TW202233662A - 膜融合蛋白及其在免疫細胞中的應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了一種表現介白素-15的嵌合抗原受體免疫細胞及其應用。具體地，本發明提供了一種基因重組的嵌合抗原受體免疫細胞，其細胞表面表現介白素-15突變體與IL-15Ra融合蛋白，實驗顯示該突變體免疫細胞在抗原持續刺激情況下，明顯提高免疫細胞存活，促進免疫細胞的擴增，減少TME對免疫細胞的抑制，並增強CAR-T 細胞的持久性和抗腫瘤活性。
Description
本發明涉及免疫細胞治療領域，更具體地涉及共表現介白素-15突變體和IL-15Rα融合蛋白且標靶固態腫瘤和血液瘤的基因工程化免疫細胞及其應用。
免疫細胞療法是一種全新的藥物開發模式。利用基因工程化改造人類免疫細胞使其成為活性藥物，在治療B細胞惡性腫瘤方面已經取得了顯著的進展。
目前已開發了多種免疫療法，包括LAK、DC、CIK、DC-CIK、TCR-T、CAR-T、NK、CAR-NK等等。常用的CAR-T細胞免疫療法包括自體和通用型CAR-T療法，其中自體CAR-T療法採用病人的免疫細胞，而異體免疫療法採用同種異體對象的CAR-T細胞，將所需的免疫細胞進行體外培養、基因編輯和擴增後回輸病人體內，這些細胞以非MHC限制方式辨識腫瘤細胞，不需要抗原呈現的機制辨識腫瘤抗原，減少腫瘤細胞透過向下調控MHC以及抗原呈現介導的免疫逃逸。針對腫瘤相關抗原標的(TAA)，設計細胞表面嵌合抗原受體（CAR）分子特異辨識腫瘤細胞表現的抗原標的，透過分泌干擾素、穿孔素等細胞因子直接攻擊並毒殺腫瘤細胞，從而達到治療或緩解疾病的目的。
目前，免疫治療血液瘤已有突出的療效，而在固態腫瘤中療效並不理想。主要原因包括三方面，一是安全的腫瘤特異性抗原標的，二是實體腫瘤的異質性，三是存在複雜的腫瘤細胞微環境等因素，包括免疫抑制細胞Tregs和MDSCs等以及免疫抑制因子的存在，不利於免疫細胞存活，從而抑制免疫治療效果。間皮素是一種存在於正常間皮細胞上的分化抗原，在間皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等腫瘤中均有高度表現，正常組織如正常胸膜、心包和腹膜的間皮細胞中有限表現，在氣管，卵巢，睾丸，扁桃腺和輸卵管的上皮細胞表面上表現最低。因此間皮素可作為有效的免疫治療標的，目前針對MSLN設計免疫治療策略，主要包括抗體療法、免疫毒素和嵌合抗原受體T細胞療法。抗體類藥物包括Amatuximab（MORAb-009），Anetumab Ravtansine (BAY94-9343)，DMOT4039A，MDX-1204等，但其治療固態腫瘤療效並不理想，尚需完善現有的治療技術，增強療效，降低治療過程中的風險。
綜上所述，本領域尚需進一步開發更有效、持久、安全標靶固態腫瘤的免疫療法。
本發明的目的在於提供一種表現介白素-15的嵌合抗原受體免疫細胞及其應用。
在本發明的第一方面，提供了一種嵌合抗原受體(CAR)建構物，所述CAR建構物的結構如下式I或II所示，
X-A-E (I)
E-A-X (II)
式中，
各“-”獨立地為連接肽或肽鍵；
X為標靶腫瘤抗原的CAR；
A為自剪切元件；
E為IL-15/IL-15Rα複合體。
在另一優選例中，所述的CAR建構物的結構如式I所示。
在另一優選例中，所述的IL-15/IL-15Rα複合體包含IL-15和IL-15Rα。
在另一優選例中，所述的IL-15和IL-15Rα來源於人。
在另一優選例中，所述的IL-15和IL-15Rα透過連接肽連接。
在另一優選例中，所述的IL-15/IL-15Rα複合體還包含信號肽元件。
另一優選例中，所述的IL-15/IL-15Rα複合體的結構如下式III所示，
L’-M-I-R (III)
式中，
各“-”獨立地為連接肽或肽鍵；
L’為無或信號肽；
M為IL-15或其突變體；
I為柔性連接子；
R為IL-15Rα。
在另一優選例中，所述的IL-15突變體具有IL-15的生物活性。
在另一優選例中，所述的IL-15的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 1所示。
在另一優選例中，所述的IL-15突變體(IL-15N72D)的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 2所示。
在另一優選例中，所述的IL-15Rα為完整的IL-15Rα元件。
在另一優選例中，所述的IL-15Rα包含跨膜區和胞內區。
在另一優選例中，所述的IL-15Rα從N端到C端依次包括sushi結構域(與IL-15結合的活性片段)胞外區、跨膜區和胞內區。
在另一優選例中，所述的IL-15Rα的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 3所示。
在另一優選例中，所述的柔性連接子為連接肽，較佳地，所述連接肽的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 4所示(SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ)。
在另一優選例中，所述的L’為來源IgE, IL-2的信號肽。
在另一優選例中，所述的IL-15 /IL-15Rα複合體的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 5所示。
在另一優選例中，所述的IL-15突變體/IL-15Rα複合體的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 6所示。
在另一優選例中，所述的自剪切元件包括T2A、P2A。
在另一優選例中，所述的X(CAR)的結構如下式IV所示，
L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (IV)
各“-”獨立地為連接肽或肽鍵；
L為無或信號肽；
scFv為標靶腫瘤抗原的抗體單鏈可變區；
H為無樞紐區；
TM為跨膜結構域；
C為共刺激信號分子；
CD3ζ為源於CD3ζ的細胞質液信號傳導序列；
在另一優選例中，所述的腫瘤抗原選自下組：間皮素、Claudin18.2、MUC1、GPC3、PSCA、Her2、CD19、或其組合。
在另一優選例中，所述的腫瘤抗原為間皮素。
在另一優選例中，所述的L為選自下組的蛋白的信號肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其組合。
在另一優選例中，所述的L為CD8來源的信號肽。
在另一優選例中，所述的H為選自下組的蛋白的樞紐區：CD8、CD28、CD137、或其組合。
在另一優選例中，所述的H為CD8來源的樞紐區。
在另一優選例中，所述的TM為選自下組的蛋白的跨膜區：ICOS、CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、MUC1-Tn、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其組合。
在另一優選例中，所述的TM為CD8或CD28來源的跨膜區。
在另一優選例中，所述的C為選自下組的蛋白的共刺激信號分子：ICOS、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其組合。
在另一優選例中，所述的C為CD28來源的共刺激信號分子。
在另一優選例中，所述的X的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 8所示。
在另一優選例中，所述的CAR建構物的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 7所示。
在本發明的第二方面，提供了一種核酸分子，所述的核酸分子編碼本發明第一方面所述的CAR建構物，或者，
所述的核酸分子包含編碼標靶腫瘤抗原的CAR的第一核酸分子和編碼IL-15/IL-15Rα複合體的第二核酸分子，其中所述的標靶腫瘤抗原的CAR和IL-15/IL-15Rα複合體的定義如上所述。
在另一優選例中，所述的第一核酸分子和第二核酸分子可以是串聯的，也可以是獨立存在的。
在本發明的第三方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發明第二方面所述的核酸分子。
在另一優選例中，所述的載體選自下組：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體(AAV)、反轉錄病毒載體、轉座子、或其組合。
在另一優選例中，所述的載體選自下組：質體、病毒載體。
在另一優選例中，所述載體為病毒顆粒的形式。
在另一優選例中，所述載體為慢病毒載體。
在本發明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述的宿主細胞中含有本發明第三方面所述的載體或染色體中整合有外源的本發明第二方面所述的核酸分子或表現本發明第一方面所述的CAR建構物。
在另一優選例中，所述的宿主細胞包括真核細胞和原核細胞。
在另一優選例中，所述的宿主細胞包括大腸桿菌。
在本發明的第五方面，提供了一種基因工程化的免疫細胞，所述的免疫細胞表現有本發明第一方面所述的CAR建構物，或者所述的免疫細胞表現有標靶腫瘤抗原的CAR和IL-15/IL-15Rα複合體，其中所述的標靶腫瘤抗原的CAR和IL-15/IL-15Rα複合體的定義如上所述。
在另一優選例中，標靶腫瘤抗原的CAR和IL-15/IL-15Rα複合體獨立地表現於所述免疫細胞的細胞膜上。
在另一優選例中，所述細胞為分離的細胞，和/或所述細胞為基因工程化的細胞。
在另一優選例中，所述的免疫細胞來自人或非人哺乳動物(如鼠)。
在另一優選例中，所述細胞包括T細胞、NK細胞。
在另一優選例中，所述的基因工程化的免疫細胞可以是嵌合抗原受體T細胞（CAR-T 細胞）或嵌合抗原受體NK細胞（CAR-NK 細胞）。
在本發明的第六方面，提供了一種製劑，所述製劑含有本發明第一方面所述的CAR建構物、本發明第二方面所述的核酸分子、本發明第三方面所述的載體、或本發明第五方面所述的免疫細胞，以及藥學上可接受的載劑。
在另一優選例中，所述製劑為液態製劑。
在另一優選例中，所述製劑的劑型為注射劑。
在另一優選例中，所述製劑中所述CAR-T細胞的濃度為1×10
3-1×10
8個細胞/ml，較佳地1×10
4-1×10
7個細胞/ml。
在另一優選例中，所述的製劑還包含抗腫瘤的第二活性成分，較佳地包括第二抗體、或化療劑。
在另一優選例中，所述的化療劑選自下組：多西他賽、卡鉑、或其組合。
在本發明的第七方面，提供了一種本發明第一方面所述的CAR建構物、本發明第二方面所述的核酸分子、本發明第三方面所述的載體、或本發明第五方面所述的免疫細胞、或本發明第六方面所述的製劑的用途，用於製備預防和/或治療癌症或腫瘤的藥物或製劑。
在另一優選例中，所述腫瘤選自下組：血液腫瘤、固態腫瘤、或其組合。
在另一優選例中，所述血液腫瘤選自下組：急性骨髓性白血病(AML)、多發性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、或其組合。
在另一優選例中，所述固態腫瘤選自下組：胃癌、胃癌腹膜轉移、肝癌、白血病、腎臟腫瘤、肺癌、小腸癌、骨癌、前列腺癌、結直腸癌、乳腺癌、大腸癌、宮頸癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、腎上腺腫瘤、膀胱腫瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、腦膠質瘤、子宮內膜癌、或其組合。
在另一優選例中，所述的腫瘤為間皮素陽性腫瘤，較佳地為間皮素高度表現的腫瘤。
在本發明的第八方面，提供了一種用於製備本發明第四方面所述的宿主細胞的套組，所述套組含有容器，以及位於容器內的本發明第二方面所述的核酸分子、或本發明第三方面所述的載體。
在本發明的第九方面，提供了一種製備本發明第五方面所述的基因工程化的免疫細胞的方法，所述方法包括以下步驟：
(a)提供待改造的免疫細胞；和
(b)將本發明第二方面所述的核酸分子或本發明第三方面所述的載體轉導入所述免疫細胞內，從而獲得所述基因工程化的免疫細胞。
在另一優選例中，所述基因工程化的免疫細胞為CAR-T細胞或CAR-NK細胞。
在另一優選例中，所述的方法還包括對獲得的基因工程化免疫細胞進行功能和有效性檢測的步驟。
在本發明的第十方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對象施用適量的本發明第三方面所述的載體、本發明第五方面所述的免疫細胞、或本發明第六方面所述的製劑。
在另一優選例中，所述疾病為癌症或腫瘤。
在本發明的第十一方面，提供了一種IL-15/IL-15Rα複合體，所述的IL-15/IL-15Rα複合體的結構如下式III所示，
L’-M-I-R (III)
式中，
各“-”獨立地為連接肽或肽鍵；
L’為無或信號肽；
M為IL-15或其突變體；
I為柔性連接子；
R為IL-15Rα，
其中，所述的IL-15Rα包含跨膜區和胞內區。
在本發明的第十二方面，提供了一種本發明的第十一方面所述的IL-15/IL-15Rα複合體的用途，用於製備一製劑，所述製劑用於增強CAR-T細胞的持久性和/或增強CAR-T細胞的細胞毒性。
在另一優選例中，所述製劑用於基於CAR-T細胞的過繼免疫治療。
在另一優選例中，所述的增強CAR-T細胞的持久性是指增強CAR-T細胞對腫瘤細胞的持續毒殺能力。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
本發明人經過廣泛而深入地研究，首次意外地發現一種基因重組的嵌合抗原受體免疫細胞及其應用，所述嵌合抗原受體免疫細胞表面表現超級介白素-15，即為介白素-15突變體與IL-15Ra融合蛋白，體外實驗顯示該突變體能顯著增強免疫細胞的增殖能力、存活能力，持續毒殺力和促進NK細胞的擴增；體內實驗顯示該突變體持久抗腫瘤活性。在此基礎上完成了本發明。
術語
為了可以更容易地理解本公開，首先定義某些術語。如本申請中所使用的，除非本文另有明確規定，否則以下術語中的每一個應具有下面給出的含義。在整個申請中闡述了其它定義。
術語“約”可以是指在本領域普通技術人員確定的特定值或組成的可接受誤差範圍內的值或組成，其將部分地取決於如何測量或測定值或組成。
術語“給予”是指使用本領域技術人員已知的各種方法和遞送系統中的任一種將本發明的產品物理引入受試者，包括靜脈內，肌內，皮下，腹膜內，脊髓或其它腸胃外給藥途徑，例如透過注射或輸液。
術語“抗體”(Ab)應包括但不限於免疫球蛋白，其特異性結合抗原並包含透過二硫鍵互連的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈，或其抗原結合部分。每條H鏈包含重鏈可變區 (本文縮寫為VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個恆定結構域CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個恆定結構域CL。VH和VL區可以進一步細分為稱為互補決定區(CDR)的高度變異，其散佈有更守恆的稱為框架區(FR)的區域。每個VH和VL包含三個CDR和四個FR，從胺基末端到羧基末端按照以下順序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。
應理解，本文中胺基酸名稱採用國際通用的單英文字母標識，與其相對應的胺基酸名稱三英文字母簡寫分別是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
術語“嵌合抗原受體”、“嵌合膜抗原受體”、“膜融合蛋白”、和“重組的膜融合蛋白”可互換使用，均代表本發明所建構的IL-15/IL-15Rα複合體。
IL-15
IL-15是一種可以刺激免疫細胞生長的細胞因子。基於IL-15的藥物開發長期以來集中在可溶型的IL-15改造上。已有文獻和專利報導，集中在開發可溶型IL-15藥物，主要有RL1，ALT803，HRP008，P22339四種結構。
RL1是IL-15與IL-15受體α的 Sushi domain的複合體，兩者之間透過一個Linker連接。ALT803是兩個IL-15N72D突變體與二聚體IL-15受體α的 Sushi domain /Fc融合蛋白的複合體，即IL-15（N72D）: IL-15Rα Su / Fc的複合體。HRP00018是IL-15 /Fc融合蛋白與IL-15受體α的 Sushi domain /Fc融合蛋白透過Knob-into-Hole形式相連形成複合體。P22339是IL-15(L52C)突變體與IL-15Rα Sushi domain（S40C）/Fc 複合體在突變位點形成二硫鍵，透過Knob-into-Hole形式連接，進而穩定複合物的結構。
綜上所述的四種結構，克服了重組的IL-15半衰期短的缺點，都明顯延長體內的半衰期，並提高其生物學活性，如促進了CD8+記憶 T細胞、NKT和NK細胞增殖。但其仍舊存在毒副作用和半衰期短的問題，在臨床使用中需多次給藥，限制其臨床實用性。
IL-15/IL-15Rα 複合體
本發明提供了一種“IL-15/IL-15Rα複合體”，其包含IL-15或其突變體，以及完整的包含跨膜區和胞內區的IL-15Rα，可以用於增強CAR-T細胞的持久性和/或增強CAR-T細胞的細胞毒性。
在優選的實施方式中，本發明的IL-15/IL-15Rα複合體可以包含IL-15N72D/IL-15Rα複合體，可以包含信號肽(IgE, IL-2等)，可以與CAR基本結構共表現。
本發明的IL-15(N72D)-IL-15Rα結構是表現在免疫治療細胞表面的複合物。IL-15和IL-15Rα透過linker相連，其中IL-15Rα結構是指完整的IL-15Rα分子包括胞外區（含sushi domain）、跨膜區和胞內區。IL-15Rα可透過召集免疫治療細胞表面自身表現的IL-2Rβ和IL-2Rγc鏈，活化下游信號途徑信號比如JAK1/JAK3，Stat3/Stat5達到促進免疫治療細胞增殖，抑制免疫治療細胞凋亡的目的，從而獲得更好的治療效果。同時將該複合物限制在免疫治療細胞表面，避免活化免疫抑制型T細胞、NK和NKT細胞的增殖（比如Treg）可能帶來的免疫抑制作用，也能夠避免過度活化T細胞、NK和NKT細胞帶來的系統性或者全身性的毒副作用。
嵌合抗原受體（ CAR ）
本發明例示性的採用Meso-CAR基本結構，即標靶間皮素的CAR結構進行表現IL-15/IL-15Rα複合體的CAR-T細胞的建構。
在優選的實施方式中，所述IL-15/IL-15Rα複合體透過自剪切元件連接至基本CAR結構的C端，並在剪切後在CAR-T細胞的膜上表現。
在優選的實施方式中，所述Meso-CAR由信號肽、Mesothelin單鏈可變區、CD28/4-1bb/ICOS、CD3ζ串聯而成。
具體地，本發明的嵌合抗原受體(CAR)包括細胞外結構域、跨膜結構域、和細胞內結構域。胞外結構域包括標的-特異性結合元件(也稱為抗原結合結構域)。細胞內結構域包括共刺激信號傳導區和ζ鏈部分。共刺激信號傳導區指包括共刺激分子的細胞內結構域的一部分。共刺激分子為淋巴細胞對抗原的有效反應所需要的細胞表面分子，而不是抗原受體或它們的配體。在優選的實施方式中，本發明的CAR包含來源CD28的共刺激信號分子。
在CAR的胞外結構域和跨膜結構域之間，或在CAR的細胞質液結構域和跨膜結構域之間，可併入連接子。如本文所用的，術語“連接子”通常指起到將跨膜結構域連接至多肽鏈的胞外結構域或細胞質液結構域作用的任何寡肽或多肽。連接子可包括0-300個胺基酸，優選地2至100個胺基酸和最優選地3至50個胺基酸。
在本發明的一個較佳的實施方式中，本發明提供的CAR的胞外結構域包括標靶Meso的抗原結合結構域。本發明的CAR當在T細胞中表現時，能夠基於抗原結合特異性進行抗原辨識。當其結合其關聯抗原時，影響腫瘤細胞，導致腫瘤細胞不生長、被促使死亡或以其他方式被影響，並導致患者的腫瘤負荷縮小或消除。抗原結合結構域優選與來自共刺激分子和ζ鏈中的一個或多個的細胞內結構域融合。
如本文所用，“抗原結合結構域”“單鏈抗體片段”均指具有抗原結合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)
2片段，或單一Fv片段。Fv抗體含有抗體重鏈可變區、輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般的，Fv抗體還包含VH和VL結構域之間的多肽連接子，且能夠形成抗原結合所需的結構。抗原結合結構域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一個完整抗體的1/6。單鏈抗體優選是由一條核苷酸鏈編碼的一條胺基酸鏈序列。作為本發明的優選方式，所述scFv包含特異性辨識Meso的抗體，較佳地為人源化的單鏈抗體。
對於絞鏈區和跨膜區(跨膜結構域)，CAR可被設計以包括融合至CAR的胞外結構域的跨膜結構域。在一個實施方式中，使用天然與CAR中的結構域之一相關聯的跨膜結構域。在一些例子中，可選擇跨膜結構域，或透過胺基酸置換進行修飾，以避免將這樣的結構域結合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜結構域，從而最小化與受體複合物的其他成員的相互作用。
序列
本申請序列表中涉及的各序列如下：
載體
| SEQ ID NO | 序列名稱 | 序列 |
| 1 | IL-15 | NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS |
| 2 | IL-15突變體 | NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS |
| 3 | IL-15Rα | ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL |
| 4 | 柔性連接子 | SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ |
| 5 | IL-15 /IL-15α複合物 | MDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL |
| 6 | IL-15突變體/IL-15α複合物 | MDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL |
| 7 | CAR建構物 | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDWTWILFLVAAATRVHSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL |
| 8 | CAR | MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSG |
編碼期望分子的核酸序列可利用在本領域中已知的重組方法獲得，諸如例如透過從表現基因的細胞中篩選文庫，透過從已知包括該基因的載體中得到該基因，或透過利用標準的技術，從包含該基因的細胞和組織中直接分離。可選地，感興趣的基因可被合成生產。
本發明也提供了其中插入本發明的表現匣的載體。源於反轉錄病毒諸如慢病毒的載體是實現長期基因轉移的合適工具，因為它們允許轉基因長期、穩定的整合並且其在子細胞中增殖。慢病毒載體具有超過源自致癌反轉錄病毒諸如鼠科白血病病毒的載體的優點，因為它們可轉導非增殖的細胞，諸如肝細胞。它們也具有低免疫原性的優點。
簡單概括，通常可操作地連接本發明的表現匣或核酸序列至啟動子，並將其併入表現載體。該載體適合於複製和整合真核細胞。典型的選殖載體包含可用於調節期望核酸序列表現的轉錄和翻譯終止子、初始序列和啟動子。
本發明的表現建構體也可利用標準的基因傳遞方案，用於核酸免疫和基因療法。基因傳遞的方法在本領域中是已知的。見例如美國專利號5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此透過引用全文併入。在另一個實施方式中，本發明提供了基因療法載體。
該核酸可被選殖入許多類型的載體。例如，該核酸可被選殖入如此載體，其包括但不限於質體、噬質體、噬菌體衍生物、動物病毒和黏接質體。特定的感興趣載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體和定序載體。
進一步地，表現載體可以以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術在本領域中是公知的並在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒學和分子生物學手冊中進行了描述。可用作載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。通常，合適的載體包含在至少一種有機體中起作用的複製起點、啟動子序列、方便的限制酶位點和一個或多個可選擇的標記(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美國專利號6,326,193)。
已經開發許多基於病毒的系統，用於將基因轉移入哺乳動物細胞。例如，反轉錄病毒提供了用於基因傳遞系統的方便的平台。可利用在本領域中已知的技術將選擇的基因插入載體並包封入反轉錄病毒顆粒。該重組病毒可隨後被分離和傳遞至體內或離體的對象細胞。許多反轉錄病毒系統在本領域中是已知的。在一些實施方式中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領域中是已知的。在一個實施方式中，使用慢病毒載體。
額外的啟動子元件，例如增強子，可以調節轉錄開始的頻率。通常地，這些位於起始位點上游的30-110bp區域中，儘管最近已經顯示許多啟動子也包含起始位點下游的功能元件。啟動子元件之間的間隔經常是柔性的，以便當元件相對於另一個被倒置或移動時，保持啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間隔可被增加隔開50bp，活性才開始下降。取決於啟動子，表現出單個元件可合作或獨立地起作用，以起動轉錄。
合適的啟動子的一個例子為即時早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序列為能夠驅動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高位準表現的強組成型啟動子序列。合適的啟動子的另一個例子為延伸生長因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於類人猿病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、鳥類白血病病毒啟動子、艾伯斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒即時早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、以及人基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅素啟動子和肌酸激酶啟動子。進一步地，本發明不應被限於組成型啟動子的應用。誘導型啟動子也被考慮為本發明的一部分。誘導型啟動子的使用提供了分子開關，其能夠當這樣的表現是期望的時，打開可操作地連接誘導型啟動子的多核苷酸序列的表現，或當表現是不期望的時關閉表現。誘導型啟動子的例子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子和四環素啟動子。
為了評估CAR多肽或其部分的表現，被引入細胞的表現載體也可包含可選擇的標記基因或報導基因中的任一個或兩者，以便於從透過病毒載體尋求被轉染或感染的細胞群中鑑定和選擇表現細胞。在其他方面，可選擇的標記可被攜帶在單獨一段DNA上並用於共轉染程序。可選擇的標記和報導基因兩者的側翼都可具有適當的調節序列，以便能夠在宿主細胞中表現。有用的可選擇標記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。
報導基因用於鑑定潛在轉染的細胞並用於評價調節序列的功能性。通常地，報導基因為以下基因：其不存在於受體有機體或組織或由受體有機體或組織進行表現，並且其編碼多肽，該多肽的表現由一些可容易檢測的性質例如酶活性清楚表示。在DNA已經被引入受體細胞後，報導基因的表現在合適的時間下進行測定。合適的報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合適的表現系統是公知的並可利用已知技術製備或從商業上獲得。通常，顯示最高位準的報導基因表現的具有最少5個側翼區的建構體被鑑定為啟動子。這樣的啟動子區可被連接至報導基因並用於評價試劑調節啟動子-驅動轉錄的能力。
將基因引入細胞和將基因表現入細胞的方法在本領域中是已知的。在表現載體的內容中，載體可透過在本領域中的任何方法容易地引入宿主細胞，例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。例如，表現載體可透過物理、化學或生物學手段轉移入宿主細胞。
將多核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染法、基因槍、微注射、電穿孔等等。生產包括載體和/或外源核酸的細胞的方法在本領域中是公知的。見例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。將多核苷酸引入宿主細胞的優選方法為磷酸鈣轉染。
將感興趣的多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，特別是反轉錄病毒載體，已經成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細胞的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺相關病毒等等。見例如美國專利號5,350,674和5,585,362。
將多核苷酸引入宿主細胞的化學手段包括膠體分散系統，諸如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠；和基於脂質的系統，包括水包油乳劑、微胞、混合微胞和脂質體。用作體外和體內傳遞工具(delivery vehicle)的例示性膠體系統為脂質體(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒傳遞系統的情況下，例示性傳遞工具為脂質體。考慮使用脂質製劑，以將核酸引入宿主細胞(體外、離體(ex vivo)或體內)。在另一方面，該核酸可與脂質相關聯。與脂質相關聯的核酸可被封裝入脂質體的水性內部中，散佈在脂質體的脂雙層內，經與脂質體和寡核苷酸兩者都相關聯的連接分子附接至脂質體，陷入脂質體，與脂質體複合，分散在包含脂質的溶液中，與脂質混合，與脂質聯合，作為懸浮液包含在脂質中，包含在微胞中或與微胞複合，或以其他方式與脂質相關聯。與組合物相關聯的脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體不限於溶液中的任何具體結構。例如，它們可存在於雙分子層結構中，作為微胞或具有“塌縮的(collapsed)”結構。它們也可簡單地被散佈在溶液中，可能形成大小或形狀不均一的聚集體。脂質為脂肪物質，其可為天然發生或合成的脂質。例如，脂質包括脂肪小滴，其天然發生在細胞質以及包含長鏈脂肪族烴和它們的衍生物諸如脂肪酸、醇類、胺類、胺基醇類和醛類的該類化合物中。
在本發明的一個優選地實施方式中，所述載體為慢病毒載體。
製劑
本發明提供了一種含有本發明的CAR-T細胞，以及藥學上可接受的載劑、稀釋劑或賦形劑。在一個實施方式中，所述製劑為液態製劑。優選地，所述製劑為注射劑。優選地，所述製劑中所述CAR-T細胞的濃度為1×10
3-1×10
8個細胞/ml，更優地1×10
4-1×10
7個細胞/ml。
在一個實施方式中，所述製劑可包括緩衝液諸如中性緩衝鹽水、硫酸鹽緩衝鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑諸如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發明的製劑優選配製用於靜脈內施用。
治療性應用
本發明包括用編碼本發明表現匣的慢病毒載體(LV)轉導的細胞(例如，T細胞)進行的治療性應用。轉導的T細胞可標標的腫瘤細胞的標誌物Meso，協同活化T細胞，引起T細胞免疫反應，從而顯著提高其對腫瘤細胞的毒殺效率。
因此，本發明也提供了刺激對哺乳動物的標的細胞群或組織的T細胞-介導的免疫反應的方法，其包括以下步驟：給哺乳動物施用本發明的CAR-T細胞。
在一個實施方式中，本發明包括一類細胞療法，分離病人自體T細胞（或者異源供體），活化並進行基因改造產生CAR-T細胞，隨後注入同一病人體內。這種方式患移植物抗宿主病概率極低，抗原被T細胞以無MHC限制方式辨識。此外，一種CAR-T就可以治療表現該抗原的所有癌症。不像抗體療法，CAR-T細胞能夠體內複製，產生可導致持續腫瘤控制的長期持久性。
在一個實施方式中，本發明的CAR-T細胞可經歷穩固的體內T細胞擴展並可持續延長的時間量。另外，CAR介導的免疫反應可為過繼免疫療法步驟的一部分，其中CAR-修飾T細胞誘導對CAR中的抗原結合結構域特異性的免疫反應。例如，抗Meso的CAR-T細胞引起抗Meso陽性的細胞的特異性免疫反應。
儘管本文公開的數據具體公開了包括抗-Meso scFv、樞紐和CD28跨膜區和胞內區和CD3ζ信號傳導結構域的慢病毒載體，但本發明應被解釋為包括對建構體組成部分中的每一個的任何數量的變化。
可治療的癌症包括沒有被血管化或基本上還沒有被血管化的腫瘤，以及血管化的腫瘤。癌症可包括非固態腫瘤(諸如血液學腫瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括固態腫瘤。用本發明的CAR治療的癌症類型包括但不限於癌、胚細胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴惡性腫瘤、良性和惡性腫瘤、和惡性瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。也包括成人腫瘤/癌症和兒童腫瘤/癌症。
血液學癌症為血液或骨髓的癌症。血液學(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(諸如急性淋巴細胞白血病、急性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病和成髓細胞性、前髓細胞性、顆粒-單核細胞型、單核細胞性和紅白血病)、慢性白血病(諸如慢性髓細胞(顆粒細胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴細胞白血病)、真性紅血球增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(無痛和高等級形式)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、重鏈疾病、骨髓增生異常綜合症、多毛細胞白血病和脊髓發育不良。
固態腫瘤為通常不包含囊腫或液體區的組織的異常腫塊。固態腫瘤可為良性或惡性的。不同類型的固態腫瘤以形成它們的細胞類型命名(諸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。固態腫瘤諸如肉瘤和癌的例子包括纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤間皮瘤、淋巴惡性腫瘤、胰腺癌卵巢癌。
在優選的實施方式中，可治療的癌症為Meso陽性腫瘤。
本發明的CAR-修飾T細胞也可用作對哺乳動物離體免疫和/或體內療法的疫苗類型。優選地，哺乳動物為人。
對於離體免疫，以下中的至少一項在將細胞施用進入哺乳動物前在體外發生：i)擴增細胞，ii)將編碼CAR的核酸引入細胞，和/或iii)冷凍保存細胞。
離體程序在本領域中是公知的，並在以下更完全地進行討論。簡單地說，細胞從哺乳動物(優選人)中分離並用表現本文公開的CAR的載體進行基因修飾(即，體外轉導或轉染)。CAR-修飾的細胞可被施用給哺乳動物接受者，以提供治療益處。哺乳動物接受者可為人，和CAR-修飾的細胞可相對於接受者為自體的。可選地，細胞可相對於接受者為同種異基因的、同基因的(syngeneic)或異種的。
除了就離體免疫而言使用基於細胞的疫苗之外，本發明也提供了體內免疫以引起針對患者中抗原的免疫反應的組合物和方法。
本發明提供了治療腫瘤的方法，其包括施用給需要其的對象治療有效量的本發明的CAR-修飾的T細胞。
本發明的CAR-修飾的T細胞可被單獨施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其他組分諸如IL-2、IL-17或其他細胞因子或細胞群結合施用。簡單地說，本發明的藥物組合物可包括如本文所述的標的細胞群，與一種或多種藥學或生理學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑結合。這樣的組合物可包括緩衝液諸如中性緩衝鹽水、硫酸鹽緩衝鹽水等等；碳水化合物諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑諸如EDTA或谷胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。本發明的組合物優選配製用於靜脈內施用。
本發明的藥物組合物可以以適於待治療(或預防)的疾病的方式施用。施用的數量和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病症、和患者疾病的類型和嚴重度——儘管適當的劑量可由臨床試驗確定。
當指出“免疫學上有效量”、“抗腫瘤有效量”、“腫瘤-抑制有效量”或“治療量”時，待施用的本發明組合物的精確量可由醫師確定，其考慮患者(對象)的年齡、重量、腫瘤大小、感染或轉移程度和病症的個體差異。可通常指出：包括本文描述的T細胞的藥物組合物可以以10
4至10
9個細胞/kg體重的劑量，優選10
5至10
6個細胞/kg體重的劑量(包括那些範圍內的所有整數值)施用。T細胞組合物也可以以這些劑量多次施用。細胞可透過使用免疫療法中公知的注入技術(見例如Rosenberg等，NewEng.J. of Med.319:1676，1988)施用。對於具體患者的最佳劑量和治療方案可透過監測患者的疾病跡象並因此調節治療由醫學領域技術人員容易地確定。
對象組合物的施用可以以任何方便的方式進行，包括透過噴霧法、注射、吞咽、輸液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內、瘤內、結內、脊髓內、肌肉內、透過靜脈內(i.v.)注射或腹膜內施用給患者。在一個實施方式中，本發明的T細胞組合物透過皮內或皮下注射被施用給患者。在另一個實施方式中，本發明的T細胞組合物優選透過i.v.注射施用。T細胞的組合物可被直接注入腫瘤，淋巴結或感染位置。
在本發明的某些實施方式中，利用本文描述的方法或本領域已知的其他將T細胞擴展至治療性層級的方法活化和擴展的細胞，與任何數量的有關治療形式結合(例如，之前、同時或之後)施用給患者，所述治療形式包括但不限於用以下試劑進行治療：所述試劑諸如抗病毒療法、西多福韋和白細胞介素-2、阿糖胞苷(也已知為ARA-C)或對MS患者的那他珠單抗治療或對牛皮癬患者的厄法珠單抗治療或對PML患者的其他治療。在進一步的實施方式中，本發明的T細胞可與以下結合使用：化療、輻射、免疫抑制劑，諸如，環孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麥考酚酯和FK506，抗體或其他免疫治療劑。在進一步的實施方式中，本發明的細胞組合物與骨髓移植、利用化療劑諸如氟達拉濱、外部光束放射療法(XRT)、環磷醯胺結合(例如，之前、同時或之後)而施用給患者。例如，在一個實施方式中，對象可經歷高劑量化療的標準治療，之後進行周邊血液幹細胞移植。在一些實施方式中，在移植後，對象接受本發明的擴展的免疫細胞的注入。在一個額外的實施方式中，擴展的細胞在外科手術前或外科手術後施用。
施用給患者的以上治療的劑量將隨著治療病症的精確屬性和治療的接受者而變化。人施用的劑量比例可根據本領域接受的實踐實施。通常，每次治療或每個療程，可將1×10
6個至1×10
10個本發明經修飾的T細胞(如，CAR-T細胞)，透過例如靜脈回輸的方式，施用於患者。
本發明的主要優點包括：
(a) 本發明CAR-T細胞的CAR結構中同時包含CAR的基本結構和IL-15/IL-15Rα複合體或IL-15突變體/IL-15Rα複合體，各自發揮功能，互不干擾。
(b) 體內實驗結果顯示本發明免疫細胞Meso-E1m1能明顯增強CAR-T細胞的細胞毒性和持久性，明顯優於Meso-E1。
(c) 體外實驗結果顯示，與Meso-1 CAR-T 比較，本發明免疫細胞Meso-E1m1在標的細胞和TGF-β1持續共培養情況下，明顯提高免疫細胞存活率，促進免疫細胞的擴增，減少TGF-β1對免疫細胞的抑制，同時增強CAR-T 細胞的細胞毒性和持久性。
(d) 與Meso-1 CAR-T 比較，本發明免疫細胞Meso-E1m1在體外暫態毒殺實驗中，明顯減少發炎因子TNF-α分泌。
(e) 本發明的免疫細胞可明顯增強NK細胞擴增。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子選殖：實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
實施例 1 從供體血液中分離 PBMC 和擴增 T 細胞
從周邊血液中分離單核細胞，使用Ficoll進行密度梯度離心，並富集T細胞（EasySep human T cell enrichment kit，Stemcell Technologies），使用偶聯anti-CD3/CD28磁珠活化培養和擴增T細胞，細胞培養系統採用x-vivo 15(5% FBS，300IU/mL rhIL-2)，細胞培養在37℃，5% CO
2培養箱連續培養。
實施例 2 細胞培養及建構
從ATCC獲得表現MSLN的細胞株： OVCAR3(人卵巢癌細胞株，ATCC HTB-161)，HCC70(人乳腺癌細胞株)，MDA-MB-231(人乳腺癌細胞株)，中MDA-MB-231MESO在MDA-MB231細胞基礎上透過慢病毒將MSLN抗原轉入，再經過單株選殖篩選後獲得高度表現MSLN的穩定細胞株。以上細胞按照ATCC指引配製培養基並培養細胞。
實施例 3 CAR 結構設計與轉導
本實施例例示性的採用Meso-CAR基本結構，即標靶間皮素的CAR結構進行表現IL-15/IL-15Rα複合物的CAR-T細胞建構。
本實施例建構了二代和四代CAR，結構如表1所示。
CAR的核心結構包括CD8胞外信號肽，P4 scFv(特異性標靶間皮素的scFv)，CD8來源的樞紐區和CD8/CD28跨膜區，並採用CD28胞內段共刺激信號，建構了3種Meso-CAR。
表1
| 命名 | 共刺激信號 | 胞內活化區 | 增強子 |
| Meso-1 | CD28 | 3ζ | N/A |
| Meso-E1 | CD28 | 3ζ | IL-15/IL-15Rα |
| Meso-E1m1 | CD28 | 3ζ | IL-15突變體/IL-15Rα |
將3種Meso-CAR基因分別選殖至FUW慢病毒載體中，與慢病毒包封質體pMD2.G（Addgene,Plasmid#12259）和psPAX2（Addgene, Plasmid#12260）使用PEI轉染試劑轉入293T細胞中，表現載體，分別收集48小時和72小時病毒，超高速離心濃縮後，感染活化T細胞。
結果顯示，利用三種Meso-CAR基因，成功建構了慢病毒載體。
實施例 4 CAR-T 細胞製備 - 慢病毒感染、 CAR 陽性率檢測和體外增殖
分離純化的原代T細胞在活化48小時後，分別加入實施例3中濃縮的慢病毒，細胞感染72小時後檢測CAR陽性率，分別使用生物素標記MSLN 抗原作為一抗，APC-Streptavidin(BD)作為二抗，以及anti-IL-15Rα抗體檢測scFv和IL-15Rα表現。
流式檢測結果如圖4所示。
轉染後T細胞置於37℃，5%CO
2培養箱中連續培養，隔天補液，在第10天收取細胞，凍存、計數，計算體外增殖率，E1 CAR-T細胞與E1m1 CAR-T細胞的增殖無明顯差異。
實施例 5 體外毒殺實驗和細胞因子檢測
對實施例4中收取的T細胞進行體外毒殺實驗。透過RTCA方法，以1x10
4/孔將標的細胞平盤培養於96孔RTCA平盤，培養18小時後，CAR T與標的細胞OVCAR3按比例1:1,1:3,1:6共培養，連續培養1-2天，即時記錄標的細胞的生長狀況，檢測標的細胞的存活率，計算CAR-T細胞的毒殺效率。連續培養1-2天後，將RTCA平盤取出，離心取共培養上清液，凍存-20℃。
結果如圖5A所示，Meso-1，Meso-E1與Meso-E1m1 CAR-T細胞與OVCAR3標的細胞共培養下，有明顯毒殺，且三者之間毒殺無明顯差異，NT （Non-transduced T cell）分別與腫瘤細胞進行共培養時(E:T=1:1,1:3,1:6)對腫瘤細胞沒有明顯毒殺。
按說明書推薦方法，使用HumanTh1/Th2 Cytokine kit Ⅱ（BD，Cat.551809）檢測共培養上清液細胞因子，先將共培養上清液解凍，配置mixed capture beads和Human Th1/Th2-Ⅱ PE Detection, 與樣品或標準品避光培育3小時，培育後，300g離心5min，甩掉上清液。加入100µl washing buffer 重新懸浮，震盪5min，流式細胞儀上機檢測。用FCAP Array v.3軟體數據分析。結果見圖5B所示，Meso-1，Meso-E1與Meso-E1m1 CAR-T細胞與OVCAR3標的細胞共培養的上清液中，IFN-γ含量無明顯差異；Meso-E1與Meso-E1m1 CAR-T細胞與OVCAR3標的細胞共培養上清液，TNF-α含量明顯低於Meso-1。
結果如圖6A所示，Meso-1，Meso-E1與Meso-E1m1CAR-T細胞與MDA-MB-231-MESO標的細胞共培養下，有明顯毒殺，且三者之間毒殺無明顯差異， NT （Non-transduced T cell）分別與腫瘤細胞進行共培養時(E:T=3:1,1:1,1:3)對腫瘤細胞沒有明顯毒殺。用HumanTh1/Th2 Cytokine kit Ⅱ（BD）檢測共培養上清液細胞因子，結果如圖6B， Meso-E1與Meso-E1m1 CAR-T細胞與MDA-MB-231-MESO標的細胞共培養上清液，TNF-α含量明顯低於Meso-1。
實施例 6 體內藥效研究 -1
選取NOD小鼠，皮下注射5E6 HCC70細胞，連續檢測腫瘤負荷，待腫瘤處於高速生長時，分組，每組2-3隻小鼠，分組後一天尾靜脈注射200uL DPBS/鼠， 5E6 E1/E1m1-CAR-T/鼠，CAR-T細胞注射後第1天，取少量小鼠血檢測CAR-T細胞體內存活數量，其後每週取一次血樣，檢測CAR-T細胞各種表型，每週兩次檢測皮下瘤大小。
結果如圖7A所示，注射Meso-E1 CAR-T細胞與Meso-E1m1 CAR-T細胞的小鼠在D10出現較為明顯的腫瘤體積下降；在D17、D21、D24繼續觀察動物腫瘤體積，E1組動物腫瘤體積回升，E1m1組繼續下降。
小鼠體重如圖7B所示，注射CAR-T細胞後，Meso-E1m1組小鼠的體重基本沒有變化。
實施例 7 體內藥效研究 -2
選取NOD小鼠，皮下注射5E6 HCC70細胞，連續檢測腫瘤負荷，待腫瘤處於高速生長時，分組，每組2-3隻小鼠，分組後一天尾靜脈注射200uL DPBS/鼠，高（表示HD）低劑量（表示LD）兩組CAR-T，每隻小鼠注射劑量分別為5E6或2E6，CAR-T分別為 Meso-1/Meso-E1m1，CAR-T細胞注射後第1天，取少量小鼠血檢測CAR-T細胞體內存活數量，其後每週取一次血樣，檢測CAR-T細胞各種表型，每週兩次檢測皮下瘤大小。
結果如圖8A所示，注射Meso-1 CAR-T細胞與Meso-E1m1 CAR-T細胞的小鼠在D10開始出現較為明顯的腫瘤體積下降；在D17、D21、D24繼續觀察動物腫瘤體積，高、低劑量Meso-1組動物腫瘤體積回升，高劑量E1m1組動物腫瘤體積沒有上升，低劑量E1m1組動物在D40開始腫瘤體積有復發，與Meso-1組比較，腫瘤體積明顯小。
如圖8B所示，各組小鼠體重無明顯變化。
如圖8C所示，注射CAR-T細胞後，各組中單隻小鼠的腫瘤體積變化，與Meso-1組比較，高劑量Meso-E1m1組動物腫瘤體積無復發，腫瘤體積均一併明顯小於Meso-1組。
實施例 8 體外藥效研究 — 多輪 毒殺
對實施例4中收取的T細胞進行體外多輪毒殺實驗。實驗方法見示意圖(圖9A)，將CAR-T細胞與標的細胞按1：3共培育，連續培養2-3天，在顯微鏡下觀察標的細胞的生長狀況，當其中一種CAR-T細胞將標的細胞全部裂解時，取一半T細胞檢測T細胞的表型及細胞數，並用胰蛋白酶消化標的細胞，將其計數作為標的細胞殘餘值，CAR-T細胞毒殺效率的計算公式： CAR-T細胞的毒殺效率=（腫瘤only組-實驗組)/腫瘤only組*100%，餘下一半細胞繼續與新的標的細胞共培養，按上述方法繼續連續毒殺。
結果如圖9B所示，各組CAR-T與OVCAR3共培養下(E:T=1:3)，Meso-E1/E1m1 在第三輪連續培養後顯示明顯毒殺優勢，如圖9C，顯示Meso-E1/E1m1在每一輪連續毒殺後，根據CAR陽性率和T細胞的計數，計算CAR-T細胞值，結果顯示Meso-E1/E1m1連續擴增明顯多於Meso-1 CAR-T, Meso-E1/E1m1之間無顯著差異。
結果如圖9D所示，各組CAR-T與MDA-MB231-Meso共培養下(E:T=1:3)，Meso-E1/E1m1 在第四輪連續培養後顯示明顯毒殺優勢。如圖9E，顯示Meso-E1/E1m1在每一輪連續毒殺後，根據CAR陽性率和T細胞的計數，計算CAR-T細胞值，結果顯示Meso-E1/E1m1連續擴增明顯多於Meso-1 CAR-T， Meso-E1/E1m1之間無顯著差異。
實施例 9 體外藥效研究 — TGF-β 存在下多輪毒殺
對實施例4中收取的T細胞進行體外多輪毒殺實驗。實驗方案如圖9A所示。將CAR-T細胞與標的細胞按1：5共培育，培養過程中加入不同濃度重組TGF-β1，每兩天補加一次，連續培養2-3天，即時記錄標的細胞生長狀況，當其中一種CAR-T細胞將標的細胞全部裂解時，取一半T細胞檢測T細胞的表型，細胞數，胰蛋白酶消化標的細胞後，計數即得到CAR-T細胞的毒殺效率=(對照組-實驗組)/對照組*100%，對照組為腫瘤only組，餘下一半細胞繼續與標的細胞共培養，按上述方法繼續連續毒殺。
結果如圖10A所示，各組CAR-T與OVCAR3共培養下(E:T=1:5)，Meso-E1m1在第二(R2)、四輪(R4)連續培養後顯示明顯毒殺優勢。表1顯示每輪毒殺後根據細胞陽性率，T細胞計數值和稀釋係數，計算出Meso-1、Meso-E1m1 CAR-T細胞數。圖10B為根據表2和表3所繪製CAR-T細胞擴增曲線，結果顯示Meso-E1m1在連續毒殺第四輪，CAR-T細胞擴增明顯比Meso-1多；Meso-E1m1在添加1.25、2.5、5ng/mL TGFβ1培養條件下，在連續毒殺第二輪，CAR-T細胞擴增明顯比Meso-1多17倍、19倍、15倍；Meso-E1m1在添加1.25 ng/mL TGFβ1培養條件下，連續毒殺第四輪有明顯毒殺標的細胞能力明顯優於Meso-1，CAR-T細胞的擴增也明顯多於相同培養條件的Meso-1 CAR-T，實驗結果顯示Meso-E1m1 CAR-T能有效減少TGFβ抑制T細胞增殖、活化能力，從而減少TGFβ的免疫抑制作用。
表2 Meso-1
表3 Meso-E1m1
實施例 10 Annexin V 染色檢測細胞凋亡
| 未處理組 | +1.25ng/mL TGF-β1 | +2.5ng/mL TGF-β1 | +5ng/mL TGF-β1 | |
| R0 | 1.20E+05 | 1.20E+05 | 1.20E+05 | 1.20E+05 |
| R1 | 2.57E+06 | 1.76E+06 | 1.51E+06 | 1.45E+06 |
| R2 | 1.31E+07 | 6.66E+05 | 3.46E+05 | 5.36E+05 |
| R4 | 8.48E+06 | 1.93E+05 | 9.22E+04 | 7.55E+04 |
| 未處理組 | +1.25ng/mL TGF-β1 | +2.5ng/mL TGF-β1 | +5ng/mL TGF-β1 | |
| R0 | 1.20E+05 | 1.20E+05 | 1.20E+05 | 1.20E+05 |
| R1 | 2.84E+06 | 1.59E+06 | 1.39E+06 | 1.37E+06 |
| R2 | 2.16E+07 | 1.12E+07 | 6.76E+06 | 7.92E+06 |
| R4 | 2.61E+07 | 1.27E+07 | 1.38E+06 | 7.71E+05 |
對實施例4中收取的T細胞進行體外毒殺實驗，CAR-T細胞與標的細胞(MDA-MB231-Meso)按1：2共培育，連續培養3天後，將CAR-T細胞移到新鮮的標的細胞中，繼續培養3天後，檢測CAR-T細胞的凋亡情況，培養過程中分兩組分別為不添加/添加圖示濃度的TGF-β1組。
結果如圖10C所示，Annexin V和7-AAD雙陰細胞，Meso-E1m1 CAR-T活細胞比例最高為60%，加入不同濃度TGF-β，其存活率也沒有明顯變化，而Meso-1 CAR組在TGF-β1培養條件下，凋亡細胞隨著TGF-β1濃度而升高，早期凋亡和晚期細胞明顯增多，實驗結果顯示Meso-E1m1 CAR-T能有效減少TGFβ促進T細胞凋亡能力，從而減少TGFβ的免疫抑制作用。
實施例 11 CAR-T 細胞與 PBNK 細胞共培育
對實施例4中收取的T細胞與體外培養的自體PBNK細胞按1：1比例共培養，PBNK細胞先用CFSE標記，分別檢測48小時，96小時的PBNK細胞數量，採用流式檢測方法，檢測培養系統中FITC+ 細胞。
CFSE標記方法： PBNK細胞離心後用PBS重新懸浮至1E6/mL，加入終濃度4uM CFSE，室溫培育2分鐘，再加入培養基終止反應。
自體PBNK來源於T細胞同一Donor的單核細胞，使用anti-CD56 microbeads 分離、純化，具體方法見美天旎的protocol。
實驗結果如圖11所示，E1 CAR-T 細胞與E1m1 CAR-T 細胞與PBNK細胞共培養48-72小時，與NT 細胞相比，E1和E1-m1 CAR-T細胞能明顯促進PBNK細胞的擴增。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1顯示了本發明所述膜融合蛋白的作用機理示意圖。
圖2A顯示本發明採用的CAR結構的示意圖。
圖2B顯示huIL-15/IL-15突變體複合物示意圖。
圖2C顯示huIL-15/IL-15突變體複合物的huIL-15Rα的結構。
圖3A顯示MESO-E1m1基因的胺基酸序列。
圖3B顯示E1m1基因的胺基酸序列。
圖4顯示CAR-T細胞的陽性率檢測圖。
圖5A顯示Meso-1，Meso-E1和Meso-E1m1 CAR-T細胞與卵巢癌細胞OVCAR3體外共培養系統中，CAR-T細胞對標的細胞裂解率。
圖5B顯示CAR-T細胞與卵巢癌OVCAR3體外共培養後， CAR-T細胞的細胞因子分泌。
圖6A顯示Meso-1，Meso-E1和Meso-E1m1 CAR-T細胞與三陰性乳腺癌MDA-MB-231-MESO細胞體外共培養系統中，CAR-T細胞對標的細胞裂解率。
圖6B顯示CAR-T細胞與三陰性乳腺癌MDA-MB-231-MESO細胞體外共培養後，CAR-T細胞的細胞因子分泌。
圖7A顯示Meso-E1和Meso-E1m1 CAR-T 體內藥效實驗-1， HCC70（乳腺癌細胞）腫瘤體積變化曲線。
圖7B顯示Meso-E1和Meso-E1m1 CAR-T細胞體內藥效實驗-1，動物體重變化曲線。
圖8A顯示Meso-1和Meso-E1m1 CAR-T體內藥效實驗-2，HCC70(乳腺癌細胞)腫瘤體積變化曲線。
圖8B顯示Meso-1和Meso-E1m1 CAR-T體內藥效實驗-2，動物體重變化。
圖8C顯示Meso-1和Meso-E1m1 CAR-T體內藥效實驗-2，每組單隻小鼠的腫瘤體積變化。
圖9A顯示多輪毒殺實驗設計方案。
圖9B、圖9C顯示體外共培養系統Meso-1，Meso-E1和Meso-E1m1 CAR-T細胞分別與卵巢癌細胞OVCAR3多輪毒殺後，標的細胞裂解率和CAR-T細胞擴增比較。
圖9D、圖9E顯示體外共培養系統Meso-1，Meso-E1和Meso-E1m1 CAR-T細胞分別與三陰性乳腺癌MDA-MB-231-MESO細胞多輪刺激後，標的細胞裂解率和CAR-T細胞擴增比較。
圖10A顯示添加不同濃度TGF-β1體外共培養系統，Meso-1和Meso-E1m1 CAR-T細胞分別與卵巢癌細胞OVCAR3多輪刺激後，標的細胞的裂解率。
圖10B顯示添加不同濃度TGF-β1體外共培養系統，Meso-1和Meso-E1m1 CAR-T細胞分別與卵巢癌細胞OVCAR3多輪刺激後， CAR-T細胞擴增曲線。
圖10C顯示添加不同濃度TGF-β1體外共培養系統，Meso-1和Meso-E1m1 CAR-T細胞分別與卵巢癌細胞OVCAR3第二輪多輪毒殺後， CAR-T細胞凋亡的檢測。
圖11顯示不同CAR-T與PBNK共培養後，PBNK細胞在48和72小時擴增值。
Claims (15)
- 一種嵌合抗原受體(CAR)建構物，其特徵在於，所述CAR建構物的結構如下式I或II所示， X-A-E (I) E-A-X (II) 式中， 各“-”獨立地為連接肽或肽鍵； X為標靶腫瘤抗原的CAR； A為自剪切元件； E為IL-15/IL-15Rα複合體。
- 如請求項1所述的CAR建構物，其特徵在於，所述的IL-15/IL-15Rα複合體的結構如下式III所示， L’-M-I-R (III) 式中， 各“-”獨立地為連接肽或肽鍵； L’為無或信號肽； M為IL-15或其突變體； I為柔性連接子； R為IL-15Rα。
- 如請求項2所述的CAR建構物，其特徵在於，所述的IL-15突變體為IL-15N72D，其胺基酸序列如SEQ ID NO.: 2所示。
- 如請求項2所述的CAR建構物，其特徵在於，所述的IL-15Rα為完整的IL-15Rα元件，其胺基酸序列如SEQ ID NO.: 3所示。
- 如請求項2所述的CAR建構物，其特徵在於，所述的IL-15/IL-15Rα複合體的胺基酸序列如SEQ ID NO.: 5或6所示。
- 如請求項1所述CAR建構物，其特徵在於，所述的X(CAR)的結構如下式IV所示， L-scFv-H-TM-C-CD3ζ (IV) 各“-”獨立地為連接肽或肽鍵； L為無或信號肽； scFv為標靶腫瘤抗原的抗體單鏈可變區； H為無樞紐區； TM為跨膜結構域； C為共刺激信號分子； CD3ζ為源於CD3ζ的細胞質液信號傳導序列。
- 一種核酸分子，其特徵在於，所述核酸分子編碼請求項1所述的嵌合抗原受體(CAR)建構物，或者， 所述的核酸分子包含編碼標靶腫瘤抗原的CAR的第一核酸分子和編碼IL-15/IL-15Rα複合體的第二核酸分子。
- 一種載體，其特徵在於，所述的載體含有請求項7所述的核酸分子。
- 一種基因工程化的免疫細胞，其特徵在於，所述的免疫細胞表現有請求項1所述的CAR建構物，或者 所述的免疫細胞表現有標靶腫瘤抗原的CAR和IL-15/IL-15Rα複合體。
- 如請求項9所述的免疫細胞，其特徵在於，所述標靶腫瘤抗原的CAR和IL-15/IL-15Rα複合體獨立地表現於所述免疫細胞的細胞膜上。
- 一種製劑，其特徵在於，所述製劑含有請求項1所述的嵌合抗原受體建構物、請求項3所述的核酸分子、請求項4所述的載體、或請求項5所述的免疫細胞，以及藥學上可接受的載劑。
- 一種請求項1所述的嵌合抗原受體建構物、請求項7所述的核酸分子、請求項8所述的載體、或請求項9所述的免疫細胞、或請求項11所述的製劑的用途，用於製備預防和/或治療癌症或腫瘤的藥物或製劑。
- 一種製備請求項9所述的基因工程化的免疫細胞的方法，所述方法包括以下步驟： (a) 提供待改造的免疫細胞；和 (b) 將請求項7所述的核酸分子或請求項8所述的載體轉導入所述免疫細胞內，從而獲得所述基因工程化的免疫細胞。
- 一種IL-15/IL-15Rα複合體的用途，用於製備一製劑，所述製劑用於增強CAR-T細胞的持久性和/或增強CAR-T細胞的細胞毒性， 其中，所述的IL-15/IL-15Rα複合體的結構如下式III所示， L’-M-I-R (III) 式中， 各“-”獨立地為連接肽或肽鍵； L’為無或信號肽； M為IL-15或其突變體； I為柔性連接子； R為IL-15Rα， 其中，所述的IL-15Rα包含跨膜區和胞內區。
- 一種治療疾病的方法，其特徵在於，所述方法包括給需要治療的對象施用適量的如請求項8所述的載體、如請求項9所述的免疫細胞、或如請求項11所述的製劑，其中所述疾病為癌症或腫瘤。
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