TW202112801A

TW202112801A - 純化遮蔽抗體之方法

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Publication number: TW202112801A
Application number: TW109118787A
Authority: TW
Inventors: 伊莉絲坎寧安; 素珊李; 丹妮爾萊斯克; 凱薩琳埃金; 凱文賓; 蘿莉維思登朵芙; 邁可菲爾德豪斯; 薩繆爾皮爾斯阿爾科巴
Original assignee: 美商西雅圖遺傳學公司
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2021-04-01
Also published as: US20220306727A1; WO2020247574A1; AR119097A1

Abstract

本發明係關於抗體調配物之領域。特定言之，本發明係關於製備減少聚集之遮蔽抗體之特定方法。在一些實施例中，該等遮蔽抗體包含抗CD47抗體。

Description

純化遮蔽抗體之方法

本發明係關於純化遮蔽抗體之領域。特別地，本發明係關於製備減少聚集之遮蔽抗體之特定方法。在一些實施例中，該等遮蔽抗體包含抗CD47抗體。

當前基於抗體之治療劑對於預期目標之選擇性可能不夠最佳。儘管單株抗體通常特異性結合於其預期目標，大部分目標分子並不特定針對疾病部位且可存在於除疾病部位以外之細胞或組織中。

已描述用於藉由工程改造抗體以具有連接至抑制抗體結合之抑制性或遮蔽域的可裂解連接子克服此等脫靶效果的若干方法(參見例如WO2003/068934、WO2004/009638、WO 2009/025846、WO2101/ 081173及WO2014103973)。連接子可經設計以藉由對特定組織或病理具有特異性之酶來裂解，因此允許抗體在所需部位中優先活化。遮蔽部分可藉由直接結合於抗體之結合位點而起作用或可經由位阻間接地起作用。已提出各種掩蔽部分、連接子、蛋白酶位點及組裝型式。遮蔽程度可隨著掩蔽部分與抗體之表現、純化、結合或藥物動力學之相容性而在不同型式之間變化。

本發明係關於製備具有減少聚集之遮蔽抗體之方法。在一些實施例中，遮蔽抗體包含：第一纏繞線圈域，其連接至抗體之重鏈可變區；及第二纏繞線圈域，其連接至抗體之輕鏈可變區。此等潛在地疏水性纏繞線圈多肽序列之存在可在純化、處理及儲存期間引起聚集。在一些實施例中，本發明製備方法可幫助減少遮蔽抗體之聚集，因此增加用於各種應用中之正確摺疊、未聚集遮蔽抗體之產量。

本發明闡述製備包含遮蔽抗體之組合物之方法，該等遮蔽抗體包含可移除遮蔽劑(例如，纏繞線圈遮蔽劑)，該可移除遮蔽劑防止抗體結合於其預期目標直至遮蔽劑裂解或以其他方式移除。換言之，遮蔽劑遮蔽抗體之抗原結合部分以使得其無法與其目標相互作用。在某些治療性用途中，在向患者投與遮蔽抗體後，可藉由活體內環境中存在的一或多個分子(例如，蛋白酶)移除(例如，裂解)遮蔽劑。舉例而言，在其他非治療性用途中，可藉由將一或多種蛋白酶添加至正使用抗體之培養基中來移除遮蔽劑。遮蔽劑之移除復原抗體結合於其目標之能力，因此使得能夠特定靶向抗體。在本文中之一些實施例中，抗體為CD47抗體。

舉例而言，纏繞線圈遮蔽劑之存在可能增加抗體在純化製程期間及稍後在使用之前的儲存期間聚集之機率。因此，本發明闡述製備可在製程期間減少遮蔽抗體之聚集之遮蔽抗體，因此潛在地增加產量的方法。舉例而言，在一些實施例中，特定方法步驟經設計以在彼等步驟間減少聚集以便在各製程步驟期間維持相對較高產量。

在一些實施例中，提供一種純化遮蔽抗體之方法，其中該方法包含： a) 在適合使該遮蔽抗體結合於蛋白質A層析管柱之條件下將包含該遮蔽抗體之起始組合物裝載至該蛋白質A層析管柱上； b) 用pH 4.5-5.5之酸性洗滌緩衝液洗滌包含該結合遮蔽抗體之蛋白質A層析管柱至少一次；以及 c) 在pH 2.5-4之酸性溶離緩衝液中自該蛋白質A管柱溶離該遮蔽抗體以形成包含該遮蔽抗體之蛋白質A溶離液； d) 其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含第一纏繞線圈域，其中該第一遮蔽域連接至抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區；及第二遮蔽域，其包含第二纏繞線圈域，其中該第二遮蔽域連接至該抗體之該重鏈可變區或該輕鏈可變區中之另一者，其中該第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且該第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。

在一些實施例中，該第一遮蔽域連接至該抗體之該重鏈可變區且該第二遮蔽域連接至該抗體之該輕鏈可變區。在一些實施例中，該起始組合物為細胞溶解物。

在一些實施例中，該蛋白質A層析係在室溫進行。在一些實施例中，該酸性洗滌緩衝液為乙酸鹽緩衝液。在一些實施例中，該酸性洗滌緩衝液為麩胺酸鹽緩衝液。在一些實施例中，該酸性洗滌緩衝液包含10-100 mM、10-90 mM、10-80 mM、10-70 mM、10-60 mM、10-50 mM、10-40 mM、15-30 mM、20-30 mM或25 mM乙酸鹽，或其中該酸性洗滌緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、20-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。在一些實施例中，步驟(b)之該至少一種酸性洗滌緩衝液係呈pH 4.7-5.4、pH 4.8、pH 4.9、pH 5、pH 5.1或pH 5.2。

在一些實施例中，該酸性溶離緩衝液包含0.05-0.2 M、0.07-0.15 M、0.07-0.13 M、0.08-0.12 M、0.09 M、0.1 M或0.11 M乙酸，或其中該酸性溶離緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、20-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸。在一些實施例中，步驟(c)之該酸性溶離緩衝液係呈pH 2.5-5、pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4、pH 2.5-3.8、pH 2.7-3.8、或pH 2.5-3.5、pH 2.6、pH 2.7、pH 2.8、pH 2.9、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5。

在一些實施例中，該方法包含在(a)與(b)之間用pH 6-8之中性洗滌緩衝液洗滌該管柱至少一次，視情況其中該中性洗滌緩衝液為視情況呈pH 7.5之Tris緩衝液，及/或其中該方法包含在(a)與(b)之間用pH 8.5-9.5之鹼性洗滌緩衝液洗滌該管柱至少一次，視情況其中該鹼性洗滌緩衝液為視情況呈pH 9之精胺酸緩衝液。

在一些實施例中，該方法進一步包含將該蛋白質A溶離液之pH調整至pH 3-4.2、pH 3-4、pH 3.5-4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4，以形成酸化溶離液。在一些實施例中，該pH係使用乙酸(視情況1 M乙酸)或使用磷酸(視情況0.5 M磷酸)調整。

在一些實施例中，該方法包含在調整該pH後將該酸化溶離液培育4-30小時、6-30小時、10-30小時、4-20小時、6-20小時、8-20小時、10-20小時、4-18小時、6-18小時、8-18小時、10-18小時、8-16小時、10-16小時、8-14小時、10-14小時、11-13小時、10小時、11小時、12小時、13小時或14小時。

在一些實施例中，提供一種純化遮蔽抗體之方法，其中該方法包含： a) 使包含該遮蔽抗體之起始組合物經歷一或多個層析純化步驟，以形成層析溶離液； b) 將該層析溶離液之pH調整至pH 3-4.2、pH 3-4、pH 3.5-4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4，以形成酸化溶離液；以及 c) 將該酸化溶離液培育4-30小時、6-30小時、10-30小時、4-20小時、6-20小時、8-20小時、10-20小時、4-18小時、6-18小時、8-18小時、10-18小時、8-16小時、10-16小時、8-14小時、10-14小時、11-13小時、10小時、11小時、12小時、13小時或14小時； d) 其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含第一纏繞線圈域，其中該第一遮蔽域連接至抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區；及第二遮蔽域，其包含第二纏繞線圈域，其中該第二遮蔽域連接至該抗體之該重鏈可變區或該輕鏈可變區中之另一者，其中該第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且該第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。

在一些實施例中，該酸化溶離液係在室溫培育。在一些實施例中，該方法進一步包含在培育後將該酸化溶離液之pH調整至pH 3.5-4.5、pH 3.5-4.3、pH 3.7-4.2、pH 3.6-4、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1或pH 4.2。在一些實施例中，該pH係使用tris鹼，視情況1 M tris鹼調整。

在一些實施例中，該方法包含在深層過濾器(depth filter)上過濾該酸化溶離液。在一些實施例中，該方法包含在培育或深層過濾後將該酸化溶離液冷卻至1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃之溫度。

在一些實施例中，該方法包含將該冷卻酸化溶離液之pH調整至pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9，以形成冷卻中性溶離液。在一些實施例中，該pH係使用tris鹼，視情況1 M tris鹼調整。

在一些實施例中，該方法進一步包含將該冷卻中性溶離液裝載至疏水性相互作用層析(HIC)管柱或膜上。在一些實施例中，該方法包含用已經冷卻至1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃之溫度的HIC洗滌緩衝液洗滌該HIC管柱或膜。

在一些實施例中，提供純化遮蔽抗體之方法，其中該方法包含： a) 冷卻包含該遮蔽抗體之起始組合物，其中在冷卻之前或之後將該起始組合物之pH調整至pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9，以形成冷卻之起始組合物； b) 將該冷卻之起始組合物裝載至疏水性相互作用層析(HIC)管柱或膜上；以及 c) 用已經冷卻至1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃之溫度的HIC洗滌緩衝液洗滌該HIC管柱或膜； d) 其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含第一纏繞線圈域，其中該第一遮蔽域連接至抗體之重鏈可變區或輕鏈可變區；及第二遮蔽域，其包含第二纏繞線圈域，其中該第二遮蔽域連接至該抗體之該重鏈可變區或該輕鏈可變區中之另一者，其中該第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且該第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。

在一些實施例中，該HIC洗滌緩衝液為tris/檸檬酸鈉緩衝液。在一些實施例中，該HIC洗滌緩衝液係呈pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9。在一些實施例中，該HIC洗滌緩衝液包含檸檬酸鈉。在一些實施例中，該HIC洗滌緩衝液中檸檬酸鈉之濃度為200-700 mM、或200-600 mM、或200-500 mM、或250-500 mM、或300-500 mM、或300-400 mM。

在一些實施例中，該方法包含收集HIC流出物，該HIC流出物包含該遮蔽抗體。在一些實施例中，該方法進一步包含在HIC之後進行第一次透濾以將檸檬酸鈉之濃度降低至低於40 mM、或低於35 mM、或低於30 mM、或低於25 mM、或低於20 mM、或低於15 mM、或低於10 mM、或低於5 mM，以形成經透濾之HIC流出物。在一些實施例中，該第一次透濾係在1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃進行。

在一些實施例中，該方法進一步包含在乙酸鹽緩衝液中進行第二次透濾，其中該第二次透濾係在室溫，視情況在15-28℃或18-25℃進行。在一些實施例中，該乙酸鹽緩衝液包含20-100 mM、20-90 mM、20-80 mM、20-70 mM、30-50 mM、35 mM、40 mM或45 mM。在一些實施例中，在該第二次透濾之前，將該經透濾之HIC流出物之pH調整至pH 3.5-4.5、pH 3.7-4.5、pH 3.7-4.3、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1或pH 4.2。在一些實施例中，pH係使用25% v/v冰醋酸調整，以形成酸化透濾HIC流出物。在一些實施例中，使該酸化透濾HIC流出物經過超過濾，形成濃縮之遮蔽抗體組合物。在一些實施例中，該濃縮之遮蔽抗體組合物中該遮蔽抗體之濃度為15-35 mg/mL、或20-35 mg/mL、或25-35 mg/mL。

在一些實施例中，該方法進一步包含進行病毒移除。在一些實施例中，病毒移除係藉由奈米過濾進行。在一些實施例中，該奈米過濾係在酸性pH下進行。在一些實施例中，該酸性pH為pH 3-4.4、pH 3.5-4.4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4。在一些實施例中，該病毒移除係在室溫進行。在一些實施例中，該病毒移除在超過濾之後。

在一些實施例中，該方法視情況包含將該酸化溶離液之pH調整至pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5在一些實施例中，該pH係使用tris鹼，視情況1 M tris鹼調整。

在一些實施例中，該方法進一步包含將該視情況調整過pH之酸化溶離液裝載至疏水性相互作用層析(HIC)管柱或膜上。在一些實施例中，HIC係在室溫進行。

在一些實施例中，提供一種純化遮蔽抗體之方法，其中該方法包含： a) 獲得包含該遮蔽抗體之起始組合物，其中將該起始組合物之pH調整至pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5； b) 將該起始組合物裝載至疏水性相互作用層析(HIC)管柱或膜上；以及 c) 用pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5之HIC洗滌緩衝液洗滌該HIC管柱或膜；其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含第一纏繞線圈域，其中該第一遮蔽域連接至抗體之重鏈可變區；及第二遮蔽域，其包含第二纏繞線圈域，其中該第二遮蔽域連接至該抗體之輕鏈可變區，其中該第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且該第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。

在一些實施例中，該起始組合物為細胞溶解物。在一些實施例中，該HIC洗滌緩衝液為麩胺酸鹽緩衝液。在一些實施例中，該HIC洗滌緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、20-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。在一些實施例中，該HIC洗滌緩衝液係呈pH 3.6-4、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4。在一些實施例中，該HIC步驟係在室溫進行。

在一些實施例中，該方法包含收集HIC流出物，該HIC流出物包含該遮蔽抗體。在一些實施例中，該方法進一步包含將該HIC流出物之該緩衝液交換為呈pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5之麩胺酸鹽緩衝液，其中交換該緩衝液係經由透濾或切向流過濾進行。在一些實施例中，該麩胺酸鹽緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、20-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。

在一些實施例中，該方法進一步包含在透濾或切向流過濾之前超進行過濾以將該遮蔽抗體濃縮至10-40 mg/mL、15-35 mg/mL、20-35 mg/mL或25-35 mg/mL。在一些實施例中，該方法進一步包含進行病毒移除。在一些實施例中，病毒移除係藉由奈米過濾進行。在一些實施例中，該奈米過濾係在酸性pH下進行。在一些實施例中，該酸性pH為pH 3-4.4、pH 3.5-4.4、pH 3.6-4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4。在一些實施例中，該病毒移除係在室溫進行。在一些實施例中，病毒移除在該透濾及超過濾之前。

在一些實施例中，該方法之各pH ＞5步驟係在1℃至15℃溫度下進行，及/或其中該方法之各室溫步驟係在pH ＜4.5進行。

在一些實施例中，各遮蔽域包含蛋白酶可裂解連接子且經由該蛋白酶可裂解連接子連接至該重鏈或輕鏈。在一些實施例中，該蛋白酶可裂解連接子包含基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物裂解位點、間質蛋白酶(matriptase)裂解位點、豆莢蛋白酶(legumain)裂解位點、解整合素及金屬蛋白酶(A Disintegrin And Metalloproteinase) (ADAM)裂解位點或半胱天冬酶(caspase)裂解位點。在一些實施例中，該蛋白酶可裂解連接子包含基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點。在一些實施例中，該MMP裂解位點選自MMP2裂解位點、MMP7裂解位點、MMP9裂解位點及MMP13裂解位點。在一些實施例中，該MMP裂解位點包含序列IPVSLRSG (SEQ ID NO: 19)或GPLGVR (SEQ ID NO: 21)。

在一些實施例中，該第一遮蔽域包含序列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，該第二遮蔽域包含序列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 3)。在一些實施例中，該第一遮蔽域包含序列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 4)，且該第二遮蔽域包含序列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 3)。

在一些實施例中，該第一遮蔽域連接至該重鏈之胺基端且該第二遮蔽域連接至該輕鏈之胺基端。在一些實施例中，該第一遮蔽域連接至該輕鏈之胺基端且該第二遮蔽域連接至該重鏈之胺基端。

在一些實施例中，抗體結合選自以下之抗原：CD47、CD3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、CD123、Her-2、EphA2、淋巴球相關抗原1、VEGF或VEGFR、CTLA-4、LIV-1、結合蛋白(nectin)-4、CD74、SLTRK-6、EGFR、CD73、PD-L1、CD163、CCR4、CD147、EpCam、Trop-2、CD25、C5aR、Ly6D、α v整合素、B7H3、B7H4、Her-3、葉酸受體α、GD-2、CEACAM5、CEACAM6、c-MET、CD266、MUC1、CD10、MSLN、唾液酸基Tn、路易(Lewis) Y、CD63、CD81、CD98、CD166、組織因子(CD142)、CD55、CD59、CD46、CD164、TGF β受體1 (TGFβR1)、TGFβR2、TGFβR3、FasL、MerTk、Axl、Clec12A、CD352、FAP、CXCR3及CD5。

在一些實施例中，該抗體結合CD47。在一些實施例中，該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO: 25；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 26；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 27；其中該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO: 31；LCDR2，其包含SEQ ID NO: 32；及LCDR3，其包含SEQ ID NO: 33或34。在一些實施例中，該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 23或24之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其包含SEQ ID NO: 25、26、27、31、32及33。

在一些實施例中，結合CD47之該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO: 28；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 29；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 30；且其中該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO: 35；LCDR2，其包含SEQ ID NO: 36；及LCDR3，其包含SEQ ID NO: 37或38。在一些實施例中，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 23或24之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其包含SEQ ID NO: 28、29、30、35、36及37。

在一些實施例中，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。在一些實施例中，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 23或24之胺基酸序列。在一些實施例中，該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。

在一些實施例中，該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其連接至重鏈，及第二遮蔽域，其連接至輕鏈，其中該第一遮蔽域及該重鏈包含SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40之序列或由其組成，且該第二遮蔽域及該輕鏈包含SEQ ID NO: 42之序列或由其組成。

在一些實施例中，結合CD47之該抗體阻斷CD47與SIRPα之間的相互作用。

在一些實施例中，該抗體具有減少的核心岩藻糖基化。在一些實施例中，該抗體係無岩藻糖基化(afucosylated)。

在一些實施例中，該遮蔽抗體與細胞毒性劑結合。在一些實施例中，該細胞毒性劑為抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、DNA烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、NAMPT抑制劑或化學療法敏化劑。在一些實施例中，該細胞毒性劑為蒽環類(anthracycline)、奧瑞他汀(auristatin)、喜樹鹼(camptothecin)、倍癌黴素(duocarmycin)、依託泊苷(etoposide)、烯二炔抗生素(enediyine antibiotic)、萊希菌素(lexitropsin)、紫杉烷(taxane)、類美登素(maytansinoid)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)、康柏斯達汀(combretastatin)、念珠藻素(cryptophysin)或長春花生物鹼(vinca alkaloid)。在一些實施例中，該細胞毒性劑為奧瑞他汀E、AFP、AEB、AEVB、MMAF、MMAE、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、小紅莓(doxorubicin)、嗎啉基)-小紅莓、氰基-嗎啉基-小紅莓、美法侖(melphalan)、甲胺喋呤(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin) C、CC-1065類似物、CBI、卡奇黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、尾海兔素(dolastatin) 10之類似物、根瘤菌素(rhizoxin)或沙海葵毒素(palytoxin)、埃坡黴素(epothilone) A、埃坡黴素B、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙鹼(colchicine)、秋水醯胺(colcimid)、雌氮芥(estramustine)、西馬多丁(cemadotin)、圓皮海綿內酯(discodermolide)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、微管蛋白裂解素(tubulysin)、普魯卡布林(plocabulin)，或美登素(maytansine)。在一些實施例中，該細胞毒性劑為奧瑞他汀。在一些實施例中，該細胞毒性劑為MMAE或MMAF。

在一些實施例中，在純化該遮蔽抗體之後，該遮蔽抗體與至細胞毒性劑結合。在一些實施例中，該細胞毒性劑為抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、DNA烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、NAMPT抑制劑或化學療法敏化劑。在一些實施例中，該細胞毒性劑為蒽環類、奧瑞他汀、喜樹鹼、倍癌黴素、依託泊苷、烯二炔抗生素、萊希菌素、紫杉烷、類美登素、吡咯并苯并二氮呯、康柏斯達汀、念珠藻素或長春花生物鹼。

在一些實施例中，該細胞毒性劑為奧瑞他汀E、AFP、AEB、AEVB、MMAF、MMAE、太平洋紫杉醇、多西他賽、小紅莓、(嗎啉基)-小紅莓、氰基-嗎啉基-小紅莓、美法侖、甲胺喋呤、絲裂黴素C、CC-1065類似物、CBI、卡奇黴素、美登素、尾海兔素10之類似物、根瘤菌素或沙海葵毒素、埃坡黴素A、埃坡黴素B、諾考達唑、秋水仙鹼、秋水醯胺、雌氮芥、西馬多丁、圓皮海綿內酯、艾榴塞洛素、微管蛋白裂解素、普魯卡布林或美登素。在一些實施例中，該細胞毒性劑為奧瑞他汀。在一些實施例中，該細胞毒性劑為MMAE或MMAF。

在一些實施例中，提供已藉由本文所揭示之方法純化的遮蔽抗體。

上文所描述的本發明之發明內容為非限制性的，且所揭示抗體及製造並使用其之方法之其他特徵及優點將根據以下圖式、詳細描述、實例及權利要求書顯而易見。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2019年6月5日申請的美國臨時申請案第62/857,367號之優先權益，其出於任何目的以全文引用之方式併入本文中。

本發明包括製備包含遮蔽抗體之組合物之製程。遮蔽抗體可包含其中藉由將可變區鏈之胺基端連接至形成纏繞線圈之肽來遮蔽可變區的抗體。形成纏繞線圈之肽彼此結合以形成纏繞線圈(亦即，各別肽各自形成線圈且此等線圈圍繞彼此纏繞)，且在一些實施例中，空間上抑制抗體結合位點結合於其目標。藉由此型式遮蔽抗體可將結合親和力(及在ADC之情況下，細胞毒性活性)減小超過一百倍，且在一些實施例中，可減小脫靶效果。然而，在一些個例中，遮蔽抗體可能聚集於溶液中，該聚集可能為非所需的。在一些實施例中，本發明製程在遮蔽抗體之純化且濃縮成用於儲存及使用之調配物期間及/或之後減少該等遮蔽抗體之聚集。在一些實施例中，製程涉及在可能減少聚集之條件下進行層析或其他純化步驟。

由於此纏繞線圈遮蔽可應用於任何抗體，此係因為其獨立於抗體之特定CDR及可變區序列且獨立於抗體結合之目標或抗原決定基，因此本文之製程適用於包含纏繞線圈遮蔽多肽之多種遮蔽抗體。

在一些實施例中，抗體為抗CD47抗體。其可適用於以遮蔽形式向患者投與抗CD47抗體。舉例而言，已知抗CD47 IgG3抗體展現毒性，諸如周邊紅血球消耗及血小板消耗，其降低其作為抗CD47相關病症(諸如表現CD47之癌症)之有效治療劑的有用性。舉例而言，遮蔽抗CD47抗體因此可為較低毒性的，原因在於其可藉由在腫瘤微環境之情況下去遮蔽而活化，以有效靶向特定針對表現CD47之實體腫瘤的本發明抗體。因此，本文之製程與多種抗CD47抗體，諸如本文中所特定揭示之彼等抗體相容。

在某些例示性實施例中，提供抗體，其包含阻斷抗體與其抗原目標之結合的可移除遮罩(例如，包含纏繞線圈域之遮罩)。在某些實施例中，纏繞線圈域經由基質金屬蛋白酶(MMP)-可裂解連接子序列連接至抗體之重鏈及/或輕鏈中之一或多者之胺基端。舉例而言，在腫瘤微環境中，經更改蛋白分解引起未經調節的腫瘤生長、組織重塑、發炎、組織侵入及癌轉移(Kessenbrock (2011) Cell 141:52)。MMP表示與腫瘤形成相關的最重要蛋白酶家族，且MMP在腫瘤進展期間介導微環境中之多種變化。如先前所提及。在本發明之抗體暴露於MMP之後，MMP連接子序列裂解，因此允許移除纏繞線圈遮罩且使得抗體能夠以腫瘤微環境特異性方式結合其目標抗原。

在其他實施例中，遮蔽抗體可適用於諸如活體外，諸如用於醫學診斷學、化學品處理或工業用途，使得抗體活性可藉由在適當點處將外源性蛋白酶添加至溶液來控制，以裂解遮罩之纏繞線圈且允許抗體結合於其目標。然而，無關於應用，將纏繞線圈遮罩添加至抗體可能在抗體經純化或其以濃縮形式儲存時增加聚集風險。本文中所描述之製備製程可藉由隨著製程進行減少遮蔽抗體之聚集來解決此問題，從而在一些實施例中允許更高的遮蔽抗體產量。定義

為使本發明可較容易理解，在下文中特定地定義某些技術及科學術語。除非在本文件中其他地方特定地定義，否則本文所使用之所有其他技術及科學術語均具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。

除非上下文另外清楚地規定，否則如本文(包括隨附申請專利範圍)所用，諸如「一(a/an)」及「該(the)」之詞語之單數形式包括其對應複數種參考物。

「包含」一或多種所敍述要素或步驟之組合物或方法可包括未特定敍述之其他要素或步驟。舉例而言，包含抗體之組合物可單獨或與其他成分組合地含有抗體。

「基本上由」一或多個步驟「組成」之組合物或方法可包括未特定敍述之要素或步驟，只要任何另外的要素或步驟並不材料上更改如申請專利範圍中所敍述之組合物或方法之重要性質。舉例而言，可包括其他步驟，只要其並不材料上更改總體製備製程，諸如洗滌步驟或緩衝液變化。

除非根據上下文另外顯而易見，否則當值表示為「約」X或「大約」X時，所陳述的X值應理解為準確至±10%。

在本發明之情形下之溶劑合物為經由與溶劑分子配位形成固態或液態之複合物的本發明化合物之彼等形式。水合物為與水發生配位之溶劑合物之一種特定形式。在某些例示性實施例中，在本發明之上下文中之溶劑合物為水合物。

在本文之製程中，某些步驟可在「中性pH」下或在「酸性pH」下進行。「中性pH」在本文中經廣泛定義以涵蓋大致6.5與8.5之間的pH，而「酸性pH」係指通常6.0或更小之pH。然而，在酸性pH下進行之步驟通常係在pH 5或更小、或pH 4.5或更小下進行，如下文進一步描述。

在本文之製程中，「室溫」意謂製程係在無溫度控制之情況下進行，諸如在除施加於進行製程之整個設備上或建築上以外的無溫度控制之情況下進行，或係以其他方式在約15℃至28℃，諸如18℃至25℃、或20℃至25℃的溫度下進行。

術語「病毒移除」係指處理組合物以自組合物移除病毒或潛在病毒或病毒粒子的製程。舉例而言，病毒移除可藉由用過濾器過濾組合物進行，該過濾器足夠大以使所需蛋白質材料穿過但足夠小以使病毒粒子滯留在過濾器中。病毒移除亦可藉由輻射或其他化學程序進行，只要製程不損壞組合物中之蛋白質即可。

術語「奈米過濾」係指使用具有例如1-30 nm、10-30 nm或20 nm孔之過濾器進行病毒移除的製程。

術語「多肽」與「蛋白質」可互換使用以係指胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。此類胺基酸殘基之聚合物可含有天然或非天然胺基酸殘基，且包括(但不限於)胺基酸殘基之肽、寡肽、二聚體、三聚體及多聚體。全長蛋白質及其片段皆由該定義涵蓋。該等術語亦包括多肽之表現後修飾，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾。此外，出於本發明之目的，「多肽」係指包括對原生序列之修飾(諸如缺失、添加及取代(實際上通常保守))之蛋白質，只要該蛋白質維持所要活性即可。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發進行；或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之宿主的突變或由於PCR擴增所引起之錯誤引起。

術語「抗體」表示由主體回應於抗原之存在而產生且結合於抗原的免疫球蛋白蛋白質以及其抗原結合片段及經工程改造變體。因此，術語「抗體」包括例如完整單株抗體(例如，使用雜交瘤技術產生之抗體)且其亦涵蓋抗原結合抗體片段，諸如F(ab')₂ 、Fv片段、雙功能抗體、單鏈抗體、scFv片段或scFv-Fc。經基因工程改造的完整抗體及片段，諸如嵌合抗體、人類化抗體、單鏈Fv片段、單鏈抗體、雙功能抗體、微型抗體、線性抗體、雙特異性或二價、多價或多特異性(例如，雙特異性)混合抗體及類似抗體。因此，術語「抗體」廣泛用於包括包含抗體之抗原結合位點且能夠特異性結合於其抗原的任何蛋白質。

術語「抗體」包括未結合(亦即，共價或非共價結合)於本發明之遮蔽化合物的「裸露(naked)」抗體。術語抗體亦包涵「遮蔽」抗體，其包含共價或非共價結合於如本文中進一步描述之一或多種遮蔽化合物(例如，纏繞線圈肽)的抗體。術語抗體包括「結合」抗體或「抗體-藥物結合物(ADC)」，其中抗體共價或非共價結合於醫藥劑，例如結合於細胞生長抑制劑或細胞毒性藥物。在某些實施例中，抗體為視情況結合至醫藥劑，例如結合至細胞生長抑制劑或細胞毒性藥物的裸露抗體或抗原結合片段。在其他實施例中，抗體為視情況結合至醫藥劑，例如結合至細胞生長抑制劑或細胞毒性藥物的遮蔽抗體或抗原結合片段。

抗體通常包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其各自包含三個互補決定區(CDR)與包圍構架(FR)區，總計六個CDR。抗體輕鏈或重鏈可變區(在本文中亦分別稱為「輕鏈可變域」(「VL域」)或「重鏈可變域」(「VH域」))包含間雜有三個「互補決定區」或「CDR」之「構架」區。構架區用以比對CDR，以供特異性結合於抗原之抗原決定基。由此，術語「CDR」係指主要負責抗原結合的抗體之胺基酸殘基。自胺基端至羧基末端，VL域及VH域兩者皆包含以下構架(FR)及CDR區：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

天然存在之抗體通常為四聚體且由兩個相同的重鏈及輕鏈對組成。在各對中，輕鏈及重鏈可變區(VL及VH)一起主要負責結合於抗原，且恆定區主要負責抗體效應功能。已在高等脊椎動物中鑑別出五類抗體(IgG、IgA、IgM、IgD及IgE)。IgG包含主要類別，且其通常作為血漿中發現之第二豐富的蛋白質存在。在人類中，IgG由命名為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之四個子類組成。各免疫球蛋白重鏈擁有包含恆定區蛋白域(CH1、鉸鏈、CH2及CH3；IgG3亦含有CH4域)之恆定區，該等恆定區蛋白域對於物種中之給定子類為大體上不變的。如本文所定義之抗體可包括此等天然形式以及如上所描述之各種抗原結合片段、具有經修飾重鏈恆定區之抗體、雙特異性及多特異性抗體以及遮蔽抗體。

根據Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (國立衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD, 1987及1991)之定義將胺基酸分配至各可變區域。Kabat亦提供廣泛使用的編號規約(Kabat編號)，其中不同重鏈可變區之間或不同輕鏈可變區之間的對應殘基經指派相同編號。VL域之CDR 1、2及3在本文中亦分別稱為CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。VH域之CDR 1、2及3在本文中亦分別稱為CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3。若如此標記，則CDR之分配可根據IMGT® (Lefranc等人, Developmental & Comparative Immunology 27:55-77; 2003)代替Kabat。

抗體之「抗原結合位點」為足以結合於其抗原的抗體之部分。最小此類區通常為包含六個CDR (或在單域抗體之情況下，三個CDR)之可變域之片段。在一些實施例中，抗體之抗原結合位點包含結合於通用抗原決定基的重鏈可變(VH)域及輕鏈可變(VL)域兩者。在本發明之上下文內，抗體可包括一或多種除抗原結合位點以外的組分，諸如抗體之第二抗原結合位點(其可結合於相同或不同抗原決定基或結合於相同或不同抗原)、肽連接子、免疫球蛋白恆定區、免疫球蛋白鉸鏈、兩親性螺旋(參見Pack及Pluckthun, Biochem. 31: 1579-1584, 1992)、非肽連接子、寡核苷酸(參見Chaudri等人, FEBS Letters 450:23-26, 1999)、細胞生長抑制劑或細胞毒性藥物及其類似物，且可為單體或多聚體蛋白。包含抗體之抗原結合位點的分子之實例在此項技術中已知且包括例如Fv、單鏈Fv (scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、雙功能抗體、微型抗體、奈米抗體、Fab-scFv融合體、雙特異性(scFv)4-IgG及雙特異性(scFv)2-Fab。(參見例如，Hu等人, Cancer Res. 56:3055-3061, 1996；Atwell等人, Molecular Immunology 33: 1301-1312, 1996；Carter and Merchant, Curr. Op. Biotechnol. 8:449-454, 1997；Zuo等人, Protein Engineering 13:361-367, 2000；及Lu等人, J. Immunol. Methods 267:213-226, 2002。)

重鏈恆定區之編號係經由如Kabat中所闡述之EU索引進行(Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 國立衛生研究院, Bethesda, MD, 1987及1991)。

除非上下文另有規定，否則術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」可包括自單一純系(包括任何真核、原核或噬菌體純系)衍生之抗體。在特定實施例中，本文所描述之抗體為單株抗體。

術語「嵌合抗體」係指其中重鏈及/或輕鏈之部分與自特定物種(例如，人類)衍生或屬於特定抗體類或子類的抗體中之對應序列一致或同源，同時鏈之剩餘部分與自另一物種(例如，小鼠)衍生或屬於另一抗體類或子類的抗體中之對應序列一致或同源的抗體以及此類抗體之片段，只要其展現所需生物活性即可。

術語「人類化VH域」或「人類化VL域」係指包含一些或所有完全或大體上來自非人類供體免疫球蛋白(例如，小鼠或大鼠)之CDR及完全或大體上來自人類免疫球蛋白序列之可變域構架序列的免疫球蛋白VH或VL域。提供CDR之非人類免疫球蛋白稱為「供體」且提供構架之人類免疫球蛋白稱為「受體」。在一些個例中，人類化抗體將使一些非人類殘基保留在人類可變域構架區內以增強恰當結合特徵(例如，可能需要構架之突變以在抗體經人類化時保留結合親和力)。

「人類化抗體」為包含人類化VH域及人類化VL域中之一或兩者的抗體。無需存在免疫球蛋白恆定區，但其若存在，則其完全或大體上來自人類免疫球蛋白恆定區。

儘管人類化抗體通常併入來自小鼠抗體之全部六個CDR (較佳地如由Kabat或IMGT®所定義)，但其亦可經製得具有少於來自小鼠抗體之全部六個CDR (例如，至少3、4或5個) (例如，Pascalis等人, J. Immunol. 169:3076, 2002；Vajdos等人, Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002；Iwahashi等人, Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999；Tamura等人, Journal of Immunology, 164: 1432-1441, 2000)。

當至少60%、至少85%、至少90%、至少95%或100%對應殘基(如藉由Kabat(或IMGT)所定義)在各別CDR之間為一致時，人類化抗體中之CDR「大體上來自」非人類抗體中之對應CDR。在其中CDR大體上來自非人類免疫球蛋白的人類化VH或VL域之特定變型中，人類化VH或VL域之CDR相對於對應非人類VH或VL CDR在全部三個CDR中具有不超過六個(例如，不超過五個、不超過四個、不超過三個、不超過兩個或不超過一個)胺基酸取代(較佳地，保守性取代)。當至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%之對應殘基(如藉由用於可變區之Kabat編號及用於恆定區之Eu編號所定義)或約100%之對應殘基(如用於可變區之Kabat編號及用於恆定區之Eu編號所定義)一致時，抗體VH或VL域之可變區構架序列或(若存在)免疫球蛋白恆定區之序列分別「大體上來自」人類VH或VL構架序列或人類恆定區。因此，除CDR之外，人類化抗體之所有部分通常完全或大體上來自天然人類免疫球蛋白序列之對應部分。

當針對最大對應性進行比對時，若兩個胺基酸序列之胺基酸殘基相同，則兩個胺基酸序列具有「100%胺基酸序列一致性」。可使用標準軟體程式，諸如包括在由DNASTAR (Madison, Wisconsin)製作的LASERGENE生物資訊計算套件中的軟體程式來進行序列比較。用於藉由測定最佳比對來比較兩個核苷酸或胺基酸序列之其他方法為熟習此項技術者所熟知。(參見例如，Peruski及Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997)；Wu等人(編),「Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins,」 in Methods in Gene Biotechnology 123-151 (CRC Press, Inc. 1997)；Bishop (編), Guide to Human Genome Computing (第2版, Academic Press, Inc. 1998)。)若兩個序列相對於彼此具有至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列一致性，則認為兩個胺基酸序列具有「實質性序列一致性」。

藉由Kabat編號規約最大限度地比對抗體序列來測定序列一致性百分比。在比對之後，若將主題抗體區(例如，重鏈或輕鏈之完整可變域)與參考抗體之相同區進行比較，則主題抗體區與參考抗體區之間的序列一致性百分比係將主題抗體區與參比抗體區二者中之相同胺基酸所佔之位置數目除以兩個區之比對位置總數(未統計間隔)，乘以100以轉換成百分比。

抗體與其目標抗原之特異性結合通常係指至少約10⁶ 、約10⁷ 、約10⁸ 、約10⁹ 或約10¹⁰ M^-1 之親和力。特異性結合之可偵測量值較高且可與發生於至少一種非特異性目標的非特異性結合進行區分。特異性結合可能為在特定官能基或特定空間擬合(例如，鎖鑰類型)之間形成鍵的結果，而非特異性結合通常為凡得瓦爾力(van der Waals forces)之結果。

術語「抗原決定基」係指抗體所結合的抗原之位點。抗原決定基可由藉由一或多種蛋白質之三級摺疊並列的相鄰胺基酸或非相鄰胺基酸形成。由相鄰胺基酸形成的抗原決定基通常在暴露於變性劑(例如，溶劑)後保留，而藉由三級摺疊形成的抗原決定基在用變性劑(例如，溶劑)處理後通常損失。抗原決定基在特有空間構形中通常包括至少約3個，且更通常至少約5個、至少約6個、至少約7個或約8至10個胺基酸。測定抗原決定基之空間構形的方法包括例如x射線晶體學及二維核磁共振。參見例如Epitope Mapping Protocols, 在Methods in Molecular Biology中, 第66卷, Glenn E. Morris, 編(1996)。

識別相同或重疊抗原決定基之抗體可以在單一免疫分析中鑑別，該單一免疫分析展示一種抗體與另一抗體競爭結合於目標抗原的能力。抗體之抗原決定基亦可以由與其抗原結合以鑑別接觸殘基的抗體之X射線晶體學定義。

替代地，若減少或消除結合一種抗體的抗原中之所有胺基酸突變減少或消除結合另一種抗體(限制條件為此類突變並不在抗原結構中產生全域更改)，則兩種抗體具有相同抗原決定基。若減少或消除結合一種抗體之一些胺基酸突變減少或消除結合另一種抗體，則兩種抗體具有重疊抗原決定基。

抗體之間的競爭可藉由如下分析測定：其中測試抗體抑制參考抗體與通用抗原之特異性結合(參見例如，Junghans等人, Cancer Res. 50: 1495, 1990)。若過量測試抗體抑制參考抗體之結合，則測試抗體與參考抗體競爭。

藉由競爭分析(競爭抗體)鑑別之抗體包括結合於與參考抗體相同的抗原決定基的抗體及結合於足夠靠近參考抗體所結合之抗原決定基之相鄰抗原決定基以供產生位阻的抗體。藉由競爭分析鑑別之抗體亦包括藉由在目標蛋白質中引起構形改變從而防止參考抗體結合於與測試抗體所結合之抗原決定基不同的抗原決定基而與參考抗體間接競爭的彼等抗體。

抗體效應功能係指由Ig之Fc區貢獻的功能。此類功能可為例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。此類功能可受例如Fc區與具有吞噬細胞或裂解活性之免疫細胞上之Fc受體之結合或Fc區與補體系統之組分之結合影響。通常，由Fc結合細胞或補充組分介導之效果引起目標細胞之抑制及/或消耗。抗體之Fc區可募集表現Fc受體(FcR)之細胞且使其與經抗體塗佈之目標細胞並列。表現包括FcγRIII (CD16)、FcγRII (CD32)及FcγRIII (CD64)之IgG之表面FcR的細胞可充當用於破壞經IgG塗佈之細胞的效應細胞。此類效應細胞包括單核球、巨噬細胞、自然殺手(NK)細胞、嗜中性球及嗜酸性球。藉由IgG進行之FcγR接合活化ADCC或ADCP。ADCC係由CD16+效應細胞經由分泌膜造孔蛋白及蛋白酶介導，而吞噬作用係由CD32+及CD64+效應細胞介導(參見Fundamental Immunology, 第4版, Paul編, Lippincott-Raven, N.Y., 1997, 第3章、第17章及第30章；Uchida等人, J. Exp. Med. 199:1659-69, 2004；Akewanlop等人, Cancer Res. 61:4061-65, 2001；Watanabe等人, Breast Cancer Res. Treat. 53: 199-207, 1999)。

除ADCC及ADCP之外，細胞結合抗體之Fc區亦可活化補體經典路徑以誘發CDC。當抗體與抗原複合時，補體系統之C1q結合於抗體之Fc區。C1q與細胞結合抗體之結合可引發涉及C4及C2之蛋白水解活化以生成C3轉化酶的一連串事件。藉由C3轉化酶將C3裂解為C3b使得能夠活化包括C5b、C6、C7、C8及C9之末端補體組分。共同地，此等蛋白質在經抗體塗佈之細胞上形成膜攻擊複合物孔。此等孔破壞細胞膜完整性，從而殺死目標細胞(參見Immunobiology,第6版, Janeway等人, Garland Science, N. Y., 2005, 第2章)。

術語「抗體依賴性細胞毒性」或「ADCC」係指用於誘導細胞死亡之機制，其視經抗體塗佈之目標細胞與具有裂解活性之免疫細胞(亦稱為效應細胞)的相互作用而定。此類效應細胞包括自然殺手細胞、單核球/巨噬細胞及嗜中性球。效應細胞經由其抗原結合位點連接至結合於目標細胞的Ig之Fc區。經抗體塗佈之目標細胞之死亡由於效應細胞活性而發生。

術語「抗體依賴性細胞噬菌作用」或「ADCP」係指藉由結合於Ig之Fc區的吞噬細胞免疫細胞(例如，藉由巨噬細胞、嗜中性球及/或樹突狀細胞)整體或部分地內化經抗體塗佈之細胞的製程。

術語「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指用於誘導細胞死亡之機制，其中結合目標之抗體之Fc區活化一系列酶促反應，最終在目標細胞膜中形成孔。

通常，抗原-抗體複合物(諸如經抗體塗佈之目標細胞上之彼等複合物)結合且活化補體組分C1q，其轉而活化導致目標細胞死亡之補體級聯。補體之活化亦可引起補體組分沈積於目標細胞表面上，藉由結合白血球上之補體受體(例如，CR3)而促進ADCC。

「抗體-藥物結合物」係指結合至細胞毒性劑或細胞生長抑制劑之抗體。通常，抗體-藥物結合物結合於細胞表面上之目標抗原，隨後將抗體-藥物結合物內化至細胞中且將藥物隨後釋放至細胞中。

「細胞毒性效果」係指消耗、消除及/或殺滅目標細胞。「細胞毒性劑」係指對細胞具有細胞毒性效果之化合物，從而介導目標細胞之消耗、消除及/或殺滅。在某些實施例中，細胞毒性劑結合至抗體或與抗體組合投藥。本文進一步描述適合的細胞毒性劑。

「細胞生長抑制效果」係指對細胞增殖之抑制。「細胞生長抑制劑」係指對細胞具有細胞生長抑制效果之化合物，從而介導對特定細胞類型及/或細胞子集之生長及/或擴增之抑制。本文進一步描述適合的細胞生長抑制劑。

術語「患者」及「個體」係指待藉由本文中所描述之方法治療的生物體，且包括人類及其他哺乳動物個體，諸如非人類靈長類動物、哺乳動物(例如，鼠類、猿猴、馬科動物、牛科動物、豬科動物、犬科動物、貓科動物以及類似物)家兔、大鼠、小鼠以及類似物，及接收防治性或治療性治療之其轉基因物種。在某些例示性實施例中，個體為罹患癌症或處於罹患癌症(實體腫瘤)之風險下的人類患者，該癌症視情況分泌能夠裂解本文中所描述之抗體之遮蔽域(例如，纏繞線圈遮蔽域)的一或多種蛋白酶。

如本文中所用，術語「治療(treat/treatment/treating)」包括引起病況、疾病、病症以及類似物之改善或緩解其症狀，諸如(例如)減少癌細胞之數目、減小腫瘤大小、降低癌細胞浸潤至周邊器官中之速率或降低腫瘤轉移或腫瘤生長之速率的任何效果，例如減輕、減少、調節、緩解或消除。

如本文中所使用，術語「有效量」係指足以影響有益或所需結果的化合物(例如，抗CD47抗體或遮蔽抗體)之量。在藉由投與如本文所描述之抗CD47抗體治療表現CD47之病症的情況下，術語「有效量」係指足以抑制CD47相關病症(例如，表現CD47之癌症)之一或多種症狀出現或減輕該一或多種症狀的此類抗體之量。以「有效方案」投與有效量之抗體。術語「有效方案」係指足夠實現病症之防治性或治療性治療(例如，表現CD47之癌症之防治性或治療性治療)的待投與之抗體之量及劑量頻率之組合。

術語「醫藥學上可接受」意謂由或可由聯邦管制機構或州政府核准或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他一般公認之藥典中供在動物且更特別在人類中使用。術語「醫藥學上相容成分」係指與抗體一起調配之醫藥學上可接受之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。

片語「醫藥學上可接受之鹽」係指醫藥學上可接受之有機鹽或無機鹽。例示性鹽包括硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸性磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸性檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、丁二酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、葡糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽，及雙羥萘酸鹽(亦即，1,1'-亞甲基雙(2羥基-3-萘甲酸鹽))。醫藥學上可接受之鹽可進一步包含另外分子，諸如乙酸根離子、丁二酸根離子或其他相對離子。相對離子可為使母化合物上之電荷穩定的任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽在其結構中可具有超過一個帶電原子。多個帶電原子係醫藥學上可接受鹽之部分的情況可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。I. 包含纏繞線圈之遮蔽域

在某些實施例中，抗體與包含纏繞線圈域之遮蔽域(亦稱為「纏繞線圈遮蔽域」)結合，該遮蔽域阻斷抗體與其抗原目標之結合。在各種實施例中，與遮蔽域結合之抗體稱為「遮蔽」抗體。

纏繞線圈為蛋白質及肽中之結構性基元，其中兩個或更多個α螺旋圍繞彼此捲繞形成超線圈。纏繞線圈束中可存在兩個、三個或四個螺旋，且螺旋可以相同(平行)或相對(逆平行)方向運行。

纏繞線圈通常包含三個及四個殘基之序列元件，其疏水性模式及殘基組成與兩親媒性α螺旋之結構相容。交替三個及四個殘基序列元件構成七肽重複(heptad repeats)，其中胺基酸命名為『a』、『b』、『c』、『d』、『e』、『f』及『g』。位置『a』及『d』中之殘基通常為疏水性的且形成杵-臼(knobs and holes)之z字形模式，該等杵-臼與另一股上之類似模式互鎖形成緊密擬合的疏水性核心。在剩餘殘基中，『b』、『c』及『f』傾向帶電荷。因此，七肽重複之形成視特定位置而非特定胺基酸上需要的疏水性及電荷之物理性質而定。在某些例示性實施例中，本發明之纏繞線圈係由兩個纏繞線圈形成之肽形成。

形成纏繞線圈之肽中之七肽重複的共有式之實例由W02011034605提供，其出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。

根據某些實施例之例示性共有式闡述於以下：式1：(X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7)n，其中： X1為疏水性胺基酸或天冬醯胺； X2、X3及X6為任何胺基酸； X4為疏水性胺基酸； X5及X7各自為帶電胺基酸殘基；以及 n為正整數。式2：(X1', X2', X3', X4', X5', X6', X7')n，其中： X1'為疏水性胺基酸或天冬醯胺； X2'、X3'及X6'各自為任何胺基酸殘基； X4'為疏水性胺基酸； X5'及X7'各自為帶電胺基酸殘基；其中式1及式2中之n大於或等於2；且 n為正整數。

在式1及式2之肽形成纏繞線圈之某些實施例中，式1之X5的電荷與式2之X7'的電荷相反，且式1之X7的電荷與式2之X5'的電荷相反。形成纏繞線圈之肽內之七肽重複可彼此相同或不同，同時符合式1及/或2。

纏繞線圈可為均二聚體或異二聚體。可根據某些例示性實施例形成纏繞線圈的肽之實例展示於下表1中(SEQ ID NO: 1-4)。肽序列可按原樣使用，或其組分可用於其他組合中。舉例而言，形成Vel纏繞線圈之肽可與其他連接子序列一起使用。針對輕鏈展示之序列亦可與重鏈一起使用，且反之亦然。

在某些例示性實施例中，提供包含兩個輕鏈及重鏈對之二價抗體，其中輕鏈及/或重鏈中之一或多者之胺基端經由包含蛋白酶裂解位點之連接子連接連接至結合以形成纏繞線圈的形成纏繞線圈之肽，從而減少輕鏈及重鏈對對於目標之結合親和力。視情況，肽結合而不形成二硫橋鍵。

視情況，兩個輕鏈及重鏈對相同。視情況，兩個輕鏈及重鏈對不同。視情況，輕鏈包括輕鏈可變區及輕鏈恆定區，且重鏈包括重鏈可變區及重鏈恆定區。視情況，重鏈區包括CH1、鉸鏈、CH2及CH3區。視情況，兩個輕鏈連接至第一異源肽，且兩個重鏈連接至第二異源肽。

視情況，蛋白酶裂解位點為MMP1、MMP2及/或MMP12裂解位點。

在一些情況下，抗原結合因遮蔽域(例如，纏繞線圈遮蔽域)之存在而減少至少100倍。在一些實施例中，抗原結合因遮蔽域(例如，纏繞線圈遮蔽域)之存在而減少200至1500倍。在一些實施例中，結合物之細胞毒性因遮蔽域(例如，纏繞線圈遮蔽域)之存在而減少至少100倍。在一些實施例中，結合物之細胞毒性因遮蔽域(例如，纏繞線圈遮蔽域)之存在而減少至少200至1500倍。

視情況，形成纏繞線圈之肽連接至相同取向上之重鏈及輕鏈之胺基端。視情況，形成纏繞線圈之肽連接至相反取向上之重鏈及輕鏈之胺基端。視情況，形成纏繞線圈之肽之多個複本以串聯方式連接至重鏈及輕鏈之胺基端。

在一些實施例中，遮蔽域包含VelA纏繞線圈域(SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，遮蔽域包含VelB纏繞線圈域(SEQ ID NO: 2)。在一些實施例中，遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含VelA纏繞線圈域，及第二遮蔽域，其包含VelB纏繞線圈域，其中第一遮蔽域連接至輕鏈且第二遮蔽域連接至重鏈，或反之亦然。在一些實施例中，各遮蔽域連接至重鏈或輕鏈之胺基端。表1：非限制性例示性纏繞線圈遮蔽域

描述	序列	SEQ ID NO
VelA纏繞線圈	VAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQL	1
VelB纏繞線圈	VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL	2
VelA-IPV	GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG	3
VelB-IPV	GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG	4

在某些例示性實施例中，形成纏繞線圈之變體肽中之胺基酸取代為保守性取代。出於將胺基酸取代分類為保守性或非保守性之目的，將以下胺基酸取代視為保守性取代：絲胺酸，其經蘇胺酸、丙胺酸或天冬醯胺取代；蘇胺酸，其經脯胺酸或絲胺酸取代；天冬醯胺，其經天冬胺酸、組胺酸或絲胺酸取代；天冬胺酸，其經麩胺酸或天冬醯胺取代；麩胺酸，其經麩醯胺酸、離胺酸或天冬胺酸取代；麩醯胺酸，其經精胺酸、離胺酸或麩胺酸取代；組胺酸，其經酪胺酸或天冬醯胺取代；精胺酸，其經離胺酸或麩醯胺酸取代；甲硫胺酸，其經異白胺酸、白胺酸或纈胺酸取代；異白胺酸，其經白胺酸、纈胺酸或甲硫胺酸取代；白胺酸，其經纈胺酸、異白胺酸或甲硫胺酸取代；苯丙胺酸，其經酪胺酸或色胺酸取代；酪胺酸，其經色胺酸、組胺酸或苯丙胺酸取代；脯胺酸，其經蘇胺酸取代；丙胺酸，其經絲胺酸取代；離胺酸，其經麩胺酸、麩醯胺酸或精胺酸取代；纈胺酸，其經甲硫胺酸、異白胺酸或白胺酸取代；及色胺酸，其經苯丙胺酸或酪胺酸取代。保守性取代亦可意謂相同類別之胺基酸之間的取代。類別如下：第I組(疏水性側鏈)：met、ala、val、leu、ile；第II組(中性親水性側鏈)：cys、ser、thr；第III組(酸性側鏈)：asp、glu；第IV組(鹼性側鏈)：asn、gin、his、lys、arg；第V組(影響鏈取向之殘基)：gly、pro；及第VI組(芳族側鏈)：trp、tyr、phe。連接子及裂解位點

在本發明之某些實施例中，遮蔽域包含連接子，其位於纏繞線圈域與纏繞線圈域所連接之抗體鏈之間。連接子可為習知用作用於接合肽域之連接子的胺基酸之任何區段。適合連接子之長度可能改變，諸如1至20、2至15、3至12、4至10、5、6、7、8、9或10。一些此類連接子包括聚甘胺酸之區段。一些此類連接子通常在側接甘胺酸殘基之位置處包括一或多個絲胺酸殘基。其他連接子包括一或多個丙胺酸殘基。甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物相對地未經結構化，且因此能夠充當組分之間的中性繫鏈。甘胺酸甚至比丙胺酸進入顯著更多的φ-ψ空間，且比具有較長側鏈之殘基更不受限制(參見Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992))。一些例示性連接子呈形式S(G)nS，其中n為5至20。其他例示性連接子為(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n [(GSGGS)為SEQ ID NO: 5]及(GGGS)n，[(GGGS)為SEQ ID NO: 6]，其中n為至少1之整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物及此項技術中已知的其他可撓性連接子。連接子之一些實例為Ser-(Gly)10-Ser (SEQ ID NO: 7)、Gly-Gly-Ala-Ala (SEQ ID NO: 8)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 9)、Leu-Ala-Ala-Ala-Ala (SEQ ID NO: 10)、Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 11)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 12)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 13)、Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 14)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 15)、Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 16)及類似者。

蛋白酶位點較佳地經細胞外表現之蛋白酶識別且裂解，因此其接觸遮蔽抗體，從而釋放遮蔽抗體且允許其接觸其目標，諸如受體細胞外域或可溶性配位體。若干基質金屬蛋白酶位點(MMP1-28)為適合的。MMP在組織重塑中起作用且涉及贅生性過程，諸如形態發生、血管生成及癌轉移。一些例示性蛋白酶位點為PLG-XXX (SEQ ID NO: 17)，MMP之熟知內源序列；PLG-VR (SEQ ID NO: 18) (W02014193973)及IPVSLRSG (SEQ ID NO: 19) (Turk等人, Nat. Biotechnol., 2001, 19, 661-667)，LSGRSDNY (SEQ ID NO: 20) (Cytomyx)及GPLGVR (SEQ ID NO: 21) (Chang等人, Clin. Cancer Res. 2012年1月1日; 18(1):238-47)。MMP之另外實例提供於US 2013/0309230、WO 2009/025846、WO 2010/081173、WO 2014/107599、WO 2015/048329、US 20160160263及Ratnikov等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 111: E4148-E4155 (2014)中。表2.蛋白酶裂解序列。MMP裂解位點由*指示，而uPA/間質蛋白酶/豆莢蛋白酶裂解位點由**指示。

裂解位點名稱	序列
M2	GPLGVR* (SEQ ID NO: 21)
IPV	IPVSLR*SG (SEQ ID NO: 19)

在一些實施例中，遮蔽域包含纏繞線圈域、連接子及蛋白酶裂解序列。在一些此類實施例中，遮蔽域為VelA-IPV (SEQ ID NO: 3)，其中纏繞線圈域為VelA (SEQ ID NO: 1)，連接子為GS，且蛋白酶裂解序列為IPVSLRSG (SEQ ID NO: 19)。在一些實施例中，遮蔽域包含纏繞線圈域、連接子及蛋白酶裂解序列。在一些此類實施例中，遮蔽域為VelB-IPV (SEQ ID NO: 4)，其中纏繞線圈域為VelB (SEQ ID NO: 2)，連接子為GS，且蛋白酶裂解序列為IPVSLRSG (SEQ ID NO: 19)。

在一些實施例中，第一遮蔽域為VelA-IPV遮蔽域(SEQ ID No: 3)，其包括MMP蛋白酶位點，且第二遮蔽域為VelB-IPV遮蔽域(SEQ ID NO: 4)，其亦包括MMP蛋白酶位點。在一些實施例中，第一遮蔽域連接至輕鏈且第二遮蔽域連接至重鏈，或反之亦然。在一些實施例中，各遮蔽域連接至重鏈或輕鏈之胺基端。II. 將纏繞線圈遮蔽劑連接至抗體

經由包括蛋白酶位點之連接子將形成纏繞線圈之肽連接至抗體可變區之胺基端。典型抗體包括重鏈及輕鏈可變區，在此情況下，將形成纏繞線圈之肽連接至各胺基端。二價抗體具有可相同或可不相同的兩個結合位點。在正常單特異性抗體中，結合位點為相同的且抗體具有兩個相同的輕鏈及重鏈對。在此情況下，各重鏈連接至相同的形成纏繞線圈之肽，且各輕鏈連接至相同的形成纏繞線圈之肽(其可與連接至重鏈之肽相同或不相同)。在雙特異性抗體中，結合位點為不同的且由兩個不同的重鏈及輕鏈對形成。在此情況下，一個結合位點之重鏈及輕鏈可變區分別連接至形成纏繞線圈之肽，另一結合位點之重鏈及輕鏈可變區亦分別連接至形成纏繞線圈之肽。通常兩個重鏈可變區連接至相同類型之形成纏繞線圈之肽，兩個輕鏈可變區亦連接至相同類型之形成纏繞線圈之肽。

可經由包括蛋白酶位點之連接子將形成纏繞線圈之肽連接至抗體可變區。通常，具有相同蛋白酶裂解位點之相同連接子用於將抗體之各重鏈或輕鏈可變區連接至纏繞線圈肽。蛋白酶裂解位點應為適合於藉由細胞外存在於預期目標組織或病變(諸如癌症)中之蛋白酶裂解的蛋白酶裂解位點，使得連接子之裂解自遮蔽其活性之纏繞線圈中釋放抗體，從而使得抗體結合於其預期目標，諸如細胞表面抗原或可溶性配位體。

作為可變區，遮蔽抗體通常包括全部或部分恆定區，其可包括輕鏈恆定區、CH1、鉸鏈、CH2及CH3區中之任一者或全部。如同其他抗體，一或多個羧基末端殘基可經蛋白分解處理或衍生。

纏繞線圈可由形成均二聚體之相同肽或形成異二聚體之兩個不同肽形成。為形成均二聚體，將輕抗體鏈及重抗體鏈連接至相同的形成纏繞線圈之肽。為形成異二聚體，將輕抗體鏈及重抗體鏈連接至纏繞線圈肽。對於一些形成纏繞線圈之肽對，較佳的為，該對中之一者連接至抗體之重鏈且另一者連接至抗體之輕鏈，但逆向取向亦為可能的。

可以串聯方式(例如，肽之兩個、三個、四個或五個複本)將各抗體鏈連接至單一的形成纏繞線圈之肽或多個此類肽。若為後者，則以串聯方式連接之肽通常相同。此外，若採用串聯連接，則輕鏈及重鏈通常連接至相同數目的肽。

將抗體鏈連接至形成纏繞線圈之肽可相對於不具有此類連接或此類連接裂解後之相同抗體使抗體之結合親和力減小至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約500倍、至少約1000倍或至少約1500倍。在一些此類抗體中，結合親和力減小約50-5000倍、約50-1500倍、約100-1500倍、約200-1500倍、約500-1500倍、約500-5000倍、約50-約1000倍、約100-1000倍、約200-1000倍、約500-1000倍、約50-500倍或約100-500倍。由於連接至抗體藥物結合物中之藥物，因此諸如ADCC、噬菌作用、及CDC或細胞毒性之抗體之效應功能可減小相同因數或範圍。在用於去遮蔽抗體之蛋白水解裂解或以其他方式自抗體移除遮罩後，相較於從未經遮蔽之其他相同對照抗體，經恢復抗體通常具有在因數2、1.5內或較佳地在實驗誤差內不變的親和力或效應功能。III. 用於製備遮蔽抗體組合物之 製程

遮蔽抗體組合物可根據以下製程製得。用於製備製程的含有意欲構成組合物之多肽的起始組合物可獲自各種來源，例如獲自細胞溶解物或已進行某些初始純化步驟後之細胞溶解物。在一些實施例中，例如表現多肽之細胞可經過濾以移除細胞組分且將起始組合物置放於適當緩衝液中以用於後續步驟。在一些實施例中，用清潔劑處理起始組合物例如以移除反轉錄病毒、細胞組分或包含磷脂膜之組分。

在一些實施例中，使起始組合物經歷蛋白質A層析。在一些實施例中，在蛋白質A層析之前，起始組合物先前未經歷任何層析程序。在一些實施例中，在適合於使遮蔽抗體結合於蛋白質A層析管柱之條件下將包含遮蔽抗體之起始組合物裝載至蛋白質A層析管柱上，接著洗滌管柱，且在至少一次洗滌之後，自管柱溶離所需多肽材料。在一些實施例中，該蛋白質A層析係在室溫進行。在一些實施例中，蛋白質A層析係在中性pH下進行，意謂管柱平衡緩衝液及含起始組合物之裝載緩衝液呈中性pH。舉例而言，可在pH 7.0-8.0下，諸如在pH 7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0下進行層析。因此，例如，管柱之平衡緩衝液可呈中性pH及/或裝載至管柱上之起始組合物可呈中性pH。

如上文所提及，層析製程可包括在管柱裝載之後且在溶離之前的一或多個洗滌步驟。洗滌步驟可包含用在小於5.5之pH下或在pH 4.5-5.5下之酸性洗滌緩衝液洗滌包含經結合遮蔽抗體之蛋白質A層析管柱至少一次。在一些實施例中，至少一種酸性洗滌緩衝液係呈pH 4.7-5.4、pH 4.8、pH 4.9、pH 5、pH 5.1或pH 5.2。在一些實施例中，至少一種酸性洗滌緩衝液係呈pH 4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。

在一些實施例中，自初始洗滌至最終洗滌，可在增加酸性之緩衝液中進行洗滌。在一些實施例中，一或多個洗滌步驟可在管柱平衡緩衝液中進行，且接著可包括在酸性洗滌緩衝液(諸如上文所描述的乙酸洗滌緩衝液)中在酸性pH下進行的在溶離之前的至少一次最終洗滌步驟。

在洗滌之後，製程可包含在酸性溶離緩衝液中自蛋白質A管柱溶離遮蔽抗體以形成包含遮蔽抗體之蛋白質A溶離液。在一些實施例中，溶離緩衝液可比先前洗滌緩衝液更加酸性。遮蔽抗體可在酸性pH，諸如在小於4之pH或小於4.5之pH，或pH 2.5-4.5、pH 2.5-4、pH 3-4.5、pH 3-4、pH 2.5-3.8、pH 2.7-3.8、或pH 2.5-3.5、pH 2.6、pH 2.7、pH 2.8、pH 2.9、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5下自管柱溶離。

在一些實施例中，至少一種酸性洗滌緩衝液包含乙酸鹽。在一些實施例中，至少一種酸性洗滌緩衝液包含10-100 mM、10-90 mM、10-80 mM、10-70 mM、10-60 mM、10-50 mM、10-40 mM、15-30 mM、20-30 mM或25 mM乙酸鹽。在一些實施例中，特定言之在洗滌緩衝液包含乙酸鹽之情況下，溶離緩衝液包含乙酸。在一些實施例中，溶離緩衝液可包含0.05-0.2M、0.07-0.15M、0.07-0.13M、0.08-0.12M、0.09M、0.1M或0.11M乙酸鹽(諸如乙酸)。

在一些實施例中，至少一種酸性洗滌緩衝液包含麩胺酸鹽。在一些實施例中，至少一種酸性洗滌緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。在一些此類實施例中，溶離緩衝液包含麩胺酸。在一些實施例中，溶離緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸。

作為一非限制性實例，在一些實施例中，純化製程包含(a)在適合於使遮蔽抗體結合於蛋白質A層析管柱之條件下將包含遮蔽抗體之起始組合物裝載至蛋白質A層析管柱上；(b)用pH 4.5-5.5之酸性洗滌緩衝液洗滌包含經結合遮蔽抗體之蛋白質A層析管柱至少一次；以及(c)在pH 2.5-4之酸性溶離緩衝液中自蛋白質A管柱溶離遮蔽抗體以形成包含遮蔽抗體之溶離液。在一些實施例中，製程包含在(a)與(b)之間用pH 6-8之中性洗滌緩衝液(諸如呈pH 7-8 (諸如pH 7.5)下Tris緩衝液)及/或用pH 8.5-9.5之鹼性洗滌緩衝液(諸如呈pH 9之精胺酸緩衝液)洗滌管柱至少一次。

在一些實施例中，在蛋白質A層析之後，將組合物調整至酸性pH且在後續步驟之前培育。舉例而言，在一些實施例中，製程進一步包含將包含遮蔽抗體之溶離液之pH調整至pH 3-4.2、pH 3-4、pH 3.5-4、pH 3.6-4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4，以形成酸化溶離液。舉例而言，pH可使用乙酸(視情況1M乙酸)或磷酸(視情況0.5 M磷酸)調整。

在一些實施例中，蛋白質A層析製程包含平衡蛋白質A管柱且裝載呈中性pH，諸如pH 6-8、或pH 7-8、或pH 7.5之包含遮蔽抗體之樣本(上文步驟(a))，且視情況在步驟(a)後用pH 6-8之中性洗滌緩衝液(諸如pH 7-8 (諸如pH 7.5)之Tris緩衝液)洗滌管柱至少一次，隨後(b)用pH 4.5-5.5之酸性洗滌緩衝液洗滌包含結合遮蔽抗體之蛋白質A層析管柱至少一次；以及(c)在pH 2.5-4之酸性溶離緩衝液中自蛋白質A管柱溶離遮蔽抗體以形成包含遮蔽抗體之溶離液，其中酸性洗滌緩衝液及酸性溶離緩衝液包含如上所描述之乙酸鹽/乙酸。

在一些實施例中，蛋白質A層析製程包含平衡蛋白質A管柱且裝載呈中性pH，諸如pH 6-8、或pH 7-8、或pH 7.5之包含遮蔽抗體之樣本(上文步驟(a))，且視情況在步驟(a)後用pH 6-8下中性洗滌緩衝液(諸如呈pH 7至8 (諸如pH 7.5)之Tris緩衝液)洗滌管柱至少一次，且在步驟(a)後用pH 8.5-9.5之鹼性洗滌緩衝液(諸如呈pH 9之精胺酸緩衝液)洗滌管柱至少一次，隨後(b)用pH 4.5-5.5之酸性洗滌緩衝液洗滌包含結合遮蔽抗體之蛋白質A層析管柱至少一次；以及(c)在pH 2.5-4之酸性溶離緩衝液中自蛋白質A管柱溶離遮蔽抗體以形成包含遮蔽抗體之溶離液，其中酸性洗滌緩衝液及酸性溶離緩衝液包含如上所描述之麩胺酸鹽/麩胺酸。

在一些實施例中，接著將所收集的蛋白質A溶離液在酸性pH下培育一段時間。在一些實施例中，製程包含在調整pH後將蛋白質A層析溶離液培育4-30小時、6-30小時、10-30小時、4-20小時、6-20小時、8-20小時、10-20小時、4-18小時、6-18小時、8-18小時、10-18小時、8-16小時、10-16小時、8-14小時、10-14小時、11-13小時、10小時、11小時、12小時、13小時或14小時。在一些實施例中，溶離液係在室溫培育。在一些實施例中，組合物係在室溫在pH 3-4.2、pH 3-4、pH 3.5-4、pH 3.6-4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4下培育。

在一些實施例中，在培育之後，將溶離液之pH調整至pH 3.5-4.5、pH 3.5-4.3、pH 3.7-4.2、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5。在一些實施例中，當將pH調整至更加鹼性時，pH係使用Tris鹼(視情況1 M Tris鹼)調整。

在一些實施例中，可在培育之前或期間在酸性pH進行過濾步驟例如以移除另外的粒子或非蛋白材料。在一些實施例中，在深層過濾器上過濾溶離液。舉例而言，此過濾可在培育之前或之後進行。

在一些實施例中，相較於使用相同製程但無需在蛋白質A層析之後在酸性pH下培育數小時製備的遮蔽抗體組合物，在蛋白質A層析之後在酸性pH下培育減少最終遮蔽抗體組合物之聚集。

在一些實施例中，疏水性相互作用層析(HIC)製程係在蛋白質A層析之後，或在蛋白質A層析及低pH培育之後或在蛋白質A層析、低pH培育及過濾之後進行。如本文所描述，HIC製程可在中性pH下在低溫下進行，或可在酸性pH下進行。在HIC製程係在酸性pH下進行的情況下，在一些實施例中，自HIC至透濾/切向流過濾及病毒過濾之製程例如係在酸性pH下，諸如在pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.5-4、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5下進行。在一些實施例中，本文中之以HIC開始之製程係在pH 3.6-4，諸如pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4下進行。在一些情況下，其係在pH 4下進行。

在一些實施例中，HIC係在中性pH下進行，亦即管柱平衡緩衝液及含組合物之裝載緩衝液係呈中性pH。舉例而言，層析可在pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9下進行。在一些實施例中，HIC係在中性pH下進行，且在低pH培育及/或深層過濾之後，將溶離液冷卻至1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃之溫度。在一些實施例中，將冷卻溶離液之pH調整至pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9。在一些實施例中，該pH係使用Tris鹼，視情況1 M Tris鹼調整。在一些實施例中，HIC膜包含Sartobind®苯基，其包含纖維素膜主鏈上之苯基。在一些此類實施例中，HIC係在低溫，例如≤15℃或在1℃至15℃、或2℃至10℃、或4℃至15℃、或4℃至12℃、或4℃至8℃、或6℃至12℃、或6℃至10℃之範圍下進行。在一些實施例中，HIC係在1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃之溫度下且在中性pH下進行。因此，在一些實施例中，將平衡、裝載及洗滌緩衝液冷卻至例如≤15℃或冷卻至1℃至15℃、或1℃至10℃、或1℃至9℃、或2℃至8℃、或4℃至15℃、或4℃至12℃、或4℃至8℃、或6℃至12℃、或6℃至10℃之範圍，以將程序維持處於低溫。因此，在一些實施例中，HIC管柱裝載有冷卻、中性蛋白質A溶離溶液。在一些實施例中，HIC管柱亦可經預冷卻。在一些實施例中，洗滌緩衝液亦保持冷卻。在一些實施例中，低溫隨著pH升高至中性而減少溶液中之聚集。在一些實施例中，HIC管柱平衡、裝載組合物、洗滌緩衝液皆呈中性pH，例如pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9。

在一些實施例中，HIC洗滌緩衝液為檸檬酸鈉緩衝液。在一些實施例中，HIC洗滌緩衝液包含200-700 mM、或200-600 mM、或200-500 mM、或250-500 mM、或300-500 mM、或300-400 mM檸檬酸鈉。在各種實施例中，將遮蔽抗體收集於HIC流出物中。

在其他實施例中，HIC係在酸性pH下進行。在一些此類情況下，HIC可在室溫(亦即，15-28℃或18-25℃)而非低溫下進行。在此類情況下，可在蛋白質A層析之後，或在蛋白質A層析及低pH培育之後，或在蛋白質A層析、低pH培育及過濾之後將組合物之pH調整至pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.5-4、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5。在一些實施例中，pH可使用Tris鹼，視情況1 M Tris鹼調整。在一些實施例中，HIC樹脂包含丁基Sepharose®HP，其包含瓊脂糖主鏈上之脂族丁基。在一些實施例中，HIC樹脂為Capto Butyl ImpRes樹脂(具有丁基配位體之Capto鹼基質)、Capto Phenyl ImpRes (具有苯基配位體之Capto鹼基質)、Zetarous Dodecyl (C12) FF6，低取代物、Zetarous Dodecyl (C12) FF6，高取代物、Zetarous Hexadecyl (C16) FF6，低取代物，或Zetarous Hexadecyl (C16) FF6，高取代物。

在一些此類實施例中，HIC洗滌緩衝液為麩胺酸鹽緩衝液。在一些實施例中，HIC洗滌緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。在一些實施例中，HIC係在pH 3.6-4、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4下進行。

在一些實施例中，蛋白質A及HIC為經進行以製備遮蔽抗體組合物的唯一層析程序。在其他實施例中，進行其他層析，諸如在蛋白質A及HIC步驟之前或之後或在其之間。

在一些實施例中，在層析之後，將組合物中之遮蔽抗體進一步濃縮及/或將pH自中性調整至酸性及/或使溫度升高至室溫。

在一些實施例中，在HIC之後進行至少一個透濾步驟。在一些實施例中，透濾係藉由切向流過濾(TFF)進行。舉例而言，透濾可用於減小鹽(諸如檸檬酸鈉)濃度，將組合物重新平衡至酸性pH緩衝液，移除另外雜質以及進一步濃縮蛋白質。

在一些實施例中，製程包含第一次透濾，以將鹽(諸如檸檬酸鈉)濃度減小至低於40 mM、或低於35 mM、或低於30 mM、或低於25 mM、或低於20 mM、或低於15 mM、或低於10 mM、或低於5 mM，及/或以將緩衝液交換為例如特定鹽及濃度，諸如10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽，或10至100 mM、10至90 mM、20至80 mM、20至70 mM、30至50 mM、35 mM、40 mM或45 mM乙酸鹽，由此形成透濾HIC流出物。在一些實施例中，該第一次透濾係在1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃進行。在一些實施例中，製程進一步包含在乙酸鹽緩衝液或麩胺酸鹽緩衝液中進行第二透濾。在一些實施例中，第二次透濾係在室溫，視情況15-28℃或18-25℃進行。在一些實施例中，用於第二次透濾之乙酸鹽緩衝液包含10-100 mM、10-90 mM、20-80 mM、20-70 mM、30-50 mM、35 mM、40 mM或45 mM乙酸鹽。在一些實施例中，用於第二次透濾之麩胺酸鹽緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。在一些實施例中，在第二次透濾之前，將透濾HIC溶離液之pH調整至酸性pH，諸如調整至pH 3.5-4.5、pH 3.7-4.5、pH 3.7-4.3、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1或pH 4.2。在一些實施例中，將pH調整至pH 3.5至4.5，或pH 3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4或4.5。在一些實施例中，在將組合物交換成乙酸鹽緩衝液的情況下，使用25% v/v冰醋酸調整pH，以形成酸化透濾HIC流出物。

在一些實施例中，例如當HIC係在中性或非酸性pH下進行時，使酸化透濾HIC流出物經過超過濾(UF)以濃縮遮蔽抗體，例如形成濃縮之遮蔽抗體組合物。在一些實施例中，超過濾製程允許進一步濃縮遮蔽抗體，同時避免聚集。在一些實施例中，在超過濾之後，組合物中遮蔽抗體多肽之濃度為10-40 mg/mL、15-35 mg/mL、20-35 mg/mL或25-35 mg/mL。

替代地，例如當HIC係在酸性pH下進行時，超過濾步驟可能在透濾之前。在一些此類實施例中，在超過濾之前，將pH調整至＜pH 3.6、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 3.6至4。在一些實施例中，在超過濾之後，組合物中遮蔽抗體多肽之濃度為10-40 mg/mL、15-35 mg/mL、20-35 mg/mL或25-35 mg/mL。在此等實施例中，可使用超過濾溶離液進行透濾。

在一些實施例中，在層析及另外蛋白質濃縮之後，例如藉由其他過濾(諸如奈米過濾)使組合物經歷病毒移除或去活化。舉例而言，奈米過濾可在超過濾之後，例如在HIC係在低溫及中性pH下進行的情況下的實施例中。在其他實施例中，奈米過濾可在透濾及/或超過濾之前，諸如在HIC係在酸性pH及室溫進行的情況下的實施例中。

在一些實施例中，該奈米過濾係在室溫進行。在一些實施例中，該奈米過濾係在酸性pH下進行。在一些實施例中，酸性pH為pH 3-4.4、pH 3-4、pH 3.5-4、pH 3.6至4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3或pH 4.4。在一些實施例中，在HIC係在中性pH及低溫下進行的情況下，在HIC之後將組合物重新平衡至酸性pH，且在酸性pH下諸如藉由奈米過濾進行病毒移除。在一些此類實施例中，在降低pH之前、大致同時或之後將組合物之溫度增加至室溫。

在一些實施例中，考慮自起始組成至病毒移除之整個製程，製程之一或多個或每一中性pH步驟係在1℃至15℃之溫度下進行，及/或製程之一或多個或每一室溫步驟係在酸性pH下進行。在其他實施例中，在酸性pH下以蛋白質A管柱之酸性洗滌及溶離開始進行整個製程。

在一些實施例中，在病毒移除之後或另外在上述製程結束時，組合物可經進一步處理諸如以交換緩衝液，將其冷卻至低溫，或進一步濃縮遮蔽抗體或用於此等目的中之一些或全部。

在一些實施例中，經純化組合物中遮蔽抗體之最終濃度為10-40 mg/mL、15-35 mg/mL、20-35 mg/mL或25-35 mg/mL。舉例而言，在一些實施例中，在上述製程步驟後(亦即，在病毒移除後)，將組合物調配成水性調配物以供儲存或以供凍乾或以供立即使用。將組合物調配成水性調配物可經由緩衝液交換製程及/或經由奈米過濾期間使用的清洗溶液及/或藉由添加濃縮之調配物組分以達到所需最終濃度進行。調配步驟亦可包括進一步濃縮或稀釋遮蔽抗體。

在一些實施例中，至少包含遮蔽抗體及一或多種緩衝液成分的所得水性調配物之pH為pH 3.5至4.3，諸如pH 3.6至4.0、或pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5。

在一些實施例中，製程包括凍乾調配物之另一步驟。此製程可必然伴有視情況在存在凍乾保護劑物質的情況下冷卻乾燥水性調配物。在凍乾調配物的情況下，其可稍後復原成另一水性調配物，例如僅在使用之前。IV. 例示性抗體

抗體包括非人類抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體及飾面抗體、奈米抗體、dAbs、scFV's、Fabs以及類似物。一些此類抗體對癌細胞抗原具有免疫特異性，較佳在抗體結合時在細胞內可內化之細胞表面上的抗原。在一些實施例中，遮蔽抗體之抗體部分結合治療性抗原。此類治療性抗原包括可經靶向以供治療任何疾病或病症，包括(但不限於)癌症、自體免疫病症及感染的抗原。

可導引至抗體之目標包括癌細胞上之受體及其配位體或反受體(亦即，腫瘤相關抗原)。此類目標包括(但不限於)：CD3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD40、CD44、CD47、CD52、CD70、CD79a、CD123、Her-2、EphA2、淋巴球相關抗原1、VEGF或VEGFR、CTLA-4、LIV-1、結合蛋白-4、CD74、SLTRK-6、EGFR、CD73、PD-L1、CD163、CCR4、CD147、EpCam、Trop-2、CD25、C5aR、Ly6D、α v整合素、B7H3、B7H4、Her-3、葉酸受體α、GD-2、CEACAM5、CEACAM6、c-MET、CD266、MUC1、CD10、MSLN、唾液酸基Tn、路易Y、CD63、CD81、CD98、CD166、組織因子(CD142)、CD55、CD59、CD46、CD164、TGF β受體1 (TGFβR1)、TGFβR2、TGFβR3、FasL、MerTk、Axl、Clec12A、CD352、FAP、CXCR3及CD5。

在一些實施例中，本文所提供之遮蔽抗體可適用於治療自體免疫疾病。可由適用於治療自體免疫疾病之抗體結合的非限制性抗原包括TNF-α、IL-1、IL-2R、IL-6、IL-12、IL-23、IL-17、IL-17R、BLyS、CD20、CD52、α4β7整合素及α4-整合素。

適用於本文中所描述之遮蔽抗體的商業抗體及其目標之一些實例包括(但不限於)貝倫妥單抗(brentuximab)或貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、CD30、阿侖單抗(alemtuzumab)、CD52、利妥昔單抗(rituximab)、CD20、曲妥珠單抗(trastuzumab) Her/neu、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、EGFR、貝伐單抗(bevacizumab)、VEGF、帕利珠單抗(palivizumab)、RSV、阿昔單抗(abciximab)、GpIIb/IIIa、英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、戈利木單抗(golimumab) TNF-α、巴利昔單抗(baciliximab)、達利珠單抗(daclizumab)、IL-2R、奧馬珠單抗(omalizumab)、IgE、吉妥單抗(gemtuzumab)或伐達妥昔單抗(vadastuximab)、CD33、那他珠單抗(natalizumab)、VLA-4、維多珠單抗(vedolizumab) α4β7、貝利單抗(belimumab)、BAFF、奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab) CD3、奧伐木單抗(ofatumumab)、奧克珠單抗(ocrelizumab) CD20、依帕珠單抗(epratuzumab) CD22、阿倫單抗(alemtuzumumab) CD52、艾庫組單抗(eculizumab) C5、卡納基單抗(canakimumab) IL-1β、美泊利單抗(mepolizumab) IL-5、瑞利珠單抗(reslizumab)、托西利單抗(tocilizumab) IL-6R、優特克單抗(ustekinumab)、貝伐珠單抗(briakinumab) IL-12、貝伐珠單抗IL-23、hBU12 (CD19) (US20120294853)、人類化1F6或2F12 (CD70) (US20120294863)、BR2-14a及BR2-22a (LIV-1) (WO2012078688)。例示性抗 CD47 抗體

本發明調配物可包含經分離、重組及/或合成抗CD47人類、靈長類、嚙齒動物、哺乳動物、嵌合、人類化及/或CDR移植抗體之遮蔽版本。在某些例示性實施例中，本文中之調配物包含遮蔽人類化抗CD47 IgG1抗體。

在本發明之特定實施例中，人類化抗CD47抗體具有以下活性中之一或多者：1)相對於參考抗體(例如，鼠類親本抗體)之增強型抗原結合；2)相對於參考抗體(例如，鼠類親本抗體)之增強型抗體依賴性細胞毒性(ADCC)；3)相對於參考抗體(例如，鼠類親本抗體)之增強型噬菌作用(例如，抗體依賴性細胞噬菌作用(ADCP))；4)相對於參考抗體(例如，鼠類親本抗體)之減少的紅血球血球凝集(HA)；5)與三維(亦即，非線性) CD47抗原決定基之結合。抗體hB6H12.3及hB6H12.3 (去醯胺突變體)具有前述特性中之一或多者或所有，其中參考抗體為mB6H12。在一些實施例中，抗體hB6H12.3相對於鼠類B6H12抗體至少具有引起紅血球HA減少之特性。

可包括於本文中之遮蔽抗體中的例示性抗CD47抗體包括hB6H12.3 (hvH1/hvK3)或hB6H12.3 (去醯胺突變體) (hvH1/hvK3 G91A)之CD47抗體重鏈/輕鏈對。可在表3至表8發現例示性抗CD47抗體重鏈可變區序列、輕鏈可變區、重鏈CDR及輕鏈CDR。可在表9發現例示性人類化抗CD47抗體之重鏈及輕鏈之胺基酸序列。表3. hB6H12.3及hB6H12.3 (去醯胺突變體)之重鏈可變序列。Kabat CDR為帶下劃線的，且IMGT CDR為加粗的。

重鏈	序列
hvH1	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYG MS WVRQAPGKRLEWVATITSG GTYT YYPDSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYFCARSLAGNAMDY WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO: 22)

表4. hB6H12.3及hB6H12.3 (去醯胺突變體)之輕鏈可變可變序列。Kabat CDR為帶下劃線的，且IMGT CDR為加粗的。

輕鏈	序列
hvK3	EIVMTQSPDFQSVTPKEKVTLTCRASQTISDY LH WYQQKPDQSPKLLIK FAS QSIS GVPSRFSGSGSGSDFTLTINSLEAEDAATYYC QNGHGFPRT FGQGTKLEIK(R)(SEQ ID NO: 23)
hvK3 (G91A)	EIVMTQSPDFQSVTPKEKVTLTCRASQTISDY LH WYQQKPDQSPKLLIK FAS QSIS GVPSRFSGSGSGSDFTLTINSLEAEDAATYYC QN AHGFPRT FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO: 24)

表5. hB6H12.3及hB6H12.3 (去醯胺突變體)之重鏈CDR序列(Kabat)。

CDR	序列
hvH1 HCDR1 (Kabat)	GYGMS (SEQ ID NO: 25)
hvH1 HCDR2 (Kabat)	TITSGGTYTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 26)
hvH1 HCDR3 (Kabat)	SLAGNAMDY (SEQ ID NO: 27)

表6. hB6H12.3及hB6H12.3 (去醯胺突變體)之重鏈CDR序列(IMGT)。

CDR	序列
hvH1 HCDR1 (IMGT)	GFTFSGYG (SEQ ID NO: 28)
hvH1 HCDR2 (IMGT)	ITSGGTYT (SEQ ID NO: 29)
hvH1 HCDR3 (IMGT)	ARSLAGNAMDY (SEQ ID NO: 30)

表7. hB6H12.3及hB6H12.3 (去醯胺突變體)之輕鏈CDR序列(Kabat)。

CDR	序列
hvK3 LCDR1 (Kabat)	RASQTISDYLH (SEQ ID NO: 31)
hvK3 LCDR2 (Kabat)	FASQSIS (SEQ ID NO: 32)
hvK3 LCDR3 (Kabat)	QNGHGFPRT (SEQ ID NO: 33)
hvK3 (G91A) LCDR3 (Kabat)	QNAHGFPRT (SEQ ID NO: 34)

表8. hB6H12.3及hB6H12.3 (去醯胺突變體)之輕鏈CDR序列(IMGT)。

CDR	序列
hvK3 LCDR1 (IMGT)	QTISDY (SEQ ID NO: 35)
hvK3 LCDR2 (IMGT)	FAS (SEQ ID NO: 36)
hvK3 LCDR3 (IMGT)	QNGHGFPRT (SEQ ID NO: 37)
hvK3 (G91A) LCDR3 (IMGT)	QNAHGFPRT (SEQ ID NO: 38)

表9.根據本發明之一較佳實施例的遮蔽抗CD47抗體之完整重鏈及輕鏈序列。重鏈及輕鏈序列呈純文本形式，遮蔽序列呈加粗文本形式，且蛋白酶裂解序列為帶下劃線的。

抗體鏈	序列
重鏈版本1	QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKRLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(SEQ ID NO: 39)
重鏈版本2	QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMSWVRQAPGKRLEWVATITSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYFCARSLAGNAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ(SEQ ID NO: 40)
重鏈遮蔽序列	QGASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGS(SEQ ID NO: 41)
輕鏈	QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG EIVMTQSPDFQSVTPKEKVTLTCRASQTISDYLHWYQQKPDQSPKLLIKFASQSISGVPSRFSGSGSGSDFTLTINSLEAEDAATYYCQNGHGFPRTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 42)
輕鏈遮蔽序列	QGASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGS(SEQ ID NO: 43)

hB6H12.3

在某些例示性實施例中，抗CD47抗體包含來自闡述為SEQ ID NO: 22之HCVR的CDR及/或來自闡述為SEQ ID NO: 23之LCVR的CDR。在其他實施例中，抗CD47抗體包含SEQ ID NO: 25、26及27之重鏈CDR及/或SEQ ID NO: 31、32及33之輕鏈CDR。在一些實施例中，抗CD47抗體包含SEQ ID NO: 28、29及30之重鏈CDR及/或SEQ ID NO: 35、36及37之輕鏈CDR。在其他實施例中，抗CD47抗體包含HCVR/LCVR對SEQ ID NO: 22/SEQ ID NO: 23。在其他實施例中，抗CD47抗體包含HCVR，其與SEQ ID NO: 22具有至少約80%同源性或一致性(例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)，及/或包含LCVR，其與SEQ ID NO: 23具有至少約80%同源性或一致性(例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)。hB6H12.3 G91A

在某些例示性實施例中，抗CD47抗體包含來自闡述為SEQ ID NO: 22之HCVR的CDR及/或來自闡述為SEQ ID NO: 24之LCVR的CDR。在其他實施例中，抗CD47抗體包含SEQ ID NO: 25、26及27之重鏈CDR及/或SEQ ID NO: 31、32及34之輕鏈CDR。在一些實施例中，抗CD47抗體包含SEQ ID NO: 28、29及30之重鏈CDR及/或SEQ ID NO: 35、36及38之輕鏈CDR。在其他實施例中，抗CD47抗體包含HCVR/LCVR對SEQ ID NO: 22/SEQ ID NO: 24。在其他實施例中，抗CD47抗體包含HCVR，其與SEQ ID NO: 22具有至少約80%同源性或一致性(例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)，及/或包含LCVR，其與SEQ ID NO: 24具有至少約80%同源性或一致性(例如，80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)。

本文中所描述之抗CD47抗體通常以≦1 μM，例如≦100 nM，較佳≦10 nM，且更佳≦1 nM之均衡結合常量結合CD47，如使用標準結合分析(例如，基於Biacore®之結合分析)所量測。

用於本發明調配物中之抗體分子可相對於參考抗CD47抗體，例如B6H12、2D3、MABL、CC2C6或BRIC126表徵。抗體B6H12描述於例如美國專利第5,057,604號及美國專利第9,017,675號中，可購自Abcam, PLC, Santa Cruz Biotechnology, Inc.及eBioscience, Inc。糖基化變體

抗體可在其恆定區中之保守位置處經糖基化(Jefferis及Lund, (1997) Chem. Immunol. 65:111-128；Wright及Morrison, (1997) TibTECH 15:26-32)。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能(Boyd等人, (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318；Wittwe及Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180)及糖蛋白之部分之間的分子內相互作用，該相互作用可能影響糖蛋白之構形及所呈現之三維表面(Jefferis及Lund,同上；Wyss及Wagner, (1996) Current Op. Biotech. 7:409-416)。寡醣亦可用於使給定糖蛋白基於特定識別結構而靶向某些分子。舉例而言，已報導在無乳糖化(agalactosylated) IgG中，寡醣部分『跳』出CH2間空間且末端N-乙醯基葡糖胺殘基變得可用於結合甘露糖結合蛋白(Malhotra等人, (1995) Nature Med. 1:237-243)。自中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生之CAMPATH-1H (識別人類淋巴球之CDw52抗原的重組人類化鼠類單株IgG1抗體)移除寡醣之糖肽酶引起補體介導之裂解(CMCL)完全減少(Boyd等人, (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318)，而使用神經胺糖酸酶選擇性移除唾液酸殘基未引起DMCL損失。亦已報導抗體之糖基化影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。特定而言，據報導，具有α(1,4)-N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III (GnTIII) (催化等分GlcNAc之形成的糖基轉移酶)之四環素調節之表現的CHO細胞具有提高的ADCC活性(Umana等人(1999) Mature Biotech. 17:176-180)。

抗體之糖基化通常為N連接或O連接的。N連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為用於將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈的識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中之任一者之存在產生潛在糖基化位點。O連接之糖基化係指將糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者連接至羥胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥脯胺酸或5-羥基離胺酸。

抗體之糖基化變體為其中抗體之糖基化模式經更改的變體。更改意謂刪除抗體中發現之一或多個碳水化合物部分，將一或多個碳水化合物部分添加至抗體，改變糖基化之組成(糖基化模式)、糖基化程度等等。

將糖基化位點添加至抗體可藉由更改胺基酸序列以使得其含有上述三肽序列中之一或多者來實現(對於N-連接之糖基化位點)。亦可藉由向原始抗體之序列添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或該一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始抗體之序列來進行更改(對於O連接之糖基化位點)。類似地，移除糖基化位點可藉由抗體之天然糖基化位點內之胺基酸更改來實現。

胺基酸序列通常藉由更改潛在核酸序列而經更改。此等方法包括自天然來源分離(在天然存在之胺基酸序列變體的情況下)或藉由對抗體之早期製備變體或非變體型式進行寡核苷酸介導(或定點)突變誘發、PCR突變誘發及卡匣突變誘發來製備。

抗體之糖基化(包括糖基化模式)亦可在不更改胺基酸序列或潛在核苷酸序列的情況下經更改。糖基化很大程度上視用於表現抗體之宿主細胞而定。由於用於將重組糖蛋白(例如，抗體)表現為潛在治療劑之細胞類型為罕見天然細胞，因此可預期抗體之糖基化模式的明顯變化。參見例如，Hse等人, (1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070。除選擇宿主細胞之外，在重組產生抗體期間影響糖基化之因素包括生長模式、培養基調配物、培養物密度、加氧作用、pH、純化方案及其類似因素。已提出各種方法來更改特定宿主生物體中實現之糖基化模式，包括引入或過度表現涉及寡醣產生之某些酶(美國專利第5047335號、第5510261號、第5278299號)。可例如使用內切糖苷酶H (Endo H)以酶方式自糖蛋白移除糖基化或某些類型之糖基化。另外，重組宿主細胞可經基因工程改造以例如在處理某些類型之多醣中形成缺陷。此等及類似技術為此項技術中所熟知。

抗體之糖基化結構可容易地藉由碳水化合物分析之習知技術分析，包括凝集素層析、NMR、質譜分析、HPLC、GPC、單醣組成分析、依序酶促消化及HPAEC-PAD，其使用高pH陰離子交換層析以基於電荷分離寡醣。出於分析目的而釋放寡醣之方法亦為已知的，且包括(但不限於)酶促處理(通常使用肽-N-糖苷酶F/內-β-半乳糖進行)，使用惡劣鹼性環境進行消除以釋放主要O連接之結構，及使用無水肼之化學方法以釋放N連接及O連接之寡醣兩者。

抗體之糖基化修飾之較佳形式為減少的核心岩藻糖基化。「核心岩藻糖基化」係指在N-連接之聚醣之還原末端處將岩藻糖(「岩藻糖基化」)添加至N-乙醯基葡糖胺(「GlcNAc」)。

「複合N-糖苷連接之糖鏈」通常結合於天冬醯胺297 (根據Kabat之編號)。如本文中所用，複合N-糖苷連接之糖鏈具有二觸角複合糖鏈，其主要具有以下結構：

其中+/-指示糖分子可存在或不存在，且數字指示糖分子之間的鍵位置。在上文結構中，結合於天冬醯胺之糖鏈末端被稱為還原末端(在右側)，而相對側被稱為非還原末端。岩藻糖通常藉由α1,6鍵(GlcNAc之6位連接至岩藻糖之1位)通常結合於還原末端之N-乙醯基葡糖胺(「GlcNAc」)。「Gal」係指半乳糖，且「Man」係指甘露糖。

「複合N-醣苷連接之糖鏈」包括1)複合類型，其中核心結構之非還原末端側具有半乳糖-N-乙醯基葡糖胺(亦稱為「gal-GlcNAc」)之一或多個分支且Gal-GlcNAc之非還原末端側視情況具有唾液酸、等分N-乙醯基葡糖胺或其類似物；或2)混合類型，其中核心結構之非還原末端側具有高甘露糖N-醣苷連接之糖鏈及複合N-醣苷連接之糖鏈之分支兩者。

在一些實施例中，「複合N-醣苷連接之糖鏈」包括複合類型，其中核心結構之非還原末端側具有零個、一或多個半乳糖-N-乙醯基葡糖胺(亦稱為「gal-GlcNAc」)之分支且Gal-GlcNAc之非還原末端側視情況進一步具有諸如唾液酸、等分N-乙醯基葡糖胺或類似物之結構。

根據某些方法，僅少量岩藻糖併入至抗體之複合N-醣苷連接之糖鏈中。舉例而言，在各種實施例中，少於約60%、少於約50%、少於約40%、少於約30%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約5%或少於約3%之抗體分子藉由岩藻糖進行核心岩藻糖基化。在一些實施例中，約2%之抗體分子藉由岩藻糖進行核心岩藻糖基化。

在某些實施例中，僅少量之岩藻糖類似物(或岩藻糖類似物之代謝物或產物)併入至複合N-醣苷連接之糖鏈中。舉例而言，在各種實施例中，少於約60%、少於約50%、少於約40%、少於約30%、少於約20%、少於約15%、少於約10%、少於約5%或少於約3%之抗體藉由岩藻糖類似物或岩藻糖類似物之代謝物或產物進行核心岩藻糖基化。在一些實施例中，約2%之抗體藉由岩藻糖類似物或岩藻糖類似物之代謝物或產物進行核心岩藻糖基化。

藉由將產抗體細胞與岩藻糖類似物一起培育以製得未岩藻糖基化抗體(其可用於製得未岩藻糖基化遮蔽抗體)之方法描述於例如WO2009/135181中。簡言之，在岩藻糖類似物或岩藻糖類似物之胞內代謝物或產物之存在下培育已經工程改造以表現抗體之細胞。胞內代謝物可為例如經GDP改質之類似物或完全或部分去酯化類似物。舉例而言，產物可為完全或部分去酯化類似物。在一些實施例中，岩藻糖類似物可抑制岩藻糖補救路徑中之酶。舉例而言，岩藻糖類似物(或岩藻糖類似物之胞內代謝物或產物)可抑制岩藻糖激酶或GDP-岩藻糖-焦磷酸化酶之活性。在一些實施例中，岩藻糖類似物(或岩藻糖類似物之胞內代謝物或產物)抑制岩藻糖基轉移酶(較佳為1,6-岩藻糖基轉移酶，例如FUT8蛋白)。在一些實施例中，岩藻糖類似物(或岩藻糖類似物之胞內代謝物或產物)可抑制岩藻糖之重新合成路徑中的酶之活性。舉例而言，岩藻糖類似物(或岩藻糖類似物之胞內代謝物或產物)可抑制GDP-甘露糖4,6-去水酶及/或GDP-岩藻糖合成酶之活性。在一些實施例中，岩藻糖類似物(或岩藻糖類似物之胞內代謝物或產物)可抑制岩藻糖轉運體(例如，GDP-岩藻糖轉運體)。

在一個實施例中，岩藻糖類似物為2-氟岩藻糖(flurofucose)。使用生長培養基中之岩藻糖類似物及其他岩藻糖類似物之方法揭示於例如WO/2009/135181中，其以引用之方式併入本文中。

用於工程改造細胞株以減少核心岩藻糖基化之其他方法包括基因剔除(knock-outs)、基因敲入(knock-ins)及RNA干擾(RNAi)。在基因剔除中，編碼FUT8 (α1,6-岩藻糖基轉移酶)之基因不活化。FUT8催化岩藻糖基殘基自GDP-岩藻糖轉移至N-聚醣之Asn連接(N-連接)之GlcNac之位置6。據報導，FUT8為負責將岩藻糖添加至Asn297處N-連接之二觸角碳水化合物的唯一酶。基因敲入添加編碼諸如GNTIII或Golgi α甘露糖苷酶II之酶之基因。細胞中此類酶量之增加使自岩藻糖基化路徑轉向單株抗體(導致核心岩藻糖基化減少)，且具有增加量的二等分N-乙醯葡萄糖胺。RNAi通常亦靶向FUT8基因表現，導致mRNA轉錄物量減少或完全地剔除基因表現。此等方法中之任一者可用於產生能夠產生非岩藻糖基化抗體之細胞株。

多種方法可用於測定抗體上之岩藻糖基化之量。方法包括例如經由PLRP-S層析之LC-MS及電噴霧電離四極TOF MS。V. 抗體 - 藥物結合物

在某些實施例中，遮蔽抗體可包含抗體藥物結合物(ADC，在本文中亦稱為「免疫結合物」)。特定ADC可包含細胞毒性劑(例如化學治療劑)、前藥轉化酶、放射性同位素或化合物，或毒素(此等部分統稱為治療劑)。舉例而言，ADC可結合至細胞毒性劑，諸如化學治療劑或毒素(例如，細胞生長抑制劑或殺細胞劑，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、綠膿桿菌外毒素或白喉毒素)。細胞毒性劑之適用類別之實例包括例如DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、DNA烷基化劑、NAMPT抑制劑及微管蛋白抑制劑(亦即抗微管蛋白劑)。例示性細胞毒性劑包括例如奧瑞他汀、喜樹鹼、卡奇黴素、倍癌黴素、依讬泊苷、烯二炔抗生素、類美登素(例如DM1、DM2、DM3、DM4)、紫杉烷、苯并二氮呯(例如，吡咯并[l,4]苯并二氮呯、吲哚啉并苯并二氮呯及噁唑啶并苯并二氮呯，包括吡咯并[l,4]苯并二氮呯二聚體、吲哚啉并苯并二氮呯二聚體，及噁唑啶苯并二氮呯二聚體)、萊希菌素、紫杉烷、康柏斯達汀、念珠藻素，及長春花生物鹼。非限制性例示性細胞毒性劑包括奧瑞他汀E、AFP、AEB、AEVB、MMAF、MMAE、太平洋紫杉醇、多西他賽、小紅莓、(嗎啉基)-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、美法侖、甲胺喋呤、絲裂黴素C、CC-1065類似物、CBI、卡奇黴素、美登素、尾海兔素10之類似物、根瘤菌素，或沙海葵毒素、埃坡黴素A、埃坡黴素B、諾考達唑、秋水仙鹼、秋水醯胺、雌氮芥、西馬多丁、圓皮海綿內酯、艾榴塞洛素、微管蛋白裂解素、普魯卡布林，及美登素。

ADC可結合至前藥轉化酶。前藥轉化酶可以重組方式稠合至抗體或使用已知方法化學結合至該抗體。例示性前藥轉化酶為羧肽酶G2、β葡糖苷酸酶、青黴素-V-醯胺酵素、青黴素-G-醯胺酵素、β-內醯胺酶、β-葡糖苷酶、硝基還原酶及羧肽酶A。

用於將治療劑結合至蛋白質(且特定言之結合至抗體)之技術為熟知的。(參見例如，Alley等人, Current Opinion in Chemical Biology 2010 14: 1-9; Senter, Cancer J., 2008, 14(3): 154-169。)除非治療劑裂解完抗體(例如，藉由水解、藉由蛋白水解降解或藉由裂解劑)，否則其可以減小其活性之方式結合。在一些態樣中，當治療劑藉由表現抗原之癌細胞內化(例如，在核內體中或例如藉助於pH靈敏度或蛋白酶靈敏度，在溶酶體環境或小窩環境中(caveolear environment))時，治療劑藉由對在表現抗原之癌細胞之胞內環境中裂解敏感但對細胞外環境大體上不敏感的可裂解連接子連接至抗體，使得結合物自抗體裂解。在一些實施例中，治療劑亦可藉由不可裂解連接子連接至抗體。

在某些例示性實施例中，ADC可包括細胞毒性劑或細胞生長抑制劑與抗體之間的連接子區。如上文所提及，通常，連接子可在胞內條件下為可裂解的，使得連接子之裂解自胞內環境(例如，在溶酶體、或核內體、或胞膜窖內)中的抗體釋放治療劑。連接子可為例如藉由包括溶酶體或核內體蛋白酶之胞內肽酶或蛋白酶裂解的肽基連接子。裂解劑可包括組織蛋白酶B及D及纖維蛋白溶酶(參見例如，Dubowchik and Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999)。最典型的肽基連接子為可由存在於表現抗原之細胞中之酶裂解的肽基連接子。舉例而言，可使用可由在癌性組織中高度表現之硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶B裂解的肽基連接子(例如，包含Phe-Leu或Val-Cit肽之連接子)。

可裂解連接子可為pH敏感的，亦即對在某些pH值下水解敏感。通常，pH敏感性連接子可在酸性條件下水解。舉例而言，可使用可在溶酶體中水解的酸不穩定連接子(例如，腙、半卡巴腙、硫半卡巴肼、順式烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或類似物)。(參見例如，美國專利第5,122,368號；第5,824,805號；第5,622,929號；Dubowchik及Walker, Pharm. Therapeutics 83:67-123, 1999；Neville等人, Biol. Chem. 264: 14653-14661, 1989。)此類連接子在中性pH條件下，諸如血液中之pH條件下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0 (溶酶體之近似pH)下不穩定。

其他連接子可在還原條件下裂解(例如，二硫化物連接子)。二硫化物連接子包括可使用SATA (N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基硫基乙酸)、SPDP (N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB (N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)及SMPT (N-丁二醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)、SPDB及SMPT形成的彼等連接子。(參見例如，Thorpe等人, Cancer Res. 47:5924-5931, 1987；Wawrzynczak等人, In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel編, Oxford U. Press, 1987；亦參見美國專利第4,880,935號。)

連接子亦可為丙二酸酯連接子(Johnson等人, Anticancer Res. 15: 1387- 93, 1995)、順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基連接子(Lau等人, Bioorg-Med-Chem. 3: 1299-1304, 1995)或3'-N-醯胺類似物(Lau等人, Bioorg-Med-Chem. 3: 1305-12, 1995)。

連接子亦可為不可裂解連接子，諸如直接連接至治療劑且藉由抗體之蛋白水解降解而釋放的馬來醯亞胺基-伸烷基或順丁烯二醯亞胺-芳基連接子。

通常，連接子大體上不對細胞外環境敏感，意謂當ADC存在於細胞外環境中(例如，血漿中)時，ADC之樣本中不超過約20%、通常不超過約15%、更通常不超過約10%且甚至更通常不超過約5%、不超過約3%或不超過約1%之連接子裂解。連接子是否大體上不對細胞外環境敏感可以例如藉由以下測定：單獨地將血漿與(a) ADC (「ADC樣本」)及(b)相等莫耳量之未結合抗體或治療劑(「對照樣本」)培育預定時間段(例如，2、4、8、16或24小時)且接著將存在於ADC樣本中之未結合抗體或治療劑之量與存在於對照樣本中之未結合抗體或治療劑之量進行比較，如例如藉由高效液相層析所量測。

連接子亦可促進細胞內化。當結合至治療劑時(亦即，在如本文所描述之ADC或ADC衍生物連接子-治療劑部分之背景下)，連接子可促進細胞內化。替代地，當結合至治療劑及抗體兩者時(亦即，在如本文中所描述之ADC之背景下)，連接子可促進細胞內化。

抗體可經由抗體之雜原子結合至連接子。此等雜原子可以其天然狀態存在於抗體上或可引入至抗體中。在一些態樣中，抗體將經由離胺酸殘基之氮原子結合至連接子。在其他態樣中，抗體將經由半胱胺酸殘基之硫原子結合至連接子。將連接子及藥物-連接子結合至抗體之方法為此項技術中已知的。

例示性抗體-藥物結合物包括基於奧瑞他汀之抗體-藥物結合物，意謂藥物組分為奧瑞他汀藥物。已顯示奧瑞他汀結合微管蛋白干擾微管機構動力學及核及細胞分裂，且具有抗癌活性。通常，基於奧瑞他汀之抗體-藥物結合物包含奧瑞他汀藥物與抗體之間的連接子。連接子可為例如可裂解連接子(例如，肽基連接子)或不可裂解連接子(例如，藉由抗體之降解釋放的連接子)。奧瑞他汀包括MMAF及MMAE。例示性奧瑞他汀之合成及結構描述於美國公開案第7,659,241號、第7,498,298號、第2009-0111756號、第2009-0018086號及第7,968,687號中，其中之每一者以全文引用之方式且出於所有目的併入本文中。

其他例示性抗體-藥物結合物包括：類美登素抗體-藥物結合物，意謂藥物組分為類美登素藥物；及苯并二氮呯抗體藥物結合物，意謂藥物組分為苯并二氮呯(例如，吡咯并[l,4]苯并二氮呯二聚體、吲哚啉并苯并二氮呯二聚體及噁唑啶苯并二氮呯二聚體)。

在某些實施例中，抗體可與對不同目標具有結合特異性之ADC組合。可與遮蔽抗體組合的例示性ADC包括貝倫妥單抗維多汀(抗CD30 ADC)、因福土單抗維多汀(enfortumab vedotin) (抗結合蛋白-4 ADC)、拉迪拉單抗維多汀(ladiratuzumab vedotin) (抗LIV-1 ADC)、德甯土珠單抗馬佛多坦(denintuzumab mafodotin) (抗CD19 ADC)、格雷巴土木單抗維多汀(glembatumumab vedotin) (抗GPNMB ADC)、抗TIM-1 ADC、保納珠單抗維多汀(polatuzumab vedotin) (抗CD79b ADC)、抗MUC16 ADC、德帕土西珠單抗馬佛多坦(depatuxizumab mafodotin)、特意蘇單抗維多汀(telisotuzumab vedotin)、抗PSMA ADC、抗C4.4a ADC、抗BCMA ADC、抗AXL ADC、提索單抗維多汀(tisotuumab vedotin) (抗組織因子ADC)。VI. 遮蔽抗體表現

編碼遮蔽抗體之核酸可在宿主細胞中表現，該宿主細胞含有編碼本文中提供之抗體或遮蔽抗體的內源性DNA。此類方法為此項技術中所熟知，例如如美國專利第5,580,734號、第5,641,670號、第5,733,746號及第5,733,761號中所描述。亦參見例如Sambrook等人，同上，及Ausubel等人，同上。一般技術者瞭解可用於表現編碼本發明之蛋白質之核酸的諸多表現系統。適用於產生抗體、遮蔽抗體、其指定部分或變體的說明性細胞培養物為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞株統通常將呈細胞單層形式，但亦可使用哺乳動物細胞懸浮液或生物反應器。此項技術中已開發出能夠表現完整糖基化蛋白之多種適合宿主細胞株，且包括COS-1 (例如，ATCC CRL 1650)、COS-7 (例如，ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21 (例如，ATCC CRL-10)、CHO (例如，ATCC CRL 1610)及BSC-1 (例如，ATCC CRL-26)細胞株、hep G2細胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、HeLa細胞以及類似物，其容易地獲自例如弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas, VA)的美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)。亦可使用酵母及細菌性宿主細胞且為熟習此項技術者所熟知。適用於產生本發明之核酸或蛋白質的其他細胞為已知的及/或可獲自例如細胞株及雜交瘤之美國菌種保存中心目錄或其他已知或商業來源。

表現載體可包括以下表現控制序列中之一或多者，諸如(但不限於)：複製起點；啟動子(例如，後期或早期SV40啟動子、CMV啟動子(美國專利第5,168,062號、第5,385,839號)、HSV tk啟動子、pgk (磷酸甘油酸激酶)啟動子、EF-1 α啟動子(美國專利第5,266,491號)、至少一種人類免疫球蛋白啟動子；強化子，及/或處理資訊位點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點(例如，SV40大T Ag poly A添加位點)及轉錄終止子序列)。參見例如Ausubel等人，同上；Sambrook等人，同上。

表現載體視情況包括至少一種可選標記物。此類標記物包括例如(但不限於)甲胺喋呤(MTX)、二氫葉酸還原酶(DHFR，美國專利第4,399,216號；第4,634,665號；第4,656,134號；第4,956,288號；第5,149,636號；第5,179,017號)、安比西林(ampicillin)、新黴素(G418)、黴酚酸，或麩胺合成酶(GS，美國專利第5,122,464號；第5,770,359號；及第5,827,739號)、對於真核生物細胞培養物之抗性，及用於在大腸桿菌(E. coli)及其他細菌或原核生物中培養之四環素或安比西林抗性基因。用於上述宿主細胞之適當培養基及條件為此項技術中已知的。適合載體將為熟習此項技術者顯而易見的。將載體構築體引入至宿主細胞至可以藉由磷酸鈣轉染、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、陽離子脂質介導之轉染、電致孔、換能、感染或其他已知方法來實現。此類方法描述於此項技術中，諸如Sambrook同上；Ausubel，同上。

核酸插入物應以操作方式連接至適當啟動子。表現構築體將進一步含有用於轉錄開始、結束之位點，且在所轉錄區中含有用於轉譯之核糖體結合位點。由構築體表現之成熟轉錄物之編碼部分將較佳地包括適當地安置於待轉譯之mRNA之端處的開始及結束密碼子(例如，UAA、UGA或UAG)處引發的轉譯，其中UAA及UAG較佳用於哺乳動物或真核生物細胞表現。

核酸插入物視情況在具有纏繞線圈序列及/或MMP裂解序列之框內，例如在一或多個重鏈及/或輕鏈序列之胺基端處。替代地，可例如經由二硫鍵或類似物將纏繞線圈序列及/或MMP裂解序列轉譯後添加至抗體。

當採用真核宿主細胞時，通常將聚腺苷酸化或轉錄終止子序列併入至載體中。終止子序列之一實例為來自牛生長激素基因之多腺苷酸化序列。亦可包括用於準確剪接轉錄之序列。剪接序列之一實例為來自SV40之VP1內含子(Sprague,等人(1983) J. Virol. 45:773-781)。另外，如此項技術中已知，可將控制宿主細胞之複製的基因序列併入至載體中。VII. 治療性應用

在一些實施例中，藉由本文中所揭示之方法製備的遮蔽抗體組合物可用於治療性治療方法中可經本文提供之調配物治療的非限制性例示性疾病及病症包括癌症、自體免疫病症及感染。舉例而言，當抗體為抗CD47抗體時，本文中之調配物可用於治療與表現CD47之細胞相關之病症(例如癌症)之方法。該等細胞相對於並不與所關注病症相關之細胞可能表現或可能不表現升高量的CD47。因此，使用本文中所描述之遮蔽抗體提供一種治療個體(例如，患有癌症之個體)之方法。方法包含向有需要之個體投與有效量的抗CD47遮蔽抗體或包含抗CD47遮蔽抗體之組合物。

可以多種方式量測癌症之陽性治療效果(參見，W. A. Weber, J. Null. Med. 50:1S-10S (2009)；Eisenhauer等人, 同上)。在一些較佳實施例中，使用RECIST 1.1準則評估對遮蔽抗體之反應。在一些實施例中，藉由治療有效量達成之治療為以下中之任一者：部分反應(PR)、完全反應(CR)、無進展存活期(PFS)、存活期(DFS)、客觀反應(OR)或總存活期(OS)。本文所描述之可有效治療原發性或繼發性肝癌患者之療法的給藥方案可根據諸如以下之因素變化：患者之疾病病況、年齡及體重，及該療法引發個體之抗癌反應的能力。雖然本發明之治療方法、藥劑及用途之實施例可能無法有效地在每位個體中達成陽性治療效果，但其應採用相關技術中已知之任何統計試驗法，在統計學上顯著數量之個體中測定，諸如史都登氏t試驗法(Student's t-test)、chi2-試驗法、根據曼及惠特尼之U試驗法(U-test according to Mann and Whitney)、克拉斯卡-瓦立斯試驗法(Kruskal-Wallis test) (H-試驗法)、瓊克希爾-特普斯特拉試驗法(Jonckheere-Terpstra-test)及威爾科克森試驗法(Wilcoxon-test)。

如本文所使用，「RECIST 1.1反應準則」意謂視需要基於量測反應時之背景，在Eisenhauer等人, E.A.等人, Eur. J Cancer 45:228-247 (2009)中針對目標病灶或非目標病灶闡述的定義。

應用於經診斷患有或懷疑具有原發性或繼發性肝癌之個體之「腫瘤」係指任何大小之惡性或可能惡性的贅瘤或組織塊狀物。實體腫瘤為通常不含囊腫或液體區域的組織之異常生長或塊狀物。不同類型之實體腫瘤係依據形成該腫瘤之細胞類型命名。實體腫瘤之實例為肉瘤、癌瘤及淋巴瘤。白血病(血液癌)通常不形成實體腫瘤(國家癌症學會(National Cancer Institute)，癌症術語詞典(Dictionary of Cancer Terms))。非限制性例示性肉瘤包括軟組織肉瘤及骨肉瘤。

「腫瘤負荷」係指分佈在整個身體內的腫瘤物質之總量。腫瘤負荷係指整個身體中之癌細胞之總數目或腫瘤總大小，包括淋巴結及骨髓。腫瘤負荷可藉由此項技術中已知之多種方法測定，諸如(例如)在自個體移出之後例如使用測徑規量測腫瘤之尺寸，或當在身體內時使用成像技術，例如超音波、骨骼掃描、電腦斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)掃描來測定。

術語「腫瘤大小」係指可量測為腫瘤之長度及寬度的腫瘤之總大小。腫瘤大小可藉由此項技術中已知之多種方法測定，諸如在自個體移出之後例如使用測徑規量測腫瘤之尺寸，或當在身體內時使用成像技術，例如骨骼掃描、超音波、CT或MRI掃描來測定。

可使用遮蔽抗體治療的非限制性例示性自體免疫疾病包括克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、僵直性脊椎炎、葡萄膜炎、幼年特發性關節炎、多發性硬化症、牛皮癬(包括斑塊型牛皮癬)、全身性紅斑性狼瘡症、伴有多血管炎之肉芽腫、顯微多血管炎、全身性硬化症、特發性血小板減少性紫癜、移植物抗宿主病及自體免疫血球減少症。

如本文中所使用，術語「有效量」係指足以影響有益的或所需結果的化合物(例如，遮蔽抗體)之量。有效量可以一或多次投藥、施藥或給藥來投藥且不意欲受限於特定調配物或投藥途徑。大體而言，治療有效量之活性組分在0.01 mg/kg至100 mg/kg、0.1 mg/kg至100 mg/kg、1 mg/kg至100 mg/kg、0.01 mg/kg至10 mg/kg、0.1 mg/kg至10 mg/kg、1 mg/kg至10 mg/kg之範圍內。所投與劑量可視已知因素而變化，諸如特定試劑之藥效學特徵及其投藥模式及途徑；接受體之年齡、健康及體重；待治療之疾病或跡象之類型及程度、症狀之性質及程度、並行治療之種類、治療之頻率及所需效果。初始劑量可增加超出上限含量，以快速達成所需血液含量或組織含量。替代地，初始劑量可小於最佳劑量且日劑量可在治療方法中逐漸地增加。人類劑量可例如在經設計以自0.5 mg/kg運行至20 mg/kg之習知階段I劑量遞增研究中經最佳化。給藥頻率可視諸如投藥途徑、劑量、抗體之血清半衰期及所治療之疾病的因素而變化。例示性給藥頻率為每天一次、每週一次及每兩週一次。基於單株抗體之藥物之調配物在本領域的一般技術內。在一些實施例中，單株抗體經凍乾，且接著在投藥時，復原於緩衝生理食鹽水中。

在某些例示性實施例中，本發明提供一種治療細胞、組織、器官、動物或患者之癌症的方法。在特定實施例中，本發明提供一種用於治療人類之實體癌之方法。舉例而言，待藉由抗CD47抗體治療之例示性癌症為在具有癌症之細胞中擁有CD47表現的彼等癌症(亦即，「表現CD47之癌症」)。癌症之實例包括(但不限於)實體腫瘤、軟組織腫瘤、引起實體腫瘤之造血腫瘤及轉移性病變。具有引起實體腫瘤可能性的造血腫瘤之實例包括(但不限於)彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤、骨髓發育不良症候群(MDS)、淋巴瘤、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、惡性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、多發性骨髓瘤、理查特氏症候群(理查特氏轉變(Richter's Transformation))及類似腫瘤。實體腫瘤之實例包括(但不限於)各種器官系統之惡性腫瘤，例如肉瘤(包括軟組織肉瘤及骨肉瘤)、腺癌及癌瘤，諸如影響頭部及頸部(包括咽部)、甲狀腺、肺(小細胞或非小細胞肺癌(NSCLC))、乳房、淋巴、胃腸道(例如，口腔、食道、胃、肝、胰臟、小腸、結腸及直腸、肛管)、生殖器及泌尿生殖道(例如，腎、尿道上皮、膀胱、卵巢、子宮、宮頸、子宮內膜、前列腺、睪丸)、中樞神經系統(例如，神經或膠細胞，例如神經母細胞瘤或神經膠質瘤)、皮膚(例如，黑素瘤)及類似器官的彼等惡性腫瘤。在某些實施例中，實體腫瘤為NMDA受體陽性畸胎瘤。在其他實施例中，癌症選自乳癌、結腸癌、胰臟癌(例如，胰臟神經內分泌腫瘤(PNET)或胰管腺癌(PDAC))、胃癌、子宮癌及卵巢癌。

在某些實施例中，癌症選自(但不限於)白血病類，諸如急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病(HCL)、T細胞前淋巴球性白血病(T-PLL)、大顆粒淋巴球性白血病、成人T細胞白血病及急性單核球性白血病(AMoL)。

在一個實施例中，癌症為與腹水相關之實體腫瘤。腹水為許多癌症類型之症狀且亦可由多種病況，諸如晚期肝病引起。可能產生腹水之癌症類型包括(但不限於)乳癌、肺癌、大腸(結腸)癌、胃癌、胰臟癌、卵巢癌、子宮(子宮內膜)癌、腹膜癌及類似癌症。在一些實施例中，與腹水相關之實體腫瘤選自乳癌、結腸癌、胰臟癌、胃癌、子宮癌及卵巢癌。在一些實施例中，癌症與胸膜積液相關，例如肺癌。

引起實體腫瘤之另外血液癌包括(但不限於)非霍奇金氏淋巴瘤(例如，彌漫性大B細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、B淋巴母細胞性淋巴瘤、周邊T細胞淋巴瘤及伯基特氏淋巴瘤)、B淋巴母細胞性淋巴瘤；B細胞慢性淋巴球性白血病/小淋巴球性淋巴瘤；淋巴漿細胞淋巴瘤；脾邊緣區B細胞淋巴瘤(±絨毛淋巴球)；漿細胞骨髓瘤/漿細胞瘤；MALT類型之結外邊緣區B細胞淋巴瘤；結邊緣區B細胞淋巴瘤(±單細胞狀B細胞)；濾泡性淋巴瘤；彌漫性大B細胞淋巴瘤；伯基特氏淋巴瘤；前體T-淋巴母細胞性淋巴瘤；T成年T細胞淋巴瘤(HTLV1-陽性)；結外NK/T細胞淋巴瘤，鼻部類型；腸病型T細胞淋巴瘤；肝脾γ-δ T細胞淋巴瘤；類皮下脂層炎T細胞淋巴瘤；蕈樣黴菌病/塞紮萊症候群(mycosis fungoides/sezary syndrome)；多形性大細胞淋巴瘤、T/零位細胞，原發性皮膚類型；多形性大細胞淋巴瘤、T/零位細胞、原發性全身性類型；周邊T細胞淋巴瘤，不另外表徵；血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、紅血球增多症或骨髓纖維化、皮膚T細胞淋巴瘤、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、邊緣區淋巴瘤、CNS淋巴瘤、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前體B淋巴母細胞性淋巴瘤及類似者。

在特定實施例中，癌症為肉瘤、結腸直腸癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、胃癌、黑素瘤及/或乳癌。

如本文中所描述之抗CD47抗體及遮蔽抗體亦可用於治療與癌症相關之病症，例如癌症誘導之腦病。

本發明之組合物可用於與其他治療劑及/或模態組合的治療方法中。如本文中所用，術語「組合」投與應理解為意謂在患有病症之個體之病痛時程期間向個體遞送兩種(或更多)不同的治療，使得治療對患者之影響在一時間點處重疊。在某些實施例中，當開始遞送第二種治療時，第一種治療之遞送仍存在，使得就投藥而言存在重疊。此在本文中有時係指「同步」或「同時遞送」。在其他實施例中，一種治療之遞送在另一治療之遞送開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，療法由於組合投藥而更有效。舉例而言，與在不存在第一治療之情況下投與第二治療時所發現相比，第二治療更有效，例如使用較少第二治療即可發現同等效果，或第二治療更大程度減少症狀，或對於第一治療可發現類似情形。在一些實施例中，遞送使得症狀減輕，或與病症相關之其他參數大於將在無另一治療存在下遞送一種治療觀測到的參數。兩種治療之效果可部分累加、完全累加或大於累加(亦即，協同性反應)。遞送可使得在遞送第二治療時仍可偵測到所遞送的第一治療之效果。

在一個實施例中，本發明之方法包括向個體投與如本文所描述之遮蔽抗體，例如組合物或製劑以及一或多種另外療法，例如手術或投藥另一治療性製劑。在癌症之情況下，例如另外療法可包括化學療法，例如細胞毒性劑。在一個實施例中，另外療法可包括靶向療法，例如酪胺酸激酶抑制劑、蛋白酶體抑制劑或蛋白酶抑制劑。在一個實施例中，另外療法可包括消炎、抗血管生成、抗纖維化或抗增殖化合物，例如類固醇、生物免疫調節劑，諸如免疫檢查點分子之抑制劑、單株抗體、抗體片段、適體、siRNA、反義分子、融合蛋白、細胞介素、細胞介素受體、支氣管擴張劑、士他汀(statin)、消炎劑(例如，甲胺喋呤)或NSAID。在另一實施例中，另外療法可包括將不同類別的治療劑組合。可同時或依序投與抗體或遮蔽抗體製劑及另外療法。

如本文中所用，「免疫檢查點分子」係指上調信號(刺激分子)或下調信號(抑制性分子)的免疫系統中之分子。許多癌症藉由抑制T細胞傳導避開免疫系統。因此，此等分子可作為另外治療劑用於癌症治療中。在其他情況下，遮蔽抗體可為免疫檢查點分子。

例示性免疫檢查點分子包括(但不限於)計劃性細胞死亡蛋白1 (PD-1)、計劃性死亡配位體1 (PD-L1)、PD-L2、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA-4)、含T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域3 (TIM-3)、淋巴球活化基因3 (LAG-3)、癌胚抗原相關之細胞黏附分子1 (CEACAM-1)、CEACAM-5、T細胞活化之V域Ig抑制因子(VISTA)、B及T淋巴球衰減因子(BTLA)、具有Ig域及ITIM域之T細胞免疫受體(TIGIT)、白細胞相關免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)、CD160、TGFR、腺苷2A受體(A2AR)、B7-H3 (亦稱為CD276)、B7-H4 (亦稱為VTCN1)、吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)、2B4、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)及類似物。

如本文中所用，「免疫檢查點抑制劑」係指抑制及/或阻斷一或多種抑制性檢查點分子的分子(例如，小分子、單株抗體、抗體片段等等)。

例示性免疫檢查點抑制劑包括(但不限於)以下單株抗體：PD-1抑制劑，諸如派立珠單抗(pembrolizumab) (Keytruda, Merck)及納武單抗(nivolumab) (Opdivo, Bristol-Myers Squibb)；PD-L1抑制劑，諸如阿特珠單抗(atezolizumab) (Tecentriq, Genentech)、阿維魯單抗(avelumab) (Bavencio, Pfizer)、德瓦魯單抗(durvalumab) (Imfinzi, AstraZeneca)；及CTLA-1抑制劑，諸如伊派利單抗(ipilimumab) (Yervoy, Bristol-Myers Squibb)。

例示性細胞毒性劑包括抗微管劑、拓樸異構酶抑制劑、抗代謝物、蛋白合成及降解抑制劑、有絲分裂抑制劑、烷基化劑、鉑類試劑、核酸合成抑制劑、組蛋白去乙醯基酶抑制劑(HDAC抑制劑，例如伏立諾他(vorinostat) (SAHA、MK0683)、恩替諾他(entinostat) (MS-275)、帕比諾他(panobinostat) (LBH589)、曲古黴素A (TSA)、莫塞諾他(mocetinostat) (MGCD0103)、貝林諾他(belinostat) (PXD101)、羅米地辛(romidepsin) (FK228、縮酚酞))、DNA甲基轉移酶抑制劑、氮芥、亞硝基脲、伸乙亞胺、烷基磺酸鹽、三氮烯、葉酸類似物、核苷類似物、核糖核苷酸還原酶抑制劑、長春花生物鹼、紫杉烷、埃博黴素、插入劑、能夠干擾信號轉導路徑之試劑、促進細胞凋亡及輻射之試劑或結合表面蛋白以遞送毒性劑之抗體分子結合物。在一個實施例中，可與本文中所描述之製劑一起投與的細胞毒性劑為基於鉑之試劑(諸如順鉑(cisplatin))、環磷醯胺、達卡巴嗪(dacarbazine)、甲胺喋呤、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitabine)、羥基尿素(hydroxyurea)、拓朴替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、氮胞苷(azacytidine)、伏立諾他(vorinostat)、伊沙匹隆(ixabepilone)、硼替佐米(bortezomib)、紫杉烷(例如，太平洋紫杉醇或多西他賽)、細胞遲緩素(cytochalasin) B、短桿菌素(gramicidin) D、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞賓(vinorelbine)、秋水仙鹼、蒽環類(例如，小紅莓或表柔比星(epirubicin))、道諾黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D、阿德力黴素(adriamycin)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、蓖麻毒素或類美登素。

方法及組合物可用於治療患有CD47陽性癌症之個體。在一個實施例中，CD47陽性癌症表現一或多種基質金屬蛋白酶(MMP)。例示性MMP包括(但不限於) MMP1至MMP28。特定例示性MMP包括MMP2及MMP9。在一個實施例中，CD47陽性癌症為其中存在浸潤性巨噬細胞之腫瘤。

本發明之方法及組合物可用於治療患有CD47陽性癌症之個體，該CD47陽性癌症表現一或多種MMP且含有浸潤性巨噬細胞。

測定CD47陽性癌症之存在、MMP表現及腫瘤浸潤性巨噬細胞之存在的方法為此項技術中已知的。

個體之CD47陽性癌症之評定可藉由習知方法測定，該等方法包括免疫組織化學(IHC)、西方墨點法(Western blot)、流式細胞術或RNA測序方法。IHC、西方墨點法及流式細胞術可分析此項技術中已知之任何抗CD47抗體以及本文所揭示之抗CD47抗體。

組織中之巨噬細胞浸潤評定可藉由利用包括免疫組織化學(IHC)、西方墨點法、流式細胞術或RNA測序方法之習知方法監測巨噬細胞之表面標記物(包括小鼠巨噬細胞之F4/80或CD163、CD68或CD11b)來進行。

組織中之蛋白酶評定可使用多種技術進行監測，包括監測蛋白酶活性之彼等技術以及可偵測蛋白分解活性之彼等技術兩者。可偵測組織中之蛋白酶之存在(其可包括蛋白酶之非活性及活性形式兩者)的習知方法包括IHC、RNA測序、西方墨點法或基於ELISA之方法。另外技術可用於偵測組織中之蛋白酶活性，包括酶譜法、利用螢光顯微法之原位酶譜法或使用螢光蛋白水解受質。另外，螢光蛋白水解受質之使用可與特定蛋白酶之免疫捕獲組合。另外，針對蛋白酶之活性位點的抗體可由多種技術使用，包括IHC、螢光顯微法、西方墨點法、ELISA或流式細胞術(參見，Sela-Passwell等人, Nature Medicine. 18:143-147. 2012；LeBeau等人, Cancer Research. 75:1225-1235. 2015；Sun等人, Biochemistry. 42:892-900. 2003；Shiryaev等人, 2:e80. 2013)。VIII. 醫藥組合物及調配物

出於醫療用途，遮蔽抗體較佳地與醫藥學上可接受之載劑組合。如本文中所用，「醫藥學上可接受之載劑」意謂與合理益處/風險比相稱的適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症的緩衝液、載劑及賦形劑。載體應在與調配物之其他成分相容且不對接受者有害之意義上為「可接受的」。醫藥學上可接受之載劑包括與醫藥投藥相容之緩衝液、溶劑、分散介質、包衣、等張劑及吸收延遲劑及類似物。此類介質及藥劑用於醫藥學上活性之物質的用途為此項技術中已知的。

因此，藉由本發明之製程製得的經純化遮蔽抗體調配物可經調配以包含任何適合賦形劑中之至少一者，諸如(但不限於)稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩衝液、鹽、親油性溶劑、防腐劑、佐劑或類似物。醫藥學上可接受之賦形劑為較佳的。製備此類無菌溶液之非限制性實例及方法為此項技術中所熟知的，諸如(但不限於) Gennaro編, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990中所描述之彼等實例及方法。可常規地選擇適用於抗體分子亦及此項技術中已知或如本文中所描述之片段或變體組合物之投藥模式、溶解度及/或穩定性的醫藥學上可接受之載劑。

在一些實施例中，遮蔽抗體之組合物為水性調配物。在其他實施例中，組合物經凍乾。在任一情況下，組合物可包含緩衝液以及包含第一及第二遮蔽域之遮蔽抗體，此等域分別連接至抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些實施例中，遮蔽域包含形成纏繞線圈之多肽。因此，在一些實施例中，藉由本文中之製程純化且接著經調配之遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含連接至抗體之重鏈可變區的纏繞線圈域；及第二遮蔽域，其包含連接至抗體之輕鏈可變區的纏繞線圈域，其中第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，第一遮蔽域包含序列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 4)及/或第二遮蔽域包含序列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 3)。

製備用於如本文所揭示之經純化遮蔽抗體的醫藥調配物可以單位劑型呈現，或可以適用於供應超過一個單位劑量之形式儲存。醫藥組合物應調配為與其預期投藥途徑相容。凍乾調配物通常在投藥或使用之前復原於溶液中，而水性調配物可為「即用型(ready to use)」，意謂其係直接投藥，而無需例如在使用之前首先稀釋，或可稀釋於生理鹽水或另一溶液中。

投藥途徑之實例為靜脈內(IV)、皮內、瘤內、吸入、經皮、局部、經黏膜及直腸投藥。如本文所用，片語「非經腸投藥(parenteral administration/administered parenterally)」意謂除經腸及局部投藥之外的投藥模式，通常為注射，且包括(但不限於)靜脈內、肌肉內、皮下、動脈內、鞘內、囊內、眶內、玻璃體內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、吸入、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。

醫藥調配物較佳為無菌的。滅菌可藉由任何適合方法，例如經由無菌過濾膜過濾實現。當組合物經凍乾時，可在凍乾及復原之前或之後進行過濾滅菌。

本發明亦提供一種套組，其包含封裝材料及至少一個瓶，該瓶包含如本文中所描述之遮蔽抗體之水性調配物。套組可進一步包含使用說明書及/或稀釋劑溶液(若抗體調配物必須在使用之前經稀釋)。本發明亦提供一種套組，其包含封裝材料及至少一個瓶，該瓶包含如本文中所描述之遮蔽抗體之凍乾調配物。套組可進一步包含使用說明書、用於將抗體復原成溶液之復原溶液，及/或稀釋劑溶液(若抗體調配物必須在復原後進一步稀釋)。實例實例1：具有不同pH之調配物中抗CD47遮蔽抗體Vel-IPV-hB6H12.3之穩定性

在抗CD47之遮蔽抗體Vel-IPV-hB6H12.3 (本文中亦稱為「CD47M」)之調配物中評估聚集之pH依賴性。高分子量(HMW)抗體物種百分比隨時間之增加表明正發生聚集。

使Vel-IPV-hB6H12.3經由滲析而緩衝液交換至以下調配物中(在存在及不存在150 mM氯化鈉的情況下研究的各pH條件)：20 mM乙酸鹽pH 4、20 mM組胺酸pH 5、20 mM組胺酸pH 6、20 mM磷酸鉀pH 7及20 mM磷酸鉀pH 8。用適當緩衝液將樣本稀釋至大約5 mg/mL，填充至玻璃瓶中且儲存於25℃直至所指示時間點。如下，藉由尺寸排外超高效液相層析(SE-UPLC)進行分析。

SE-UPLC分析用於量測Vel-IPV-hB6H12.3之高分子量(HMW)、主峰(MP)及低分子量(LMW)形式。對於SE-UPLC分析，Vel-IPV-hB6H12.3之大小分佈係經由用86% 25 mM磷酸鈉、480 mM氯化鈉pH 6.6加14%異丙醇等濃度沖提分離使用連接至U-HPLC (Waters I-Class)之ACQUITY Protein BEH SEC管柱(4.6 × 300 mm)達成。總運行時間在0.3毫升/分鐘之流速下為20分鐘。偵測係在220 nm下進行。

pH 4之調配物控制HMW聚集且促進在25℃培育3天後(圖1A)，尤其在低鹽中Vel-IPV-HB6H12.3之穩定性。相比之下，pH 5-8之調配物中觀察到相對較高HMW量。添加鹽增加pH 4之調配物之HMW量，並不影響pH 5之調配物之HMW量，且減小pH 6-8之調配物之HMW量。

在Vel-IPV-hB6H12.3濃度為大約5 mg/mL之情況下測定pH 4 (20 mM乙酸鹽)及pH 6 (20 mM組胺酸)之調配物隨時間推移的穩定性(圖1B)。pH 6之調配物為典型抗體調配物，但在25℃培育的情況下隨時間推移發現HMW Vel-IPV-hB6H12.3量增加。因此，在pH 6之標準調配物中，Vel-IPV-hB6H12.3在製造通常所需的處理時間期間具有不足的液體穩定性。

相比之下，pH 4之調配物並未在25℃培育的情況下隨時間推移展示增加的HMW Vel-IPV-hB6H12.3量。此等資料表明Vel-IPV-hB6H12.3不易在低pH下聚集。實例2a.例示性抗體純化製程

研發用於Vel-IPV-hB6H12.3遮蔽抗體之純化製程，包括採集步驟、一系列過濾步驟及抗體之調配。用於遮蔽抗體之此純化製程包括在中性pH下進行之純化步驟之冷卻。對於在室溫進行之步驟，使產物集合保持處於低pH。發現此等修改提高遮蔽抗體穩定性且減少聚集。採集

採集2000 L CHO細胞樣本。採集製程產生含有遮蔽抗體之細胞溶解物。接著過濾樣本以移除細胞碎片、污染物及雜質。過濾係藉由Cuno 05SP01A、Cuno 90ZB08A及Emphaze混合純化器及0.2 µm過濾器進行。在進一步處理之前使所採集細胞培養物流體保持冷卻，以減少微生物生長。使所有其他溶液保持處於室溫，且在室溫(18-25℃)下進行處理。

在採集過濾後，使樣本經歷蛋白質A層析。蛋白質 A 層析

蛋白質A層析係藉由封裝於BPG30管柱中之GE MabSelect®SuRe進行。將蛋白質A層析參數提供於表2中。表2.蛋白質A層析參數

步驟	緩衝液	體積(CV)	流速(cm/h)
平衡	25 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.5	5.0	300
裝載	HCCF (採集細胞培養流體)	(達25 g/L樹脂裝載)	300
第1次洗滌	25 mM Tris，50 mM NaCl，pH 7.5	2.5	300
第2次洗滌	25 mM Tris，500 mM NaCl，pH 7.5	3.0	300
第3次洗滌	25 mM Tris，50 mM NaCl，pH 7.5	2.5	300
第4次洗滌	25 mM乙酸鈉，pH 5.0	3.0	300
溶離	0.1 M乙酸	4.0*	300

CV =管柱體積 *在2 mm路徑長度下自A280 200 mAU遞升-200 mAU遞減收集溶離液

限制樹脂裝載以減少聚集，其中最大裝載為25 g/L。

在pH 5下進行蛋白質A層析期間的最終洗滌步驟(第4次洗滌)改良結果。相較於在無此等步驟中之一或兩者的情況下進行的層析，第4次洗滌及溶離溶液(0.1 M乙酸)之組合減少抗體聚集。

在溶離之後，用1 M乙酸將溶離液滴定至pH 3.6且保持90分鐘(18-25℃)以用於低pH病毒去活化。在完成病毒去活化時，在室溫(18-25℃)下在pH 3.6下使溶離液保持12-24小時。在低pH下之此延長保持進一步去聚集溶離液中之抗體。在保持低pH後，用1 M Tris鹼將pH調整至4.0，隨後進行深層過濾。深層過濾

深層過濾器用於另外雜質清除(例如，用於清除宿主細胞蛋白質及DNA)。限制過濾器裝載以確保充分減少雜質進入下游步驟中。pH 4下進行之深層過濾有助於維持抗體穩定性且減少聚集。

在用20 mM乙酸鈉，pH 4平衡之Millipore®X0HC POD上進行深層過濾。按體積收集樣本。使深層濾液集合保持處於2-8℃以準備用於疏水性相互作用層析(HIC)。疏水性相互作用層析

在裝載至HIC上之前，可使用0.22 µm聚醚碸(PES)過濾器進行視情況選用之串聯過濾。HIC膜為Sartobind®苯基。HIC製程係以流過模式操作。在整個處理中，使裝載、平衡及洗滌緩衝液以及流過物(Flow-Through)保持於2-8℃。

用1 M Tris鹼將經冷卻(2至8℃) X0HC深層濾液滴定至pH 7.5。滴定產物集合係藉由以1:2添加(亦即，以0.5×中和X0HC深層濾液體積添加調整緩衝液體積)添加冷卻至2-8℃的25 mM Tris、1.05 M檸檬酸鈉，pH 7.5進行調整。調整將產物集合帶至pH介於7.5-8.1之間的0.35 M檸檬酸鈉。限制膜裝載以減少聚集，其中最大裝載為25 g/L。

相較於在室溫進行製程，冷卻HIC製程提高抗體穩定性。在處理期間使溶液維持處於低pH或中性pH但處於低溫減少了抗體聚集。

表4提供HIC製程之代表性參數。表4. HIC參數

步驟	緩衝液	體積(MV)	流速(MV/min)
平衡	25 mM Tris，0.35 M檸檬酸鈉，pH 8.0 (經冷卻)	10.0	1.5
裝載*	調節的HIC裝載(經冷卻)	(達25 g/L裝載)	1.5
洗滌*	25 mM Tris，0.35 M檸檬酸鈉，pH 8.0 (經冷卻)	10.0	1.5

*在2 mm路徑長度下自A280 100 mAU遞升-200 mAU遞減收集產物切向流過濾

在HIC後，進行切向流過濾(TFF)以將抗體緩衝液交換為40 mM乙酸。使用Pall Omega Centrasette® T-Series 30 kDa膜，其用20 mM磷酸鉀，pH 7緩衝液平衡。將保留物冷卻至2-15℃。在滴定至pH 4後，在室溫操作製程。TFF製程包括在兩個步驟之間滴定至酸性pH的情況下進行之兩個透濾(DF)步驟(DF 1及DF 2)，隨後進行超過濾(UF)。

在DF 1步驟中，將6個透濾體積引入至20 mM磷酸鉀，pH 7.0中。此步驟在滴定至pH 4之前減少鹽，此係由於當鹽在低pH下存在時，遮蔽抗體可能聚集。將DF 1緩衝液及保留物冷卻至2-15℃以維持產物穩定性。在滴定步驟中，添加25%體積/體積(v/v)冰醋酸以獲得4之目標pH。在DF 2步驟中，將8個透濾體積引入至40 mM乙酸中。使DF 2緩衝液及保留物保持處於室溫(18-25℃)。接著進行UF以將產物集合濃縮至25-30 mg/mL蛋白質。在UF後，使保留物保持處於18-25℃。

儘管通常抗體係在進行透濾之前由UF濃縮，但此可能引起遮蔽抗體之聚集，此係因為遮蔽抗體之聚集對抗體濃縮敏感，當遮蔽抗體未在酸性、低鹽溶液中時，該聚集可能進一步加重。藉由使用透濾首先減少pH及鹽，可在室溫進行UF。病毒過濾

在UF後使用Sartopore® 2 (0.1 μm標稱)預過濾器及Asahi® BioEX 4 m² 病毒過濾器進行病毒過濾(奈米過濾)。病毒過濾係在18-25℃進行，其中目標操作壓力為45 psig (30-49 psig)。儘管通常奈米過濾係在純化製程早期進行，但奈米過濾可在本製程結束時在低pH及室溫進行。實例2b.其他例示性抗體純化製程採集

採集2000 L CHO細胞樣本。採集製程產生含有遮蔽抗體之細胞溶解物。接著過濾樣本以移除細胞碎片、污染物及雜質。過濾係藉由Millipore D0SP、Millipore X0SP及Emphaze混合純化器及0.2 µm過濾器進行。在進一步處理之前使所採集細胞培養物流體保持冷卻，以減少微生物生長。使所有其他溶液保持處於室溫，且在室溫(18-25℃)下進行處理。在採集過濾後，使樣本經歷蛋白質A層析。蛋白質A

蛋白質A層析係藉由封裝至20 cm床高度之GE MabSelect®SuRe進行。蛋白質A層析參數提供於表5中。表5.蛋白質A層析參數

步驟	緩衝液	體積(CV)	流速(cm/h)
平衡	25 mM Tris，50 mM NaCl，pH 7.5	5.0	300
裝載	HCCF (採集細胞培養流體)	(達37 g/L樹脂裝載)	300
第1次洗滌	25 mM Tris，50 mM NaCl，pH 7.5	2.5	300
第2次洗滌	25 mM Tris，0.5 M精胺酸，pH 9.0	3.0	300
第3次洗滌	25 mM Tris，50 mM NaCl，pH 7.5	2.5	300
第4次洗滌	20 mM麩胺酸鹽，pH 5.0	3.0	300
溶離	40 mM麩胺酸	4.0*	300

中間洗滌步驟可減少雜質，諸如宿主細胞蛋白質及DNA。舉例而言，在麩胺酸鹽或乙酸鹽緩衝液中的pH 5下之最終洗滌步驟(第4次洗滌)可進一步改良結果。相較於在無此等步驟中之一或兩者的情況下進行的層析，第4次洗滌及溶離溶液(40 M麩胺酸)之組合減少抗體聚集。

溶離之後，用0.5 M磷酸將溶離液滴定至pH 3.6且保持90分鐘(18-25℃)以用於低pH病毒去活化。在完成病毒去活化時，在室溫(18-25℃)下在pH 3.6下使溶離液保持12-24小時。在低pH下之此延長保持進一步去聚集溶離液中之抗體。在保持低pH後，用1 M Tris鹼將pH調整至4.0，隨後進行深層過濾。深層過濾

深層過濾器用於另外雜質清除(例如，用於清除宿主細胞蛋白質及DNA)。限制過濾器裝載以確保充分減少雜質進入下游步驟中。≤ pH 4 (諸如pH 3.6至pH 4)之深層過濾有助於維持抗體穩定性且減少聚集。

在用40 mM麩胺酸鹽，pH 4平衡之Millipore®X0SP POD上方進行深層過濾。按體積收集樣本。使深層濾液集合保持處於2-8℃或室溫以準備用於疏水性相互作用層析(HIC)。疏水性相互作用層析(HIC)

在裝載至HIC上之前，可使用0.22 µm聚醚碸(PES)過濾器進行視情況選用之串聯過濾。所使用之HIC樹脂為丁基瓊脂糖HP。HIC製程係以流過模式操作。在整個處理中，使裝載、平衡及洗滌緩衝液以及流過物保持於室溫。製程利用40 mM麩胺酸鹽，pH 4.0作為平衡及洗滌緩衝液。可將pH 4.0之X0SP深層濾液直接裝載至HIC管柱上而無需操控。限制樹脂裝載以減少聚集，其中最大裝載為25 g/L。表6提供HIC製程之代表性參數。表6：代表性HIC參數

步驟	緩衝液	體積(CV)	流速(cm/h)
平衡	40 mM麩胺酸鹽，pH 4.0	5.0	150
裝載	深層濾液	(達25 g/L樹脂)	150
洗滌	40 mM麩胺酸鹽，pH 4.0	5.0	150

CV =管柱體積 *在2 mm路徑長度下自A280 100 mAU遞升-100 mAU遞減收集溶離液病毒過濾

在此工作流程中，在切向流過濾之前而非之後進行病毒過濾。在HIC後使用Sartopore® 2 (0.1 μm標稱)預過濾器及Asahi® BioEX 4 m2病毒過濾器進行病毒過濾(奈米過濾)。病毒過濾係在18-25℃進行，其中目標操作壓力為45 psig (30-49 psig)。切向流過濾

病毒過濾後，進行切向流過濾(TFF)以將抗體緩衝液交換為40 mM麩胺酸鹽，pH 3.6，以靶向pH 3.8之40 mM麩胺酸鹽中之經調配mAb。使用Pall Omega Centrasette® T-Series 30 kDa膜，其用40 mM麩胺酸鹽，pH 3.6緩衝液平衡。在室溫操作製程。若奈米濾液pH＞3.6，則在開始超過濾(濃縮)步驟之前將其滴定至pH 3.6以隨著抗體濃縮增加而減少聚集。將pH 3.6之奈米濾液濃縮至30 mg/mL，接著透濾成8個透濾體積之40 mM麩胺酸鹽，pH 3.6。實例3：去遮蔽Vel-IPV-hB6H12.3後之聚集之評估

評估Vel-IPV-hB6H12.3之遮罩移除之影響。在消化緩衝液(50 mM Tris、150 mM NaCl、10 mM CaCl₂ 、0.05% Brij-35，pH 7.5)中使用基質金屬蛋白酶2 (MMP2，EMD Millipore)以酶方式去遮蔽Vel-IPV-hB6H12.3。使去遮蔽在37℃進行2小時，接著用金屬蛋白酶2之組織抑制劑(TIMP2，EMD Millipore)淬滅MMP2活性。藉由SE-UPLC分析去遮蔽樣本。

去遮蔽Vel-IPV-hB6H12.3藉由MMP2在反應時間內增加，伴隨遮蔽Vel-IPV-hB6H12.3之對應減少(圖2A)。Vel-IPV-hB6H12.3聚集量最初由於在pH 7.5消化緩衝液中稀釋而增加。在2小時MMP2處理結束時，去遮蔽樣本展示極低聚集量，如藉由HMW百分比所量測(圖2B)。因此，聚集量在自Vel-IPV-hB6H12.3移除遮罩後減少。此等資料支持Vel-IPV-hB6H12.3之遮罩在誘導某些調配物中之聚集中起作用的假定。實例4：回應於hB6H12.3之細胞介素產生

在37℃將來自癌症患者(10個肉瘤、3個NSCLC、3個結腸癌及1個黑素瘤)之新製全血樣本與增加濃度(最大濃度，20 µg/ml)的FITC標記之hB6H12.3或FITC標記之Vel-IPV-hB6H12.3或與0.1 µg/mL LPS一起培育20小時。使用38叢細胞介素及趨化因子磁珠面板評定細胞介素量。

在所測試的大部分患者樣本中，適度的細胞介素產生係由hB6H12.3誘導，但最少的細胞介素產生係由Vel-IPV-hB6H12.3誘導。細胞介素IP-10、IL1-Ra、MIP-1α及MIP-1α最常由hB6H12.3誘導。IL1-Ra (圖3B)、MIP-1α及MIP-1β之量在所測試之hB6H12.3之最大濃度下低於200 pg/mL，而IP-10量達至4000至5000 ng/mL (圖3A)。在所有情況下由Vel-IPV-hB6H12.3產生之細胞介素量低於由hB6H12.3產生之細胞介素量，且通常低100-1000倍。實例5：hB6H12.3誘導活體內細胞凋亡

攜帶人類HT1080纖維肉瘤異種移植物之裸小鼠在腫瘤達至200 mm³ 時經投與5 mg/kg IP劑量之hB6H12.3、Vel-IPV-hB6H12.3或hIgG1同型對照。在給定時間點(24及96小時)處，將小鼠處死且收集腫瘤。腫瘤經均質化且將人類HT1080異種移植纖維肉瘤腫瘤細胞以1百萬個細胞/毫升再懸浮於1×磷脂結合蛋白V染色緩衝液(含有以1:10稀釋於水中之50 mM HEPES、700 mM NaCl、12.5 mM CaCl₂ pH7.4的10×染色緩衝液)。將細胞轉移至圓底96孔盤(100微升/孔)且將5 µl FITC磷脂結合蛋白V染色試劑及1 µl之100 µg/ml紫外光存活/死亡染色緩衝液添加至各孔。將細胞在室溫染色30分鐘。將樣本以1550 g旋轉5分鐘，移除上清液且將細胞用1×冰冷磷脂結合蛋白V染色緩衝液洗滌3×。將細胞再懸浮於100 µl之1×磷脂結合蛋白V染色緩衝液中。藉由流式細胞術在LSRII細胞計數器上將細胞凋亡評定為對於結合於表面磷脂醯基絲胺酸之磷脂結合蛋白V為陽性的細胞%。將經存活/死亡染色劑陽性染色的細胞排除在分析之外。

如圖4中所展示，當相較於未治療及同型對照治療之腫瘤樣本時，經hB6H12.3及Vel-IPV-hB6H12.3兩者治療之腫瘤在治療後96小時展現增加的磷脂結合蛋白V+凋亡細胞。

圖1A至圖1B展示對pH敏感的抗CD47遮蔽抗體(Vel-IPV-hB6H12.3；亦稱為CD47M)之穩定性。(A)在具有150 mM NaCl (鹽)或無加成鹽(無鹽)的不同pH之調配物中在25℃下3天後Vel-IPV-hB6H12.3之穩定性(量測為高分子量[HMW]百分比)。(B)在pH 4及pH 6之調配物中在25℃下3天內Vel-IPV-hB6H12.3之穩定性。

圖2A至圖2B展示關於去遮蔽Vel-IPV-hB6H12.3之資料。(A)去遮蔽Vel-IPV-hB6H12.3之量經由與MMP2之2小時去遮蔽反應而增加。(B)去遮蔽反應期間隨時間推移HMW Vel-IPV-hB6H12.3之百分比。

圖3A至圖3B描繪藉由培育在37℃下與hB6H12.3或Vel-IPV-hB6H12.3 (CD47M)一起培育20小時之癌症患者全血樣本而誘導的代表性細胞介素產生。圖3A展示IP-10之產生且圖3B展示IL-1RA之產生。

圖4展示在來自投與hB6H12.3、Vel-IPV-hB6H12.3 (CD47M)或hIgG1同型對照(「h00同型」)之HT1080異種移植模型小鼠的HT1080腫瘤細胞上進行之磷脂結合蛋白V染色。

Claims

一種純化遮蔽抗體之方法，其包含： a) 在適合使該遮蔽抗體結合於蛋白質A層析管柱之條件下，將包含該遮蔽抗體之起始組合物裝載至該蛋白質A層析管柱上； b) 用pH 4.5-5.5之酸性洗滌緩衝液洗滌包含該結合遮蔽抗體之蛋白質A層析管柱至少一次；以及 c) 在pH 2.5-4之酸性溶離緩衝液中自該蛋白質A管柱溶離該遮蔽抗體，以形成包含該遮蔽抗體之蛋白質A溶離液； d) 其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含第一纏繞線圈域，其中該第一遮蔽域連接至抗體之重鏈可變區；及第二遮蔽域，其包含第二纏繞線圈域，其中該第二遮蔽域連接至該抗體之輕鏈可變區；其中該第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且該第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKS EVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。
如請求項1之方法，其中該起始組合物為細胞溶解物。
如請求項1或2之方法，其中該蛋白質A層析係在室溫進行。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該酸性洗滌緩衝液為乙酸鹽或麩胺酸鹽緩衝液。
如請求項4之方法，其中該酸性洗滌緩衝液包含10-100 mM、10-90 mM、10-80 mM、10-70 mM、10-60 mM、10-50 mM、10-40 mM、15-30 mM、20-30 mM或25 mM乙酸鹽，或其中該酸性洗滌緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、20-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。
如請求項1至4中任一項之方法，其中步驟(b)之該至少一種酸性洗滌緩衝液係呈pH 4.7-5.4、pH 4.8、pH 4.9、pH 5、pH 5.1或pH 5.2。
如請求項1至5中任一項之方法，其中該酸性溶離緩衝液包含0.05-0.2 M、0.07-0.15 M、0.07-0.13 M、0.08-0.12 M、0.09 M、0.1 M或0.11 M乙酸，或其中該酸性溶離緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、20-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸。
如請求項1至7中任一項之方法，其中步驟(c)之該酸性溶離緩衝液係呈pH 2.5-5、pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4、pH 2.5-3.8、pH 2.7-3.8或pH 2.5-3.5、pH 2.6、pH 2.7、pH 2.8、pH 2.9、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該方法包含在(a)與(b)之間用pH 6-8之中性洗滌緩衝液洗滌該管柱至少一次，視情況其中該中性洗滌緩衝液為視情況呈pH 7.5之Tris緩衝液，及/或其中該方法包含在(a)與(b)之間用pH 8.5-9.5之鹼性洗滌緩衝液洗滌該管柱至少一次，視情況其中該鹼性洗滌緩衝液為視情況呈pH 9之精胺酸緩衝液。
如請求項1至9中任一項之方法，其進一步包含將該蛋白質A溶離液之pH調整至pH 3-4.2、pH 3-4、pH 3.5-4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4，以形成酸化溶離液。
如請求項10之方法，其中該pH係使用乙酸(視情況1 M乙酸)或使用磷酸(視情況0.5 M磷酸)調整。
如請求項10或請求項11中任一項之方法，其包含在調整該pH後，將該酸化溶離液培育4-30小時、6-30小時、10-30小時、4-20小時、6-20小時、8-20小時、10-20小時、4-18小時、6-18小時、8-18小時、10-18小時、8-16小時、10-16小時、8-14小時、10-14小時、11-13小時、10小時、11小時、12小時、13小時或14小時。
一種純化遮蔽抗體之方法，其包含： a) 使包含該遮蔽抗體之起始組合物經歷一或多個層析純化步驟，以形成層析溶離液； b) 將該層析溶離液之pH調整至pH 3-4.2、pH 3-4、pH 3.5-4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4，以形成酸化溶離液；以及 c) 將該酸化溶離液培育4-30小時、6-30小時、10-30小時、4-20小時、6-20小時、8-20小時、10-20小時、4-18小時、6-18小時、8-18小時、10-18小時、8-16小時、10-16小時、8-14小時、10-14小時、11-13小時、10小時、11小時、12小時、13小時或14小時； d) 其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含第一纏繞線圈域，其中該第一遮蔽域連接至抗體之重鏈可變區；及第二遮蔽域，其包含第二纏繞線圈域，其中該第二遮蔽域連接至該抗體之輕鏈可變區；其中該第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且該第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKS EVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。
如請求項13之方法，其中該起始組合物為細胞溶解物。
如請求項12至14中任一項之方法，其中該酸化溶離液係在室溫培育。
如請求項12至15中任一項之方法，其包含在培育後將該酸化溶離液之pH進一步調整至pH 3.5-4.5、pH 3.5-4.3、pH 3.7-4.2、pH 3.6-4、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1或pH 4.2。
如請求項16之方法，其中該pH係使用tris鹼，視情況1 M tris鹼調整。
如請求項12至17中任一項之方法，其包含在深層過濾器(depth filter)上過濾該酸化溶離液。
如請求項12至18中任一項之方法，其包含在培育或深層過濾後將該酸化溶離液冷卻至1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃之溫度。
如請求項19之方法，其包含將該冷卻酸化溶離液之pH調整至pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9，以形成冷卻中性溶離液。
如請求項20之方法，其中該pH係使用tris鹼，視情況1 M tris鹼調整。
如請求項20或請求項21之方法，其進一步包含將該冷卻中性溶離液裝載至疏水性相互作用層析(HIC)管柱或膜上。
如請求項22之方法，其包含用已經冷卻至1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃之溫度的HIC洗滌緩衝液洗滌該HIC管柱或膜。
一種純化遮蔽抗體之方法，其包含： a) 冷卻包含該遮蔽抗體之起始組合物，其中在冷卻之前或之後將該起始組合物之pH調整至pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9，以形成冷卻之起始組合物； b) 將該冷卻之起始組合物裝載至疏水性相互作用層析(HIC)管柱或膜上；以及 c) 用已經冷卻至1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃之溫度的HIC洗滌緩衝液洗滌該HIC管柱或膜； d) 其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含第一纏繞線圈域，其中該第一遮蔽域連接至抗體之重鏈可變區；及第二遮蔽域，其包含第二纏繞線圈域，其中該第二遮蔽域連接至該抗體之輕鏈可變區；其中該第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且該第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKS EVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。
如請求項24之方法，其中該起始組合物為細胞溶解物。
如請求項23至25中任一項之方法，其中該HIC洗滌緩衝液為tris/檸檬酸鈉緩衝液。
如請求項23至26中任一項之方法，其中該HIC洗滌緩衝液係呈pH 7-9、pH 7-8.5、pH 7-8、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8或pH 7.9。
如請求項23至27中任一項之方法，其中該HIC洗滌緩衝液包含檸檬酸鈉。
如請求項28之方法，其中該HIC洗滌緩衝液中檸檬酸鈉之濃度為200-700 mM、或200-600 mM、或200-500 mM、或250-500 mM、或300-500 mM、或300-400 mM。
如請求項23至29中任一項之方法，其包含收集HIC流出物，該HIC流出物包含該遮蔽抗體。
如請求項30之方法，其進一步包含在HIC之後進行第一次透濾，以將檸檬酸鈉之濃度降低至低於40 mM、或低於35 mM、或低於30 mM、或低於25 mM、或低於20 mM、或低於15 mM、或低於10 mM、或低於5 mM，以形成經透濾之HIC流出物。
如請求項31之方法，其中該第一次透濾係在1-15℃、1-10℃、或1-9℃、或2-8℃進行。
如請求項31或請求項32之方法，其進一步包含在乙酸鹽緩衝液中進行第二次透濾，其中該第二次透濾係在室溫，視情況在15-28℃或18-25℃進行。
如請求項33之方法，其中該乙酸鹽緩衝液包含20-100 mM、20-90 mM、20-80 mM、20-70 mM、30-50 mM、35 mM、40 mM或45 mM乙酸鹽。
如請求項33或請求項34之方法，其中在該第二次透濾之前，將該經透濾之HIC流出物之pH調整至pH 3.5-4.5、pH 3.7-4.5、pH 3.7-4.3、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1或pH 4.2。
如請求項35之方法，其中該pH係使用25% v/v冰醋酸調整，以形成酸化透濾之HIC流出物。
如請求項33至36中任一項之方法，其中使該酸化透濾之HIC流出物經過超過濾，形成濃縮之遮蔽抗體組合物。
如請求項37之方法，其中該濃縮之遮蔽抗體組合物中該遮蔽抗體之濃度為10-40 mg/mL、15-35 mg/mL、20-35 mg/mL或25-35 mg/mL。
如請求項30至38中任一項之方法，其進一步包含進行病毒移除。
如請求項39之方法，其中病毒移除係藉由奈米過濾進行。
如請求項40之方法，其中該奈米過濾係在酸性pH進行。
如請求項41之方法，其中該酸性pH為pH 3-4.4、pH 3.5-4.4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4。
如請求項39至42中任一項之方法，其中該病毒移除係在室溫進行。
如請求項39至43中任一項之方法，其中病毒移除係在該超過濾之後。
如請求項10至18中任一項之方法，其視情況包含將該酸化溶離液之pH調整至pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5。
如請求項45之方法，其中該pH係使用tris鹼，視情況1 M tris鹼調整。
如請求項45或請求項46之方法，其進一步包含將該視情況調整過pH之酸化溶離液裝載至疏水性相互作用層析(HIC)管柱或膜上。
如請求項47之方法，其包含在室溫進行HIC。
一種純化遮蔽抗體之方法，其包含： a) 獲得包含該遮蔽抗體之起始組合物，其中將該起始組合物之pH調整至pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5； b) 將該起始組合物裝載至疏水性相互作用層析(HIC)管柱或膜上；以及 c) 用pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5之HIC洗滌緩衝液洗滌該HIC管柱或膜； d) 其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其包含第一纏繞線圈域，其中該第一遮蔽域連接至抗體之重鏈可變區；及第二遮蔽域，其包含第二纏繞線圈域，其中該第二遮蔽域連接至該抗體之輕鏈可變區；其中該第一纏繞線圈域包含序列VDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKL (SEQ ID NO: 2)，且該第二纏繞線圈域包含序列VAQLEEKVKTLRAENYELKS EVQRLEEQVAQL (SEQ ID NO: 1)。
如請求項47至49中任一項之方法，其中該起始組合物為細胞溶解物。
如請求項47至50中任一項之方法，其中該HIC洗滌緩衝液為麩胺酸鹽緩衝液。
如請求項51之方法，其中該HIC洗滌緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、20-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。
如請求項47至52中任一項之方法，其中該HIC洗滌緩衝液係呈pH 3.6至4、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9或pH 4。
如請求項47至53任一項之方法，其中該HIC步驟係在室溫進行。
如請求項47至54中任一項之方法，其包含收集HIC流出物，該HIC流出物包含該遮蔽抗體。
如請求項55之方法，其進一步包含將該HIC流出物之緩衝液交換為呈pH 3-5、pH 3-4.5、pH 3.5-4.5、pH 3.6-4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4或pH 4.5之麩胺酸鹽緩衝液，其中交換該緩衝液係經由透濾或切向流過濾。
如請求項56之方法，其中該麩胺酸鹽緩衝液包含10-60 mM、10-50 mM、20-60 mM、20-50 mM、10-40 mM、20-40 mM、30-50 mM、20-40 mM、30-40 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM或60 mM麩胺酸鹽。
如請求項56或57之方法，其進一步包含在透濾或切向流過濾之前進行超過濾，以將該遮蔽抗體濃縮至10-40 mg/mL、15-35 mg/mL、20-35 mg/mL或25-35 mg/mL。
如請求項49至58中任一項之方法，其進一步包含進行病毒移除。
如請求項59之方法，其中病毒移除係藉由奈米過濾進行。
如請求項60之方法，其中該奈米過濾係在酸性pH進行。
如請求項61之方法，其中該酸性pH為pH 3-4.4、pH 3.5-4.4、pH 3.6-4、pH 3、pH 3.1、pH 3.2、pH 3.3、pH 3.4、pH 3.5、pH 3.6、pH 3.7、pH 3.8、pH 3.9、pH 4、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4。
如請求項59至62中任一項之方法，其中該病毒移除係在室溫進行。
如請求項59至63中任一項之方法，其中病毒移除在該透濾及超過濾之前。
如請求項1至64中任一項之方法，其中該方法之各pH ＞5步驟係在1℃至15℃之溫度進行，及/或其中該方法之各室溫步驟係在pH ＜4.5進行。
如請求項1至65中任一項之方法，其中各遮蔽域包含蛋白酶可裂解連接子且經由該蛋白酶可裂解連接子連接至該重鏈或輕鏈。
如請求項66之方法，其中該蛋白酶可裂解連接子包含基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點、尿激酶纖維蛋白溶酶原活化物裂解位點、間質蛋白酶(matriptase)裂解位點、豆莢蛋白酶(legumain)裂解位點、解整合素及金屬蛋白酶(A Disintegrin And Metalloproteinase) (ADAM)裂解位點，或半胱天冬酶(caspase)裂解位點。
如請求項67之方法，其中該蛋白酶可裂解連接子包含基質金屬蛋白酶(MMP)裂解位點。
如請求項68之方法，其中該MMP裂解位點選自MMP2裂解位點、MMP7裂解位點、MMP9裂解位點及MMP13裂解位點。
如請求項67或請求項68之方法，其中該MMP裂解位點包含序列IPVSLRSG (SEQ ID NO: 19)或GPLGVR (SEQ ID NO: 21)。
如請求項1至70中任一項之方法，其中該第一遮蔽域包含序列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 4)。
如請求項1至71中任一項之方法，其中該第二遮蔽域包含序列GASTTVAQLEEKVKTLRAENYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 3)。
如請求項1至72中任一項之方法，其中該第一遮蔽域包含序列GASTSVDELQAEVDQLEDENYALKTKVAQLRKKVEKLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 4)，且該第二遮蔽域包含序列GASTTVAQLEEKVKTLRAE NYELKSEVQRLEEQVAQLGSIPVSLRSG (SEQ ID NO: 3)。
如請求項1至73中任一項之方法，其中該第一遮蔽域連接至該重鏈之胺基端且該第二遮蔽域連接至該輕鏈之胺基端。
如請求項1至74中任一項之方法，其中該抗體結合選自以下之抗原：CD47、CD3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD40、CD44、CD52、CD70、CD79a、CD123、Her-2、EphA2、淋巴球相關抗原1、VEGF或VEGFR、CTLA-4、LIV-1、結合蛋白(nectin)-4、CD74、SLTRK-6、EGFR、CD73、PD-L1、CD163、CCR4、CD147、EpCam、Trop-2、CD25、C5aR、Ly6D、α v整合素、B7H3、B7H4、Her-3、葉酸受體α、GD-2、CEACAM5、CEACAM6、c-MET、CD266、MUC1、CD10、MSLN、唾液酸基Tn、路易(Lewis) Y、CD63、CD81、CD98、CD166、組織因子(CD142)、CD55、CD59、CD46、CD164、TGF β受體1 (TGFβR1)、TGFβR2、TGFβR3、FasL、MerTk、Axl、Clec12A、CD352、FAP、CXCR3及CD5。
如請求項75之方法，其中該抗體結合CD47。
如請求項76之方法，其中該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO: 25；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 26；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 27；其中該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO: 31；LCDR2，其包含SEQ ID NO: 32；及LCDR3，其包含SEQ ID NO: 33或34。
如請求項77之方法，其中該重鏈可變區包含與選自SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
如請求項77或請求項78之方法，其中該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 23或24之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
如請求項76至79中任一項之方法，其中該抗體包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其包含SEQ ID NO: 25、26、27、31、32及33。
如請求項76之方法，其中該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：HCDR1，其包含SEQ ID NO: 28；HCDR2，其包含SEQ ID NO: 29；及HCDR3，其包含SEQ ID NO: 30；及其中該輕鏈可變區包含：LCDR1，其包含SEQ ID NO: 35；LCDR2，其包含SEQ ID NO: 36；及LCDR3，其包含SEQ ID NO: 37或38。
如請求項81之方法，其中該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 22之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
如請求項81或請求項82之方法，其中該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO: 23或24之胺基酸序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列。
如請求項81至83中任一項之方法，其中該抗體包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其包含SEQ ID NO: 28、29、30、35、36及37。
如請求項76至84中任一項之方法，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列。
如請求項76至85中任一項之方法，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 23或24之胺基酸序列。
如請求項76至86中任一項之方法，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 22之胺基酸序列且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 23之胺基酸序列。
如請求項76之方法，其中該遮蔽抗體包含：第一遮蔽域，其連接至重鏈；及第二遮蔽域，其連接至輕鏈；其中該第一遮蔽域及該重鏈包含SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40之序列或由其組成，且該第二遮蔽域及該輕鏈包含：SEQ ID NO: 42之序列或由其組成。
如請求項76至88中任一項之方法，其中該抗體阻斷CD47與SIRPα之間的相互作用。
如請求項1至89中任一項之方法，其中該抗體具有減少的核心岩藻糖基化。
如請求項1至89中任一項之方法，其中該抗體係無岩藻糖基化(afucosylated)。
如請求項1至91中任一項之方法，其中該遮蔽抗體與細胞毒性劑結合。
如請求項92之方法，其中該細胞毒性劑為抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、DNA烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、NAMPT抑制劑，或化學療法敏化劑。
如請求項92或請求項93之方法，其中該細胞毒性劑為蒽環類(anthracycline)、奧瑞他汀(auristatin)、喜樹鹼(camptothecin)、倍癌黴素(duocarmycin)、依託泊苷(etoposide)、烯二炔抗生素(enediyine antibiotic)、萊希菌素(lexitropsin)、紫杉烷(taxane)、類美登素(maytansinoid)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)、康柏斯達汀(combretastatin)、念珠藻素(cryptophysin)，或長春花生物鹼(vinca alkaloid)。
如請求項92至94中任一項之方法，其中該細胞毒性劑為奧瑞他汀E、AFP、AEB、AEVB、MMAF、MMAE、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、小紅莓(doxorubicin)、(嗎啉基)-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、美法侖(melphalan)、甲胺喋呤(methotrexate)、絲裂黴素(mitomycin) C、CC-1065類似物、CBI、卡奇黴素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、尾海兔素(dolastatin) 10之類似物、根瘤菌素(rhizoxin)，或沙海葵毒素(palytoxin)、埃坡黴素(epothilone) A、埃坡黴素B、諾考達唑(nocodazole)、秋水仙鹼(colchicine)、秋水醯胺(colcimid)、雌氮芥(estramustine)、西馬多丁(cemadotin)、圓皮海綿內酯(discodermolide)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、微管蛋白裂解素(tubulysin)、普魯卡布林(plocabulin)，或美登素(maytansine)。
如請求項95之方法，其中該細胞毒性劑為奧瑞他汀。
如請求項96之方法，其中該細胞毒性劑為MMAE或MMAF。
如請求項1至91中任一項之方法，其中在純化該遮蔽抗體之後，該遮蔽抗體與細胞毒性劑結合。
如請求項98之方法，其中該細胞毒性劑為抗微管蛋白劑、DNA小溝結合劑、DNA複製抑制劑、DNA烷基化劑、拓樸異構酶抑制劑、NAMPT抑制劑，或化學療法敏化劑。
如請求項98或請求項99之方法，其中該細胞毒性劑為蒽環類、奧瑞他汀、喜樹鹼、倍癌黴素、依託泊苷、烯二炔抗生素、萊希菌素、紫杉烷、類美登素、吡咯并苯并二氮呯、康柏斯達汀、念珠藻素，或長春花生物鹼。
如請求項98至100中任一項之方法，其中該細胞毒性劑為奧瑞斯他汀E、AFP、AEB、AEVB、MMAF、MMAE、太平洋紫杉醇、多西他賽、小紅莓、(嗎啉基)-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、美法侖、甲胺喋呤、絲裂黴素C、CC-1065類似物、CBI、卡奇黴素、美登素、尾海兔素10之類似物、根瘤菌素，或沙海葵毒素、埃坡黴素A、埃坡黴素B、諾考達唑、秋水仙鹼、秋水醯胺、雌氮芥、西馬多丁、圓皮海綿內酯、艾榴塞洛素、微管蛋白裂解素、普魯卡布林，或美登素。
如請求項101之方法，其中該細胞毒性劑為奧瑞他汀。
如請求項102之方法，其中該細胞毒性劑為MMAE或MMAF。
一種遮蔽抗體，其係由如請求項1至103中任一項之方法純化。