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TW202106879A - 於生物反應器中生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(biic)之系統及方法 - Google Patents

於生物反應器中生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(biic)之系統及方法 Download PDF

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TW202106879A
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克里夏努 瑪瑟
安德拉德 漢德里克斯
克里斯多福 莫瑞森
泰勒 波勒莫斯
彼得 史萊德
安納史塔西亞 諾曼
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美商航海家醫療公司
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Abstract

本發明提供用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之方法。本發明描述用於生產腺相關病毒(AAV)粒子、組合物及調配物之方法及系統，該AAV包括重組腺相關病毒(rAAV)。在某些實施例中，生產方法及系統在生產rAAV時使用桿狀病毒表現載體(BEV)及/或經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)。在某些實施例中，本發明提供用於設計、生產、澄清、純化、調配、過濾及處理rAAV及rAAV調配物之方法及系統。在某些實施例中，生產方法及系統使用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆蟲細胞(諸如Sf9或Sf21)作為病毒生產細胞(VPC)。

Description

於生物反應器中生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之系統及方法
本發明提供用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(baculovirus infected insect cell，BIIC)之方法。本發明描述用於生產腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)粒子、組合物及調配物之方法及系統，該AAV包括重組腺相關病毒(rAAV)。在某些實施例中，生產方法及系統在生產rAAV時使用桿狀病毒表現載體(Baculoviral Expression Vector，BEV)及/或經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)。在某些實施例中，本發明提供設計、生產、澄清、純化、調配、過濾及處理rAAV及rAAV調配物之方法及系統。在某些實施例中，生產方法及系統使用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆蟲細胞(諸如Sf9或Sf21)作為病毒生產細胞(viral production cell，VPC)。
AAV已成為用於基因轉移至哺乳動物細胞的最廣泛研究及利用之病毒載體之一者。參見例如Tratschin等人,Mol. Cell Biol ., 5(11):3251-3260 (1985)及Grimm等人, Hum. Gene Ther., 10(15):2445-2450 (1999)，其內容各自以全文引用的方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。腺相關病毒(AAV)載體為治療性基因遞送之有前景的候選物，且已在臨床試驗中經證實為安全且有效的。出於此目的，設計及生產經改良之AAV粒子為活躍的研究領域。
仍需要用於生產AAV衣殼蛋白、AAV衣殼及相應AAV載體(諸如AAV粒子)的經改良系統及方法。
本發明之各種實施例之細節闡述於以下實施方式中。
本發明提供用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之方法。在某些實施例中，本發明提供用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之方法，其包括以下步驟中之一或多者：(a)將一定體積之細胞培養基引入生物反應器中；(b)將至少一個病毒生產細胞(VPC)引入生物反應器中且使該生物反應器中之VPC數目擴增至目標VPC細胞密度；(c)將至少一種桿狀病毒表現載體(BEV)引入該生物反應器中，其中該BEV包含AAV病毒表現構築體或AAV有效負載構築體；(d)在允許至少一種BEV感染至少一個VPC以生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的條件下，在生物反應器中培育VPC與BEV之混合物；(e)在允許該生物反應器中之BIIC數目達到目標BIIC細胞密度之條件下培育該生物反應器；及(f)視情況自該生物反應器收穫BIIC。在某些實施例中，生物反應器包含用於管理生物反應器內之細胞培養基的灌注系統。在某些實施例中，灌注系統為交替切向流(alternating tangential flow，ATF)灌注系統。
本發明提供用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之方法，其中生物反應器包括用於管理生物反應器內之細胞培養基的灌注系統。在某些實施例中，本發明提供用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之方法，其包括以下步驟：(a)將一定體積之細胞培養基引入生物反應器中，其中生物反應器包括用於管理生物反應器內之細胞培養基的灌注系統；(b)將至少一個病毒生產細胞(VPC)引入生物反應器中且使該生物反應器中之VPC數目擴增至目標VPC細胞密度；(c)將至少一種桿狀病毒表現載體(BEV)引入該生物反應器中，其中該BEV包含AAV病毒表現構築體或AAV有效負載構築體；(d)在允許至少一種BEV感染至少一個VPC以生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的條件下，在生物反應器中培育VPC與BEV之混合物；(e)在允許該生物反應器中之BIIC數目達到目標BIIC細胞密度之條件下培育該生物反應器；及(f)自該生物反應器收穫BIIC。在某些實施例中，灌注系統為交替切向流(ATF)灌注系統(例如，XCell ATF系統)。
在某些實施例中，灌注系統置換生物反應器中之培養基的至少一部分，同時截留生物反應器內之至少90%的VPC及BIIC。在某些實施例中，灌注系統自生物反應器內之細胞培養基移除細胞廢物。在某些實施例中，灌注系統置換已由細胞代謝耗盡營養物之細胞培養基。在某些實施例中，灌注系統用補充有生長或生產增強因子之細胞培養基置換細胞培養基，以提高AAV產物之品質及數量。在某些實施例中，灌注系統在生物反應器達到目標BIIC細胞密度之後用低溫保存培養基置換細胞培養基，其允許在自生物反應器收穫之前或之後冷凍及保存BIIC細胞。
在某些實施例中，生物反應器之體積為至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L。在某些實施例中，生物反應器中之細胞培養基的體積(亦即工作體積)為至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L。在某些實施例中，BEV感染下的目標VPC細胞密度為1.5-4.0×106 個細胞/毫升，或更特定言之2.0-3.5×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，VPC為昆蟲細胞。在某些實施例中，VPC為Sf9細胞。
在某些實施例中，將BEV以BEV對VPC之目標感染倍率(MOI)引入生物反應器中。在某些實施例中，BEV MOI為0.0005-0.003，或更特定言之0.001-0.002。
在某些實施例中，在特定BIIC細胞密度下自生物反應器收穫BIIC。在某些實施例中，自生物反應器收穫之BIIC具有特定BIIC細胞密度。在某些實施例中，在收穫時之BIIC細胞密度為6.0-18.0×106 個細胞/毫升，更特定言之8.0-16.5×106 個細胞/毫升或10.0-16.5×106 個細胞/毫升。
本發明提供由本發明之方法生產之經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)。
本發明提供生產包含編碼有效負載之聚核苷酸的腺相關病毒(AAV)的方法，其中該方法使用一或多個本發明之BIIC。在某些實施例中，本發明提供用於生產腺相關病毒(AAV)之方法，包括以下步驟中之一或多者：(a)將生物反應器中之病毒生產細胞(VPC)培養至目標細胞密度，其中生物反應器包含細胞培養基；(b)將至少一種經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)引入生物反應器中，其中引入生物反應器中之至少一種BIIC包含至少一種表現BIIC，該至少一種表現BIIC包含至少一種表現Bac，且其中引入生物反應器中之至少一種BIIC包含至少一個有效負載BIIC，該至少一個有效負載BIIC包含至少一個有效負載Bac，且其中引入生物反應器中之BIIC中之至少一者為本發明之BIIC；(c)在引起一或多種VPC內之一或多種AAV生產之條件下在生物反應器中培育VPC，其中該等AAV中之一或多者包含編碼有效負載之聚核苷酸；及(d)自該生物反應器收穫病毒生產池，其中該病毒生產池包含有一或多種包含一或多種AAV之VPC。
在某些實施例中，VPC為昆蟲細胞。在某些實施例中，VPC為Sf9細胞。在某些實施例中，步驟(a)之VPC之目標細胞密度為3.0×106 -3.4×106 個細胞/毫升(例如3.2×106 -3.4×106 個細胞/毫升；例如3.2×106 個細胞/毫升)。
本發明提供藉由本發明方法生產之腺相關病毒(AAV)。本發明提供醫藥組合物，其包含藉由本發明方法生產之AAV。在某些實施例中，醫藥組合物係用於治療及/或預防疾病。在某些實施例中，醫藥組合物可用於治療疾病之方法中，其中該方法包含向個體投與有效量之醫藥。在某些實施例中，醫藥組合物可用於製造用以治療及/或預防疾病之藥劑。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張以下各者之權益：2019年4月29日提交之美國臨時專利申請案第62/839,893號，名稱為SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING GENE THERAPY PRODUCTS IN BIOREACTORS；2019年8月9日提交之美國臨時專利申請案第62/884,827號，名稱為SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING GENE THERAPY PRODUCTS IN BIOREACTORS；2020年4月15日提交之美國臨時專利申請案第63/010,342號，名稱為SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING BACULOVIRAL INFECTED INSECT CELLS (BIICs) IN BIOREACTORS；該等申請案之內容各自以全文引用之方式併入本文中。 I.腺相關病毒(AAV)  概述
腺相關病毒(AAV)為細小病毒科(Parvoviridae family)之小型無包膜二十面體衣殼病毒，其特徵在於單股DNA病毒基因體。細小病毒科病毒由兩種亞科組成：感染脊椎動物之細小病毒亞科(Parvovirinae)，及感染無脊椎動物之濃核病毒亞科(Densovirinae)。細小病毒科包括依賴病毒屬(Dependovirus genus)，其包括AAV，能夠在包括但不限於人類、靈長類動物、牛類、犬類、馬類及綿羊類物種之脊椎動物宿主中複製。
細小病毒及細小病毒科中之其他成員大體描述於Kenneth I. Berns, 「Parvoviridae: The Viruses and Their Replication,」, 第69章, 於Fields Virology(第3版1996)中，其內容以全文引用之方式併入本文中。
已證實AAV由於其相對簡單的結構、其在不整合至宿主基因體中及不複製之情況下感染廣泛細胞(包括靜止及分裂細胞)之能力及其相對良性的免疫原性概況而適用作生物學工具。病毒之基因體可經操縱以含有用於組裝功能性重組病毒或病毒粒子之最少組分，該功能性重組病毒或病毒粒子負載有所需有效負載或經工程改造以靶向特定組織且表現或遞送所需有效負載。 AAV病毒基因體
野生型AAV病毒基因體為長度約5,000個核苷酸(nt)的線性單股DNA (ssDNA)分子。反向末端重複序列(ITR)傳統地在5'端及3'端處封端病毒基因體，為病毒基因體提供複製起點。雖然不希望受理論束縛，但AAV病毒基因體典型地包含兩個ITR序列。這些ITR在ssDNA的5'端及3'端處具有由自補區域(145 nt於野生型AAV中)定義之特徵性T形髮夾結構，形成能量上穩定的雙股區域。該等雙股髮夾結構包含多種功能，包含但不限於藉由充當宿主病毒複製細胞之內源DNA聚合酶複合體的引子來充當DNA複製的起點。
野生型AAV病毒基因體進一步包含用於兩個開放閱讀框架之核苷酸序列，一個用於四種非結構Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，由Rep基因編碼)，且一個用於三種衣殼或結構蛋白(VP1、VP2、VP3，由衣殼基因或Cap基因編碼)。Rep蛋白對於複製及封裝至關重要，而衣殼蛋白經組裝以產生AAV之蛋白外殼，或AAV衣殼。置換性剪接及交替的起始密碼子及啟動子使得自單一開放閱讀框架生產四種不同Rep蛋白及自單一開放閱讀框架生產三種衣殼蛋白。儘管其根據AAV血清型變化，但作為非限制性實例，對於AAV9/hu.14 (US 7,906,111之SEQ ID NO: 123，其關於AAV9/hu.14之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)，VP1係指胺基酸1-736，VP2係指胺基酸138-736，及VP3係指胺基酸203-736。換言之，VP1為全長衣殼序列，而VP2及VP3為整體之較短組分。因此，VP3區域中之序列的變化亦為VP1及VP2之變化，然而，VP3相比於親本序列之百分比差異將最大，因為其為三者中之最短序列。儘管本文中關於胺基酸序列進行描述，但可類似地描述編碼此等蛋白之核酸序列。三種衣殼蛋白一同組裝以產生AAV衣殼蛋白。雖然不希望受理論束縛，但AAV衣殼蛋白通常包含莫耳比為1:1:10之VP1:VP2:VP3。如本文所用，「AAV血清型」主要由AAV衣殼定義。在一些情況下，ITR亦由AAV血清型(例如AAV2/9)特定地描述。
為了用作生物工具，可對野生型AAV病毒基因體進行修飾，以用包含具有至少一個ITR區域之有效負載區域的核酸序列置換rep/cap序列。通常，在重組AAV病毒基因體中，存在兩個ITR區域。rep/cap序列可在生產期間以反式提供，以生成AAV粒子。
除經編碼的異源有效負載之外，AAV載體亦可包含任何天然存在之及/或重組AAV血清型核苷酸序列或變異體之完整或部分病毒基因體。AAV變異體可以核酸水準(基因體或衣殼)及胺基酸水準(衣殼)具有顯著同源序列，以生產在實體及功能上大體等效的構築體，該等構築體藉由類似機制複製且藉由類似機制組裝。參見Chiorini等人, J. Vir. 71: 6823-33(1997)；Srivastava等人, J. Vir. 45:555-64 (1983)；Chiorini等人, J. Vir. 73:1309-1319 (1999)；Rutledge等人, J. Vir. 72:309-319 (1998)；及Wu等人, J. Vir. 74: 8635-47 (2000)，其關於AAV變異體及等效物之內容各自以全文引用的方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子、病毒基因體及/或有效負載，及其使用方法可如WO2017189963中所描述，其關於AAV粒子、病毒基因體及/或有效負載之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
本發明之AAV粒子可調配成本發明之基因療法調配物中的任一者，包含熟習此項技術者顯而易知的此類調配物之任何變化形式。本申請案中提及的「AAV粒子」、「AAV粒子調配物」及「經調配AAV粒子」係指可經調配之AAV粒子及經調配之AAV粒子(均不受限制)。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子為複製缺陷性重組AAV (rAAV)病毒粒子，其病毒基因體內缺乏編碼功能性Rep及Cap蛋白之序列。此等缺陷性AAV粒子可能缺乏大部分或全部親本編碼序列，且基本上僅攜有一或兩個用於遞送至細胞、組織、器官或生物體之AAV ITR序列及所關注之核酸(亦即有效負載)。
在某些實施例中，本發明AAV粒子之病毒基因體包含至少一個控制元件，其提供其中所編碼之編碼序列的複製、轉錄及轉譯。並非所有的控制元件都需要始終存在，只要編碼序列能夠在適當的宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。表現控制元件之非限制性實例包含用於轉錄起始及/或終止之序列、啟動子及/或增強子序列、高效RNA加工信號(諸如剪接及聚腺苷酸化信號)、使細胞質mRNA穩定之序列、增強轉譯功效之序列(例如Kozak共同序列)，增強蛋白質穩定性之序列，及/或促進蛋白質加工及/或分泌之序列。
根據本發明，治療及/或診斷中所用的AAV粒子包含已精煉或減少至所關注之核酸有效負載或負荷之轉導所必需之最少組分的病毒。以此方式，AAV粒子經工程改造為用於特異性遞送、同時缺乏發現於野生型病毒中之有害複製及/或整合特徵的媒劑。
本發明之AAV粒子可以重組方式生產，且可基於腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。如本文所用，「載體」為轉運、轉導或以其他方式充當諸如本文所描述之核酸的異源分子之運載體的任何分子或部分。
除單股AAV病毒基因體(例如ssAAV)以外，本發明亦提供自補AAV (scAAV)病毒基因體。scAAV病毒基因體含有黏接在一起以形成雙股DNA的DNA股。藉由跳過第二股合成，scAAV在細胞中實現快速表現。
在某些實施例中，本發明之AAV病毒基因體為scAAV。在某些實施例中，本發明之AAV病毒基因體為ssAAV。
生產及/或修飾AAV粒子之方法揭示於此項技術中，諸如假型AAV粒子(PCT專利公開案第WO200028004號；第WO200123001號；第WO2004112727號；第WO 2005005610號及第WO 2005072364號，其關於生產及/或修飾AAV粒子之內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。
AAV粒子可經修飾以增強遞送效率。此類經修飾之AAV粒子可經過有效封裝且用於成功地以高頻率及最小毒性感染標靶細胞。在某些實施例中，根據美國公開案第US 20130195801號中所描述方法對AAV粒子之衣殼進行工程改造，其關於修飾AAV粒子以增強遞送效率之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，AAV粒子包含編碼本發明之多肽或蛋白之有效負載構築體及/或區域，且可引入哺乳動物細胞中。在某些實施例中，AAV粒子包含編碼本發明之多肽或蛋白之有效負載構築體及/或區域，且可引入昆蟲細胞中。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子包含具有至少一個ITR區域及有效負載區域之病毒基因體。在某些實施例中，病毒基因體具有兩個ITR。此等兩個ITR在5'端及3'端側接有效負載區域。ITR充當複製起點，包含用於複製之識別位點。ITR包含可互補且對稱配置之序列區。併入本發明之病毒基因體中的ITR可包含天然存在之聚核苷酸序列或以重組方式衍生之聚核苷酸序列。
ITR可衍生自與衣殼相同的血清型，或其衍生物。ITR可具有與衣殼不同之血清型。在某些實施例中，AAV粒子具有超過一個ITR。在非限制性實例中，AAV粒子具有包含兩個ITR之病毒基因體。在某些實施例中，ITR具有彼此相同的血清型。在另一個實施例中，ITR具有不同血清型。非限制性實例包含零個、一個或兩個具有與衣殼相同之血清型的ITR。在某些實施例中，AAV粒子之病毒基因體的兩個ITR均為AAV2 ITR。
獨立地，各ITR之長度可為約100至約150個核苷酸。ITR之長度可為約100-105個核苷酸，長度為106-110個核苷酸，長度為111-115個核苷酸，長度為116-120個核苷酸，長度為121-125個核苷酸，長度為126-130個核苷酸，長度為131-135個核苷酸，長度為136-140個核苷酸，長度為141-145個核苷酸或長度為146-150個核苷酸。在某些實施例中，ITR之長度為140-142個核苷酸。ITR長度之非限制性實例為長度為102、130、140、141、142、145個核苷酸。
在某些實施例中，各ITR之長度可為141個核苷酸。在某些實施例中，各ITR之長度可為130個核苷酸。在某些實施例中，各ITR之長度可為119個核苷酸。 病毒基因體尺寸
在某些實施例中，包括本文所描述之有效負載的AAV粒子可為單股或雙股病毒基因體。病毒基因體尺寸可為小尺寸、中等尺寸、大尺寸或最大尺寸。另外，病毒基因體可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效負載的病毒基因體可為小單股病毒基因體。小單股病毒基因體之尺寸可為2.1至3.5 kb，諸如尺寸為約2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4及3.5 kb。作為非限制性實例，小單股病毒基因體之尺寸可為3.2 kb。作為另一非限制性實例，小單股病毒基因體之尺寸可為2.2 kb。另外，病毒基因體可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效負載的病毒基因體可為小雙股病毒基因體。小雙股病毒基因體之尺寸可為1.3至1.7 kb，諸如尺寸為約1.3、1.4、1.5、1.6及1.7 kb。作為非限制性實例，小雙股病毒基因體之尺寸可為1.6 kb。另外，病毒基因體可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效負載的病毒基因體(例如聚核苷酸、siRNA或dsRNA)可為中等單股病毒基因體。中等單股病毒基因體之尺寸可為3.6至4.3 kb，諸如尺寸為約3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2及4.3 kb。作為非限制性實例，中等單股病毒基因體之尺寸可為4.0 kb。另外，病毒基因體可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效負載的病毒基因體可為中等雙股病毒基因體。中等雙股病毒基因體之尺寸可為1.8至2.1 kb，諸如尺寸為約1.8、1.9、2.0及2.1 kb。作為非限制性實例，中等雙股病毒基因體之尺寸可為2.0 kb。另外，病毒基因體可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效負載的病毒基因體可為大單股病毒基因體。大單股病毒基因體之尺寸可為4.4至6.0 kb，諸如尺寸為約4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9及6.0 kb。作為非限制性實例，大單股病毒基因體之尺寸可為4.7 kb。作為另一非限制性實例，大單股病毒基因體之尺寸可為4.8 kb。作為又一個非限制性實例，大單股病毒基因體之尺寸可為6.0 kb。另外，病毒基因體可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，包括本文所描述之有效負載的病毒基因體可為大雙股病毒基因體。大雙股病毒基因體之尺寸可為2.2至3.0 kb，諸如尺寸為約2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9及3.0 kb。作為非限制性實例，大雙股病毒基因體之尺寸可為2.4 kb。另外，病毒基因體可包括啟動子及polyA尾。
在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包括至少一個填充子區域。在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包括至少一個多選殖位點(MCS)區域。在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包括至少一個啟動子區。在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包括至少一個外顯子區域。在某些實施例中，本發明之病毒基因體可包括至少一個內含子區域。 病毒基因體區域：反向末端重複序列(ITR)
本發明之AAV粒子包括具有至少一個反向末端重複序列(ITR)區域及有效負載區域之病毒基因體。在某些實施例中，病毒基因體具有兩個ITR。此等兩個ITR在5'端及3'端側接有效負載區域。ITR充當複製起點，包括用於複製之識別位點。ITR包括可互補且對稱配置之序列區。併入本發明之病毒基因體中的ITR可包括天然存在之聚核苷酸序列或以重組方式衍生之聚核苷酸序列。
ITR可衍生自與衣殼相同的血清型，或其衍生物。ITR可具有與衣殼不同之血清型。在某些實施例中，AAV粒子具有超過一個ITR。在非限制性實例中，AAV粒子具有包括兩個ITR的病毒基因體。在某些實施例中，ITR具有彼此相同的血清型。在另一個實施例中，ITR具有不同血清型。非限制性實例包括零個、一個或兩個具有與衣殼相同之血清型的ITR。在某些實施例中，AAV粒子之病毒基因體的兩個ITR均為AAV2 ITR。
獨立地，各ITR之長度可為約100至約150個核苷酸。ITR之長度可為約100-105個核苷酸，長度為106-110個核苷酸，長度為111-115個核苷酸，長度為116-120個核苷酸，長度為121-125個核苷酸，長度為126-130個核苷酸，長度為131-135個核苷酸，長度為136-140個核苷酸，長度為141-145個核苷酸或長度為146-150個核苷酸。在某些實施例中，ITR之長度為140-142個核苷酸。ITR長度之非限制性實例為長度為102、130、140、141、142、145個核苷酸，及與其具有至少95%一致性之彼等核苷酸。
在某些實施例中，各ITR之長度可為141個核苷酸。在某些實施例中，各ITR之長度可為130個核苷酸。在某些實施例中，各ITR之長度可為119個核苷酸。
在某些實施例中，AAV粒子包括兩個ITR，且一個ITR之長度為141個核苷酸且另一個ITR之長度為130個核苷酸。在某些實施例中，AAV粒子包括兩個ITR，且兩個ITR之長度均為141個核苷酸。
獨立地，各ITR之長度可為約75至約175個核苷酸。ITR之長度可獨立地為諸如但不限於以下：75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174及175個核苷酸。病毒基因體之ITR之長度可為75-80、75-85、75-100、80-85、80-90、80-105、85-90、85-95、85-110、90-95、90-100、90-115、95-100、95-105、95-120、100-105、100-110、100-125、105-110、105-115、105-130、110-115、110-120、110-135、115-120、115-125、115-140、120-125、120-130、120-145、125-130、125-135、125-150、130-135、130-140、130-155、135-140、135-145、135-160、140-145、140-150、140-165、145-150、145-155、145-170、150-155、150-160、150-175、155-160、155-165、160-165、160-170、165-170、165-175及170-175個核苷酸。作為非限制性實例，病毒基因體包含長度為約105個核苷酸之ITR。作為非限制性實例，病毒基因體包含長度為約141個核苷酸之ITR。作為非限制性實例，病毒基因體包含長度為約130個核苷酸之ITR。作為非限制性實例，病毒基因體包含長度為約105個核苷酸及長度為約141個核苷酸之ITR。作為非限制性實例，病毒基因體包含長度為約105個核苷酸及長度為約130個核苷酸之ITR。作為非限制性實例，病毒基因體包含長度為約130個核苷酸及長度為約141個核苷酸之ITR。 AAV血清型
本發明之AAV粒子可包括或衍生自任何天然或重組AAV血清型。根據本發明，AAV粒子可利用或基於血清型或包括肽，該血清型或肽選自以下中之任一者：VOY101、VOY201、AAVPHP.B (PHP.B)、AAVPHP.A (PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2 (PHP.B2)、AAVPHP.B3 (PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AAVPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A15/G2A3 (G2A3)、AAVG2B4 (G2B4)、AAVG2B5 (G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、AAV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AAV223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、AAV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AAV33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVrh.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AAVLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAVCy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AAVhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、AAVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVhu.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAVhu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVrh.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AAVrh8R、AAVrh8R A586R突變體、AAVrh8R R533A突變體、AAAV、BAAV、羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVhER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、AAVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr3.1、AAV2.5T 、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、AAV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AAV-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-前miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2 、AAV Shuffle 100-1 、AAV Shuffle 100-3、AAV Shuffle 100-7、AAV Shuffle 10-2、AAV Shuffle 10-6、AAV Shuffle 10-8、AAV Shuffle 100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8 、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、AAVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAVLG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AAV54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、AAV128.1/hu.43、真型AAV (ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV 10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV CBr-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAV CBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAV CHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、AAV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CKd-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAV CLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、AAV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAV Clv1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AAV CLv-8、AAV CLv-D1、AAV CLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CLv-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、AAV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV CLv-M7、AAV CLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAV CLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAV CSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、AAV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAV CSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HSC3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8、AAVF9/HSC9、AAVrh20、AAVrh32/33、AAVrh39、AAVrh46、AAVrh73、AAVrh74、AAVhu.26，或其變異體或衍生物。
AAV-DJ序列可包括兩種突變：(1) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)，及(2) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。作為另一非限制性實例，可包括三個突變：(1) K406R，其中胺基酸406處之離胺酸(K；Lys)變為精胺酸(R；Arg)；(2) R587Q，其中胺基酸587處之精胺酸(R；Arg)變為麩醯胺酸(Q；Gln)；及(3) R590T，其中胺基酸590處之精胺酸(R；Arg)變為蘇胺酸(T；Thr)。
在某些實施例中，AAV可為藉由在胺基酸390-627 (VP1編號)中具有突變之AAV9衣殼庫生成的血清型。血清型及對應之核苷酸及胺基酸取代可為但不限於AAV9.1 (G1594C；D532H)、AAV6.2 (T1418A及T1436X；V473D及I479K)、AAV9.3 (T1238A；F413Y)、AAV9.4 (T1250C及A1617T；F417S)、AAV9.5 (A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6 (T1231A；F411I)、AAV9.9 (G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10 (A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11 (A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13 (A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14 (T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16 (A1775T；Q592L)、AAV9.24 (T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26 (A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33 (A1667C；D556A)、AAV9.34 (A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35 (A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40 (A1694T、E565V)、AAV9.41 (A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44 (A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45 (A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46 (G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47 (G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48 (C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50 (A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53 (G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54 (C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55 (T1605A；F535L)、AAV9.58 (C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59 (T1336C；Y446H)、AAV9.61 (A1493T；N498I)、AAV9.64 (C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65 (C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68 (C1510A；P504T)、AAV9.80 (G1441A；G481R)、AAV9.83 (C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87 (T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90 (A1196T；Y399F)、AAV9.91 (T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93 (A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94 (A1675T；M559L)以及AAV9.95 (T1605A；F535L)。
在本文所提及及/或描述之DNA及RNA序列中之任一者中，單字母符號具有以下描述：A為腺嘌呤；C為胞嘧啶；G為鳥嘌呤；T為胸腺嘧啶；U為尿嘧啶；W為弱鹼，諸如腺嘌呤或胸腺嘧啶；S為強核苷酸，諸如胞嘧啶及鳥嘌呤；M為胺基核苷酸，諸如腺嘌呤及胞嘧啶；K為酮核苷酸，諸如鳥嘌呤及胸腺嘧啶；R為嘌呤，腺嘌呤及鳥嘌呤；Y為嘧啶，胞嘧啶及胸腺嘧啶；B為不為A之任何鹼(例如胞嘧啶、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)；D為不為C之任何鹼(例如腺嘌呤、鳥嘌呤及胸腺嘧啶)；H為不為G之任何鹼(例如腺嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶)；V為不為T之任何鹼(例如腺嘌呤、胞嘧啶及鳥嘌呤)；N為任何核苷酸(其不為間隙)；以及Z為零。
在本文所提及及/或描述之胺基酸序列中之任一者中，單字母符號具有以下描述：G (Gly)為甘胺酸；A (Ala)為丙胺酸；L (Leu)為白胺酸；M (Met)為甲硫胺酸；F (Phe)為苯丙胺酸；W (Trp)為色胺酸；K (Lys)為離胺酸；Q (Gln)為麩醯胺酸；E (Glu)為麩胺酸；S (Ser)為絲胺酸；P (Pro)為脯胺酸；V (Val)為纈胺酸；I (Ile)為異白胺酸；C (Cys)為半胱胺酸；Y (Tyr)為酪胺酸；H (His)為組胺酸；R (Arg)為精胺酸；N (Asn)為天冬醯胺；D (Asp)為天冬胺酸；T (Thr)為蘇胺酸；B (Asx)為天冬胺酸或天冬醯胺；J (Xle)為白胺酸或異白胺酸；O (Pyl)為吡咯離胺酸；U (Sec)為硒半胱胺酸；X (Xaa)為任何胺基酸；以及Z (Glx)為麩醯胺酸或麩胺酸。
在某些實施例中，AAV血清型可為或可包括如專利公開案WO2015038958、WO2017100671、WO2016134375、WO2017083722、WO2017015102、WO2017058892、WO2017066764、US9624274、US9475845、US20160369298、US20170145405中所描述之序列、插入、修飾或突變，該等公開案之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV可為藉由基於Cre重組之AAV靶向演化(CREATE)所生產的血清型，如Deverman等人(Nature Biotechnology 34(2):204-209 (2016))所描述，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，AAV血清型可如Jackson等人(Frontiers in Molecular Neuroscience 9:154 (2016))中所描述，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV血清型由於其針對中樞神經系統之細胞的趨向性而經選擇以供使用。在某些實施例中，中樞神經系統之細胞為神經元。在另一個實施例中，中樞神經系統之細胞為星形細胞。
在某些實施例中，AAV血清型由於其針對肌肉之細胞的趨向性而經選擇以供使用。
在某些實施例中，用於轉譯AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子可為如美國專利第US8163543號中所描述之CTG、TTG或GTG，該專利之內容以全文引用之方式併入本文中。
本發明係指由衣殼(Cap)基因編碼之結構衣殼蛋白(包括VP1、VP2及VP3)。此等衣殼蛋白形成諸如AAV之病毒載體之外部蛋白結構外殼(亦即衣殼)。由Cap聚核苷酸合成之VP衣殼蛋白通常包括甲硫胺酸作為肽序列中之第一胺基酸(Met1)，其與對應Cap核苷酸序列中之起始密碼子(AUG或ATG)相關聯。然而，通常使第一甲硫胺酸(Met1)殘基或大體上任何第一胺基酸(AA1)在多肽合成之後或期間藉由諸如Met-胺基肽酶之蛋白質處理酶裂解。此「Met/AA-削減」過程通常與多肽序列中之第二胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、絲胺酸、蘇胺酸等)的對應乙醯化相關。Met-削減通常用VP1及VP3衣殼蛋白進行，但亦可用VP2衣殼蛋白進行。
當Met/AA-削減不完全時，可生產包括病毒衣殼之一或多種(一種、兩種或三種) VP衣殼蛋白之混合物，其中一些可包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)，且其中一些可由於Met/AA-削減而缺乏Met1/AA1胺基酸(Met-/AA-)。關於衣殼蛋白中之Met/AA-削減之進一步論述，參見Jin, 等人 Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis for Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Capsid Proteins.Hum Gene Ther Methods . 2017年10月. 28(5):255-267；Hwang, 等人 N-Terminal Acetylation of Cellular Proteins Creates Specific Degradation Signals.Science . 2010年2月19日. 327(5968): 973-977；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
根據本發明，提及的衣殼蛋白不限於經削減的(Met-/AA-)或未經削減的(Met+/AA+)，且在上下文中可指獨立衣殼蛋白、衣殼蛋白混合物包括之病毒衣殼及/或編碼、描述、生產或獲得本發明之衣殼蛋白的聚核苷酸序列(或其片段)。直接提及的「衣殼蛋白」或「衣殼多肽」(諸如VP1、VP2或VP2)亦可包括VP衣殼蛋白，其包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)，以及對應VP衣殼蛋白，其由於Met/AA-削減而缺乏Met1/AA1胺基酸(Met-/AA-)。
另外，根據本發明，提及的分別包括或編碼一或多種包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA+)之衣殼蛋白的特定SEQ ID NO: (無論是蛋白質抑或核酸)應理解為教示缺乏Met1/AA1胺基酸之VP衣殼蛋白，當檢查序列時，其顯然為僅缺乏第一所列胺基酸(無論是否為Met1/AA1)之任何序列。
作為非限制性實例，提及的長度為736個胺基酸且包括由AUG/ATG起始密碼子編碼之「Met1」胺基酸(Met+)的VP1多肽序列亦可理解為教示長度為735個胺基酸且不包括736個胺基酸Met+序列之「Met1」胺基酸(Met-)的VP1多肽序列。作為第二非限制性實例，提及的長度為736個胺基酸且包括由任何NNN起始密碼子編碼之「AA1」胺基酸(AA1+)的VP1多肽序列亦可理解為教示長度為735個胺基酸且不包括736個胺基酸AA1+序列之「AA1」胺基酸(AA1-)的VP1多肽序列。
提及的由VP衣殼蛋白形成之病毒衣殼(諸如提及的特定AAV衣殼血清型)可併有包括Met1/AA1胺基酸(Met+/AA1+)之VP衣殼蛋白、由於Met/AA1-削減而缺乏Met1/AA1胺基酸(Met-/AA1-)之對應VP衣殼蛋白以及其組合(Met+/AA1+及Met-/AA1-)。
作為非限制性實例，AAV衣殼血清型可包括VP1 (Met+/AA1+)、VP1 (Met-/AA1-)或VP1 (Met+/AA1+)及VP1 (Met-/AA1-)之組合。AAV衣殼血清型亦可包括VP3 (Met+/AA1+)、VP3 (Met-/AA1-)或VP3 (Met+/AA1+)及VP3 (Met-/AA1-)之組合；且亦可包括VP2 (Met+/AA1)及VP2 (Met-/AA1-)之類似視情況存在之組合。 有效負載
本發明之AAV粒子可包含至少一種包含至少一個有效負載區域之有效負載構築體，或使用該至少一種有效負載構築體生產。在某些實施例中，有效負載區域可位於病毒基因體，諸如有效負載構築體之病毒基因體內。在有效負載區域之5'端及/或3'端處可存在至少一個反向末端重複序列(ITR)。在有效負載區域內，可存在啟動子區、內含子區及編碼區。
在某些實施例中，AAV粒子之有效負載區域包含一或多個編碼一或多種有效負載(諸如有效負載多肽或聚核苷酸)之核酸序列。在某些實施例中，AAV粒子之有效負載區域包含一或多個編碼所關注之一或多個多肽或蛋白質的核酸序列。在某些實施例中，AAV粒子之有效負載區域包含一或多個編碼作為治療劑之一或多種調節聚核苷酸(例如RNA或DNA分子)之核酸序列。因此，本發明提供編碼聚核苷酸之病毒基因體，該等聚核苷酸經加工成靶向所關注之基因的小雙股RNA (dsRNA)分子(小干擾RNA、siRNA、miRNA、前miRNA)。本發明亦提供將其用於抑制所關注之基因之對偶基因的基因表現及蛋白生產，以治療疾病、病症及/或病況之方法。
在某些實施例中，有效負載區域可包括於用於生產AAV粒子之有效負載構築體中。在某些實施例中，本發明之有效負載構築體可為穿梭載體，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，本發明之有效負載構築體可為桿狀病毒表現載體(BEV)。在某些實施例中，本發明之有效負載構築體可為包括BEV之BIIC。如本文所用，術語「有效負載Bac」係指包含有效負載構築體及/或有效負載區域之穿梭載體(諸如BEV)。病毒生產細胞(例如Sf9細胞)可用有效負載Bac及/或用包含有效負載Bac之BIIC轉染。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子包含一或多個編碼一或多種有效負載(諸如有效負載多肽或聚核苷酸)之核酸序列，其適用於治療、預防、減輕或改善疾病及/或病症，包括神經疾病及/或病症之醫學領域。在某些實施例中，本發明之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善弗里德希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)或任何源於共濟蛋白之喪失或部分喪失之疾病的醫學領域。在某些實施例中，本發明之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善帕金森氏病(Parkinson's Disease)之醫學領域。在某些實施例中，本發明之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善肌肉萎縮性側索硬化之醫學領域。在某些實施例中，本發明之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善亨汀頓氏舞蹈症(Huntington's Disease)之醫學領域。在某些實施例中，本發明之AAV粒子適用於治療、預防、減輕或改善阿茲海默氏病(Alzheimer's Disease)之醫學領域。 有效負載：多肽及變異體
在某些實施例中，AAV粒子之有效負載區域包含一或多個編碼所關注之多肽或蛋白質之核酸序列。在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼超過一種所關注之多肽之核酸序列。在某些實施例中，編碼一或多種多肽之病毒基因體可複製及封裝至病毒粒子中。經包含病毒基因體之病毒粒子轉導之標靶細胞可在單一標靶細胞中表現一或多種多肽中之每一者。
在AAV粒子有效負載區域編碼多肽的情況下，該多肽可為肽、多肽或蛋白質。作為非限制性實例，有效負載區域可編碼至少一種所關注之治療蛋白。編碼本文所描述之多肽的AAV病毒基因體可適用於人類疾病、病毒、感染獸醫學應用之領域及多種活體內及活體外環境中。
在某些實施例中，向個體投與經調配AAV粒子(其包含病毒基因體)將增加個體之蛋白表現。在某些實施例中，蛋白表現之增加將減少與由有效負載編碼之多肽相關之疾病或病痛的影響及/或症狀。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼所關注之蛋白(亦即有效負載蛋白、治療蛋白)之核酸序列。
由本發明之病毒基因體之有效負載區域編碼的胺基酸序列可轉譯為整個多肽、多個多肽或多肽片段，其獨立地可由一或多個核酸、核酸片段或前述任一者之變異體編碼。如本文所用，「多肽」意謂最常藉由肽鍵連接在一起的胺基酸殘基(天然或非天然)之聚合物。如本文所用，該術語係指具有任何尺寸、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。在一些情況下，所編碼之多肽小於約50個胺基酸，且該多肽隨後稱為肽。若多肽為肽，則其將為至少約2、3、4或至少5個胺基酸殘基長。因此，多肽包含基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、以上各者之片段及其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單分子或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽，且可為締合或連接的。術語多肽亦可適用於其中一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物。
在某些實施例中，提供「多肽變異體」。術語「多肽變異體」係指其胺基酸序列與原生或參考序列不同之分子。相較於原生或參考序列，胺基酸序列變異體可在胺基酸序列內某些位置處具有取代、缺失及/或插入。通常，變異體將與原生或參考序列具有至少約50%一致性(同源性)，且在某些實施例中，其將與原生或參考序列至少約80%或至少約90%一致(同源)。
在某些實施例中，AAV粒子之有效負載區域包含一或多個編碼所關注之多肽或蛋白質之核酸序列。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼超過一種所關注之多肽之核酸序列。在某些實施例中，編碼一或多種多肽之病毒基因體可複製及封裝至病毒粒子中。經包含病毒基因體之病毒粒子轉導之標靶細胞可在單一標靶細胞中表現一或多種多肽中之每一者。
在AAV粒子有效負載區域編碼多肽的情況下，該多肽可為肽、多肽或蛋白質。作為非限制性實例，有效負載區域可編碼至少一種所關注之治療蛋白。編碼本文所描述之多肽的AAV病毒基因體可適用於人類疾病、病毒、感染獸醫學應用之領域及多種活體內及活體外環境中。
在某些實施例中，向個體投與經調配AAV粒子(其包含病毒基因體)將增加個體之蛋白表現。在某些實施例中，蛋白表現之增加將減少與由有效負載編碼之多肽相關之疾病或病痛的影響及/或症狀。
在某些實施例中，可使用本發明之經調配AAV粒子來降低功能能力及日常生活活動的下降，如藉由標準評價系統所量測，諸如但不限於總功能能力(total functional capacity，TFC)量表。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼所關注之蛋白(亦即有效負載蛋白、治療蛋白)之核酸序列。
在某些實施例中，有效負載區域包含編碼蛋白質之核酸序列，該蛋白質包括但不限於抗體、芳族L-胺基酸去羧酶(AADC)、ApoE2、共濟蛋白、運動神經元存活(SMN)蛋白、葡萄糖腦苷脂酶、N-磺基葡糖胺磺基水解酶、N-乙醯基-α-胺基葡糖苷酶、艾杜糖醛2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖苷、棕櫚醯基-蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、battenin、CLN5、CLN6 (linclin)、MFSD8、CLN8、天冬醯轉移酶(ASPA)、顆粒蛋白前體(GRN)、MeCP2、β-半乳糖苷酶(GLB1)及/或巨軸突蛋白(gigaxonin，GAN)。
在某些實施例中，AAV粒子包括具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼AADC之核酸序列或此項技術中已知用於治療帕金森氏病之任何其他有效負載。作為非限制性實例，有效負載可包括序列諸如：NM_001082971.1 (GI: 132814447)、NM_000790.3 (GI: 132814459)、NM_001242886.1 (GI: 338968913)、NM_001242887.1 (GI: 338968916)、NM_001242888.1 (GI: 338968918)、NM_001242889.1 (GI: 338968920)、NM_001242890.1 (GI: 338968922)及其片段或變異體。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼共濟蛋白之核酸序列或此項技術中已知用於治療弗里德希氏共濟失調之任何其他有效負載。作為非限制性實例，有效負載可包含序列諸如：NM_000144.4 (GI: 239787167)、NM_181425.2 (GI: 239787185)、NM_001161706.1 (GI: 239787197)及其片段或變異體。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼SMN之核酸序列或此項技術中已知用於治療脊髓性肌萎縮(SMA)之任何其他有效負載。作為非限制性實例，有效負載可包含序列諸如：NM_001297715.1 (GI: 663070993)、NM_000344.3 (GI: 196115055)、NM_022874.2 (GI: 196115040)及其片段或變異體。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼美國專利公開案第20180258424號所述之疾病相關蛋白(及其片段或變異體)中之任一者的核酸序列；其內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，AAV粒子包括具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼以下國際公開案中之任一者所述之任何疾病相關蛋白(及其片段或變異體)的核酸序列：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，可使用本發明之經調配AAV粒子以改善任何用以量測神經退化性病症/疾病之症狀的評定的效能。此類評定包括但不限於阿茲海默氏病認知評定量表(Alzheimer Disease Assessment Scale-cognitive，ADAS-cog)、簡易精神狀態檢查(Mini-Mental State Examination，MMSE)、老人抑鬱量表(Geriatric Depression Scale，GDS)、功能活動問卷(Functional Activities Questionnaire，FAQ)、日常生活活動(Activities of Daily Living，ADL)、全科醫師認知評定(General Practitioner Assessment of Cognition，GPCOG)、Mini-Cog、簡略心理測試評分(Abbreviated Mental Test Score，AMTS)、畫鐘測試(Clock-drawing test)、6項認知障礙測試(6-item Cognitive Impairment Test，6-CIT)、記憶力測試(Test Your Memory，TYM)、蒙特利爾認知評定(Montreal Cognitive Assessment，MoCa)、阿登布魯克斯認知評定(Addenbrookes Cognitive Assessment，ACE-R)、記憶障礙篩檢(Memory Impairment Screen，MIS)、布里斯托爾日常生活活動量表(Bristol Activities of Daily Living Scale，BADLS)、巴式指數(Barthel Index)、功能獨立性量測(Functional Independence Measure)、工具性日常生活活動(Instrumental Activities of Daily Living)、老人認知減退知情者問卷(Informant Questionnaire on Cognitive Decline in the Elderly，IQCODE)、神經精神評估量表(Neuropsychiatric Inventory)、柯恩-曼斯菲爾德精神激動評估量表(The Cohen-Mansfield Agitation Inventory)、BEHAVE-AD、EuroQol、簡表-36 (Short Form-36)及/或MBR照護者壓力儀器(Caregiver Strain Instrument)，或如Sheehan B (Ther Adv Neurol Disord 5(6):349-358 (2012))中所描述之其他測試中之任一者，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，提供「變異體模擬物」。如本文所用，術語「變異體模擬物」為含有將模擬活化序列之一或多個胺基酸的模擬物。舉例而言，麩胺酸可充當偶磷基-蘇胺酸及/或偶磷基-絲胺酸之模擬物。替代地，變異體模擬物可引起失活或生產含有該模擬物之非活化產物，例如苯丙胺酸可充當酪胺酸之失活性取代；或丙胺酸可充當絲胺酸之失活性取代。
在某些實施例中，提供「胺基酸序列變異體」。術語「胺基酸序列變異體」係指其胺基酸序列與原生或起始序列相比具有一些差異之分子。胺基酸序列變異體可在胺基酸序列內某些位置處具有取代、缺失及/或插入。「原生」或「起始」序列不應與野生型序列混淆。如本文所用，原生或起始序列為相對術語，係指用於比較的原始分子。「原生」或「起始」序列或分子可表示野生型(在自然中所發現之序列)但不一定為野生型序列。
通常，變異體將與原生序列具有至少約70%同源性，及在某些實施例中，其將與原生序列至少約80%或至少約90%同源。在應用於胺基酸序列時，「同源性」定義為在比對序列且視需要引入空隙以達成最大同源性百分比之後，候選胺基酸序列中之殘基與第二序列之胺基酸序列中之殘基一致的百分比。用於比對之方法及電腦程式為此項技術中所熟知。應理解，同源性視一致性百分比之計算而定，但其值可能由於在計算中引入之空隙及罰分而不同。
在應用於胺基酸序列時，「同源物」意謂與第二物種之第二序列大體上一致的其他物種之對應序列。
「類似物」意謂包含相差一或多個胺基酸改變(例如胺基酸殘基之取代、添加或缺失)，仍維持親本多肽之特性的多肽變異體。
可將序列標籤或胺基酸，諸如一或多個離胺酸，添加至本發明之肽序列中(例如在N端或C端末端處)。序列標籤可用於肽純化或定位。離胺酸可用於增加肽溶解度或允許生物素標記。替代地，位於肽或蛋白質之胺基酸序列的羧基及胺基端區域的胺基酸殘基可視情況缺失，從而提供截短序列。替代地可視序列之用途而定，例如序列表現為可溶的或與固體載體連接之較大序列的一部分，缺失某些胺基酸(例如，C端或N端殘基)。
在某些實施例中，提供「取代型變異體」。當提及蛋白質時，「取代型變異體」為將原生或起始序列中之至少一個胺基酸殘基移除且將不同胺基酸插入在同一位置處之地點的彼等蛋白質。取代可為單取代，其中分子中僅一個胺基酸經取代，或取代可為多取代，其中同一個分子中兩個或更多個胺基酸經取代。
如本文所用，術語「保守性胺基酸取代」係指用具有相似尺寸、電荷或極性之不同胺基酸取代通常存在於序列中之胺基酸。保守性取代之實例包含將諸如異白胺酸、纈胺酸及白胺酸之非極性(疏水性)殘基取代為另一非極性殘基。同樣地，保守性取代之實例包含將一個極性(親水性)殘基取代為另一極性殘基，諸如在精胺酸與離胺酸之間、在麩醯胺酸與天冬醯胺酸之間及在甘胺酸與絲胺酸之間。另外，以諸如離胺酸、精胺酸或組胺酸之鹼性殘基取代另一鹼性殘基，或以一種諸如天冬胺酸或麩胺酸之酸性殘基取代另一酸性殘基為保守性取代之額外實例。非保守性取代之實例包含將諸如異白胺酸、纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸之非極性(疏水性)胺基酸殘基取代為諸如半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸或離胺酸之極性(親水性)殘基及/或將極性殘基取代為非極性殘基。
在某些實施例中，提供「插入型變異體」。當提及蛋白質時，「插入型變異體」為將一或多個胺基酸緊鄰於原生或起始序列中特定位置處之胺基酸插入的彼等蛋白質。「緊鄰」於胺基酸意謂連接至該胺基酸之α-羧基或α-胺基官能基。
在某些實施例中，提供「缺失型變異體」。當提及蛋白質時，「缺失型變異體」為將原生或起始胺基酸序列中之一或多個胺基酸移除的彼等蛋白質。通常，缺失型變異體將在分子之特定區域缺失一或多個胺基酸。
如本文所用，術語「衍生物」與術語「變異體」同義地使用，且係指已相對於參考分子或起始分子以任何方式加以修飾或變化的分子。在某些實施例中，衍生物包含已用有機蛋白質或非蛋白質衍生劑及轉譯後修飾來加以修飾之原生或起始蛋白質。共價修飾在傳統上藉由使蛋白質之所靶向的胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或末端殘基反應之有機衍生劑反應，或藉由利用在所選重組宿主細胞中起作用的轉譯後修飾機制來進行引入。所得共價衍生物適用於針對鑑別對生物學活性、免疫分析或製備抗蛋白質抗體用於重組糖蛋白免疫親和力純化而言至關重要之殘基的程式。此類修飾在一般技術者之能力範圍內，且無需不正當實驗即可進行。
某些轉譯後修飾由重組宿主細胞對所表現之多肽的作用生產。常使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基在轉譯後脫除醯胺基，變成相應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。替代地，此等殘基在適度酸性條件下脫除醯胺基。任一形式之此等殘基均可存在於根據本發明使用之蛋白質中。
其他轉譯後修飾包含脯胺酸及離胺酸之羥基化、絲胺醯基或羥丁胺醯基殘基之羥基之磷酸化、離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基之甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 第79-86頁 (1983))。
當提及蛋白質時，「特徵」定義為分子中基於獨特胺基酸序列之組分。本發明之蛋白質的特徵包含表面表現特徵(manifestation)、局部構形形狀、摺疊、環、半環、域、半域、位點、端或其任何組合。
如本文所用，當提及蛋白質時，術語「表面表現特徵」係指出現在最外表面上的基於多肽之蛋白質組分。
如本文所用，當提及蛋白質時，術語「局部構形形狀」意謂位於可界定之蛋白質空間內的基於多肽之蛋白質結構表現特徵。
如本文所用，在提及蛋白質時，術語「摺疊」意謂在能量最小化時所得的胺基酸序列之構形。摺疊可出現於摺疊過程之二級或三級時。二級摺疊之實例包含β摺疊及α螺旋。三級摺疊之實例包含由於高能力之聚集或分離而形成的域及區域。以此方式形成之區域包含疏水性及親水性凹處，及其類似物。
如本文所用，在與蛋白質構形相關時，術語「轉角」意謂改變肽或多肽之主鏈方向且可涉及一個、兩個、三個或更多個胺基酸殘基的彎曲。
如本文所用，當提及蛋白質時，術語「環」係指使肽或多肽之主鏈方向反轉且包含四個或更多個胺基酸殘基的肽或多肽結構特徵。Oliva等人已鑑別至少5類之蛋白質環(J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997)。
如本文所用，當提及蛋白質時，術語「半環」係指所鑑別環之一部分，具有衍生出該部分之環的至少半數胺基酸殘基。應理解，環可能並非始終含有偶數個胺基酸殘基。因此，在其中環含有或鑑別為包含奇數個胺基酸之彼等情況下，奇數編號之環的半環將包含該環之整數部分或下一整數部分(環之胺基酸數目/2+/-0.5個胺基酸)。舉例而言，鑑別為7個胺基酸環的環可生產3個胺基酸或4個胺基酸之半環(7/2=3.5+/-0.5為3或4)。
如本文所用，當提及蛋白質時，術語「域」係指具有一或多種可鑑別的結構或功能特徵或特性(例如，結合力、充當蛋白質間相互作用位點)的多肽基元。
如本文所用，當提及蛋白質時，術語「半域」意謂所鑑別域之一部分，具有衍生出該部分之域的至少半數胺基酸殘基。應理解，域可能並非始終含有偶數個胺基酸殘基。因此，在其中域含有或鑑別為包含奇數個胺基酸之彼等情況下，奇數編號之域的半域將包含該域之整數部分或下一整數部分(域之胺基酸數目/2+/-0.5個胺基酸)。舉例而言，鑑別為7個胺基酸域的域可生產3個胺基酸或4個胺基酸之半域(7/2=3.5+/-0.5為3或4)。亦應理解，可在域或半域內鑑別子域，此等子域並不完全具有在其所衍生自之域或半域中所鑑別的全部結構或功能特性。亦應理解，包含本文中之任一域類型的胺基酸不必沿著多肽主鏈相連(亦即，非相鄰胺基酸可在結構上摺疊以生產域、半域或子域)。
如本文所用，當提及蛋白質時，術語「位點」在涉及基於胺基酸之實施例時與「胺基酸殘基」及「胺基酸側鏈」同義地使用。位點表示可在本發明之基於多肽之分子內經修飾、操縱、改變、衍生或變化的肽或多肽內之位置。
如本文所用，當提及蛋白質時，術語「端(termini/terminus)」係指肽或多肽之末端。此類末端並非僅限於肽或多肽之第一或最末位點，而可包含末端區域中之額外胺基酸。本發明之基於多肽的分子可表徵為：具有N端(經具有游離胺基(NH2)之胺基酸封端)及C端(經具有游離羧基(COOH)之胺基酸封端)。在某些實施例中，本發明之蛋白質由藉由二硫鍵或藉由非共價力結合在一起之多個多肽鏈構成(多聚體、寡聚體)。此等類別的蛋白質將具有多個N端及C端。替代地，多肽之端可經修飾以使得視具體情況，其以基於非多肽之部分(諸如有機共軛物)起始或結束。
一旦已將任一該等特徵鑑別或定義為本發明之分子的組分，就可藉由移動、調換、反轉、缺失、隨機化或複製來執行對此等特徵之若干操縱及/或修飾中的任一者。此外，應理解，操縱特徵可生產與修飾本發明分子相同的結果。舉例而言，涉及域缺失之操縱將引起分子長度之改變，正如修飾核酸以編碼小於全長分子一樣。
修飾及操縱可藉由此項技術中已知之方法，諸如定點突變誘發來實現。可隨後使用活體外或活體內分析(諸如本文所描述之彼等分析或此項技術中已知之任何其他適合之篩選分析)來測試所得經修飾之分子的活性。 有效負載：靶向所關注之基因的調節聚核苷酸
本發明包含使用經調配AAV粒子，該等AAV粒子之病毒基因體編碼作為治療劑之調節聚核苷酸，例如RNA或DNA分子。因此，本發明提供編碼聚核苷酸之病毒基因體，該等聚核苷酸經加工成靶向所關注之基因的小雙股RNA (dsRNA)分子(小干擾RNA、siRNA、miRNA、前miRNA)。本發明亦提供將其用於抑制所關注之基因之對偶基因的基因表現及蛋白生產，以治療疾病、病症及/或病況之方法。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼或包含一或多種調節聚核苷酸之核酸序列。在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼所關注之調節聚核苷酸的核酸序列。在本發明之某些實施例中，調節聚核苷酸，例如RNA或DNA分子係呈現為治療劑。由RNA干擾介導之基因靜默可特異性抑制所靶向之基因表現。
在某些實施例中，編碼此類siRNA分子，或siRNA分子之單股的核酸序列係插入至腺相關病毒載體中且引入細胞，尤其中樞神經系統中之細胞中。
由於若干獨特的特徵，已研究將AAV粒子用於siRNA遞送。特徵之非限制性實例包含(i)感染分裂與非分裂細胞之能力；(ii)廣泛的感染性宿主範圍，包含人類細胞；(iii)野生型AAV尚未與任何疾病相關及尚未在經感染細胞中顯示出複製；(iv)缺乏針對載體的細胞介導之免疫反應及(v)宿主染色體中的非整合性質，由此降低長期表現之可能性。此外，經AAV粒子感染對改變細胞基因表現模式的影響極小(Stilwell及Samulski等人,Biotechniques , 2003, 34, 148)。
在某些實施例中，本發明之經編碼siRNA雙螺旋體含有混雜在一起形成雙螺旋結構的反義股及有義股，其中反義股與所關注之靶向基因的核酸序列互補，且其中有義股與所關注之靶向基因的核酸序列同源。在其他態樣中，在各股之3'端存在0、1或2個核苷酸突出端。
本發明之經調配AAV粒子的有效負載可編碼一或多種試劑，其經受RNA干擾(RNAi)誘導之基因表現抑制。本文提供靶向所關注之基因的經編碼siRNA雙螺旋體或經編碼dsRNA (本文中統稱為「siRNA分子」)。例如經編碼siRNA雙螺旋體、經編碼dsRNA或經編碼siRNA或dsRNA前驅體之此類siRNA分子可使細胞，例如星形膠質細胞或微神經膠質細胞、皮質、海馬、內嗅、丘腦、感覺或運動神經元中之基因表現減少或靜默。
RNAi (亦稱為轉錄後基因靜默(PTGS)、抑制或共同遏制)為轉錄後基因靜默方法，其中RNA分子以序列特異性方式抑制基因表現，通常藉由使特定mRNA分子毀壞。RNAi之活性組分為短/小雙股RNA (dsRNA)，稱為小干擾RNA (siRNA)，其通常含有15-30個核苷酸(例如19至25、19至24或19-21個核苷酸)及2-核苷酸3'突出端，且其匹配標靶基因之核酸序列。此等短RNA物種可藉由較大dsRNA的Dicer介導之裂解而在活體內天然生產，且其在哺乳動物細胞中具功能性。
天然表現之小RNA分子(稱為微RNA (miRNA))藉由調控mRNA之表現引發基因靜默。含有RNA誘導之靜默複合物(RISC)的miRNA靶向與miRNA之5'區域(稱為種子區)中之核苷酸2-7及其3'區域之其他鹼基對呈現完美序列互補的mRNA。miRNA介導的基因表現之下調可由標靶mRNA之裂解、標靶mRNA之轉譯抑制或mRNA分解引起。miRNA靶向序列通常位於標靶mRNA之3' UTR中。單一miRNA可靶向超過100個來自各種基因之轉錄本，且一個mRNA可經不同miRNA所靶向。
靶向特定mRNA之siRNA雙螺旋體或dsRNA可設計為AAV粒子之有效負載且引入細胞中用於活化RNAi過程。Elbashir等人證明，21-核苷酸siRNA雙螺旋體(稱為小干擾RNA)能夠在哺乳動物細胞中實現有力且特異性的基因表現減弱而不誘導免疫反應(Elbashir SM等人,Nature , 2001, 411, 494-498)。自此初始報導以來，藉由siRNA進行之轉錄後基因靜默作為用於哺乳動物細胞中基因分析之有效工具迅速出現，且具有生產新穎治療劑之潛力。
siRNA雙螺旋體包含與標靶mRNA同源的有義股及與標靶mRNA互補的反義股，在標靶RNA破壞效率方面提供與使用單股(ss)-siRNA (例如，反義股RNA或反義寡核苷酸)相比多得多的優勢。在多數情況下，需要較高濃度之ss-siRNA來達成對應雙螺旋體之有效基因靜默效力。
在某些實施例中，siRNA分子可經編碼於亦包含分子支架之調節聚核苷酸中。如本文所用，「分子支架」為形成針對其設計或製成後續分子之序列或結構性基礎之構架或起始分子。
在某些實施例中，包含有效負載(例如，siRNA、miRNA或本文所描述之其他RNAi劑)之調節聚核苷酸包含分子支架，該分子支架包含前導5'側接序列，其可具有任何長度且可完全或部分衍生自野生型微RNA序列或完全為人工的。3'側接序列之尺寸及起點可反映5'側接序列。在某些實施例中，5'及3'側接序列中之一者或兩者不存在。
在某些實施例中，分子支架可包含一或多個此項技術中已知之連接子。連接子可使各區域分隔開或使一個分子支架與另一分子支架分隔開。作為非限制性實例，分子支架可為多順反子的。
在某些實施例中，使用以下特性中之至少一者設計調節聚核苷酸：環變異體、種子錯配/凸出/擺動變異體、莖錯配、環變異體及基部莖錯配變異體、種子錯配及基部莖錯配變異體、莖錯配及基部莖錯配變異體、種子擺動及基部莖擺動變異體，或莖序列變異體。
在某些實施例中，本發明提供經調配AAV粒子之用途，該等AAV粒子之病毒基因體編碼作為治療劑之調節聚核苷酸，例如RNA或DNA分子。因此，本發明提供編碼聚核苷酸之病毒基因體，該等聚核苷酸經加工成靶向所關注之基因的小雙股RNA (dsRNA)分子(小干擾RNA、siRNA、miRNA、前miRNA)。本發明亦提供將其用於抑制所關注之基因之對偶基因的基因表現及蛋白生產，以治療疾病、病症及/或病況之方法。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼或包含一或多種調節聚核苷酸之核酸序列。在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼所關注之調節聚核苷酸的核酸序列。在本發明之某些實施例中，調節聚核苷酸，例如RNA或DNA分子係呈現為治療劑。由RNA干擾介導之基因靜默可特異性抑制所靶向之基因表現。
在某些實施例中，有效負載區域包含編碼調節聚核苷酸之核酸序列，該調節聚核苷酸干擾標靶基因表現及/或標靶蛋白生產。在某些實施例中，待抑制/修飾之基因表現或蛋白生產可包含但不限於超氧化歧化酶1 (SOD1)、染色體9開放閱讀框架72 (C9ORF72)、TAR DNA結合蛋白(TARDBP)、脊髓小腦性共濟失調蛋白-3 (ATXN3)、亨汀頓蛋白(huntingtin，HTT)、澱粉樣蛋白前驅蛋白(APP)、載脂蛋白E (ApoE)、微管相關蛋白tau (MAPT)、α-突觸核蛋白(SNCA)、電壓閘控之鈉通道α次單位9 (SCN9A)及/或電壓閘控之鈉通道α次單位10 (SCN10A)。
本發明提供小干擾RNA (siRNA)雙螺旋體(及編碼其之調節聚核苷酸)，其靶向SOD1 mRNA以干擾SOD1之基因表現及/或蛋白生產。本發明亦提供將其用於抑制SOD1之對偶基因的基因表現及蛋白生產，以治療肌肉萎縮性側索硬化(ALS)之方法。在某些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可靶向沿著相應核苷酸序列之任何區段的SOD1。在某些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可靶向SNP之位置處的SOD1或核苷酸序列內之變異體。
本發明提供小干擾RNA (siRNA)雙螺旋體(及編碼其之調節聚核苷酸)，其靶向HTT mRNA以干擾HTT之基因表現及/或蛋白生產。本發明亦提供將其用於抑制HTT之對偶基因的基因表現及蛋白生產，以治療亨汀頓氏舞蹈症(HD)之方法。在某些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可靶向沿著相應核苷酸序列之任何區段的HTT。在某些實施例中，本發明之siRNA雙螺旋體可靶向SNP之位置處的HTT或核苷酸序列內之變異體。
在某些實施例中，AAV粒子包含具有有效負載區域之病毒基因體，該有效負載區域包含編碼以下國際公開案中之任一者所述之任何調節聚核苷酸、RNAi分子、siRNA分子、dsRNA分子及/或RNA雙螺旋體的核酸序列：WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，編碼此類siRNA分子，或siRNA分子之單股的核酸序列係插入至腺相關病毒載體中且引入細胞，尤其中樞神經系統中之細胞中。
由於若干獨特的特徵，已研究將AAV粒子用於siRNA遞送。特徵之非限制性實例包含(i)感染分裂與非分裂細胞之能力；(ii)廣泛的感染性宿主範圍，包含人類細胞；(iii)野生型AAV尚未與任何疾病相關及尚未在經感染細胞中顯示出複製；(iv)缺乏針對載體的細胞介導之免疫反應及(v)宿主染色體中的非整合性質，由此降低長期表現之可能性。此外，經AAV粒子感染對改變細胞基因表現模式的影響極小(Stilwell及Samulski等人,Biotechniques , 2003, 34, 148)。
在某些實施例中，本發明之經編碼siRNA雙螺旋體含有混雜在一起形成雙螺旋結構的反義股及有義股，其中反義股與所關注之靶向基因的核酸序列互補，且其中有義股與所關注之靶向基因的核酸序列同源。在其他態樣中，在各股之3'端存在0、1或2個核苷酸突出端。
根據本發明，靶向所關注之基因之siRNA雙螺旋體之各股的長度可為約19至25、19至24或19至21個核苷酸，諸如長度為約19個核苷酸、20個核苷酸、21個核苷酸、22個核苷酸、23個核苷酸、24個核苷酸或25個核苷酸。
在某些實施例中，siRNA或dsRNA包含至少兩個彼此互補的序列。dsRNA包含具有第一序列之有義股及具有第二序列之反義股。反義股包含實質上與編碼所關注之基因的mRNA之至少一部分互補的核苷酸序列，及互補區之長度為30個或更少核苷酸及至少15個核苷酸。一般而言，dsRNA之長度為19至25、19至24或19至21個核苷酸。在某些實施例中，dsRNA之長度為約15至約25個核苷酸，及在某些實施例中，dsRNA之長度為約25至約30個核苷酸。
當藉由此項技術中已知之方法或如本文所描述之方法分析時，在表現載體中編碼之dsRNA在與由所關注之基因編碼之表現蛋白的細胞接觸後，抑制由所關注之基因編碼之蛋白的表現至少10%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或更高。
根據本發明，設計siRNA分子及測試其降低經培養細胞中之mRNA含量的能力。
在某些實施例中，設計siRNA分子及測試其降低經培養細胞中之所關注之基因含量的能力。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含靶向所關注之基因之至少一種siRNA雙螺旋體及醫藥學上可接受之載劑。在一些態樣中，siRNA雙螺旋體由AAV粒子中之病毒基因體編碼。
在某些實施例中，本發明提供用於抑制/靜默在細胞中之基因表現的方法。在一些態樣中，抑制基因表現係指抑制至少約20%，諸如至少約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95% 及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、35-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。
在某些實施例中，所編碼之siRNA雙螺旋體可用於將由所關注之基因編碼之蛋白質或mRNA之表現減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%，或至少20-30%、20-40%、20-50%、20-60%、20-70%、20-80%、20-90%、20-95%、20-100%、30-40%、35-40%、30-50%、30-60%、30-70%、30-80%、30-90%、30-95%、30-100%、40-50%、40-60%、40-70%、40-80%、40-90%、40-95%、40-100%、50-60%、50-70%、50-80%、50-90%、50-95%、50-100%、60-70%、60-80%、60-90%、60-95%、60-100%、70-80%、70-90%、70-95%、70-100%、80-90%、80-95%、80-100%、90-95%、90-100%或95-100%。作為非限制性實例，蛋白質或mRNA之表現可降低50-90%。作為非限制性實例，蛋白質或mRNA之表現可降低30-70%。作為非限制性實例，蛋白質或mRNA之表現可降低40-70%。
在某些實施例中，經編碼siRNA雙螺旋體可用於降低由所關注之基因編碼及/或在CNS之至少一個區域中轉錄mRNA的蛋白之表現。作為非限制性實例，區域為神經元(例如，皮質神經元)。
在某些實施例中，可將包含此類經編碼siRNA分子的經調配AAV粒子直接引入個體之中樞神經系統中，例如藉由輸注至殼核中。
在某些實施例中，可將包含此類經編碼siRNA分子的經調配AAV粒子直接引入個體之中樞神經系統中，例如藉由輸注至個體的丘腦中。
在某些實施例中，可將包含此類經編碼siRNA分子的經調配AAV粒子直接引入個體之中樞神經系統中，例如藉由輸注至個體的白質中。
在某些實施例中，可將包含此類經編碼siRNA分子的經調配AAV粒子直接引入個體之中樞神經系統中，例如藉由向個體靜脈內投與。
在某些實施例中，本發明之醫藥組合物用作單獨療法。在某些實施例中，本發明之醫藥組合物用於組合療法中。組合療法可與已針對其對運動神經元退化之神經保護作用進行測試之一或多種神經保護劑組合，該等神經保護劑諸如小分子化合物、生長因子及激素。
本發明之經調配AAV粒子的有效負載可編碼一或多種試劑，其經受RNA干擾(RNAi)誘導之基因表現抑制。本文提供靶向所關注之基因的經編碼siRNA雙螺旋體或經編碼dsRNA (本文中統稱為「siRNA分子」)。例如經編碼siRNA雙螺旋體、經編碼dsRNA或經編碼siRNA或dsRNA前驅體之此類siRNA分子可使細胞，例如星形膠質細胞或微神經膠質細胞、皮質、海馬、內嗅、丘腦、感覺或運動神經元中之基因表現減少或靜默。
RNAi (亦稱為轉錄後基因靜默(PTGS)、抑制或共同遏制)為轉錄後基因靜默方法，其中RNA分子以序列特異性方式抑制基因表現，通常藉由使特定mRNA分子毀壞。RNAi之活性組分為短/小雙股RNA (dsRNA)，稱為小干擾RNA (siRNA)，其通常含有15-30個核苷酸(例如19至25、19至24或19-21個核苷酸)及2-核苷酸3'突出端，且其匹配標靶基因之核酸序列。此等短RNA物種可藉由較大dsRNA的Dicer介導之裂解而在活體內天然生產，且其在哺乳動物細胞中具功能性。
在一些實施例中，病毒基因體之調節聚核苷酸可包含至少一個編碼至少一個siRNA分子之核酸序列。若存在超過一個，則核酸序列可獨立地編碼1、2、3、4、5、6、7、8、9或超過9個siRNA分子。
天然表現之小RNA分子(稱為微RNA (miRNA))藉由調控mRNA之表現引發基因靜默。含有RNA誘導之靜默複合物(RISC)的miRNA靶向與miRNA之5'區域(稱為種子區)中之核苷酸2-7及其3'區域之其他鹼基對呈現完美序列互補的mRNA。miRNA介導的基因表現之下調可由標靶mRNA之裂解、標靶mRNA之轉譯抑制或mRNA分解引起。miRNA靶向序列通常位於標靶mRNA之3' UTR中。單一miRNA可靶向超過100個來自各種基因之轉錄本，且一個mRNA可經不同miRNA所靶向。
靶向特定mRNA之siRNA雙螺旋體或dsRNA可設計為AAV粒子之有效負載且引入細胞中用於活化RNAi過程。Elbashir等人證明，21-核苷酸siRNA雙螺旋體(稱為小干擾RNA)能夠在哺乳動物細胞中實現有力且特異性的基因表現減弱而不誘導免疫反應(Elbashir SM等人,Nature , 2001, 411, 494-498)。自此初始報導以來，藉由siRNA進行之轉錄後基因靜默作為用於哺乳動物細胞中基因分析之有效工具迅速出現，且具有生產新穎治療劑之潛力。
siRNA雙螺旋體包含與標靶mRNA同源的有義股及與標靶mRNA互補的反義股，在標靶RNA破壞效率方面提供與使用單股(ss)-siRNA (例如，反義股RNA或反義寡核苷酸)相比多得多的優勢。在多數情況下，需要較高濃度之ss-siRNA來達成對應雙螺旋體之有效基因靜默效力。
前述分子中之任一者可由AAV粒子或病毒基因體編碼。 引入細胞中
本發明之經編碼有效負載可藉由AAV粒子之病毒基因體編碼而引入細胞中。此等AAV粒子可經工程改造及最佳化以便於進入不可輕易改良以進行轉染/轉導之細胞。此外，一些合成病毒載體能夠將有效負載整合至細胞基因體中，由此生產穩定有效負載表現及長期治療作用。以此方式，病毒載體經工程改造為用於特異性遞送，同時不含發現於野生型病毒中之有害複製及/或整合特徵的媒劑。
在某些實施例中，藉由用AAV粒子轉染、感染或轉導細胞來將經編碼有效負載引入細胞中，該AAV粒子包含在細胞中處理時能夠生產有效負載之核酸序列。在某些實施例中，藉由將AAV粒子注射至細胞或組織中來將有效負載引入細胞中，該AAV粒子包含在細胞中處理時能夠生產有效負載之核酸序列。
引入AAV粒子(其包含本文所描述之用於有效負載之核酸序列)的其他方法可包含如美國專利公開案第20120264807號中所描述之光化學內化；該公開案關於光化學內化之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，本文所描述之調配物可含有至少一種AAV粒子，其包含編碼本文所描述之有效負載的核酸序列。在某些實施例中，有效負載可靶向一個標靶位點處的所關注之基因。在另一個實施例中，該調配物包含複數個AAV粒子，各AAV粒子包含編碼有效負載(其靶向不同標靶位點處的所關注之基因)的核酸序列。可靶向2、3、4、5個或超過5個位點處的所關注之基因。
在某些實施例中，可將來自任何相關物種之AAV粒子引入細胞中，相關物種諸如但不限於人類、豬、狗、小鼠、大鼠或猴。
在某些實施例中，經調配AAV粒子可引入與待治療之疾病相關的細胞或組織中。在某些實施例中，可將經調配AAV粒子引入具有高水準之標靶基因之內源性表現的細胞中。在另一實施例中，可將經調配AAV粒子引入具有低水準之標靶基因之內源性表現的細胞中。在某些實施例中，細胞可為具有高AAV轉導效率之細胞。
在某些實施例中，包含編碼本發明之有效負載之核酸序列的經調配AAV粒子可用於將有效負載遞送至中樞神經系統(例如美國專利第6,180,613號；其關於siRNA分子及AAV粒子之遞送及治療用途之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，包含編碼本發明之有效負載之核酸序列的經調配AAV粒子可進一步包含有包含來自非病毒來源之肽的經修飾之衣殼。在其他態樣中，AAV粒子可含有CNS特定嵌合衣殼以便於將經編碼siRNA雙螺旋體遞送至大腦及脊髓中。舉例而言，來自展現CNS趨向性之AAV變異體之帽核苷酸序列的對準可經構築以鑑別可變區(VR)序列及結構。
在某些實施例中，本發明之包含用於siRNA分子之核酸序列的AAV粒子可經調配用於CNS遞送。可使用穿過腦血障之試劑。舉例而言，可將siRNA分子靶向腦血障內皮之一些細胞穿透肽可用於調配靶向所關注之基因之siRNA雙螺旋體。
在某些實施例中，包含編碼本發明之有效負載之核酸序列的經調配AAV粒子可直接投與至CNS。作為非限制性實例，載體包含編碼靶向所關注之基因之siRNA分子的核酸序列。作為非限制性實例，載體包含編碼靶向所關注之基因之多肽的核酸序列。
在某些實施例中，經調配AAV粒子可以治療有效量向個體(例如向個體之CNS)投與。 II.AAV生產  通用病毒生產方法
哺乳動物細胞及/或昆蟲細胞通常用作用於生產rAAV粒子之病毒生產細胞。在各種實施例中，本文所揭示之方法及系統採用昆蟲細胞，例如Sf9細胞。
用於生產rAAV粒子之病毒生產細胞通常包含哺乳動物細胞類型。然而，哺乳動物細胞對rAAV粒子之大規模生產呈現若干併發情況，其包含每個複製細胞病毒粒子之總產率一般較低，以及病毒生產細胞中其他哺乳動物生物材料生產非所需污染的風險較高。因此，昆蟲細胞已變為大規模生產rAAV粒子之置換媒劑。
使用昆蟲細胞之AAV生產系統亦呈現一系列併發情況。舉例而言，高產率地生產rAAV粒子通常需要Rep78相比於Rep52之較低表現。控制Rep78及Rep52於昆蟲細胞中之相對表現因此需要Rep操縱子內之小心設計的控制機制。此等控制機制可包含經個別工程改造之昆蟲細胞啟動子，諸如用於Rep78之ΔIE1啟動子及用於Rep52之PolH啟動子，或Rep編碼核苷酸序列至經獨立工程改造之序列或構築體上之分區。然而，實施此等控制機制通常導致降低之rAAV粒子產率或結構上不穩定之病毒粒子。
在另一實例中，生產rAAV粒子需要裝配形成AAV衣殼之VP1、VP2及VP3蛋白。高產率地生產rAAV粒子需要調節VP1、VP2及VP3之比，其一般應分別為約1:1:10，但相對於10個VP3複本，VP1可在1-2之間變化及/或VP2可在1-2之間變化。此比對於衣殼之品質至關重要，因為過多VP1使衣殼不穩定，且過少VP1將降低病毒之感染性。
野生型AAV使用缺陷剪接方法來控制VP1表現；具有特殊周圍序列(「Kozak」序列)之弱起始密碼子(ACG)用於控制VP2；且標準起始密碼子(ATG)用於VP3表現。然而，在一些桿狀病毒系統中，哺乳動物剪接序列並非始終經識別且無法恰當地控制VP1、VP2及VP3之生產。因此，來自VP2之相鄰核苷酸及ACG起始序列可用於驅動衣殼蛋白生產。不幸的是，對於大部分AAV血清型，此方法產生VP1相比於VP2之比率較低(相對於10個VP3複本＜1)的衣殼。為了更有效地控制VP蛋白質之生產，已使用非典型或起始密碼子，如TTG、GTG或CTG。然而，相對於野生型ATG或ACG起始密碼子，此等起始密碼子可視為次佳的(參見WO2007046703及WO2007148971，其關於AAV衣殼蛋白的生產之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。
在另一實例中，使用桿狀病毒/Sf9系統生產rAAV粒子一般需要廣泛使用之基於穿梭載體的桿狀病毒表現載體系統(BEVs)，其針對大規模AAV生產未經最佳化。病毒蛋白質於基於穿梭載體之BEVs中之異常蛋白水解降解為出人意料的問題，妨礙了使用桿狀病毒/Sf9系統可靠地大規模生產AAV衣殼蛋白。
仍需要在哺乳動物及昆蟲細胞中實現有效且高效地大規模(商業)生產rAAV粒子的方法及系統。
本發明之一或多個實施例詳細闡述於以下隨附說明書中。本發明之其他特徵、目標及優勢將自說明書、圖示及申請專利範圍顯而易見。在實施方式中，除非上下文另有明確規定，否則單數形式亦包括複數形式。除非另外規定，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解相同之含義。在與以引用的方式併入之揭示內容有衝突的情況下，將以本說明書為準。
在某些實施例中，本發明之構築體、聚核苷酸、多肽、載體、血清型、衣殼調配物或粒子可為以下國際公開案中之一者中所描述之任何序列、元件、構築體、系統、目標或製程，可含該序列、元件、構築體、系統、目標或製程，可由該序列、元件、構築體、系統、目標或製程修改，可由該序列、元件、構築體、系統、目標或製程使用，可用於該序列、元件、構築體、系統、目標或製程，可與該序列、元件、構築體、系統、目標或製程一起使用或可由該序列、元件、構築體、系統、目標或製程生產：WO2016073693、WO2017023724、WO2018232055、WO2016077687、WO2016077689、WO2018204786、WO2017201258、WO2017201248、WO2018204803、WO2018204797、WO2017189959、WO2017189963、WO2017189964、WO2015191508、WO2016094783、WO20160137949、WO2017075335；其內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
本發明之AAV生產包含用於生產AAV粒子及病毒載體之製程及方法，該等AAV粒子及病毒載體可接觸標靶細胞以遞送有效負載(例如重組病毒構築體)，該有效負載包含編碼有效負載分子之核苷酸。在某些實施例中，病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體，諸如重組腺相關病毒(rAAV)載體。在某些實施例中，AAV粒子為腺相關病毒(AAV)粒子，諸如重組腺相關病毒(rAAV)粒子。
本發明提供藉由以下生產AAV粒子或病毒載體之方法：(a)使病毒生產細胞與一或多種編碼至少一個AAV衣殼蛋白及/或至少一個AAV複製蛋白之病毒表現構築體及一或多種有效負載構築體載體接觸，其中該有效負載構築體載體包含編碼選自由轉殖基因、聚核苷酸編碼蛋白及調節核酸組成之群之有效負載分子的有效負載構築體；(b)在使得生產至少一種AAV粒子或病毒載體之條件下培養該病毒生產細胞，及(c)分離該至少一種AAV粒子或病毒載體。
在此等方法中，病毒表現構築體可編碼至少一種結構蛋白及/或至少一種非結構蛋白。結構蛋白可包含原生或野生型衣殼蛋白VP1、VP2及/或VP3或嵌合蛋白中之任一者。非結構蛋白可包含原生或野生型Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40蛋白或嵌合蛋白中之任一者。
在某些實施例中，如本文所揭示之rAAV生產方法包含瞬時轉染、病毒轉導及/或電穿孔。
在某些實施例中，病毒生產細胞係選自由哺乳動物細胞及昆蟲細胞組成之群。在某些實施例中，昆蟲細胞包含草地貪夜蛾昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包含Sf9昆蟲細胞。在某些實施例中，昆蟲細胞包含Sf21昆蟲細胞。
本發明之有效負載構築體載體可包含至少一個反向末端重複序列(ITR)及可包含哺乳動物DNA。
亦提供根據本文所描述之方法生產之AAV粒子及病毒載體。
本發明之AAV粒子可調配為具有一或多種可接受之賦形劑的醫藥組合物。
在某些實施例中，AAV粒子或病毒載體可由本文所描述之方法生產。
在某些實施例中，AAV粒子可藉由使病毒生產細胞(例如昆蟲細胞)與至少一種編碼至少一個衣殼蛋白及至少一個AAV複製蛋白之病毒表現構築體以及至少一個有效負載構築體載體接觸來生產。在某些實施例中，可使用編碼至少一個衣殼蛋白及至少一個AAV複製蛋白之單獨的病毒表現構築體。病毒生產細胞可藉由瞬時轉染、病毒轉導及/或電穿孔接觸。有效負載構築體載體可包含編碼有效負載分子(諸如但不限於轉殖基因、聚核苷酸編碼蛋白及調節核酸)之有效負載構築體。病毒生產細胞可在使得生產、分離(例如使用溫度誘導之溶解、機械溶解及/或化學溶解)及/或純化(例如使用過濾、層析及/或免疫親和力純化)至少一種AAV粒子或病毒載體之條件下培養。作為非限制性實例，有效負載構築體載體可包含哺乳動物DNA。
在某些實施例中，使用本文所描述之方法在昆蟲細胞(例如草地貪夜蛾(Sf9)細胞)中生產AAV粒子。作為非限制性實例，使用可包含桿狀病毒轉導之病毒轉導來接觸昆蟲細胞。
在另一實施例中，使用本文所描述之方法在哺乳動物細胞中生產AAV粒子。作為非限制性實例，使用瞬時轉染來接觸哺乳動物細胞。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼至少一種結構蛋白及至少一種非結構蛋白。作為非限制性實例，結構蛋白可包含VP1、VP2及/或VP3衣殼蛋白。作為另一非限制性實例，非結構蛋白可包含Rep78、Rep68、Rep52及/或Rep40複製蛋白。
在某些實施例中，本文所描述之AAV粒子生產方法在病毒生產細胞中生產大於101 、大於102 、大於103 、大於104 或大於105 個AAV粒子。
在某些實施例中，本發明之方法包含使用病毒生產系統在病毒生產細胞中生產病毒粒子，該病毒生產系統包含至少一種病毒表現構築體及至少一種有效負載構築體。至少一種病毒表現構築體及至少一種有效負載構築體可共轉染(例如雙重轉染、三重轉染)至病毒生產細胞中。使用熟習此項技術者已知且常規進行之標準分子生物學技術來完成轉染。病毒生產細胞提供蛋白質表現所需之細胞機構及生產AAV粒子所需之其他生物材料，包含複製有效負載構築體之Rep蛋白及組裝形成圍封複製之有效負載構築體之衣殼的Cap蛋白。自病毒生產細胞提取所得AAV粒子且加工成用於投與之醫藥製劑。
在某些實施例中，用於生產病毒粒子之方法利用病毒生產細胞之種子培養物，該等病毒生產細胞包含一或多種桿狀病毒(例如桿狀病毒表現載體(BEV)或經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)，其已經病毒表現構築體(例如包含於表現Bac中)及有效負載構築體(例如包含於有效負載Bac中)轉染)。在某些實施例中，收穫種子培養物，將其分成等分試樣且冷凍，且可在稍後時間點使用以起始原生生產細胞群體之感染。
大規模生產AAV粒子可利用生物反應器。使用生物反應器實現精確量測及/或控制支持病毒生產細胞之生長及活性的變數，諸如質量、溫度、混合條件(葉輪RPM或波振盪)、CO2 濃度、O2 濃度、氣體噴射速率及體積、氣體覆蓋速率及體積、pH、活細胞密度(VCD)、細胞存活率、細胞直徑及/或光密度(OD)。在某些實施例中，生物反應器用於批量生產，其中整個培養物在以實驗方式確定之時間點收穫且AAV粒子經純化。在另一實施例中，生物反應器用於連續生產，其中一部分培養物在以實驗方式確定之時間點收穫以用於AAV粒子純化，且生物反應器中其餘的培養物用額外的生長培養基組分再新。
在某些實施例中，AAV病毒粒子可在包含細胞溶解、澄清、滅菌及純化之過程中自病毒生產細胞提取。細胞溶解包含破壞病毒生產細胞之結構，由此釋放AAV粒子之任何方法。在某些實施例中，細胞溶解可包含熱衝擊、化學或機械溶解方法。在一些實施例中，細胞溶解以化學方式進行。經溶解細胞之澄清可包含對經溶解細胞、培養基組分及AAV粒子之混合物進行總體純化。在某些實施例中，澄清包含離心及/或過濾，包含但不限於深度末端、切向流及/或中空纖維過濾。
病毒生產之最終結果為經純化AAV粒子集合，其包含兩種組分：(1)有效負載構築體(例如重組病毒基因體構築體)及(2)病毒衣殼。
在某些實施例中，諸如圖1中呈現之實施例，本發明之病毒生產系統或方法包含使用病毒生產細胞(VPC)及質體構築體生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的步驟。來自細胞庫(CB)之病毒生產細胞(VPC)經解凍及擴增，得到目標工作體積及VPC濃度。將所得VPC池分成Rep/Cap VPC池及有效負載VPC池。將一或多種Rep/Cap質體構築體(病毒表現構築體)加工成Rep/Cap穿梭載體聚核苷酸且轉染至Rep/Cap VPC池中。將一或多種有效負載質體構築體(有效負載構築體)加工成有效負載穿梭載體聚核苷酸且轉染至有效負載VPC池中。培育兩個VPC池，以生產P1 Rep/Cap桿狀病毒表現載體(BEV)及P1有效負載BEV。將兩個BEV池擴增成空斑集合，其中選擇單一空斑用於純系空斑(CP)純化(亦稱為單一空斑擴增)。該方法可包含單一CP純化步驟或可包含連續或由其他加工步驟分開之多個CP純化步驟。一或多個CP純化步驟提供CP Rep/Cap BEV池及CP有效負載BEV池。此等兩個BEV池隨後可經儲存及用於未來的生產步驟，或其隨後可轉染至VPC中，以生產Rep/Cap BIIC池及有效負載BIIC池。
在某些實施例中，諸如圖2中呈現之實施例，本發明之病毒生產系統或方法包含使用病毒生產細胞(VPC)及經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)生產AAV粒子的步驟。來自細胞庫(CB)之病毒生產細胞(VPC)經解凍及擴增，得到目標工作體積及VPC濃度。此擴增可包括一或多個小體積擴增步驟直到工作體積為2000-5000 mL，隨後為於大規模生物反應器(例如Wave及/或N-1生物反應器)中的一或多個大體積擴增步驟直到工作體積為25-500 L。將工作體積之病毒生產細胞接種至生產用生物反應器中，且可進一步擴增為具有用於BIIC感染之目標VPC濃度的200-2500 L工作體積。
生產用生物反應器中之工作體積的VPC接著例如以目標VPC:BIIC比及目標BIIC:BIIC比用Rep/Cap BIIC及有效BIIC共感染。VCD感染亦可利用BEV。將共感染之VPC在生產用生物反應器中培育及擴增，以生產批量收穫之AAV粒子及VPC。
在某些實施例中，諸如圖3中呈現之實施例，本發明之病毒生產系統或方法包含藉由處理、澄清及純化批量收穫之AAV粒子及病毒生產細胞來生產藥物物質的步驟。經由細胞破壞及溶解(例如，化學溶解及/或機械溶解)，接著核酸酶處理溶解池，藉此生產粗溶解物池，來處理批量收穫之AAV粒子及VPC (於生產用生物反應器內)。經由一或多個過濾及澄清步驟(包含深層過濾及微過濾)處理粗溶解物池，得到澄清溶解物池。澄清溶解物池經由一或多個層析及純化步驟處理，該等步驟包含親和層析(AFC)及離子交換層析(AEX或CEX)，得到純化產物池。隨後視情況經由奈米過濾及隨後經由切向流過濾(TFF)處理純化產物池。TFF方法包含串聯或交替之一或多個透濾(DF)步驟及一或多個超過濾(UF)步驟。產物池經由病毒截留性過濾(VRF)及另一過濾步驟進一步處理，得到藥物物質池。藥物物質池可進一步過濾，接著等分至小瓶中以用於儲存及處理。 病毒表現構築體
本發明之病毒生產系統包含一或多種病毒表現構築體，其可經轉染/轉導至病毒生產細胞(例如Sf9)中。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或有效負載構築體可為穿梭載體，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為桿狀病毒表現載體(BEV)。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為包括BEV之BIIC。如本文所用，術語「表現Bac」或「Rep/Cap Bac」係指包含病毒表現構築體及/或病毒表現區域之穿梭載體(諸如BEV)。病毒生產細胞(例如Sf9細胞)可用表現Bac及/或用包含表現Bac之BIIC轉染。
在某些實施例中，病毒表現區域包含蛋白質編碼核苷酸序列及至少一個用於在病毒生產細胞中表現之表現控制序列。在某些實施例中，病毒表現區域包含蛋白質編碼核苷酸序列，其可操作地連接於至少一個用於在病毒生產細胞中表現之表現控制序列。在某些實施例中，病毒表現構築體含有在一或多個啟動子控制下之細小病毒基因。細小病毒基因可包含編碼非結構AAV複製蛋白之核苷酸序列，諸如編碼Rep52、Rep40、Rep68或Rep78蛋白之Rep基因，例如Rep78及Rep52之組合。細小病毒基因可包含編碼結構AAV蛋白之核苷酸序列，諸如Cap基因，其編碼VP1、VP2及VP3蛋白。
本發明之病毒生產系統不受用於將細小病毒功能引入病毒複製細胞中之病毒表現載體的限制。病毒表現構築體於病毒複製細胞中之存在不必為永久的。病毒表現構築體可藉由任何已知方式引入，例如藉由細胞化學處理、電穿孔或感染。
本發明之病毒表現構築體可包含任何化合物或調配物、生物或化學物質，其便於細胞經核酸轉化、轉染或轉導。例示性生物病毒表現構築體包含質體、線性核酸分子及重組病毒，包括桿狀病毒。例示性化學載體包含脂質複合物。病毒表現構築體用於將核酸序列併入至根據本發明之病毒複製細胞中。(O'Reilly, David R., Lois K. Miller及Verne A. Luckow. Baculovirus expression vectors: a laboratory manual. Oxford University Press, 1994.)；Maniatis等人, 編. Molecular Cloning. CSH Laboratory, NY, N.Y. (1982)；及Philiport 及Scluber, 編. Liposoes as tools in Basic Research and Industry. CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)，其關於病毒表現構築體及其用途之內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體為AAV表現構築體，其包含一或多個編碼非結構AAV複製蛋白、結構AAV衣殼蛋白或其組合之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現區域為包含一或多個編碼非結構AAV複製蛋白、結構AAV衣殼蛋白或其組合之核苷酸序列的表現構築體之AAV表現區域。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為質體載體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為桿狀病毒構築體。
本發明不受限於用於生產AAV粒子或病毒載體之病毒表現構築體的數目。在某些實施例中，一個、兩個、三個、四個、五個、六個或更多個病毒表現構築體可用於在根據本發明之病毒生產細胞中生產AAV粒子。在一個非限制性實例中，五個表現構築體可個別地編碼AAV VP1、AAV VP2、AAV VP3、Rep52、Rep78，且伴隨的有效負載構築體包含有效負載聚核苷酸及至少一個AAV ITR。在另一實施例中，表現構築體可用於表現例如Rep52及Rep40，或Rep78及Rep 68。表現構築體可包含VP1、VP2、VP3、Rep52/Rep40及Rep78/Rep68編碼序列之任何組合。
在本發明之某些實施例中，病毒表現構築體可用於在昆蟲細胞中生產AAV粒子。在某些實施例中，可對衣殼及/或rep基因之野生型AAV序列進行修改，例如以改良病毒粒子之屬性，諸如增強感染性或特異性，或提高產率。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼具有併入之Gly-Ala重複區域之細小病毒衣殼的組分，該重複區可充當免疫侵入序列，如美國專利申請案20110171262中所描述，其關於細小病毒衣殼蛋白之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在本發明之某些實施例中，病毒表現構築體可用於在昆蟲細胞中生產AAV粒子。在某些實施例中，可對衣殼及/或rep基因之野生型AAV序列進行修改，例如以改良病毒粒子之屬性，諸如增強感染性或特異性，或提高自昆蟲細胞之產率。VP- 編碼區
在某些實施例中，病毒表現構築體可包含VP-編碼區；VP-編碼區為包含編碼VP1、VP2、VP3或其組合之VP核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包含VP1-編碼區；VP1-編碼區為包含編碼VP1蛋白之VP1核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包含VP2-編碼區；VP2-編碼區為包含編碼VP2蛋白之VP2核苷酸序列的核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包含VP3-編碼區；VP3-編碼區為包含編碼VP3蛋白之VP3核苷酸序列的核苷酸序列。
在某些實施例中，VP-編碼區編碼特定AAV血清型之一或多種AAV衣殼蛋白。VP-編碼區之AAV血清型可相同或不同。在某些實施例中，VP-編碼區可經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區或核苷酸序列可針對哺乳動物細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區或核苷酸序列可針對昆蟲細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區或核苷酸序列可針對草地貪夜蛾細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區或核苷酸序列可針對Sf9或Sf21細胞株經密碼子最佳化。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含第一VP-編碼區，其包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含編碼一或多種選自VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含編碼VP1、VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含僅僅編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白但並非VP1之核苷酸序列。
在某些實施例中，核酸構築體包含第二VP-編碼區，其包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列。在某些實施例中，第二VP-編碼區包含編碼VP1 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第二VP-編碼區包含僅僅編碼VP1 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第二VP-編碼區包含編碼VP1 AAV衣殼蛋白但並非VP2或VP3之核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體為經工程改造之核酸構築體。在某些實施例中，病毒表現構築體包含第一核苷酸序列，其包含第一VP-編碼區及第二VP-編碼區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含第一開放閱讀框架(ORF)，其包含第一VP-編碼區，及第二開放閱讀框架(ORF)，其包含第二VP-編碼區。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含第一核苷酸序列，其包含第一VP-編碼區及第二核苷酸序列，其包含第二VP-編碼區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含第一開放閱讀框架(ORF)，其包含第一VP-編碼區，且第二核苷酸序列包含第二開放閱讀框架(ORF)，其包含第二VP-編碼區。在某些實施例中，第一開放閱讀框架不同於第二開放閱讀框架。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含第一VP-編碼區，其包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列；及第二VP-編碼區，其包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含編碼VP1、VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列；且第二VP-編碼區包含僅僅編碼VP1 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含編碼VP1、VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列；且第二VP-編碼區包含編碼VP1 AAV衣殼蛋白但並非VP2或VP3之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含僅僅編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列；且第二VP-編碼區包含僅僅編碼VP1 AAV衣殼蛋白之核苷酸序列。在某些實施例中，第一VP-編碼區包含編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白但並非VP1之核苷酸序列；及第二VP-編碼區，其包含編碼VP1 AAV衣殼蛋白但並非VP2或VP3之核苷酸序列。
在某些實施例中，第一VP-編碼區編碼AAV血清型，例如AAV2之AAV衣殼蛋白。在某些實施例中，第二VP-編碼區編碼AAV血清型，例如AAV2之AAV衣殼蛋白。在某些實施例中，第一VP-編碼區之AAV血清型與第二VP-編碼區之AAV血清型相同。在某些實施例中，第一VP-編碼區之AAV血清型與第二VP-編碼區之AAV血清型不同。在某些實施例中，VP-編碼區可針對昆蟲細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，VP-編碼區可針對草地貪夜蛾細胞經密碼子最佳化。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含：(i)第一核苷酸序列，該第一核苷酸序列包含第一表現控制區，其包含第一啟動子序列，以及第一VP-編碼區，其包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列；及(ii)第二核苷酸序列，該第二核苷酸序列包含第二表現控制區，其包含第二啟動子序列，以及第二VP-編碼區，其包含編碼VP1 AAV衣殼蛋白但並非VP2或VP3之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體包含：(i)第一核苷酸序列，該第一核苷酸序列包含第一表現控制區，其包含第一啟動子序列，以及第一VP-編碼區，其包含編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白但並非VP1之核苷酸序列；及(ii)第二核苷酸序列，該第二核苷酸序列包含第二表現控制區，其包含第二啟動子序列，以及第二VP-編碼區，其包含編碼VP1 AAV衣殼蛋白但並非VP2或VP3之核苷酸序列。在某些實施例中，第二VP-編碼區之核苷酸序列經密碼子最佳化。在某些實施例中，第二VP-編碼區之核苷酸序列針對昆蟲細胞，或更特定言之，針對草地貪夜蛾細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，第二VP-編碼區之核苷酸序列經密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%、小於90%或小於80%之核苷酸同源性。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含：(i)第一核苷酸序列，該第一核苷酸序列包含第一表現控制區，其包含第一啟動子序列；第一起始密碼子區，其包含第一起始密碼子；第一VP-編碼區，其包含編碼一或多種選自VP1、VP2及VP3之AAV衣殼蛋白的核苷酸序列；及第一終止密碼子區，其包含第一終止密碼子；以及 (ii)第二核苷酸序列，該第二核苷酸序列包含第二表現控制區，其包含第二啟動子序列；第二起始密碼子區，其包含第二起始密碼子；第二VP-編碼區，其包含編碼VP1 AAV衣殼蛋白但並非VP2或VP3之核苷酸序列；及第二終止密碼子區，其包含第二終止密碼子。在某些實施例中，核酸構築體包含：(i)第一核苷酸序列，該第一核苷酸序列包含第一表現控制區，其包含第一啟動子序列；第一起始密碼子區，其包含第一起始密碼子；第一VP-編碼區，其包含編碼VP2及VP3 AAV衣殼蛋白但並非VP1之核苷酸序列；及第一終止密碼子區，其包含第一終止密碼子；以及(ii)第二核苷酸序列，該第二核苷酸序列包含第二表現控制區，其包含第二啟動子序列；第二起始密碼子區，其包含第二起始密碼子；第二VP-編碼區，其包含編碼VP1 AAV衣殼蛋白但並非VP2或VP3之核苷酸序列；及第二終止密碼子區，其包含第二終止密碼子。在某些實施例中，第一起始密碼子為ATG，第二起始密碼子為ATG，或第一及第二起始密碼子均為ATG。
在某些實施例中，編碼VP1衣殼蛋白之核苷酸序列可經密碼子最佳化。在某些實施例中，編碼VP1衣殼蛋白之核苷酸序列可針對昆蟲細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，編碼VP2衣殼蛋白之核苷酸序列可經密碼子最佳化。在某些實施例中，編碼VP2衣殼蛋白之核苷酸序列可針對昆蟲細胞經密碼子最佳化。在某些實施例中，編碼VP3衣殼蛋白之核苷酸序列可經密碼子最佳化。在某些實施例中，編碼VP3衣殼蛋白之核苷酸序列可針對昆蟲細胞經密碼子最佳化。
在某些實施例中，編碼VP1衣殼蛋白之核苷酸序列可經密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，經密碼子最佳化之VP1核苷酸序列與參考VP1核苷酸序列之間的核苷酸同源性為小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
在某些實施例中，編碼VP2衣殼蛋白之核苷酸序列可經密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，經密碼子最佳化之VP1核苷酸序列與參考VP1核苷酸序列之間的核苷酸同源性為小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
在某些實施例中，編碼VP3衣殼蛋白之核苷酸序列可經密碼子最佳化以與參考核苷酸序列具有小於100%之核苷酸同源性。在某些實施例中，經密碼子最佳化之VP1核苷酸序列與參考VP1核苷酸序列之間的核苷酸同源性為小於100%、小於99%、小於98%、小於97%、小於96%、小於95%、小於94%、小於93%、小於92%、小於91%、小於90%、小於89%、小於88%、小於87%、小於86%、小於85%、小於84%、小於83%、小於82%、小於81%、小於80%、小於78%、小於76%、小於74%、小於72%、小於70%、小於68%、小於66%、小於64%、小於62%、小於60%、小於55%、小於50%及小於40%。
病毒表現構築體之結構VP蛋白質VP1、VP2及VP3可在單一開放閱讀框架中編碼，該單一開放閱讀框架藉由利用選擇式剪接受體及非典型轉譯起始密碼子來調控。VP1、VP2及VP3可自單一轉錄本轉錄及轉譯，其中框架中及/或框架外起始密碼子均經工程改造以控制由核苷酸轉錄本生產之VP1:VP2:VP3比。在某些實施例中，VP1可生產自僅僅編碼VP1之序列。如本文所用，術語「僅用於VP1」或「僅VP1」係指編碼VP1衣殼蛋白及(i)缺乏VP1序列(亦即缺失型或突變型)內用於自相同序列完全轉錄或轉譯VP2及VP3所需之起始密碼子；(ii)包含VP1序列內阻止VP2及VP3自相同序列轉錄或轉譯之額外密碼子；或(iii)包含VP1之起始密碼子(例如ATG)，以使得VP1為由核苷酸轉錄本生產之初級VP蛋白質的核苷酸序列或轉錄本。
在某些實施例中，VP2可生產自僅僅編碼VP2之序列。如本文所用，術語「僅用於VP2」或「僅VP2」係指編碼VP2衣殼蛋白之核苷酸序列或轉錄本且：(i)核苷酸轉錄本為僅僅編碼VP2及VP3衣殼蛋白之完整VP衣殼序列的截短變異體；及(ii)其包含VP2之起始密碼子(例如ATG)，以使得VP2為由核苷酸轉錄本生產之初級VP蛋白質。
在某些實施例中，VP1及VP2可生產自僅僅編碼VP1及VP2之序列。如本文所用，術語「僅用於VP1及VP2」或「僅VP1及VP2」係指編碼VP1及VP2衣殼蛋白及(i)缺乏VP序列(亦即缺失型或突變型)內用於自相同序列完全轉錄或轉譯VP3所需之起始密碼子；(ii)包含VP序列內阻止VP3自相同序列轉錄或轉譯之額外密碼子；(iii)包含VP1之起始密碼子(例如ATG)及VP2之起始密碼子(例如ATG)，以使得VP1及VP2為由核苷酸轉錄本生產之初級VP蛋白質；或(iv)包含由連接子，諸如IRES區連接之僅VP1之核苷酸轉錄本及僅VP2之核苷酸轉錄本的核苷酸序列或轉錄本。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包含起始密碼子區之核苷酸序列，諸如編碼包含一或多個起始密碼子區之AAV衣殼蛋白的序列。在某些實施例中，起始密碼子區可在表現控制序列內。起始密碼子可為ATG或非ATG密碼子(亦即，次佳起始密碼子，其中AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子為非ATG)。在某些實施例中，用於AAV生產之病毒表現構築體可含有編碼AAV衣殼蛋白之核苷酸序列，其中AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子為非ATG，亦即次佳起始密碼子，其允許在生產系統中表現經修改比率之病毒衣殼蛋白，得到經改良之宿主細胞感染性。在非限制性實例中，病毒構築體載體可含有核酸構築體，其包含編碼AAV VP1、VP2及VP3衣殼蛋白之核苷酸序列，其中用於轉譯AAV VP1衣殼蛋白之起始密碼子為CTG、TTG或GTG，如美國專利第US8,163,543號中所描述，其關於AAV衣殼蛋白及其生產之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。 Rep-編碼區
在某些實施例中，病毒表現構築體可包含Rep52-編碼區。Rep52-編碼區為包含編碼Rep52蛋白質之Rep52核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包含Rep78-編碼區。Rep78-編碼區為包含編碼Rep78蛋白質之Rep78核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包含Rep40-編碼區。Rep40-編碼區為包含編碼Rep40蛋白質之Rep40核苷酸序列之核苷酸序列。在某些實施例中，病毒表現構築體可包含Rep68-編碼區。Rep68-編碼區為包含編碼Rep68蛋白質之Rep68核苷酸序列之核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含第一核苷酸序列，其包含：Rep52-編碼區，其包含編碼Rep52蛋白質之Rep52序列；Rep78-編碼區，其包含編碼Rep78蛋白質之Rep78序列，或其組合。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep52-編碼區及Rep78-編碼區兩者。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含單一開放閱讀框架、基本上由單一開放閱讀框架組成或由單一開放閱讀框架組成。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含：第一開放閱讀框架，其包含Rep52-編碼區；及第二開放閱讀框架，其包含Rep78-編碼區，且其不同於第一開放閱讀框架。
在某些實施例中，病毒表現構築體之非結構蛋白Rep52及Rep78可在單一開放閱讀框架中編碼，該單一開放閱讀框架藉由利用選擇式剪接受體及非典型轉譯起始密碼子來調控。
Rep78及Rep52均可自單一轉錄本轉譯：Rep78轉譯起始於第一起始密碼子(AUG或非AUG)，且Rep52轉譯起始自Rep78序列內之Rep52起始密碼子(例如AUG)。Rep78及Rep52亦可自具有獨立起始密碼子之獨立轉錄本轉譯。Rep78序列內之Rep52起始密碼子可經突變、修飾或移除，使得經修飾之Rep78序列之加工將不生產Rep52蛋白質。
在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體可為質體載體或桿狀病毒構築體，其編碼細小病毒rep蛋白質以表現於昆蟲細胞中。在某些實施例中，單一編碼序列用於Rep78及Rep52蛋白質，其中用於轉譯Rep78蛋白質之起始密碼子為次佳起始密碼子，其選自由ACG、TTG、CTG及GTG組成之群，其在昆蟲細胞中之表現時影響部分外顯子跳躍，如美國專利第8,512,981號中所描述，其關於Rep78之充分表現的促進相較於Rep52較低，以促成載體產率提高之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體可為用於在含有具有不同密碼子偏差之重複密碼子的昆蟲細胞中表現之質體載體或桿狀病毒構築體，例如以達成Rep蛋白質(例如Rep78及Rep52)之經改良比率，藉此改良昆蟲細胞中病毒表現構築體及/或有效負載構築體載體之大規模(市售)生產，如美國專利第8,697,417號中所教示，其關於AAV複製蛋白及其生產之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某一實施例中，可使用如美國專利第8,642,314號中所描述之方法及構築體達成Rep蛋白質之經改良比率，其關於AAV複製蛋白及其生產之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體可編碼突變型細小病毒Rep多肽，該多肽與其對應野生型Rep多肽相比具有一或多種改良之特性，諸如製備較高病毒效價以用於大規模生產。替代地，其可能能夠允許生產品質更佳之病毒粒子或維持更穩定的病毒生產。在非限制性實例中，病毒表現構築體可編碼具有突變型核定位序列或鋅指域之突變Rep多肽，如美國專利第US 20130023034號中所描述，其關於AAV複製蛋白及其生產之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，核酸構築體包含第一核苷酸序列，及第二核苷酸序列，其與第一核苷酸序列在核酸構築體內分離。在某些實施例中，核酸構築體包含第一核苷酸序列，其包含Rep52-編碼區，以及獨立第二核苷酸序列，其包含Rep78-編碼區。在某些實施例中，核酸構築體包含第一核苷酸序列及獨立第二核苷酸序列；其中該第一核苷酸序列包含Rep52-編碼區及2A序列區；且其中該第二核苷酸序列包含Rep78-編碼區及2A序列區。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep52-編碼區及2A序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep78-編碼區及2A序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep52-編碼區、Rep78-編碼區及2A序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含在核苷酸序列上位於Rep52-編碼區與Rep78-編碼區之間的2A序列區。在某些實施例中，第一核苷酸依序自5'端至3'端包含Rep52-編碼區、2A序列區及Rep78-編碼區。在某些實施例中，第一核苷酸依序自5'端至3'端包含Rep78-編碼區、2A序列區及Rep52-編碼區。
舉例而言，在某些實施例中，第一核苷酸序列包含起始密碼子區、Rep52-編碼區、2A序列區及終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含起始密碼子區、Rep78-編碼區、2A序列區及終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含起始密碼子區、Rep52-編碼區、2A序列區、Rep78-編碼區及終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸依序自5'端至3'端包含起始密碼子區、Rep52-編碼區、2A序列區、Rep78-編碼區及終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸依序自5'端至3'端包含起始密碼子區、Rep78-編碼區、2A序列區、Rep52-編碼區及終止密碼子區。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含一或多個必需基因型區域，其包含編碼核酸構築體之必需蛋白質的必需基因型核苷酸序列。在某些實施例中，必需基因型核苷酸序列為編碼必需桿狀病毒蛋白質之桿狀病毒序列。在某些實施例中，必需桿狀病毒蛋白質為桿狀病毒包膜蛋白或桿狀病毒衣殼蛋白。舉例而言，在某些實施例中，核酸構築體包含第一核苷酸序列及獨立第二核苷酸序列；其中該第一核苷酸序列包含Rep52-編碼區及第一必需基因型區域；且其中該第二核苷酸序列包含Rep78-編碼區及第二必需基因型區域。在某些實施例中，核酸構築體包含第一核苷酸序列及獨立第二核苷酸序列；其中該第一核苷酸序列包含Rep52-編碼區、2A序列區及第一必需基因型區域；且其中該第二核苷酸序列包含Rep78-編碼區、2A序列區及第二必需基因型區域。在某些實施例中，核酸構築體包含第一核苷酸序列及獨立第二核苷酸序列；其中該第一核苷酸序列依序包含Rep52-編碼區、2A序列區及第一必需基因型區域；且其中該第二核苷酸序列依序包含Rep78-編碼區、2A序列區及第二必需基因型區域。
在某些實施例中，必需桿狀病毒蛋白質為GP64桿狀病毒包膜蛋白。在某些實施例中，必需桿狀病毒蛋白質為VP39桿狀病毒衣殼蛋白。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包含Rep52-編碼區、Rep78-編碼區及IRES序列區。在某些實施例中，第一核苷酸序列包含在核苷酸序列上位於Rep52-編碼區與Rep78-編碼區之間的IRES序列區。在某些實施例中，第一核苷酸依序自5'端至3'端包含Rep52-編碼區、IRES序列區及Rep78-編碼區。在某些實施例中，第一核苷酸依序自5'端至3'端包含Rep78-編碼區、IRES序列區及Rep52-編碼區。
在某些實施例中，第一核苷酸序列包含：第一開放閱讀框架，其包含Rep52-編碼區；第二開放閱讀框架，其包含Rep78-編碼區；及IRES序列區，其位於第一開放閱讀框架與第二開放閱讀框架之間。在某些實施例中，第一核苷酸序列依序自5'端至3'端包含：第一開放閱讀框架，其包含Rep52-編碼區、IRES序列區及第二開放閱讀框架，其包含Rep78-編碼區。在某些實施例中，第一核苷酸序列依序自5'端至3'端包含：第一開放閱讀框架，其包含Rep78-編碼區、IRES序列區及第二開放閱讀框架，其包含Rep52-編碼區。
在某些實施例中，第一核苷酸序列依序自5'端至3'端包含：第一開放閱讀框架，其包含第一起始密碼子區、Rep52-編碼區及第一終止密碼子區；IRES序列區；及第二開放閱讀框架，其包含第二起始密碼子區、Rep78-編碼區及第二終止密碼子區。在某些實施例中，第一核苷酸序列依序自5'端至3'端包含：第一開放閱讀框架，其包含第一起始密碼子區、Rep78-編碼區及第一終止密碼子區；IRES序列區；及第二開放閱讀框架，其包含第二起始密碼子區、Rep52-編碼區及第二終止密碼子區。
在本發明之某些實施例中，Rep52或Rep78係轉錄自桿狀病毒源性多面體啟動子(polh)。Rep52或Rep78亦可轉錄自較弱啟動子，例如IE-1啟動子之缺失突變體ΔIE-1啟動子之轉錄活性為IE-1啟動子的約20%。可使用基本上與ΔIE-1啟動子同源之啟動子。對於啟動子，同源性為至少50%、60%、70%、80%、90%或更大視為基本上同源之啟動子。 表現控制  表現控制區
本發明之病毒表現構築體(例如表現Bac)可包含一或多個由表現控制序列編碼之表現控制區。在某些實施例中，表現控制序列係用於在病毒生產細胞，諸如昆蟲細胞中表現。在某些實施例中，表現控制序列可操作地連接於蛋白質編碼核苷酸序列。在某些實施例中，表現控制序列可操作地連接於VP編碼核苷酸序列或Rep編碼核苷酸序列。
本文中，術語「編碼核苷酸序列」、「蛋白質編碼基因」或「蛋白質編碼核苷酸序列」係指編碼或轉譯成蛋白質產物，諸如VP蛋白質或Rep蛋白質之核苷酸序列。「可操作地連接」意謂表現控制序列相對於編碼序列定位，以使得其可促進經編碼之基因產物的表現。
「表現控制序列」係指調控其可操作地連接之核苷酸序列之表現的核酸序列。當表現控制序列控制及調控核苷酸序列之轉錄及/或轉譯時，表現控制序列「可操作地連接」於核苷酸序列。因此，表現控制序列可包含啟動子、強化子、未轉譯區(UTR)、內部核糖體入口位點(IRES)、轉錄終止子、蛋白質編碼基因前面的起始密碼子、內含子之剪接信號及終止密碼子。在最低限度下，術語「表現控制序列」意欲包含其存在經設計以影響表現之序列，且亦可包含額外有利組分。舉例而言，前導序列及融合搭配物序列為表現控制序列。該術語亦可包含核酸序列之設計，以使得自該序列移除框架中及框架外的非所需潛在起始密碼子。其亦可包含核酸序列之設計，以使得移除非所需潛在剪接位點。其包含序列或聚腺苷酸化序列(pA)，該等序列導引polyA尾之添加，polyA尾亦即mRNA之3'端處的一串腺嘌呤殘基，序列稱為polyA序列。其亦可經設計以增強mRNA穩定性。在昆蟲細胞中已知影響轉錄及轉譯穩定性之表現控制序列，例如啟動子，以及影響轉譯之序列，例如Kozak序列。表現控制序列可具有此類性質：關於調節其可操作地連接之核苷酸序列，以使得實現更低表現量或更高表現量。
在某些實施例中，表現控制序列可包含一或多個啟動子。啟動子可包含但不限於桿狀病毒主要晚期啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、核基因啟動子、來自一或多個包含病毒及非病毒元件之物種的嵌合啟動子及/或合成啟動子。在某些實施例中，啟動子可為Ctx、Op-EI、EI、ΔEI、EI-1、pH、PIO、polH (多面體)、ΔpolH、Dmhsp70、Hr1、Hsp70、4xHsp27 EcRE+最小Hsp70、IE、IE-1、ΔIE-1、ΔIE、p10、Δp10 (p10之經修飾之變異體或衍生物)、p5、p19、p35、p40、p6.9及其變異體或衍生物。在某些實施例中，啟動子為Ctx啟動子。在某些實施例中，啟動子為p10啟動子。在某些實施例中，啟動子為polH啟動子。在某些實施例中，啟動子可選自組織特異性啟動子、細胞類型特異性啟動子、細胞週期特異性啟動子及其變異體或衍生物。在某些實施例中，啟動子可為CMV啟動子、α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)啟動子、甲狀腺激素結合球蛋白啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(LPS)啟動子、HCR-ApoCII雜合啟動子、HCR-hAAT雜合啟動子、白蛋白啟動子、載脂蛋白E啟動子、α1-AT+EaIb啟動子、腫瘤選擇性E2F啟動子、單核血液IL-2啟動子及其變異體或衍生物。在某些實施例中，啟動子為低表現啟動子序列。在某些實施例中，啟動子為增強表現啟動子序列。在某些實施例中，啟動子可包含如美國專利申請案20110136227中所描述之Rep或Cap啟動子，其關於表現啟動子之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，病毒表現構築體可在所有核苷酸序列中包含相同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在兩個或更多個核苷酸序列中包含相同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在兩個或更多個核苷酸序列中包含不同啟動子。在某些實施例中，病毒表現構築體可在所有核苷酸序列中包含不同啟動子。
在某些實施例中，病毒表現構築體編碼元件以改良於某些細胞類型中之表現。在另一實施例中，表現構築體可包含polh及/或ΔIE-1昆蟲轉錄啟動子、CMV哺乳動物轉錄啟動子及/或p10昆蟲特異性啟動子，以在哺乳動物或昆蟲細胞中表現所需基因。
超過一個表現控制序列能夠可操作地連接於給定核苷酸序列。舉例而言，啟動子序列、轉譯起始序列及終止密碼子能夠可操作地連接於核苷酸序列。
在某些實施例中，病毒表現構築體可包含蛋白質編碼核苷酸序列之間的一或多個表現控制序列。在某些實施例中，表現控制區可包含IRES序列區，其包含編碼內部核糖體入口位點(IRES)之IRES核苷酸序列。內部核糖體入口位點(IRES)可選自由以下組成之群：來自口蹄疫病毒之FMDV-IRES、來自腦心肌炎病毒之EMCV-IRES以及其組合。
在某些實施例中，病毒表現構築體係如PCT/US2019/054600及/或美國臨時專利申請案第62/741,855號中所描述，該等申請案之內容各自以全文引用之方式併入。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包含起始密碼子區之核苷酸序列，諸如編碼包含一或多個起始密碼子區之AAV衣殼蛋白的序列。在某些實施例中，起始密碼子區可在表現控制序列內。
在某些實施例中，病毒表現構築體可含有包含終止密碼子區之核苷酸序列，諸如編碼包含一或多個終止密碼子區之AAV衣殼蛋白的序列。在某些實施例中，終止密碼子區可在表現控制序列內。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含一或多個包括起始密碼子之起始密碼子區。在某些實施例中，病毒表現構築體包含一或多個包括終止密碼子之終止密碼子區。在某些實施例中，病毒表現構築體包含一或多個起始密碼子區及一或多個終止密碼子區。在某些實施例中，起始密碼子區及/或終止密碼子區可在表現控制序列內。
在某些實施例中，病毒表現構築體包含一或多個包含表現控制序列之表現控制區。在某些實施例中，表現控制區包含一或多個啟動子序列。在某些實施例中，表現控制區包含一或多個選自由以下組成之群的啟動子序列：桿狀病毒主要晚期啟動子、昆蟲病毒啟動子、非昆蟲病毒啟動子、脊椎動物病毒啟動子、核基因啟動子、來自一或多個包括病毒及非病毒元件之物種的嵌合啟動子、合成啟動子及其變異體或衍生物。在某些實施例中，表現控制區包含一或多個選自由以下組成之群的啟動子序列：Ctx啟動子、polh昆蟲轉錄啟動子、ΔIE-1昆蟲轉錄啟動子、p10昆蟲特異性啟動子、Δp10昆蟲特異性啟動子(p10之變異體或衍生物)、CMV哺乳動物轉錄啟動子及其變異體或衍生物。在某些實施例中，表現控制區包含一或多個低表現啟動子序列。在某些實施例中，表現控制區包含一或多個增強表現啟動子序列。
在某些實施例中，表現控制區可包含2A序列區，其包含編碼病毒2A肽之2A核苷酸序列。序列允許在單一開放閱讀框架(ORF)內共轉譯多個多肽。隨著ORF經轉譯，甘胺酸及脯胺酸殘基以及2A序列防止形成正常肽鍵，其導致多肽鏈內之核糖體「跳躍」及「自裂解」。病毒2A肽可選自由以下組成之群：來自口蹄疫病毒之F2A、來自明脈扁刺蛾(Thosea asigna )病毒之T2A、來自馬鼻炎A (Equine rhinitis A )病毒之E2A、來自豬捷申病毒-1 (porcine teschovirus-1 )之P2A、來自質型多角體病毒之BmCPV2A、來自家蠶(B. mori )軟化病病毒之BmIFV 2A以及其組合。
在一些實施例中，第一及/或第二核苷酸序列包含起始密碼子及/或終止密碼子及/或內部核糖體入口位點(IRES)。在某些實施例中，IRES核苷酸序列編碼選自由以下組成之群的內部核糖體入口位點(IRES)：來自口蹄疫病毒之FMDV-IRES、來自腦心肌炎病毒之EMCV-IRES以及其組合。
本發明之方法不受使用特定表現控制序列限制。然而，當達成VP產物之某一化學計量(分別對於VP1、VP2及VP3，接近1:1:10)時，以及當Rep52或Rep40 (亦稱作p19 Rep)之水準顯著高於Rep78或Rep68 (亦稱作p5 Rep)時，可獲得生產細胞(諸如昆蟲細胞)中改良之AAV產率。在某些實施例中，p5/p19比率低於0.6以上、低於0.4或低於0.3，但始終為至少0.03。此等比率可以蛋白質水準量測或可與特定mRNA之相對水準有關。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為1:1:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為2:2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為2:0:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為1-2:0-2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為1-2:1-2:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為2-3:0-3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為2-3:2-3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為3:3:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為3-5:0-5:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，AAV粒子生產於病毒生產細胞(諸如哺乳動物或昆蟲細胞)中，其中所有三種VP蛋白質均以接近、大約或為3-5:3-5:10 (VP1:VP2:VP3)之化學計量表現。
在某些實施例中，表現控制區經工程改造以生產選自由以下組成之群之VP1:VP2:VP3比：約或確切為1:0:10；約或確切為1:1:10；約或確切為2:1:10；約或確切為2:1:10；約或確切為2:2:10；約或確切為3:0:10；約或確切為3:1:10；約或確切為3:2:10；約或確切為3:3:10；約或確切為4:0:10；約或確切為4:1:10；約或確切為4:2:10；約或確切為4:3:10；約或確切為4:4:10；約或確切為5:5:10；約或確切為1-2:0-2:10；約或確切為1-2:1-2:10；約或確切為1-3:0-3:10；約或確切為1-3:1-3:10；約或確切為1-4:0-4:10；約或確切為1-4:1-4:10；約或確切為1-5:1-5:10；約或確切為2-3:0-3:10；約或確切為2-3:2-3:10；約或確切為2-4:2-4:10；約或確切為2-5:2-5:10；約或確切為3-4:3-4:10；約或確切為3-5:3-5:10；及約或確切為4-5:4-5:10。 病毒生產細胞及載體  哺乳動物細胞
本文所揭示之本發明之病毒生產描述了用於生產AAV粒子或病毒載體之製程及方法，該等AAV粒子或病毒載體接觸標靶細胞以遞送有效負載構築體(例如重組AAV粒子或病毒構築體)，該有效負載構築體包含編碼有效負載分子之核苷酸。病毒生產細胞可選自任何生物生物體，其包含原核(例如細菌)細胞及真核細胞，該等真核細胞包含昆蟲細胞、酵母細胞及哺乳動物細胞。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子可在包含哺乳動物細胞之病毒生產細胞中生產。病毒生產細胞可包含哺乳動物細胞，諸如衍生自哺乳動物之A549、WEH1、3T3、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、HEK293、HEK293T (293T)、Saos、C2C12、L細胞、HT1080、HepG2及初生纖維母細胞、肝細胞及肌母細胞。病毒生產細胞可包含來源於哺乳動物物種之細胞，該等哺乳動物物種包含但不限於人類、猴、小鼠、大鼠、兔及倉鼠或細胞類型，其包含但不限於纖維母細胞、肝細胞、腫瘤細胞、經細胞株轉化細胞等。
通常用於生產重組AAV粒子之AAV病毒生產細胞包含但不限於HEK293細胞、COS細胞、C127、3T3、CHO、HeLa細胞、KB細胞、BHK及如美國專利第6,156,303號、第5,387,484號、第5,741,683號、第5,691,176號、第6,428,988號及第5,688,676號；美國專利申請案2002/0081721及國際專利公開案第WO 00/47757號、第WO 00/24916號及第WO 96/17947號中所描述之其他哺乳動物細胞株，其內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。在某些實施例中，AAV病毒生產細胞為反式互補封裝細胞株，其提供複製缺陷型輔助病毒缺失之功能，例如HEK293細胞或其他Ea反式互補細胞。
在某些實施例中，封裝細胞株293-10-3 (ATCC寄存編號：PTA-2361)可用於生產AAV粒子，如美國專利第US6,281,010號中所描述，其關於293-10-3封裝細胞株及其用途之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在本發明之某些實施例中，在磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子之控制下編碼腺病毒E1a及腺病毒E1b之反式互補E1缺失型腺病毒載體的細胞株(諸如HeLA細胞株)可用於如美國專利第6365394號中所描述之AAV粒子生產，其關於HeLA細胞株及其用途之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，AAV粒子使用三重轉染方法在哺乳動物細胞中生產，其中有效負載構築體、細小病毒Rep及細小病毒Cap以及病毒表現構築體包含於三種不同構築體內。AAV粒子生產之三種組分之三重轉染方法可用於生產小批量病毒以用於包含轉導效率、標靶組織(趨向性)評價及穩定性之分析。
待調配之AAV粒子可藉由三重轉染或桿狀病毒介導之病毒生產或此項技術中已知的任何其他方法生產。可採用此項技術中已知的任何適合之容許或封裝細胞來生產載體。在某些實施例中，使用提供複製缺陷型輔助病毒缺失之功能的反式互補封裝細胞株，例如293細胞或其他E1a反式互補細胞。
基因卡匣可含有細小病毒(例如AAV) cap及rep基因中之一些或全部。在某些實施例中，藉由將編碼衣殼及/或Rep蛋白質之封裝載體引入細胞中來以反式形式提供cap及rep功能中之一些或全部。在某些實施例中，基因卡匣並不編碼衣殼或Rep蛋白質。或者，使用經穩定轉化以表現cap及/或rep基因之封裝細胞株。
在某些實施例中，根據如US2016/0032254中所描述之程序由培養上清液生產及純化重組AAV病毒粒子，其關於重組AAV病毒粒子的生產及加工之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。生產亦可涉及此項技術中已知之方法，包含使用293T細胞之方法、三重轉染或任何適合之生產方法。
在某些實施例中，哺乳動物病毒生產細胞(例如293T細胞)可呈黏著/黏附狀態(例如與磷酸鈣)或懸浮狀態(例如與聚乙二亞胺(PEI))。用生產AAV (亦即AAV rep/cap構築體、腺病毒病毒表現構築體及/或ITR側接有效負載構築體)所需之質體轉染哺乳動物病毒生產細胞。在某些實施例中，轉染過程可包含視情況存在之培養基更換(例如對於呈黏著形式之細胞更換培養基、對於呈懸浮形式之細胞不更換培養基、對於呈懸浮形式之細胞在必要時更換培養基)。在某些實施例中，轉染過程可包含轉染培養基，諸如DMEM或F17。在某些實施例中，轉染培養基可包含血清或可不含血清(例如與磷酸鈣及與血清呈黏著狀態之細胞、與PEI呈懸浮狀態且無血清之細胞)。
細胞可隨後藉由刮擦(黏附形式)及/或粒化(懸浮形式及經刮擦之黏附形式)收集且轉移至容器中。可視需要重複收集步驟以完整收集生產之細胞。隨後，可藉由連續凍融循環(-80℃至37℃)、化學溶解(諸如添加清潔劑曲拉通(triton))、機械溶解或藉由使細胞培養物在達到約0%存活率之後降解來達成細胞溶解。藉由離心及/或深層過濾移除細胞碎屑。藉由DNA qPCR由抗DNA酶基因體滴定針對AAV粒子對樣品進行定量。
根據基因體複本數(每毫升基因體粒子數)量測AAV粒子效價。基因體粒子濃度係基於如先前所報導的載體DNA之DNA qPCR(Clark等人 (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039；Veldwijk等人 (2002) Mol. Ther., 6:272-278，其關於對粒子濃度之量測的內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突)。 昆蟲細胞
本發明之病毒生產包含用於生產AAV粒子及病毒載體之製程及方法，該等AAV粒子及病毒載體接觸標靶細胞以遞送有效負載構築體(例如重組病毒構築體)，該有效負載構築體包含編碼有效負載分子之核苷酸。在某些實施例中，本發明之AAV粒子或病毒載體可在包含昆蟲細胞之病毒生產細胞中生產。
在培養物中昆蟲細胞之生長條件及在培養物中昆蟲細胞中之異源產物的生產為此項技術中所熟知，參見美國專利第6,204,059號，其關於昆蟲細胞在病毒生產中之生長及用途的內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
可根據本發明使用允許細小病毒之複製且可維持於培養物中之任何昆蟲細胞。通常用於生產重組AAV粒子之AAV病毒生產細胞包含但不限於草地貪夜蛾，其包含但不限於Sf9或Sf21細胞株；果蠅(Drosophila )細胞株；或蚊蟲細胞株，諸如白紋伊蚊(Aedes albopictus )源性細胞株。昆蟲細胞用於表現異源蛋白質之用途已經充分證明，將核酸，諸如載體(例如昆蟲-細胞兼容載體)引入此類細胞中之方法及將此類細胞維持於培養物中之方法同樣已經充分證明。參見例如Methods in Molecular Biology, Richard編, Humana Press, NJ (1995)；O'Reilly等人, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994)；Samulski等人, J. Vir.63:3822-8 (1989)；Kajigaya等人, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991)；Ruffing等人, J. Vir. 66:6922-30 (1992)；Kimbauer等人,Vir.219:37-44 (1996)；Zhao等人, Vir.272:382-93 (2000)；及Samulski等人, 美國專利第6,204,059號，其關於昆蟲細胞在病毒生產中之用途的內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在一個實施例中，AAV粒子使用WO2015/191508中所描述之方法製得，其內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，可使用昆蟲宿主細胞系統與桿狀病毒系統之組合(例如如Luckow等人, Bio/Technology 6: 47 (1988)所描述)。在某些實施例中，用於製備嵌合肽之表現系統為粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)，Tn 5B1-4昆蟲細胞/桿狀病毒系統，其可用於高水準之蛋白質，如美國專利第6660521號中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。 昆蟲細胞培養基
昆蟲細胞之擴增、培養、轉染、感染及儲存可在此項技術中已知或呈現於本發明中之任何細胞培養基、細胞轉染培養基或儲存培養基中進行，包括Hyclone SFX昆蟲細胞培養基、表現系統ESF AF昆蟲細胞培養基、Basal IPL-41昆蟲細胞培養基、ThermoFisher Sf900II培養基、ThermoFisher Sf900III培養基、ThermoFisher Grace的昆蟲培養基或其經修飾之培養基調配物。
在某些實施例中，本發明之昆蟲細胞培養基可包含本發明中所描述之調配物添加劑或要素中之任一者，包括但不限於無機鹽、酸、鹼、緩衝劑、界面活性劑(諸如泊洛沙姆(Poloxamer) 188/普洛尼克(Pluronic) F-68)、胺基酸混合物、營養物混合物、糖(諸如葡萄糖)、維生素、脂質、水解產物(亦即酵母提取物)、膽固醇及其他已知培養基要素。調配物成分及/或添加劑可逐漸併入一或多種大丸劑，或以「劇增」形式(在短時間內併入大體積)。
在某些實施例中，本發明之昆蟲細胞培養基可包含水解產物，諸如酵母提取物(例如酵母提取物超濾液)。在某些實施例中，酵母提取物可包含以下中之一或多者：Bacto TC Yeastolate、Sigma Select Yeast Extract、BD Difco Yeast Extract UF、Sigma Yeast Autolysate、NuTek NTB3-UF及NuTek NTB3-UF。在某些實施例中，酵母提取物可包含BD Difco酵母提取物UF。在某些實施例中，酵母提取物可包含Sigma酵母自溶產物。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含約2.0 g/L、約2.5 g/L、約3.0 g/L、約3.5 g/L、約4.0 g/L、約4.5 g/L、約5.0 g/L、約5.5 g/L、約6.0 g/L、約6.5 g/L、約7.0 g/L、約7.5 g/L、約8.0 g/L、約8.5 g/L、約9.0 g/L、約9.5 g/L、約10.0 g/L、約10.5 g/L、約11.0 g/L、約11.5 g/L、約12.0 g/L，或約12.5 g/L水解產物(每1 L昆蟲細胞培養基)。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含約6.0 g/L水解產物，諸如酵母提取物。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含約27.0 g/L水解產物，諸如酵母提取物。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含約54.0 g/L水解產物，諸如酵母提取物。
在某些實施例中，本發明之昆蟲細胞培養基包含膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含至少2.0 mg/L、至少2.5 mg/L、至少3.0 mg/L、至少3.5 mg/L、至少4.0 mg/L、至少4.5 mg/L、至少5.0 mg/L、至少5.5 mg/L、至少6.0 mg/L、至少6.5 mg/L、7.0 mg/L、至少7.5 mg/L、至少8.0 mg/L、至少8.5 mg/L、9.0 mg/L、至少9.5 mg/L、至少10.0 mg/L、至少10.5 mg/L、11.0 mg/L、至少11.5 mg/L、至少12.0 mg/L，或至少12.5 mg/L膽固醇(每1 L昆蟲細胞培養基)。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含至少2.0 mg/L膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含至少4.0 mg/L膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含至少6.0 mg/L膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含至少8.0 mg/L膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含至少10.0 mg/L膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含至少12.0 mg/L膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含在4.0-12.5 mg/L之間的膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含在4.0-8.0 mg/L之間的膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含在6.0-8.0 mg/L之間的膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含在6.0-12.5 mg/L之間的膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含在8.0-12.5 mg/L之間的膽固醇。
在某些實施例中，本發明之昆蟲細胞培養基可包含脂質乳液。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含每1 L昆蟲細胞培養基至少5.0 mL、至少5.5 mL、至少6.0 mL、至少6.5 mL, 7.0 mL、至少7.5 mL、至少8.0 mL、至少8.5 mL、至少9.0 mL、至少9.5 mL、至少10.0 mL、至少10.5 mL、至少11.0 mL、至少11.5 mL、至少12.0 mL、至少12.5 mL、至少13.0 mL、至少13.5 mL、至少14.0 mL、至少14.5 mL, 15.0 mL、至少15.5 mL、至少16.0 mL、至少16.5 mL、至少17.0 mL、至少17.5 mL、至少18.0 mL、至少18.5 mL、至少19.0 mL、至少19.5 mL、至少20.0 mL、至少20.5 mL、至少21.0 mL、至少21.5 mL、至少22.0 mL，或至少22.5 mL脂質乳液。
在某些實施例中，脂質乳液可包含以下中之一或多者：魚肝油、Tween 80、α-生育酚乙酸酯、乙醇、10%普洛尼克F-68及水。
在某些實施例中，脂質乳液可包含以下中之一或多者：二十碳四烯酸、dl-α-生育酚乙酸酯、乙醇100%、亞麻油酸、次亞麻油酸、肉豆蔻酸、油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、普洛尼克f-68、硬脂酸及tween 80。在某些實施例中，脂質乳液每500 mL包含：約1.0 μL二十碳四烯酸、約36.5 μL dl-α-生育酚乙酸酯、約48.75 mL乙醇100%、約5.5 μL亞麻油酸、約5.5 μL次亞麻油酸、約5 mg肉豆蔻酸、約5.6 μL油酸、約5 mg棕櫚酸、約5.6 μL棕櫚油酸、約450 mL普洛尼克f-68、約5 mg硬脂酸及約1030 μL tween 80。
在某些實施例中，本發明之昆蟲細胞培養基可包含胺基酸混合物。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含每1 L昆蟲細胞培養基至少100 mL、至少105 mL、至少110 mL、至少115 mL、至少120 mL、至少125 mL、至少130 mL、至少135 mL、至少140 mL、至少145 mL、150 mL、至少155 mL、至少160 mL、至少165 mL、至少170 mL、至少175 mL、至少180 mL、至少185 mL、至少190 mL、至少195 mL、至少200 mL、至少205 mL、至少210 mL、至少215 mL、至少220 mL、至少225 mL、至少230 mL、至少235 mL、至少240 mL、至少245 mL、至少250 mL，或至少255 mL胺基酸混合物。
在某些實施例中，胺基酸混合物可包含以下中之一或多者：L-精胺酸、L-天冬醯胺、L-天冬胺酸、L-麩胺酸、L-甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-纈胺酸、L-脯胺酸、L-半胱胺酸.HCl.H2O。
在某些實施例中，胺基酸混合物包含：約54.9 mM L-精胺酸、約39 mM L-天冬醯胺、約38.7 mM L-天冬胺酸、約118.4 mM L-麩胺酸、約128.9 mM L-甘胺酸、約27.7 mM L-組胺酸、約84.1 mM L-異白胺酸、約104 mM L-白胺酸、約75.9 mM L-離胺酸、約4.9 mM L-甲硫胺酸、約13.4 mM L-苯丙胺酸、約247.7 mM L-絲胺酸、約46.6 mM L-蘇胺酸、約9.1 mM L-色胺酸、約45.2 mM L-纈胺酸、約82.2 mML-脯胺酸、約45 mM L-半胱胺酸.HCL.H2O。
在某些實施例中，本發明之昆蟲細胞培養基可包含營養物混合物。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含每1 L昆蟲細胞培養基至少5.0 mL、至少5.5 mL、至少6.0 mL、至少6.5 mL, 7.0 mL、至少7.5 mL、至少8.0 mL、至少8.5 mL、至少9.0 mL、至少9.5 mL、至少10.0 mL、至少10.5 mL、至少11.0 mL、至少11.5 mL、至少12.0 mL、至少12.5 mL、至少13.0 mL、至少13.5 mL、至少14.0 mL、至少14.5 mL, 15.0 mL、至少15.5 mL、至少16.0 mL、至少16.5 mL、至少17.0 mL、至少17.5 mL、至少18.0 mL、至少18.5 mL、至少19.0 mL、至少19.5 mL、至少20.0 mL、至少20.5 mL、至少21.0 mL、至少21.5 mL、至少22.0 mL，或至少22.5 mL營養物混合物。
在某些實施例中，該營養物混合物可包含以下中之一或多者：硫胺素.HCL、核黃素、D-泛酸鈣、吡哆醇HCl、對胺基苯甲酸、菸鹼酸、i-肌醇、生物素、氯化膽鹼、維生素B12、葉酸、鉬酸(銨鹽)、六水合氯化鈷、氯化銅、氯化錳、氯化鋅、硫酸亞鐵、天冬胺酸鹽。在某些實施例中，該營養物混合物可包含：硫胺素.HCL、核黃素、D-泛酸鈣、吡哆醇HCl、對胺基苯甲酸、菸鹼酸、i-肌醇、生物素、氯化膽鹼及維生素B12。在某些實施例中，營養物混合物可包含葉酸。在某些實施例中，該營養物混合物可包含：鉬酸(銨鹽)、六水合氯化鈷、氯化銅、氯化錳及氯化鋅。在某些實施例中，該營養物混合物可包含：硫酸亞鐵及天冬胺酸鹽。在某些實施例中，該營養物混合物可包含：硫胺素.HCL、核黃素、D-泛酸鈣、吡哆醇HCl、對胺基苯甲酸、菸鹼酸、i-肌醇、生物素、氯化膽鹼、維生素B12、葉酸、鉬酸(銨鹽)、六水合氯化鈷、氯化銅、氯化錳、氯化鋅、硫酸亞鐵及天冬胺酸鹽。
在某些實施例中，該營養物混合物可包含：約80 mg/L硫胺素.HCL、約80 mg/L核黃素、約86.25 mg/L D-泛酸鈣、約400 mg/L吡哆醇HCl、約320 mg/L對胺基苯甲酸、約160 mg/L菸鹼酸、約400 mg/L i-肌醇、約160 mg/L生物素、約20 g/L氯化膽鹼，及約240 mg/L維生素B12。在某些實施例中，該營養物混合物可包含約80 mg/L葉酸。在某些實施例中，該營養物混合物可包含：約6.86 mg/L鉬酸(銨鹽)、約27.27 mg/L六水合氯化鈷、約19.95 mg/L氯化銅、約20.58 mg/L氯化錳，及約40 mg/L氯化鋅。在某些實施例中，該營養物混合物可包含：約550.48 mg/L硫酸亞鐵及約356 mg/L天冬胺酸鹽。在某些實施例中，該營養物混合物可包含：約80 mg/L硫胺素.HCL、約80 mg/L核黃素、約86.25 mg/L D-泛酸鈣、約400 mg/L吡哆醇HCl、約320 mg/L對胺基苯甲酸、約160 mg/L菸鹼酸、約400 mg/L i-肌醇、約160 mg/L生物素、約20 g/L氯化膽鹼、約240 mg/L維生素B12、約80 mg/L葉酸、約6.86 mg/L鉬酸(銨鹽)、約27.27 mg/L六水合氯化鈷、約19.95 mg/L氯化銅、約20.58 mg/L氯化錳、約40 mg/L氯化鋅、約550.48 mg/L硫酸亞鐵及約356 mg/L天冬胺酸鹽。
在某些實施例中，昆蟲細胞培養基不含血清。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基不含動物來源之蛋白質。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含L-麩胺酸及/或L-麩醯胺酸。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含泊洛沙姆188 (例如10%普洛尼克F-68)。
在某些實施例中，昆蟲細胞培養基包含：水解產物(諸如酵母提取物超濾液)、L-麩醯胺酸、泊洛沙姆188 (例如10%普洛尼克F-68)、脂質乳液及膽固醇。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基不含血清且包含每L培養基：6 g水解產物(諸如酵母提取物超濾液)、8.5 mL 200 mM L-麩醯胺酸、2 mL泊洛沙姆188 (例如10%普洛尼克F-68)、8 mL脂質乳液及4.65 mL膽固醇濃縮物，其餘體積包含基礎培養基，諸如Basal IPL-41昆蟲細胞培養基或ESF AF昆蟲細胞培養基。
在某些實施例中，昆蟲細胞培養基為ESF AF昆蟲細胞培養基。在某些實施例中，當與其他昆蟲細胞培養基相比時，用於生產AAV粒子之昆蟲細胞培養基(例如ESF AF昆蟲細胞培養基)增加至少1.5倍或至少2倍之效價。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基為Basal IPL-41昆蟲細胞培養基。在某些實施例中，昆蟲細胞培養基為Basal IPL-41昆蟲細胞培養基之經修飾之調配物。
在某些實施例中，本發明之昆蟲細胞培養基可包括培養基進料添加劑。在某些實施例中，將培養基進料添加劑以單一大丸劑形式添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染之前將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染時將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染之後將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。
在某些實施例中，將培養基進料添加劑以兩個大丸劑形式添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染之前及在BIIC感染時將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染之前及在BIIC感染之後將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染時及在BIIC感染之後將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。
在某些實施例中，將培養基進料添加劑以三個或更多個大丸劑形式添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染之前、在BIIC感染時及在BIIC感染之後，將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染之前、在BIIC感染時以一或更多個大丸劑形式及在BIIC感染之後以一或更多個大丸劑形式將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。在某些實施例中，在BIIC感染之後，基於每日將培養基進料添加劑添加至昆蟲細胞培養基中。
在某些實施例中，培養基進料添加劑不含血清。在某些實施例中，培養基進料添加劑不含動物來源之蛋白質。在某些實施例中，培養基進料添加劑包含L-麩胺酸及/或L-麩醯胺酸。在某些實施例中，培養基進料添加劑包含泊洛沙姆188 (例如10%普洛尼克F-68)。
在某些實施例中，培養基進料添加劑不含血清，且包含水解產物(諸如酵母提取物超濾液)、脂質乳液、營養物混合物、胺基酸混合物及葡萄糖。
在某些實施例中，培養基進料添加劑包含水解產物(例如酵母提取物超濾液)、脂質乳液、營養物混合物、胺基酸混合物及葡萄糖。
在某些實施例中，培養基進料添加劑不含血清，且每336 mL進料添加劑包含：9 g水解產物(100 g/L於90 mL中)、18 mL脂質乳液、8 mL營養物混合物、200 mL胺基酸混合物及10.09 g葡萄糖(504 g/L於20 mL中)。
在某些實施例中，培養基進料添加劑中之葡萄糖可經麥芽糖置換。在某些實施例中，培養基進料添加劑中之葡萄糖可經蔗糖置換。在某些實施例中，培養基進料添加劑中之葡萄糖可經海藻糖置換。在某些實施例中，培養基進料添加劑中之葡萄糖可經包含麥芽糖及葡萄糖之雙醣置換。在某些實施例中，培養基進料添加劑中之葡萄糖可經包含海藻糖及葡萄糖之雙醣置換。
在某些實施例中，培養基進料添加劑可包括約10 g至約20 g糖。在某些實施例中，培養基進料添加劑可包括約20 g至約30 g糖。在某些實施例中，培養基進料添加劑可包括約30 g至約40 g糖。 桿狀病毒生產系統
在某些實施例中，本發明之方法可包含使用病毒表現構築體及有效負載構築體載體在桿狀病毒系統中生產AAV粒子或病毒載體。在某些實施例中，桿狀病毒系統包含桿狀病毒表現載體(BEV)及/或經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或有效負載構築體可為穿梭載體，亦稱為桿狀病毒質體或重組桿狀病毒基因體。在某些實施例中，本發明之病毒表現構築體或有效負載構築體可為聚核苷酸，其藉由熟習此項技術者已知及進行之標準分子生物學技術由同源重組(轉座子供體/受體系統)併入至穿梭載體中。獨立病毒複製細胞群體之轉染生產兩種或更多種組(例如兩種、三種)桿狀病毒(BEV)；一或多種組，其可包含病毒表現構築體(例如桿狀病毒為「表現BEV」或「表現Bac」)；及一或多種組，其可包含有效負載構築體(例如桿狀病毒為「有效負載BEV」或「有效負載Bac」)。桿狀病毒可用於感染病毒生產細胞以生產AAV粒子或病毒載體。
在某些實施例中，方法包含轉染單一病毒複製細胞群體以生產包含病毒表現構築體及有效負載構築體之單一桿狀病毒(BEV)組。此等桿狀病毒可用於感染病毒生產細胞以生產AAV粒子或病毒載體。
在某些實施例中，使用穿梭載體轉染劑，諸如Promega FuGENE HD、WFI水或ThermoFisher Cellfectin II試劑來生產BEV。在某些實施例中，在諸如昆蟲細胞之病毒生產細胞中生產及擴增BEV。
在某些實施例中，方法利用包含一或多種BEV之病毒生產細胞，其包含經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的種子培養物。種子BIIC已經包含病毒表現構築體之表現BEV，亦及包含有效負載構築體之有效負載BEV轉染/轉導/感染。在某些實施例中，收穫種子培養物，將其分成等分試樣且冷凍，且可在稍後使用以引發原生生產細胞群體之轉染/轉導/感染。在某些實施例中，將種子BIIC庫儲存於-80℃下或LN2 蒸汽中。
桿狀病毒由若干必需蛋白質製成，該等必需蛋白質對於桿狀病毒之功能及複製為必需的，諸如複製蛋白、包膜蛋白及衣殼蛋白。桿狀病毒基因體因此包含編碼必需蛋白質之若干必需基因型核苷酸序列。作為非限制性實例，基因體可包含必需基因型區域，其包含編碼用於桿狀病毒構築體之必需蛋白質的必需基因型核苷酸序列。必需蛋白質可包含：GP64桿狀病毒包膜蛋白、VP39桿狀病毒衣殼蛋白或用於桿狀病毒構築體之其他類似的必需蛋白質。
用於在包含但不限於草地貪夜蛾(Sf9)細胞之昆蟲細胞中生產AAV粒子之桿狀病毒表現載體(BEV)提供高效價之病毒載體產物。編碼病毒表現構築體及有效負載構築體之重組桿狀病毒引發病毒載體複製細胞之產毒性感染(productive infection)。自初級感染釋放之感染性桿狀病毒粒子其次感染培養物中之額外細胞，以指數方式感染多個感染週期(其作為初始感染倍率之函數)中之整個細胞培養物群體，參見Urabe, M.等人 J Virol. 2006年2月;80(4):1874-85，其關於BEV及病毒粒子之生產及用途的內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，藉由利用無效價感染細胞保存及按比例擴大系統，本發明之生產系統在多個繼代內解決桿狀病毒不穩定性。病毒生產細胞之小規模種子培養物經編碼AAV粒子之結構及/或非結構組分的病毒表現構築體轉染。將經桿狀病毒感染之病毒生產細胞收穫成可在液氮中低溫保存的等分試樣；等分試樣保留用於感染大規模病毒生產細胞培養物之活力及感染性Wasilko DJ 等人 Protein Expr Purif. 2009年6月;65(2):122-32，其關於BEV及病毒粒子之生產及用途的內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
基因穩定之桿狀病毒可用於生產用以在無脊椎細胞中生產AAV粒子之組分中的一或多者之來源。在某些實施例中，缺陷性桿狀病毒表現載體可游離地維持在昆蟲細胞中。在此類實施例中，對應穿梭載體用複製控制元件，包括但不限於啟動子、強化子及/或細胞週期調節之複製元件經工程改造。
在某些實施例中，桿狀病毒可用標記物經工程改造以用於重組至殼質酶/組織蛋白酶基因座中。chia/v-cath基因座對於在組織培養物中繁殖桿狀病毒為非必需的，且V-cath (EC 3.4.22.50)係對含有底物之Arg-Arg二肽活性最強之半胱胺酸內切蛋白酶。Arg-Arg二肽存在於濃核病毒及微小病毒衣殼結構蛋白中但偶爾出現於依賴病毒VP1中。
在某些實施例中，容許桿狀病毒感染的穩定病毒生產細胞用AAV複製及載體生產所需之元件中之任一者的至少一個穩定整合複本經工程改造，該等元件包含但不限於完整AAV基因體、Rep及Cap基因、Rep基因、Cap基因、呈獨立轉錄卡匣形式之各Rep蛋白質、呈獨立轉錄卡匣形式之各VP蛋白質、AAP (組裝活化蛋白)或至少一種具有原生或非原生啟動子之桿狀病毒輔助基因。
在某些實施例中，桿狀病毒表現載體(BEV)係基於AcMNPV桿狀病毒或BmNPV桿狀病毒BmNPV。在某些實施例中，本發明之穿梭載體係基於AcMNPV穿梭載體，諸如bmon14272、vAce25ko或vAclef11KO (亦即其經工程改造變異體)。
在某些實施例中，桿狀病毒表現載體(BEV)為其中桿狀病毒v-cath 基因已部分或完全缺失(「v-cath缺失之BEV」)或突變的BEV。在某些實施例中，BEV缺乏v-cath 基因或包含v-cath 基因之突變不活化型式。在某些實施例中，BEV缺乏v-cath 基因。在某些實施例中，BEV包含v-cath 基因之突變不活化型式。
本發明之病毒生產穿梭載體可包含某些桿狀病毒基因或基因座之缺失。
在某些實施例中，桿狀病毒接種物庫可使用小比例搖瓶，諸如3L或5L搖瓶生產。然而，此製程大體上受限於可生產之BIIC細胞的最大細胞密度，及因此需要離心以將所得細胞濃縮至可工作濃度。此相應地限制可使用此方法生產及儲存的桿狀病毒接種物庫之體積(亦即數量) (約600 mL)。由於開放操作，此製程亦存在無菌問題。
在某些實施例中，桿狀病毒接種物庫可使用生物反應器，諸如20-50 L生物反應器生產。然而，此製程亦大體上受限於可生產之BIIC細胞的最大細胞密度，及因此需要經由切向流過濾(TFF)及/或離心進行顯著處理以將所得細胞濃縮至可工作濃度(需要3 L培養物材料以生產約600 mL經濃縮BIIC調配物，對應於15-25%產率)。此相應地限制可使用此方法生產及儲存的桿狀病毒接種物庫之體積(亦即數量) (約3000 mL)。由於開放操作，此製程亦存在無菌問題。
在某些實施例中，灌注技術可用於生產桿狀病毒接種物庫中。灌注系統為流體循環系統，其使用泵、過濾器與篩網之組合來截留生物反應器內部之細胞，同時不斷地移除細胞廢物且藉由細胞代謝置換缺乏營養物的培養基。在某些實施例中，灌注系統為交替切向流(ATF)灌注系統(例如，XCell ATF系統)。在某些實施例中，灌注系統可與生物反應器協同使用，以在生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)期間管理及循環生物反應器內之細胞培養基。在某些實施例中，灌注系統可用於支持大規模生產具有出乎意料的高細胞密度之高品質BIIC庫。在某些實施例中，灌注系統可用於提供大於70% (例如75-80%、80-85%、85-90%、90-95%或95-100%)之感染細胞比產物細胞產率。在某些實施例中，灌注系統可用於在生物反應器內進行培養基切換，諸如用允許BIIC細胞冷凍及保存之低溫保存培養基置換細胞培養基。
本發明提供用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)，例如表現BIIC及/或有效負載BIIC之方法。在某些實施例中，本發明提供用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之方法，其包含以下步驟：(a)將一定體積之細胞培養基引入生物反應器中；(b)將至少一個病毒生產細胞(VPC)引入生物反應器中且使該生物反應器中之VPC數目擴增至目標VPC細胞密度；(c)將至少一種桿狀病毒表現載體(BEV)引入該生物反應器中，其中該BEV包含AAV病毒表現構築體或AAV有效負載構築體；(d)在允許至少一種BEV感染至少一個VPC以生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的條件下，在生物反應器中培育VPC與BEV之混合物；(e)在允許該生物反應器中之BIIC數目達到目標BIIC細胞密度之條件下培育該生物反應器；及(f)自該生物反應器收穫BIIC。在某些實施例中，生物反應器之體積為至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L。在某些實施例中，生物反應器中之細胞培養基的體積(亦即工作體積)為至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L。
在某些實施例中，BEV引入時的VPC密度為1.0×105 -2.5×105 、2.5×105 -5.0×105 、5.0×105 -7.5×105 、7.5×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、1.0×106 -2.0×106 、1.5×106 -2.5×106 、2.0×106 -3.0×106 、2.5×106 -3.5×106 、3.0×106 -4.0×106 、3.5×106 -4.5×106 、4.0×106 -5.0×106 、4.5×106 -5.5×106 、5.0×106 -1.0×107 、5.0×106 -6.0×106 、5.5×106 -6.5×106 、6.0×106 -7.0×106 、6.5×106 -7.5×106 、7.0×106 -8.0×106 、7.5×106 -8.5×106 、8.0×106 -9.0×106 、8.5×106 -9.5×106 、9.0×106 -1.0×107 、9.5×106 -1.5×107 、1.0×107 -5.0×107 ，或5.0×107 -1.0×108 個細胞/毫升。在某些實施例中，BEV引入時的VPC密度為5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、1.5×106 、2.0×106 、2.5×106 、3.0×106 、3.5×106 、4.0×106 、4.5×106 、5.0×106 、5.5×106 、6.0×106 、6.5×106 、7.0×106 、7.5×106 、8.0×106 、8.5×106 、9.0×106 、9.5×106 、1.0×107 、1.5×107 、2.0×107 、2.5×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 ，或9.0×107 個細胞/毫升。
在某些實施例中，BEV引入時的目標VPC細胞密度為1.5-4.0×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，BEV引入時的目標VPC細胞密度為2.0-3.5×106 個細胞/毫升。
在某些實施例中，將BEV以BEV對VPC之目標感染倍率(MOI)引入生物反應器中。在某些實施例中，BEV MOI為0.0005-0.003，或更特定言之0.001-0.002。
在某些實施例中，生物反應器可包含用於管理生物反應器內之細胞培養基的灌注系統。在某些實施例中，灌注系統用於分批進料AAV生產方法中。在某些實施例中，灌注系統為交替切向流(ATF)灌注系統(例如，XCell ATF系統)。在某些實施例中，灌注系統置換生物反應器中之培養基的至少一部分，同時截留生物反應器內之至少90%的VPC及BIIC。在某些實施例中，灌注系統自生物反應器內之細胞培養基移除細胞廢物。在某些實施例中，灌注系統置換已由細胞代謝耗盡營養物之細胞培養基。在某些實施例中，灌注系統用允許BIIC細胞冷凍及保存之低溫保存培養基置換細胞培養基。在某些實施例中，灌注系統用補充有生長或生產增強因子之細胞培養基置換細胞培養基，以提高AAV產物之品質及數量。
在某些實施例中，在特定BIIC細胞密度下自生物反應器收穫BIIC。在某些實施例中，自生物反應器收穫之BIIC具有特定BIIC細胞密度。在某些實施例中，在收穫時之BIIC細胞密度為6.0-18.0×106 個細胞/毫升、8.0-16.5×106 個細胞/毫升、10.0-16.5×106 個細胞/毫升。
在一些實施例中，使用BIIC (表現BIIC、有效負載BIIC)轉染病毒生產細胞，例如Sf9細胞。在一些實施例中，使用包含諸如BEV (表現Bac、有效負載Bac)之穿梭載體之桿狀病毒轉染病毒生產細胞，例如Sf9細胞。 其他
在某些實施例中，表現宿主包含但不限於埃希氏桿菌屬(Escherichia )、芽孢桿菌屬(Bacillus )、假單胞菌屬(Pseudomonas )、沙門氏菌屬(Salmonella )內之細菌物種。
在某些實施例中，可將包含穩定整合於細胞的染色體內之AAV rep及cap基因的宿主細胞用於AAV粒子生產。在非限制性實例中，可根據美國專利第7238526號中所描述之方法及構築體使用已穩定整合於其染色體中AAV rep基因及AAV cap基因之至少兩個複本的宿主細胞生產AAV粒子，其關於病毒粒子生產之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，AAV粒子可在經分子穩定轉化之宿主細胞中生產，該分子包含准許在宿主細胞中調控地表現稀有限制酶之核酸序列，如US20030092161及EP1183380中所描述，其關於生產病毒粒子之內容以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
在某些實施例中，生產方法及生產AAV粒子之細胞株可包含但不限於以下中教示之彼等：PCT/US1996/010245、PCT/US1997/015716、PCT/US1997/015691、PCT/US1998/019479、PCT/US1998/019463、PCT/US2000/000415、PCT/US2000/040872、PCT/US2004/016614、PCT/US2007/010055、PCT/US1999/005870、PCT/US2000/004755、美國專利申請案第US08/549489號、第US08/462014號、第US09/659203號、第US10/246447號、第US10/465302號、美國專利第US6281010號、第US6270996號、第US6261551號、第US5756283號(讓與NIH)、第US6428988號、第US6274354號、第US6943019號、第US6482634號(讓與NIH：US7238526、US6475769)、第US6365394號(讓與NIH)、第US7491508號、第US7291498號、第US7022519號、第US6485966號、第US6953690號、第US6258595號、EP2018421、EP1064393、EP1163354、EP835321、EP931158、EP950111、EP1015619、EP1183380、EP2018421、EP1226264、EP1636370、EP1163354、EP1064393、US20030032613、US20020102714、US20030073232、US20030040101 (讓與NIH)、US20060003451、US20020090717、US20030092161、US20070231303、US20060211115、US20090275107、US2007004042、US20030119191、US20020019050，其內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。 病毒生產系統  大規模生產
在某些實施例中，AAV粒子生產可經修改以增加生產規模。根據本發明之大規模病毒生產方法可包含以下中教示之方法或加工步驟中之任一者：美國專利第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號，或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353及第WO2001023597號，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
提高AAV粒子生產規模之方法通常包含增加病毒生產細胞之數目。在某些實施例中，病毒生產細胞包含黏附細胞。為了藉由黏附病毒生產細胞提高AAV粒子生產規模，需要較大細胞培養物表面。在某些實施例中，大規模生產方法包含使用滾瓶以增加細胞培養物表面。具有增加之表面積的其他細胞培養物受質係此項技術中已知的。具有增加之表面積之額外黏附細胞培養物產物之實例包含但不限於iCELLis (Pall Corp, Port Washington, NY)、CELLSTACK® 、CELLCUBE® (Corning Corp., Corning, NY) 及NUNCTM CELL FACTORYTM (Thermo Scientific, Waltham, MA.)在某些實施例中，大規模黏附細胞表面可包含約1,000 cm2 至約100,000 cm2 。
在某些實施例中，本發明之大規模病毒生產方法可包含使用懸浮細胞培養物。懸浮細胞培養物可實現顯著增加之細胞數目。通常，可在約10-50 cm2 表面積上生長之一定數目的黏附細胞可以懸浮形式以約1 cm3 體積生長。
在某些實施例中，大規模細胞培養物可包含約107 至約109 個細胞、約108 至約1010 個細胞、約109 至約1012 個細胞或至少1012 個細胞。在某些實施例中，大規模培養物可生產約109 至約1012 個、約1010 至約1013 個、約1011 至約1014 個、約1012 至約1015 個或至少1015 個AAV粒子。
以大規模培養物形式之複製細胞之轉染可根據此項技術中已知之任何方法進行。對於大規模黏附細胞培養物，轉染方法可包含但不限於使用無機化合物(例如磷酸鈣)、有機化合物(例如聚乙二亞胺(PEI))或使用非化學方法(例如電穿孔)。對於以懸浮形式生長之細胞，轉染方法可包含但不限於使用無機化合物(例如磷酸鈣)、有機化合物(例如聚乙二亞胺(PEI))或使用非化學方法(例如電穿孔)。在某些實施例中，大規模懸浮培養物之轉染可根據標題為「Transfection Procedure」之章節進行，其描述於Feng, L. 等人, 2008. Biotechnol Appl Biochem. 50:121-32中，該文獻之內容以全文引用之方式併入本文中。根據此類實施例，可形成PEI-DNA複合物以用於引入待轉染之質體。在某些實施例中，用PEI-DNA複合物轉染之細胞可在轉染之前進行『休克』。此包含將細胞培養物溫度降低至4℃持續約1小時之時段。在某些實施例中，細胞培養物可休克約10分鐘至約5小時之時段。在某些實施例中，細胞培養物可在約0℃至約20℃之溫度下休克。
在某些實施例中，轉染可包含用於表現RNA效應分子以減少來自一或多種有效負載構築體之核酸表現的一或多種載體。此類方法可藉由減少在表現有效負載構築體上浪費之細胞資源來提高AAV粒子之產量。在某些實施例中，此類方法可根據美國公開案第US2014/0099666號中所教示之彼等進行，其內容以全文引用之方式併入本文中。 生物反應器
在某些實施例中，細胞培養生物反應器可用於大規模生產AAV粒子。在某些實施例中，生物反應器包含攪拌槽反應器。此類反應器一般包含具有攪拌器(例如葉輪)之容器，其形狀通常為圓柱形。在某些實施例中，此類生物反應器容器可置放於水套內以控制容器溫度及/或將環境溫度變化之影響降至最低。
生物反應器容器體積之尺寸可在以下範圍：約500 ml至約2 L、約1 L至約5 L、約2.5 L至約20 L、約10 L至約50 L、約25 L至約100 L、約75 L至約500 L、約250 L至約2,000 L、約1,000 L至約10,000 L、約5,000 L至約50,000 L或至少50,000 L。容器底部可為圓形或平坦的。在某些實施例中，動物細胞培養物可維持在具有圓形容器底部之生物反應器中。
在某些實施例中，生物反應器容器可經由使用熱循環器而升溫。熱循環器在水套周圍泵送經加熱之水。在某些實施例中，經加熱之水可經由存在於生物反應器容器內之管道(例如蛇形管)泵送。在某些實施例中，暖氣可在生物反應器周圍循環，包含但不限於培養基正上方之空氣空間。另外，可維持pH值及CO2 水準以最佳化細胞存活率。
在某些實施例中，生物反應器可包含中空纖維反應器。中空纖維生物反應器可支撐固著依賴性及固著非依賴性細胞兩者之培養物。其他生物反應器可包含但不限於填充床或固定床生物反應器。此類生物反應器可包含具有用於黏附細胞附著之玻璃珠的容器。其他填充床反應器可包含陶瓷珠。
在某些實施例中，病毒粒子經由使用拋棄式生物反應器而生產。在某些實施例中，生物反應器可包含GE WAVE生物反應器、GE Xcellerax生物反應器、Sartorius Biostat生物反應器、ThermoFisher Hyclone生物反應器或Pall Allegro生物反應器。
在某些實施例中，細胞生物反應器培養物中之AAV粒子生產可根據美國專利第5,064764號、第6,194,191號、第6,566,118號、第8,137,948號或美國專利申請案第US2011/0229971號中教示之方法或系統進行，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，灌注技術可用於生產病毒粒子中。灌注系統為流體循環系統，其使用過濾器及篩網來截留生物反應器內部之細胞，同時不斷地移除細胞廢物及藉由細胞代謝缺乏營養物的培養基。在某些實施例中，灌注系統為交替切向流(ATF)灌注系統(例如，XCell ATF系統)。在某些實施例中，灌注系統可與生物反應器協同使用，以在生產病毒粒子，諸如AAV病毒粒子期間管理及循環生物反應器內之細胞培養基。在某些實施例中，灌注系統可用於支持大規模生產具有出乎意料的高細胞密度之高品質AAV病毒粒子。在某些實施例中，灌注系統可用於在生物反應器內進行培養基切換，諸如用補充有生長或生產增強因子之培養基置換細胞培養基，以提高AAV產物之品質及數量。
有利的為在單次生產活動中生產大批次AAV粒子用於基因療法臨床開發活動，因為大批次治療材料確保臨床研究一致性且使由多個較小製造活動引起之治療性及統計變化降至最低。有利的為在單次生產活動中生產大批次AAV粒子用於商業產物開發活動，因為大批次治療材料使由多個較小製造活動引起之變化以及與小批次生產相關的品質控制及產物分析方面之對應併發情況降至最低。 病毒生產細胞(VPC)混合物之擴增
在某些實施例中，本發明之AAV粒子或病毒載體可在病毒生產細胞(VPC)，諸如昆蟲細胞中生產。生產細胞可源自細胞庫(CB)且通常儲存於冷凍細胞庫中。
在某些實施例中，來自細胞庫之病毒生產細胞將以冷凍形式提供。將冷凍細胞之小瓶解凍，通常直至冰晶消散。在某些實施例中，冷凍細胞在10-50℃、15-40℃、20-30℃、25-50℃、30-45℃、35-40℃或37-39℃的溫度下解凍。在某些實施例中，冷凍的病毒生產細胞使用經加熱之水浴解凍。
在某些實施例中，解凍之CB細胞混合物的細胞密度將為1.0×104 -1.0×109 個細胞/毫升。在某些實施例中，解凍之CB細胞混合物的細胞密度為：1.0×104 -2.5×104 個細胞/毫升、2.5×104 -5.0×104 個細胞/毫升、5.0×104 -7.5×104 個細胞/毫升、7.5×104 -1.0×105 個細胞/毫升、1.0×105 -2.5×105 個細胞/毫升、2.5×105 -5.0×105 個細胞/毫升、5.0×105 -7.5×105 個細胞/毫升、7.5×105 -1.0×106 個細胞/毫升、1.0×106 -2.5×106 個細胞/毫升、2.5×106 -5.0×106 個細胞/毫升、5.0×106 -7.5×106 個細胞/毫升、7.5×106 -1.0×107 個細胞/毫升、1.0×107 -2.5×107 個細胞/毫升、2.5×107 -5.0×107 個細胞/毫升、5.0×107 -7.5×107 個細胞/毫升、7.5×107 -1.0×108 個細胞/毫升、1.0×108 -2.5×108 個細胞/毫升、2.5×108 -5.0×108 個細胞/毫升、5.0×108 -7.5×108 個細胞/毫升，或7.5×108 -1.0×109 個細胞/毫升。
在某些實施例中，CB細胞混合物之體積擴大。此過程通常稱為種子培養(Seed Train)、種子擴增(Seed Expansion)或CB細胞擴增(CB Cellular Expansion)。細胞/種子擴增可包含使用依次增大的工作體積經由多個擴增步驟來接種及擴增細胞混合物之連續步驟。在某些實施例中，細胞擴增可包含1、2、3、4、5、6、7或大於7個擴增步驟。在某些實施例中，細胞擴增之工作體積可包含以下工作體積中之一或多者或工作體積範圍：5 mL、10 mL、20 mL、5-20 mL、25 mL、30 mL、40 mL、50 mL、20-50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL、175 mL、200 mL、50-200 mL、250 mL、300 mL、400 mL、500 mL、750 mL、1000 mL、250-1000 mL、1250 mL、1500 mL、1750 mL、2000 mL、1000-2000 mL、2250 mL、2500 mL、2750 mL、3000 mL、2000-3000 mL、3500 mL、4000 mL、4500 mL、5000 mL、3000-5000 mL、5.5 L、6.0 L、7.0 L、8.0 L、9.0 L、10.0 L，及5.0-10.0 L。
在某些實施例中，來自第一擴增細胞混合物之一定體積的細胞可用於接種第二、獨立種子培養物/種子擴增物(而非使用解凍之CB細胞混合物)。此過程通常稱為「滾動接種(rolling inoculum)」。在某些實施例中，滾動接種用於一系列的兩個或更多個(例如兩個、三個、四個或五個)獨立種子培養/種子擴增中。
在某些實施例中，大體積細胞擴增可包含使用生物反應器，諸如GE WAVE生物反應器、GE Xcellerex生物反應器、Sartorius Biostat生物反應器、ThermoFisher Hyclone生物反應器或Pall Allegro生物反應器。
在某些實施例中，將工作體積內之細胞密度擴增為目標輸出細胞密度。在某些實施例中，擴增步驟之輸出細胞密度為1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、5.0×106 -1.0×107 、1.0×107 -5.0×107 、5.0×107 -1.0×108 、5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、2.0×106 、3.0×106 、4.0×106 、5.0×106 、6.0×106 、7.0×106 、8.0×106 、9.0×106 、1.0×107 、2.0×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 ，或9.0×107 個細胞/毫升。
在某些實施例中，工作體積之輸出細胞密度提供用於更大的連續工作體積之接種細胞密度。在某些實施例中，擴增步驟之接種細胞密度為1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、5.0×106 -1.0×107 、1.0×107 -5.0×107 、5.0×107 -1.0×108 、5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、2.0×106 、3.0×106 、4.0×106 、5.0×106 、6.0×106 、7.0×106 、8.0×106 、9.0×106 、1.0×107 、2.0×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 ，或9.0×107 個細胞/毫升。
在某些實施例中，細胞擴增可持續1-50天。各細胞擴增步驟或總細胞擴增可持續1-10天、1-5天、1-3天、2-3天、2-4天、2-5天、2-6天、3-4天、3-5天、3-6天、3-8天、4-5天、4-6天、4-8天、5-6天，或5-8天。在某些實施例中，各細胞擴增步驟或總細胞擴增可持續1-100代、1-1000代、100-1000代、100代或更多代、或1000代或更多代。
在某些實施例中，經感染或轉染之生產細胞可以與CB細胞混合物相同之方式擴增，如本發明中所闡述。 感染病毒生產細胞
在某些實施例中，本發明之AAV粒子在諸如昆蟲細胞之病毒生產細胞(VPC)中藉由用包含AAV表現構築體之病毒載體及/或包含AAV有效負載構築體之病毒載體感染VPC來生產。在某些實施例中，VPC經包含AAV表現構築體之表現BEV及包含AAV有效負載構築體之有效負載BEV感染。
在某些實施例中，AAV粒子由經包含AAV表現構築體及AAV有效負載構築體二者之病毒載體感染VPC而生產。在某些實施例中，VPC經包含AAV表現構築體及AAV有效負載構築體二者之單一BEV感染。
在某些實施例中，VPC (諸如昆蟲細胞)在包含以下步驟之感染方法中使用感染BIIC進行感染：(i)將VPC集合接種至生產用生物反應器中；(ii)接種之VPC可視情況擴增至目標工作體積及細胞密度；(iii)將包含表現BEV之感染BIIC及包含有效負載BEV之感染BIIC注入至生產用生物反應器中，生產感染之病毒生產細胞；及(iv)培育經感染之病毒生產細胞，以在病毒生產細胞內生產AAV粒子。
在某些實施例中，感染時的VPC密度為1.0×105 -2.5×105 、2.5×105 -5.0×105 、5.0×105 -7.5×105 、7.5×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、1.0×106 -2.0×106 、1.5×106 -2.5×106 、2.0×106 -3.0×106 、2.5×106 -3.5×106 、3.0×106 -3.4×106 、3.0×106 -4.0×106 、3.5×106 -4.5×106 、4.0×106 -5.0×106 、4.5×106 -5.5×106 、5.0×106 -1.0×107 、5.0×106 -6.0×106 、5.5×106 -6.5×106 、6.0×106 -7.0×106 、6.5×106 -7.5×106 、7.0×106 -8.0×106 、7.5×106 -8.5×106 、8.0×106 -9.0×106 、8.5×106 -9.5×106 、9.0×106 -1.0×107 、9.5×106 -1.5×107 、1.0×107 -5.0×107 ，或5.0×107 -1.0×108 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、1.5×106 、2.0×106 、2.5×106 、3.0×106 、3.1×106 、3.2×106 、3.3×106 、3.4×106 、3.5×106 、4.0×106 、4.5×106 、5.0×106 、5.5×106 、6.0×106 、6.5×106 、7.0×106 、7.5×106 、8.0×106 、8.5×106 、9.0×106 、9.5×106 、1.0×107 、1.5×107 、2.0×107 、2.5×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 ，或9.0×107 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為2.0-3.5×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為3.5-5.0×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為5.0-7.5×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為5.0-10.0×106 個細胞/毫升。
在某些實施例中，感染時的VPC密度為1.0×105 -2.5×105 、2.5×105 -5.0×105 、5.0×105 -7.5×105 、7.5×105 -1.0×106 、1.0×106 -5.0×106 、1.0×106 -2.0×106 、1.5×106 -2.5×106 、2.0×106 -3.0×106 、2.5×106 -3.5×106 、3.0×106 -3.4×106 、3.0×106 -4.0×106 、3.5×106 -4.5×106 、4.0×106 -5.0×106 、4.5×106 -5.5×106 、5.0×106 -1.0×107 、5.0×106 -6.0×106 、5.5×106 -6.5×106 、6.0×106 -7.0×106 、6.5×106 -7.5×106 、7.0×106 -8.0×106 、7.5×106 -8.5×106 、8.0×106 -9.0×106 、8.5×106 -9.5×106 、9.0×106 -1.0×107 、9.5×106 -1.5×107 、1.0×107 -5.0×107 ，或5.0×107 -1.0×108 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為5.0×105 、6.0×105 、7.0×105 、8.0×105 、9.0×105 、1.0×106 、1.5×106 、2.0×106 、2.5×106 、3.0×106 、3.1×106 、3.2×106 、3.3×106 、3.4×106 、3.5×106 、4.0×106 、4.5×106 、5.0×106 、5.5×106 、6.0×106 、6.5×106 、7.0×106 、7.5×106 、8.0×106 、8.5×106 、9.0×106 、9.5×106 、1.0×107 、1.5×107 、2.0×107 、2.5×107 、3.0×107 、4.0×107 、5.0×107 、6.0×107 、7.0×107 、8.0×107 ，或9.0×107 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為2.0-3.5×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為3.5-5.0×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為5.0-7.5×106 個細胞/毫升。在某些實施例中，感染時的VPC密度為5.0-10.0×106 個細胞/毫升。
在某些實施例中，感染BIIC與VPC以VPC:BIIC之目標比率組合。在某些實施例中，VPC:BIIC感染比率(體積比體積)在1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 ，或5.0×106 -1.0×107 之間(VPC體積比BIIC體積)。在某些實施例中，VPC:BIIC感染比率(體積比體積)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 ，或約9.5×106 (VPC體積比BIIC體積)。在某些實施例中，VPC:BIIC感染比率(細胞比細胞)在1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 ，或5.0×106 -1.0×107 之間(VPC細胞比BIIC細胞)。在某些實施例中，VPC:BIIC感染比率(細胞比細胞)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 ，或約9.5×106 (VPC細胞比BIIC細胞)。
在某些實施例中，包含表現BEV之感染BIIC與VPC以VPC:表現BIIC之目標比率組合。在某些實施例中，VPC:表現BIIC感染比率(體積比體積)在1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 ，或5.0×106 -1.0×107 之間(VPC體積比表現BIIC體積)。在某些實施例中，VPC:表現BIIC感染比率(體積比體積)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 ，或約9.5×106 (VPC體積比表現BIIC體積)。在某些實施例中，VPC:表現BIIC感染比率(細胞比細胞)在1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 ，或5.0×106 -1.0×107 之間(VPC細胞比表現BIIC細胞)。在某些實施例中，VPC:表現BIIC感染比率(細胞比細胞)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 ，或約9.5×106 (VPC細胞比表現BIIC細胞)。
在某些實施例中，包含有效負載BEV之感染BIIC與VPC以VPC:有效負載BIIC之目標比率組合。在某些實施例中，VPC:有效負載BIIC感染比率(體積比體積)在1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 ，或5.0×106 -1.0×107 之間(VPC體積比有效負載BIIC體積)。在某些實施例中，VPC:有效負載BIIC感染比率(體積比體積)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 ，或約9.5×106 (VPC體積比有效負載BIIC體積)。在某些實施例中，VPC:有效負載BIIC感染比率(細胞比細胞)在1.0×103 -3.0×103 、2.0×103 -4.0×103 、3.0×103 -5.0×103 、4.0×103 -6.0×103 、5.0×103 -7.0×103 、6.0×103 -8.0×103 、7.0×103 -9.0×103 、8.0×103 -1.0×104 、9.0×103 -1.1×104 、1.0×103 -5.0×103 、5.0×103 -1.0×104 、1.0×104 -3.0×104 、2.0×104 -4.0×104 、3.0×104 -5.0×104 、4.0×104 -6.0×104 、5.0×104 -7.0×104 、6.0×104 -8.0×104 、7.0×104 -9.0×104 、8.0×104 -1.0×105 、9.0×104 -1.1×105 、1.0×104 -5.0×104 、5.0×104 -1.0×105 、1.0×105 -3.0×105 、2.0×105 -4.0×105 、3.0×105 -5.0×105 、4.0×105 -6.0×105 、5.0×105 -7.0×105 、6.0×105 -8.0×105 、7.0×105 -9.0×105 、8.0×105 -1.0×106 、9.0×105 -1.1×106 、1.0×105 -5.0×105 、5.0×105 -1.0×106 、1.0×106 -3.0×106 、2.0×106 -4.0×106 、3.0×106 -5.0×106 、4.0×106 -6.0×106 、5.0×106 -7.0×106 、6.0×106 -8.0×106 、7.0×106 -9.0×106 、8.0×106 -1.0×107 、9.0×106 -1.1×107 、1.0×106 -5.0×106 ，或5.0×106 -1.0×107 之間(VPC細胞比有效負載BIIC細胞)。在某些實施例中，VPC:有效負載BIIC感染比率(細胞比細胞)為約1.0×103 、約1.5×103 、約2.0×103 、約2.5×103 、約3.0×103 、約3.5×103 、約4.0×103 、約4.5×103 、約5.0×103 、約5.5×103 、約6.0×103 、約6.5×103 、約7.0×103 、約7.5×103 、約8.0×103 、約8.5×103 、約9.0×103 、約9.5×103 、約1.0×104 、約1.5×104 、約2.0×104 、約2.5×104 、約3.0×104 、約3.5×104 、約4.0×104 、約4.5×104 、約5.0×104 、約5.5×104 、約6.0×104 、約6.5×104 、約7.0×104 、約7.5×104 、約8.0×104 、約8.5×104 、約9.0×104 、約9.5×104 、約1.0×105 、約1.5×105 、約2.0×105 、約2.5×105 、約3.0×105 、約3.5×105 、約4.0×105 、約4.5×105 、約5.0×105 、約5.5×105 、約6.0×105 、約6.5×105 、約7.0×105 、約7.5×105 、約8.0×105 、約8.5×105 、約9.0×105 、約9.5×105 、約1.0×106 、約1.5×106 、約2.0×106 、約2.5×106 、約3.0×106 、約3.5×106 、約4.0×106 、約4.5×106 、約5.0×106 、約5.5×106 、約6.0×106 、約6.5×106 、約7.0×106 、約7.5×106 、約8.0×106 、約8.5×106 、約9.0×106 ，或約9.5×106 (VPC細胞比有效負載BIIC細胞)。
在某些實施例中，包含表現BEV之感染BIIC及包含有效負載BEV之感染BIIC與VPC以目標表現BIIC:有效負載BIIC比組合。在某些實施例中，表現BIIC與有效負載BIIC之比為10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8、1:9或1:10。在某些實施例中，表現BIIC與有效負載BIIC之比在6.5-7.5:1、6-7:1、5.5-6.5:1、5-6:1、4.5-5.5:1、4-5:1、3.5-4.5:1、3-4:1、2.5-3.5:1、2-3:1、1.5-2.5:1、1-2:1、1-1.5:1、1:1-1.5、1:1-2、1:1.5-2.5、1:2-3、1:2.5-3.5、1:3-4、1:3.5-4.5、1:4-5、1:4.5-5.5、1:5-6、1:5.5-6.5、1:6-7，或1:6.5-7.5之間。
在某些實施例中，經感染之病毒生產細胞在某一溶解氧(DO)含量(DO%)下培育。在某些實施例中，經感染之病毒生產細胞在10%-50%、20%-40%、10%-20%、15%-25%、20%-30%、25%-35%、30%-40%、35%-45%、40%-50%、10%-15%、15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%、35%-40%、40%-45%，或45%-50%之間的DO%下培育。在某些實施例中，經感染之病毒生產細胞在約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%之DO%下培育。在某些實施例中，經感染之病毒生產細胞在20%-30%或約25%之間的DO%下培育。在某些實施例中，經感染之病毒生產細胞在25%-35%或約30%之間的DO%下培育。在某些實施例中，經感染之病毒生產細胞在30%-40%或約35%之間的DO%下培育。在某些實施例中，經感染之病毒生產細胞在35%-45%或約40%之間的DO%下培育。 細胞溶解
包含但不限於病毒生產細胞的本發明之細胞可根據此項技術中已知之任何方法經受細胞溶解。可進行細胞溶解，以獲得任何本發明之細胞內存在之一或多種試劑(例如病毒粒子)。在某些實施例中，批量收穫之AAV粒子及病毒生產細胞根據本發明經受細胞溶解。
在某些實施例中，細胞溶解可根據以下中所呈現之方法或系統中之任一者進行：美國專利第7,326,555號、第7,579,181號、第7,048,920號、第6,410,300號、第6,436,394號、第7,732,129號、第7,510,875號、第7,445,930號、第6,726,907號、第6,194,191號、第7,125,706號、第6,995,006號、第6,676,935號、第7,968,333號、第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號，或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
細胞溶解方法及系統可為化學的或機械的。化學細胞溶解通常包含在化學溶解條件下使一或多種細胞與一或多種化學溶解劑接觸。機械溶解通常包含使一或多種細胞經受藉由機械力進行之細胞溶解。溶解亦可藉由使細胞在達到約0%存活率之後降解來完成。
在某些實施例中，化學溶解可用於溶解細胞。如本文所用，術語「化學溶解劑」係指可有助於破壞細胞之任何試劑。在某些實施例中，將溶解劑引入稱為溶解溶液或溶解緩衝液之溶液中。如本文所用，術語「化學溶解溶液」係指包含一或多種溶解劑之溶液(通常為水溶液)。除了溶解劑之外，溶解溶液可包含一或多種緩衝劑、增溶劑、界面活性劑、防腐劑、低溫保護劑、酶類、酶抑制劑及/或螯合劑。溶解緩衝液為包含一或多種緩衝劑之溶解溶液。溶解溶液之額外組分可包含一或多種增溶劑。如本文所用，術語「增溶劑」係指提高溶液之一或多種組分之溶解度及/或施加溶液之一或多種實體之溶解度的化合物。在某些實施例中，增溶劑提高蛋白質溶解度。在某些實施例中，基於其提高蛋白質溶解度同時維持蛋白質構形及/或活性之能力選擇增溶劑。
例示性溶解劑可包含描述於美國專利第8,685,734號、第7,901,921號、第7,732,129號、第7,223,585號、第7,125,706號、第8,236,495號、第8,110,351號、第7,419,956號、第7,300,797號、第6,699,706號及第6,143,567號中之彼等中之任一者，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，溶解劑可選自溶解鹽、兩性試劑、陽離子型試劑、離子型清潔劑及非離子型清潔劑。溶解鹽可包含但不限於氯化鈉(NaCl)及氯化鉀(KCl)。其他溶解鹽可包含描述於美國專利第8,614,101號、第7,326,555號、第7,579,181號、第7,048,920號、第6,410,300號、第6,436,394號、第7,732,129號、第7,510,875號、第7,445,930號、第6,726,907號、第6,194,191號、第7,125,706號、第6,995,006號、第6,676,935號及第7,968,333號中之彼等中之任一者，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，細胞溶解物試劑包括胺基酸，諸如精胺酸，或酸化胺基酸混合物，諸如精胺酸HCl。
在某些實施例中，細胞溶解物溶液包含穩定添加劑。在某些實施例中，穩定添加劑可包含海藻糖、甘胺酸甜菜鹼、甘露糖醇、檸檬酸鉀、CuCl2 、脯胺酸、木糖醇、NDSB 201、CTAB及K2 PO4 。在某些實施例中，穩定添加劑可包含胺基酸，諸如精胺酸，或酸化胺基酸混合物，諸如精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.1 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.2 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.25 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.3 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.4 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.5 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.6 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.7 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.8 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含0.9 M精胺酸或精胺酸HCl。在某些實施例中，穩定添加劑可包含1.0 M精胺酸或精胺酸HCl。
可提高或降低鹽濃度以獲得用於細胞膜破裂之有效濃度。如本文中所提及之兩性試劑為能夠呈酸或鹼形式進行反應之化合物。兩性試劑可包含但不限於溶血磷脂醯膽鹼、3-((3-膽醯胺基丙基)二甲基銨)-1-丙磺酸鹽(CHAPS)、ZWITTERGENT®及其類似物。陽離子型試劑可包含但不限於溴化鯨蠟基三甲基銨(C (16) TAB)及苯紮氯銨。包含清潔劑之溶解劑可包含離子型清潔劑或非離子型清潔劑。
清潔劑可用以分裂或溶解細胞結構，該等細胞結構包含但不限於細胞膜、細胞壁、脂質、碳水化合物、脂蛋白及糖蛋白。例示性離子型清潔劑包含美國專利第7,625,570號及第6,593,123號或美國公開案第US2014/0087361號中所教示之彼等中之任一者，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，溶解溶液包含一或多種離子型清潔劑。用於溶解溶液之離子型清潔劑的實例包含但不限於十二烷基硫酸鈉(SDS)、膽酸鹽及脫氧膽酸鹽。在某些實施例中，離子型清潔劑可以增溶劑形式包含於溶解溶液中。在某些實施例中，溶解溶液包含一或多種非離子型清潔劑。用於溶解溶液中之非離子型清潔劑可包含但不限於辛基葡糖苷、毛地黃皂苷、蘆布若爾(lubrol)、C12E8、TWEEN®-20、TWEEN®-80、曲拉通X-100、曲拉通X-114、Brij-35、Brij-58及Noniodet P-40。非離子型清潔劑通常為較弱溶解劑，但可以增溶劑形式包含在內以用於溶解細胞及/或病毒蛋白質。在某些實施例中，溶解溶液包含一或多種兩性離子型清潔劑。用於溶解溶液中之兩性離子型清潔劑可包含但不限於：月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)；N,N-二甲基-N-十二烷基甘胺酸甜菜鹼(Empigen® BB)；3-(N,N-二甲基肉豆蔻基銨基)丙磺酸酯(Zwittergent® 3-10)；正十二烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯(Zwittergent® 3-12)；正十四烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯(Zwittergent® 3-14)；3-(N,N-二甲基棕櫚基銨基)丙磺酸酯(Zwittergent® 3-16)；3-((3-膽醯胺基丙基)二甲基銨基)-1-丙磺酸酯(CHAPS)；以及3-([3-膽醯胺基丙基]二甲基銨基)-2-羥基-1-丙磺酸酯(CHAPSO)。
在某些實施例中，溶解溶液包含曲拉通X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)，諸如0.5% w/v曲拉通X-100。在某些實施例中，溶解溶液包含月桂基二甲胺N-氧化物(LDAO)，諸如0.184% w/v (4×CMC)的LDAO。在某些實施例中，溶解溶液包含種子油界面活性劑，諸如EcosurfTM SA-9。在某些實施例中，溶解溶液包含N,N-二甲基-N-十二烷基甘胺酸甜菜鹼(Empigen® BB)。在某些實施例中，溶解溶液包含Zwittergent®清潔劑，諸如Zwittergent® 3-12 (正十二烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯)、Zwittergent® 3-14 (正十四烷基-N,N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸酯)或Zwittergent® 3-16 (3-(N,N-二甲基棕櫚基銨基)丙磺酸酯)。
其他溶解劑可包含酶類及尿素。在某些實施例中，一或多種溶解劑可合併至溶解溶液中以便提高細胞溶解及蛋白質溶解度中之一或多者。在某些實施例中，酶抑制劑可包含於溶解溶液中以便防止可能由細胞膜破壞觸發之蛋白分解。
在某些實施例中，溶解溶液包含0.1-1.0% w/v之間、0.2-0.8% w/v之間、0.3-0.7% w/v之間、0.4-0.6% w/v之間或約0.5% w/v之細胞溶解劑(例如清潔劑)。在某些實施例中，溶解溶液包含0.3-0.35% w/v之間、0.35-0.4% w/v之間、0.4-0.45% w/v之間、0.45-0.5% w/v之間、0.5-0.55% w/v之間、0.55-0.6% w/v之間、0.6-0.65% w/v之間或0.65%-0.7% w/v之間的細胞溶解劑(例如清潔劑)。
在某些實施例中，由黏附細胞培養物生產之細胞溶解物可用一或多種核酸酶，諸如Benzonase核酸酶(I級，99%純度)或c-LEcta Denarase核酸酶(先前為Sartorius Denarase)進行處理。在某些實施例中，添加核酸酶以降低由釋放之DNA引起之溶解物的黏度。
在某些實施例中，化學溶解使用單一化學溶解混合物。在某些實施例中，化學溶解使用連續添加之若干溶解劑，得到最終化學溶解混合物。
在某些實施例中，化學溶解混合物包含酸化胺基酸混合物(諸如精胺酸HCl)、非離子型清潔劑(諸如曲拉通X-100)及核酸酶(諸如Benzonase核酸酶)。在某些實施例中，化學溶解混合物可包含酸或鹼，以得到目標溶解pH。
在某些實施例中，溶解溶液包含0.5% w/v曲拉通X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽。在某些實施例中，溶解溶液包含0.5% w/v曲拉通X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽，且不具有可偵測之核酸酶。在某些實施例中，溶解溶液由0.5% w/v曲拉通X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽組成。
在某些實施例中，化學溶解在化學溶解條件下進行。如本文所用，術語「化學溶解條件」係指可藉由化學溶解劑溶解標靶細胞的環境條件(例如，溫度、壓力、pH等)之任何組合。
在某些實施例中，溶解pH在3.0-3.5、3.5-4.0、4.0-4.5、4.5-5.0、5.0-5.5、5.5-6.0、6.0-6.5、6.5-7.0、7.0-7.5或7.5-8.0之間。在某些實施例中，溶解pH在6.0-7.0、6.5-7.0、6.5-7.5或7.0-7.5之間。
在某些實施例中，溶解溫度在15-35℃之間、在20-30℃之間、在25-39℃之間、在20-21℃之間、在20-22℃之間、在21-22℃之間、在21-23℃之間、在22-23℃之間、在22-24℃之間、在23-24℃之間、在23-25℃之間、在24-25℃之間、在24-26℃之間、在25-26℃之間、在25-27℃之間、在26-27℃之間、在26-28℃之間、在27-28℃之間、在27-29℃之間、在28-29℃之間、在28-30℃之間、在29-30℃之間、在29-31℃之間、在30-31℃之間、在30-32℃之間、在31-32℃之間，或在31-33℃之間。
在某些實施例中，溶解溶液包含0.5% w/v曲拉通X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽，且溶解條件包含在26℃-28℃ (例如27℃)下至少4小時(例如4-6小時，例如4小時)之持續時間。在某些實施例中，溶解溶液包含0.5% w/v曲拉通X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽，且不具有可偵測之核酸酶，且溶解條件包含在26℃-28℃ (例如27℃)下至少4小時(例如4-6小時，例如4小時)之持續時間。在某些實施例中，溶解溶液由0.5% w/v曲拉通X-100 (辛基苯酚乙氧基化物)及200 mM精胺酸鹽酸鹽組成，且溶解條件包含在26℃-28℃ (例如27℃)下至少4小時(例如4-6小時，例如4小時)之持續時間。
在某些實施例中，進行機械細胞溶解。機械細胞溶解方法可包含使用一或多種溶解條件及/或一或多種溶解力。如本文所用，術語「溶解條件」係指促進細胞破壞之狀態或情況。溶解條件可包含特定溫度、壓力、滲透純度、鹽度及其類似者。在某些實施例中，溶解條件包含升高或降低之溫度。根據某些實施例，溶解條件包含溫度變化以促進細胞破壞。根據此類實施例進行之細胞溶解可包含凍融溶解。如本文所用，術語「凍融溶解」係指其中細胞溶液經受一或多個凍融循環之細胞溶解。根據凍融溶解方法，溶液中之細胞經冷凍以誘導由冰晶體形成及擴張引起之細胞膜的機械破壞。根據凍融溶解方法使用之細胞溶液可進一步包含一或多種溶解劑、增溶劑、緩衝劑、低溫保護劑、界面活性劑、防腐劑、酶類、酶抑制劑及/或螯合劑。一旦經受凍結之細胞溶液經解凍，此類組分可促進所需細胞產物之回收。在某些實施例中，一或多種低溫保護劑包含於經歷凍融溶解之細胞溶液中。如本文所用，術語「低溫保護劑」係指用於保護一或多種物質免於由於凍結引起之損壞的試劑。低溫保護劑可包含美國公開案第US2013/0323302號或美國專利第6,503,888號、第6,180,613號、第7,888,096號、第7,091,030號中所教示之彼等中之任一者，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，低溫保護劑可包含但不限於二甲亞碸、1,2-丙二醇、2,3-丁二醇、甲醯胺、甘油、乙二醇、1,3-丙二醇及正二甲基甲醯胺、聚乙烯吡咯啶酮、羥乙基澱粉、瓊脂糖、聚葡萄糖、肌醇、葡萄糖、羥乙基澱粉、乳糖、山梨糖醇、甲基葡萄糖、蔗糖及尿素。在某些實施例中，可根據美國專利第7,704,721號中所描述之方法中之任一者進行凍融溶解，其內容以全文引用之方式併入本文中。
如本文所用，術語「溶解力」係指用於破壞細胞之物理活力。溶解力可包含但不限於機械力、聲波力、重力、光學力、電力及其類似者。藉由機械力進行之細胞溶解在本文中稱為「機械溶解」。可根據機械溶解使用之機械力可包含高剪切流體力。根據此類機械溶解方法，可使用微流化床。微流化床通常包含其中可施加細胞溶液之入口儲集器。隨後可經由泵(例如高壓泵)在高速及/或高壓下將細胞溶液泵送至相互作用腔室以生產剪切流體力。所得溶解物隨後可收集於一或多個輸出儲集器中。可調整泵速度及/或壓力以調節細胞溶解且促進產物(例如病毒粒子)之回收。其他機械溶解方法可包含藉由刮擦進行的細胞之物理破壞。
可基於待溶解之細胞之細胞培養物形式選擇細胞溶解方法。舉例而言，對於黏附細胞培養物，可使用一些化學及機械溶解方法。此類機械溶解方法可包含凍融溶解或刮擦。在另一實例中，黏附細胞培養物之化學溶解可經由與包含界面活性劑(諸如曲拉通-X-100)之溶解溶液一起培育來進行。
在某些實施例中，用於在無溶解下收穫AAV粒子之方法可用於有效及可擴充的AAV粒子生產。在非限制性實例中，AAV粒子可藉由以下生產：培養缺乏肝素結合位點之AAV粒子，進而允許AAV粒子進入細胞培養物中之上清液中，自培養物收集上清液；及使AAV粒子與上清液分離，如美國專利申請案20090275107中所描述，該申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。 澄清及純化：綜述
包含病毒粒子之細胞溶解物可經受澄清及純化。澄清通常係指自細胞溶解物純化病毒粒子中進行之初始步驟，且用以製備溶解物以藉由自批量溶解收穫物移除較大的不溶性碎屑而進一步純化。病毒生產可在病毒生產過程中之任何時間點包含澄清步驟。澄清步驟可包含但不限於離心及過濾。在澄清期間，離心可在低速下進行以僅移除較大碎屑。類似地，過濾可使用具有較大孔徑之過濾器進行以使得僅移除較大碎屑。
純化通常係指藉由自澄清之溶解收穫物移除較小碎屑而自細胞溶解物純化及濃縮病毒粒子以製備最終混合藥物物質中進行之最終步驟。病毒生產可在病毒生產過程中之任何時間點包含純化步驟。純化步驟可包含但不限於過濾及層析。過濾可使用具有較小孔徑之過濾器進行以自產物移除較小碎屑，或使用具有較大孔徑之過濾器進行以自產物截留較大碎屑。過濾可用於改變病毒生產池或物料流之濃度及/或含量。可進行層析以自一組雜質選擇性分離標靶粒子。
高濃度之AAV粒子之聚集或聚結傾向使大規模生產高濃度AAV調配物複雜化。小規模澄清及濃縮系統，諸如透析卡匣或旋轉離心一般對於大規模生產不可充分擴展。本發明提供用於加工大體積之高濃度AAV生產調配物之澄清、純化及濃縮系統的實施例。在某些實施例中，大體積澄清系統包含以下加工步驟中之一或多者：深層過濾、微過濾(例如0.2 µm過濾)、親和層析、離子交換層析(諸如陰離子交換層析(AEX)或陽離子交換層析(CEX))、切向流過濾系統(TFF)、奈米過濾(例如病毒截留過濾(VRF))、最終過濾(FF)及填充過濾。
病毒澄清及純化之目標包含高通量地加工細胞溶解物及使最終病毒回收最佳化。包含本發明之澄清及純化步驟的優點包含加工較大體積之溶解物的可擴展性。在某些實施例中，澄清及純化可根據以下中所呈現之方法或系統中之任一者進行：美國專利第8,524,446號、第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號、第7,491,508號，美國公開案第US2013/0045186號、第US2011/0263027號、第US2011/0151434號、第US2003/0138772號，及國際公開案第WO2002012455號、第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，包含至少一種AAV粒子之組合物可使用美國專利第6146874號、第US 6660514號、第US 8283151號或第US 8524446號中所描述之方法或系統分離或純化，其內容以全文引用之方式併入本文中。 澄清及純化：離心
根據某些實施例，細胞溶解物可藉由一或多個離心步驟澄清。可使用離心使溶解物中之不溶性粒子集結。在澄清期間，離心強度(其可以重力單位(g)表示，g表示標準重力之倍數)可低於後續純化步驟中之離心強度。在某些實施例中，可在約200 g至約800 g、約500 g至約1500 g、約1000 g至約5000 g、約1200 g至約10000 g或約8000 g至約15000 g之重力下對細胞溶解物進行離心。在某些實施例中，細胞溶解物離心係在8000 g下進行15分鐘。在某些實施例中，可進行密度梯度離心以便藉由沈降速率分隔細胞溶解物中之顆粒。根據本發明之方法或系統使用之梯度可包含但不限於氯化銫梯度及碘克沙醇步驟梯度。在某些實施例中，離心使用傾析器離心系統。在某些實施例中，離心使用盤堆疊(disc-stack)離心系統。在某些實施例中，離心包含超速離心，諸如雙循環CsCl梯度超速離心或碘克沙醇不連續密度梯度超速離心。 澄清及純化：過濾
在某些實施例中，在澄清、純化及/或滅菌期間可使用一或多個微過濾、奈米過濾及/或超過濾步驟。一或多個微過濾、奈米過濾或超過濾步驟可包含使用諸如以下之過濾系統：EMD Millipore Express SHC XL10 0.5/0.2 µm過濾器、EMD Millipore Express SHCXL6000 0.5/0.2 µm過濾器、EMD Millipore Express SHCXL150過濾器、EMD Millipore Millipak Gamma Gold 0.22 µm過濾器(雙重串聯滅菌級過濾器)、Pall Supor EKV，0.2 µm滅菌級過濾器、Asahi Planova 35N、Asahi Planova 20N、Asahi Planova 75N、Asahi Planova BioEx、Millipore Viresolve NFR或Sartorius Sartopore 2XLG，0.8/0.2 µm。
在某些實施例中，可在澄清、純化及/或滅菌期間使用一或多個微過濾步驟。微過濾利用孔徑通常在0.1 µm與10 µm之間的微過濾膜。微過濾一般用於微粒之大體澄清、滅菌及移除。在某些實施例中，微過濾用於移除病毒粒子之聚集凝塊。在某些實施例中，本發明之生產方法或系統包含至少一個微過濾步驟。一或多個微過濾步驟可包含具有深層過濾系統之深層過濾步驟，該深層過濾系統諸如EMD Millipore Millistak+ POD過濾器(D0HC培養基系列)、Millipore MC0SP23CL3過濾器(C0SP培養基系列)或Sartorius Sartopore過濾器系列。本發明之微過濾系統可用熟習此項技術者已知之調配物，其包含本發明之AAV醫藥、加工及儲存調配物預沖洗、填充、平衡、沖洗、加工、溶離、洗滌或清潔。在某些實施例中，澄清包含使用C0SP培養基系列過濾器。在一些實施例中，C0SP培養基系列過濾器可有效減少或防止0.2微米過濾器堵塞。
在某些實施例中，可在澄清及純化期間使用一或多個超過濾步驟。超過濾步驟可用於對本發明之加工及/或調配溶液進行濃縮、調配、脫鹽或脫水。超過濾利用孔徑通常在0.001與0.1 µm之間的超過濾膜。超過濾膜亦可由其分子量截斷(MWCO)定義且可在1 kD至500 kD範圍內。超過濾一般用於濃縮及調配溶解之生物分子，諸如蛋白質、肽、質體、病毒粒子、核酸及碳水化合物。本發明之超過濾系統可用熟習此項技術者已知之調配物，其包含本發明之AAV醫藥、加工及儲存調配物預沖洗、填充、平衡、沖洗、加工、溶離、洗滌或清潔。
在某些實施例中，可在澄清及純化期間使用一或多個奈米過濾步驟。奈米過濾利用孔徑通常小於100 nm之奈米過濾膜。奈米過濾一般用於移除非所需內源病毒雜質(例如桿狀病毒)。在某些實施例中，奈米過濾可包含病毒移除過濾(VRF)。VRF過濾器之過濾尺寸可通常在15 nm與100 nm之間。VRF過濾器之實例包含但不限於：Planova 15N、Planova 20N及Planova 35N (Asahi-Kasei Corp，Tokyo，Japan)；及Viresolve NFP及Viresolve NFR (Millipore Corp，Billerica，MA，USA)。本發明之奈米過濾系統可用熟習此項技術者已知之調配物，其包含本發明之AAV醫藥、加工及儲存調配物預沖洗、填充、平衡、沖洗、加工、溶離、洗滌或清潔。在某些實施例中，奈米過濾用於移除病毒粒子之聚集凝塊。
在某些實施例中，可在澄清及純化期間使用一或多個切向流過濾(TFF) (亦稱為交叉流過濾)步驟。切向流過濾為膜過濾之一形式，其中進料流(其包含待澄清及濃縮之標靶試劑/粒子)自進料槽流至過濾模組或濾筒中。在TFF過濾模組內，進料流平行於膜表面傳遞，使得一部分物料流穿過膜(滲透物/濾液)，而其餘部分之物料流(滲餘物)經由過濾系統再循環返回且進入進料槽中。
在某些實施例中，TFF過濾模組可為平板模組(堆疊之平面卡匣)、螺旋捲繞之模組(螺旋捲繞之膜層)或中空纖維模組(膜管束)。用於本發明之TFF系統之實例包含但不限於：Spectrum mPES Hollow Fiber TFF系統(0.5 mm纖維ID，100 kDA MWCO)或Millipore Ultracel PLCTK系統伴以Pellicon-3卡匣(0.57 m2 ，30 kDA MWCO)。
可在進料流經由TFF過濾系統循環時將新緩衝材料添加至TFF進料槽。在某些實施例中，可在流動物料流經由TFF過濾系統循環時完全補充緩衝材料。在此實施例中，以與滲透物中損失之緩衝材料相等的量將緩衝材料添加至物料流，以生產恆定濃度。在某些實施例中，可在流動物料流經由過濾系統循環時減少緩衝材料。在此實施例中，將相對於滲透物中損失之緩衝材料減少量的緩衝材料添加至物料流，以生產增加之濃度。在某些實施例中，可在流動物料流經由過濾系統循環時更換緩衝材料。在此實施例中，添加至物料流之緩衝液不同於滲透物中損失之緩衝材料，以使得最終更換物料流中之緩衝材料。本發明之TFF系統可用熟習此項技術者已知之調配物，其包含本發明之AAV醫藥、加工及儲存調配物預沖洗、填充、平衡、沖洗、加工、溶離、洗滌或清潔。
在某些實施例中，TFF負載池可在過濾之前外加賦形劑或稀釋劑。在某些實施例中，TFF負載池在過濾之前外加高鹽混合物(諸如氯化鈉或氯化鉀)。在某些實施例中，TFF負載池在過濾之前外加高糖混合物(諸如50% w/v蔗糖)。
TFF處理之效果可視若干因素而定，其包含但不限於：來自流動設計之剪應力、交叉流動速率、濾液流動控制、跨膜壓力(TMP)、膜調節、膜組成(例如空心纖維構造)及設計(例如表面積)、系統流動設計、儲集器設計及混合策略。在某個實施例中，過濾膜可受到TFF前膜調節。
在某些實施例中，TFF處理可包含一或多個微過濾階段。在某些實施例中，TFF處理可包含一或多個超過濾階段。在某些實施例中，TFF處理可包含一或多個奈米過濾階段。
在某些實施例中，TFF處理可包含一或多個濃縮階段，諸如超過濾(UF)或微過濾(MF)濃縮階段。在濃縮階段中，在物料流經由過濾系統循環時更換減少量的緩衝材料(相對於滲透物損失之緩衝材料的量)。未能完全更換滲透物中損失之所有緩衝材料導致過濾物料流內之病毒粒子的濃度增加。在某些實施例中，在物料流經由過濾系統循環時更換增加量的緩衝材料。併入相對於滲透物中損失之緩衝材料之量過量的緩衝材料導致過濾物料流內之病毒粒子的濃度減小。
在某些實施例中，TFF處理可包含一或多個透濾(DF)階段。透濾階段包含更換第二緩衝材料(諸如低鹽或零鹽材料)內之第一緩衝材料(諸如高鹽材料)。在此實施例中，將不同於滲透物中損失之第一緩衝材料的第二緩衝液添加至流動物料流，以使得最終更換物料流中之緩衝材料。
在某些實施例中，TFF處理可包含連續的多個階段。在某些實施例中，TFF處理過程可包含超過濾(UF)濃縮階段繼之以透濾階段(DF)。在某些實施例中，相對於包含DF繼之以UF之TFF，包含UF繼之以DF之TFF引起rAAV回收率增加。在一些實施例中，包含UF繼之以DF之TFF引起rAAV之回收率為約70-80%。
在某些實施例中，TFF處理可包含透濾階段繼之以超過濾濃縮階段。在某些實施例中，TFF處理可包含第一透濾階段，繼之以超過濾濃縮階段，繼之以第二透濾階段。在某些實施例中，TFF處理可包含第一透濾階段，其將高鹽低糖的緩衝材料併入至流動物料流中，繼之以超過濾/濃縮階段，其生產流動物料流中之病毒材料的高濃度，繼之以第二透濾階段，其將低鹽高糖或零鹽高糖的緩衝材料併入至流動物料流中。在某些實施例中，鹽可為氯化鈉、磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀或其組合。在某些實施例中，糖可為蔗糖，諸如5% w/v蔗糖混合物或7% w/v蔗糖混合物。
在某些實施例中，一或多個TFF步驟可包含調配物透濾步驟，其中用高蔗糖調配物緩衝液更換該病毒生產池之至少一部分液體介質。在某些實施例中，高蔗糖調配物緩衝液包含6-8% w/v之間的糖或糖取代物及90-100 mM之間的鹼氯化鹽。在某些實施例中，高蔗糖調配物緩衝液包含7% w/v蔗糖及90-100 mM之間的氯化鈉。在某些實施例中，高蔗糖調配物緩衝液包含7% w/v蔗糖、10 mM磷酸鈉、95-100 mM之間的氯化鈉及0.001% (w/v)泊洛沙姆188。在某些實施例中，調配物透濾步驟為一或多個TFF步驟中之最終透濾步驟。在某些實施例中，調配物透濾步驟為一或多個TFF步驟中之唯一透濾步驟。
在某些實施例中，TFF處理可包含同時進行之多個階段。作為非限制性實例，TFF澄清過程可包含與濃縮階段同時進行之超過濾階段。
藉由過濾進行細胞溶解物澄清及純化之方法為此項技術中所充分理解，且可根據多種可用方法，包含但不限於被動過濾及流式過濾進行。所用過濾器可包含多種材料及孔徑。舉例而言，細胞溶解物過濾器可包含以下之孔徑：約1 µM至約5 µM、約0.5 µM至約2 µM、約0.1 µM至約1 µM、約0.05 µM至約0.05 µM及約0.001 µM至約0.1 µM。細胞溶解物過濾器之例示性孔徑可包含但不限於2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.95、0.9、0.85、0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0.22、0.21、0.20、0.19、0.18、0.17、0.16、0.15、0.14、0.13、0.12、0.11、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.02、0.019、0.018、0.017、0.016、0.015、0.014、0.013、0.012、0.011、0.01、0.009、0.008、0.007、0.006、0.005、0.004、0.003、0.002、0.001及0.001 µM。在某些實施例中，澄清可包含經由孔徑為2.0 µM之過濾器進行過濾以移除大碎屑，接著穿過孔徑為0.45 µM之過濾器以移除完整細胞。
過濾器材料可由多種材料構成。此類材料可包含但不限於聚合材料及金屬材料(例如燒結金屬及多孔鋁)。例示性材料可包含但不限於耐綸、纖維素材料(例如乙酸纖維素)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚碸、聚醯胺、聚碸、聚丙烯及聚對苯二甲酸伸乙酯。在某些實施例中，適用於澄清細胞溶解物之過濾器可包含但不限於ULTIPLEAT PROFILE™過濾器(Pall Corporation，Port Washington，NY)、SUPOR™膜過濾器(Pall Corporation，Port Washington，NY)。
在某些實施例中，可進行流式過濾以提高過濾速度及/或效果。在某些實施例中，流式過濾可包含真空過濾。根據此類方法，在與待過濾之細胞溶解物之側部相對的過濾器側部上產生真空。在某些實施例中，細胞溶解物可藉由離心力穿過過濾器。在某些實施例中，使用泵迫使細胞溶解物穿過澄清過濾器。細胞溶解物穿過一或多個過濾器之流動速率可藉由調整通道尺寸及/或流體壓力中之一者來調節。 澄清及純化：層析
在某些實施例中，調配物中之AAV粒子可經由使用一或多種不同層析方法之一或多個層析步驟自細胞溶解物澄清及純化。層析係指用於自混合物選擇性分離出一或多種要素的此項技術中已知之任何數目的方法。此類方法可包含但不限於離子交換層析(例如陽離子交換層析及陰離子交換層析)、親和層析(例如免疫親和層析、金屬親和層析、假親和層析，諸如Blue Sepharose樹脂)、疏水相互作用層析(HIC)、尺寸排阻層析及多元層析(MMC) (利用固定相與分析物之間的超過一種相互作用形式之層析方法)。在某些實施例中，病毒層析之方法或系統可包含以下中所教示之彼等中之任一者：美國專利第5,756,283號、第6,258,595號、第6,261,551號、第6,270,996號、第6,281,010號、第6,365,394號、第6,475,769號、第6,482,634號、第6,485,966號、第6,943,019號、第6,953,690號、第7,022,519號、第7,238,526號、第7,291,498號及第7,491,508號或國際公開案第WO1996039530號、第WO1998010088號、第WO1999014354號、第WO1999015685號、第WO1999047691號、第WO2000055342號、第WO2000075353號及第WO2001023597號，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
本發明之層析系統可用熟習此項技術者已知之調配物，其包含本發明之AAV醫藥、加工及儲存調配物預沖洗、填充、平衡、沖洗、加工、溶離、洗滌或清潔。
在某些實施例中，一或多個離子交換(IEX)層析步驟可用於分離病毒粒子。離子交換步驟可包含陰離子交換(AEX)層析、陽離子交換(CEX)層析或其組合。在某些實施例中，離子交換層析係以結合/溶離模式使用。可藉由基於病毒粒子之衣殼蛋白(或其他帶電組分)與固定相上存在之帶電位點之間的電荷-電荷相互作用將病毒粒子結合至固定相來使用結合/溶離IEX。此方法可包含使用管柱，病毒製劑(例如澄清之溶解物)穿過該管柱。在向帶電固定相(例如管柱)施加病毒製劑之後，結合之病毒粒子可接著藉由施加溶離溶液以破壞電荷-電荷相互作用而自固定相溶離。溶離溶液可藉由調整鹽濃度及/或pH值最佳化以促進經結合之病毒粒子的回收。在某些實施例中，溶離溶液可包含核酸酶，諸如Benzonase核酸酶。視所分離之病毒衣殼之電荷而定，可選擇陽離子或陰離子交換層析方法。在某些實施例中，離子交換層析以穿流模式使用。可藉由將非病毒雜質或非所需病毒粒子結合至固定相(基於電荷-電荷相互作用)及允許病毒製劑中之標靶病毒粒子「穿流」IEX系統進入收集池來使用穿流IEX。
離子交換層析之方法或系統可包含但不限於美國專利第7,419,817號、第6,143,548號、第7,094,604號、第6,593,123號、第7,015,026號及第8,137,948號中所教示之彼等中之任一者，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，IEX方法使用AEX層析系統，諸如Sartorius Sartobind Q膜、Sartorius Sartobind STIC膜、Millipore Fractogel TMAE HiCap(m) Flow-Through膜、GE Q Sepharose HP膜、Poros XQ及Porox HQ。在某些實施例中，IEX方法使用CEX系統，諸如Poros XS膜。在某些實施例中，AEX系統包含固定相，其包含三甲基銨基甲基(TMAE)官能基。在某些實施例中，IEX方法使用多元層析(MMC)系統，諸如Nuvia aPrime 4A膜。
在某些實施例中，一或多個親和層析步驟，諸如免疫親和層析可用於分離病毒粒子。免疫親和層析係利用一或多種免疫化合物(例如抗體或抗體相關結構)以保留病毒粒子之層析形式。免疫化合物可特異性地結合於病毒粒子表面上之一或多種結構，包含但不限於一或多種病毒鞘蛋白。在某些實施例中，免疫化合物可對特定病毒變異體具有特異性。在某些實施例中，免疫化合物可與多種病毒變異體結合。在某些實施例中，免疫化合物可包含重組單鏈抗體。此類重組單鏈抗體可包含Smith, R.H.等人, 2009. Mol. Ther. 17(11):1888-96中所描述之彼等抗體，其內容以全文引用之方式併入本文中。此類免疫化合物(例如重組蛋白配位體)能夠與數種AAV衣殼變異體結合，其包含但不限於AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6及/或AAV8或本文中所教示之彼等中之任一者。在一些實施例中，此類免疫化合物(例如重組蛋白配位體)能夠與至少AAV2結合。在某些實施例中，AFC方法使用GE AVB Sepharose HP管柱樹脂、Poros CaptureSelect AAV8樹脂(ThermoFisher)、Poros CaptureSelect AAV9樹脂(ThermoFisher)及Poros CaptureSelect AAVX樹脂(ThermoFisher)。
在某些實施例中，一或多個親和層析步驟先於一或多個陰離子交換層析步驟。在某些實施例中，一或多個陰離子交換層析步驟先於一或多個親和層析步驟。
在某些實施例中，一或多個尺寸排阻層析(SEC)步驟可用於分離病毒粒子。SEC可包含使用凝膠以根據尺寸分離粒子。在病毒粒子純化中，SEC過濾有時稱作「拋光」。在某些實施例中，可進行SEC以生產幾乎均質之最終產物。此類最終產物可在某些實施例中用於臨床前研究及/或臨床研究(Kotin, R.M. 2011. Human Molecular Genetics. 20(1):R2-R6，其內容以全文引用之方式併入本文中)。在某些實施例中，SEC可根據美國專利第6,143,548號、第7,015,026號、第8,476,418號、第6,410,300號、第8,476,418號、第7,419,817號、第7,094,604號、第6,593,123號及第8,137,948號中所教示之方法中之任一者進行，其內容各自以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，重組AAV之純化生產之總rAAV加工產率為30-50%。 III.組合物及調配物  綜述
基因療法藥品(諸如rAAV粒子)由於其有限液態穩定性及在低濃度下大規模聚集之高傾向而對於併入至組合物及調配物中具挑戰性。基因療法藥品通常直接遞送至治療區域(包含CNS組織)；其需要賦形劑及調配物參數與組織功能、微環境及體積限制相容。
根據本發明，AAV粒子可如醫藥組合物製備或包含於其中。應理解，此類組合物必然包含一或多種活性成分，及最常包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
視所治療之個體的屬性、尺寸及/或條件而定，且進一步視用以投與組合物之途徑而定，根據本發明之醫藥組合物中的活性成分(例如AAV粒子)、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分的相對量可變化。舉例而言，組合物可包含0.1%與99% (w/w)之間的活性成分。藉助於實例，組合物可包含0.1%與100%之間、例如0.5與50%之間、1-30%之間、5-80%之間或至少80% (w/w)的活性成分。
在某些實施例中，本文中所描述之AAV粒子醫藥組合物可包含至少一種本發明之有效負載。作為非限制性實例，醫藥組合物可含有具有1、2、3、4或5種有效負載之AAV粒子。
儘管描述本文所提供之醫藥組合物主要針對適用於向人類投與之醫藥組合物，但熟習此項技術者應理解，此類組合物一般適用於向任何其他動物投與，例如向非人類動物，例如非人類哺乳動物投與。應充分理解，為使組合物適用於向各種動物投與，對適用於向人類投與之醫藥組合物進行修改，且一般熟練的獸醫藥理學家可僅用一般實驗(若存在)設計及/或進行此類修改。預期投與醫藥組合物之個體包含但不限於人類及/或其他靈長類動物；哺乳動物，包含商業相關之哺乳動物，諸如牛、豬、馬、羊、貓、狗、小鼠、大鼠、鳥類，包含商業相關之鳥類，諸如家禽、雞、鴨、鵝及/或火雞。
在某些實施例中，向人類、人類患者或個體投與組合物。
本發明之調配物可包含但不限於生理鹽水、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、肽、蛋白質、經AAV粒子轉染之細胞(例如用於轉移或移植至個體中)及其組合。
本文所描述之醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後開發之任何方法來製備。如本文所用，術語「醫藥組合物」係指包含至少一種活性成分及視情況選用之一或多種醫藥學上可接受之賦形劑之組合物。
一般而言，此類製備方法包含使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分締合之步驟。如本文所用，片語「活性成分」一般係指本發明之攜有編碼聚核苷酸或多肽之有效負載區域的AAV粒子或由如本文所描述之AAV粒子之病毒基因體編碼的最終產物。
在某些實施例中，調配物可包含至少一種非活性成分。如本文所用，術語「非活性成分」係指包含於調配物中之一或多種非活性試劑。在某些實施例中，可用於本發明之調配物的非活性成分中之全部、無一者或一些可經美國食品及藥物管理局(FDA)批准。
本文所描述之AAV粒子及醫藥組合物的調配物可藉由藥理學技術中已知或此後開發之任何方法來製備。一般而言，此類製備方法包含以下步驟：使活性成分與賦形劑及/或一或多種其他附屬成分締合，且隨後在必要及/或需要時，將產物分割、成型及/或封裝成所需單劑量或多劑量單元。
根據本發明之醫藥組合物可以批量、以單個單位劑量形式及/或以複數個單個單位劑量形式製備、封裝及/或出售。如本文所用，「單位劑量」係指包含預定量之活性成分之醫藥組合物之離散量。活性成分之量一般等於將向個體投與之活性成分之劑量及/或此類劑量之適宜分數，諸如此類劑量之一半或三分之一。
在某些實施例中，本發明之調配物為水性調配物(亦即包含水之調配物)。在某些實施例中，本發明之調配物包含水、經消毒之水或注射用水(WFI)。
在某些實施例中，本發明之AAV粒子可在pH為約7.0下在具有0.001%-0.1% (w/v)泊洛沙姆188 (例如普洛尼克F-68)的PBS中調配。
在某些實施例中，本文所描述之AAV調配物可含有足以表現至少一個所表現之功能性有效負載的AAV粒子。作為非限制性實例，AAV粒子可含有編碼1、2、3、4或5個功能性有效負載之病毒基因體。
根據本發明，AAV粒子可經調配用於CNS遞送。可使用穿過腦血障之試劑。舉例而言，可將分子靶向腦血障內皮之一些細胞穿透肽可用於調配物(例如Mathupala,Expert Opin Ther Pat ., 2009, 19, 137-140；其內容以全文引用之方式併入本文中)。
在某些實施例中，本文所描述之AAV調配物可包含緩衝系統，其包含磷酸鹽、Tris及/或組胺酸。磷酸鹽、Tris及/或組胺酸之緩衝劑可在2-12 mM範圍內獨立地用於調配物中。
本發明之調配物可用於生產、加工、製備、儲存、擴增或投與本發明之AAV粒子及病毒載體的任何步驟中。在某些實施例中，醫藥調配物及組分可用於本發明之AAV生產、AAV加工、AAV澄清、AAV純化及AAV精整系統中，該等系統均可用熟習此項技術者已知之調配物，其包含本發明之AAV醫藥、加工及儲存調配物預沖洗、填充、平衡、沖洗、加工、溶離、洗滌或清潔。 賦形劑及稀釋劑
本發明之AAV粒子可調配成包含一或多種賦形劑或稀釋劑的醫藥組合物，以(1)增加穩定性；(2)增加細胞轉染或轉導；(3)允許有效負載持續或延遲釋放；(4)改變生物分佈(例如使病毒粒子靶向特定組織或細胞類型)；(5)增加所編碼蛋白質之轉譯；(6)改變所編碼蛋白質之釋放曲線；及/或(7)實現本發明之有效負載的可調節表現。
視所治療之個體的屬性、尺寸及/或條件而定，且進一步視用以投與組合物之途徑而定，根據本發明之醫藥組合物中的活性成分(例如AAV粒子)、醫藥學上可接受之賦形劑及/或任何額外成分的相對量可變化。在某些實施例中，組合物可包含0.001%與99% (w/w)之間的活性成分。舉例而言，組合物可包含0.001%與100%之間，例如0.5與50%之間、1-30%之間、5-80%之間或至少80% (w/w)的活性成分。在某些實施例中，組合物可包含0.001%與99% (w/w)之間的賦形劑及稀釋劑。舉例而言，組合物可包含0.001%與100%之間，例如0.5與50%之間、1-30%之間、5-80%之間或至少80% (w/w)的賦形劑及稀釋劑。
在某些實施例中，醫藥學上可接受之賦形劑可為至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%純度。在某些實施例中，賦形劑經批准用於人類及用於獸醫學用途。在某些實施例中，賦形劑可經美國食品及藥物管理局(United States Food and Drug Administration)批准。在某些實施例中，賦形劑可為醫藥級。在某些實施例中，賦形劑可滿足美國藥典(USP)、歐洲藥典(EP)、英國藥典及/或國際藥典之標準。
如本文所用，賦形劑包含但不限於適合於所需特定劑型之任何及全部溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、界面活性劑、等張劑、增稠或乳化劑、防腐劑及其類似物。用於調配醫藥組合物之各種賦形劑及用於製備該組合物之技術為此項技術中已知的(參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第21版, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006；以全文引用之方式併入本文中)。除非任何習知賦形劑介質可與物質或其衍生物不相容，諸如生產任何非所需生物學作用或以有害的方式與醫藥組合物的任何其他組分另外相互作用，否則習知賦形劑介質之用途可涵蓋於本發明之範疇內。
可包含於本發明之調配物中之例示性賦形劑及稀釋劑包含但不限於碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鈣、磷酸二鈣、硫酸鈣、磷酸氫鈣、磷酸鈉乳糖、蔗糖、纖維素、微晶纖維素、高嶺土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化鈉、乾燥澱粉、玉米澱粉、粉糖等，及/或其組合。
可包含於本發明之調配物中的例示性賦形劑及稀釋劑包含但不限於1,2,6-已三醇；1,2-二肉豆蔻醯基-Sn-甘油-3-(磷酸基-S-(1-甘油基))；1,2-二肉豆蔻醯基-Sn-甘油-3-磷酸膽鹼；1,2-二油醯基-Sn-甘油-3-磷酸膽鹼；1,2-二棕櫚醯基-Sn-甘油-3-(磷酸基-Rac-(1-甘油基))；1,2-二硬脂醯基-Sn-甘油-3-(磷酸基-Rac-(1-甘油基))；1,2-二硬脂醯基-Sn-甘油-3-磷酸膽鹼；1-O-甲苯基二胍；2-乙基-1,6-己二醇；乙酸；冰乙酸；乙酸酐；丙酮；丙酮亞硫酸氫鈉；乙醯化羊毛脂乙醇；乙醯化單甘油酸酯；乙醯半胱胺酸；DL-乙醯色胺酸；丙烯酸酯共聚物；丙烯酸-丙烯酸異辛酯共聚物；丙烯酸黏著劑788；活性木炭；Adcote 72A103；黏著帶；己二酸；Aerotex樹脂3730；丙胺酸；聚集白蛋白；膠態白蛋白；人類白蛋白；乙醇；脫水乙醇；變性乙醇；稀釋乙醇；Alfadex；褐藻酸；烷基銨磺酸甜菜鹼；烷基芳基磺酸鈉；尿囊素；烯丙基.α.-紫羅蘭酮；杏仁油；α-松香醇；α-生育酚；Dl-α-生育酚乙酸酯；Dl-α-生育酚；乙酸鋁；氯羥尿囊素鋁；氫氧化鋁；含水氫氧化鋁-蔗糖；氫氧化鋁凝膠；氫氧化鋁凝膠F 500；氫氧化鋁凝膠F 5000；單硬脂酸鋁；氧化鋁；鋁聚酯；矽酸鋁；澱粉辛烯基丁二酸鋁；硬脂酸鋁；次乙酸鋁；無水硫酸鋁；愛美高(Amerchol) C；愛美高-Cab；胺甲基丙醇；氨；氨溶液；強氨溶液；乙酸銨；氫氧化銨；月桂基硫酸銨；壬苯醇醚-4硫酸銨；C-12-C-15線性一級醇乙氧基化物之銨鹽；硫酸銨；Ammonyx；兩性化合物(Amphoteric)-2；兩性化合物-9；大茴香腦；無水檸檬酸；無水右旋糖；無水乳糖；無水檸檬酸三鈉；洋茴香油；Anoxid Sbn；消泡劑；安替比林(Antipyrine)；阿帕氟烷(Apaflurane)；杏仁油Peg-6酯；Aquaphor；精胺酸；Arlacel；抗壞血酸；抗壞血酸棕櫚酸酯；天冬胺酸；秘魯香脂(Balsam Peru)；硫酸鋇；蜂蠟；合成蜂蠟；山崳醇聚醚-10；膨潤土；苯紮氯銨；苯磺酸；苄索氯銨；十二烷基二甲基苯甲基溴化銨；苯甲酸；苯甲醇；苯甲酸苯甲酯；苯甲基氯化物；倍他環糊精；雙巴西肽(Bibapcitide)；次沒食子酸鉍；硼酸；溴克利那(Brocrinat)；丁烷；丁醇；乙烯基甲醚/順丁烯二酸酐共聚物之丁酯(125000 Mw)；硬脂酸丁酯；丁基化羥基大茴香醚；丁基化羥基甲苯；丁二醇；對羥基苯甲酸丁酯；丁酸；C20-40 Pareth-24；咖啡鹼；鈣；碳酸鈣；氯化鈣；葡庚糖酸鈣；氫氧化鈣；乳酸鈣；考布曲鈣(Calcobutrol)；卡地醯胺鈉；鈣塞酸三鈉；卡特利多鈣(Calteridol Calcium)；加拿大香脂；辛酸/癸酸三甘油酯；辛酸/癸酸/硬脂酸三甘油酯；Captan；Captisol；焦糖(Caramel)；卡波姆(Carbomer) 1342；卡波姆1382；卡波姆934；卡波姆934p；卡波姆940；卡波姆941；卡波姆980；卡波姆981；卡波姆均聚物B型(烯丙基季戊四醇交聯)；卡波姆均聚物C型(烯丙基季戊四醇交聯)；二氧化碳；羧基乙烯基共聚物；羧甲基纖維素；羧甲基纖維素鈉；羧基聚亞甲基；角叉菜膠；角叉菜膠鹽；蓖麻油；柏葉油；纖維素；微晶纖維素；Cerasynt-Se；賽洛辛(Ceresin)；Ceteareth-12；Ceteareth-15；Ceteareth-30；十六醇十八醇/Ceteareth-20；乙基己酸鯨蠟硬脂酯；鯨蠟醇聚醚(Ceteth)-10；鯨蠟醇聚醚-2；鯨蠟醇聚醚-20；鯨蠟醇聚醚-23；鯨蠟硬脂醇；氯化鯨蠟基三甲基銨、鯨蠟醇、鯨蠟酯蠟；棕櫚酸鯨蠟酯；氯化鯨蠟基吡錠；氯丁醇；氯丁醇半水合物；無水氯丁醇；氯甲酚；氯二甲酚；膽固醇；膽固醇聚醚；膽固醇聚醚-24；檸檬酸酯；檸檬酸；單水合檸檬酸；含水檸檬酸；椰油醯胺醚硫酸酯；椰油胺氧化物；可可甜菜鹼；可可二乙醇醯胺；可可單乙醇醯胺；可可豆油；可可-甘油酯；椰子油；氫化椰子油；氫化椰子油/棕櫚仁油甘油酯；椰油醯基癸醯基癸酸酯；Cola Nitida種子提取物；膠原蛋白；著色懸浮液；玉米油；棉籽油；乳膏基劑；肌酸；肌酐；甲酚；交聯羧甲纖維素鈉；交聯聚維酮；硫酸銅；無水硫酸銅；環甲聚矽氧烷；環甲聚矽氧烷/二甲聚矽氧烷共聚醇；半胱胺酸；半胱胺酸鹽酸鹽；無水半胱胺酸鹽酸鹽；Dl-半胱胺酸；D&C Red第28號；D&C Red第33號；D&C Red第36號；D&C Red第39號；D&C Yellow第10號；達方吡啶(Dalfampridine)；Daubert 1-5 Pestr (Matte) 164z；癸基甲基亞碸；Dehydag Wax Sx；去氫乙酸；Dehymuls E；地那銨苯甲酸鹽；脫氧膽酸；右旋糖苷；右旋糖苷40；糊精；右旋糖；右旋糖單水合物；右旋糖溶液；泛影酸；重氮利定脲；二氯苯甲基乙醇；二氯二氟甲烷；二氯四氟乙烷；二乙醇胺；焦碳酸二乙酯；癸二酸二乙酯；二乙二醇單乙醚；鄰苯二甲酸二乙基己酯；胺基乙酸二羥基鋁；二異丙醇胺；己二酸二異丙酯；二亞麻油酸二異丙酯；二甲聚矽氧烷350；二甲聚矽氧烷共聚醇；二甲聚矽氧烷Mdx4-4210；二甲聚矽氧烷醫用流體360；二甲基異山梨醇；二甲亞碸；甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-甲基丙烯酸丁酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物；二甲基二(十八烷基)銨膨潤土；二甲基矽氧烷/甲基乙烯基矽氧烷共聚物；Dinoseb銨鹽；Dl-二棕櫚醯基磷脂醯甘油；二丙二醇；椰油兩性二乙酸二鈉；月桂醇醚磺基丁二酸二鈉；月桂基磺基丁二酸二鈉；磺基水楊酸二鈉；地索苯寧(Disofenin)；二乙烯苯苯乙烯共聚物；Dmdm乙內醯脲；二十二烷醇；多庫酯鈉；Duro-Tak 280-2516；Duro-Tak 387-2516；Duro-Tak 80-1196；Duro-Tak 87-2070；Duro-Tak 87-2194；Duro-Tak 87-2287；Duro-Tak 87-2296；Duro-Tak 87-2888；Duro-Tak 87-2979；乙二胺四乙酸鈣二鈉；乙二胺四乙酸二鈉；無水乙二胺四乙酸二鈉；乙二胺四乙酸鈉；乙二胺四乙酸；蛋磷脂；恩磺酸；恩磺酸鈉；表半乳糖；表四環素鹽酸鹽；Essence Bouquet 9200；乙醇胺鹽酸鹽；乙酸乙酯；油酸乙酯；乙基纖維素；乙二醇；乙烯乙酸乙烯酯共聚物；乙二胺；乙二胺二鹽酸鹽；乙烯-丙烯共聚物；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(28%乙酸乙烯酯)；乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(9%乙酸乙烯酯)；羥基硬脂酸乙基己酯；對羥基苯甲酸乙酯；桉油醇；依沙美肟(Exametazime)；可食用脂肪；硬脂肪；脂肪酸酯；脂肪酸季戊四醇酯；脂肪酸；脂肪醇檸檬酸鹽；脂肪醇；Fd&C Blue第1號；Fd&C Green第3號；Fd&C Red第4號；Fd&C Red第40號；Fd&C Yellow第10號(退市)；Fd&C Yellow第5號；Fd&C Yellow第6號；氯化鐵；氧化鐵；調味劑89-186；調味劑89-259；調味劑Df-119；調味劑Df-1530；增香劑；調味劑Fig 827118；調味劑Raspberry Pfc-8407；調味劑Rhodia Pharmaceutical第Rf 451號；氟氯烴；甲醛；甲醛溶液；經分餾之椰子油；芳香劑3949-5；芳香劑520a；芳香劑6.007；芳香劑91-122；芳香劑9128-Y；芳香劑93498g；芳香劑Balsam Pine No. 5124；芳香劑Bouquet 10328；芳香劑Chemoderm 6401-B；芳香劑Chemoderm 6411；芳香劑Cream No. 73457；芳香劑Cs-28197；芳香劑Felton 066m；芳香劑Firmenich 47373；芳香劑Givaudan Ess 9090/1c；芳香劑H-6540；芳香劑Herbal 10396；芳香劑Nj-1085；芳香劑P O Fl-147；芳香劑Pa 52805；芳香劑Pera Derm D；芳香劑Rbd-9819；芳香劑Shaw Mudge U-7776；芳香劑Tf 044078；芳香劑Ungerer Honeysuckle K 2771；芳香劑Ungerer N5195；果糖；氧化釓；半乳糖；γ環糊精；明膠；交聯明膠；明膠海綿；結蘭膠(Gellan Gum) (低醯基)；Gelva 737；龍膽酸；龍膽酸乙醇醯胺；葡庚糖酸鈉；葡庚糖酸鈉二水合物；葡萄糖酸內酯；葡糖醛；Dl-麩胺酸；麩胱甘肽；甘油；氫化松香之甘油酯；檸檬酸甘油酯；異硬脂酸甘油酯；月桂酸甘油酯；單硬脂酸甘油酯；油酸甘油酯；油酸甘油酯/丙二醇；棕櫚酸甘油酯；蓖麻油酸甘油酯；硬脂酸甘油酯；硬脂酸甘油酯-月桂醇醚-23；硬脂酸甘油酯/Peg硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯/Peg-100硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯/Peg-40硬脂酸酯；硬脂酸甘油酯-硬脂醯胺基乙基二乙胺；三油酸甘油酯；甘胺酸；甘胺酸鹽酸鹽；二元醇二硬脂酸酯；二元醇硬脂酸酯；鹽酸胍；瓜爾豆膠；毛髮調節劑(18n195-1m)；庚烷；羥乙基澱粉；己二醇；高密度聚乙烯；組胺酸；微球人類白蛋白；玻尿酸鈉；烴；塑化烴凝膠；鹽酸；稀釋鹽酸；氫皮質酮；水凝膠聚合物；過氧化氫；氫化蓖麻油；氫化棕櫚油；氫化棕櫚/棕櫚仁油Peg-6酯；氫化聚丁烯635-690；氫氧根離子；羥乙基纖維素；羥乙基哌嗪乙磺酸；羥甲基纖維素；羥基硬脂酸羥基二十八烷基酯；羥丙基纖維素；羥丙基甲基纖維素2906；羥丙基-β-環糊精；羥丙甲纖維素2208 (15000 Mpa.S)；羥丙甲纖維素2910 (15000 Mpa.S)；羥丙甲纖維素；咪唑啶基脲；碘；碘沙酸；碘非他胺鹽酸鹽；角叉菜提取物；異丁烷；異鯨蠟醇聚醚-20；異白胺酸；丙烯酸異辛酯；異丙醇；異硬脂酸異丙酯；肉豆蔻酸異丙酯；肉豆蔻酸異丙酯-肉豆寇醇；棕櫚酸異丙酯；硬脂酸異丙酯；異硬脂酸；異硬脂醇；等張氯化鈉溶液；Jelene；高嶺土；Kathon Cg；Kathon Cg II；乳酸鹽；乳酸；Dl-乳酸；L-乳酸；乳糖酸；乳糖；單水合乳糖；含水乳糖；羊毛脂醇聚醚；羊毛脂；羊毛脂醇-礦物油；羊毛脂醇；無水羊毛脂；羊毛脂膽固醇；羊毛脂非離子衍生物；乙氧基化羊毛脂；氫化羊毛脂；勞拉氯銨；月桂基胺氧化物；月桂基二甲基銨水解之動物膠原蛋白；月桂醇醚硫酸酯；月桂醇醚-2；月桂醇醚-23；月桂醇醚-4；月桂酸二乙醇醯胺；月桂酸肉豆蔻酸二乙醇醯胺；月桂醯基肌胺酸；乳酸月桂酯；硫酸月桂酯；薰衣草花頂部；卵磷脂；未經漂白之卵磷脂；卵磷脂(Lecithin, Egg)；氫化卵磷脂；氫化大豆卵磷脂；大豆卵磷脂；檸檬油；白胺酸；乙醯丙酸；利多苯寧(Lidofenin)；輕質礦物油；輕質礦物油(85 Ssu)；檸檬烯，(+/-)；Lipocol Sc-15；離胺酸；離胺酸乙酸酯；離胺酸單水合物；矽酸鎂鋁；水合矽酸鎂鋁；氯化鎂；硝酸鎂；硬脂酸鎂；順丁烯二酸；甘露糖醇；磺化脂肪醇；甲溴菲寧(Mebrofenin)；經改質之醫用黏著劑S-15；Medical Antiform A-F乳液；亞甲基二膦酸二鈉；亞甲基二膦酸；葡甲胺(Meglumine)；薄荷醇；間甲酚；偏磷酸；甲磺酸；甲硫胺酸；甲醇；甲基葡糖醇聚醚-10；甲基葡糖醇聚醚-20；甲基葡糖醇聚醚-20倍半硬脂酸酯；甲基葡萄糖倍半硬脂酸酯；月桂酸甲酯；甲基吡咯啶酮；水楊酸甲酯；硬脂酸甲酯；甲基硼酸；甲基纖維素(4000 Mpa.S)；甲基纖維素；甲基氯異噻唑啉酮；亞甲基藍；甲基異噻唑啉酮；對羥基苯甲酸甲酯；微晶蠟；礦物油；單甘油酯及二甘油酯；檸檬酸單硬脂基酯；單硫代甘油；多固醇提取物；肉豆寇醇；乳酸肉豆蔻酯；肉豆蔻基-.γ.-甲吡錠氯化物；N-(胺甲醯基-甲氧基Peg-40)-1,2-二硬脂醯基-腦磷脂鈉；N,N-二甲基乙醯胺；菸鹼醯胺；環己二酮二肟；硝酸；氮；壬苯醇醚碘；壬苯醇醚-15；壬苯醇醚-9；諾氟烷；燕麥片；十八烯-1/順丁烯二酸共聚物；辛酸；奧替柳酯(Octisalate)；辛苯聚醇-1；辛苯聚醇-40；辛苯聚醇-9；辛基十二醇；辛基苯酚聚亞甲基；油酸；油醇醚-10/油醇醚-5；油醇醚-2；油醇醚-20；油醇；油醇油酸酯；橄欖油；羥亞甲基二膦酸二鈉；氧基喹啉；棕櫚仁油；棕櫚胺氧化物；對羥苯甲酸酯；石蠟；白色軟石蠟；Parfum Creme 45/3；花生油；精煉花生油；果膠；Peg 6-32硬脂酸酯/乙二醇硬脂酸酯；Peg植物油；Peg-100硬脂酸酯；Peg-12月桂酸甘油酯；Peg-120硬脂酸甘油酯；Peg-120甲基葡萄糖二油酸酯；Peg-15椰油胺；Peg-150二硬脂酸酯；Peg-2硬脂酸酯；Peg-20脫水山梨糖醇異硬脂酸酯；Peg-22甲基醚/十二烷基乙二醇共聚物；Peg-25丙二醇硬脂酸酯；Peg-4二月桂酸酯；Peg-4月桂酸酯；Peg-40蓖麻油；Peg-40脫水山梨糖醇二異硬脂酸酯；Peg-45/十二烷基乙二醇共聚物；Peg-5油酸酯；Peg-50硬脂酸酯；Peg-54氫化蓖麻油；Peg-6異硬脂酸酯；Peg-60蓖麻油；Peg-60氫化蓖麻油；Peg-7甲基醚；Peg-75羊毛脂；Peg-8月桂酸酯；Peg-8硬脂酸酯；Pegoxol 7硬脂酸酯；十五內酯；季戊四醇椰油酸酯；噴替酸五鈉；噴替酸鈣三鈉；噴替酸；薄荷油；全氟丙烷；香料25677；香料Bouquet；香料E-1991；香料Gd 5604；香料Tana 90/42 Scba；香料W-1952-1；凡士林；白色凡士林；石油餾出物；苯酚；液化苯酚；Phenonip；苯氧基乙醇；苯丙胺酸；苯乙醇；乙酸苯汞；硝酸苯汞；卵磷脂醯基甘油；磷脂；卵磷脂；Phospholipon 90g；磷酸；松針油(歐洲赤松(Pinus Sylvestris))；哌嗪六水合物；Plastibase-50w；泊拉可林(Polacrilin)；泊利氯銨；泊洛沙姆124；泊洛沙姆181；泊洛沙姆182；泊洛沙姆188；泊洛沙姆237；泊洛沙姆407；聚(雙(對羧基苯氧基)丙烷酸酐):癸二酸；聚(二甲基矽氧烷/甲基乙烯基矽氧烷/甲基氫矽氧烷)二甲基乙烯基或二甲基羥基或三甲基封端；聚(Dl-乳酸-共-乙醇酸)、(50:50；聚(Dl-乳酸-共-乙醇酸)、封端之乙酯、(50:50；聚丙烯酸(250000 Mw)；聚丁烯(1400 Mw)；聚卡波非(Polycarbophil)；聚酯；聚酯多元胺共聚物；聚酯人造絲；聚乙二醇1000；聚乙二醇1450；聚乙二醇1500；聚乙二醇1540；聚乙二醇200；聚乙二醇300；聚乙二醇300-1600；聚乙二醇3350；聚乙二醇400；聚乙二醇4000；聚乙二醇540；聚乙二醇600；聚乙二醇6000；聚乙二醇8000；聚乙二醇900；含有黑色氧化鐵(＜1%)之高密度聚乙烯；含有硫酸鋇(20-24%)之低密度聚乙烯；聚乙烯T；聚對苯二甲酸伸乙酯；聚多糖(Polyglactin)；聚甘油基-3油酸酯；聚甘油基-4油酸酯；甲基丙烯酸聚羥乙酯；聚異丁烯聚異丁烯(1100000 Mw)；聚異丁烯(35000 Mw)；聚異丁烯178-236；聚異丁烯241-294；聚異丁烯35-39；低分子量聚異丁烯；中等分子量聚異丁烯；聚異丁烯/聚丁烯黏著劑；聚乳酸交酯；多元醇；聚氧化乙烯-聚氧化丙烯1800；聚氧化乙烯醇；聚氧化乙烯脂肪酸酯；聚氧化乙烯亞丙基；聚乙二醇20十六基十八基醚；聚乙二醇35蓖麻油；聚乙二醇40氫化蓖麻油；聚乙二醇40硬脂酸酯；聚乙二醇400硬脂酸酯；聚乙二醇6與聚乙二醇32棕櫚基硬脂酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯；聚乙二醇硬脂酸甘油酯；聚乙二醇羊毛脂；聚乙二醇棕櫚酸酯；聚乙二醇硬脂酸酯；聚丙烯；聚丙二醇；聚四級銨-10；聚四級銨-7 (70/30丙烯醯胺/Dadmac；聚矽氧烷；聚山梨醇酯20；聚山梨醇酯40；聚山梨醇酯60；聚山梨醇酯65；聚山梨醇酯80；聚胺甲酸酯；聚乙酸乙烯酯；聚乙烯醇；聚氯乙烯；聚氯乙烯-聚乙酸乙烯酯共聚物；聚乙烯吡啶；罌粟子油；鉀肥；乙酸鉀；鋁鉀礬；碳酸氫鉀；亞硫酸氫鉀；氯化鉀；檸檬酸鉀；氫氧化鉀；偏亞硫酸氫鉀；磷酸氫二鉀；磷酸二氫鉀；鉀皂(Potassium Soap)；山梨酸鉀；聚維酮丙烯酸酯共聚物；聚維酮水凝膠；聚維酮K17；聚維酮K25；聚維酮K29/32；聚維酮K30；聚維酮K90；聚維酮K90f；聚維酮/Eicosene共聚物；Povidones；Ppg-12/Smdi共聚物；Ppg-15硬脂基醚；Ppg-20甲基葡萄糖醚二硬脂酸酯；Ppg-26油酸酯；Product Wat；脯胺酸；Promulgen D；Promulgen G；丙烷；推進劑A-46；沒食子酸丙酯；碳酸伸丙酯；丙二醇；丙二醇二乙酸酯；丙二醇二辛酸酯；丙二醇單月桂酸酯；丙二醇單棕櫚醯硬脂酸酯；丙二醇棕櫚基硬脂酸酯；丙二醇蓖麻油酸酯；丙二醇/重氮烷基(Diazolidinyl)；尿素/對羥基苯甲酸甲酯/對羥基苯甲酸丙酯；對羥基苯甲酸丙酯；魚精蛋白硫酸酯；蛋白質水解產物；Pvm/Ma共聚物；四級銨鹽-15；四級銨鹽-15順式-形式；四級銨鹽-52；Ra-2397；Ra-3011；糖精(Saccharin)；糖精鈉；無水糖精鈉；紅花子油；Sd Alcohol 3a；Sd Alcohol 40；Sd Alcohol 40-2；Sd Alcohol 40b；Sepineo P 600；絲胺酸；芝麻油；牛油樹油；Silastic Brand醫用級別管；Silastic醫用黏著劑，聚矽氧A型；牙科用二氧化矽；矽；二氧化矽；膠態二氧化矽；聚矽氧；聚矽氧黏著劑4102；聚矽氧4502；聚矽氧Bio-Psa Q7-4201；聚矽氧Bio-Psa Q7-4301；聚矽氧乳液；聚矽氧/聚酯膜帶材；聚二甲矽氧烷；聚二甲矽氧烷乳液；Sipon Ls 20np；蘇打灰(Soda Ash)；乙酸鈉；無水乙酸鈉；烷基硫酸鈉；抗壞血酸鈉；苯甲酸鈉；碳酸氫鈉；硫酸氫鈉；亞硫酸氫鈉；硼酸鈉；十水合硼酸鈉；碳酸鈉；十水合碳酸鈉；單水合碳酸鈉；十六基十八基硫酸鈉；氯酸鈉；氯化鈉；氯化鈉注射劑；抑菌氯化鈉注射劑；膽固醇基硫酸鈉；檸檬酸鈉；椰油醯基肌胺酸鈉；脫氧膽酸鈉；二硫磺酸鈉；十二烷基苯磺酸鈉；甲醛合次硫酸氫鈉；葡糖酸鈉；氫氧化鈉；次氯酸鈉；碘化鈉；乳酸鈉；L-乳酸鈉；月桂醇醚-2硫酸鈉；月桂醇醚-3硫酸鈉；月桂醇醚-5硫酸鈉；月桂醯基肌胺酸鈉；月桂基硫酸鈉；月桂基磺基乙酸鈉；偏亞硫酸氫鈉；硝酸鈉；磷酸鈉；二水合磷酸鈉；磷酸氫二鈉；無水磷酸氫二鈉；二水合磷酸氫二鈉；十二水合磷酸氫二鈉；七水合磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；無水磷酸二氫鈉；二水合磷酸二氫鈉；單水合磷酸二氫鈉；聚丙烯酸鈉(2500000 Mw)；焦磷酸鈉；吡咯啶酮甲酸鈉；羥基乙酸澱粉鈉；六水合丁二酸鈉；硫酸鈉；無水硫酸鈉；十水合硫酸鈉；亞硫酸鈉；磺基丁二酸鈉十一烯酸單烷醇醯胺；酒石酸鈉；硫代乙酸鈉；硫代蘋果酸鈉；硫代硫酸鈉；無水硫代硫酸鈉；三偏磷酸鈉；二甲苯磺酸鈉；索馬伊(Somay) 44；山梨酸；脫水山梨糖醇；脫水山梨糖醇異硬脂酸酯；脫水山梨糖醇單月桂酸酯；脫水山梨糖醇單油酸酯；脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯；脫水山梨糖醇單硬脂酸酯；脫水山梨糖醇倍半油酸酯；脫水山梨糖醇三油酸酯；脫水山梨糖醇三硬脂酸酯；山梨糖醇；山梨糖醇溶液；大豆粉；大豆油；綠薄荷油；鯨蠟(Spermaceti)；角鯊烷；穩定氧氯複合體；2-乙基己酸亞錫；氯化亞錫；無水氯化亞錫；氟化亞錫；酒石酸亞錫；澱粉；預膠凝澱粉1500；玉米澱粉；硬酯基二甲基苄基氯化銨(Stearalkonium Chloride)；司拉氯銨水輝石(Stearalkonium Hectorite)/碳酸伸丙酯；硬脂醯胺基乙基二乙胺；硬脂醇醚-10；硬脂醇醚-100；硬脂醇醚-2；硬脂醇醚-20；硬脂醇醚-21；硬脂醇醚-40；硬脂酸；硬脂酸二乙醇醯胺；硬脂氧基三甲基矽烷；硬脂基三甲基銨水解動物膠原蛋白；硬脂醇；無菌吸入用水；苯乙烯/異戊二烯/苯乙烯嵌段共聚物；二巰丁二酸(Succimer)；丁二酸；蔗糖素；蔗糖；蔗糖二硬脂酸酯；蔗糖聚酯；磺胺乙醯胺鈉；磺基丁醚.β.-環糊精；二氧化硫；硫酸；亞硫酸；Surfactol Qs；D-塔格糖(Tagatose)；滑石；松油(Tall Oil)；動物脂甘油酯；酒石酸；Dl-酒石酸；Tenox；Tenox-2；第三丁醇；氫過氧化第三丁基；第三丁基氫醌；四氟硼酸肆(2-甲氧基異丁基異腈)銅(I)；正矽酸四丙酯；替曲膦(Tetrofosmin)；茶鹼(Theophylline)；硫柳汞(Thimerosal)；蘇胺酸；瑞香草酚(Thymol)；錫；二氧化鈦；生育酚；托可索侖(Tocophersolan)；全營養注射劑(Total parenteral nutrition)，脂質乳液；三乙酸甘油酯；三辛酸甘油酯(Tricaprylin)；三氯單氟甲烷；十三烷醇聚醚-10；月桂基硫酸三乙醇胺；三氟乙酸；中長鏈三甘油酯；三羥基硬脂精(Trihydroxystearin)；三羊毛醇聚醚-4磷酸酯；三月桂醇聚醚-4磷酸酯；二水合檸檬酸三鈉；Hedta三鈉；曲拉通720；曲拉通X-200；三乙醇胺；曲金剛胺(Tromantadine)；緩血酸胺(TRIS)；色胺酸；泰洛沙泊(Tyloxapol)；酪胺酸；十一烯酸；Union 76 Amsco-Res 6038；尿素；纈胺酸；植物油；氫化植物油甘油酯；氫化植物油；維塞胺(Versetamide)；Viscarin；人絲(Viscose)/棉花；維生素E；乳化蠟；Wecobee Fs；白賽洛辛蠟；白蠟；三仙膠；鋅；乙酸鋅；碳酸鋅；氯化鋅；及氧化鋅。
本文所揭示之AAV粒子之醫藥調配物可包含陽離子或陰離子。在某些實施例中，調配物包含金屬陽離子，諸如但不限於Zn2+ 、Ca2+ 、Cu2+ 、Mn2+ 、Mg+ 及其組合。作為非限制性實例，調配物可包含具有金屬陽離子之聚合物及錯合物(參見例如美國專利第6,265,389號及第6,555,525號，其各自以全文引用之方式併入本文中)。
本發明之調配物亦可包含一或多種醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示之化合物之衍生物，其中親本化合物藉由將現有酸或鹼部分轉化為其鹽形式(例如藉由使游離鹼基團與適合有機酸反應)來修飾。
在某些實施例中，可用於調配醫藥組合物之額外賦形劑可包含氯化鎂(MgCl2 )、精胺酸、山梨糖醇及/或海藻糖。
除AAV粒子以外，本發明之調配物可包含至少一種賦形劑及/或稀釋劑。除AAV粒子以外，調配物可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或超過10種賦形劑及/或稀釋劑。
在某些實施例中，調配物可包含但不限於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。作為非限制性實例，PBS可包含氯化鈉、氯化鉀、磷酸二鈉、磷酸一鉀及蒸餾水。在一些情況下，PBS不含有鉀或鎂。在其他情況下，PBS含有鈣及鎂。 磷酸鈉
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為磷酸鈉。調配物可包含磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉與磷酸氫二鈉之組合。在某些實施例中，調配物中之磷酸鈉之濃度可為但不限於0.1-15 mM (或其中之任何值或範圍)。在某些實施例中，調配物可包括0-10 mM磷酸鈉。在某些實施例中，調配物可包含2-12 mM磷酸鈉。在某些實施例中，調配物可包含2-3 mM磷酸鈉。在某些實施例中，調配物可包含9-10 mM磷酸鈉。在某些實施例中，調配物可包含10-11 mM磷酸鈉。在某些實施例中，調配物可包含2.7 mM磷酸鈉。在某些實施例中，調配物可包含10 mM磷酸鈉。 磷酸鉀
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為磷酸鉀。調配物可包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀之組合。在某些實施例中，調配物中之磷酸鉀之濃度可為但不限於0.1-15 mM (或其中之任何值或範圍)。在某些實施例中，調配物可包括0-10 mM磷酸鉀。在某些實施例中，調配物可包括1-3 mM磷酸鉀。在某些實施例中，調配物可包含1-2 mM磷酸鉀。在某些實施例中，調配物可包含2-3 mM磷酸鉀。在某些實施例中，調配物可包含2-12 mM磷酸鉀。在某些實施例中，調配物可包含1.5 mM磷酸鉀。作為非限制性實例，調配物可包含1.54 mM磷酸鉀。在某些實施例中，調配物可包含2 mM磷酸鉀。 氯化鈉
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為氯化鈉。在某些實施例中，調配物中之氯化鈉之濃度可為但不限於75-220 mM (或其中之任何值或範圍)。在某些實施例中，調配物可包括80-220 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包括80-150 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包括75 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含80-220 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含83 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含92 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含95 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含98 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含100 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含107 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含109 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含118 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含125 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含127 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含133 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含142 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含150 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含155 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含180 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含192 mM氯化鈉。在某些實施例中，調配物可包含210 mM氯化鈉。 氯化鉀
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為氯化鉀。在某些實施例中，調配物中之氯化鉀之濃度可為但不限於0.1-15 mM (或其中之任何值或範圍)。在某些實施例中，調配物可包括0-10 mM氯化鉀。在某些實施例中，調配物可包括1-3 mM氯化鉀。在某些實施例中，調配物可包含1-2 mM氯化鉀。在某些實施例中，調配物可包含2-3 mM氯化鉀。在某些實施例中，調配物可包含1.5 mM氯化鉀。在某些實施例中，調配物可包含2.7 mM氯化鉀。 氯化鎂
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為氯化鎂。在某些實施例中，氯化鎂之濃度可為但不限於1-100 mM (或其中之任何值或範圍)。在某些實施例中，調配物可包括0-75 mM氯化鎂。在某些實施例中，調配物可包含0-75 mM氯化鎂。在某些實施例中，調配物可包含0-5 mM氯化鎂。在某些實施例中，調配物可包含50-100 mM氯化鎂。在某些實施例中，調配物可包含2 mM氯化鎂。在某些實施例中，調配物可包含75 mM氯化鎂。 Tris
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為Tris (亦稱為參(羥甲基)胺基甲烷、緩血酸胺或THAM)。在某些實施例中，調配物中之Tris之濃度可為但不限於0.1-15 mM。在某些實施例中，調配物可包括0-10 mM Tris。在某些實施例中，調配物可包括2-12 mM Tris。在某些實施例中，調配物可包括10 mM Tris。在某些實施例中，調配物可包含10 mM Tris。 組胺酸
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為組胺酸。
在某些實施例中，調配物可包括2-12 mM組胺酸。在某些實施例中，調配物可包含0-10 mM組胺酸。在某些實施例中，調配物可包含2-12 mM組胺酸。在某些實施例中，調配物可包含10 mM組胺酸。 精胺酸
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為精胺酸。
在某些實施例中，精胺酸之濃度可為但不限於1-100 mM。在某些實施例中，調配物可包括0-75 mM精胺酸。在某些實施例中，調配物可包括50-100 mM精胺酸。在某些實施例中，調配物可包含0-75 mM精胺酸。在某些實施例中，調配物可包含75 mM精胺酸。 鹽酸
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為鹽酸。在某些實施例中，調配物中之鹽酸之濃度可為但不限於0.1-15 mM。在某些實施例中，調配物可包括0-10 mM鹽酸。在某些實施例中，調配物可包含6.2-6.3 mM鹽酸。在某些實施例中，調配物可包含8.9-9 mM鹽酸。在某些實施例中，調配物可包含6.2 mM鹽酸。在某些實施例中，調配物可包含6.3 mM鹽酸。在某些實施例中，調配物可包含8.9 mM鹽酸。在某些實施例中，調配物可包含9 mM鹽酸。 糖
在某些實施例中，調配物可包括至少一種糖及/或糖取代物。在某些實施例中，調配物可包括至少一種糖及/或糖取代物以提高調配物之穩定性。在某些實施例中，調配物可包括以0.1-10% w/v (或其中之任何值或範圍)之糖及/或糖取代物。在某些實施例中，調配物可包括以0.1-10% w/v之範圍(或其中之任何值或範圍)之糖及/或糖取代物。在某些實施例中，調配物可包括0-10% w/v糖及/或糖取代物。在某些實施例中，調配物可包括0.1-1%、1-2%、2-3%、3-4%、4-5%、5-6%、6-7%、7-8%、8-9%或9-10% w/v糖及/或糖取代物。
在某些實施例中，調配物可包括至少一種糖，其為蔗糖。在某些實施例中，調配物可包括以0.1-10% w/v (或其中之任何值或範圍)之蔗糖。在某些實施例中，調配物可包括0.1-1%、1-2%、2-3%、3-4%、4-5%、5-6%、6-7%、7-8%、8-9%或9-10% w/v蔗糖。
在某些實施例中，調配物可包括至少一種糖，其為海藻糖。在某些實施例中，調配物可包括以0.1-10% w/v (或其中之任何值或範圍)之海藻糖。在某些實施例中，調配物可包括0.1-1%、1-2%、2-3%、3-4%、4-5%、5-6%、6-7%、7-8%、8-9%或9-10% w/v海藻糖。
在某些實施例中，調配物可包括至少一種糖取代物，其為山梨糖醇。在某些實施例中，調配物可包括以0.1-10% w/v (或其中之任何值或範圍)之山梨糖醇。在某些實施例中，調配物可包括0.1-1%、1-2%、2-3%、3-4%、4-5%、5-6%、6-7%、7-8%、8-9%或9-10% w/v山梨糖醇。 界面活性劑
在某些實施例中，本文所描述之醫藥組合物的調配物可包含界面活性劑。界面活性劑可幫助控制懸浮培養物中之剪切力。本文所用之界面活性劑可為陰離子型、兩性離子型或非離子型界面活性劑，且可包含此項技術中已知適用於醫藥調配物中之界面活性劑。
陰離子型界面活性劑之實例包含但不限於硫酸鹽、磺酸鹽、磷酸酯及羧酸鹽。
非離子型界面活性劑之實例包含但不限於乙氧基化物、脂肪醇乙氧基化物、烷基苯酚乙氧基化物(例如壬苯醇醚、曲拉通X-100)、脂肪酸乙氧基化物、乙氧基化胺及/或脂肪酸醯胺(例如，聚乙氧基化牛脂胺、椰油醯胺單乙醇胺、椰油醯胺二乙醇胺)、環氧乙烷/環氧丙烷共聚物(例如，泊洛沙姆，諸如普洛尼克® F-68或F-127)、脂肪酸及多元醇之酯、脂肪酸烷醇醯胺、乙氧基化脂族酸、乙氧基化脂族醇、乙氧基化山梨糖醇脂肪酸酯、乙氧基化甘油酯、具有EDTA (乙二胺四乙酸)之乙氧基化嵌段共聚物、乙氧基化環醚加成物、乙氧基化醯胺及咪唑啉加成物、乙氧基化胺加成物、乙氧基化硫醇加成物、具有烷基苯酚之乙氧基化縮合物、乙氧基化基於氮之疏水物、乙氧基化聚氧丙烯、聚合聚矽氧、氟化界面活性劑及可聚合界面活性劑。
兩性離子型界面活性劑之實例包含但不限於烷基醯胺基甜菜鹼及其氧化胺、烷基甜菜鹼及其氧化胺、磺基甜菜鹼、羥基磺基甜菜鹼、兩性甘胺酸鹽、兩性丙酸鹽、平衡兩性聚-羧基甘胺酸鹽及烷基聚胺基甘胺酸鹽。蛋白質具有取決於pH而帶電荷或不帶電之能力；因此，在正確pH下，蛋白質較佳pI為約8至9，諸如經修飾牛血清白蛋白或胰凝乳蛋白酶原，可充當兩性離子型界面活性劑。需要時可使用界面活性劑之各種混合物。 共聚物
在某些實施例中，調配物中之組分中的至少一者為共聚物。
在某些實施例中，調配物可包含以0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%或1% w/v濃度之至少一種共聚物。
在某些實施例中，調配物可包含在0.00001%-0.0001%、0.00001%-0.001%、0.00001%-0.01%、0.00001%-0.1%、0.00001%-1%、0.0001%-0.001%、0.0001%-0.01%、0.0001%-0.1%、0.0001%-1%、0.001%-0.01%、0.001%-0.1%、0.001%-1%、0.01%-0.1%、0.01%-1%，或0.1-1% w/v範圍之至少一種共聚物。
在某些實施例中，調配物可包含0.001% w/v共聚物。
在某些實施例中，共聚物為環氧乙烷/環氧丙烷共聚物。
在某些實施例中，調配物可包含以0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%，或1% w/v濃度之至少一種環氧乙烷/環氧丙烷共聚物。
在某些實施例中，調配物可包含在0.00001%-0.0001%、0.00001%-0.001%、0.00001%-0.01%、0.00001%-0.1%、0.00001%-1%、0.0001%-0.001%、0.0001%-0.01%、0.0001%-0.1%、0.0001%-1%、0.001%-0.01%、0.001%-0.1%、0.001%-1%、0.01%-0.1%、0.01%-1%，或0.1-1% w/v範圍之至少一種環氧乙烷/環氧丙烷共聚物。
在某些實施例中，調配物可包含0.001% w/v環氧乙烷/環氧丙烷共聚物。
在某些實施例中，調配物可包含至少一種環氧乙烷/環氧丙烷共聚物，其為泊洛沙姆。在某些實施例中，調配物可包含以0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%，或1% w/v濃度之泊洛沙姆。
在某些實施例中，調配物可包含在0.00001%-0.0001%、0.00001%-0.001%、0.00001%-0.01%、0.00001%-0.1%、0.00001%-1%、0.0001%-0.001%、0.0001%-0.01%、0.0001%-0.1%、0.0001%-1%、0.001%-0.01%、0.001%-0.1%、0.001%-1%、0.01%-0.1%、0.01%-1%，或0.1-1% w/v範圍之泊洛沙姆。
在某些實施例中，調配物可包含0.001% w/v泊洛沙姆。
在某些實施例中，調配物可包含至少一種環氧乙烷/環氧丙烷共聚物，其為泊洛沙姆188。在某些實施例中，調配物可包含以0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%，或1% w/v濃度之泊洛沙姆188。
在某些實施例中，調配物可包含在0.00001%-0.0001%、0.00001%-0.001%、0.00001%-0.01%、0.00001%-0.1%、0.00001%-1%、0.0001%-0.001%、0.0001%-0.01%、0.0001%-0.1%、0.0001%-1%、0.001%-0.01%、0.001%-0.1%、0.001%-1%、0.01%-0.1%、0.01%-1%，或0.1-1% w/v範圍之泊洛沙姆188。
在某些實施例中，調配物可包含0.001%-0.1 w/v 泊洛沙姆188。
在某些實施例中，調配物可包含至少一種環氧乙烷/環氧丙烷共聚物，其為普洛尼克® F-68。在某些實施例中，調配物可包含以0.00001%、0.0001%、0.001%、0.01%、0.1%，或1% w/v濃度之普洛尼克® F-68。
在某些實施例中，調配物可包含在0.00001%-0.0001%、0.00001%-0.001%、0.00001%-0.01%、0.00001%-0.1%、0.00001%-1%、0.0001%-0.001%、0.0001%-0.01%、0.0001%-0.1%、0.0001%-1%、0.001%-0.01%、0.001%-0.1%、0.001%-1%、0.01%-0.1%、0.01%-1%，或0.1-1% w/v範圍之普洛尼克® F-68。
在某些實施例中，調配物可包含0.001%-0.1% w/v普洛尼克® F-68。在某些實施例中，調配物可包含0.001% w/v普洛尼克® F-68。 調配物特性
在某些實施例中，調配物已經最佳化以具有特定pH、重量莫耳滲透濃度、濃度、AAV粒子濃度及/或AAV粒子總劑量。 pH
在某些實施例中，調配物可針對特定pH進行最佳化。在某些實施例中，調配物可包含pH緩衝劑(在本文中亦稱為「緩衝劑」)，其為弱酸或弱鹼，當用於調配物中時甚至在將另一酸或鹼添加至調配物中之後，維持調配物之pH接近所選擇值。調配物之pH可為但不限於0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9及14。
在某些實施例中，調配物可針對特定pH範圍進行最佳化。pH範圍可為但不限於0-4、1-5、2-6、3-7、4-8、5-9、6-10、7-11、8-12、9-13、10-14、0-1.5、1-2.5、2-3.5、3-4.5、4-5.5、5-6.5、6-7.5、7-8.5、8-9.5、9-10.5、10-11.5、11-12.5、12-13.5、0-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、11-12、12-13、13-14、0-0.5、0.5-1、1-1.5、1.5-2、2-2.5、2.5-3、3-3.5、3.5-4、4-4.5、4.5-5、5-5.5、5.5-6、6-6.5、6.5-7、7-7.5、7.2-8.2、7.2-7.6、7.3-7.7、7.5-8、7.8-8.2、8-8.5、8.5-9、9-9.5、9.5-10、10-10.5、10.5-11、11-11.5、11.5-12、12-12.5、12.5-13、13-13.5，或13.5-14。
在某些實施例中，調配物之pH在6與8.5之間。在某些實施例中，調配物之pH在7與8.5之間。在某些實施例中，調配物之pH在7與7.6之間。在某些實施例中，調配物之pH為7。在某些實施例中，調配物之pH為7.1。在某些實施例中，調配物之pH為7.2。在某些實施例中，調配物之pH為7.3。在某些實施例中，調配物之pH為7.4。在某些實施例中，調配物之pH為7.5。在某些實施例中，調配物之pH為7.6。在某些實施例中，調配物之pH為7.7。在某些實施例中，調配物之pH為7.8。在某些實施例中，調配物之pH為7.9。在某些實施例中，調配物之pH為8。在某些實施例中，調配物之pH為8.1。在某些實施例中，調配物之pH為8.2。在某些實施例中，調配物之pH為8.3。在某些實施例中，調配物之pH為8.4。在某些實施例中，調配物之pH為8.5。在某些實施例中，當調配物在5℃下時測定pH。在某些實施例中，當調配物在25℃下時測定pH。
適合之緩衝劑可包含但不限於Tris HCl、Tris鹼、磷酸鈉(磷酸一鈉及/或磷酸二鈉)、磷酸鉀(磷酸一鉀及/或磷酸二鉀)、組胺酸、硼酸、檸檬酸、甘胺酸、HEPES (4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸)及MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸)。
調配物中之緩衝劑的濃度可在1-50 mM之間、在1-25 mM之間、在5-30 mM之間、在5-20 mM之間、在5-15 mM之間、在10-40 mM或在15-30 mM之間。調配物中之緩衝劑的濃度可為約1 mM、5 mM、7.5 mM、10 mM、12.5 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM、35 mM、40 mM或50 mM。
在某些實施例中，調配物可包含但不限於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。作為非限制性實例，PBS可包含氯化鈉、氯化鉀、磷酸二鈉、磷酸一鉀及蒸餾水。在一些情況下，PBS不含有鉀或鎂。在其他情況下，PBS含有鈣及鎂。
在某些實施例中，用於本文所描述之醫藥組合物之調配物的緩衝劑可包含磷酸鈉(磷酸一鈉及/或磷酸二鈉)。作為非限制性實例，磷酸鈉可調節至7.4±0.2範圍內之pH (在5℃下)。在某些實施例中，用於本文所描述之醫藥組合物之調配物的緩衝劑可包含Tris鹼。Tris鹼可用鹽酸調節至7.1至9.1範圍內之任何pH。作為非限制性實例，用於本文所描述之調配物的Tris鹼可調節至8.0±0.2。作為非限制性實例，用於本文所描述之調配物的Tris鹼可調節至7.5±0.2。 重量莫耳滲透濃度
在某些實施例中，調配物可針對特定重量莫耳滲透濃度進行最佳化。調配物之重量莫耳滲透濃度可為但不限於350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499，或500 mOsm/kg (毫滲量/kg)。
在某些實施例中，調配物可針對特定重量莫耳滲透濃度範圍進行最佳化。該範圍可為但不限於350-360、360-370、370-380、380-390、390-400、400-410、410-420、420-430、430-440、440-450、450-460、460-470、470-480、480-490、490-500、350-370、360-380、370-390、380-400、390-410、400-420、410-430、420-440、430-450、440-460、450-470、460-480、470-490、480-500、350-375、375-400、400-425、425-450、450-475、475-500、350-380、360-390、370-400、380-410、390-420、400-430、410-440、420-450、430-460、440-470、450-480、460-490、470-500、350-390、360-400、370-410、380-420、390-430、400-440、410-450、420-460、430-470、440-480、450-490、460-500、350-400、360-410、370-420、380-430、390-440、400-450、410-460、420-470、430-480、440-490、450-500、350-410、360-420、370-430、380-440、390-450、400-460、410-470、420-480、430-490、440-500、350-420、360-430、370-440、380-450、390-460、400-470、410-480、420-490、430-500、350-430、360-440、370-450、380-460、390-470、400-480、410-490、420-500、350-440、360-450、370-460、380-470、390-480、400-490、410-500、350-450、360-460、370-470、380-480、390-490、400-500、350-460、360-470、370-480、380-490、390-500、350-470、360-480、370-490、380-500、350-480、360-490、370-500、350-490、360-500，或350-500 mOsm/kg。
在某些實施例中，調配物之重量莫耳滲透濃度在350-500 mOsm/kg之間。在某些實施例中，調配物之重量莫耳滲透濃度在400-500 mOsm/kg之間。在某些實施例中，調配物之重量莫耳滲透濃度在400-480 mOsm/kg之間。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為395 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為413 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為420 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為432 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為447 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為450 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為452 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為459 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為472 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為490 mOsm/kg。在某些實施例中，重量莫耳滲透濃度為496 mOsm/kg。 AAV粒子之濃度
在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度可在約1×106 VG/ml與約1×1016 VG/ml之間。如本文所用，「VG/ml」表示載體基因體(VG)/毫升(ml)。VG/ml亦可描述基因體複本/毫升或抗DNA酶粒子/毫升。
在某些實施例中，調配物可包含以下之AAV粒子濃度：約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、2.1×1011 、2.2×1011 、2.3×1011 、2.4×1011 、2.5×1011 、2.6×1011 、2.7×1011 、2.8×1011 、2.9×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、7.1×1011 、7.2×1011 、7.3×1011 、7.4×1011 、7.5×1011 、7.6×1011 、7.7×1011 、7.8×1011 、7.9×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 、4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、7.1×1012 、7.2×1012 、7.3×1012 、7.4×1012 、7.5×1012 、7.6×1012 、7.7×1012 、7.8×1012 、7.9×1012 、8×1012 、8.1×1012 、8.2×1012 、8.3×1012 、8.4×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、8.7×1012 、8.8×1012 、8.9×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、2.1×1013 、2.2×1013 、2.3×1013 、2.4×1013 、2.5×1013 、2.6×1013 、2.7×1013 、2.8×1013 、2.9×1013 、3×1013 、3.1×1013 、3.2×1013 、3.3×1013 、3.4×1013 、3.5×1013 、3.6×1013 、3.7×1013 、3.8×1013 、3.9×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 ，或1×1016 VG/ml。
在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度在1×1011 與5×1013 之間、在1×1012 與5×1012 之間、在2×1012 與1×1013 之間、在5×1012 與1×1013 之間、在1×1013 與2×1013 之間、在2×1013 與3×1013 之間、在2×1013 與2.5×1013 之間、在2.5×1013 與3×1013 之間，或不超過5×1013 VG/ml。
在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為2.7×1011 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為9×1011 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為1.2×1012 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為2.7×1012 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為4×1012 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為6×1012 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為7.9×1012 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為8×1012 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為1×1013 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為1.8×1013 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為2.2×1013 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為2.7×1013 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為3.5×1013 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為2.7-3.5×1013 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為7.0×1013 VG/ml。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度為5.0×1012 VG/ml。
在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之濃度可在約1×106 個總衣殼/mL與約1×1016 個總衣殼/ml之間。在某些實施例中，遞送可包含以下濃度之組合物：約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、3.1×1012 、3.2×1012 、3.3×1012 、3.4×1012 、3.5×1012 、3.6×1012 、3.7×1012 、3.8×1012 、3.9×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 、4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、8×1012 、9×1012 、1×1013 、2×1013 、2.1×1013 、2.2×1013 、2.3×1013 、2.4×1013 、2.5×1013 、2.6×1013 、2.7×1013 、2.8×1013 、2.9×1013 、3×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 ，或1×1016 總衣殼/ml。 AAV粒子之總劑量
在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量可在約1×106 VG與約1×1016 VG之間。在某些實施例中，調配物可包含以下之AAV粒子之總劑量：約1×106 、2×106 、3×106 、4×106 、5×106 、6×106 、7×106 、8×106 、9×106 、1×107 、2×107 、3×107 、4×107 、5×107 、6×107 、7×107 、8×107 、9×107 、1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 、9×108 、1×109 、2×109 、3×109 、4×109 、5×109 、6×109 、7×109 、8×109 、9×109 、1×1010 、2×1010 、3×1010 、4×1010 、5×1010 、6×1010 、7×1010 、8×1010 、9×1010 、1×1011 、2×1011 、2.1×1011 、2.2×1011 、2.3×1011 、2.4×1011 、2.5×1011 、2.6×1011 、2.7×1011 、2.8×1011 、2.9×1011 、3×1011 、4×1011 、5×1011 、6×1011 、7×1011 、7.1×1011 、7.2×1011 、7.3×1011 、7.4×1011 、7.5×1011 、7.6×1011 、7.7×1011 、7.8×1011 、7.9×1011 、8×1011 、9×1011 、1×1012 、1.1×1012 、1.2×1012 、1.3×1012 、1.4×1012 、1.5×1012 、1.6×1012 、1.7×1012 、1.8×1012 、1.9×1012 、2×1012 、2.1×1012 、2.2×1012 、2.3×1012 、2.4×1012 、2.5×1012 、2.6×1012 、2.7×1012 、2.8×1012 、2.9×1012 、3×1012 、4×1012 、4.1×1012 、4.2×1012 、4.3×1012 、4.4×1012 、4.5×1012 ,4.6×1012 、4.7×1012 、4.8×1012 、4.9×1012 、5×1012 、6×1012 、7×1012 、7.1×1012 、7.2×1012 、7.3×1012 、7.4×1012 、7.5×1012 、7.6×1012 、7.7×1012 、7.8×1012 、7.9×1012 、8×1012 、8.1×1012 、8.2×1012 、8.3×1012 、8.4×1012 、8.5×1012 、8.6×1012 、8.7×1012 、8.8×1012 、8.9×1012 、9×1012 、1×1013 、1.1×1013 、1.2×1013 、1.3×1013 、1.4×1013 、1.5×1013 、1.6×1013 、1.7×1013 、1.8×1013 、1.9×1013 、2×1013 、2.1×1013 、2.2×1013 、2.3×1013 、2.4×1013 、2.5×1013 、2.6×1013 、2.7×1013 、2.8×1013 、2.9×1013 、3×1013 、3.1×1013 、3.2×1013 、3.3×1013 、3.4×1013 、3.5×1013 、3.6×1013 、3.7×1013 、3.8×1013 、3.9×1013 、4×1013 、5×1013 、6×1013 、6.7×1013 、7×1013 、8×1013 、9×1013 、1×1014 、2×1014 、3×1014 、4×1014 、5×1014 、6×1014 、7×1014 、8×1014 、9×1014 、1×1015 、2×1015 、3×1015 、4×1015 、5×1015 、6×1015 、7×1015 、8×1015 、9×1015 ，或1×1016 VG。
在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量在1×1011 與5×1013 VG之間。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量在1×1011 與2×1014 VG之間。
在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為1.4×1011 VG。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為4.5×1011 VG。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為6.8×1011 VG。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為1.4×1012 VG。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為2.2×1012 VG。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為4.6×1011 VG。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為9.2×1012 VG。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為1.0×1013 VG。在某些實施例中，調配物中之AAV粒子之總劑量為2.3×1013 VG。 量測與分析
來自病毒基因體之有效負載之表現或此類有效負載之下調效應可使用此項技術中已知之各種方法測定，諸如但不限於免疫化學(例如IHC)、原位雜交(ISH)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、親和力ELISA、ELISPOT、流式細胞量測術、免疫細胞學、表面電漿子共振分析、動力排除分析、液相層析質譜法(LCMS)、高效液相層析(HPLC)、BCA分析、免疫電泳、西方墨點、SDS-PAGE、蛋白質免疫沈澱及/或PCR。 生物可用性
在某些實施例中，調配成具有如本文所描述之遞送劑之組合物的AAV粒子可展現其生物可用性與缺乏如本文所描述之遞送劑的組合物相比之增加。如本文所用，術語「生物可用性」係指向哺乳動物投與的給定量之AAV粒子或所表現之有效負載的全身可用性。生物可用性可藉由量測後續組合物之曲線下面積(AUC)或最大血清或血漿濃度(Cmax )來加以評定。AUC為沿縱座標(Y軸)之化合物(例如AAV粒子或所表現之有效負載)的血清或血漿濃度相對於沿橫座標(X軸)之時間繪製的曲線下面積之測定值。一般而言，特定化合物之AUC可使用一般熟習此項技術者已知之方法計算且如G. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中。
Cmax 值為在向哺乳動物投與AAV粒子後在該哺乳動物之血清或血漿中達成的AAV粒子或所表現之有效負載之最大濃度。Cmax 值可使用一般熟習此項技術者已知之方法進行量測。如本文所用之片語「增加生物可用性」或「改良藥物動力學」意謂當與如本文所描述之遞送劑共同投與時，以AUC、Cmax 或Cmin 形式量測的第一AAV粒子或所表現之有效負載在哺乳動物中之全身可用性比在不進行此類共同投與時的全身可用性更大。在某些實施例中，生物可用性可增加至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。 治療窗
如本文所用，「治療窗」係指治療活性物質在作用部位引發治療作用之機率較高的血漿濃度範圍或水準範圍。在某些實施例中，如本文所描述之AAV粒子調配物的治療窗可增加至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%，或約100%。 分佈體積
如本文所用，術語「分佈體積」係指體內含有與血液或血漿中濃度相同的藥物總量所需的液體體積：Vdist 等於體內藥物量/血液或血漿中之藥物濃度。舉例而言，對於10 mg劑量及10 mg/L之血漿濃度，分佈體積將為1公升。分佈體積反映藥物存在於血管外組織中的程度。較大分佈體積反映與血漿蛋白質結合相比，化合物傾向於與組織組分結合。在臨床配置中，Vdist 可用於確定達成穩態濃度之起始劑量。在某些實施例中，如本文所描述之AAV粒子調配物的分佈體積可降低至少約2%、至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%。 生物學作用
在某些實施例中，向動物遞送之AAV粒子調配物的生物學作用可藉由分析該等動物中之有效負載表現來分類。有效負載表現可藉由分析自投與本發明之AAV粒子調配物的哺乳動物收集之生物樣品來確定。舉例而言，對於由向哺乳動物遞送之AAV粒子編碼之蛋白質，50-200 pg/ml之蛋白質表現可視為該哺乳動物中之蛋白質的治療有效量。 IV.定義
在本發明中的不同位置，以組或範圍來揭示本發明化合物之取代物或特性。特別預期本發明包含此類組及範圍之成員的每一個別或子組合。
除非另有說明，否則以下術語及片語具有下文描述之含義。定義本質上不意欲為限制性的且用以提供本發明之某些態樣之更清晰理解。
腺相關病毒 ：如本文所用之術語「腺相關病毒」或「AAV」係指依賴病毒屬之成員，包含衍生自其之任何粒子、序列、基因、蛋白質或組分。
AAV 粒子 ：如本文所用，「AAV粒子」為包含衣殼及病毒基因體的病毒，該病毒基因體具有至少一個有效負載區域及至少一個ITR區域。AAV粒子可衍生自本文所描述或此項技術中已知之任何血清型，其包含血清型之組合(亦即，「假模式化」AAV)或來自各種基因體(例如，單股或自補)。另外，AAV粒子可為複製缺陷型及/或靶向型的。
活性 ：如本文所用，術語「活性」係指其中事件發生或進行之條件。本發明之組合物可具有活性，且此活性可涉及一或多個生物學事件。
投與 ：如本文所用，術語「投與」係指向個體提供醫藥劑或組合物。
以組合形式投與 ：如本文所用，術語「以組合形式投與」或「組合投與」意謂同時或在一定時間間隔內向個體投與兩種或更多種藥劑，使得每種藥劑對患者之作用存在重疊。在某些實施例中，其係在彼此之約60、30、15、10、5或1分鐘內投與。在某些實施例中，藥劑之投與係以在一起足夠緊密的程度間隔開以達成組合(例如協同)作用。
改善 ：如本文所用，術語「改善(amelioration/ameliorating)」係指病況或疾病之至少一種指標的嚴重程度減輕。舉例而言，在神經退化病症之情形下，改善包含神經元損失之減少。
動物 ：如本文所用，術語「動物」係指動物界的任何成員。在某些實施例中，「動物」係指任何發育階段之人類。在某些實施例中，「動物」係指任何發育階段之非人類動物。在某些實施例中，非人類動物為哺乳動物(例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、羊、牛、靈長類動物或豬)。在某些實施例中，動物包含但不限於哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物、魚類及蠕蟲。在某些實施例中，動物為轉殖基因動物、經基因工程改造之動物或純系。
反義股 ：如本文所用，術語siRNA分子之「反義股」或「第一股」或「引導股」係指與所靶向以用於靜默之基因之mRNA的約10-50個核苷酸，例如約15-30、16-25、18-23或19-22個核苷酸之鏈段實質上互補的股。反義股或第一股具有與所需標靶mRNA序列充分互補以導引標靶特異性靜默的序列，例如互補性足以藉由RNAi機制或過程觸發對所需標靶mRNA之破壞。
大致 ：如本文所用，在應用於一或多個所關注之值時，術語「大致」或「約」係指與所陳述之參考值類似的值。如本文所用，術語「約」意謂所列舉之值的+/- 10%。在某些實施例中，除非另有說明或另外自上下文顯而易見(除了此類數目將超出可能值之100%的情況)，否則術語「大致」係指在所陳述之參考值的任一方向(大於或小於)屬於25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內的一系列值。
與 … 締合 ：如本文所用，當關於兩個或更多個部分使用時，術語「與…締合」、「結合」、「連接」、「附接」及「系留」意謂該等部分直接或經由一或多個充當連接劑之額外部分而在物理上彼此締合或連接，以形成足夠穩定之結構以使得該等部分在使用該結構之條件(例如生理學條件)下保持在物理上締合。「締合」不必嚴格經由直接共價化學鍵結進行。其亦可表示離子鍵結或氫鍵結或基於雜化之連接性足夠穩定以使得「締合的」實體保持物理上締合。
桿狀病毒表現載體 (BEV) ：如本文所用，BEV為桿狀病毒表現載體，亦即桿狀病毒來源之聚核苷酸載體。桿狀病毒表現載體(BEV)為已經基因修飾以引起外源基因表現之重組桿狀病毒。使用BEV之系統係稱為桿狀病毒表現載體系統(BEVS)。
mBEV 或經修飾之 BEV ：如本文所用，經修飾之BEV為桿狀病毒來源之表現載體，其已藉由以下一或多者之添加及/或缺失及/或複製及/或倒置而自起始BEV (無論野生型抑或人工的)改變：基因；基因片段；裂解位點；限制位點；序列區；編碼有效負載或所關注之基因的序列；或前述之組合。
雙功能性 ：如本文所用，術語「雙功能性」係指任何能夠具有或維持至少兩種功能的物質、分子或部分。該等功能可影響相同結果或不同結果。生產該功能之結構可相同或不同。
BIIC ：如本文所用，BIIC為經桿狀病毒感染之昆蟲細胞。
生物相容性 ：如本文所用，術語「生物相容性」意謂與活細胞、組織、器官或系統相容，幾乎不引起損傷、毒性或由免疫系統排斥的風險。
生物可降解 ：如本文所用，術語「生物可降解」意謂能夠藉由活物之作用分解成無害產物。
生物活性 ：如本文所用，片語「生物活性」係指任何在生物系統及/或生物體中具有活性之物質的特徵。舉例而言，當向生物體投與時對彼生物體具有生物學作用之物質視為具有生物活性。在特定實施例中，若經編碼之有效負載的即使一部分具有生物活性或模擬視為生物學相關的活性，則可認為本發明之AAV粒子具有生物活性。
衣殼 ：如本文所用，術語「衣殼」係指病毒粒子之蛋白質外殼。
經密碼子最佳化 ：如本文所用，術語「經密碼子最佳化」或「密碼子最佳化」係指經修飾之核酸序列編碼與親本/參考序列相同的胺基酸序列，但已改變，使得經修飾之核酸序列的密碼子針對在特定系統(諸如特定物種或物種群)中之表現最佳化或改良。作為非限制性實例，包含AAV衣殼蛋白之核酸序列可經密碼子最佳化以用於在昆蟲細胞中或在特定昆蟲細胞(諸如草地貪夜蛾細胞)中表現。密碼子最佳化可使用熟習此項技術者已知之方法及資料庫完成。
互補及實質上互補 ：如本文所用，術語「互補」係指聚核苷酸彼此形成鹼基對之能力。鹼基對通常由反平行聚核苷酸股中之核苷酸單元之間的氫鍵形成。互補聚核苷酸股可以華特生-克里克(Watson-Crick)方式(例如A至T、A至U、C至G)，或以允許形成雙螺旋之任何其他方式形成鹼基對。如熟習此項技術者所知，當與DNA相對使用RNA時，尿嘧啶而非胸腺嘧啶為視為與腺苷互補之鹼基。然而，除非另有說明，否則當在本發明之上下文中指示U時，暗示能夠取代T。完美互補性或100%互補性係指一個聚核苷酸股之各核苷酸單元可與第二聚核苷酸股之核苷酸單元形成氫鍵之情況。次完美互補性係指兩股之一些但並非所有核苷酸單元可彼此形成氫鍵的情況。舉例而言，對於兩個20-聚體，若各股上僅兩個鹼基對可彼此形成氫鍵，則聚核苷酸股展現10%互補性。在同一實例中，若各股上之18個鹼基對可彼此形成氫鍵，則聚核苷酸股展現90%互補性。
化合物 ：本發明之化合物包含存在於中間化合物或最終化合物中之原子的所有同位素。「同位素」係指具有相同原子數但因為原子核中之中子數不同而具有不同質量數的原子。舉例而言，氫之同位素包含氚及氘。
本發明之化合物及鹽可藉由常規方法與溶劑或水分子組合製備以形成溶劑合物及水合物。
條件性活性 ：如本文所用，術語「條件性活性」係指野生型多肽之突變體或變異體，其中該突變體或變異體之活性在生理學條件下比親本多肽大或小。此外，條件性活性多肽在異常條件下相比於親本多肽具有增加或減小的活性。條件性活性多肽在普通生理學條件或異常條件下可以可逆地或不可逆地不活化。
保守 ：如本文所用，術語「保守」係指聚核苷酸序列或多肽序列之核苷酸或胺基酸殘基分別在所比較之兩個或更多個序列之相同位置中未發生改變。相對保守之核苷酸或胺基酸為與序列中其他地方出現之核苷酸或胺基酸相比而言較相關之序列中的保守核苷酸或胺基酸。
在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此100%相同，則將其稱為「完全保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則將其稱為「高度保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%、約98%或約99%一致，則將其稱為「高度保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此至少30%一致、至少40%一致、至少50%一致、至少60%一致、至少70%一致、至少80%一致、至少90%一致或至少95%一致，則將其稱為「保守的」。在某些實施例中，若兩個或更多個序列為彼此約30%一致、約40%一致、約50%一致、約60%一致、約70%一致、約80%一致、約90%一致、約95%一致、約98%一致或約99%一致，則將其稱為「保守的」。序列之保守可應用於聚核苷酸或多肽之整個長度或可應用於其一部分、區域或特徵。
控制元件 ：如本文所用，「控制元件」、「調控控制元件」或「調控序列」係指提供接受者細胞中之編碼序列之複製、轉錄及轉譯的啟動子區、聚腺苷酸化信號、轉錄終止序列、上游調控域、複製起點、內部核糖體入口位點(「IRES」)、增強子及其類似物。此等控制元件並非全部都需要始終存在，只要所選編碼序列能夠在適當的宿主細胞中進行複製、轉錄及/或轉譯即可。
控制釋放 ：如本文所用，術語「控制釋放」係指符合特定釋放模式以實現治療結果的醫藥組合物或化合物釋放特徵。
細胞抑制 ：如本文所用，「細胞抑制」係指抑制、減少、抑止細胞(例如，哺乳動物細胞(例如，人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲、普里昂蛋白或其組合之生長、分裂或增殖。
細胞毒性 ：如本文所用，「細胞毒性」係指將細胞(例如，哺乳動物細胞(例如，人類細胞))、細菌、病毒、真菌、原生動物、寄生蟲、普里昂蛋白或其組合殺死或對其造成有害、有毒或致命的影響。
遞送 ：如本文所用，「遞送」係指遞送AAV粒子、化合物、物質、實體、部分、負荷或有效負載的動作或方式。
遞送劑 ：如本文所用，「遞送劑」係指任何至少部分地有助於將AAV粒子活體內遞送至所靶向細胞的物質。
去穩定 ：如本文所用，術語「去穩定」或「去穩定化區域」意謂比相同區域或分子之起始、野生型或原生形式更不穩定之區域或分子。
可偵測標記 ：如本文所用，「可偵測標記」係指一或多種與另一實體附接、一起併入或與其締合的標記物、信號或部分，該另一實體易於藉由此項技術中已知之方法偵測，該等方法包含射線照相術、螢光、化學發光、酶活性、吸光度及其類似方法。可偵測標記包含放射性同位素、螢光團、發色團、酶類、染料、金屬離子、配位體(諸如生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素及半抗原)、量子點及其類似物。可偵測標記可位於本文所揭示之肽或蛋白質中之任何位置。其可在胺基酸、肽或蛋白質內，或位於N端或C端。
分解 ：如本文所用，術語「分解」意謂分裂成較小的碎片或組分。在提及多肽或蛋白質時，分解引起肽的生產。
遠端 ：如本文所用，術語「遠端」意謂位於遠離中心或遠離所關注之點或區域處。
給藥方案 ：如本文所用，「給藥方案」為投與時程或由醫師確定之治療、預防或緩解性照護方案。
囊封 ：如本文所用，術語「囊封」意謂圍封、包圍或包覆。
經工程改造 ：如本文所用，當本發明之實施例經設計以具有與起始點、野生型或原生分子不同的特徵或特性(無論結構上抑或化學上)時，該等實施例「經工程改造」。
有效量 ：如本文所用，術語藥劑之「有效量」為足以實現有益的或所需的結果，例如臨床結果的量，且因此「有效量」視其應用情形而定。舉例而言，在投與治療癌症之藥劑的情形下，藥劑之有效量為例如相比於在未投與藥劑之情況下所獲得的反應，足以實現對癌症進行如本文所定義之治療的量。
表現 ：如本文所用，核酸序列之「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列生產RNA模板(例如，藉由轉錄)；(2)加工RNA轉錄本(例如，藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3'端加工)；(3)將RNA轉譯成多肽或蛋白質；及(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。
表現 Bac ：如本文所用，「表現Bac」或「rep/cap bac」係指包含腺相關病毒(AAV)病毒表現構築體及/或區域之桿狀病毒。在一些實施例中，表現Bac之病毒表現構築體包含一或多種編碼用於AAV，諸如但不限於AAV2之衣殼及/或複製基因之聚核苷酸。舉例而言，一或多種編碼用於AAV之衣殼及/或複製基因之聚核苷酸可編碼VP1、VP2、VP3、Rep52及/或Rep78，且此等聚核苷酸可存在於一或多個開放閱讀框架，例如兩個開放閱讀框架中之構築體中。
表現 BIIC ：如本文所用，「表現BIIC」或「rep/cap BIIC」係指包含一或多種桿狀病毒(例如表現Bac)之昆蟲細胞，該等桿狀病毒包含有包含病毒表現構築體之穿梭載體。在一些實施例中，表現構築體包含一或多種編碼用於AAV，諸如但不限於AAV2之衣殼及/或複製基因之聚核苷酸。舉例而言，一或多種編碼用於AAV之衣殼及/或複製基因之聚核苷酸可編碼VP1、VP2、VP3、Rep52及/或Rep78，且此等聚核苷酸可存在於一或多個開放閱讀框架，例如兩個開放閱讀框架中之構築體中。在一些實施例中，昆蟲細胞為Sf9細胞。
特徵 (Feature) ：如本文所用，「特徵」係指特徵(characteristic)、特性或獨特要素。
調配物 ：如本文所用，「調配物」包含至少一種AAV粒子及遞送劑或賦形劑。
片段 ：如本文所用之「片段」係指一部分。舉例而言，蛋白質之片段可包含藉由使自經培養細胞分離之全長蛋白質分解而獲得的多肽。
功能性 ：如本文所用，「功能性」生物分子為展現出其特性及/或活性的生物分子形式，其以該特性及/或活性為特徵。
基因表現 ：術語「基因表現」係指核酸序列進行成功轉錄且在大部分情況下進行成功轉譯以生產蛋白質或肽的過程。為了清楚起見，在提及量測「基因表現」時，此應該理解為意謂量測可針對核酸轉錄產物，例如對RNA或mRNA，或針對胺基酸轉譯產物，例如多肽或肽。量測RNA、mRNA、多肽及肽之量或水準的方法為此項技術中熟知的。
同源性 ：如本文所用，術語「同源性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。在某些實施例中，若聚合分子之序列為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%一致或類似，則將該等聚合分子視為彼此「同源」。術語「同源」必然係指在至少兩個序列(聚核苷酸或多肽序列)之間的比較。根據本發明，若對於至少約20個胺基酸之至少一個延伸部，兩個聚核苷酸序列編碼之多肽為至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或甚至99%，則將兩個聚核苷酸序列視為同源。在某些實施例中，同源聚核酸苷序列之特徵在於編碼至少4-5個特別指定之胺基酸的延伸部的能力。對於長度小於60個核苷酸之聚核苷酸序列，同源性由編碼至少4-5個特別指定之胺基酸的延伸部之能力來確定。根據本發明，若對於至少約20個胺基酸之至少一個延伸部，蛋白質為至少約50%、60%、70%、80%或90%相同，則將兩個蛋白質序列視為同源。
異源區域 ：如本文所用，術語「異源區域」係指不被視為同源區域之區域。
同源區域 ：如本文所用，術語「同源區域」係指在位置、結構、進化起源、特徵、形式或功能方面類似的區域。
一致性 ：如本文所用，術語「一致性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。舉例而言，兩個聚核苷酸序列之一致性百分比的計算可藉由出於最佳比較目的而比對兩個序列來進行(例如，可將間隙引入第一及第二核酸序列中之一者或兩者中以便最佳比對且出於比較目的可忽略非一致序列)。在某些實施例中，出於比較目的而比對之序列的長度為參考序列之長度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。隨後比較在對應核苷酸位置處之核苷酸。當第一序列中之位置經與第二序列中之對應位置相同的核苷酸佔據時，則分子在該位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比與該等序列共有的一致位置數目有關，考慮為了兩個序列之最佳比對而需要引入之空隙數目及各空隙長度。可使用數學算法達成序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比。舉例而言，可使用諸如以下中描述之方法測定兩個核苷酸序列之間的一致性百分比：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., 編, Academic Press, New York, 1993；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M.及Griffin, H. G., 編, Humana Press, New Jersey, 1994；及Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.及Devereux, J., 編, M Stockton Press, New York, 1991；其內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。舉例而言，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用Meyers及Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17)之演算法來測定，該演算法已併入使用PAM120權重殘基表、空隙長度罰分12及空隙罰分4之ALIGN程式(2.0版)中。替代地，兩個核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG套裝軟體中之GAP程式，使用NWSgapdna.CMP矩陣來測定。通常用於測定序列之間的一致性百分比之方法包含但不限於以下中所揭示之方法：Carillo, H.及Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988)；其內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。用於測定一致性之技術編碼於公開可獲得之電腦程式中。測定兩個序列之間的同源性之例示性電腦軟體包含但不限於GCG程式包, Devereux, J.,等人 . ,Nucleic Acids Research , 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN及FASTA Altschul, S. F.等人 ,J. Molec. Biol. , 215, 403 (1990))。
抑制基因表現 ：如本文所用，片語「抑制基因表現」意謂引起基因表現產物之量減少。表現產物可為自基因轉錄之RNA (例如mRNA)或自mRNA轉譯之多肽，該mRNA自基因轉錄。通常，mRNA水準之減少引起自其轉譯之多肽的水準減少。表現量可使用用於量測mRNA或蛋白質之標準技術來測定。
活體外 ：如本文所用，術語「活體外」係指發生在人工環境中(例如試管或反應容器中、細胞培養物中、皮氏培養皿(Petri dish)中等)而非發生在生物體(例如動物、植物或微生物)內的事件。
活體內 ：如本文所用，術語「活體內」係指發生在生物體(例如動物、植物或微生物、或其細胞或組織)內之事件。
經分離 ：如本文所用，術語「經分離」係指物質或實體已與至少一些與其締合之組分(無論在自然界中或在實驗環境中)分離。經分離之物質關於其所締合之物質之純度水準可不同。經分離之物質及/或實體可與其最初締合之其他組分的至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或更多分離。在某些實施例中，經分離之藥劑之純度超過約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或超過約99%。如本文所用，若物質實質上不含其他組分，則該物質為「純的」。如本文所用，術語「實質上分離」意謂物質自其形成或經偵測之環境實質上分離。部分分離可包含例如富含本發明之物質或AAV粒子的組合物。實質上分離可包含含有至少約50重量%、至少約60重量%、至少約70重量%、至少約80重量%、至少約90重量%、至少約95重量%、至少約97重量%或至少約99重量%之本發明化合物或其鹽的組合物。用於分離化合物及其鹽之方法為此項技術中之常規方法。
連接子 ：如本文所用，「連接子」係指連接兩個分子之分子或分子群。連接子可為連接編碼兩種不同多肽的兩個核酸序列之核酸序列。連接子可經轉譯或可未經轉譯。連接子可為可裂解連接子。
微 RNA (miRNA) 結合位點 ：如本文所用，微RNA (miRNA)結合位點表示至少由miRNA之「種子」區域結合的核酸轉錄本之核苷酸位置或區域。
經修飾 ：如本文所用，「經修飾」係指本發明之分子的狀態或結構變化。分子可以包含化學上、結構上及功能上之許多方式修飾。如本文所用，當本發明之實施例具有或擁有與起始點、野生型或原生分子不同的特徵或特性(無論結構上抑或化學上)時，該等實施例「經修飾」。
突變 ：如本文所用，術語「突變」係指基因結構之任何變化，該變化生產可傳遞至後代之變異(亦稱為「突變」)形式。基因突變可由DNA中之單鹼基之交替、或基因或染色體之較大部分之缺失、插入或重排引起。
天然存在 ：如本文所用，「天然存在」或「野生型」意謂存在於自然界中而沒有人工輔助或人的手的參與。
非人類脊椎動物 ：如本文所用，「非人類脊椎動物」包含除了智人之外的所有脊椎動物，包含野生及家養物種。非人類脊椎動物之實例包含但不限於哺乳動物，諸如羊駝、爪哇牛、野牛、駱駝、貓、牛、鹿、狗、驢、大額牛、山羊、天竺鼠、馬、駱馬、騾、豬、兔、馴鹿、綿羊、水牛及犛牛。
核酸 ：如本文所用，術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」係指由以下構成之任何核酸聚合物：聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、或聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，或任何其他類型之聚核苷酸(其為嘌呤或嘧啶鹼基或經修飾嘌呤或嘧啶鹼基之N醣苷)。在術語「核酸」、「聚核苷酸」及「寡核苷酸」之間不存在預期長度區別，且此等術語將可互換使用。此等術語僅指分子之一級結構。因此，此等術語包含雙股及單股DNA以及雙股及單股RNA。
脫靶 ：如本文所用，「脫靶」係指對任一或多個標靶、基因或細胞轉錄本之任何非預期作用。
開放閱讀框架 ：如本文所用，「開放閱讀框架」或「ORF」係指除了閱讀框架之末端以外，在給定閱讀框架內不含有終止密碼子之序列。
可操作地連接 ：如本文所用，片語「可操作地連接」係指在兩個或更多個分子、構築體、轉錄本、實體、部分或其類似物之間的功能性連接。作為非限制性實例，當啟動子序列控制及/或調控核苷酸序列之轉錄時，啟動子「可操作地連接」至核苷酸序列。
患者 ：如本文所用，「患者」係指可能尋求或需要治療、要求治療、正在接受治療、即將接受治療的個體，或受到經過訓練的專業人員針對特定疾病或病況之照護的個體。
有效負載 ：如本文所用，「有效負載」或「有效負載區域」係指一或多個由病毒基因體編碼或在病毒基因體內編碼之聚核苷酸或聚核苷酸區域，或此類聚核苷酸或聚核苷酸區域之表現產物，例如轉殖基因、編碼多肽或多元多肽之聚核苷酸或調節核酸或調控核酸。
有效負載 Bac ：如本文所用，「有效負載Bac」係指包含有效負載構築體及/或區域之桿狀病毒。在一些實施例中，有效負載Bac之有效負載構築體及/或區域包含編碼有效負載之聚核苷酸。
有效負載 BIIC ：如本文所用，「有效負載BIIC」係指包含一或多個桿狀病毒(例如有效負載Bac)之昆蟲細胞，該一或多個桿狀病毒包含有效負載構築體及/或區域。在一些實施例中，有效負載構築體及/或區域包含編碼有效負載之聚核苷酸。在一些實施例中，昆蟲細胞為Sf9細胞。
有效負載構築體 ：如本文所用，「有效負載構築體」為包含聚核苷酸區域之一或多個載體構築體，該聚核苷酸區域編碼或包含在一側或兩側上側接有反向末端重複(ITR)序列的有效負載。有效負載構築體可呈遞在病毒生產細胞中複製之模板，以生產治療性病毒基因體。
有效負載構築體載體 ：如本文所用，「有效負載構築體載體」為編碼或包含有效負載構築體，及用於在細菌細胞中複製及表現有效負載構築體之調控區的載體。
有效負載構築體表現載體 ：如本文所用，「有效負載構築體表現載體」為以下載體，其編碼或包含有效負載構築體且進一步包含一或多個編碼或包含用於在病毒複製細胞中進行病毒表現之組分的聚核苷酸區域。
肽 ：如本文所用，「肽」小於或等於50個胺基酸長，例如為約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
醫藥學上可接受 ：片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內，適用於與人類及動物之組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，與合理益處/風險比相匹配的彼等化合物、材料、組合物及/或劑型。
醫藥學上可接受之賦形劑 ：如本文所用之片語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指除本文所描述之化合物以外的任何成分(例如，能夠懸浮或溶解活性化合物之媒劑)且其特性為在患者中實質上無毒且非發炎性。賦形劑可包含例如：抗黏劑、抗氧化劑、黏合劑、包衣、壓縮助劑、崩解劑、染料(顏料)、潤膚劑、乳化劑、填充劑(稀釋劑)、成膜劑或包衣、調味劑、芳香劑、助滑劑(流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸附劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑及水合用水。例示性賦形劑包含但不限於：丁基化羥基甲苯(BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣(二元)、硬脂酸鈣、交聯羧甲纖維素、交聯聚乙烯吡咯啶酮、檸檬酸、交聯聚維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露糖醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚維酮、預膠凝化澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥基乙酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化鈦、維生素A、維生素E、維生素C及木糖醇。
醫藥學上可接受之鹽 ：本發明亦包含本文所描述之化合物之醫藥學上可接受之鹽。如本文所用，「醫藥學上可接受之鹽」係指所揭示之化合物之衍生物，其中親本化合物藉由將現有酸或鹼部分轉化為其鹽形式(例如藉由使游離鹼基團與適合有機酸反應)來修飾。醫藥學上可接受之鹽的實例包含但不限於鹼性殘基(諸如胺)之無機酸鹽或有機酸鹽；酸性殘基(諸如羧酸)之鹼金屬鹽或有機鹽；及其類似物。代表性酸加成鹽包含乙酸鹽、乙酸、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯磺酸、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及其類似物。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包含鈉、鋰、鉀、鈣、鎂及其類似物，以及無毒性銨、四級銨及胺陽離子，其包含但不限於銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺及其類似物。本發明之醫藥學上可接受之鹽包含由例如無毒無機酸或有機酸形成之親本化合物的習知無毒鹽。本發明之醫藥學上可接受之鹽可藉由習知化學方法由含有鹼性或酸性部分之親本化合物合成。一般而言，可藉由使此等化合物之游離酸或鹼形式與化學計算量之適當鹼或酸於水中或有機溶劑中，或兩者之混合物中反應來製備此類鹽；一般而言，可使用非水性介質，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。適合鹽之清單見於Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁、Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use , P.H. Stahl及C.G. Wermuth (編), Wiley-VCH, 2008以及Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science , 66, 1-19 (1977)，其內容各自以全文引用之方式併入本文中，只要其不與本發明衝突。
醫藥學上可接受之溶劑合物 ：如本文所用之術語「醫藥學上可接受之溶劑合物」意謂本發明化合物，其中適合溶劑之分子併入晶格中。適合的溶劑在所投與之劑量下為生理學上可耐受的。舉例而言，溶劑合物可藉由結晶、再結晶或沈澱自包含有機溶劑、水或其混合物之溶液製備。適合溶劑之實例為乙醇、水(例如單水合物、二水合物及三水合物)、N -甲基吡咯啶酮(NMP)、二甲亞碸(DMSO)、N,N ' -二甲基甲醯胺(DMF)、N,N ' -二甲基乙醯胺(DMAC)、1,3-二甲基-2-咪唑啶酮(DMEU)、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氫-2-(1H)-嘧啶酮(DMPU)、乙腈(ACN)、丙二醇、乙酸乙酯、苯甲醇、2-吡咯啶酮、苯甲酸苯甲酯及其類似者。當水為溶劑時，溶劑合物稱為「水合物」。
藥物動力學 ：如本文所用，「藥物動力學」係指分子或化合物在涉及確定向活生物體投與之物質的結果時的任何一或多種特性。藥物動力學分成若干領域，包含吸收、分佈、代謝及排泄之程度及速率。此通常稱為ADME，其中：(A)吸收為物質進入血液循環之過程；(D)分佈為物質在整個體液及身體組織中之分散或擴散；(M)代謝(或生物轉化)為親本化合物至子體代謝物之不可逆轉化；及(E)排泄(或消除)係指物質自身體之消除。在罕見情況下，一些藥物在身體組織中不可逆地聚積。
多肽 ：如本文所用，「多肽」係指最通常藉由肽鍵連接在一起之胺基酸殘基(天然或非天然)之聚合物。如本文所用，該術語係指具有任何尺寸、結構或功能之蛋白質、多肽及肽。在一些情況下，所編碼之多肽小於約50個胺基酸，且該多肽隨後稱為肽。若多肽為肽，則其將為至少約2、3、4或至少5個胺基酸殘基長。因此，多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段及前述者之其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單分子或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽，且可為締合或連接的。術語多肽亦可適用於其中一或多個胺基酸殘基為對應天然存在之胺基酸之人工化學類似物的胺基酸聚合物。
物理化學 ：如本文所用，「物理化學」意謂具有或涉及物理及/或化學特性。
預防 (preventing) ：如本文所用，術語「預防(preventing/prevention)」係指部分或完全地延遲感染、疾病、病症及/或病況之發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病況之一或多種症狀、特徵或臨床表現的發作；部分或完全地延遲特定感染、疾病、病症及/或病況之一或多種症狀、特徵或表現的發作；部分或完全地延遲感染、特定疾病、病症及/或病況之進展；及/或降低患上與感染、疾病、病症及/或病況相關之病變的風險。
增殖 ：如本文所用，術語「增殖」意謂生長、擴增或增加或引起快速生長、擴增或增加。「增殖性」意謂具有增殖能力。「抗增殖性」意謂具有與增殖特性相對或相反之特性。
預防 (prophylactic) ：如本文所用，「預防」係指用於預防疾病擴散之治療或作用時程。
預防 (prophylaxis) ：如本文所用，「預防」係指為維持健康並預防疾病擴散而採用之措施。
所關注之蛋白質 ：如本文所用，術語「所關注之蛋白質」或「所需蛋白質」包含本文所提供之蛋白質及其片段、突變體、變異體及改變形式。
近端 ：如本文所用，術語「近端」意謂位於較靠近中心或所關注之點或區域處。
經純化 ：如本文所用，「純化(purify)」、「經純化(purified)」、「純化(purification)」意謂自非所需組分、材料污物、混雜物或缺陷品變得實質上純的或乾淨的。「經純化」係指純的狀態。「純化」係指變純的方法。
區域 (region) ：如本文所用，術語「區域」係指區(zone)或一般區域(area)。在某些實施例中，當提及蛋白質或蛋白質模組時，區域可包含沿著蛋白或蛋白模組之線性胺基酸序列，或可包含三維區域、抗原決定基及/或抗原決定基簇。在某些實施例中，區域包含末端區域。如本文所用，術語「末端區域」係指位於既定藥劑之端部或末端處之區域。當提及蛋白質時，末端區域可包含N端及/或C端。N端係指包含具有游離胺基之胺基酸的蛋白質末端。C端係指包含具有游離羧基之胺基酸的蛋白質末端。因此，N端及/或C端區域可包含N端及/或C端以及周圍的胺基酸。在某些實施例中，N端及/或C端區域包含約3個胺基酸至約30個胺基酸、約5個胺基酸至約40個胺基酸、約10個胺基酸至約50個胺基酸、約20個胺基酸至約100個胺基酸及/或至少100個胺基酸。在某些實施例中，N端區域可包含任何長度之胺基酸，其包含N端但不包含C端。在某些實施例中，C端區域可包含任何長度之胺基酸，其包含C端但不包含N端。
在某些實施例中，當提及聚核苷酸時，區域可包含沿著聚核苷酸之線性核酸序列，或可包含三維區域、二級結構或三級結構。在某些實施例中，區域包含末端區域。如本文所用，術語「末端區域」係指位於既定藥劑之端部或末端處之區域。當提及聚核苷酸時，末端區域可包含5'端及3'端。5'端係指包含具有游離磷酸酯基團之核酸的聚核苷酸末端。3'端係指包含具有游離羥基之核酸的聚核苷酸末端。因此，5'及3'區域可包含5'端及3'端以及周圍的核酸。在某些實施例中，5'端及3'端區域包含約9個核酸至約90個核酸、約15個核酸至約120個核酸、約30個核酸至約150個核酸、約60個核酸至約300個核酸及/或至少300個核酸。在某些實施例中，5'區域可包含任何長度之核酸，其包含5'端但不包含3'端。在某些實施例中，3'區域可包含任何長度之核酸，其包含3'端但不包含5'端。
RNA 或 RNA 分子 ：如本文所用，術語「RNA」或「RNA分子」或「核糖核酸分子」係指核糖核苷酸之聚合物；術語「DNA」或「DNA分子」或「脫氧核糖核酸分子」係指脫氧核糖核苷酸之聚合物。DNA及RNA可分別例如藉由DNA複製及DNA轉錄天然合成；或化學合成。DNA及RNA可為單股(亦即分別為ssRNA或ssDNA)或多股(例如雙股，亦即分別為dsRNA及dsDNA)。如本文所用，術語「mRNA」或「信使RNA」係指編碼一或多條多肽鏈之胺基酸序列的單股RNA。
RNA 干擾或 RNAi ：如本文所用，術語「RNA干擾」或「RNAi」係指由RNA分子介導的引起對應蛋白質編碼基因之表現受到抑制或干擾或「靜默」的序列特異性調控機制。已在許多類型之生物體中觀測到RNAi，該等生物體包含植物、動物及真菌。RNAi出現在天然移除外源RNA (例如病毒RNA)之細胞中。天然RNAi經由自游離dsRNA裂解之片段前進，其將降解機制引導至其他類似RNA序列。RNAi受RNA誘導靜默複合物(RNA-induced silencing complex，RISC)控制且由細胞細胞質中之短/小dsRNA分子起始，其中其與催化RISC組分阿爾戈(argonaute)相互作用。可將dsRNA分子外源地引入細胞中。外源性dsRNA藉由活化核糖核酸酶蛋白Dicer起始RNAi，該Dicer結合且裂解dsRNA以生產具有21-25個鹼基對之雙股片段，其中各端上具有若干未配對突出鹼基。此等短雙股片段稱為小干擾RNA (siRNA)。
樣品 ：如本文所用，術語「樣品」或「生物樣品」係指其組織、細胞或組成部分之子組(例如，體液，包含但不限於血液、黏液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、尿液、陰道液及精液)。樣品進一步可包含由完整生物體或其組織、細胞或組成部分之子組或其級分或部分製備的均質物、溶解物或提取物，包含但不限於例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液，皮膚、呼吸道、腸道及生殖泌尿道之外部切片，淚液、唾液、乳汁、血球、腫瘤、器官。樣品進一步係指培養基，諸如營養培養液或凝膠，其可含有細胞組分，諸如蛋白質或核酸分子。
自補病毒粒子 ：如本文所用，「自補病毒粒子」為包含至少兩種組分的粒子，這兩種組分為蛋白質衣殼及封入衣殼內之編碼自補基因體之聚核苷酸序列。
有義股 ：如本文所用，術語siRNA分子之「有義股」或「第二股」或「隨從股」係指與反義股或第一股互補之股。siRNA分子之反義股及有義股經混雜以形成雙螺旋結構。如本文所用，「siRNA雙螺旋體」包含siRNA股，該siRNA股具有與用於靜默之所靶向基因之mRNA的約10-50個核苷酸之部分的足夠互補性，及具有足夠互補性以與另一siRNA股形成雙螺旋體之siRNA股。
短干擾 RNA 或 siRNA ：如本文所用，術語「短干擾RNA」、「小干擾RNA」或「siRNA」係指包含在約5-60個之間的能夠導引或介導RNAi之核苷酸(或核苷酸類似物)的RNA分子(或RNA類似物)。在某些實施例中，siRNA分子包含在約15-30個之間的核苷酸或核苷酸類似物，諸如約16-25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、約18-23個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)、約19-22個之間的核苷酸(或核苷酸類似物) (例如19、20、21或22個核苷酸或核苷酸類似物)、約19-25個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)及約19-24個之間的核苷酸(或核苷酸類似物)。術語「短」siRNA係指包含5-23個核苷酸，諸如21個核苷酸(或核苷酸類似物)，例如19、20、21或22個核苷酸之siRNA。術語「長」siRNA係指包含24-60個核苷酸，諸如約24-25個核苷酸，例如23、24、25或26個核苷酸之siRNA。短siRNA在一些情況下可包含少於19個核苷酸，例如16、17或18個核苷酸、或少至5個核苷酸，其限制條件為較短的siRNA保留介導RNAi之能力。同樣地，長siRNA在一些情況下可包含超過26個核苷酸，例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60個核苷酸，其限制條件為較長的siRNA保留介導RNAi或轉譯抑制而不需進一步加工、例如酶促加工為短siRNA的能力。siRNA可為單股RNA分子(ss-siRNA)或包含有義股及反義股之雙股RNA分子(ds-siRNA)，有義股與反義股混雜形成雙螺旋結構，該雙螺旋結構稱為siRNA雙螺旋體。
信號序列 ：如本文所用，片語「信號序列」係指可引導蛋白質之轉運或定位的序列。
單個單位劑量 ：如本文所用，「單個單位劑量」為以一個劑量/一次性/單個途徑/單個接觸點(亦即單個投與事件)投與的任何治療劑之劑量。在某些實施例中，單個單位劑量以離散劑型(例如錠劑、膠囊、貼片、裝藥注射器、小瓶等)提供。
類似性 ：如本文所用，術語「類似性」係指聚合分子之間，例如聚核苷酸分子(例如DNA分子及/或RNA分子)之間及/或多肽分子之間的整體相關性。聚合分子彼此之類似性百分比的計算可按與一致性百分比之計算相同的方式進行，不同之處在於計算類似性百分比時要考慮如此項技術中所理解之保守性取代。
分次劑量 ：如本文所用，「分次劑量」為將單個單位劑量或每日總劑量分成兩個或更多個劑量。
穩定的 ：如本文所用，「穩定的」係指化合物足夠穩固以經受住自反應混合物中分離得到適用純度，且在某些實施例中能夠調配成有效治療劑。
經穩定 ：如本文所用，術語「使……穩定」、「經穩定」、「經穩定區域」意謂使之穩定或變得穩定。
個體 ：如本文所用，術語「個體」或「患者」係指可例如出於實驗、診斷、預防及/或治療目的而向其投與根據本發明之組合物的任何生物體。典型個體包含動物(例如哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人類靈長類動物及人類)及/或植物。個體或患者可能尋求或需要治療，要求治療，正在接受治療、即將接受治療，或受到經過訓練的專業人員針對特定疾病或病況之照護。
實質上 ：如本文所用，術語「實質上」係指展現總或接近總範圍或程度之所關注特徵或特性之定性條件。生物技術中之一般熟習此項技術者應理解，生物及化學現象很少(若曾有)進行完全及/或繼續進行至完全，或達成或避免絕對結果。因此本文中使用術語「實質上」以獲得許多生物及化學現象中所固有的完整性之潛在缺乏。
實質上相等 ：如本文所用，在其與各劑量之間的時間差異相關時，該術語意謂加/減2%。
實質上同時 ：如本文所用且在其與複數個劑量相關時，該術語意謂在2秒之內。
罹患 ：「罹患」疾病、病症及/或病況之個體已診斷患有該疾病、病症及/或病況或呈現其一或多種症狀。
易患 ：「易患」疾病、病症及/或病況之個體尚未診斷患有該疾病、病症及/或病況及/或可能未展現其症狀，但具有患上疾病或生產其症狀之傾向。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況(例如癌症)之個體可由以下中之一或多者表徵：(1)與疾病、病症及/或病況生產相關之基因突變；(2)與疾病、病症及/或病況生產相關之基因多形性；(3)與疾病、病症及/或病況相關之蛋白質及/或核酸的表現及/或活性增加及/或減少；(4)與疾病、病症及/或病況生產相關之習慣及/或生活方式；(5)疾病、病症及/或病況之家族病史；及(6)暴露於與疾病、病症及/或病況生產相關之微生物及/或經該微生物感染。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況之個體將患上該疾病、病症及/或病況。在某些實施例中，易患疾病、病症及/或病況之個體將不患上該疾病、病症及/或病況。
持續釋放 ：如本文所用，術語「持續釋放」係指醫藥組合物或化合物在特定時間段內的釋放曲線符合一定釋放速率。
合成 ：術語「合成」意謂藉由人的手生產、製備及/或製造。本發明之聚核苷酸或多肽或其他分子之合成可為化學合成或酶合成。
靶向 ：如本文所用，「靶向」意謂設計及選擇核酸序列的過程，該核酸序列將與標靶核酸混雜且誘導所需作用。
標靶細胞 ：如本文所用，「標靶細胞」係指任何一或多種所關注之細胞。細胞可見於活體外、活體內、原位或生物體之組織或器官中。生物體可為動物，諸如哺乳動物、人類或人類患者。
末端區域 ：如本文所用，術語「末端區域」係指連接之核苷或胺基酸(分別為聚核苷酸或多肽)區域之5'或3'端上之區域。
末端最佳化 ：當提及核酸時，術語「末端最佳化」意謂核酸之末端區域相比於原生或野生型末端區域以一些方式經改良，例如經密碼子最佳化。
治療劑 ：術語「治療劑」係指當向個體投與時，具有治療、診斷及/或預防作用及/或引起所需生物學及/或藥理學作用之任何藥劑。
治療有效量 ：如本文所用，術語「治療有效量」意謂當向罹患或易患感染、疾病、病症及/或病況之個體投與時，足以治療該感染、疾病、病症及/或病況，改善其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的所遞送之藥劑(例如核酸、藥物、治療劑、診斷劑、預防劑等)之量。在某些實施例中，治療有效量將以單次劑量提供。在某些實施例中，治療有效量以包含複數個劑量之給藥方案投與。熟習此項技術者應瞭解，在某些實施例中，若單位劑型包含在作為此類給藥方案之一部分投與時有效的量，則該單位劑型可視為包含治療有效量之特定藥劑或實體。
治療有效結果 ：如本文所用，術語「治療有效結果」意謂在罹患或易患感染、疾病、病症及/或病況之個體中足以治療該感染、疾病、病症及/或病況、改善其症狀、對其進行診斷、預防及/或延遲其發作的結果。
每日總劑量 ：如本文所用，「每日總劑量」為在24小時時段內給予或以處方開具之量。其可以單個單位劑量形式進行投與。
轉染 ：如本文所用，術語「轉染」係指將外源性核酸引入細胞中之方法。轉染方法包含但不限於化學方法、物理處理及陽離子型脂質或混合物。
治療 ：如本文所用，術語「治療」係指部分或完全緩解、改善、改良、減輕特定感染、疾病、病症及/或病況、延遲其發作、抑制其進展、降低其嚴重程度及/或降低其一或多種症狀或特徵之發生率。舉例而言，「治療」癌症可指抑制腫瘤之存活、生長及/或擴散。出於降低患上與疾病、病症及/或病況相關之病變的風險的目的，可向未展現該疾病、病症及/或病況之病徵的個體及/或向僅展現該疾病、病症及/或病況之早期病徵的個體投與治療。
未經修飾 ：如本文所用，「未經修飾」係指任何以任何方式改變之前的物質、化合物或分子。未經修飾可指，但並不始終指生物分子之野生型或原生形式。分子可進行一系列修飾，由此，各經修飾分子可充當後一修飾之「未經修飾」的起始分子。
載體 ：如本文所用，「載體」為轉運、轉導或以其他方式充當異源分子運載體的任何分子或部分。本發明之載體可以重組方式生產，且可基於及/或可包含腺相關病毒(AAV)親本或參考序列。此類親本或參考AAV序列可充當用於對載體進行工程改造之原始、第二、第三或後續序列。在非限制性實例中，此類親本或參考AAV序列可包含以下序列中之任何一或多者：編碼多肽或多元多肽之聚核苷酸序列，該序列可為野生型或自野生型修飾，且該序列可編碼蛋白質、蛋白質域或蛋白質之一或多個次單元的全長或部分序列；包含調節或調控核酸之聚核苷酸，該序列可為野生型或自野生型修飾；及轉殖基因，其可自野生型序列修飾或可不自野生型序列修飾。此等AAV序列可充當一或多個密碼子(在核酸水準)或胺基酸(在多肽水準)之「供體」序列或一或多個密碼子(在核酸水準)或胺基酸(在多肽水準)之「受體」序列。
病毒基因體 ：如本文所用，「病毒基因體」或「載體基因體」係指囊封於AAV粒子中之核酸序列。 V.等效物及範疇
最多使用常規實驗，熟習此項技術者將識別或能夠確定根據本文所描述之本發明之特定實施例的許多等效物。本發明之範疇不意欲受限於以上描述，而實際上如隨附申請專利範圍中所闡述。
在申請專利範圍中，除非相反地指示或另外自上下文顯而易見，否則諸如「一(a/an)」及「該」之冠詞可意謂一或大於一。除非相反地指示或另外自上下文中顯而易見，否則若一個、大於一個或所有群組成員存在於給定產物或方法中、用於給定產物或方法中或以其他方式與給定產物或方法相關，則在該群組的一或多個成員之間包含「或」的申請專利範圍或描述視為滿足。本發明包含群組中恰好一個成員存在於、用於給定產物或方法中或以其他方式與給定產物或方法相關之實施例。本發明包含大於一個或全部群組成員存在於、用於給定產物或方法中或以其他方式與給定產物或方法相關之實施例。
亦應注意，術語「包含」意欲為開放的且准許但不要求包括額外要素或步驟。當本文使用術語「包含」時，亦因此涵蓋及揭示術語「由……組成」。
在給出範圍的情況下，包含端點。此外，應理解，除非另有指示或以其他方式自上下文及一般熟習此項技術者之理解顯而易見，否則表示為範圍之值可在本發明之不同實施例中採用所陳述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另外明確規定，否則達到該範圍下限之單位的十分之一。
另外，應理解，屬於先前技術內之本發明之任何特定實施例可自任何一或多個技術方案中明確排除。因為此類實施例視為一般熟習此項技術者所已知的，所以可對其進行排除，即使未在本文中明確地闡述該排除。出於任何原因，無論是否與先前技術之存在有關，本發明之組合物之任何特定實施例(例如任何抗生素、治療或活性成分；任何生產方法；任何使用方法；等)可自任何一或多個技術方案中排除。
應理解，已使用之文字係描述性而非限制性文字，且可在不背離本發明在其較廣泛態樣中之真實範疇及精神的情況下，在隨附申請專利範圍之範圍內作出改變。
儘管已經相對於所描述之若干實施例以一定的長度及一些特殊性描述本發明，但並非意欲本發明應受限於任何此類細節或實施例或任何特定實施例，而應參考隨附申請專利範圍進行解釋，以便鑒於先前技術提供對此類申請專利範圍之儘可能最廣泛的解釋，並因此有效地涵蓋本發明之預期範疇。
所有公開案、專利申請案、專利及所提及之其他參考案均以全文引用之方式併入本文中。在有衝突之情況下，將以本說明書(包含定義)為準。另外，章節標題、材料、方法及實例僅為說明性的而不意欲為限制性的。 實例  實例1：生產源Rep/Cap BIIC (A)  CP BEV池
將Sf9 CB之一個小瓶在125 mL搖瓶中解凍(37℃，使用水浴，1-5分鐘，直至冰晶體消散)，及隨後稀釋至19-20 mL工作體積之Hyclone SFX昆蟲細胞培養基中。搖瓶在27℃ (135 rpm振盪，0% v/v CO2 )下在第一擴增(P0，3-4天)中培育，直至Sf9細胞混合物之細胞密度擴增至4.0-6.0×106 個細胞/毫升。
隨後使用較大搖瓶接種細胞混合物及經由多個額外擴增步驟擴增，每個擴增步驟之目標輸出密度為4.0-6.0×106 個細胞/毫升，以允許在後續擴增步驟中之恆定接種密度為0.5-3.0×106 個細胞/毫升。在27℃下在135 rpm振盪(≤2 L工作體積)或90 rpm振盪 (＞2 L工作體積)下持續3-5天(0% v/v CO2 )完成擴增。完成以下額外擴增：(i)在1.0 L燒瓶中擴增至200 mL工作體積；及(ii)在3 L燒瓶中擴增至1000 mL工作體積。
藉由組合5 μg Rep/Cap穿梭載體材料與375 μL WFI水來製備Rep/Cap轉染混合物。將經稀釋穿梭載體混合物與30 µL Promega FuGENE HD (轉染劑)及額外345 µL WFI水組合，及隨後在27℃下培育15分鐘以得到轉染混合液。
將25 mL經擴增Sf9細胞混合物接種至125 mL燒瓶(1.0×106 個細胞/毫升接種濃度)中且擴增至目標感染密度為2.5-4.0×106 個細胞/毫升。將轉染混合液添加至125 mL燒瓶中且在27℃下培育5-7天(0% v/v CO2 ，135 rpm攪拌)。將所得混合物在50 mL錐形管中離心5分鐘，且收集含有P1 BEV之上清液及與其他P1 BEV上清液合併。將P1 BEV池儲存在5℃下。
將經擴增Sf9細胞混合物接種於Cellstar 6孔細胞聚苯乙烯培養盤中(2 mL/孔，0.5-1.0×106 個細胞/毫升接種濃度)，輕輕搖動以均勻分佈細胞，隨後在27℃下培育90分鐘(0% v/v CO2 ，0 rpm攪拌)。用Hyclone SFX昆蟲細胞培養基將P1 BEV連續稀釋至目標稀釋度為1.0×107 個BEV/毫升，及隨後將1 mL經稀釋P1 BEV混合物添加至各孔中，輕輕搖動以均勻分佈P1 BEV。在27℃下培育感染混合物90分鐘(0% v/v CO2 ，0 rpm攪拌)。
瓊脂糖凝膠藉由將4% w/v瓊脂糖1:3與Life Technologies Sf-900培養基覆蓋物組合(在70℃下熔融瓊脂糖，冷卻至37℃用於組合)來製備。隨後向各孔中添加2 mL瓊脂糖覆蓋物，且將盤維持在室溫下15-20分鐘，以使瓊脂糖凝膠硬化。隨後在27℃下培育經覆蓋盤5-14天(0% v/v CO2 ，0 rpm攪拌)，直至觀察到空斑形成。經由測試及空斑檢查處理各孔中之空斑，以得到用於純系空斑純化之單一空斑(亦即單一空斑擴增)。使用Sf9細胞混合物擴增單一空斑及在27℃下培育3-5天(0% v/v CO2 ，0 rpm攪拌)。使用在50 mL錐形管中離心5分鐘收穫所得CP1 BEV及將含有CP1 BEV之上清液收集至CP1 BEV池中。 BEV感染/BIIC生產
使用較大搖瓶接種Sf9細胞混合物及經由多個擴增步驟擴增，每個擴增步驟之目標輸出密度為4.0-6.0×106 個細胞/毫升，以允許在後續擴增步驟中之恆定接種密度為0.5-2.0×106 個細胞/毫升。在27℃下在135 rpm振盪(≤2 L工作體積)或90 rpm振盪 (＞2 L工作體積)下持續3-5天(0% v/v CO2 )完成擴增。完成以下擴增：(i)在1.0 L燒瓶中擴增至200 mL工作體積；(ii)在3 L燒瓶中擴增至1000 mL工作體積及(iii)在5 L燒瓶中擴增至2500 mL工作體積，最終輸出密度為2.0-4.0×106 個細胞/毫升。
將200 mL經擴增Sf9細胞混合物接種於1.0 L燒瓶(1.0×106 個細胞/毫升接種密度)中及擴增至活感染細胞密度為≥2.0×106 個細胞/毫升，及隨後用0.01 MOI之CP1 BEV感染。隨後培育經感染細胞及在27℃下擴增48-80小時(0% v/v CO2 ，135 rpm)，直至細胞達到≥2.0×106 個細胞/毫升(VCD)、≥16.5 µm細胞直徑及≥75%細胞存活率。經感染細胞藉由向下離心(聚丙烯離心管，5分鐘)及使細胞集結粒以4.0×107 個細胞/毫升再懸浮於Hyclone SFX昆蟲細胞培養基中，接著添加300 mM海藻糖、14% v/v DMSO及額外SFX培養基，得到目標VCD為2.0×106 個細胞/毫升來收穫。Rep/Cap源BIIC等分至2 mL或5 mL冷凍小瓶中，及使用對照速率冷凍器冷凍降至≤-65℃，及隨後儲存在-80℃下或LN2 蒸汽中。 實例2.生產源轉殖基因BIIC (A)
根據實例1生產轉殖基因源BIIC，其中轉殖基因穿梭載體材料而非Rep/Cap穿梭載體材料用於P1 BEV生產。 實例3.生產源Rep/Cap BIIC (B)  CP BEV池
將Sf9 CB之一個小瓶在125 mL搖瓶中解凍(37℃，使用水浴，1-5分鐘，直至冰晶體消散)，及隨後稀釋至40 mL工作體積之Hyclone SFX昆蟲細胞培養基中。使搖瓶培育第一擴增(P0，3-4天)，直至Sf9細胞混合物之細胞密度擴增至4.0-6.0×106 個細胞/毫升。
隨後使用較大搖瓶接種培養物及經由多個額外擴增步驟擴增，每個擴增步驟之目標輸出密度為4.0-6.0×106 個細胞/毫升，以允許在後續擴增步驟中之恆定接種密度為0.5-3.0×106 個細胞/毫升。擴增在27℃下3-5天完成及包含：(i)在1.0 L燒瓶(P1)中擴增至200 mL工作體積；及(ii)在3 L燒瓶(P2)中擴增至1000 mL工作體積。
Rep/Cap轉染混合物藉由將30 µg Rep/Cap穿梭載體材料與0.6 mL ThermoFisher Grace之昆蟲培養基(轉染培養基)組合來製備。將經稀釋穿梭載體混合物與30 µL ThermoFisher細胞轉染劑II試劑(轉染劑)及額外0.6 mL轉染培養基組合，接著在18-25℃下培育25-35分鐘，及隨後用4.8 mL轉染培養基進一步稀釋，得到轉染混合液。
將60 mL經擴增Sf9細胞混合物接種至125 mL燒瓶中及使其擴增至1.0×106 個細胞/毫升接種濃度。隨後將Sf9細胞混合物接種於6孔細胞培養盤(2 mL/孔，1.0×106 個細胞/毫升接種濃度)中。向各孔中添加1 mL轉染混合液，及在27℃下培育盤4-5小時。向各孔中添加2 mL Hyclone SFX昆蟲細胞培養基，及隨後在27℃下培育盤3-4天。將所得混合物在50 mL錐形管中離心5分鐘，及收集含有P1 BEV之上清液及與其他P1 BEV上清液合併。將P1 BEV池儲存在4-8℃下。
將經擴增Sf9細胞混合物接種於6孔細胞培養盤(2 mL/孔，0.5-1.0個細胞/毫升接種濃度)中，輕輕搖動以均勻分佈細胞，隨後在27℃下培育90分鐘。用Hyclone SFX昆蟲細胞培養基將P1 BEV連續稀釋至目標稀釋度為1.0-5.0×107 BEV，及隨後將1 mL經稀釋P1 BEV混合物添加至各孔中，輕輕搖動以均勻分佈P1 BEV。在27℃下培育感染混合物90分鐘。
瓊脂糖凝膠藉由將4% w/v瓊脂糖1:3與Life Technologies Sf-900培養基覆蓋物組合來製備。向各孔中添加瓊脂糖覆蓋物，且將盤維持在室溫下15-20分鐘，以使瓊脂糖凝膠硬化。隨後在27℃下培育經覆蓋盤10天，直至觀察到空斑形成。經由測試及空斑檢查處理各孔中之空斑，以得到用於純系空斑純化之單一空斑(亦即單一空斑擴增)。使用120 mL池之Sf9細胞混合物在500 mL燒瓶中擴增單一空斑，在27℃下培育4天。使用在50 mL錐形管中離心5分鐘收穫所得CP2 BEV及將含有CP2 BEV之上清液收集至CP2 BEV池中。 BEV感染/BIIC生產
接種Sf9細胞混合物及在5 L燒瓶中經由多個擴增步驟擴增至3000 mL工作體積，最終感染密度為1.0×106 個細胞/毫升。隨後用0.01 MOI之CP2 BEV感染經擴增Sf9細胞混合物。將經感染細胞在27℃下培育及擴增48-36小時，隨後藉由向下離心(聚丙烯離心管，5分鐘)及使細胞集結粒以2.0×107 個細胞/毫升再懸浮於Hyclone SFX昆蟲細胞培養基中，接著添加300 mM海藻糖、14% v/v DMSO及額外SFX培養基，得到目標VCD為2.0×106 個細胞/毫升來收穫。Rep/Cap源BIIC等分至2 mL或5 mL冷凍小瓶中，及使用對照速率冷凍器冷凍降至≤-65℃，及隨後儲存在-80℃下或LN2 蒸汽中。 實例4.生產源轉殖基因BIIC (B)
根據實例3生產轉殖基因源BIIC，其中轉殖基因穿梭載體材料而非Rep/Cap穿梭載體材料用於P1 BEV生產。 實例5.生產來自源BIIC之感染BIIC
將Sf9 9f4 CB之一個小瓶在125 mL搖瓶中解凍(37℃，使用水浴，1-5分鐘，直至冰晶體消散)，及隨後稀釋至20 mL工作體積之ESF-AF培養基中。搖瓶在27℃ (100 rpm振盪，2吋軌道直徑)下在未加濕的環境空氣、溫度調節恆溫箱中在第一擴增中培育，直至細胞密度擴增至5.0-8.0×106 個細胞/毫升之間。
隨後使用較大搖瓶接種培養物及經由多個額外擴增步驟擴增，每個擴增步驟之目標輸出密度為5.0-8.0×106 個細胞/毫升，以允許在後續擴增步驟中之恆定接種密度為1.0-4.0×106 個細胞/毫升。在27℃下在100 rpm振盪(≤2 L工作體積)或80 rpm振盪(＞2 L工作體積)下持續3-5天完成擴增。
完成以下額外擴增：(i)在500 mL燒瓶中擴增至100 mL工作體積；(ii)在1.0 L燒瓶中擴增至400 mL工作體積；(iii)在3 L燒瓶中擴增至1500 mL工作體積；以及(iv)在兩個5 L生產用燒瓶(Rep/Cap生產用燒瓶及轉殖基因生產用燒瓶)中之每一者中擴增至2500 mL工作體積。
培育Rep/Cap生產用燒瓶直至細胞濃度擴增至1.8-2.5×106 個細胞/毫升，及隨後用Rep/Cap源BIIC (Sf9:BIIC感染比率為1.0×104 細胞比細胞(c/c)，等效於1.0×105 (v/v)感染比率)感染。將經感染細胞培育72小時(目標細胞直徑≥19.0 µm，細胞培養物密度目標為≥3.0×106 個細胞/毫升)，及隨後藉由向下離心(聚丙烯離心管，在4.0℃下5分鐘)及使細胞集結粒以2.0×107 個細胞/毫升再懸浮於50% 2×冷凍培養基(858 mL/L ESF-AF培養基，140 mL/L二甲亞碸，113 mL/L海藻糖，二水合物)及50% ESF-AF培養基中來收穫。Rep/Cap感染BIIC之再懸浮培養物等分至2 mL或5 mL冷凍小瓶中及儲存於LN2 蒸汽中。
培育轉殖基因生產用燒瓶直至細胞濃度擴增至1.8-2.5×106 個細胞/毫升，及隨後用轉殖基因源BIIC (Sf9:BIIC感染比率為1.0×104 細胞比細胞(c/c)，等效於1.0×105 v/v感染比率)感染。將經感染細胞培育96-100小時(目標細胞直徑≥19.0 µm，細胞培養物密度目標為≥3.0×106 個細胞/毫升)，及隨後藉由向下離心(聚丙烯離心管，在4.0℃下5分鐘)及使細胞集結粒以2.0×107 個細胞/毫升再懸浮於50% 2×冷凍培養基(858 mL/L ESF-AF培養基，140 mL/L二甲亞碸，113 mL/L海藻糖，二水合物)及50% ESF-AF培養基中來收穫。轉殖基因感染BIIC之再懸浮培養物等分至2 mL或5 mL冷凍小瓶中及儲存於LN2 蒸汽中。 實例6.高細胞密度灌注-BIIC生產
完成研究之集合以研究在生產桿狀病毒接種體組，諸如經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)組中，使用交替灌注技術之影響。在BIIC生產期間，灌注系統與生物反應器協同使用以管理及循環生物反應器內之細胞培養基。高細胞密度ATF灌注系統支持大規模生產具有出乎意料地高的細胞密度之高品質BIIC組。 A.ATF單元之評估
病毒生產細胞根據實例2中之通用程序，使用具有某些批次(0.5 sLPM目標交換率，以2.5-3.0×106 個細胞/毫升開始，每天更換1容器體積)之XCell ATF系統在3 L燒瓶(1.5 L工作體積)中擴增。參數及結果顯示於表1 (VCD-活細胞密度(×106 個細胞/毫升)；CVB-細胞存活率(%)；ACD-平均細胞直徑(μm))以及圖4A及圖4B中。 表1.灌注對比批次分析
生物反應器條件 感染後天數 VCD ( ×106 個細胞 / 毫升 ) CVB (%) ACD (μm)
SFX 培養基批次 0 0.913 94 14.4
1 1.97 96.65 13.85
2 3.52 97.6 13.5
3 5.71 98.3 13.85
4 10.265 97.25 14.2
5 11.25 97.6 14.8
6 11.7 94.4 15.4
7 11.9 88.6 15.8
8 10.05 78.3 16.3
9 9.31 69.2 16.9
10 8.1 59.3 17.4
SFX 培養基 ATF 灌注 0 1.13 90.3 14.6
1 2.105 97.4 13.7
2 2.56 97.1 14
3 4.15 97.55 13.95
4 7.47 97.05 14.2
5 11.05 96.6 14.35
6 14.75 93.2 14.6
7 21 93.7 14.8
8 28.5 93 15.2
9 32.9 88.6 15
10 37.9 89.5 15.3
11 41.7 85 15.9
12 40 79.7 16.2
13 44.8 77 16.8
14 35 63 17.6
ESF-AF 培養基批次 0 1.31 98.7 15.1
1 1.675 99.35 14.8
2 2.56 99.5 14.3
3 3.29 98.65 14.7
4 5.16 98.05 14.9
5 8.1 98 14.95
6 11.05 97.7 15.05
7 15.9 96.6 15.8
8 14.5 94.1 17.2
9 12.9 85.5 17.1
10 12.1 82.6 16.8
11 2.55 21.2 17.7
ESF-AF 培養基 ATF 灌注 0 1.04 95.7 14.8
1 1.275 98.95 14.75
2 1.73 97.6 14.4
3 2.98 98.95 14.25
4 3.285 98.45 14.4
5 4.515 98.85 14.7
6 6.395 98.1 14.9
7 7.9 98.8 15
8 11.2 94.9 15.5
9 13.5 92.7 16.1
10 17.25 93.4 16
11 21.3 93.5 16.2
12 24.8 93.5 16.6
13 32.6 92.7 16.6
14 45.7 93.8 16.7
15 60.7 92.3 16.7
16 59.5 90.1 16.8
17 62.4 92.3 17
ATF評估研究之結果顯示：批次單元(無ATF灌注)限於約15×106 個細胞/毫升之峰值VCD，而具有ATF灌注之SFX培養基系統能夠達到約45×106 個細胞/毫升且具有ATF灌注之ESF-AF培養基系統能夠達到高於60×106 個細胞/毫升(參見圖4A)。
結果亦顯示，在6天(SFX培養基批次系統)及10天(SFX培養基批次系統)之後，批次單元(無ATF灌注)之細胞存活率顯著降低，而具有ATF灌注之SFX培養基系統能夠維持細胞存活率高於75%持續13天且具有ATF灌注之ESF-AF培養基系統能夠維持細胞存活率高於90%持續17天(參見圖4B)。 B.感染密度及規模分析
根據實例2中之通用程序(使用SFX培養基)在500 mL搖瓶(200 mL工作體積)及3 L玻璃生物反應器(1.0-1.5 L工作體積)中生產BIIC，其中目標感染細胞密度不同且目標感染MOI為0.001。將XCell ATF系統與某些批次(以2.5-3.0×106 個細胞/毫升開始，每天更換1容器體積)一起使用。將所得BIIC以2×107 個活細胞/毫升儲備及冷凍，體積為1 m。對於包括ATF灌注之系統而言，使用ATF灌注系統將低溫保存儲備培養基直接引入生物反應器中。
參數及結果顯示於表2 (VCD-活細胞密度(×106 個細胞/毫升)；CVB-細胞存活率(%)；ACD-平均細胞直徑(μm))中。在搖瓶與生物反應器之間的細胞倍增時間中未觀測到顯著影響。感染動力學在整個2.0-6.0×106 個細胞/毫升之感染密度範圍中為一致的。 表2.感染密度及規模分析
生物反應器條件 感染細胞密度 ( 個細胞 / 毫升 ) 感染後天數 VCD ( ×106 個細胞 / 毫升 ) CVB (%) ACD (μm)
500 mL 燒瓶 2×106 -1 1 94.1 13.66
0 1.82 94.6 14.6
1 3.1 94 14
2 4.8 95.8 16.2
3 5.45 93.1 17.8
4 3.17 67.1 18
5 1.53 37.7 18.1
3 L 生物反應器 無灌注 2×106 -1 0.955 98 14.3
0 1.47 98.6 13.9
1 2.72 99.2 13.7
2 4.56 98.9 14.5
3 5.01 97.2 16.8
4×106 -1 1.98 99.6 14.1
0 3.05 99.6 13.8
1 5.24 99 14.2
2 6.76 98.9 14.7
3 9.45 95.6 16.6
8×106 -1 3.82 99.4 13.9
0 6.02 99 14
1 9.09 99.4 14.7
2 10.6 98.1 15.3
3 10.9 90.8 16.8
3 L 生物反應器 灌注 2×106 -1 1.19 97.6 13.4
0 1.66 98.5 13.7
1 2.77 99 13.6
2 3.32 95.9 15.2
3 3.81 96.4 17
10×106 批次 1 -5 1.87 98.2 14
-4 2.12 96.9 14.1
-3 3.31 97.4 14.3
-2 5.93 96 14.3
-1 9.32 95.6 14.8
0 11.9 93.8 14.7
1 16.2 87.6 14.8
2 16 78.8 15.2
3 16.3 79.3 16.3
10×106 批次 2 -4 2.27 98.4 13.8
-3 3.42 95.3 13.7
-2 5.52 95.2 13.7
-1 8.43 95 14.2
0 9.05 84.6 14.9
1 11.8 80.8 16.1
2 14.2 87.9 16.4
3 15.2 81.4 17
感染密度及規模分析之結果顯示ATF灌注系統能夠維持VCD至超過15.0×106 個細胞/毫升(對於感染密度)或10×106 個細胞/毫升。 C.氣體分佈器分析
根據實例2中之通用程序(使用SFX培養基)在500 mL搖瓶(200 mL工作體積)及2 L玻璃生物反應器(1.3 L工作體積，一個生物反應器使用環型巨型分佈器(R)，一個生物反應器使用微型分佈器(M))中生產BIIC，其中感染細胞密度不同且目標感染MOI為0.001。將XCell ATF系統與某些批次(以2.5-3.0×106 個細胞/毫升開始，每天更換1容器體積)一起使用。
參數及結果顯示於表3 (VCD-活細胞密度(×106 個細胞/毫升)；CVB-細胞存活率(%)；ACD-平均細胞直徑(μm))中。
在不同類型之分佈器中未觀測到對感染動力學之影響，且細胞生長趨勢一般顯示出在整個分佈器類型(甚至在較高感染密度之情況下)中為一致的。針對微型分佈器條件收穫時存在較低存活率，但分佈器選擇(巨型對比微型)對細胞生長參數具有總體極小影響。 表3.氣體分佈器分析
生物反應器條件 感染細胞密度 ( 個細胞 / 毫升 ) 感染後天數 VCD (×106 個細胞 / 毫升 ) CVB (%) ACD (μm)
500 mL 燒瓶 2×106 -1 1 94.1 13.66
0 1.82 94.6 14.6
1 3.1 94 14
2 4.8 95.8 16.2
3 5.45 93.1 17.8
4 3.17 67.1 18
5 1.53 37.7 18.1
2 L 生物反應器 灌注 環型巨型分佈器 10×106 -5 0.95 99.2 13.6
-4 1.29 98.7 14
-3 2.4 99.5 14.3
-2 3.56 99.2 13.5
-1 6 98.3 13.8
0 9.75 96.7 14
1 12.7 97.3 14.2
2 16.8 96.4 14.8
3 19 91.7 17.5
2 L 生物反應器 灌注 微 型分佈器 20×106 -5 2.6 99 13.6
-4 4.44 99.7 13.9
-3 7.08 99 13.9
-2 12 97.3 14.3
-1 16 91.8 15
0 20.9 94.1 15.2
1 23.5 90.2 15.9
2 26.3 85.1 16.15
3 31.9 72.7 16.5
D.BIIC-類型分析
根據實例2中之通用程序(使用SFX培養基)在500 mL搖瓶(200 mL工作體積)及2 L玻璃生物反應器(1.0-1.5 L工作體積，3次操作)中生產BIIC。根據實例1中之通用程序(使用SFX培養基)，亦在2 L玻璃生物反應器(1.0-1.5 L工作體積，3次操作)中生產BIIC。使用不同目標感染細胞密度及0.001之目標感染MOI生產樣品。將XCell ATF系統與某些批次(以2.5-3.0×106 個細胞/毫升開始，每天更換1容器體積)一起使用。將所得BIIC以2×107 個活細胞/毫升儲備及冷凍，體積為1 m。對於包括ATF灌注之系統而言，使用ATF灌注系統將低溫保存儲備培養基直接引入生物反應器中。
參數及結果顯示於表4 (VCD-活細胞密度(×106 個細胞/毫升)；CVB-細胞存活率(%)；ACD-平均細胞直徑(μm))中。
在不同類型之BIIC及多次操作中未觀測到對感染動力學之顯著影響。細胞生長趨勢在整個BIIC類型中為一致的。 表4.BIIC-類型分析
生物反應器條件 感染細胞密度 ( 個細胞 / 毫升 ) 感染後天數 VCD (x106 個細胞 / 毫升 ) CVB (%) ACD (μm)
500 mL 燒瓶 2×106 -1 1 94.1 13.66
0 1.82 94.6 14.6
1 3.1 94 14
2 4.8 95.8 16.2
3 5.45 93.1 17.8
4 3.17 67.1 18
5 1.53 37.7 18.1
2 L 生物反應器 灌注 轉殖基因 BIIC 操作 1 2×106 -5 1.87 98.2 14
-4 2.12 96.9 14.1
-3 3.31 97.4 14.3
-2 5.93 96 14.3
-1 9.32 95.6 14.8
0 11.9 93.8 14.7
1 16.2 87.6 14.8
2 16 78.8 15.2
3 16.3 79.3 16.3
操作 2 10×106 -4 2.27 98.4 13.8
-3 3.42 95.3 13.7
-2 5.52 95.2 13.7
-1 8.43 95 14.2
0 9.05 84.6 14.9
1 11.8 80.8 16.1
2 14.2 87.9 16.4
3 15.2 81.4 17
操作 3 2×106 -5 1.66 94.7 14.2
-4 2.49 96.4 14.1
-3 4.34 99.1 14.2
-2 - - -
-1 8.37 99.4 13.2
0 13.7 95.4 14.5
1 - - -
2 30.7 95.2 15.4
3 26.4 93.2 17.2
2 L 生物反應器 灌注 Rep/Cap BIIC 操作 1 2×106 -5 2.01 96.4 14.3
-4 2.89 96.9 14.21
-3 5.76 99 14
-2 - - -
-1 9.26 97.7 13.6
0 12.9 92.7 14.5
1 - - -
2 28.3 91.9 15.3
3 27 90.3 16.1
4 23.7 84.5 17.2
操作 2 2×106 -4 1.6 98.6 14.02
-3 3.38 97.7 13.93
-2 4.55 97 13.7
-1 7.65 96.3 13.9
0 14.1 97.5 14
1 17.4 92.3 14.6
2 26.2 90.8 16
3 19.3 80.1 17.7
操作 3 2×106 -4 1.72 98.9 14.08
-3 3.2 98.1 13.93
-2 4.7 97.5 13.8
-1 8.35 96.5 13.9
0 14.2 98.1 14.2
1 20.2 92.8 14.8
2 29 92.5 15.6
3 24.5 85.2 16.6
實例7.上游-生產批量粒子池(A)
將Sf9 9f4 CB之一個小瓶在125 mL搖瓶中解凍(37℃，使用水浴，1-5分鐘，直至冰晶體消散)，及隨後稀釋至20 mL工作體積之ESF-AF培養基中。搖瓶在27℃ (130-150 rpm振盪，25 mm軌道直徑)下在未加濕的環境空氣、溫度調節恆溫箱中在第一擴增中培育約48小時，直至細胞密度擴增至5.0-8.0×106 個細胞/毫升之間。
隨後使用較大搖瓶接種培養物及經由多個額外擴增步驟擴增，每個擴增步驟之目標輸出密度為5.0-8.0×106 個細胞/毫升，以允許在後續擴增步驟中之恆定目標接種密度為1.0-4.0×106 個細胞/毫升。在27℃下在130-150 rpm振盪(≤400 mL工作體積)或100-120 rpm振盪(＞400 mL工作體積)下持續3-5天完成擴增。
完成以下額外擴增：(i)在250或500 mL燒瓶中擴增至100 mL工作體積；(ii)在1.0 L燒瓶中擴增至400 mL工作體積；(iii)在3 L燒瓶中擴增至1500 mL工作體積；以及(iv)在兩個5 L燒瓶(5000 mL總工作體積)中之每一者中擴增至2500 mL工作體積。
將經擴增培養混合物轉移至50 L GE WAVE生物反應器(0.25毫升/分鐘固定空氣噴霧，按需供氧，經溶解O2 多達40%，20 rpm搖動，9o 搖動角度，250毫升/分鐘進氣口)中，用於額外擴增(在27℃下3-5天)直至25 L工作體積，目標輸出密度為5.0-8.0×106 個細胞/毫升。隨後將培養基接種於攪拌槽GE Xcellerex生物反應器(68 rpm攪拌，0.5毫升/分鐘固定空氣噴霧，按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%，0.5毫升/分鐘頂部空間流動速率)中，及擴增(N-1生物反應器步驟，在27℃下2-3天)直至125 L工作體積，目標輸出密度為1.0-5.0×106 個細胞/毫升。
將培養混合物接種至接種密度為0.8-1.5×106 個細胞/毫升及200 L工作體積之單用途生產用生物反應器中。培養基在生物反應器(6 W/m3 葉輪，0.8毫升/分鐘固定空氣噴霧，按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%，0.8毫升/分鐘頂部空間流動速率)中進一步擴增至3.0-3.2×106 個細胞/毫升(於200 L工作體積中)。
隨後用Rep/Cap感染BIIC (1:250k v/v)及轉殖基因感染BIIC (1:80k v/v)共感染生物反應器中之細胞。培育經感染細胞144小時(6天)及收集批量收穫物以用於經由下游處理進行溶解及處理。
經由擴增及生物反應步驟中之每一者獲取樣品，以在整個上游處理中監測細胞密度及存活率。
在一個置換方案中，擴增生物反應器為Pall 200 L Allegro生物反應器，其維持35 rpm攪拌、1.3毫升/分鐘固定空氣噴霧、按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%及0.8毫升/分鐘頂部空間流動速率。
在一個置換方案中，生產用生物反應器之處理參數為41攪拌rpm (感染前)、51攪拌rpm (感染後)、2.5毫升/分鐘固定空氣噴霧、按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%及1.2毫升/分鐘頂部空間流動速率，在200 L工作體積中目標擴增至3.2-3.4×106 個細胞/毫升。
在一個置換方案中，將經擴增培養混合物轉移至Pall Allegro XRS 25 L生物反應器中進行額外擴增(25 cpm攪拌，按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%，0.3毫升/分鐘固定空氣噴霧，0.5毫升/分鐘頂部空間流動速率，在27℃下3-5天)直至10 L工作體積，目標輸出密度為5.0×106 -1.0×107 個細胞/毫升。
在一個置換方案中，N-1生物反應器為Pall 125L Allegro生物反應器(45 rpm攪拌，按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%，0.8升/分鐘空氣覆蓋，27℃容器溫度，1.5升/分鐘O2 流動速率)，目標輸出密度為5.0×106 -1.0×107 個細胞/毫升。
在一個置換方案中，N生產用生物反應器為PD 200L Allegro生物反應器(60 rpm攪拌，按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%，1.2升/分鐘空氣覆蓋，27±1℃容器溫度，2.5升/分鐘O2 流動速率)。將培養混合物接種至目標接種密度為約1.0×106 個細胞/毫升及200 L工作體積之生產用生物反應器中。培養基在生物反應器中進一步擴增至約3.2×106 個細胞/毫升(於200 L工作體積中)。隨後用Rep/Cap感染BIIC (1:300k v/v)及轉殖基因感染BIIC (1:100k v/v)共感染生物反應器中之細胞。將經感染細胞培育168小時(7天)。感染後，如下調節生物反應器條件：70 rpm攪拌、按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%、1.2升/分鐘空氣覆蓋、27℃容器溫度、3.0升/分鐘O2 流動速率。收集批量收穫物以用於經由下游處理進行溶解及處理。 實例8.上游-生產批量粒子池(B)
將Sf9 9f4 CB之一個小瓶在125 mL搖瓶中解凍(37℃，使用水浴，1-5分鐘，直至冰晶體消散)，及隨後稀釋至20 mL工作體積之ESF-AF培養基中。搖瓶在27℃ (100 rpm振盪，2吋軌道直徑)下在未加濕的環境空氣、溫度調節恆溫箱中在第一擴增中培育，直至細胞密度擴增至5.0-8.0×106 個細胞/毫升之間。
隨後使用較大搖瓶接種培養物及經由多個額外擴增步驟擴增，每個擴增步驟之目標輸出密度為4.0-8.0×106 個細胞/毫升，以允許在後續擴增步驟中之恆定接種密度為0.5-3.0×106 個細胞/毫升。在27℃下在100 rpm振盪(≤2 L工作體積)或80 rpm振盪(＞2 L工作體積)下持續3-5天完成擴增。
完成以下額外擴增：(i)在1 L燒瓶中擴增至200 mL工作體積；(ii)在3 L燒瓶中擴增至1000 mL工作體積及(iii)在5 L燒瓶中擴增至3000 mL工作體積。
將5 L經擴增培養混合物摻加10% w/v普洛尼克F-68 (2.045 v/v摻加物)，其隨後轉移至50 L GE WAVE生物反應器(0.25毫升/分鐘固定空氣噴霧，按需供氧，經溶解O2 多達40%，20 rpm搖動直至9o 角度)中，用於額外擴增(在27℃下3-5天)直至25 L工作體積，目標輸出密度為2.0-6.0×106 個細胞/毫升。
培養基再次摻加10% w/v普洛尼克F-68 (2.045 v/v摻加物)及隨後接種至GE 250 L Xcellerex生物反應器中，接種密度為0.8×106 個細胞/毫升及125 L工作體積(Hyclone SFX昆蟲細胞培養基)。培養基於生物反應器中擴增2-4天(按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%，1升/分鐘空氣覆蓋，27℃容器溫度，60℃通風口加熱器溫度，80 rpm向下混合器方向)，直至3.0×106 個細胞/毫升(於200 L工作體積中)。
隨後將生物反應器中之細胞用Rep/Cap感染BIIC及轉殖基因感染BIIC共感染(1:1 BIIC比率，5.0×103 SF9:BIIC比率)。培育經感染細胞5-7天及收集批量收穫物以用於經由下游處理進行溶解及處理。
經由擴增及生物反應步驟中之每一者獲取樣品，以在整個上游處理中監測細胞密度及存活率。 實例9.上游-生產批量粒子池(C)
將Sf9 9f4 CB之一個小瓶在125 mL搖瓶中解凍(37℃，使用水浴，1-5分鐘，直至冰晶體消散)，及隨後稀釋至20 mL工作體積之ESF-AF培養基中。搖瓶在27℃ (100 rpm振盪，2吋軌道直徑)下在未加濕的環境空氣、溫度調節恆溫箱中在第一擴增中培育，直至細胞密度擴增至5.0-8.0×106 個細胞/毫升之間。
隨後使用較大搖瓶接種培養物及經由多個額外擴增步驟擴增，每個擴增步驟之目標輸出密度為3.0-6.0×106 個細胞/毫升，以允許在後續擴增步驟中之恆定接種密度為0.5-4.0×106 個細胞/毫升。在27℃下在100 rpm振盪(≤2 L工作體積)或80 rpm振盪(＞2 L工作體積)下持續3-5天完成擴增。
完成以下額外擴增：(i)在1 L燒瓶中擴增至200 mL工作體積；(ii)在3 L燒瓶中擴增至1000 mL工作體積及(iii)在5 L燒瓶中擴增至3000 mL工作體積。
將5 L經擴增培養混合物摻加10% w/v普洛尼克F-68 (2.045 v/v摻加物)，其隨後轉移至50 L GE WAVE生物反應器(0.25毫升/分鐘固定空氣噴霧，按需供氧，經溶解O2 多達40%，20 rpm搖動直至9o 角度)中，用於額外擴增(在27℃下3-5天)直至25 L工作體積，目標輸出密度為2.0-5.0×106 個細胞/毫升。
培養基再次摻加10% w/v普洛尼克F-68 (2.5 v/v摻加物)及隨後接種至Thermofisher 250 L HyPerforma生物反應器中，接種密度為1.0-2.0×106 個細胞/毫升及125 L工作體積(Hyclone SFX昆蟲細胞培養基)。培養基於生物反應器中擴增2-3天(按需級聯氧氣，經溶解O2 多達40%，0.25升/分鐘空氣噴霧，7升/分鐘空氣覆蓋，27℃容器溫度，65℃通風口加熱器溫度，60 rpm混合器)，直至2.5-2.75×106 個細胞/毫升(於200 L工作體積中)。
隨後用Rep/Cap感染BIIC (1:250k v/v)及轉殖基因感染BIIC (1:50k v/v)共感染生物反應器中之細胞。培育經感染細胞1-2天及收集批量收穫物以用於經由下游處理進行溶解及處理。
經由擴增及生物反應步驟中之每一者獲取樣品，以在整個上游處理中監測細胞密度及存活率。 實例10.灌注BIIC組之評估
完成研究以研究在用於AAV生產之BIIC之生產及低溫保存中使用ATF灌注系統之影響。AAV粒子係根據實例9中之一般程序，使用實例6D中所生產及分析之BIIC生產。第一對照樣品使用對照轉殖基因BIIC及對照Rep/Cap BIIC之組合；第二組樣品結合對照Rep/Cap BIIC使用來自實例6D (操作1、操作2及操作3)之灌注轉殖基因BIIC；及第三組樣品結合來自實例6D (操作1、操作2及操作3)之灌注Rep/Cap BIIC使用對照轉殖基因BIIC。
分析所得經澄清溶解物池以用於AAV粒子效價(qPCR)。結果係顯示於圖5中。
評估ATF灌注BIIC組之結果顯示，來自實例6D之灌注轉殖基因BIIC提供等於或高於對照樣品之AAV效價；而來自實例6D之灌注Rep/Cap BIIC提供低於對照樣品之AAV效價。所有BIIC樣品提供約1.0×1010 VG/mL或更高之AAV效價。 實例11.填充及整理
將藥物物質轉移至生物安全櫃(Biosafety Cabinet，BSC)且經由0.22 µm過濾器(雙重串聯滅菌級過濾器)過濾。隨後使用BSC內之可程式化蠕動分配泵將過濾之藥物物質池無菌填充至2 ml冷凍小瓶中。將產物小瓶塞住，密封加蓋，100%目視檢查且標記(在25℃下)，且隨後儲存於≤-65℃下。
前述及其他目標、特徵及優勢將自如隨附圖式中所說明之本發明特定實施例的以下描述顯而易見。圖式未必按比例或全面的，而是強調說明本發明之各種實施例的原理。
圖1顯示使用病毒生產細胞(VPC)及質體構築體生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)之系統之一個實施例的示意圖，及方法之一個實施例的流程圖。
圖2顯示使用病毒生產細胞(VPC)及經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)生產AAV粒子之系統之一個實施例的示意圖，及方法之一個實施例的流程圖。
圖3顯示藉由處理、澄清及純化批量收穫之AAV粒子及病毒生產細胞來生產藥物物質的系統之一個實施例的示意圖，及方法之一個實施例的流程圖。
圖4A提供對應於本發明之BIIC生產系統之某些實施例的活細胞密度資料(×106 個細胞/毫升)。
圖4B提供對應於本發明之BIIC生產系統之某些實施例的細胞存活率資料(%)。
圖5提供顯示根據本發明之AAV粒子生產之某些實施例的BIIC生產過程與AAV效價之間的相關性的圖。

Claims (27)

  1. 一種用於生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(baculovirus infected insect cell，BIIC)之方法，其包含： (a)將一定體積之細胞培養基引入生物反應器中； (b)將至少一個病毒生產細胞(viral production cell，VPC)引入該生物反應器中且使該生物反應器中之VPC數目擴增至目標VPC細胞密度； (c)將至少一種桿狀病毒表現載體(Baculoviral Expression Vector，BEV)引入該生物反應器中，其中該至少一種BEV包含AAV病毒表現構築體或有效負載構築體； (d)在允許至少一種BEV感染至少一個VPC以生產經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)的條件下，在該生物反應器中培育VPC與BEV之混合物； (e)在允許該生物反應器中之BIIC數目達到目標BIIC細胞密度之條件下培育該生物反應器；及 (f)視情況自該生物反應器收穫該等BIIC。
  2. 如請求項1之方法，其中該生物反應器包含灌注系統以用於管理該生物反應器內之該細胞培養基。
  3. 如請求項2之方法，其中該灌注系統為交替切向流(alternating tangential flow，ATF)灌注系統。
  4. 如請求項3之方法，其中該灌注系統置換該生物反應器中之該培養基的至少一部分，同時截留該生物反應器內之至少90%的該等VPC及BIIC。
  5. 如請求項4之方法，其中該灌注系統自該生物反應器內之該細胞培養基移除細胞廢物。
  6. 如請求項4之方法，其中該灌注系統置換已由細胞代謝耗盡營養物之細胞培養基。
  7. 如請求項4之方法，其中該灌注系統在該生物反應器達到該目標BIIC細胞密度之後用低溫保存培養基置換細胞培養基，其允許在自該生物反應器收穫之前或之後冷凍及保存BIIC細胞。
  8. 如請求項4之方法，其中該生物反應器中之細胞培養基之體積為至少5 L、10 L、20 L、50 L、100 L或200 L。
  9. 如請求項8之方法，其中該等VPC為昆蟲細胞。
  10. 如請求項9之方法，其中該等VPC為Sf9細胞。
  11. 如請求項9之方法，其中BEV感染時的該目標VPC細胞密度為1.5-4.0×106 個細胞/毫升。
  12. 如請求項9之方法，其中BEV感染時的該目標VPC細胞密度為2.0-3.5×106 個細胞/毫升。
  13. 如請求項11之方法，其中將BEV以BEV對VPC之目標感染倍率(Multiplicity of Infection，MOI)引入該生物反應器中。
  14. 如請求項13之方法，其中BEV MOI為0.0005-0.003。
  15. 如請求項13之方法，其中BEV MOI為0.001-0.002。
  16. 如請求項14之方法，其中在收穫時的BIIC細胞密度為6.0-18.0×106 個細胞/毫升。
  17. 如請求項16之方法，其中在收穫時的BIIC細胞密度為8.0-16.5×106 個細胞/毫升。
  18. 如請求項16之方法，其中在收穫時的BIIC細胞密度為10.0-16.5×106 個細胞/毫升。
  19. 如請求項9之方法，其中該至少一種BEV包含至少一種桿狀病毒(表現Bac)，其包含AAV病毒表現構築體。
  20. 一種經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)，其係由如請求項19之方法生產。
  21. 如請求項9之方法，其中該至少一種BEV包含至少一種桿狀病毒(有效負載Bac)，其包含有效負載構築體，該有效負載構築體包含編碼有效負載之聚核苷酸。
  22. 一種經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)，其係由如請求項21之方法生產。
  23. 一種用於生產包含編碼有效負載之聚核苷酸的腺相關病毒(AAV)的方法，該方法包含： (a)將生物反應器中之病毒生產細胞(VPC)培養至目標細胞密度，其中該生物反應器包含細胞培養基； (b)將至少一種經桿狀病毒感染之昆蟲細胞(BIIC)引入該生物反應器中，其中引入該生物反應器中之該至少一種BIIC包含至少一種表現BIIC，其包含至少一種表現Bac，其中引入該生物反應器中之該至少一種BIIC包含至少一種有效負載BIIC，其包含至少一種有效負載Bac，且其中引入該生物反應器中之該至少一種BIIC包含至少一種如請求項20或請求項22之BIIC； (c)在引起在一或多種VPC內生產一或多種AAV之條件下在該生物反應器中培育該等VPC，其中該等AAV中之一或多者包含編碼該有效負載之該聚核苷酸；及 (d)自該生物反應器收穫病毒生產池，其中該病毒生產池包含有一或多種包含一或多種AAV之VPC。
  24. 如請求項23之方法，其中步驟(a)之該等VPC之目標細胞密度為3.0×106 -3.4×106 個細胞/毫升(例如，3.2×106 -3.4×106 個細胞/毫升；例如，3.2×106 個細胞/毫升)。
  25. 一種腺相關病毒(AAV)，其係藉由如請求項23之方法生產。
  26. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之如請求項25之AAV及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  27. 一種如請求項25之AAV之用途，其係用於製造用以治療及/或預防疾病之藥劑。
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