TW202222337A - 一種提高bdnf水平的方法和藥物 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種促進成熟BDNF形成和提高BDNF水平的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖溶酶原途徑激活劑。本發明還涉及用於促進成熟BDNF形成和提高BDNF水平的包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、製品和試劑盒。

Description

一種提高BDNF水平的方法和藥物

本發明涉及一種促進成熟BDNF形成和提高BDNF水平的方法，包括給藥有需要的受試者有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原，以修復損傷神經。

腦源性神經營養因子(BDNF)是神經營養因子(NTF)家族的一員。BDNF主要在中樞神經系統內表達，主要分佈在海馬、杏仁核和皮質，在外周系統心臟、脂肪和骨骼肌也有表達。酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,Trk B)是BDNF的特異性高親和力受體，BDNF可通過與Trk B結合，激發各種信號傳導通路而發揮其特殊的生物學功能。

腦源性神經營養因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶受體B(Trk B)基因突變或功能缺失均會導致機體能量代謝失衡。BDNF可通過調節神經元的生存、生長並維持其功能在學習和記憶中發揮著重要的作用。

本發明研究發現纖溶酶原途徑激活劑例如纖溶酶原可以明顯促進成熟BDNF形成和提高BDNF水平，從而對神經元存活、分化、生長發育起作用。

一方面，本發明涉及以下各項：

1. 一種促進成熟BDNF形成和提高BDNF水平的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖溶酶原途徑激活劑。

2. 項1的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑促進受試者神經組織Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的轉錄或表達。

3. 項1的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑促進患神經組織損傷受試者神經組織Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的轉錄或表達，其中所述神經組織損傷由選自如下的一種或多種疾病或狀況所致：

1）感染，選自如下的一種或多種：腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎和硬膜外膿腫；

2）血管疾病，選自如下的一種或多種：中風、短暫性腦缺血發作(TIA)、蛛網膜下腔出血、硬膜下出血和血腫、和硬膜外出血；

3）神經結構損傷疾病，選自如下的一種或多種：腦或脊髓損傷、貝爾氏麻痺、頸椎病、腕管綜合症、腦或脊髓腫瘤、周圍神經病和格林-巴利綜合症；

4）功能障礙，選自如下的一種或多種：頭痛、癲癇、失眠、神經痛、焦慮和抑鬱症；

5）神經退化性疾病，選自如下的一種或多種：阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症（Huntington's disease，HD）、肌萎縮側索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多發性硬化症（Multiple sclerosis，MS）、脊髓小腦共濟失調和Pick病；

6）運動神經元疾病，選自如下的一種或多種：脊髓性肌萎縮症（SpinalMuscularAtrophy，SMA）、進行性延髓麻痺、進行性肌肉萎縮、和原發性側索硬化；

7）腫瘤，選自如下的一種或多種：腦部腫瘤和腦癌。

4. 項1的方法，其中所纖溶酶原途徑激活劑促進脊髓性肌萎縮症（SpinalMuscularAtrophy，SMA）受試者神經組織Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的轉錄或表達。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑提高受試者損傷神經組織中其它神經營養因子的基因轉錄、蛋白表達和水平。在一些實施方案中，所述神經營養因子包括神經生長因子(NGF)、神經營養因子3(NT-3)、神經營養因子4/5（NT-4/5）、睫狀神經營養因子 (ciliary neurotrophic factor, CNTF)、膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）、類胰島素生長因子I（insulin like-growth factor-1，IGF-1）、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）、 表皮生長因子( epidermal growth factor, EGF)、 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)或血小板源生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)。

在一些實施方案中，本發明涉及一種預防或治療BDNF相關疾病或病症的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖溶酶原途徑激活劑。

在一些實施方案中，所述BDNF相關疾病或病症包括選自如下的任一種：

1）感染，選自如下的任一種：腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎和硬膜外膿腫；

2）血管疾病，選自如下的任一種：中風、短暫性腦缺血發作(TIA)、蛛網膜下腔出血、硬膜下出血和血腫、和硬膜外出血；

3）神經結構損傷疾病，選自如下的任一種：腦或脊髓損傷、貝爾氏麻痺、頸椎病、腕管綜合症、腦或脊髓腫瘤、周圍神經病和格林-巴利綜合症；

4）功能障礙，選自如下的任一種：頭痛、癲癇、失眠、神經痛、焦慮和抑鬱症；

5）神經退化性疾病，選自如下的任一種：阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症（Huntington's disease，HD）、肌萎縮側索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多發性硬化症（Multiple sclerosis，MS）、脊髓小腦共濟失調和Pick病；

6）運動神經元疾病，選自如下的任一種：脊髓性肌萎縮症（SpinalMuscularAtrophy，SMA）、進行性延髓麻痺、進行性肌肉萎縮、和原發性側索硬化；

7）腫瘤，選自如下的任一種：腦部腫瘤和腦癌；

8）周圍神經病、外傷引起的神經損傷，視神經病變、多發性神經炎、帶狀皰疹、顏面神經麻痺、燒傷、褥瘡、角膜潰瘍、放射治療或化療引起的副作用；

9）神經精神障礙、強迫性神經失調、創傷後應激障礙、神經性厭食、中樞神經系統的自身免疫性疾病、長期或短期記憶障礙、兒童學習障礙、閉合性顱腦損傷、注意力缺陷障礙、發作性嗜睡症、睡眠障礙、腦或神經細胞損傷、與AIDS有關的神經功能缺損、以運動和/或發聲性抽搐為特徵的運動和抽搐障礙(例如，妥瑞氏精神障礙、慢性運動或發聲性抽搐障礙、短時抽搐性障礙和刻板型活動障礙)、物質濫用病症(例如，物質依賴、物質濫用以及物質濫用/依賴的後遺症，例如物質誘發的心理障礙、物質戒斷和物質誘發的癡呆或遺忘症)、外傷性腦損傷、耳鳴、共濟失調、肌肉強直(痙攣狀態)、由酒精或物質濫用(例如，搖頭丸、去氧麻黃鹼等)引發的神經毒性、精神發育遲緩或認知缺損(例如，非綜合症X染色體易裂連帶精神發育遲緩、脆性X綜合症、唐氏綜合症、孤獨症)、失語症、貝爾氏麻痺、克-雅氏病、腦炎、年齡相關性黃斑病變、ondine綜合症、WAGR綜合症、聽力損失、雷特綜合症、視神經損傷、糖尿病神經病變、神經移植併發症、周圍神經損傷、肥胖症、代謝綜合症、哮喘、特應性疾病、過敏性炎症、濕疹、神經免疫學疾病或病症和神經耳科疾病或病症、以及與老化和衰老有關的疾病或病症；

10）神經痛，選自如下的任一項：三叉神經痛、慢性疼痛、慢性炎性痛、與關節炎有關的疼痛、纖維肌痛、癌症相關的疼痛、與消化性疾病有關的疼痛、與克羅恩氏病有關的疼痛、與自身免疫性疾病有關的疼痛、與內分泌疾病有關的疼痛、與糖尿病神經病變有關的疼痛、幻肢痛、自發性疼痛、慢性術後疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹後神經痛、AIDS相關的疼痛、I和II型複雜性區域疼痛綜合症、慢性背痛、與脊髓損傷有關的疼痛、與藥物攝入有關的疼痛和復發性急性疼痛、神經性疼痛。

5. 項1-4任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑提高受試者患病神經組織中纖溶酶原水平。

6. 項1-5任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑與一種或多種其它藥物或治療方法聯合施用。

7. 項1-6任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑通過靜脈內、肌肉內、鞘內、鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液形式給藥。

8. 項1-7任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑為纖溶酶原激活途徑的組分，優選纖溶酶原。

9. 項1-8任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑具有選自如下的一項或多項中的用途或活性：促進神經元存活、分化、生長發育；防止神經元受損傷死亡；促進受損傷神經元再生及分化；和維持神經元生存及正常生理功能。

10. 項1-9任一項的方法，其中所述纖溶酶原包含與序列2、6、8、10或12所示胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列，並且具有纖溶酶原活性。

11. 項1-9任一項的方法，所述纖溶酶原為纖溶酶原活性片段、並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性或離胺酸結合活性的蛋白質。

12. 項1-9任一項的方法，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。

13. 項1-9任一項的方法，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示胺基酸序列。

在上述技術方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑選自如下一種或多種：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

在一些具體實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自天然或重組的纖維蛋白溶酶原、人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。在一些具體實施方案中，所述纖溶抑制劑的拮抗劑為天然或重組的PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的拮抗劑，例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體。

在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑與一種或多種其它藥物和/或治療方法聯合施用，優選地，所述治療方法包括細胞療法（例如幹細胞療法）和基因療法，例如反義 RNA、小分子剪接修飾劑。

在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑為纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原包含或具有與序列2、6、8、10或12所示胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列，並且具有纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且具有纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的蛋白質。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性為纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原為包含纖溶酶原活性片段、並且具有纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的蛋白質。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性為纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性片段包含或具有纖溶酶原絲氨酸蛋白酶結構域或稱纖溶酶原蛋白酶結構域。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性片段的胺基酸序列如序列14所示。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原（人全長纖溶酶原）、Lys-纖溶酶原（在第76-77位胺基酸之間切割後的人全長纖溶酶原）、小纖溶酶原(包含Kringle 5（K5）和絲氨酸蛋白酶結構域)、微纖溶酶原(包含絲氨酸蛋白酶結構域)、delta-纖溶酶原（包含Kringle 1和絲氨酸蛋白酶結構域）或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原為人全長纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施方案中，本發明還涉及如下各項的技術方案：

1. 一方面，本發明涉及用於促進受試者神經組織中成熟BDNF形成和/或提高BDNF水平的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物。一方面，本發明還涉及纖溶酶原途徑激活劑在製備用於促進受試者神經組織中成熟BDNF形成和/或提高BDNF水平的藥物中的用途。

2. 項1的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原途徑激活劑促進受試者神經組織中Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的轉錄或表達。

3. 項1或2的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原途徑激活劑提高受試者神經組織中其它神經營養因子的基因轉錄、蛋白表達和水平。

4. 項3的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述神經營養因子包括神經生長因子(NGF)、神經營養因子3(NT-3)、神經營養因子4/5（NT-4/5）、睫狀神經營養因子 (ciliary neurotrophic factor, CNTF)、膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）、類胰島素生長因子I（insulin like-growth factor-1，IGF-1）、 轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）、 表皮生長因子( epidermal growth factor, EGF)、 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)或血小板源生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)。

5. 項1-4任一項的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原途徑激活劑具有選自如下的一項或多項中的用途或活性：促進神經元存活、分化、生長發育；防止神經元受損傷死亡；促進受損傷神經元再生及分化；和維持神經元生存及正常生理功能。

6. 項1-5中任一項的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述受試者為神經或腦組織損傷受試者，其中所述神經或腦組織損傷由選自如下的一種或多種疾病或狀況所致：

1）感染，選自如下的一種或多種：腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎和硬膜外膿腫；

2）血管疾病，選自如下的一種或多種：中風、短暫性腦缺血發作(TIA)、蛛網膜下腔出血、硬膜下出血和血腫、和硬膜外出血；

3）神經結構損傷疾病，選自如下的一種或多種：腦或脊髓損傷、貝爾氏麻痺、頸椎病、腕管綜合症、腦或脊髓腫瘤、周圍神經病和格林-巴利綜合症；

4）功能障礙，選自如下的一種或多種：頭痛、癲癇、失眠、神經痛、焦慮和抑鬱症；

5）神經退化性疾病，選自如下的一種或多種：阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症（Huntington's disease，HD）、肌萎縮側索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多發性硬化症（Multiple sclerosis，MS）、脊髓小腦共濟失調和Pick病；

6）運動神經元疾病，選自如下的一種或多種：脊髓性肌萎縮症（SpinalMuscularAtrophy，SMA）、進行性延髓麻痺、進行性肌肉萎縮、和原發性側索硬化；

7）腫瘤，選自如下的一種或多種：腦部腫瘤和腦癌。

7. 用於預防或治療BDNF相關疾病或病症的纖溶酶原途徑激活劑、包含該纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合、或纖溶酶原途徑激活劑在製備預防或治療BDNF相關疾病或病症的藥物中的用途。

8. 項7的纖溶酶原途徑激活劑、藥物組合物或用途，其中所述BDNF相關疾病或病症包括選自如下的任一種：

1）感染，選自如下的任一種：腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎和硬膜外膿腫；

2）血管疾病，選自如下的任一種：中風、短暫性腦缺血發作(TIA)、蛛網膜下腔出血、硬膜下出血和血腫、和硬膜外出血；

3）神經結構損傷疾病，選自如下的任一種：腦或脊髓損傷、貝爾氏麻痺、頸椎病、腕管綜合症、腦或脊髓腫瘤、周圍神經病和格林-巴利綜合症；

4）功能障礙，選自如下的任一種：頭痛、癲癇、失眠、神經痛、焦慮和抑鬱症；

5）神經退化性疾病，選自如下的任一種：阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症（Huntington's disease，HD）、肌萎縮側索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多發性硬化症（Multiple sclerosis，MS）、脊髓小腦共濟失調和Pick病；

6）運動神經元疾病，選自如下的任一種：脊髓性肌萎縮症（SpinalMuscularAtrophy，SMA）、進行性延髓麻痺、進行性肌肉萎縮、和原發性側索硬化；

7）腫瘤，選自如下的任一種：腦部腫瘤和腦癌；

8）周圍神經病、外傷引起的神經損傷，視神經病變、多發性神經炎、帶狀皰疹、顏面神經麻痺、燒傷、褥瘡、角膜潰瘍、放射治療或化療引起的副作用；

9）神經精神障礙、強迫性神經失調、創傷後應激障礙、神經性厭食、中樞神經系統的自身免疫性疾病、長期或短期記憶障礙、兒童學習障礙、閉合性顱腦損傷、注意力缺陷障礙、發作性嗜睡症、睡眠障礙、腦或神經細胞損傷、與AIDS有關的神經功能缺損、以運動和/或發聲性抽搐為特徵的運動和抽搐障礙(例如，妥瑞氏精神障礙、慢性運動或發聲性抽搐障礙、短時抽搐性障礙和刻板型活動障礙)、物質濫用病症(例如，物質依賴、物質濫用以及物質濫用/依賴的後遺症，例如物質誘發的心理障礙、物質戒斷和物質誘發的癡呆或遺忘症)、外傷性腦損傷、耳鳴、共濟失調、肌肉強直(痙攣狀態)、由酒精或物質濫用(例如，搖頭丸、去氧麻黃鹼等)引發的神經毒性、精神發育遲緩或認知缺損(例如，非綜合症X染色體易裂連帶精神發育遲緩、脆性X綜合症、唐氏綜合症、孤獨症)、失語症、貝爾氏麻痺、克-雅氏病、腦炎、年齡相關性黃斑病變、ondine綜合症、WAGR綜合症、聽力損失、雷特綜合症、視神經損傷、糖尿病神經病變、神經移植併發症、周圍神經損傷、肥胖症、代謝綜合症、哮喘、特應性疾病、過敏性炎症、濕疹、神經免疫學疾病或病症和神經耳科疾病或病症、以及與老化和衰老有關的疾病或病症；

10）神經痛，選自如下的任一項：三叉神經痛、慢性疼痛、慢性炎性痛、與關節炎有關的疼痛、纖維肌痛、癌症相關的疼痛、與消化性疾病有關的疼痛、與克羅恩氏病有關的疼痛、與自身免疫性疾病有關的疼痛、與內分泌疾病有關的疼痛、與糖尿病神經病變有關的疼痛、幻肢痛、自發性疼痛、慢性術後疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹後神經痛、AIDS相關的疼痛、I和II型複雜性區域疼痛綜合症、慢性背痛、與脊髓損傷有關的疼痛、與藥物攝入有關的疼痛和復發性急性疼痛、神經性疼痛。9. 項1-8任一項的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原途徑激活劑提高受試者損傷神經組織中纖溶酶原水平。

10. 項1-9任一項的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原途徑激活劑與一種或多種其它藥物或治療方法聯合施用。

11. 項1-10任一項的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原途徑激活劑通過靜脈內、肌肉內、鞘內、鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液形式給藥。

12. 項1-11任一項的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原途徑激活劑選自如下一種或多種：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

13. 項12的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自天然或重組的纖溶酶原、人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和/或蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。

14. 項12的纖溶酶原途徑激活劑或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶抑制劑的拮抗劑為天然或重組的PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的拮抗劑，例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體。

15. 項1-13任一項的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原途徑激活劑為纖溶酶原。

16. 項15的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，其中所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示的胺基酸序列，或包含與序列2、6、8、10或12所示胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列，並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性和/或離胺酸結合活性。

17. 項15的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，所述纖溶酶原包含選自如下的一項或多項：

1）具有序列14所示的絲氨酸蛋白酶結構域；

2) 與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性並保留蛋白水解活性的絲氨酸蛋白酶結構域；

3) 選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和 Kringle 5中一個或多個的Kringle結構域；和

4）與選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和 Kringle 5中一個或多個具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性並保留離胺酸結合活性的Kringle結構域。

18. 項15的纖溶酶原途徑激活劑、或包含纖溶酶原途徑激活劑的藥物組合物、或用途，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。

在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑以全身或局部方式給藥，例如通過靜脈內、肌肉內、鞘內、鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液形式給藥。在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。在一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000 mg/kg、0.001-800 mg/kg、0.01-600 mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg（以每公斤體重計算）或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800 mg/cm2、0.01-600 mg/cm2、0.1-400 mg/cm2、1-200 mg/cm2、1-100 mg/cm2、 10-100 mg/cm2（以每平方釐米體表面積計算）的劑量，每天、每二天或每三天連續施用。

一方面，本發明還涉及用於上述方法的藥物組合物、藥物、製劑、試劑盒、製品，包含以上所述的纖溶酶原途徑激活劑，例如以上所述的纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述藥物組合物、藥物、製劑包含藥學上可接受的載體和纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒和製品包含一個或多個容器，所述容器中包含所述藥物組合物、藥物或製劑。在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示使用纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原用於上述方法。在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個容器，該容器中含有一種或多種其他藥物。

一方面本發明還涉及用於以上所述用途的纖溶酶原途徑激活劑，例如以上所述的纖溶酶原。

一方面，本發明還涉及治療有效量的上述纖溶酶原途徑激活劑在製備用於上述方法的藥物組合物、藥物、製劑、試劑盒、製品中的用途。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑選自如下的一種或多種：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

在一些具體實施方案中，所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。在一些具體實施方案中，所述纖溶抑制劑的拮抗劑為PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的拮抗劑，例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體。

在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑與一種或多種其它藥物和/或治療方法聯合施用，優選地，所述治療方法包括細胞療法（例如幹細胞療法）和基因療法，例如反義 RNA、小分子剪接修飾劑。

在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑為纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原包含或具有與序列2、6、8、10或12所示胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列，並且具有纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且具有纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的蛋白質。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性為纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原為包含纖溶酶原活性片段、並且具有纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的蛋白質。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性為纖溶酶原的蛋白水解活性。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性片段包含或具有纖溶酶原絲氨酸蛋白酶結構域或稱纖溶酶原蛋白酶結構域。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原活性片段的胺基酸序列如序列14所示。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原（人全長纖溶酶原）、Lys-纖溶酶原（在第76-77位胺基酸之間切割後的人全長纖溶酶原）、小纖溶酶原(包含Kringle 5（K5）和絲氨酸蛋白酶結構域)、微纖溶酶原(包含絲氨酸蛋白酶結構域)、delta-纖溶酶原（包含Kringle 1和絲氨酸蛋白酶結構域）或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些具體實施方案中，所述纖溶酶原為人全長纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原與一種或多種其它藥物和/或治療方法聯合施用。在一些實施方案中，所述纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原通過靜脈內、肌肉內、鞘內、鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液形式給藥。

在一些實施方案中，所述藥物組合物、藥物、製劑包含藥學上可接受的載體和纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒和製品包含一個或多個容器，所述容器中包含所述藥物組合物、藥物或製劑。在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示使用纖溶酶原途徑激活劑，例如纖溶酶原激活途徑的組分，例如纖溶酶原用於上述用途。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個容器，該容器中含有一種或多種其他藥物。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本發明中已經明確公開，就像上述技術方案  已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確公開。

纖維蛋白溶解系統（Fibrinolytic system）也稱纖溶系統，為參與纖維蛋白溶解（纖溶）過程的一系列化學物質組成的系統，主要包括纖維蛋白溶解酶原（纖溶酶原）、纖溶酶、纖溶酶原激活物、纖溶抑制劑。纖溶酶原激活物包括組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）。t-PA是一種絲氨酸蛋白酶，由血管內皮細胞合成。t-PA激活纖溶酶原，此過程主要在纖維蛋白上進行；尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）由腎小管上皮細胞和血管內皮細胞產生，可以直接激活纖溶酶原而不需要纖維蛋白作為輔因子。纖溶酶原（PLG）由肝臟合成，當血液凝固時，PLG大量吸附在纖維蛋白網上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活為纖溶酶，促使纖維蛋白溶解。纖溶酶（PL）是一種絲氨酸蛋白酶，作用如下：降解纖維蛋白和纖維蛋白原；水解多種凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅶ、ⅩⅠ、Ⅱ等；使纖溶酶原轉變為纖溶酶；水解補體等。纖溶抑制物：包括纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）和α2抗纖溶酶（α2-AP）。PAI主要有PAI-1和PAI-2兩種形式，能特異性與t-PA以1：1比例結合，從而使其失活，同時激活PLG。α2-AP由肝臟合成，與PL以1：1比例結合形成複合物，抑制PL活性；FⅩⅢ使α2-AP以共價鍵與纖維蛋白結合，減弱了纖維蛋白對PL作用的敏感性。體內抑制纖溶系統活性的物質：PAI-1，補體C1抑制物；α2抗纖溶酶；α2巨球蛋白。

本發明“纖維蛋白溶酶原途徑激活劑”或“纖溶酶原途徑激活劑”術語涵蓋纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

本發明的術語“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”或“纖溶酶原激活途徑的組分”涵蓋：

1. 纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、delta-纖溶酶原；它們的變體或類似物；

2. 纖維蛋白溶酶以及它們的變體或類似物；和

3. 纖維蛋白溶酶原激活劑，例如tPA和uPA以及包含一個或多個tPA或uPA的結構域(如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的tPA或uPA變體和類似物。

所述的“纖溶抑制劑的拮抗劑”術語涵蓋PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的拮抗劑，例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過添加、刪除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸、仍然具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白質。例如，纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括通過例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個保守性胺基酸取代獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的“纖溶酶原變體”涵蓋包含或具有與序列2、6、8、10或12所示胺基酸序列具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性，並且具有纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的蛋白質。例如本發明的“纖溶酶原變體”可以是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的蛋白質。具體地，本發明纖溶酶原變體包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過保守性胺基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的纖溶酶原可以為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的變體，例如序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原，例如序列2所示的人天然纖溶酶原。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“類似物”包括分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”。例如，纖維蛋白溶酶原的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖溶酶原結構域(例如一個或多個kringle（k）結構域和蛋白水解結構域(或稱絲氨酸蛋白酶結構域，或稱纖溶酶原蛋白酶結構域）的纖維蛋白溶酶原變體和類似物，例如小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纖維蛋白溶酶的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖維蛋白溶酶結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶 “變體”和“類似物”，例如小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纖維蛋白溶酶(delta-plasmin)。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的“變體”或“類似物”是否分別具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以通過本領域已知方法進行檢測，例如，通過基於酶譜法(enzymography)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)和FACS(熒光激活細胞分選方法)通過激活的纖維蛋白溶酶活性水平來衡量，例如可以參照選自如下文獻中記載的方法測量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P. and Ny，T. (1999). Ovulation inplasminogen-deficient mice. Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL, Leung LL, Harpel PC, Nachman RL (November 1984). "Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator". J. Clin. Invest. 74 (5): 1625–33；Gravanis I, Tsirka SE (February 2008). "Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke". Expert Opinion on Therapeutic Targets. 12 (2): 159–70；Geiger M, Huber K, Wojta J, Stingl L, Espana F, Griffin JH, Binder BR (Aug 1989). "Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo". Blood. 74 (2): 722–8.

在本發明的一些實施方案中，本發明的“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”為纖溶酶原，選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的保守突變變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原為來自靈長類動物或齧齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性和/或離胺酸結合活性的保守突變變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的胺基酸序列包含或具有如序列2、6、8、10或12所示的胺基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人全長纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是如序列2所示的人全長纖溶酶原。

“能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物”指能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、鏈激酶、沙蘆普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉諾替普酶、帕米普酶、葡萄球菌激酶。

本發明“纖溶抑制劑的拮抗劑”為拮抗、減弱、封閉、阻止纖溶抑制劑作用的化合物。所述纖溶抑制劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體，或阻斷或下調例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白表達的反義RNA或小RNA，或佔據PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合位點但無PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白功能的化合物”，或 封閉PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合結構域和/或活性結構域的化合物。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統（PA系統）的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質（ECM）的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層黏連蛋白和蛋白聚糖。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)激活形成具有活性的金屬蛋白酶（MMPs）。因此纖溶酶被認為是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原激活劑（tPA ）或尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水平較高，傳統上認為PA系統的調節主要通過PAs的合成和活性水平實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因子和細胞因子。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶（α2-antiplasmin）。PAs的活性同時被uPA 和tPA 的纖溶酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1）抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活劑抑制劑-2（PAI-2）調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)。

纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個胺基酸組成，分子量約為92 kDa。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2 μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潛在來源。纖溶酶原存在兩種分子形式：麩胺酸-纖溶酶原（Glu-plasminogen）和離胺酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端（N-末端）麩胺酸，因此被稱為麩胺酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，麩胺酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為離胺酸-纖溶酶原。與麩胺酸-纖溶酶原相比，離胺酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的離胺酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原為38 kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層黏連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體為活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器。此外，纖溶酶具有激活某些潛在形式的生長因子的能力。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原胺基酸序列（序列4）計算由810個胺基酸組成，分子量約為90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個胺基酸組成（不含有19個胺基酸的信號肽），編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其胺基酸序列如序列2所示。 在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位胺基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原 (δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶（結構）域(也可稱為蛋白水解結構域，或稱纖溶酶原蛋白酶結構域），有文獻報導了delta-纖溶酶原的胺基酸序列（序列8），編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原（Mini-plasminogen）由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸），其胺基酸序列如序列10所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原（Micro-plasminogen）僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其胺基酸序列包括殘基Ala543-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸），也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸），本專利序列參考專利文獻CN102154253A，其胺基酸序列如序列12所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本發明中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義或活性為受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義或活性為受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

本領域技術人員可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的離胺酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段”在本發明中包括1）在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合的活性片段，也稱為離胺酸結合片段，例如包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或 Kringle 5的片段（所述纖溶酶原結構參見Aisina R B , Mukhametova L I . Structure and function of plasminogen/plasmin system[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40(6):590-605所述）；2）在纖溶酶原蛋白中發揮蛋白水解功能的活性片段，例如包含序列14所示的纖溶酶原活性（蛋白水解功能）的片段；3) 在纖溶酶原蛋白中，既具有與底物中的靶序列結合活性(離胺酸結合活性) 又具有纖溶酶原活性（蛋白水解功能）的片段。在本發明的一些實施方案中，所述纖溶酶原為包含序列14所示的纖溶酶原活性片段的蛋白質。在本發明的一些實施方案中，所述纖溶酶原為包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或 Kringle 5的離胺酸結合片段的蛋白質。在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的胺基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。在一些實施方案中，本發明的纖溶酶原包含Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和/或 Kringle 5、或與Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4或 Kringle 5具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性並且仍然具有離胺酸結合活性的蛋白質。

目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg) 、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物（ortholog）” 指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的胺基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性（如酸性，鹼性，疏水性，等）的胺基酸取代接近原本蛋白質中胺基酸序列中的胺基酸。具有類似性質的胺基酸是眾所周知的。例如，精胺酸、組胺酸和離胺酸是親水性的鹼性胺基酸並可以互換。同樣，異白胺酸是疏水胺基酸，則可被亮胺酸，甲硫胺酸或纈胺酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或胺基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN算法的70％至99％的相似度（同源性）。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA算法確定具有60％以上的胺基酸同源性的多肽或酶，若能達 75％以上更好，最好能達85％以上，甚至達90％以上為最佳，並且與天然或接近原本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99% (按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的胺基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的胺基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的胺基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源胺基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫胺酸殘基)的融合物等。

關於參照多肽序列的“胺基酸序列同源性百分數（%）”定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同源性後，且不將任何保守替代視為序列同源性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序列同源性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何算法。然而，為了本發明的目的，胺基酸序列同源性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。

在採用ALIGN-2來比較胺基酸序列的情況中，給定胺基酸序列A相對於給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同源性（或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列B的某一%胺基酸序列同源性的給定胺基酸序列A）如下計算：

分數X/Y 乘 100

其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中的胺基酸殘基的總數。應當領會，在胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%胺基酸序列同源性會不等於B相對於A的%胺基酸序列同源性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%胺基酸序列同源性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2電腦程式獲得的。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。“治療有效量”會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

術語疾病狀態的“治療”包括抑制或阻止所述疾病狀態或其臨床症狀的發展，或減輕所述疾病狀態或症狀，使得所述疾病狀態或其臨床症狀暫時或永久性的退去。

本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS) (其中將序列的C末端胺基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的胺基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis； 第3-284頁於The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield,等 J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963)； Stewart等, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984)；和Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10和Camarero JA等 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相遊離N末端胺與單個受N保護的胺基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的胺基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環黴素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於克隆纖溶酶原編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多已知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色胺酸(trp)啟動子系統，beta-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的纖溶酶原(例如編碼纖溶酶原的多核苷酸)。參見Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等, Immunol. Rev. 89:49 (1986))，以及必需的加工訊息位點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等, J. Immunol. 148:1149 (1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱、親和柱、柱層析、高效液相層析(HPLC)和凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除纖溶酶原以外的大分子等。

藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版，Osol, A. ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘胺酸、谷氨醯胺、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如 TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。

本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，優選活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物，抗心律失常的藥物，治療糖尿病的藥物等。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，奈米顆粒和奈米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981)；Langer, Chem. Tech., 12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919, EP 58,481)，L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯胺酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機制是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過靜脈內，腹膜內，皮下，顱內，鞘內，動脈內(例如經由頸動脈)，肌內來實現本發明藥物組合物的施用。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體等等。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中已知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以為每天約0.0001至2000 mg/kg，或約0.001至500 mg/kg (例如0.02 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.75 mg/kg，10 mg/kg，50 mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1 mg/kg體重或50 mg/kg體重或在1-50 mg/kg的範圍，或至少1 mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10 mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要實時評估治療效果和安全性。

製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療由糖尿病引起的心血管病及其相關病症的本發明纖溶酶原或纖溶酶。所述製品優選包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原/纖溶酶。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述由糖尿病引起的心血管病及其相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

實施例

以下所有實施例中使用的人纖溶酶原來自捐贈者血漿，基於文獻 [1-3]所描述的方法並進行工藝優化，從人捐贈者血漿純化獲得，其中人Lys-纖維蛋白溶酶原（Lys-纖溶酶原）和Glu-纖維蛋白溶酶原（Glu-纖溶酶原）＞98%。

實施例1纖溶酶原促進Pro-BDNF在正常小鼠腦勻漿中裂解

取11~12週齡、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠4隻，處死後取整個腦並秤重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液即腦勻漿液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設為1空白組、2空白對照組、3溶劑對照組、4纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶劑對照組加入21.5μL Pro-BDNF（上海強耀，定製錶達人Pro-BDNF，1.0mg/mL）、4.6μL溶劑溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.μL Pro-BDNF（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入100μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比為3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷卻後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件為30V跑30min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比為5:2:13的混合液中）染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在生物分子成像儀下拍照並定量掃描分析。

BDNF是一類分子量為12.3 kD 的鹼性蛋白質，由119 個胺基酸殘基構成，並含有3 對二硫鍵，在體內以二聚體的形式存在，以BDNF前體的形式合成，BDNF前體（Pro-BDNF）可經酶解作用裂解形成成熟的BDNF。文獻報導Pro-BDNF與其裂解形成的成熟的BDNF具有相反的作用。Pro-BDNF促進神經細胞凋亡，降低神經突觸可塑性[1]。成熟的BDNF及其受體廣泛分佈於中樞神經系統內，在中樞神經系統發育過程中，對神經元存活、分化、生長發育起重要作用，並能防止神經元受損傷死亡，改善神經元的病理狀態，促進受損傷神經元再生及分化等生物效應，而且也是成熟的中樞及周圍神經系統的神經元維持生存及正常生理功能所必須的[2]。

結果顯示，在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）（圖1）。提示纖溶酶原能夠促進正常小鼠腦勻漿中Pro-BDNF裂解。

實施例2纖溶酶原促進Pro-BDNF在正常小鼠腦勻漿中裂解形成成熟的BDNF

取11~12週齡、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠4隻，處死後取整個腦部並秤重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液即腦勻漿液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設為1空白組、2空白對照組、3溶劑對照組、4纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶劑對照組加入21.5μL Pro-BDNF（上海強耀，定製錶達人Pro-BDNF，1.0mg/mL）、4.6μL溶劑溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.μL Pro-BDNF（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入100μL 0.01%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備10%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比為3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷卻後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件為30V跑45 min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件為15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗人BDNF抗體（Boster Biological Technology, PB9075）室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析。

結果顯示，在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極顯著（**代表P＜0.01）（圖2）。提示纖溶酶原能夠促進正常小鼠腦勻漿中Pro-BDNF裂解。

實施例3纖溶酶原促進Pro-BDNF在帕金森氏症模型小鼠腦勻漿中裂解

取11~12週齡、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠4隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森氏症模型[5]。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度為5mg/mL。造模完成後即造模第6天，所有小鼠進行曠場實驗，鑒定造模成功。所有小鼠處死後取整個腦部並秤重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液即腦勻漿液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設為1空白組、2空白對照組、3溶劑對照組、4纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶劑對照組加入21.5μL Pro-BDNF（上海強耀，定製錶達人Pro-BDNF，1.0mg/mL）、4.6μL溶劑溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.μL Pro-BDNF（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入100μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比為3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷卻後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件為30V跑45min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比為5:2:13的混合液中）染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在生物分子成像儀下拍照並定量掃描分析。

結果顯示，在帕金森氏症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）（圖3）。提示纖溶酶原能夠促進帕金森氏症模型小鼠腦勻漿中Pro-BDNF裂解。

實施例4纖溶酶原促進Pro-BDNF在帕金森氏症模型小鼠腦勻漿中裂解形成成熟的BDNF

取11~12週齡、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠8隻，造模前1天秤重，根據體重隨機分為2組，空白對照組4隻，模型組4隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森氏症模型[5]。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度為5mg/mL。造模完成後即造模第6天，所有小鼠進行曠場實驗，鑒定造模成功。所有小鼠處死後取整個腦部並秤重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液即腦勻漿液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設為1空白組、2空白對照組、3溶劑對照組、4纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶劑對照組加入21.5μL Pro-BDNF（上海強耀，定製錶達人Pro-BDNF，1.0mg/mL）、4.6μL溶劑溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.μL Pro-BDNF（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入100μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備10%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比為3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷卻後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件為30V跑45min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件為15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗人BDNF抗體（Boster Biological Technology, PB9075）室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析。

結果顯示，在帕金森氏症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異顯著（*代表P＜0.05，***表示P＜0.001）；纖溶酶原組BDNF的量明顯高於溶劑對照組，差異極為顯著（圖4）。提示纖溶酶原能夠促進帕金森氏症模型小鼠腦勻漿液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。

實施例5在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原促進Pro-BDNF裂解

選取11週齡B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799 Vas/ Mmjax（FAD）（Stock Number：034840）（簡稱FAD）小鼠各4隻，處死後取整個腦組織，秤重後置於 Eppendorf (EP)管中，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031），4℃下勻漿（1min/次，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，15min），取上清腦勻漿液於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設為1空白對照組、2溶劑對照組、3纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液；溶劑對照組加入21.5μL Aβ40（上海強耀，04010011521，1.0mg/mL）、4.6μL溶劑溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿液；纖溶酶原組加入21.5mL Aβ40（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比為3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷卻後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件為30V跑45min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比為5:2:13的混合液中）染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在生物分子成像儀下拍照並定量掃描分析。

結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）（圖5）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿中Pro-BDNF裂解。

實施例6 在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原促進Pro-BDNF裂解形成成熟的BDNF

選取11週齡B6SJLTg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799 Vas/ Mmjax（FAD）（Stock Number：034840）（簡稱FAD）小鼠各4隻，處死後取整個腦組織，秤重後置於 Eppendorf (EP)管中，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031），4℃下勻漿（1min/次，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，15min），取上清腦勻漿液於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設為1空白對照組、2溶劑對照組、3纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液；溶劑對照組加入21.5μL Aβ40（上海強耀，04010011521，1.0mg/mL）、4.6μL溶劑溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿液；纖溶酶原組加入21.5mL Aβ40（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿液。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.01%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比為3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷卻後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件為30V跑45min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件為15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗人BDNF抗體（Boster Biological Technology, PB9075）室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析條帶光密度。

結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極為顯著（**代表P＜0.01，***表示P＜0.001）；纖溶酶原組BDNF的量明顯高於溶劑對照組，差異極顯著（圖6）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。

實施例7給予纖溶酶原促進SMA小鼠腦組織中纖溶酶原水平增加

取出生3或7天的FVB.Cg-Grm7Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1MsdTg(SMN2*delta7) 4299Ahmb/J基因突變小鼠（簡稱SMNΔ7 SMA小鼠）（購自Jackson Laboratory實驗室， 譜系號：005025）8隻和同齡的野生型小鼠4隻，SMNΔ7 SMA小鼠隨機分為溶劑組和給藥組，每組各4隻，4隻野生型小鼠作為空白對照組。給藥組小鼠按照60mg/kg/天腹腔注射纖溶酶原，濃度為10mg/ml，溶劑組和空白對照組小鼠按照6 ml/kg/天腹腔注射溶劑，均給藥到出生後11天。在小鼠出生後11天給藥2小時後處死解剖所有小鼠，取材部分腦組織，勻漿後按照Human Plasminogen ELISA Kit（廠家：AssayMax，貨號：EP1200-1）說明書操作進行檢測。以人纖溶酶原工作標準品作為內標，對每個樣本的濃度進行濃度標定，標定後的濃度除以總蛋白濃度計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的量並進行統計分析。

SMNΔ7 SMA小鼠的SMN1基因純合突變並且表達人的SMN2基因，該小鼠臨床及病理表現類似於人類脊髓性肌萎縮（SMA）。

結果顯示，空白對照組野生型小鼠腦組織纖溶酶原水平為1.18±1.54ng/mg；溶劑組小鼠腦組織纖溶酶原水平為1.49±1.59ng/mg，與空白對照組相比，溶劑組小鼠腦組織纖溶酶原水平未見明顯變化；給藥組SMA轉基因小鼠纖溶酶原水平為12.09±5.32ng/mg，約為溶劑組的8倍（圖7）。提示補充纖溶酶原可以促進SMA疾病條件下血-腦屏障對纖酶原通透性增加，纖溶酶原可通過血-腦屏障，達到腦部。

實施例8給予纖溶酶原促進SMA小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取出生3或7天的SMNΔ7 SMA小鼠8隻和同齡的野生型小鼠4隻和同齡的SMA雜合小鼠3隻，SMNΔ7 SMA小鼠隨機分為溶劑組和給藥組，每組各4隻，4隻野生型小鼠作為空白對照組，3隻SMA雜合小鼠作為正常給藥對照組。給藥組和正常給藥對照組小鼠按照60mg/kg/天腹腔注射纖溶酶原，濃度為10mg/ml，溶劑組和空白對照組小鼠按照6 ml/kg/天腹腔注射溶劑，均給藥到出生後11天。在小鼠出生後11天給藥2小時後處死解剖所有小鼠，取材部分脊髓組織，勻漿後行纖溶酶原ELISA檢測。

結果顯示，空白對照組野生型小鼠脊髓纖溶酶原水平為8.51±9.51ng/mg。溶劑組SMA轉基因小鼠脊髓纖溶酶原水平為19.95±4.06ng/mg，相比於空白對照組稍有增加。正常給藥對照組纖溶酶原水平為13.03±7.51ng/mg。給藥組SMA轉基因小鼠脊髓纖溶酶原水平為62.33±17.37ng/mg，約為溶劑組小鼠的3倍，且給藥組和溶劑組兩組比較統計分析P值為0.029；約為正常給藥對照組的4.8倍，且給藥組和正常給藥對照組比較統計分析P值為0.026（圖8）。說明給藥纖溶酶原可促進SMA條件下血-脊髓屏障對纖溶酶原通透性增加，纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，達到脊髓部位。

實施例9給予纖溶酶原促進LPS誘導的肺炎SMA雜合小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取SMA雜合性小鼠（購自Jackson Laboratory ，譜系號：005025）9隻，根據體重隨機分為2組，空白對照組3隻和模型組6隻。所有小鼠使用舒泰50麻醉後，模型組小鼠氣管滴注2.5mg/ml的細菌脂多糖（LPS）溶液進行造模，造模劑量5mg/kg，空白對照組小鼠管滴注2ml/kg生理鹽水。造模2小時後，模型組所有小鼠根據體重隨機分為兩組，溶劑組3隻，給藥組3隻；分組完成後開始給藥，給藥組小鼠按照50mg/kg/隻尾靜脈注射纖溶酶原，溶劑組小鼠及空白對照組小鼠按照5ml/kg/隻尾靜脈注射溶劑。給藥2小時後處死所有小鼠解剖取材脊髓組織，勻漿後按照Human Plasminogen ELISA Kit（廠家：AssayMax，貨號：EP1200-1）說明書操作進行檢測。以人纖溶酶原工作標準品作為內標，對每個樣本的濃度進行濃度標定，標定後的濃度除以總蛋白濃度計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的量並進行統計分析。

結果顯示，空白對照組小鼠脊髓組織勻漿纖溶酶原水平為2.70±0.74ng/mg；氣管滴注LPS後，溶劑組小鼠脊髓組織勻漿纖溶酶原水平為3.17±1.51ng/mg，與空白對照組相比未見明顯變化；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，纖溶酶原水平為121.16±44.68ng/mg，約為溶劑組小鼠的38.2倍（圖9）。提示補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠血-脊髓屏障對纖溶酶原的通透性增加，該條件下纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，進入中樞神經系統。

實施例10給予纖溶酶原促進LPS誘導的肺炎SMA雜合小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取SMA雜合性小鼠（購自Jackson Laboratory ，譜系號：005025）9隻，根據體重隨機分為2組，空白對照組3隻和模型組6隻。所有小鼠使用舒泰50麻醉後，模型組小鼠氣管滴注2.5mg/ml的細菌脂多糖（LPS）溶液進行造模，造模劑量5mg/kg，空白對照組小鼠管滴注2ml/kg生理鹽水。造模2小時後，模型組所有小鼠根據體重隨機分為兩組，溶劑組3隻，給藥組3隻；分組完成後開始給藥，給藥組小鼠按照50mg/kg/隻尾靜脈注射纖溶酶原，溶劑組小鼠及空白對照組小鼠按照5ml/kg/隻尾靜脈注射溶劑。給藥2小時後處死所有小鼠解剖取材脊髓組織，勻漿後進行纖溶酶原的酶促反應動力學檢測。依次向酶標板（廠家：NUNC，貨號：446469）中加入85μL/孔七個不同濃度點的標準品溶液、空白、樣本，然後每孔加入15μL 20mM S-2251溶液（廠家：Chromogenix，貨號：82033239）和100ng/μL uPA溶液的混合物（臨用前按體積比2：1混合），於37℃溫育。從反應0min開始，每隔5min在多功能酶標儀中讀取A405吸光值，至反應90min止。所有的反應以時間為和吸光值進行直線擬合，得出直線的斜率為標準品/樣本的反應速率（ΔA405/min）。最後以標準品的效價值和ΔA405/min作標準曲線進行計算所測樣本效價。計算出每個樣本單位總蛋白量中纖溶酶原的活性。

結果顯示，空白對照組小鼠脊髓組織纖溶酶原水平為0.00011±4.51x10-5 U/mg；氣管滴注LPS後，溶劑組小鼠脊髓纖溶酶原水平為0.00010±9.72 x10-6 U/mg，與空白對照組相比，未見明顯變化；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，纖溶酶原水平增加至0.00034±1.04 x10-4 U/mg，與溶劑相比，統計分析P值為0.058（圖10）。提示補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠血-脊髓屏障對纖溶酶原的通透性增加，纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，在脊髓處聚集。

實施例11給予纖溶酶原促進LPS誘導的肺炎小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取C57雄性小鼠15隻，秤重後隨機分為2組，空白對照組小鼠3隻，模型組小鼠12隻。所有模型組小鼠使用舒泰50麻醉後，氣管滴注2.5mg/ml的LPS溶液進行造模，造模劑量5mg/kg。造模2小時後，模型組所有小鼠根據體重分為四組，溶劑組3隻，給藥A組3隻、給藥B組3隻、給藥C組3隻。分組完成後開始給藥，給藥A組小鼠按照50mg/kg/隻尾靜脈注射纖溶酶原，給藥B組小鼠按照17mg/kg/隻尾靜脈注射纖溶酶原，給藥C組小鼠按照6mg/kg/隻尾靜脈注射纖溶酶原。溶劑組小鼠及空白對照組小鼠按照5ml/kg/隻尾靜脈注射溶劑。給藥2小時後解剖取材脊髓組織，行特異性人纖溶酶原ELISA檢測。

脊髓組織勻漿液中纖溶酶原水平ELISA檢測結果顯示，空白對照組的脊髓組織Plg含量為7.71±0.51ng/mg，溶劑組小鼠脊髓組織Plg含量14.04±3.25ng/mg，氣管滴注LPS後，小鼠脊髓纖溶酶原水平有所增加；給藥A組小鼠補充50mg/kg （每隻小鼠約1mg）的纖溶酶原後，脊髓組織纖溶酶原水平為85.10±11.59ng/mg，約為溶劑組小鼠的6.1倍；給藥B組小鼠補充17mg/kg（每隻小鼠約0.34mg）的纖溶酶原後，脊髓組織纖溶酶原水平為77.90±21.39ng/mg，約為溶劑組小鼠的5.5倍；給藥C組小鼠補充6mg/kg（每隻小鼠約0.1mg）的纖溶酶原後，脊髓組織纖溶酶原水平為64.00±19.63ng/mg，約為溶劑組小鼠的4.6倍（圖11）。提示1）補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎小鼠血腦屏障對纖溶酶原的通透性增加，纖溶酶原可穿過血腦屏障，在脊髓組織富集；2）纖溶酶原在脊髓中的富集具有劑量依賴效應，在6mg/kg至50mg/kg給藥劑量範圍內，脊髓中纖溶酶原富集水平隨纖溶酶原施予劑量增加而增加。

實施例12給予纖溶酶原促進LPS誘導的肺炎小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取6-9周C57雄性小鼠54隻，秤重後隨機分為2組，空白對照組小鼠15隻，模型組小鼠39隻。所有小鼠使用舒泰50麻醉後，模型組小鼠氣管滴注2.5mg/ml的LPS溶液進行造模，造模劑量5mg/kg，空白組小鼠氣管滴注生理鹽水2ml/kg。所有模型組小鼠LPS造模2小時後，根據體重分為三組，LPS+溶劑組15隻，LPS+50mg/kg纖溶酶原組12隻、LPS+6mg/kg纖溶酶原組12隻。空白組小鼠根據體重隨機分為2組，空白+溶劑組3隻，空白+50mg/kg 纖溶酶原組12隻，並開始給藥操作。LPS+50mg/kg纖溶酶原組和空白+50mg/kg 纖溶酶原組按照50mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原，LPS+溶劑組和空白+溶劑組按照5ml/kg/隻尾靜脈注射給予溶劑，LPS+6mg/kg纖溶酶原組按照6mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原。3隻空白+溶劑組和3隻LPS+溶劑組給藥後0小時處死，在2、6、12和24小時每個時間點每組小鼠隨機處死3隻。處死後取材脊髓，勻漿後行特異性人纖溶酶原ELISA法檢測

結果顯示，假手術+溶劑組小鼠和LPS+溶劑組小鼠未接受纖溶酶原注射，在0、2、6、12和24小時，脊髓組織勻漿液中均未檢測到人纖溶酶原。假手術+50mg/kg纖溶酶原組和LPS+50mg/kg纖溶酶原組小鼠接受50mg/kg體重的纖溶酶原注射，注射2小時後脊髓組織勻漿中人纖溶酶原均有顯著升高，注射6-12小時後纖溶酶原水平明顯降低，24小時基本檢測不到人纖溶酶原。LPS+6mg/kg纖溶酶原組小鼠接受6mg/kg體重的纖溶酶原注射，注射2小時後脊髓組織勻漿中檢測到纖溶酶原水平顯著高於LPS+溶劑組小鼠，顯著低於LPS+50mg/kg纖溶酶原組小鼠（圖12）。

該結果表明1）在生理和病理情況下施予纖溶酶原後，可促進纖溶酶原穿過血腦屏障，在脊髓組織中富集；2）靜脈注射纖溶酶原於正常小鼠體內，脊髓組織纖溶酶原水平顯著增加；3）纖溶酶原在脊髓富集具有時間依賴效應，先升高，2至12小時逐漸降低，在12至24小時幾乎全部完全代謝；4）纖溶酶原在脊髓富集具有劑量依賴效應，施予劑量越高，脊髓組織中纖溶酶原水平越高。

實施例13給予纖溶酶原促進LPS誘導的肺炎小鼠腦組織中纖溶酶原水平增加

取6-9周C57雄性小鼠54隻，秤重後隨機分為2組，空白對照組小鼠15隻，模型組小鼠39隻。所有小鼠使用舒泰50麻醉後，模型組小鼠氣管滴注2.5mg/ml的LPS溶液進行造模，造模劑量5mg/kg，空白組小鼠氣管滴注生理鹽水2ml/kg。所有模型組小鼠LPS造模2小時後，根據體重分為三組，LPS+溶劑組15隻，LPS+50mg/kg纖溶酶原組12隻、LPS+6mg/kg纖溶酶原組12隻。空白組小鼠根據體重隨機分為2組，空白+溶劑組3隻，空白+50mg/kg 纖溶酶原組12隻，並開始給藥操作。LPS+50mg/kg纖溶酶原組和空白+50mg/kg 纖溶酶原組按照50mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原，LPS+溶劑組和空白+溶劑組按照5ml/kg/隻尾靜脈注射給予溶劑，LPS+6mg/kg纖溶酶原組按照6mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原。3隻空白+溶劑組和3隻LPS+溶劑組給藥後0小時處死，在2、6、12和24小時每個時間點每組小鼠隨機處死3隻。處死後取材脊髓，勻漿後行特異性人纖溶酶原ELISA法檢測。

結果顯示，空白+溶劑組小鼠和LPS+溶劑組小鼠未接受纖溶酶原注射，在0、2、6、12和24小時，腦組織勻漿液中均未檢測到人纖溶酶原。空白+50mg/kg纖溶酶原組和LPS+50mg/kg纖溶酶原組小鼠接受50mg/kg體重的纖溶酶原注射，注射2小時後腦組織勻漿中檢測到人纖溶酶原均有顯著升高，注射6-12小時後纖溶酶原水平明顯降低，24小時基本檢測不到人纖溶酶原。LPS+6mg/kg纖溶酶原組小鼠接受6mg/kg體重的纖溶酶原注射，注射2小時後腦組織勻漿中檢測到纖溶酶原水平顯著高於LPS+溶劑組小鼠，顯著低於LPS+50mg/kg纖溶酶原組小鼠（圖13）。

該結果表明1）在生理和病理情況下施予纖溶酶原後，可促進纖溶酶原穿過血腦屏障，在腦組織富集；2）靜脈注射纖溶酶原於正常小鼠體內，腦組織纖溶酶原水平顯著增加；3）纖溶酶原在腦組織富集具有時間依賴效應，先升高，2至12小時逐漸降低，在12至24小時幾乎全部完全代謝；4）纖溶酶原在腦組織富集具有劑量依賴效應，施予劑量越高，腦組組織中纖溶酶原水平越高。

實施例14給予纖溶酶原促進SOD1-G93A小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取15週齡B6.Cg-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉基因小鼠(以下簡稱SOD1-G93A小鼠) （購自Jackson Laboratory ，譜系號：004435）27隻隨機為分三組，溶劑組3隻，50mg/kg給藥組12隻，6mg/kg給藥組12隻。溶劑組小鼠尾靜脈注射給予溶劑，50mg/kg 纖溶酶原組按照50mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原，6mg/kg纖溶酶原組按照6mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原。溶劑組小鼠在給藥後2小時處死，剩餘小鼠在給藥後2、6、12、24小時每組小鼠取3隻處死。處死後取材脊髓，勻漿後行特異性人纖溶酶原ELISA法檢測。

SOD1-G93A小鼠過表達人突變SOD1基因，該小鼠臨床及病理表現與人肌萎縮側索硬化症相似。

SOD1-G93A小鼠脊髓ELISA水平檢測結果顯示，尾靜脈注射給予50mg/kg和6mg/kg纖溶酶原，SOD1-G93A小鼠脊髓纖溶酶原水平明顯增加，且50mg/kg給藥組纖溶酶原水平明顯高於6mg/kg組。纖溶酶原水平在給藥後2小時後逐漸降低，在12至24小時基本代謝完全（圖14）。

該結果表明1）施予生理劑量水平的纖溶酶原能夠穿過SOD1-G93A小鼠血腦屏障，在脊髓組織富集；2）纖溶酶原在脊髓的富集具有劑量依賴效應，纖溶酶原施予劑量越高，富集的越多；3）纖溶酶原在脊髓的富集具有時間依賴效應，先升高，在2至12小時逐漸降低，在12至24小時基本完全代謝。

實施例15給予纖溶酶原促進SOD1-G93A小鼠腦組織中纖溶酶原水平增加

取15週齡SOD1-G93A小鼠27隻隨機為分三組，溶劑組3隻，50mg/kg給藥組12隻，6mg/kg給藥組12隻。溶劑組小鼠尾靜脈注射給予溶劑，50mg/kg 纖溶酶原組按照50mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原，6mg/kg纖溶酶原組按照6mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原。溶劑組小鼠在給藥後2小時處死，剩餘小鼠在給藥後2、6、12、24小時每組小鼠取3隻處死。處死後取材腦，勻漿後行特異性人纖溶酶原ELISA法檢測。

SOD1-G93A小鼠腦ELISA水平檢測結果顯示，尾靜脈注射給予50mg/kg和6mg/kg纖溶酶原，SOD1-G93A小鼠腦組織纖溶酶原水平明顯增加，且50mg/kg給藥組纖溶酶原水平明顯高於6mg/kg給藥組。纖溶酶原水平在給藥後2小時後逐漸降低，在12至24小時基本代謝完全（圖15）。

該結果表明1）施予生理劑量水平的纖溶酶原能夠穿過SOD1-G93A小鼠血腦屏障，在腦組織富集；2）纖溶酶原在腦組織的富集具有劑量依賴效應，纖溶酶原施予劑量越高，富集的越多；3）纖溶酶原在腦組織的富集具有時間依賴效應，先升高，在2至12小時逐漸降低，在12至24小時基本完全代謝。

實施例16給予纖溶酶原促進FAD小鼠脊髓組織中纖溶酶原水平增加

取15週齡B6-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/Mmjax (以下簡稱FAD小鼠) （購自Jackson Laboratory ，譜系號：034840）27隻隨機為分三組，溶劑組3隻，50mg/kg給藥組12隻，6mg/kg給藥組12隻。溶劑組小鼠尾靜脈注射給予溶劑，50mg/kg 纖溶酶原組按照50mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原，6mg/kg纖溶酶原組按照6mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原。溶劑組小鼠在給藥後2小時處死，剩餘小鼠在給藥後2、6、12、24小時每組小鼠取3只處死。處死後取材脊髓，勻漿後行特異性人纖溶酶原ELISA法檢測。

FAD小鼠為阿爾茲海默病研究中常用的動物模型。

脊髓組織勻漿ELISA水平檢測結果顯示，尾靜脈注射給予50mg/kg和6mg/kg纖溶酶原，FAD小鼠脊髓組織纖溶酶原水平明顯增加，且50mg/kg給藥組纖溶酶原水平明顯高於6mg/kg給藥組。纖溶酶原水平在給藥後2小時後逐漸降低，在12至24小時基本代謝完全（圖16）。

該結果表明1）施予生理劑量水平的纖溶酶原能夠穿過FAD小鼠血腦屏障，在脊髓組織富集；2）纖溶酶原在脊髓組織的富集具有劑量依賴效應，纖溶酶原施予劑量越高，富集的越多；3）纖溶酶原在脊髓組織的富集具有時間依賴效應，先升高，在2至12小時逐漸降低，在12至24小時基本完全代謝。

實施例17給予纖溶酶原促進FAD小鼠腦組織中纖溶酶原水平增加

取15週齡FAD小鼠27只隨機為分三組，溶劑組3隻，50mg/kg給藥組12隻，6mg/kg給藥組12隻。溶劑組小鼠尾靜脈注射給予溶劑，50mg/kg 纖溶酶原組按照50mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原，6mg/kg纖溶酶原組按照6mg/kg體重尾靜脈注射給予纖溶酶原。溶劑組小鼠在給藥後2小時處死，剩餘小鼠在給藥後2、6、12、24小時每組小鼠取3隻處死。處死後取材腦，勻漿後行特異性人纖溶酶原ELISA法檢測。

腦組織勻漿ELISA水平檢測結果顯示，尾靜脈注射給予50mg/kg和6mg/kg纖溶酶原，FAD小鼠腦組織纖溶酶原水平明顯增加，且50mg/kg給藥組纖溶酶原水平明顯高於6mg/kg給藥組。纖溶酶原水平在給藥後2小時後逐漸降低，在12至24小時基本代謝完全（圖17）。

該結果表明1）施予生理劑量水平的纖溶酶原能夠穿過FAD小鼠血腦屏障，在腦組織富集；2）纖溶酶原在腦組織的富集具有劑量依賴效應，纖溶酶原施予劑量越高，富集的越多；3）纖溶酶原在腦組織的富集具有時間依賴效應，先升高，在2至12小時逐漸降低，在12至24小時基本完全代謝。

實施例18給予纖溶酶原促進SOD1-G93A小鼠脊髓組織中BDNF基因轉錄

取12週齡的雌性SOD1-G93A小鼠，開始詳細觀察發病情況，發病後腿顫抖時開始觀察記錄，記錄每隻小鼠發病時間。發病14天後的SOD1-G93A小鼠根據體重及行為學檢測，隨機進行分為兩組，一組為給藥組9隻，另一組為溶劑組9隻。另取同週齡的野生型（C57）小鼠5隻作為正常對照組。給藥組小鼠按照50mg/kg/天尾靜脈注射纖溶酶原，溶劑組和正常對照組小鼠按照5mL/kg /天尾靜脈注射溶劑。連續給藥29天進行解剖取材脊髓組織。進行所有BDNF基因轉錄產物 qPCR檢測。

結果顯示，給藥組小鼠脊髓組織BDNF基因轉錄水平明顯高於溶劑組，且統計差異P值為0.05（圖18）。表明纖溶酶原能夠促進SOD1-G93A小鼠脊髓組織中BDNF基因轉錄。

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[4]Komoly S . Experimental demyelination caused by primary oligodendrocyte dystrophy. Regional distribution of the lesions in the nervous system of mice [corrected].[J]. ideggyógyászati szemle, 2005.

無

圖1A-B 在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用。A為SDS-PAGE成像圖片，B為SDS-PAGE條帶定量分析結果。結果顯示，在正常小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）。提示纖溶酶原能夠促進正常小鼠腦勻漿中重組人Pro-BDNF裂解。

圖2 A-B在正常小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用。A為Western blot成像圖片，B為Western blot中Pro-BDNF條帶光密度(OD)值分析結果。結果顯示，在正常小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極顯著（**代表P＜0.01）。提示纖溶酶原能夠促進正常小鼠腦勻漿中重組人Pro-BDNF裂解。

圖3A-B 在帕金森氏症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用，A為SDS-PAGE成像圖片，B為SDS-PAGE條帶定量分析結果。結果顯示，在帕金森氏症模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）。提示纖溶酶原能夠促進帕金森氏症模型小鼠腦勻漿中重組人Pro-BDNF裂解。

圖4A-C 在帕金森氏症模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用。A為Western blot成像圖片，B為Western blot中Pro-BDNF條帶光密度(OD)值分析結果，C為Western blot中 BDNF條帶光密度(OD)值分析結果。結果顯示，在帕金森氏症模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異顯著（*代表P＜0.05，***表示P＜0.001）；給藥纖溶酶原組BDNF的量明顯高於溶劑對照組，差異極為顯著。提示纖溶酶原能夠促進帕金森氏症模型小鼠腦勻漿液重組人Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。

圖5A-B在阿爾茲海默模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用。A為SDS-PAGE成像圖片，B為SDS-PAGE中Pro- BDNF條帶定量分析結果。結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿中Pro-BDNF裂解。

圖6 A-C在阿爾茲海默模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用，A為Western blot成像圖片，B為Western blot中Pro-BDNF條帶光密度(OD)值分析結果，C為Western blot中BDNF條帶光密度(OD)值分析結果。結果顯示，在阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶劑對照組，差異極為顯著（**代表P＜0.01，***表示P＜0.001）；給藥纖溶酶原組BDNF的量明顯高於溶劑對照組，差異極顯著。提示纖溶酶原能夠促進阿爾茲海默症模型小鼠腦勻漿液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。

圖7連續給藥纖溶酶原後，ELISA 法檢測SMNΔ7 SMA小鼠腦組織中纖溶酶原含量結果。結果顯示，空白對照組野生型小鼠腦組織纖溶酶原水平為1.18±1.54ng/mg；溶劑組小鼠腦組織纖溶酶原水平為1.49±1.59ng/mg，與空白對照組相比，溶劑組小鼠腦組織纖溶酶原水平未見明顯變化；給藥組SMA轉基因小鼠纖溶酶原水平為12.09±5.32ng/mg，約為溶劑組的8倍。提示補充纖溶酶原可以促進SMA疾病條件下血-腦屏障對纖酶原通透性增加，纖溶酶原可通過血-腦屏障，達到腦部。

圖8連續給藥纖溶酶原後，ELISA 法檢測SMNΔ7 SMA脊髓組織中纖溶酶原含量結果。結果顯示，空白對照組野生型小鼠脊髓纖溶酶原水平為8.51±9.51ng/mg。溶劑組SMA轉基因小鼠脊髓纖溶酶原水平為19.95±4.06ng/mg，相比於空白對照組稍有增加。正常給藥對照組纖溶酶原水平為13.03±7.51ng/mg。給藥組SMA轉基因小鼠脊髓纖溶酶原水平為62.33±17.37ng/mg，約為溶劑組小鼠的3倍，且給藥組和溶劑組兩組比較統計分析P值為0.029；約為正常給藥對照組的4.8倍，且給藥組和正常給藥對照組比較統計分析P值為0.026。說明給藥纖溶酶原可促進SMA條件下血-脊髓屏障對纖溶酶原通透性增加，纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，達到脊髓部位。

圖9單次尾靜脈注射給予纖溶酶原於LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠2小時後，脊髓勻漿纖溶酶原水平ELISA檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠脊髓組織勻漿纖溶酶原水平為2.70±0.74ng/mg；氣管滴注LPS後，溶劑組小鼠脊髓組織勻漿纖溶酶原水平為3.17±1.51ng/mg，與空白對照組相比未見明顯變化；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，纖溶酶原水平為121.16±44.68ng/mg，約為溶劑組小鼠的38.2倍。提示補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠血-脊髓屏障對纖溶酶原的通透性增加，該條件下纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，進入中樞神經系統。

圖10單次尾靜脈注射給予纖溶酶原於LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠2小時後，脊髓勻漿纖溶酶原水平酶促反應動力學檢測結果。結果顯示，空白對照組小鼠脊髓組織纖溶酶原水平為0.00011±4.51x10-5 U/mg；氣管滴注LPS後，溶劑組小鼠脊髓纖溶酶原水平為0.00010±9.72 x10-6 U/mg，與空白對照組相比，未見明顯變化；給藥組小鼠補充2.5倍生理劑量水平的纖溶酶原後，纖溶酶原水平增加至0.00034±1.04 x10-4 U/mg，與溶劑相比，統計分析P值為0.058。提示補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎SMA雜合子小鼠血-脊髓屏障對纖溶酶原的通透性增加，纖溶酶原可通過血-脊髓屏障，在脊髓處聚集。

圖11單次尾靜脈注射給予纖溶酶原於LPS誘導的肺炎小鼠2小時後，脊髓勻漿纖溶酶原水平ELISA檢測結果。脊髓組織勻漿液中纖溶酶原水平ELISA檢測結果顯示，空白對照組的脊髓組織Plg含量為7.71±0.51ng/mg，溶劑組小鼠脊髓組織Plg含量14.04±3.25ng/mg，氣管滴注LPS後，小鼠脊髓纖溶酶原水平有所增加；給藥A組小鼠補充50mg/kg （每隻小鼠約1mg）的纖溶酶原後，脊髓組織纖溶酶原水平為85.10±11.59ng/mg，約為溶劑組小鼠的6.1倍；給藥B組小鼠補充17mg/kg（每隻小鼠約0.34mg）的纖溶酶原後，脊髓組織纖溶酶原水平為77.90±21.39ng/mg，約為溶劑組小鼠的5.5倍；給藥C組小鼠補充6mg/kg（每隻小鼠約0.1mg）的纖溶酶原後，脊髓組織纖溶酶原水平為64.00±19.63ng/mg，約為溶劑組小鼠的4.6倍。提示1）補充纖溶酶原能夠促進LPS誘導的肺炎小鼠血腦屏障對纖溶酶原的通透性增加，纖溶酶原可穿過血腦屏障，在脊髓組織富集；2）纖溶酶原在脊髓中的富集具有劑量依賴效應，在6mg/kg至50mg/kg給藥劑量範圍內，脊髓中纖溶酶原富集水平隨纖溶酶原施予劑量增加而增加。

圖12尾靜脈注射纖溶酶原於 C57肺炎模型小鼠後，不同時間點脊髓組織勻漿液中人纖溶酶原水平ELISA法檢測結果。結果顯示，假手術+溶劑組小鼠和LPS+溶劑組小鼠未接受纖溶酶原注射，在0、2、6、12和24小時，脊髓組織勻漿液中均未檢測到人纖溶酶原。假手術+50mg/kg纖溶酶原組和LPS+50mg/kg纖溶酶原組小鼠接受50mg/kg體重的纖溶酶原注射，注射2小時後脊髓組織勻漿中人纖溶酶原均有顯著升高，注射6-12小時後纖溶酶原水平明顯降低，24小時基本檢測不到人纖溶酶原。LPS+6mg/kg纖溶酶原組小鼠接受6mg/kg體重的纖溶酶原注射，注射2小時後脊髓組織勻漿中檢測到纖溶酶原水平顯著高於LPS+溶劑組小鼠，顯著低於LPS+50mg/kg纖溶酶原組小鼠。該結果表明1）在生理和病理情況下施予纖溶酶原後，可促進纖溶酶原穿過血腦屏障，在脊髓組織中富集；2）靜脈注射纖溶酶原於正常小鼠體內，脊髓組織纖溶酶原水平顯著增加；3）纖溶酶原在脊髓富集具有時間依賴效應，先升高，2至12小時逐漸降低，在12至24小時幾乎全部完全代謝；4）纖溶酶原在脊髓富集具有劑量依賴效應，施予劑量越高，脊髓組織中纖溶酶原水平越高。

圖13尾靜脈注射纖溶酶原於 C57肺炎模型小鼠後，不同時間點腦組織勻漿液中纖溶酶原水平ELISA法檢測結果。結果顯示，空白+溶劑組小鼠和LPS+溶劑組小鼠未接受纖溶酶原注射，在0、2、6、12和24小時，腦組織勻漿液中均未檢測到人纖溶酶原。空白+50mg/kg纖溶酶原組和LPS+50mg/kg纖溶酶原組小鼠接受50mg/kg體重的纖溶酶原注射，注射2小時後腦組織勻漿中檢測到人纖溶酶原均有顯著升高，注射6-12小時後纖溶酶原水平明顯降低，24小時基本檢測不到人纖溶酶原。LPS+6mg/kg纖溶酶原組小鼠接受6mg/kg體重的纖溶酶原注射，注射2小時後腦組織勻漿中檢測到纖溶酶原水平顯著高於LPS+溶劑組小鼠，顯著低於LPS+50mg/kg纖溶酶原組小鼠。該結果表明1）在生理和病理情況下施予纖溶酶原後，可促進纖溶酶原穿過血腦屏障，在腦組織富集；2）靜脈注射纖溶酶原於正常小鼠體內，腦組織纖溶酶原水平顯著增加；3）纖溶酶原在腦組織富集具有時間依賴效應，先升高，2至12小時逐漸降低，在12至24小時幾乎全部完全代謝；4）纖溶酶原在腦組織富集具有劑量依賴效應，施予劑量越高，腦組織中纖溶酶原水平越高。

圖14 尾靜脈注射纖溶酶原於SOD1-G93A小鼠後，不同時間點脊髓組織勻漿液中人纖溶酶原水平ELISA法檢測結果。SOD1-G93A小鼠脊髓ELISA水平檢測結果顯示，尾靜脈注射給予50mg/kg和6mg/kg纖溶酶原，SOD1-G93A小鼠脊髓纖溶酶原水平明顯增加，且50mg/kg給藥組纖溶酶原水平明顯高於6mg/kg組。纖溶酶原水平在給藥後2小時後逐漸降低，在12至24小時基本代謝完全。

該結果表明1）施予生理劑量水平的纖溶酶原能夠穿過SOD1-G93A小鼠血腦屏障，在脊髓組織富集；2）纖溶酶原在脊髓的富集具有劑量依賴效應，纖溶酶原施予劑量越高，富集的越多；3）纖溶酶原在脊髓的富集具有時間依賴效應，先升高，在2至12小時逐漸降低，在12至24小時基本完全代謝。

圖15尾靜脈注射纖溶酶原於SOD1-G93A小鼠後，不同時間點腦組織勻漿液中纖溶酶原水平ELISA法檢測結果。SOD1-G93A小鼠腦ELISA水平檢測結果顯示，尾靜脈注射給予50mg/kg和6mg/kg纖溶酶原，SOD1-G93A小鼠腦組織纖溶酶原水平明顯增加，且50mg/kg給藥組纖溶酶原水平明顯高於6mg/kg給藥組。纖溶酶原水平在給藥後2小時後逐漸降低，在12至24小時基本代謝完全。該結果表明1）施予生理劑量水平的纖溶酶原能夠穿過SOD1-G93A小鼠血腦屏障，在腦組織富集；2）纖溶酶原在腦組織的富集具有劑量依賴效應，纖溶酶原施予劑量越高，富集的越多；3）纖溶酶原在腦組織的富集具有時間依賴效應，先升高，在2至12小時逐漸降低，在12至24小時基本完全代謝。

圖16尾靜脈注射纖溶酶原於FAD小鼠後，不同時間點脊髓組織勻漿液中纖溶酶原水平ELISA法檢測結果。脊髓組織勻漿ELISA水平檢測結果顯示，尾靜脈注射給予50mg/kg和6mg/kg纖溶酶原，FAD小鼠脊髓組織纖溶酶原水平明顯增加，且50mg/kg給藥組纖溶酶原水平明顯高於6mg/kg給藥組。纖溶酶原水平在給藥後2小時後逐漸降低，在12至24小時基本代謝完全。該結果表明1）施予生理劑量水平的纖溶酶原能夠穿過FAD小鼠血腦屏障，在脊髓組織富集；2）纖溶酶原在脊髓組織的富集具有劑量依賴效應，纖溶酶原施予劑量越高，富集的越多；3）纖溶酶原在脊髓組織的富集具有時間依賴效應，先升高，在2至12小時逐漸降低，在12至24小時基本完全代謝。

圖17尾靜脈注射纖溶酶原於FAD小鼠後，不同時間點腦組織勻漿液中纖溶酶原水平ELISA法檢測結果。腦組織勻漿ELISA水平檢測結果顯示，尾靜脈注射給予50mg/kg和6mg/kg纖溶酶原，FAD小鼠腦組織纖溶酶原水平明顯增加，且50mg/kg給藥組纖溶酶原水平明顯高於6mg/kg給藥組。纖溶酶原水平在給藥後2小時後逐漸降低，在12至24小時基本代謝完全。該結果表明1）施予生理劑量水平的纖溶酶原能夠穿過FAD小鼠血腦屏障，在腦組織富集；2）纖溶酶原在腦組織的富集具有劑量依賴效應，纖溶酶原施予劑量越高，富集的越多；3）纖溶酶原在腦組織的富集具有時間依賴效應，先升高，在2至12小時逐漸降低，在12至24小時基本完全代謝。

圖18尾靜脈注射纖溶酶原於SOD1-G93A小鼠後，脊髓組織BDNF 基因mRNA PCR檢測。結果顯示，給藥組小鼠脊髓組織BDNF基因轉錄水平明顯高於溶劑組，且統計差異P值為0.05。表明纖溶酶原能夠促進SOD1-G93A小鼠脊髓組織中BDNF基因轉錄。

Claims (18)

1. 一種促進成熟BDNF形成和/或提高BDNF水平的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖溶酶原途徑激活劑。
2. 如請求項1所述的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑促進受試者神經組織中Pro-BDNF裂解形成成熟BDNF和BDNF基因的轉錄或表達。
3. 如請求項1或2所述的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑提高受試者神經組織中其它神經營養因子的基因轉錄、蛋白表達和水平。
4. 如請求項3所述的方法，其中所述其它神經營養因子包括神經生長因子(NGF)、神經營養因子3(NT-3)、神經營養因子4/5（NT-4/5）、睫狀神經營養因子 (ciliary neurotrophic factor, CNTF)、膠質細胞源神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）、類胰島素生長因子I（insulin like-growth factor-1，IGF-1）、 轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）、 表皮生長因子( epidermal growth factor, EGF)、 成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)或血小板源生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)。
5. 如請求項1-4任一項所述的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑具有選自如下的一項或多項中的用途或活性：促進神經元存活、分化、生長發育；防止神經元受損傷死亡；促進受損傷神經元再生及分化；和維持神經元生存及正常生理功能。
6. 如請求項1-5中任一項所述的方法，其中所述受試者為患神經或腦組織損傷的受試者，該神經或腦組織損傷由選自如下的一種或多種疾病或狀況所致： 1）感染，選自如下的一種或多種：腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎和硬膜外膿腫； 2）血管疾病，選自如下的一種或多種：中風、短暫性腦缺血發作(TIA)、蛛網膜下腔出血、硬膜下出血和血腫、和硬膜外出血； 3）神經結構損傷疾病，選自如下的一種或多種：腦或脊髓損傷、貝爾氏麻痺、頸椎病、腕管綜合症、腦或脊髓腫瘤、周圍神經病和格林-巴利綜合症； 4）功能障礙，選自如下的一種或多種：頭痛、癲癇、失眠、神經痛、焦慮和抑鬱症； 5）神經退化性疾病，選自如下的一種或多種：阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症（Huntington's disease，HD）、肌萎縮側索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多發性硬化症（Multiple sclerosis，MS）、脊髓小腦共濟失調和Pick病； 6）運動神經元疾病，選自如下的一種或多種：脊髓性肌萎縮症（SpinalMuscularAtrophy，SMA）、進行性延髓麻痺、進行性肌肉萎縮、和原發性側索硬化； 7）腫瘤，選自如下的一種或多種：腦部腫瘤和腦癌。
7. 一種預防或治療BDNF相關疾病或病症的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖溶酶原途徑激活劑。
8. 如請求項7的方法，其中所述BDNF相關疾病或病症包括選自如下的任一種： 1）感染，選自如下的任一種：腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎和硬膜外膿腫； 2）血管疾病，選自如下的任一種：中風、短暫性腦缺血發作(TIA)、蛛網膜下腔出血、硬膜下出血和血腫、和硬膜外出血； 3）神經結構損傷疾病，選自如下的任一種：腦或脊髓損傷、貝爾氏麻痺、頸椎病、腕管綜合症、腦或脊髓腫瘤、周圍神經病和格林-巴利綜合症； 4）功能障礙，選自如下的任一種：頭痛、癲癇、失眠、神經痛、焦慮和抑鬱症； 5）神經退化性疾病，選自如下的任一種：阿茲海默症、帕金森氏症、亨丁頓舞蹈症（Huntington's disease，HD）、肌萎縮側索硬化症(Amyotrophiclateral sclerosis，ALS)、多發性硬化症（Multiple sclerosis，MS）、脊髓小腦共濟失調和Pick病； 6）運動神經元疾病，選自如下的任一種：脊髓性肌萎縮症（SpinalMuscularAtrophy，SMA）、進行性延髓麻痺、進行性肌肉萎縮、和原發性側索硬化； 7）腫瘤，選自如下的任一種：腦部腫瘤和腦癌； 8）周圍神經病、外傷引起的神經損傷，視神經病變、多發性神經炎、帶狀皰疹、顏面神經麻痺、燒傷、褥瘡、角膜潰瘍、放射治療或化療引起的副作用； 9）神經精神障礙、強迫性神經失調、創傷後應激障礙、神經性厭食、中樞神經系統的自身免疫性疾病、長期或短期記憶障礙、兒童學習障礙、閉合性顱腦損傷、注意力缺陷障礙、發作性嗜睡症、睡眠障礙、腦或神經細胞損傷、與AIDS有關的神經功能缺損、以運動和/或發聲性抽搐為特徵的運動和抽搐障礙(例如，妥瑞氏精神障礙、慢性運動或發聲性抽搐障礙、短時抽搐性障礙和刻板型活動障礙)、物質濫用病症(例如，物質依賴、物質濫用以及物質濫用/依賴的後遺症，例如物質誘發的心理障礙、物質戒斷和物質誘發的癡呆或遺忘症)、外傷性腦損傷、耳鳴、共濟失調、肌肉強直(痙攣狀態)、由酒精或物質濫用(例如，搖頭丸、去氧麻黃鹼等)引發的神經毒性、精神發育遲緩或認知缺損(例如，非綜合症X染色體易裂連帶精神發育遲緩、脆性X綜合症、唐氏綜合症、孤獨症)、失語症、貝爾氏麻痺、克-雅氏病、腦炎、年齡相關性黃斑病變、ondine綜合症、WAGR綜合症、聽力損失、雷特綜合症、視神經損傷、糖尿病神經病變、神經移植併發症、周圍神經損傷、肥胖症、代謝綜合症、哮喘、特應性疾病、過敏性炎症、濕疹、神經免疫學疾病或病症和神經耳科疾病或病症、以及與老化和衰老有關的疾病或病症； 10）神經痛，選自如下的任一項：三叉神經痛、慢性疼痛、慢性炎性痛、與關節炎有關的疼痛、纖維肌痛、癌症相關的疼痛、與消化性疾病有關的疼痛、與克羅恩氏病有關的疼痛、與自身免疫性疾病有關的疼痛、與內分泌疾病有關的疼痛、與糖尿病神經病變有關的疼痛、幻肢痛、自發性疼痛、慢性術後疼痛、慢性顳下頜疼痛、灼痛、皰疹後神經痛、AIDS相關的疼痛、I和II型複雜性區域疼痛綜合症、慢性背痛、與脊髓損傷有關的疼痛、與藥物攝入有關的疼痛和復發性急性疼痛、神經性疼痛。
9. 如請求項1-8任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑提高受試者神經組織中纖溶酶原水平。
10. 如請求項1-9任一項的方法，其其中所述纖溶酶原途徑激活劑與一種或多種其它藥物或治療方法聯合施用。
11. 如請求項1-10任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑通過靜脈內、肌肉內、鞘內、鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液形式給藥。
12. 如請求項1-11任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑選自如下一種或多種：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。
13. 如請求項12的方法，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自天然或重組的纖溶酶原、人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和/或蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。
14. 如請求項12的方法，其中所述纖溶抑制劑的拮抗劑為天然或重組的PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的拮抗劑，例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體。
15. 如請求項1-13任一項的方法，其中所述纖溶酶原途徑激活劑為纖溶酶原。
16. 如請求項15的方法，其中所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示的胺基酸序列，或包含與序列2、6、8、10或12所示胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性的胺基酸序列，並且具有纖溶酶原的蛋白水解活性和/或離胺酸結合活性。
17. 如請求項15的方法，所述纖溶酶原包含選自如下的一項或多項： 1）具有序列14所示的絲氨酸蛋白酶結構域； 2) 與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性並保留蛋白水解活性的絲氨酸蛋白酶結構域； 3) 選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和 Kringle 5中一個或多個的Kringle結構域；和 4）與選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4和 Kringle 5中一個或多個具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性並保留離胺酸結合活性的Kringle結構域。
18. 如請求項15的方法，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。

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