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TW202144016A - 抗ｐｓｍａ抗體－依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途 - Google Patents

抗ｐｓｍａ抗體－依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途 Download PDF

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TW202144016A
TW202144016A TW110110881A TW110110881A TW202144016A TW 202144016 A TW202144016 A TW 202144016A TW 110110881 A TW110110881 A TW 110110881A TW 110110881 A TW110110881 A TW 110110881A TW 202144016 A TW202144016 A TW 202144016A
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TW
Taiwan
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antibody
cancer
drug conjugate
pharmaceutically acceptable
cycloalkyl
Prior art date
Application number
TW110110881A
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English (en)
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應華
張小敏
楊筱瑩
陶維康
Original Assignee
大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司
大陸商上海恆瑞醫藥有限公司
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Abstract

本揭露涉及抗PSMA抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途。具體而言，本揭露涉及如通式(Pc-L-Y-D)所示的抗PSMA抗體-藥物偶聯物，其中Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段，L、Y和n如說明書中所定義。

Description

抗PSMA抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途
請求2020年3月25日提交的中國專利申請(申請號CN 202010218297.4)的優先權。
本揭露涉及抗PSMA抗體、抗PSMA抗體-依喜替康類似物偶聯物，其製備方法，包含其的藥物組成物，以及其用於製備治療PSMA介導的疾病或病症的藥物中的用途；尤其在用於製備抗癌藥物中的用途。
這裡的陳述僅提供與本揭露有關的背景資訊，而不必然地構成現有技術。
美國癌症協會2019年統計數據顯示，美國男性新增癌症病例中前列腺癌排名第一，為174650例(CA CANCER J CLIN 2019；69：7-34)。對於臨床局部疾病，通常選擇手術和放射治療。對於局部晚期或轉移性疾病，通常先採用手術或化學方式剝奪雄激素(ADT)治療。對於去勢抵抗(CRPC)初期可選用Sipuleucel-T細胞免疫療法，對於轉移性去勢抵抗階段(mCRPC)病人，可根據情況選用雄激素抑制劑、雄激素受體拮抗劑、針對骨轉移的放療藥物以及作用於微 管的化療藥物等藥物治療。但每種治療方式都只能延長幾個月的存活期，需要尋求有效的治療方式(European Urology,66(6),1190-1193；Journal of Nuclear Medicine,59(2),177-182.)。
前列腺特異性膜抗原(PSMA)除了由前列腺上皮细胞表達以外，還可以由非前列腺組織表達，例如小腸，近端腎小管和唾液腺，但其水平遠低於前列腺組織。而PSMA在前列腺癌細胞中高表達，特別是在轉移性疾病、激素難治性疾病和高級別病變中的表達最高。另外，PSMA還高表達於所有實體瘤的新生血管的內皮细胞中，但其在正常血管中没有表達，所以它也被作為實體瘤治療的靶點(Clinical Cancer Research,Vol.3,81-85,January 1997；Urologic Oncology：Seminars and Original Investigations,1(1),18-28.；Clin Cancer Res.2010 November 15；16(22)：5414-5423.)。雄激素剝奪或雄激素受體拮抗劑治療均可上調前列腺特異膜抗原(PSMA)的表達(J Nucl Med 2017；58：81-84)，這為靶向療法與傳統激素療法聯合治療提供依據。
PSMA屬於麩胺酸II型羧肽酶(Glutamate carboxypeptidase II，GCPII)，它在神經系統中作為NAALDase，酶解NAAG得到麩胺酸，與麩胺酸的神經傳遞相關。在小腸中作為FOLH1，分解葉酸-聚-γ-麩胺酸(folyl-poly-γ-glutamate，FPGn)得到葉酸，與葉酸代謝相關(Curr Med Chem.2012；19(6)：856-870.)。而在前列腺中作為PSMA，表現在上皮細胞上，與前列腺癌的發生有關。PSMA由750個胺基酸組成，胞內19個，跨膜24個，胞外707個。結晶結果顯示胞外部分由3個結構域組成，分別為蛋白酶樣結構域、頂端結構域和C末端結構域。三者都參與受質的結合，前兩者直接與受質結合，C末端結構域在使PSMA形成二聚體中發揮作用(The EMBO Journal(2006)25,1375-1384)。麩胺酸II型羧肽酶 (GCPII)及其剪接變體，旁系同源物的研究有限。以PSM’為代表的剪接變體大多存在於正常前列腺組織細胞的胞內。研究最深入的GCPII同源物GCPIII或NAALADase II作為自身有效的藥物標靶，可以彌補正常的GCPII酶促活性的不足，其與GCPII有68%序列相似性(Current Medicinal Chemistry,2012,19,1316-1322；Frontiers in Bioscience,Landmark,24,648-687,March 1,2019)。
抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugate,ADC)把單株抗體或者抗體片段通過接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和細胞毒性物質的高效性，同時又避免了抗體的療效偏低和毒性物質毒副作用過大等缺陷。這也就意味著，與以往傳統的化療藥物相比，抗體-藥物偶聯物能更精准地殺傷腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響。
目前已有多種ADC藥物被用於臨床或臨床研究，如Kadcyla，是靶向Her2的曲妥珠單抗與DM1形成的ADC藥物。同時，也有靶向PSMA的ADC藥物的用於臨床治療研究。Cytogen公司的PSMA-ADC，處於二期臨床階段，MedImmune公司的MEDI-3726以及BZL Biologics Inc公司的MLN-2704在臨床一期結束後因為藥效不良停止了研究。採用不同策略開發新的ADC藥物具有廣闊的前景。
本揭露涉及抗PSMA抗體-ADC以及其用途，提供與抗PSMA抗體或抗原結合片段與細胞毒性物質依喜替康類似物偶聯的ADC藥物。
本揭露提供了一種通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：
Figure 110110881-A0202-12-0004-4
其中，
Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-和-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；
Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基和雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
m為0至4的整數；非限制性實例如m選自0、1、2、3和4；
n為1至10，n是小數或整數；以n為1-8較佳，為3-8更佳，為3-7再較佳，為6-7再更佳。
L為接頭單元；
Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段，較佳為該抗PSMA抗體或其抗原结合片段特異性結合PSMA胞外結構域。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-LYD)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含與如SEQ ID NO：1所示的重鏈可變區相同序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含與如SEQ ID NO：2所示的輕鏈可變區相同序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-LYD)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-LYD)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體是鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-LYD)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：1所示或與其有至少90%-100%的序列同一性，包括但不限於至少91%、至少92%、至少93%、至少94%，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%的序列同一性；和該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：2所示或與其有至少90%-100%的序列同一性，包括但不限於至少91%、至少92%、至少93%、至少94%，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%的序列同一性。
該在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-LYD)所示的抗體-藥 物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體或其抗原結合片段，包含序列如SEQ ID NO：1所示的重鏈可變區和序列如SEQ ID NO：2所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，如前該的通式(Pc-LYD)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體包含抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區；該重鏈恆定區較佳為選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恆定區及其常規變體，該輕鏈恆定區較佳為選自人抗體κ和λ鏈的恆定區及其常規變體。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-LYD)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體，包含如SEQ ID NO：9所示的重鏈和如SEQ ID NO：10所示的輕鏈。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中n為1至8，較佳為3-8，更佳為3-7，n是小數或整數。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，
其中，
Y為-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；
Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素和C1-6烷基；
R1為鹵烷基或C3-6環烷基；
R2選自氫原子、鹵烷基和C3-6環烷基；
或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；
m為0或1。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中Y選自：
Figure 110110881-A0202-12-0007-5
其中Y的O端與接頭單元L相連。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中接頭單元-L-為-L1-L2-L3-L4-，
L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH2-C(O)-NR3-W-C(O)-或-C(O)-W-C(O)-，其中W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基和1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中該C1-8亞烷基、C1-8烷基-環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；
L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-和化學鍵，其中p1為1至20的整數；
L3為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸選自苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、瓜胺酸、絲胺酸(S)、麩胺酸(E)和天門冬胺酸(D)中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；
L4選自-NR5(CR6R7)t-、-C(O)NR5、-C(O)NR5(CH2)t-和化學鍵，其中t為 1至6的整數；
R3、R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；
R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中接頭單元-L-為-L1-L2-L3-L4-，
L1為
Figure 110110881-A0202-12-0008-6
，s1為2至8的整數；
L2為化學鍵；
L3為四肽殘基；較佳地，L3為GGFG(SEQ ID NO：13)(甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸)的四肽殘基；
L4為-NR5(CR6R7)-t-，R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2；
其中該L1端與Pc相連，L4端與Y相連。
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中-L-為：
Figure 110110881-A0202-12-0008-7
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中-L-Y-任選自：
Figure 110110881-A0202-12-0009-8
在一些實施方案中，如前所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-La-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：
Figure 110110881-A0202-12-0009-9
其中，
W、L2、L3、R5、R6、R7如前所述接頭單元-L-中所定義；
Pc、n、R1、R2、m如通式(Pc-L-Y-D)中所定義；
具體的，Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段；
m為0至4的整數；非限制性實例如m選自0、1、2、3和4；
n為1至10，n是小數或整數；以n為1-8較佳，為3-8更佳，為3-7再較 佳，為6-7再更佳；
R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；
L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-和化學鍵，其中p1為1至20的整數；
L3為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該的胺基酸殘基選自苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、瓜胺酸、絲胺酸(S)、麩胺酸(E)和天門冬胺酸(D)中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；
R5選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；
R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。
在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-Lb-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：
Figure 110110881-A0202-12-0011-10
其中，
s1為2至8的整數；
Pc、R1、R2、R5、R6、R7、m和n如通式(Pc-La-Y-D)所中所定義。
在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物選自：
Figure 110110881-A0202-12-0011-11
Figure 110110881-A0202-12-0012-12
其中Pc和n如通式(Pc-L-Y-D)中所定義，具體地，Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段，或如前任一項所述的抗PSMA抗體；
n為1至10，n是小數或整數；以n為1-8較佳，為3-8更佳，為3-7再較佳；為6-7再更佳。
在一些實施方案中，如前任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物為：
Figure 110110881-A0202-12-0012-13
其中，
n為1至8，較佳為3-8，n是小數或整數；
PM為抗PSMA抗體，其包含如SEQ ID NO：9所示的重鏈和如SEQ ID NO：10所示的輕鏈。
本揭露進一步提供一種製備如通式(Pc-La-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的方法，其包括以下步驟：
Figure 110110881-A0202-12-0013-14
Pc’為還原後的Pc，與通式(La-Y-D)所示的化合物進行偶聯反應，得到通式(Pc-La-Y-D)所示的化合物；
其中，
Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段；
n、m、W、L2、L3、R1、R2、R5、R6和R7如前述通式(Pc-La-Y-D)中所定義。
進一步提供一種製備如通式(Pc-L’-D)所示的抗體藥物偶聯物的方法，其包括以下步驟：
Figure 110110881-A0202-12-0014-15
上述反應中，Pc’與式(L’-D)所示的化合物進行偶聯反應，得到通式(Pc-L’-D)所示的化合物；其中，
Pc為如前所述的抗PSMA抗體或其抗原结合片段；Pc’為經還原後的Pc，
n如通式(Pc-L-Y-D)中所定義。
本揭露進一步提供一種製備如PM-9-A所示的抗體藥物偶聯物的方法，其包括以下步驟：
Figure 110110881-A0202-12-0015-16
PM’與式9-A所示的化合物進行偶聯反應，得到通式(PM-9-A)所示的化合物；其中，
n為1至8，較佳為3-8，n是小數或整數；
PM為抗PSMA抗體，其包含序列如SEQ ID NO：9所示的重鏈和序列如SEQ ID NO：10所示的輕鏈；
PM’為經PM還原後得到。
在一些實施方案中，n代表抗體-藥物偶聯物的載藥量，也可稱為DAR值，其可用一般方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗和HPLC測定；在一些實施方案中，n為0-10，以1-10較佳，以1-8更佳，或2-8、或2-7、或2-4、或3-8、或3-7、或3-6、或4-7、或4-6、或4-5的平均值；在一些實施方案中，n為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的平均值。
另一方面，提供了一種藥物組成物，其包含根據該抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。在一些實施方案中，該單位劑量的藥物組成物中含有0.1mg-3000mg或1mg- 1000mg如前所述的抗PSMA抗體或如前所述的抗體藥物偶聯物。
另一方面，本揭露提供了根據本揭露所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或包含其的藥物組成物作為藥物的用途。
另一方面，本揭露提供了根據本揭露所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或包含其的藥物組成物在製備用於治療PSMA介導的疾病或病症的藥物中的用途，其中該PSMA介導的疾病或病症為PSMA高表達癌症、中表達癌症或低表達癌症較佳。
另一方面，本揭露提供根據本揭露所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或包含其的藥物組成物在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途，其中該癌症較佳為頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝細胞瘤、肝細胞癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合徵、庫肯勃氏瘤、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克爾細胞癌，更佳為前列腺癌；該淋巴瘤再較佳為選自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、瀰漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤，該肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌，該白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細 胞性白血病和髓樣細胞白血病。
另一方面，本揭露進一步涉及一種用於治療和/或預防腫瘤的方法，該方法包括向需要其的受試者施用治療有效劑量的根據本揭露所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或其藥學上可接受的鹽或包含其的藥物組成物；其中該腫瘤較佳為與PSMA高表達相關的癌症、中表達癌症或低表達癌症。
另一方面，本揭露進一步涉及一種用於治療或預防腫瘤或癌症的方法，該方法包括向需要其的受試者施用治療有效劑量的根據本揭露所述的抗體藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或包含其的藥物組成物；其中該腫瘤和癌症較佳為頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝細胞瘤、肝細胞癌、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、庫肯勃氏瘤、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克爾細胞癌；較佳為前列腺癌；該淋巴瘤更佳為選自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤，該肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌，該白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病。
另一方面，本揭露進一步提供前述的抗PSMA抗體或其抗體-藥物偶聯物作為藥物，較佳為作為治療癌症或腫瘤的藥物，更佳為作為治療PSMA介導的癌症的藥物。
可將活性化合物(例如根據本揭露所述的配體-藥物偶聯物、或其藥學上可接受的鹽)製成適合於通過任何適當途徑給藥的形式，活性化合物較佳是以單位元劑量的方式，或者是以受試者能夠以單劑進行自我給藥的方式。本揭露所述的活性化合物或組成物的單位元劑量的方式可以是片劑、膠囊、扁囊劑、瓶裝藥水、藥粉、顆粒劑、錠劑、栓劑、再生藥粉或液體製劑。
本揭露治療方法中所用活性化合物或組成物的施用劑量通常將隨疾病的嚴重性、受試者的體重和活性化合物的相對功效而改變。作為一般性指導，合適的單位劑量可以是0.1mg~1000mg。
本揭露的藥物組成物除活性化合物外，可含有一種或多種輔料，該輔料選自以下成分：填充劑、稀釋劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑或賦形劑等。根據給藥方法的不同，組成物可含有0.1至99重量%的活性化合物。
本揭露提供的PSMA抗體及抗體藥物偶聯物具有與細胞表面抗原良好的親和力、良好的細胞內吞效率和很強的腫瘤抑制效率，並且具有更寬的藥物應用窗口、更高的抑瘤效果和治療活性、更好的安全性、藥物代謝動力學特性和成藥性(如穩定性)，更適於臨床的藥物應用。
圖1A：本揭露的ADC或抗體與細胞MDAPCa的體外結合能力。
圖1B：本揭露的ADC或抗體與細胞LNCaP的體外結合能力。
圖1C：本揭露的ADC或抗體與細胞22Rv1的體外結合能力。
圖1D：本揭露的ADC或抗體與細胞PC-3的體外結合能力。
圖1E：本揭露的ADC或抗體與細胞DU 145的體外結合能力。
圖2A：抗體PM在LNCaP細胞中的體外內吞實驗；2K細胞，10%U-L IgG FBS。
圖2B：抗體PM在22Rv1細胞中的體外內吞實驗；2K細胞，10%U-L IgG FBS。
圖3A：本揭露的不同ADC對LNCaP細胞殺傷作用，用2K細胞，4.5% FBS。
圖3B：本揭露中毒素(化合物2-B)對LNCaP細胞殺傷作用，用2K細胞，4.5% FBS。
圖3C：本揭露的不同ADC對22Rv1細胞殺傷作用，用4K細胞，4.5% FBS。
圖3D：本揭露中毒素(化合物2-B)對22Rv1細胞殺傷作用，用4K細胞，4.5% FBS。
圖3E：本揭露的不同ADC對PC-3細胞殺傷作用，用4K細胞，4.5% FBS。
圖3F：本揭露中毒素(化合物2-B)對PC-3細胞殺傷作用，用2K細胞，4.5% FBS。
圖4A：本揭露不同劑量的ADC對人前列腺癌細胞22Rv1裸小鼠移植瘤的抑制活性。
圖4B：本揭露不同劑量的ADC對人前列腺癌細胞22Rv1裸小鼠移 植瘤的抑制活性測試中小鼠的體重變化。
圖5A：本揭露不同劑量的ADC對人前列腺癌細胞22Rv1裸小鼠移植瘤的抑制活性。
圖5B：本揭露不同劑量的ADC對人前列腺癌細胞22Rv1裸小鼠移植瘤的抑制活性測試中小鼠的體重變化。
圖6A：本揭露不同劑量的ADC對人前列腺癌細胞LNCap在SCID Beighe小鼠上的移植瘤的抑制活性。
圖6B：本揭露不同劑量的ADC對人前列腺癌細胞LNCap在SCID Beighe小鼠上的移植瘤的抑制活性測試中小鼠的體重變化。
圖7：本揭露ADC-2的藥代穩定性，其中ADC的濃度為100μg/ml。
圖8：本揭露ADC-5的血漿穩定性，其中ADC的濃度為100μg/ml。
圖9：給藥ADC對荷瘤裸鼠22Rv1移植瘤的療效。
術語
除非另有限定，本文所用的所有技術和科學術語均與本揭露所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解一致。雖然也可採用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本揭露，但本文描述了較佳的方法和材料。描述和要求保護本揭露時，依據以下定義使用下列術語。
當本揭露中使用商品名時，旨在包括該商品名產品的製劑、該商品名產品的藥物和活性藥物部分。
除非有相反陳述，在說明書和申請專利範圍中使用的術語具有下 述含義。
術語“藥物”或“毒素”是指細胞毒性藥物，能在腫瘤細胞內具有較強破壞其正常生長的化學分子。細胞毒性藥物原則上在足夠高的濃度下都可以殺死細胞，但是由於缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會導致正常細胞的凋亡，導致嚴重的副作用。該術語包括如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，化療藥物，抗生素和核溶酶。
術語“接頭單元”、“接頭”、“連接單元”或“連接片段”是指一端與配體(本揭露中為抗體)連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與配體或藥物相連。
接頭可以包含一種或多種接頭元件。示例性的接頭元件包括6-馬來醯亞胺基己醯基(“MC”)、馬來醯亞胺基丙醯基(“MP”)、纈胺酸-瓜胺酸(“val-cit”或“vc”)、丙胺酸-苯丙胺酸(“ala-phe”)、對胺基苄氧羰基(“PAB”)、N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯(“SMCC”，在本文中也稱作“MCC”)和N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(“SIAB”)。接頭可以包含以下的元件中的一個或多個、或其組合：延伸物、間隔物和胺基酸單元，可以通過本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。
接頭元件包括但不限於：
MC=6-馬來醯亞胺基己醯基，結構如下：
Figure 110110881-A0202-12-0022-17
Val-Cit或“vc”=纈胺酸-瓜胺酸(蛋白酶可切割接頭中的示例二肽)；
瓜胺酸=2-胺基-5-脲基戊酸；
PAB=對胺基苄氧羰基(“自我犧牲”接頭元件的示例)；
Me-Val-Cit=N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(其中接頭肽鍵已經修飾以防止其受到組織蛋白酶B的切割)；
MC(PEG)6-OH=馬來醯亞胺基己醯基-聚乙二醇(可附著於抗體半胱胺酸)；
SPP=N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯；
SPDP=N-琥珀醯亞胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯；
SMCC=琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯；
IT=亞胺基硫烷。
IT=亞胺基硫烷。
術語“抗體藥物偶聯物”指抗體通過連接單元與具有生物活性的藥物相連。在本揭露中“抗體藥物偶聯物”(antibody drug conjugate，ADC)，指將單株抗體或者抗體片段通過連接單元與具有生物活性的毒性藥物相連。抗體可直接地或經接頭地偶聯至藥物。n是每個抗體的平均藥物模組數，可以是整數或小數，其範圍可以是：例如每個抗體約0到約20個藥物模組，在某些實施方案中是每個抗體1個到約10個藥物模組，在某些實施方案中是每個抗體1個到約8個 藥物模組，如2、3、4、5、6、7、8個藥物模組。本揭露的抗體-藥物偶聯物的混合物的組成物，其中每個抗體的平均藥物載重是約1個至約10個，包括但不限於約3個至約7個、約3個至約6個、約3個至約5個、約1個至約9個、約7個或約4個。
本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
術語“抗體”指免疫球蛋白，完整抗體是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈通過恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
全長抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的框架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
術語“完全人源抗體”、“完全人抗體”、“人抗體”或“全人抗體”，也稱“全人源單株抗體”，其抗體的可變區和恆定區都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗體製備的相關技術主要有：人雜交瘤技術、EBV 轉化B淋巴細胞技術、噬菌體顯示技術(phage display)、轉基因小鼠抗體製備技術(transgenic mouse)和單個B細胞抗體製備技術等。
術語“抗原結合片段”是指抗體的保持特異性結合抗原的能力的一個或多個片段。可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。“抗原結合片段”中包含的結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段，示例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含通過鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可任選地通過合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，通過合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的一般技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可通過重組DNA技術或通過酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。
通常，Fab是通過用蛋白酶木瓜蛋白酶(例如，切割H鏈的224位的 胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的部分和L鏈通過二硫鍵結合在一起。
通常，F(ab')2是通過用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中二硫鍵的下方部分而獲得的，分子量約為100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
通常，Fab'是通過切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。
此外，可以通過將編碼Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或VH)和抗體輕鏈可變結構域(或VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本揭露的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno l.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種習知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括“Kabat”編號規則(參 見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則(參見Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通過組合Kabat和Chothia兩者的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)構成。遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT規則，抗體的CDR區可以使用程式IMGT/DomainGap Align確定。除非特別說明，本揭露中該6個CDR均按照Kabat編號規則獲得。((Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication 91-3242))。按照Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。本領域其他的編號規則Chothia、IMGT等。
術語“抗體框架區”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用 作該可變結構域的抗原结合環(CDR)的支架。從本質上來說，其是不具有CDR的可變結構域。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上被免疫球蛋白或抗體結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體或抗原結合片段對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體或抗原結合片段以大约小於10-7M，例如大约小於10-8M、10-9M或10-10M或更小的親和力(KD)結合。
術語“KD”是指抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本揭露的抗體或抗原結合片段以小於大约10-7M，例如小於大约10-8M或10-9M的解離平衡常數(KD)結合PSMA或其表位，例如，在本揭露中抗體與細胞表面抗原的親和力採用FACS法測定KD值。
術語“核酸分子”是指DNA分子或RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。
胺基酸序列“序列同一性”指比對胺基酸序列過程中，在必要時引入間隙，以達成最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，第一序列中與第二序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。為測定胺基酸序列同一性百分比的目的，比對可以通過屬於本領域技術的範 圍內的多種方式來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。
術語“表達載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括微生物(如細菌)、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本揭露工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以克隆並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性 的克隆在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
術語“肽”是指由2個或2個以上胺基酸分子通過肽鍵相互連接而成的分子，是蛋白質的結構與功能片段。
術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳為含有1至12(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12個)個碳原子的烷基，更佳為含有1至10個碳原子的烷基，最佳為含有1至6個碳原子(包含1個、2個、3個、4個、5個或6個碳原子)的烷基。非限制性示例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、 2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。再較佳的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基。
術語“雜烷基”指含有一個或多個選自N、O或S的雜原子的烷基，其中烷基如上所定義。
術語“亞烷基”指飽和的直鏈或支鏈脂肪族烴基，其具有2個從母體烷的相同碳原子或兩個不同的碳原子上除去兩個氫原子所衍生的殘基，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳為含有1至12個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12個)碳原子，更佳為含有1至6個碳原子(包含1個、2個、3個、4個、5個或6個碳原子)的亞烷基。伸烷基的非限制性示例包括但不限於伸甲基(-CH2-)、1,1-伸乙基(-CH(CH3)-)、1,2-伸乙基(-CH2CH2)-、1,1-伸丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-伸丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-伸丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-伸丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和1,5-伸丁基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)等。伸烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為獨立地任選選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰 基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基中的一個或多個取代基所取代。
術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基或環烷基的定義如上該。烷氧基的非限制性示例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基和雜環烷硫基。
術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳為包含3至12個碳原子，更佳為包含3至8個碳原子，再較佳為包含3至6個碳原子。單環環烷基的非限制性示例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。
該環烷基環包括如上所述的環烷基(包括單環、螺環、稠環和橋環)稠合於芳基、雜芳基或雜環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為環烷基，非限制性實例包括茚滿基、四氫萘基和苯并環庚烷基等；較佳為苯基并環戊基和四氫萘基。
環烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為獨立地任選選自氫原子、鹵素、烷基、烷氧基、鹵烷基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個取代基所取代。
術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)p(其中p是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳為包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳為包含3至8個環原子，其中1-3是雜原子；再較佳為包含3至6個環原子，其中1-3個是雜原子；最佳為包含5或6個環原子，其中1-3個是雜原子。單環雜環基的非限制性示例包括吡咯烷基、四氫吡喃基、1,2.3.6-四氫吡啶基、呱啶基、呱嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基和高呱嗪基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。
該雜環基環包括如上所述的雜環基(包括單環、螺雜環、稠雜環和橋雜環)稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性示例包括：
Figure 110110881-A0202-12-0032-18
雜環基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為獨立地任選選自氫原子、鹵素、烷基、烷氧基、鹵烷基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個取代基所取代。
術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14元全碳單環或稠合多環(也就是共用毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10元，例如苯基和萘基。該芳基環包括如上該的芳基環稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性示例包括：
Figure 110110881-A0202-12-0033-19
芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為獨立地任選選自氫原子、鹵素、烷基、烷氧基、鹵烷基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個取代基所取代。
術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為5至10元，更佳為5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基等。該雜芳基環包括如上述的雜芳基稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性示例包括：
Figure 110110881-A0202-12-0033-20
Figure 110110881-A0202-12-0034-21
雜芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代較佳為獨立地任選選自氫原子、鹵素、烷基、烷氧基、鹵烷基、羥基、羥烷基、氰基、胺基、硝基、環烷基、雜環基、芳基和雜芳基中的一個或多個取代基所取代。
術語“鹵烷基”指烷基上的氫被一個或多個鹵素取代，其中烷基如上所定義。
術語“氘代烷基”指烷基上的氫被一個或多個氘原子取代，其中烷基如上所定義。
術語“羥烷基”指烷基上的氫被一個或多個羥基取代，其中烷基如上所定義。
術語“羥基”指-OH基團。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
術語“胺基”指-NH2。
術語“硝基”指-NO2。
術語“氰基”指-CN。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選被烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團被烷基取代的情形和雜環基團不被烷基取代的情形。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳 為1個、2個或3個氫原子彼此獨立地被取代基取代。取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(通過實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
術語“藥物組成物”表示含有一種或多種本文該化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。藥物組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“藥學上可接受的鹽”或“可藥用鹽”是指本揭露抗體藥物偶聯物的鹽，這類鹽用於受試者體內時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性，本揭露抗體藥物偶聯物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，可藥用鹽的非限制性示例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。
“載藥量”或“平均藥物載重”也稱藥物抗體比例(Drug-to-Antibody Ratio，DAR)，即ADC中每個抗體所偶聯的藥物的平均數量。其可在例如每個抗體偶聯約1至約10個藥物的範圍內，並且在某些實施例中，在每個抗體偶聯約1至約8個藥物的範圍內，較佳為自2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、3-4、3-5、5-6、5-7、5-8和6-8的範圍。示例性的，載藥量可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的平均值。本揭露的ADC通式包括與前述一定載藥量範圍內的抗體藥物偶聯物的集合。在本揭露的實施方案中，載藥量表示為n，也可稱為DAR值，示例性 的為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的均值。可用一般方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗和HPLC測定載藥量。
可以用以下非限制性方法調控配體藥物偶聯物的載量，包括：
(1)調控連接試劑和單抗的莫耳比，
(2)調控反應時間和溫度，
(3)選擇不同的反應試劑。
一般的藥物組成物的製備見中國藥典。
術語“載體”用於本揭露的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、調控藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的示例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。
術語“賦形劑”是在藥物製劑中除主藥以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的粘合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。
術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。如澱粉、乳糖、鈣的無機鹽、微晶 纖維素等。
藥物組成物可以是無菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶劑中有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳液。例如將活性成分溶於大豆油和卵磷脂的混合物中。然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成微乳液。可通過局部大量注射，將注射液或微乳液注入受試者的血流中。或者，最好按可保持本揭露化合物恆定迴圈濃度的方式給予溶液和微乳液。為保持這種恆定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的示例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。
藥物組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸浮液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸浮液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或混懸浮液，例如1,3-丁二醇中製備的溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用包括合成甘油單或二酯在內的任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以製備注射劑。
合成方法
為了完成合成目的，採用如下的合成技術方案：
通式(PM-9-A)所示的化合物的製備方法，其包括如下步驟：
Figure 110110881-A0202-12-0038-22
PM還原後得到PM’，PM’與通式(9-A)偶聯反應，得到通式(PM-9-A)所示的化合物；還原劑較佳為TCEP，特別地，較佳為還原抗體上的二硫鍵；
其中，
PM為抗PSMA抗體或其抗原結合片段；
n為1至10，n是小數或整數。
在以上說明書中提出了本揭露一種或多種實施方案的細節。雖然可使用與本文該類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本揭露，但是以下描述較佳的方法和材料。通過說明書和申請專利範圍，本揭露的其他特點、目的和優點將是顯而易見的。在說明書和申請專利範圍中，除非上下文中有清楚的另外指明，單數形式包括複數指代物的情況。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都具有本揭露所屬技術領域中具有通常知識者所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都通過引用納入。提出以下實施例是為了更全面地說明本揭露的較佳實施方案。這些實施例不應以任何方式理解為限制本揭露的範圍，本揭露的範圍由申請專利範圍限定。
本揭露實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
實施例1. 抗體的製備
(一)PSMA抗體製備
1.1抗體序列
本揭露的抗體參照WO2003034903A2製備，其中AB-PG1-XG1-006可變區的胺基酸序列如下：
AB-PG1-XG1-006重鏈可變區：
Figure 110110881-A0202-12-0039-23
SEQ ID NO：1
AB-PG1-XG1-006輕鏈可變區：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKTGKVPKFLIYEASTLQSGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQNYNSAPFTFGPGTKVDIK SEQ ID NO：2
註：底線部分為依照Kabat編號規則確定的CDR區。
表1AB-PG1-XG1-006抗體的CDR區
Figure 110110881-A0202-12-0040-24
1.2全長抗體的構建
根據以上序列，設計引物PCR搭建得到VH/VK基因片段，獲得可變區。
抗體可變區再與恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段進行同源重組，構建完整抗體VH-CH1-Fc/VK-CL。
構建的完整全長抗體PM序列如下：
重鏈(IgG1)胺基酸序列：
Figure 110110881-A0202-12-0040-25
Figure 110110881-A0202-12-0041-26
SEQ ID NO：9
輕鏈(Kappa)胺基酸序列：
Figure 110110881-A0202-12-0041-27
SEQ ID NO：10
1.3全長抗體的表達與純化
將分別表達抗體輕、重鏈的質粒例轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用Protein A柱進行純化。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性沖提液沖提目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。沖提樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。
(二)對照抗體Lmab製備
對照抗體labetuzumab(簡稱Lmab)參照WHO Drug Information Vol.30,No.1,2016製備，其中重鏈和輕鏈胺基酸序列如下：
>抗體重鏈序列Lmab-HC
Figure 110110881-A0202-12-0041-28
Figure 110110881-A0202-12-0042-29
SEQ ID NO：11
>抗體輕鏈序列Lmab-LC
Figure 110110881-A0202-12-0042-30
SEQ ID NO：12
實施例2. 化合物的製備
本揭露實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
化合物的結構是通過核磁共振(NMR)或質譜(MS)來確定的。NMR 的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)，化學位移是以10-6(ppm)作為單位給出。
MS的測定用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(生產商：Thermo，型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。
UPLC的測定用Waters Acquity UPLC SQD液質聯用儀。
HPLC的測定使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150×4.6mm色譜柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(Gimini C18 150×4.6mm色譜柱)。
UV-HPLC的測定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度計。
增殖抑制率及IC50值的測定用PHERA starFS酶標儀(德國BMG公司)。
薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm矽膠板。
柱層析一般使用煙臺黃海200~300目矽膠為載體。
本揭露的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。
實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。
氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。
氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。
加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。
氫化反應通常抽真空，充入氫氣，重複操作3次。
微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。
實施例中如無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。
實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫。
室溫為最適宜的反應溫度，溫度範圍是20℃~30℃。
實施例中pH=6.5的PBS緩衝液的配製：取KH2PO4 8.5g，K2HPO4.3H2O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置於瓶中，定容至2L，超聲波使其全部溶解，搖勻即得。
純化化合物採用的柱層析的沖提劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括：A：二氯甲烷和異丙醇體系，B：二氯甲烷和甲醇體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。
本揭露部分化合物是通過Q-TOF LC/MS來表徵的。Q-TOF LC/MS使用安捷倫6530精確質量數四級杆-飛行時間質譜儀和安捷倫1290-Infinity超高效液相色譜儀(安捷倫Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色譜柱)。
本揭露抗體藥物偶聯物的Y-D藥物部分參見PCT/CN2019/107873，相關的化合物合成及測試引用至本專利。其中的非限制性實施例合成引用如下：
實施例2-1
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丙烷-1-甲醯胺1
Figure 110110881-A0202-12-0045-31
Figure 110110881-A0202-12-0045-32
向依喜替康甲磺酸鹽1b(2.0mg，3.76μmol，採用專利申請“EP0737686A1”公開的方法製備而得)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基環丙基甲酸1a(1.4mg，3.7μmol，採用公知的方法“Tetrahedron Letters,25(12),1269-72；1984”製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(3.8mg，13.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物1(1.6mg，產率：82.1%)。
MS m/z(ESI)：520.2[M+1]
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.90-7.84(m,1H),7.80-7.68(m,1H), 5.80-5.70(m,1H),5.62-5.54(m,2H),5.44-5.32(m,2H),5.28-5.10(m,2H),3.40-3.15(m,3H),2.44(s,3H),2.23(t,1H),2.06-1.75(m,2H),1.68-1.56(m,1H),1.22-1.18(m,2H),1.04-0.98(m,2H),0.89(t,3H).
實施例2-2
(S)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-A
(R)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-B
Figure 110110881-A0202-12-0046-33
Figure 110110881-A0202-12-0046-34
向1b(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入2-環丙基-2-羥基乙酸2a(2.3mg，19.8μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)、1-羥基苯并三唑(3mg，22.4 μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(4.3mg，22.4μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌2小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗製化合物2用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)，B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/分鐘)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2-A：1.5mg，2-B：1.5mg)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
單一構型化合物2-B(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.06分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.37(d,1H),7.76(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.56(m,1H),5.48(d,1H),5.41(s,2H),5.32-5.29(m,2H),3.60(t,1H),3.19-3.13(m,1H),2.38(s,3H),2.20-2.14(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.83(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.34-1.28(m,1H),0.86(t,3H),0.50-0.39(m,4H)。
單一構型化合物2-A(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.10分鐘，純度：86%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.35(d,1H),7.78(d,1H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),5.58-5.53(m,1H),5.42(s,2H),5.37(d,1H),5.32(t,1H),3.62(t,1H),3.20-3.15(m,2H),2.40(s,3H),2.25-2.16(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.21-1.14(m,1H),0.87(t,3H),0.47-0.35(m,4H)。
實施例2-3
(S)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-A
(R)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-B
Figure 110110881-A0202-12-0048-35
Figure 110110881-A0202-12-0048-36
向1b(5.0mg，9.41μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入3,3,3-三氟-2-羥基丙酸3a(4.1mg，28.4μmol，供應商Alfa)、1-羥基苯并三唑(3.8mg，28.1μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(5.4mg，28.2μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應10分鐘。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌8小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗製化合物3用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/分鐘)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(1.5mg，1.5mg)。
MS m/z(ESI)：561.9[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.11分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.94(d,1H),7.80(d,1H),7.32(s,1H),7.20(d,1H),6.53(s,1H),5.61-5.55(m,1H),5.45-5.23(m,3H),5.15-5.06(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.26-2.20(m,1H),2.16-2.08(m,1H),2.02-1.94(m,1H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
單一構型化合物(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.19分鐘，純度：90%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.97(d,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.16(d,1H),6.53(s,1H),5.63-5.55(m,1H),5.45-5.20(m,3H),5.16-5.07(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.22-2.14(m,1H),2.04-1.95(m,2H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
實施例2-4
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環戊烷-1-甲醯胺4
Figure 110110881-A0202-12-0050-37
Figure 110110881-A0202-12-0050-38
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基-環戊烷甲酸4a(2.2mg，16.9μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.7mg，16.9μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4(2.5mg，產率：80.9%)。
MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.73-7.62(m,2H),5.75-5.62(m,1H),5.46-5.32(m,2H),5.26-5.10(m,1H),3.30-3.10(m,1H),2.43(s,3H),2.28-2.20(m,2H),2.08-1.84(m,8H),1.69-1.58(m,2H),1.04-1.00(m,2H),0.89(t,3H)。
實施例2-5
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羥甲基)環丙烷-1-甲醯胺5
Figure 110110881-A0202-12-0051-39
Figure 110110881-A0202-12-0051-40
向1b(2.0mg，3.76μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-(羥甲基)-環戊烷甲酸5a(0.87mg，7.5μmol，採用專利申請“WO201396771”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2mg，7.24μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物5(1.0mg，產率：50%)。
MS m/z(ESI)：533.9[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.07(s,1H),7.23-7.18(m,2H),6.71-6.64(m,1H),6.55-6.51(m,1H),5.36-5.27(m,2H),4.67-4.61(m,2H),3.53-3.48(m,1H),3.30- 3.22(m,2H),3.18-3.13(m,1H),2.71-2.61(m,2H),2.35-2.28(m,1H),2.04-1.91(m,4H),1.53-1.40(m,3H),0.91-0.75(m,4H)。
實施例2-6
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-(羥基甲基)環丁烷-1-甲醯胺6
Figure 110110881-A0202-12-0052-41
Figure 110110881-A0202-12-0052-42
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-(羥基甲基)環丁烷-1-甲酸6a(2.2mg，16.9μmol；採用文獻“Journal of the American Chemical Society,2014,vol.136,#22,p.8138-8142”公開的方法製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(4.7mg，16.9μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸 鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物6(2.1mg，產率：67.9%)。
MS m/z(ESI)：548.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 7.85-7.62(m,1H),6.88(br，1H),5.87-5.48(m，2H),5.47-5.33(m，1H),5.31-5.06(m，1H),4.25-3.91(m,2H),3.25(br,1H),2.60-2.32(m,3H),2.23(t,1H),2.15-1.95(m,3H),1.70-1.56(m,2H),1.41-1.17(m,9H),1.03(s,1H),0.95-0.80(m,2H)。
實施例2-7
N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丁烷-1-甲醯胺7
Figure 110110881-A0202-12-0053-43
Figure 110110881-A0202-12-0053-44
向1b(3.0mg，5.64μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。 向反應液中依次加入1-羥基環丁烷甲酸7a(2.0mg，17.22μmol，供應商藥石)，1-羥基苯并三唑(2.3mg，17.0μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(3.2mg，16.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應10分鐘。撤去冰水浴，常溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物7(2.5mg，產率：83.1%)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.28(d,1H),7.75(d,1H),7.29(s,1H),6.51(s,1H),6.12(s,1H),5.59-5.51(m,1H),5.41(s,2H),5.20-5.01(m,2H),3.27-3.17(m,1H),3.15-3.05(m,1H),2.71-2.63(m,1H),2.37(s,3H),2.12-2.05(m,1H),2.03-1.94(m,2H),1.92-1.78(m,4H),1.50-1.42(m,1H),0.90-0.83(m,4H)。
實施例2-8
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8
Figure 110110881-A0202-12-0054-45
Figure 110110881-A0202-12-0055-46
第一步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸苄酯8c
將1-羥基環丙烷-1-羧酸苄酯8a(104mg，0.54mmol；採用專利申請“US2005/20645”公開的方法製備而得)和2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲基乙酸酯8b(100mg，0.27mmol；採用專利申請“CN105829346A”公開的方法製備而得)加入反應瓶，加入5mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(61mg，0.54mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相1並濃縮。所得殘餘物溶於3mL 1,4-二氧六環中，加入0.6mL水，加入碳酸氫鈉(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(70mg，0.27mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物8c(100mg，產率：73.6%)。
MS m/z(ESI)：501.0[M+1]。
第二步
1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸8d
將8c(50mg，0.10mmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(25mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到標題產物8d(41mg，產率：100%)。
MS m/z(ESI)：411.0[M+1]。
第三步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯8e
將1b(7mg，0.013mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入8d(7mg，0.017mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(7mg，0.026mmol)，冰浴攪拌反應35分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物8e(8.5mg，產率78.0%)。
MS m/z(ESI)：828.0[M+1]。
第四步
1-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8f
將8e(4mg，4.84μmol)溶於0.2mL二氯甲烷中，加入0.1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗製標題產物8f(2.9mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：606.0[M+1]。
第五步
1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺8
將粗製8f(2.9mg，4.84μmol)溶於0.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-二側氧-1H-吡咯-1-基)已醯胺基)乙醯胺基)乙醯胺基)-3-苯基丙酸8g(2.7mg，5.80μmol，採用專利申請“EP2907824”公開的方法製備而得)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(2.7mg，9.67μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌15分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物8(2mg，產率：39.0%)。
MS m/z(ESI)：1060.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 9.01(d,1H),8.77(t,1H),8.21(t,1H),8.08-7.92(m,2H),7.73(d,1H),7.28(s,1H),7.24-7.07(m,4H),6.98(s,1H),6.50(s,1H),5.61(q,1H),5.40(s,2H),5.32(t,1H),5.12(q,2H),4.62(t,1H),4.52(t,1H),4.40-4.32(m,1H),3.73-3.47(m,8H),3.16-3.04(m,2H),2.89(dd,1H),2.69-2.55(m,2H),2.37-2.23(m,4H),2.12-1.93(m,4H),1.90-1.74(m,2H),1.52-1.38(m,4H),1.33-1.11(m,5H),0.91-0.81(m,4H)。
實施例2-9
N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2.5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-B
Figure 110110881-A0202-12-0058-47
Figure 110110881-A0202-12-0059-48
第一步
2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯9a
將2a(1.3g，11.2mmol；採用專利申請“WO2013/106717”公開的方法製備而得)溶於50mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(6.18g，44.8mmol)，溴化苄(1.33mL，11.2mmol)和四丁基碘化銨(413mg，1.1mmol)。將反應液室溫攪拌48小時，通過矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物9a(2g，產率：86.9%)。
第二步
10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯9b
將9a(120.9mg,0.586mmol)和8b(180mg，0.489mmol)加入反應瓶，加入4mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(109mg，0.98mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌40分鐘，加入10mL冰水，用乙酸乙酯 (20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於4mL二氧六環中，加入2mL水，加入碳酸氫鈉(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室溫攪拌2小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物9b(48mg，產率：19%)。
MS m/z(ESI)：515.0[M+1]。
第三步
10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸9c
將9b(20mg，0.038mmol)溶於4.5mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(12mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗製標題產物9c(13mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。
第四步
(9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-環丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯9d
將1b(10mg，18.8μmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗製9c(13mg，30.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(16.9mg，61.2 μmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物9d(19mg，產率：73.6%)。
MS m/z(ESI)：842.1[M+1]。
第五步
2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺9e
將9d(19mg，22.6μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯并減壓濃縮，重複兩次。往殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，保留固體。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵拉乾得到粗製標題產物9e(17mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：638.0[M+18]。
第六步
N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-A
N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4'：6,7]吲哚嗪并[1,2- b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺9-B
將粗製9e(13.9mg，22.4μmol)溶於0.6mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入8g(21.2mg，44.8μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(18.5mg，67.3μmol)，冰浴攪拌反應10分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物9。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5μm 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度沖提，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(9-A：2.4mg，9-B：1.7mg)。
MS m/z(ESI)：1074.4[M+1]。
單一構型化合物9-A(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.14分鐘，純度：85%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.60(t,1H),8.51-8.49(d,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.15(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.74-4.62(m,1H),4.54-4.40(m,2H),3.76-3.64(m，4H),3.62-3.48(m,2H),3.20-3.07(m,2H),3.04-2.94(m,1H),2.80-2.62(m,1H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.15(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.93-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.87(t,3H),0.64-0.38(m,4H)。
單一構型化合物9-B(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.16分鐘，純度：89%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc),B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.68-8.60(m,1H),8.58-8.50(m,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.94(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.13(m,3H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.60-5.50(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,2H),4.78-4.68(m,1H),4.60-4.40(m,2H),3.76-3.58(m,4H),3.58-3.48(m,1H),3.20-3.10(m,2H),3.08-2.97(m,2H),2.80-2.72(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.13(m,2H),2.13-2.04(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.91-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,4H),0.91-0.79(m,3H),0.53-0.34(m,4H)。
實施例3. ADC的製備
ADC藥物載量分析
實驗目的及原理
採用紫外分光光度法(UV-Vis)測定ADC載量。儀器：Thermo nanodrop2000紫外分光光度計。其原理是在某波長下ADC的總吸光值等於藥物與單株抗體在該波長下吸光值的加和。
實驗方法
將裝有琥珀酸鈉緩衝液的比色皿分別置於參比吸收池和樣品測定吸收池中後，扣除溶劑空白後，再將裝有供試品溶液的比色皿置於樣品測定吸收池中，測定280nm和370nm處吸光度。
結果計算：
(1)A280nm=εmab-280bCmab+εDrug-280bCDrug
εDrug-280：藥物在280nm平均莫耳消光係數5100；
CDrug：藥物的濃度；
εmab-280：單抗在280nm平均莫耳消光係數214600；
Cmab：單抗的濃度；
b：光程長度為1cm。
同理可以得到樣品在370nm下的總吸光值方程：
(2)A370nm=εmab-370bCmab+εDrug-370bCDrug
εDrug-370：藥物在370nm平均莫耳消光係數19000；
CDrug：藥物的濃度；
εmab-370：單抗在370nm消光係數為0；
Cmab：單抗的濃度；
b：光程長度為1cm。
由(1)和(2)兩種方程式結合單株抗體和藥物在兩個檢測波長下的消光係數和濃度資料可以計算出ADC中藥物的載量。
藥物載量=CDrug/Cmab。
不同DAR值的PSMA抗體-藥物偶聯物PM-9-A製備實施例
以下實施例為本揭露相關ADC的製備過程。其中實施例3-4、實施例3-5、實施例3-7、實施例3-11中抗體PM通過半胱胺酸上的巰基偶聯帶有連接單元的藥物9-A反應，製備抗體藥物偶聯PM-9-A(DAR=約3-4)；實施例3-1至實施例3-3和實施例3-6中抗體PM通過半胱胺酸上的巰基偶聯帶有連接單元的藥物9-A反應，製備PSMA ADC分子PM-9-A(DAR=約6-7)；實施例3-8至實施例3-10通過抗體 PM半胱胺酸上的巰基，與帶有連接單元的藥物VcMMAE(瀚香生物科技，CAS 646502-53-6)反應製備偶聯物分子PM-VcMMAE為對照。
通過對抗體和藥物比例，反應量規模，以及其它條件的調整，可以獲得不同DAR值(n)的抗體藥物偶聯物，較佳為DAR值為1-8，更佳為3-8，最佳為3-7。
(一)不同DAR值的抗體藥物偶聯PM-9-A的製備
Figure 110110881-A0202-12-0065-49
實施例3-1 ADC-1
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.27mL，18nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，9.8μL，98nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(0.3mg，277nmol)溶解於20μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶聯物的示例性產物ADC-1的PBS緩衝液(0.18mg/mL，11mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.31。
實施例3-2 ADC-2
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，3.6mL，243nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，128.9μL，1289nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(3.93mg，3649nmol)溶解於200μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶聯物的示例性產物ADC-2的PBS緩衝液(1.93mg/mL，15.4mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.63。
實施例3-3 ADC-3
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，10mL，676nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，358.1μL，3581nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(10.91mg，10135nmol)溶解於480μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶聯物的示例性產物ADC-3的PBS緩衝液(3.47mg/mL，25mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.9。
實施例3-4 ADC-4
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，0.21mL，14nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，3.5μL，35nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(0.15mg，139nmol)溶解於20μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶聯物的示例性產物ADC-4的PBS緩衝 液(0.28mg/mL，4.6mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.68。
實施例3-5 ADC-5
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，5.23mL，353nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，84.8μL，848nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(3.8mg，3534nmol)溶解於260μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶聯物的示例性產物ADC-5的PBS緩衝液(2.48mg/mL，18.2mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.89。
實施例3-6 ADC-6
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，3.5mL，236nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，125.3μL，1253nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(3.82mg，3547nmol)溶解於150μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將 反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶聯物的示例性產物ADC-6的PBS緩衝液(1.83mg/mL，14mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.61。
實施例3-7 ADC-7
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，14.68mL，992nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，238.1μL，2381nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(10.67mg，9919nmol)溶解於420μl二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶聯物的示例性產物ADC-7的PBS緩衝液(3.61mg/mL，37mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=3.93。
(二)對照抗體藥物偶聯PM-VeMMAE的製備(參考專利WO9007002222A2)
Figure 110110881-A0202-12-0070-50
實施例3-8 ADC-8
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.5mL，169nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，42.2μL，422nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物VcMMAE(2.22mg，1689nmol)溶解於100μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-VcMMAE所示偶聯物的示例性產物ADC-8的PBS緩衝液(1.76mg/mL，12mL)，於4℃儲存。
CE-SDS計算平均值：n=4.47。
實施例3-9 ADC-9
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，3.3mL，223nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，55.7μL，557nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物VcMMAE(2.93mg，2230nmol)溶解於200μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反 應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-VcMMAE所示偶聯物的示例性產物ADC-9的PBS緩衝液(2.05mg/mL，17mL)，於4℃儲存。
CE-SDS計算平均值：n=4.23。
實施例3-10 ADC-10
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.5mL，169nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，42.2μL，422nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物VcMMAE(2.22mg，1689nmol)溶解於150μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-VcMMAE所示偶聯物的示例性產物ADC-10的PBS緩衝液(2.2mg/mL，13mL)，於4℃儲存。
CE-SDS計算平均值：n=3.92。
實施例3-11 ADC-11
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.4mL，160nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，42.2μL，422nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(1.75mg，1629nmol)溶解於100μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-9-A所示偶聯物的示例性產物ADC-11的PBS緩衝液(1.34mg/mL，15.5mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=4.19。
實施例3-12 ADC-12
Figure 110110881-A0202-12-0072-51
在37℃條件下，向抗體PM的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.4mL，160nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，42.2μL，422nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物58(參照專利“CN104755494A中第163頁的實施例58製備，1.68mg，1624nmol)溶解於100μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到如式PM-58所示偶聯物的示例性產物ADC-12的PBS緩衝液(1.45mg/mL，14.8mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=4.16。
(三)對照抗體藥物偶聯Lmab-9-A的製備
Figure 110110881-A0202-12-0073-52
在37℃條件下，向抗體Lmab的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/mL，2.15mL，145nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，74.1μL，741nmol)，置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物9-A(3.20mg，2179nmol)溶解於155μL二甲亞碸中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(沖提相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到標題產物Lmab-9-A的PBS緩衝液(0.99mg/mL，15mL)，於4℃儲存。
UV-Vis計算平均值：n=7.07。
以下用生化測試方法驗證本揭露的抗體的活性
測試例1：體外細胞結合實驗
本實驗通過檢測細胞表面抗體的螢光信號，根據螢光信號強弱來 評價抗體的結合。製備好的ADC-2、ADC-10、對照ADC Lmab-9-A和抗體PM一起被用於進行體外結合檢測。
將梯度稀釋的ADC-2、ADC-10和抗體PM與1×105個細胞(ATCC，MDA PCa 2b/CRL-2422，LNCaP/CRL-1740，22Rv1/CRL-2505，PC-3/CRL-1435，DU 145/HTB-81)在4℃孵育60分鐘後洗掉多餘的ADC或抗體。將細胞與FITC標記的山羊抗人IgG(H+L)二抗(Jackson Immuno Research，109-095-003)在4℃孵育30分鐘，洗掉多餘抗體後，使用BD CantoII讀取細胞表面的螢光信號，(結果如表2，圖1A，圖1B，圖1C，圖1D，圖1E所示)。
表2 體外細胞結合活性(EC50，nM)
Figure 110110881-A0202-12-0074-53
檢測用細胞的抗原PSMA的表達水準：MDA PCa 2b>LNCaP>22Rv1，PC-3和DU 145不表達PSMA。
結果表明：ADC-2、ADC-10、對照ADCLmab-9-A和抗體PM與不同PSMA抗原表達水準的細胞具有相應強或弱的結合能力。EC50越小代表結合能力越強。
測試例2：體外細胞內吞實驗
DT3C，70kd，是重組表達的融合蛋白，由白喉毒素的Fragment A(僅毒素部分)和G群鏈球菌的3C片段(IgG結合部分)融合而成，該蛋白能夠與抗體的IgG部分高度親和，在抗體發生內吞時一同進入細胞，在胞內弗林蛋白酶的作用下，釋放出具有毒性的DT，DT能夠抑制EF2-ADP核糖基化的活性，阻斷蛋白翻譯過程，最終導致細胞死亡。而未進入細胞的DT3C則不具有殺傷細胞的活性。根據細胞殺傷情況來評價抗體的內吞活性。
將無菌過濾的DT3C(70KD,SB HRS3A,MEI3AU0803)和抗體PM抗體(DT3C莫耳濃度為抗體莫耳濃度的6倍)按照1：1的體積混勻，於室溫下靜置孵育30分鐘後用無血清培養基梯度稀釋，加入提前一天準備的用含20% low IgG FBS的培養基培養的細胞(ATCC，LNCaP/CRL-1740，22Rv1/CRL-2505)中(2000個細胞/孔)，5%二氧化碳培養箱中37℃孵育三天。加入CellTiter-Glo(Promega，G7573)，室溫下避光孵育10分鐘，Victor3上讀取化學發光(結果如表3，圖2A，圖2B所示)。
表3 抗體在不同細胞的內吞活性(IC50，nM)
Figure 110110881-A0202-12-0075-54
結果表明：抗體PM在陽性表達PSMA抗原的細胞上具備內吞能力。
測試例3：細胞增殖抑制實驗
本實驗通過檢測細胞內ATP含量，根據IC50大小評價PSMA ADC對 細胞(ATCC，LNCaP/CRL-1740，22Rv1/CRL-2505，PC-3/CRL-1435)增殖的抑制效果。
待檢測樣品：ADC-2，ADC-4，對照ADC Lmab-9-A
1、對LNCaP細胞增殖的抑制效果
LNCaP細胞培養在含10%FBS的RPMI-1640培養基中，一週繼代2~3次，繼代比列1：3或1：6。繼代時，吸掉培養基，用5mL 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入180μL的細胞懸浮液，2×103細胞/孔，培養基為4.5%FBS的RPMI-1640，96孔板週邊只加入培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO2)。
將待測ADC(ADC-2，ADC-4，Lmab-9-A)配成起始濃度，用PBS 1：6梯度稀釋9個點，另加0濃度點。取20μL加入到上述細胞板中，在培養箱中孵育5天(37℃，5% CO2)。對於化合物2-B(即9-A的游離毒素)，先用DSMO稀釋成母液並用PBS配成200μM為起始，再用PBS 1：6梯度稀釋9個點，另加0濃度點，取1μL加入20μL RPMI-1640中並轉至96孔細胞培養板中，在培養箱中孵育5天(37℃，5% CO2)。在96孔細胞培養板中，每孔加入80μL CellTiter-Glo試劑，室溫避光放置10-15分鐘，在Victor3中讀取化學發光信號值，資料使用GraphPad軟體處理。(結果如表4，圖3A，圖3B所示)。
2、對22Rv1細胞增殖的抑制效果
22Rv1細胞培養在含10%FBS的RPMI-1640培養基中，一週繼代2次，繼代比列1：3或1：6。繼代時，吸掉培養基，用5mL 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後 吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入180μL的細胞懸浮液，4×103細胞/孔，培養基為4.5%FBS的RPMI-1640，96孔板週邊只加入培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO2)。待測ADC及化合物2-B配製及實驗方法同上。(結果如表4，圖3C，圖3D所示)。
3、對PC-3細胞增殖的抑制效果
PC-3細胞培養在含10%FBS的F-12K培養基中，一週繼代2-3次，繼代比列1：3或1：6。繼代時，吸掉培養基，用5mL 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重新懸浮細胞。在96孔細胞培養板中加入180μL的細胞懸浮液，4×103細胞/孔，培養基為4.5%FBS的F-12K，96孔板週邊只加入培養基。將培養板在培養箱培養24小時(37℃，5% CO2)。待測ADC及化合物2-B配製及實驗方法同上。(結果如表4，圖3E，圖3F所示)。
表4 對細胞殺傷作用(IC50，nM)
Figure 110110881-A0202-12-0077-55
結論：PSMA ADC在LNCaP和22RV1細胞上具有殺傷作用。化合物2-B(即9-A的游離毒素)具有透膜殺傷作用。
測試例4：ADC藥物對人前列腺癌細胞22Rv1裸小鼠移植瘤的療效評價
一、測試方法
實驗用nu/nu裸小鼠，雄性，6-8週，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證編號1908120082)。飼養環境：SPF級。裸小鼠皮下接種人前列腺癌細胞22Rv1(中科院)，當腫瘤平均體積達到220mm3時，將動物隨機分組(D0)，每組6只，開始腹腔注射給藥2次/週，共給藥5次，每週2次檢測瘤體積和體重，記錄資料。
腫瘤體積V=1/2×a×b2，其中a、b分別表示長、寬。
相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。
二、測試對象
ADC-10：3mpk,10mpk；
ADC-2：3mpk,10mpk；
空白對照組：pH7.4的PBS緩衝液。
三、抗體ADC的抑瘤效果
觀察至給藥開始後第17天(D17)時，陽性ADC-10的10mpk和3mpk的抑瘤率分別為48.9%和10.0%，ADC-2的10mpk和3mpk的抑瘤率分別為>100%和91.5%，顯著優於空白對照組和陽性ADC組，且呈現良好的劑量依賴關係(表5， 圖4A)。
給藥過程中小鼠體重平穩，提示ADC-2各給藥劑量沒有明顯的毒副作用(圖4B)。
表5 給藥ADC對荷瘤裸鼠22Rv1移植瘤的療效
Figure 110110881-A0202-12-0079-56
測試例5：ADC藥物對人前列腺癌細胞22Rv1裸小鼠移植瘤的療效評價
一、測試方法
實驗用nu/nu裸小鼠，雄性，6-8週，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證編號1908120082)。飼養環境：SPF級。裸小鼠皮下接種人前列腺癌細胞22Rv1(中科院)，當腫瘤平均體積達到210mm3時，將動物隨機分組(D0)，每組8只，開始腹腔注射給藥2次/週，共給藥6次，每週2次檢測瘤體積和體重，記錄資料。
腫瘤體積V=1/2×a×b2，其中a、b分別表示長、寬。
相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。
二、測試對象
ADC-8：10mpk；
ADC-6：3mpk,6mpk；
ADC-7：3mpk,6mpk,10mpk；
空白對照組：pH7.4的PBS緩衝液。
三、抗體ADC的抑瘤效果
觀察至給藥開始後第14天(D14)時，陽性ADC-8的10mpk抑瘤率為81.6%，受試ADC-6的6mpk和3mpk的抑瘤率分別為>100%和97.8%，另一個受試ADC-7的10mpk、6mpk和3mpk的抑瘤率分別為>100%、88.4%和80.5%，所有給藥組均顯著優於對照組，受試ADC-6在同等劑量下顯著優於受試ADC-7，2個受試ADC均呈現良好的劑量依賴關係(表6，圖5A)。
給藥過程中小鼠體重平穩，提示各受試抗體各給藥劑量沒有明顯的毒副作用(圖5B)。
表6 給藥ADC對荷瘤裸鼠22Rv1移植瘤的療效
Figure 110110881-A0202-12-0081-57
測試例6：ADC藥物對人前列腺癌細胞LNCap在SCID Beighe小鼠上的移植瘤的療效評價
一、測試方法
實驗用SCID Beige小鼠，雄性，6-8週，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證編號1908120082)。飼養環境：SPF級。小鼠皮下接種人前列腺癌細胞LNCap(ATCC)，當腫瘤平均體積達到160mm3時，將動物隨機分組(D0)，每組7只，於D0和D4腹腔注射給藥2次，每週2次檢測瘤體積和體重，記錄資料。
腫瘤體積V=1/2×a×b2，其中a、b分別表示長、寬。
相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。
二、測試對象
ADC-9：10mpk；
ADC-3：3mpk,10mpk；
ADC-5：3mpk,6mpk,10mpk；
空白對照組：pH7.4的PBS緩衝液。
三、抗體ADC的抑瘤效果
所有給藥組腫瘤在D0和D4兩次給藥後即開始消退，且其藥效一直維持到實驗終點D18。受試ADC-3和ADC-5均呈現出一定的劑量依賴關係，但它們之間並沒有顯著性差異(表7，圖6A)。
給藥過程中小鼠體重平穩，提示各受試抗體各給藥劑量沒有明顯的毒副作用(圖6B)。
表7 給藥ADC對荷瘤SCID Beige鼠LNCap移植瘤的療效
Figure 110110881-A0202-12-0083-58
測試例7：PMSA ADC SD大鼠T1/2評價
SD雄性大鼠9只，分為三組，每組3只，12/12小時光/暗調節，溫度20-26℃恆溫，濕度40-70%，自由進食飲水。購自浙江維通利華實驗動物有限公司。實驗當天對SD雄性大鼠分別尾靜脈注射受試藥物ADC-2，ADC-5，ADC-10，給藥劑量為3mg/kg，注射體積5mL/kg。
取血時間點為：第1天給藥後5分鐘、8小時、24小時(第2天)、第3天、第5天、第8天、第11天、第15天、第22天和第29天，於大鼠眼底靜脈取血，每次300μL(相當於取血清150μL)；收集的血樣在室溫下置放半小時至凝集，然後4℃下1000×g離心15分鐘，將上清(血清)轉移至EP管中，立即放置-80℃貯存。採用ELISA法檢測SD大鼠血清中PSMA抗體ADC的濃度。
測試方法：
總抗體(Total antibody)的檢測：
1.在ELISA板(cornning)中每孔加入100μL，1μg/mL羊抗人lgG FC(abcam)，4℃隔夜孵育。
2.用洗板液PBST沖洗三遍(1×PBS,0.5% tween-20(生工)。
3.每孔加入200μL封閉液(5%牛奶，碧雲天)，37℃孵育1-3小時。
4.用洗板液PBST沖洗三遍。
5.加入100μL的標準樣品，質控樣品和檢測樣品，37℃孵育1-3小時。
6.用洗板液沖洗三遍。
7.加入100μL鼠預吸附過的羊抗人lgG輕/重鏈HRP(1：5000，abcam)，37℃孵育1-1.5小時。
8.用洗板液沖洗三遍。
9.加入100μL TMB(KPL)，常溫避光孵育10分鐘。
10.加入100μL 1M稀硫酸(國藥集團)終止，在450nm波長下讀板(molecular device,flexstation 3)。
完整ADC(Intact ADC)的檢測：
1.在ELISA板中每孔加入100μL，1μg/mL羊抗鼠IgG Fc，4℃隔夜孵育。
2.用洗板液PBST沖洗三遍。
3.每孔加入200μL封閉液，37℃孵育1-3小時。
4.用洗板液沖洗三遍。
5.每孔加入100μL 0.2μg/mL抗毒素抗體或anti-pab-mmae(中科英沐， s-497-8)，37℃孵育1-1.5小時。
6.用洗板液沖洗三遍。
7.加入100μL的標準樣品，質控樣品和檢測樣品，37℃孵育1-3小時。
8.用洗板液沖洗三遍。
9.加入100μL鼠預吸附過的羊抗人lgG輕/重鏈HRP(1：5000)，37℃孵育1-1.5小時。
10.用洗板液沖洗三遍。
11.加入100μL TMB，常溫避光孵育10分鐘。
12.加入100μL 1M稀硫酸終止，在450nm波長下讀板。
檢測及分析結果：
用ELISA檢測血清中的PSMA抗體ADC的濃度，進行PK分析，(結果見表8)。
表8 PSMA抗體偶聯物在SD大鼠中的T1/2
Figure 110110881-A0202-12-0085-59
結果表明，大鼠靜脈給予3mg/kg受試抗體偶聯物ADC-10，ADC-2，ADC-5後，總抗體(ADC中偶聯的抗體和血清中游離的抗體)在大鼠體內的半衰期約為219.8小時(9.2天)，171.2小時(7.1天)，172.5小時(7.2天)；完整ADC在大鼠體內的半衰期約為76.7小時(3.2天)，153.9小時(6.4天)，137.9小時(5.7天)。ADC-2和ADC-5的T1/2優於ADC-10。
測試例8：PSMA ADC的穩定性研究(游離毒素檢測)
1.大鼠藥代樣品中ADC-2穩定性
運用液質聯用技術，監測樣品經靜脈給藥，在雄性大鼠體內，28天中化合物2-B(9-A的游離毒素)隨時間的釋放量，用以反映樣品在定濃度條件下的穩定性。通過對28天中，不同時間點(5分鐘、8小時、1天、2天、4天、7天、10天、14天、21天、28天)的大鼠血漿中化合物2-B的含量測定，ADC-2表現了良好的穩定性，結果如表9所示。
結果顯示，ADC-2在雄性大鼠體內28天之內均顯示出良好的穩定性。
表9 PSMA ADC的穩定性研究
Figure 110110881-A0202-12-0087-60
Blq表示：1ng/mL；M表示大鼠性別為雄性。
2. PSMA ADC血漿穩定性研究
運用液質聯用技術，監測樣品ADC-2(100μg/mL)分別在(人、猴、狗、大鼠、小鼠五個種屬的血漿(肝素抗凝)以及1%BSA-PBS作為對照)中，分別在(37℃ &5%CO2孵育箱中，放置0天、7天、14天、21天)不同時間內化合物2-B隨時間的釋放量，用以反映樣品在特定濃度(100μg/mL)條件下的穩定性。通過對不同時間點中化合物2-B的含量測定，ADC-2表現了良好的穩定性，結果如 圖7和表10所示。
結果顯示，ADC-2在不同種屬血漿中，在一定溫度、一定時間內顯示出良好的穩定性。
註：試驗操作是在無菌實驗室中進行的，空白血漿用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌。
表10 化合物2-B的含量(ng/mL)
Figure 110110881-A0202-12-0088-61
化合物2-B線性範圍1~5000ng/mL；BLQ表示：1ng/mL。“-1”和“-2”表示重複實驗的第一次和第二次。
3. PSMA ADC血漿穩定性研究
運用液質聯用技術，監測樣品ADC-5分別在(人、猴、狗、大鼠、小鼠五個種屬的血漿(肝素抗凝)以及1%BSA-PBS作為對照)中，分別在(37℃ &5%CO2孵育箱中，放置0天、7天、14天、23天)不同時間內化合物2-B隨 時間的掉落的量，用以反映樣品在特定濃度(100μg/mL)條件下的穩定性。通過對不同時間點中化合物2-B的含量測定，ADC-5表現了良好的穩定性，結果如表11、圖8所示。
結果顯示，ADC-5在不同種屬血漿，一定溫度，一定時間內顯示出良好的穩定性。
註：試驗操作是在無菌實驗室中進行的，空白血漿用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌。
表11 化合物2-B的含量(ng/mL)-ADC-5(100μg/mL)在不同血漿中37℃孵育23天
Figure 110110881-A0202-12-0089-62
23d僅為單孔，化合物2-B線性範圍2~5000ng/mL；BLQ表示：1ng/mL。
測試例9：ADC藥物對人前列腺癌細胞22Rv1裸小鼠移植瘤的療效 評價
一、測試方法
實驗用雄性nu/nu裸小鼠，6-8週齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(合格證編號1908120082)。飼養環境：SPF級。裸小鼠皮下接種人前列腺癌細胞22Rv1(中科院)，當腫瘤平均體積達到190mm3時，將動物隨機分組(D0)，每組8只，開始腹腔注射給藥，2次/週，共給藥4次，每週2次檢測瘤體積和體重，記錄資料。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b2其中a、b分別表示長、寬。
相對腫瘤增殖率T/C(%)=(T-T0)/(C-C0)×100，其中T、C為實驗結束時治療組和對照組的腫瘤體積；T0、C0為實驗開始時的腫瘤體積。
抑瘤率TGI(%)=1-T/C(%)。
二、測試對象
ADC-11：5mpk
ADC-12：5mpk
空白對照組：pH7.4的PBS緩衝液
三、抗體ADC的抑瘤效果
觀察至給藥開始後第13天(D13)時，ADC-11和ADC-12在5mpk劑量下的抑瘤率分別為87.63%和79.82%，均顯著優於對照組。ADC-11和ADC-12之間沒有顯著性差異(表12，圖9)。
給藥過程中小鼠體重平穩，提示各受試抗體沒有明顯的毒副作用。
表12 給藥ADC對荷瘤裸鼠22Rv1移植瘤的療效
Figure 110110881-A0202-12-0091-63
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.) 上海恆瑞醫藥有限公司(SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)
<120> 抗PSMA抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途
<130> 721024CPCT
<150> CN202010218297.4
<151> 2020-03-25
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> AB-PG1-XG1-006重鏈可變區
<400> 1
Figure 110110881-A0202-12-0092-64
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> AB-PG1-XG1-006輕鏈可變區
<400> 2
Figure 110110881-A0202-12-0092-65
Figure 110110881-A0202-12-0093-66
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> AB-PG1-XG1-006 HCDR1
<400> 3
Figure 110110881-A0202-12-0093-69
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> AB-PG1-XG1-006 HCDR2
<400> 4
Figure 110110881-A0202-12-0093-67
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> AB-PG1-XG1-006 HCDR3
<400> 5
Figure 110110881-A0202-12-0093-68
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> AB-PG1-XG1-006 LCDR1
<400> 6
Figure 110110881-A0202-12-0094-70
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> AB-PG1-XG1-006 LCDR2
<400> 7
Figure 110110881-A0202-12-0094-71
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> AB-PG1-XG1-006 LCDR3
<400> 8
Figure 110110881-A0202-12-0094-72
<210> 9
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> PM-HC
<400> 9
Figure 110110881-A0202-12-0094-73
Figure 110110881-A0202-12-0095-74
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> PM-LC
<400> 10
Figure 110110881-A0202-12-0096-75
<210> 11
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 抗體重鏈序列Lmab-HC
<400> 11
Figure 110110881-A0202-12-0096-76
Figure 110110881-A0202-12-0097-77
<210> 12
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 抗體輕鏈序列Lmab-LC
<400> 12
Figure 110110881-A0202-12-0098-78
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> 四肽接頭
<400> 13
Figure 110110881-A0202-12-0098-79
Figure 110110881-A0202-11-0002-3

Claims (20)

  1. 一種通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：
    Figure 110110881-A0202-13-0001-80
    其中，
    Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-和-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；
    Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基和雜環基；
    或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
    R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；
    R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；
    或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
    或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
    m為0至4的整數；
    n為1至10，n是小數或整數；
    L為接頭單元；
    Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段。
  2. 如請求項1所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，
    該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDRI、LCDR2和LCDR3。
  3. 如請求項1或2中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體是鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：1所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：2所示的輕鏈可變區。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中該抗PSMA抗體包含抗體重鏈恆定區和輕鏈恆定區；該重鏈恆定區較佳為選自人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恆定區及其常規變體，該輕鏈恆定區較佳為選自人抗體κ和λ鏈的恆定區及其常規變體；該抗PSMA抗體更佳為包含如SEQ ID NO：9所示的重鏈和如SEQ ID NO：10所示的輕鏈。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中n為1至8，較佳為3至8，n是小數或整數。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，
    其中，
    Y為-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；
    Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素和C1-6烷基；
    R1為鹵烷基或C3-6環烷基；
    R2選自氫原子、鹵烷基和C3-6環烷基；
    或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；
    m為0或1。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中Y選自：
    Figure 110110881-A0202-13-0003-81
    其中Y的O端與接頭單元L相連。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中接頭單元-L-為-L1-L2-L3-L4-，
    L1選自-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-W-C(O)-、-CH2-C(O)-NR3-W-C(O)-和-C(O)-W-C(O)-，其中W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基和1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中該的C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；
    L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-和化學鍵，其中p1為1至20的整數；
    L3為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸殘基選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸和天門冬胺酸中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；
    L4選自-NR5(CR6R7)t-、-C(O)NR5、-C(O)NR5(CH2)t-和化學鍵，其中t為1至6的整數；
    R3、R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；
    R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。
  10. 如請求項1至9中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中接頭單元-L-為-L1-L2-L3-L4-，
    L1為
    Figure 110110881-A0202-13-0004-82
    ，s1為2至8的整數；
    L2為化學鍵；
    L3為四肽殘基；L3為GGFG的四肽殘基較佳；
    L4為-NR5(CR6R7)t-，R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2；
    其中該L1端與Pc相連，L4端與Y相連。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中-L-為：
    Figure 110110881-A0202-13-0005-83
  12. 如請求項1至11中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其中-L-Y-任選自：
    Figure 110110881-A0202-13-0005-84
  13. 如請求項1至10中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-La-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：
    Figure 110110881-A0202-13-0005-85
    其中，
    Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段；
    m為0至4的整數；
    n為1至10，n是小數或整數；
    R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；
    R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基和雜芳基；
    或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；
    W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基和1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O和S的雜原子，其中該C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；
    L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-和化學鍵，其中p1為1至20的整數；
    L3為由2至7個胺基酸殘基構成的肽殘基，其中該胺基酸殘基選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸和天門冬胺酸中的胺基酸形成的胺基酸殘基，並任選進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基中的一個或多個取代基所取代；
    R5選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；
    R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基。
  14. 如請求項1至10、13中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，其為通式(Pc-Lb-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽：
    Figure 110110881-A0202-13-0007-86
    其中，
    s1為2至8的整數；
    Pc、R1、R2、R5、R6和R7、m和n如請求項13中所定義。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物選自：
    Figure 110110881-A0202-13-0007-87
    Figure 110110881-A0202-13-0008-88
    其中，
    Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段；
    n為1至10，n是小數或整數。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的通式(Pc-L-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，該抗體-藥物偶聯物為：
    Figure 110110881-A0202-13-0008-89
    其中，
    n為1至8，較佳為3至8，n是小數或整數；
    PM為抗PSMA抗體，其包含如SEQ ID NO：9所示的重鏈和如SEQ ID NO：10所示的輕鏈。
  17. 一種製備如通式(Pc-La-Y-D)所示的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽的方法，其包括以下步驟：
    Figure 110110881-A0202-13-0009-90
    Pc’與通式(La-Y-D)所示的化合物進行偶聯反應，得到通式(Pc-La-Y-D)所示的化合物；
    其中，
    Pc為抗PSMA抗體或其抗原結合片段；Pc較佳為請求項2至5中任一項所述的抗PSMA抗體或其抗原結合片段；Pc’為Pc經還原後所得；n、m、W、L2、L3、R1、R2、R5、R6和R7如請求項13中所定義。
  18. 一種藥物組成物，其包含如請求項1至16中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
  19. 如請求項1至16中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或請求項18所述的藥物組成物在製備用於治療PSMA介導的疾病或病症的藥物中的用途。
  20. 如請求項1至16中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽、或如請求項18所述的藥物組成物在製備用於治療和/或預防腫瘤和癌症的藥物中的用途，其中該腫瘤和癌症較佳為頭和頸鱗狀細胞癌、頭和頸癌、腦癌、神經膠質瘤、多形性成膠質細胞瘤、神經母細胞瘤、中樞神經系統癌、神經內分泌腫瘤、咽喉癌、鼻咽癌、食管癌、甲狀腺癌、惡性胸膜間皮瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、肝細胞瘤、肝膽癌、胰腺癌、胃癌、胃腸道癌、腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎癌、透明細胞腎細胞癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、皮膚癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、骨癌、軟骨肉瘤、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合症、庫肯勃氏瘤、骨髓增生性腫瘤、鱗狀細胞癌、尤因氏肉瘤、尿路上皮癌和梅克爾細胞癌；該淋巴瘤更佳為選自：何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、彌漫性大B-細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、原發性縱隔大B-細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、富含T-細胞/組織細胞的大B-細胞淋巴瘤和淋巴漿細胞性淋巴瘤；該肺癌選自：非小細胞肺癌和小細胞肺癌；該白血病選自：慢性髓細胞樣白血病、急性髓細胞樣白血病、淋巴細胞白血病、成淋巴細胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病和髓樣細胞白血病。
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