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TW202033224A - 藉靶向肌營養相關蛋白基因治療肌肉萎縮症之方法 - Google Patents

藉靶向肌營養相關蛋白基因治療肌肉萎縮症之方法 Download PDF

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TW202033224A
TW202033224A TW108141671A TW108141671A TW202033224A TW 202033224 A TW202033224 A TW 202033224A TW 108141671 A TW108141671 A TW 108141671A TW 108141671 A TW108141671 A TW 108141671A TW 202033224 A TW202033224 A TW 202033224A
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base sequence
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TW108141671A
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吉見英治
吉岡克郎
山形哲也
元寶 秦
伊恩 羅伯特 湯普生
尼德西 康納
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日商安斯泰來製藥股份有限公司
日商摩大力斯醫療公司
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Abstract

本發明係關於包含以下鹼基序列之聚核苷酸： (a)編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列，及 (b)編碼靶向以下之導引RNA之鹼基序列：人類肌營養相關蛋白基因(Utrophin gene)之表現調節區中SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172所示區中長度18至24個核苷酸之連續區， 該等聚核苷酸預期可用於治療或預防杜興氏(DUCHENNE)肌肉萎縮症或貝克爾(BECKER)肌肉萎縮症。

Description

藉靶向肌營養相關蛋白基因治療肌肉萎縮症之方法
本發明係關於藉由靶向人類肌營養相關蛋白(UTRN)基因及類似者來治療肌肉萎縮症之方法。更特定言之本發明係關於藉由活化人類UTRN基因之表現來治療或預防肌肉萎縮症之方法及試劑，活化人類UTRN基因之表現係藉由使用靶向人類UTRN基因之特定序列之導引RNA及轉錄活化因子與CRISPR效應蛋白之融合蛋白及類似者。
肌肉萎縮症為與進行性肌肉萎縮及肌無力相關之遺傳疾病的通用術語。在肌肉萎縮症中，由X染色體上之肌肉萎縮蛋白基因之突變所引起的肌肉萎縮症包括杜興氏肌肉萎縮症(DUCHENNE muscular dystrophy) (DMD)及其輕度類型貝克爾肌肉萎縮症(BECKER muscular dystrophy) (BMD)。
DMD為最常見的遺傳進行性肌肉疾病，約3,500名男性新生兒中出現一例。其臨床症狀包括大約2歲至5歲肌無力，其後為肌無力進展，約10歲步行不能，及在二十多歲由於心臟衰竭或呼吸衰竭而死亡(參見WO 2009/044383，其以全文引用之方式併入本文中)。
眾所周知DMD由肌肉萎縮蛋白基因之突變所引起。肌肉萎縮蛋白基因存在於X染色體上，且為由約2,200,000個DNA鹼基組成的巨大基因。其自DNA轉錄成mRNA前驅物，藉由拼接進一步移除內含子，且產生由79個外顯子組成之mRNA (約14 kb)。將此mRNA轉譯成3685個胺基酸以產生肌肉萎縮蛋白。肌肉萎縮蛋白涉及肌肉細胞之膜穩定性之維持。在DMD患者中，由於突變發生在肌肉萎縮蛋白基因中，因此幾乎不表現肌肉萎縮蛋白且不能維持肌肉細胞之結構，由此導致肌無力。
BMD亦由肌肉萎縮蛋白基因之突變所引起；然而，其症狀與DMD相比一般較輕。DMD與BMD之臨床症狀之間的差異係基於在DMD中幾乎不表現功能性肌肉萎縮蛋白，然而在BMD中產生不完整但具功能性的肌肉萎縮蛋白。
即使現在，不存在作為肌肉萎縮症之病因療法的有效藥物，且執行諸如投與類固醇之症狀性療法。已提出複數種治療性策略來治療DMD及BMD，且基因療法方法作為策略中之一者已吸引注意。基因療法之目的為藉由向具有突變之肌肉細胞補充正常肌肉萎縮蛋白來達成正常肌肉萎縮蛋白之表現。然而，全長肌肉萎縮蛋白cDNA相對較大，長度為約14 kb；因此可經封裝的DNA之尺寸限制對於某些載體類腺相關病毒(AAV)載體而言可能為問題。已提出使用具有最小功能域之截短肌肉萎縮蛋白基因(迷你/微小肌肉萎縮蛋白基因)的方法(參見Sakamoto M.等人, Biochem Biophys Res Commun. 2002年5月17日; 293(4):1265-72，其以全文引用之方式併入本文中)作為此問題之一種解決方案。鑒於由引入肌肉萎縮蛋白至缺少肌肉萎縮蛋白之DMD患者中而誘發免疫響應之可能性，亦已報導一種使用肌營養相關蛋白(在本發明書中有時亦描述為「Utrophin」、「UTRN」等)用於減少此免疫響應之方法(參見Gilbert R.等人, Hum Gene Ther. 1999年5月20日; 10(8):1299-310，其以全文引用之方式併入本文中)。肌營養相關蛋白為與肌肉萎縮蛋白高度同源之細胞骨架蛋白，且存在於正常及DMD肌肉中，儘管以較低含量。肌營養相關蛋白cDNA如同肌肉萎縮蛋白一樣極大(超過10 kb)。亦已知肌營養相關蛋白能夠補償肌肉萎縮蛋白之肌肉細胞膜穩定功能(參見Gilbert R.等人, Hum Gene Ther. 1999年5月20日; 10(8):1299-310及Liao H.等人, Cell. 2017年12月14日; 171(7): 1495-507，其以全文引用之方式併入本文中)。
如靶向肌營養相關蛋白之基因療法，例如WO2015/018503揭示關於用於骨胳或心臟肌肉組織中之基因的表現之重組腺相關病毒(AAV)載體之發明，該基因包含肌肉特異性啟動子及編碼融合蛋白之基因，其中該融合蛋白包含： a)轉錄活化元件及 b) DNA結合元件， 其中該融合蛋白，當在該骨胳或心臟肌肉組織中表現時，能夠增加肌營養相關蛋白表現(參見WO2015/018503，其以全文引用之方式併入本文中)。在本發明中，將鋅指蛋白用作DNA結合元件。
另一方面，近年來已出現使用Cas9與去活化核酸酶活性(dCas9)及轉錄活化域或轉錄抑制域之組合的系統，其中目標基因之表現經由藉由使用導引RNA使蛋白靶向基因且不分裂基因之DNA序列來控制(WO2013/176772，其以全文引用之方式併入本文中)。預期其臨床應用(參見Dominguez A.等人, Nat Rev Mol Cell Biol. 2016年1月; 17(1): 5-15，其以全文引用之方式併入本文中)。然而，存在一個問題，編碼dCas9、導引RNA及共轉錄活化因子之複合體的序列超過代表活體內基因傳遞之最有前景方法之最常見病毒載體(例如AAV)之容量(參見Liao H.等人, Cell. 2017年12月14日; 171(7): 1495-507，其以全文引用之方式併入本文中)。
在2017年，據報導(a)藉由向引入Cas9基因之DMD模型小鼠(mdx小鼠)投與攜帶靶向小鼠UTRN且抑制Cas9 (dgUtrn)之DNA裂解能力的導引RNA及轉錄活化域之AAV，來增加UTRN之表現水平且亦提高握力；及(b)藉由向mdx小鼠共注射攜帶Cas9之AAV及攜帶前述dgUtrn及轉錄活化域之AAV，來提高握力(參見Liao H.等人, Cell. 2017年12月14日; 171(7): 1495-507，其以全文引用之方式併入本文中)。
因此，提供肌肉萎縮症(特定言之DMD及BMD)之新型治療方法為本發明之一個目標。
在以下詳細描述期間將變得顯而易見之此及其他目標已藉由本發明人之發現來達成，發明人之發現為人類UTRN基因(基因ID：7402)之表現可藉由使用靶向人類UTRN基因的特定序列之導引RNA及轉錄活化因子與核酸酶缺失CRISPR效應蛋白之融合蛋白來強烈活化。此外，本發明人已發現人類UTRN基因之表現可藉由攜帶編碼融合蛋白的鹼基序列及編碼導引RNA之鹼基序列的單一AAV載體，使用小型核酸酶缺失CRISPR效應蛋白及小型轉錄活化因子來強烈活化。
因此，本發明提供： (1)包含以下鹼基序列之聚核苷酸： (a)編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列，及 (b)編碼導引RNA之鹼基序列，該導引RNA靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區。 (2)如(1)之聚核苷酸，其中編碼導引RNA之鹼基序列包含SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之鹼基序列。 (3)如(1)或(2)之聚核苷酸，其包含至少兩個不同的編碼導引RNA之鹼基序列。 (4)如(1)至(3)中之任一者之聚核苷酸，其中轉錄活化因子為包含VP64及RTA之轉錄活化域之肽。 (5)如(4)之聚核苷酸，其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。 (6)如(1)至(5)中之任一者的聚核苷酸，其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dCas9。 (7)如(6)之聚核苷酸，其中dCas9來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )。 (8)如(1)至(7)中之任一者的聚核苷酸，其進一步包含編碼導引RNA之鹼基序列的啟動子序列及/或編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之啟動子序列。 (9)如(8)之聚核苷酸，其中編碼導引RNA之鹼基序列的啟動子序列係選自群組：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。 (10)如(8)或(9)之聚核苷酸，其中編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之啟動子序列係選自群組：EFS啟動子、EF-1α啟動子、CMV啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、Des啟動子、CAG啟動子及MYOD啟動子。 (11)如(8)至(10)中之任一者之聚核苷酸， 其中編碼導引RNA之鹼基序列包含SEQ ID NO: 45、46或59中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46或59中所列之鹼基序列， 轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列， 核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 用於編碼導引RNA之鹼基序列的啟動子序列為U6啟動子，及 用於編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之啟動子序列為CK8啟動子。 (12)如(11)之聚核苷酸， 其中編碼導引RNA之鹼基序列包含SEQ ID NO: 59中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 59中所列之鹼基序列。 (13)一種包含(1)至(12)中之任一者之聚核苷酸的載體。 (14)如(13)之載體，其中該載體為質體載體或病毒載體。 (15)如(14)之載體，其中病毒載體選自由以下組成之群：腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體及慢病毒載體。 (16)如(15)之載體，其中AAV載體選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV587 MTP、AAV588 MTP、AAV-B1、AAVM41、AAVrh74、AAVS1_P1及AAVS10_P1。 (17)如(16)之載體，其中AAV載體為AAV9。 (18)一種醫藥組合物，其包含(1)至(12)中之任一者的聚核苷酸或(13)至(17)中之任一者之載體。 (19)如(18)之醫藥組合物，其用於治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症。 (20)一種用於治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之方法，其包含向有需要之個體投與(1)至(12)中之任一者的聚核苷酸或(13)至(17)中之任一者之載體。 (21)如(1)至(12)中之任一者之聚核苷酸或如(13)至(17)中之任一者的載體之用途，其用於治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症。 (22)如(1)至(12)中之任一者之聚核苷酸或如(13)至(17)中之任一者的載體之用途，其用於製造用以治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之醫藥組合物。 (23)一種核糖核蛋白，其包含以下： (c)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白，及 (d)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區的導引RNA。 (24)如(23)之核糖核蛋白，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列。 (25)如(23)或(24)之核糖核蛋白，其中轉錄活化因子為包含VP64及RTA之轉錄活化域之肽。 (26)如(25)之核糖核蛋白，其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。 (27)如(23)至(26)中之任一者的核糖核蛋白，其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dCas9。 (28)如(27)之核糖核蛋白，其中dCas9來源於金黃色葡萄球菌。 (29)如(23)至(28)中之任一者的核糖核蛋白， 其中導引RNA包含SEQ ID NO: 194、195或197中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 194、195或197中所列之鹼基序列， 其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列，及 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌的dCas9。 (30)如(29)之核糖核蛋白，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 197中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 197中所列之鹼基序列。 (31)一種包含以下之組合物或套組，其用於活化人類肌營養相關蛋白基因之表現： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區的導引RNA或編碼該導引RNA之聚核苷酸。 (32)如(31)之組合物或套組，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基之SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列。 (33)如(31)或(32)之組合物或套組，其包含至少兩個不同導引RNA。 (34)如(31)至(33)中之任一者之組合物或套組，其中轉錄活化因子為包含VP64及RTA之轉錄活化域之肽。 (35)如(34)之組合物或套組，其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。 (36)如(31)至(35)中之任一者的組合物或套組，其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dCas9。 (37)如(36)之組合物或套組，其中dCas9來源於金黃色葡萄球菌。 (38)如(31)至(37)中之任一者之組合物或套組， 其中組合物或套組包含編碼融合蛋白之聚核苷酸及編碼導引RNA之聚核苷酸及 其中編碼融合蛋白之聚核苷酸進一步包含融合蛋白之啟動子序列及/或編碼導引RNA之聚核苷酸進一步包含導引RNA之啟動子序列。 (39)如(38)之組合物或套組，其中導引RNA之啟動子序列係選自群組：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。 (40)如(38)或(39)之組合物或套組，其中融合蛋白之啟動子序列係選自群組：EFS啟動子、EF-1α啟動子、CMV啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、Des啟動子、CAG啟動子及MYOD啟動子。 (41)如(38)至(40)中之任一者的組合物或套組，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 194、195或197中所列之鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 194、195或197中所列之鹼基序列， 其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 其中導引RNA之啟動子序列為U6啟動子，及 其中融合蛋白之啟動子序列為CK8啟動子。 (42)如(41)之組合物或套組，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 197中所列之鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 197中所列之鹼基序列。 (43)一種用於治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之方法，其包含投與以下(e)及(f)： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區的導引RNA或編碼該導引RNA之聚核苷酸。 (44)如(43)之方法，其中該導引RNA包含SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列，或編碼該導引RNA之聚核苷酸。 (45)如(43)或(44)之方法，其包含至少兩個不同的導引RNA。 (46)如(43)至(45)中之任一者的方法，其中轉錄活化因子為包含VP64及RTA之轉錄活化域之肽。 (47)如(46)之方法，其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。 (48)如(43)至(47)中之任一者的方法，其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dCas9。 (49)如(48)之方法，其中dCas9來源於金黃色葡萄球菌。 (50)如(43)至(49)中之任一者的方法， 其中該方法包含投與編碼融合蛋白之聚核苷酸及編碼導引RNA之聚核苷酸，及 其中編碼融合蛋白之聚核苷酸進一步包含融合蛋白之啟動子序列及/或編碼導引RNA的聚核苷酸進一步包含導引RNA之啟動子序列。 (51)如(50)之方法，其中導引RNA之啟動子序列係選自群組：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。 (52)如(50)或(51)之方法，其中融合蛋白之啟動子序列係選自群組：EFS啟動子、EF-1α啟動子、CMV啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、Des啟動子、CAG啟動子及MYOD啟動子。 (53)如(50)至(52)中之任一者的方法，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 194、195或197中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入、及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 194、195或197中所列之鹼基序列， 其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 其中導引RNA之啟動子序列為U6啟動子，及 其中融合蛋白之啟動子序列為CK8啟動子。 (54)如(53)之方法，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 197中所列之鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 197中所列之鹼基序列。 (55)以下(e)及(f)之用途： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區的導引RNA或編碼該導引RNA之聚核苷酸， 其用於製造用以治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之醫藥組合物。 (56)如(55)之用途，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列。 (57)如(55)或(56)之用途，其包含至少兩個不同的導引RNA。 (58)如(55)至(57)中之任一者之用途，其中轉錄活化因子為包含VP64及RTA之轉錄活化域的肽。 (59)如(58)之用途，其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。 (60)如(55)至(59)中之任一者之用途，其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dCas9。 (61)如(60)之用途，其中dCas9來源於金黃色葡萄球菌。 (62)如(55)至(61)中之任一者之用途， 其中該用途包含編碼融合蛋白之聚核苷酸的用途及編碼導引RNA之聚核苷酸的用途及 其中編碼融合蛋白之聚核苷酸進一步包含融合蛋白之啟動子序列及/或編碼導引RNA之聚核苷酸進一步包含導引RNA之啟動子序列。 (63)如(62)之用途，其中導引RNA之啟動子序列係選自群組：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。 (64)如(62)或(63)之用途，其中融合蛋白之啟動子序列係選自群組：EFS啟動子、EF-1α啟動子、CMV啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、Des啟動子、CAG啟動子及MYOD啟動子。 (65)如(62)至(64)中之任一者之用途，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 194、195或197中所列的鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基之SEQ ID NO: 194、195或197中所列的鹼基序列， 其中轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 其中導引RNA之啟動子序列為U6啟動子，及 其中融合蛋白之啟動子序列為CK8啟動子。 (66)如(65)之用途，其中導引RNA包含SEQ ID NO: 197中所列之鹼基序列，或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 197中所列之鹼基序列。 本發明之作用
根據本發明，人類肌營養相關蛋白基因之表現可經活化，且因此預期本發明能夠治療DMD及BMD。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2018年11月16日申請之美國臨時專利申請案第62/768,474號、2019年6月13日申請之美國臨時專利申請案第62/861,039號及2019年11月7日申請之美國臨時專利申請案第62/931,925號之優先權，其各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 較佳實施例之實施方式
下文詳細解釋本發明之實施例。 1. 聚核苷酸
本發明提供一種包含以下鹼基序列之聚核苷酸(在下文中有時亦稱為「本發明之聚核苷酸」)： (a)編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列，及 (b)編碼導引RNA之鹼基序列，該導引RNA靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸(亦即18至24個連續核苷酸)之連續區。
將本發明之聚核苷酸引入所需細胞中且經轉錄以產生核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白及靶向人類UTRN基因之表現調節區的特定區之導引RNA。此等融合蛋白及導引RNA形成複合體(在下文中複合體有時稱為「核糖核蛋白；RNP」)且合作性地作用於前述特定區，由此活化人類UTRN基因之轉錄。 (1)定義
在本發明書中，「人類肌營養相關蛋白(UTRN)基因之表現調節區」意謂任何區，其中可藉由使RNP結合該區而活化人類UTRN基因之表現。亦即，人類UTRN基因之表現調節區可存在於任何區中，諸如人類UTRN基因之啟動子區、增強子區、內含子及外顯子，只要藉由結合RNP來活化人類UTRN基因之表現即可。在本發明書中，當藉由特定序列展示表現調節區時，表現調節區在概念上包括有義股序列及反義股序列。
在本發明中，藉由導引RNA將核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白募集至人類UTRN基因之表現調節區的特定區中。在本發明書中，「靶向...之導引RNA」意謂「募集融合蛋白至...中之導引RNA」。
在本發明書中，「導引RNA (亦稱為「gRNA」)」為包含基因組特異性CRISPR-RNA (稱為「crRNA」)之RNA。crRNA為結合(下文描述之)靶向序列之互補序列的RNA。當Cpf1用作CRISPR效應蛋白時，「導引RNA」係指包含由crRNA及連接至其5'末端之特定序列組成的RNA之RNA (例如在FnCpf 1之情形下SEQ ID NO: 106中所列之RNA序列)。當Cas9用作CRISPR效應蛋白時，「導引RNA」係指包含crRNA及連接至其3'末端之反式活化crRNA (稱為「tracrRNA」)的嵌合體RNA (稱為「單導引RNA (sgRNA)」) (參見例如Zhang F.等人, Hum Mol Genet. 2014年9月15日; 23(R1):R40-6及Zetsche B.等人, Cell. 2015年10月22日; 163(3): 759-71，其以全文引用之方式併入本文中)。
在本發明書中，在人類UTRN基因之表現調節區中與crRNA所結合之序列互補的序列稱為「靶向序列」。亦即，在本發明書中，「靶向序列」為存在於人類UTRN基因之表現調節區中且鄰近於PAM (前間隔子鄰近基序)之DNA序列。當Cpf1用作CRISPR效應蛋白時，PAM鄰近於靶向序列之5'側。當Cas9用作CRISPR效應蛋白時，PAM鄰近於靶向序列之3'側。靶向序列可存在於人類UTRN基因之表現調節區的有義股序列側或反義股序列側上(參見例如前述Zhang F.等人, Hum Mol Genet. 2014年9月15日; 23(R1): R40-6及Zetsche B.等人, Cell. 2015年10月22日; 163(3): 759-71，其以全文引用之方式併入本文中)。 (2)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白
在本發明中，使用核酸酶缺失CRISPR效應蛋白、融合於其上之轉錄活化因子係募集至人類UTRN基因之表現調節區。待用於本發明中之核酸酶缺失CRISPR效應蛋白(在下文中僅稱為「CRISPR效應蛋白」)不受特定限制，只要其形成與gRNA之複合體且募集至人類UTRN基因之表現調節區即可。舉例而言，可包括核酸酶缺失Cas9(在下文中有時亦稱為「dCas9」)或核酸酶缺失Cpf1 (在下文中有時亦稱為「dCpf1」)。
上文提及的dCas9之實例包括(但不限於)化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes )源性Cas9之核酸酶缺失變異體((SpCas9；PAM序列：NGG (N為A、G、T或C，在下文中同樣))、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )源性Cas9 (StCas9；PAM序列：NNAGAAW (W為A或T，在下文中同樣))、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis )源性Cas9 (NmCas9；PAM序列：NNNNGATT)或金黃色葡萄球菌源性Cas9 (SaCas9；PAM序列：NNGRRT (R為A或G，在下文中同樣))及類似者(參見例如Nishimasu等人, Cell. 2014年2月27日; 156(5): 935-49, Esvelt KM等人, Nat Methods. 2013年11月; 10(11):1116-21, Zhang Y. Mol Cell. 2015年10月15日; 60(2):242-55及Friedland AE等人, Genome Biol. 2015年11月24日; 16:257，其以全文引用之方式併入本文中)。舉例而言，在SpCas9之情形下，可使用其中第10個Asp殘基轉換成Ala殘基且第840個His殘基轉換成Ala殘基之雙重突變體(有時稱為「dSpCas9」) (參見例如前述Nishimasu等人, Cell. 2014)。或者，在SaCas9之情形下，可使用其中第10個Asp殘基轉換成Ala殘基且第580個Asn殘基轉換成Ala殘基之雙重突變體(SEQ ID NO: 107)或其中第10個Asp殘基轉換成Ala殘基且第557個His殘基轉換成Ala殘基之雙重突變體(SEQ ID NO: 108) (在下文中此等雙重突變體中之任一者有時稱為「dSaCas9」) (參見例如前述Friedland AE等人, Genome Biol. 2015，其以全文引用之方式併入本文中)。
此外，在本發明之一個實施例中，亦可使用呈dCas9之形式的藉由修飾前述dCas9之胺基酸序列之一部分所獲得的變異體，其形成與gRNA之複合體且募集至人類UTRN基因之表現調節區。此等變異體之實例包括具有部分刪除之胺基酸序列的截短變異體。在本發明之一個實施例中，可使用呈dCas9之形式的PCT/JP2019/022795及PCT/JP2019/041751 (其以全文引用之方式併入本文中)中所揭示之變異體。具體而言，亦可使用藉由自dSaCas9刪除第721個至第745個胺基酸所獲得的dSaCas9，該dSaCas9為其中第10個Asp殘基轉換成Ala殘基且第580個Asn殘基轉換成Ala殘基之雙重突變體(SEQ ID NO: 109)；或其中經刪除部分經肽連接子取代(例如其中經刪除部分經GGSGGS連接子(SEQ ID NO: 110)取代之一者列於SEQ ID NO: 111中，且其中經刪除部分經SGGGS連接子(SEQ ID NO: 213)取代之一者列於SEQ ID NO: 214中等)的dSaCas9 (在下文中此等雙重突變體中之任一者有時稱為「dSaCas9[-25]」)；或藉由自為前述雙重突變體(SEQ ID NO: 112)之dSaCas9刪除第482個至第648個胺基酸所獲得的dSaCas9；或其中經刪除部分經肽連接子取代之dSaCas9 (其中經刪除部分經GGSGGS連接子取代之一者列於SEQ ID NO: 113中)。
上文提及的dCpf1之實例包括(但不限於)新兇手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida )源性Cpf1之核酸酶缺失變異體(FnCpf1；PAM序列：NTT)、胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp.)源性Cpf1 (AsCpf1；PAM序列：NTTT)或毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium )源性Cpf1 (LbCpf1；PAM序列：NTTT)及類似者(參見例如Zetsche B.等人, Cell. 2015年10月22日; 163(3):759-71、Yamano T等人, Cell. 2016年5月5日; 165(4):949-62及Yamano T等人, Mol Cell. 2017年8月17日; 67(4):633-45，其以全文引用之方式併入本文中)。舉例而言，在FnCpf1之情形下，可使用其中第971個Asp殘基轉換成Ala殘基且第1006個Glu殘基轉換成Ala殘基之雙重突變體(參見例如前述Zetsche B等人, Cell. 2015，其以全文引用之方式併入本文中)。在本發明之一個實施例中，亦可使用呈dCpf1之形式的藉由修飾前述dCpf1之胺基酸序列之一部分所獲得的變異體，其形成與gRNA之複合體且募集至人類UTRN基因之表現調節區。
在本發明之一個實施例中，dCas9用作核酸酶缺失CRISPR效應蛋白。在一個實施例中，dCas9為dSaCas9，且在一特定實施例中，dSaCas9為dSaCas9[-25]。
包含編碼CRISPR效應蛋白之鹼基序列的聚核苷酸可藉由例如合成oligoDNA引子及藉由PCR方法使用由產生蛋白作為模板之細胞製備的總RNA或mRNA部分擴增聚核苷酸來選殖，該oligoDNA引子覆蓋編碼基於其cDNA序列資訊之蛋白的所需部分之區。此外，包含編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白之鹼基序列的聚核苷酸可藉由經已知定點突變誘發方法引入突變至編碼選殖CRISPR效應蛋白之核苷酸序列中以在對於DNA裂解活性而言重要之位點將胺基酸殘基(可包括例如在SaCas9之情形下第10個Asp殘基、第557個His殘基及第580個Asn殘基；在FnCpf1之情形下第917個Asp殘基及第1006個Glu殘基及類似者，但不限於此等)轉換成其他胺基酸。
或者，包含編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白之鹼基序列的聚核苷酸可藉由化學合成或化學合成與PCR方法或吉布森組裝(Gibson Assembly)方法之組合基於其cDNA序列資訊來獲得，且亦可進一步構建為經受密碼子最佳化以得到適合於在人類中表現之密碼子的鹼基序列。 (3)轉錄活化因子
在本發明中，人類UTRN基因表現藉由與核酸酶缺失CRISPR效應蛋白融合之轉錄活化因子之作用來活化。在本發明書中，「轉錄活化因子」意謂具有活化人類UTRN基因之基因轉錄的能力或保持其功能的肽片段之蛋白。待用於本發明中之轉錄活化因子不受特定限制，只要其可活化人類UTRN基因之表現即可。舉例而言，其包括VP64、VPH、VPR、miniVR及microVR、其具有轉錄活化能力之變異體及類似者。VP64為由SEQ ID NO: 114中所列之50個胺基酸組成的肽。VPH為VP64、p65與HSF1之融合蛋白，具體而言，為由SEQ ID NO: 115中所列之376個胺基酸組成的肽。VPR為VP64、p65及艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus) 之複製品與轉錄活化因子(RTA)之融合蛋白，例如由SEQ ID NO: 116中所列之523個胺基酸組成的肽、由SEQ ID NO: 216中所列之519個胺基酸組成的肽及類似者。VP64、VPH及VPR為吾人所知且詳細揭示於例如Chavez A.等人, Nat Methods. 2016年7月; 13(7):563-7及Chavez A.等人, Nat Methods. 2015年4月; 12(4):326-8中，其以全文引用之方式併入本文中。在本發明之一個實施例中，可使用呈轉錄活化因子形式的包含VP64及RTA之轉錄活化域之肽。RTA之轉錄活化域為已知的且揭示於例如J Virol. 1992年9月;66(9):5500-8 (其以全文引用之方式併入本文中)及類似者中。作為此等肽之序列，miniVR為由SEQ ID NO: 117中所列之167個胺基酸組成的肽，且microVR為由SEQ ID NO: 118中所列之140個胺基酸組成的肽。SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列由其中RTA之第493個至第605個胺基酸殘基(其為RTA之較短轉錄活化域)及VP64與G-S-G-S連接子鍵聯之胺基酸序列組成(SEQ ID NO: 209)。SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列由其中RTA之第520個至第605個胺基酸殘基(其為RTA之短得多的轉錄活化域)及VP64與G-S-G-S連接子鍵聯之胺基酸序列組成。miniVR及microVR之詳情描述於PCT/JP2019/030972中，其以全文引用之方式併入本文中。可對前述轉錄活化因子中之任一者進行任何修飾及/或改變，只要其保持其轉錄活化能力即可。舉例而言，亦可使用(i)包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列的肽；(ii)包含刪除、取代、插入及/或添加1個或若干(例如2個、3個、4個、5個或更多個)胺基酸之SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列的肽；(iii)包含與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列不低於90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上)一致的胺基酸序列之肽；(iv)由刪除、取代、插入及/或添加1個或若干(例如2個、3個、4個、5個或更多個)胺基酸之SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列組成的肽；或(v)由與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列不低於90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上)一致的胺基酸序列組成之肽作為本發明中之轉錄活化因子，只要其保持轉錄活化能力。舉例而言，亦可使用(i)包含SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列的肽；(ii)包含刪除、取代、插入及/或添加1個或若干(例如2個、3個、4個、5個或更多個)胺基酸之SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列的肽；(iii)由與SEQ ID NO: 118中所示之胺基酸序列不低於90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上)一致的胺基酸序列組成之肽；(iv)由刪除、取代、插入及/或添加1個或若干(例如2個、3個、4個、5個或更多個)胺基酸之SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列組成的肽；或(v)由與SEQ ID NO: 118中所列之胺基酸序列不低於90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上)一致的胺基酸序列組成之肽作為本發明中之轉錄活化因子，只要其保持轉錄活化能力。
包含編碼轉錄活化因子之鹼基序列的聚核苷酸可藉由化學合成或化學合成與PCR方法或吉布森組裝方法之組合來構建。此外，包含編碼轉錄活化因子之鹼基序列的聚核苷酸亦可構建為經密碼子最佳化之DNA序列以成為適合於在人類中表現之密碼子。
包含編碼轉錄活化因子與核酸酶缺失CRISPR效應蛋白之融合蛋白的鹼基序列之聚核苷酸可藉由將編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白之鹼基序列與編碼轉錄活化因子之鹼基序列直接接合或在添加編碼連接子之鹼基序列、NLS (核定位信號)、標籤及/或其他之後接合來製備。在本發明中，轉錄活化因子可與CRISPR效應蛋白之N-末端或C-末端融合。可使用胺基酸數目為約2至50之連接子作為連接子，且其具體實例包括(但不限於)其中甘胺酸(G)及絲胺酸(S)交替連接之G-S-G-S連接子及類似者。 (4)導引RNA
在本發明中，可藉由導引RNA將核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白募集至人類UTRN基因之表現調節區。如前述「(1)定義」中所述，導引RNA包含crRNA，且crRNA結合至靶向序列之互補序列。crRNA可能不完全與靶向序列之互補序列互補，只要導引RNA可將融合蛋白募集至目標區即可，且可包含其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至3個鹼基的靶向序列之鹼基序列。
當將dCas9用作核酸酶缺失CRISPR效應蛋白時，例如，可使用公開的gRNA設計設計網站(CRISPR Design Tool、CRISPR direct等)來確定靶向序列。為了特異性，在目標基因(亦即人類UTRN基因)之序列中，列舉長度為約20個核苷酸之候選靶向序列(其中PAM (例如SaCas9之情形下的NNGRRT)鄰近於其3'側)，且從此等候選靶向序列之中在人類基因組中具有少數偏離目標位點之一者可用作靶向序列。靶向序列之鹼基長度為18至24個核苷酸，較佳地長度為20至23個核苷酸，更佳地長度為21至23個核苷酸。作為用於偏離目標位點數目之預測的初次篩選，許多生物資訊學工具為吾人所知且可公開獲得，且可用以預測具有最低偏離目標作用之靶向序列。其實例包括生物資訊工具諸如Benchling (https://benchling.com)及COSMID (具有錯配、插入及刪除之CRISPR偏離目標位點) (在網際網路https://crispr.bme.gatech.edu上可獲得)。使用此等，可彙總與由gRNA靶向之鹼基序列的相似性。當待使用之gRNA設計軟體不具有探索目標基因組之偏離目標位點的功能時，例如可藉由根據候選靶向序列(具有靶向核苷酸序列之高識別能力之種子序列)之3'側上的8至12個核苷酸對目標基因組進行Blast檢索來檢索偏離目標位點。
在本發明之一個實施例中，在存在於人類染色體6 (Chr 6)之GRCh38.p12位置中的區中，以下五個區可為人類UTRN基因之表現調節區。藉由組蛋白修飾模式強烈建議此等區為表現調節區。因此，在本發明之一個實施例中，在存在於人類染色體6 (Chr 6)之GRCh38.p12中的以下五個區之至少一個區中靶向序列長度可為18至24個核苷酸，較佳地長度為20至23個核苷酸，更佳地長度為21至23個核苷酸： (1) 144,215,500-144,217,000， (2) 144,248,500-144,249,800， (3) 144,264,000-144,267,000， (4) 144,283,900-144,288,300， (5) 144,292,500-144,295,500。
在本發明之一個實施例中，在存在於上文提及的區(3)中之SEQ ID NO: 104中所列或存在於上文提及的區(4)中之SEQ ID NO: 105、135、141、153、167或172中所列之區中，靶向序列長度可為連續性的18至24個核苷酸，較佳地長度為20至23個核苷酸，更佳地長度為21至23個核苷酸。
在本發明之另一實施例中，靶向序列可為SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之鹼基序列。SEQ ID NO: 45及46中所列之鹼基序列為包含於前述SEQ ID NO: 104中所列之區中的靶向序列，且SEQ ID NO: 58、59、60、155、156、157及159中所列之鹼基序列為包含於前述SEQ ID NO: 105中所列之區中的靶向序列。
在本發明之一個實施例中，編碼crRNA在鹼基序列可為與靶向序列相同的鹼基序列。舉例而言，當將SEQ ID NO: 4 (AGAAAAGCGGCCCCTAGGGGC)中所列之靶向序列引入細胞中作為編碼crRNA之鹼基序列時，自序列轉錄之crRNA為AGAAAAGCGGCCCCUAGGGGC (SEQ ID NO: 119)且結合於GCCCCTAGGGGCCGCTTTTCT (SEQ ID NO: 120)，該SEQ ID NO: 120為與SEQ ID NO: 4中所列之鹼基序列互補的序列且存在於人類UTRN基因之表現調節區中。在另一實施例中，為靶向序列(其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至3個鹼基)之鹼基序列可用作編碼crRNA之鹼基序列，只要導引RNA可募集融合蛋白至目標區即可。因此，在本發明之一個實施例中，可使用SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之鹼基序列作為編碼crRNA之鹼基序列。
在本發明之一個實施例中，SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之鹼基序列可用作編碼crRNA之鹼基序列以分別產生包含SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之crRNA的gRNA。在本發明之另一實施例中，gRNA可包含SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列。
當將dCpf1用作核酸酶缺失CRISPR效應蛋白時，編碼gRNA之鹼基序列可經設計為編碼crRNA之DNA序列，其中特定RNA連接至5'末端。連接至crRNA之5'末端的此等RNA及編碼該RNA之DNA序列可藉由一般熟習此項技術者根據待使用之dCpf1來適當選擇。舉例而言，當使用dFnCpf1時，其中SEQ ID NO: 121；AATTTCTAC TGTTGTAGA T連接至靶向序列之5'側的鹼基序列可用作編碼gRNA之鹼基序列(當轉錄成RNA時，加下劃線部分之序列形成鹼基對以形成莖環結構)。待添加至5'末端之序列可為一般用於各種Cpf1蛋白之序列，其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至6個鹼基，只要在轉錄之後gRNA可募集融合蛋白至表現調節區即可。
當將dCas9用作CRISPR效應蛋白時，編碼gRNA之鹼基序列可經設計為DNA序列，其中編碼已知tracrRNA之DNA序列連接至編碼crRNA之DNA序列的3'末端。此等tracrRNA及編碼tracrRNA之DNA序列可藉由一般熟習此項技術者根據待使用之dCas9適當選擇。舉例而言，當使用dSaCas9時，將SEQ ID NO: 122中所列之鹼基序列用作編碼tracrRNA之DNA序列。編碼tracrRNA之DNA序列可為一般用於各種Cas9蛋白質的編碼tracrRNA之鹼基序列，其中刪除、取代、插入及/或添加至少1至6個鹼基，只要在轉錄之後gRNA可募集融合蛋白至表現調節區即可。
以此方式設計的包含編碼gRNA之鹼基序列的聚核苷酸可使用已知DNA合成方法來化學合成。
在本發明之另一實施例中，本發明之聚核苷酸可包含至少兩個不同的編碼gRNA之鹼基序列。舉例而言，聚核苷酸可包含至少兩個不同的編碼導引RNA之鹼基序列，其中至少兩個不同的鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之序列的鹼基序列。在本發明之一個實施例中，聚核苷酸可包含至少兩個不同的編碼導引RNA之鹼基序列，其中至少兩個不同的鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列。 (5)啟動子序列
在本發明之一個實施例中，可將啟動子序列可操作地連接至編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列及/或編碼gRNA之鹼基序列中之每一者之上游。可能連接之啟動子不受特定限制，只要其在目標細胞中展示啟動子活性即可。可能連接至編碼融合蛋白之鹼基序列的上游之啟動子序列之實例包括(但不限於)EFS啟動子、EF-1α啟動子、CMV (細胞巨大病毒(細胞巨大病毒))啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、MLC啟動子、Des啟動子、cTnC啟動子、MYOD啟動子、hTERT啟動子、SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CAG啟動子、RSV (勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))啟動子及類似者。可能連接至編碼gRNA之鹼基序列的上游之啟動子序列之實例包括(但不限於)U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子、H1啟動子及為pol III啟動子的tRNA啟動子及類似者。在本發明之一個實施例中，當聚核苷酸包含兩個或更多個編碼導引RNA之鹼基序列時，可將單一啟動子序列可操作地連接至兩個或更多個鹼基序列之上游。在另一實施例中，可將啟動子序列可操作地連接至兩個或更多個鹼基序列中之每一者的上游，其中可操作地連接至各鹼基序列之啟動子序列可為相同或不同的。
在本發明之一個實施例中，可將肌肉特異性啟動子用作連接至編碼前述融合蛋白的鹼基序列之上游。肌肉特異性啟動子之實例包括(但不限於)CK8啟動子、CK6啟動子、CK1啟動子、CK7啟動子、CK9啟動子、心臟肌肉肌鈣蛋白C啟動子、α肌蛋白啟動子、肌凝蛋白重鏈激酶(MHCK)啟動子、肌凝蛋白輕鏈2A啟動子、肌肉萎縮蛋白啟動子、肌肉肌胺酸激酶啟動子、dMCK啟動子、tMCK啟動子、enh348 MCK啟動子、合成C5-12(Syn)啟動子、Myf5啟動子、MLC1/3f啟動子、MYOD啟動子、Myog啟動子、Pax7啟動子、Des啟動子及類似者(對於肌肉特異性啟動子之詳情，參見例如以全文引用之方式併入本文中之US2011/0212529A、McCarthy JJ等人, Skeletal Muscle. 2012年5月; 2(1):8、Wang B.等人, Gene Ther. 2008年11月; 15(22):1489-99及類似者)。
在本發明之一個實施例中，可將U6啟動子用作編碼gRNA之鹼基序列的啟動子序列，及可將CK8啟動子用作編碼融合蛋白之鹼基序列的啟動子序列。具體而言，對於U6啟動子，可使用以下鹼基序列：(i) SEQ ID NO: 128中所列之鹼基序列；(ii)在目標細胞中具有啟動子活性的SEQ ID NO: 128中所列之鹼基序列，其中刪除、取代、插入及/或添加1個或若干(例如2個、3個、4個、5個或更多個)鹼基；或(iii)與在目標細胞中展示啟動子活性的SEQ ID NO: 128中所列之鹼基序列不低於90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)一致之鹼基序列。對於CK8啟動子，可使用以下鹼基序列；(i)SEQ ID NO: 191中所列之鹼基序列；(ii)在目標細胞中具有啟動子活性的SEQ ID NO: 191中所列之鹼基序列，其中刪除、取代、插入及/或添加1個或若干(例如2個、3個、4個、5個或更多個)鹼基；或(iii)與在目標細胞中展示啟動子活性的SEQ ID NO: 191中所列之鹼基序列不低於90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)一致之鹼基序列。 (6)其他鹼基序列
此外，除上文所提及之用於改善藉由編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之轉錄而產生的mRNA之轉譯效率之目的的彼等序列以外，本發明之聚核苷酸可進一步包含已知序列，諸如多腺苷酸化(polyA)信號、Kozak共同序列及類似者。舉例而言，本發明中之多腺苷酸化信號可包括hGH polyA、bGH polyA、2x sNRP-1 polyA (參見US7557197B2，其以全文引用之方式併入本文中)等等。此外，本發明之聚核苷酸可包含編碼連接子序列之鹼基序列、編碼NLS之鹼基序列及/或編碼標籤之鹼基序列。 (7)本發明之例示性實施例
在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列， 用於編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列的啟動子序列， 一或兩個編碼導引RNA之鹼基序列，其中一或兩個鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列或包含其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列，及 用於編碼導引RNA之鹼基序列之U6啟動子， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dSaCas9或dSaCas9[-25]， 其中轉錄活化因子係選自群組：VP64、VPH、VPR、miniVR及microVR，及 其中用於編碼融合蛋白之鹼基序列的啟動子序列係選自群組：EF-1α啟動子、EFS啟動子及CK8啟動子。 聚核苷酸可進一步包含hGH polyA、GH polyA或2x sNRP-1 polyA。
在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列， 用於編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之CK8啟動子， 一或兩個編碼導引RNA之鹼基序列，其中一或兩個鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列或包含其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列，及 用於編碼導引RNA之鹼基序列之U6啟動子， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dSaCas9或dSaCas9[-25]，及 其中轉錄活化因子為miniVR或microVR。 聚核苷酸可進一步包含bGH polyA或2x sNRP-1 polyA。
在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列， 用於編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之CK8啟動子， 一或兩個編碼導引RNA之鹼基序列，其中一或兩個鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列或包含其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列，及 用於編碼導引RNA之鹼基序列之U6啟動子， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dSaCas9及 其中轉錄活化因子為miniVR。 聚核苷酸可進一步包含bGH polyA或2x sNRP-1 polyA。
在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列， 用於編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之CK8啟動子， 一或兩個編碼導引RNA之鹼基序列，其中一或兩個鹼基序列係選自包含SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列或包含其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46或59中所列之序列的鹼基序列，及 用於編碼導引RNA之鹼基序列之U6啟動子， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dSaCas9及 其中轉錄活化因子為microVR。 聚核苷酸可進一步包含bGH polyA或2x sNRP-1 polyA。
在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列， 用於編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之CK8啟動子， 編碼導引RNA之鹼基序列，該導引RNA包含SEQ ID NO: 59中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 59中所列之鹼基序列，及 用於編碼導引RNA之鹼基序列之U6啟動子， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dSaCas9及 其中轉錄活化因子為miniVR。 聚核苷酸可進一步包含2x sNRP-1 polyA。
在本發明之一個實施例中，提供一種聚核苷酸，其包含： 編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列， 用於編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之CK8啟動子， 編碼導引RNA之鹼基序列，該導引RNA包含SEQ ID NO: 59中所列之鹼基序列或其中刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 59中所列之鹼基序列，及 用於編碼導引RNA之鹼基序列之U6啟動子， 其中核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dSaCas9及 其中轉錄活化因子為microVR。 聚核苷酸可進一步包含2x sNRP-1 polyA。
在本發明之聚核苷酸之一實施例中，聚核苷酸自5'端依序包含(i)編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列及(ii)編碼gRNA之鹼基序列。在另一實施例中，聚核苷酸自5'端依序包含(ii)編碼gRNA之鹼基序列及(i)編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列。 2. 載體
本發明提供一種含本發明之聚核苷酸的載體(在下文中有時稱為「本發明之載體」)。本發明之載體可為質體載體或病毒載體。
當本發明之載體為質體載體時，待使用之質體載體不受特定限制且可為任何質體載體，諸如選殖質體載體及表現質體載體。質體載體藉由經已知方法將本發明之聚核苷酸插入質體載體中來製備。
當本發明之載體為病毒載體時，待使用之病毒載體不受特定限制且其實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體、仙台病毒(Sendaivirus)載體及類似者。在本發明書中，「病毒載體(virus vector/viral vector)」亦包括其衍生物。考慮在基因療法中之使用，較佳將AAV載體用於使得其可長期表現轉基因且及來源於非病原性病毒並具有高安全性之原因。
包含本發明之聚核苷酸的病毒載體可藉由已知方法來製備。簡言之，製備用於病毒表現之已插入本發明之聚核苷酸的質體載體，將載體轉染至適當之宿主細胞中以瞬時產生包含本發明之聚核苷酸的病毒載體，且收集病毒載體。
在本發明之一個實施例中，當使用AAV載體時，AAV載體之血清型不受特定限制，只要可活化人類UTRN基因在目標中之表現即可，且可使用AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10及類似者中之任一者(對於AAV之各種血清型，參見例如WO 2005/033321及EP2341068 (A1)，其以全文引用之方式併入本文中)。AAV之變異體之實例包括(但不限於)具有經改質之衣殼的新穎血清型(例如WO 2012/057363，其以全文引用之方式併入本文中)及類似者。舉例而言，在本發明之一個實施例中，可使用改善肌肉細胞之傳染性的具有經改質之衣殼之新穎血清型，諸如AAV587 MTP、AAV588 MTP、AAV-B1、AAVM41、AAVS1_P1及AAVS10_P1及類似者(參見Yu等人, Gene Ther. 2009年8月;16(8):953-62、Choudhury等人, Mol Ther. 2016年8月;24(7):1247-57、Yang等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009年3月10日;106(10):3946-51及WO2019/207132，其以全文引用之方式併入本文中)。
當製備AAV載體時，可使用已知方法，諸如(1)使用質體之方法；(2)使用桿狀病毒(baculovirus)之方法；(3)使用單純疱疹病毒(herpes simplex virus)之方法；(4)使用腺病毒之方法；或(5)使用酵母菌之方法(例如Appl Microbiol Biotechnol. 2018; 102(3): 1045-1054等，其以全文引用之方式併入本文中)。舉例而言，當藉由使用質體之方法製備AAV載體時，首先，製備載體質體，其包含在野生型AAV基因組序列之兩端處的反向末端重複(ITR)及插入編碼Rep蛋白及衣殼蛋白之DNA的位置中之本發明之聚核苷酸。另一方面，將形成病毒顆粒所需之編碼Rep蛋白及衣殼蛋白之DNA插入至其他質體中。此外，將AAV之增殖所需的負責腺病毒之輔助作用之包含基因(E1A、E1B、E2A、VA及E4orf6)的質體製備為腺病毒輔助質體。此等三個種類之質體共轉染至宿主細胞中引起在細胞中產生重組AAV (亦即AAV載體)。較佳使用能夠供應負責前述輔助作用之基因的基因產物(蛋白)之一部分的細胞(例如293細胞等)作為宿主細胞。當使用此等細胞時，其不必攜帶基因，該基因編碼可由前述腺病毒輔助質體中之宿主細胞供應的蛋白。所產生之AAV載體存在於核中。因此，所需AAV載體係藉由用冷凍-解凍破壞宿主細胞，收集病毒且隨後藉由使用氯化銫的密度梯度超速離心方法、管柱方法或類似者對病毒溶離份進行分離及純化來製備。
就安全性、基因轉導效率及類似者而言AAV載體具有極大優勢，且將其用於基因療法。然而，眾所周知可封裝入AAV載體中之聚核苷酸之尺寸受限制。舉例而言，在本發明之一個實施例中，包括聚核苷酸之鹼基長度的總長度為約4.85 kb，該聚核苷酸包含編碼dSaCas9與miniVR或microVR之融合蛋白的鹼基序列、編碼靶向人類UTRN基因之表現調節區的gRNA之鹼基序列、及EFS啟動子序列或CK8啟動子序列及U6啟動子序列作為啟動子序列、及ITR部分，且可將其封裝在單一AAV載體中。 3. 醫藥組合物
本發明亦提供包含本發明之聚核苷酸或本發明之載體的醫藥組合物(在下文中有時稱為「本發明之醫藥組合物」)。本發明之醫藥組合物可用於治療或預防DMD或BMD。
本發明之醫藥組合物包含本發明之聚核苷酸或本發明之載體作為活性成分，且可製備為包含此等活性成分(亦即本發明之聚核苷酸或本發明之載體)及(一般而言)醫藥學上可接受之載劑的調配物。
本發明之醫藥組合物係非經腸投與，且可局部或系統地投與。本發明之醫藥組合物可藉由(但不限於)例如靜脈內投與、動脈內投與、皮下投與、腹膜內投與或肌肉內投與來投與。
給個體之本發明之醫藥組合物之劑量不受特定限制，只要其為用於治療及/或預防之有效量即可。其可根據活性成分、劑型、個體之年齡及體重、投與時程、投與方法及類似者來適當最佳化。
在本發明之一個實施例中，可不僅向受DMD或BMD影響之個體投與且亦向基於基因背景分析及類似者在未來可能罹患DMD或BMD之受試者防治性地投與本發明之醫藥組合物。在本發明書中，除治癒疾病以外術語「治療」亦包括緩解疾病。此外，除防治疾病之發作以外術語「預防」亦可包括延緩疾病之發作。本發明之醫藥組合物亦可稱為「本發明之試劑」或類似者。 4. 用於治療或預防DMD或BMD之方法
本發明亦提供一種用於治療或預防DMD或BMD之方法(在下文中有時稱為「本發明之方法」)，其包含向有需要之個體投與本發明之聚核苷酸或本發明之載體。此外，本發明包括將本發明之聚核苷酸或本發明之載體用於治療或預防DMD或BMD。此外，本發明包括本發明之聚核苷酸或本發明之載體在製造用於治療或預防DMD或BMD之醫藥組合物中的用途。
本發明之方法可藉由向受DMD或BMD之影響的個體投與本發明之前述醫藥組合物來實踐，且劑量、投與途徑、個體及類似者與上文所提及之彼等相同。
可在開始使用本發明之方法治療之前及治療之後的任何時機執行症狀之量測以確定個體對治療之響應。
本發明之方法可改善個體之骨胳肌肉及/或心臟肌肉之功能。待改善功能之肌肉不受特別限制，且任何肌肉及肌肉組為例示性的。 5. 核糖核蛋白
本發明提供一種包含以下之核糖核蛋白(在下文中有時稱為「本發明之RNP」)： (c)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白，及 (d)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區的導引RNA。
可使用上文提及之章節「1.聚核苷酸」中詳細解釋之核酸酶缺失CRISPR效應蛋白、轉錄活化因子及導引RNA作為本發明之RNP中所包含的核酸酶缺失CRISPR效應蛋白、轉錄活化因子及導引RNA。本發明之RNP中所包含之核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子的融合蛋白可藉由例如將編碼融合蛋白之聚核苷酸引入細胞、細菌或其他生物體中以允許表現或藉由使用聚核苷酸的活體外轉譯系統來產生。此外，本發明之RNP中所包含之導引RNA可藉由例如化學合成或藉由使用編碼導引RNA的聚核苷酸之活體外轉錄系統來產生。將由此製備之融合蛋白與導引RNA混合以製備本發明之RNP。必要時，可混合其他物質，諸如金顆粒。為直接遞送本發明之RNP至目標細胞、組織及類似者，可藉由已知方法將RNP包封在脂質奈米顆粒(LNP)中。可藉由已知方法將本發明之RNP引入目標細胞、組織及類似者中。舉例而言，對於囊封於LNP中及引入方法，可指以全文引用之方式併入本文中的Lee K.,等人, Nat Biomed Eng. 2017; 1:889-901、WO 2016/153012及類似者。
在本發明之一個實施例中，本發明之RNP中所包含之導引RNA靶向存在於人類染色體6 (Chr 6)之GRCh38.p12位置中的以下五個區之至少一個區中之連續18至24個核苷酸長度，較佳地20至23個核苷酸長度，更佳地21至23個核苷酸長度： (1) 144,215,500-144,217,000， (2) 144,248,500-144,249,800， (3) 144,264,000-144,267,000， (4) 144,283,900-144,288,300， (5) 144,292,500-144,295,500。
在一個實施例中，導引RNA靶向SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之DNA序列中之連續18至24個核苷酸長度，較佳地20至23個核苷酸長度，更佳地21至23個核苷酸長度之鹼基序列。在一個實施例中，導引RNA靶向包含SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之序列之全部或一部分的區。在本發明之一個實施例中，可分別使用包含SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之crRNA或其中刪除、取代、插入、及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206或207中所列之鹼基序列之導引RNA。 6. 其他
本發明亦提供一種用於活化人類肌營養相關蛋白基因之表現的組合物或套組，其包含以下： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區的導引RNA或編碼該導引RNA之聚核苷酸。
本發明亦提供一種用於治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之方法，其包含投與以下(e)及(f)： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區的導引RNA或編碼該導引RNA之聚核苷酸。
本發明亦提供以下(e)及(f)之用途： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中的SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172中所列之區中的長度為18至24個核苷酸之連續區的導引RNA或編碼該導引RNA之聚核苷酸， 其用於製造用以治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之醫藥組合物。
可使用上文提及之章節「1.聚核苷酸」、「2.載體」及「5.核糖核蛋白」中詳細解釋之彼等作為此等發明中的核酸酶缺失CRISPR效應蛋白、轉錄活化因子、導引RNA以及編碼其之聚核苷酸及運載其之載體。上文提及之(e)及(f)之劑量、投與途徑、個體、調配物及類似者與章節「3.用於DMD或BMD之治療或預防試劑」中解釋之彼等相同。
本發明之其他特徵在例示性實施例的以下描述過程中將變得顯而易見，該等例示性實施例為了說明本發明而給出且不欲對其進行限制。 實例
實例描述使用dCas9與轉錄活化因子之融合蛋白以在人類UTRN基因之界定的表現調節區中增強基因表現，從而引起人類UTRN基因表現之選擇性活化。基因表現之修改的目標為增強野生型人類UTRN基因產物之表現而補充缺陷性肌肉萎縮蛋白基因產物之功能。實例亦描述賦予人類UTRN基因之選擇性活化而未最低限度地影響其他基因之表現的特異性基因組區之定義。本發明之增強人類UTRN基因表現之方法代表如本文所述及說明的用於改善由缺陷性肌肉萎縮蛋白所引起的缺陷性肌肉功能之新型治療性或預防性策略。 實例1.使用HEK293FT細胞篩選人類肌營養相關蛋白基因之gRNA
在此實例中，吾人說明使用本文所描述之方法以經由靶向UTRN基因之所界定的表現調節區來達成UTRN基因之活化。該等方法利用待藉由設計適當之sgRNA序列募集至基因組之所需基因座的Cas9與sgRNA之複合體之特性。該等方法亦利用SaCas9蛋白之核酸酶缺失形式(D10A及N580A突變體(SEQ ID NO: 107)或D10A及H557A突變體(SEQ ID NO: 108)；dSaCas9)以將基因組序列完整但繫鏈不同的轉錄/表觀遺傳功能性域或基序留給dSaCas9以達成由sgRNA序列靶向之預期基因座之所需修改，如Gilbert LA等人, Cell 2013年7月; 154(2):442-51及Gilbert LA等人, Cell 2014年10月; 159(3):647-61中所述，其以全文引用之方式併入本文中。
在此實例中，吾人說明本文所描述之方法可用於活化野生型UTRN之表現。sgRNA經設計以靶向賦予選擇性及有效基因活化之UTRN基因之表現調節區。圖1展示人類UTRN基因座及兩個預測轉錄開始位點(TSS) (頂部及中間)。UTRN基因之TSS藉由查詢FANTOM5人類啟動子組資料庫(www.fantom.gsc.riken.jp, Nature 2014年3月; 507(7493):462-70，其以全文引用之方式併入本文中)來鑑定。報導兩個用於UTRN基因之啟動子區(啟動子A及B)，且吾人已針對活化測試兩個啟動子。導引RNA序列經設計以覆蓋以上區以便確定此等區內之有效及選擇性治療性序列。 (1)  實驗方法 sgRNA序列之選擇
當將結合dSaCas9與sgRNA之複合體時，針對潛在的識別序列掃描關於UTRN基因之啟動子區的序列(對於啟動子A (Chr6: GRCh38/hg38; 144,283,900-144,288,300)大約4.4 kb且對於啟動子B (Chr6: GRCh38/hg38; 144,342,683-144,345,311)大約2.6 kb)。針對具有序列NNGRRT之前間隔子相鄰基序(PAM)掃描該等區。鑑定鄰近於PAM之靶向序列。將靶向序列(雜合至目標DNA之gRNA之部分)的長度設定為21個核苷酸。靶向序列係基於由Benchling軟體(https://benchling.com)產生之預測特異性及效率選擇，且均勻分佈於整個所選區中。亦參考來自ENCODE研究(The ENCODE Project Consortium, Nature. 2012年9月; 489: 57-74，其以全文引用之方式併入本文中)之關於UTRN表現調節區之表觀遺傳資訊以選擇具有結合至基因之功能元件之高似然性的gRNA。
針對UTRN基因表現之調節功能測試表1中所列之二十四個靶向序列(導引編號sgED3-1至sgED3-24 (SEQ ID No: 129至152)) (在下文中表1中所列之靶向序列有時稱為「sgED3系列」)。
靶向序列在UTRN基因中之位置亦展示於圖1中(頂部及中間)。
分別將所選24個靶向序列及對照非靶向序列(SEQ ID NO: 177)與編碼tracr RNA之DNA序列(SEQ ID NO: 122)融合以形成sgRNA序列，且選殖至來自Genecopoeia的pCRISPR-LvSG03載體(編號pCRISPR-LvSG03)中。在本說明書中所獲得的載體表示為pCRISPR-LvSG03 sgRNA表現載體。藉由U6啟動子及SV40啟動子下的經載體表現之mCherry-IRES-嘌呤黴素基因驅動sgRNA表現以促進sgRNA表現細胞之追蹤及選擇。 效應分子之選殖
核酸酶缺失SaCas9蛋白(D10A及N580A，或D10A及H557A；dSaCas9)以直接融合蛋白形式充當繫鏈功能性域/基序之主要架構。使dSaCas9在其N末端(胺基酸序列由SEQ ID NO: 178展示，DNA序列由SEQ ID NO: 179展示)及C末端(胺基酸序列由SEQ ID NO: 180展示，DNA序列藉由SEQ ID NO: 181展示)中與兩個核定位信號(NLS)連接以能夠將效應分子有效定位至核。
在一個實例中，使編碼具有D10A及N580A突變的dSaCas9之DNA序列與編碼VP64、VPH或VPR(其為合成的胺基酸轉錄活化部分) (參見Chavez A等人, Nat Methods. 2016年7月; 13(7):563-67及Chavez A等人, Nat Methods. 2015年4月; 12(4):326-8，其以全文引用之方式併入本文中)之DNA序列融合至其C末端(SEQ ID NO: 182、183或184)。在本說明書中所獲得的融合蛋白分別表示為dSaCas9-VP64、dSaCas9-VPH或dSaCas9-VPR融合蛋白。
將融合蛋白募集至UTRN基因之表現調節區且藉此發揮其轉錄活化作用。因此，UTRN基因之表現增強。
在一個實例中，將編碼缺少胺基酸721至745之dSaCas9蛋白(dSaCas9[-25]，(SEQ ID NO: 214))的DNA序列與編碼合成胺基酸轉錄活化因子miniVR之DNA序列融合(參見PCT/JP2019/030972，其以全文引用之方式併入本文中)至其C末端(SEQ ID NO: 185)。在本說明書中所獲得的融合蛋白表示為dSaCas9[-25]-miniVR融合蛋白(SEQ ID NO: 186)。
為了dSaCas9-VP64、dSaCas9-VPH、dSaCas9-VPR及dSaCas9[-25]-miniVR融合蛋白之表現，將編碼融合蛋白之DNA片段選殖至來自Genecopoeia的CP-LvC9NU-09慢病毒表現載體(目錄號CP-LvC9NU-09)中。將原始載體中之Cas9編碼序列用融合蛋白編碼序列替換，引起CP-LvC9NU-09慢病毒表現載體之產生，該慢病毒表現載體包含編碼以下四個融合蛋白中之一者的DNA片段：dSaCas9-VP64、dSaCas9-VPH、dSaCas9-VPR或dSaCas9[-25]-miniVR。在本說明書中，所得載體分別表示為CP-LvdSaCas9-VP64-09、CP-LvdSaCas9-VPH-09、CP-LvdSaCas9-VPR-09或CP-LvdSaCas9[-25]-miniVR-09質體。載體使用EF1a啟動子用於效應分子之表現，及使用SV40啟動子以表現eGFP-IRES-新黴素基因。
為了在腺相關病毒載體中表現，將編碼dSaCas9[-25]-miniVR融合蛋白、U6啟動子及sgRNA之DNA片段選殖至來自Takara的pAAV-CMV載體(編號6234)中。將CMV啟動子用EFS啟動子(SEQ ID NO: 187)替換。自原始載體移除β血球蛋白內含子且將hGH poly-A用牛類GH polyA (bGH polyA)替換。所獲得的載體自其5'端至其3'端依序包含ITR、EFS啟動子、dCas9、miniVR、bGH polyA、U6啟動子、sgRNA及ITR，且在本說明書中表示為pAAV-EFS-dSaCas9[-25]-miniVR-U6-sgRNA AIO質體。 細胞培養及轉染
在轉染前24小時將HEK293FT細胞(Thermo Fisher編號R70007)接種於24孔板(CORNING編號351147)中以每孔75,000個細胞之密度且在補充有10% FBS及2 mM新鮮L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及非必需胺基酸的DMEM培養基(Thermo Fisher編號11140050)中培養。為了在慢病毒表現載體中表現，用500 ng之CP-LvdSaCas9-VP64-09、CP-LvdSaCas9-VPH-09、CP-LvdSaCas9-VPR-09或CP-LvdSaCas9[-25]-miniVR-09質體及500 ng之pCRISPR-LvSG03 sgRNA表現載體使用1.5 μl之脂染胺2000 (Life technologies編號11668019)根據製造商的說明轉染細胞。用嘌呤黴素(1 μg/ml)來選擇經轉染細胞。為了在腺相關病毒載體中表現，用500 ng之pAAV-EFS-dSaCas9[-25]-miniVR-U6-sgRNA AIO質體使用1.5 μl之脂染胺2000 (Life technologies編號11668019)根據製造商的說明轉染細胞。不用嘌呤黴素來選擇經轉染細胞。
為了基因表現分析，經轉染細胞在37℃用5% CO2 培養，且在轉染後72 h採集並在RLT緩衝劑(Qiagen編號74104)中溶解以使用RNeasy套組(Qiagen編號74104)提取總RNA。 基因表現分析
為了Taqman分析，使用1.5 μg之總RNA於使用TaqMan™高能力RNA-至-cDNA套組(Applied Biosystems編號4387406)以20 μl體積生成cDNA。將產生的cDNA用水稀釋20倍，且每Taqman反應使用6.33 μl。用於UTRN及HPRT基因之Taqman引子及探針自Applied Biosystems獲得。使用Taqman基因表現主混合物(Thermo Fisher編號4369016)在Roche LightCycler 96或LightCycler 480中進行Taqman反應，且使用LightCycler 96分析軟體來分析。將UTRN基因之表現量藉由HPRT基因之表現量正規化。
Taqman探針產品ID： UTRN：Hs01125994_m1 (FAM) HPRT：Hs99999909_m1 (FAM, VIC) TaqmanQPCR條件： 步驟1；95℃持續10 min 步驟2；95℃持續15 sec 步驟3；60℃持續30 sec 重複步驟2及3；40次 腺相關病毒(AAV)產生
腺相關病毒血清型2 (AAV2)顆粒係使用以9,000,000個細胞/培養皿之密度接種於150 mm培養皿(Corning)中的AAVpro 293T細胞(Takara編號632273)產生且在補充有10% FBS、2 mM新鮮L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及非必需胺基酸的DMEM培養基(Thermo Fisher編號11140050)中培養。將細胞用14.85 μg之pRC2-mi342及pHelper載體(Takara編號6234)及14.85 μg之pAAV-EFS-dsaCas9[-25]-miniVR-U6-sgRNA AIO質體用81 μl TransIT-VirusGen (Mirus Bio編號MIR6703)轉染。在72 h之後，採集細胞且以550 μl/150 mm培養皿根據AAV2 Helper Free System方案(Takara編號6230)中之製造商的說明來提取粗AAV2。 用AAV2轉導細胞
為了轉導HEK293FT細胞(Thermo Fisher編號R70007)，將75,000個細胞/孔接種於24孔板(CORNING編號351147)中且在補充有10% FBS、2 mM新鮮L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及非必需胺基酸的DMEM培養基(Thermo Fisher編號11140050)中培育16 h。將培養基用包括10 μl或1 μl (分別為1:100或1:1000稀釋度)之粗AAV2之1000 μl新鮮培養基替換。在後續72 h培育之後，使細胞裂解且根據製造商之說明(Qiagen編號74192)提取總RNA(RNeasy Plus 96套組)並如「基因表現分析」中所描述藉由Taqman確定肌營養相關蛋白之過表現。表 1 . 用於篩選UTRN基因之表現調節區的靶向序列
SEQ ID NO. 導引編號 位置 股 靶向序列 PAM 特異性 效率
129 sgED3-1 144283943 1 CTTGTTAAATGAATGAATGAA GTGAAT 21.67 24.07
130 sgED3-2 144284051 1 TGTCCTAGAAACCTTACAAGG AAGAGT 81.73 47.49
131 sgED3-3 144284216 -1 GGTTTATTGCTGGCTTAATAT TTGAGT 73.32 27.89
132 sgED3-4 144284644 1 ACGTCAGCAAACTGAGATGGG GTGAGT 72.28 29.99
133 sgED3-5 144284753 1 TTTTCGGATAATCTGAATAAG GGGAAT 73.39 26.71
134 sgED3-6 144285129 -1 GGGGTCCGCTCTCCAGATGAG AAGGGT 86.65 25.53
135 sgED3-7 144285744 -1 GGCTCCTCTAGGAGTTTGACA CGGAGT 88.25 85.15
136 sgED3-8 144285873 1 TAATGTGACTACAGCCCCCGA GGGAAT 93.52 70.61
137 sgED3-9 144285972 1 CCAAGTCCCAGAGTCGAAGAT GGGAGT 92.21 44.26
138 sgED3-10 144286550 -1 TCAGTTGCAGCAAGAGATCCC CAGAGT 82.58 26.26
139 sgED3-11 144286736 -1 CCTCCTCCTCGAAAAACGCAC TGGAAT 90.03 64.99
140 sgED3-12 144287009 -1 GGGAGGGTCGGCTCAGACCTA GGGAAT 91.68 30.46
141 sgED3-13 144287207 1 GGGTAGTTCTGCGGTGACGGA CAGGGT 92.71 23.34
142 sgED3-14 144287288 -1 ATTTTAGGTAAACACCCAAAG GAGAGT 70.86 46.61
143 sgED3-15 144287397 -1 GAAACACAGTAAAAGAAAACG GTGAGT 51.32 53.15
144 sgED3-16 144287614 -1 TAAGATTTTAGGAATTATACA ATGAAT 50.22 34.45
145 sgED3-17 144287760 1 AGCGTTCTGAAGGGAGAGTTA GTGAAT 75.62 42.44
146 sgED3-18 144287920 -1 CAGAAGGCTAGGTGAGAAACT GAGAAT 64.29 34.34
147 sgED3-19 144288078 -1 AATTTGAGTACACTTAAGGCA AAGGAT 74.85 24.36
148 sgED3-20 144288193 -1 AGATACAGCAGAAAAGGTGAT CAGAGT 59.61 52
149 sgED3-21 144343311 1 GACACATGCAGAAGTGACAGC AGGAGT 62.51 64.83
150 sgED3-22 144344138 -1 AGCAGCCTTCGAACTGCACAC TGGGAT 85.61 69.44
151 sgED3-23 144344637 -1 TCTAGATGGCAGTAAACAGCA CAGAGT 72.98 81.01
152 sgED3-24 144345218 -1 GGCTGCTCCAATCATTTTGGT TTGAAT 79.1 56.17
153 sgED3-25 144284787 -1 GAGTCCGGAGACCGAACCAGA ATGGAT 91.54 23.9
154 sgED3-26 144284810 -1 GAACCGTGCGTGCCGGGAGCC GGGAGT 86.09 1
155 sgED3-27 144284837 -1 GCTGGCCTGGGGCGCGCGCTC CAGAGT 78.51 0.56
156 sgED3-28 144285003 -1 AAGATCAGCCCCACTACGTTC CCGGGT 94.71 15.9
157 sgED3-29 144285172 1 CCGGAGGCGAGCCCCTTCCCG GGGGGT 82.7 14.59
158 sgED3-30 144285207 -1 GGAGGGTGGGGCGCAGGACCG CTGGGT 68.11 4.19
159 sgED3-31 144285227 -1 GAGCGCTGGAGGCGGAGGAGG GAGGGT 40.4 5.54
160 sgED3-32 144285325 1 CCTCTCTCGCGCACAAAGTTG TGGAGT 92.3 13.5
161 sgED3-33 144285460 1 GGGAGCGGCGCCCCCCTTCTT TTGGGT 92.82 3.72
162 sgED3-34 144285496 -1 CACCAACTTTGCCAAACGCTA CAGAGT 90.69 15.32
163 sgED3-35 144285722 -1 GGAGTAACCGCGGGGGTGTGT GCGAGT 90.76 15.84
164 sgED3-36 144285896 1 GAATGGGGCGGGGGCCGGGAG GAGGAT 47.73 3.79
165 sgED3-37 144285926 1 TCTTTCTGTGGTTCTTCCGCC TGGGAT 81.43 25.49
166 sgED3-38 144286089 -1 TTTGGATCGTTCACAACTAGT ACGGAT 92.05 18.73
167 sgED3-39 144286240 1 AGAGGGGACGTGGCCTCTTAG GAGAGT 83.03 23.82
168 sgED3-40 144286311 1 GTCCACAGGAGAGGGTGGGCA GAGGGT 38.6 9.03
169 sgED3-41 144286418 1 GCTCCCAAGGGTGGGGCTCCG GAGAGT 75.62 5.83
170 sgED3-42 144286683 1 TTTCAGATGGCAGGTTGTTCA AAGGAT 84.92 0.55
171 sgED3-43 144286895 1 CTTTCCCAGCCTTCAGGTCAG CCGGAT 70.16 23.24
172 sgED3-44 144286993 1 GCGCGCGGAGCTCGGGGGAGG CCGGAT 58.97 0.54
173 sgED3-45 144287068 -1 TGAGGCCGGTGCAACTTACAA AGGAAT 94 33.46
174 sgED3-46 144287139 1 TGGGCGTGGGAGACGCAGCCT GCGGAT 73.4 1.47
175 sgED3-47 144287184 1 AGGTGGAGGAATGCGAAGCTT GTGGGT 87 21.29
176 sgED3-48 144287284 1 AGACAACTCTTTAACTCTCCT TTGGGT 78.9 15.46
在表1中，「位置」指示當使用SaCas9時存在靶向序列之股中核苷酸之裂解位置。
在表1中之「股」項中，1展示有義股且-1展示反義股。 (2)結果
圖1展示與對照sgRNA相比藉由三種不同dSaCas9-活化因子融合蛋白(dSaCas9-VP64、dSaCas9-VPH及dSaCas9-VPR)之UTRN基因表現的活化。對照sgRNA包含ACGGAGGCUAAGCGUCGCAAG (SEQ ID NO: 215)及tracrRNA序列，且經設計為其不具有人類基因組中之任何序列上的目標。包含分別由導引編號sgED3-6、sgED3-7或sgED3-13 (SEQ ID NO: 134、135或141)編碼之crRNA的sgRNA藉由募集dSaCas9-活化因子融合蛋白至UTRN基因之表現調節區來活化UTRN基因表現。在dSaCas9-VPR融合蛋白之情況下活化作用最強。
根據以上結果，由對應於Chr6: GRCh38/hg38; 144,285,000-144,286,000 (圖1)之導引編號sgED3-6至sgED3-7 (SEQ ID NO 134至135) (表1)覆蓋的約1.0 kb區(區A)及對應於Chr6: GRCh38/hg38; 144,287,000-144,287,300的導引編號sgED3-13 (SEQ ID NO 141)周圍之約0.3 kb區(區B)賦予UTRN基因表現之有效活化。與由導引編號sgED3-6、sgED3-7及sgED3-13 (SEQ ID NO: 134、135及141)編碼之crRNA相比啟動子B賦予UTRN基因之相對較弱活化。
在圖2中，將對應於Chr6: GRCh38/hg38; 144,284,750-144,287,300之跨越區A+B之區用另外二十四個sgRNA (表1，導引編號sgED3-25至sgED3-48 (SEQ ID NO: 153至176))與dSaCas9-VPR進一步篩選以更有效活化UTRN基因。與前述對照sgRNA相比，包含分別由導引編號sgED3-6、sgED3-13、sgED3-25至sgED3-32、sgED3-39、sgED3-40及sgED3-44 (SEQ ID NO: 134、141、153至160、167、168及172)編碼的crRNA之sgRNA活化UTRN基因表現超過兩倍。
圖3中，對於一些包含分別由導引編號sgED3-6、sgED3-13、sgED3-25、sgED3-27、sgED3-30、sgED3-31、sgED3-39、sgED3-40及sgED3-44 (SEQ ID No: 134、141、153、155、158、159、167、168及172)編碼之crRNA的有效sgRNA，製備pAAV-EFS-dSaCas9[-25]-miniVR-U6-sgRNA AIO質體且分別將其轉染至HEK293FT細胞中用於驗證功能。與前述對照sgRNA相比，觀測到UTRN基因之誘發，不同sgRNA具有不同程度。
圖4中，產生攜帶EFS-dSaCas9[-25]-miniVR-U6-sgRNA之AAV2且轉導HEK293FT細胞。使用包含分別由導引編號sgED3-6、sgED3-30或sgED3-31 (SEQ ID NO: 134、158或159)編碼之crRNA的sgRNA作為sgRNA。與前述對照sgRNA相比，關於全部三種sgRNA，均觀測到UTRN基因誘發。 實例2.使用HSMM細胞篩選人類肌營養相關蛋白基因之gRNA (1)實驗方法 UTRN靶向序列之選擇
基於人類骨胳肌肉細胞中之基因組之H3K4me3及H3K27Ac模式，掃描人類UTRN基因的假定強化子(稱為E)及啟動子(稱為P)區周圍之大約13.2 kb之序列以得到可由與gRNA複合之核酸酶缺失SaCas9 (D10A及N580A突變體；dSaCas9[SEQ ID NO: 123(蛋白)])靶向之序列，在本文中定義為靶向序列。與UTRN基因相關之靶向基因組區之位置描繪在圖6中且其配位標註在下文： 1.  Chr6: GRCh38.p12; 144215500-144217000→約1.5 kb (稱為P2) 2.  Chr6: GRCh38.p12; 144248500-144249800→約1.3 kb (稱為E1) 3.  Chr6: GRCh38.p12; 144264000-144267000→約3.0 kb (稱為E2) 4.  Chr6: GRCh38.p12; 144283900-144288300→約4.4 kb (稱為P1) 5.  Chr6: GRCh38.p12; 144292500-144295500→約3.0 kb (稱為E3)
靶向序列係藉由鄰近於具有序列NNGRRT (5'-21nt靶向序列-NNGRRT-3')之前間隔子鄰近基序(PAM)的21-核苷酸片段指定，且經過濾以包括大部分具有食蟹獼猴(長尾獼猴)基因組之對應區的完美匹配之彼等(靶向序列及PAM序列) (在表3中列為「真」)。 慢病毒轉移質體(pED176)之構建
pLentiCRISPR v2購自Genscript (https://www.genscript.com)且做出以下修改：使SpCas9 gRNA架構序列經SaCas9 gRNA架構序列(SEQ ID NO: 124)置換；將SpCas9用與密碼子經最佳化之VP64-miniRTA (亦稱為miniVR)融合之dSaCas9 [SEQ ID NO: 125 (DNA)及126 (蛋白)]替換。MiniVR轉錄活化域可藉由活化轉錄活化基因表現。將MiniVR系留至dSaCas9 (D10A及N580A突變體)之C末端，其在下文中稱為dSaCas9-miniVR (SEQ ID NO: 192 (DNA)及193 (蛋白))，且由於藉由包含由各靶向序列編碼之crRNA的gRNA引導而靶向人類UTRN基因之假定強化子或啟動子區(圖6)。所產生之主鏈質體命名為pED176。 gRNA選殖
將三個對照非靶向序列(表3，SEQ ID NO: 1至3)及100個靶向序列(表3，SEQ ID NO.: 4至103)選殖至pED176中。藉由整合DNA技術以以下型式合成正向及反向寡核苷酸：正向：5' CACC(G)-20-21鹼基對靶向序列-3'，及反向：5' AAAC-20-21鹼基對反向互補靶向序列-(C)-3'，其中若目標並不以G開始則添加括號中之鹼基。使寡核苷酸再懸浮於100 µM之Tris-EDTA緩衝劑(pH 8.0)中。將1 µl之各互補寡核苷酸合併在10 µl於NE緩衝劑3.1 (新英格蘭生物實驗室(NEB)編號B7203S)中之反應物中。在熱循環儀中將反應物加熱至95℃且使其冷卻至25℃，由此退火具有與選殖至pED176相容的黏性端突出端之寡核苷酸。將經退火之寡核苷酸與已用BsmBI消化且凝膠純化之慢病毒轉移質體pED176組合，且根據製造商的方案與T4 DNA接合酶(NEB編號M0202S)接合。根據製造商之方案將2 µl之接合反應物轉化成10 µl之NEB穩定勝任細胞(NEB編號C3040I)。所得構築體驅動包含由與tracrRNA (guuuuaguacucuggaaacagaaucuacuaaaacaaggcaaaaugccguguuuaucucgucaacuuguuggcgagauuuuuu (SEQ ID NO: 127))融合於其3'端之單獨靶向序列編碼的crRNA之sgRNA之表現，該tracrRNA自添加有U6聚合酶TTTTTT之終止信號的SaCas9 gRNA架構序列藉由U6啟動子(SEQ ID NO: 128)編碼。 慢病毒產生
將HEK293TA細胞(Genecopoeia編號LT008)以0.75×106 個細胞/孔在6孔細胞培養皿(VWR編號10062-892)中於2 ml生長培養基(補充有10% FBS及2 mM新鮮L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及非必需胺基酸的DMEM培養基(Thermo Fisher編號11140050))中接種且在37℃/5% CO2 下培育24小時。次日，根據製造商之方案用1.5 µg封裝質體混合物[1 µg混合物(參見pCMV δ R8.2；addgene編號12263)及0.5 µg包膜表現質體(參見pCMV-VSV-G；addgene編號8454)]及1 µg之含有編碼dSaCas9-miniVR之序列且指示為sgRNA的轉移質體建立TransIT-VirusGEN轉染反應物(Mirus Bio編號MIR6700)。在轉染後48小時藉由經由0.45 µm PES過濾器(VWR編號10218-488)傳送培養基上清液來採集慢病毒。直至即將使用，將經純化且等分之慢病毒儲存於-80℃冰箱中。 HSMM細胞之轉導
自Lonza公司獲得來自年齡自0至35歲之5個不同的人類供體之初代骨胳肌肉成肌細胞(HSMM)，如表2中所示。 表2
供體編號 批次編號 年齡(歲) 性別
1 650386 35 男性
2 657512 34 女性
3 542368 0 女性
4 629287 19 女性
5 655307 18 男性
在來自Lonza之初代骨胳肌肉細胞生長培養基[SkGM™-2骨胳肌肉生長BulletKit培養基(編號CC-3245)，其含有培養系統，該培養系統含有骨胳肌肉成肌細胞之生長所需的SkBM™-2基礎培養基(編號CC-3246)及SkGM™-2 SingleQuots™補充劑(編號CC-3244))]中培養細胞。CC-3246含有1 x SkBM™-2基礎培養基，500 mL。1 x SkGM™-2 SingleQuots™補充劑封裝(編號CC-3244)含有： 1 x紅蓋小瓶，含有GA-1000，0.50 mL 1 x綠蓋小瓶，具有hEGF，0.50 mL 1 x天然蓋小瓶，具有地塞米松，0.50 mL 1 x瓶FBS，50.00 mL 1 x瓶L-麩醯胺酸，10.00 mL
根據製造商之說明將CC-3244之組分添加至500 ml培養基(編號CC-3246)。
為了轉導，將細胞以0.125×106 至0.33×106 個細胞/孔接種於含有生長培養基的6孔細胞培養皿(VWR編號10062-894)中且在37℃/5% CO2 下培育24小時。次日，將1.5 ml生長培養基添加至各孔，該生長培養基補充有8 µg/ml凝聚胺(Sigma編號TR-1003-G)及1.0 ml對應於各包含由與tracrRNA融合的單獨靶向序列(表3)編碼之crRNA的sgRNA之慢病毒上清液(參見上文)。藉由使用Lenti-XTM qRT-PCR滴定套組(Clontech編號631235)量測，慢病毒滴定範圍為108 至109 個顆粒/ml。在移除病毒培養基且用新鮮生長培養基替換之前用慢病毒培育細胞6小時。在轉導之後72小時，向細胞饋入選擇培養基[補充有0.5 µg/ml嘌呤黴素(Sigma編號P8833-100MG)之生長培養基]。每2至3天向細胞提供新鮮選擇培養基。細胞在選擇培養基中7至10天後，採集細胞且如製造商之引導用RNeasy 96套組(Qiagen編號74182)提取RNA。
以相同方式實施兩種病毒之共轉導實驗，其中病毒之總量等於單一病毒轉導。 基因表現分析
為了基因表現分析，根據高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems；Thermo Fisher編號4368813)方案以10 µl體積自約0.05至0.8 µg之總RNA產生cDNA。將cDNA稀釋10倍且使用Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher編號4444557)根據製造商之方案來分析。Taqman探針(UTRN：檢定Id Hs01125994_m1 FAM；HPRT：檢定Id Hs99999909_m1 VIC_PL)自Life Technologies獲得。進行基於Taqman探針之即時PCR反應且藉由QuantStudio 5 即時PCR系統如由Taqman Fast Advanced Master Mix方案引導來分析。 資料分析
對於各樣品及三種對照，藉由自HPRT探針減去來自UTRN探針之3個技術複製物之平均Ct值(平均Ct UTRN-平均Ct HPRT)來計算Ct差值。使用公式2-( Ct 差值 ) 來確定各樣品之表現值。隨後將樣品表現值(表3；SEQ ID NO: 4至103)歸一化至各實驗之3個對照表現值(表3；SEQ ID NO: 1至3)之平均值以確定各樣品之相對UTRN表現。分析各篩選之兩個生物複製物且計算來自所有實驗之平均值(表3)。 (2)結果 藉由RNP活化UTRN基因表現
將dSaCas9-miniVR及各靶向序列之sgRNA的表現卡匣自5個不同供體(表2)遞送至初代HSMM細胞以產生慢病毒。由於細胞之生長速度在來自供體3號(表2)之HSMM細胞上實施大部分檢定。針對對嘌呤黴素之抗性選擇經轉導的細胞，其使用Taqman檢定定量UTRN表現(表3)。將來自各樣品之表現值歸一化至用對照sgRNA (表3；SEQ ID NO: 1至3)轉導之細胞中的UTRN表現之平均值。在整個供體3號之複製物中量測平均表現水平(表3；及圖7)。 表3用於篩選UTRN基因之表現調節區的靶向序列。 表3-1
SEQ ID 導引編號 座標(hg38/Chr.6) 核苷酸長度 正或負股 序列 食蟹獼猴匹配 HSMMd3 _ screen1 HSMMd3 _ screen2
1 CtrlX3 NA 20 - ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA - 1 1
2 NA 20 - CGCTTCCGCGGCCCGTTCAA -
3 NA 20 - GTAGGCGCGCCGCTCTCTAC -
4 12 144216047 21 1 AGAAAAGCGGCCCCTAGGGGC 真 1.42 0.55
5 16 144216199 21 -1 CAAACACACACCAGCAAACTT 真 1.27 0.53
6 17 144216257 21 1 TGAAAGCGCAACTGGAGGGCC 真 0.99 0.73
7 24 144216593 21 -1 ACCCACGCGGACATATGTCCA 真 0.82 0.59
8 25 144216602 21 1 ATCCAATGGACATATGTCCGC 真 1.41 0.68
9 31 144216855 21 1 GAGGGGGAGGGCTGTGACCTG 真 1.35 0.56
10 34 144248644 21 -1 ATTTGGTGGTCAGGGAGCAAG 真 1.71 0.57
11 35 144248677 21 1 AATGAAACCAAAGACAGCTTC 真 1.32 0.51
12 44 144248973 21 -1 CCAAAATCCTTTAATGAATCA 真 1.43 0.65
13 45 144248977 21 1 TACAGATTCCATGATTCATTA 真 1.58 0.59
14 46 144248981 21 -1 GGAACAAACCAAAATCCTTTA 真 1.37 0.69
15 48 144249031 21 -1 ATCTGTTTGTGGGGAAATCTT 真 1.21 0.77
16 49 144249058 21 1 CAAACAGATTTCAGTATTTTC 真 1.41 0.64
17 51 144249159 21 1 GTGGTGATTTATGTTACTGGT 真 1.18 0.77
18 52 144249181 21 1 TGAGTCTTTCAAGTTCCTTTC 真 1.5 0.72
19 53 144249211 21 1 AGATCATTTTTGGCTTCAAAC 真 1.63 0.71
20 54 144249221 21 1 TGGCTTCAAACTAGAATGTCC 真 1.93 0.72
21 56 144249311 21 1 GATCTATCTATAGACACCAAA 真 1.33 0.54
22 61 144249393 21 -1 TGCTTCTTCCAGGCTTGAGTG 真 1.39 0.75
23 62 144249400 21 -1 ACCGCTTTGCTTCTTCCAGGC 真 0.96 0.71
24 63 144249413 21 1 AAGCCTGGAAGAAGCAAAGCG 真 1.51 0.98
25 73 144249669 21 -1 cttctgaatcagaattcctaa 真 1.04 0.66
表3-2
26 78 144249756 21 1 TGGTTCCAAGCTAGTACTTCA 真 1.03 0.78
27 80 144264074 21 1 ATGTTCACAAAATAAATTTAA 真 0.99 0.75
28 86 144264238 21 1 CCTTTATGGTCACCTTCTCTG 真 1.2 0.79
29 87 144264250 21 1 CCTTCTCTGCTGAGTAAAAAT 真 1.09 1.07
30 88 144264297 21 1 AAGGTGGCCAAAAAAGAACCC 假 1.28 1.37
31 91 144264318 21 -1 AAGGAAGAGAGAGGCAAGAAA 真 1.43 1.04
32 95 144264449 21 -1 TAAAGAATTCTAGCACTGGAA 真 0.62 0.51
33 106 144264745 21 1 AAATGTGTCATGTGTTGGTTA 真 0.89 0.8
34 114 144265048 21 1 AAAAATGAAAATTGCAACTTC 真 1.01 0.65
35 115 144265058 21 1 ATTGCAACTTCTAGAATTTAA 真 0.79 0.57
36 121 144265214 21 1 CAGCTGGAGTGGGCCACGTAA 真 1.19 1.25
37 123 144265304 21 -1 ATTTTTGCATATTTCTTTGGT 真 1.14 0.64
38 125 144265450 21 -1 AGTGACCTGCTGATTTCTCTA 真 1.38 0.74
39 127 144265606 21 1 CTTTCCCCATTGTTCAGGACT 真 1.1 0.82
40 135 144265764 21 1 TTGGTTGATAAATTTGTATAT 真 1.41 0.82
41 136 144265795 21 -1 TCTCTAGTTCATTTTTTAGCT 真 1.17 0.82
42 139 144266101 21 -1 TCCTTCAACTTCAAGACAACA 真 0.87 0.66
43 140 144266147 21 -1 GCTCCTCCTGCTGGATGGGGG 真 1.36 0.8
44 141 144266158 21 -1 CTCTATTTCCAGCTCCTCCTG 真 1.08 0.86
45 145 144266243 21 1 GTACAGTTAGTGCTACTAGGA 真 3.2 1.43
46 146 144266254 21 1 GCTACTAGGACAGGATGCTGG 真 2.5 1.23
47 148 144266287 21 -1 CCCCAGCTGTGCCTCTGTTTT 真 1.42 0.72
48 149 144266297 21 1 TTCCCAAAACAGAGGCACAGC 真 1.36 0.87
49 151 144266338 21 -1 GTTTTGAAACTGGTAGCAGCT 真 1.52 1.2
50 175 144283934 21 1 aaactgatgcttgttaaatga 真 1.05 0.91
51 176 144283943 21 1 cttgttaaatgaatgaatGAA 真 1.34 0.89
52 178 144283973 21 -1 AATCCAAAGGATTAACTTGAA 真 1.48 1.09
53 179 144283981 21 1 TACCCATTTCAAGTTAATCCT 真 1.3 1.02
54 183 144284099 21 1 TGCCCCCTCCCTGGAGCACTT 真 1.39 0.65
55 192 144284640 21 1 AGCAACGTCAGCAAACTGAGA 真 1.06 0.96
表3-3
56 193 144284644 21 1 ACGTCAGCAAACTGAGATGGG 真 1.29 0.63
57 202 144284810 21 -1 GAACCGTGCGTGCCGGGAGCC 真 1.15 0.95
58 205 144285129 21 -1 GGGGTCCGCTCTCCAGATGAG 假 2.28 1.8
59 208 144285207 21 -1 GGAGGGTGGGGCGCAGGACCG 真 2.29 1.59
60 210 144285325 21 1 CCTCTCTCGCGCACAAAGTTG 假 1.88 1.76
61 211 144285429 21 1 TCTGGCTCCAGAAGCCGATTG 真 1.11 1.01
62 214 144285603 21 1 ACAAGTAAGGGGCGTTTTCAG 真 1.14 0.78
63 218 144285756 21 -1 GAGCTGGCCAAGGGCTCCTCT 真 1.3 0.82
64 219 144285770 21 1 TAGAGGAGCCCTTGGCCAGCT 真 1.34 0.86
65 224 144285972 21 1 CCAAGTCCCAGAGTCGAAGAT 真 1.25 0.87
66 234 144286311 21 1 GTCCACAGGAGAGGGTGGGCA 真 1.38 0.87
67 236 144286403 21 1 CTCTGGGTGGTTGCTGCTCCC 真 1 0.73
68 239 144286550 21 -1 TCAGTTGCAGCAAGAGATCCC 真 1.12 0.92
69 262 144287288 21 -1 ATTTTAGGTAAACACCCAAAG 真 1.35 0.78
70 275 144287912 21 -1 taggtgagaaactgagaatca 真 1.45 0.77
71 276 144287920 21 -1 cagaaggctaggtgagaaact 真 1.3 0.69
72 283 144288096 21 -1 GCCATTAATGGCCAGAGGAAT 真 1.71 0.91
73 286 144288193 21 -1 AGATACAGCAGAAAAGGTGAT 真 1.13 0.92
74 288 144288268 21 1 AATTTGAAAAATCACCTTGAG 真 1.47 0.81
75 289 144292526 21 -1 cagttgattcatctgtacagc 真 1.1 1.01
76 290 144292529 21 1 tttttgactctggctgtacag 真 1.26 1.21
77 291 144292541 21 1 gctgtacagatgaatcaactg 真 2.12 1.08
78 295 144292639 21 -1 ATCTCCCCTTTGAGTTTGTCT 真 1.31 0.88
79 296 144292651 21 -1 CTGTTCAAAAATATCTCCCCT 真 1.31 1.03
80 297 144292708 21 1 AAAATTACACAGAACTCCACC 真 1.69 1.06
81 300 144292779 21 -1 TTTTTTGTCTTTAAAGTGACA 真 1.12 0.7
82 303 144293063 21 1 TCTTGTTTTAAAATATGCTTT 真 1.15 1.11
83 308 144293185 21 -1 CTCTGTTATATTTACATATGT 真 1.05 0.73
84 311 144293308 21 -1 TATAAATATCAAAGGTCTTAC 真 0.88 0.73
85 316 144293537 21 -1 cctagggaaaaactctagaaa 真 1.17 0.82
表3-4
86 318 144293638 21 1 acaccatgaaaatctaatatt 真 1.09 0.93
87 322 144293778 21 -1 agatgtgctagagtaaagaaa 真 1.25 0.93
88 323 144293791 21 -1 GTATGATCTGTTCagatgtgc 真 1.55 1.17
89 330 144294147 21 1 TTTAAAGATTATCAAATTGCT 真 1.23 0.71
90 332 144294262 21 1 ATATGAATCACATTCTTTTGG 真 1.33 0.93
91 334 144294294 21 1 TGCAAAAGCCAGTAGATAAAT 真 1.01 0.81
92 335 144294300 21 1 AGCCAGTAGATAAATTTGGAT 真 0.8 1.01
93 339 144294447 21 1 TTTTAGTTTAGATTAAGTCAT 真 0.81 0.84
94 342 144294575 21 -1 AAGAAACCTGGAAGAGCAGAT 真 1.07 1.1
95 343 144294603 21 1 GGTTTCTTTTTTGGGGGGAAA 真 1.37 0.92
96 350 144294924 21 1 TATGGTTGTAGTATACTTGCC 真 1.24 1.02
97 351 144294930 21 1 TGTAGTATACTTGCCTTGGGT 真 1.07 0.83
98 352 144294934 21 1 GTATACTTGCCTTGGGTTTGG 真 1.11 0.93
99 358 144295231 21 1 ACATGAAATAATAAAATGGTT 真 0.86 1.03
100 360 144295268 21 -1 ATTATTGAATGAAATAGCAGT 真 0.86 1.06
101 363 144295330 21 -1 ACAACACTGACAGCAACAGAA 真 0.89 0.97
102 366 144295418 21 1 AGTGTGTCAGCTGGCTCCATG 真 1.09 1.14
103 367 144295435 21 1 CATGTGGAGTTCTTGACAGTT 真 1.03 0.98
表3中，「座標」指示當使用SaCas9時所有所展示之gRNA之潛在的SaCas9裂解位點。
如圖7中所展示，在所測試之100個靶向序列中，5個靶向序列展示HSMM供體3號細胞中UTRN mRNA表現之一致上調(導引編號145、146、205、208及210 (SEQ ID NO: 45、46、58、59及60))。此等序列中之2個，亦即編號145 (SEQ ID NO: 45)、編號146 (SEQ ID NO: 46)在強化子E2區中聚集，然而其餘3個，亦即編號205 (SEQ ID NO: 58)、編號208 (SEQ ID NO: 59)及編號210 (SEQ ID NO: 60)在啟動子P1區中聚集。在實例1中導引編號205、208及210分別與編號sgED3-6、sgED3-30及sgED3-32相同。
在此等5個靶向序列中，3個序列亦即編號145、編號146及編號208與食蟹獼猴基因組之對應區100%匹配。另一方面，此等序列中之2個，亦即編號205及編號210與食蟹獼猴基因組之對應區並不匹配(圖8)。
當分別測試時，此等5個靶向序列一致展示在5個不同HSMM供體中UTRN mRNA表現之約2至4倍上調(圖9)。在啟動子區中的導引編號205、編號208或編號210與增強子區中的導引編號145或編號146之組合(示意性展示於圖8中)中，2個組合導引編號205與編號145 (編號205+145)及導引編號208與編號145 (編號208+145)引起在5個不同HSMM供體中UTRN表現之約3至7倍上調(圖9)。 實例3.AAV順式質體之產生及評估 (1)實驗方法 AAV AlO順式質體之構建
如表4中所示，所有所測試之質體主鏈pED260 (SEQ ID NO: 210)、pED261 (SEQ ID NO: 211)及pED263 (SEQ ID NO: 212)含有全長dSaCas9之相同鹼基序列、CK8啟動子及U6啟動子，替換pAAV-CMV載體之ITR之間的序列(Takara編號6234)。其不同之處在於活化因子部分，polyA序列-pED260、pED261含有miniVR然而pED263含有microVR作為活化因子部分，且pED260具有bGH polyA然而pED261、pED263具有2x sNRP-1 polyA序列(SEQ ID NO: 208)。 表4
   啟動子(dCas9) dSaCas9 活化因子 polyA 啟動子(gRNA) 靶向序列
質體 pED260 (5171bp*) CK8 全長 miniVR bGH polyA U6 SEQ ID NO: 45 (#145)
CK8 全長 miniVR bGH polyA U6 SEQ ID NO: 46 (#146)
CK8 全長 miniVR bGH polyA U6 SEQ ID NO: 59 (#208)
質體 pED261 (4973bp*) CK8 全長 miniVR 2x sNRP-1 polyA U6 SEQ ID NO: 45 (#145)
CK8 全長 miniVR 2x sNRP-1 polyA U6 SEQ ID NO: 46 (#146)
CK8 全長 miniVR 2x sNRP-1 polyA U6 SEQ ID NO: 59 (#208)
質體 pED263 (4883bp*) CK8 全長 microVR 2x sNRP-1 polyA U6 SEQ ID NO: 45 (#145)
CK8 全長 microVR 2x sNRP-1 polyA U6 SEQ ID NO: 46 (#146)
CK8 全長 microVR 2x sNRP-1 polyA U6 SEQ ID NO: 59 (#208)
*ITR (包括ITR核苷酸)之間的核苷酸長度   
將包含由靶向序列導引編號145、編號146或編號208編碼之crRNA的sgRNA之各寡核苷酸選殖至此等主鏈中之每一者中以形成用於測試的一體式(AlO)質體。各所得AlO質體表示為pAAV-CK8-dSaCas9-miniVR-bGH polyA-U6-sgRNA編號145 (pED260-145)、pAAV-CK8-dSaCas9-miniVR-bGH polyA-U6-sgRNA編號146 (pED260-146)、pAAV-CK8-dSaCas9-miniVR-bGH polyA-U6-sgRNA編號208 (pED260-208)、pAAV-CK8-dSaCas9-miniVR-2x sNRP-1 polyA-U6-sgRNA編號145 (pED261-145)、pAAV-CK8-dSaCas9-miniVR-2x sNRP-1 polyA-U6-sgRNA編號146 (pED261-146)、pAAV-CK8-dSaCas9-miniVR-2x sNRP-1 polyA-U6-sgRNA編號208 (pED261-208)、pAAV-CK8-dSaCas9-microVR-2x sNRP-1 polyA-U6-sgRNA編號145 (pED263-145)、pAAV-CK8-dSaCas9-microVR-2x sNRP-1 polyA-U6-sgRNA編號146 (pED263-146)或pAAV-CK8-dSaCas9-microVR-2x sNRP-1 polyA-U6-sgRNA編號208 (pED263-208)，如表4中所示。
將已知不與人類基因組之任何部分同源的兩個不同序列用作陰性對照且稱為非靶向導引(NTg1 (SEQ ID NO: 1)及NTg2 (SEQ ID NO: 2))。亦將NTg1或NTg2之各寡核苷酸選殖至各別主鏈中且用作對照質體。 HEK293FT細胞之轉染
將HEK293FT細胞(Thermo Fisher編號R70007)以5×104 個細胞/孔接種於24孔細胞培養皿(CORNING編號351147)0.5 ml生長培養基(補充有10% FBS及2 mM新鮮L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及非必需胺基酸的DMEM培養基(Thermo Fisher編號11140050))中且在37℃/5% CO2 下培育24小時。次日，根據製造商之方案用0.5 µg含有編碼dSaCas9-miniVR或dSaCas9-microVR之序列及包含實例2中所選的靶向序列之sgRNA(亦即導引編號145 (SEQ ID NO: 45)、編號146 (SEQ ID NO: 46)或編號208 (SEQ ID NO: 59))之質體(表4)來建立脂染胺-2000轉染反應(Thermo Fisher編號11668019)。
在轉染後48小時，採集細胞且如由製造商引導用RNeasy 96套組(Qiagen編號74182)提取RNA。 基因表現分析
為了基因表現分析，根據高容量cDNA反轉錄套組(Applied Biosystems；Thermo Fisher編號4368813)方案以10 µl體積自約0.5 µg之總RNA產生cDNA。將cDNA稀釋10倍且使用Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher編號4444557)根據製造商之方案來分析。Taqman探針(UTRN：檢定Id Hs01125994_m1 FAM；HPRT：檢定Id Hs99999909_m1 VIC_PL)自Thermo Fisher獲得。進行基於Taqman探針之即時PCR反應且藉由QuantStudio 5 即時PCR系統如由Taqman Fast Advanced Master Mix方案引導來分析。 資料分析
對於含有NTg1或NTg2之質體，結果之平均值展示為CtrlX2。
對於各樣品，藉由自來自非靶向導引對照之3個技術複製物的平均Ct值減去來自各樣品之3個技術複製物的平均Ct值來計算各探針之Ct差值。
Ct UTRN差量=平均對照Ct UTRN-平均樣品Ct UTRN。
Ct HPRT差量=平均對照Ct HPRT-平均樣品Ct HPRT。
隨後對於各樣品藉由自UTRN之Ct差值減去HPRT之Ct差值來計算Ct差值差量。
Ct差值差量=Ct UTRN差量-Ct HPRT差量。
使用公式2( Ct 差值差量 ) 確定各樣品之表現值。 (2)結果
在包含由靶向序列導引編號145 (SEQ ID NO: 45)或編號146 (SEQ ID NO: 46)或編號208 (SEQ ID NO: 59)之編碼之crRNA的sgRNA存在下，全部3個所測試之主鏈(pED260、261及263)能夠上調HEK293FT細胞中之UTRN (圖10)。 實例4.攜帶dSaCas9、轉錄活化因子及sgRNA之重組AAV9之產生 (1)實驗方法 腺相關病毒(AAV)產生
腺相關病毒血清型9 (AAV9)顆粒係使用以0.96×107 至1.8×107 個細胞/T225燒瓶(Corning)之密度接種且在補充有10% FBS (Thermo Fisher編號11995-065)的DMEM培養基中培養之293T細胞(ATCC CRL-3216)來產生。pRC9質體係如下構建：將AAV9衣殼序列(參見JP5054975B)次選殖至pRC2-mi342質體(Takara編號6230)中替換AAV2衣殼序列。用20 μg之pRC9質體及pHelper載體(Takara編號6230)及20 μg之6種AIO質體(其用於實例3中，pED261-145、pED261-146、pED261-208、pED263-145、pED263-146或pED263-208)中之一者，用180 μl TransIT-293轉染劑(Mirus Bio編號MIR2700)/T225燒瓶來轉染細胞。轉染之後一日，培養基變成補充有2% FBS之DMEM培養基。在72 h之後，採集細胞，且使用AAVpro純化套組(所有血清型) (Takara編號6666)根據製造商之說明提取並純化AAV。經純化AAV之滴度使用AAVpro滴定套組(用於即時PCR) (Takara編號6233)來量測。各所得AAV表示為AAV9-ED261-145、AAV9-ED261-146、AAV9-ED261-208、AAV9-ED263-145、AAV9-ED263-146或AAV9-ED263-208。 AAV之確認
在AAV樣品製備之後藉由SDS-PAGE用NuPAGE樣品還原劑、抗氧化劑及緩衝劑(Thermo Fisher編號NP0009、編號NP0005、編號NP0007)使用NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白凝膠1.0 mm x 12-孔(Thermo Fisher編號NP0322BOX)檢驗AAV衣殼蛋白。各AAV之施用量為1.0×1010 vg/色帶。在用Oriole螢光凝膠染色溶液(BioRad編號161-0495)染色凝膠之後，由ChemiDoc™ Touch (BioRad)用UV激發及580 nm濾光片捕獲圖像。 (2)結果
T225燒瓶中所產生的AAV9之滴度值計算如下。 表5
AAV名稱 濃度(vg/mL)
AAV9-ED261-145 1.82×1012
AAV9-ED261-146 3.66×1012
AAV9-E D261-208 2.11×1012
AAV9-ED263-145 2.43×1012
AAV9-ED263-146 6.00×1012
AAV9-E D263-208 1.43×1012
在SDS-PAGE中，自各AAV樣品偵測到3種衣殼蛋白(VP1、VP2及VP3，其分別為87、72及62 kDa) (圖11)。此等結果指示選殖至AAV AIO順式質體中之包括dSaCas9及轉錄活化因子之所關注基因可封裝至AAV9中。 實例5.攜帶dSaCas9、轉錄活化因子及sgRNA之重組AAV9對於肌營養相關蛋白上調之活體外藥理學評估 (1)實驗方法 AAV9產生
腺相關病毒血清型9 (AAV9)顆粒係使用以4.77×107 個細胞/700 mL/Cell Stack 5燒瓶(Corning)之密度接種且在補充有10% FBS (Hyclone編號SH30070.03)、1% MEM (Sigma編號M7145)、1%青黴素/鏈黴素/鏈黴素(Thermo Fisher編號15070-063)及2.5% HEPES (Sigma編號H0887)的DMEM培養基中培養之293T細胞(ATCC編號CRL-3216)來產生。三天後，用227.9 μg實例4中構建之pRC9質體、pHelper載體(Takara編號6230)及用於實例3的3種AlO質體(pED261-145、pED261-208或pED263-208)中之一者，用683.7 μl聚乙二亞胺最大量(2 mg/mL) (Polysciences編號24765-2)/燒瓶來轉染細胞。在轉染之後六天，用Triton X-100 (最終0.2%) (Roche編號10789704001)採集細胞。AAV樣品經歷離心、過濾、濃縮及使用層析(AKTA avant 25，GE Healthcare及POROS CaptureSelect AAV樹脂管柱，Thermo Fisher)純化及用CsCl超速離心(Optima XE-90，Beckman Coulter)。在滲析目標溶離份之後，使用AAVpro滴定套組(用於即時PCR) (Takara編號6233)來量測AAV之滴度。獲得AAV9-ED261-145、AAV9-ED261-208及AAV9-ED263-208。 細胞培養及AAV感染
將人類骨胳肌肉成肌細胞(HSMM，Lonza編號CC-2580，批次號18TL211617)以100,000個細胞/孔之密度接種至經膠原蛋白I塗佈之24孔盤(IWAKI編號4820-010)中且在37℃及5% CO2 下於補充有500 U/mL青黴素/鏈黴素(Thermo Fisher編號15070063)之SkGM™-2骨胳肌肉細胞生長培養基-2 BulletKit™ (Lonza編號CC-3245)中培養2天。將培養基用分化培養基(補充有2% FBS (GE Healthcare編號SH30070.03)及500 U/mL青黴素/鏈黴素之DMEM培養基(Sigma編號D6429))替換且在37℃及5% CO2 下培養細胞3天。為了AAV感染，將培養基用500 μL含有0.2、1.0或5.0×1011 vg/mL AAV9-ED261-145、AAV9-ED261-208或AAV9-ED263-208之新鮮分化培養基替換。在感染之後在37℃及5% CO2 下培養經感染細胞3至4天，且使用RNeasy Plus迷你套組(Qiagen編號74134)根據製造商之說明提取總RNA。來自無AAV感染之細胞的RNA設定為對照且展示為AAV (-)。 基因表現分析
為了Taqman qPCR，使用SuperScript™ VILO™ cDNA合成套組(Thermo Fisher編號11754250)以20 μL反應體積將250 ng之總RNA轉換成cDNA。將cDNA用水稀釋5倍且將2 μL用於qPCR。以含有用於UTRN (Thermo Fisher編號Hs01125994_m1，FAM)、HPRT1 (Thermo Fisher編號Hs02800695_m1，FAM)之Taqman探針及TaqMan™通用PCR主混合物(Thermo Fisher編號4324018)之10 μL最終容積用QuantStudio™ 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher)執行qPCR。qPCR循環條件如下：95℃持續10 min，接著45次95℃持續15秒及60℃持續1 min之循環。用QuantStudio™ 12K Flex軟體(Thermo Fisher)分析資料。用各基因之標準曲線分析表現值且將UTRN基因之表現水平歸一化至HPRT1基因之表現水平。 (2)結果
藉由將AAV9-ED261-145、AAV9-ED261-208或AAV9-ED263-208施用至HSMM細胞中，發現肌營養相關蛋白mRNA上調，其表明攜帶dSaCas9之轉基因、miniVR或microVR及包含導引編號145或編號208的sgRNA之AAV9對人類肌肉細胞中的肌營養相關蛋白上調具有藥理學作用(圖12)。 實例6使用RNA測序分析之偏離目標分析 (1)實驗方法 慢病毒產生
將HEK293TA細胞(Genecopoeia編號LT008)以0.75×106 個細胞/孔在6孔細胞培養皿(VWR編號10062-892)中於2 ml生長培養基(補充有10% FBS及2 mM新鮮L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及非必需胺基酸的DMEM培養基(Thermo Fisher編號11140050))中接種且在37℃/5% CO2 下培育24小時。次日，根據製造商之方案用1.5 µg封裝質體混合物[1µg封裝質體(參見pCMV δ R8.2；addgene編號12263)及0.5 µg包膜表現質體(參見pCMV-VSV-G；addgene編號8454)]及1 µg含有編碼dSaCas9-miniVR之鹼基序列及包含實例2中所選靶向序列(亦即導引編號145 (SEQ ID NO: 45)、編號146 (SEQ ID NO: 46)、編號208 (SEQ ID NO: 59))或NTg1 (非靶向導引-1) (SEQ ID NO: 1)之sgRNA的轉移質體來建立TransIT-VirusGEN轉染反應物。轉染後48至72小時藉由將培養基上清液經由0.45 µm PES過濾器(VWR編號10218-488)傳送來採集慢病毒。直至即將使用，將經純化且等分之慢病毒儲存於-80℃冰箱中。 HSMM細胞之轉導及RNA樣品製備
自Lonza公司獲得來自年齡為0歲之人類供體的初代骨胳肌肉成肌細胞(HSMM) (批次號542368)。在來自Lonza之初代骨胳肌肉細胞生長培養基[SkGMTM -2骨胳肌肉生長BulletKit培養基(編號CC-3245)，其含有培養系統，該培養系統含有骨胳肌肉成肌細胞之生長所需的SkBMTM -2基礎培養基(編號CC-3246)及SkGMTM -2 SingleQuotsTM 補充劑(編號CC-3244)]中培養細胞。為了轉導，將細胞以0.125×106 個細胞/孔接種於含有生長培養基之6孔細胞培養皿(VWR編號10062-894)中且在37℃/5% CO2 下培育24小時。次日，對應於包含由單獨靶向序列(導引編號145 (SEQ ID NO: 45)、編號146 (SEQ ID NO: 46)或編號208 (SEQ ID NO: 59))編碼之crRNA及tracrRNA的各sgRNA將1.5 ml補充有8 µg/ml凝聚胺(Sigma編號TR-1003-G)之生長培養基及1.0 ml慢病毒上清液(效價範圍為0.2至2×109 個複製物/ml，藉由Lenti-XTM qRT-PCR滴定套組(Clontech編號631235)量測)添加至各孔。在移除病毒培養基且用新鮮生長培養基替換之前用慢病毒培育細胞6小時。在轉導之後72小時，向細胞饋入選擇培養基[補充有0.5 µg/ml嘌呤黴素(Sigma編號P8833-100MG)的生長培養基]。每2至3天向細胞提供新鮮選擇培養基。細胞在選擇培養基中7至10天之後，採集細胞且用RNeasy 96套組(Qiagen編號74182)如製造商所引導提取RNA。用作對照之NTg1 (非靶向導引-1)導引之序列為ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA (SEQ ID NO: 1)。 偏離目標分析
藉由GeneWiz、LLC執行Illumina定序，其中使用NEBNext超級RNA文庫製備套組(美國，馬薩諸塞州，伊普斯維奇，NEB編號E7530L)根據製造商之方案製備RNA文庫。定序文庫在Illumina HiSeq流動細胞之三個通道上聚集且使用2X150成對末端組態來定序。將所得原始序列資料(.bcl文件)轉換成fastq文件且使用Illumina之bcl2fastq 2.17軟體來分用，其中對於索引序列鑑別而言允許一個錯配。使用STAR比對器將Fastq文件與人類基因組組裝GRCh38.p12比對。使用DESeq2實施差異性分析且用plotly (https://plot.ly)使用自定義R腳本產生曲線圖。 (2)結果
將各導引之mRNA水平中的全基因組倍數變化相對於非靶向導引1 (NTg1)歸一化。各點代表一種基因。X軸展示基因之平均表現水平。Y軸展示基因表現相對於NTg1樣品之log-2倍數變化。高於水平Log2 = 0之基因指示在實驗樣品(例如導引編號145)中比在NTg1樣品中之基因表現高，且低於水平Log2 = 0之基因指示在實驗樣品中比在NTg1樣品中基因表現低。展示在實驗樣品中比在NTg1樣品中高度上調或下調的基因之基因ID。不同的gRNA誘發不同基因表現變化(圖13A：導引編號145，13B：導引編號146，13C：導引編號208)。導引編號208似乎觸發較低的其他基因表現變化，然而展示良好UTRN基因上調。 實例7.對肌營養相關蛋白上調之藥理學作用之活體內評估 (1)實驗方法 動物及免疫抑止方案
將AAV9血清陰性食蟹獼猴(雄性)用於此研究。在適應之後一週，向食蟹獼猴經口投與0.75 mg/kg/天之潑尼松龍磷酸鈉(Abcam編號ab142456)。在AAV投與之前14天開始給藥且繼續直至處死。 AAV9治療及肌肉組織取樣
經由頭部靜脈向食蟹獼猴靜脈內投與1.0或6.0×1013 vg/kg AAV9-ED261-208 (在SignaGen中產生)。為了四頭肌活組織檢查，藉由肌肉內投與10 mg/kg之氯胺酮(Ketamine)氫氯酸鹽及0.08 mg/kg美托定咪啶(Medetomidine)氫氯酸鹽將猴子麻醉，且在AAV投與之前19天及之後28天獲得50至200 mg樣品。在AAV9投與之後56天，處死猴子，且獲得各肌肉及心臟樣品。將樣品在液氮中冷凍且用於基因及蛋白表現分析。 肌肉組織樣品之基因及蛋白表現分析
為了Taqman qPCR，使用RNeasy纖維組織迷你套組(Qiagen編號74704)自肌肉樣品提取總RNA，且使用SuperScript™ VILO™ cDNA合成套組(Thermo Fisher編號11754250)將其轉換成cDNA。使用用於UTRN (Thermo Fisher編號Mf01126001_m1，FAM)、HPRT1 (Thermo Fisher編號Hs02800695_m1，FAM)之Taqman探針及TaqMan™通用PCR主混合物(Thermo Fisher，編號4324018)用QuantStudio™ 12K Flex即時PCR系統(Thermo Fisher)執行qPCR。將UTRN基因之表現水平歸一化至HPRT1基因之表現水平。
為了蛋白表現分析，用含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物(Thermo Fisher編號78441)之RIPA緩衝劑(Millipore編號20-188)製備全肌肉裂解物且將其用於SDS-PAGE及西方墨點。使用肌營養相關蛋白之初級抗體(SantaCruz編號SC-33700) 及經辣根過氧化酶標記之二次抗體(Cell Signaling編號7076)偵測肌營養相關蛋白。 工業實用性
根據本發明，可活化人類細胞中UTRN基因之表現。因此，預期本發明極其適用於治療及/或預防DMD及BMD。
當本文中陳述數字界限或範圍時，包括端點在內。而且，在數字界限或範圍內的所有值及子範圍均特定地包括在內，就如同明確寫出一般。
如本文所用，詞語「一(a/an)」及類似者意謂「一或多個」。
顯然，根據以上教示，本發明之眾多修改及變化為可能的。因此應理解，在所附申請專利範圍之範疇內，可以不同於如本文特定描述之方式的其他方式實踐本發明。
上文所提及之所有專利及其他參考文獻在此均全部併入，如同詳細闡述此參考文獻一般。
當結合附圖考慮時，參考以下實施方式，本發明之更完整理解及其許多伴隨優點將易於獲得，同樣變得較好理解，其中：
圖1中，上圖展示人類UTRN基因中之啟動子A之區，且中間圖展示啟動子B之區且展示各別區中所確定的24個靶向序列(導引編號sgED3-1至sgED3-24 (SEQ ID NO: 129至152))之位置。圖1中，下圖展示在HEK293FT細胞中藉由使用sgRNA與3種不同dSaCas9-轉錄活化因子融合蛋白(dSaCas9-VP64 (SEQ ID NO:188)、dSaCas9-VPH (SEQ ID NO: 189)、dSaCas9-VPR (SEQ ID NO: 190))之組合來活化人類UTRN基因表現(N=3，誤差條展示標準差)，sgRNA包含由SEQ ID NO: 129至152中所列之靶向序列編碼的crRNA。當分別使用特異性結合包含導引編號sgED3-6及sgED3-7 (SEQ ID NO: 134及135)之區(區A)及包含導引編號sgED3-13 (SEQ ID NO: 141)之另一區(區B)的sgRNA時，與使用對照sgRNA之情況相比人類UTRN基因之表現經強烈活化。在3種dSaCas9-轉錄活化因子融合蛋白中當使用dSaCas9-VPR融合蛋白時活化作用最強。
圖2中，上圖展示人類UTRN基因之啟動子A之區中所確定的靶向序列(導引編號sgED3-1至sgED3-20及sgED3-25至sgED3-48 (SEQ ID NO: 129至148及153至176))之位置。圖2中，下圖展示在HEK293FT細胞中藉由使用包含由靶向序列導引編號sgED3-6、sgED3-13、sgED3-25至sgED3-48 (SEQ ID NO: 134、141、153至176)編碼之crRNA的sgRNA與dSaCas9-VPR之組合來活化人類UTRN基因表現(N=3，誤差條展示標準差)。當分別使用特異性結合包含靶向序列導引編號sgED3-6、sgED3-13、sgED3-25至sgED3-32、sgED3-39、sgED3-40、sgED3-44 (SEQ ID NO: 134、141、153至160、167、168及172)之區的sgRNA時，與使用對照sgRNA之情況相比活化人類UTRN基因表現不低於兩倍。
圖3展示藉由使用質體載體之各sgRNA之功能的驗證結果(N=1)。製備表現包含由靶向序列導引編號sgED3-6、sgED3-13、sgED3-25、sgED3-27、sgED3-30、sgED3-31、sgED3-39、sgED3-40或sgED3-44 (SEQ ID NO: 134、141、153、155、158、159、167、168或172)編碼之crRNA的sgRNA之pAAV-EFS-dSaCas9[-25]-miniVR-U6-sgRNA AIO質體且將其轉染至HEK293FT細胞中，並驗證其功能。與對照sgRNA相比，當使用包含由靶向序列導引編號sgED3-6、sgED3-13、sgED3-25、sgED3-27、sgED3-30、sgED3-31、sgED3-39、sgED3-40或sgED3-44 (SEQ ID NO: 134、141、153、155、158、159、167、168或172)編碼之crRNA的sgRNA時，觀測到人類UTRN基因表現之活化。
圖4展示藉由使用AAV載體之各sgRNA之功能的驗證結果(N=1)。將使用表現包含由靶向序列導引編號sgED3-6、sgED3-30或sgED3-31 (SEQ ID NO: 134、158或159)編碼之crRNA的sgRNA之pAAV-EFS-dSaCas9[-25]-miniVR-U6-sgRNA AIO質體產生的AAV2轉導至HEK293FT細胞中。在所有包含由靶向序列導引編號sgED3-6、sgED3-30或sgED3-31 (SEQ ID NO: 134、158或159)編碼之crRNA的sgRNA中，與對照sgRNA相比觀測到人類UTRN基因之活化。
圖5展示pAAV-EFS-dSaCas9[-25]-miniVR-U6-sgRNA AIO質體之構築體。
圖6中，圖A展示人類骨胳肌肉細胞中之基因組的H3K4me3及H3K27Ac模式及人類UTRN基因之假定增強子區E1、E2及E3以及假定啟動子區P1及P2。圖B至F展示各導引編號中所列之靶向序列(SEQ ID NO: 4至103中所列之序列)之位置。
圖7展示評估在HSMM細胞中藉由使用sgRNA及dSaCas9-miniVR活化人類UTRN基因表現之結果(N=2)，sgRNA包含由各導引編號中所列的靶向序列(SEQ ID NO: 4至103中所列之序列)編碼的crRNA。
圖8中，上圖分別展示與食蟹獼猴(長尾獼猴)之同源性及5個靶向序列導引編號145、146、205、208、210 (SEQ ID NO: 45、46、58、59及60)之定位區。下圖展示5靶向序列、其與食蟹獼猴之同源性及定位區之組合。
圖9展示在5種不同HSMM細胞(N = 2)中藉由使用包含分別由靶向序列導引編號145、146、205、208、210 (SEQ ID NO: 45、46、58、59及60)或其組合編碼之crRNA的sgRNA及dSaCas9-miniVR來活化人類UTRN基因。
圖10展示包含由靶向序列導引編號145、編號146或編號208編碼的crRNA之sgRNA在pED260、pED261或pED263質體主鏈中上調UTRN。根據分別在pED260、pED261或pED263主鏈中短暫表現導引編號145、編號146或編號208的HEK293FT細胞確定相對mRNA表現。資料表示為3次重複之平均值+標準差(N = 3，誤差條展示標準差)。
圖11中，左圖展示SDS-PAGE之色帶佈局，其中應用各AAV9樣品及標記物，且右圖展示SDS-PAGE之圖像。緊靠色帶11之值意謂分子量(kDa)。自各AAV樣品偵測三種衣殼蛋白(VP1、VP2及VP3，其分別為87、72及62 kDa)。此等結果指示選殖至質體(pED261-145、pED261-146、pED261-208、pED263-145、pED263-146及pED263-208)中的所關注基因可封裝至AAV9中。
圖12展示在HSMM細胞中藉由使用3種AAV9 (AAV9-ED261-145、AAV9-ED261-208及AAV9-ED263-208)活化人類UTRN基因表現(對於AAV組N = 3至4且對於非AAV對照N = 8，誤差條展示標準誤差)。人類UTRN基因表現藉由此等AAV9活化。
圖13展示以log 2倍數變化對比歸一化計數之平均值的形式繪製之相對於非靶向導引歸一化的目標導引之RNA測序結果(圖A；導引編號145對比NTg1，圖B；導引編號146對比NTg1及圖C；導引編號208對比NTg1)。
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Figure 12_A0101_SEQ_0161
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Figure 12_A0101_SEQ_0163
Figure 12_A0101_SEQ_0164

Claims (26)

  1. 一種聚核苷酸，其包含以下鹼基序列： (a)編碼核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白之鹼基序列，及 (b)編碼靶向以下之導引RNA之鹼基序列：人類肌營養相關蛋白(Utrophin)基因之表現調節區中SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172所示區中長度18至24個核苷酸之連續區。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其中編碼該導引RNA之鹼基序列包含SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之鹼基序列，或刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46、58、59、60、135、141、153、155、156、157、159、167或172中所列之鹼基序列。
  3. 如請求項1或2之聚核苷酸，其包含至少兩個不同的編碼該導引RNA之鹼基序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之聚核苷酸，其中該轉錄活化因子為包含VP64及RTA之轉錄活化域之肽。
  5. 如請求項4之聚核苷酸，其中該轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之聚核苷酸，其中該核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為dCas9。
  7. 如請求項6之聚核苷酸，其中該dCas9來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )。
  8. 如請求項1至7中任一項之聚核苷酸，其進一步包含用於編碼該導引RNA之鹼基序列的啟動子序列及/或用於編碼該核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與該轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之啟動子序列。
  9. 如請求項8之聚核苷酸，其中用於編碼該導引RNA之鹼基序列的啟動子序列係選自以下之群：U6啟動子、SNR6啟動子、SNR52啟動子、SCR1啟動子、RPR1啟動子、U3啟動子及H1啟動子。
  10. 如請求項8或9之聚核苷酸，其中用於編碼該核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與該轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之啟動子序列係選自以下之群：EFS啟動子、EF-1α啟動子、CMV啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、Des啟動子、CAG啟動子及MYOD啟動子。
  11. 如請求項8至10中任一項之聚核苷酸，其中編碼該導引RNA之鹼基序列包含SEQ ID NO: 45、46或59中所列之鹼基序列，或刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 45、46或59中所列之鹼基序列， 該轉錄活化因子包含SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 117中所列之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列， 該核酸酶缺失CRISPR效應蛋白為來源於金黃色葡萄球菌之dCas9， 用於編碼該導引RNA之鹼基序列之啟動子序列為U6啟動子，及 用於編碼該核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與該轉錄活化因子之融合蛋白的鹼基序列之啟動子序列為CK8啟動子。
  12. 如請求項11之聚核苷酸，其中編碼該導引RNA之鹼基序列包含SEQ ID NO: 59中所列之鹼基序列，或刪除、取代、插入及/或添加1至3個鹼基的SEQ ID NO: 59中所列之鹼基序列。
  13. 一種載體，其包含如請求項1至12中任一項之聚核苷酸。
  14. 如請求項13之載體，其中該載體為質體載體或病毒載體。
  15. 如請求項14之載體，其中該病毒載體選自由以下組成之群：腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體及慢病毒載體。
  16. 如請求項15之載體，其中該AAV載體選自由以下組成之群：AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV587 MTP、AAV588 MTP、AAV-B1、AAVM41、AAVrh74、AAVS1_P1及AAVS10_P1。
  17. 如請求項16之載體，其中該AAV載體為AAV9。
  18. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13至17中任一項之載體。
  19. 如請求項18之醫藥組合物，其用於治療或預防杜興氏(DUCHENNE)肌肉萎縮症或貝克爾(BECKER)肌肉萎縮症。
  20. 一種用於治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之方法，其包含向有需要之個體投與如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13至17中任一項之載體。
  21. 如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13至17中任一項之載體之用途，其用於治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症。
  22. 如請求項1至12中任一項之聚核苷酸或如請求項13至17中任一項之載體之用途，其用於製造用以治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症的醫藥組合物。
  23. 一種核糖核蛋白，其包含以下： (c)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白，及 (d)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172所示區中長度18至24個核苷酸之連續區的導引RNA。
  24. 一種用於活化人類肌營養相關蛋白基因表現的組合物或套組，其包含以下： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172所示區中長度18至24個核苷酸之連續區的導引RNA，或編碼該導引RNA之聚核苷酸。
  25. 一種用於治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之方法，其包含向有需要之個體投與以下(e)及(f)： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172所示區中長度18至24個核苷酸之連續區的導引RNA，或編碼該導引RNA之聚核苷酸。
  26. 一種如下(e)及(f)之用途： (e)核酸酶缺失CRISPR效應蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白，或編碼該融合蛋白之聚核苷酸，及 (f)靶向人類肌營養相關蛋白基因之表現調節區中SEQ ID NO: 104、105、135、141、153、167或172所示區中長度18至24個核苷酸之連續區的導引RNA，或編碼該導引RNA之聚核苷酸， 其用於製造用以治療或預防杜興氏肌肉萎縮症或貝克爾肌肉萎縮症之醫藥組合物。
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