、8日以上、10日以上、或15日以上。在CDK8/19抑制劑存在下之培養較佳為進行4日以上。在以CDK8/19抑制劑處理之期間中係亦可交換培養基，依據培養日程，可與添加了CDK8/19抑制劑之「與交換前具有相同組成之培養基或具有不同組成之培養基」進行交換。

從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團，係能以CDK8/19抑制劑進行處理並施行更進一步分化成標的細胞集團之步驟。於此，所謂「以CDK8/19抑制劑進行處理並施行...」係指亦包含：同時施行以CDK8/19抑制劑進行處理之步驟與分化之步驟的情形、在以CDK8/19抑制劑進行處理後再施行分化之步驟的情形、以及在施行分化之步驟後再施行以CDK8/19抑制劑進行處理之步驟的情形。因此，「在以CDK8/19抑制劑進行處理時所用之培養基」與「在使細胞集團分化時所用之培養基」可為不同之培養基，亦可於「分化步驟中所用之培養基」中更進一步添加CDK8/19抑制劑。

於本發明之一實施形態中，在從多能性幹細胞分化誘導出胰島素陽性細胞之步驟中，使CDK8/19抑制劑包含於步驟5後之培養基(亦即，步驟5之培養基、或步驟6之培養基、或步驟5之培養基及步驟6之培養基)中而作用於細胞。

藉由本發明所得之胰島素陽性細胞集團，係可分化誘導成包含胰臟β細胞之細胞集團(以下記載為「胰臟β細胞集團」)。於本說明書中，「胰臟β細胞」意指比「胰島素陽性細胞」更成熟之細胞，具體而言，意指表現屬於胰臟β細胞成熟標記之MAFA、UCN3及IAPP的至少一種標記，或是藉由葡萄糖刺激所致之胰島素分泌上升反應而附加特徵之細胞。胰臟β細胞集團中，除了胰臟β細胞，亦可包含其他細胞(例如胰島素陽性細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。

胰臟β細胞集團，係可藉由使胰島素陽性細胞集團進行分化/成熟(較佳為於動物生體內進行分化/成熟)而得之。

「動物」以哺乳動物為佳，例如人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、綿羊、山羊、羊駝、狗、貓、兔、小鼠、天竺鼠等，較佳為人類。

移植較佳為在可將細胞集團固定於一定位置之生體內領域中進行，例如，可在動物皮下、腹腔內、腹膜上皮、大胃繫膜、脂肪組織、肌肉組織或胰臟、腎臟等各臟器之被膜下等進行。移植之細胞數係可根據移植之細胞之分化階段、移植對象之年齡、體重、移植部位之尺寸大小、疾病之嚴重程度等要素而變化，並無特別限制，例如，可為10×10⁴個細胞至10×10¹¹個細胞左右。移植之細胞集團可在生體內環境進行分化誘導而分化成目標之細胞集團(較佳為胰臟β細胞集團)，然後，可予以回收，亦可維持留在生體內。

在進行移植時，細胞集團可包埋於包含生物相容性材料之凝膠中而進行移植，例如，可將經包含生物相容性材料之凝膠所包埋之細胞集團封入膠囊、袋、小室等裝置中而移植至生體內。

於本說明書中，所謂的「包埋」意指於包含生物相容性材料之凝膠中，使內分泌前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團分散並收容。

於本說明書中，所謂的「生物相容性材料」意指移植至生體內並短期或長期留存時不會誘導出顯著之免疫反應或有害之生體反應(例如毒性反應、凝血等)的任意材料。又，「生物相容性材料」較佳為生物可分解性材料。如此之材料可列舉：聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺甲酸酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羥基乙酯、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-羥基戊酸酯)共聚物(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物(PEVA)、聚丙烯醯胺、聚乙二醇、聚乙烯亞胺、聚羥基丁酸酯、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚乙烯醇、聚延胡索酸丙二醇酯、聚丙烯酸、聚e-己內酯、聚甲基丙烯酸、聚偏二氟乙烯(PVDF)、果膠酸、玻尿酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸肝素蛋白多醣(heparan sulfate proteoglycan)、肝素、幾丁質、幾丁聚醣、三仙膠、羧甲基纖維素、羧甲基幾丁聚醣、海藻酸鹽、海藻酸酯、膠原蛋白、纖維素、絲蛋白、角蛋白、明膠、血纖維蛋白、聚三葡萄糖(pullulan)、層連結蛋白、結蘭膠(gellan gum)、矽、胺甲酸乙酯、彈性蛋白等及其等之修飾物、以及其等之組合。「生物相容性材料」之表面依照需要可施予：能實現細胞貼附之表面修飾(例如以細胞貼附用基質(膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白、纖維連接蛋白、Matrigel基質凝膠、玻璃體結合蛋白等)塗覆)，或經已知能控制細胞之增殖、分化或功能之官能基(例如胺基、羧基、羥基、甲基丙烯酸基、丙烯酸基等)所致之改變。於特定態樣中，「生物相容性材料」可合適使用海藻酸鹽或海藻酸酯。

海藻酸鹽只要是水溶性鹽即可，可利用金屬鹽、銨鹽等。例如可合適使用海藻酸鈉、海藻酸鈣、海藻酸銨等。

海藻酸酯(亦稱為海藻酸丙二醇酯)，係藉由使海藻酸之羧基與丙二醇進行酯鍵結而成之衍生物。

海藻酸鹽所包含之甘露糖醛酸與葡萄糖醛酸之比例(M/G比)為任意者，一般而言，M>G時可形成富有柔軟性之凝膠，M<G時可形成堅固之凝膠。於本發明中，可利用包含葡萄糖醛酸之比例為10至90%、20至80%、30至70%、或40至60%者。

使用海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠之製作可依照習知手法(WO2010/032242、WO2011/154941)而製作，可藉由在海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液中添加交聯劑並進行凝膠化而得。

於溶劑中可包含0.05至10重量%，較佳為0.1至5重量%、更佳為0.5至3重量%之量的海藻酸鹽或海藻酸酯。溶劑只要是可溶解海藻酸鹽或海藻酸酯者即可，可利用水、生理食鹽水等。

交聯劑只要是可使海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液進行凝膠化者即可，並無特別限制，可利用多價之金屬陽離子。多價之金屬陽離子較佳為2價之金屬陽離子，更佳為鈣離子、鍶離子、鋇離子。可利用鹽形態之交聯劑，於本發明中，可利用選自氯化鈣、氯化鍶、氯化鋇中之至少一者作為交聯劑。

在包含海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠中，可包含奈米纖維。奈米纖維為具有奈米等級直徑之天然或合成纖維。天然奈米纖維可列舉包含膠原蛋白、纖維素、絲蛋白、角蛋白、明膠、幾丁聚醣等多糖類之一種或複數種者。合成奈米纖維可列舉：聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺甲酸酯(PU)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-羥基戊酸酯)共聚物(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物(PEVA)等。於包含海藻酸之凝膠中，可包含未達1重量%，例如0.9重量%、0.8重量%、0.7重量%、0.6重量%、0.5重量%或未達該量的奈米纖維。於包含海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠中所包含之奈米纖維量之下限並無特別限制，可為0.05重量%以上，較佳為0.1重量%以上。

可藉由任意手段進行「將細胞集團包埋於包含海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠中」，並無特別限制，例如，可藉由在海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液中將細胞集團進行混合並使其凝膠化而進行。

於海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液中，可包含選自1×10⁴個細胞/mL至1×10⁹個細胞/mL(較佳為1×10⁷個細胞/mL至1×10⁸個細胞/mL)之量的細胞集團。

包含細胞集團之海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液之凝膠化，係可藉由在該溶液中添加交聯劑而進行。關於添加之交聯劑之量，係相對於該溶液，而可設為選自0.1至5重量%(例如0.1至1重量%)之量。關於凝膠化，係可於細胞培養或細胞移植所用之具有預定結構及/或形狀之容器內進行，或可於為了獲得適合該容器之凝膠而設計之鑄模內進行。

或者，亦可依據習知手法(WO2010/010902)並藉由形成包含海藻酸之凝膠膠囊而進行。亦即，可對交聯劑之溶液滴加包含細胞集團之海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液而進行。根據滴加時之噴嘴形狀或滴加方法，可調整液滴之尺寸大小，從而可規定包含海藻酸之凝膠膠囊之大小。滴加方法並無特別限制，可藉由空氣噴霧法、無空氣噴霧方式、靜電噴霧法等手法進行。包含海藻酸之凝膠膠囊之大小並無特別限制，可為直徑5mm以下、1mm以下、500μm以下。交聯劑溶液中可包含選自0.1至10重量%(例如0.1至5重量%)之量之交聯劑。

本發明所得之胰島素陽性細胞集團係可移植至動物生體內，於動物生體內分化時可直接留置而作為產生/分泌胰島素之細胞來利用。

本發明所得之胰島素陽性細胞集團，係可直接或膠囊化以移植至患部，藉此而可用於作為糖尿病(特別是I型糖尿病)治療用之細胞醫藥。

又，本發明所得之胰島素陽性細胞集團可為前藥。於本說明書中，所謂的前藥，係指移植至生體內之後進行分化而變化成具有治療疾病之功能之細胞的細胞集團。

本發明所得之胰島素陽性細胞集團係毒性(例如急性毒性、慢性毒性、遺傳毒性、生殖毒性、心臟毒性、癌原性)低，藉由直接或與藥學上容許之載體等混合作成醫藥組成物，可對哺乳動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、綿羊、猴、人類)安全地投予。

3.分化培養基

本發明提供一種胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團的分化培養基，係包含CDK8/19抑制劑。

本發明之分化培養基可用於胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團之分化誘導。本發明之分化培養基可用於上述多能性幹細胞分化誘導成胰島素陽性細胞之方法之步驟5)、或步驟6)。

本發明之分化培養基，係於RPMI 1640培養基、MEM培養基、iMEM培養基、DMEM/F12培養基、Improved MEM Zinc Option培養基、Improved MEM/1%B-27/青黴素鏈黴素培養基、MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAXTM/抗壞血酸/青黴素鏈黴素培養基等哺乳類細胞之培養所使用之基本培養基中以能抑制CDK8/19活性之任意量包含上述CDK8/19抑制劑而成。培養基所包含之CDK8/19抑制劑之量係如上述定義。

本發明之分化培養基中，除了CDK8/19抑制劑以外，亦可包含步驟5)、及步驟6)中所各自要求之增殖因子、各種抑制劑、血清替代物、抗生素、維生素等其他因子。依據已報導者(Nature Biotechnology,2014；32：1121-1133)，例如可於步驟5)所使用之培養基中添加預定量之SANT1、視網酸、T3、LDN、Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生素等。又，可於步驟6)所使用之培養基中添加預定量之T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑XX、γ-分泌酶抑制劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血酸、Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生素、ZnSO₄、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、Trolox、R428等。

本發明之分化培養基為實質上不具有ALK5抑制活性者。所謂的「實質上不具有ALK5抑制活性」係如上述定義，不只意指完全不具有ALK5抑制活性的情形，亦包含對ALK5之抑制率未達50%(較佳為40%以下，更佳為30%以下，再更佳為20%以下，又再更佳為10%以下，特佳為5%以下)的情形，具有ALK5抑制活性之化合物(例如ALK5抑制劑II等)只要滿足上述定義即可包含。

本發明之分化培養基，能以將基本培養基、CDK8/19抑制劑及上述其他因子全部合一之形態來提供，或者亦能以任意組合或各自分別之複數種形態來提供而準備調製。

以下，藉由實施例說明本發明，但本發明並非被此等實施例所限制者。

[實施例]

實施例1：ALK4抑制活性、ALK5抑制活性、CDK8抑制活性及CDK19抑制活性之評估

藉由以下方法，評估屬於試驗化合物之磷酸(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯醯胺)苯甲基)二乙酯(化合物1)、2-(4-(4-(異喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙醯胺(化合物2(BI-1347))、及4-((2-(6-(4-甲基哌

-1-羰基)萘-2-基)乙基)胺基)喹唑啉-6-甲腈(化合物3(Senexin B))的ALK4抑制活性、ALK5抑制活性、CDK8抑制活性及CDK19抑制活性。

於激酶品評試驗(kinase panel test)中，對ALK4、ALK5、CDK8、及CDK19之各激酶，以0.1μM、1μM(亦即Log10^-7、10^-6)添加試驗化合物，測定其結合抑制活性0至100%。從所得之2個值算出預估之pIC₅₀，以6至8之值表示。表中的pIC₅₀=6係意指於本測定試驗中在0.1μM、1μM之任一添加濃度下並未顯示結合抑制活性而被認為該化合物不具抑制活性，或只具有pIC₅₀≦6之弱結合抑制活性。同樣地，pIC₅₀=8係意指從0.1μM、1μM之結合抑制活性所求出之預估pIC₅₀值為8以上而顯示pIC₅₀≧8之強結合活性。

對ALK4、ALK5、CDK8及CDK19顯示抑制率50%所需之各試驗化合物之濃度(預估pIC₅₀值)係表示於表3。

[表3]

表中，關於預估pIC₅₀值，「6」表示IC₅₀≧1μM，「8」表示IC₅₀≦10nM。

根據表3，確認化合物1、化合物2及化合物3強力抑制CDK8及CDK19。

實施例2：在胰臟前驅細胞集團經CDK8/19抑制劑處理所得之細胞集團中之標的細胞(胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)之增加

1.方法

依據上述步驟1)至4)、已報導者(Stem Cell Research(2015)14、185-197)等而實施「從iPS細胞分化誘導出胰臟前驅細胞集團」。依據上述步驟5)、6)等而實施「分化誘導成胰島素陽性細胞」。

將從iPS細胞分化誘導所得之胰臟前驅細胞集團，與分化因子(SANT1、視網酸、T3、LDN、Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF2)一起，於「以預定濃度包含ALK5抑制劑II(10μM)或CDK8/19抑制劑(化合物1、化合物2或化合物3)、或是不包含ALK5抑制劑II及CDK8/19抑制劑兩者之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B-27/青黴素鏈黴素培養基)」中培養2日，而分化誘導成內分泌前驅細胞集團。

其次，與分化因子(T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、FGF受容體1抑制劑PD-166866)一起，於「以預定濃度包含ALK5抑制劑II(10μM)或C DK8/19抑制劑(化合物1、化合物2或化合物3)、或是不包含ALK5抑制劑II及CDK8/19抑制劑兩者之分化誘導培養基(Improved MEM/1%B-27/青黴素鏈黴素培養基)」中培養7日後，依據已報導者(Nature Biotechnology,2014；32：1121-1133)，與T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、N-乙醯基半胱胺酸、AXL抑制劑R428、抗壞血酸、ROCK抑制劑、ZnSO₄、肝素、Trolox一起，於「以預定濃度包含ALK5抑制劑II(10 μM)或CDK8/19抑制劑、或是不包含ALK5抑制劑II及CDK8/19抑制劑兩者之分化誘導培養基(MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO₃/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/青黴素鏈黴素培養基)」中培養4日，分化誘導成胰島素陽性細胞集團。

藉由流式細胞分析儀，計數由上述方法所得之胰島素陽性細胞集團中的胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞數、以及胰島素陽性且NKX6.1陰性之細胞數，求出各細胞集團中之標的細胞(亦即胰島素陽性且NKX6.1陽性)之細胞率、以及目標外之細胞(亦即胰島素陽性且NKX6.1陰性)之細胞率。

2.結果

將使用「以預定濃度包含ALK5抑制劑II(10μM)或CDK8/19抑制劑(化合物1、化合物2或化合物3)、或是不包含ALK5抑制劑II及CDK8/19抑制劑兩者之分化誘導培養基」進行處理時所得之胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞率、及胰島素陽性且NKX6.1陰性之細胞率的結果顯示於圖1。又，將使用「ALK5抑制劑II(10μM)、0.3μM之化合物1、3nM之化合物2、及0.1μM之化合物3」時所得之細胞集團之流式細胞分析儀之結果顯示於圖2。

在分化誘導培養基中包含CDK8/19抑制劑時，確認可製造目標之「胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞」的比例為目標外之「胰島素陽性且NKX6.1陰性之細胞」的比例以上之細胞集團。

特別是使用0.3μM之化合物1、3nM之化合物2、及0.1μM之化合物3作為CDK8/19抑制劑時，相較於使用以往從胰臟前驅細胞集團分化誘導成胰島素陽性細胞集團時一般所用之ALK5抑制劑II(10μM)的情形，可製造使目標之「胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞」的比例更高之細胞集團。

利用ALK5抑制劑II時，所得之細胞集團中之目標之「胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞」的比例為33%左右。即使培養基中所添加之ALK5抑制劑II之濃度提高至30μM時，該細胞的比例仍為同等或其以下(未顯示數據)。

另一方面，在從胰臟前驅細胞集團分化誘導成胰島素陽性細胞集團之製造過程中，藉由進行CDK8/19抑制劑之處理，確認細胞集團中之標的細胞(胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)的比例提高至超過33%。

由以上結果可知，從胰臟前驅細胞集團分化誘導成胰島素陽性細胞集團之過程中，將其中之細胞集團，藉由以CDK8/19抑制劑取代ALK5抑制劑II來進行處理，可製造比以往方法包含更高比例之標的細胞(胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞)的胰島素陽性細胞集團。

Claims

一種胰島素陽性細胞集團之製造方法，係包括下列步驟：使胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團在包含CDK8/19抑制劑之培養基中分化之步驟。
如請求項1所述之製造方法，其中，前述培養基實質上不具有ALK5抑制活性。
如請求項1或2所述之製造方法，其中，前述CDK8/19抑制劑對於ALK5之IC₅₀為1μM以上。
如請求項1至3中任一項所述之製造方法，其中，CDK8/19抑制劑為選自由磷酸(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯醯胺)苯甲基)二乙酯、2-(4-(4-(異喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙醯胺、4-((2-(6-(4-甲基哌
-1-羰基)萘-2-基)乙基)胺基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氫苯并[b][1,4]二氧雜環己二烯-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]嗒
-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺醯基)-3,4-二氫喹
啉-2(1H)-酮、及(E)-3-(4-(1-環丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(嗎啉基甲基)苯基)丙烯醯胺所組成群組中之一個或複數個。
如請求項1至4中任一項所述之製造方法，其中，胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團係藉由將多能性幹細胞進行分化誘導而製成者。
一種胰臟前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團之分化培養基，係包含CDK8/19抑制劑。
如請求項6所述之分化培養基，係實質上不具有ALK5抑制活性。
如請求項6或7所述之分化培養基，其中，CDK8/19抑制劑對於ALK5之IC₅₀為1μM以上。
如請求項6至8中任一項所述之分化培養基，其中，CDK8/19抑制劑為選自由磷酸(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯醯胺)苯甲基)二乙酯、2-(4-(4-(異喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙醯胺、4-((2-(6-(4-甲基哌
-1-羰基)萘-2-基)乙基)胺基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氫苯并[b][1,4]二氧雜環己二烯-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]嗒
-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺醯基)-3,4-二氫喹
啉-2(1H)-酮、及(E)-3-(4-(1-環丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(嗎啉基甲基)苯基)丙烯醯胺所組成群組中之一個或複數個。