[go: up one dir, main page]

TW202229314A - 用於針對輪狀病毒疫苗接種之融合蛋白質 - Google Patents

用於針對輪狀病毒疫苗接種之融合蛋白質 Download PDF

Info

Publication number
TW202229314A
TW202229314A TW110136858A TW110136858A TW202229314A TW 202229314 A TW202229314 A TW 202229314A TW 110136858 A TW110136858 A TW 110136858A TW 110136858 A TW110136858 A TW 110136858A TW 202229314 A TW202229314 A TW 202229314A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
rotavirus
protein
polypeptide
thr
fragment
Prior art date
Application number
TW110136858A
Other languages
English (en)
Inventor
大衛 安斯特龍
亞比 雷 派特森
桂格瑞 布萊恩 海威克
威斯利 史考特 強森
布萊恩 尼克遜
艾利克 馬丁 范恩
Original Assignee
德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司 filed Critical 德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司
Publication of TW202229314A publication Critical patent/TW202229314A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明係關於以重組方式構築之多肽，其用於製備特定言之用於減少由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀的疫苗。更特定言之，本發明係關於一種在N端至C端方向上包含以下之融合蛋白質：(i)輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段及(ii)免疫球蛋白Fc片段，諸如IgG Fc片段，其中該融合蛋白質可用於減少由豬中之輪狀病毒感染引起的一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的方法中。

Description

用於針對輪狀病毒疫苗接種之融合蛋白質
本發明係關於以重組方式構築之多肽，其用於製備疫苗，特定言之用於減少由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀。更特定言之，本發明係關於一種在N端至C端方向上包含以下之融合蛋白質：(i)輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段及(ii)免疫球蛋白Fc片段，諸如IgG Fc片段，其中該融合蛋白質可用於減少由豬中之輪狀病毒感染引起的一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的方法中。
輪狀病毒為包含呼腸孤病毒科( Reoviridae)內之病毒屬的雙股RNA病毒。已知輪狀病毒感染會引起腸胃疾病且視為嬰兒之胃腸炎的最常見原因。輪狀病毒係藉由糞便-經口途徑傳播且感染穿過小腸之細胞。受感染細胞產生腸毒素，其誘發胃腸炎，導致嚴重腹瀉且有時經由脫水死亡。
輪狀病毒具有由11個雙股RNA (dsRNA)區段構成之基因體，且當前基於如藉由國際病毒分類委員會(International Commitee on Taxonomy of Viruses；ICTV)定義且由Matthijnssens等人(Arch Virol 157:1177-1182 (2012))概述之內部病毒衣殼蛋白6 (VP6)之抗原特性及基於序列之分類分為八組(A-H)，其中本文所提及之此公開案及以下公開案以全文引用之方式併入。
輪狀病毒之基因體編碼六種結構蛋白(VP1-VP4、VP6及VP7)及六種非結構蛋白(NSP1-NSP6)，其中基因體區段1-10各自編碼一種輪狀病毒蛋白質，且基因體區段11編碼兩種蛋白質(NSP5及NSP6)。
在輪狀病毒A之情況下，不同病毒株可基於結構蛋白VP7及VP4分類為基因型(由比較序列分析及/或核酸雜交資料定義)或血清型(由血清學分析定義)。VP7及VP4為最外部蛋白質層之組分(外部衣殼)，且兩者均攜帶中和抗原決定基。VP7為形成病毒粒子之外層或表面的醣蛋白(因此稱為「G」)。VP7確定病毒株之G型及G血清型及G基因型之名稱相同。VP4為蛋白酶敏感的(因此稱為「P」)且確定病毒之P型。與G型相比，針對P血清型及基因型指定之數字不同(Santos N. et Hoshino Y., 2005, Reviews in Medical Virology, 15, 29-56)。因此，P血清型表示為P，接著指定為數字，且P基因型表示為P，接著指定為括號中之數字(例如，「P[7]」或「P[13]」)。屬於相同基因型之病毒株具有高於89%胺基酸序列一致性(Estes及Kapikian. Rotaviruses. 在Knipe, D.M.; Howley, P.M. Fields Virology, 第5版; Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health: Philadelphia, PA, USA (2007); Gorziglia等人Proc Natl Acad Sci U S A. 87(18):7155-9 (1990)中)。
輪狀病毒尤其亦為具有針對幾乎100%豬中所存在之A族及C族輪狀病毒之抗體的豬之胃腸炎的主要原因(Vlasova等人Viruses. 9(3): 48 (2017))。當前，僅針對輪狀病毒A可獲得經修飾之存活或經殺滅疫苗。無法在實驗室中培養輪狀病毒C會妨礙研發針對此群之疫苗，隨後增加重組疫苗之吸引性。
重組抗輪狀病毒疫苗之產生受輪狀病毒衣殼之複雜性阻礙，該輪狀病毒衣殼由配置於三個層中之四種蛋白質構成。最內層由60個具有T=1對稱性之VP2二聚體構成。對於中間層之恰當排序，需要VP2層，其由260個具有T=13對稱性之VP6三聚體形成。VP2與VP6之間的所得對稱性錯配產生五個不同的VP6三聚體位置及三種不同孔徑類型。在VP2不存在之情況下，VP6易於以可表示病毒組裝之副產物的鹽及pH依賴性方式形成有序高分子量微管及球狀體。在衣殼中，VP6層由VP7之260個Ca2+依賴性三聚體覆蓋，其充當使VP4刺突蛋白保持在適當位置之夾具。VP7為糖基化的或G型抗原，且含有中和抗原決定基。大部分中和抗體僅識別三聚VP7且被認為藉由防止VP7三聚體解離而起作用，其反過來阻斷刺突蛋白之釋放。輪狀病毒刺突蛋白以60個VP4之三聚體形式存在，其僅在II型孔隙處插入VP6層中。VP4含有中和抗原決定基且為P型抗原，藉由胰蛋白酶裂解為刺突蛋白鹼基VP5*及細胞相互作用頭VP8*，其在裂解後保持與VP5*相關。胰蛋白酶消化進入刺突蛋白用於細胞進入，在此期間該刺突蛋白經歷深入的結構重排以暴露用於宿主細胞上之受體結合的活性位點。忽略以上組裝方法之複雜性，難以達成在環境條件下將輪狀病毒衣殼蛋白之化學計算量表現促進適當組裝。
鑒於輪狀病毒衣殼組裝之困難，對次單位疫苗方法感興趣。VP7及VP4為含有中和抗原決定基之兩種蛋白質，然而VP7之使用將由於其糖基化及鈣依賴性三聚而變得複雜。VP4之使用因其三聚、胰蛋白酶消化及潛在構形狀態範圍而變得複雜。VP8蛋白質，亦稱為VP8域或VP8*，其藉由VP4之胰蛋白酶消化產生，含有中和抗原決定基，為單體，其結構測定為高解析度(Dormitzer等人EMBO J. 21(5):  885-897 (2002))且描述為高度穩定的。
此外，在VP8蛋白質內，被視為與宿主受體相互作用且涉及病毒附著至宿主細胞的凝集素樣域(aa65-224) (Rodriguez等人, PloS Pathog. 10(5):e1004157 (2014))。
已描述研發針對兒童之輪狀病毒次單位疫苗之方法，其中N端連接至破傷風類毒素通用CD4 +T細胞抗原決定基(aa830-844) P2之截短VP8蛋白質(VP8*胺基酸殘基64 (或65)-223)產生於大腸桿菌中(Wen等人Vaccine. 32(35): 4420-7 (2014))，且在嬰兒及幼童中測試(Groome等人Lancet Infect Dis.17(8):843-853 (2017))。然而，由於此使用單價次單位疫苗(基於輪狀病毒基因型P[8]之截短VP8蛋白質)引發針對異型輪狀病毒病毒株之不良反應，因此最近亦測試三價疫苗調配物(包含用於組合基因型P[4]、P[6]、P[8]抗原之三種蛋白質) (Groome等人Lancet Infect Dis. S1473-3099(20)30001 (2020))。
在另一方法中，N端截短VP8蛋白質，即「VP8-1」(aa26-241)之N端或C端與霍亂毒素(CTB)之五聚無毒性B次單位融合。在所得五聚融合蛋白質(CTBA-VP8-1，VP8-1-CTB)中，在小鼠模型中，相比於VP8-1-CTB，僅CTB-VP8-1 (亦即N端融合至CTB之VP8-1)被視為用於進一步研發之可行候選物，其展示較高的與GM1或與針對VP8*具有特異性之構形敏感性中和單株抗體之結合活性，且引起較高效價之中和抗體且賦予較高的保護功效(Xue等人Hum Vaccin Immunother. 12(11) 2959-2968 (2016))。
然而，鑒於在輪狀病毒衣殼組裝中之困難，對替代次單位疫苗方法感興趣，特定言之因為次單位疫苗一般視為非常安全的。此外，強烈需要有效的輪狀病毒次單位抗原之重組表現，其使得難以培養之此類輪狀病毒之疫苗抗原得到簡單生產。此外，因為輪狀病毒為豬之胃腸炎之主要原因，所以尤其非常需要具有用於豬之次單位疫苗，其包括使得功效與當前可購得用於豬之MLV輪狀病毒疫苗相當或甚至比其更高效的抗原。
以上技術問題之解決方案係藉由本發明及申請專利範圍中所表徵之實施例實現。
因此，本發明在其不同態樣中係根據申請專利範圍實施。
本發明係基於以下驚人發現：經由被動傳遞中和抗體，在用輪狀病毒攻擊之後向母豬投與包含輪狀病毒VP8蛋白質之片段，即連接於IgG Fc片段之C端處之N端延伸之凝集素樣域顯著減少其後代之腹瀉及糞便排出。
在第一態樣中，本發明因此係關於一種多肽，其包含 - 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，以及 - 免疫球蛋白Fc片段， 且其中該多肽在下文中亦稱為「本發明之多肽」。
在本發明之上下文中，亦出乎意料地發現此類多肽當在細胞中產生時，自細胞釋放，且可隨後自細胞周圍之上清液而非自細胞本身回收。
本發明之多肽之另一優點為必要時，其可製備為包含/呈現不同輪狀病毒之兩個免疫原性片段的一種多肽，藉此使得不必分別製備兩種不同的單價多肽，隨後需要組合該等多肽以用於相同目的。
較佳地，將如本文所描述之免疫球蛋白Fc片段連接至 - 輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端，或 - 輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的N端。
特定言之，該免疫球蛋白Fc片段較佳 - 經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端，或 - 經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的N端。
在另一較佳態樣中，如本文所描述之免疫球蛋白Fc片段 -   經由該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端，或 -   經由該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之N端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之N端。
最佳地，如本文所描述之免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端。
因此，本發明之多肽尤其為包含以下之多肽： - 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，以及 - 免疫球蛋白Fc片段， 其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端。
本文所用之術語「多肽」尤其係指藉由肽鍵連接在一起之胺基酸殘基之任何鏈，且並非係指產物之特定長度。舉例而言，「多肽」可指胺基酸殘基之長鏈，例如長度為150至600個胺基酸殘基或更長的胺基酸殘基。術語「多肽」包括具有一或多個轉譯後修飾之多肽，其中轉譯後修飾包括例如糖基化、磷酸化、脂質化(例如豆蔻醯化等)、乙醯化、泛素化、硫酸化、ADP核糖基化、羥基化、Cys/Met氧化、羧化、甲基化等。術語「多肽」及「蛋白質」在本發明之上下文中可互換地使用。
術語「免疫原性片段」尤其理解為係指蛋白質之片段，其至少部分保留衍生其之蛋白質之免疫原性。因此，「輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段」尤其應理解為係指輪狀病毒VP8蛋白質之片段，其至少部分保留全長VP8蛋白質之免疫原性。
如本文所描述，術語「VP8蛋白質」應理解為尤其等效於「VP8域」、「VP8*」或「VP4之VP8片段」，如在輪狀病毒之情況下頻繁使用。
如本文所用，術語「免疫球蛋白Fc片段」係指含有免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)及重鏈恆定區3 (CH3)，且更特定言之，不含有免疫球蛋白之重鏈及輕鏈可變區及輕鏈恆定區1 (CL1)的蛋白質。其可進一步包括免疫球蛋白之鉸鏈區或鉸鏈區之一部分(亦即，重鏈恆定區處之鉸鏈區)。此外，免疫球蛋白Fc片段可含有重鏈恆定區1 (CH1)之一部分或全部。
應理解，如本文所用，術語「免疫球蛋白Fc片段」等效於「免疫球蛋白Fc域」。
本文所用之術語「連接至」尤其係指用於在多肽內將免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP蛋白質之免疫原性片段之C端或N端的任何方式。連接方式之實例包括(1.)免疫球蛋白Fc片段藉由插入部分間接連接至輪狀病毒VP 8蛋白質之免疫原性片段之C端，該插入部分直接連接至輪狀病毒VP8蛋白之該免疫原性片段之C端，且亦結合該免疫球蛋白Fc片段；及(2.)藉由共價鍵結將免疫球蛋白Fc片段直接連接至輪狀病毒VP8蛋白之免疫原性片段之C端。術語「連接至」及「與......連接」在本發明之上下文中可互換地使用。
特定言之，應理解，措辭「包含 - 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，以及 - 免疫球蛋白Fc片段之多肽， 其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端」， 如本文所用，尤其等效於措辭 「在N端至C端方向上包含 - 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段的胺基酸序列，及 - 免疫球蛋白Fc片段之胺基酸序列的多肽」， 或等效於措辭 「包含 - 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，以及 - 連接至該免疫原性片段之C端的免疫球蛋白Fc片段」。
根據一最佳態樣，免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端。
如本文在本發明之上下文中所描述之連接部分較佳為肽連接子。
如本文所用之術語「肽連接子」係指包含一或多個胺基酸殘基的肽。更特定言之，如本文所用之術語「肽連接子」係指能夠連接兩種可變蛋白質及/或域之肽，例如輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段及免疫球蛋白Fc片段。
在一尤其較佳態樣中，免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端，其中 - 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段經由連接部分之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至連接部分，以及 - 連接部分經由免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與連接部分之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至免疫球蛋白Fc片段。
此外，免疫球蛋白Fc片段可較佳經由免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段。
應理解，本發明之多肽尤其為融合蛋白質。
如本文所用，術語「融合蛋白質」意謂藉由融合(亦即接合)兩種或更多種多肽之全部或部分所形成之蛋白質。通常，使用重組DNA技術，端對端接合編碼兩種或更多種多肽之聚核苷酸來製得融合蛋白質。更特定言之，術語「融合蛋白質」因此係指由組合編碼第一多肽之第一核酸序列及至少編碼第二多肽之第二核酸產生的核酸轉錄物轉譯之蛋白質，其中融合蛋白質並非天然存在之蛋白質。核酸構築體可編碼兩種或更多種在融合蛋白質中接合之多肽。
在另一較佳態樣中，本發明提供一種多肽，尤其如上文所提及之多肽，其中該多肽為式x-y-z之融合蛋白質，其中 x由輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段組成或包含輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段； y為連接部分；並且 z為免疫球蛋白Fc片段。
特定言之，式x-y-z應理解為輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端胺基酸殘基與該連接部分連接，較佳經由肽鍵與該連接部分之N端胺基酸殘基連接，且該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與該連接部分連接，較佳經由肽鍵與該連接部分之C端胺基酸殘基連接。
如本文所描述，措辭「x係由輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段組成」特別理解為等效於「x為輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段」。
在一較佳態樣中，如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳能夠在投與輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的個體內誘導針對輪狀病毒之免疫反應。
在另一較佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段為長度為50至200個、較佳140至190個胺基酸殘基之多肽。
本文所提及之輪狀病毒係選自由輪狀病毒A及輪狀病毒C組成之群。因此，如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳選自由以下組成之群：輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段及輪狀病毒C VP8蛋白質之免疫原性片段。
如本文分別提及之一或多個術語「輪狀病毒A」及「輪狀病毒C」分別係指如由ICTV (由Matthijnssens等人 Arch Virol 157:1177-1182 (2012)概述)所定義之輪狀病毒A及輪狀病毒C。
根據另一較佳態樣，本文所提及之輪狀病毒為豬輪狀病毒。
在一個尤其較佳態樣中，本文所提及之輪狀病毒為輪狀病毒A。因此，如本文所描述之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳為輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段。
在另一較佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段包含輪狀病毒VP8蛋白質之凝集素樣域。如本文所提及，「輪狀病毒VP8蛋白質之凝集素樣域」應較佳理解為輪狀病毒A VP8蛋白質之凝集素樣域。
特定言之，術語「輪狀病毒VP8蛋白質之凝集素樣域」係指輪狀病毒VP8蛋白質之殘基65-224或分別對應於由輪狀病毒VP8蛋白質之胺基酸殘基65-224組成之胺基酸序列，且其中輪狀病毒VP8蛋白質之該胺基酸殘基65-224較佳為輪狀病毒A VP8蛋白質之胺基酸殘基65-224。
因此，「輪狀病毒VP8蛋白質之凝集素樣域」較佳由輪狀病毒VP8蛋白質，尤其輪狀病毒A VP8蛋白質之胺基酸殘基65-224的胺基酸序列組成。
輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳為輪狀病毒VP8蛋白質之N端延伸之凝集素樣域，其中N端延伸長度為1至20個胺基酸殘基，尤其5至15個胺基酸殘基。輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段最佳為輪狀病毒VP8蛋白質之N端延伸之凝集素樣域，其中N端延伸長度為八個胺基酸殘基。
該N端延伸之胺基酸序列較佳係在輪狀病毒VP8蛋白質之胺基酸序列中側接凝集素樣域之N端胺基酸殘基的各別長度之胺基酸序列。
因此，在特定態樣中，如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳由以下組成：輪狀病毒VP8蛋白質，尤其輪狀病毒A蛋白質之胺基酸殘基60-224、胺基酸殘基59-224、胺基酸殘基58-224、胺基酸殘基57-224、胺基酸殘基56-224、胺基酸殘基55-224、胺基酸殘基54-224、胺基酸殘基53-224、胺基酸殘基52-224、胺基酸殘基51-224、胺基酸殘基50-224或胺基酸殘基49-224之胺基酸序列。
如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段最佳由輪狀病毒VP8蛋白質，尤其輪狀病毒A蛋白質之胺基酸殘基57-224的胺基酸序列組成。
以上胺基酸殘基編號(例如「65-224」或「57-224」)較佳參考野生型輪狀病毒VP8蛋白質，尤其野生型輪狀病毒A VP8蛋白質之胺基酸序列。該野生型輪狀病毒VP8蛋白質較佳為SEQ ID NO: 1中所列之蛋白質。
根據另一較佳態樣，本文所提及之輪狀病毒為選自由以下組成之群的輪狀病毒，尤其輪狀病毒A：基因型P[6]輪狀病毒、基因型P[7]輪狀病毒及基因型P[13]輪狀病毒。因此，如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳選自由以下組成之群：基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段、基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段及基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，且尤其選自由以下組成之群：基因型P[6]輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段、基因型P[7]輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段及基因型P[13]輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段。
如本文所用之術語「基因型P[6]輪狀病毒」、「基因型P[7]輪狀病毒」、「基因型P[13]輪狀病毒」及「基因型P[23]輪狀病毒」尤其係指輪狀病毒之已確立VP4 (P)基因型分類(例如P[6]、P[7]、P[13]或P[23])，其描述於Estes及Kapikian. Rotaviruses. 在Knipe, D.M.; Howley, P.M. Fields Virology, 第5版；Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health: Philadelphia, PA, USA (2007)；Gorziglia等人 Proc Natl Acad Sci U S A. 87(18):7155-9 (1990)中。
最佳地，本文所提及之輪狀病毒為基因型P[7]輪狀病毒。因此，如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段最佳為基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，尤其基因型P[7]輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段。
本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白質最佳包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 1之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或再更加至少99%序列一致性之胺基酸序列。
如本文所提及，輪狀病毒VP8蛋白質之凝集素樣域較佳包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 2之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一個實例中，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列組成。
在另一較佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段由以下組成或為以下之共同序列：輪狀病毒VP8蛋白質之一部分，尤其輪狀病毒A VP8蛋白質之一部分。
如本文所用，術語「共同序列」係指由相關序列家族中最常見之胺基酸(或核苷酸)形成之序列(參見例如Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987))。在蛋白質家族中，共同序列中之各位置由該家族中最頻繁出現於該位置處之胺基酸佔據。術語「共同序列」因此表示所推斷之胺基酸序列(或核苷酸序列)。共同序列表示複數個類似序列。共同序列中之各位置對應於藉由比對三個或更多個序列所確定之該位置處最頻繁出現之胺基酸殘基(或核苷酸鹼基)。
較佳地，如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白質之一部分之共同序列可藉由包含以下步驟之方法獲得： - 將編碼輪狀病毒VP8蛋白質之一部分的複數個核苷酸序列轉譯為胺基酸序列， - 將該等胺基酸序列與已知輪狀病毒VP8蛋白質比對，較佳藉由使用MUSCLE序列比對軟體UPGMB叢聚法及預設空隙罰分參數， - 對該等比對序列進行種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白質序列產生鄰近連接種系發生重建，特定言之將該等比對胺基酸序列導入MEGA7軟體以用於種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白質序列產生鄰近連接種系發生重建， - 使用泊松(Poisson)校正法以及種系發生之自助重抽檢定來計算最優樹(n=100)， - 按比例繪製最優樹，其中分支長度等於在總共170個位置上以每個位點之胺基酸取代為單位的進化距離 - 將自助重抽叢聚關聯大於70%的節點作為顯著的， - 將具有大致10%距離及大於70%的自助重抽叢聚關聯之節點指定為叢聚，以及 - 選擇叢聚及藉由鑑別該叢聚內每個比對位置之最大頻率來產生共同序列， - 且視情況，在其中在比對位置中觀測到相等比例之胺基酸的情況下，基於所報導之流行病學資料以及預定產品保護概況選擇胺基酸殘基。
舉例而言，在此情形下，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳由與選自由SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
在另一較佳態樣中，本文所提及之輪狀病毒為輪狀病毒C。根據此態樣，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳為輪狀病毒C VP8蛋白質之免疫原性片段。
在此態樣之情形下，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段較佳由與SEQ ID NO: 6之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
根據本發明，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段因此較佳由以下組成或為以下： - 輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段，尤其輪狀病毒A VP8蛋白質之本文所描述之免疫原性片段中之任一者，或 - 輪狀病毒VP8蛋白質之一部分，諸如輪狀病毒A VP8蛋白質之一部分之共同序列，較佳在共同序列之情形下，本文所描述之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段中之任一者，或 - 輪狀病毒C VP8蛋白質之免疫原性片段，尤其輪狀病毒C VP8蛋白質之本文所描述之免疫原性片段中之任一者。
在一尤其較佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段為由與選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列組成的多肽。
本文所描述之免疫球蛋白Fc片段之長度較佳為至少220個胺基酸殘基，且長度最佳為220至250個胺基酸殘基。
根據另一尤其較佳態樣，本文所描述之免疫球蛋白Fc片段未經糖基化。如本文所用，術語「未經糖基化」尤其意謂免疫球蛋白Fc片段不具有附著至其上之寡醣分子。
較佳地，如本文所提及之免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下組成： - 免疫球蛋白重鏈恆定區2 (CH2)，及 - 重鏈恆定區3 (CH3)， - 及視情況鉸鏈區或鉸鏈區之一部分。
根據另一較佳態樣，本文所提及之免疫球蛋白係選自由IgG、IgA、IgD、IgE及IgM組成之群。因此，免疫球蛋白Fc片段較佳選自由以下組成之群：IgG Fc片段、IgA Fc片段、IgD Fc片段、IgE Fc片段及IgM Fc片段。
根據一最佳態樣，本文所描述之免疫球蛋白Fc片段為IgG Fc片段。
如本文所提及之IgG較佳選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG5及IgG6。因此，根據另一較佳態樣，本文所提及之免疫球蛋白Fc片段係選自由以下組成之群：IgG1 Fc片段、IgG2 Fc片段、IgG3 Fc片段、IgG4 Fc片段、IgG5 Fc片段及IgG6 Fc片段。
最佳地，免疫球蛋白Fc片段為由腸細胞易受如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段所衍生之輪狀病毒感染的物種之基因體編碼的蛋白質。舉例而言，若輪狀病毒VP8蛋白質之片段為豬輪狀病毒VP8蛋白質之片段，則免疫球蛋白Fc片段較佳為由豬基因體編碼之免疫球蛋白Fc片段。根據另一實例，若輪狀病毒VP8蛋白質之片段為雞輪狀病毒VP8蛋白質之片段，則免疫球蛋白Fc片段較佳為由雞基因體編碼之免疫球蛋白Fc片段。
更特定言之，免疫球蛋白Fc片段較佳為豬IgG Fc片段。
在另一較佳態樣中，免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或尤其100%序列一致性之胺基酸序列。
本文所分別提及之連接部分或肽連接子為長度較佳為1至50個胺基酸殘基，尤其長度為3至20個胺基酸殘基之胺基酸序列。舉例而言，連接部分可為長度為3、8或10個胺基酸殘基之肽連接子。
視目的而定，可能需要短連接子以降低融合蛋白質搭配物之間的蛋白質水解風險。因此，在本發明之上下文中所描述之肽連接子較佳具有1-5個胺基酸殘基、更佳2至4個胺基酸殘基且最佳三個胺基酸殘基之長度，或分別由其組成。
根據一較佳態樣，連接部分包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的序列具有至少66%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或尤其100%序列一致性之胺基酸序列。
較佳地，本發明之多肽具有側接輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段之N端胺基酸殘基的N端甲硫胺酸殘基。
根據另一較佳態樣，本發明之多肽包含連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端的輪狀病毒VP8蛋白質之另一免疫原性片段。
輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳由以下組成或為以下： - 輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段，尤其輪狀病毒A VP8蛋白質之本文所描述之免疫原性片段中之任一者，或 - 輪狀病毒VP8蛋白質之一部分，諸如輪狀病毒A VP8蛋白質之一部分之共同序列，較佳在共同序列之情形下，本文所描述之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段中之任一者，或 - 輪狀病毒C VP8蛋白質之免疫原性片段，尤其輪狀病毒C VP8蛋白質之本文所描述之免疫原性片段中之任一者。
特定言之，輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 2至6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一尤其較佳態樣中，輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳不同於C端連接至該免疫球蛋白Fc片段之輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段。
輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳經由連接部分，尤其經由本文所描述之連接部分中之任一者連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端。較佳地，輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段經由輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段的N端胺基酸殘基與連接部分之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至連接部分。
替代地，可輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段可較佳經由輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段之N端胺基酸殘基與該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端。
在一尤其較佳態樣中，本發明之多肽為包含以下或由以下組成之蛋白質：與選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%序列一致性之胺基酸序列。
較佳地，本發明之多肽為包含以下或由以下組成之蛋白質：選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群的胺基酸序列。
應理解，如本文所用，措辭「由胺基酸序列組成(consisting of an amino acid sequence/consists of an amino acid sequence)」分別尤其亦關於受表現蛋白質或蛋白質域之細胞實現之胺基序列的任何共轉譯及/或轉譯後修飾或修飾。因此，除非另外明確提及，否則如本文所描述之措辭「由胺基酸序列組成(consisting of an amino acid sequence/consists of an amino acid sequence)」分別亦關於具有一或多個由表現蛋白質或蛋白質域之細胞影響之修飾，尤其在蛋白質生物合成及/或蛋白質加工中實現之胺基酸殘基之修飾，較佳選自由糖基化、磷酸化及乙醯化組成之群的修飾的胺基酸序列。
應理解，關於如本發明之上下文中所提及之術語「至少90%」，該術語較佳地係指「至少91%」、更佳「至少92%」、仍更佳「至少93%」或尤其「至少94」。
應理解，關於如本發明之上下文中所提及之術語「至少95%」，該術語較佳地係指「至少96%」、更佳「至少97%」、仍更佳「至少98%」或尤其「至少99%」。
應理解，關於如本發明之上下文中所提及之術語「至少99%」，該術語較佳地係指「至少99.2%」、更佳「至少99.4%」、仍更佳「至少99.6%」或尤其「至少99.8%」。
如本文所用，術語「具有100%序列一致性」應理解為等效於術語「為一致的」。
序列一致性百分比具有此項技術中公認的含義且存在多種方法量測兩種多肽或聚核苷酸序列之間的一致性。參見例如Lesk編, Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988)；Smith編, Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, New York, (1993)；Griffin & Griffin編, Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994)；von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987)；及Gribskov & Devereux編, Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, New York, (1991). 用於比對聚核苷酸或多肽之方法編碼於電腦程式中，包括GCG程式包(Devereux等人, Nuc. Acids Res.12:387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul等人, J. Molec. Biol.215:403 (1990))及Bestfit程式(Wisconsin Sequence Analysis Package, 用於Unix之版本8, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711)，該Bestfit程式使用史密斯及Waterman之局部同源演算法( Adv. App. Math., 2:482-489 (1981))。舉例而言，可使用採用FASTA演算法之電腦程式ALIGN，其中存在空隙開放罰分-12及空隙擴展罰分−2之仿射空隙搜尋。出於本發明之目的，使用DNASTAR公司之MegAlign軟體版本11.1.0 (59), 419中之Clustal W方法，使用程式中之預設多序列比對參數比對核苷酸序列(空隙罰分=15.0，空隙長度罰分=6.66，延遲發散序列(%)=30%，DNA轉化權重=0.50及權重矩陣=IUB)，且蛋白質/胺基酸序列分別使用DNASTAR公司之MegAlign軟體版本11.1.0 (59), 419中之Clustal W方法，使用程式中之預設多序列比對參數比對(在空隙罰分=10.0之情況下Gonnet連續蛋白質權重矩陣，間隙長度罰分=0.2及延遲發散序列(%)=30%)。
如本文所用，尤其應理解術語「與SEQ ID NO: X之序列之序列一致性」分別等效於術語「在SEQ ID NO: X之長度上與SEQ ID NO: X之序列的序列一致性」或等效於術語「在SEQ ID NO: X之全長上與SEQ ID NO: X之序列的序列一致性」。在此情形下，「X」係選自1至25之任何整數，使得「SEQ ID NO: X」表示本文所提及之SEQ ID NO中之任一者。
如本文所用，措辭「由SEQ ID NO: […]、…及SEQ ID NO: […]組成之群」與「由SEQ ID NO: […]之序列、…及SEQ ID NO: […]之序列組成之群」可互換。在此上下文中，「[…]」該序列之數字的佔位符。舉例而言，措辭「由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6組成之群」與「由SEQ ID NO: 3之序列、SEQ ID NO: 4之序列、SEQ ID NO: 5之序列及SEQ ID NO: 6之序列組成之群」可互換。
根據另一尤其較佳態樣，本發明之多肽由以下組成： - 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，尤其輪狀病毒VP8蛋白質之本文所描述之免疫原性片段中之任一者， - 側接輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之N端胺基酸殘基的N端甲硫胺酸殘基，以及 - 免疫球蛋白Fc片段，尤其本文所描述之免疫球蛋白Fc片段中之任一者， 其中該免疫球蛋白Fc片段尤其經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端，其中該連接部分較佳為本文所描述之連接部分中之任一者， - 及視情況選用之連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端之輪狀病毒VP8蛋白質之另一免疫原性片段，尤其經由連接部分，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳為輪狀病毒VP8蛋白質之本文所描述之其他免疫原性片段中之任一者，且其中該連接部分較佳為本文所描述之連接部分中之任一者。
在又一較佳態樣中，本發明之多肽與本發明之另一多肽形成二聚體。最佳地，本發明之多肽與第二相同多肽形成同源二聚體。
因此，尤其應理解，術語「本發明之多肽」進一步涵蓋由本發明之兩種多肽構成之任何二聚體，且尤其涵蓋由本發明之兩種一致多肽構成之任何同源二聚體。
根據另一尤其較佳態樣，本發明提供一種多聚體，其包含複數種本發明之多肽或由複數種本發明之多肽構成，且其中該多聚體在下文中亦稱為「本發明之多聚體」。
較佳地，本發明之多聚體為由本發明之一種多肽與本發明之第二相同多肽形成之同源二聚體。
在特定理解中，術語「本發明之多聚體」進一步涵蓋本發明之不同多聚體之任何混合物，例如以下之混合物： - 由本發明之一種多肽與本發明之第二相同多肽形成的同源二聚體，及 - 由本發明之相同多肽中之超過兩者形成的一或多種多聚體。
本發明進一步提供一種包含本發明之多肽及/或本發明之多聚體的免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物在下文中亦稱為「本發明之免疫原性組合物」。
因此，在一個較佳實例中，本發明之免疫原性組合物包含 - 由本發明之一種多肽組成的單體，及 - 由本發明之兩種一致多肽組成之同源二聚體， - 及視情況存在之由本發明之三種一致多肽組成的均三聚體， 其中較佳地， - 本發明之該兩種一致多肽中之每一者， - 及視情況選用之本發明之該三種一致多肽中之每一者， 包含與本發明之該一種多肽相同的胺基酸序列或由該胺基酸序列組成。
本發明之免疫原性組合物較佳包含濃度為至少100 nM、較佳至少250 nM、更佳至少500 nM及最佳至少1 µM之本發明之多肽。
根據另一較佳態樣，本發明之免疫原性組合物含有濃度為100 nM至50 µM、較佳250 nM至25 µM及最佳1-10 µM之本發明之多肽。
特定言之，向個體投與1 mL或視具體情況，2 mL本發明之免疫原性組合物。因此，待投與個體之本發明之免疫原性組合物的劑量較佳具有1 mL或2 mL之體積。
較佳地，向個體投與一劑或兩劑免疫原性組合物。
本發明之免疫原性組合物較佳全身性或局部投與。習知使用之適合的投與途徑為非經腸或經口投與，諸如肌肉內、皮內、靜脈內、腹膜內、皮下、鼻內以及吸入。然而，視化合物之性質及作用模式而定，免疫原性組合物亦可藉由其他途徑投與。最佳為肌肉內投與免疫原性組合物。本發明之免疫原性組合物較佳進一步包含醫藥學或獸醫學上可接受之載劑或賦形劑。
如本文所用，「醫藥學或獸醫學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑及其類似物。在一些較佳實施例及尤其包括凍乾免疫原性組合物之實施例中，用於本發明之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。
在一些實施例中，本發明之免疫原組合物含有佐劑。
如本文所用，「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、皂苷，例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech公司, Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals公司, Birmingham, AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液可尤其基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopeia)類型)；諸如鯊烷或鯊烯之類異戊二烯油；由烯烴，特定言之異丁烯或癸烯寡聚產生之油；含有直鏈烷基之酸或醇之酯，更特定言之植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支鏈脂肪酸或醇之酯，特定言之異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子界面活性劑，特定言之視情況經乙氧基化的脫水山梨糖醇、二縮甘露醇(例如，油酸無水甘露糖醇)、乙二醇、聚丙三醇、丙二醇及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定言之普洛尼克(Pluronic)產品，尤其L121。參見Hunter等人, The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, 第51-94頁(1995)，及Todd等人, Vaccine 15:564-570 (1997)。例示性佐劑為描述於「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」, M. Powell及M. Newman編, Plenum Press, 1995之第147頁上之SPT乳液及描述於此同一本書之第183頁上之乳液MF59。
佐劑之另一實例為選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐劑化合物為尤其與糖或多元醇之聚烯基醚交聯之丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。此等化合物藉由術語卡波姆(carbomer)已知(Phameuropa第8卷, 第2期, 1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號，其描述與具有至少3個羥基、較佳不超過8個羥基之聚羥基化合物交聯之此類丙烯酸聚合物，至少三個羥基之氫原子經具有至少2個碳原子之不飽和脂族基團置換。較佳基團為例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團之含有2至4個碳原子之不飽和脂族基團。不飽和基團本身可含有其他取代基，諸如甲基。以名稱CARBOPOL®出售之產品(BF Goodrich, Ohio, USA)為尤其適合的。其與烯丙基蔗糖或烯丙基新戊四醇交聯。尤其可提及Carbopol 974P、934P及971P。最佳為使用CARBOPOL® 971P。在順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物中為共聚物EMA (Monsanto)，其為順丁烯二酸酐與乙烯之共聚物。此等聚合物溶解於水中產生酸溶液，較佳地將該酸溶液中和至生理pH，以便得到併入免疫原性、免疫或疫苗組合物本身之佐劑溶液。
可自其選擇佐劑之其他適合的佐劑尤其包括(但不限於)：RIBI佐劑系統(Ribi公司)、Block共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M (Chiron, Emeryville CA)、單磷醯基脂質A、Avridine脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌(E. coli) (重組或以其他方式)之不耐熱腸毒素、霍亂毒素IMS 1314或胞壁醯二肽或天然存在或重組細胞介素或其類似物或內源性細胞介素釋放刺激劑等等。
預期佐劑可以每劑約100 µg至約10 mg之量、較佳每劑約100 µg至約10 mg之量、更佳每劑約500 µg至約5 mg之量、甚至更佳每劑約750 µg至約2.5 mg之量及最佳每劑約1 mg之量添加。替代地，佐劑可以最終產物之體積計在約0.01%至50%之濃度下、較佳在約2%至30%之濃度下、更佳在約5%至25%之濃度下、仍更佳在約7%至22%之濃度下且最佳在10%至20%之濃度下。
「稀釋劑」可包括水、生理鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑可尤其包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。
根據一尤其較佳態樣，本發明亦提供一種免疫原性組合物，特定言之本發明之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物包含以下或由以下組成： - 本發明之多肽及/或本發明之多聚體，及 - 醫藥學或獸醫學上可接受之載劑或賦形劑， - 以及視情況選用之佐劑。
在本發明之上下文中，佐劑較佳選自由乳化水包油佐劑及卡波姆組成之群。
術語「免疫原性組合物」係指包含至少一種抗原之組合物，其在投與免疫原性組合物之宿主中引起免疫反應。此類免疫反應可為對根據本發明之免疫原性組合物之細胞及/或抗體介導之免疫反應。宿主亦描述為「個體」。較佳地，本文所描述或提及之宿主或個體中之任一者為動物。
如本文所用，術語「動物」尤其係指哺乳動物，較佳豬類，更佳豬，最佳豬崽。
通常，「免疫反應」包含（但不限於）：以下效果中之一或多個：產生或活化特異性針對本發明之免疫原性組合物中所包括之一或多種抗原的抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞及/或γ-δ T細胞。較佳地，宿主將呈現保護性免疫反應或治療反應。
「保護性免疫反應」將由以下情形證明：受感染宿主通常所呈現之一或多種臨床症狀減少或缺失、恢復時間加快及/或感染持續時間減少，或受感染宿主之組織或體液或排泄物中之病原體效價降低。
如本文所提及之「病原體」或「特定病原體」尤其係有關衍生出輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段的輪狀病毒。舉例而言，如本文所提及之病原體為輪狀病毒A或輪狀病毒C。
在宿主呈現保護性免疫反應使得對新感染之抗性將增強及/或疾病之臨床嚴重程度將降低的情況下，將免疫原性組合物描述為「疫苗」。
如本文所描述之「抗原」係指(但不限於)在宿主中引起針對包含此類抗原或其免疫活性組分之所關注的免疫原性組合物或疫苗的組分的免疫反應。特定言之，如本文所用之術語「抗原」係指一種蛋白質或蛋白質域，其若向宿主投與，則可在宿主中引起免疫反應。
術語「治療及/或預防」係指畜群中之特定病原體感染之發病率之減少，或由特定病原體感染所引起或與特定病原體感染有關的一或多種臨床症狀之嚴重程度之降低。因此，術語「治療及/或預防」亦係指與動物未接受此類免疫原性組合物的動物組相比，在動物接受有效量之如本文所提供之免疫原性組合物的動物組中，感染特定病原體之畜群中之動物數目減少(=特定病原體感染之發病率減少)或通常與病原體感染有關或由病原體感染所引起之一或多種臨床症狀之嚴重程度降低。
「治療及/或預防」一般涉及向需要此類治療/預防或可受益於此類治療/預防之個體或畜群投與有效量之本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物。術語「治療」係指一旦個體或畜群中之至少一些動物已感染此類病原體且其中此類動物已展示由此類病原體感染造成或與此類病原體感染相關聯之一些臨床症狀，則投與有效量之免疫原組合物。術語「預防」係指在此類個體感染任何病原體之前或至少在此類動物或動物組中之所有動物未展現由此類病原體感染所引起或與此類病原體感染有關之一或多種臨床症狀的情況下向個體投與。
如本文所用之術語「有效量」意謂(但不限於)抗原，特定言之本發明之多肽及/或本發明之多聚體的量，其引起或能夠引起個體之免疫反應。此類有效量能夠降低畜群中特定病原體感染之發生率或降低特定病原體感染之一或多種臨床症狀之嚴重程度。較佳地，與未經處理或未經在本發明之前可獲得之免疫原性組合物處理，但隨後感染特定病原體之個體相比，一或多種臨床症狀之發生率或嚴重程度減輕至少10%、更佳至少20%、仍更佳至少30%、甚至更佳至少40%、仍更佳至少50%、甚至更佳至少60%、仍更佳至少70%、甚至更佳至少80%、仍更佳至少90%及最佳至少95%。
如本文所用，術語「臨床症狀」係指個體感染特定病原體之症狀。感染之臨床症狀取決於所選病原體。此類臨床症狀之實例包括(但不限於)：腹瀉、嘔吐、發熱、腹痛及脫水。
減少個體中由特定病原體感染引起或與特定病原體感染相關之一或多種臨床症狀之發生率或降低其嚴重程度可藉由向個體投與一或多劑本發明之免疫原性組合物來達成。
術語「減少糞便排出」意謂(但不限於)減少每毫升糞便之病原病毒，諸如輪狀病毒之RNA複本之數目或每分升糞便之溶菌斑形成集落之數目，與未接受組合物之個體相比，接受本發明之組合物之個體之糞便減少至少50%且可變得感染。更佳地，接受本發明之組合物之個體中糞便排出量減少至少90%、較佳至少99.9%、更佳至少99.99%且甚至更佳至少99.999%。
如本文所用，術語「糞便排出」根據其在藥品及病毒學中之普通含義使用且係指經由個體之大便自個體之細胞至感染個體中產生及釋放病毒。
本發明之多肽較佳為重組蛋白，尤其重組桿狀病毒表現之蛋白質。
如本文所用，術語「重組蛋白」尤其係指藉由重組DNA技術產生之蛋白質，其中通常將編碼所表現蛋白質之DNA插入適合的表現載體中，其繼而用於轉型或在病毒載體之情況下感染宿主細胞以產生異源蛋白質。因此，如本文所用之術語「重組蛋白」尤其係指自重組DNA分子表現之蛋白質分子。如本文所用，「重組DNA分子」係指由藉助於分子生物技術接合在一起之DNA區段構成之DNA分子。用於產生重組蛋白之適合的系統包括(但不限於)：昆蟲細胞(例如桿狀病毒)、原核系統(例如大腸桿菌)、真菌(例如嗜熱毀絲菌( Myceliophthora thermophile)、米麯黴( Aspergillus oryzae)、玉米黑粉菌( Ustilago maydis))、酵母菌(例如釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、甲醇酵母( Pichia pastoris))、哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢、HEK293)、植物(例如紅花)、海藻、禽類細胞、兩棲動物細胞、魚類細胞及無細胞系統(例如家兔網狀紅血球溶解物)。
根據另一態樣，本發明提供一種聚核苷酸，其包含編碼本發明之多肽之序列，其中該聚核苷酸，在下文中亦稱為「根據本發明之聚核苷酸」較佳為經分離之聚核苷酸。
較佳地，根據本發明之聚核苷酸包含與選自由SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或尤其100%序列一致性的核苷酸序列。
本文所描述之聚核苷酸之生產屬於此項技術中之技術範圍內且可在其他場合中根據Sam brook等人, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Amusable等人, 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY；Innis等人(編), 1995, PCR Strategies, Academic Press公司, San Diego；以及Erlich (編), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York中所描述之重組技術進行，所有文獻均以引用之方式併入本文中。
在另一態樣中，本發明提供一種含有編碼本發明之多肽之聚核苷酸的載體。
出於本發明之目的，「載體」以及「含有編碼本發明之多肽之聚核苷酸的載體」係指適合的表現載體，較佳桿狀病毒表現載體，其繼而用於轉染或在桿狀病毒表現載體之情況下用於感染宿主細胞以產生由DNA編碼之蛋白質或多肽。載體及用於製備及/或使用載體(或重組體)進行表現之方法可藉由以下或類似於以下所揭示之方法製得或進行：美國專利第4,603,112號、第4,769,330號、第5,174,993號、第5,505,941號、第5,338,683號、第5,494,807號、第4,722,848號、第5,942,235號、第5,364,773號、第5,762,938號、第5,770,212號、第5,942,235號、第382,425號、PCT公開案WO 94/16716、WO 96/39491、WO 95/30018；Paoletti, 「Applications of pox virus vectors to vaccination: An update」, PNAS USA 93: 11349-11353, 1996年10月；Moss, 「Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety」, PNAS USA 93: 11341-11348, 1996年10月；Smith等人, 美國專利第4,745,051號(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D. (編者), Methods in Molecular Biology 39, 「Baculovirus Expression Protocols」 (1995 Humana Press公司)；Smith等人, 「Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector」, Molecular and Cellular Biology, 1983年12月, 第3卷, 第12期, 第2156-2165頁；Pennock等人, 「Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector」, Molecular and Cellular Biology 1984年3月, 第4卷, 第3期, 第406頁；EPA0 370 573；1986年10月16日申請之美國申請案第920,197號；歐洲專利申請案第265785號；美國專利第4,769,331號(重組疱疹病毒)；Roizman, 「The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors」, PNAS USA 93:11307-11312, 1996年10月；Andreansky等人, 「The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors」, PNAS USA 93: 11313-11318, 1996年10月；Robertson等人, 「Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes」, PNAS USA 93: 11334-11340, 1996年10月；Frolov等人, 「Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications」, PNAS USA 93: 11371-11377, 1996年10月；Kitson等人, J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；美國專利第5,591,439號、第5,552,143號；WO 98/00166；均在1996年7月3日申請之所允許之美國申請案系列第08/675,556號及第08/675,566號(重組腺病毒)； Grunhaus等人, 1992, 「Adenovirus as cloning vectors」, Seminars in Virology (第3卷) 第237-52頁, 1993；Ballay等人EMBO Journal, 第4卷, 第3861-65頁, Graham, Tibtech 8, 85-87, 1990年4月；Prevec等人, J. Gen Virol. 70, 42434；PCT WO 91/11525；Felgner等人(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；以及McClements等人, 「Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease」, PNAS USA 93: 11414-11420, 1996年10月；及美國專利第5,591,639號、第5,589,466號以及第5,580,859號，以及WO 90/11092、WO93/19183、WO94/21797、WO95/11307、WO95/20660；Tang等人, Nature, 及尤其Furth等人, Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectors。亦參見WO 98/33510；Ju等人, Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (慢病毒表現系統)；Sanford等人, 美國專利第4,945,050號；Fischbach等人(Intracel)；WO 90/01543；Robinson等人, Seminars in Immunology 第9卷, 第271-283頁 (1997), (DNA載體系統)；Szoka等人, 美國專利第4,394,448號(將DNA插入活細胞之方法)；McCormick等人, 美國專利第5,677,178號(細胞病變病毒之用途)；以及美國專利第5,928,913號(用於基因遞送之載體)；以及本文所引用之其他文獻。
較佳病毒載體包括桿狀病毒，諸如BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)，特定言之，其限制條件為產生細胞為昆蟲細胞。儘管桿狀病毒表現系統為較佳的，但熟習此項技術者應理解包括上文所描述之彼等表現系統之其他表現系統將有效達成本發明之目的，即重組蛋白之表現。
因此，本發明亦提供含有聚核苷酸之桿狀病毒，該聚核苷酸包含編碼本發明之多肽之序列。該桿狀病毒，在下文中亦稱為「根據本發明之桿狀病毒」較佳為經分離之桿狀病毒。
此外，本發明因此亦提供一種質體，較佳表現載體，其包含有包含編碼本發明之多肽之序列的聚核苷酸。該質體，在下文中亦稱為「根據本發明之質體」尤其為經分離之質體。
本發明亦提供一種由桿狀病毒感染及/或含有桿狀病毒之細胞，該桿狀病毒包含有包含編碼本發明之多肽之序列的聚核苷酸，或包含有包含編碼本發明之多肽之序列的聚核苷酸的質體，較佳表現載體。該細胞，在下文中亦稱為「根據本發明之細胞」較佳為經分離之細胞。
當用於經分離之細胞之上下文中時，術語「經分離」係除其天然環境以外存在且因此不為自然界產物之細胞。
在另一態樣中，本發明亦關於本發明之多肽；本發明之多聚體；根據本發明之桿狀病毒；本發明之免疫原性組合物；根據本發明之聚核苷酸；根據本發明之病毒樣粒子；根據本發明之質體；及/或根據本發明之細胞用於製備藥劑，較佳疫苗之用途。
在此上下文中，本發明亦提供生產本發明之多肽之方法，其中該方法包含用根據本發明之桿狀病毒感染細胞，較佳昆蟲細胞之步驟。
此外，本發明亦提供一種生產本發明之多肽之方法，其中該方法包含用根據本發明之質體轉染細胞之步驟。
本發明之多肽較佳以足夠穩定自組裝可隨後用於疫苗接種的病毒樣粒子之高量表現。
如本文所用，術語「疫苗接種(vaccination/vaccinating)」意謂(但不限於)一種方法，其包括向個體投與抗原(諸如免疫原性組合物中所包括之抗原)，其中當向該個體投與時，該抗原(例如本發明之多肽或本發明之多聚體)引起或能夠引起該個體中之保護性免疫反應。
本發明亦提供本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物，其用作藥劑，較佳用作疫苗。
特定言之，提供本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物用於減少或預防由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀或疾病的方法中，其中輪狀病毒較佳為具有編碼輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段之基因體的群組中之輪狀病毒。本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物尤其提供用於減少或預防由輪狀病毒感染引起之糞便排出的方法中，其中病毒較佳為具有編碼輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段的基因體的群組中之輪狀病毒。因此，在一個特定實例中，若如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段由輪狀病毒A之基因體編碼，則本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物用於減少或預防由輪狀病毒A感染引起之一或多種臨床症狀、死亡率、糞便排出或疾病的方法中。
更特定言之，本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物提供用於減少或預防個體之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的方法中或用於治療或預防個體之輪狀病毒感染的方法中。
如本文所提及之輪狀病毒感染尤其係指感染輪狀病毒A或輪狀病毒C。
此外，本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物提供用於誘導針對個體之輪狀病毒的免疫反應。
如本文所提及，個體較佳為哺乳動物，諸如豬或牛；或鳥類，諸如雞。特定言之，個體為豬，且其中豬較佳為豬崽或母豬，諸如懷孕母豬。最佳地，在誘導針對個體內之輪狀病毒的免疫反應之情況下，該個體為懷孕母豬。在減少或預防個體中之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出或治療或預防個體之輪狀病毒感染之情形下，該個體最佳為豬崽。
根據一個較佳態樣，本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物用於減少或預防豬崽中之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的方法中，其中該豬崽將由已投與免疫原性組合物的母豬哺乳。已投與免疫原性組合物之該母豬較佳為已投與免疫原性組合物之母豬，而該母豬已懷孕，特定言之懷有該豬崽。
此外，本發明係關於一種用於治療或預防輪狀病毒感染、減少、預防或治療由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出或預防或治療由輪狀病毒感染引起之疾病的方法，其包含向個體投與本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物。
此外，提供一種用於在較佳懷孕母豬中誘導產生對輪狀病毒具有特異性之抗體的方法，其中該方法包含向該母豬投與本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物。
此外，本發明提供一種減少或預防豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的方法，其中該方法包含 - 向母豬投與本發明之多肽或根據本發明之免疫原性，及 - 允許該母豬哺乳該豬崽， 且其中該母豬較佳為懷孕母豬，特定言之懷有該小豬。
較佳地，該兩種前述方法包含以下步驟： - 向懷有該豬崽之母豬投與本發明之多肽或根據本發明之免疫原性， - 允許該母豬生產該豬崽，以及 - 允許該母豬哺乳該豬崽。
此外，提供一種減少豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的方法，其中豬崽由已投與本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物的母豬哺乳。
如本文所提及之一或多種臨床症狀較佳選自由以下組成之群： - 腹瀉， - 輪狀病毒拓殖，特定言之腸道輪狀病毒拓殖， - 病變，特定言之宏觀病變，以及 - 減少之平均每日體重增加。
根據一個實例，本文所提及之一或多種臨床症狀為腸道，特定言之小腸之輪狀病毒拓殖。根據另一實例，本文所提及之一或多種臨床症狀為腸病變，特定言之宏觀腸病變。
根據另一尤其較佳態樣，本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物用於上文所描述之任一方法中，其中 - 該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， - 該感染輪狀病毒為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， - 針對輪狀病毒之該免疫反應為針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒的免疫反應，或 - 對輪狀病毒具有特異性之該等抗體為對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體， 且其中較佳地，本發明之該多肽為或本發明之該免疫原性組合物分別包含本文所描述之包含基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段的本發明之多肽中之任一者，特定言之由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
在一個特定態樣中，如本文所提及之「感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒」為感染基因型P[23]輪狀病毒。
在另一較佳態樣中，如本文所提及之「感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒」為感染基因型P[23]輪狀病毒及基因型P[7]輪狀病毒。
在一個特定態樣中，如本文所提及之「針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒之免疫反應」為針對基因型P[23]輪狀病毒之免疫反應。
在另一較佳態樣中，如本文所提及之「針對基因型[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒之免疫反應」為針對基因型P[23]輪狀病毒及基因型p[7]輪狀病毒之免疫反應。
在一個特定態樣中，如本文所提及之「對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體」為對基因型[23]輪狀病毒具有特異性之抗體。
在另一較佳態樣中，如本文所提及之「對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體」包含或為對基因型P[23]具有特異性之抗體及對基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體。
在另一態樣中，投與本發明之多肽或本發明之免疫原性組合物以在動物中，較佳在懷孕母豬中誘導對輪狀病毒C具有特異性之抗體的產生。較佳地，在此另一態樣中，本發明之該多肽為或本發明之該免疫原性組合物分別包含本文所描述之包含輪狀病毒C VP8蛋白質之免疫原性片段的本發明之多肽中之任一者，尤其由與SEQ ID NO: 15之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
本發明進一步提供一種生產本發明之多肽及/或本發明之多聚體的方法，其中該方法包含用本發明之質體轉染細胞。
此外，提供一種生產本發明之多肽及/或本發明之多聚體的方法，其中該方法包含用本發明之桿狀病毒感染細胞，較佳昆蟲細胞。
此外，本發明係關於一種生產本發明之免疫原性組合物的方法，其中該方法包含以下步驟： (a)    允許用包含編碼本發明之多肽之核酸序列的載體感染培養物中之易感細胞，其中該多肽由該載體表現； (b)    其後特定言之在該經培養細胞之上清液中回收該多肽，其中細胞碎片較佳經由分離步驟與該多肽分離，該分離步驟較佳地包括經由至少一個過濾器、較佳兩個過濾器之微過濾，其中該至少一個過濾器之孔徑較佳為約1 µm至約20 µm及/或約0.1 µm至約4 µm； (c)    藉由向步驟(b)之混合物中添加二元伸乙基亞胺(BEI)使載體不活化； (d)    藉由添加硫代硫酸鈉至由步驟(c)產生之混合物中來中和BEI；以及 (e)    藉由利用過濾器之過濾步驟自混合物移除一部分液體來濃縮由步驟(d)產生之混合物中之多肽，該過濾器之濾膜之分子量截止值在約5 kDa與約100 kDa之間，較佳在約10 kDa與約50 kDa之間； (f)    及視情況將在步驟(e)之後殘餘之混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合。
在該方法之步驟(a)中，該等細胞較佳為昆蟲細胞且該載體較佳為本發明之桿狀病毒。
在該方法之步驟(b)中，該多肽最佳回收於該等經培養細胞之上清液中，而非自細胞內部回收。
此外，本發明提供本發明之免疫原性組合物及該免疫原性組合物在本文所描述之方法中之任一者中的用途，其中該免疫原性組合物可藉由前述產生本發明之免疫原性組合物的方法獲得。
此外，本發明提供一種多肽，其包含 - 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，以及 - 異源二聚域， 其中該異源二聚域連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之C端。
如本文所用之術語「二聚域」尤其係指能夠特異性結合至另一二聚合域或與另一二聚合域締合以形成二聚體的胺基酸序列。在一個實施例中，二聚域為能夠結合至具有相同胺基酸序列之另一二聚域或分別與其均締合以形成同源二聚體之胺基酸序列。二聚域可含有一或多個半胱胺酸殘基，使得[a]一或多個雙硫鍵可形成或已分別在締合二聚域之間形成。
在本發明情形下，「異源二聚域」尤其係指衍生自除衍生如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段的輪狀病毒以外之實體的二聚域。舉例而言，異源二聚域為由除輪狀病毒以外之病毒之基因體或較佳由真核細胞或原核細胞，尤其哺乳動物或禽類細胞之基因體編碼的二聚域。
較佳地，異源二聚域為由腸細胞對由衍生如本文所提及之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段的輪狀病毒感染敏感之物種的基因體編碼之二聚域。舉例而言，若輪狀病毒VP8蛋白質之片段為豬輪狀病毒VP8蛋白質之片段，則異源二聚域較佳為由豬基因體編碼之二聚域。根據另一實例，若輪狀病毒VP8蛋白質之片段為雞輪狀病毒VP8蛋白質之片段，則異源二聚域較佳為由雞基因體編碼之二聚域。
根據另一較佳態樣，異源二聚域分別能夠形成或形成同源二聚體。
在一個較佳實例中，本文所提及之異源二聚域為捲曲螺旋域，尤其白胺酸拉鏈域。
該白胺酸拉鏈域較佳為c-Jun白胺酸拉鏈域，諸如豬c-Jun白胺酸拉鏈域。 實例
以下實例僅意欲說明本發明。其不應以任何方式限制申請專利範圍之範疇。 實例 1 融合蛋白質之設計、生產及測試 ： 構築體設計：
輪狀病毒A VP4序列最初自最緊密匹配GenBank序列JX971567.1且歸類為P[7]基因型的豬糞便樣本獲得。使用VP4胺基酸57-224 (SEQ ID NO: 3)，在下文中亦命名為「AVP8」，且對應於VP8蛋白質之凝集素樣域，但其中N端延長八個胺基酸殘基。連接部分為Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 9)。豬IgG Fc序列(SEQ ID NO: 7)匹配IgG重鏈恆定前驅體之胺基酸242-470 (Genbank序列BAM75568.1)。接收編碼AVP8之IDT Gblock、Gly-Gly-Ser連接子及豬IgG Fc序列(SEQ ID NO: 17)，所有密碼子均針對昆蟲細胞最佳化且在本文中命名為AVP8-IgG Fc。由AVP8-IgG Fc編碼之蛋白質(SEQ ID NO: 12)在本文中亦稱為「AVP8-IgG Fc蛋白質」。 選殖、表現及純化：
AVP8-IgG Fc為TOPO選殖的，且隨後使用BamHI及NotI限制位點插入桿狀病毒轉移質體pVL1393中，接著與BaculoGold共轉染至Sf9細胞中以產生重組桿狀病毒。生產AVP8-IgG Fc蛋白質係如下進行：在0.2 MOI下，於3 L轉瓶中之1L Sf+細胞用捕獲4DPI之消耗培養基感染，在15,000 g下離心20分鐘且經0.2 µm過濾。添加1 mL之MabSelect SuRE LX樹脂漿料(GE Healthcare，目錄號17-5474-01)且在4℃下藉由適度攪拌培育隔夜。藉由過濾再捕獲樹脂，經4×10 mL之溫和結合緩衝液(Pierce，目錄號21012)洗滌且在7×5 mL體積之溫和溶離緩衝液(Pierce，目錄號21027)中溶離。合併溶離份且在4℃下針對3.5 L TBS透析一次緩衝液變化。進行BCA分析(Thermo Scientific，目錄號23227)以測定含量(80 µg/mL)。 血清學研究：
用具有87.5%抗原及12.5%佐劑之Emulsigen D調配蛋白質A純化之AVP8-IgG Fc蛋白質。大致七週齡之小豬藉由IM在頸部側面上接受2 mL劑量，其中21天後增強。每週收集血清樣本持續七週。藉由ELISA評估來自疫苗接種如下文所描述(「用於ELISA之方案」)AVP8-IgG Fc蛋白質之豬的血清( 圖 1)，及如下文所描述(「用於病毒中和分析之方案」)病毒中和分析法( 圖 2)。與非相關疫苗對照相比，來自經AVP8-IgG Fc蛋白質疫苗接種之豬的IgG ELISA結果展示在第14天SP比率峰值增加且在第21天增強之後再次升高。病毒中和效價類似地展示第7天及第14天增加，接著第21天增強後第28天之第二峰值。 用於 ELISA 之方案
對於IgA ELISA，用稀釋於1×PBS 1:16中之完整輪狀病毒抗原塗佈培養基蛋白結合96孔ELISA培養盤。在4℃下培育培養盤隔夜。培育之後，使用1×PBST洗滌培養盤且隨後在37℃下用酪蛋白阻斷溶液阻斷1小時。在洗滌之後，將100 µL於阻斷緩衝液中稀釋至1:40之最終稀釋液的初級抗體添加至培養盤中且在37℃下培育1小時。在洗滌之後，孔塗佈有100 µl之辣根過氧化酶(HRP)-共軛-羊-抗豬-IgA之1:3200稀釋液且在37℃下培育一小時。在洗滌之後，在室溫下用3,5,3',5'-四甲基聯苯胺顯影培養盤15分鐘，且在450 nm處之光學密度(OD)量測之前，用1 N HCl來終止反應。包括陽性及陰性對照之樣本在重複孔中運作且結果報導為(樣本-陰性對照)至(陽性-陰性對照)比率(S-N)/(P-N)之平均值。
對於IgG ELISA，用稀釋於1×PBS 1:8中之完整輪狀病毒抗原塗佈培養基蛋白結合96孔ELISA培養盤。在4℃下培育培養盤隔夜。培育之後，使用1×PBST洗滌培養盤且隨後在37℃下用印跡級阻斷溶液阻斷1小時。在洗滌之後，將100 µL於阻斷緩衝液中稀釋至1:625之最終稀釋液的初級抗體添加至培養盤中且在37℃下培育1小時。在洗滌之後，孔塗佈有100 µl之辣根過氧化酶(HRP)-共軛-羊-抗豬-IgG之1:8000稀釋液且在37℃下培育一小時。在洗滌之後，在室溫下用3,5,3',5'-四甲基聯苯胺顯影培養盤10分鐘且在450 nm處之光學密度(OD)量測之前，用1 N HCl來終止反應。包括陽性及陰性對照之樣本在重複孔中運作且結果報導為(樣本-陰性對照)至(陽性-陰性對照)比率(S-N)/(P-N)之平均值。 用於病毒中和分析之方案
將所有血清及牛奶樣本在56℃下加熱不活化30分鐘。將樣本在輪狀病毒生長培養基(MEM+2.5% HEPES+0.3%胰蛋白磷酸酯培養液+0.02%酵母+10 µg/mL胰蛋白酶)中自1:40連續稀釋至1:2,560。將輪狀病毒A分離株(效價7.0對數TCID 50/mL) 1:25,000稀釋至輪狀病毒生長培養基中。將總共200 µl經稀釋之血清添加至200 µl經稀釋之病毒中；在37℃±5% CO 2下培育混合物一小時。自接種有MA104細胞之三四天齡之96孔盤無菌移除生長培養基。在培育之後，將200 µl之病毒-血清混合物轉移至細胞培養盤中。在37℃±5% CO 2下培育細胞72小時。在使用當天滴定儲備液及經稀釋之病毒以確定分析中所使用之稀釋度。在培育之後，丟棄上清液且將培養盤用200 µL/孔1×PBS洗滌一次。為固定，添加100 µL/孔之50%/50%丙酮/甲醇。將培養盤在室溫下培育15分鐘，風乾，隨後用100 µL/孔1×PBS復水。初級抗體(兔抗輪狀病毒A多株血清，內部產生)在1×PBS中以1:1000稀釋。添加100 µL/孔之經稀釋之初級抗體，且將培養盤在37℃±5% CO 2下培育一小時。在培育之後，培養盤用100 µL/孔1×PBS洗滌兩次。將二級抗體(Jackson ImmunoResearch FITC標記之羊-抗家兔IgG，目錄號111-095-003)在1×PBS中以1:100稀釋。添加100 µL/孔之經稀釋之二級抗體，且將培養盤在37℃±5% CO 2下培育一小時。在培育之後，培養盤用100 µL/孔1×PBS洗滌兩次。使用紫外輻射顯微鏡讀取培養盤以供存在螢光。若發現經稀釋之病毒之效價(使用Reed-Muench方法產生)為2.8±0.5對數TCID 50/mL，則該分析視為有效的。另外，各分析中包括已知陽性及陰性樣本作為對照。血清效價報導為最高稀釋度，其中未觀測到染色。 實例 2 攻擊研究：
此研究之主要目的為評價向豬提供針對毒力輪狀病毒A攻擊之被動保護的習知母豬投與原型疫苗,在本文中亦稱為「IgG:AVP8」，包括AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)及非相關對照疫苗，在本文中稱為「安慰劑」。此外，為了比較，在該研究中使用可商購的MLV輪狀病毒痘苗(ProSystem® Rota, Merck Animal Health)，在本文中亦稱為「商業產品」或「商業疫苗」。以與上文實例1中所描述之生產類似之方式生產原型疫苗，但其中不同體積用於感染且培育時段更長，如下文章節「 IgG:AVP8 之生產」中所描述。商業產品係根據用於疫苗ProSystem® TGE/Rota之由製造商提供之標籤說明書(劑量及方向，以及用於豬之口服疫苗接種的建議方法)。
研究中包括總共16隻母豬。將母豬隨機分為三個處理組及一個嚴格對照組，如下表1中所描述。將T02及T04中之母豬共混於三個房間之間。將T06及T07中之母豬圈養在兩個單獨的房間中。所有母豬均藉由如表1中所列之適當途徑接種適當物質。T07中之母豬保持未經疫苗接種(嚴格對照)。在整個疫苗接種時段期間定期自母豬收集血清且分析血清轉化之證據。在分娩之前收集糞便樣本且藉由RT-qPCR篩選以證實母畜在分娩之前未主動排出輪狀病毒。每日記錄各母豬之整體健康狀況觀測結果。使分娩天然進行直至母豬到達妊娠第114天。此後，誘導分娩。在分娩時，豬崽入選試驗中。僅將在出生時健康之豬崽標記，根據設施標準操作程序處理且包括於試驗中。當豬為零至五日齡時，對其進行抽血，收集糞便拭子，且攻擊豬(不包括T07)。在攻擊時，向豬胃內投與5 mL劑量之碳酸氫鈉，隨後胃內投與5 mL劑量之攻擊物質。在整個攻擊時段，每日監測所有動物是否存在腸道疾病(腹瀉及行為變化)。在整個攻擊時段定期收集糞便樣本。在攻擊後兩天(DPC 2)，使大致三分之一的來自各窩之豬安樂死。安樂死之後，進行屍體剖檢且評估豬之宏觀病變。收集腸切片用於顯微及免疫組織化學評價。收集腸拭子用於RT-qPCR評價。在DPC 21，對所有剩餘豬進行稱重、抽血且收集糞便拭子。在樣本收集之後，將豬安樂死。評價豬之宏觀病變且收集腸拭子。 表 1 ：研究設計
組別 N ( 母豬 ) N ( 豬崽 ) 房間 母豬疫苗接種 ( 分娩前 6 及 2 週 ) 豬崽攻擊 (DPC0 ； 0-5 日齡 ) 屍體剖檢
描述 途徑 / 劑量 *
T02 6 57 共混於房間115、116及117之間 安慰劑 2mL IM + 2mL IN 組織勻漿1:2稀釋1 mL胃內劑量 在DPC2對1/3豬進行屍體剖檢；在DPC21對剩餘豬進行屍體解剖
T04 5 46 IgG:AVP8 2mL IM
T06 2 22 118 商業疫苗 在分娩5及2週口服2 mL+在分娩之前1週IM 2 mL
T07 3 27 114 嚴格對照 不適用 無 不適用
*IM=肌肉內，IN=鼻內
在整個研究中，來自T07 (嚴格對照)之母豬的血清VN效價保持恆定或下降，指示缺乏暴露及有效研究(如上文在實例1中所描述來評估病毒中和(「 用於 病毒中和分析之方案」)，結果展示於 圖 3)。在疫苗接種階段，在疫苗接種IgG:AVP8 (T04)原型疫苗之母豬血清中觀測到最高中值VN效價。在此組中，在分娩前六週投與之一劑導致在T04 (IgG:AVP8)中之3/5動物到D14時效價增加四倍或更多。在豬攻擊之前，T04 (IgG:AVP8)中之5/5隻動物之效價增加四倍或更多。在疫苗接種階段，安慰劑組(T02)中之母豬之血清VN效價無顯著增加(＜2倍)。直至D35，在T06 (商業疫苗)中之母豬之血清VN效價無顯著增加(＜2倍)。在豬攻擊之前，T06 (商業疫苗)之兩隻母豬之效價增加四倍。在外肌暴露至攻擊物質之後，T02 (安慰劑)及T06 (市售疫苗)中之母豬之VN血清效價增加。反之，在4/5母豬中，T04 (IgG:AVP8)中之母豬之VN血清效價保持恆定或降低。關於初乳及乳汁VN效價，在組T04 (IgG:AVP8)中，在分娩時VN效價最高，在攻擊前樣本中降低且在攻擊後樣本中進一步降低。在安慰劑組(T02)中，在分娩及攻毒前VN效價較低，但在外肌暴露至攻擊物質之後增加。
在攻擊前豬血清中之VN效價在T04 (IgG:AVP8)中之大部分豬中較高(＞1280)，表明來自母豬之免疫性被動轉移至小豬。反之，T02 (安慰劑)及T06 商業疫苗)中之豬之大部分效價較低(＜1280)。
在整個攻擊階段中，在T02 (安慰劑)中觀測到最高死亡率數目，其中8/57 (14.0%)之豬死亡。反之，在T04 (IgG:AVP8)中僅1/46 (2.2%)豬死亡，在T06 (商業疫苗)中1/22 (4.5%)豬死亡，且在T07 (嚴格對照)中1/27 (3.7%)豬死亡。在整個研究中，在T07 (嚴格對照)中之豬中未觀測到腹瀉之臨床症狀。在攻擊後第1天或第2天，T02 (安慰劑)中之豬開始腹瀉之臨床症狀且在DPC10在大部分動物中消退。總體而言，在研究期間至少一次在T02 (安慰劑)中之44/57 (77.2%)之動物中觀測到腹瀉之臨床症狀。在此等44隻動物中，腹瀉在29 (65.9%)隻動物中視為嚴重的。相比之下，在T04 (IgG:AVP8)中之豬中腹瀉之臨床症狀減少。關於各組之臨床腹瀉結果之概述，參見下表2。 表 2 ： 各組具有異常腹瀉 ( 曾有 ) 之動物之百分比
組別 曾經異常* 曾經嚴重**
T02-安慰劑 44/57 (77.2%) 29/44 (65.9%)
T04- IgG:AVP8 15/46 (32.6%) 8/15 (53.3%)
T06-商業疫苗 13/22 (59.1%) 10/13 (76.9%)
T07-嚴格對照 0/27 (0.0%) 不適用
*包括在研究期間至少一次得分為1或2的豬除以每組豬之總數 **包括在研究期間至少一次得分為2的豬除以曾經異常之豬的總數
在攻擊之前，藉由RT-qPCR未偵測到輪狀病毒A RNA，表明為有效研究。另外，在整個研究中，在來自T07 (嚴格對照)母豬或豬中藉由RT-qPCR未偵測到輪狀病毒A RNA。在攻擊之後的豬中，在T02 (安慰劑)中之排出最普遍。在大部分豬中，在DPC1-3開始排出且持續直至DPC14。最關注的係與T02 (安慰劑)及T06 (商業疫苗)相比，T04 (IgG:AVP8)中觀測到之排出減少。排出之百分比及所偵測之RNA之中值量均減少(參見 圖 4，關於研究日之組中值對數輪狀病毒A RNA基因體複本數(gc)/mL糞便)；測試如下文所描述進行(「 用於 輪狀病毒 A qRT-PCR 之方案」) 。
將來自各組之隨機選擇之豬子集安樂死且在DPC2進行屍體剖檢。評價豬之存在宏觀腸病變(薄壁、氣擴張之小腸、純液體含量等)、顯微病變(萎縮性腸炎)及藉由免疫組織化學(IHC)特定染色之輪狀病毒A。下表3呈現在按組屍體剖檢時具有腸病變之豬的數目。攻擊視為成功的，因為安慰劑組(T02)中之84.2% (16/19)豬具有宏觀病變且彼等之63.2% (12/19)具有染色。最關注的係在T04 (IgG:AVP8)中僅1/15豬缺乏輪狀病毒A染色。另外，相比於T02 (安慰劑)及商業產品(T06)，在T04 (IgG:AVP8)中具有宏觀病變之豬之百分比降低。 表 3. 在按組屍體剖檢時具有腸病變及 IHC 染色之動物之百分比 .
組別 在 DPC2 處之腸病變 * 在 DPC2 處之 IHC 染色 **
位置 % 得分 1 之數目 得分 2 之數目 得分 3 之數目
T02-安慰劑 16/19 (84.2%) 12/19 (63.2%) 2/12 (16.7%) 2/12 (16.7%) 8/12 (66.6%)
T04- IgG:AVP8 4/15 (26.7%) 1/15 (6.7%) 0/1 (0.0%) 0/1 (0.0%) 1/1 (100.0%)
T06-商業疫苗 4/8 (50.0%) 4/8 (50.0%) 3/4 (75.0%) 1/4 (25.0%) 0/4 (0.0%)
T07-嚴格對照 不適用 § 不適用 §
*表示在DPC2處具有腸病變之豬之數目除以DPC2處之豬屍體剖檢之總數目 **其中得分1=＜10%之絨毛含有抗原，得分2=10%至50%之絨毛含有抗原，得分3=＞50%之絨毛含有抗原 §不適用，因為來自T07之豬不進行屍體剖檢
計算存活豬之平均每日體重增加(以kg為單位)且呈現於下表4中。在來自T04 (IgG:AVP8)之豬中觀測到ADWG中之最高數值益處。疫苗接種後ADWG之增加與T02 (安慰劑)相比顯著不同。 表 4. 按組之以 kg 為單位之平均每日體重增加 ( 標準差 ).
組別 以 kg 為單位之 ADWG 平均值 ( 標準差 )
T02-安慰劑 0.15 (0.13)
T04- IgG:AVP8 0.25 (0.08)
T06-商業疫苗 0.22 (0.11)
T07-嚴格對照 0.23 (0.07)
總之，用IgG:AVP8原型疫苗(包含SEQ ID NO: 12之多肽)在分娩前六週及兩週對習知母豬進行疫苗接種在母豬血清及初乳中產生較高中和抗體效價。如藉由在來自疫苗接種之母豬的豬血清中偵測高效價(＞1280)所證明，此等中和抗體被動傳輸至出生後的豬。豬中存在較高中和抗體效價引起臨床保護。特定言之，相比於安慰劑對照及商購疫苗生出的豬，接種疫苗之母豬生出的豬具有減少的輪狀病毒A RNA之糞便排出、降低之死亡率、減少之腹瀉臨床症狀、減少之在DPC2處之輪狀病毒A之拓殖、減少之在DPC2處之宏觀病變及增加之ADWG。 用於輪狀病毒 A qRT-PCR 之方案
為了測定糞便樣本中之輪狀病毒A RNA，定量一步RT-PCR套組(iTaq Universal一步RT-PCR套組；BioRad，目錄號1725140)用於分析。關於引子及探針資訊參見下表5。 表 5 ： 引子 (F/R) 及探針 (Pr1/Pr2) 資訊
名稱 序列 大小 位置
RVA F 5'-GCT AGG GAY AAA ATT GTT GAA GGT A-3' (SEQ ID NO:22) 25 40..64
RVA R 5'-ATT GGC AAA TTT CCT ATT CCT CC-3' (SEQ ID NO:23) 23 145..167
RVA Pr1 5'-FAM-ATG AAT GGA AAT GAY TTT CAA AC-MGB-3' (SEQ ID NO:24) 23 121..143
RVA Pr2 5'-FAM-ATG AAT GGA AAT AAT TTT CAA AC-MGB-3' (SEQ ID NO:25) 23 121..143
在含有5 µl之所提取總核酸、1 µl之各探針(5 µM)、1 µl之各引子(10 µM)、10 µl之2×RT-PCR混合、0.5 µl iScript逆轉錄酶及0.5 µl之經DEPC處理之水的20 µl反應物中進行即時RT-PCR。使用CFX96即時PCR偵測系統(BioRad)在以下條件下進行反應：初始逆轉錄在50℃下10 min，接著初始變性在95℃下3 min，40個週期之95℃下之變性15 s及60℃下退火及延伸45 s。為產生相對定量資料，兩種輪狀病毒A g阻斷液之連續稀釋液包括於各運行中。使用5.0×10 7個基因體複本/µL作為起始濃度，在運行中包括相等量之g阻斷液中之每一者。使用CFX管理器軟體分析光學資料。對於各測定，使用循環臨限值(Ct)測定模式之回歸設置自動地計算臨限值線。使用減去基線之模式自動進行基線減除。人工校正基線末端值小於10之曲線。 IgG:AVP8 之生產
在5 L搖瓶中用1.7 mL之含有輪狀病毒A VP8核-豬IgG Fc融合蛋白質(BaculoGold (BG)/pVL1393-AVP8-IgG；1.18×10 8TCID50/mL)之重組桿狀病毒儲備液感染於搖瓶中之大致1×10 6個細胞/毫升濃度之2 L Sf+ (草地黏蟲 Spodoptera frugiperda))細胞。將搖瓶在28℃±2℃下在以90 rpm之持續攪拌下培育五天。將細胞及培養基無菌轉移至3×1 L離心瓶中，且在4℃下以10,000 g使細胞集結20分鐘。使所得上清液通過0.2 µm過濾器(Thermo Scientific，目錄號567-0020)，隨後在4℃下在適度攪拌下用2.5 mL之MabSelect SuRe LX蛋白A樹脂(GE Healthcare，目錄號17-5474-01)培育隔夜。樹脂藉由0.2 µm過濾(Thermo Scientific，目錄號567-0020)回收，隨後用12×10 mL體積之溫和Ag/Ab結合緩衝液(Thermo Scientific，目錄號21012)洗滌。使用7×10 mL體積之溫和Ag/Ab溶離緩衝液(Thermo Scientific，目錄號21027)自樹脂溶離AVP8-IgG。將VP8-IgG相對於3.5 L之20 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl滲析一次緩衝液變化。在37℃下將殘餘桿狀病毒用5 mM BEI不活化24小時。所得物質在1×PBS (Gibco，目錄號10010-023)中稀釋至70 µg/mL之目標濃度。用12.5% Emulsigen D調配經稀釋之物質。 實例 3 血清學研究：
此研究之主要目的為評價向習知母豬投與原型疫苗(包括AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12))及對照疫苗(本文中稱為「安慰劑」)是否產生針對輪狀病毒A之血清學反應。原型疫苗(包含Emulsigen D或Carbopol作為佐劑，參見下表7 A及表7 B)，在本文中亦稱為「IgG-AVP8」係以類似於上文在實例1及2中所描述之生產方式生產，但其中不同體積用於感染及更長的培育期，如下文在章節「 疫苗生產： IgG-AVP8」中所描述。
研究中包括總共20隻母豬。將母豬隨機分為四個處理組，如下表6中所描述。在整個研究中，將母豬共混。所有母豬在D0及D21時肌肉內疫苗接種適當物質，如表4中所列出。在整個研究中定期自母豬收集血清且藉由病毒中和分析來分析血清轉化之證據。每日記錄各母豬之整體健康狀況觀測結果。在D42終止研究。 表 6 ：研究設計
組別 N 在 D0 及 D21 時用於 IM* 疫苗接種之物質 血液收集日期 研究終止
T02 8 IgG-AVP8 / Emulsigen D D0、7、14、21、28、35、42 D42
T03 8 IgG-AVP8 / Carbopol
T06 2 安慰劑/ Emulsigen D
T07 2 安慰劑/ Carbopol
*IM =肌肉內
在整個研究中，來自T06及T07 (安慰劑組)中之母豬之血清VN效價保持恆定或下降，表明缺乏暴露及有效研究(病毒中和係如上文在實例1中所描述評估(「 用於 病毒中和分析之方案」），其中評價增加之稀釋度-1:40至1:40,960之修改)。在疫苗接種階段，經IgG-AVP8/Emulsigen D (T02)及IgG-AVP8/Carbopol (T03)原型疫苗接種之母豬的效價顯著增加(＞4倍)。對於兩組(T02及T03)，在一次疫苗接種後各組平均效價高於640且在整個研究時段中保持高於640。相比之下，安慰劑組(T06及T07)中之母豬在整個研究中血清VN效價無顯著增加(＜2倍)。
總之，用IgG-AVP8原型疫苗(包含SEQ ID NO: 12之多肽)在分娩前六週及兩週對習知母豬進行疫苗接種在母豬血清中產生較高中和抗體中和抗體。 疫苗生產： IgG-AVP8
對於0.22之MOI，用1.19×10 8TCID50/mL之15 mL BG/pVL1393-AVP8-IgG感染於有夾套之10 L Sartorius Biostat B玻璃容器中之8 L之1.00×10 6個細胞/毫升的Sf+細胞。生物反應器在27℃下在100 rpm攪拌下運作且在0.3 slpm下鼓泡氧氣。在6 DPI下捕獲容器，在10,000 g及4℃下離心20分鐘，且以0.8/0.2 µm過濾上清液(GE Healthcare,目錄號6715-7582)。在27℃下用5 mM BEI使2750 mL之澄清上清液不活化五天。在殘餘BEI用硫代硫酸鈉中和之後，使用10 kDa中空纖維過濾器(GE,目錄號UFP -10-C-4MA)濃縮2750 mL大致12×至225 mL。濃度測定為255 µg/mL。 表 7 A. 疫苗調配物
組分 目標 體積 濃度
AVP8-IgG蛋白質 抗原 16.5 mL 27.5%
PBS 稀釋液 31.5 mL 52.5%
Carbopol 佐劑 12 mL 20%
表 7 B. 疫苗調配物
組分 目標 體積 濃度
AVP8-IgG蛋白質 抗原 16.5 mL 27.5%
PBS 稀釋液 36 mL 60%
Emulsigen D 佐劑 7.5 mL 12.5%
實例 4
此研究之主要目的為評價經IgG-AVP8 (包括AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12))疫苗接種之動物是否能夠交叉中和除P[7]以外的各種G型及P型之各種輪狀病毒A血清型/基因型，AVP8-IgG Fc蛋白質係自該研究設計。此將指示AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)針對其他分離株具有保護性之能力。
簡言之，來自經IgG-AVP8疫苗接種之豬的熱不活化血清以1:200開始在自列A至列G之稀釋阻斷液中在MEM中稀釋2倍。列H不含血清。在另一稀釋阻斷液中，各種G型及P型之輪狀病毒A在來自第1行至第11行之6.0 Log 10TCID 50/mL開始的整個稀釋盤中稀釋1.5倍。第12欄不含病毒。將來自相應孔之250 µL病毒及250 µL血清合併且在37℃下培育1小時。在培育1小時之後，將100 µL病毒-血清混合物覆蓋於單層MA104細胞上，且在37℃下培育72小時並且藉由IFA染色且讀取病毒之存在。病毒之存在記錄為培養盤上之『+』且病毒之缺乏記錄為『0』。隨後將此等結果轉移至表8。
將以下六種輪狀病毒A分離株與此分析進行比較；G9P[7]、G9P[23]、G4P[23]、G3P[7]、G5P[7]及G4P[7]。表1中之結果表明P型P[23]交叉中和P[7]。包括P[7]或P[23]之所有G型亦經中和，指示在此分析中，G型在病毒之中和中並不顯著。 表 8 ：研究設計及結果
G9P[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + + + + 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + + + + 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + + 0 + + + 0 0
無血清 H + + + + + + + + + + 0 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
G9P[23] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + + 0 0 0 0 + 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + + + + + + 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + + + + + + + 0
無血清 H + + + + + + + + + + + 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
G4P[23] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + + + 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + 0 0 0 0 0 0 0
無血清 H + + + + + + + + + 0 + 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
G3P[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + 0 0 0 0 0 0 0
無血清 H + + + + + + + + + + 0 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
G5P[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D + + + + + 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + + + + + + + 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + + + + + + + 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + + + + + + 0 0
無血清 H + + + + + + + + + + + 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
G4P[7] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
血清 @ 1:200   A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:400    B + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @1:800     C 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:1600    D + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:3200     E + 0 + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:6400     F + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0
血清 @ 1:12800   G + + + + + + 0 0 0 0 0 0
無血清 H + + + + + + + + + + + 0
病毒稀釋液 100 150 225 338 506 759 1139 1709 2563 3844 5767 無病毒
總之，經IgG-AVP8 (包括AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12))疫苗接種之動物將交叉中和輪狀病毒基因型P[7]及P[23]。G型在病毒中和方面發揮顯著作用。 實例 5 豬中之概念實驗驗證：
總共40隻動物用於此研究。豬隨機分為四個處理組，每組10隻豬。在整個研究中，將豬共混。在處理之前獲取整體健康狀況觀測結果、篩選前血清樣本及篩選前糞便樣本以確認動物健康，確定對輪狀病毒A之基線血清學反應且在疫苗接種之前或在疫苗接種時證實無活性輪狀病毒A感染。研究第零天(D0)時，動物肌肉內疫苗接種以下物質：T01：IgG-P[7] AVP8疫苗(包含SEQ ID NO: 12之多肽)；T02：IgG-P[13] AVP8疫苗(包含SEQ ID NO: 14之多肽)；T03：P[7] AVP8-IgG-P[13] AVP8疫苗(包含SEQ ID NO: 16之多肽)；T04：安慰劑。在研究第0、7、14、21、28、36、42及49天採集血清樣本。在研究D49時在屍體剖檢時對所有動物進行人道安樂死。藉由病毒中和分析法測試血清樣本以測定隨時間推移對疫苗原型之血清學反應。經T01疫苗接種之動物具有抗體中和輪狀病毒基因型P[7]及P[23]，經T02疫苗接種之動物具有抗體中和輪狀病毒基因型P[13]且經T03疫苗接種之動物具有抗體中和輪狀病毒基因型P[7]、P[13]及P[23]。 實例 6 SDS PAGE ：
存在及不存在DTT ( 圖 5 A))之經蛋白質A純化之AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)產物的SDS-PAGE：產生用於SDS-PAGE影像之樣本的方法簡化如下:在37℃下用10 mM BEI不活化桿狀病毒收穫上清液36小時且隨後中和。隨後使用蛋白A樹脂純化樣本。所有樣本隨後使用具有25 mM DTT (最終)或等體積水之NuPAGE 4×LDS樣本緩衝液(Invitrogen，目錄號NP0007)變性，且在95℃下加熱10分鐘。樣本在180 V下之4%-12% SDS-PAGE凝膠(Invitrogen，目錄號NP0335BOX)上運行45分鐘且染色(eStain L1，GenScript目錄號M00548-1；destain目錄號M00549-1)。
因此，發現在具有還原(+DTT (二硫蘇糖醇))樣本之色帶中,主要一個條帶(單體AVP8-IgG Fc蛋白質，其結合下文所描述之西方墨點法之結果考慮)。在用未經還原之樣本(-DTT)運行的色帶中可見其他條帶。額外條帶之分子量範圍各自為單體之倍數。 西方墨點法：
抗豬IgG Fc片段西方墨點法( 圖 5 B))：在BEI添加之前，用1 mL樣本收集在生物反應器中產生之AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)產物。樣本在20,000g及4℃下離心5分鐘，將上清液傾析至新試管中，且將集結粒與上清液儲存於-70℃下。集結粒及上清液經解凍，將集結粒再懸浮於1 mL 8 M脲中，隨後在還原條件(+DTT)下在SDS-PAGE上運行等量集結粒及上清液，且轉移至PVDF膜。用HRP結合羊抗豬之1:1000稀釋液來探測西方墨點以偵測豬IgG Fc片段。
因此，未在細胞集結粒樣本中出乎意料地發現AVP8-IgG Fc蛋白質。實際上，在細胞培養物上清液樣本中有利地發現所有AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)。 實例 7 共同序列之產生：
產生SEQ ID NO: 4 (基於基因型P[6]輪狀病毒VP8蛋白質)及SEQ ID NO: 5 (基於基因型P[13]輪狀病毒VP8蛋白質)之共同序列，如下文中所描述： 序列由公開可獲得之豬輪狀病毒VP4核苷酸序列自NCBI病毒變化資料庫及內部衍生之輪狀病毒分離序列編譯。亦編譯序列之額外後設資料，包括用於以下之後設資料：分離株名稱、分離株P型、地理來源及可獲得時之分離日期。將核苷酸序列轉譯成蛋白質序列，且使用MUSCLE序列比對軟體UPGMB叢聚法及預設空隙罰分參數比對至已知VP8蛋白質。修整未比對之VP5胺基酸且丟棄。將VP8比對蛋白質序列導入MEGA7軟體以進行種系發生分析，且基於VP8蛋白質序列產生鄰近連接種系發生重建。使用泊松校正法以及種系發生之自助重抽檢定來計算最優樹(n=100)且按比例繪製，其中分支長度等於在總共170個位置上以每個位點之胺基酸取代為單位的進化距離。其中將自助重抽法叢聚關聯大於70%之節點視為顯著的。將具有大致10%距離及大於70%的自助重抽叢聚關聯之節點指定為叢聚。將不擬合至大叢聚中之離群序列個別地針對序列品質及P型來源進行評估。自分析中移除疑似低品質序列，而保留來自在豬輪狀病毒中很少觀測到之P型的序列。基於所需產物保護概況以及活體外血清交叉中和研究選擇用於產生共同序列之叢聚。根據每個比對位置之最大頻率產生共同序列，在其中在比對位置中觀測到相等比例之胺基酸的情況下，基於所報導之流行病學資料以及產物保護概況選擇胺基酸殘基。 實例 8 攻擊研究：
此研究之主要目的為評價向豬提供針對毒力輪狀病毒A攻擊之被動保護的習知母畜投與原型疫苗,在本文中亦稱為「IgG#AVP8」，包括AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)及非相關對照疫苗，在本文中稱為「安慰劑」。以與上文實例1中所描述之生產類似之方式生產原型疫苗，但其中不同體積用於感染及不同的純化方法，如下文章節「 IgG#AVP8 之 生產」中所描述。
研究中包括總共20隻母畜。將母畜隨機分為兩個處理組及一個嚴格對照組，如下表9中所描述。將T01及T03中之母畜在三個房間之間共混。將T07中之母畜圈養在獨立的房間中。所有母畜均藉由如表9中所列之適當途徑接種適當物質。T07中之母畜保持未經疫苗接種(嚴格對照)。在整個疫苗接種時段期間定期自母畜收集血清且分析血清轉化之證據。在分娩之前收集糞便樣本且藉由RT-qPCR篩選以證實母畜在分娩之前未主動排出輪狀病毒。每日記錄各母豬之整體健康狀況觀測結果。使分娩天然進行直至母豬到達妊娠第114天。此後，誘導分娩。在分娩時，豬崽入選試驗中。僅將在出生時健康之豬崽進行標記，根據設施標準操作程序處理且包括於試驗中。當豬一至五日齡時，對其進行抽血，收集糞便拭子，且攻擊豬(不包括T07)。在攻擊時，向豬胃內投與5 mL劑量之碳酸氫鈉，隨後胃內投與1 mL劑量之攻擊物質。在整個攻擊時段，每日監測所有動物是否存在腸道疾病(腹瀉及行為變化)。在攻擊後一天(DPC1)收集糞便樣本。在DPC2，使T01及T03中之所有豬安樂死。收集腸切片用於顯微及免疫組織化學評價。 表 9 ：研究設計
組別 N ( 母畜 ) N ( 豬崽 ) 房間 母豬疫苗接種 ( 分娩前 6 週 及 2 週 ) 豬崽攻擊 (DPC0 ； 1-5 日齡 ) 屍體剖檢
描述 途徑 / 劑量 *
T01 8 67 在房間CC1、CC2、CC3之間共混 安慰劑 2mL IM 輪狀病毒A P[7]組織勻漿1:2稀釋液 胃內1 mL劑量 DPC2
T03 8 72 IgG#AVP8 2mL IM
T07 4 35 CB8 嚴格對照 不適用 無 不適用
*IM =肌肉內
在整個研究中，來自T07 (嚴格對照)之母畜的血清VN效價增加低於4倍，表明缺乏暴露及有效的研究(如上文實例1 (「 用於病毒中和分析之方案」)中所描述來評估病毒中和，結果展示於表10及 圖 6中)。在疫苗接種階段，在疫苗接種原型疫苗IgG#AVP8 (組T03)之母畜血清中觀測到最高平均值VN效價。在此組中，在分娩前六週投與之一劑導致T03 (IgG#AVP8)中6/8動物到D14時效價增加四倍或更多。在疫苗接種階段，組T01 (安慰劑)中之母畜中無一者具有顯著的血清VN效價增加(＜2倍)。母畜初乳VN效價：組T03 (IgG#AVP8)中之母畜具有相比於組T01 (安慰劑)中之母畜更高的平均VN效價。 表 10 ： VN 結果
組別 母畜 血清 初乳
D0 D14 D21 D28 DPC0 DOF*
T01 887 160 320 320 453 320 160
7768 320 160 320 320 320 1280
7777 320 320 640 640 640 226
7785 320 640 905 905 1810 640
7795 160 80 640 640 640 1280
7802 320 113 453 320 640 1280
7813 320 640 640 905 453 905
7821 160 320 320 160 113 320
T03 1051 320 1280 320 1280 320 640
7767 160 640 1280 905 1280 2560
7772 160 1280 1280 1280 2560 2560
7774 160 1280 1280 1280 2560 1280
7781 320 640 905 640 640 453
7783 160 640 1280 905 2560 2560
7798 113 226 640 640 1280 453
7807 160 1280 1280 453 1280 2560
T07 886 226 80 160 1280 320 320
889 160 320 320 320 453 1280
7770 226 113 320 226 320 1280
7778 226 453 320 320 640 80
*DOF =分娩日
在攻擊前豬血清中之VN效價在T03 (IgG#AVP8)中之大部分豬中較高(＞1280)，表明來自母畜之免疫性被動轉移至小豬。反之，在T02 (安慰劑)中之豬中大部分效價較低(＜1280)。
在組T01 (安慰劑)及T03 (IgG#AVP8)中,若輪狀病毒抗原係藉由至少一個腸部分中之免疫組織化學(IHC)來偵測，則豬被定義為感染的,且動物在攻擊後至少一天具有異常糞便為了。頻率分佈列於下表11中。基於此案例定義之用途，在分娩前6週及2週用原型疫苗IgG#AVP8 (組T03)疫苗接種之母畜在用異源輪狀病毒A P[7]攻擊物質攻擊之後的豬中避免輪狀病毒相關之疾病；預防分率0.926，95%信賴區間0.734、0.979。 表11.案例定義之頻率分佈
組別 總計 案例定義 *
0 1
N % N %
T01 67 42 62.7 25 37.3
T03 72 70 97.2 2 2.8
*案例定義：若回腸或空腸組織樣本中之一或多者對輪狀病毒A為IHC陽性(分數＞0)且在攻擊後之任一天具有至少一個異常糞便得分，則豬被視為感染的。得分0=未感染；1=感染的
總之，在分娩前六週及兩週用原型疫苗IgG#AVP8 (包含SEQ ID NO: 12之多肽）對習知母畜進行疫苗接種在母豬血清及初乳中產生較高中和抗體效價。如藉由在來自疫苗接種之母畜的豬血清中偵測高效價(＞1280)所證明，此等中和抗體被動傳輸至出生後的豬。豬中存在較高中和抗體效價引起臨床保護。特定言之，相比於安慰劑對照生出的豬,疫苗接種之母畜生出的較少的豬視為感染的。 IgG#AVP8 之生產
將兩個10 L有夾套之Sartorius Biostat B玻璃容器以1.00×10 6個細胞/毫升接種3 L Sf+細胞。在接種之後三天，各容器以0.1之MOI感染且使用實例細胞420無血清培養基(SAFC目錄號14420C-1000 mL)將各容器之體積調節至8 L。生物反應器在27℃下在100 rpm攪拌下運行，其中溶氧設定為40%或高於40%，且CCA覆層在1.3 slpm下。在接種後7天收集容器；在4℃下以10,000 g使流體離心20分鐘，且以0.8/0.2 µm過濾上清液(GE Healthcare，目錄號6715-7582)。在37℃下藉由5 mM BEI在有夾套之Sartorius Biostat B玻璃容器中使澄清的上清液(8 L/容器)不活化三天。在不活化之後，用硫代硫酸鈉中和殘餘BEI。在中和之後，使用10 kDa中空纖維過濾器(GE，目錄號UFP-10-C-5A)將7000 mL濃縮大致10×至700 mL。用5個體積(3500 mL)之1×PBS對經濃縮之物質進行透濾。疫苗用12.5% Emulsigen D、28%濃縮物質及59.5% 1×PBS (體積:體積)調配。 實例 9 豬中之概念實驗驗證：
總共20隻動物用於此研究。豬隨機分為兩個處理組，每組10隻豬。在整個研究中，將豬共混。在處理之前獲取整體健康狀況觀測結果、篩選前血清樣本及篩選前糞便樣本以確認動物健康，確定對輪狀病毒C之基線血清學反應且在疫苗接種之前或在疫苗接種時證實無活性輪狀病毒C感染。研究第零天(D0)及D28時，動物肌肉內疫苗接種以下物質：T01：IgG-P CVP8疫苗(包含SEQ ID NO: 15之多肽)；T02：安慰劑。在研究第0、7、14、21、28、36及42天採集血清樣本。在研究D42時在屍體剖檢時對所有動物進行人道安樂死。藉由ELISA測試血清樣本以測定隨時間推移對疫苗原型之血清學反應。經T01疫苗接種之動物的抗輪狀病毒C抗體平均含量高於經T02疫苗接種之動物，其效價未增加。
在序列表 / 來源及地理來源 ( 在適用情況下 ) 中：SEQ ID NO: 1對應於來源於North Carolina, USA之農場的(基因型P[7])輪狀病毒VP8蛋白質之序列， SEQ ID NO: 2對應於來源於North Carolina, USA之農場的(基因型P[7])輪狀病毒VP8蛋白質之凝集素樣域之序列， SEQ ID NO: 3對應於來源於North Carolina, USA之農場的(基因型P[7])輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段之序列， SEQ ID NO: 4對應於輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段之序列，亦即，輪狀病毒VP8蛋白質(基於基因型P[6])之一部分的共同序列， SEQ ID NO: 5對應於輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段之序列，亦即，輪狀病毒VP8蛋白質(基於基因型P[13])之免疫原性片段的共同序列之一部分的共同序列， SEQ ID NO: 6輪狀病毒C VP8蛋白質之免疫原性片段之序列， SEQ ID NO: 7對應於豬IgG Fc片段之序列， SEQ ID NO: 8對應於天竺鼠IgG Fc片段之序列， SEQ ID NO: 9對應於連接部分之序列， SEQ ID NO: 10對應於連接部分之序列， SEQ ID NO: 11對應於連接部分之序列， SEQ ID NO: 12對應於包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 7之序列的多肽(融合蛋白質)之序列， SEQ ID NO: 13對應於包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 7之序列的多肽(融合蛋白質)之序列， SEQ ID NO: 14對應於包含SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 7之序列的多肽(融合蛋白質)之序列， SEQ ID NO: 15對應於包含SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 7之序列的多肽(融合蛋白質)之序列， SEQ ID NO: 16對應於包含SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 5之序列的多肽(融合蛋白質)之序列， SEQ ID NO: 17對應於編碼SEQ ID NO: 12之多肽(融合蛋白質)的聚核苷酸之序列， SEQ ID NO: 18對應於編碼SEQ ID NO: 13之多肽(融合蛋白質)的聚核苷酸之序列， SEQ ID NO: 19對應於編碼SEQ ID NO: 14之多肽(融合蛋白質)的聚核苷酸之序列， SEQ ID NO: 20對應於編碼SEQ ID NO: 15之多肽(融合蛋白質)的聚核苷酸之序列， SEQ ID NO: 21對應於編碼SEQ ID NO: 16之多肽(融合蛋白質)的聚核苷酸之序列， SEQ ID NO: 22-25：引子及探針序列(表5)。
本文中亦揭示以下條項。因此，本發明進一步包括由以下條項特性化之態樣： 1. 一種多肽，其包含 -  輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，以及 -  免疫球蛋白Fc片段。 2. 如條項1之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的N端。 3. 如條項1或2之多肽，其中 該免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的N端。 4. 如條項1至3中任一項之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段經由該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段經由輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基與該免疫原性片段之N端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的N端。 5. 如條項1至4中任一項之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端。 6. 如條項1至5中任一項之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段經由該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端。 7. 如條項1至6中任一項之多肽，其中該多肽為融合蛋白質。 8. 一種多肽，特定言之如條項1至7中任一項之多肽，其中該多肽為式x-y-z之融合蛋白質，其中 x由輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段組成； y為連接部分；並且 z為免疫球蛋白Fc片段。 9. 如條項1至8中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段能夠在投與輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的個體內誘導針對輪狀病毒之免疫反應。 10.   如條項1至9中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之長度為50至200個、較佳140至190個胺基酸殘基。 11.   如條項1至10中任一項之多肽，其中該輪狀病毒為豬輪狀病毒。 12.   如條項1至11中任一項之多肽，其中該輪狀病毒係選自由以下組成之群：輪狀病毒A及輪狀病毒C。 13.   如條項1至12中任一項之多肽，其中該輪狀病毒為輪狀病毒A。 14.   如條項1至13中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段包含輪狀病毒VP8蛋白質之凝集素樣域。 15.   如條項1至14中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段為輪狀病毒VP8蛋白質之N端延伸之凝集素樣域，其中該N端延伸之長度為1至20個胺基酸殘基，較佳5至15個胺基酸殘基。 16.   如條項14或15之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之凝集素樣域係由輪狀病毒VP8蛋白質之胺基酸殘基65-224之胺基酸序列組成。 17.   如條項15或16之多肽，其中該N端延伸之胺基酸序列為在輪狀病毒VP8蛋白質之胺基酸序列中側接凝集素樣域之N端胺基酸殘基的各別長度之胺基酸序列。 18.   如條項1至17中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段係由以下之胺基酸序列組成： 輪狀病毒VP8蛋白質之胺基酸殘基60-224、胺基酸殘基59-224、胺基酸殘基58-224、胺基酸殘基57-224、胺基酸殘基56-224、胺基酸殘基55-224、胺基酸殘基54-224、胺基酸殘基53-224、胺基酸殘基52-224、胺基酸殘基51-224、胺基酸殘基50-224或胺基酸殘基49-224。 19.   如條項1至18中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段係由輪狀病毒VP8蛋白質之胺基酸殘基57-224的胺基酸序列組成。 20.   如條項16至19中任一項之多肽，其中該胺基酸殘基之編號係指野生型輪狀病毒VP8蛋白質，特定言之野生型輪狀病毒A VP8蛋白質之胺基酸序列，且其中該野生型輪狀病毒VP8較佳為SEQ ID NO: 1中所列之蛋白質。 21.   如請求項1至20中任一項之多肽，其中該輪狀病毒係選自由以下組成之群：基因型P[7]輪狀病毒、基因型P[6]輪狀病毒及基因型P[13]輪狀病毒。 22.   如條項1至21中任一項之多肽，其中該輪狀病毒VP8蛋白質包含以下或由以下組成：與SEQ ID NO: 1之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列。 23.   如條項14至22中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該凝集素樣域係由與SEQ ID NO: 2之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 24.   如條項1至23中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段係由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 25.   如條項1至24中任一項之多肽，輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段由以下組成或為以下之共同序列：輪狀病毒VP8蛋白質之一部分，特定言之輪狀病毒A VP8蛋白質之一部分， 且其中輪狀病毒VP8蛋白質之一部分之該共同序列較佳可藉由包含以下步驟之方法獲得： -  將編碼輪狀病毒VP8蛋白質之一部分的複數個核苷酸序列轉譯為胺基酸序列， -  將該等胺基酸序列與已知輪狀病毒VP8蛋白質比對，較佳藉由使用MUSCLE序列比對軟體UPGMB叢聚法及預設空隙罰分參數， -  對該等比對序列進行種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白質序列產生鄰近連接種系發生重建，特定言之將該等比對胺基酸序列導入MEGA7軟體以用於種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白質序列產生鄰近連接種系發生重建， -  使用泊松校正法以及種系發生之自助重抽檢定來計算最優樹(n=100)， -  按比例繪製最優樹，其中分支長度等於在總共170個位置上以每個位點之胺基酸取代為單位的進化距離， -  將自助重抽叢聚關聯大於70%的節點作為顯著的， -  將具有大致10%距離及大於70%的自助重抽叢聚關聯之節點指定為叢聚，以及 -  選擇叢聚及藉由鑑別該叢聚內每個比對位置之最大頻率來產生共同序列， -  且視情況，在其中在比對位置中觀測到相等比例之胺基酸的情況下，基於所報導之流行病學資料以及預定產品保護概況選擇胺基酸殘基。 26.   如條項1至25中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段係由與選自由SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 27.   如條項1至26中任一項之多肽，其中該輪狀病毒為輪狀病毒C。 28.   如條項1至27之多肽，其中旋輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段係由與SEQ ID NO: 6之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 29.   如條項1至28中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段係由以下組成或為以下： -  輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段，如條項9至24中任一項或多項所指定，或 -  輪狀病毒VP8蛋白質之一部分，特定言之A VP8蛋白質之一部分的共同序列，如條項9至13、25及26中任一項所指定，或 -  輪狀病毒C VP8蛋白質之免疫原性片段，如條項9至12、27及28中任一項所指定。 30.   如條項1至29中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段係由與選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 31.   如條項1至30中任一項之多肽， 其中該免疫球蛋白Fc片段之長度為至少220個胺基酸殘基，較佳長度為220至250個胺基酸殘基， 及/或其中該免疫球蛋白Fc片段未經糖基化。 32.   如條項1至31中任一項之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段包含免以下或由以下組成：免疫球蛋白之重鏈恆定區2 (CH2)及重鏈恆定區3 (CH3)及視情況存在之鉸鏈區或鉸鏈區之一部分。 33.   如條項1至32中任一項之多肽，其中該免疫球蛋白係選自由以下組成之群：IgG、IgA、IgD、IgE及IgM。 34.   如條項1至33中任一項之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段為由其腸道細胞易受輪狀病毒感染的物種之基因體編碼的免疫球蛋白Fc片段，輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段係衍生自該輪狀病毒。 35.   如條項1至34中任一項之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段為豬IgG Fc片段。 36.   如條項1至35中任一項之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列。 37.   如條項3至36中任一項之多肽，其中該連接部分為長度為1至50個胺基酸殘基之胺基酸序列。 38.   如條項3至37中任一項之多肽，其中該連接部分包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的序列具有至少66%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列。 39.   如條項5至38中任一項之多肽，其中該多肽具有側接輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之N端胺基酸殘基的N端甲硫胺酸殘基。 40.   如條項5至39中任一項之多肽，其中該多肽包含連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端的輪狀病毒VP8蛋白質之另一免疫原性片段。 41.   一種多肽，特定言之如條項1至40中任一項之多肽，其包含 -  輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段(1)， -  免疫球蛋白Fc片段，以及 -  輪狀病毒VP8蛋白質之另一免疫原性片段(2)， 其中該免疫球蛋白Fc片段連接至該免疫原性片段(1)的C端， 且其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段(2)連接至該免疫球蛋白Fc片段的C端。 42.   如條項40或41之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段係由以下組成或為以下： -  輪狀病毒A VP8蛋白質之免疫原性片段，如條項9至24中任一項或多項所指定；或 -  輪狀病毒VP8蛋白質之一部分，特定言之A VP8蛋白質之一部分的共同序列，如條項9至13、25及26中任一項或多項所指定；或 -  輪狀病毒C VP8蛋白質之免疫原性片段，如條項9至12、27及28中任一項或多項所指定。 43.   如條項40至42中任一項之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 2至6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列， 及/或其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段不同於C端連接至該免疫球蛋白Fc片段之輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段。 44.   如條項40至43中任一項之多肽， 其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段經由連接部分連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端，其中該連接部分較佳為如條項37或38中所指定之連接部分， 或其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段經由輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段之N端胺基酸殘基與該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端。 45.   如條項1至44中任一項之多肽，其中該多肽由以下組成： -  輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，特定言之，如條項9至30中任一項或多項所指定之輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段， -  側接輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之N端胺基酸殘基的N端甲硫胺酸殘基，以及 -  免疫球蛋白Fc片段，特定言之，如條項31至36中之任一項或多項所指定之免疫球蛋白Fc片段， 其中該免疫球蛋白Fc片段尤其經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端，其中該連接部分較佳為如條項37或38中所指定之連接部分， -  及視情況選用之尤其經由連接部分連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端的輪狀病毒VP8蛋白質之另一免疫原性片段，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳為如條項41至44中任一項或多項所指定之另一免疫原性片段，且其中該連接部分較佳為如條項37或38中所指定之連接部分。 46.   如條項1至45中任一項之多肽，其中該多肽為包含以下或由以下組成之蛋白質：與選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或尤其100%序列一致性的胺基酸序列。 47.   如條項1至46中任一項之多肽，其中該多肽為重組蛋白，特定言之重組桿狀病毒表現之蛋白質。 48.   如條項1至47中任一項之多肽，其中該多肽與第二相同多肽形成同源二聚體。 49.   一種多聚體，其包含複數個如條項1至48中任一項之多肽或由其構成，且其中該多聚體較佳為由具有第二相同多肽之如條項1至48中任一項之多肽形成之同源二聚體。 50.   一種免疫原性組合物，其包含如條項1至48中任一項之多肽及/或如條項49之多聚體。 51.   如條項50之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進一步包含醫藥學或獸醫學上可接受之載劑或賦形劑。 52.   如條項50或51之免疫原性組成物，其中該免疫原性組成物進一步包含佐劑。 53.   一種免疫原性組合物，其包含以下或由以下組成： -  如條項1至48中任一項之多肽及/或如條項49之多聚體，及 -  醫藥學或獸醫學上可接受之載劑或賦形劑， -  以及視情況選用之佐劑。 54.   如條項52或53之免疫原性組合物，其中該佐劑為乳化水包油佐劑。 55.   如條項52或53之免疫原性組合物，其中該佐劑為卡波姆。 56.   一種聚核苷酸，其包含編碼如條項1至48中任一項之多肽的核苷酸序列， 57.   如條項56之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含與選自由SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或尤其100%序列一致性的核苷酸序列。 58.   一種質體，較佳表現載體，其包含有包含編碼如條項1至48中任一項之多肽之序列的聚核苷酸。 59.   一種細胞，其包含質體，較佳表現載體，該質體包含有包含編碼如條項1至48中任一項之多肽之序列的聚核苷酸。 60.   一種桿狀病毒，其含有聚核苷酸，該聚核苷酸包含編碼如條項1至48中任一項之多肽的序列。 61.   一種細胞，較佳昆蟲細胞，其包含桿狀病毒，該桿狀病毒含有包含編碼如條項1至48中任一項之多肽之序列的聚核苷酸。 62.   一種用途，其使用以下以製備藥劑，較佳疫苗： -  如條項1至48中任一項之多肽， -  如條項49之多聚體， -  如條項50至55中任一項之免疫原性組合物， -  如條項56或57之聚核苷酸， -  如條項58之質體， -  如條項60之桿狀病毒，及/或 -  如條項59或61之細胞， 63.   如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物，其適用作藥劑。 64.   如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物，其適用作疫苗。 65.   如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物，其用於在個體中誘導針對輪狀病毒之免疫反應的方法中。 66.   如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物，其用於減少或預防個體之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的方法中或用於治療或預防個體之輪狀病毒感染的方法中。 67.   如條項65或66之多肽或免疫原性組合物，其中該個體為哺乳動物或鳥類，且其中該鳥類較佳為雞。 68.   如條項65至67中任一項之多肽或免疫原性組合物，其中該個體為哺乳動物，且其中該哺乳動物較佳為豬或牛。 69.   如條項65至68中任一項之多肽或免疫原性組合物，其中該個體為豬，且其中該豬較佳為豬崽或母豬。 70.   如條項65之多肽或免疫原性組合物，其中該個體為懷孕母豬。 71.   如條項66之多肽或免疫原性組合物，其中該個體為豬崽。 72.   如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物，其用於減少或預防豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的方法中，其中該豬崽由已投與該免疫原性組合物之母豬哺乳。 73.   如條項72之多肽或免疫原性組合物，其中已投與該免疫原性組合物之該母豬為已投與該免疫原性組合物所投與之母豬，同時該母豬已懷孕，特定言之懷有該豬崽。 74.   一種方法，其用於治療或預防輪狀病毒感染，減少、預防或治療由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出，或預防或治療由輪狀病毒感染引起之疾病，該方法包含向個體投與如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物。 75.   一種方法，其用於在母豬中誘導產生對輪狀病毒具有特異性之抗體，其中該方法包含向該母豬投與如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物。 76.   一種方法，其減少或預防豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出，其中該方法包含 -  向母豬投與如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物，以及 -  允許該母豬哺乳該豬崽。 77.   如條項76之方法，其中該母豬為懷孕母豬，特定言之懷有該豬崽。 78.   如條項76或77之方法，其包含以下步驟： -  向懷有該豬崽之母豬投與如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物， -  允許該母豬生產該豬崽，以及 -  允許該母豬哺乳該豬崽。 79.   一種方法，其減少豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出，其中該豬崽由該母豬哺乳，向該母豬投與如條項1至48中任一項之多肽或如條項50至55中任一項之免疫原性組合物。 80.   如條項66至73中任一項之多肽或免疫原性組合物或如條項74至79中任一項之方法，其中該一或多種臨床症狀係選自由以下組成之群： -  腹瀉， -  輪狀病毒拓殖， -  病變，特定言之宏觀病變， -  減少之平均每日體重增加，以及 -  胃腸炎。 81.   如條項80之多肽或免疫原性組合物或如條項80之方法，其中該輪狀病毒拓殖為腸之輪狀病毒拓殖及/或其中該等病變為腸病變。 82.   如條項65至73、80及81中任一項之多肽或免疫原性組合物，或如條項74至81中任一項之方法，其中 -  該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， -  該感染輪狀病毒為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， -  針對輪狀病毒之該免疫反應為針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒的免疫反應，或 -  對輪狀病毒具有特異性之該等抗體為對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒具有特異性之抗體。 83.   如條項82之多肽，其中該多肽包含基因型P[7]輪狀病毒VP 8蛋白之免疫原性片段，且其中該多肽較佳為如條項21至26及29至48中任一項所指定之多肽。 84.   如條項82之免疫原性組合物或方法，其中該免疫原性組合物包含如條項21至26及29至48中任一項所指定之多肽，其輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段為基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段。 85.   如條項83之多肽或如條項84之免疫原性組合物或方法，其中基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段係由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。 86.   一種方法，其產生如條項1至48中任一項之多肽及/或如條項49之多聚體，其包含用如條項58之質體轉染細胞。 87.   一種方法，其產生如條項1至48中任一項之多肽及/或如條項49之多聚體，其包含用如條項60之桿狀病毒感染細胞，較佳昆蟲細胞。 88.   一種方法，其製備如條項50至55中任一項之免疫原性組合物，其中該方法包含以下步驟： (a)    允許用載體感染培養物中之易感細胞，該載體包含編碼如條項1至48中任一項之多肽的核酸序列，其中該多肽由該載體表現； (b)    其後特定言之在細胞培養物上清液中回收該多肽，其中細胞碎片較佳經由分離步驟與該多肽分離，該分離步驟較佳地包括經由至少一個過濾器、較佳兩個過濾器之微過濾，其中該至少一個過濾器之孔徑較佳為約1 µm至約20 µm及/或約0.1 µm至約4 µm； (c)    藉由向步驟(b)之混合物中添加二元伸乙基亞胺(BEI)使載體不活化； (d)    藉由添加硫代硫酸鈉至由步驟(c)產生之混合物中來中和BEI；以及 (e)    藉由利用過濾器之過濾步驟自混合物移除一部分液體來濃縮由步驟(d)產生之混合物中之多肽，該過濾器之濾膜之分子量截止值在約5 kDa與約100 kDa之間，較佳在約10 kDa與約50 kDa之間； (f)    及視情況將在步驟(e)之後殘餘之混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合。 89.   如條項50至55、63至73及80至85中任一項之免疫原性組合物、條項62之用途或如條項74至82、84及85中任一項之方法，其中該免疫原性組合物可藉由如條項88之方法獲得。 90.   一種多肽，其包含 -  輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，以及 -  異源二聚域， 其中該異源二聚域連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之C端。 91.   如條項90之多肽，其中該異源二聚域為捲曲螺旋域，特定言之白胺酸拉鏈。
圖 1：針對豬輪狀病毒A疫苗接種經Emulsigen D調配之AVP8-IgG Fc蛋白質(在標記中稱為「AVP8-IgG」)或安慰劑(「非相關對照」)之豬的血清IgG反應。 圖 2：在疫苗接種經Emulsigen D調配之AVP8-IgG Fc蛋白質(在標記中稱為「AVP8-IgG」)或安慰劑(「非相關對照」)之豬的樣本中，針對能夠中和豬輪狀病毒A病毒之偵測及定量抗體所進行之 病毒抵消(virus neutralization；VN)分析之結果。 圖 3：在分組日及研究日，針對母豬血清中之輪狀病毒之平均VN效價，其中研究日D0及D28表示時間點「分娩前六週及兩週」(亦即，當試驗用產品分別投與研究組T02及T04時)且研究日D7、D28及D35表示時間點「分娩前五週、兩週及一週」(亦即，當商用疫苗投與T06時)。 圖 4：研究日之組中值對數糞便中之輪狀病毒A RNA基因體複本數(gc)/毫升。 圖 5：A)經二硫蘇糖醇還原(「+DTT」)或未還原(「-DTT」)之經蛋白質A純化之AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)產物樣本之SDS-PAGE；B)AVP8-IgG Fc蛋白質(SEQ ID NO: 12)生物反應器產物之西方墨點法，其中樣本經離心以分離出細胞集結粒溶離份(「集結粒」)及上清液溶離份(「上清液」)，該樣本在冷凍-解凍製程之後在還原條件(+DTT)下溢流於SDS-PAGE上，傳遞至PVDF膜且經共軛羊抗豬之HRP探測以偵測豬IgG Fc片段。 圖 6：在分組日及研究日，針對母豬血清中之輪狀病毒之平均VN效價，其中研究日D0及D28表示時間點「分娩前六週及兩週」(亦即，當試驗用產品分別投與研究組T01及T03時)。 

          <![CDATA[<110>  德商百靈佳殷格翰維美迪加股份有限公司(Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH)]]>
          <![CDATA[<120>  用於針對輪狀病毒疫苗接種之融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<130>  01-3438]]>
          <![CDATA[<140> TW 110136858]]>
          <![CDATA[<141> 2021-10-04]]>
          <![CDATA[<150>  EP 20200161.6]]>
          <![CDATA[<151>  2020-10-05]]>
          <![CDATA[<160>  25    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  247]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  輪狀病毒]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Thr Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Leu Ser Asp Glu Ile Gln Glu Ile Gly Ser Ala Lys Ser Gln Asp 
                      20                  25                  30          
          Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Gly Tyr Ala Pro Val 
                  35                  40                  45              
          Asn Trp Gly Ala Gly Glu Thr Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr 
                          85                  90                  95      
          Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val 
                      100                 105                 110         
          Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Gly Thr Thr Pro Asn Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr 
                      180                 185                 190         
          Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile 
                  195                 200                 205             
          Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu 
              210                 215                 220                 
          Pro Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Val Ser Leu Ser Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Glu Ile Val His Thr Arg 
                          245         
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  160]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  輪狀病毒]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val 
                  35                  40                  45              
          Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser 
                          85                  90                  95      
          Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Ser Gly Thr Thr Pro Asn Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr 
                  115                 120                 125             
          Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu 
          145                 150                 155                 160 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  168]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  輪狀病毒]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr 
          1               5                   10                  15      
          Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr Val 
                      20                  25                  30          
          Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu Ala 
                  35                  40                  45              
          Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr Asn 
              50                  55                  60                  
          Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val Met 
                      100                 105                 110         
          Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr Tyr Ser Gly Thr Thr Pro Asn Ala 
                  115                 120                 125             
          Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met Thr 
              130                 135                 140                 
          Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu 
                          165             
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  167]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輪狀病毒共同序列]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Asp Ser Thr Thr Ile Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr 
          1               5                   10                  15      
          Ser Phe Lys Pro Pro Asn Asp Tyr Trp Ile Leu Leu Asn Pro Thr Asn 
                      20                  25                  30          
          Gln Gln Ile Val Leu Glu Gly Thr Asn Arg Thr Asp Val Trp Val Ala 
                  35                  40                  45              
          Leu Leu Leu Ile Glu Pro Asn Val Thr Asn Gln Ser Arg Gln Tyr Thr 
              50                  55                  60                  
          Leu Phe Gly Glu Thr Lys Gln Ile Thr Val Glu Asn Asn Thr Asn Lys 
          65                  70                  75                  80  
          Trp Lys Phe Phe Glu Met Phe Arg Asn Ser Ala Asn Ala Glu Phe Gln 
                          85                  90                  95      
          His Lys Arg Thr Leu Thr Ser Asp Thr Lys Leu Ala Gly Phe Leu Lys 
                      100                 105                 110         
          His Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe His Gly Glu Thr Pro Asn Ala Thr 
                  115                 120                 125             
          Thr Asp Tyr Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ser Glu Ile Glu Thr Val Ile 
              130                 135                 140                 
          His Thr Glu Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Tyr Ile Asn Thr Gly Leu 
                          165         
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  170]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輪狀病毒共同序列]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr 
          1               5                   10                  15      
          Thr Phe Asn Pro Pro Ile Glu Tyr Trp Thr Leu Phe Ala Pro Asn Asp 
                      20                  25                  30          
          Lys Gly Val Val Ala Glu Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Trp Leu Ala 
                  35                  40                  45              
          Ile Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val Pro Gln Glu Leu Arg Thr Tyr Thr 
              50                  55                  60                  
          Ile Phe Gly Gln Gln Val Asn Leu Val Ile Glu Asn Thr Ser Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Trp Lys Phe Ala Asp Phe Arg Arg Arg Ser Gln Asn Asp Thr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Val Leu Asn Asp Thr Leu Leu Ser Asp Thr Lys Leu Gln Ala Ala Met 
                      100                 105                 110         
          Lys Tyr Gly Ala Arg Leu Phe Thr Phe Thr Gly Asp Thr Pro Asn Ala 
                  115                 120                 125             
          Ala Pro Gln Glu Tyr Gly Tyr Glu Thr Asn Asn Tyr Ser Ala Ile Glu 
              130                 135                 140                 
          Ile Arg Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Met Pro Arg Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Val Cys Arg Asn Tyr Ile Asn His Gly Leu 
                          165                 170 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  181]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  輪狀病毒]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Glu Ser Thr Phe Lys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Pro His Asn Asn Thr 
          1               5                   10                  15      
          Val Ile Glu Trp Ser Asn Leu Met Asn Ser Asp Ile Trp Leu Leu Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gln Lys Pro Leu Asp Ile Thr Ala Pro Ile Arg Leu Leu Lys His Gly 
                  35                  40                  45              
          Pro Glu Asn His Ala Asp Val Ala Ala Phe Glu Leu Trp Tyr Gly Lys 
              50                  55                  60                  
          Ala Gly His Thr Val Thr Ser Ile Tyr Tyr Ser Ala Ile Ser Asn Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Asn Thr Val Thr Leu Thr Ser Asp Ser Leu Val Leu Phe Trp Asn 
                          85                  90                  95      
          Glu Gly Gln Thr Ile Leu Asp Thr Lys Thr Val Asn Phe Asn Trp Asn 
                      100                 105                 110         
          Met Gly Gly Ile Leu Val Arg Pro Ser Arg Gly Thr Arg Val Asp Ile 
                  115                 120                 125             
          Cys Met Ser Asp Met Asp Asn Thr Asp Gly Thr Asn Phe Asn Trp Ile 
              130                 135                 140                 
          Gln Trp Lys His Glu Phe Pro Arg Ser Ser Ser Asn Ala Asn Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Met Tyr Val Glu Tyr Tyr Leu Ala Ser Ser Asp Pro Tyr His Glu Leu 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Leu Gln Arg 
                      180     
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  229]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  豬]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln 
                  35                  40                  45              
          Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe 
                      180                 185                 190         
          Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala 
                  195                 200                 205             
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr Pro Gly Lys 
          225                 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  233]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  天竺鼠]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Arg Thr Pro Gln Pro Asn Pro Cys Thr Cys Pro Lys Cys Pro Pro Pro 
          1               5                   10                  15      
          Glu Asn Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Arg Val Thr Cys Val Val Val 
                  35                  40                  45              
          Asp Val Ser Gln Asp Glu Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Phe Val Asp 
              50                  55                  60                  
          Asn Lys Pro Val Gly Asn Ala Glu Thr Lys Pro Arg Val Glu Gln Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Thr Thr Phe Arg Val Glu Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp 
                          85                  90                  95      
          Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Tyr Asn Lys Ala Leu 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Ala Pro Arg 
                  115                 120                 125             
          Met Pro Asp Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Ser Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Ile Ile Asn Phe Phe Pro Ala Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Ile His Val Glu Trp Ala Ser Asn Arg Val Pro Val Ser Glu Lys Glu 
                          165                 170                 175     
          Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Glu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Ala Trp Asp Gln Gly Thr Val 
                  195                 200                 205             
          Tyr Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Val Thr Gln 
              210                 215                 220                 
          Lys Ala Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 
          225                 230             
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  3]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Gly Gly Ser 
          1           
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Ala Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  401]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Met Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro 
          1               5                   10                  15      
          Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr 
              50                  55                  60                  
          Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser 
                          85                  90                  95      
          Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val 
                      100                 105                 110         
          Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr Tyr Ser Gly Thr Thr Pro Asn 
                  115                 120                 125             
          Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met 
              130                 135                 140                 
          Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu Gly Gly Ser Thr Lys Thr Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu 
              210                 215                 220                 
          Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys 
                      260                 265                 270         
          Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile 
                  275                 280                 285             
          Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 
              290                 295                 300                 
          Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn 
                          325                 330                 335     
          Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln 
                      340                 345                 350         
          Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys 
                  355                 360                 365             
          Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu 
              370                 375                 380                 
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Lys 
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  400]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Met Asp Ser Thr Thr Ile Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro 
          1               5                   10                  15      
          Thr Ser Phe Lys Pro Pro Asn Asp Tyr Trp Ile Leu Leu Asn Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Gln Gln Ile Val Leu Glu Gly Thr Asn Arg Thr Asp Val Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Leu Leu Leu Ile Glu Pro Asn Val Thr Asn Gln Ser Arg Gln Tyr 
              50                  55                  60                  
          Thr Leu Phe Gly Glu Thr Lys Gln Ile Thr Val Glu Asn Asn Thr Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Trp Lys Phe Phe Glu Met Phe Arg Asn Ser Ala Asn Ala Glu Phe 
                          85                  90                  95      
          Gln His Lys Arg Thr Leu Thr Ser Asp Thr Lys Leu Ala Gly Phe Leu 
                      100                 105                 110         
          Lys His Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe His Gly Glu Thr Pro Asn Ala 
                  115                 120                 125             
          Thr Thr Asp Tyr Ser Ser Thr Ser Asn Leu Ser Glu Ile Glu Thr Val 
              130                 135                 140                 
          Ile His Thr Glu Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Glu Tyr Ile Asn Thr Gly Leu Gly Gly Ser Thr Lys Thr Lys Pro 
                          165                 170                 175     
          Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe 
                      180                 185                 190         
          Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 
                  195                 200                 205             
          Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val 
              210                 215                 220                 
          Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 
                          245                 250                 255     
          Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys 
                      260                 265                 270         
          Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser 
                  275                 280                 285             
          Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 
              290                 295                 300                 
          His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val 
          305                 310                 315                 320 
          Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly 
                          325                 330                 335     
          Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp 
                      340                 345                 350         
          Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala 
                  355                 360                 365             
          Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala 
              370                 375                 380                 
          Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys 
          385                 390                 395                 400 
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  403]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Met Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro 
          1               5                   10                  15      
          Thr Thr Phe Asn Pro Pro Ile Glu Tyr Trp Thr Leu Phe Ala Pro Asn 
                      20                  25                  30          
          Asp Lys Gly Val Val Ala Glu Leu Thr Asn Asn Thr Asp Ile Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Ala Ile Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val Pro Gln Glu Leu Arg Thr Tyr 
              50                  55                  60                  
          Thr Ile Phe Gly Gln Gln Val Asn Leu Val Ile Glu Asn Thr Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Lys Trp Lys Phe Ala Asp Phe Arg Arg Arg Ser Gln Asn Asp Thr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Val Leu Asn Asp Thr Leu Leu Ser Asp Thr Lys Leu Gln Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Met Lys Tyr Gly Ala Arg Leu Phe Thr Phe Thr Gly Asp Thr Pro Asn 
                  115                 120                 125             
          Ala Ala Pro Gln Glu Tyr Gly Tyr Glu Thr Asn Asn Tyr Ser Ala Ile 
              130                 135                 140                 
          Glu Ile Arg Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Met Pro Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Val Cys Arg Asn Tyr Ile Asn His Gly Leu Gly Gly Ser Thr Lys 
                          165                 170                 175     
          Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                  195                 200                 205             
          Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn 
              210                 215                 220                 
          Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
                          245                 250                 255     
          Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
                      260                 265                 270         
          Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg 
                  275                 280                 285             
          Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
              290                 295                 300                 
          Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln 
                          325                 330                 335     
          Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro 
                      340                 345                 350         
          Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val 
                  355                 360                 365             
          Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met 
              370                 375                 380                 
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Gly Lys 
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  414]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Met Glu Ser Thr Phe Lys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Pro His Asn Asn 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Ile Glu Trp Ser Asn Leu Met Asn Ser Asp Ile Trp Leu Leu 
                      20                  25                  30          
          Tyr Gln Lys Pro Leu Asp Ile Thr Ala Pro Ile Arg Leu Leu Lys His 
                  35                  40                  45              
          Gly Pro Glu Asn His Ala Asp Val Ala Ala Phe Glu Leu Trp Tyr Gly 
              50                  55                  60                  
          Lys Ala Gly His Thr Val Thr Ser Ile Tyr Tyr Ser Ala Ile Ser Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Asn Asn Thr Val Thr Leu Thr Ser Asp Ser Leu Val Leu Phe Trp 
                          85                  90                  95      
          Asn Glu Gly Gln Thr Ile Leu Asp Thr Lys Thr Val Asn Phe Asn Trp 
                      100                 105                 110         
          Asn Met Gly Gly Ile Leu Val Arg Pro Ser Arg Gly Thr Arg Val Asp 
                  115                 120                 125             
          Ile Cys Met Ser Asp Met Asp Asn Thr Asp Gly Thr Asn Phe Asn Trp 
              130                 135                 140                 
          Ile Gln Trp Lys His Glu Phe Pro Arg Ser Ser Ser Asn Ala Asn Val 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Met Tyr Val Glu Tyr Tyr Leu Ala Ser Ser Asp Pro Tyr His Glu 
                          165                 170                 175     
          Leu Lys Glu Leu Gln Arg Gly Gly Ser Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys 
                      180                 185                 190         
          Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe 
                  195                 200                 205             
          Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val 
              210                 215                 220                 
          Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro 
                          245                 250                 255     
          Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro 
                      260                 265                 270         
          Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val 
                  275                 280                 285             
          Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala 
              290                 295                 300                 
          Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly 
                          325                 330                 335     
          Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro 
                      340                 345                 350         
          Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp 
                  355                 360                 365             
          Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp 
              370                 375                 380                 
          Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His 
          385                 390                 395                 400 
          Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly Lys 
                          405                 410                 
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  579]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Met Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Leu Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro 
          1               5                   10                  15      
          Thr Thr Phe Asn Pro Pro Thr Ser Tyr Trp Val Leu Leu Ala Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Glu Gly Val Ile Ile Gln Gly Thr Asn Asn Thr Asp Arg Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Leu Ile Glu Pro Asn Val Gln Thr Thr Asn Arg Ile Tyr 
              50                  55                  60                  
          Asn Leu Phe Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Val Glu Asn Thr Ser Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gln Trp Lys Phe Ile Asp Val Ser Thr Thr Thr Pro Thr Gly Ser 
                          85                  90                  95      
          Tyr Thr Gln His Gly Pro Leu Phe Ser Thr Pro Lys Leu Tyr Ala Val 
                      100                 105                 110         
          Met Lys Phe Ser Gly Arg Ile Tyr Thr Tyr Ser Gly Thr Thr Pro Asn 
                  115                 120                 125             
          Ala Thr Thr Gly Tyr Tyr Ser Thr Thr Asn Tyr Asp Thr Val Asn Met 
              130                 135                 140                 
          Thr Ser Phe Cys Asp Phe Tyr Ile Ile Pro Arg Asn Gln Glu Glu Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Thr Glu Tyr Ile Asn His Gly Leu Gly Gly Ser Thr Lys Thr Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser Pro Gly Pro Ser Val 
                      180                 185                 190         
          Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu 
              210                 215                 220                 
          Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Gln 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 
                          245                 250                 255     
          Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys 
                      260                 265                 270         
          Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile Ile 
                  275                 280                 285             
          Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 
              290                 295                 300                 
          Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Ser Ile Thr Cys Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn 
                          325                 330                 335     
          Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln Gln 
                      340                 345                 350         
          Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Phe Ser Val Asp Lys 
                  355                 360                 365             
          Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys Ala Val Met His Glu 
              370                 375                 380                 
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Pro Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro 
                          405                 410                 415     
          Val Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Asn Pro Pro Ile Glu 
                      420                 425                 430         
          Tyr Trp Thr Leu Phe Ala Pro Asn Asp Lys Gly Val Val Ala Glu Leu 
                  435                 440                 445             
          Thr Asn Asn Thr Asp Ile Trp Leu Ala Ile Ile Leu Ile Glu Pro Asn 
              450                 455                 460                 
          Val Pro Gln Glu Leu Arg Thr Tyr Thr Ile Phe Gly Gln Gln Val Asn 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Val Ile Glu Asn Thr Ser Gln Thr Lys Trp Lys Phe Ala Asp Phe 
                          485                 490                 495     
          Arg Arg Arg Ser Gln Asn Asp Thr Tyr Val Leu Asn Asp Thr Leu Leu 
                      500                 505                 510         
          Ser Asp Thr Lys Leu Gln Ala Ala Met Lys Tyr Gly Ala Arg Leu Phe 
                  515                 520                 525             
          Thr Phe Thr Gly Asp Thr Pro Asn Ala Ala Pro Gln Glu Tyr Gly Tyr 
              530                 535                 540                 
          Glu Thr Asn Asn Tyr Ser Ala Ile Glu Ile Arg Ser Phe Cys Asp Phe 
          545                 550                 555                 560 
          Tyr Ile Ile Pro Arg Met Pro Arg Glu Val Cys Arg Asn Tyr Ile Asn 
                          565                 570                 575     
          His Gly Leu 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  1206]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  編碼融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          atggatagta ccacagtaga accactgttg gacggcccct accaacctac tacgtttaac       60
          cccccaacct catactgggt gttgctcgcg cctacagtcg agggtgtcat aatccaaggt      120
          acgaataaca ccgatcgctg gttggctact atccttattg aaccgaatgt tcagaccaca      180
          aatcgcattt acaacttgtt cggacagcag gtgacccttt cagttgagaa cacgagtcaa      240
          acccaatgga aatttatcga cgtttctacc acaacaccta ccggcagcta tacgcaacac      300
          ggcccactct ttagcacccc taagctgtat gcagtaatga agtttagcgg acgcatttac      360
          acatactcag gtacaactcc taatgctact acgggctact atagcactac taattatgat      420
          acggtgaata tgacaagttt ctgtgatttc tacatcatcc ccagaaacca ggaggagaaa      480
          tgtactgaat atataaatca tggactgggc ggctcgacca agaccaagcc cccctgtcct      540
          atttgcccgg catgcgagag tccgggtccg tccgtcttta ttttcccccc aaagccaaaa      600
          gatacgctga tgatcagccg caccccccag gtcacatgcg tggttgtaga tgtaagccaa      660
          gaaaatcccg aagtgcagtt ttcctggtat gtcgatggcg tggaggttca cacagcacag      720
          acgcggccga aggaagagca gtttaattcc acgtaccgag tggtgagtgt gctgcctatt      780
          cagcatcagg attggttgaa cggaaaggag ttcaagtgca aggtgaacaa caaagacctg      840
          cccgcaccaa tcactcgcat aatcagcaag gctaagggac agacacgcga gccacaggtg      900
          tacaccctgc caccgcatgc agaagagctg agccgatcca aggtatccat aacctgcctg      960
          gtgatcggat tctacccccc cgatatcgac gtcgagtggc agaggaatgg ccagccggag     1020
          ccagagggca actaccggac cacgcctccg cagcaggatg tcgatggtac atattttctg     1080
          tacagcaaat ttagcgtgga caaggccagt tggcagggcg gcggtatctt ccagtgtgct     1140
          gtcatgcacg aggcactcca caatcattac acccagaaat ccatttcgaa gacgccgggc     1200
          aagtag                                                                1206
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  1203]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  編碼融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          atggatagta ctactatcga accagttttg gatgggccat accagccaac atcgtttaaa       60
          ccaccaaatg actattggat tttattgaac cctactaatc aacagattgt gctggaaggc      120
          acaaacagaa cagatgtttg ggtcgcgctc ctgctaatag agccgaacgt aaccaaccag      180
          tcccgccaat acaccctatt cggtgaaaca aagcaaataa ctgttgaaaa taacacgaat      240
          aagtggaagt tttttgaaat gtttagaaac tcagcaaatg ccgagtttca gcataaacgg      300
          acgttgactt ctgacaccaa gctagcgggt ttccttaaac atggcggccg cgtctggacg      360
          ttccacggag agacccccaa tgccaccacc gactactcta gcacaagcaa tctctcagag      420
          atagaaaccg taatacatac tgagttctat atcatacccc gaagtcaaga gtccaagtgc      480
          aacgagtata tcaatacggg gttgggtgga tctaccaaaa ccaagccccc ctgccctatt      540
          tgtccagcgt gcgagtcgcc gggtcccagt gtatttattt ttccaccgaa gcctaaagac      600
          acacttatga tcagccgcac tccccaagtc acttgtgtgg tagttgacgt gagccaagaa      660
          aatccggaag tccagttttc atggtatgtc gatggggtag aggtgcacac ggctcaaacg      720
          aggcctaaag aagagcaatt caattcaaca tatcgtgtgg tctccgtcct tcctatacag      780
          caccaagatt ggttaaacgg aaaagaattt aaatgtaaag tgaataacaa ggatctgccg      840
          gctcccatta cgcggatcat tagcaaagca aagggacaga cgcgtgagcc tcaggtttac      900
          actctaccgc cacatgcaga ggaactctcg cgaagtaagg tgtctataac gtgtctggta      960
          attgggttct acccgcctga catcgacgtt gagtggcaga gaaacggtca gccggaaccg     1020
          gagggcaact acaggacaac cccccctcag caagatgtag atggcacgta cttcctctat     1080
          tctaagttct cggttgacaa ggcctcatgg cagggcggag ggatcttcca atgcgctgtg     1140
          atgcatgaag cgttacacaa tcactataca caaaagtcca tatccaaaac tccaggaaaa     1200
          tga                                                                   1203
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  1221]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  編碼融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          atgacttatc cgcgccgacg atatcgccga agaaggcata gaccgcggtc tcatctagga       60
          caaatattgc ggcgccgccc atggttggta catcctcgtc atcgataccg ctggcggagg      120
          aagaacggca tctttaatac taggctctcc cgaacgttcg ggtatacagt caaggctact      180
          acagtcacca caccgagttg ggcagtggac atgatgcgtt ttaatatcga cgatttcgta      240
          cctcccggtg ggggtactaa taaaatatcc attcccttcg agtactacag gatacgcaaa      300
          gttaaggtgg aattttggcc ttgttcgcca attacgcaag gcgatagagg ggtcggctcg      360
          accgccgtga ttctcgacga caacttcgtt acaaaagcta ctgcgttaac atatgatcca      420
          tacgtcaact actcttcaag acacacgata cctcaaccat tttcctacca cagccgttat      480
          ttcactccta agcccgtact agactccaca atagactact tccagcctaa taataagaga      540
          aaccagttat ggcttagact tcaaacctca cggaacgttg accacgttgg cctaggcacg      600
          gcctttgaga atagtaaata tgatcaggac tataacatcc gtgtaacgat gtacgtacag      660
          tttcgcgagt ttaaccttaa agaccccccc ctcgagcccg gaggatcaga tagcacgaca      720
          gttgaaccgg tgctggatgg gccatatcag cctaccacgt tcaatccacc aattgaatac      780
          tggaccctct tcgcgccgaa cgacaaaggt gtggtagctg agttaactaa taatactgac      840
          atctggttgg ctatcatcct gattgaacca aatgttccgc aggaattgcg tacctatact      900
          attttcgggc agcaagtaaa ccttgtcata gagaatacaa gtcaaaccaa atggaagttt      960
          gccgatttta gacgtcggtc tcagaatgat acgtatgtcc tgaatgatac gttactatct     1020
          gatacaaaac tgcaagccgc aatgaagtat ggagcaaggc tatttacttt tactggagat     1080
          accccgaatg cggcgccgca agaatatggt tacgaaacga ataactatag cgcaatagag     1140
          attaggtcgt tttgtgactt ctacatcatt cccaggatgc ctcgggaagt gtgccgaaac     1200
          tacataaacc acggtctttg a                                               1221
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  1245]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  編碼融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          atggaatcta cattcaaatc atcaaatata actggtccac acaataacac agtcattgaa       60
          tggagtaatt taatgaattc tgatatttgg ttattgtatc aaaaaccatt ggatataact      120
          gcaccaatca gattattaaa acatggaccg gaaaatcatg ctgatgtagc agcttttgaa      180
          ttatggtatg gtaaagctgg tcataccgtg acatcaatat attattcagc aatatctaat      240
          cctaataata ctgttacgtt aacgtcggat tcattagttc tattttggaa cgaaggtcaa      300
          acgatactgg atacaaagac agtcaatttt aattggaata tgggtggtat attagttaga      360
          ccgtcaagag gtacacgtgt ggacatttgt atgtctgata tggacaatac agatggtact      420
          aattttaatt ggattcaatg gaagcatgag ttcccccgta gtagtagtaa tgctaatgtt      480
          agtatgtatg ttgaatatta tctagcaagt agtgatccat accatgaact caaagagttg      540
          caaagaggcg gctcgaccaa gaccaagccc ccctgtccta tttgcccggc atgcgagagt      600
          ccgggtccgt ccgtctttat tttcccccca aagccaaaag atacgctgat gatcagccgc      660
          accccccagg tcacatgcgt ggttgtagat gtaagccaag aaaatcccga agtgcagttt      720
          tcctggtatg tcgatggcgt ggaggttcac acagcacaga cgcggccgaa ggaagagcag      780
          tttaattcca cgtaccgagt ggtgagtgtg ctgcctattc agcatcagga ttggttgaac      840
          ggaaaggagt tcaagtgcaa ggtgaacaac aaagacctgc ccgcaccaat cactcgcata      900
          atcagcaagg ctaagggaca gacacgcgag ccacaggtgt acaccctgcc accgcatgca      960
          gaagagctga gccgatccaa ggtatccata acctgcctgg tgatcggatt ctaccccccc     1020
          gatatcgacg tcgagtggca gaggaatggc cagccggagc cagagggcaa ctaccggacc     1080
          acgcctccgc agcaggatgt cgatggtaca tattttctgt acagcaaatt tagcgtggac     1140
          aaggccagtt ggcagggcgg cggtatcttc cagtgtgctg tcatgcacga ggcactccac     1200
          aatcattaca cccagaaatc catttcgaag acgccgggca agtag                     1245
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  1740]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  編碼融合蛋白質]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          atggacagca cgacggttga accgctactg gacggaccat accaacctac tacatttaat       60
          cctccaacaa gttattgggt tctgcttgct cctacagtcg agggagtgat aatacagggg      120
          acaaataata cggaccggtg gttagctaca attttgatcg aaccgaatgt gcaaacgact      180
          aatcgcatat acaatttatt cggccaacag gtaaccttaa gtgtggagaa cacctcgcaa      240
          actcaatgga aatttattga tgtctccaca acaaccccca ctggatcgta cactcaacac      300
          gggccgctct tctctacccc taaactatac gcggttatga aatttagtgg gagaatctac      360
          acttattctg gtactacacc caatgcgacc actggttact attcaaccac aaactacgac      420
          actgtcaata tgacgtcctt ttgtgatttt tatataatcc ctaggaatca agaggagaag      480
          tgtacggaat acattaacca tggtctgggg ggcagcacga aaacaaaacc gccatgcccc      540
          atctgccctg cctgcgaaag tcccggccct tccgttttca tttttccccc aaagcccaag      600
          gacacgctaa tgatttccag gacaccacag gtcacgtgtg tggttgtgga tgttagccag      660
          gagaatccgg aagttcagtt ttcgtggtat gtagatgggg tagaagtgca tacagcccag      720
          acgcgaccaa aagaagagca gttcaacagc acctatcgtg ttgtaagtgt attaccgata      780
          caacaccaag actggcttaa tggtaaagag ttcaaatgca aggtaaacaa taaggatcta      840
          ccggcgccta taacgagaat catttcaaag gctaagggac aaacaaggga gccgcaagtg      900
          tacaccttgc ccccccacgc cgaggaattg agtaggtcaa aagtctcgat aacttgtttg      960
          gttatagggt tctatcctcc agacatcgat gtggaatggc aacggaacgg gcaacccgaa     1020
          cctgaaggca actatcgcac taccccaccg caacaggatg tcgacggtac ttattttttg     1080
          tactccaagt tttctgtaga caaggcatca tggcagggcg gaggtatttt tcaatgtgct     1140
          gtcatgcatg aagcactcca caaccattac acccagaaat ctatttcaaa gacacccgga     1200
          aaaggcggat cagggggatc aggaggcgat agcactacgg tcgagccggt tctggacgga     1260
          ccttatcagc ctaccacttt taatcccccg atagaatatt ggaccctctt tgcaccaaac     1320
          gacaagggcg tcgtagcaga gctaacgaac aacaccgata tctggttagc aattatcctc     1380
          atcgagccga acgtaccaca ggaattacgg acgtacacca tcttcgggca gcaagtcaac     1440
          ctcgtgattg aaaacacgtc ccagacgaag tggaaattcg cggacttccg tagacgttcg     1500
          caaaacgata cgtatgtgct gaatgatact cttctatcgg acactaagct tcaggccgct     1560
          atgaaatacg gcgcccgact cttcacattc actggtgata cacccaacgc cgcgccacag     1620
          gagtatggtt acgagaccaa taactatagc gcaatcgaga ttcgctcttt ttgtgatttc     1680
          tatataatac cacgaatgcc ccgtgaggta tgccgaaatt atatcaatca tggtctttga     1740
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  25]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子序列]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          gctagggaya aaattgttga aggta                                             25
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  引子序列]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          attggcaaat ttcctattcc tcc                                               23
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  探針序列]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          atgaatggaa atgaytttca aac                                               23
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  探針序列]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          atgaatggaa ataattttca aac                                               23
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030

Claims (21)

  1. 一種多肽，其包含 輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段，及 免疫球蛋白Fc片段。
  2. 如請求項1之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段經由連接部分連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端， 或其中該免疫球蛋白Fc片段經由該免疫球蛋白Fc片段之N端胺基酸殘基與輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段的C端。
  3. 一種多肽，特定言之如請求項1或2之多肽，其中該多肽為式x-y-z之融合蛋白質，其中 x由輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段組成； y為連接部分；並且 z為免疫球蛋白Fc片段。
  4. 如請求項1或2之多肽，其中該輪狀病毒為豬輪狀病毒， 及/或其中該輪狀病毒係選自由以下組成之群：輪狀病毒A及輪狀病毒C。
  5. 如請求項1或2之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段為輪狀病毒VP8蛋白質之N端延伸之凝集素樣域，其中該N端延伸之長度為1至20個胺基酸殘基，較佳5至15個胺基酸殘基。
  6. 如請求項1或2之多肽，其中該輪狀病毒係選自由以下組成之群：基因型P[7]輪狀病毒、基因型P[6]輪狀病毒及基因型P[13]輪狀病毒。
  7. 如請求項1或2之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段由以下組成或為以下之共同序列：輪狀病毒VP8蛋白質之一部分，特定言之輪狀病毒A VP8蛋白質之一部分， 且其中輪狀病毒VP8蛋白質之一部分之該共同序列較佳可藉由包含以下步驟之方法獲得： 將編碼輪狀病毒VP8蛋白質之一部分的複數個核苷酸序列轉譯為胺基酸序列， 將該等胺基酸序列與已知輪狀病毒VP8蛋白質比對，較佳藉由使用MUSCLE序列比對軟體UPGMB叢聚法及預設空隙罰分參數， 對該等比對序列進行種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白質序列產生鄰近連接種系發生重建，特定言之將該等比對胺基酸序列導入MEGA7軟體以用於種系發生分析且基於輪狀病毒VP8蛋白質序列產生鄰近連接種系發生重建， 使用泊松(Poisson)校正法以及種系發生之自助重抽檢定來計算最優樹(n=100)， 按比例繪製最優樹，其中分支長度等於在總共170個位置上以每個位點之胺基酸取代為單位的進化距離， 將自助重抽叢聚關聯大於70%的節點作為顯著的， 將具有大致10%距離及大於70%的自助重抽叢聚關聯之節點指定為叢聚，以及 選擇叢聚及藉由鑑別該叢聚內每個比對位置之最大頻率來產生共同序列， 且視情況，在其中在比對位置中觀測到相等比例之胺基酸的情況下，基於所報導之流行病學資料以及預定產品保護概況選擇胺基酸殘基。
  8. 如請求項1或2之多肽，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段由與選自由SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5及SEQ ID NO: 6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性之胺基酸序列組成。
  9. 如請求項1或2之多肽，其中該免疫球蛋白Fc片段為由其腸道細胞易受該輪狀病毒感染的物種之基因體編碼之免疫球蛋白Fc片段，輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段衍生自該輪狀病毒， 及/或其中該免疫球蛋白Fc片段較佳為豬IgG Fc片段， 及/或其中該免疫球蛋白Fc片段包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 8組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或特定言之100%序列一致性的胺基酸序列。
  10. 如請求項1或2之多肽，其中該連接部分為長度為1至50個胺基酸殘基之胺基酸序列， 及/或其中該連接部分包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 11組成之群的序列具有至少66%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或特定言之100%序列一致性的胺基酸序列。
  11. 如請求項2之多肽，其中該多肽包含連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端的輪狀病毒VP8蛋白質之另一免疫原性片段，其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳經由連接部分連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端，其中該連接部分特定言之為如請求項10中所指定之連接部分， 或其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段經由輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段之N端胺基酸殘基與該免疫球蛋白Fc片段之C端胺基酸殘基之間的肽鍵連接至該免疫球蛋白Fc片段之C端， 且其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳包含以下或由以下組成：與選自由SEQ ID NO: 2至6組成之群的序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列， 及/或其中輪狀病毒VP8蛋白質之該另一免疫原性片段較佳不同於C端連接至該免疫球蛋白Fc片段之輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段。
  12. 如請求項1或2之多肽，其中該多肽為包含以下或由以下組成之蛋白質：與選自由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15及SEQ ID NO: 16組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或特定言之100%序列一致性的胺基酸序列。
  13. 一種多聚體，其包含複數種如請求項1至12中任一項之多肽或由該複數種多肽構成，且其中該多聚體較佳為由如請求項1至12中任一項之多肽與第二相同多肽形成之同源二聚體。
  14. 一種免疫原性組合物，其包含如請求項1至12中任一項之多肽及/或如請求項13之多聚體。
  15. 一種聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至12中任一項之多肽的核苷酸序列，且其中該聚核苷酸較佳包含與選自由SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21組成之群的序列具有至少70%、較佳至少80%、更佳至少90%、仍更佳至少95%或特定言之100%序列一致性的核苷酸序列。
  16. 一種如請求項1至12中任一項之多肽或如請求項14之免疫原性組合物的用途，其用於製造用於減少或預防個體之由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出或用於治療或預防個體之輪狀病毒感染或用於治療或預防個體之輪狀病毒感染， 及/或用於在個體中誘導針對輪狀病毒之免疫反應的藥劑或疫苗。
  17. 一種如請求項1至12中任一項之多肽或如請求項14之免疫原性組合物的用途，其用於製造用於減少或預防豬崽中由輪狀病毒感染引起之一或多種臨床症狀、死亡或糞便排出的藥劑，其中使用該藥劑之該方法包含 向母豬投與如請求項1至12中任一項之多肽或如請求項14之免疫原性組合物，及 允許該母豬哺乳該豬崽。
  18. 如請求項16或17之用途，其中該一或多種臨床症狀係選自由以下組成之群： 腹瀉， 輪狀病毒拓殖，特定言之腸道輪狀病毒拓殖， 病變，特定言之宏觀病變， 減少之平均每日體重增加，以及 胃腸炎。
  19. 如請求項16或17之用途，其中 該輪狀病毒感染為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒， 該感染輪狀病毒為感染基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒，或 針對輪狀病毒之該免疫反應為針對基因型P[23]輪狀病毒及/或基因型P[7]輪狀病毒的免疫反應。
  20. 如請求項19之用途， 其中該多肽包含基因型P[7]輪狀病毒VP 8蛋白質之免疫原性片段，或其中該免疫原性組合物包含有包含基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白質之免疫原性片段的多肽， 且其中基因型P[7]輪狀病毒VP8蛋白質之該免疫原性片段較佳由與SEQ ID NO: 3之序列具有至少90%、較佳至少95%、更佳至少98%或仍更佳至少99%序列一致性的胺基酸序列組成。
  21. 一種製備如請求項14之免疫原性組合物的方法，其中該方法包含以下步驟： (a)    允許用包含編碼如請求項1至12中任一項之多肽之核酸序列的載體感染培養物中之易感細胞，其中該多肽由該載體表現； (b)    其後特定言之在細胞培養物上清液中回收該多肽，其中細胞碎片較佳經由分離步驟與該多肽分離，該分離步驟較佳地包括經由至少一個過濾器、較佳兩個過濾器之微過濾，其中該至少一個過濾器之孔徑較佳為約1 µm至約20 µm及/或約0.1 µm至約4 µm； (c)    藉由向步驟(b)之混合物中添加二元伸乙基亞胺(BEI)使載體不活化； (d)    藉由添加硫代硫酸鈉至由步驟(c)產生之混合物中來中和該BEI；以及 (e)    藉由利用過濾器之過濾步驟自該混合物移除一部分液體來濃縮由步驟(d)產生之該混合物中之多肽，該過濾器之濾膜之分子量截止值在約5 kDa與約100 kDa之間，較佳在約10 kDa與約50 kDa之間； (f)  及視情況將在步驟(e)之後殘餘之混合物與選自由醫藥學上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組分摻合。
TW110136858A 2020-10-05 2021-10-04 用於針對輪狀病毒疫苗接種之融合蛋白質 TW202229314A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20200161 2020-10-05
EP20200161.6 2020-10-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202229314A true TW202229314A (zh) 2022-08-01

Family

ID=72752390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110136858A TW202229314A (zh) 2020-10-05 2021-10-04 用於針對輪狀病毒疫苗接種之融合蛋白質

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20220160866A1 (zh)
EP (1) EP4225776A1 (zh)
JP (1) JP2023544396A (zh)
KR (1) KR20230082653A (zh)
CN (1) CN116438195A (zh)
AU (1) AU2021356630A1 (zh)
BR (1) BR112023006274A2 (zh)
CA (1) CA3195910A1 (zh)
CL (1) CL2023000836A1 (zh)
CO (1) CO2023003544A2 (zh)
MX (1) MX2023004006A (zh)
TW (1) TW202229314A (zh)
WO (1) WO2022076979A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4504251A1 (en) * 2022-04-05 2025-02-12 Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH Immunogenic composition useful for vaccination against rotavirus
CN114875047A (zh) * 2022-05-27 2022-08-09 江苏三仪生物工程有限公司 一种优化的猪轮状病毒外衣壳蛋白vp4的重组表达及应用
CN114957489B (zh) * 2022-06-20 2023-11-21 甘肃省畜牧兽医研究所 一种猪轮状病毒重组蛋白及其应用
CN115873131B (zh) * 2022-12-13 2024-12-06 深圳市惠安生物科技有限公司 一种病毒抗原检测试剂盒及其应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US382425A (en) 1888-05-08 Brandt
US920197A (en) 1906-04-25 1909-05-04 Benjamin Siegel Garment-display rack.
US2909462A (en) 1955-12-08 1959-10-20 Bristol Myers Co Acrylic acid polymer laxative compositions
US4394448A (en) 1978-02-24 1983-07-19 Szoka Jr Francis C Method of inserting DNA into living cells
US4769331A (en) 1981-09-16 1988-09-06 University Patents, Inc. Recombinant methods and materials
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5505941A (en) 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5364773A (en) 1991-03-07 1994-11-15 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
IE872748L (en) 1986-10-16 1988-04-16 Arjomari Europ Polypeptides derived from the evvelope gene of human¹immunodeficiency virus in recombinant baculovirus infected¹insect cells
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0386185A1 (fr) 1988-07-29 1990-09-12 IntraCel Corporation Procede d'expression genetique de proteines heterologues par des cellules transfectees in vivo
CA2003300A1 (en) 1988-11-21 1990-05-21 Franklin Volvovitz Skin test and test kit for aids
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
ATE277193T1 (de) 1989-03-21 2004-10-15 Vical Inc Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
US5552143A (en) 1989-03-24 1996-09-03 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
US5591439A (en) 1989-03-24 1997-01-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Recombinant cytomegalovirus vaccine
GB9001766D0 (en) 1990-01-25 1990-03-28 Univ Court Of The University O Vaccines
DE69233158T2 (de) 1991-03-07 2004-05-13 Connaught Technology Corp., Greenville Gentechnologisch hergestellter stamm für impfstoffe
US5997878A (en) 1991-03-07 1999-12-07 Connaught Laboratories Recombinant poxvirus-cytomegalovirus, compositions and uses
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
US5846945A (en) 1993-02-16 1998-12-08 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Cytopathic viruses for therapy and prophylaxis of neoplasia
IL108915A0 (en) 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
FR2711670B1 (fr) 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
EP0740704A1 (en) 1994-01-27 1996-11-06 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of dna transcription unit
ATE298370T1 (de) 1994-04-29 2005-07-15 Baxter Healthcare Sa Rekombinante poxviren mit fremdenpolynukleotiden in wichtigen regionen
US5928913A (en) 1995-03-23 1999-07-27 Efstathiou; Stacey Vectors for gene delivery
JP2002512501A (ja) 1996-07-03 2002-04-23 メリアル インコーポレイテッド 外来性ｄｎａを含む組換えイヌアデノウィルス（ｃａｖ）
US6183752B1 (en) 1997-02-05 2001-02-06 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Restenosis/atherosclerosis diagnosis, prophylaxis and therapy
US6187319B1 (en) * 1998-06-01 2001-02-13 University Of Massachusetts Cross-protective rotavirus vaccine
US7670595B2 (en) * 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
US20070253960A1 (en) * 2006-04-28 2007-11-01 Josee Roy Pharmaceutical removal of vascular extensions from a degenerating disc
KR100951118B1 (ko) * 2007-09-21 2010-04-05 주식회사 코미팜 돼지 면역글로불린 지의 에프씨 도메인의 세포 표면 발현용벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포 및 상기숙주세포를 이용한 돼지 질병 관련 바이러스에 대한 백신의제조방법
PL2478678T3 (pl) 2009-09-17 2016-05-31 Digifonica Int Ltd Bezprzerwowe przesyłanie transmisji protokołu internetowego podczas zmian punktów końcowych
DK2814508T5 (da) * 2012-02-14 2017-06-12 Merial Inc Rotavirus-underenhedsvacciner og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf
CN103304642B (zh) * 2013-06-06 2015-01-07 黑龙江八一农垦大学 猪轮状病毒δvp8*亚单位重组蛋白及其应用
US10400015B2 (en) * 2014-09-04 2019-09-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant HIV-1 envelope proteins and their use
EP3981782A1 (en) * 2015-05-21 2022-04-13 Xiamen University Truncated rotavirus vp4 protein and application thereof
WO2017081110A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 Curevac Ag Rotavirus vaccines
CA3046684A1 (en) * 2017-01-30 2018-08-02 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. Porcine coronavirus vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
MX2023004006A (es) 2023-04-26
JP2023544396A (ja) 2023-10-23
KR20230082653A (ko) 2023-06-08
CO2023003544A2 (es) 2023-06-30
CN116438195A (zh) 2023-07-14
CL2023000836A1 (es) 2023-12-01
WO2022076979A1 (en) 2022-04-14
US20220160866A1 (en) 2022-05-26
BR112023006274A2 (pt) 2023-05-09
AU2021356630A9 (en) 2024-10-03
CA3195910A1 (en) 2022-04-14
EP4225776A1 (en) 2023-08-16
AU2021356630A1 (en) 2023-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6589529B1 (en) Rotavirus subunit vaccine
US11786589B2 (en) Human rotavirus strains and vaccines
TW202229314A (zh) 用於針對輪狀病毒疫苗接種之融合蛋白質
CN109803678B (zh) 抗猪细小病毒的疫苗
US9096644B2 (en) Antigen-Norovirus P-domain monomers and dimers, antigen Norovirus P-particle molecules, and methods for their making and use
CN101932336B (zh) 有外来氨基酸插入的pcv2 orf2病毒样颗粒
Bellido et al. Brucella spp. lumazine synthase as a bovine rotavirus antigen delivery system
US20240050555A1 (en) Immunogenic composition useful for vaccination against rotavirus
US20030166139A1 (en) Rotavirus VP6 subunit
US20220160864A1 (en) Fusion protein comprising circoviridae capsid protein, and chimeric virus-like particles composed thereof
AU2004203804B2 (en) Rotavirus subunit vaccine
HK1169426B (zh) 抗原-諾羅病毒p-結構域單體和二聚體，抗原-諾羅病毒p-粒子分子，及其製備和應用方法
HK1169426A (zh) 抗原-諾羅病毒p-結構域單體和二聚體，抗原-諾羅病毒p-粒子分子，及其製備和應用方法