TW202039543A - Ｔ細胞受體的變體 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種變體，其係T細胞受體的變體，係由2個包含T細胞受體鏈之恆定區域的多肽所組合而成，其中，該T細胞受體鏈係選自由α鏈、β鏈、γ鏈及δ鏈所構成之群組中，該多肽不包含該T細胞受體鏈之互補性決定區域(CDR)、α鏈之互補性決定區域(CDR)及β鏈之互補性決定區域(CDR)。

Description

T細胞受體的變體

本發明係關於T細胞受體的變體及表現該變體的細胞等。

T細胞係在針對細菌或病毒等外來病原體或癌細胞等異常細胞的免疫系統中扮演中心之角色。其中，細胞傷害性T細胞(CTL)，係經由存在於其細胞表面上的T細胞受體(TCR)，而識別與抗原提呈細胞(antigen presenting cell)之類型1主要組織相容性抗原一起提呈的源自病毒或腫瘤等之抗原肽，並對於提呈屬於異物之該抗原肽的細胞，專一性地發揮細胞傷害活性。

如此，由於T細胞在免疫系統中扮演中心角色，所以正在開發一種T細胞療法，其係在來自患者之細胞、或HLA基因型為相同或實質相同的同種細胞中，導入可識別源自病毒或腫瘤等之抗原肽的TCR基因、嵌合抗原受體(CAR)等，以人為方式於體外(in vitro)製作大量之癌抗原特異性T細胞，並輸注至活體內。然而，接受基因導入之T細胞中存在有內在性之TCR，內在性之TCR會與導入之TCR競爭並與細胞表面表現TCR所需的CD3分子結合，因而發生阻礙導入之TCR之表現的問題。此外，導入有基因之TCR鏈亦被指摘其與內在性之TCR鏈有發生配對錯誤 (mispairing)的問題。再者，於使用同種細胞的情況下，亦存在有內在性之TCR會識別接受者(recipient)之抗原而引起移植物抗宿主病(graft versus host disease，即GvHD)的可能性。

就解決此等問題之方法而言，有報告提及將由α鏈之可變區域(Vα)及β鏈之可變區域(Vβ)融合於TCRβ鏈之恆定區域(Cβ)而成的單股嵌合TCR、及TCRα鏈之恆定區域(Cα)導入細胞的方法，並且，該報告亦指出，藉由該方法可抑制與內在性TCRα鏈的錯配(mismatch)，並認為可藉此而抑制無預期之活體內(in vivo)作用的可能性(非專利文獻1)。此外，亦有報告指出，藉由在導入的TCR之α鏈及β鏈之恆定區域中導入半胱胺酸，可抑制所導入的TCR鏈與內在性之TCR鏈的錯配(非專利文獻2)。然而，此等文獻係以防止導入之TCR鏈與內在性之TCR鏈發生錯配為主要焦點，關於內在性之TCR鏈的同種異體反應性(Alloreactivity)則並未加以驗證，另外，關於不具有「對於抗原-HLA複合體之識別為重要的TCRα鏈及β鏈之任一者的互補性決定區域(CDR)」的TCR之變體，亦無明示或暗示。

[先前技術文獻]

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Knies D. et al., Oncotarget, 7(16): 21199-21221 (2016)

[非專利文獻2] Kuball J. et al., blood, 109(6):2331-2338 (2007)

因此，本發明之課題係提供一種新穎之T細胞受體之變體，其不具有T細胞受體(TCR)α鏈及β鏈之任一者之互補性決定區域(CDR)。此外，本發明之課題亦為提供表現該變體並抑制同種異體反應性(Alloreactivity)的T細胞。

本發明人等在開發可解決上述課題之經抑制同種異體反應性的T細胞受體(TCR)時，發現在導入有「不包含TCRα鏈及β鏈之CDR的T細胞受體之變體」的細胞中，被認為是由內在性TCR所導致的同種異體反應性意外地受到抑制。此外，發現由TCR鏈之不同鏈所組合成者，亦即具有αβTCR之恆定區域及γδTCR之CDR的TCR變體，亦同樣地可抑制T細胞之同種異體反應性。基於此等見解並專心研究的結果，於是完成本發明。

亦即，本發明提供以下事項。

[1]一種變體，其係T細胞受體之變體，係由2個包含T細胞受體鏈之恆定區域的多肽所組合而成，其中，該T細胞受體鏈係選自由α鏈、β鏈、γ鏈及δ鏈所構成的群組中，該多肽不包含該T細胞受體鏈之互補性決定區域(CDR)、α鏈之互補性決定區域(CDR)及β鏈之互補性決定區域(CDR)。

[2]如[1]記載之變體，其中，前述多肽之一者包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域，另一者包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域。

[2a]如[2]記載之變體，其中，前述多肽之至少一者包含T細胞受體γ鏈之互補性決定區域(CDR)、及/或T細胞受體δ鏈之互補性決定區域(CDR)。

[2b]如[2a]記載之變體，其中，前述多肽之至少一者所含的恆定區域為α鏈之恆定區域，且互補性決定區域(CDR)為γ鏈之互補性決定區域(CDR)。

[2c]如[2a]或[2b]記載之變體，其中，前述多肽之至少一者所含的恆定區域為β鏈之恆定區域，且互補性決定區域(CDR)為δ鏈之互補性決定區域(CDR)。

[3]如[1]至[2c]中任一項記載之變體，其中，2個多肽係以1個以上之二硫鍵(disulfide bond)所鍵結。

[3a]如[1]至[3]中任一項記載之變體，其中，前述多肽更包含1個以上之訊息肽(signal peptide)。

[3b]如[3a]記載之變體，其中，前述訊息肽係與T細胞受體鏈之恆定區域的N末端結合。

[3c]如[3a]記載之變體，其中，前述訊息肽為CD8及/或IGH之訊息肽。

[4]一種核酸分子，其編碼[1]至[3c]中任一項記載之變體。

[5]一種載體，其包含[4]記載之核酸分子。

[6]一種細胞之製造方法，其包含導入[5]記載之載體的步驟。

[6a]一種多能性幹細胞，其包含編碼[1]至[3c]中任一項記載之變體的核酸。

[6b]如[6a]記載之細胞，其中，前述多能性幹細胞為人工多能性幹細胞(iPS細胞)。

[7]一種細胞，其表現[1]至[3c]中任一項記載之變體。

本發明之T細胞受體之變體，若導入細胞中，由於可抑制該細胞之同種異體反應性，故可減低同種移植中的移植物抗宿主病(GvHD)之風險。

第1圖展示對於表現不包含TCR鏈之可變區域但包含C區域的TCR變體的T細胞，使用流式細胞術(flow cytometry)檢測其細胞膜表面上之CD3分子之表現的結果。橫軸表示CD3分子在細胞膜表面之表現，縱軸表示細胞數。

第2圖展示對於從經使用慢病毒(lentivirus)載體而導入有AB6基因之iPS細胞分化的細胞膜上所表現之CD3、CD5、CD7及αβTCR，使用流式細胞術測定該等之表現的結果。

(發明之詳細說明)

1. T細胞受體之變體

本發明提供一種T細胞受體之變體(以下有時稱為「本發明之變體」)，其係由2個包含T細胞受體(TCR)鏈之恆定區域的多肽所組合而成，其中，該T細胞受體(TCR)鏈係選自由α鏈、β鏈、γ鏈及δ鏈所構成的群組中。本發明之變體之特徵為：不包含TCRα鏈及β鏈之互補性決定區域(CDR)、或相同種類之鏈之互補性決定區域(CDR)(較佳為包含該CDR之可變區域的一部分或全部)的任一者；以及不包含恆定區域所源自的T細胞受體鏈之互補性決定區域(CDR)、或相同種類之鏈之互補性決定區域(CDR)(較佳為包含該CDR之可變區域的一部分或全部)。因此，本發明之變體中，不包含天然型或人工型(例如成為恆定區域及可變區域之來源的動物種類相異)之αβTCR、γδTCR，或對此等TCR更進一步加成胺基酸之TCR變體。例如，在相當於本發明之變體之至少一鏈的多肽係包含T細胞受體α鏈之恆定區域的情況下，該多肽中雖不包含T細胞受體α鏈之CDR(較佳為包含該CDR的可變區域之一部分或全部)，但可包含α鏈及β鏈以外之相異的TCR鏈(例如γ鏈、δ鏈之CDR或可變區域)。同樣地，在相當於本發明之變體之至少一鏈的多肽係包含T細胞受體β鏈之恆定區域的情況下，該多肽中雖不包含T細胞受體β鏈之CDR(較佳為包含該CDR的可變區域之一部分或全部)，但可包含α鏈及β鏈以外之相異的TCR鏈(例如γ鏈、δ鏈之CDR或可變區域)。關於γ鏈及δ鏈亦相同。在本發明之一態樣中，T細胞受體β鏈係包含T細胞受體β1鏈(序列編號2)或T細胞受體β2鏈(序列編號3)。在本發明之一態樣中，T細胞受體β鏈係包含T細胞受體β1鏈(序列編號2)及T細胞受體β2鏈(序列編號3)。

此外，對於本發明之多肽，可更進一步加成膜移行訊息肽(以下亦稱為「訊息肽」)。就訊息肽而言，除了可使用CD8、免疫球蛋白-H(IGH)、CD4之外，尚可使用源自於「編碼具有膜貫通結構域之各種肽的基因」的膜移行訊息肽，及/或由「在該訊息肽之胺基酸序列中經刪除、置換、插入及/或加成1個或數個(例如2個、3個、4個、5個)胺基酸而成的胺基酸序列」或「與該訊息肽之胺基酸序列具有相同性之胺基酸序列」所構成的訊息肽。在加成訊息肽時，結合位置及訊息肽之數目係無特別限定。

在本說明書中，「T細胞受體(TCR)」係意指由TCR鏈(α鏈、β鏈、γ鏈、δ鏈)之二聚體所構成，且可識別抗原或該抗原-HLA(人類白血球型抗原)(MHC；主要組織相容性基因複合體)複合體，並對T細胞傳達刺激訊息的受體。各個TCR鏈係由可變區域及恆定區域所構成，在可變區域中存在有3個互補性決定區域(CDR1、CDR2、CDR3)。TCR之變體(以下有時亦稱為TCR變體)係意指該TCR鏈之二聚體，其中，各多肽至少包含上述TCR鏈之恆定區域。

在本發明之一態樣中係提供一種變體，其中，構成本發明之變體之一個多肽係包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域(亦稱為C區域)，另一個多肽則包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域。該變體中，其中一個多肽更佳係包含：TCRγ鏈之CDR(較佳為包含該CDR的TCRγ鏈之可變區域之一部分或全部)，及/或TCRδ鏈之CDR(較佳為包含該CDR的TCRδ鏈之可變區域之一部分或全部)。在包含該可變區域之至少一部分的情況下，較佳係構成本發明之變體的至少一個多肽之恆定區域為TCRα鏈或β鏈之恆定區域，且CDR為γ鏈或δ鏈之CDR。更佳係構成本發明之 變體的一個多肽之恆定區域為TCRα鏈之恆定區域，CDR為γ鏈之CDR，且另一個多肽之恆定區域為TCRβ鏈之恆定區域，CDR為δ鏈之CDR。

就本發明之一態樣而言，提供不包含「包含TCR鏈之CDR的可變區域之一部分或全部」但包含C區域的變體。該變體例如可為一個多肽包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域，且另一個多肽包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域者。此外，該變體例如可為一個多肽包含T細胞受體γ鏈或δ鏈之恆定區域，且另一個多肽包含T細胞受體γ鏈或δ鏈之恆定區域者。再者，該變體例如可為一個多肽包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域，且另一個多肽包含T細胞受體γ鏈或δ鏈之恆定區域者。

就構成本發明之變體的多肽而言，例如，可列舉包含由「序列編號1所示之胺基酸序列」、「序列編號1所示之胺基酸序列中經刪除、置換、插入及/或加成1個或數個(例如2個、3個、4個、5個)胺基酸而成的胺基酸序列」、或「與序列編號1所示之胺基酸序列具有相同性之胺基酸序列」所構成的TCRα鏈之恆定區域的多肽(以下稱為「多肽1」)。此外，就構成本發明之變體的多肽而言，例如，可列舉包含由「序列編號2或3所示之胺基酸序列」、「在序列編號2或3所示之胺基酸序列中經刪除、置換、插入及/或加成1個或數個(例如2個、3個、4個、5個)胺基酸而成的胺基酸序列」、或「與序列編號2或3所示之胺基酸序列具有相同性之胺基酸序列」所構成的TCRβ鏈之恆定區域的多肽(以下分別稱為「多肽2」及「多肽3」)。在本發明之較佳實施態樣中，本發明之變體係由前述多肽1(TCRα鏈之恆定區域)及多肽2(TCRβ1鏈之恆定區域)、或前述多肽1(TCRα鏈之恆定區域)及多肽3(TCRβ2鏈之恆定區域)所構成。

就本發明之一實施態樣而言，為了使不包含「包含TCR鏈之CDR的可變區域之一部分或全部」但包含C區域的多肽(例如由前述多肽1及多肽2、或前述多肽1及多肽3所構成的變體)更有效率地在細胞膜表面上表現，較佳係對至少任一個多肽更進一步加成訊息肽。就訊息肽而言，以CD8、IGH為較佳。在加成訊息肽時，結合位置係無特別限定，以加成於包含TCR之C區域的多肽之C末端或N末端為較佳，以加成於N末端為更佳。在加成訊息肽時，訊息肽的數目係無特別限定，相對於各多肽，以加成1個以上為較佳，以加成1個為更佳。

就訊息肽而言，例如，可列舉由「序列編號4(CD8)或5(IGH)所示之胺基酸序列」、「在序列編號4或5所示之胺基酸序列中分別經刪除、置換、插入及/或加成1個或數個(例如2個、3個、4個、5個)胺基酸而成的胺基酸序列」、或「與序列編號4或5所示之胺基酸序列分別具有相同性的胺基酸序列」所構成的訊息肽(以下分別稱為「訊息肽4」及「訊息肽5」)。

在本發明之較佳實施態樣中，本發明之變體係由「前述訊息肽5加成於多肽1之N末端而成的序列編號8或11所示之多肽(以下稱為「多肽8」及「多肽11」)」、及「前述訊息肽4加成於多肽2之N末端而成的序列編號7或10所示之多肽(以下稱為「多肽7」及「多肽10」)」所構成。

此外，在本發明之其他較佳實施態樣中，係由多肽8或多肽11、以及「前述訊息肽4加成於多肽3之N末端而成的序列編號13或15所示之多肽(以下稱為「多肽13」及「多肽15」)」所構成。

另外，就構成本發明之變體的多肽而言，可列舉包含TCRγ鏈之可變區域的多肽。此外，就構成本發明之變體的多肽而言，可列舉包含TCRδ鏈之可變區域的多肽。

在本說明書中，「相同性」係意指90%以上(例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或比其更高)之相同性。胺基酸序列之相同性可在以下之條件下(期望值(expectancy)=10；允許空位(gap allowed)；矩陣(matrix)=BLOSUM62；filtering=OFF)，使用同源性計算演算法之NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)計算。為了決定相同性，可理解要將涵蓋全長的本發明序列與其他序列做比較。換言之，在本發明中的相同性，係排除將本發明序列的短片段(例如1至3個胺基酸)與其他序列做比較，反之亦然。

本發明之變體中所包含的TCR鏈之恆定區域、可變區域及CDR的來源，係無特別限制，以源自動物哺乳動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、綿羊、猴、人類)者為較佳，其中，以源自人類者為更佳。

此外，本發明之變體中所含的TCR鏈之恆定區域，較佳係在天然型之TCR鏈的恆定區域中施加預定之改變者。就此改變而言，例如可不受限地列舉：藉由將天然型之TCR之恆定區域的特定胺基酸殘基置換成半胱胺酸殘基(例如將由序列編號1所示之胺基酸序列所構成的恆定區域之第48號之蘇胺酸置換成半胱胺酸，將由序列編號2或序列編號3所示之胺基酸序列所構成的恆定區域之第56號或第55號之絲胺酸置換成半胱胺酸)，而使由α鏈與β鏈間之二硫鍵所成的二聚體之表現效率亢進等。在 較佳之實施態樣中，2個多肽較佳係藉由1個以上(更佳為2個以上)之二硫鍵來鍵結，該二硫鍵係在變體之各多肽所含的半胱胺酸殘基(可為天然型所含者，亦可為如上述方式以人工方式導入者)之間藉由氧化或轉譯後修飾而形成。

本發明之變體可使用後述的本發明之核酸或載體並以基因工程手法進行製作。例如，可將編碼構成本發明之變體之一個多肽的核酸及編碼另一個多肽的核酸兩者導入細胞中，使各多肽表現而形成二聚體，並藉由本身周知之方法，將該二聚體單離而製作。

2.編碼本發明之變體的核酸或包含該核酸之載體

本發明提供上述編碼本發明之TCR的核酸(以下有時稱為「本發明之核酸」)。就本發明之核酸而言，編碼構成本發明之變體之一個多肽的核酸及編碼另一個多肽之核酸係可包含於不同分子中，亦可使編碼該二個多肽之核酸包含於單一分子中。

本發明之核酸可為DNA，亦可為RNA，或可為DNA/RNA嵌合物，較佳為DNA。此外，該核酸可為雙股，亦可為單股。在雙股之情況下，可為雙股DNA、雙股RNA或DNA：RNA之雜交物。在核酸為RNA之情況下，對於RNA之序列，係將序列表中的T改換為U。另外，本發明之核酸只要在體外或細胞中能表現多肽，即可包含天然核苷酸、修飾核苷酸、核苷酸類似體、或此等之混合物。

本發明之核酸可藉由本身周知之方法製作，例如，可基於TCR鏈之周知的DNA序列資訊，以涵蓋該序列之期望部分的方式合成寡聚DNA引子，使用從具有該序列之細胞所調製的全RNA或mRNA之部 分作為模板，藉由RT-PCR法擴增而進行選殖。或者是以化學方式合成DNA鏈，或是藉由將合成之一部份重疊的寡聚DNA短鏈利用PCR法(重疊PCR法)或Gibson Assembly法而併接，據此而可構築編碼全長或其一部分的DNA。

本發明之核酸可組入表現載體中。因此，本發明提供包含上述本發明之核酸的表現載體(以下有時稱為「本發明之載體」)。

就本發明之載體中所使用的啟動子而言，例如，可使用泛素(ubiquitin)啟動子、EF1α啟動子、CAG啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV(巨細胞病毒)啟動子、RSV(勞斯氏肉瘤病毒)啟動子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(單純皰疹病毒胸苷激酶)啟動子等。其中，以泛素啟動子、EF1α啟動子、CAG啟動子、MoMuLV LTR、CMV啟動子、SRα啟動子等為較佳。

本發明之載體中，除了包含上述啟動子之外，視需要而亦可包含轉錄及轉譯調節序列、核糖體結合部位、增強子、複製起點、Poly A加成訊息、選擇標記基因等。就選擇標記基因而言，例如，可列舉二氫葉酸還原酵素基因、新黴素耐性基因、嘌呤黴素耐性基因等。

在本發明之一態樣中，可將包含「編碼構成上述本發明之變體之一個多肽的核酸」及「編碼另一個多肽的核酸」的表現載體導入標的細胞內，並於細胞內或細胞表面構成該二個多肽之雜二聚體。在此情況下，「編碼構成本發明之變體之一個多肽的核酸」及「編碼另一個多肽之核酸」係可組入個別不同之表現載體中，亦可組入1個表現載體中。在組入1個表現載體中之情況下，此2種核酸較佳係經由可進行多順反子表現之序列 而組入。藉由使用可進行多順反子表現之序列，而可使組入有1種表現載體的複數個基因更有效率地表現。就可進行多順反子表現之序列而言，例如，可列舉2A序列(例如源自口蹄疫病毒(FMDV)之2A序列(F2A)、源自馬鼻炎A病毒(ERAV)之2A序列(E2A)、源自豬鐵士古病毒(Porcine teschovirus)(PTV-1)之2A序列(P2A)、源自明脈扁翅蛾病毒(Thosea asigna virus)(TaV)之2A序列(T2A))(PLoS ONE,3：e2532,2008、Stem Cells 25,1707,2007等)、內部核糖體進入部位(IRES)(U.S.Patent No.4,937,190)等，從均勻表現量之觀點來看，以2A序列為較佳。此外，在2A序列之中，以P2A序列及T2A序列為較佳。

就可使用於本發明之表現載體而言，可列舉病毒載體、質體載體等。就病毒載體而言，可列舉逆轉錄病毒載體(包含慢病毒載體或假型(pseudo-type)載體)、腺病毒載體、腺相關病毒載體、皰疹病毒載體、仙台病毒、游離基因組(episomal)載體等。此外，亦可使用轉位子(transposon)表現系統(例如PiggyBac系統)。就質體載體而言，可列舉動物細胞表現質體(例如pa1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。

3.表現本發明之變體的T細胞

本發明提供導入有本發明之核酸或載體的細胞(以下有時稱為「本發明之細胞」)。本發明之細胞係以表現本發明之變體為較佳。

就導入本發明之核酸或表現載體的細胞而言，例如，可列舉淋巴球、淋巴球之前驅細胞、多能性幹細胞。在本發明中，「淋巴球」係意指脊椎動物之免疫系統中的白血球之亞型之一，就淋巴球而言，可列舉 T細胞、B細胞、自然殺手細胞(NK細胞)。就導入本發明之核酸或載體的細胞而言，以多能性幹細胞為較佳。

在本發明中，「T細胞」係意指CD3陽性細胞。就表現本發明之變體的T細胞而言，例如，可列舉屬於CD8陽性細胞之細胞傷害性T細胞(CTL)、屬於CD4陽性細胞之輔助T細胞、控制性T細胞、效應T細胞等，較佳為細胞傷害性T細胞。表現本發明之變體的T細胞，可藉由在從活體採集之T細胞中導入本發明之核酸或載體而得到。或者，可藉由從導入有本發明之核酸或載體的多能性幹細胞或淋巴球之前驅細胞來分化誘導成T細胞，而得到表現本發明之TCR的T細胞(亦即，源自該多能性化細胞或前驅細胞之T細胞)。

在本發明之一態樣中，T細胞除了表現CD3外，亦有表現CD5及/或CD7的情況。CD5及/或CD7在活體內之T細胞中亦有於其細胞表面表現的情況。在T細胞表現CD5及/或CD7時，CD3係藉由在T細胞中與TCR形成複合體而表現於細胞表面，相對於此，CD5及CD7係不與TCR分子形成複合體而表現。

本發明之細胞(例如細胞傷害性T細胞)，除了該細胞原本具有的TCR基因之外，亦具有源自本發明之核酸或載體的外因性之TCR基因。就此點而言，本發明之細胞係與從活體採集之細胞不同。本發明之細胞除了表現本發明之變體外，亦可表現嵌合抗原受體(CAR)。

前述淋巴球可從人類或非人類哺乳動物之例如末梢血、骨髓及臍帶血採集。在將表現本發明之變體的細胞使用於癌等疾病之治療時， 該細胞集團較佳係從治療對象本人、或與治療對象之HLA類型一致的捐贈者所採集。

就淋巴球之前驅細胞而言，例如，可列舉造血幹細胞、失去自己複製能力之多能性前驅細胞(multipotent progenitor：MMP)、髓-淋巴樣(myelo-lymphoid)共通前驅細胞(MLP)、髓樣(myeloid)系前驅細胞(MP)、顆粒球單核前驅細胞(GMP)、巨噬細胞樹狀細胞前驅細胞(MDP)、樹狀細胞前驅細胞(DCP)等。就多能性幹細胞而言，例如，可列舉胚性幹細胞(embryonic stem cell：ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell：iPS細胞)、胚性腫瘤細胞(EC細胞)、胚性生殖幹細胞(EG細胞)等。在上述多能性幹細胞為源自ES細胞或人類胚之任意細胞的情況下，該細胞可為破壞胚而製作之細胞，亦可為不破壞胚而製作之細胞，較佳為不破壞胚而製作之細胞。

在本說明書中，「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」係意指胚性幹細胞(ES細胞)及與其具有同樣之分化多能性(亦即潛在性地具有分化成活體之各種組織(內胚葉、中胚葉、外胚葉之全部)之能力)的細胞。就具有ES細胞同樣之分化多能性的細胞而言，可列舉「人工多能性幹細胞」(在本說明書中亦稱為「iPS細胞」)。

就「ES細胞」而言，若為小鼠ES細胞，則可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(即理化學研究所)等所建立的各種小鼠ES細胞株，若為人類ES細胞，則可利用NIH、理研、京都大學、Cellartis公司所建立的各種人類ES細胞株。例如，就人類ES細胞株而言，可利用NIH之CHB-1~CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1~HUES28株 等、WisCell Research之H1株、H9株、理研之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。

在本說明書中，「人工多能性幹細胞(iPS細胞)」係意指藉由對哺乳動物體細胞或未分化幹細胞導入特定之因子(核初期化因子)並進行再程式化(programming)所得到的細胞。現今，「人工多能性幹細胞」有各式各樣者，除了由山中氏等藉由對小鼠纖維母細胞導入Oct3/4‧Sox2‧Klf4‧c-Myc之4種因子而建立的iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)之外，亦可使用將同樣之4種因子導入人類纖維母細胞而建立的源自人類細胞之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131：861-872.)、在導入上述4種因子後以Nanog之表現作為指標進行篩選而建立的Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、以不含c-Myc之方法製作的iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)、以無病毒法導入6種因子而建立的iPS細胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al.Stem Cells.31(3)：458-66.)。此外，亦可使用由Thomson氏等所製作之經導入OCT3/4‧SOX2‧NANOG‧LIN28之4種因子而建立的入工多能性幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318：1917-1920.)、由Daley氏等所製作的人工多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451：141-146)、由櫻田氏等所製作的人工多能性幹細胞(日本特開2008-307007號)等。

此外，亦可使用公開之所有論文(例如Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、或專利文獻(例如日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)所記載的該領域中周知之人工多能性幹細胞的任一者。

就人工多能性細胞株而言，可利用NIH、理研、京都大學等所建立的各種iPS細胞株。例如，若為人類iPS細胞株，則可列舉理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等。

在本發明中，「造血前驅細胞」係意指可分化成血球系細胞之多能性幹細胞(multipotent stem cell)。在人類中，主要存在於骨髓並分化成白血球(嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、淋巴球、單核球、巨噬細胞)、紅血球、血小板、肥胖細胞、樹狀細胞。此外，在本發明中，「造血前驅細胞」係意指CD34陽性細胞，較佳為CD34/CD43雙陽性(DP)細胞。本發明所用之造血前驅細胞之來源係無限制，例如，可為依照下述方法分化誘導多能性幹細胞所得到的造血前驅細胞，另外，亦可為從活體組織依照周知之手法而單離的造血前驅細胞。

在多能性幹細胞或淋巴球之前驅細胞中導入本發明之核酸或表現載體時，該細胞較佳係以藉由本身周知之方法分化成淋巴球(較佳為T細胞)。就使多能性幹細胞分化成T細胞之方法而言，例如，可列舉包含(1)使導入有本發明之核酸或載體之多能性幹細胞分化成造血前驅細胞的步驟及(2)使該造血前驅細胞分化成T細胞之步驟的方法。前述步驟(1)，例如，可列舉如國際公開第2013/075222號、國際公開第2016/076415號及Liu S.et al.,Cytotherapy,17(2015)；344-358等所記載的在誘導成造血前驅細胞之誘導培養基中培養多能性幹細胞的方法。此外，前述步驟(2)可列舉包含如國際公開第2016/076415號等所記載的(2-1)從造血前驅細胞誘導CD4CD8雙陽性T細胞之步驟及(2-2)從CD4CD8雙陽性T細胞誘導CD8陽性T細胞之步驟的方法。

將本發明之核酸或載體導入細胞的方法係無特別限定，可使用周知之方法。在導入核酸或質體載體時，例如，可藉由磷酸鈣共沉澱法、PEG法、電穿孔法、顯微注射法、脂質轉染法等而進行。例如，可使用細胞工學別冊8新細胞工學實驗規程，263-267(1995)(秀潤社發行)、病毒學(Virology),52卷，456(1973)、日藥理誌(Folia Pharmacol.Jpn.)，第119卷(第6號)，345-351(2002)等記載之方法。在使用病毒載體時，可將本發明之核酸導入適當之包裝細胞(例如Plat-E細胞)或互補細胞株(例如293細胞)，回收培養上清液中產生的病毒載體，藉由因應各病毒載體之適當方法，使該載體感染細胞而導入細胞中。例如，關於使用逆轉錄病毒載體作為載體之具體手段，係揭示於國際公開第2007/69666號、Cell,126,663-676(2006)及Cell,131,861-872(2007)等。此外，關於使用慢病毒作為 載體之具體手段，係揭示於Zufferey R.et al.,Nat Biotechnol,15(9)：871-895(1997)等。尤其，在使用逆轉錄病毒載體時，係藉由使用作為重組纖連蛋白片段之CH-296(Takara Bio公司製)，可對各種細胞進行高效率之基因導入。或者亦可依照基因組編集(例如CRISPR系統、TALEN、ZFN等)，將本發明之核酸或載體導入細胞之基因組中。

此外，本發明之核酸亦能以RNA之形態直接導入細胞中，用於在細胞內表現本發明之變體。就RNA之導入方法而言，可使用周知之方法，例如，可適合使用脂質轉染法或電穿孔法等。

本發明之變體的表現，例如，可使用識別本發明之變體之一部分(例如TCR鏈之恆定區域等)的抗體，依照免疫學之手法進行檢驗或測定。就免疫學之手法而言，例如，可列舉抗體陣列、流式細胞術解析、放射性同位素免疫測定法(RIA法)、ELISA、西方墨點法、免疫組織染色、酵素免疫測定法(EIA法)、螢光免疫測定法(FIA)、免疫層析法等。

關於是否有藉由本發明之變體而抑制細胞的同種異體反應性，可依照本身周知之方法確認。例如，使用表現本發明之變體的細胞、及不表現該變體之對象細胞，進行混合白血球反應(MLR)、Elispot檢定、極限稀釋檢定(Limiting dilution assay)等，在表現該變體之細胞中，若至少有任一種檢定是得到同種異體反應性低之結果，則可評價為同種異體反應性被本發明之變體抑制。

4.本發明之細胞的製造方法

本發明提供細胞之製造方法(以下有時稱為「本發明之製法」)，其包含將本發明之核酸或載體導入細胞中的步驟。導入有本發明之核酸或載體的 細胞、導入方法等，係如上述3.所記載。前述細胞係以表現本發明之變體為較佳。本發明之變體的表現，可藉由上述3.記載之方法進行檢驗或測定。

在本發明之製法之一態樣中，提供一種T細胞之製法，其包含：(1)使導入有本發明之核酸或載體的多能性幹細胞分化成造血前驅細胞的步驟，以及(2)使該造血前驅細胞分化成T細胞的步驟。

(1)使多能性幹細胞分化成造血前驅細胞的步驟(步驟(1))

關於從多能性幹細胞分化成造血前驅細胞之分化方法，只要能分化成造血前驅細胞即無特別限制，例如，可列舉如國際公開第2013/075222號、國際公開第2016/076415號及Liu S.et al.,Cytotherapy,17(2015)；344-358等所記載的在誘導成造血前驅細胞之誘導培養基中培養多能性幹細胞的方法。

在本發明中，誘導成造血前驅細胞之誘導培養基係無特別限定，可將用於培養動物細胞的培養基作為基礎培養基而調製。就基礎培養基而言，可列舉例如Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)培養基、Medium 199培養基、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培養基、αMEM培養基、Dulbecco's modified Eagle's Medium(DMEM)培養基、Ham's F12培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、Neurobasal Medium(Life Technologies)、此等之混合培養基等。在培養基中，可含有血清，或亦可在無血清下使用。視需要，可在基礎培養基中包含例如維生素C類(例如抗壞血酸)、白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巰基乙醇、巰基甘油、脂質、胺基酸、L-麩醯胺酸(L-glutamine)、非 必需胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞因子等。

在本發明中，維生素C類係意指L-抗壞血酸及其衍生物，L-抗壞血酸衍生物係意指在活體內藉由酵素反應而成為維生素C者。就本發明中所用的抗壞血酸之衍生物而言，可例示磷酸維生素C、抗壞血酸葡萄糖苷、抗壞血酸乙酯、維生素C酯、四己基癸酸抗壞血酸酯(ascorbyl tetrahexyldecanoate)、硬脂酸抗壞血酸酯及抗壞血酸-2磷酸-6棕櫚酸。較佳為磷酸維生素C，例如，可列舉磷酸-L-抗壞血酸鈉或磷酸-L-抗壞血酸鎂等磷酸-L-抗壞血酸鹽。

步驟(1)中所用的較佳的基礎培養基，係包含血清、胰島素、轉鐵蛋白、絲胺酸、驗基甘油、L-麩醯胺酸、抗壞血酸之IMDM培養基。

步驟(1)中所用的培養基，亦可更進一步添加選自由BMP4(Bone morphogenetic protein 4)、VEGF(vascular endothelial growth factor)、SCF(Stem cell factor)及FLT-3L(Flt3 Ligand)所構成之群組中的至少1種細胞因子。更佳為添加有VEGF、SCF及FLT-3L的培養基。

在步驟(1)中使用維生素C類時，維生素C類係以每4日、每3日、每2日、或每1日另行添加(補充)為較佳，以每1日添加為更佳。該維生素C類之在培養基中之濃度係無特別限制，以相當於5ng/ml至500ng/ml之量(例如相當於5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml之量)為較佳。

在步驟(1)中使用BMP4時，培養基中之BMP4的濃度係無特別限制，以10ng/ml至100ng/ml(例如10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、 40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)為較佳，以20ng/ml至40ng/ml為更佳。

在步驟(1)中使用VEGF時，培養基中之VEGF之濃度係無特別限制，以10ng/ml至100ng/ml(例如10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)為較佳，其中，以20ng/ml為更佳。

在步驟(1)中使用SCF時，培養基中之SCF之濃度係無特別限制，以10ng/ml至100ng/ml(例如10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)為較佳，其中，以30ng/ml為更佳。

在步驟(1)中使用FLT-3L時，培養基中之FLT-3L之濃度係無特別限制，以1ng/ml至100ng/ml(例如1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)為較佳，其中，以10ng/ml為更佳。

在步驟(1)中，多能性幹細胞之培養可為黏附培養或懸浮培養，在黏附培養之情況下，可使用塗覆有塗覆劑之培養容器，此外，亦可與其他細胞進行共培養。就可共培養之其他細胞而言，可例示如C3H10T1/2(Takayama N.,et al.J Exp Med.2817-2830,2010)、源自異種之基質細胞(Niwa A et al.J Cell Physiol.2009 Nov；221(2)：367-77.)。就塗覆劑而言，可例示基質膠(matrigel)(Niwa A,et al.PLoS One.6(7)：e22261,2011)。就懸浮培養而言，可例示如Chadwick et al.Blood 2003, 102：906-15、Vijayaragavan et al.Cell Stem Cell 2009,4：248-62及Saeki et al.Stem Cells 2009,27：59-67記載之方法。

在步驟(1)中，培養溫度之條件係無特別限制，例如為37℃至42℃左右，以37℃至39℃左右為較佳。此外，關於培養期間，只要是本發明所屬技術領域中具有通常知識者，即可監測造血前驅細胞之數目等而適宜決定。只要能得到造血前驅細胞，日數係無特別限定，例如為至少6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上，較佳為14日。關於培養期間長，雖然在造血前驅細胞之製造方面上通常不會視為問題，惟以例如35日以下為較佳，以21日以下為更佳。另外，可在低氧條件下培養，在本發明中，低氧條件可例示如15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%或彼等以下之氧濃度。

(2)使造血前驅細胞分化成T細胞之步驟(步驟(2))

關於從造血前驅細胞分化成T細胞之方法，只要可將造血前驅細胞分化成T細胞即無特別限制，例如，可列舉如國際公開第2016/076415號等所記載的包含(2-1)從造血前驅細胞誘導CD4CD8雙陽性T細胞之步驟及(2-2)從CD4CD8雙陽性T細胞誘導CD8陽性T細胞之步驟的方法。造血前驅體，係以從步驟(1)所得到之細胞集團中使用造血前驅細胞之標記預先單離者為較佳。就該標記而言，可列舉選自由CD43、CD34、CD31及CD144所構成之群組中的至少1種。

(2-1)從造血前驅細胞誘導CD4CD8雙陽性T細胞的步驟(步驟(2-1))

在本發明中，就分化成CD4CD8雙陽性T細胞之分化方法而言，例如，可列舉在誘導成CD4CD8雙陽性T細胞之誘導培養基中培養造血前驅細胞的方法。

在本發明中，就分化誘導成CD4CD8雙陽性T細胞之分化誘導培養基而言，係無特別限制，可將用於培養動物細胞的培養基作為基礎培養基而調製。基礎培養基可列舉與上述步驟(1)所用者相同者。培養基中可含有血清，或亦可在無血清下使用。視需要，可在基礎培養基中包含例如維生素C類、白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巰基乙醇、巰基甘油、脂質、胺基酸、L-麩醯胺酸、非必需胺基酸、維生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類、細胞因子等。

步驟(2-1)中所用的較佳的基礎培養基，係包含血清、轉鐵蛋白、絲胺酸、及L-麩醯胺酸的αMEM培養基。在基礎培養基中添加維生素C類時，維生素C類係與步驟(1)之情況相同。

步驟(2-1)中所用的培養基，可更進一步包含作為細胞因子之FLT-3L及/或IL-7，更佳為添加FLT-3L及IL-7的培養基。

在步驟(2-1)中使用IL-7時，培養基中之IL-7之濃度係以1ng/ml至50ng/ml(例如1ng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml)為較佳，其中，以5ng/ml為更佳。

在步驟(2-1)中使用FLT-3L時，FLT-3L係可與上述步驟(1)以同樣方式使用。

在步驟(2-1)中，可將造血前驅細胞進行黏附培養或懸浮培養，在黏附培養之情況下，可將培養容器塗覆而使用，此外，亦可與餵養細胞(feeder cell)等進行共培養。就共培養之餵養細胞而言，可例示骨髓間質細胞株OP9細胞(可從理研Bio Resource Center取得)。該OP9細胞較佳為恆常地表現DLL4或DLL1的OP9-DL4細胞或OP9-DL1細胞(例如Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC.Cold Spring Harb Protoc.2009)。在本發明中，在使用OP9細胞作為餵養細胞時，可藉由將另行準備的DLL4或DLL1、或是DLL4或DLL1與Fc等之融合蛋白質添加於適宜培養基中而進行。在使用餵養細胞時，係以將該餵養細胞適當交換並進行培養為較佳。餵養細胞之交換，可藉由將培養中之對象細胞移至預先播種的餵養細胞上而進行。該交換可以每5日、每4日、每3日、或每2日進行。此外，在將胚狀體進行懸浮培養而得到造血前驅細胞時的情況下，係以使其解離成單細胞後進行黏附培養為較佳。雖亦可與餵養細胞進行共培養，惟較佳為不使用餵養細胞進行培養。

在黏附培養之情況下，關於塗覆培養容器時的塗覆劑，例如可列舉基質膠(Niwa A,et al.PLos One,6(7)：e22261,2011))、膠原、明膠、層黏連蛋白(laminin)、肝素硫酸蛋白聚糖、重組人纖黏連蛋白(RetroNectin)、DLL4或DLL1、或是DLL4或DLL1與抗體之Fc區域等的融合蛋白質(例如DLL4/Fcchimera)、巢蛋白(entactin)、及/或此等之組合，以重組人纖黏連蛋白及DLL4與Fc區域等之融合蛋白質的組合為較佳。

在步驟(2-1)中，培養溫度之條件係無特別限制，例如為37℃至42℃左右，以37℃至39℃左右為較佳。此外，關於培養期間，只要是本發明所屬技術領域中具有通常知識者，即可監測CD4CD8雙陽性T細胞之數目等而適宜決定。只要能得到造血前驅細胞，日數係無特別限定，例如為至少10日以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、23日以上，較佳為23日。另外，以90日以下為較佳，以42日以下為更佳。

(2-2)從CD4CD8雙陽性(DP)T細胞誘導CD8陽性T細胞(CD3單陽性T細胞)的步驟(步驟(2-2))

藉由進行將步驟(2-1)所得到的CD4/CD8DPT細胞分化誘導成CD8陽性T細胞的步驟，而可分化誘導成CD8陽性T細胞。

就步驟(2-2)所用的基礎培養基及培養基而言，可列舉與步驟(1)記載之基礎培養基及培養基相同者。

前述培養基亦可包含腎上腺皮質激素劑。就腎上腺皮質激素劑而言，例如可列舉糖質腎上腺皮質激素(glucocorticoid)及其衍生物等，就該糖質腎上腺皮質激素而言，例如可列舉乙酸可體松、氫化可體松、乙酸氟可體松、潑尼松龍(prednisolone)、曲安奈德(triamcinolone)、甲基潑尼松龍、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、丙酸倍氯米松(beclomethasone dipropionate)。其中，以地塞米松為較佳。

在使用地塞米松作為腎上腺皮質激素劑時，培養基中之地塞米松之濃度係以1Nm至100nM(例如1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、 40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM)為較佳，其中，以10nM為更佳。

前述培養基亦可含有抗體(例如抗CD3抗體、抗CD28抗體、抗CD2抗體)、細胞因子(例如IL-7、IL-2、IL-15)等。

在步驟(2-2)中使用抗CD3抗體時，就該抗CD3抗體而言，若為專一性地識別CD3之抗體則無特別限定，例如可列舉從OKT3純系所產生的抗體。抗CD3抗體亦可為與磁珠等結合者，此外，亦可藉由將該T淋巴球在表面上結合有抗CD3抗體之培養容器上培養一定期間而賦予刺激，來代替將前述抗CD3抗體添加於培養基中。抗CD3抗體之於培養基中的濃度，係以10ng/ml至1000ng/ml(例如10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml)為較佳，其中，以500ng/ml為較佳。關於其他抗體之濃度，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可基於根據培養條件等而適宜決定。

在步驟(2-2)中使用IL-2時，培養基中的IL-2之濃度係以10U/ml至1000U/ml(例如10U/ml、20U/ml、30U/ml、40U/ml、50U/ml、60U/ml、70U/ml、80U/ml、90U/ml、100U/ml、200U/ml、500U/ml、1000U/ml)為較佳，其中，以100U/ml為較佳。步驟(2-2)中所用的IL-7或IL15之於培養基中的濃度，係以1ng/ml至100ng/ml(例如1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml)為較佳，其中，以10ng/ml為較佳。

在步驟(2-2)中，培養溫度之條件係無特別限制，以37℃至42℃左右為較佳，以37℃至39℃左右為更佳。此外，關於培養期間，只要是本發明所屬技術領域中具有通常知識者，即可監測CD8陽性T細胞之數目等而適當地決定。只要能得到CD8陽性T細胞，日數係無特別限定，以1日以上、3日以上、7日以上為較佳，以60日以下為較佳，以35日以下為更佳。

另外，在其他態樣中，本發明提供減低該細胞中之同種異體反應性的方法，其包含將本發明之核酸或載體導入細胞中的步驟。

以下列舉實施例，更進一步具體地說明本發明，惟此等例僅單純為例示，本發明並不受此等例所限定。

[實施例]

[實施例1]製作包含編碼TCR變體之核酸的Lenti V載體(該TCR變體具有αβTCR之恆定區域但不具互補性決定區域(CDR))

設計多肽鏈(表1之AB5至AB8)，係將在N末端加成有CD8分子之膜移行訊息肽的各α鏈(TRAC)、與在N末端加成有IGH分子之膜移行訊息肽之各β鏈(TRBC1或TRBC2)之胺基酸，以P2A序列連接。將編碼所設計之多肽鏈的寡聚DNA(GenScript)進行人工合成，將其插入慢病毒載體質體之多選殖位點。慢病毒載體質體係使用將pCDH-CMV-MCS-EF1a-Puro(SystemBioscience)之CMV啟動子置換成人類泛素啟動子者。病毒載體之製作係委託SIRION公司。

[表1]

[實施例2]表現TCR變體之T細胞的製造

使用塗覆有重組人纖維黏連蛋白(RetroNectin，Takara公司)之24孔培養盤，對於強制表現4種CD3基因(γ、δ、ε及ζ)的K562細胞(K562-CD3細胞，由日本國立癌研究中心之植村先生所提供)，使搭載編碼表1所示之各變體之基因的慢病毒載體進行感染，將編碼各變體的基因予以轉導。被慢病毒載體感染後，於37℃、5%CO₂條件下培養3日。

[試驗例1]表現上述TCR變體之T細胞的細胞膜表面分子表現的評價

對於[實施例2]所得之表現表1所示之各變體的T細胞，以抗CD3抗體(APC/Cy7,UCHT1,BioLegend)染色後，使用LSRFortessaTMX-20(BD Bioscience公司)流式細胞術，將細胞膜表面上之CD3分子之表現用流式細胞術檢測(第1圖)。在由AB5所得到的細胞及由AB7所得到的細胞中，均在細胞膜表面上可見到CD3之表現。此外，在由AB6所得到之細胞及由AB8所得到之細胞中，在細胞膜表面上可見到強烈的CD3表現。

[實施例3]製造表現TCR變體之源自iPS細胞的T細胞

1. iPS細胞之準備

iPS細胞係使用由京都大學iPS細胞研究所(CiRA)所提供的iPS細胞(Ff-I01s04株：來自健康人末梢血單核球)。iPS細胞培養係依據CiRA所發布的規程「無餵養(feeder free)之人類iPS細胞的培養」來進行。

2.製作包含編碼TCR變體之核酸的Lenti V載體(該TCR變體具有αβTCR之恆定區域但不具有互補性決定區域(CDR))

使用從pLVSIN-CMV Neo(Clontech公司)中除去編碼新黴素耐性基因之序列並將CMV啟動子置換成人類泛素啟動子而成之pLVSIN-Ub，製作慢病毒載體。將上述合成的編碼AB6之人工寡聚DNA組入pLVSIN-Ub慢病毒載體之多選殖位點中。使用此質體及Clontech公司之Lenti-X^TM 293T細胞株及Lenti-X^TMPackaging Single Shots(VSV-G)，製作慢病毒載體。

3.將改變型T細胞受體基因導入至iPS細胞中

使組入有[實施例1]所製成之AB6的慢病毒載體感染iPS細胞，藉此而將改變型T細胞受體基因導入至該細胞中。

使所製作之慢病毒載體感染[實施例3]1.所準備的iPS細胞，藉此而將改變型TCR基因導入至iPS細胞中。以下，將導入有改變型TCR基因之iPS細胞稱為「tTCR-iPSC」。

4.將iPS細胞分化成造血前驅細胞(HPC)

關於將iPS細胞分化成造血前驅細胞(HPC)，係可依據周知之方法(例如Cell Reports 2(2012)1722-1735或國際公開第2017/221975號記載的方法)進行。具體而言，將[實施例3]3所得到的tTCR-iPSC，分別以3 x 10⁵細胞/孔之量播種在經超低黏附處理之6孔培養盤中，在EB培養基(於StemPro34中添加10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉、2mM L-麩醯胺酸、45mM α-單硫甘油、及50μg/ml抗壞血酸2-磷酸酯)中，添加10ng/ml BMP4、50ng/ml bFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542，於低氧條件下(5% O₂)進行5日培養。繼而，添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml Flt3L，更進一步進行5至9日培養，得到懸浮細胞集團。再者，在培養期間中，每2日或3日進行培養基交換。將包含HPC之上述懸浮細胞集團使用表2之抗體組進行染色。將經進行上述染色之細胞集團提供至藉由FACSAria而進行之揀選(sorting)。

[表2]

5. HPC分化成T細胞

[實施例3]4.將所得到之細胞部分依據周知之方法(例如Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175或國際公開第2017/221975號記載的方法)分化成淋巴球系細胞。具體而言，將造血前驅細胞集團以2000細胞/孔之方式播種在塗覆有重組h-DLL4/Fc chimera(SinoBiological)及Retronectin(Takara Bio)之48孔培養盤中，以2000細胞/孔，並於5%CO₂、37℃條件下培養。於培養期間中每2日或3日進行培養基交換。再者，培養基係使用添加有15% FBS及2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100ng/ml鏈黴素、55μM 2-巰基乙醇、50μg/ml抗壞血酸2-磷酸酯、10μg/ml人類胰島素、5.5μg/ml人類轉鐵蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml Flt3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580、30ng/ml SDF-1α的αMEM培養基。在培養開始第7日及第14日，於經同樣塗覆之48孔培養盤中進行繼代。在培養開始第21日回收所有細胞。將回收之細胞使用表3之抗體組進行染色。

[表3]

[試驗例2]表現上述TCR變體之T細胞的細胞膜表面分子表現的評價

對於[實施例3]5.所得到之細胞，藉由流式細胞儀測定細胞膜表面上之CD3、CD5、CD7及αβTCR之表現(第2圖)。

在本說明書中，如「包含(comprising)」或「包含(comprise)」之各術語，可任意選擇，亦可以「由…所構成(consisting of)」或「由…所構成(consists of)」置換。

[產業上之可利用性]

本發明之變體，若於細胞中表現，由於可抑制該細胞之同種異體反應性，故可減低同種移植的移植物抗宿主病(GvHD)之風險。亦即，本發明之變體的導入，可成為T細胞療法中之同種異體反應性控制之一個選項。

本申請案係以在日本國申請之日本特願2018-245253(申請日：2018年12月27日)作為基礎，藉由在此言及而使其內容全部包含於本說明書中。

<110> 國立大學法人京都大學 日商武田藥品工業股份有限公司

<120> T細胞受體的變體

<130> 092982

<150> JP 2018-245253

<151> 2018-12-27

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR α鏈的恆定區域

<400> 1

<210> 2

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR β鏈的恆定區域

<400> 2

<210> 3

<211> 177

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TCR β鏈的恆定區域

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8訊息序列

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IGH訊息序列

<400> 5

<210> 6

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB5的鹼基序列

<400> 6

<210> 7

<211> 197

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB5的CD8及TRBC1的胺基酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 160

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB5或AB7的IGH及TRAC的胺基酸序列

<400> 8

<210> 9

<211> 1143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB6的鹼基序列

<400> 9

<210> 10

<211> 197

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB6的CD8及TRBC1的胺基酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 160

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB6或AB8的IGH及TRAC的胺基酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB7的鹼基序列

<400> 12

<210> 13

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB7的CD8及TRBC2的胺基酸序列

<400> 13

<210> 14

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB8的鹼基序列

<400> 14

<210> 15

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AB8的CD8及TRBC2的胺基酸序列

<400> 15

Claims (7)

1. 一種變體，其係T細胞受體之變體，係由2個包含T細胞受體鏈之恆定區域的多肽所組合而成，其中，該T細胞受體鏈係選自由α鏈、β鏈、γ鏈及δ鏈所構成之群組中，該多肽不包含該T細胞受體鏈之互補性決定區域(CDR)、α鏈之互補性決定區域(CDR)及β鏈之互補性決定區域(CDR)。
2. 如申請專利範圍第1項所述之變體，其中，前述多肽之一者包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域，另一者包含T細胞受體α鏈或β鏈之恆定區域。
3. 如申請專利範圍第1或2項所述之變體，其中，2個多肽係以1個以上之二硫鍵所鍵結。
4. 一種核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至3項中任一項所述之變體。
5. 一種載體，其包含申請專利範圍第4項所述之核酸分子。
6. 一種細胞之製造方法，其包含導入申請專利範圍第5項所述之載體的步驟。
7. 一種細胞，其表現申請專利範圍第1至3項中任一項所述之變體。

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