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TW202207904A - 用於治療癌症及癌症抗藥性之脂質體調配物 - Google Patents

用於治療癌症及癌症抗藥性之脂質體調配物 Download PDF

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TW202207904A
TW202207904A TW110116450A TW110116450A TW202207904A TW 202207904 A TW202207904 A TW 202207904A TW 110116450 A TW110116450 A TW 110116450A TW 110116450 A TW110116450 A TW 110116450A TW 202207904 A TW202207904 A TW 202207904A
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TW
Taiwan
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dox
cancer
drug
imt
liposomes
Prior art date
Application number
TW110116450A
Other languages
English (en)
Inventor
芳 劉
徐賢
Original Assignee
美商納米科技製藥公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本發明揭示囊封一或多種抗癌劑之脂質體醫藥組合物及使用該等脂質體醫藥組合物治療癌症之方法，其中複數種抗癌劑可以協同莫耳比經由脂質體遞送粒子向癌症患者投與。本發明亦揭示製備囊封多種抗癌劑之該等脂質體及其醫藥組合物的方法。

Description

用於治療癌症及癌症抗藥性之脂質體調配物
本發明係關於基於脂質體之醫藥調配物、將兩種或更多種活性醫藥成分(active pharmaceutical ingredient；API) (特定言之抗癌劑)囊封在脂質體核心隔室中之方法，以及使用醫藥調配物治療癌症(尤其各種抗藥性癌症)之方法。
對癌症化學療法之抗性為常見問題，尤其在患者通常已暴露於多個先前治療線之細胞株之後的轉移性階段中。由於抗藥性之產生，患者可在治療期間或治療完成之後不久經歷快速疾病進展。此抗性導致治療選擇之數目有限。因此，為使抗藥性之影響降至最低，已嘗試同時組合使用兩種或更多種具有不相關作用機制及不同抗藥性模式之抗癌藥物。採用組合藥物療法的基本原理為協同藥物相互作用。首先，當應用具有不同分子目標之多種藥物時，可延遲諸如癌細胞突變之癌症適應過程。第二，當多種藥物靶向相同細胞路徑時，其可協同作用以獲得更高治療功效及更高目標選擇性。當前在臨床研究中可用於多種癌症之組合方案非常限於投與兩種或更多種抗癌劑之物理混合物。常見的臨床研究中臨床使用之組合方案通常可基於其作用機制而分類，包括：(1)非特異性小分子化學治療劑之組合；(2)目標特異性受體試劑與化學治療劑之組合；及(3)目標特異性受體藥劑之組合。
對於化學治療劑與目標特異性受體藥劑之組合，化學治療劑缺乏癌細胞特異性靶向能力且亦影響身體之快速分裂的正常細胞。因此，來自此等化學治療劑之主要不良作用為非特異性毒性，包括貧血、噁心、嘔吐及脫髮。目標特異性受體藥劑(或目標癌症抑制劑)在其主動靶向特異性受體之能力方面有利於化學療法。習知化學療法不會有效區分腫瘤細胞與快速分裂的正常細胞，由此產生非特異性不良作用。相反，目標特異性抗癌療法干擾不同於正常細胞的在腫瘤生長或進展中具有重要作用的分子目標。另外，此等藥劑中之一些充當多重抗藥性(MDR)相關蛋白質之抑制劑，藉此增加反應率。與習知化學療法相比，整體靶向療法提供具有較小毒性及較高反應率的較寬治療窗(therapeutic window)。與傳統細胞毒性療法相比，靶向療法通常與化學療法及/或輻射組合使用以產生具有獨特作用機制之累加或甚至協同作用。
在過去幾年期間，組合化學療法已廣泛用於增強臨床癌症治療。然而，組合方案之傳統混合物投與通常受不同藥物之間的不同藥物動力學影響。在常見臨床前及臨床實踐中，組合藥物療法以各種量及/或以不同給藥時程單獨投與，而無需經設計以控制藥物之遞送或半衰期的醫藥製劑。此等投與方法具有限制組合藥物治療之治療用途的各種缺陷。通常，首先單獨研發此類方案之組分，而不考慮在其組合使用時可能出現的許多問題，諸如靶上拮抗作用及不良事件之增強。儘管來自組合治療之有益治療有效性在考慮各抗癌藥物之理論上非重疊作用機制時有前景的，以上臨床癌症治療中的常見組合遠非完美，通常具有中等增強功效及累加毒性。因此，藉由將奈米技術與組合抗癌治療結合來研究新穎方法。此有前景的假設係藉由使用載劑介導之藥物遞送系統同時遞送兩種或更多種藥物，組合系統可產生協同抗癌作用，降低個別藥物相關毒性，控制釋放且統一各藥物之藥物動力學。近年來，已對用於多種藥物遞送之載劑，諸如脂質體、樹枝狀聚合物、聚合物奈米粒子及水溶性聚合物-藥物結合物進行普遍研究。(Markman, J. L.等人, Adv. Drug Delivery Rev. 2013, 65, 1866-1879)。
近年來，基於脂質之奈米載劑已藉由克服P-gp介導之外排、經由高通透性及滯留(enhanced permeability and retention；EPR)將藥物隔離在腫瘤部位處及一旦內化就逃脫內體清除而顯示出極佳的結果。舉例而言，CPX-351 (Vyxeos®)為阿糖胞苷及道諾比星之雙藥物脂質體囊封體，其經合理設計以提高對患有急性骨髓性白血病(AML)之患者的傳統7+3阿糖胞苷/道諾比星化學療法方案的功效(Lawrence D Mayer等人, International Journal of Nanomedicine 2019:14, 3819-3830)。為實現多種藥物之有效遞送，已嘗試將一些藥物囊封於脂質體遞送媒劑中，該脂質體遞送媒劑經設計以保護該等藥物免受將以其他方式導致其自血流中清除的機制的影響。然而，新穎的組合抗癌藥物脂質體調配物研發仍需要改良藥物遞送特異性，增強藥物治療指數，且藉此減少藥物相關不良作用。
本發明係關於使用脂質體遞送系統投與有效量之化學治療劑及蛋白激酶抑制劑(例如，多柔比星(doxorubicin)、道諾比星(daunorubicin)、伊達比星(idarubicin)、長春瑞濱(vinorelbine)、伊立替康(irinotecan)、拓朴替康(topotecan)或吉西他濱(gemcitabine)與伊馬替尼(imatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、尼達尼布(nintedanib)、普納替尼(ponatinib)、阿法替尼(afatinib)、魯索利替尼(ruxolitinib)或其他者)藥物組合之方法，其中囊封至少一種化學治療劑及一種蛋白激酶抑制劑藥物。此等組合物允許將兩種或更多種藥劑以協調方式遞送至疾病部位，藉此確保藥劑將以所需比率存在於疾病部位處。無論將藥劑共囊封於基於脂質之遞送媒劑中或囊封於單獨的基於脂質之遞送媒劑中投與以使得在疾病部位處維持所需比率，都將實現此結果。組合物之藥物動力學(PK)由基於脂質之遞送媒劑自身來控制，以使得實現協調遞送(其限制條件為遞送系統之PK為類似的)。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含懸浮於液體介質中之脂質體，其中該液體介質包含水及pH緩衝劑；其中該脂質體包含由外脂質雙層膜包圍之內部隔室，其中該內部隔室在水性介質中包含蛋白激酶抑制劑或較佳地親水性化學治療劑與蛋白激酶抑制劑的組合；其中該脂質雙層膜包含形成該內部隔室之親水性內表面、親脂性雙層及與該組合物之該液體介質接觸的親水性外表面；且其中該親水性化學治療劑及該蛋白激酶抑制劑可以協同模式自該脂質體釋放。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種根據本文所揭示之任何實施例的醫藥組合物，其用於治療需要治療之個體之癌症或癌症抗性，其中該癌症視情況選自由以下組成之群：乳癌、黑色素瘤、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌及胃腸道基質瘤，其中用對癌細胞具有協同細胞毒性或細胞抑制作用之該化學治療劑及該蛋白激酶抑制劑可藉由該脂質體來遞送。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種治療癌症或癌症抗藥性之方法，其包含向需要治療之個體投與治療有效量的根據本文所揭示之任何實施例的醫藥組合物。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種製備脂質體醫藥組合物(例如，如技術方案1至11中任一項之脂質體醫藥組合物)之方法。
在另一態樣中，本發明提供如本文中任何實施例實例中所揭示及/或藉由根據本文所揭示之任何實施例或實例之方法製備的脂質體。
在另一態樣中，本發明提供一種治療套組，其包含容器及在容器中的複數個根據本文所揭示之任何實施例之載藥脂質體，其中載藥脂質體係懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中或可懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中。
因此，在一些實施例中，本發明提供一種用於非經腸投與之脂質體組合物，其包含以治療有效比率囊封於脂質體中的至少一種化學治療劑及一種蛋白激酶抑制劑(有時較佳地為酪胺酸激酶抑制劑)，尤其為非拮抗的彼等。藉由在一定濃度範圍內評定藥劑對來自個別患者活檢體之相關細胞培養物及腫瘤勻漿之生物活性或作用來測定藥劑之治療有效非拮抗比率。此外，經常提供包含伊馬替尼或舒尼替尼(或另一種蛋白激酶抑制劑)及包含多柔比星、道諾比星、伊達比星或其他已知化學治療劑的蒽環黴素(anthracycline)的組合。可使用任何促使測定維持所需治療作用之藥劑比率的方法。
組合物以對培養物及腫瘤勻漿中之相關細胞展現所需生物作用的化學治療劑與蛋白激酶抑制劑之莫耳比包含至少一種化學治療劑及一種蛋白激酶抑制劑。較佳地，該比率係藥劑為非拮抗時之比率。
在一些實施例中，本發明係針對一種藉由投與本發明之組合物來將治療有效量之化學治療劑/蛋白激酶抑制劑組合(例如，多柔比星及伊馬替尼或舒尼替尼)遞送至所需目標之方法。
本發明亦係針對一種藉由投與穩定地與第一遞送媒劑相關之化學治療劑及穩定地與第二遞送媒劑相關之蛋白激酶抑制劑來遞送治療有效量的化學治療劑與蛋白激酶抑制劑之組合的方法。第一及第二遞送媒劑可含於單獨的小瓶中，同時或依次向患者投與小瓶之內含物。在一個實施例中，化學治療劑與蛋白激酶抑制劑之比率為非拮抗的。
在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：乳癌、黑色素瘤、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌及胃腸道基質瘤。
在一些實施例中，有時較佳地，乳癌為三陰性乳癌，且其中肺癌係因野生型EGFR之高度磷酸化或在EGFR胺基酸序列內之突變所引起。
在一些實施例中，本發明係針對一種製備治療組合物之方法，該治療組合物包含含有一定比率的提供所需治療作用的至少一種化學治療劑與一種蛋白激酶抑制劑的脂質體。方法包含：(a)提供一組至少一種化學治療劑及一種蛋白激酶抑制劑，其中該組包含至少一種，但較佳多種比率之該等藥物；(b)測試該組之成員在一定濃度範圍內對相關細胞培養物或腫瘤勻漿發揮生物作用的能力；(c)選擇該組之成員，其中比率在適合之濃度範圍內對細胞培養物及腫瘤勻漿提供所需治療作用；及(d)穩定地將由該組之成功成員代表的藥物之比率與基於脂質的藥物遞送媒劑相關聯。在較佳的實施例中，上述所需治療作用為非拮抗的。
如下文進一步描述，在一較佳實施例中，在根據上文所描述之方法設計適當組合時，將非拮抗比選擇為組合指數(CI) ≤ 1.1(等於或小於1.1)之彼等。在其他實施例中，設計適合之脂質體調配物以使得其穩定地併入有效量之化學治療劑及蛋白激酶抑制劑組合且允許兩種藥物在活體內持續釋放。較佳的調配物含有mPEG-DSPE或至少一種帶負電荷之脂質，諸如磷脂醯甘油。
脂質體可用主動藥物負載及/或被動藥物負載由天然磷脂及合成類似物(諸如電荷兩性離子型磷脂醯膽鹼)來製備。可添加微量比例之陰離子磷脂(諸如磷脂醯甘油)以產生用於膠體穩定的淨負表面電荷。可基於共負載藥物之物理特性使用各種捕獲劑(例如，硫酸銨、過渡金屬離子及以下的銨鹽或經取代之銨鹽：聚陰離子化硫酸化環糊精、磺基丁醚環糊精、聚陰離子化硫酸化糖、聚磷酸鹽及其類似物)。
鑒於以下詳細描述、實例及申請專利範圍將更佳地瞭解本發明之其他態樣或優點。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年5月6日申請之美國臨時專利申請案第63/020,845號的優先權，其揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在本發明中，吾等已鑑別出容納至少一種化學治療細胞毒性劑(例如，多柔比星、道諾比星、伊達比星、表柔比星及其衍生物、吉西他濱、長春瑞濱或類似者)與至少一種蛋白激酶抑制劑(例如，伊馬替尼、舒尼替尼、尼達尼布、阿法替尼、普納替尼、魯索利替尼或類似者)之組合所需的特定遞送媒劑調配物，其引起各藥劑之優良藥物滯留及持續藥物釋放。此已進一步證實，當囊封於脂質體中時，此等藥物之協同比率可成功地在血液隔室中維持延長的時段，從而產生與用於治療相關癌症及癌症抗性之組合個別單一習知藥物劑型相比增強的功效。
在奈米粒子遞送系統當中，脂質體為最廣泛使用的具有若干獨特特徵之醫藥學載劑中之一者，該等特徵包括：(1)由載劑介導之延長的藥物循環半衰期，(2)減少之非特異性攝入，(3)經由被動高通透性及滯留(EPR)效應及/或藉由併入靶向配體之主動靶向在腫瘤部位處增加的累積，(4)主要為內飲攝入，有可能繞過多重抗藥性機制，及(5)基於各藥劑之藥理學配置調整其相對比率的能力，(6)在同一平台中攜載多種藥物(親水性及疏水性藥物)之單一遞送系統可導致各藥物之同步且受控藥物動力學，從而引起藥物功效改善，單一調配物具有改善的溶解度及生物可用性(參見例如，Mamot, C.等人, Drug Resist. 2003年更新, 6, 271-279)。
本發明提供包含囊封至少一種化學治療癌症藥物及一種蛋白激酶抑制劑之脂質體的組合物，其中化學治療癌症藥物及蛋白激酶抑制劑以對相關細胞或腫瘤勻漿展現所需細胞毒性、細胞抑制或生物作用的化學治療藥物:蛋白激酶抑制劑(例如，多柔比星:伊馬替尼或多柔比星:舒尼替尼)莫耳比(僅多柔比星、多柔比星:伊馬替尼或多柔比星:舒尼替尼約為30:1至約1:30，及僅伊馬替尼或舒尼替尼)存在。較佳地，本文所提供之脂質體組合物將包括以對相關細胞或腫瘤勻漿展現非拮抗作用的化學治療劑與蛋白激酶抑制劑之莫耳比囊封至少一種化學治療藥物及至少一種蛋白激酶抑制劑的脂質體。
在一個態樣中，本揭示內容提供一種醫藥組合物，其包含懸浮於液體介質中之脂質體，其中液體介質包含水及pH緩衝劑；其中脂質體包含由外脂質雙層膜包圍之內部隔室，其中內部隔室在水性介質中包含蛋白激酶抑制劑(有時較佳為酪胺酸激酶抑制劑)或親水性化學治療劑與蛋白激酶抑制劑(有時較佳為酪胺酸激酶抑制劑)之組合；其中脂質雙層膜包含形成內部隔室之親水性內表面、親脂性雙層及與組合物之液體介質接觸的親水性外表面；且其中親水性化學治療劑及蛋白激酶抑制劑可以協同模式自脂質體釋放。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，脂質體之脂質雙層膜包含(a)至少10 mol%選自由磷脂醯膽鹼(例如，HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂醯甘油(例如，DSPG)、磷脂醯肌醇、甘油糖脂、神經鞘醣脂(例如，神經鞘磷脂)及其組合組成之群的磷脂；(b) 0至60 mol%膽固醇或其衍生物；及(c)視情況衍生成聚乙二醇之帶電荷的磷脂(例如，mPEG-2000-DSPE)。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，一或多種脂質獨立地選自由以下組成之群：HSPC、DSPC、DPPC、DMPC、DSPG、mPEG-DSPE-2000及膽固醇。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，液體介質進一步包含以下中之一或多者：水可混溶有機溶劑、滲透劑、控制釋放賦形劑。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，脂質體之水性內部隔室進一步包含捕獲劑。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，捕獲劑係選自由以下組成之群：硫酸銨；聚陰離子化磺基丁醚環糊精(例如，TEA-SBE-α-環糊精、TEA-SBE-β-環糊精、TEA-SBE-γ-環糊精、Tris-SBE-α-環糊精、Tris-SBE-β-環糊精及Tris-SBE-γ-環糊精)的銨鹽或經取代之銨鹽；聚陰離子化硫酸化碳水化合物(例如，TEA-SOS及Tris-SOS)的銨鹽或經取代之銨鹽；聚磷酸鹽(例如，肌醇六磷酸三乙銨及三(羥基甲基)胺基甲烷肌醇六磷酸鹽)的銨鹽或經取代之銨鹽；過渡金屬鹽(例如，銅、鋅、錳、鎳、鈷或類似者與鹵化物、硫酸根離子及葡萄糖酸根離子形成的鹽)；四級銨化合物(例如，苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)、溴化十六烷基三甲基銨(cetrimonium bromide)、硬脂基二甲基苄基氯化銨)；聚氧乙烯(亦即，聚乙二醇)及椰子胺。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，脂質體之脂質雙層膜之外表面包含表面帶負電荷的脂質(例如，DSPG)或含有聚乙二醇之表面改質劑(例如，mPEG-2000-DSPE)，其中總脂質與蛋白激酶抑制劑之莫耳比或與當親水性化學治療劑及蛋白激酶抑制劑兩者存在時之組合總量之莫耳比至少等效(1:1)。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，化學治療劑係選自由以下組成之群：多柔比星、環磷醯胺、卡鉑(carboplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、道諾比星、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、艾瑞布林(eribulin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、甲胺喋呤(methotrexate)、突變黴素(mutamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、長春瑞濱、多西他賽(docetaxel)、噻替派(thiotepa)、博萊黴素(bleomycin)、長春新鹼(vincristine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、卡培他濱(capecitabine)、普賴松(prednisone)、喜樹鹼(camptothecin)、拓朴替康、伊立替康、BCNU、卡莫司汀(carmustine)、順鉑(cis-platin)、來那度胺(lenalidomide)及培美曲塞(pemetrexed)。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，蛋白激酶抑制劑係選自由以下組成之群：伊馬替尼、舒尼替尼、阿法替尼、尼達尼布、普納替尼、魯索利替尼、克唑替尼、依魯替尼、阿卡替尼(acalabrutinib)、阿貝西利(abemaciclib)、阿法利貝(aflibercept)、艾樂替尼(alectinib)、阿瓦替尼(avapritinib)、阿西替尼(axitinib)、伯舒替尼(bosutinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡普替尼(capmatinib)、色瑞替尼(ceritinib)、考比替尼(cobimetinib)、克唑替尼、達拉非尼(dabrafenib)、達可替尼(dacomitinib)、達沙替尼(dasatinib)、恩拉非尼(encorafenib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄達替尼(erdafitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、依維莫司(everolimus)、非達替尼(fedratinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉列替尼(gilteritinib)、依魯替尼、拉帕替尼(lapatinib)、拉羅替尼(larotrectinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、勞拉替尼(lorlatinib)、尼達尼布、來那替尼(neratinib)、尼羅替尼(nilotinib)、奈妥舒迪(netarsudil)、奧希替尼(osimertinib)、帕瑞替尼(pacritinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、吡昔替尼(pexidartinib)、培米替尼(pemigatinib)、帕柏西利(palbociclib)、普納替尼、吡昔替尼、普拉替尼(pralsetinib)、奎紮替尼(quizartinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、瑞博西尼(ribociclib)、力普替尼(ripretinib)、塞爾帕替尼(selpercatinib)、司美替尼(selumetinib)、索拉非尼(sorafenib)、坦羅莫司(temsirolimus)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、圖卡替尼(tucatinib)、優帕替尼(upadacitinib)、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)、澤布替尼(zanubrutinib)及塞維-阿法利貝(ziv-aflibercept)。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，脂質體之內部隔室包含抗癌劑或選自由以下組成之群的組合： (a)單獨囊封之伊馬替尼； (b)共囊封之多柔比星及伊馬替尼； (c)單獨囊封之舒尼替尼； (d)共囊封之多柔比星及舒尼替尼； (e)單獨囊封之吉西他濱； (f)共囊封之吉西他濱及舒尼替尼； (g)約30:1至約1:30莫耳比之多柔比星及伊馬替尼； (h)約30:1至約1:30莫耳比之多柔比星及舒尼替尼；及 (i)約30:1至約1:30莫耳比之吉西他濱及舒尼替尼。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，脂質體具有4.5 nm至450 nm之間，較佳25 nm與300 nm之間，且更佳50 nm至200 nm之間的平均粒度。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，化學治療劑及蛋白激酶抑制劑可在投與後以協同模式依序釋放。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，兩種共囊封藥劑(亦即，化學治療劑及蛋白激酶抑制劑)之莫耳比使得當以該比率提供給該癌症相關之癌細胞時，以活體外分析於受影響細胞之分率約0.20至0.80之濃度範圍內，協同作用在該範圍展現超過至少20%。
在一些實施例中，在醫藥組合物中，用化學治療劑及蛋白激酶抑制劑囊封之脂質體在活體內投與之後在血液中維持該協同莫耳藥物比至少一小時。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種根據本文所揭示之任何實施例的醫藥組合物，其用於治療需要治療之個體之癌症或癌症抗性，其中該癌症視情況選自由以下組成之群：乳癌、黑色素瘤、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌及胃腸道基質瘤，其中用對癌細胞具有協同細胞毒性或細胞抑制作用之化學治療劑及蛋白激酶抑制劑可藉由脂質體來遞送。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種治療癌症或癌症抗藥性之方法，其包含向需要治療之個體投與治療有效量的根據本文所揭示之任何實施例的醫藥組合物。
在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：乳癌、黑色素瘤、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌及胃腸道基質瘤。
在一些實施例中，乳癌為三陰性乳癌，且其中肺癌係因野生型EGFR之高度磷酸化或在EGFR胺基酸序列內之突變所引起。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種製備脂質體醫藥組合物(例如，如技術方案1至11中任一項之脂質體醫藥組合物)之方法，其中該脂質體係藉由包含以下步驟的方法來製造： (a)在包含水、脂質及捕獲劑之溶液中形成多層脂質體囊泡； (b)將多層脂質體囊泡於高溫下(例如，在40至75℃之範圍內)經由聚碳酸酯膜(例如，大小為50 nm或100 nm)多次擠出以形成單層脂質體； (c)藉由透濾(diafiltration)或尺寸排阻層析法(size exclusion chromatography)或其他緩衝液交換方法實質上移除脂質體外部之捕獲劑；及 (d)在高溫下(例如，40至75℃)下，加熱於包含一或多種活性醫藥成分(API)之水溶液中的未負載脂質體，藉此形成藥物囊封之脂質體。
在一些實施例中，脂質係選自由以下組成之群：(a)至少10 mol%選自由磷脂醯膽鹼(例如，HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂醯甘油(例如，DSPG)、磷脂醯肌醇、甘油糖脂、神經鞘醣脂(例如，神經鞘磷脂)及其組合組成之群的磷脂；(b) 0至60 mol%膽固醇或其衍生物；及(c)視情況衍生成聚乙二醇的帶電荷磷脂(例如mPEG-2000-DSPE)。
在一些實施例中，捕獲劑係選自由以下組成之群：硫酸銨；聚陰離子化磺基丁醚環糊精(例如，TEA-SBE-α-環糊精、TEA-SBE-β-環糊精、TEA-SBE-γ-環糊精、Tris-SBE-α-環糊精、Tris-SBE-β-環糊精及Tris-SBE-γ-環糊精)的銨鹽或經取代之銨鹽；及聚陰離子化硫酸化碳水化合物(例如，TEA-SOS及Tris-SOS)的銨鹽或經取代之銨鹽；聚磷酸鹽(例如，肌醇六磷酸三乙銨及三(羥基甲基)胺基甲烷肌醇六磷酸)的銨鹽或經取代之銨鹽；過渡金屬鹽(例如，銅、鋅、錳、鎳、鈷或類似者與鹵化物、硫酸根離子及葡萄糖酸根離子形成的鹽)；四級銨化合物(例如，苯紮氯銨、苄索氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、硬脂基二甲基苄基氯化銨)；聚氧乙烯(亦即，聚乙二醇)及椰子胺。
在一些實施例中，方法包含選自以下之方法：主動負載、被動負載及其組合；其中主動或被動負載係選自以下組成之群： (a)基於pH梯度之主動負載方法，其基於跨膜pH梯度囊封API，其中脂質體之內部水性隔室的pH值低於脂質體外部之pH值； (b)基於過渡金屬之主動負載方法，其藉由利用過渡金屬離子通過錯合來驅動API攝入至脂質體中來囊封API； (c)被動負載方法，其在脂質體形成期間囊封API；及 (d)被動負載方法，其涉及脂質體形成之後的被動平衡。
在一些實施例中，pH梯度係藉由銨離子之濃度梯度或具有能夠質子化之銨衍生物或經取代之銨的有機化合物之濃度梯度來形成。
在一些實施例中，API係蛋白激酶抑制劑(有時較佳為酪胺酸激酶抑制劑)或化學治療劑與蛋白激酶抑制劑(有時較佳為酪胺酸激酶抑制劑)之組合。
在一些實施例中，化學治療劑係選自由以下組成之群：多柔比星、環磷醯胺、卡鉑、太平洋紫杉醇、道諾比星、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、艾瑞布林、伊沙匹隆、甲胺喋呤、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌、長春瑞濱、多西他賽、噻替派、博萊黴素、長春新鹼、達卡巴嗪、卡培他濱、普賴松、喜樹鹼、拓朴替康、伊立替康、卡莫司汀、順鉑、BCNU、來那度胺及培美曲塞。
在一些實施例中，蛋白激酶抑制劑係選自由以下組成之群：伊馬替尼、舒尼替尼、阿法替尼、尼達尼布、普納替尼、魯索利替尼、克唑替尼、依魯替尼、阿卡替尼、阿貝西利、阿法利貝、艾樂替尼、阿瓦替尼、阿西替尼、伯舒替尼、卡博替尼、卡普替尼、色瑞替尼、考比替尼、克唑替尼、達拉非尼、達可替尼、達沙替尼、恩拉非尼、恩曲替尼、厄達替尼、埃羅替尼、依維莫司、非達替尼、福他替尼、吉非替尼、吉列替尼、依魯替尼、拉帕替尼、拉羅替尼、樂伐替尼、勞拉替尼、尼達尼布、來那替尼、尼羅替尼、奈妥舒迪、奧希替尼、帕瑞替尼、帕唑帕尼、吡昔替尼、培米替尼、帕柏西利、普納替尼、吡昔替尼、普拉替尼、奎紮替尼、瑞戈非尼、瑞博西尼、力普替尼、塞爾帕替尼、司美替尼、索拉非尼、坦羅莫司、托法替尼、曲美替尼、圖卡替尼、優帕替尼、凡德他尼、維羅非尼、澤布替尼及塞維-阿法利貝及其組合。
在一些實施例中，脂質體具有4.5 nm至450 nm之間，較佳25 nm與300 nm之間，且更佳50 nm至200 nm之間的範圍內的平均粒度。
在另一態樣中，本發明提供如本文中任何實施例實例中所揭示及/或藉由根據本文中所揭示之任何實施例或實例之方法製備的複數個載藥脂質體。
在另一態樣中，本發明提供一種治療套組，其包含容器及在容器中的複數個根據本文所揭示之任何實施例之載藥脂質體，其中載藥脂質體係懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中或可懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中。
在本發明之其他實施例中，上文所描述的基於脂質之遞送媒劑包含第三或第四藥劑，例如任何治療劑、診斷劑或化妝劑。
在本發明之一些實施例中，提供包含一或多種磷脂之脂質體。在一些實施例中，磷脂係選自由以下組成之群：mPEG-2000-DSPE、DPPC、DMPC、DSPC、HSPC、DSPE、DSPG及其類似物。其中磷脂不少於總脂質之10 mol%，且帶負電荷之脂質為mPEG-2000 DSPE或DSPG，作為脂質體穩定脂質。
在本發明之一些實施例中，提供包含固醇之脂質體。在一些實施例中，固醇為具有約0至60%莫耳總脂質之膽固醇。
在本發明之一些實施例中，提供包含用於在脂質體核心隔室中主動負載之捕獲劑的脂質體。在一些實施例中，捕獲劑係選自由以下組成之群：硫酸銨；過渡金屬；以及以下之銨鹽或經取代之銨鹽：聚陰離子化硫酸化環糊精、磺基丁醚環糊精、聚陰離子化硫酸化糖、聚磷酸鹽及其類似物。
本發明之基於脂質之遞送媒劑不僅可用於非經腸投與，且亦可用於局部、經鼻、皮下、腹膜內、肌肉內、氣霧或經口遞送，或藉由將遞送媒劑施用至目標部位處或附近的天然或合成可植入裝置上或中，以用於治療目的或醫學成像及其類似者。較佳地，本發明之基於脂質之遞送媒劑用於非經腸投與，最佳地，靜脈內投與。
如熟習此項技術者將理解，所有載藥脂質體及由其製備之醫藥組合物必須在所使用的任何材料及方法所需之無菌條件下製備，以便用於投與至需要治療之個體。因此，雖然本揭示內容不限於此，但本文中所揭示或所要求且意欲用於治療個體之所有脂質體及醫藥組合物為無菌的。
本文中所描述之較佳實施例並不意欲為詳盡的，或將本發明之範疇限制為所揭示的精確形式。其經選擇及描述以最佳地解釋本發明之原理及其應用及實際使用，以允許熟習此項技術者瞭解其教示內容。
1.組合物
A.治療劑
a.蛋白激酶抑制劑
i. 酪胺酸激酶抑制劑(TKI) 可在本發明中使用抑制酪胺酸激酶路徑之任何化合物。研究中所描述之較佳化合物列於以下：伊馬替尼 靶向多個BCR-Abl及PDGFR α/β受體。舒尼替尼 靶向PDGFR α/β及VEGR家族受體。阿法替尼 靶向EGFR家族受體。尼達尼布 靶向PDGFR α/β及VEGFR家族受體。普納替尼 靶向BCR-Abl及Src家族受體。魯索利替尼 靶向JAK家族受體。克唑替尼 靶向ALK及c-Met受體。依魯替尼 靶向BTK受體。
其他TKI包括以下：阿卡替尼、艾樂替尼、安聖莎(alecensa)、阿瓦替尼、阿西替尼、伯舒替尼、卡博替尼、達可替尼、達沙替尼、恩曲替尼、埃羅替尼、吉列替尼、埃克替尼(icotinib)、拉帕替尼、米哚妥林(midostaurin)、來那替尼、尼羅替尼、帕瑞替尼、帕唑帕尼、吡昔替尼、奎紮替尼、瑞戈非尼、索拉非尼、凡德他尼、澤布替尼、阿法利貝等。
ii. 其他類型之蛋白激酶抑制劑 抑制其他激酶路徑之蛋白激酶抑制劑包括如下：阿貝西利、卡普替尼、拉羅替尼、勞拉替尼、奈妥舒迪、培米替尼、瑞博西尼、色瑞替尼、考比替尼、達拉非尼、恩拉非尼、厄達替尼、依維莫司、非達替尼、福他替尼、吉非替尼、樂伐替尼、奧希替尼、帕柏西利、普拉替尼、力普替尼、塞爾帕替尼、司美替尼、坦羅莫司、曲美替尼、圖卡替尼、優帕替尼、凡德他尼、維羅非尼。
許多蛋白激酶與人類癌症起始及進展相關。用於治療不同類型之癌症的蛋白激酶抑制劑之最新發展已證實在臨床療法中取得了成功。在蛋白激酶抑制劑當中，蛋白酪胺酸激酶(PTK)為細胞信號轉導過程中之主要信號傳導酶中之一者，其催化ATP-γ-磷酸酯轉移至基質蛋白質之酪胺酸殘基，使其磷酸化，從而調節細胞生長、分化、死亡及一系列生理及生物化學過程。PTK之異常表現通常導致細胞增殖病症，且與腫瘤侵襲、轉移及腫瘤血管生成密切相關。目前，多種PTK已用作篩選抗癌藥物之目標。PTK抑制劑與ATP競爭PTK之ATP結合部位且減少酪胺酸激酶磷酸化，藉此抑制癌細胞增殖。因此，PTK抑制劑已在癌症治療中取得巨大進展，但所產生之後天抗性仍不可避免，從而限制癌症治療。
較佳的PTK抑制劑描述於以下研究中。
伊馬替尼(IMT)為具有針對BCR-ABL融合基因、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)及c-KIT受體之高效及特異性抑制活性的TKI抑制劑。伊馬替尼之甲磺酸鹽(由Novartis以Gleevec® 市售)在2001年由FDA批准用於治療費城染色體(Philadelphia chromosome)陽性慢性骨髓性白血病(Ph+ CML)、與PDGFR基因重排相關聯之骨髓發育不良/骨髓增生性疾病、侵襲性全身性肥大細胞增多症、嗜伊紅白血球增多症候群、慢性嗜酸性球白血病、隆凸性皮膚纖維肉瘤及惡性胃腸道基質瘤。
另一較佳的TKI抑制劑舒尼替尼(SUN)為抑制PDGFR (A及B)、VEGFR1、VEGFR2、FLT3R、c-Kit及RET介導之信號傳導的多靶向酪胺酸激酶抑制劑。在2017年，FDA批准蘋果酸舒尼替尼以SUTENT® 由Pfizer作為輔助療法，以用於治療具有腎切除後復發性腎細胞癌(RCC)，疾病進展或對甲磺酸伊馬替尼不耐受後的胃腸基質瘤(GIST)、晚期腎細胞癌之高風險的成年患者。在患有不可切除之局部晚期或轉移性疾病之患者中的進展性、良好分化之胰臟神經內分泌腫瘤(pNET)。 b.化學治療劑
用於癌症治療之任何化學治療劑均可用於本發明中。研究中所描述之較佳化合物列於以下：多柔比星、環磷醯胺、卡鉑、太平洋紫杉醇、道諾比星、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、艾瑞布林、伊沙匹隆、甲胺喋呤、絲裂黴素、米托蒽醌、長春瑞濱、多西他賽、噻替派、博萊黴素、長春新鹼、達卡巴嗪、卡培他濱、普賴松、喜樹鹼、拓朴替康、伊立替康、卡莫司汀、順鉑、來那度胺、培美曲塞。
較佳的化學治療性化合物描述於以下研究中。
多柔比星常用於治療廣泛範圍之癌症，包括一些白血病及霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)，以及膀胱癌、乳癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、軟組織肉瘤、多發性骨髓瘤及其他癌症。
多柔比星為蒽環黴素抗生素，其與天然產物道諾比星密切相關。如同所有蒽環黴素，其藉由嵌入DNA起作用。多柔比星藉由嵌入且抑制大分子生物合成而與DNA相互作用。此抑制酶拓樸異構酶II之進展，其放鬆DNA中之超螺旋以用於轉錄。多柔比星在拓樸異構酶II錯合物已斷裂DNA鏈以用於複製之後使該拓樸異構酶II錯合物穩定，從而防止DNA雙螺旋再密封且藉此停止複製過程。分子之平面芳族發色團部分嵌入DNA之兩個鹼基對之間，而六員道諾胺糖(daunosamine sugar)位於小凹槽中且與緊鄰嵌入部位之側接鹼基對相互作用，如由若干晶體結構所證明。
其他蒽環黴素DNA嵌入劑包括道諾比星、阿魯黴素(arugamycin)、表柔比星(一種多柔比星之差向異構體(epimer)且僅在糖上C-4羥基之取向上不同)、伊達比星(一種道諾比星之類似物，其缺少C-4甲氧基)及伐柔比星(valrubicin) (N-三氟乙醯基、多柔比星之1-4-戊酸酯衍生物)。
數十年來，化學療法在癌症之輔助治療中發揮至關重要的作用且獲得廣泛發展。然而，抗藥性及腫瘤復發之出現通常與癌症化學療法相關，主要係由於癌症單一療法通常會發生之路徑重疊、串擾及中和反應。作為一實例，化學治療性蒽環黴素藥物多柔比星(DOX)已用於治療各種癌症，諸如乳癌、卵巢癌及三陰性(ER2、PR 2、Her-22)乳癌；然而，在多數情況下仍然出現抗性(Cobleigh MA (2011). Semin. Oncol., 38, 增刊2: S11-16)。對於其他癌症，諸如黑色素瘤，多柔比星由於固有抗性而無法常規地使用。因此，儘管多柔比星為高效化學治療劑，但由於其抗性以及由於其狹窄治療窗(例如，心臟毒性)，其用途極有限(Shi., Y,等人(2011). Herz 36: 296-305)。
對於癌症及癌症抗藥性治療，已在臨床研究中頻繁進行使用多柔比星及其他癌症藥物之組合方案的研究。已報導多柔比星與酪胺酸激酶抑制劑伊馬替尼之組合可藉由抑制ABC運輸蛋白功能而有效地逆轉與多柔比星相關的固有及後天抗性(Sims, J. T.等人, PLOS One 2013, 8, e55509)。Maurel等人(2010)在患有胃腸道肉瘤腫瘤難治性之患者中進行多柔比星加上伊馬替尼之I-II期研究。得出結論，多柔比星與伊馬替尼之低劑量化學生物療法組合在經許多預治療之胃腸道肉瘤腫瘤患者中，尤其在患有WT KIT表現型之彼等患者中展示出具有前景的活性，且對高劑量伊馬替尼療法沒有反應之患者顯示為是種合理及安全的選項(Maurel J,等人, Cancer. 2010, 116(15):3692-3701)。
另一較佳的化合物吉西他濱為展現抗腫瘤活性之核苷類似物。已知吉西他濱HCl可有效治療胰臟癌及肺癌。一般而言，吉西他濱係藉由干擾核酸合成來防止細胞製造DNA及RNA。此動作阻止癌細胞生長，從而引起細胞死亡。Michaelson等人(2015)報導吉西他濱及舒尼替尼在患有肉瘤樣及/或高危轉移性腎細胞癌之患者中的2期試驗。得出結論，抗血管生成療法及細胞毒性化學療法對於侵襲性RCC患者而言為一種有效及耐受良好的組合。該組合比任一單獨療法更有效。(Michaelson, M.D.等人, Cancer, 2015, 121(19):3435-43)。
其他類別之化學治療性化合物包括抗腫瘤藥物，諸如伊立替康、長春瑞濱、吉西他濱、拓朴替康、長春新鹼或類似者，亦可用於本發明中。
B.非經腸調配物 本文中所描述之化合物可經調配以用於非經腸投與。如本文中所使用，「非經腸投與」意謂藉由除經由消化道或非侵入性局部或區域途徑以外的任何方法投與。舉例而言，非經腸投與可包括藉由注射及藉由輸注靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節內、前列腺內、胸膜內、氣管內、玻璃體內、瘤內、肌肉內、皮下、結膜下、囊泡內、心包內、臍內對患者進行投與。
可使用此項技術中已知之技術將非經腸調配物製備為水性組合物。通常，可將此類組合物製備為可注射調配物，例如溶液或懸浮液；適合用於在注射之前添加復原介質時製備溶液或懸浮液的固體形式；乳液，諸如油包水(w/o)乳液、水包油(o/w)乳液及其微乳液、脂質體或乳脂體。
載劑可為含有例如水、緩衝液及等張劑之溶劑或分散介質，例如糖、HEPES緩衝液或氯化鈉等。
可在與一或多種醫藥學上可接受之賦形劑適當混合的水或另一種溶劑或分散介質中製備呈游離酸或鹼或其藥理學上可接受之鹽形式的活性化合物之溶液及分散液，所述賦形劑包括(但不限於)界面活性劑、分散劑、乳化劑、pH值調節劑、黏度調節劑及其組合。
調配物可含有防腐劑以防止微生物生長。適合的防腐劑包括(但不限於)對羥苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸及硫柳汞。調配物亦可含有抗氧化劑以防止活性劑降解。
通常將調配物緩衝至3至8之pH以便在復原時非經腸投與。適合的緩衝液包括(但不限於) HEPES緩衝液、磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液及檸檬酸鹽緩衝液。
水溶性聚合物通常用於非經腸投與之調配物中。適合的水溶性聚合物包括(但不限於)聚乙烯吡咯啶酮、葡聚糖、羧甲基纖維素及聚乙二醇。
可藉由用上文所列之賦形劑中之一或多者將活性化合物以所需量併入適當溶劑或分散介質中，視需要，隨後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將各種滅菌活性成分併入含有鹼性分散介質及來自上文所列之彼等成分之所需其他成分的無菌媒劑中來製備分散液。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，較佳的製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，該等技術自其先前無菌過濾溶液中產生活性成分加任何額外所需成分之粉末。可以使得粒子本質上為多孔之方式製備粉末，此可增加粒子之溶解度。用於製備多孔粒子之方法為此項技術中已知的。
2.控制釋放調配物 可調配本文中所描述之非經腸調配物以用於控制釋放，包括立即釋放、延遲釋放、延長釋放、脈衝式釋放及其組合。
對於非經腸投與，一或多種化合物及視情況選用之一或多種額外活性劑可併入提供化合物及/或一或多種額外活性劑之控制釋放的微米粒子、奈米粒子或其組合中。在其中調配物含有兩種或更多種藥物之實施例中，藥物可經調配用於相同類型之控制釋放(例如，延遲、延長、立即或脈衝式)或藥物可獨立地調配用於不同類型之釋放(例如，立即及延遲、立即及延長、延遲及延長、延遲及脈衝式等)。
舉例而言，化合物及/或一或多種額外活性劑可併入提供藥物之控制釋放的奈米粒子及微米粒子中。藉由藥物自奈米粒子及微米粒子中之擴散及/或聚合物粒子藉由水解及/或酶促降解來控制藥物釋放。適合的聚合物包括脂質及其他天然或合成脂質衍生物。
不溶於水之蛋白質(諸如玉米蛋白)亦可用作用於形成含有奈米粒子及微米粒子之藥物的材料。另外，水溶性的蛋白質、多醣及其組合可與藥物一起調配成微米粒子且隨後交聯以形成不可溶的網狀物。舉例而言，環糊精可與個別藥物分子錯合且隨後交聯。
將藥物囊封或併入載劑材料中以產生含有奈米粒子及微米粒子之藥物可經由已知醫藥調配技術實現。在以磷脂或磷脂類材料調配之情況下，通常將載劑材料加熱至高於其熔融溫度且添加藥物以形成包含懸浮於載劑材料中之藥物粒子、溶解於載劑材料中之藥物或其混合物的混合物。奈米粒子及微米粒子可隨後經由若干方法調配，包括(但不限於)凝結、擠出、噴霧冷卻或水性分散之方法。在一較佳的方法中，將脂質加熱至高於其熔融溫度，在水溶液中復水，擠壓且負載藥物。此等方法為此項技術中已知的。
3.活體外測定非拮抗組合藥物比率 在本發明之另一態樣中，化學治療劑及蛋白激酶抑制劑將以協同或累加(亦即非拮抗)比率囊封於脂質體中。可基於實驗之類型使用各種演算法(較佳為本發明中之Chou-Talalay中位數效應方法)來進行顯示協同或累加組合作用的藥劑之比率之測定(Chou, T.C., J. Theor. Biol. (1976) 39:253-276)。
通常使用培養物中之細胞在活體外測定基礎實驗資料。較佳地，將組合指數(CI)繪製為受影響細胞之分率(Fa)之函數，如上文所解釋，濃度範圍之替代參數。較佳的藥劑組合為在實質Fa值範圍內顯示協同作用或累加作用的彼等藥劑組合。若在其中超過1%之細胞受到影響的至少約5%之濃度範圍(亦即，大於0.01之Fa範圍)內為非拮抗的，則選擇藥劑組合。較佳地，較大部分之總體濃度展現有利CI；例如5%之Fa範圍為0.2至1.0。更佳地，此範圍之約10%展現有利CI。甚至更佳地，在組合物中使用約20%之Fa範圍，較佳超過約50%且最佳超過0.2至1.0之Fa範圍之至少約70%。可在多種藥劑比率下再評估在Fa值之實質範圍內顯示協同作用的組合，以定義最佳比率以增強非拮抗相互作用之強度且增加觀測到協同作用的Fa範圍。
雖然期望在細胞受影響之整個濃度範圍內具有協同作用，但已觀測到，在許多情況下，當使用諸如MTT分析之分光光度法時，結果在0.2至0.8之Fa範圍內相當可靠。因此，儘管藉由本發明之組合展現的協同作用經闡述存在於0.01或更大之廣泛範圍內，但較佳地，協同作用建立於0.2至0.8之Fa範圍內。然而，其他更敏感的分析可用於評估Fa值大於0.8時之協同作用，例如生物發光或選殖形成分析。
最佳組合比率可進一步用作單一醫藥單元以測定與第三藥劑之協同或累加相互作用。另外，三種藥劑組合可用作用以測定與第四藥劑之非拮抗相互作用的單元等等。
如上文所闡述，將用「相關」細胞進行對細胞培養物之活體外研究。細胞之選擇將視藥劑之既定治療用途而定。僅一種相關細胞株或細胞培養物類型需要展現所需非拮抗作用，以便為組合物落入本發明之範疇內提供基礎。
舉例而言，在本發明之一個較佳實施例中，藥劑組合意欲用於抗癌療法。在一常見實施例中，藥劑組合意欲用於多種癌症，諸如白血病或淋巴瘤療法、乳癌、三陰性乳癌、胃腸癌及肺癌。接著對待測試之細胞及測試之性質進行適當的選擇。特定言之，腫瘤細胞株為適合的個體且細胞死亡或細胞停滯之量測為適當終點。如下文將進一步論述，在試圖尋找用於其他適應症之適合非拮抗組合的情形下，可採用除細胞毒性或細胞停滯外的其他目標細胞及標準。
對於涉及抗腫瘤劑之測定，細胞株可自標準細胞株儲存庫(例如，NCI或ATCC)、學術機構或包括商業來源之其他組織獲得。較佳的細胞株將包括一或多種選自由NCI/NIH之發展治療計劃鑑別的細胞株。此計劃使用之腫瘤細胞株篩選目前鑑別約60種不同的腫瘤細胞株，其表示白血病、黑色素瘤及肺癌、結腸癌、腦癌、卵巢癌、乳癌、前列腺癌、胃癌及腎癌等。所需濃度範圍內之所需非拮抗作用僅需要展示於單一細胞類型上；然而，較佳至少兩個細胞株展現此作用，更佳三個細胞株，更佳五個細胞株，且更佳10個細胞株。細胞株可為已建立的腫瘤細胞株或自患者樣品獲得之原代培養物。細胞株可來自任何物種，但較佳來源將為哺乳動物且特定言之人類。細胞株可在藉由各種實驗室條件下選擇來進行基因改變。
在一個較佳實施例中，給定的作用(Fa)係指將細胞毒性劑施用至細胞培養物之後的細胞死亡或細胞停滯。在本發明中，可藉由MTT分析來量測細胞死亡或存活率。可針對除癌症以外之疾病適應症來測定兩種或更多種藥劑之非拮抗比率，且此資訊可用於製備用於治療此等疾病之兩種或更多種藥物之治療性調配物。關於活體外分析，可選擇許多可量測之終點來定義藥物協同作用，其限制條件為彼等終點對於特定疾病而言為治療上相關的。如上文所闡述，將用「相關」細胞進行對細胞培養物之活體外研究。細胞之選擇將視藥劑之既定治療用途而定。可使用由將腫瘤樣品均質化成單一細胞產生之「腫瘤勻漿」來進行對個別患者活檢體或整個腫瘤之活體外研究。在一個較佳實施例中，給定作用(Fa)係指將細胞毒性劑施用至「相關」細胞培養物之後的細胞死亡或細胞停滯。可使用此項技術中已知之多種方法來量測細胞死亡或存活率。
4.製備基於脂質之遞送媒劑 用於本發明之較佳脂質載劑為脂質體。適用於本發明之脂質體包括大單層囊泡(LUV)、多層囊泡(MLV)、小單層囊泡(SUV)及交指融合脂質體。用於本發明之脂質體可經製備以含有磷脂醯膽鹼脂質或磷脂類材料，諸如二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)或氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)。
本發明之脂質體亦可含有固醇，諸如膽固醇。脂質體亦可含有治療性脂質，其實例包括醚脂質、磷脂酸、膦酸酯、神經醯胺及神經醯胺類似物、神經鞘胺醇及神經鞘胺醇類似物及含絲胺酸之脂質。
脂質體亦可用表面穩定親水性聚合物-脂質結合物(諸如聚乙二醇-DSPE)來製備，以增強循環壽命。亦可將帶負電荷之脂質(諸如磷脂醯甘油(PG)及磷脂醯肌醇(PI))之併入添加至脂質體調配物中以增加載劑之循環壽命。此等脂質可用於代替親水性聚合物-脂質結合物作為表面穩定劑。本發明之較佳實施例可利用含有磷脂醯甘油(PG)或磷脂醯肌醇(PI)之脂質體來防止聚集，藉此增加載劑之血液滯留時間。
在一個實施例中，根據本發明之脂質體組合物較佳用於治療癌症。藉由投與本發明之脂質體來實現將經囊封藥物遞送至腫瘤部位。較佳的脂質體具有小於300 nm之平均粒徑。最佳脂質體具有小於200 nm之平均粒徑。由於內皮中之穿孔或間隙，腫瘤脈管系統通常比正常脈管系統更容易滲漏。此允許直徑為200 nm或更小之遞送媒劑穿透非連續的內皮細胞層及包圍將血液供應至腫瘤之血管的下層基底膜。外滲之後遞送媒劑選擇性聚集至腫瘤部位產生增強的抗癌藥物遞送及治療有效性。
可利用各種方法將活性劑囊封在脂質體中。「囊封」包括藥劑與基於脂質之遞送媒劑之共價或非共價締合。舉例而言，此可藉由藥劑與脂質體之一或多個外層之相互作用或藥劑在脂質體內之截留來進行，在脂質體之不同部分之間實現平衡。因此，可藉由與脂質體之雙層相互作用經由與脂質組分共價或非共價相互作用或脂質體之水性內部中之截留，或在內部水相及雙層之間處於平衡而使藥劑締合來囊封藥劑。「負載」係指將一或多種藥劑囊封至遞送媒劑中之動作。
可經由囊封於單獨遞送媒劑中或同一遞送媒劑內來實現所需組合之囊封。當需要囊封至單獨脂質體中時，各脂質體之脂質組合物可能完全不同以允許協調的藥物動力學。藉由改變媒劑組合物，可匹配囊封藥物之釋放速率以允許將所需比率之藥物遞送至腫瘤部位。改變釋放速率之方法包括增加形成囊泡之脂質之醯基鏈長以改善藥物滯留，控制表面接枝親水性聚合物(諸如mPEG-DSPE)自脂質體膜中的交換及將膜硬化劑(諸如固醇或神經鞘磷脂)併入膜中。熟習此項技術者應顯而易見，若需要以特定藥物比率投與第一及第二藥物且若第二藥物在第一藥物之脂質體組合物(例如，DMPC/膽固醇)內保留不良，則可藉由將第二藥物囊封於具有增加之醯基鏈長之脂質的脂質體組合物(例如，DSPC/膽固醇)中來實現改善之藥物動力學。當囊封於單獨脂質體中時，應容易接受，可藉由在投與之前組合適當量之各脂質體囊封藥物，針對個別患者產生已在患者特異性基礎上確定以提供最佳治療活性的兩種藥物之比率。替代地，兩種或更多種藥劑可囊封於同一脂質體內。
用於囊封之技術視治療劑及遞送媒劑之性質而定。舉例而言，可使用被動及主動負載方法將治療劑負載至脂質體中。將活性劑囊封於脂質體中之被動方法涉及在脂質體之製備期間囊封活性劑。此技術引起多層囊泡(MLV)之形成，其可在擠出時轉化為大單層囊泡(LUV)或小單層囊泡(SUV)。另外，另一適合的被動囊封方法涉及在形成脂質體之後的被動平衡。此方法涉及在經改變或非環境(基於溫度、壓力等)條件下培育預先形成之脂質體及將治療劑(例如，化學治療劑及/或蛋白激酶抑制劑)添加至脂質體之外部。治療劑接著平衡進入脂質體內部，穿過脂質體膜。接著使脂質體返回至環境條件且經由透析或另一適合方法移除未囊封的治療劑(若存在)。
藥物囊封之主動負載方法包括pH梯度負載方法及活性過渡金屬負載技術。基於跨膜pH梯度之負載方法利用單陰離子或聚陰離子之銨鹽或經取代之銨鹽作為捕獲劑，該捕獲劑在囊封治療劑之前預負載至脂質體中。彼等捕獲劑建立跨膜pH梯度且亦可與治療劑形成沈澱、聚集或膠凝，該治療劑用作用於將藥劑主動負載至脂質體中之驅動力。關於pH梯度，通常公認脂質體之內部與外部環境之間的pH值差至少大於一個單位。用以建立且維持脂質體上之pH梯度的其他方法涉及使用可插入脂質體膜中且跨越膜運輸以交換質子的離子載體。其中，活性過渡金屬負載技術利用過渡金屬經由錯合或配位驅動藥劑攝入至脂質體中。
適合的捕獲劑可為陰離子、陽離子、兩性或非離子活性劑，包括(但不限於)含有羧酸鹽、聚磷酸鹽、磺酸鹽(包括長鏈烷基磺酸鹽及烷基芳基磺酸鹽)及硫酸鹽之彼等。陽離子捕獲劑包括四級銨化合物，諸如苯紮氯銨、苄索氯銨、十六烷基三甲基溴化銨、硬脂基二甲基苄基氯化銨、聚氧乙烯及椰子胺及其類似物。
捕獲劑之更特定實例包括硫酸銨、過渡金屬及以下之銨鹽或經取代之銨鹽：聚陰離子化硫酸化環糊精、磺基丁醚環糊精、聚陰離子化硫酸化糖、聚磷酸鹽及其類似物。
特定言之，捕獲劑包括以下聚陰離子化硫酸化糖之銨鹽或經取代之銨鹽：蔗糖八硫酸鹽、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質素、硫酸乙醯肝素及硫酸化玻尿酸、褐藻糖膠(fucoidan)、半乳聚糖(galactan)、角叉菜膠(carrageenan)、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)、半乳褐藻聚糖(galactofucan)、甘露糖醛酸褐藻聚糖(mannoglucuronofucan)、硫酸阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactans sulfate)、硫酸甘露聚糖(mannan sulfate)、硫酸化異鼠李聚糖(sulfated heterorhamnan)及硫酸木甘露聚糖(xylomannan sulfate)及其類似物。
特定言之，捕獲劑包括以下形式之磺基丁醚環糊精之銨鹽或經取代之銨鹽：磺基丁醚-α-環糊精、磺基丁醚-β-環糊精及磺基丁醚-γ-環糊精。
特定言之，捕獲劑包括以下聚磷酸鹽之銨鹽或經取代之銨鹽：植酸、三磷酸、聚磷酸及環狀三偏磷酸鹽。
特定言之，上述聚陰離子之相對離子包括銨鹽及經取代之銨，其進一步包括以下之質子化形式：三乙胺、三乙醇胺、三(羥基甲基)胺基甲烷或緩血酸胺、二乙醇胺、乙二胺、三丁胺、1,4-二吖雙環[2.2.2]辛烷、二乙基乙醇胺、二乙醇乙胺、乙醇胺及嗎啉。
基於過渡金屬離子之捕獲劑包括以下之鹽形式：銅離子、鋅離子、錳離子、鎳離子及鈷離子。金屬之相對離子包括硫酸根離子、氯化物、葡萄糖酸根離子、溴化物及氫氧化物。
更特定言之，用於脂質體載藥之捕獲劑包括以下：硫酸銨、蔗糖八硫酸三乙銨(TEA-SOS)、三乙銨磺基丁醚β-環糊精(TEA-SBE-β-CD)；磺基丁醚-β-環糊精之三(羥基甲基)胺基甲烷鹽(Tris-SBE-β-CD)、植酸或肌醇六磷酸之三乙銨鹽(TEA-IP6)、葡糖酸銅、硫酸銅、氯化銅及硫酸鋅。
亦可偶合截留之被動及主動載藥方法以便製備含有超過一種囊封藥劑之脂質體調配物。
5.活體內投與本發明之組合物 如上文所提及，可將本發明之遞送媒劑組合物投與至溫血動物，包括人類以及家禽物種。對於治療人類病痛，合格的醫師將使用已建立之方案確定應如何在投與之劑量、時程及途徑方面使用本發明之組合物。若囊封於本發明之遞送媒劑組合物中之藥劑對個體之健康組織展現降低的毒性，則此類施用亦可利用劑量遞增。
較佳地，非經腸，亦即動脈內、靜脈內、腹膜內、皮下或肌肉內投與本發明之醫藥組合物。更佳地，藉由推注或輸注注射靜脈內或腹膜內投與醫藥組合物。
在其他方法中，本發明之醫藥或化妝用製劑可藉由將製劑直接施用至組織而與目標組織接觸。可藉由局部「開放」或「封閉」程序進行施用。藉由「局部」，意謂將多藥製劑直接施用至暴露於環境之組織，諸如皮膚、口咽、外耳道及其類似者。「開放」程序為包括切開患者皮膚且直接觀察施用醫藥製劑之皮下組織的彼等程序。此通常藉由手術程序來實現，諸如用以進入肺部之開胸術、用以進入腹部內臟之腹部開腹術或用以進入目標組織之其他直接手術方法。「封閉」程序為侵入性程序，其中內部目標組織不直接可視化，而是經由皮膚中的小傷口插入器械來進入。舉例而言，可藉由針灌洗向腹膜投與製劑。替代地，可經由內窺鏡裝置投與製劑。
包含本發明之遞送媒劑的醫藥組合物根據標準技術製備且可包含水、緩衝水、0.9%生理鹽水、0.3%甘胺酸、5%右旋糖、等滲蔗糖溶液及其類似者，包括用於增強穩定性之糖蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白及其類似者。此等組合物可藉由習知熟知滅菌技術滅菌。所得水溶液可封裝以供使用或在無菌條件下過濾且凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水溶液組合。組合物可含有接近生理條件所需的醫藥學上可接受之輔助物質，諸如pH調節及緩衝劑、張力調節劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣及其類似物。替代地，遞送媒劑懸浮液可包括脂質保護劑，其保護脂質在儲存時免受自由基及脂質過氧化損害。親脂性自由基淬滅劑(諸如α-生育酚)及水溶性鐵特異性螯合劑(諸如鐵胺)為適合的。
醫藥調配物中之遞送媒劑之濃度可廣泛變化，例如自小於約0.05重量%，通常為或至少約2至5重量%至多達10至30重量%，且將根據所選擇的特定投與模式,主要藉由流體體積，黏度及其類似者來選擇。舉例而言，可增加濃度以降低與治療相關之流體負載。替代地，可將由刺激性脂質構成之遞送媒劑稀釋至低濃度以減輕投與部位處之炎症。對於診斷，所投與之遞送媒劑之量將視所使用之特定標記，經診斷之疾病狀態及臨床醫師之判斷而定。
較佳地，靜脈內投與本發明之醫藥組合物。遞送媒劑調配物之劑量將視藥物與脂質之比率及投與醫師基於患者年齡，體重及病狀之意見而定。
除醫藥組合物之外，適用於獸醫學用途之調配物可以適合於個體的方式製備及投與。較佳的獸醫學個體包括哺乳動物物種，例如非人類靈長類動物、狗、貓、牛、馬、綿羊及家養家禽。個體亦可包括實驗室動物，例如，特定言之，大鼠、兔、小鼠及天竺鼠。
6.封裝套組 本發明組合物中之治療劑可分別調配於個別組合物中，其中各治療劑與適當遞送媒劑穩定締合。只要協調遞送媒劑之藥物動力學以使得所投與治療劑之比率維持在治療目標處，就可單獨向個體投與此等組合物。因此，構築套組係有用的，該等套組包括在單獨容器中的包含與至少一種第一治療劑穩定締合之遞送媒劑的第一組合物及在第二容器中的包含與至少一種第二治療劑穩定締合之遞送媒劑的第二組合物。容器可接著封裝於封裝套組中。
套組亦將包括關於向個體投與組合物之模式的說明書，至少包括對待投與的各組合物之量之比率的描述。替代地或另外，套組經構築以使得預量測各容器中之組合物之量，使得一個容器之內含物與另一容器之內含物組合表示正確比率。替代地或另外，容器可標記有允許根據可見刻度分配適當量的量測刻度。容器本身可用於投與；例如，套組可在單獨注射器中含有適當量之各組合物。包含預調配之正確比率之治療劑的調配物亦可以此方式封裝，使得直接自預封裝於套組中之注射器中投與調配物。
定義 除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術術語、標記及其他科學術語或術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同的含義。在一些情況下，為了清楚起見及/或為便於參考，本文中定義具有通常所理解之含義的術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中一般所理解的實質性差異。熟習此項技術者充分理解且通常使用習知方法論採用本文中描述或提及之許多技術及程序。按需要，除非另外指出，否則涉及市售可得之套組及試劑之使用的程序通常根據製造商所定義之方案及/或參數進行。本文所提及之所有專利、申請案、公開申請案及其他公開案以全文引用之方式併入本文中。若此章節中所闡述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開之申請案及其他公開案中所闡述之定義相反或者不一致，則以此章節中所闡述之定義，而非以引用方式併入本文中的定義為準。
如本文中所使用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物，且反之亦然，任何複數形式包括單數指示物。
除非另外定義，否則術語「約」或「大致」通常包括所指示數目之至多加或減10%。舉例而言，「約10%」可指示9%至11%之範圍，且「約20」可意謂18至22。有時較佳地，「約」包括指示值之至多加或減5%。替代地，「約」包括指示值之至多加或減5%。當在範圍之前使用「約」時，其適用於該範圍之下限及上限兩者。
如一般熟習此項技術者將理解，如本文中所使用之術語「實質上」意謂「大部分」或「基本上」，且若可定量量測，則其係指至少90%，較佳至少95%，更佳至少98%。
除非另外指出，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」或類似者應理解為開放式術語(亦即，意謂「包括(但不限於)」)。
如本文中所使用，術語「協同作用」意謂兩種或更多種藥物之間的相互作用，其造成藥物之總作用大於各藥物之個別作用之總和。
「協同比率」意謂可獲得協同作用之組合中使用的兩種或更多種藥物之莫耳比。
如本文中所使用，術語「協同細胞毒性作用」係指兩種或更多種藥物之間的相互作用，其造成藥物之總作用大於各藥物之個別作用之總和。此總作用引起細胞殺死及最終腫瘤縮小。
如本文中所使用，術語「協同細胞抑制作用」係指兩種或更多種藥物之間的相互作用，其造成藥物之總作用大於各藥物之個別作用之總和。此總作用引起在不直接殺死細胞之情況下的腫瘤生長抑制。
術語「累加作用」意謂藉由兩種或更多種藥物之作用產生的組合作用等於其單獨作用之總和。
「累加比率」意謂可獲得累加作用之組合中使用的兩種或更多種藥物之莫耳比。
術語「非拮抗比率」係指協同比率及累加比率兩者。
如本文中所使用，術語「拮抗作用」意謂對暴露於兩種或更多種藥物之治療性反應，其小於將個別藥物之已知作用加在一起時所預期的治療性反應。
如本文中所使用之術語「拮抗比率」係指可獲得拮抗作用之組合中使用的兩種或更多種藥物之莫耳比。
術語「組合指數」係指用於測定藥物相互作用之程度的參數。可基於如Chou及Talalay所描述之中位數效應分析演算法來計算組合指數(CI) (Adv. Enzyme Reg. (1984), 22:27-55)。CI值＜ 0.9指示協同藥物相互作用；0.9 ≤CI≤ 1.1反映累加作用且CI值 ＞1.1指示拮抗作用。
術語「受影響分率」係指在活體外分析中特定藥物劑量影響其生長的細胞之分率。受影響分率用於計算如Chou及Talalay所描述之組合指數(Adv. Enzyme Reg. (1984), 22:27-55)。
「相關」細胞係指適合於測試所需生物作用之至少一種細胞培養物或細胞株。由於此等藥劑用作抗腫瘤劑，因此「相關」細胞係由國家癌症研究所(National Cancer Institute；NCI)/國立衛生研究院(National Institutes of Health；NIH)之發展治療計劃(Developmental Therapeutics Program；DTP)鑑別為適用於其抗癌藥物發現計劃的細胞株之彼等細胞。目前，DTP篩選利用60種不同的人類腫瘤細胞株。需要證實對此類細胞株中之至少一者的所需活性。
「腫瘤勻漿」係指自患者活檢體或腫瘤之均質化產生的細胞。可由合格醫師經由標準醫學技術實現完整腫瘤或腫瘤活檢體之提取，且可在實驗室中使用此項技術中熟知之多種方法進行將組織均質化為單一細胞。
如本文中所使用之術語「捕獲劑」係指存在於脂質體之水性隔室內且用於將一或多種藥物截留及保留在脂質體內之相同位置內的化學化合物。
術語「脂質體」係指由一或多個磷脂雙層構成之球形囊泡，其與細胞膜之結構非常類似。
如本文中所使用之片語「單層囊泡」係指由一個脂質雙層膜構成之球形囊泡，該脂質雙層膜限定單個封閉的水性隔室。雙層膜由兩層脂質構成：內層及外層。外層中之脂質分子以其親水性頭部部分朝向外部水性環境且其疏水性尾部向下指向脂質體之內部來定向。脂質之內層直接位於外層下方，脂質以其頭部面向脂質體之水性內部且其尾部朝向脂質之外層之尾部來定向。
如本文中所使用之片語「多層囊泡」係指由超過一個脂質雙層膜構成之脂質體，該脂質雙層膜限定超過一個封閉的水性隔室。該等膜同心地配置以使得不同膜由水性隔室分隔開，非常像洋蔥。
「化學治療劑」意謂可用於治療癌症之藥物物質。化學治療劑亦稱為細胞毒性劑，其作用引起細胞殺死及最終腫瘤縮小。可出於治癒目的或延長生命或減輕症狀而投與化學治療劑。化學治療劑可與諸如放射療法或手術之其他癌症治療結合投與。
「蛋白激酶抑制劑」意謂一大類獨特且有效的抗腫瘤劑，其特異地靶向在癌細胞中改變且造成其中之一些異常生長的蛋白激酶。蛋白激酶抑制劑之作用通常為細胞抑制的，其意謂在不直接殺死細胞之情況下抑制腫瘤生長。因此，蛋白激酶抑制劑毒性較小，且在適當患者群體中，蛋白激酶抑制劑比習知化學治療劑更有效。
「釋放」意謂囊封於脂質體中之藥物穿過構成脂質體之脂質膜且接著離開至脂質體外部。
如本文中所使用之術語「囊封」係指包圍內相，其通常產生與外部介質分隔開之內部空腔。因此，如本文中所描述「囊封」內相/內部空腔之組分。如本文中所描述，被包圍或囊封之內相為水相。負載至脂質體之內部空腔中且因此直至觸發脂質體釋放為止不可供外部介質使用的治療藥物之量將視為「囊封」於脂質體內。
如本文中所使用之片語「共囊封」及「共囊封的」係指兩種或更多種治療劑囊封於脂質體內之情況。
如本文中所使用之術語「被動負載」係指脂質體藥物產品製備中使用之載藥技術。在一種情形下，可藉由在脂質體形成期間囊封治療劑來實現被動負載。在另一情形下，被動負載涉及在形成脂質體之後的被動藥物平衡。在以上兩種情況下，治療劑負載於脂質體之水性隔室內。
如本文中所使用之片語「主動負載」係指脂質體藥物產品製備中使用之載藥技術。此項技術中通常使用之主動負載方法包括跨膜pH梯度負載技術及過渡金屬負載技術。前者利用單陰離子或聚陰離子之銨鹽或經取代之銨鹽作為捕獲劑，該捕獲劑在囊封治療劑之前預負載至脂質體中。基於如藉由pH梯度所測定之平衡，治療劑可「主動地」擴散至脂質體之水性隔室中，經由形成沈澱、聚集或膠凝而與預負載捕獲劑相互作用，此用作將治療劑囊封於脂質體內部的另一驅動力。基於過渡金屬之負載技術利用過渡金屬經由錯合或配位驅動藥劑攝入至脂質體中。總體而言，與自被動負載技術獲得之囊封效率相比，藉由使用主動負載技術可實現高得多的治療劑囊封效率(例如＞ 90%)。
術語「平均粒度」係指脂質體之平均直徑。此可藉由基於動態光散射之儀器來量測。
術語「經取代之銨」意謂銨離子中之氫原子經一或多種烷基或一些其他有機基團取代以形成經取代之銨離子。
術語「三陰性乳癌」係指一種類型之乳癌，其中癌細胞不具有雌激素或孕酮受體，且亦不產生過多的稱為人類表皮生長因子受體2 (HER2)之蛋白質。亦即，細胞對以上受體之全部三種測試均測試為「陰性」。
術語「抗藥性癌症」係指對給定治療劑展示抗性之癌症類型。當癌細胞對通常能夠殺死或削弱其之藥物沒有反應時，出現抗藥性。抗藥性可在給與治療之前存在(固有抗性)或可在藥物治療期間或之後出現(後天抗性)。在癌症治療中，存在許多可對抗癌藥物具有抗性之事物。舉例而言，DNA變化或其他遺傳變化可改變藥物進入癌細胞之方式或藥物在癌細胞內分解之方式。抗藥性可導致癌症治療不起作用或導致癌症復發。
術語「有效量」係指實現所需生物或治療作用所必需或足以實現所需生物或治療作用的量。
術語「治療有效量」意謂有效遞送延遲所治療之特定疾病、病症或病狀發作、抑制所治療之特定疾病、病症或病狀進展或完全中斷所治療之特定疾病、病症或病狀，或以其他方式對待治療的個體提供所需作用所需的治療有效量之活性劑的量。如一般熟習此項技術者應理解，治療有效量隨患者之年齡、病狀及性別以及患者之疾病、病症或病狀之性質及程度而變化，且劑量可由個別醫師(或獸醫)調節。
術語「醫藥學上可接受」描述在生物學上或在其他方面非所需(亦即，不會引起不可接受水準之不合需要的生物作用或以有害方式相互作用)的物質。
術語「治療(treating)」及「治療(treatment)」或其類似術語係指逆轉、緩解、抑制或減緩此類術語適用之疾病、病症或病狀之進展，或此類疾病或病症或病狀之一或多種症狀。
本文中所使用之術語「個體」或「患者」係指人類患者或哺乳動物，諸如貓、狗、牛、馬、猴或其類似者。
藉由以下實例進一步描述本發明。提供實例僅僅係為了參考特定實施例說明本發明。此等例證雖然說明本發明之某些特定態樣，但並不描繪限制或限定本發明之範疇。
使用以下縮寫： API：活性醫藥成分 DOX：多柔比星 IMT：伊馬替尼 SUN：舒尼替尼 GEM：吉西他濱 DOX-L：用多柔比星囊封之脂質體 IMT-L：用伊馬替尼囊封之脂質體 SUN-L：用舒尼替尼囊封之脂質體 GEM-L：用吉西他濱囊封之脂質體 DOX/IMT-L：用多柔比星及伊馬替尼囊封之脂質體 DOX/SUN-L：用多柔比星及舒尼替尼囊封之脂質體 GEM/SUN-L：用吉西他濱及舒尼替尼囊封之脂質體 mPEG-2000-DSPE，鈉鹽：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺鈉 DSPC：1,2-二硬脂醯基-sn -甘油-3-磷酸膽鹼 DMPC：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 DPPC：1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼 DSPG：1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸甘油 HSPC：氫化L-α-磷脂醯膽鹼 PG：磷脂醯甘油 Chol：膽固醇 SUV：小單層囊泡 LUV：大單層囊泡 MLV：多層囊泡 MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2-H四唑鎓溴化物 TEA：三乙胺 TEA-SOS：蔗糖八硫酸三乙銨 TEA-SBE-β-CD：三乙銨磺基丁醚-β-環糊精 Tris-SBE-β-CD：三(羥基甲基)胺基甲烷磺基丁醚-β-環糊精 SBE-β-CD：磺基丁醚-β-環糊精 EDTA：乙二胺四乙酸 HEPES：N-2-羥基乙基-哌𠯤-N-2-乙磺酸 ED75 及ED90 ：影響細胞培養物中75%及90%之細胞所需的有效劑量 CI：組合指數 Fa：受影響分率 MS：HEPES緩衝生理鹽水(20 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4) SHE：300 mM蔗糖，20 mM HEPES，30 mM EDTA
實驗方法
物質 鹽酸多柔比星(DOX)、甲磺酸伊馬替尼(IMT)及蘋果酸舒尼替尼(SUN)、硫酸銨、蔗糖八硫酸(SOS)鈉及SBE-β-環糊精鈉鹽係購自Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA)。氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DSPC)、二硬脂醯基磷脂醯甘油(DSPG)、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(mPEG-2000-DSPE，Na鹽)及膽固醇係購自Lipoid GmbH。其他試劑如下獲得：硫酸銨、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑鎓溴化物(MTT)及來自Sigma-Aldrich Co. (St Louis, MO, USA)之香豆素-6。在研究期間使用之所有其他化學品均為試劑級且未進一步純化即使用。
癌細胞株 人類乳腺癌細胞株(例如，MDA-MB-231)、具有2型EWS-FLI-1融合之尤文氏肉瘤細胞株(例如，SK-ES-1)、1型EWS-FLI-1融合細胞株(例如，A-673)、對多柔比星展示固有抗性的黑色素瘤癌細胞株(例如，SK-MEL-28)、對多柔比星細胞株展示固有抗性的三陰性乳癌細胞株(例如，BT-549)、乳癌細胞株(例如，MCF-7)、非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株(例如，A-549)、具有KIT突變之GIST：異型接合外顯子11，V560-Y579缺失細胞株(例如，GIST-T1)及大腸直腸腺癌細胞株(例如，HT-29)係獲自美國的細胞庫。
DOX 抗性 MDA-MB-231 及 MCF-7 細胞株之研發 內部研發MDA-MB-231及MCF-7之多柔比星抗性細胞株。藉由在0.2 μmol/L DOX存在下重複培養MDA-MB-231及MCF-7細胞來產生抗性變異體。將在多次傳代之後在多柔比星存在下良好增殖的此等細胞限定為DOX抗性MDA-MB-231及MCF-7細胞，其分別命名為MDA-MB-231(R)及MCF-7(R)細胞株。MDA-MB-231(R)及MCF-7(R)細胞株均針對未經DOX治療之MDA-MB-231及MCF-7細胞株表徵。
脂質體製備 下文描述一般單獨及組合藥物脂質體製備方法。
活性 pH 梯度載藥方法 ：舉例而言，藉由水合/擠出、透析及遠端pH梯度負載來製備共負載多柔比星/伊馬替尼(DOX/IMT-L)及多柔比星/舒尼替尼脂質體(DOX/SUN-L)。簡言之，在約50至70℃下，將mPEG-2000-DSPE或DSPG、膽固醇及DSPC或HSPC溶解於有機溶劑中且在所選之水性捕獲劑溶液(例如，硫酸銨、TEA-SOS、TEA-SBE-β-CD水溶液、聚磷酸鹽離子等)中進行水合。將有機相緩慢注入水相中，且劇烈攪拌大致30分鐘以允許乳化。使乳液經受在約50至70℃下用多個50-100 nm膜擠出以獲得所需脂質體粒度及粒度分佈且在冰浴中冷卻以產生未負載脂質體。脂質體外部捕獲劑通過透析膜擴散作用被洗掉。藉由蔗糖緩衝液稀釋未負載脂質體懸浮液且加熱至約50至70℃。將組合藥物(諸如多柔比星/伊馬替尼或多柔比星/舒尼替尼)添加至溫熱的未負載脂質體懸浮液中且加熱45分鐘，以分別獲得共負載組合藥物DOX/IMT脂質體(DOX/IMT-L)或DOX/SUN脂質體(DOX/SUN-L)。對於各個別藥物DOX-L、IMT-L及SUN-L脂質體之製備，分別排除添加混合藥物方案DOX/IMT或DOX/SUN，重複以上程序。
活性過渡金屬離子載藥方法 ：舉例而言，藉由水合/擠出、透析及遠端主動負載過渡金屬離子葡糖酸銅來製備共負載多柔比星/伊馬替尼(DOX/IMT-L)及多柔比星/舒尼替尼脂質體(DOX/SUN-L)。簡言之，將mPEG-2000-DSPE或DSPG、膽固醇及DSPC或HSPC溶解於有機溶劑中且在約50至70℃下在由100 mM Cu (葡萄糖酸鹽)、220 mM三乙醇胺(TEA)，pH 7.4組成之所選水性捕獲劑溶液中進行水合。將有機相緩慢注入水相中，且劇烈攪拌大致30分鐘以允許乳化。使乳液經受在約50至70℃下用多個50至100 nm膜擠出以得到所需脂質體粒度及粒度分佈且在冰浴中冷卻以產生未負載脂質體。脂質體外部之外部捕獲劑通過透析膜擴散作用被洗掉。藉由蔗糖緩衝液稀釋未負載脂質體懸浮液且加熱至約50至70℃。將預混合組合藥物物質(諸如多柔比星/伊馬替尼或多柔比星/舒尼替尼)添加至溫熱的未負載脂質體懸浮液中且加熱45分鐘，以分別獲得共負載組合藥物DOX/IMT脂質體(DOX/IMT-L)或DOX/SUN脂質體(DOX/SUN-L)。對於各個別藥物DOX-L、IMT-L及SUN-L脂質體之製備，分別排除添加混合藥物方案DOX/IMT或DOX/SUN，重複以上程序。
脂質體之表徵 粒度及 ζ 電位 ： 動態光散射(Dynamic Light Scattering；DLS)用於使用Nano-S90 ZetaSizer (Malvern Instruments，UK)記錄組合藥物脂質體及個別藥物脂質體之流體動力學粒度、多分散指數(PDI)及ζ電位。所有實驗均在90°之散射角及25℃之溫度下重複進行三次。在量測之前，用蒸餾水充分稀釋各樣品，且對各樣品量測三次。
形態表徵 ： 採用低溫透射電子顯微術(Cryo-TEM)來檢查共負載脂質體之大小及形態。將一滴調配物沈積至塗佈有碳膜之銅網格上，且使粒子經受藉由2% (w/v)磷鎢酸進行負染色。接著在輕度至中度紅外線輻射下適當地乾燥樣品且在H7600透射電子顯微鏡(Hitachi, Tokyo, Japan)下觀測。
載藥及囊封 ： 藉由將已知量之負載脂質體溶解於Triton-100水溶液中且藉由HPLC-UV分析量化各囊封藥物來測定脂質體之藥物含量(分析)及囊封效率(EE%)。在脂質體懸浮液經由Sephadex G-50離心柱溶離之後量測藥物囊封效率。接著，使用HPLC-UV分析測定載藥效率。將囊封效率百分比(EE%)計算為總藥物含量減去游離藥物含量之百分比，接著除以總藥物含量。
活體外藥物釋放研究 舉例而言，藉由透析在pH 6.8下評估DOX及/或IMT自DOX/IMT-L、DOX-L及IMT-L之活體外釋放。將當前研究下之脂質體樣品(約1至2 mL)置放於透析袋(截留分子量50 kDa)中，該透析袋在pH 6.8之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中預水合隔夜。將透析袋兩端夾住，在200 rpm攪拌及在37至48℃範圍內之溫度下浸漬於具有150 mL PBS (pH 6.8)之200 mL溶解容器中。以預定時間間隔取樣釋放培養基之等分試樣(約1 mL)且用等體積之新鮮培養基置換。藉由HPLC-UV方法測定各樣品中之DOX及IMT含量。
活體外細胞毒性研究
藥物組合之最佳化 。舉例而言，研究改變DOX/IMT-L中之DOX及IMT之莫耳比對MDA-MB-231(R)或MCF-7(R)細胞之增殖的影響，以測定藥物在脂質體中之最佳組合比率。出於此目的，與DOX-L及IMT-L一起製備以1:1、1:5及1:10之莫耳比含有DOX及IMT之DOX/IMT-L。將MDA-MB-231(R)及MCF-7(R)細胞分別接種在補充有10% FBS之高葡萄糖DMEM中之96孔培養盤(1×104個細胞/孔)中且在37℃下培育隔夜。自各孔移除培養基，且以適當稀釋度添加以上調配物，使得各孔中作為總藥物濃度的DOX/IMT-L之最終濃度均勻為0.5 μg/mL。根據針對以下MTT分析中所描述之方案測定48小時培育之後各孔中的活細胞。將以如此測定之最佳莫耳組合共負載有DOX及IMT之DOX/IMT-L用於進一步研究。
MTT 分析 在藥物治療之前，將細胞接種培養盤在標準細胞培養物培育箱中在37℃及5% CO2 下培育24小時。第二天，使用各別細胞培養基製備單獨藥物或限定莫耳藥物比之藥物組合的藥物稀釋液。接著將96孔培養盤中之先前細胞培養基置換為含有藥物之新鮮培養基。再培育24小時之後，按照製造商的方案藉由MTT分析評定細胞存活率。藉由自藥物治療孔中減去僅培養基孔獲得之吸光度值，且接著歸一化至無藥物對照孔(僅細胞對照)來測定相對存活百分比。隨後計算各孔在各藥物濃度下之受影響細胞之分率(Fa)或細胞生長抑制(%)。接著藉由用於藥物協同分析之軟體CompuSyn來計算且處理藥物組合之作用。程式採用中位數效應分析演算法，其產生組合指數(CI)值作為協同程度之定量指標。基於此分析方法，CI＜0.9指示協同作用，0.9 ≤CI≤ 1.1反映累加作用且CI ＞1.1指示拮抗作用。CI曲線通常用表示y軸之CI相對於x軸上受影響細胞之比例或受影響分率(Fa)來說明。
活體內抗腫瘤研究 研發 SK-MEL-28 異種移植模型 。在六週齡雌性小鼠(BALB/c裸體)在小鼠之右側腹皮下接種10 × 106 個SK-MEL-28腫瘤細胞以用於腫瘤發展。接著在開始治療之前，使接種之腫瘤生長約五週。將小鼠組織成適當治療組，該等治療組由生理鹽水對照組及藥物治療組組成，該等藥物治療組包括(1)聚乙二醇化DOX-L，(2)聚乙二醇化IMT-L，(3) DOX/IMT預混合游離藥物混合物溶液(DOX:IMT莫耳比為1:5)，及(4)聚乙二醇化DOX/IMT-L (DOX:IMT莫耳比為1:5)。使小鼠靜脈內注射所需體積之樣品，以基於各個別小鼠之體重每週向動物投與目標劑量(6 mg/kg DOX，27.3 mg/kg IMT)，持續二至五週。量測且監測腫瘤體積及小鼠重量。
藥物投與及資料收集 舉例而言，使以上六組異種移植小鼠中之五組經受在尾部靜脈中靜脈內(i.v. )投與生理鹽水溶液(對照)、聚乙二醇化DOX-L、游離預混合DOX/IMT混合物、聚乙二醇化DOX-L、聚乙二醇化IMT-L及聚乙二醇化DOX/IMT-L。每週投與劑量等效於6 mg DOX/kg及27.3 mg IMT/kg小鼠體重的各調配物，持續二至五週。在預定時間評估小鼠之腫瘤尺寸及體重。基於以下公式計算各別腫瘤體積：體積= 1/2 × (最長尺寸) × (最短尺寸)。統計分析
藉由在p ＜ 0.05之顯著水準下進行單向ANOVA以及鄧尼特氏測試(Dunnett test)來測定在MTT分析期間及在活體內抗腫瘤研究中組合藥物脂質體治療組與其他治療組之間的統計差異。所有觀測結果均表述為平均值± SD (n = 3)。
實例 具有化學治療劑及蛋白激酶抑制劑的雙載藥脂質體之方案之實例展示於圖1A及圖1B中。較佳化合物鹽酸多柔比星、甲磺酸伊馬替尼、蘋果酸舒尼替尼及鹽酸吉西他濱之化學結構展示於圖2 (A、B、C、D)中。
實施例 1 DOX/IMT 脂質體製備之方法
如實驗方法章節中所描述，藉由組合乳化、擠出、透析及主動遠程負載來製備脂質體DOX-L、IMT-L及DOX/IMT-L。進行初步實驗以鑑別且優化調配物及生產製程條件(諸如脂質選擇、脂質體之組合物、藥物與脂質比率、捕獲劑、製程條件等)中影響脂質體粒度、粒度分佈、囊封效率、脂質體穩定性、藥物釋放曲線及其他脂質體物理化學特性的主要因素。
實例 2 使用 (NH4 )2 SO4 作為捕獲劑之情況下 DOX/IMT-L 之物理化學表徵 用DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L奈米粒子進行物理化學表徵。使用DSPC/mPEG-2000-DSPE/膽固醇(聚乙二醇化脂質體)或DSPG/DSPC/膽固醇(DSPG脂質體)與pH遠程負載捕獲劑硫酸銨(NH4 )2 SO4 產生含有多柔比星及伊馬替尼之脂質體，以主動負載多柔比星及/或伊馬替尼以形成DOX-L、IMT-L及DOX/IMT-L脂質體。最終聚乙二醇化DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L脂質體展示以下參數：平均粒度約100 nm，PDI ＜0.100 (參見圖3)，囊封效率% ＞95.0%及表面ζ-電位＜ - 25 mV (參見表1)。另外，最終DSPG DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L脂質體展示以下參數：平均粒度約100 nm，PDI ＜0.100 (參見圖4)，囊封效率% ＞95.0%及表面ζ-電位＜ - 30 mV。展示於表2中之聚乙二醇化脂質體及DSPG脂質體之比較證實兩種脂質體組合物之類似平均粒度及囊封效率。粒度＜200 nm之奈米載劑脂質體由於滲漏腫瘤脈管而在腫瘤部位處理想地展現較佳聚集，其與奈米粒子系統之延長循環一起形成EPR被動腫瘤靶向之核心。當前脂質體平台之聚乙二醇化藉由避免網狀內皮清除提供所需延長循環。此外，脂質體奈米載劑容納高有效負載之能力確保將足夠量的藥物遞送至腫瘤部位。奈米載劑亦展現來自DSPG之適中表面電荷賦予循環系統適合的物理及生理穩定性。
總藥物與總脂質比率對載藥容量及囊封效率之影響展示於圖5中。在使用固定脂質濃度(8 mg/mL)之硫酸銨捕獲劑的情況下，當總脂質與總藥物比率在6.4:1至3.2:1 (莫耳比)範圍內時，負載藥容量及囊封效率% ＞ 95%。然而，在總脂質與總藥物比率(莫耳比)為1.6:1時，囊封效率下降至50至70%左右。
對於使用硫酸銨捕獲劑之DOX/IMT-L脂質體(總脂質與總藥物莫耳比為6.4:1)，TEM影像顯示脂質體奈米粒子為具有緻密核心(DOX及IMT之沈澱物)及約100 nm之大小的球形(圖6)。彼等結果證實藥物以非晶形或分子分散狀態良好的囊封於脂質體之水性核心隔室中。 表1.使用(NH4 )2 SO4 作為捕獲劑之情況下對聚乙二醇化DOX-L、IMT-L及DOX/IMT-L之平均粒度/粒度分佈(PDI)及Zeta (ζ)電位(表面電荷)及囊封效率(EE%)的影響
樣品名稱 (DOX/IMT 莫耳比) 藥物含量 (mg/mL) 平均粒度(nm) 粒度分佈(PDI) ζ-電位(mv) EE%
DOX IMT
DOX-L 1.0 94.39 0.079 -24.9 99.1 -
IMT-L 1.0 98.17 0.087 -27.4 - 99.5
DOX/IMT-L 1:10 0.09 (DOX) 0.91 (IMT) 103.1 0.08 -26.5 96.0 99.2
DOX/IMT-L 1:5 0.17 (DOX) 0.84 (IMT) 101.7 0.081 -29.9 97.5    99.4
DOX/IMT-L 1:1 0.5 (DOX) 0.5 (IMT) 99.98 0.063 -27.8 98.8 99.6
表2.聚乙二醇化及DSPG脂質體對DOX/IMT脂質體之粒度/粒度分佈(PDI)、ζ電位及囊封效率% (EE%)的影響
樣品名稱 平均粒度(nm)/PDI ζ-電位(mv) EE%
mPEG- 2000-DSPE DSPG mPEG- 2000-DSPE DSPG mPEG- 2000-DSPE DSPG
DOX-L (1 mg/mL) 94.39/0.08 101.4/0.076 -24.9 -30.4 99.1 (DOX) 99.2 (DOX)
IMT-L (1 mg/mL) 98.17/0.09 100.2/0.086 -27.4 -30.1 99.5 (IMT) 99.5 (IMT)
DOX/IMT-L 0.5 mg/mL (DOX) 0.5 mg/mL (IMT)    99.98/0.06    100.8/0.073    -27.8    -30.2    98.8 (DOX) 99.6 (IMT)    99.1 (DOX) 99.4 (IMT)
實例 3 使用 (NH4 )2 SO4 作為捕獲劑之情況下 DOX/IMT-L 之活體外釋放及穩定性研究 在pH 6.8 (PBS)下在加速條件下藉由擴散進行針對聚乙二醇化DOX/IMT-L以及DOX-L及IMT-L之藥物釋放研究。如圖7中所展示，由聚乙二醇化DOX/IMT-L實現DOX及IMT之持續釋放。在5小時時間點，藥物DOX及IMT分別釋放約40%及60%。針對單一載藥聚乙二醇化DOX-L及IMT-L脂質體奈米粒子，觀測到類似釋放趨勢。另外，自上述聚乙二醇化脂質體調配物之藥物釋放遵循類似趨勢，其特徵在於持續釋放之模式明顯缺乏初始突釋，此指示DOX/IMT-L脂質體樣品外部之較低游離藥物含量，此證實囊封效率結果。
藉由記錄在4℃ (長期儲存條件)及25℃ (加速條件)下儲存45天後平均粒度及粒度分佈(PDI)及囊封效率(EE%)之變化來評定聚乙二醇化DOX/IMT-L脂質體之物理穩定性。在儲存之初始、1天、4天、7天、15天、30天及45天獲取樣品之等分試樣且分別藉由DLS表徵及HPLC分析測定平均粒度、PDI及EE%。表3中所展示之結果指示使用(NH4 )2 SO4 捕獲劑之DOX/IMT-L脂質體奈米粒子在儲存條件4℃及25℃下穩定持續45天。 表3.聚乙二醇化DOX/IMT脂質體(NH4 )2 SO4 捕獲劑在儲存條件4℃ (長期儲存)及25℃ (加速)下之物理穩定性
( 天 ) 在 4℃ 下儲存 在 25℃ 下儲存
平均粒度(nm) PDI EE % 平均粒度(nm) PDI EE %
1 98.3 0.08 99.5 98.3 0.06 99.5
3 98.2 0.07 99.6 98.1 0.07 99.3
7 101.1 0.09 99.8 98.4 0.08 99.6
15 99.7 0.08 99.7 98.7 0.08 99.3
30 99.2 0.09 99.5 98.4 0.08 99.5
45 99.6 0.07 99.5 98.1 0.07 99.7
實例 4 捕獲劑對囊封效率及藥物釋放之影響 如脂質體製備之活性pH梯度載藥方法中所描述，捕獲劑對有效負載、囊封效率、脂質體形狀及藥物釋放特性至關重要。多年來，硫酸銨已用作常見熟知的捕獲劑。在本發明中，使用兩種新穎脂質體捕獲劑TEA-SOS及TEA-SBE-β-CD，且其結構展示於圖8中。
TEA-SOS 及 TEA-SBE-β-CD 之製備 ：蔗糖八硫酸鈉及SBE-β-環糊精鈉購自Sigma-Aldrich, US。將約10公克蔗糖八硫酸鈉或SBE-β-環糊精鈉溶解於約20 mL去離子水中，以得到約3 N硫酸根基團之最終濃度。使溶液通過裝填有約150 mL陽離子交換樹脂珠粒之分離管柱。用約3 M HCl使管柱預平衡，且接著用去離子水洗滌至中性pH。將約20 mL SOS鈉或SBE-β-環糊精鈉溶液施加於管柱上且用去離子H2 O溶離。
使用 TEA-SOS 及 TEA-SBE-β-CD 製備 DOX/IMT-L ：如實驗方法中所描述，藉由組合乳化、擠出、透析及主動遠程負載來製備DOX-L、IMT-L及DOX/IMT-L。各種捕獲劑關於DOX/IMT-L之囊封效率及藥物釋放曲線之比較展示於表4中。當DOX/IMT莫耳比為1:1、1:5、1:10 (總藥物含量為2 mg/mL)時，所有三種捕獲劑具有極佳囊封效率(＞99.0%)且對藥物囊封效率及粒度/粒度分佈影響不大。然而，DOX/IMT-L之藥物釋放曲線展示對所有三種捕獲劑之顯著影響。與(NH4 )2 SO4 及TEA-SOS相比，捕獲劑TEA-SBE-β-CD顯著減緩藥物釋放。此暗示此緩慢藥物釋放係藥物在釋放培養基中之溶解度以及DOX及IMT與TEA-SBE-β-CD之間的更強相互作用的函數。 表4.捕獲劑(NH4 )2 SO4 、TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS對聚乙二醇化DOX/IMT-L脂質體之囊封效率(EE%)的影響
樣品名稱莫耳比 DOX/IMT 之含量(mg/mL) EE% (DOX/IMT) (NH4 )2 SO4 EE% (DOX/IMT) (TEA-SBE-β-CD) EE% (DOX/IMT) (TEA-SOS)
DOX/IMT-1:10 0.17 / 1.84 99.2 / 99.4 96.0 / 99.2 97.2/99.1
DOX/IMT-1:5 0.31 / 1.68 99.2 / 99.4 97.5 / 99.4 97.5/99.3
DOX/IMT-1:1 0.92 / 1.03 99.3 / 99.5 98.8 / 99.6 98.1/99.5
實例 5 DOX/SUN-L 脂質體製備之方法 藉由組合乳化、擠出、透析及主動遠程負載用硫酸銨、TEA-SOS及TEA-SBE-β-CD製備DOX-L、SUN-L及DOX/SUN-L (參見實驗方法)。進行初步實驗以鑑別且優化調配物及生產製程條件(諸如脂質、脂質體之組合物、藥物與脂質比率、捕獲劑、製程條件等)中影響脂質體粒度、粒度分佈、囊封效率、脂質體穩定性、藥物釋放曲線及其他脂質體物理特性的主要因素。在使用SUN-L及DOX/SUN-L脂質體之溶解藥物釋放研究中，發現舒尼替尼脂質體在使用捕獲劑硫酸銨之情況下自SUN-L及DOX/SUN-L快速釋放藥物。為實現舒尼替尼與DOX在脂質體中之持續釋放，兩種新穎脂質體捕獲劑TEA-SOS及TEA-SBE-β-CD亦用於DOX/SUN脂質體製備。
實例 6 DOX/SUN 脂質體之物理化學表徵 進行DOX-L、SUN-L、DOX/SUN-L之物理化學表徵。舉例而言，使用含有捕獲劑硫酸銨(NH4 )2 SO4 之聚乙二醇化及DSPG脂質體產生含有多柔比星及舒尼替尼之脂質體，以主動負載多柔比星及/或舒尼替尼，以形成DOX-L、SUN-L及DOX/SUN-L脂質體。最終聚乙二醇化DOX-L、SUN-L、DOX/SUN-L展示以下參數：平均粒度約100 nm，PDI ＜0.100 (參見圖9)。囊封效率(EE%)與三種捕獲劑硫酸銨、TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS之比較列於表5中。所有三種捕獲劑顯示極佳的囊封效率(＞95%)，其中粒度為約100 nm。 表5.捕獲劑(NH4 )2 SO4 、TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS對聚乙二醇化DOX-L、SUN-L、DOX/SUN脂質體之囊封效率(EE%)的影響
樣品名稱 - 莫耳比 DOX/SUN 之含量(mg/mL) EE% (DOX/SUN) (NH4 )2 SO4 EE% (DOX/SUN) (TEA-SBE-β-CD) EE% (DOX/SUN) (TEA-SOS)
DOX-L 1 99.7 99.5 99.1
SUN-L 1 99.5 99.3 99.3
DOX/SUN-1:10 0.18 / 1.83 100 / 100 99.2 / 99.8 99.2/99.4
DOX/SUN-1:5 0.33 / 1.65 100 / 100 99.0 / 99.9 99.3/99.1
DOX/SUN-1:1 1.01 / 0.97 100 / 99.6 99.3 / 99.7 99.6/99.1
實例 7 DOX/SUN-L 之藥物活體外釋放及穩定性研究 藉由在pH 6.8 (PBS)下在加速條件48℃下透析來進行使用各種捕獲劑、硫酸銨、預混合硫酸銨加TEA-SBE-β-CD、TEA-SOS、TEA-SBE-β-CD的聚乙二醇化DOX-L、SUN-L、DOX/SUN-L之藥物釋放研究。藥物釋放方法描述於實驗方法中。如圖10中所展示，在使用捕獲劑、硫酸銨、混合硫酸銨/SBE-β-CD、TEA-SOS之情況下，所有SUN-L脂質體在3小時時間點展示極其快速的釋放(＞ 60%釋放)。6小時後，舒尼替尼完全釋放(100%釋放)。然而，使用TEA-SBE-β-CD捕獲劑之Sun-L在3小時及5小時時間點分別僅具有約18%及30%的藥物釋放。針對共負載DOX/SUN-L系統，觀測到類似釋放趨勢，其中所有捕集劑用於SUN-L。因此，使用TEA-SBE-β-CD捕獲劑製備最終DOX-L、SUN-L及DOX/SUN-L以實現DOX/SUN-L脂質體奈米粒子之持續釋放。
實例 8 MDA-MB-231 多柔比星抗性細胞株之製備及表徵 MDA-MB-231多柔比星抗性細胞株之製備描述於實驗方法中。藉由MTT分析及細胞凋亡分析進行多柔比星抗性變體MDA-MB-231(R)細胞之表徵。與MDA-MB-231相比，在48小時DOX治療之後MDA-MB-231(R)之細胞存活率在各劑量水準下顯著更高(圖11)。
實例 9 活體外多柔比星及伊馬替尼比率協同研究 對於組合藥物，兩種或更多種藥物可展現協同、累加或拮抗相互作用。為鑑別協同的多柔比星與伊馬替尼之比率(DOX/IMT)，在活體外細胞株研究中測試多柔比星與伊馬替尼之各種組合的細胞毒性作用。研究廣泛範圍藥物濃度以測定多柔比星與伊馬替尼之間的協同作用。使用多柔比星及伊馬替尼在DOX (僅)、1:1、1:5、1:10，IMT (僅)莫耳比下對各種癌細胞株(諸如A-673、GIST-882 GIST基質腫瘤細胞及MDA-MB-231(R)人類乳腺癌細胞)進行累加、協同或拮抗作用之量測。DOX/IMT莫耳比相對於細胞存活率%之圖顯示DOX/IMT與MDA-MB-231(R)多柔比星抗性細胞株之協同莫耳比為1:5 (參見圖12)。使用基於標準四唑鎓之比色MTT細胞毒性分析方案來測定受影響細胞分率的讀數。
實例 10 多柔比星及 伊馬替尼在癌細胞中之協同作用的 活體外評估 對於組合藥物方案，視組合藥物比率而定，兩種或更多種藥物可展現協同、累加或拮抗相互作用。為鑑別協同的多柔比星與伊馬替尼之組合比率(DOX:IMT)，使用相關細胞株研究DOX:IMT之較寬藥物莫耳比範圍。使用30:1至1:30，較佳10:1、5:1、1:1、1:5及1:10莫耳比之DOX:IMT對不同癌細胞株，諸如SK-MEL-28 (對多柔比星展示固有抗性的黑色素瘤癌細胞)、BT-549 (對多柔比星展示固有抗性的三陰性乳癌)、MCF-7 (R) (對多柔比星展示後天抗性的乳癌細胞)、A-673 (具有1型EWS-FLI-1融合之尤文氏肉瘤細胞株)、A-549 (非小細胞肺癌，NSCLC)、GIST-T1 (具有KIT突變之GIST：異型接合外顯子11，V560-Y579缺失)及HT-29 (大腸直腸腺癌)等進行關於多柔比星與伊馬替尼之間的協同、累加或拮抗作用之測定。
圖13A展示作為細胞生長抑制之函數的CI值，亦即在各種DOX與IMT莫耳比下對SK-MEL-28黑色素瘤細胞之受影響分率(Fa)。在DOX:IMT比率為1:10、1:5及1:1下，觀測到協同作用，此係因為在Fa之寬範圍0.05至0.9中CI遠小於0.9。此等顯示，1:1、1:5及1:10之DOX:IMT比率在造成顯著腫瘤細胞死亡之濃度下具有協同作用。相反，當Fa高於0.6且DOX:IMT莫耳比為10:1及5:1時，觀測到拮抗作用(亦即，CI ＞ 1.1)。CI對DOX:IMT比之依賴性亦呈現於圖13B中，其中在SK-MEL-28細胞中在不同DOX:IMT莫耳比下比較在足以造成75% (ED75 )及90% (ED90 )腫瘤細胞生長抑制之藥物濃度下的CI值。當DOX:IMT比率為1:5時，觀測到最強協同作用。基於以上結果，選擇1:5之DOX:IMT莫耳比作為固定藥物比率來調配用於治療SK-MEL-28黑色素瘤癌症的脂質體藥物產品。
在類似方法中，亦研究DOX:IMT比率對BT-549三陰性乳癌細胞中之細胞生長抑制的影響，且結果呈現於圖14A及圖14B中。資料反映，比率為1:5的DOX:IMT之組合在廣泛範圍之Fa中(在0.2至0.9之間)為協同的。然而，在1:1之比率下，在DOX:IMT之組合之所有Fa值下觀測到拮抗作用。對於其他DOX:IMT比率(亦即，1:10、5:1及10:1)，未偵測到顯著協同作用，且組合之作用為累加的。基於此等結果，選擇1:5之DOX:IMT莫耳比作為固定藥物比率來調配用於治療BT-549乳癌的脂質體產品。
亦對多柔比星抗性MCF-7乳癌細胞，亦即回應於各種藥物莫耳比下之DOX/IMT治療之MCR-7(R)評估如由CI值反映之藥物組合作用。藉由在低濃度DOX存在下重複培養細胞來產生抗性MCF-7細胞。在若干次傳代之後，在DOX存在下增殖良好之細胞被限定為DOX抗性MCF-7。如圖15A及圖15B中所展示，在1:5及5:1之DOX:IMT比率下觀測到累加作用。相反，在1:1之DOX:IMT比率下在ED75 及ED90 兩者下觀測到輕微協同作用。因此，選擇1:1之DOX:IMT莫耳比作為固定藥物比率來調配用於治療多柔比星抗性MCF-7乳癌的脂質體產品。
除上文所提及之三種細胞株以外，亦評估如由CI值反映的對其他癌細胞株的藥物組合作用。彼等細胞包括A-673肉瘤、GIST-T1胃腸道基質、A-549 NSCLC及HT-29大腸直腸。在各種DOX/IMT比率下研究的所有細胞株在ED75 及ED90 下之CI值概述於下表6中。此等結果指示DOX/IMT之組合作用在較寬範圍藥物比率中對A-673、GIST、A-549及HT-29細胞株為累加或拮抗的，且在回應於DOX/IMT治療之彼等細胞株當中未觀測到顯著協同作用。如上文所提及，在1:5之DOX/IMT莫耳比下對於SK-MEL-28黑色素瘤及BT-549乳癌細胞獲得協同作用。在1:1 DOX/IMT比率下對於MCF-7(R)乳癌細胞及SK-MEL-28黑色素瘤細胞亦發現協同作用。另外，5:1之DOX/IMT莫耳比亦對GIST-T1癌細胞產生協同作用(圖16A及16B)。具有協同作用之藥物比率在表6中加粗。 表6.各種癌細胞株中不同DOX:IMT莫耳比在ED75 及ED90 下的CI值
細胞株 DOX:IMT 之莫耳比
10:1 5:1 1:1 1:5 1:10
ED75 ED90 ED75 ED90 ED75 ED90 ED75 ED90 ED75 ED90
SK-MEL-28 3.22 14 4.20 14 0.56 0.71 0.41 0.44 0.60 0.93
BT-549 0.96 1.27 0.97 1.07 1.96 2.85 0.45 0.54 0.72 1.01
MCF-7 (R) 1.75 1.94 1.22 1.29 0.79 0.82 0.88 1.09 0.80 0.97
A-673 1.15 0.81 1.33 0.99 1.10 3.04 0.95 1.52 1.68 2.69
GIST-T1 0.98 1.03 0.74 0.62 1.49 1.94 1.33 1.37 1.75 2.05
A-549 25 758 3.78 44 1.49 1.93 1.08 1.68 1.34 4.93
HT-29 n/a n/a 40 395 1.81 5.33 1.08 1.51 1.70 1.95
實例 11 多柔比星及舒尼替尼 在癌細胞中之協同作用的 活體外評估 為鑑別協同的多柔比星與舒尼替尼之比率(DOX:SUN)，使用實例10中所描述之類似程序研究DOX:SUN之各種藥物莫耳比。使用30:1至1:30、較佳10:1、5:1、1:1、1:5、1:10莫耳比之DOX:SUN對以下細胞株：SK-MEL-28 (對多柔比星展示固有抗性的黑色素瘤癌細胞)及BT-549 (對多柔比星展示固有抗性的三陰性乳癌細胞)進行藥物組合之累加、協同或拮抗作用之測定。亦使用基於標準四唑鎓之比色MTT細胞毒性分析法來測定受影響細胞回應於藥物治療之分率的讀數。
如圖17A中所展示，在廣泛範圍之藥物濃度中(亦即，0.10 ＜ Fa ＜ 0.95)，使用三種測試藥物莫耳比5:1、1:1及1:5發現DOX與SUN之組合對SK-MEL-28黑色素瘤細胞的協同作用。特定言之，在所有三種藥物比率下，在產生75%及90%腫瘤生長抑制(ED75 及ED90 ，分別對應於Fa=0.75及0.90)之藥物濃度下觀測到較強藥物協同作用(CI＜0.70，圖17B)。亦對BT-549乳癌細胞分析藥物組合對細胞生長抑制之影響(圖18A及圖18B)。一般而言，在低及中等藥物濃度(亦即，Fa＜0.7)下觀測到藥物比率依賴性CI曲線。相反，在高Fa範圍(亦即，Fa＞0.70)下，獲得所有三種藥物比率之協同作用。特定言之，在DOX:SUN比率等於1:1時在ED75 及ED90 下發現明顯協同作用(CI＜0.4，圖18B)。基於以上結果，選擇1:1之DOX:SUN比率以用於調配用於治療SK-MEL-28黑色素瘤及BT-549乳癌之脂質體組合藥物產品。
實例 12 脂質與藥物比率對藥物囊封效率之影響 具有主動負載過程之脂質體製劑之實例描述於實驗方法章節中。使用聚乙二醇化脂質體對藥物莫耳比為1:5之脂質體DOX/IMT組合研究脂質與藥物比率對藥物囊封效率(EE%)的影響(表7)。在脂質體經由Sephadex G-50離心柱溶離之後評估藥物囊封效率。接著，使用HPLC-UV分析測定載藥效率。三種不同捕獲劑用於藥物遠程負載，亦即硫酸銨、TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS。獨立於所使用捕獲劑之類型觀測到一個一般趨勢：當總脂質與總藥物莫耳比為≥ 3.2:1時，可獲得非常高的有效負載EE% (≥ 95%)。然而，當總脂質與總藥物莫耳比降低至≤1.6:1時，觀測到EE%顯著減少(EE% ＜ 80%)。基於以上結果，選擇6.4 :1之總脂質與總藥物莫耳比以用於進一步脂質體組合物研究。 表7.總脂質與總藥物比率對藥物囊封效率之影響(%)
使用聚乙二醇化DOX/IMT-L 之情況下的DOX:IMT 莫耳藥物比1:5
總脂質: 總藥物 ( 莫耳/ 莫耳) EE% (DOX/IMT) (NH4 )2 SO4 EE% (DOX/IMT) (TEA-SBE-CD) EE% (DOX/IMT) (TEA-SOS)
6.4:1 99.1 / 99.5 99.5 / 99.3 99.5 / 99.6
3.2:1 99.2 / 99.0 99.1 / 96.8 99.4 / 95.0
1.6:1 69.7 / 63.4 68.5 / 56.1 71.9 / 76.1
TEA-SBE-CD ： 三乙銨磺基丁醚β-環糊精；TEA-SOS ： 蔗糖八硫酸三乙銨
實例 13 雙載藥脂質體之物理化學表徵 藉由動態光散射方法分析脂質體之平均粒度。使用實驗方法中所描述之類似程序評估藥物囊封效率。在pH 6.8下藉由透析進行活體外溶解研究。
使用各種類型之捕獲劑對聚乙二醇化脂質體DOX/IMT-L中DOX及IMT之平均粒度(直徑)及囊封效率(EE%)之表徵概述於表8中。如表8中所顯示，在使用硫酸銨、TEA-SOS及TEA-SBE-β-CD捕獲劑之情況下，聚乙二醇化DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L脂質體具有90至105 nm之平均粒度且PDI ＜0.100，具有極佳囊封效率% (約99%)。然而，在使用Tris-SBE-β-CD及葡糖酸銅捕獲劑之情況下，IMT之囊封效率%分別下降至約90%及72%。在所有上述聚乙二醇化脂質體中，以6.4:1之總脂質與總藥物莫耳比固定組合物。 表8.使用各種捕獲劑之情況下聚乙二醇化DOX/IMT-L中多柔比星及/或伊馬替尼之平均粒度(直徑)與囊封效率(EE%)的比較
樣品 ( 莫耳比 ) (NH4 )2 SO4 TEA-SOS TEA-SBE-CD Tris-SBE-CD CuGlu/TEOA
平均粒度(nm) EE% DOX/IMT 平均粒度(nm) EE% DOX/IMT 平均粒度(nm) EE% DOX/IMT 平均粒度(nm) EE% DOX/IMT 平均粒度(nm) EE% DOX/IMT
DOX-L 94 99.1 97 99.5 102 99.1 - - - -
IMT-L 98 99.5 103 99.6 103 99.3 - - - -
DOX/IMT-L (1:10) 97 99.2/ 99.4 103 98.7/ 99.7 94 99.4/ 99.1 - - - -
DOX/IMT-L (1:5) 97 99.3/ 99.5 102 99.1/ 99.7 95 99.6/ 99.2 94 97.0/ 90.0 91 100/ 72.0
DOX/IMT-L (1:1) 97 99.3/ 99.5 100 99.5/ 99.8 100 98.8/ 99.6 - - - -
AS ： 硫酸銨；TEA-SOS ： 蔗糖八硫酸三乙銨；TEA-SBE-CD ： 三乙銨磺基丁醚β-環糊精；Tris-SBE-CD ： SBE-CD之三(羥基甲基)胺基甲烷鹽；CuGlu/TEOA ： 葡糖酸銅/三乙醇胺
對於聚乙二醇化DOX/SUN-L脂質體，使用各種類型之捕獲劑對DOX及SUN之平均粒度(直徑)及囊封效率(EE%)的表徵亦概述於表9中。如表9中所展示，在使用硫酸銨、TEA-SOS及TEA-SBE-β-CD捕獲劑之情況下，聚乙二醇化DOX-L、SUN-L、DOX/SUN-L脂質體具有約100 nm之平均粒度且PDI ＜0.100，具有極佳囊封效率% (約99%)。在所有上述聚乙二醇化脂質體中，以6.4:1之總脂質與總藥物莫耳比固定組合物。 表9.使用各種捕獲劑之情況下聚乙二醇化DOX/SUN-L中多柔比星及/或舒尼替尼之平均粒度(直徑)與囊封效率(EE%)的比較
樣品名稱 ( 莫耳比 ) (NH4 )2 SO4 TEA-SOS TEA-SBE-CD
平均粒度(nm) EE% (DOX/SUN) 平均粒度(nm) EE% (DOX/SUN) 平均粒度(nm) EE% (DOX/SUN)
DOX-L 94 99.1 97 99.5 102 99.1
SUN-L 98 99.5 101 99.8 104 99.8
DOX/SUN-L (1:10) 97 99.8/ 99.9 100 99.6/ 99.7 102 99.2/ 99.8
DOX/SUN-L (1:5) 96 99.8/ 99.6 100 99.9/ 99.5 102 99.0/ 99.9
DOX/SUN-L (1:1) 96 99.9/ 99.7 99 99.8/ 99.6 103 99.3/ 99.7
AS ： 硫酸銨；TEA-SOS ： 蔗糖八硫酸三乙銨；TEA-SBE-CD ： 三乙銨磺基丁醚β-環糊精
對於活體外藥物釋放，發現聚乙二醇化DOX/IMT-L及DOX/SUN-L中DOX/IMT或DOX/SUN之藥物釋放速率展示對捕獲劑類型及其濃度之依賴性。在適當濃度的捕獲劑之下，藥物釋放速率依次為(NH4 )2 SO4 ＞葡糖酸銅＞ TEA-SOS ＞Tris-SBE-β-CD ＞ TEA-SBE-β-CD。另外，在使用硫酸銨之情況下，DOX及IMT在聚乙二醇化DOX/IMT-L中之藥物釋放速率比在DOX/IMT-DSPG-L中慢得多。
基於以上結果，證實與其他上文所提及之捕獲劑相比，負載有TEA-SBE-β-CD作為脂質體中之捕獲劑的藥物展現極佳囊封效率及優良有效負載保持率。因此，選擇TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑以進一步囊封脂質體內之雙藥物。
藉由低溫透射電子顯微術(Cryo-TEM)觀察脂質體之形態。圖19顯示雙負載聚乙二醇化脂質體奈米粒子(DOX:IMT莫耳比為1:5，TEA-SBE-β-CD)之TEM影像，其展現具有單層結構與緻密核心(DOX及IMT之沈澱物)及約100 nm平均粒度的球形。暗內部指示內部隔室為高度電子緻密的，此反映與捕獲劑相互作用的API之聚集狀態。彼等結果證實兩種藥物以聚集/沈澱狀態良好的共囊封於脂質體之水性核心隔室中。
實例 14 經由被動 / 主動雙藥物負載進行脂質體之一般製備 對於組合雙藥劑負載，可藉由耦合的主動及被動負載方法將兩種藥物囊封至脂質體中。舉例而言，兩種藥物均經由被動負載方法負載或一種藥物為被動負載，而另一種藥物為主動負載。如實驗方法中所描述，聚乙二醇化脂質組合物在本文中亦與DSPC (＞ 10 mol%之總脂質)、膽固醇(總脂質之0至50莫耳%)及mPEG-2000-DSPE (聚乙二醇化脂質體)以各種脂質比率一起採用。簡言之，下文描述一般耦合的主動及被動負載脂質體製備之實例：
經由耦合的 主動 及 被動雙藥物負載進行脂質體之一般製備： 1)製備含有一種藥物之多層囊泡：將所有脂質溶解於有機溶劑中。將一種藥物(例如，鹽酸吉西他濱，GEM)及選擇捕獲劑(例如，TEA-SBE-β-CD水溶液)以適當濃度溶解於水中，且接著升溫至60至70℃。接著在劇烈攪拌下將脂質溶液分散至以上水溶液中以形成多層囊泡，持續約5小時。2)脂質體大小減小：藉由多次通過孔徑為50至100 nm之聚碳酸酯膜進行擠出。目標脂質體大小範圍為50至200 nm，較佳在80至110 nm之間。3)透濾：為移除外部捕獲劑及外部第一負載藥物，將被動負載之脂質體轉移至pH值為6至7.5之主動負載溶液中。4)第二藥物之主動負載：藉由將藥劑溶解於水溶液中以實現所需濃度及與第一治療劑之協同比率來製備第二藥物儲備溶液(例如，蘋果酸舒尼替尼)。將第二治療劑儲備溶液添加至步驟3中製備之脂質體分散液中以實現＞ 1.0的脂質/藥物輸入莫耳比。將混合物在60至70℃下培育約1至3小時。將脂質體藥物產品冷卻至室溫且儲存在2至8℃下。
如實驗方法中所描述對聚乙二醇化GEM/SUN-L脂質體進行物理化學表徵方法。作為一實例，藉由以上共負載之聚乙二醇化GEM/SUN-L脂質體，表10展示使用TEA-β-SBE-SD捕獲劑之情況下GEM/SUN-L雙載藥脂質體之平均粒度(直徑)、囊封效率(%)及總GEM/SUN與總脂質莫耳比。GEM/SUN-L脂質體滲漏研究證實GEM/SUN-L中之GEM及SUN在冷凍機條件下穩定至少四週。另外，細胞株(較佳NSCLC細胞株)研究證實吉西他濱與舒尼替尼之協同組合的莫耳比為5:1、1:1及1:5。 表10.對吉西他濱(GEM)及舒尼替尼(SUN)共囊封脂質體之表徵
樣品名稱 莫耳比 GEM/SUN 與總脂質之莫耳比 粒度(nm) / PDI 囊封效率(%)
   GEM/SUN-L 1:1 0.17 (GEM) 98 / 0.074 99.1 (GEM)
0.12 (SUN) 98.9 (SUN)
實例 15 DOX/IMT 脂質體對細胞生長之活體外抑制 為比較脂質體對細胞生長之活體外抑制，用聚乙二醇化DOX-L、IMT-L、DOX/IMT-L以莫耳比為1:5 (協同)及5:1 (拮抗)之DOX:IMT處理SK-MEL-28黑色素瘤細胞。簡單實驗程序陳述如下：以適當接種密度將SK-MEL-28黑色素瘤細胞接種至96孔培養盤上。在藥物治療之前，將細胞接種培養盤在標準細胞培養物培育箱中在37℃及5% CO2 下培育24小時。第二天，使用各別細胞培養基製備莫耳比為1:5或5:1之聚乙二醇化單獨DOX-L、IMT-L或DOX/IMT-L脂質體藥物組合的藥物稀釋液。接著將96孔培養盤中之先前細胞培養基置換為含有相關脂質體藥物之新鮮培養基。在培育總共96小時之後，按照製造商的方案藉由MTT分析評定細胞存活率。藉由自藥物治療孔中減去僅培養基孔獲得之吸光度值，且接著歸一化至無藥物對照孔(僅細胞對照)來測定相對存活百分比。藉由自100%減去細胞存活率%來計算細胞生長抑制百分比。
如表11中所展示，聚乙二醇化脂質體DOX/IMT-L在其協同比率下(亦即DOX/IMT=1:5)之細胞生長抑制能力顯著大於各囊封藥物僅以累加方式對其活性作出貢獻時所預期的細胞生長抑制能力。特定言之，6.25 µM脂質體DOX-L之細胞生長抑制值58.3%及31.25 µM脂質體IMT-L之細胞生長抑制值18.2%預測脂質體DOX/IMT-L (1:5莫耳比)之細胞生長抑制值為76.5% (見表6)，其顯著低於所觀測到的細胞生長抑制值96.7%。另外，脂質體DOX/IMT-L在其拮抗莫耳比5:1下之細胞生長抑制展示比在各負載藥物已以累加方式對其功效作出貢獻時可預測的值(6.25µM之DOX 58.3%加1.25µM之IMT 10.1%等於68.4µM)顯著降低的值(DOX/IMT=6.25/1.25時為22.8%)。總體而言，以上結果與如實例1中觀測到的藥物比率對其功效之影響相呼應，且證實當用作游離藥物溶液時，基於DOX/IMT比率的相同協同或拮抗作用可在採用對應藥物比率時轉化為雙載藥脂質體產品。 表11.關於聚乙二醇化DOX/IMT-L在SK-MEL-28黑色素瘤癌細胞株中之抗癌活性的活體外分析
1:5 比率下之DOX/IMT-L ( 協同) DOX-L IMT-L 5:1 比率下之DOX/IMT-L ( 拮抗)
細胞生長抑制 % 96.7% 58.3% 18.2% 10.1% 22.8%
劑量(µM) 6.25/31.25 6.25 31.25 1.25 6.25/1.25
實例 16 使用 DOX/IMT 脂質體進行之活體內藥物動力學研究 在CD-1小鼠中進行游離多柔比星、游離伊馬替尼及DOX/IMT-L (1:5莫耳比)脂質體之活體內藥物動力學研究持續一週。實驗方法中描述使用TEA-SBE-β-CD製備聚乙二醇化DOX/IMT-L。經由尾部靜脈將游離多柔比星、游離伊馬替尼及聚乙二醇化DOX/IMT-L (莫耳比1:5)靜脈內投與至CD-1小鼠中且隨時間推移監測血漿DOX/IMT比率。脂質體調配物之劑量為6.0 mg/Kg鹽酸多柔比星及27.3 mg/Kg甲磺酸伊馬替尼。靜脈內投與之後，藉由心臟穿刺在一週內之多個時間點收集血液(3隻小鼠/時間點)，且將其置放於經EDTA塗佈之微容器中。將樣品離心以分離血漿，且將血漿轉移至另一試管。接著，用LC-MS量化DOX及IMT血漿含量。根據單次靜脈內注射後收集的血漿樣品中量測之DOX及IMT血漿含量計算PK參數。
基於PK研究結果，可得出結論，游離DOX及游離IMT藥物溶液快速消除，游離DOX及游離IMT之半衰期(T1/2 )值分別為0.5 (DOX)及0.88小時(IMT)。與游離藥物溶液相比，聚乙二醇化DOX/IMT-L脂質體之T1/2 延長＞ 26 (DOX)及＞ 4.3 (IMT)倍。DOX/IMT-L脂質體中之兩種藥物之AUC (曲線下面積)比游離藥物溶液中的彼等增加＞ 52 (DOX)及＞ 600 (IMT)倍。聚乙二醇化DOX/IMT-L脂質體中之兩種藥物之MRT (最大滯留時間)亦比游離藥物溶液中的彼等增加＞ 24 (DOX)及8 (IMT)倍。此等PK結果顯示，與游離藥物DOX及IMT相比，共負載DOX/IMT-L脂質體顯著延長藥物滯留且展現小鼠中DOX及IMT之血漿藥物含量實質上增加。此亦指示聚乙二醇化DOX/IMT-L中之多柔比星及伊馬替尼兩者在小鼠血液中持續及自發的釋放。另外，亦注意到，小鼠對DOX/IMT-L脂質體藥物產品在上文所提及之藥物劑量下具有良好耐受性且在此PK研究中未觀測到不良事件。
另外，根據此PK研究，亦可在不同時間點測定血漿中DOX與IMT之莫耳比。圖20展示在靜脈內投與至CD-1小鼠之後前24小時血漿中DOX/IMT之莫耳比的圖。因此，在投與至CD-1小鼠後，當藥物由脂質體同時遞送時，囊封於聚乙二醇化脂質體中之DOX及IMT之莫耳比在1:5至1:1之DOX/IMT的協同莫耳比下良好維持，如實例10所展示，持續約20小時。資料點表示在指定時間點在血漿中測定之DOX:IMT之莫耳比(+/-標準偏差)。如實例1中所論述，DOX:IMT之莫耳比高於約1:1對於組合藥物在SK-EML-28中展現協同作用係必需的。因此，經適當設計之脂質體藥物遞送媒劑證實在CD-1小鼠中遞送所需之DOX及IMT莫耳比。此外，LC-MS分析指示，循環脂質體藥物調配物含有完整藥物且未觀測到任一化合物之降解跡象。
實例 17 攜帶 SK-MEL-28 異種移植腫瘤之小鼠中之活體內腫瘤消退 為使藥物組合之治療性活性最大化且為捕獲活體外觀測到之協同益處，藥物組合需要以最佳藥物與藥物比率遞送至腫瘤部位。出於此目的，研發實例10中以已知在SK-MEL-28細胞中協同之固定比率含有DOX及IMT的脂質體調配物，從而允許協調的活體內藥物釋放，如實例8中所說明。接著在SK-MEL-28黑色素瘤模型中活體內評估此調配物之抗腫瘤活性。以協同莫耳比1:5共囊封有DOX及IMT之聚乙二醇化脂質體與用作捕獲劑之TEA-SBE-β-CD一起用於此研究。
為對小鼠(BALB/c裸體)進行腫瘤研究，動物在小鼠右側腹處皮下接種10 × 106 個SK-MEL-28腫瘤細胞以用於腫瘤發展。接著在開始治療之前，使接種之腫瘤生長約五週。將小鼠組織成適當治療組，該等治療組由生理鹽水對照組及藥物治療組組成，該等藥物治療組包括(1) DOX-L，(2) DOX/IMT混合之游離藥物混合物溶液，及(3) DOX/IMT-L (DOX:IMT莫耳比為1:5)。使小鼠靜脈內注射所需體積之樣品，以基於各個別小鼠之體重每週向動物投與目標劑量(6 mg/kg DOX，27.3 mg/kg IMT)持續兩週。量測且監測腫瘤體積及小鼠重量。
如圖21A中所展示，一般而言，與在攜帶腫瘤之生理鹽水對照組以及其他藥物治療組(包括DOX-L單藥療法、IMT-L單藥療法及組合游離DOX/IMT混合物溶液)中觀測到的彼等相比，雙載藥脂質體(DOX/IMT-L)顯著抑制腫瘤生長。此對腫瘤生長抑制係歸因於奈米級脂質體調配物之高通透性及滯留(EPR)效應，其可改善腫瘤部位中之藥物遞送特異性。因此，關於游離藥物混合物與脂質體藥物組合之間的功效的比較反映，藉由當前脂質體調配物實現之優良生物分佈可引起更有效的腫瘤抑制。與其他藥物治療組相比，DOX-L單藥療法具有與生理鹽水對照組中所觀測到的類似腫瘤生長速率，此證實SK-MEL-28細胞株之固有多柔比星抗性特性。此外，與來自DOX-L或IMT-L單藥療法之作用相比，藉由DOX/IMT-L組合施加的對腫瘤生長抑制之作用更強。結果指示，自活體外研究(實例10)中發現的DOX與IMT之間的協同作用可在活體內環境中良好的轉化成脂質體調配物。另外，在活體內功效研究中所研究之所有組中，體重無顯著降低(圖21B)。總體而言，以上結果顯示，藉由將協同DOX:IMT莫耳比囊封於脂質體內來固定協同DOX:IMT莫耳比可顯著地改善抗腫瘤活性。
前述實施例及實例僅出於說明性目的提供且並不意欲限制本發明之範疇。對上文所描述之彼等的許多變化可為可能的。由於基於本揭示內容，對上文所描述之實施例及實例之各種修改及變化對於熟習此項技術者而言將顯而易見，因此此類修改及變化在本發明的精神及範疇內。所引用之所有專利或非專利參考文獻均以全文引用之方式併入本文中，而不承認其作為先前技術。
圖1說明組合抗癌藥物共載聚乙二醇化(PEGylated)脂質體(A)及DSPG脂質體(B)之實例。在聚乙二醇化脂質體中，mPEG-2000-DSPE用於為囊泡提供空間穩定性。另一方面，在DSPG脂質體中，帶負電荷之DSPG用於經由靜電排斥穩定脂質體。化學治療藥物及蛋白激酶抑制劑兩者共負載於脂質體之水性核心隔室中。
圖2列出(A)鹽酸多柔比星(DOX)、(B)甲磺酸伊馬替尼(IMT)、(C)蘋果酸舒尼替尼(SUN)及(D)鹽酸吉西他濱(GEM)之化學結構。
圖3說明在使用(NH4 )2 SO4 作為捕獲劑之情況下聚乙二醇化DOX-L、IMT-L及DOX/IMT-L在1:10、1:5及1:1莫耳比下的粒度分佈(強度%)。
圖4說明在使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑之情況下DSPG DOX-L、IMT-L及DOX/IMT-L在1:10及1:5莫耳比下的粒度分佈(強度%)。
圖5說明在使用(NH4 )2 SO4 作為捕獲劑之情況下脂質與藥物莫耳比對聚乙二醇化DOX-L及IMT-L之囊封效率(EE%)的影響。
圖6展示在使用(NH4 )2 SO4 作為捕獲劑之情況下DOX/IMT-L之低溫透射電子顯微術(Cryo-TEM)影像。
圖7說明多柔比星及伊馬替尼在加速條件(54℃)下在DOX:IMT之1:1莫耳比下自單獨載藥聚乙二醇化DOX-IMT-L脂質體與(NH4)2SO4脂質體，亦即，DOX-L (三角形)及IMT-L (菱形)及組合聚乙二醇化DOX-IMT脂質體(DOX：圓形且IMT：方形)之活體外溶解藥物釋放曲線的比較。(NH4)2SO4用作上述所有脂質體中之捕獲劑。
圖8說明捕獲劑TEA-SBE-β-CD (左)及TEA-SOS (右)之化學結構。
圖9說明在使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑之情況下DOX-L、SUN-L及DOX/SUN-L在1:10、1:5及1:1莫耳比下的粒度分佈(強度%)。
圖10說明具有捕獲劑(NH4 )2 SO4 、TEA-SBE-β-CD及TEA-SOS之聚乙二醇化SUN-L脂質體在48℃下的活體外藥物釋放曲線。
圖11說明48小時治療後多柔比星(DOX)對MDA-MB-231及MDA-MB-231(R)細胞之活體外細胞毒性。
圖12說明DOX及IMT組合與MDA-MB-231(R)細胞株之莫耳比之最佳化。
圖13說明多柔比星(DOX)及伊馬替尼(IMT)在SK-MEL-28黑色素瘤細胞中之協同作用的活體外篩選。A：將組合指數(CI)繪製為回應於多柔比星(DOX)及伊馬替尼(IMT)在不同莫耳比：1:10 (實心方形)、1:5 (實心三角形)、1:1 (實心圓形)、5:1 (空白菱形)及10:1 (實心菱形)下之組合治療對SK-MEL-28黑色素瘤細胞之細胞生長抑制(亦即，受影響分率，Fa)的函數。＜0.9、0.9至1.1及＞1.1之CI值分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：在ED75 (黑色柱，Fa=0.75)及ED90 (空白柱，Fa=0.90)下繪製為不同多柔比星與伊馬替尼莫耳藥物比(亦即，1:10、1:5、1:1、5:1及10:1)之函數的來自SK-MEL-28黑色素瘤細胞的CI之活體外評估。
圖14說明多柔比星(DOX)及伊馬替尼(IMT)在BT-549三陰性乳癌細胞中之協同作用的活體外篩選。A：將組合指數(CI)繪製為回應於多柔比星及伊馬替尼在不同莫耳比：1:10 (實心方形)、1:5 (實心三角形)、1:1 (實心圓形)、5:1 (空白菱形)及10:1 (實心菱形)下之組合治療對BT-549細胞之細胞生長抑制(亦即，受影響分率，Fa)的函數。＜0.9、0.9至1.1及＞1.1之CI值分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：在ED75 (黑色柱，Fa=0.75)及ED90 (空白柱，Fa=0.90)下繪製為不同多柔比星與伊馬替尼莫耳藥物比(亦即，1:10、1:5、1:1、5:1及10:1)之函數的來自BT-549乳癌細胞的CI之活體外評估。
圖15說明多柔比星(DOX)及伊馬替尼(IMT)在抗性MCF-7 (亦即，MCF-7(R)乳癌細胞)中之協同作用的活體外篩選。A：將組合指數(CI)繪製為回應於多柔比星及伊馬替尼在不同莫耳比：1:10 (實心方形)、1:5 (實心三角形)、1:1 (實心圓形)、5:1 (空白菱形)及10:1 (實心菱形)下之組合治療對MCF-7(R)細胞之細胞生長抑制(亦即，受影響分率，Fa)的函數。藉由在低濃度多柔比星之存在下連續培養細胞來產生MCF-7乳癌細胞之抗性。＜0.9、0.9至1.1及＞1.1之CI值分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：在ED75 (黑色柱，Fa=0.75)及ED90 (空白柱，Fa=0.90)下繪製為不同多柔比星與伊馬替尼莫耳藥物比(亦即，1:10、1:5、1:1、5:1及10:1)之函數的來自MCF-7(R)多柔比星抗性乳癌細胞的CI之活體外評估。
圖16說明多柔比星(DOX)及伊馬替尼(IMT)在GIST-T1胃腸基質瘤細胞中之協同作用的活體外篩選。A：將組合指數(CI)繪製為回應於多柔比星及伊馬替尼在不同莫耳比：1:10 (實心方形)、1:5 (實心三角形)、1:1 (實心圓形)、5:1 (空白菱形)及10:1 (實心菱形)下之組合治療對GIST-T1細胞之細胞生長抑制(亦即，受影響分率，Fa)的函數。＜0.9、0.9至1.1及＞1.1之CI值分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：在ED75 (黑色柱，Fa=0.75)及ED90 (空白柱，Fa=0.90)下繪製為不同多柔比星與伊馬替尼莫耳藥物比(亦即，1:10、1:5、1:1、5:1及10:1)之函數的來自GIST-T1癌細胞的CI之活體外評估。
圖17說明多柔比星(DOX)及舒尼替尼(SUN)在SK-MEL-28黑色素瘤細胞中之協同作用的活體外篩選。A：將組合指數(CI)繪製為回應於多柔比星及舒尼替尼在不同莫耳比：1:5 (方形)、1:1 (三角形)及5:1 (圓形)下之組合治療對SK-MEL-28黑色素瘤細胞之細胞生長抑制(亦即，受影響分率，Fa)的函數。＜0.9、0.9至1.1及＞1.1之CI值分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：在ED75 (黑色柱，Fa=0.75)及ED90 (空白柱，Fa=0.90)下繪製為不同多柔比星與舒尼替尼莫耳藥物比(亦即，1:5、1:1及5:1)之函數的來自SK-MEL-28黑色素瘤細胞的CI之活體外評估。
圖18說明多柔比星(DOX)及舒尼替尼(SUN)在BT-549三陰性乳癌細胞中之協同作用的活體外篩選。A：將組合指數(CI)繪製為回應於多柔比星(DOX)及舒尼替尼(SUN)在不同莫耳比：1:5 (方形)、1:1 (三角形)及5:1 (圓形)下之組合治療對BT-549細胞之細胞生長抑制(亦即，受影響分率，Fa)的函數。＜0.9、0.9至1.1及＞1.1之CI值分別指示協同作用、累加作用及拮抗作用。B：在ED75 (黑色柱，Fa=0.75)及ED90 (空白柱，Fa=0.90)下繪製為不同多柔比星與舒尼替尼莫耳藥物比(亦即，1:5、1:1及5:1)之函數的來自BT-549乳癌細胞的CI之活體外評估。
圖19展示在使用TEA-SBE-β-CD作為捕獲劑之情況下組合多柔比星及伊馬替尼(DOX:IMT莫耳比為1:5)之脂質體產物之低溫透射電子顯微術(Cryo-TEM)影像。
圖20說明對組合多柔比星及伊馬替尼(DOX:IMT莫耳比為1:5)之脂質體產物之藥物動力學研究。在靜脈內注射時，以6.0 (DOX)/27.3 (IMT) mg/kg劑量向CD-1雄性小鼠(n=3隻/時間點)投與DOX/IMT-L脂質體。藥物產品含有TEA-SBE-β-CD作為脂質體內捕獲劑。根據絕對血漿濃度計算各時間點處之循環血漿伊馬替尼與多柔比星莫耳比。
圖21說明藉由脂質體共遞送之多柔比星(DOX)及伊馬替尼(IMT)對基於SK-MEL-28黑色素瘤癌症之實體腫瘤模型的活體內功效。A，腫瘤體積之變化百分比(%)，及B，體重之變化百分比(%)。藉由將在某一時間點之腫瘤體積或體重分別歸一化為在時間0處獲得之腫瘤體積或體重來計算圖A及圖B中所展示的百分比。每週靜脈內治療攜帶腫瘤之雌性BALB/c裸小鼠(每組三隻)持續總共兩週。關於各治療組之資訊描述如下：生理鹽水(空白方形)；脂質體多柔比星，DOX-L (6 mg/kg，空白三角形)；IMT-L (27.3 mg/kg，空白圓形)；游離多柔比星/伊馬替尼混合物(分別為6 DOX/27.3 IMT mg/kg，空白菱形)及脂質體多柔比星/伊馬替尼組合藥物產品，DOX/IMT-L (分別為6 DOX/27.3 IMT mg/kg，實心圓形)。對於所有脂質體藥物產品，TEA-SBE-β-CD用作脂質體內捕獲劑。

Claims (28)

  1. 一種醫藥組合物，其包含懸浮於液體介質中之脂質體，其中該液體介質包含水及pH緩衝劑；其中該脂質體包含由外脂質雙層膜包圍之內部隔室，其中該內部隔室在水性介質中包含蛋白激酶抑制劑或親水性化學治療劑與蛋白激酶抑制劑之組合；其中該脂質雙層膜包含形成該內部隔室之親水性內表面、親脂性雙層及與該組合物之該液體介質接觸的親水性外表面；且其中該親水性化學治療劑及該蛋白激酶抑制劑可以協同模式自該脂質體釋放。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該脂質雙層膜包含：(a)至少10 mol%選自由磷脂醯膽鹼(例如，HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂醯甘油(例如，DSPG)、磷脂醯肌醇、甘油糖脂、神經鞘醣脂(例如，神經鞘磷脂)及其組合組成之群的磷脂；(b) 0至60 mol%膽固醇或其衍生物；及(c)視情況衍生成聚乙二醇之帶電荷的磷脂(例如，mPEG-2000-DSPE)。
  3. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該一或多種脂質獨立地選自由以下組成之群：HSPC、DSPC、DPPC、DMPC、DSPG、mPEG-DSPE-2000及膽固醇。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中該液體介質進一步包含以下中之一或多者：水可混溶有機溶劑、滲透劑、控制釋放賦形劑。
  5. 如請求項1至4中任一項之醫藥組合物，其中脂質體粒子之水性內部隔室進一步包含捕獲劑。
  6. 如請求項5之醫藥組合物，其中該捕獲劑係選自由以下組成之群：硫酸銨；聚陰離子化磺基丁醚環糊精(例如，TEA-SBE-α-環糊精、TEA-SBE-β-環糊精、TEA-SBE-γ-環糊精、Tris-SBE-α-環糊精、Tris-SBE-β-環糊精及Tris-SBE-γ-環糊精)的銨鹽或經取代之銨鹽；聚陰離子化硫酸化碳水化合物(例如，TEA-SOS及Tris-SOS)的銨鹽或經取代之銨鹽；聚磷酸鹽(例如，肌醇六磷酸三乙銨及三(羥基甲基)胺基甲烷肌醇六磷酸鹽)的銨鹽或經取代之銨鹽；過渡金屬鹽(例如，銅、鋅、錳、鎳、鈷或類似者與鹵化物、硫酸根離子及葡萄糖酸根離子形成的鹽)；四級銨化合物(例如，苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)、溴化十六烷基三甲基銨(cetrimonium bromide)、硬脂基二甲基苄基氯化銨)；聚氧乙烯(亦即，聚乙二醇)及椰子胺。
  7. 如請求項1至6中任一項之醫藥組合物，其中該脂質雙層膜之該外表面包含表面帶負電荷的脂質(例如，DSPG)或含有聚乙二醇之表面改質劑(例如，mPEG-2000-DSPE)，其中該總脂質與該蛋白激酶抑制劑或與當該親水性化學治療劑及該蛋白激酶抑制劑兩者存在時之組合總量之莫耳比至少等效(1:1)。
  8. 如請求項1至7中任一項之醫藥組合物，其中該化學治療劑係選自由以下組成之群：多柔比星(doxorubicin)、環磷醯胺、卡鉑(carboplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、道諾比星(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、5-氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、艾瑞布林(eribulin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、甲胺喋呤(methotrexate)、突變黴素(mutamycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、長春瑞濱(vinorelbine)、多西他賽(docetaxel)、噻替派(thiotepa)、博萊黴素(bleomycin)、長春新鹼(vincristine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、卡培他濱(capecitabine)、普賴松(prednisone)、喜樹鹼(camptothecin)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、BCNU、卡莫司汀(carmustine)、順鉑(cis-platin)、來那度胺(lenalidomide)及培美曲塞(pemetrexed)。
  9. 如請求項1至8中任一項之醫藥組合物，其中該蛋白激酶抑制劑係選自由以下組成之群：伊馬替尼(imatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、阿法替尼(afatinib)、尼達尼布(nintedanib)、普納替尼(ponatinib)、魯索利替尼(ruxolitinib)、克唑替尼(crizotinib)、依魯替尼(ibrutinib)、阿卡替尼(acalabrutinib)、阿貝西利(abemaciclib)、阿法利貝(aflibercept)、艾樂替尼(alectinib)、阿瓦替尼(avapritinib)、阿西替尼(axitinib)、伯舒替尼(bosutinib)、卡博替尼(cabozantinib)、卡普替尼(capmatinib)、色瑞替尼(ceritinib)、考比替尼(cobimetinib)、克唑替尼、達拉非尼(dabrafenib)、達可替尼(dacomitinib)、達沙替尼(dasatinib)、恩拉非尼(encorafenib)、恩曲替尼(entrectinib)、厄達替尼(erdafitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、依維莫司(everolimus)、非達替尼(fedratinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉列替尼(gilteritinib)、依魯替尼、拉帕替尼(lapatinib)、拉羅替尼(larotrectinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、勞拉替尼(lorlatinib)、尼達尼布、來那替尼(neratinib)、尼羅替尼(nilotinib)、奈妥舒迪(netarsudil)、奧希替尼(osimertinib)、帕瑞替尼(pacritinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、吡昔替尼(pexidartinib)、培米替尼(pemigatinib)、帕柏西利(palbociclib)、普納替尼、吡昔替尼、普拉替尼(pralsetinib)、奎紮替尼(quizartinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、瑞博西尼(ribociclib)、力普替尼(ripretinib)、塞爾帕替尼(selpercatinib)、司美替尼(selumetinib)、索拉非尼(sorafenib)、坦羅莫司(temsirolimus)、托法替尼(tofacitinib)、曲美替尼(trametinib)、圖卡替尼(tucatinib)、優帕替尼(upadacitinib)、凡德他尼(vandetanib)、維羅非尼(vemurafenib)、澤布替尼(zanubrutinib)及塞維-阿法利貝(ziv-aflibercept)。
  10. 如請求項1至9中任一項之醫藥組合物，其中該脂質體之該內部隔室包含抗癌劑或選自由以下組成之群的組合： (a)單獨囊封之伊馬替尼； (b)共囊封之多柔比星及伊馬替尼； (c)單獨囊封之舒尼替尼； (d)共囊封之多柔比星及舒尼替尼； (e)單獨囊封之吉西他濱； (f)共囊封之吉西他濱及舒尼替尼； (g)約30:1至約1:30莫耳比之多柔比星及伊馬替尼； (h)約30:1至約1:30莫耳比之多柔比星及舒尼替尼；及 (i)約30:1至約1:30莫耳比之吉西他濱及舒尼替尼。
  11. 如請求項1至10中任一項之醫藥組合物，其中該等脂質體具有4.5 nm至450 nm之間，較佳25 nm與300 nm之間，且更佳50 nm至200 nm之間的平均粒度。
  12. 如請求項1至11中任一項之醫藥組合物，其中該化學治療劑及該蛋白激酶抑制劑可在投與後以協同模式依序釋放。
  13. 如請求項1至12中任一項之醫藥組合物，其中兩種共囊封藥劑(亦即，該化學治療劑及該蛋白激酶抑制劑)之莫耳比使得當以該比率提供給該癌症相關之癌細胞時，以活體外分析於受影響細胞之分率約0.20至0.80之濃度範圍內，協同作用在該範圍展現超過至少20%。
  14. 如請求項1至13中任一項之醫藥組合物，其中用化學治療劑及蛋白激酶抑制劑囊封之該脂質體在活體內投與之後在血液中維持該協同莫耳藥物比至少一小時。
  15. 如請求項1至14中任一項之醫藥組合物，其用於治療需要治療之個體的癌症或癌症抗性，其中該癌症視情況選自由以下組成之群：乳癌、黑色素瘤、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤(Ewing sarcoma)、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌及胃腸道基質瘤，其中用對癌細胞具有協同細胞毒性或細胞抑制作用之該化學治療劑及該蛋白激酶抑制劑可藉由該脂質體來遞送。
  16. 一種治療癌症或癌症抗藥性之方法，其包含向需要治療之個體投與治療有效量的如請求項1至14中任一項之醫藥組合物。
  17. 如請求項16之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、黑色素瘤、胃腸癌、肺癌、大腸直腸癌、尤文氏肉瘤、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、甲狀腺癌、子宮癌及胃腸道基質瘤。
  18. 如請求項16或17之方法，其中該乳癌為三陰性乳癌，且其中該肺癌是以下任一者所造成：野生型EGFR之高度磷酸化或在EGFR胺基酸序列內之突變。
  19. 一種製備脂質體醫藥組合物(例如，如請求項1至11中任一項之脂質體醫藥組合物)之方法，其中該脂質體係藉由包含以下步驟的方法來製造： (a)在包含水、脂質及捕獲劑之溶液中形成多層脂質體囊泡； (b)將該多層脂質體囊泡於高溫下(例如，在40至75℃之範圍內)經由聚碳酸酯膜(例如，大小為50 nm或100 nm)多次擠出以形成單層脂質體； (c)藉由透濾(diafiltration)或尺寸排阻層析法(size exclusion chromatography)或其他緩衝液交換方法實質上移除該等脂質體外部之該(該等)捕獲劑；及 (d)在高溫下(例如，40至75℃)下，加熱於包含一或多種活性醫藥成分(active pharmaceutical ingredient；API)之水溶液中的未負載脂質體，藉此形成藥物囊封之脂質體。
  20. 如請求項19之方法，其中該脂質係選自由以下組成之群：(a)至少10 mol%選自由磷脂醯膽鹼(例如，HSPC、DSPC、DPPC、DMPC)、磷脂醯甘油(例如，DSPG)、磷脂醯肌醇、甘油糖脂、神經鞘醣脂(例如，神經鞘磷脂)及其組合組成之群的磷脂；(b) 0至60 mol%膽固醇或其衍生物；及(c)視情況衍生成聚乙二醇的帶電荷磷脂(例如mPEG-2000-DSPE)。
  21. 如請求項19或20之方法，其中該捕獲劑係選自由以下組成之群：硫酸銨；聚陰離子化磺基丁醚環糊精(例如，TEA-SBE-α-環糊精、TEA-SBE-β-環糊精、TEA-SBE-γ-環糊精、Tris-SBE-α-環糊精、Tris-SBE-β-環糊精及Tris-SBE-γ-環糊精)的銨鹽或經取代之銨鹽；及聚陰離子化硫酸化碳水化合物(例如，TEA-SOS及Tris-SOS)的銨鹽或經取代之銨鹽；聚磷酸鹽(例如，肌醇六磷酸三乙銨及三(羥基甲基)胺基甲烷肌醇六磷酸鹽)的銨鹽或經取代之銨鹽；過渡金屬鹽(例如，銅、鋅、錳、鎳、鈷或類似者與鹵化物、硫酸根離子及葡萄糖酸根離子形成的鹽)；四級銨化合物(例如，苯紮氯銨、苄索氯銨、溴化十六烷基三甲基銨、硬脂基二甲基苄基氯化銨)；聚氧乙烯(亦即，聚乙二醇)及椰子胺。
  22. 如請求項19至21中任一項之方法，其包含選自以下之方法：主動負載、被動負載及其組合；其中該主動或該被動負載係選自以下組成之群： (a)基於pH梯度之主動負載方法，其基於跨膜pH梯度囊封該等API，其中該脂質體之該內部水性隔室之pH值低於該脂質體外部之pH值； (b)基於過渡金屬之主動負載方法，其藉由利用過渡金屬離子通過錯合來驅動API攝入至脂質體中來囊封該等API； (c)被動負載方法，其在該脂質體形成期間囊封該等API；及 (d)被動負載方法，其涉及脂質體形成之後的被動平衡。
  23. 如請求項22之方法，其中該pH梯度係藉由銨離子之濃度梯度或具有能夠質子化之銨衍生物或經取代之銨的有機化合物之濃度梯度來形成。
  24. 如請求項19至23中任一項之方法，其中該API係選自蛋白激酶抑制劑及化學治療劑與蛋白激酶抑制劑之組合。
  25. 如請求項24之方法，其中該化學治療劑係選自由以下組成之群：多柔比星、環磷醯胺、卡鉑、太平洋紫杉醇、道諾比星、表柔比星、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、艾瑞布林、伊沙匹隆、甲胺喋呤、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌、長春瑞濱、多西他賽、噻替派、博萊黴素、長春新鹼、達卡巴嗪、卡培他濱、普賴松、喜樹鹼、拓朴替康、伊立替康、卡莫司汀、順鉑、BCNU、來那度胺及培美曲塞；且其中該蛋白激酶抑制劑係選自由以下組成之群：伊馬替尼、舒尼替尼、阿法替尼、尼達尼布、普納替尼、魯索利替尼、克唑替尼、依魯替尼、阿卡替尼、阿貝西利、阿法利貝、艾樂替尼、阿瓦替尼、阿西替尼、伯舒替尼、卡博替尼、卡普替尼、色瑞替尼、考比替尼、克唑替尼、達拉非尼、達可替尼、達沙替尼、恩拉非尼、恩曲替尼、厄達替尼、埃羅替尼、依維莫司、非達替尼、福他替尼、吉非替尼、吉列替尼、依魯替尼、拉帕替尼、拉羅替尼、樂伐替尼、勞拉替尼、尼達尼布、來那替尼、尼羅替尼、奈妥舒迪、奧希替尼、帕瑞替尼、帕唑帕尼、吡昔替尼、培米替尼、帕柏西利、普納替尼、吡昔替尼、普拉替尼、奎紮替尼、瑞戈非尼、瑞博西尼、力普替尼、塞爾帕替尼、司美替尼、索拉非尼、坦羅莫司、托法替尼、曲美替尼、圖卡替尼、優帕替尼、凡德他尼、維羅非尼、澤布替尼、塞維-阿法利貝及其組合。
  26. 如請求項19至25中任一項之方法，其中該等脂質體具有在4.5 nm至450 nm之間，較佳在25 nm與300 nm之間，且更佳在50 nm至200 nm之間的範圍內的平均粒度。
  27. 一種複數個載藥脂質體，其如請求項1至14中任一項中所定義或藉由如請求項19至26中任一項之方法來製備。
  28. 一種治療套組，其包含容器及在該容器中的複數個如請求項27之載藥脂質體，其中該等載藥脂質體係懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中或可懸浮於準備向需要治療之個體投與的無菌稀釋劑溶液中。
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