TW202028472A - 用於治療丙酸血症之基因療法 - Google Patents

Abstract

本發明提供腺相關病毒載體、重組腺相關病毒(rAAV)及其在用於治療丙酸血症(PA)之基因療法中之使用方法。亦提供醫藥組合物，其包含本發明之重組腺相關病毒及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。此等醫藥組合物可適用於用以治療由丙醯輔酶A羧化酶α-次單位(PCCA)中之突變或丙醯輔酶A羧化酶β-次單位(PCCB)中之突變引起之PA的基因療法。

Description

用於治療丙酸血症之基因療法

本發明大體上係關於腺相關病毒載體、腺相關病毒及其在用於治療丙酸血症之基因療法中之使用方法。

丙酸血症(propionic acidemia，PA)，亦稱為丙酸尿症，為由活性丙醯輔酶A羧化酶(propionyl-CoA carboxylase，PCC)不足引起之先天性有機酸代謝異常，該羧化酶為一種將丙醯輔酶A轉化為(D)-甲基丙二醯基-CoA所需的酶，該轉化為奇數鏈脂肪酸及產生丙酸的胺基酸，尤其是異白胺酸、蘇胺酸、甲硫胺酸及纈胺酸在分解代謝途徑中之關鍵步驟。PCC酶由兩個不相同次單位(α及β)構成，其分別由PCCA基因及PCCB基因編碼。PCCA或PCCB中之突變可導致丙醯輔酶A羧化酶不足。在一項研究中，對30位PA患者進行突變分析且發現15位患者α-次單位不足及15位患者β-次單位不足。參見Yang等人, 2004,Mol Genet and Metab . 81: 335-342。

在美國PA之估計發病率為1:105,000至1:130,000。此罕見的常染色體隱性代謝障礙在新生兒早期呈現為不良攝食、嘔吐、嗜睡、癲癇發作及缺乏肌肉張力。若不治療，由於繼發性高氨血症、感染、心肌症或基底神經節中風，可訊速死亡。在美國，在新生兒中PA可幾乎立即診斷且該疾病包括於新生兒篩查項目中。

目前藉由膳食限制胺基酸前驅體、補充L-肉鹼以解決降低之肉鹼水準及投與抗生素以降低腸細菌產生之丙酸來管理PA。在患者無法藉由標準治療管理之情況下，肝移植在管理PA中起作用。然而，儘管積極努力經由營養、輔因子及抗生素療法之複雜組合以解決該疾病，但患有PA之患者之長期預後仍然不良。參見van der Meer等人, 1996,Eur. J.Pediatr . 155: 205-210。因此，需要改良之治療方法，其解決疾病之潛在病因，亦即PCC不足。

本發明經由創建介導功能PCCA或PCCB基因轉移至患有PA之患者的腺相關病毒載體來解決此需要。本發明亦描述重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)之創建，該重組腺相關病毒將功能PCCA或PCCB基因遞送至患有PA之患者。

本發明提供組合物及其在基因療法中之使用方法。更特定言之，本文提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)衣殼，及封裝於其中適用於治療PA之載體基因組。

在一個態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組以5'至3'次序包含：(a)5'-反向末端重複(5'-ITR)序列；(b)啟動子序列；(c)PCCA之部分或完整編碼序列；及(d)3'-反向末端重複(3'-ITR)序列。

在另一態樣中，本發明提供一種rAAV，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)內含子序列；(e)PCCA之部分或完整編碼序列；(f)聚腺苷酸化信號序列；及(g)3'-ITR序列。

在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組包含AAV 5'-ITR序列、啟動子序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列及AAV 3'-ITR序列。

在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、人類PCCA 5'-非轉譯區(5'-UTR)之截短或完整核苷酸序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、截短或完整人類PCCA 3'-非轉譯區(3'-UTR)核苷酸序列及AAV 3'-ITR。

在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組包含由SEQ ID NO: 30表示之完整人類PCCA 5'-UTR。在某些實施例中，該封裝基因組包含截短人類PCCA 5'-UTR核苷酸序列。在一些實施例中，人類PCCA 5'-UTR之該截短核苷酸序列包含SEQ ID NO: 30之一部分。在一些實施例中，人類PCCA 5'-UTR之該截短核苷酸序列包含至少100個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 30之相等長度區至少95%一致。在某些實施例中，當該封裝載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該截短或完整人類PCCA 5'-UTR位於PCCA之內含子序列與部分或完整編碼序列之間。

在某些實施例中，封裝載體基因組包含由SEQ ID NO: 31表示之完整人類PCCA 3'-UTR。在某些實施例中，該封裝基因組包含截短人類PCCA 3'-UTR核苷酸序列。在一些實施例中，人類PCCA 3'-UTR之截短核苷酸序列包含SEQ ID NO: 31之一部分。在一些實施例中，人類PCCA 3'-UTR之截短核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 31之相等長度區至少95%一致。在某些實施例中，當封裝載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該截短或完整人類PCCA 3'-UTR位於聚腺苷酸化信號序列與3'-ITR序列之間。

在一個實施例中，PCCA之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。在一替代實施例中，PCCA之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。在一個例示性實施例中，PCCA之部分或完整編碼序列經密碼子優化以用於在人類中表現。

在一些實施例中，PCCA由SEQ ID NO: 1中所示之野生型編碼序列編碼。在另一實施例中，可使用表現PCCA之天然同功異型物或變異體之編碼序列，諸如UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05165-1 (SEQ ID NO: 25)、P05165-2 (SEQ ID NO: 26)及P05165-3 (SEQ ID NO: 27)中所示之編碼序列。在某些實施例中，PCCA由密碼子優化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCA由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與SEQ ID NO: 1中所示之野生型編碼序列的小於80%一致。在一些例示性實施例中，PCCA由選自SEQ ID NO: 2-6之密碼子優化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCA由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少80%一致。在一些實施例中，PCCA由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少90%一致。在一些實施例中，PCCA由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少95%一致。在一些實施例中，PCCA之編碼序列可在3'端進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。在一些實施例中，所表現之PCCA包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列或由其組成。

在另一態樣中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組以5'至3'次序包含：(a)5'-ITR序列；(b)啟動子序列；(c) PCCB之部分或完整編碼序列；及(d) 3'-ITR序列。

在另一態樣中，本發明提供一種rAAV，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)內含子序列；(e) PCCB之部分或完整編碼序列；(f)聚腺苷酸化信號序列；及(g) 3'-ITR序列。

在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列及AAV 3'-ITR序列。

在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、人類PCCB 5'-非轉譯區(5'-UTR)之截短或完整核苷酸序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、截短或完整人類PCCB 3'-非轉譯區(3'-UTR)核苷酸序列及AAV 3'-ITR。

在某些實施例中，該封裝載體基因組包含由SEQ ID NO: 32表示之完整人類PCCB 5'-UTR。在某些實施例中，該封裝載體基因組包含截短人類PCCB 5'-UTR核苷酸序列。在一些實施例中，人類PCCB 5'-UTR之截短核苷酸序列包含SEQ ID NO: 32之一部分。在一些實施例中，人類PCCB 5'-UTR之截短核苷酸序列包含至少100個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 32之相等長度區至少95%一致。在某些實施例中，當該封裝載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該截短或完整人類PCCB 5'-UTR位於PCCB之內含子序列與部分或完整編碼序列之間。

在某些實施例中，該封裝載體基因組包含由SEQ ID NO: 33表示之完整人類PCCB 3'-UTR。在某些實施例中，該封裝載體基因組包含截短人類PCCB 3'-UTR核苷酸序列。在一些實施例中，人類PCCB 3'-UTR之截短核苷酸序列包含SEQ ID NO: 33之一部分。在一些實施例中，人類PCCB 3'-UTR之截短核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 33之相等長度區至少95%一致。在某些實施例中，當該封裝載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該截短或完整人類PCCB 3'-UTR位於聚腺苷酸化信號序列與3'-ITR序列之間。

在一個實施例中，PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。在一替代實施例中，PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。在一個例示性實施例中，PCCB之部分或完整編碼序列經密碼子優化以用於在人類中表現。

在一些實施例中，PCCB由SEQ ID NO: 7中所示之野生型編碼序列編碼。在另一實施例中，可使用表現PCCB之天然同功異型物或變異體之編碼序列，諸如UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05166-1 (SEQ ID NO: 28)及P05166-2 (SEQ ID NO: 29)中所示之編碼序列。在替代實施例中，PCCB由密碼子優化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCB由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與SEQ ID NO: 7中所示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些例示性實施例中，PCCB由選自SEQ ID NO: 8-12之密碼子優化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCB由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與選自SEQ ID NO: 8-12之序列至少80%一致。在一些實施例中，PCCB由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與選自SEQ ID NO: 8-12之序列至少90%一致。在一些實施例中，PCCB由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與選自SEQ ID NO: 8-12之序列至少95%一致。在一些實施例中，該PCCB之編碼序列可在3'端進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。在一些實施例中，表現之PCCB包含SEQ ID NO: 17之胺基酸序列或由其組成。

在一些實施例中，5'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，5'-ITR序列及3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，5'-ITR序列及/或3'-ITR序列包含SEQ ID NO: 15或由其組成。在其他實施例中，5'-ITR序列及/或3'-ITR序列來自非AAV2源。

在一個實施例中，啟動子選自：雞β-肌動蛋白(chicken β-actin，CBA)啟動子、細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)即刻早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin，TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(thyroxine binding globulin，TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(alpha-1 anti-trypsin，A1AT)啟動子、CAG啟動子(使用CMV早期強化子元件、啟動子、第一外顯子及CBA基因之第一內含子及兔β血球蛋白基因之剪接受體構築)、PCCA基因特異性內源性啟動子及PCCB基因特異性內源性啟動子。在一例示性實施例中，該啟動子為CBA啟動子。在一個實施例中，該CBA啟動子包含SEQ ID NO: 18或由其組成。在一些實施例中，該啟動子為基因特異性內源性啟動子。在一個實施例中，該啟動子包含天然基因啟動子元件。在一例示性實施例中，該啟動子為包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列的PCCA基因特異性內源性啟動子，當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 34之相等長度區至少95%一致。在一例示性實施例中，該啟動子為包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列的PCCB基因特異性內源性啟動子，當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 36之相等長度區至少95%一致。

在一些實施例中，該封裝載體基因組進一步包含一或多個強化子序列。在一個實施例中，該強化子選自細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(transthyretin enhancer，enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及脂蛋白元E (apolipoprotein E，ApoE)強化子。在一個例示性實施例中，該強化子為CMV強化子。在一個實施例中，該CMV強化子包含SEQ ID NO: 19或由其組成。在某些實施例中，該強化子位於啟動子序列上游。

在一些實施例中，封裝載體基因組進一步包含一或多個內含子序列。在一個實施例中，該內含子選自SV40小T內含子、兔血紅蛋白次單位β (rabbit hemoglobin subunit beta，rHBB)內含子、人類β血球蛋白IVS2內含子、β血球蛋白/IgG嵌合內含子(Promega嵌合內含子)或hFIX內含子。在一個例示性實施例中，該內含子為SV40小T內含子。在一個實施例中，該SV40小T內含子序列包含SEQ ID NO: 20或由其組成。在另一例示性實施例中，該內含子為rHBB內含子。在一個實施例中，該rHBB內含子序列包含SEQ ID NO: 21或由其組成。

在一些實施例中，封裝載體基因組進一步包含共同科紮克序列(consensus Kozak sequence)。在一些實施例中，該共同科紮克序列位於內含子序列下游。在一個實施例中，該共同科紮克序列為GCCGCC(SEQ ID NO: 24)。在某些實施例中，該共同科紮克序列位於PCCA之編碼序列上游。在某些實施例中，該共同科紮克序列位於PCCB之編碼序列上游。

在一些實施例中，封裝載體基因組進一步包含聚腺苷酸化信號序列。在某些實施例中，該聚腺苷酸化信號序列選自牛生長激素(bovine growth hormone，BGH)聚腺苷酸化信號序列、SV40聚腺苷酸化信號序列、兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列、PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列、PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在一例示性實施例中，該聚腺苷酸化信號序列為牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列。在一個實施例中，該BGH聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 22或由其組成。在另一例示性實施例中，該聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列。在一個實施例中，該SV40聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 23或由其組成。在另一例示性實施例中，當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該聚腺苷酸化信號序列包含PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在一個實施例中，該PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 35之相等長度區至少95%一致。在另一例示性實施例中，當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該聚腺苷酸化信號序列包含PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在一個實施例中，該PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 37之相等長度區至少95%一致。

在某些實施例中，該AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV。在一個例示性實施例中，該AAV衣殼來自AAV9。在另一例示性實施例中，該AAV衣殼來自AAV8。在另一例示性實施例中，該AAV衣殼為AAV9變異體衣殼。

在某些實施例中，本發明提供rAAV，其中編碼序列係用於PCCA且不用於PCCB，啟動子為PCCA基因特異性內源性啟動子且並非PCCB基因特異性內源性啟動子，及聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在某些實施例中，本發明提供rAAV，其中編碼序列係用於PCCB且不用於PCCA，啟動子為PCCB基因特異性內源性啟動子且並非PCCB基因特異性內源性啟動子，及聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。

在一些態樣中，本發明提供編碼PCCA之新穎的密碼子優化核酸序列。在一個實施例中，該編碼PCCA之密碼子優化核酸序列與SEQ ID NO: 1中所示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些實施例中，該編碼PCCA之密碼子優化核酸序列與SEQ ID NO: 2-6至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%一致。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 1中所示之野生型編碼序列小於80%一致且與SEQ ID NO: 2-6至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%一致的核酸序列。在例示性實施例中，本發明提供編碼選自SEQ ID NO: 2-6之PCCA之核酸序列。進一步提供SEQ ID NO: 2-6中所示之編碼具有功能性PCCA活性之多肽之核酸序列的片段。在一些實施例中，該編碼PCCA之核酸序列可在3'端進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。

在一些態樣中，本發明提供編碼PCCB之新穎的密碼子優化核酸序列。在一個實施例中，該編碼PCCB之密碼子優化核酸序列與SEQ ID NO: 7中所示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些實施例中，該編碼PCCB之密碼子優化核酸序列與SEQ ID NO: 8-12至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%一致。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 7中所示之野生型編碼序列小於80%一致且與SEQ ID NO: 8-12至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%一致的核酸序列。在例示性實施例中，本發明提供編碼選自SEQ ID NO: 8-12之PCCB之核酸序列。進一步提供SEQ ID NO: 8-12中所示之核酸序列之片段，其編碼具有功能性PCCB活性之多肽。在一些實施例中，該編碼PCCB之核酸序列可在3'端進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。

在某些實施例中，本發明提供適用作用於治療PA之基因療法之試劑的重組腺相關病毒(rAAV)，其中該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之如本文中所描述之載體基因組。在一些實施例中，該AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV(亦即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10或AAVhu37)。在一個例示性實施例中，該AAV載體為AAV血清型9 (AAV9)載體、AAV9變異體載體、AAV血清型8 (AAV8)載體或AAV血清型2 (AAV2)載體。

在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)內含子序列；(e)用於選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列；(f)聚腺苷酸化信號序列；及(g)3'ITR序列

在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)內含子序列；(e)用於選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列；(f)聚腺苷酸化信號序列；及(g) 3'ITR序列

在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)內含子序列；(e)用於選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列；(f)聚腺苷酸化信號序列；及(g) 3'-ITR序列。

在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：(a) 5'-ITR序列；(b)強化子序列；(c)啟動子序列；(d)內含子序列；(e)用於選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列；(f)聚腺苷酸化信號序列；及(g) 3'-ITR序列。

在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：(a)AAV2 5'-ITR序列；(b) CMV強化子序列；(c) CBA啟動子序列；(d) rHBB或SV40小T內含子序列；(e)用於選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列；(f) BGH或SV40聚腺苷酸化信號序列；及(g) AAV2 3'-ITR序列。

在某些實施例中，本發明提供一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：(a) AAV2 5'-ITR序列；(b) CMV強化子序列；(c) CBA啟動子序列；(d) rHBB或SV40小T內含子序列；(e)用於選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列；(f) BGH或SV40聚腺苷酸化信號序列；及(g) AAV2 3'-ITR序列。

在某些實施例中，本發明提供一種重組核酸構築體，其包含(a) 5'-ITR序列；(b)啟動子序列；(c) PCCA之部分或完整編碼序列；及(d) 3'-ITR序列。在某些實施例中，本發明提供一種重組核酸構築體，其包含(a) 5'-ITR序列；(b)啟動子序列；(c) PCCB之部分或完整編碼序列；及(d) 3'-ITR序列。

在一些態樣中，本發明提供本文所揭示之rAAV用於治療PA之用途，其中該rAAV包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組。在一些實施例中，該rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR序列、啟動子序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列及3'-ITR序列。在一例示性實施例中，封裝基因組亦包含啟動子序列上游之強化子序列、啟動子下游之內含子及3'-ITR上游之聚腺苷酸化序列。在一個例示性實施例中，該rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、CBA啟動子、SV40小T內含子、PCCA之編碼序列、BGH聚腺苷酸化信號序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含位於內含子序列下游之共同科紮克序列。在一些實施例中，該PCCA之編碼序列選自SEQ ID NO: 1-6。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

在一些態樣中，本發明提供本文所揭示之rAAV用於治療PA之用途，其中該rAAV包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組。在一些實施例中，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、啟動子序列(例如，PCCA基因特異性內源性啟動子序列)、人類PCCA 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、人類PCCA 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列及3'-ITR。在一例示性實施例中，該封裝基因組亦包含在啟動子序列上游之強化子序列、在啟動子下游之內含子及在3'-ITR上游之PCCA基因特異性聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含共同科紮克序列，其位於人類PCCA 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列下游及PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列上游。在一些實施例中，該PCCA之編碼序列選自SEQ ID NO: 1-6。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

在一些態樣中，本發明提供本文所揭示之rAAV用於治療PA之用途，其中該rAAV包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組。在一些實施例中，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、啟動子序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列及3'-ITR。在一例示性實施例中，封裝基因組亦包含啟動子序列上游之強化子序列、啟動子下游之內含子及3'-ITR上游之聚腺苷酸化序列。在一個例示性實施例中，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、CBA啟動子、SV40小T內含子、PCCB之編碼序列、BGH聚腺苷酸化信號序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含位於內含子序列下游之共同科紮克序列。在一些實施例中，該PCCB之編碼序列選自SEQ ID NO: 7-12。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

在一些態樣中，本發明提供本文所揭示之rAAV用於治療PA之用途，其中該rAAV包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組。在一些實施例中，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、啟動子序列(例如，PCCB基因特異性內源性啟動子序列)、人類PCCB 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、人類PCCB 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列及3'-ITR。在一例示性實施例中，該封裝基因組亦包含在啟動子序列上游之強化子序列、在啟動子下游之內含子及在3'-ITR上游之PCCB基因特異性聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含共同科紮克序列，其位於人類PCCB 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列下游及PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列上游。在一些實施例中，該PCCB之編碼序列選自SEQ ID NO: 7-12。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

本發明進一步係關於包含本文所揭示之rAAV的醫藥組合物。在一些實施例中，該醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，該醫藥組合物經調配用於皮下、肌肉內、皮內、腹膜內或靜脈內投與。在一例示性實施例中，該醫藥組合物經調配用於靜脈內投與。

在又一態樣中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供治療PA之方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中載體基因組包含PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在另一實施例中，本發明提供治療PA之方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中載體基因組包含用於PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。

在某些實施例中，本發明提供一種治療PA之方法，其包含投與(1)包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列；及(2)包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在一些實施例中，可同時投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可依序投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可分別投與(1)及(2)之rAAV。

在某些實施例中，本發明提供一種治療PA之方法，其包含投與(1)包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該編碼序列係用於PCCA且不用於PCCB，啟動子為PCCA基因特異性內源性啟動子且並非PCCB基因特異性內源性啟動子，及聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列；及/或(2)包括AAV衣殼及載體基因組之rAAV，其中該編碼序列係用於PCCB且不用於PCCA，啟動子為PCCB基因特異性內源性啟動子且並非PCCA基因特異性內源性啟動子，及聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列；及/或。在一些實施例中，可同時投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可依序投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可分別投與(1)及(2)之rAAV。

在某些實施例中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向診斷患有PCCA中之至少一個突變的人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供治療經診斷患有PCCA中之至少一個突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，本發明提供治療經診斷患有PCCA中之至少一個突變的人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝其中之載體基因組的rAAV，其中該編碼序列係用於PCCA而非用於PCCB，啟動子為PCCA基因特異性內源性啟動子而非PCCB基因特異性內源性啟動子，且聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列而非PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在某些實施例中，該PCCA中之突變選自表1。在一些實施例中，該PCCA之編碼序列選自SEQ ID NO: 1-6。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

在一些態樣中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向經診斷患有PCCB中之至少一個突變之人類個體投與治療有效量的本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供一種治療經診斷患有PCCB中之至少一個突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，本發明提供治療經診斷患有PCCB中之至少一個突變的人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝其中之載體基因組的rAAV，其中編碼序列係用於PCCB而非用於PCCA，啟動子為PCCB基因特異性內源性啟動子而非PCCA基因特異性內源性啟動子，且聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列而非PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在某些實施例中，該PCCB中之突變選自表2。在一些實施例中，該PCCB之編碼序列選自SEQ ID NO: 7-12。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

在一些實施例中，皮下、肌肉內、皮內、腹膜內或靜脈內投與rAAV。在一個例示性實施例中，靜脈內投與rAAV。在一些實施例中，以約1×10¹¹ 至約1×10¹⁴ 個基因組複本(GC)/公斤之劑量投與rAAV。在其他實施例中，以約1×10¹² 至約1×10¹³ 個基因組複本(GC)/公斤之劑量投與rAAV。在一些實施例中，投與單次劑量之rAAV。在其他實施例中，投與多次劑量之rAAV。

在一些態樣中，本文中提供宿主細胞，其包含本文中所揭示之重組核酸分子、AAV載體或rAAV。在特定實施例中，該宿主細胞可適用於AAV繁殖。在某些實施例中，該宿主細胞選自HeLa、Cos-7、HEK293、A549、BHK、Vero、RD、HT-1080、ARPE-19或MRC-5細胞。

本發明之此等及其他態樣及特徵描述於本發明之以下章節中。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2018年10月1日申請之美國臨時專利申請案第62/739,471號之權益及優先權，出於所有目的，該臨時專利申請案之全部揭示內容特此以全文引用之方式併入本文中。 序列表

本申請案含有序列表，其已呈ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本創建於2019年9月22日，命名為ULP-001WO_SL_ST25.txt且大小為98,889位元組。

本發明提供一系列用於治療應用之新穎試劑及組合物。本發明之核酸序列、載體、重組病毒及相關組合物可用於改善、預防或治療如本文所描述之PA。

除非另外指出，否則根據習知用途使用技術術語。分子生物學中之常用術語之定義可發現於Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press出版, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew等人(編),The Encyclopedia of Molecular Biology , Blackwell Science Ltd.出版, 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A. Meyers (編),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference , VCH Publishers, Inc.出版, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)中。

為了促進回顧檢閱本發明之各種具體實例，提供特定術語之以下解釋：

腺相關病毒(AAV)：感染人類及一些其他靈長類物種之小型、複製缺陷型、無包膜型病毒。未知AAV會引起疾病且誘導極輕度的免疫反應。利用AAV之基因療法載體可感染分裂及靜止細胞兩者且可以染色體外狀態保持而不整合至宿主細胞之基因組中。此等特徵使AAV成為用於基因療法之有吸引力的病毒載體。目前存在12種所識別之AAV血清型(AAV1-12)。

投與(administration/administer)：藉由任何有效途徑向個體提供或給予諸如治療劑(例如重組AAV)之試劑。例示性投藥途徑包括(但不限於)注射(諸如皮下、肌肉內、皮內、腹膜內及靜脈內)、經口、經導管內、經舌下、經直腸、經皮、經鼻內、經陰道及吸入途徑。

密碼子優化：「密碼子優化」核酸係指已經改變以使得密碼子對於特定系統(諸如特定物種或物種群組)中之表現最佳的核酸序列。舉例而言，核酸序列可針對在哺乳動物細胞或特定哺乳動物物種(諸如人類細胞)中之表現優化。密碼子優化不改變經編碼之蛋白質之胺基酸序列。

強化子：藉由增加啟動子之活性來增加轉錄速率之核酸序列。

內含子：基因內一段不含有蛋白質之編碼資訊之DNA。在轉譯信使RNA之前移除內含子。

反向末端重複序列(ITR)：有效複製所需之腺相關病毒之基因組中之對稱核酸序列。ITR序列位於AAV DNA基因組之各末端。ITR充當病毒DNA合成之複製起點且為產生AAV整合載體之必需順式組分。

分離：「分離」生物組分(諸如核酸分子、蛋白質、病毒或細胞)已與其中天然存在組分之生物體之細胞或組織中的其他生物組分或生物體自身(諸如其他染色體及染色體外DNA及RNA、蛋白質及細胞)實質上分離或純化。已「分離」核酸分子及蛋白質包括藉由標準純化方法純化之彼等核酸分子及蛋白質。該術語亦包括藉由重組表現於宿主細胞中製備之核酸分子及蛋白質以及化學合成之核酸分子及蛋白質。

可操作地連接：當第一核酸序列與第二核酸序列處於函數關係中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。一般而言，可操作地連接之DNA序列為連續的，且當必需接合兩個蛋白質編碼區時，在相同閱讀框架中。

醫藥學上可接受之載劑：適用於本發明之醫藥學上可接受之載劑(媒劑)為習知的。Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 由E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa.著, 第15版(1975)，描述適用於一或多種治療化合物、分子或試劑之醫藥遞送的組合物及調配物。

一般而言，載劑之性質將視採用之特定投與模式而定。舉例而言，非經腸調配物通常包含包括醫藥學上及生理學上可接受之流體的可注射流體，諸如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油或其類似物作為媒劑。對於固體組合物(例如散劑、丸劑、錠劑或膠囊形式)，習知無毒固體載劑可包括例如醫藥級之甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除生物學中性載劑以外，待投與之醫藥組合物可含有少量無毒輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑及pH緩衝劑及其類似物，例如乙酸鈉或脫水山梨醇單月桂酸酯。

預防、治療或改善疾病：「預防」疾病(諸如PA)係指抑制疾病之完全發展。「治療」係指改善疾病或病理性病症(諸如PA)之病徵或症狀在其開始發展之後的治療性干預。「改善」係指疾病(諸如PA)之病徵或症狀之數目或嚴重程度降低。

啟動子：引導/起始核酸(例如基因)之轉錄的DNA區域。啟動子包括轉錄起始位點附近之必需核酸序列。許多啟動子序列為熟習此項技術者所已知，且甚至人工核酸分子中不同啟動子序列之組合為可能的。如本文所用，基因特異性內源性啟動子係指調節相關內源性基因之表現的天然啟動子元件。在一例示性實施例中，PCCA基因特異性內源性啟動子調節PCCA基因之表現。在另一例示性實施例中，PCCB基因特異性內源性啟動子調節PCCB基因之表現。

純化：如本文所用之術語「純化」不要求絕對純度；相反，其意欲為相對術語。因此，舉例而言，經純化之肽、蛋白質、病毒或其他活性化合物為完全或部分地自天然締合之蛋白質及其他污染物分離之化合物。在某些實施例中，術語「實質上經純化」係指已自細胞、細胞培養基或其他粗製劑分離且進行部分分離以移除初始製劑之各種組分(諸如蛋白質、細胞碎片及其他組分)的肽、蛋白質、病毒或其他活性化合物。

重組：重組核酸分子為具有並非天然存在之序列或具有藉由人工組合另外間隔開之序列片段製得之序列的核酸分子。此人工組合可藉由化學合成或藉由人工操縱核酸分子之分離片段來實現，諸如藉由基因工程改造技術。

類似地，重組病毒為包含非天然存在或藉由人工組合不同來源之至少兩個序列製成之序列(諸如基因組序列)的病毒。術語「重組」亦包括僅藉由添加、取代或缺失天然核酸分子、蛋白質或病毒之一部分而變化的核酸、蛋白質及病毒。如本文所使用，「重組AAV」係指一種AAV顆粒，其中重組核酸分子，諸如編碼PCCA之重組核酸分子及/或編碼PCCB之重組核酸分子已經封裝。

序列一致性：兩種或兩種以上核酸序列或兩種或兩種以上胺基酸序列之間的一致性或相似性係根據序列之間的一致性或相似性來表現。序列一致性可依據一致性百分比進行量測；百分比愈高，序列愈一致。序列相似性可依據相似性百分比(其考慮保守胺基酸取代)量測；百分比愈高，序列愈相似。當使用標準方法比對時，核酸或胺基酸序列之同源物或直系同源物具有相對較高程度之序列一致性/相似性。當直系同源蛋白質或cDNA衍生自與更遠相關之物種(諸如人類及C .elegans 序列)相比更緊密相關之物種(諸如人類及小鼠序列)時，此同源性更顯著

用於比較之序列比對方法在此項技術中已熟知。各種程式及比對演算法描述於：Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970: Pearson & Lipman,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp,Gene , 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet 等人,Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang 等人Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992: 及 Pearson 等人,Meth. Mol. Rio. 24:307-31, 1994中。Altschul 等人, J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990, 呈現序列比對方法及同源性計算之詳細考慮。

NCBI鹼基局部比對檢索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST) (Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)可獲自數種來源，包括國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)及在網際網路上，其與序列分析程式blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx結合使用。其他資訊可見於NCBI網站。

血清型：經一組特徵性抗原區分之一組緊密相關之微生物(諸如病毒)。

填充序列：係指較大核酸分子內所含有之核苷酸序列(諸如載體)，其通常用於在兩個核酸特徵之間(諸如在啟動子與編碼序列之間)產生所需間隔，或延伸核酸分子以使其具有所需長度。填充序列不含有蛋白質編碼資訊且可具有未知/合成來源及/或與較大核酸分子內之其他核酸序列不相關。

個體：活的多細胞脊椎動物生物體，其為包括人類及非人類哺乳動物之類別。

合成：由人工手段產生於實驗室中，例如合成核酸，可在實驗室中以化學方式合成。

未轉譯區(UTR)：典型mRNA含有分別在編碼區上游及下游之5'非轉譯區(「5' UTR」)及3'非轉譯區(3' UTR)(參見Mignone F .等人, (2002)Genome Biol 3: REVIEWS0004)。

治療有效量：定量之指定醫藥或治療劑(例如重組AAV)，其足以在用該試劑治療之個體或細胞中達成所需效果。試劑之有效量將視若干因素而定，該等因素包括(但不限於)所治療之個體或細胞及治療組合物之投與方式。

載體：載體為允許插入外來核酸而不妨礙載體在宿主細胞中複製及/或整合之能力的核酸分子。載體可包括准許其在宿主細胞中複製之核酸序列，諸如複製起點。載體亦可包括一或多個可選標記基因及其他基因元件。表現載體為含有允許一或多個插入基因轉錄及轉譯所需之調節序列的載體。在本文中之一些實施例中，載體為AAV載體。

除非另外解釋，否則本文中所用的所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同的含義。除非上下文另外明確指示，否則單數術語「一(a/an)」及「該」包括多個指示物。「包含A或B」意謂包括A、或B或A及B。應進一步理解，對核酸或多肽所給出之所有鹼基大小或胺基酸大小，及所有分子量或分子質量值均為近似值，且出於描述而提供。儘管與本文所描述之方法及材料類似或等效之方法及材料可用於實施或測試本發明，但在下文描述適合方法及材料。本文所提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考案均以全文引用的方式併入本文中。在矛盾情況下，將以本說明書，包括術語解釋為準。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不欲作為限制。病毒載體：

在一些態樣中，本發明提供腺相關病毒(AAV)載體，其含有封裝基因組，該封裝基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、及AAV 3'-ITR。

在某些實施例中，本發明提供一種AAV載體，其含有封裝基因組，該基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、人類PCCA 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、截短或完整人類PCCA 3'-UTR核苷酸序列及AAV 3'-ITR。

在一些態樣中，本發明提供含有封裝基因組之AAV載體，該封裝基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、及AAV 3'-ITR。

在某些實施例中，本發明提供含有封裝基因組之AAV載體，該封裝基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、人類PCCB 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、截短或完整人類PCCB 3'-UTR核苷酸序列及AAV 3'-ITR。

在一些實施例中，封裝基因組可另外包含如本文所描述之強化子、內含子、共同科紮克序列及/或聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，重組載體可進一步包括一或多種填充核酸序列。在一個實施例中，填充核酸序列位於PCCA或PCCB之內含子與部分或完整編碼序列之間。

在本文所描述之各種實施例中，重組病毒載體為AAV載體。AAV載體可為血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12之AAV載體(亦即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12)，以及自人類及非人類靈長類組織分離之超過100種變異體中之任一者。參見例如 , Choi 等人., 2005, Curr Gene Ther. 5: 299-310, 2005 及 Gao 等人, 2005, Curr Gene Ther. 5: 285-297。任何血清型之AAV載體可用於本發明中，且AAV血清型之選擇將部分地視針對基因療法所靶向之細胞類型而定。對於PA之治療，肝為相關目標器官中之一者。在一些實施例中，AAV載體選自血清型9 (AAV9)、血清型8 (AAV8)或其變異體。在一例示性實施例中，AAV載體為血清型9 (AAV9)或其變異體。

在一些實施例中，重組AAV載體包括AAV ITR序列，當AAV及腺病毒輔助功能以反式提供時，該序列充當載體基因組之載體DNA複製起點及封裝信號兩者。另外，ITR充當大型Rep蛋白質之單股核酸內切酶切口的目標，自複製中間物解析個別基因組。

在一些實施例中，5'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，5'-ITR序列及3'-ITR序列來自AAV2。在一些實施例中，5'-ITR序列及/或3'-ITR序列來自AAV2且包含SEQ ID NO: 15或由其組成。在其他實施例中，5'-ITR序列及/或3'-ITR序列來自非AAV2源。

在一些例示性實施例中，AAV載體為AAV血清型9 (AAV9)載體，且載體包括強化子、啟動子、內含子、PCCA或PCCB之編碼序列，及本文所描述之聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，AAV9載體另外包括兩個AAV2、AAV8或AAV9反向末端重複(ITR)序列：強化子之一個5'及聚腺苷酸化信號之一個3'。在一例示性實施例中，AAV9載體包括兩個AAV2反向末端重複(ITR)序列：強化子之一個5'及聚腺苷酸化信號之一個3'。在一些實施例中，AAV2 ITR序列包含SEQ ID NO: 15或由其組成。在另一例示性實施例中，AAV9載體包括兩個AAV9反向末端重複(ITR)序列：強化子之一個5'及聚腺苷酸化信號之一個3'。啟動子：

在本文所描述之各種態樣中，提供病毒載體，其含有包含有助於驅動及調節轉基因表現，例如表現PCCA或PCCB之啟動子序列的封裝基因組。在某些實施例中，啟動子選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子、CAG啟動子、PCCA 基因特異性內源性啟動子及PCCB基因特異性內源性啟動子。在例示性實施例中，啟動子序列位於所選擇之5'-ITR序列與PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列之間。在一些實施例中，啟動子序列位於強化子序列下游。在一些實施例中，啟動子序列位於內含子序列上游。在一些實施例中，啟動子序列位於所選擇之5'-ITR序列與人類PCCA或人類PCCB 5'-非轉譯區(UTR)之截短或完整核苷酸序列之間。

在一些例示性實施例中，使用可視情況位於CMV即刻早期強化子(CMV immediate early enhancer，CMV IE)下游之廣佈的雞β-肌動蛋白啟動子(CBA)。在某些實施例中，本文所描述之封裝基因組包含原生PCCA或PCCB啟動子元件。在一些例示性實施例中，本文所描述之封裝基因組包含PCCA基因特異性啟動子，該啟動子包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，當該封裝基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 34之相等長度區至少95%一致。在某些實施例中，本文所描述之封裝基因組包含PCCA基因特異性內源性啟動子，其包含約15個連續核苷酸之核苷酸序列(例如約30、約45、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290、約300、約325、約350、約375、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、或約750)，其與SEQ ID NO: 34之相等長度區至少95%一致。在一些例示性實施例中，本文所描述之封裝基因組包含PCCA基因特異性啟動子，該啟動子包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，當該封裝基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 34之相等長度區至少100%一致。

在一些例示性實施例中，本文所描述之封裝基因組包含PCCB基因特異性啟動子，該啟動子包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，當該封裝基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 36之相等長度區至少95%一致。在某些實施例中，本文所描述之封裝基因組包含PCCB基因特異性內源性啟動子，其包含約15個連續核苷酸之核苷酸序列(例如約30、約45、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270、約280、約290、約300、約325、約350、約375、約400、約425、或約450)，其與SEQ ID NO: 36之相等長度區至少95%一致。在一些例示性實施例中，本文所描述之封裝基因組包含PCCB基因特異性啟動子，該啟動子包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，當該封裝基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 36之相等長度區至少100%一致。

在一些實施例中，啟動子選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子及CAG啟動子。在一例示性實施例中，該啟動子為CBA啟動子。在一個實施例中，該CBA啟動子包含SEQ ID NO: 18或由其組成。

除啟動子之外，封裝基因組可含有其他適當轉錄起始、終止、強化子序列及高效RNA處理信號。如下文進一步詳細描述，此類序列包括剪接及聚腺苷酸化(聚A)信號、增強表現之調節元件(亦即WPRE)、使細胞質mRNA穩定之序列、增強轉譯效率之序列(亦即科紮克共同序列)及增強蛋白質穩定性之序列。

在一些實施例中，封裝基因組進一步包含共同科紮克序列。在一些實施例中，該共同科紮克序列位於內含子序列下游。在一個實施例中，該共同科紮克序列為GCCGCC(SEQ ID NO: 24)。如熟習此項技術者將理解，共同科紮克序列通常緊鄰編碼序列之上游定位；在此情況下，緊鄰PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列之上游。如熟習此項技術者應瞭解，共同科紮克序列可視為共用對應於治療性多肽之起始密碼子之ATG殘基，例如PCCA或PCCB。為簡化本發明，如本文所描述之共同科紮克序列包含對應於不與治療多肽共用之區域的六核苷酸序列，例如PCCA或PCCB。未轉譯區 (UTR) ：

已知來自內源性基因特異性mRNA之5'-非轉譯區(UTR)在藉由與細胞轉錄物競爭轉譯起始因子及核糖體來優化轉基因生產、藉由最小化mRNA衰變或轉錄後基因靜默來延長mRNA半衰期，及避免與調節蛋白質或抑制性RNA二級結構之有害相互作用中起重要作用(參見 Chiba, Y., 及Green, P. (2009).J. Plant Biol. 52, 114-124, Moore, M. J., 及 Proudfoot, N. J. (2009).Cell 136, 688-700, Jackson, R. J., 等人(2010).Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 113-127)。已發現位於蛋白質編碼序列下游之3'-未轉譯區(3'-UTR)涉及許多調節過程，包括轉錄物裂解、穩定性及聚腺苷酸化、轉譯及mRNA定位。因此，其在測定mRNA之去向中為關鍵的(參見Barrett, L.W., 等人 (2012).Cell Mol Life Sci. Nov; 69(21): 3613-3634)。 在某些實施例中，本發明提供含有包含人類PCCA或PCCB 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列之封裝基因組的rAAV。在某些實施例中，本發明提供含有包含人類PCCA或PCCB 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列之封裝基因組的rAAV。

在某些實施例中，本發明提供一種rAAV，其含有封裝基因組，該基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、人類PCCA 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、截短或完整人類PCCA 3'-UTR核苷酸序列及AAV 3'-反向末端重複(ITR)。

在某些實施例中，本發明提供含有封裝基因組之rAAV，該封裝基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、人類PCCB 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、截短或完整人類PCCB 3'-UTR核苷酸序列及AAV 3'-ITR。

在某些實施例中，封裝基因組包含由SEQ ID NO: 30表示之完整人類PCCA 5'-UTR。在某些實施例中，封裝基因組包含由SEQ ID NO: 32表示之完整人類PCCB 5'-UTR。

在某些實施例中，封裝基因組包含截短人類PCCA 5'-UTR核苷酸序列。在某些實施例中，截短人類PCCA 5'-UTR包含約50個連續核苷酸至約1400個連續核苷酸之核苷酸序列(例如約75、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約275、約300、約325、約350、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約900、約925、約950、約975、約1000、約1025、約1050、約1075、約1100、約1125、約1150、約1175、約1200、約1225、約1250、約1275、約1300、約1325或約1350)，其與SEQ ID NO: 30之相等長度區至少95%一致。

在某些實施例中，封裝基因組包含截短天然人類PCCB 5'-UTR。在某些實施例中，截短人類PCCB 5'-UTR包含約50個連續核苷酸至約1400個連續核苷酸之核苷酸序列。(例如約75、約100、約125、約150、約175、約200、約250、約275、約300、約325、約350、約400、約425、約450、約475、約500、約525、約550、約575、約600、約625、約650、約675、約700、約725、約750、約775、約800、約825、約850、約900、約925、約950、約975、約1000、約1025、約1050、約1075、約1100、約1125、約1150、約1175、約1200、約1225、約1250、約1275、約1300、約1325或約1350)，其與SEQ ID NO: 32之相等長度區至少95%一致。

在某些實施例中，封裝基因組包含由SEQ ID NO: 31表示之完整人類PCCA 3'-UTR。在某些實施例中，封裝基因組包含由SEQ ID NO: 33表示之完整人類PCCB 3'-UTR。

在某些實施例中，封裝基因組包含截短人類PCCA 3'-UTR。在某些實施例中，截短人類PCCA 3'-UTR包含約15個連續核苷酸之核苷酸序列(例如約30、約45、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、約250、約260、約270)，其與SEQ ID NO: 31之相等長度區至少95%一致。

在某些實施例中，封裝基因組包含截短天然人類PCCB 3'-UTR。在某些實施例中，截短人類PCCB 3'-UTR包含約15個連續核苷酸之核苷酸序列(例如約30、約45、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140或約150)，其與SEQ ID NO: 33之相等長度區至少95%一致。 PCCA 或 PCCB 多肽：

如本文所描述，本發明之態樣提供重組載體，其包括封裝基因組，該基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列及AAV 3'-ITR。本文進一步描述重組載體，其包括封裝基因組，該基因組包含AAV 5'-ITR、啟動子序列、PCCB或其功能片段或功能變異體或其同功異型物之部分或完整編碼序列、及AAV 3'-ITR。

在一個實施例中，PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。如本文所用，術語「野生型」係指與自然界中存在之生物聚合物(例如多肽序列或聚核苷酸序列)相同的生物聚合物(例如多肽序列或聚核苷酸序列)。

在一替代實施例中，PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。在一個實施例中，PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列經密碼子優化以用於在人類中表現。

在本文所描述之各種實施例中，提供載體，其含有包含PCCA或PCCB之編碼序列之封裝基因組。用本文所描述之載體傳遞之多肽涵蓋可適用於治療哺乳動物(包括人類)之PCCA及PCCB多肽。

在一些實施例中，用本文所描述之載體表現之多肽為PCCA(SEQ ID NO: 16；GenBank寄存編號NP_000273.2；728個胺基酸)或其功能片段、功能變異體或功能同功異型物。在一些實施例中，用本文所描述之載體表現之多肽為PCCA且包含SEQ ID NO: 16或由其組成。

在一個實施例中，PCCA多肽由SEQ ID NO: 1中所示之野生型編碼序列編碼。在另一實施例中，可使用表現PCCA之天然同功異型物或變異體之編碼序列，諸如UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05165-1 (SEQ ID NO: 25)、P05165-2 (SEQ ID NO: 26)及P05165-3 (SEQ ID NO: 27)中所示之編碼序列。在替代實施例中，PCCA多肽由密碼子優化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCA多肽由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與SEQ ID NO: 1中所示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些例示性實施例中，PCCA多肽由選自SEQ ID NO: 2-6之密碼子優化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCA之編碼序列可在3'端進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。

在一些實施例中，用本文所描述之載體表現之多肽為PCCB (SEQ ID NO: 17；Genbank寄存編號NP_000523.2；539個胺基酸)或其功能片段、功能變異體或功能同功異型物。在一些實施例中，用本文所描述之載體表現之多肽為PCCB且包含SEQ ID NO: 17或由其組成。

在一些實施例中，PCCB多肽由SEQ ID NO: 7中所示之野生型編碼序列編碼。在另一實施例中，可使用表現PCCB之天然同功異型物或變異體之編碼序列，諸如UniProtKB/Swiss-Prot寄存編號P05166-1 (SEQ ID NO: 28)及P05166-2 (SEQ ID NO: 29)中所示之編碼序列。在替代實施例中，PCCB多肽由密碼子優化編碼序列編碼。在一些實施例中，PCCB多肽由密碼子優化編碼序列編碼，該序列與SEQ ID NO: 7中所示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些例示性實施例中，PCCB多肽由選自SEQ ID NO: 8-12之密碼子優化編碼序列編碼。在一些實施例中，該PCCB之編碼序列可在3'端進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。

在各種態樣中，本發明可用於遞送本文所描述之PCCA或PCCB多肽之片段、變異體、同功異型物或融合物。

在一些實施例中，本發明可用於遞送PCCA或PCCB多肽之片段，其包含至少50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600個胺基酸殘基且保留與全長多肽相關之一或多種活性(例如在酶之情況下之催化活性)。此類片段可藉由此項技術中常規且熟知之重組技術獲得。此外，此類片段可藉由熟習此項技術者已知之常規活體外分析來測試催化活性。舉例而言，可藉由以下分析丙醯輔酶A羧化酶(PCC)活性：(1)在含有1 mM 2-巰基乙醇及0.1 mg/ml牛血清白蛋白之10 mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.0)中稀釋多肽，(2)獲取含有50 mM Tris-HCl pH 8.0、5 mM麩胱甘肽、2 mM ATP、100 mM KCl、10 mM MgCl₂ 、10 mM[¹⁴ C]-碳酸氫鹽(特異性活性12.4 mCi/mmol)、3 mM丙醯輔酶A之標準反應混合物，且在37℃下培育酶15分鐘，(3)藉由添加10%三氯乙酸停止反應，(4)在200×g下離心，(5)在加熱燈下乾燥等分試樣，(6)溶解於水中，及(7)於Aquasol中計數，其中酶活性之一個單位定義為在37℃下催化1 pmol碳酸氫鹽/分鐘之固著的酶之量。參見Kalousek 等人, 1980,J Biol Chem 255(1): 60-65 及 Hsia 等人. , 1973J. Pediatr. 83: 625-628有關PCC活性分析之描述。本發明進一步包括編碼上文描述之多肽片段之核酸分子。

在一些實施例中，本發明可用於遞送PCCA或PCCB多肽之變異體。在一些實施例中，變異體多肽可為至少80%(例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)與野生型治療多肽(例如SEQ ID NO: 16之野生型PCCA多肽或SEQ ID NO: 17之野生型PCCB多肽)一致。在一些實施例中，變異治療多肽與各別野生型多肽相比可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40種不同殘基。此類變異體可藉由此項技術中常規且熟知之重組技術獲得。此外，此類變異體可藉由熟習此項技術者已知之常規活體外分析來測試催化活性。參見例如 Kalousek 等人, 1980,J Biol Chem 255(1): 60-65 and Hsia 等人, 1973J. Pediatr. 83: 625-628關於丙醯輔酶A羧化酶活性分析之描述。本發明進一步包括編碼上文描述之治療多肽變異體之核酸分子。新穎的密碼子優化序列：

在一些態樣中，本發明提供編碼PCCA之新穎的密碼子優化核酸序列。在一個實施例中，該編碼PCCA之密碼子優化核酸序列與SEQ ID NO: 1中所示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些實施例中，編碼PCCA之密碼子優化核酸序列與SEQ ID NO: 2-6至少80% (例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)一致。在一些實施例中，編碼PCCA之密碼子優化核酸序列與選自SEQ ID NO: 2-6之序列100%一致。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 1中所示之野生型編碼序列小於80%一致且與SEQ ID NO: 2-6至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%一致的核酸序列。在例示性實施例中，本發明提供編碼選自SEQ ID NO: 2-6之PCCA之核酸序列。進一步提供SEQ ID NO: 2-6中所示之編碼具有功能性PCCA活性之多肽之核酸序列的片段。在一些實施例中，該編碼PCCA之核酸序列可在3'端進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。

在一些態樣中，本發明提供編碼PCCB之新穎的密碼子優化核酸序列。在一個實施例中，該編碼PCCB之密碼子優化核酸序列與SEQ ID NO: 7中所示之野生型編碼序列小於80%一致。在一些實施例中，編碼PCCB之密碼子優化核酸序列與SEQ ID NO: 8-12至少80% (例如80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或100%)一致。在一些實施例中，編碼PCCB之密碼子優化核酸序列與選自SEQ ID NO: 8-12之序列100%一致。在一些實施例中，本發明提供與SEQ ID NO: 7中所示之野生型編碼序列小於80%一致且與SEQ ID NO: 8-12至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%一致的核酸序列。在例示性實施例中，本發明提供編碼選自SEQ ID NO: 8-12之PCCB之核酸序列。進一步提供SEQ ID NO: 8-12中所示之核酸序列之片段，其編碼具有功能性PCCB活性之多肽。在一些實施例中，該編碼PCCB之核酸序列可在3'端進一步包含終止密碼子(TGA、TAA或TAG)。載體基因組元件：

在一些實施例中，rAAV含有封裝載體基因組，其進一步包含一或多個強化子序列。在一個實施例中，強化子選自細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及ApoE強化子。在一個例示性實施例中，該強化子為CMV強化子。在一個實施例中，該CMV強化子包含SEQ ID NO: 19或由其組成。

在一些實施例中，rAAV含有封裝載體基因組，其進一步包含一或多個內含子序列。在一個實施例中，內含子選自SV40小T內含子、兔血紅蛋白次單位β (rHBB)內含子、人類β血球蛋白IVS2內含子、Promega嵌合內含子或hFIX內含子。在一個例示性實施例中，該內含子為SV40小T內含子。在一個實施例中，該SV40小T內含子序列包含SEQ ID NO: 20或由其組成。在另一例示性實施例中，該內含子為rHBB內含子。在一個實施例中，該rHBB內含子序列包含SEQ ID NO: 21或由其組成。

在一些實施例中，rAAV含有進一步包含聚腺苷酸化信號序列之封裝載體基因組。在一個實施例中，聚腺苷酸化信號序列選自牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列、SV40聚腺苷酸化信號序列、兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列、PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列、PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在一例示性實施例中，該聚腺苷酸化信號序列為牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列。在一個實施例中，該BGH聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 22或由其組成。在另一例示性實施例中，該聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列。在一個實施例中，該SV40聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 23或由其組成。在一個實施例中，聚腺苷酸化信號序列為基因特異性內源性聚腺苷酸化序列。在一例示性實施例中，當載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在某些實施例中，PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 35之相等長度區至少95%一致。在某些實施例中，PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含約15個連續核苷酸(例如約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150或約160)之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 35之相等長度區至少95%一致。在另一例示性實施例中，當載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在某些實施例中，PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 37之相等長度區至少95%一致。在某些實施例中，PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含約15個連續核苷酸(例如約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90或約100)之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 37之相等長度區至少95%一致。AAV 衣殼：

在另一態樣中，本發明提供適用作用於治療PA之基因療法之試劑的rAAV，其中該rAAV包括AAV衣殼及封裝於其中之如本文所描述之載體基因組。在一些實施例中，該AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV(亦即AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh10或AAVhu37)。在一個例示性實施例中，該AAV載體為AAV血清型9 (AAV9)載體、AAV9變異體載體、AAV血清型8 (AAV8)載體或AAV血清型2 (AAV2)載體。

AAV9衣殼為由多種AAV9 vp蛋白構成之自組裝AAV衣殼。AAV9 vp蛋白質通常以由SEQ ID NO: 13之核酸序列或與其至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少99%之序列編碼的替代剪接變異體形式表現，該序列編碼SEQ ID NO: 14 (GenBank寄存編號：AAS99264)之vp1胺基酸序列。此等剪接變異體產生具有不同長度之SEQ ID NO: 14的蛋白質。在某些實施例中，AAV9衣殼包括具有與AAS99264 99%一致或與SEQ ID NO: 14 99%一致的胺基酸序列之AAV。亦參見美國專利第7,906,111號及WO/2005/033321。如本文所使用，AAV9變異體包括描述於例如WO/2016/049230、美國專利第8,927,514號、美國專利公開案第2015/0344911號及美國專利第8,734,809號中之彼等變異體。

如本文所指示，AAV9序列及蛋白質適用於製造rAAV。然而，在其他實施例中，選擇另一AAV衣殼。組織特異性係藉由衣殼類型測定。可選擇轉導適合目標(例如肝臟、肌肉、肺或CNS)之AAV血清型作為AAV病毒載體衣殼源，包括例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、AAVrh8。參見例如美國專利公開案第2007/0036760號；美國專利公開案第2009/0197338號；及EP1310571。亦參見WO 2003/042397 (AAV7及其他猴AAV)、美國專利第7282199號及第7790449號(AAV8)。另外，尚待發現之AAV或基於其之重組AAV可用作AAV衣殼源。此等文獻亦描述可經選擇用於產生AAV之其他AAV且以引用之方式併入此等文獻。在一些實施例中，適用於病毒載體之AAV衣殼可藉由前述AAV衣殼中之一者或其編碼核酸之突變誘發(亦即藉由插入、缺失或取代)來產生。在一些實施例中，AAV衣殼為嵌合的，包含來自前述AAV衣殼蛋白中之兩者或三者或四者或多於四者的域。在一些實施例中，AAV衣殼為來自兩種或三種不同AAV或重組AAV之Vpl、Vp2及Vp3單體之嵌合體。在一些實施例中，rAAV組合物包含超過一個上述衣殼。包含重組核酸分子之宿主細胞：

在一些態樣中，本文中提供宿主細胞，其包含重組核酸分子、病毒載體(例如，AAV載體)或本文中所揭示之rAAV。在特定實施例中，該宿主細胞可適用於AAV繁殖。

可使用大量宿主細胞，諸如細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等。在一些實施例中，宿主細胞可為適於產生重組AAV (rAAV)之細胞(或細胞株)，例如HeLa、Cos-7、HEK293、A549、BHK、Vero、RD、HT-1080、ARPE-19或MRC-5細胞。

可使用此項技術中已知之任何適合方法將重組核酸分子或載體遞送至宿主細胞培養物中。在一些實施例中，產生具有插入至宿主細胞株基因組中之重組核酸分子或載體的穩定宿主細胞株。在一些實施例中，產生穩定宿主細胞株，其含有本文中所描述之rAAV載體。在rAAV載體轉染至宿主培養物之後，可藉由各種方法分析rAAV至宿主基因組中之整合，諸如抗生素選擇、螢光活化細胞分選、南方墨點、基於PCR之偵測、螢光原位雜交，如Nakai等人, Nature Genetics (2003) 34, 297-302; Philpott 等人, Journal of Virology (2002) 76(11):5411-5421, 及 Howden 等人, J Gene Med 2008; 10:42-50所描述。此外，穩定細胞株可根據此項技術中熟知之方案建立，諸如Clark,Kidney International第61卷(2002): S9-S15, 及Yuan等人, Human Gene Therapy, 2011年5月；22(5):613-24中所描述之彼等方案。用於基因療法之重組 AAV ：

AAV屬於細小病毒科(family Parvoviridae)及依賴病毒屬(genusDependovirus )。AAV為封裝線性單股DNA基因組之小型無包膜病毒。AAV DNA之有義股及反義股二者以相等頻率封裝於AAV衣殼中。

AAV基因組特徵在於兩個側接兩個開放閱讀框架(open reading frame，ORB)之反向末端重複序列(ITR)。在AAV2基因組中，例如ITR之前125個核苷酸為迴折，其自身摺疊以使鹼基配對最大化及形成T形之髮夾結構。ITR之其他20個鹼基(稱為D序列)保持未配對。ITR為對AAV DNA複製而言重要的順式作用序列；ITR為複製起點且充當藉由DNA聚合酶進行之第二股合成的引子。在此合成期間形成之雙股DNA (稱為可複製形式單體)用於第二輪自啟動複製且形成可複製形式二聚體。此等雙股中間物經由股置換機制處理，產生用於封裝之單股DNA及用於轉錄之雙股DNA。Rep結合元件及末端解析位點(terminal resolution site，TRS)定位於ITR內。此等特徵在AAV複製期間由病毒調節蛋白Rep使用以處理雙股中間物。除其在AAV複製中之作用以外，ITR亦為AAV基因組封裝、轉錄、在非容許條件下之負調節及位點特異性整合所必需的(Days and Berns,Clin Microbiol Rev 21(4): 583-593, 2008)。

AAV之左ORF含有Rep基因，其編碼四種蛋白質——Rep78、Rep68、Rep52及Rep40。右ORF含有Cap基因，其產生三種病毒衣殼蛋白(VP1、VP2及VP3)。AAV衣殼含有排列成為二十面體對稱之60種病毒衣殼蛋白質。VP1、VP2及VP3以1:1:10莫耳比存在(Daya and Berns,Clin Microbiol Rev 21(4):583-593, 2008)。

AAV目前為用於基因療法之最常使用之病毒中之一者。儘管AAV感染人類及一些其他靈長類動物物種，但未知其是否會引起疾病且引發極輕度免疫反應。利用AAV之基因療法載體可感染分裂及靜止細胞兩者且保持染色體外狀態而不整合至宿主細胞之基因組中。由於AAV之有利特徵，本發明涵蓋AAV用於本文所揭示之重組核酸分子及方法之用途。

AAV具有用於基因治療載體之若干所需特徵，包括結合及進入目標細胞、進入細胞核之能力、在細胞核中表現延長之時間段之能力及低毒性。然而，AAV基因組之小尺寸限制可併入的異源DNA之尺寸。為最小化此問題，已構築不編碼Rep及整合效率元件(integration efficiency element，IEE)之AAV載體。ITR由於其為封裝所需之順式信號而經保留(Daya and Berns, Clin Microbiol Rev, 21(4):583-593, 2008)。

用於產生適用於基因療法之rAAV的方法為此項技術中熟知的(參見例如美國專利申請案第2012/0100606號、第2012/0135515號、第2011/0229971號及第2013/0072548號；及第Ghosh等人,Gene Ther 13(4): 321-329, 2006)，且可與本文所揭示之重組核酸分子及方法一起使用。

在一些態樣中，本發明提供本文所揭示之rAAV用於治療丙酸血症(PA)之用途，其中rAAV包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組。在一些實施例中，該rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR序列、啟動子序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列及3'-ITR序列。在一些實施例中，該rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、啟動子序列、人類PCCA 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、人類PCCA 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列及3'-ITR。在一例示性實施例中，封裝基因組亦包含啟動子序列上游之強化子序列、啟動子下游之內含子及3'-ITR上游之聚腺苷酸化序列。因此，在另一例示性實施例中，該rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、強化子序列、啟動子序列、內含子序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、聚腺苷酸化信號序列及3'-ITR。在另一例示性實施例中，該rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、強化子序列、啟動子序列、內含子序列、人類PCCA 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、聚腺苷酸化信號序列、人類PCCA 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列及3'-ITR。在另一例示性實施例中，該rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、CBA啟動子、SV40小T內含子、PCCA之編碼序列、BGH聚腺苷酸化信號序列及AAV2 3'-ITR。在另一例示性實施例中，該rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、天然PCCA啟動子、SV40小T內含子、PCCA 5'-UTR之核苷酸序列、PCCA之編碼序列、天然PCCA聚腺苷酸化信號序列、PCCA 3'-UTR之核苷酸序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含位於內含子序列下游之共同科紮克序列。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含位於天然PCCA 5'-UTR序列下游之共同科紮克序列。在一些實施例中，該PCCA之編碼序列選自SEQ ID NO: 1-6。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

展示用於表現PCCA之例示性封裝載體基因組構築體的例示性圖提供於圖 1 ，其以5'至3'次序展示：5'-ITR、CMV強化子、CBA啟動子、SV40小T內含子、共同科紮克序列、PCCA編碼序列、SV40聚腺苷酸化信號序列及3'-ITR。

在一些態樣中，本發明提供本文所揭示之rAAV用於治療丙酸血症(PA)之用途，其中rAAV包括封裝於其中之AAV衣殼及載體基因組，其中封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、啟動子序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列及3'-ITR。在一些實施例中，rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、啟動子序列、人類PCCB 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、人類PCCB 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列及3'-ITR。在一例示性實施例中，封裝基因組亦包含啟動子序列上游之強化子序列、啟動子下游之內含子及3'-ITR上游之聚腺苷酸化序列。因此，在另一例示性實施例中，rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、強化子序列、啟動子序列、內含子序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、聚腺苷酸化信號序列及3'-ITR。在另一例示性實施例中，rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：5'-ITR、強化子序列、啟動子序列、內含子序列、人類PCCB 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列、PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列、聚腺苷酸化信號序列、人類PCCB 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列及3'-ITR。在一個例示性實施例中，rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、CBA啟動子、SV40小T內含子、PCCB之編碼序列、BGH聚腺苷酸化信號序列及AAV2 3'-ITR。在另一例示性實施例中，rAAV含有封裝基因組，該封裝基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含：AAV2 5'-ITR序列、CMV強化子、天然PCCB啟動子、SV40小T內含子、PCCB 5'-UTR之核苷酸序列、PCCB之編碼序列、天然PCCB聚腺苷酸化信號序列、PCCB 3'-UTR之核苷酸序列及AAV2 3'-ITR。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含位於內含子序列下游之共同科紮克序列。在一些實施例中，該封裝基因組進一步包含位於天然PCCB 5'-UTR序列下游之共同科紮克序列。在一些實施例中，該PCCB之編碼序列選自SEQ ID NO: 7-12。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

展示用於表現PCCB之例示性封裝載體基因組構築體的例示性圖提供於圖 2 ，其以5'至3'次序展示：5'-ITR、CMV強化子、CBA啟動子、SV40小T內含子、共同科紮克序列、PCCA編碼序列、SV40聚腺苷酸化信號序列及3'-ITR。蛋白質定位：

丙醯輔酶A羧化酶為位於粒線體基質之多體蛋白(參見Browner 等人, (1989). Journal of Biological Chemistry. 264:12680-5)。因此，有必要的是，遞送PCCA及/或PCCB基因之基因療法載體能夠編碼在粒線體中具有功能性且定位在粒線體中之蛋白質。在一個態樣中，本文所揭示之一或多種病毒載體驅動及調節編碼定位在粒線體中之PCCA及/或PCCB蛋白質之基因的表現(例如，PCCA或PCCB之表現)。醫藥組合物：

本發明提供包含本文中所揭示之rAAV及醫藥學上可接受之載劑的組合物。用於投與rAAV之適合醫藥調配物可發現於例如美國專利申請公開案第2012/0219528號中。適用於本發明之醫藥學上可接受之載劑(媒劑)為習知的。Remington ' s Pharmaceutical Sciences , 由E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa.著, 第15版(1975)，描述適用於一或多種治療化合物、分子或試劑之醫藥遞送的組合物及調配物。

如前述段落中所突出顯示，本發明在一些態樣中係關於包含本發明之rAAV的醫藥組合物。在一些實施例中，該醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。在一些實施例中，該醫藥組合物經調配用於皮下、肌肉內、皮內、腹膜內或靜脈內投與。在一例示性實施例中，該醫藥組合物經調配用於靜脈內投與。

在一些實施例中，rAAV在適用於輸注於人類個體之緩衝液/載劑中調配。緩衝液/載劑應包括防止rAAV黏附至輸注管但不干擾活體內rAAV結合活性之組分。各種適合之溶液可包括以下中之一或多者：緩衝生理鹽水、界面活性劑及生理學上相容之鹽或鹽之混合物，其經調節至等效於約100 mM氯化鈉(NaCl)至約250 mM氯化鈉之離子強度，或經調節至等效離子濃度之生理學上相容之鹽。pH可在6.5至8.5、或7至8.5、或7.5至8範圍內。適合之界面活性劑或界面活性劑之組合可選自泊洛沙姆(Poloxamer) (亦即非離子三嵌段共聚物，其由側接聚氧乙烯(聚(環氧乙烷))之兩個親水鏈的聚氧丙烯10 (聚(環氧丙烷))之中心疏水鏈構成)、SOLUTOL HS 15 (聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯)、LABRASOL (聚氧辛酸甘油酯)、聚氧基10油醚、TWEEN (聚氧伸乙基脫水山梨糖醇脂肪酸酯)、乙醇及聚乙二醇。治療丙酸血症之方法：

在又一態樣中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包括向人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。

在一個實施例中，本發明提供治療PA之方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中載體基因組包含PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。

在另一實施例中，本發明提供治療PA之方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中載體基因組包含用於PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。

在又一實施例中，本發明提供一種治療PA之方法，其包含投與(1)包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列；及(2)包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在一些實施例中，可同時投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可依序投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可分別投與(1)及(2)之rAAV。

在某些實施例中，本發明提供一種治療PA之方法，其包含投與(1)包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該編碼序列係用於PCCA且不用於PCCB，啟動子為PCCA基因特異性內源性啟動子且並非PCCB基因特異性內源性啟動子，及聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列；及/或(2)包括AAV衣殼及載體基因組之rAAV，其中該編碼序列係用於PCCB且不用於PCCA，啟動子為PCCB基因特異性內源性啟動子且並非PCCB基因特異性內源性啟動子，及聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列；及/或。在一些實施例中，可同時投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可依序投與(1)及(2)之rAAV。在一些實施例中，可分別投與(1)及(2)之rAAV。

在某些實施例中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向診斷患有PCCA中之至少一個突變的人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供治療經診斷患有PCCA中之至少一個突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，本發明提供治療經診斷患有PCCA中之至少一個突變的人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝其中之載體基因組的rAAV，其中該編碼序列係用於PCCA而非用於PCCB，啟動子為PCCA基因特異性內源性啟動子而非PCCB基因特異性內源性啟動子，且聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列而非PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在某些實施例中，該PCCA中之突變選自表1。在一些實施例中，該PCCA之編碼序列選自SEQ ID NO: 1-6。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

在一些態樣中，本發明提供治療人類個體之PA的方法，其包含向經診斷患有PCCB中之至少一個突變之人類個體投與治療有效量的本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供一種治療經診斷患有PCCB中之至少一個突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中該載體基因組包含PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在某些實施例中，本發明提供治療經診斷患有PCCB中之至少一個突變的人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝其中之載體基因組的rAAV，其中編碼序列係用於PCCB而非用於PCCA，啟動子為PCCB基因特異性內源性啟動子而非PCCA基因特異性內源性啟動子，且聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列而非PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。在某些實施例中，該PCCB中之突變選自表2。在一些實施例中，該PCCB之編碼序列選自SEQ ID NO: 7-12。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

描述PCCA及PCCB中之引起PA之突變的綜述文章提供於Ugarte等人, 1999, Hum. Mutat. 14(4): 275-282中。

在由突變PCCA基因引起之PA中，已鑑別PCCA基因中之以下突變及多形現象：表 1-PCCA 基因突變及多形現象：

誤義突變：	148 GàC, 154 CàT, 337 GàA, 416 TàC, 611 TàC, 815 AàG, 1028 AàG, 1043 TàA, 1061 GàT 1121 GàA, 1193 CàT,   1601 GàT, 1816 GàC, 1927 GàT
無意義突變：	862 CàT, 1610 CàG
小缺失 ：	700 del5, 1115del4, 2058del3
剪接突變：	1645IVS+1GàA, 1671IVS+5GàC, 1771IV2-2del9, 1824IVS+3del4, 1824IVS+3insCT
多形現象：	552AàG, 1348AàG

在由突變PCCB基因引起之PA中，已鑑別PCCB基因中之以下突變及多形現象：表 2-PCCB 基因突變及多形現象：

誤義突變：	49 CàA, 131 GàC, 318 CàA, 391 GàC, 493 CàT, 502 GàA, 593 GàA, 605 TàA, 683 CàT 1228 CàT, 1283 CàT, 1325 TàC, 1490 CàT, 1534 CàT, 1556 TàC, 1606 AàG,
無意義突變：	1495 CàT, 1593 GàA
插入及缺失：	418ins12, 790insG, 1170insT, 1218del14ins12, 1222del3, 1298insA
剪接突變：	IVS1+3GàC, IVS4+3del4, IVS10-11del6, IVS12+3del8, IVS13+1GàT

在一些實施例中，本發明提供治療經診斷患有選自表1之PCCA中至少一個突變之人類個體之PA的方法，其包含向該人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供治療經診斷患有選自表1之PCCA中之至少一個突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中載體基因組包含PCCA或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在一些實施例中，該PCCA之編碼序列選自SEQ ID NO: 1-6。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

在一些實施例中，本發明提供治療經診斷患有選自表2之PCCB中之至少一個突變的人類個體之PA的方法，其包含向該人類個體投與治療有效量之本文所揭示之至少一種rAAV。在一個實施例中，本發明提供一種治療經診斷患有選自表2之PCCB中之至少一個突變之人類個體之PA的方法，其包含投與包括AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組的rAAV，其中載體基因組包含PCCB或其同功異型物或其功能片段或功能變異體之部分或完整編碼序列。在一些實施例中，該PCCB之編碼序列選自SEQ ID NO: 7-12。在一些實施例中，該衣殼為AAV9衣殼。

可使用任何適合之方法或途徑來投與本文所描述之rAAV或含rAAV組合物。投與途徑包括例如全身性、經口、吸入、經鼻內、經氣管內、經動脈內、經眼內、經靜脈內、經肌肉內、經皮下、經皮內及其他非經腸投與途徑。在一些實施例中，rAAV、包含rAAV之組合物或包含多個rAAV之組合物(例如，表現PCCA之一種rAAV及表現PCCB之第二rAAV)經靜脈內投與。

投與之特定劑量可為用於各患者之均一劑量，例如每患者1.0×10¹¹ 至1.0×10¹⁴ 個基因組複本(GC)之病毒。或者，可以根據患者之大致體重或表面積定製患者的劑量。決定適當劑量之其他因素可以包括待治療或預防之疾病或病狀、疾病之嚴重程度、投藥途徑以及患者之年齡、性別及醫學病狀。熟習此項技術者依常規進行，尤其根據劑量資訊及本文所揭示之分析，進一步改進為確定適當治療劑量所必需的計算。亦可經由使用確定劑量的已知分析，結合使用適當的劑量-反應資料來確定劑量。可在監測疾病進展時調整個別患者的劑量。

在一些實施例中，以例如每公斤患者體重約1.0×10¹¹ 個基因組複本(GC/kg)至約1×10¹⁴ GC/kg、每公斤患者體重約5×10¹¹ 個基因組複本(GC/kg)至約5×10¹³ GC/kg或約1×10¹² 至約1×10¹³ GC/kg之劑量投予rAAV，如藉由qPCR或數位微滴PCR(digital droplet PCR，ddPCR)所量測。在一些具體例中，以約1×10¹² 至約1×10¹³ 個基因組複本(GC)/公斤之劑量投與rAAV。在一些實施例中，以約1.1×10¹¹ 、約1.3×10¹¹ 、約1.6×10¹¹ 、約1.9×10¹¹ 、約2×10¹¹ 、約2.5×10¹¹ 、約3.0×10¹¹ 、約3.5×10¹¹ 、約4.0×10¹¹ 、約4.5×10¹¹ 、約5.0×10¹¹ 、約5.5×10¹¹ 、約6.0×10¹¹ 、約6.5×10¹¹ 、約7.0×10¹¹ 、約7.5×10¹¹ 、約8.0×10¹¹ 、約8.5×10¹¹ 、約9.0×10¹¹ 、約9.5×10¹¹ 、約1.0×10¹² 、約1.5×10¹² 、約2.0×10¹² 、約2.5×10¹² 、約3.0×10¹² 、約3.5×10¹² 、約4.0×10¹² 、約4.5×10¹² 、約5.0×10¹² 、約5.5×10¹² 、約6.0×10¹² 、約6.5×10¹² 、約7.0×10¹² 、約7.5×10¹² 、約8.0×10¹² 、約8.5×10¹² 、約9.0×10¹² 、約9.5×10¹² 、約1.0×10¹³ 、約1.5×10¹³ 、約2.0×10¹³ 、約2.5×10¹³ 、約3.0×10¹³ 、約3.5×10¹³ 、約4.0×10¹³ 、約4.5×10¹³ 、約5.0×10¹³ 、約5.5×10¹³ 、約6.0×10¹³ 、約6.5×10¹³ 、約7.0×10¹³ 、約7.5×10¹³ 、約8.0×10¹³ 、約8.5×10¹³ 、約9.0×10¹³ 、約9.5×10¹³ 個基因組複本(GC)/公斤之劑量投與rAAV。rAAV可視所需治療結果而以單次劑量或以多次劑量(諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10次或10次以上劑量)投與。

劑量可以每週、每月或每年給與一次或多次或甚至每2年至20年一次。舉例而言，各劑量可最少相隔1週、相隔2週、相隔3週、相隔1個月、相隔3個月、相隔6個月或相隔1年給與。一般熟習此項技術者可容易地基於體液或組織中之可靶向構築體或複合物之滯留時間及濃度量測值估算給藥之重複率。

在通篇說明書中，在組合物描述為具有、包括或包含特定組分的情況下，或在製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟的情況下，另外預期存在基本上由所列組分組成或由所列組分組成的本發明組合物，且存在基本上由所列處理步驟組成或由所列處理步驟組成的根據本發明之製程及方法。

本發明中，其中稱一種元素或組分包括於所列元素或組分之清單中及/或選自所列元素或組分之清單中，應理解，該元素或組分可為所列元素或組分中之任一者，或該元素或組分可選自由所列元素或組分中之兩者或兩者以上組成之群。

此外，應理解，本文所描述之組合物或方法中的元素及/或特徵可以多種方式組合而不背離本發明之精神及範疇，無論在本文中為明確或隱含的。舉例而言，除非上下文另外理解，否則當提及特定化合物時，該化合物可用於本發明組合物之各種實施例及/或本發明之方法中。換言之，在本發明內，實施例已以使得本發明能夠得到簡明書寫及繪製的方式描述且描繪，但希望且應瞭解，可在不脫離本發明教示及本發明之情況下以各種方式組合或分離實施例。舉例而言，應瞭解，本文中所描述及描繪之所有特徵可適用於本文中所描述及描繪之本發明之所有態樣。

應理解，除非自上下文及用途另外理解，否則表述「……中之至少一者」個別地包括該表述之後的所述對象中之每一者及所述對象中之兩者或兩者以上之各種組合。除非自上下文另外理解，否則表述「及/或」結合三個或更多個所述對象時應理解為具有相同含義。

除非另外特定陳述或自上下文中理解，否則使用術語「包括(include)」、「包括(includes)」、「包括(including)」、「具有(have)」、「具有(has)」、「具有(having)」、「含有(contain)」、「含有(contains)」或「含有(containing)」，包括其文法等效物，通常應理解為開放端的及非限制性的，例如不排除其他未列元素或步驟。

在數量值之前使用術語「約」時，除非另外具體說明，否則本發明亦包括特定數量值本身。除非另外說明或推斷，否則如本文所用，術語「約」係指相對於標稱值之±10%偏差。

應理解步驟次序或用於執行某些行動之次序為非實質的，只要本發明仍可實施。此外，可同時進行兩個或超過兩個步驟或行動。

除非主張，否則本文中任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」或「包括」)的使用僅意欲更好地說明本發明且不對本發明之範疇造成限制。說明書中之語言不應理解為表示任何未主張之元素為實施本發明必不可少的。實例

雖然現大體上描述本發明，但參考以下實例更容易理解，該等實例僅出於說明本發明之某些態樣及實施例之目的而包括，且不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實例 1 ： PCCA 之 RNA 及蛋白質表現 RNA 表現

此實例係關於如藉由RT-qPCR所測定，在轉染連續肝細胞細胞株(HepG2)之後PCCA之RNA表現。簡言之，根據製造商的說明，使用脂染胺2000 (Invitrogen)用對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)或攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)轉染HepG2細胞。轉染後72小時收集HepG2細胞且溶解。根據製造商的說明，使用TRIzol試劑(Invitrogen)自溶解之HepG2細胞提取RNA。經由OD260/280及OD260/230比率，使用NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)量測RNA之品質及數量。根據製造商的說明，使用高容量cDNA反轉錄套組(ThermoFisher Scientific)將總RNA反轉錄成cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(應用生物系統)，根據製造商的說明使用應用生物系統7500即時PCR系統進行即時RT-qPCR。PCCA表現之倍數變化藉由δ-δ Ct(2^{- ΔΔ Ct} )方法計算，該方法利用RNA聚合酶II多肽A (POLR2A)作為各樣品之內部對照且正規化相對於「未Tx」對照之所計算之倍數變化 (參見Livak KJ, Schmittgen TD(2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-delta delta C(T)) method. Methods 25(4): 402–408)。圖 3 為展示如藉由RT-qPCR在對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)或攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)轉染連續肝細胞細胞株(HepG2)後所測定之PCCA RNA表現之倍數變化的柱狀圖。

繪製之資料展示經DTC346轉染後完全天然人類PCCA之RNA表現與經DTC347及DTC348轉染後兩個密碼子優化人類PCCA版本之表現相當。經DTC349轉染之細胞展現較高RNA表現。蛋白質表現

此實例亦係關於在轉染連續肝細胞細胞株HepG2及Huh7之後PCCA的蛋白質表現。簡言之，根據製造商的說明，使用脂染胺2000(Invitrogen)將HepG2及Huh7細胞株經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)、攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列及編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC365)或攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)轉染。轉染後72小時收集細胞且用補充有蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)及磷酸酶抑制劑混合液2+3 (Sigma P5726及P0044)之NP-40溶解緩衝液(50 mM Tris·HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1.0% NP-40)溶解。蛋白質在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)凝膠上解析且轉移至IMMUN-BLOT^® 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。使用1:1000稀釋之抗PCCA (Abcam, Cambridge, UK)抗體隨後使用共軛至遠紅外光螢光團之二級抗體(Licor IRDye二級抗體)進行西方墨點分析。

圖 4A 為圖像，其自色帶1至色帶7分別展示在經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)、攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列及編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC365)或攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)轉染之連續肝細胞細胞株(HepG2)中，藉由西方墨點所偵測之蛋白質表現量。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

如圖 4A 中所示，當與「未TX」對照(色帶1)相比時，在「未TX」對照(色帶1)中存在預期基礎之PCCA蛋白質表現量及在經DTC346 (色帶2)轉染之細胞中及經DTC347 (色帶3)或DTC348(色帶4)轉染之細胞中存在PCCA蛋白質之過度表現。即使觀測到此版本表現大量RNA，經DTC349轉染之細胞(色帶5)未展現PCCA蛋白質之過度表現。用DTC343(色帶7)轉染之細胞展現如所預期之eGFP表現。

圖 4B 為圖像，其自色帶1至色帶7分別展示在經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)、攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列及編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC365)轉染之連續肝細胞細胞株(Huh7)中，藉由西方墨點所偵測之蛋白質表現量。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

如圖 4B 中所示，當與「未TX」對照(色帶1)相比時，在「未TX」對照(色帶1)中存在預期基礎之PCCA蛋白質表現量及在經DTC346 (色帶3)轉染之細胞中及經DTC347 (色帶4)或DTC348(色帶5)轉染之細胞中存在PCCA蛋白質之過度表現。即使觀測到此版本表現大量RNA，經DTC349轉染之細胞(色帶6)未展現PCCA蛋白質之過度表現。用DTC343(色帶2)轉染之細胞展現如所預期之eGFP表現。實例 2 ： 過度表現之人類 PCCA 蛋白質定位至粒線體

此實例展示在連續肝細胞細胞株(HepG2)中過度表現之人類PCCA定位至粒線體。簡言之，用攜有編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)轉染連續肝細胞細胞株(HepG2)。在轉染之後，對細胞進行次細胞部分分離，其中分離出細胞質及粒線體部分。亦處理全細胞溶解物。蛋白質在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠上解析且轉移至IMMUN-BLOT^® 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。使用1:1000稀釋之抗PCCA (Abcam, Cambridge, UK)抗體隨後使用共軛至遠紅外光螢光團之二級抗體(Licor IRDye二級抗體)進行西方墨點分析。圖 5 為圖像，其展示在全細胞溶解物(whole cell lysate，WCL)；自經或不經攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)轉染之連續肝細胞細胞株(HepG2)分離之次細胞部分(細胞質部分(cyto)；及粒線體部分(粒線體))中，藉由西方墨點所偵測之PCCA蛋白質表現量。1×及2×表示裝載粒線體部分之相對體積。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

如圖 5 中所示且與圖 4A-B 中所示之結果一致，與未經轉染之全細胞溶解物中之對照細胞(圖5中色帶7相對於與色帶8)相比時，經攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)轉染之細胞展示PCCA過度表現。詢問粒線體內膜蛋白(mitofilin)(已知為位於粒線體之蛋白質)之含量以確定分離之細胞部分之相對純度。如圖 5 中所示，對於未轉染之與經DTC346轉染之細胞的細胞質部分未展現可偵測之粒線體內膜蛋白含量(圖 5 中色帶1相對於色帶2)，然而如所預期，易於在粒線體部分及整個細胞溶解物中偵測到粒線體內膜蛋白 (圖 5 中色帶3-8)。過度表現之PCCA主要定位至粒線體(圖 5中色帶2相對於色帶4及6)。實例 3 ： 比較 PCCA AAV9 效價產率

此實例係關於對來自攜帶編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)或攜帶編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)的PCCA AAV9效價產率之比較。連續腎細胞株(HEK293)用攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)、攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)或攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343) (各者經AAV9衣殼表現之質體(pAAV2/9)及提供腺病毒輔助功能(pAdHelper)之質體共轉染的細胞中表現)三倍轉染；圖 6 中未經轉染之細胞用作對照且表示為「未TX」。收集細胞上清液且用DNA酶I或等效物處理以消除非衣殼化DNA且利用對包括於此等構築體之設計中之聚腺苷酸化信號具有特異性之引子/探針組使耐DNA酶顆粒(DNase-resistant particle，DRP)效價定量。圖 6 為柱狀圖，其自左至右展示在攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)、或攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)三倍轉染連續腎細胞株(HEK293) (各者經AAV9衣殼表現之質體(pAAV2/9)及提供腺病毒輔助功能(pAdHelper)之質體共轉染的細胞中表現)後，藉由qPCR所測定之PCCA AAV9效價(單位為基因組複本(GC)/毫升)倍數變化；未經轉染之細胞用作對照且表示為「未TX」。圖 6 顯示藉由qPCR所測定之PCCA AAV9效價(基因組複本(GC)/毫升)相對於未轉染細胞之倍數變化。圖 6 中展示之資料證明天然完整人類PCCA表現構築體(DTC346)與所有密碼子優化版本(DTC347、DTC348及DTC349)之間的相當rAAV效價。實例 4 ： 測試 PCCA DNA 整合

在HEK293細胞中經由三倍轉染產生AAV9 rAAV病毒粒子之後，收集細胞上清液且與AAVX樹脂(Thermo Fisher)或等效物一起培育。純化AAV9 rAAV病毒粒子且接著使用Amicon離心過濾器(Millipore Sigma)濃縮。經純化之病毒在鹼性溶解緩衝液中培育，裝載至DNA瓊脂糖凝膠中且在鹼性操作緩衝液存在下運作隔夜。圖 7 為圖像，其自左至右分別為含有PCCA及表現PCCB之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC365)、表現PCCA之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC349、DTC348、DTC347或DTC346)或表現eGFP之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC343)之親和純化AAV9粒子之DNA鹼性瓊脂糖凝膠。

如圖 7 中所示，凝膠圖像展示天然及密碼子優化PCCA載體盒之預期尺寸的明顯單一帶，表明載體基因組(DTC346、DTC347、DTC348及DTC349)之適當封裝。eGFP對照物(DTC343)表明兩個帶之封裝，與封裝小載體基因組之已知侷限性一致。實例 5 ： PCCB 之 RNA 及蛋白質表現 RNA 表現

此實例係關於藉由RT-qPCR所測定，在轉染連續肝細胞細胞株(HepG2)之後PCCB之RNA表現。簡言之，根據製造商的說明，使用脂染胺2000(Invitrogen)將HepG2細胞株經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜載編碼人類PCCB之密碼子優化序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC370、DTC368、DTC369或DTC371)轉染。轉染後72小時收集HepG2細胞且溶解。根據製造商的說明，使用TRIzol試劑(Invitrogen)自溶解之HepG2細胞提取RNA。經由OD260/280及OD260/230比率，使用NanoDrop ND-1000(Thermo Scientific)量測RNA之品質及數量。根據製造商的說明，使用高容量cDNA反轉錄套組(ThermoFisher Scientific)將總RNA反轉錄成cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix(應用生物系統)，根據製造商的說明使用應用生物系統7500即時PCR系統進行即時RT-qPCR。PCCB表現之倍數變化藉由δ-δ Ct(2^{- ΔΔ Ct} )方法計算，該方法利用RNA聚合酶II多肽A (POLR2A)作為各樣品之內部對照且正規化相對於「未Tx」對照之所計算之倍數變化 (參見Livak KJ, Schmittgen TD(2001)。圖 8 為柱狀圖，其展示在對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜載編碼人類PCCB之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC370、DTC368、DTC369或DTC371)轉染連續肝細胞細胞株(HepG2)後，藉由RT-qPCR所測定之PCCB RNA表現之倍數變化。

繪製之資料展示經DTC366轉染後完全天然人類PCCB之RNA表現與經DTC367、DTC368、DTC370或DTC371轉染後四個密碼子優化人類PCCB版本之表現相當。經DTC369轉染之細胞展現較低RNA表現。蛋白質表現

此實例亦係關於在轉染連續肝細胞細胞株、HepG2及Huh7之後PCCB的蛋白質表現。簡言之，根據製造商的說明，使用脂染胺2000(Invitrogen)將HepG2及Huh7細胞株經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜載編碼人類PCCB之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)轉染。轉染後72小時收集細胞且用補充有蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)及磷酸酶抑制劑混合液2+3 (Sigma P5726及P0044)之NP-40溶解緩衝液(50 mM Tris·HCl pH 8.0、150 mM NaCl、1.0% NP-40)溶解。蛋白質在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)凝膠上解析且轉移至IMMUN-BLOT^® 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。使用1:1000稀釋之抗PCCB (Abcam, Cambridge, UK)抗體隨後使用共軛至遠紅外光螢光團之二級抗體(Licor IRDye二級抗體)進行西方墨點分析。

圖 9A 為圖像，其自色帶1至色帶8分別展示在經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜載編碼人類PCCB之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)轉染之連續肝細胞細胞株(HepG2)中，藉由西方墨點所偵測之蛋白質表現量。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

如圖 9A 中所示，當與「未TX」對照(色帶1)相比時，在「未TX」對照(色帶1)中存在預期基礎之PCCB蛋白質表現量及在經DTC366 (色帶3)轉染之細胞中及經DTC367 (色帶4)或DTC370 (色帶7)轉染之細胞中存在PCCB蛋白質之過度表現。用DTC368 (色帶5)、DTC369 (色帶6)或DTC371(色帶8)轉染之細胞未展現PCCB蛋白之過度表現。用DTC343(色帶2)轉染之細胞展現如所預期之eGFP表現。

圖 9B 為 圖像，其自色帶1至色帶8分別展示在經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜載編碼人類PCCB之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC369、DTC368、DTC370或DTC371)轉染之連續肝細胞細胞株(Huh7)中，藉由西方墨點所偵測之蛋白質表現量。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

如圖 9B 中所示，當與「未TX」對照(色帶1)相比時，在「未TX」對照(色帶1)中存在預期基礎之PCCB蛋白質表現量及在經DTC366 (色帶3)轉染之細胞中及經DTC367 (色帶4)或DTC370 (色帶7)轉染之細胞中存在PCCB蛋白質之過度表現。經DTC368 (色帶6)、DTC369 (色帶5)或DTC371(色帶8)轉染之細胞未展現PCCB蛋白之過度表現。經DTC343(色帶2)轉染之細胞展現如所預期之eGFP表現。實例 6 ： 過度表現之人類 PCCB 蛋白質定位至粒線體

此實例展示在連續肝細胞細胞株(HepG2)中過度表現之人類PCCB定位至粒線體。簡言之，用攜載編碼人類PCCB (DTC366)之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體轉染連續肝細胞細胞株(HepG2)。在轉染之後，對細胞進行次細胞部分分離，其中分離出細胞質及粒線體部分。亦處理全細胞溶解物。蛋白質在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺電泳(SDS-PAGE)凝膠上解析且轉移至IMMUN-BLOT^® 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。使用1:1000稀釋之抗PCCB (Abcam, Cambridge, UK)抗體隨後使用共軛至遠紅外光螢光團之二級抗體(Licor IRDye二級抗體)進行西方墨點分析。

圖 10 為圖像，其展示在全細胞溶解物(WCL)；自經或不經攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)轉染之連續肝細胞細胞株(HepG2)分離之次細胞部分(細胞質部分(cyto)；及粒線體部分(粒線體))中，藉由西方墨點所偵測之PCCB蛋白質表現量。1×及2×表示裝載粒線體部分之相對體積。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

如圖 10 中所示且與前述結果一致，與未經轉染之全細胞溶解物中之對照細胞(色帶7相對於色帶8)相比時，經攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)轉染之細胞展示PCCB過度表現。詢問粒線體內膜蛋白(已知為位於粒線體之蛋白質)之含量以確定分離之細胞部分之相對純度。如圖 10 中所示，對於未轉染之及經DTC366轉染之細胞的細胞質部分未展現可偵測之粒線體內膜蛋白含量(色帶1相對於色帶2)，然而如所預期，易於在粒線體部分及整個細胞溶解物中偵測到粒線體內膜蛋白 (色帶3-8)。過度表現之PCCB主要定位於粒線體(色帶2相對於色帶4及6)。實例 7 ： 比較 PCCB AAV9 效價產率

此實例係關於對來自攜帶編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜帶編碼人類PCCB之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)的PCCB AAV9效價產率之比較。連續腎細胞株(HEK293)用攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)、或攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371) (各者經AAV9衣殼表現之質體(pAAV2/9)及提供腺病毒輔助功能(pAdHelper)之質體共轉染的細胞中表現)三倍轉染。圖 11 中之未經轉染之細胞用作對照且表示為「未TX」。收集細胞上清液且用DNA酶I或等效物處理以消除非衣殼化DNA且利用對包括於此等構築體之設計中之聚腺苷酸化信號具有特異性之引子/探針組使耐DNA酶顆粒(DRP)效價定量。圖 11 為柱狀圖，其自左至右展示在攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)、或攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)三倍轉染連續腎細胞株(HEK293)(各者經AAV9衣殼表現之質體(pAAV2/9)及提供腺病毒輔助功能(pAdHelper)之質體共轉染的細胞中表現)後，藉由qPCR所測定之PCCB AAV9效價(單位為基因組複本(GC)/毫升)倍數變化；未經轉染之細胞用作對照且表示為「未TX」。圖 11 顯示藉由qPCR所測定之PCCA AAV9效價(基因組複本(GC)/毫升)相對於未轉染細胞之倍數變化。圖11 中展示之資料證明天然完整人類PCCB表現構築體(DTC366)與所有密碼子優化版本(DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)之間的相當rAAV效價。實例 8 ：測試 PCCB DNA 整合

在HEK293細胞中經由三倍轉染產生AAV9 rAAV病毒粒子之後，收集細胞上清液且與AAVX樹脂(Thermo Fisher)或等效物一起培育。純化AAV9 rAAV病毒粒子且接著使用Amicon離心過濾器(Millipore Sigma)濃縮。經純化之病毒在鹼性溶解緩衝液中培育，裝載至DNA瓊脂糖凝膠中且在鹼性操作緩衝液存在下運作隔夜。圖 12 為圖像，自左至右分別為含有對照質體(具有空載體、未TX之質體)、表現eGFP之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC343)或表現PCCB之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC366、DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)之親和純化AAV9粒子之DNA鹼性瓊脂糖凝膠。

如圖 12 中所示，凝膠圖像展示天然及密碼子優化PCCB載體盒之預期尺寸的明顯單一帶，表明載體基因組(DTC366、DTC367、DTC368、DTC369、DTC370及DTC371)之適當封裝。eGFP對照物(DTC343)表明兩個帶之封裝，與封裝小載體基因組之已知侷限性一致。實例 9 ： 向野生型小鼠投與 PCCA 病毒載體

此實例係關於在用表現完整天然人類PCCA之rAAV(DTC346)或密碼子優化人類PCCA之rAAV (DTC347、DTC348及DTC349)處理後在野生型FVB小鼠中之人類PCCA蛋白質表現。簡言之，向小鼠(n=2或3)靜脈內注射1.66×10¹¹ 個病毒基因組(VG)或5×10¹¹ 個VG之表現由SEQ ID NO: 38表示之完整天然人類PCCA之rAAV (DTC346)或表現密碼子優化人類PCCA之rAAV (DTC347、DTC348及DTC349)。藉由LC-MS偵測人類PCCA蛋白質及內源性小鼠PCCA蛋白質。圖 13 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)或編碼人類PCCA之密碼子優化序列之rAAV (DTC347、DTC348或DTC349)處理後，在野生型FVB小鼠中，相對於小鼠內源性PCCA表現，人類PCCA蛋白質表現之百分比。誤差杠表示標準差。圖 13 中呈現之資料展示自投與1.66×10¹¹ 個VG天然PCCA表現之人類PCCA (DTC346)至內源性小鼠PCCA水準為2.5%，且自投與5×10¹¹ VG之天然PCCA病毒載體(DTC346)表現之人類PCCA至內源性小鼠PCCA水準為11.6%。實例 10 ： 次形態 PCCA 小鼠模型中之人類 PCCA 活性

此實例係關於在次形態PCCA小鼠模型中測試人類PCCA活性。小鼠中PCCA基因缺失模擬人類疾病之最嚴重形式。具有PCCA基因缺失之小鼠在出生36小時內死亡，使得難以在其中測試靜脈內全身性療法(參見 Guenzel 等人, Mol Ther. 2013年7月: 21(7): 1316-1323)。歸因於在小鼠PCCA基因剔除背景上引入病原性A138T突變編碼人類PCCA之轉殖基因，次形態PCCA小鼠具有降低之PCCA活性。此突變型PCCA基因導致與心肌症相關之丙醯基肉鹼、檸檬酸甲酯、甘胺酸、丙胺酸、離胺酸、氨及標記物之含量升高，與患有丙酸血症(PA)之患者體內之此等化合物含量類似。簡言之，向小鼠(n=5)靜脈內注射1.66×10¹¹ 個病毒基因組(VG)或5×10¹¹ 個VG之編碼由SEQ ID NO: 38表示之人類PCCA之完整天然序列的rAAV (DTC346)。經PBS處理之小鼠用作對照小鼠。PCCA 表現量及酶活性分析

注射之後六週，使小鼠肝臟均質化且藉由LC-MS量測人類野生型PCCA蛋白質。圖 14 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)或編碼人類PCCA之密碼子優化序列之rAAV (DTC347、DTC348或DTC349)處理後，人類野生型PCCA蛋白質在次形態PCCA小鼠模型(A138T突變)中之濃度(單位為nmol/g蛋白)。所列之百分比數字表示按野生型FVB小鼠之內源性PCCA蛋白質水準之百分比計算的人類野生型PCCA表現。誤差杠表示標準差。所列之百分比數字表示按野生型FVB小鼠之內源性PCCA蛋白質水準之百分比計算的人類野生型PCCA表現。與先前結果一致，當與自編碼完整天然人類PCCA之rAAV表現之天然人類PCCA蛋白質相比時，由編碼密碼子優化人類PCCA之rAAV表現之人類PCCA蛋白質展示較低表現量。與碳酸氫鈉[C14]合併使用閃爍計數器量測肝組織勻漿之PCCA酶活性。圖 15 為柱狀圖，其為在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中之人類PCCA活性，如藉由每分鐘平均計數(counts per minute，CPM)資料所量測。誤差杠表示標準差。所列百分比數字描述相對於野生型FVB小鼠中所觀測到之CPM資料的CPM資料。**表示相較於使用杜奈特多重比較測試之PBS處理組p＜0.01。

如圖 15 中所示，相比於經PBS處理之小鼠，用較高劑量(5×10¹¹ VG)之編碼完整天然人類PCCA之rAAV注射的小鼠展示PCCA活性之統計學上顯著之改良(11%)。投與天然 PCCA 病毒載體至次形態 PCCA 小鼠對丙酸血症 (PA) 之已知生物標記物之濃度的影響

此實例亦係關於測試投與編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)至次形態PCCA小鼠對PA之已知生物標記物之血漿濃度的影響。簡言之，向小鼠(n=5)靜脈內注射1.66×10¹¹ 個VG或5×10¹¹ 個VG之編碼由SEQ ID NO: 38表示之人類PCCA之完整天然序列的rAAV (DTC346)。藉由液相層析-質譜分析(LC-MS)測定PA(丙醯基肉鹼(C3)、乙醯肉鹼(C2)及2-檸檬酸甲酯(2MC))之已知生物標記物之血漿濃度。圖 16A-C 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理之前及之後2、3、4及6週(分別為2W、3W、4W、及6W)，次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中已知之丙酸血症生物標記物之血漿濃度。誤差杠表示標準差。**表示相較於PBS處理組p＜0.01及***表示相較於使用杜奈特多重比較測試之PBS處理組p＜0.001。圖 16A 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中C3(丙醯基肉鹼)之血漿濃度。圖 16B 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中血漿C3/C2(丙醯基/乙醯基肉鹼)濃度比率。圖 16C 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中2-檸檬酸甲酯(2MC)之血漿濃度。

用任一劑量(1.66×10¹¹ 個VG或5×10¹¹ 個VG)之編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理的小鼠相比於經PBS處理之小鼠展示血漿C3、C3/C2及2MC含量之統計學上顯著之降低。編號實施例

本文中所揭示之實施例包括如在本發明之編號實施例中提供之實施例P1至P136。

實施例P1：一種重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組以5'至3'次序包含： (a)       5' ITR序列； (b)      啟動子序列； (c)       PCCA之部分或完整編碼序列；及 (d)      3' ITR序列。

實施例P2：如實施例P1之rAAV，其中AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV。

實施例P3：如實施例P2之rAAV，其中AAV衣殼來自AAV9。

實施例P4：如實施例P2之rAAV，其中AAV衣殼來自AAV8。

實施例P5：如實施例P1之rAAV，其中AAV衣殼為AAV9變異體衣殼。

實施例P6：如實施例P1至P5中任一者之rAAV，其中啟動子選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子及CAG啟動子。

實施例P7：如實施例P6之rAAV，其中啟動子為CBA啟動子。

實施例P8：如實施例P1至P7中任一者之rAAV，其中PCCA之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。

實施例P9：如實施例P8之rAAV，其中PCCA之編碼序列包含SEQ ID NO: 1。

實施例P10：如實施例P1至P7中任一者之rAAV，其中PCCA之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。

實施例P11：如實施例P10之rAAV，其中PCCA之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 2-6之編碼序列。

實施例P12：如實施例P1至P11中任一者之rAAV，其中5' ITR序列來自AAV2。

實施例P13：如實施例P1至P11中任一者之rAAV，其中3' ITR序列來自AAV2。

實施例P14：如實施例P1至P11中任一者之rAAV，其中5' ITR序列及3' ITR序列來自AAV2。

實施例P15：如實施例P12至P14中之任一者之rAAV，其中5' ITR序列及3' ITR序列包含SEQ ID NO: 15或由其組成。

實施例P16：如實施例P1至P11中之任一者之rAAV，其中5' ITR序列及/或3' ITR序列來自非AAV2源。

實施例P17：如實施例P1至P16中任一者之rAAV，其中封裝基因組進一步包含一或多個強化子序列。

實施例P18：如實施例P17之rAAV，其中強化子選自細胞巨大病毒即刻早期基因(CMV)強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及ApoE強化子。

實施例P19：如實施例P18之rAAV，其中強化子為CMV強化子。

實施例P20：如實施例P19之rAAV，其中強化子包含SEQ ID NO: 19或由其組成。

實施例P21：如實施例P18至P20之rAAV，其中強化子位於啟動子序列上游。

實施例P22：如實施例P1至P21中任一者之rAAV，其中封裝基因組進一步包含一或多個內含子序列。

實施例P23：如實施例P22之rAAV，其中內含子選自SV40小T內含子、兔血紅蛋白次單位β (rHBB)內含子、人類β血球蛋白IVS2內含子、Promega嵌合內含子或hFIX內含子。

實施例P24：如實施例P23之rAAV，其中內含子為SV40小T內含子。

實施例P25：如實施例P24之rAAV，其中內含子包含SEQ ID NO: 20或由其組成。

實施例P26：如實施例P23之rAAV，其中內含子為rHBB內含子。

實施例P27：如實施例P26之rAAV，其中內含子包含SEQ ID NO: 21或由其組成。

實施例P28：如實施例P1至P27中任一者之rAAV，其中封裝基因組進一步包含聚腺苷酸化信號序列。

實施例P29：如實施例P28之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列選自牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列、SV40聚腺苷酸化信號序列及兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列。

實施例P30：如實施例P29之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列為牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列。

實施例P31：如實施例P30之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 22或由其組成。

實施例P32：如實施例P29之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列。

實施例P33：如實施例P32之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 23或由其組成。

實施例P34：一種重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組以5'至3'次序包含： (a)       5' ITR序列； (b)      啟動子序列； (c)       PCCB之部分或完整編碼序列；及 (d)      3' ITR序列。

實施例P35：如實施例P34之rAAV，其中AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV。

實施例P36：如實施例P35之rAAV，其中AAV衣殼來自AAV9。

實施例P37：如實施例P35之rAAV，其中AAV衣殼來自AAV8。

實施例P38：如實施例P34之rAAV，其中AAV衣殼為AAV9變異體衣殼。

實施例P39：如實施例P34至P38中任一者之rAAV，其中啟動子選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子及CAG啟動子。

實施例P40：如實施例P39之rAAV，其中啟動子為CBA啟動子。

實施例P41：如實施例P34至P40中任一者之rAAV，其中PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。

實施例P42：如實施例P41之rAAV，其中PCCB之編碼序列包含SEQ ID NO: 7。

實施例P43：如實施例P34至P40中任一者之rAAV，其中PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子優化序列。

實施例P44：如實施例P43之rAAV，其中PCCB之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 8-12之編碼序列。

實施例P45：如實施例P34至P44中任一者之rAAV，其中5' ITR序列來自AAV2。

實施例P46：如實施例P34至P44中任一者之rAAV，其中3' ITR序列來自AAV2。

實施例P47：如實施例P34至P44中任一者之rAAV，其中5' ITR序列及3' ITR序列來自AAV2。

實施例P48：如實施例P45至P47中之任一者之rAAV，其中5' ITR序列及3' ITR序列包含SEQ ID NO: 15或由其組成。

實施例P49：如實施例P34至P44中之任一者之rAAV，其中5' ITR序列及/或3' ITR序列來自非AAV2源。

實施例P50：如實施例P34至P49中任一者之rAAV，其中封裝基因組進一步包含一或多個強化子序列。

實施例P51：如實施例P50之rAAV，其中強化子選自細胞巨大病毒即刻早期基因(CMV)強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及ApoE強化子。

實施例P52：如實施例P51之rAAV，其中強化子為CMV強化子。

實施例P53：如實施例P52之rAAV，其中強化子包含SEQ ID NO: 19或由其組成。

實施例P54：如實施例P51至P53之rAAV，其中強化子位於啟動子序列上游。

實施例P55：如實施例P34至P54中任一者之rAAV，其中封裝基因組進一步包含一或多個內含子序列。

實施例P56：如實施例P55之rAAV，其中內含子選自SV40小T內含子、兔血紅蛋白次單位β(rHBB)內含子、人類β血球蛋白IVS2內含子、Promega嵌合內含子或hFIX內含子。

實施例P57：如實施例P56之rAAV，其中內含子為SV40小T內含子。

實施例P58：如實施例P57之rAAV，其中內含子包含SEQ ID NO: 20或由其組成。

實施例P59：如實施例P56之rAAV，其中內含子為rHBB內含子。

實施例P60：如實施例P59之rAAV，其中內含子包含SEQ ID NO: 21或由其組成。

實施例P61：如實施例P34至P60中任一者之rAAV，其中封裝基因組進一步包含聚腺苷酸化信號序列。

實施例P62：如實施例P61之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列選自牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列、SV40聚腺苷酸化信號序列及兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列。

實施例P63：如實施例P62之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列為牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列。

實施例P64：如實施例P63之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 22或由其組成。

實施例P65：如實施例P62之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列。

實施例P66：如實施例P65之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 23或由其組成。

實施例P67：一種重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)       5' ITR序列； (b)      強化子序列； (c)       啟動子序列； (d)      內含子序列； (e)       PCCA之部分或完整編碼序列； (f)       聚腺苷酸化信號序列；及 (g)      3' ITR序列。

實施例P68：一種重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)       5' ITR序列； (b)      強化子序列； (c)       啟動子序列； (d)      內含子序列； (e)       PCCB之部分或完整編碼序列； (f)       聚腺苷酸化信號序列；及 (g)      3' ITR序列。

實施例P69：如實施例P67或實施例P68之rAAV，其中AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV。

實施例P70：如實施例P69之rAAV，其中AAV衣殼來自AAV9。

實施例P71：如實施例P69之rAAV，其中AAV衣殼來自AAV8。

實施例P72：如實施例P67或實施例P68之rAAV，其中AAV衣殼為AAV9變異體衣殼。

實施例P73：如實施例P67至P72中任一者之rAAV，其中啟動子選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子及CAG啟動子。

實施例P74：如實施例P73之rAAV，其中啟動子為CBA啟動子。

實施例P75：如實施例P67之rAAV，其中該PCCA之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。

實施例P76：如實施例P75之rAAV，其中PCCA之編碼序列包含SEQ ID NO: 1。

實施例P77：如實施例P67之rAAV，其中PCCA之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。

實施例P78：如實施例P77之rAAV，其中PCCA之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 2-6之編碼序列。

實施例P79：如實施例P68之rAAV，其中PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。

實施例P80：如實施例P79之rAAV，其中PCCB之編碼序列包含SEQ ID NO: 7。

實施例P81：如實施例P68之rAAV，其中PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子優化序列。

實施例P82：如實施例P81之rAAV，其中PCCB之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 8-12之編碼序列。

實施例P83：如實施例P67至P82中任一者之rAAV，其中強化子選自細胞巨大病毒即刻早期基因(CMV)強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及ApoE強化子。

實施例P84：如實施例P83之rAAV，其中強化子為CMV強化子。

實施例P85：如實施例P67至P84中任一者之rAAV，其中內含子選自SV40小T內含子、兔血紅蛋白次單位β (rHBB)內含子、人類β血球蛋白IVS2內含子、Promega嵌合內含子或hFIX內含子。

實施例P86：如實施例P85之rAAV，其中內含子為SV40小T內含子。

實施例P87：如實施例P85之rAAV，其中內含子為rHBB內含子。

實施例P88：如實施例P67至P87之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列選自牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列、SV40聚腺苷酸化信號序列及兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列。

實施例P89：如實施例P88之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列為牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列。

實施例P90：如實施例P88之rAAV，其中聚腺苷酸化信號序列為SV40聚腺苷酸化信號序列。

實施例P91：一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)       5' ITR序列； (b)      強化子序列； (c)       啟動子序列； (d)      內含子序列； (e)       用於選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列； (f)       聚腺苷酸化信號序列；及 (g)      3' ITR序列。

實施例P92：一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)       5' ITR序列； (b)      強化子序列； (c)       啟動子序列； (d)      內含子序列； (e)       用於選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列； (f)       聚腺苷酸化信號序列；及 (g)      3' ITR序列。

實施例P93：如實施例P91或P92之rAAV，其中AAV衣殼來自AAV9。

實施例P94：一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)       5' ITR序列； (b)      強化子序列； (c)       啟動子序列； (d)      內含子序列； (e)       用於選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列； (f)       聚腺苷酸化信號序列；及 (g)      3' ITR序列。

實施例P95：一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)       5' ITR序列； (b)      強化子序列； (c)       啟動子序列； (d)      內含子序列； (e)       用於選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列； (f)       聚腺苷酸化信號序列；及 (g)      3' ITR序列。

實施例P96：一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)       AAV2 5' ITR序列； (b)      CMV強化子序列； (c)       CBA啟動子序列； (d)      rHBB或SV40小T內含子序列； (e)       用於選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列； (f)       BGH或SV40聚腺苷酸化信號序列；及 (g)      AAV2 3' ITR序列。

實施例P97：一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)       AAV2 5' ITR序列； (b)      CMV強化子序列； (c)       CBA啟動子序列； (d)      rHBB或SV40小T內含子序列； (e)       用於選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列； (f)       BGH或SV40聚腺苷酸化信號序列；及 (g)      AAV2 3' ITR序列。

實施例P98：如實施例P67至P97中任一者之rAAV，其中載體基因組包含位於載體基因組元件(d)與載體基因組元件(e)之間的共同科紮克序列。

實施例P99：如實施例P98之rAAV，其中共同科紮克序列包含SEQ ID NO: 24。

實施例P100：一種組合物，其包含前述實施例中之任一者之rAAV及醫藥學上可接受之載劑。

實施例P101：一種治療人類個體之丙酸血症(PA)的方法，其包含向人類個體投與治療有效量之如實施例P1至P99中任一者之rAAV或如實施例P100之組合物。

實施例P102：一種治療人類個體之丙酸血症(PA)的方法，其包含向人類個體投與： (1)      治療有效量之組合物，其包含實施例P1至P33中之任一者之rAAV；及 (2)      治療有效量之組合物，其包含實施例P34至P66中之任一者之rAAV。

實施例P103：如實施例P102之方法，其中同時投與(1)及(2)之組合物。

實施例P104：如實施例P102之方法，其中依序投與(1)及(2)之組合物。

實施例P105：如實施例P102之方法，其中分別投與(1)及(2)之組合物。

實施例P106：一種治療經診斷患有PCCA中之至少一個突變之人類個體之丙酸血症(PA)的方法，該方法包含向人類個體投與治療有效量之包含實施例P1至P33中之任一者之rAAV的組合物。

實施例P107：如實施例P106之方法，其中PCCA中之該突變選自表1。

實施例P108：一種治療經診斷患有PCCB中之至少一個突變之人類個體之丙酸血症(PA)的方法，該方法包含向人類個體投與治療有效量之包含實施例P34至P66中任一者之rAAV的組合物。

實施例P109：如實施例P108之方法，其中PCCB中之該突變選自表2。

實施例P110：如實施例P101至P109中任一者之方法，其中重組病毒rAAV或組合物係經皮下、肌肉內、皮內、腹膜內或靜脈內投與。

實施例P111：如實施例P110之方法，其中rAAV或組合物經靜脈內投與。

實施例P112：如實施例P101至P111中任一者之方法，其中rAAV以約1×10¹¹ 至約1×10¹⁴ 個基因組複本(GC)/kg之劑量投與。

實施例P113：如實施例P112之方法，其中rAAV以約1×10¹² 至約1×10¹³ 個基因組複本(GC)/kg之劑量投與。

實施例P114：如實施例P110至P113中之任一者之方法，其中投與rAAV包含投與單次劑量之rAAV。

實施例P115：如實施例P110至P113中之任一者之方法，其中投與rAAV包含投與多次劑量之rAAV。

實施例P116：一種編碼SEQ ID NO: 16之PCCA多肽的重組核酸，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 1之野生型編碼序列小於80%一致。

實施例P117：如實施例P116之重組核酸，其中核酸序列包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少80%一致的序列。

實施例P118：如實施例P117之重組核酸，其中核酸序列包含選自SEQ ID NO: 2-6之序列。

實施例P119：如實施例P116至P118中任一者之重組核酸，其中核酸序列進一步在3'末端包含一或多個選自TGA、TAA及TAG之終止密碼子。

實施例P120：一種編碼SEQ ID NO: 17之PCCB多肽之重組核酸，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 7之野生型編碼序列小於80%一致。

實施例P121：如實施例P120之重組核酸，其中核酸序列包含與選自SEQ ID NO: 8-12之序列至少80%一致的序列。

實施例P122：如實施例P121之重組核酸，其中核酸序列包含選自SEQ ID NO: 8-12之序列。

實施例P123：如實施例P120至P122中任一者之重組核酸，其中核酸序列進一步在3'末端包含一或多個選自TGA、TAA及TAG之終止密碼子。

實施例P124：一種重組核酸，其包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少80%一致的序列。

實施例P125：如實施例P124之重組核酸，其中該重組核酸包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少90%一致的序列。

實施例P126：如實施例P125之重組核酸，其中該重組核酸包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少95%一致的序列。

實施例P127：一種重組核酸，其包含選自SEQ ID NO: 2-6之序列。

實施例P128：如實施例P124至P127中任一者之重組核酸，其中核酸序列進一步包含一或多個選自3'末端之TGA、TAA及TAG之終止密碼子。

實施例P129：一種重組核酸，其包含與選自SEQ ID NO: 7-12之序列至少80%一致的序列。

實施例P130：如實施例P129之重組核酸，其中該重組核酸包含與選自SEQ ID NO: 7-12之序列至少90%一致的序列。

實施例P131：如實施例P130之重組核酸，其中該重組核酸包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少95%一致的序列。

實施例P132：一種重組核酸，其包含選自SEQ ID NO: 7-12之序列。

實施例P133：如實施例P129至P132中任一者之重組核酸，其中核酸序列進一步在3'末端包含一或多個選自TGA、TAA及TAG之終止密碼子。

實施例P134：一種rAAV，其包含如請求項P116至P133中任一者之重組核酸。

實施例P135：一種宿主細胞，其包含如實施例P116至P133中之任一者之重組核酸或實施例P134之rAAV。

實施例P136：如實施例P135之宿主細胞，其中該宿主細胞選自HeLa、Cos-7、HEK293、A549、BHK、Vero、RD、HT-1080、ARPE-19或MRC-5細胞。參考文獻併入

本文所提及之專利文獻及科學論文中之每一者的全部揭示內容以引用之方式併入以達成所有目的。等效物

在不偏離本發明精神或基本特徵之情況下，本發明可以其他特定形式體現。因此，前述實施例應在所有方面視為說明性的而非限制本文所描述之揭示內容。不同實施例及多種揭示方法步驟之多種結構要素可呈多種組合及排列利用，且全部此類變體均視為本發明之形式。因此，本發明之範疇由隨附申請專利範圍而非前述描述指示，且本文意欲涵蓋申請專利範圍等效物之意義及範圍內之所有變化。

1:5'-ITR 2:CMV強化子 3:雞β-肌動蛋白啟動子 4:SV40小T內含子 5:共同科紮克序列 6:PCCA編碼序列/PCCB編碼序列 7:SV40聚腺苷酸化信號 8:3'-ITR

參考以下附圖可更完全地理解本發明。

圖 1 為展示根據一個實施例之包含PCCA之例示性封裝載體基因組構築體的例示性圖。5'-ITR、CMV強化子、雞β-肌動蛋白啟動子、SV40小T內含子、共同科紮克序列、PCCA編碼序列、SV40聚腺苷酸化信號及3'-ITR在圖式中分別由1、2、3、4、5、6、7及8表示。

圖 2 為展示根據一個實施例之包含PCCB之例示性封裝載體基因組構築體的例示性圖。5'-ITR、CMV強化子、雞β-肌動蛋白啟動子、SV40小T內含子、共同科紮克序列、PCCB編碼序列、SV40聚腺苷酸化信號及3'-ITR在圖式中分別由1、2、3、4、5、6、7及8表示。

圖 3 為柱狀圖，其展示在用對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)或攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)轉染連續肝細胞細胞株(HepG2)之後，藉由RT-qPCR所測定之PCCA RNA表現之倍數變化。

圖 4A 為圖像，其自色帶1至色帶7分別展示在經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)、攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列及編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC365)或攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)轉染之連續肝細胞細胞株(HepG2)中，藉由西方墨點所偵測之蛋白質表現量。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

圖 4B 為圖像，其自色帶1至色帶7分別展示在經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)、攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列及編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC365)轉染之連續肝細胞細胞株(Huh7)中，藉由西方墨點所偵測之蛋白質表現量。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

圖 5 為圖像，其展示在全細胞溶解物(whole cell lysate，WCL)；自經或不經攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)轉染之連續肝細胞細胞株(HepG2)分離之次細胞部分(細胞質部分(cyto)；及粒線體部分(粒線體))中，藉由西方墨點所偵測之PCCA蛋白質表現量。1×及2×表示裝載粒線體部分之相對體積。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

圖 6 為柱狀圖，其自左至右展示在攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列之rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCA之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC346)、或攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC347、DTC348或DTC349)三倍轉染連續腎細胞株(HEK293)(各者經AAV9衣殼表現之質體(pAAV2/9)及提供腺病毒輔助功能(pAdHelper)之質體共轉染的細胞中表現)後，藉由qPCR所測定之PCCA AAV9效價(單位為基因組複本(GC)/毫升)之倍數變化；未經轉染之細胞用作對照且表示為「未TX」。

圖 7 為圖像，自左至右分別含有PCCA及表現PCCB之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC365)、表現PCCA之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC349、DTC348、DTC347或DTC346)或表現eGFP之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC343)之親和純化AAV9粒子之DNA鹼性瓊脂糖凝膠。

圖 8 為柱狀圖，其展示在對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜載編碼人類PCCB之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC370、DTC368、DTC369或DTC371)轉染連續肝細胞細胞株(HepG2)後藉由RT-qPCR所測定之PCCB RNA表現之倍數變化。

圖 9A 為圖像，其自色帶1至色帶8分別展示在經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜載編碼人類PCCB之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)轉染之連續肝細胞細胞株(HepG2)中，藉由西方墨點所偵測之蛋白質表現量。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

圖 9B 為圖像，其自色帶1至色帶8分別展示在經對照質體(具有空載體、未TX之質體)、攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)或攜載編碼人類PCCB之密碼子優化序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC369、DTC368、DTC370或DTC371)轉染之連續肝細胞細胞株(Huh7)中，藉由西方墨點所偵測之蛋白質表現量。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

圖 10 為圖像，其展示在全細胞溶解物(WCL)；自經或不經攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)轉染之連續肝細胞細胞株(HepG2)分離之次細胞部分(細胞質部分(cyto)；及粒線體部分(粒線體))中，藉由西方墨點所偵測之PCCB蛋白質表現量。1×及2×表示裝載粒線體部分之相對體積。使用β-肌動蛋白(「肌動蛋白」)作為內參考物。

圖 11 為柱狀圖，其自左至右展示在攜載編碼增強型綠色螢光蛋白eGFP之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC343)、攜載編碼人類PCCB之完整天然序列之核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC366)、或攜載編碼人類PCCA之密碼子優化序列之人類核苷酸序列的rAAV載體質體(DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)三倍轉染連續腎細胞株(HEK293)(各者經AAV9衣殼表現之質體(pAAV2/9)及提供腺病毒輔助功能(pAdHelper)之質體共轉染的細胞中表現)後，藉由qPCR所測定之PCCB AAV9效價(單位為基因組複本(GC)/毫升)倍數變化；未經轉染之細胞用作對照且表示為「未TX」。

圖 12 為圖像，自左至右分別為含有對照質體(具有空載體、未TX之質體)、表現eGFP之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC343)或表現PCCB之重組AAV (rAAV)載體盒(DTC366、DTC367、DTC368、DTC369、DTC370或DTC371)之親和純化AAV9粒子之DNA鹼性瓊脂糖凝膠。

圖 13 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)或編碼人類PCCA之密碼子優化序列之rAAV (DTC347、DTC348或DTC349)處理後，在野生型FVB小鼠中，相對於小鼠內源性PCCA表現，人類PCCA蛋白質表現之百分比。。誤差杠表示標準差。

圖 14 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)或人類PCCA之密碼子優化序列之rAAV (DTC347、DTC348或DTC349)處理後，在次形態PCCA小鼠模型(A138T突變)中之人類野生型PCCA蛋白質之含量(單位為nmol/g蛋白)。所列之百分比數字表示按野生型FVB小鼠之內源性PCCA蛋白質水準之百分比計算的人類野生型PCCA表現。誤差杠表示標準差。

圖 15 為柱狀圖，其為在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，在次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中之人類PCCA活性，如藉由每分鐘平均計數(counts per minute，CPM)資料所量測。誤差杠表示標準差。所列百分比數字描述相對於野生型FVB小鼠中所觀測到的CPM資料。**表示相較於使用杜奈特(Dunnett)多重比較測試之PBS處理組p＜0.01。

圖 16A-C 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，在次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中已知之丙酸血症生物標記物之濃度。圖 16A 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中C3(丙醯基肉鹼)之血漿濃度。圖 16B 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中血漿C3/C2(丙醯基/乙醯基肉鹼)濃度比率。圖 16C 為柱狀圖，其展示在用編碼人類PCCA之完整天然序列之rAAV (DTC346)處理後，次形態PCCA小鼠模型(A138T突變體)中2-檸檬酸甲酯(2MC)之血漿濃度。Pre指示rAAV注射之前0至14天，2W指示rAAV注射之後2週，3W指示rAAV注射之後3週，4W指示rAAV注射之後4週，及6W指示rAAV注射之後6週。誤差杠表示標準差。**表示相較於PBS處理組p＜0.01及***表示相較於使用杜奈特多重比較測試之PBS處理組p＜0.001。

1:5'-ITR

2:CMV強化子

3:雞β-肌動蛋白啟動子

4:SV40小T內含子

5:共同科紮克序列

6:PCCA編碼序列/PCCB編碼序列

7:SV40聚腺苷酸化信號

8:3'-ITR

Claims (140)

1. 一種重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組以5'至3'次序包含： (a)    5'-反向末端重複(5'-ITR)序列； (b)    啟動子序列； (c)    PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列；及 (d)    3'-反向末端重複(3'-ITR)序列。
2. 如請求項1之rAAV，其中該AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV。
3. 如請求項2之rAAV，其中該AAV衣殼來自AAV9。
4. 如請求項2之rAAV，其中該AAV衣殼來自AAV8。
5. 如請求項1之rAAV，其中該AAV衣殼為AAV9變異體衣殼。
6. 如請求項1至5中任一項之rAAV，其中該啟動子選自雞β-肌動蛋白(chicken β-actin，CBA)啟動子、細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)即刻早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(transthyretin，TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(thyroxine binding globulin，TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(alpha-1 anti-trypsin，A1AT)啟動子、CAG啟動子、PCCA基因特異性內源性啟動子及PCCB基因特異性內源性啟動子。
7. 如請求項6之rAAV，其中該啟動子為包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列的PCCA基因特異性內源性啟動子，當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 34之相等長度區至少95%一致。
8. 如請求項6之rAAV，其中該啟動子為包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列的PCCB基因特異性內源性啟動子，當該載體基因組中之該部分或完整編碼序列用於PCCB時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 36之相等長度區至少95%一致。
9. 如請求項6之rAAV，其中該啟動子為CBA啟動子。
10. 如請求項1至9中任一項之rAAV，其中該5'-ITR及/或該3'-ITR序列來自AAV2。
11. 如請求項10之rAAV，其中該5'-ITR序列及該3'-ITR序列包含SEQ ID NO: 15或由其組成。
12. 如請求項1至9中任一項之rAAV，其中該5'-ITR序列及/或該3'-ITR序列來自非AAV2源。
13. 如請求項1至7及9至12中任一項之rAAV，其中PCCA之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。
14. 如請求項13之rAAV，其中PCCA之編碼序列包含SEQ ID NO: 1。
15. 如請求項1至7及9至12中任一項之rAAV，其中PCCA之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。
16. 如請求項15之rAAV，其中PCCA之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 2-6之編碼序列。
17. 如請求項1至6及8至12中任一項之rAAV，其中PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。
18. 如請求項17之rAAV，其中PCCB之編碼序列包含SEQ ID NO: 7。
19. 如請求項1至6及8至12中任一項之rAAV，其中PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。
20. 如請求項19之rAAV，其中PCCB之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 8-12之編碼序列。
21. 如請求項1至7及9至16中任一項之rAAV，其中該封裝基因組進一步包含人類PCCA 5'-非轉譯區(UTR)及/或3'-UTR之截短或完整核苷酸序列。
22. 如請求項21之rAAV，其中人類PCCA 5'-UTR之完整核苷酸序列包含SEQ ID NO: 30。
23. 如請求項21之rAAV，其中人類PCCA 5'-UTR之截短核苷酸序列包含至少100個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 30之相等長度區至少95%一致。
24. 如請求項21之rAAV，其中人類PCCA 3'-UTR之完整核苷酸序列包含SEQ ID NO: 31。
25. 如請求項21之rAAV，其中人類PCCA 3'-UTR之截短核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 31之相等長度區至少95%一致。
26. 如請求項1至6、8至12及17至20中任一項之rAAV，其中該封裝基因組進一步包含人類PCCB 5'-非轉譯區(UTR)及/或3'-UTR之截短或完整核苷酸序列。
27. 如請求項26之rAAV，其中人類PCCB 5'-UTR之完整核苷酸序列包含SEQ ID NO: 32。
28. 如請求項26之rAAV，其中人類PCCB 5'-UTR之截短核苷酸序列包含至少100個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 32之相等長度區至少95%一致。
29. 如請求項26之rAAV，其中人類PCCB 3'-UTR之完整核苷酸序列包含SEQ ID NO: 33。
30. 如請求項26之rAAV，其中人類PCCB 3'-UTR之截短核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 33之相等長度區至少95%一致。
31. 如請求項1至30中任一項之rAAV，其中該封裝基因組進一步包含聚腺苷酸化信號序列。
32. 如請求項31之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列選自牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列、SV40聚腺苷酸化信號序列、兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列、PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列、PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
33. 如請求項32之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列為牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列或SV40聚腺苷酸化信號序列。
34. 如請求項33之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 22或由其組成。
35. 如請求項33之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 23或由其組成。
36. 如請求項1至7、9至16、21至25及31至32中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之該部分或完整編碼序列用於PCCA時，該聚腺苷酸化信號序列包含該PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
37. 如請求項36之rAAV，其中該PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 35之相等長度區至少95%一致。
38. 如請求項1至6、8至12、17至20及26至32中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該聚腺苷酸化信號序列包含該PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
39. 如請求項38之rAAV，其中該PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 37之相等長度區至少95%一致。
40. 如請求項1至39中任一項之rAAV，其中該封裝基因組進一步包含一或多個強化子序列。
41. 如請求項40之rAAV，其中該強化子選自細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(transthyretin enhancer，enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及脂蛋白元E (ApoE)強化子。
42. 如請求項41之rAAV，其中該強化子為CMV強化子。
43. 如請求項42之rAAV，其中該強化子包含SEQ ID NO: 19或由其組成。
44. 如請求項40至43之rAAV，其中該強化子位於該啟動子序列上游。
45. 如請求項1至44中任一項之rAAV，其中該封裝基因組進一步包含一或多個內含子序列。
46. 如請求項45之rAAV，其中該內含子選自SV40小T內含子、兔血紅蛋白次單位β (rHBB)內含子、人類β血球蛋白IVS2內含子、Promega嵌合內含子及hFIX內含子。
47. 如請求項46之rAAV，其中該內含子為SV40小T內含子或rHBB內含子。
48. 如請求項47之rAAV，其中該內含子包含SEQ ID NO: 20或由其組成。
49. 如請求項47之rAAV，其中該內含子包含SEQ ID NO: 21或由其組成。
50. 一種重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)    5'-ITR序列； (b)    強化子序列； (c)    啟動子序列； (d)    內含子序列； (e)    PCCA或PCCB之部分或完整編碼序列； (f)    聚腺苷酸化信號序列；及 (g)    3'-ITR序列。
51. 如請求項50之rAAV，其中該AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV。
52. 如請求項51之rAAV，其中該AAV衣殼來自AAV8或AAV9。
53. 如請求項50之rAAV，其中該AAV衣殼為AAV9變異體衣殼。
54. 如請求項50至53中任一項之rAAV，其中該啟動子選自雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、細胞巨大病毒(CMV)即刻早期基因啟動子、甲狀腺素運載蛋白(TTR)啟動子、甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子、α-1抗胰蛋白酶(A1AT)啟動子、CAG啟動子、PCCA基因特異性內源性啟動子及PCCB基因特異性內源性啟動子。
55. 如請求項54之rAAV，其中該啟動子為包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列的PCCA基因特異性內源性啟動子，當該載體基因組中之該部分或完整編碼序列用於PCCA時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 34之相等長度區至少95%一致。
56. 如請求項54之rAAV，其中該啟動子為包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列的PCCB基因特異性內源性啟動子，當該載體基因組中之該部分或完整編碼序列用於PCCB時，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 36之相等長度區至少95%一致。
57. 如請求項54之rAAV，其中該啟動子為CBA啟動子。
58. 如請求項50至57中任一項之rAAV，其中該5'-ITR及/或該3'-ITR序列來自AAV2。
59. 如請求項58之rAAV，其中該5'-ITR序列及該3'-ITR序列包含SEQ ID NO: 15或由其組成。
60. 如請求項50至57中任一項之rAAV，其中該5'-ITR序列及/或該3'-ITR序列來自非AAV2源。
61. 如請求項50至55及57至60中任一項之rAAV，其中PCCA之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。
62. 如請求項61之rAAV，其中PCCA之編碼序列包含SEQ ID NO: 1。
63. 如請求項50至55及57至60中任一項之rAAV，其中PCCA之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。
64. 如請求項63之rAAV，其中PCCA之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 2-6之編碼序列。
65. 如請求項50至54及56至60中任一項之rAAV，其中PCCB之部分或完整編碼序列為野生型編碼序列。
66. 如請求項65之rAAV，其中PCCB之編碼序列包含SEQ ID NO: 7。
67. 如請求項50至54及56至60中任一項之rAAV，其中PCCB之部分或完整編碼序列為密碼子優化編碼序列。
68. 如請求項67之rAAV，其中PCCB之編碼序列包含選自SEQ ID NO: 8-12之編碼序列。
69. 如請求項50至68中任一項之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列選自牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列、SV40聚腺苷酸化信號序列、兔β血球蛋白聚腺苷酸化信號序列、PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列、PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
70. 如請求項69之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列為牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號序列或SV40聚腺苷酸化信號序列。
71. 如請求項70之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 22或由其組成。
72. 如請求項70之rAAV，其中該聚腺苷酸化信號序列包含SEQ ID NO: 23或由其組成。
73. 如請求項50至55、57至64及69中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCA時，該聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
74. 如請求項73之rAAV，其中該PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 35之相等長度區至少95%一致。
75. 如請求項50至54、56至60及65至69中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之該部分或完整編碼序列用於PCCB時，該聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
76. 如請求項75之rAAV，其中該PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 37之相等長度區至少95%一致。
77. 如請求項50至76中任一項之rAAV，其中該強化子選自細胞巨大病毒即刻早期基因(CMV)強化子、甲狀腺素運載蛋白強化子(enTTR)、雞β-肌動蛋白(CBA)強化子、En34強化子及ApoE強化子。
78. 如請求項77之rAAV，其中該強化子為CMV強化子。
79. 如請求項50至78中任一項之rAAV，其中該內含子選自SV40小T內含子、兔血紅蛋白次單位β (rHBB)內含子、人類β血球蛋白IVS2內含子、Promega嵌合內含子或hFIX內含子。
80. 如請求項79之rAAV，其中該內含子為SV40小T內含子或rHBB內含子。
81. 如請求項50至55、57至64、69至74及77至80中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之該部分或完整編碼序列用於PCCA時，該封裝基因組進一步包含位於載體基因組元件(d)與(e)之間的人類PCCA 5'-非轉譯區(UTR)之截短或完整核苷酸序列。
82. 如請求項81之rAAV，其中人類PCCA 5'-UTR之完整核苷酸序列包含SEQ ID NO: 30。
83. 如請求項81之rAAV，其中該人類PCCA 5'-UTR之截短核苷酸序列包含至少100個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 30之相等長度區至少95%一致。
84. 如請求項50至54、56至60、65至72及75至80中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該封裝基因組進一步包含位於載體基因組元件(d)與(e)之間的人類PCCB 5'-非轉譯區(UTR)之截短或完整核苷酸序列。
85. 如請求項84之rAAV，其中人類PCCB 5'-UTR之完整核苷酸序列包含SEQ ID NO: 32。
86. 如請求項84之rAAV，其中人類PCCB 5'-UTR之截短核苷酸序列包含至少100個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 32之相等長度區至少95%一致。
87. 如請求項50至55、57至64、69至74及77至83中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之該部分或完整編碼序列用於PCCA時，該封裝基因組進一步包含位於載體基因組元件(f)與(g)之間的人類PCCA 3'-非轉譯區(UTR)之截短或完整核苷酸序列。
88. 如請求項87之rAAV，其中人類PCCA 3'-UTR之該完整核苷酸序列包含SEQ ID NO: 31。
89. 如請求項87之rAAV，其中人類PCCA 3'-UTR之截短核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 31之相等長度區至少95%一致。
90. 如請求項50至54、56至60、65至72、75至80及84至86中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之部分或完整編碼序列用於PCCB時，該封裝基因組進一步包含位於載體基因組元件(f)與(g)之間的人類PCCB 3'-非轉譯區(UTR)之截短或完整核苷酸序列。
91. 如請求項90之rAAV，其中人類PCCB 3'-UTR之完整核苷酸序列包含SEQ ID NO: 33。
92. 如請求項90之rAAV，其中人類PCCB 3'-UTR之截短核苷酸序列包含至少15個連續核苷酸之核苷酸序列，該核苷酸序列與SEQ ID NO: 33之相等長度區至少95%一致。
93. 如請求項50至92中任一項之rAAV，其中該載體基因組包含基因組元件(e)上游之共同科紮克序列(consensus Kozak sequence)。
94. 如請求項93之rAAV，其中該共同科紮克序列包含SEQ ID NO: 24。
95. 一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)    5'-反向末端重複(ITR)序列； (b)    強化子序列； (c)    啟動子序列； (d)    內含子序列； (e)    選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列或選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列； (f)    聚腺苷酸化信號序列；及 (g)    3'-反向末端重複(ITR)序列。
96. 如請求項95之rAAV，其中該AAV衣殼來自血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、rh10或hu37之AAV。
97. 如請求項96之rAAV，其中該AAV衣殼來自AAV9。
98. 如請求項96之rAAV，其中該AAV衣殼來自AAV8。
99. 如請求項95之rAAV，其中該AAV衣殼為AAV 9變異體衣殼。
100. 一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)    5'-反向末端重複(ITR)序列； (b)    強化子序列； (c)    啟動子序列； (d)    內含子序列； (e)    選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列或選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列； (f)    聚腺苷酸化信號序列；及 (g)    3'-反向末端重複(ITR)序列。
101. 一種適用於治療丙酸血症(PA)之重組腺相關病毒(rAAV)，該rAAV包含AAV9衣殼及封裝於其中之載體基因組，該載體基因組作為可操作地連接之組分以5'至3'次序包含： (a)    AAV2 5'-反向末端重複(ITR)序列； (b)    CMV強化子序列； (c)    CBA啟動子序列； (d)    rHBB或SV40小T內含子序列； (e)    選自SEQ ID NO: 1-6之PCCA之編碼序列或選自SEQ ID NO: 7-12之PCCB之編碼序列； (f)    BGH或SV40聚腺苷酸化信號序列；及 (g)    AAV2 3'-反向末端重複(ITR)序列。
102. 如請求項95至101中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之該編碼序列用於PCCA時，該封裝基因組進一步包含位於載體基因組元件(d)與(e)之間的人類PCCA 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列。
103. 如請求項95至101中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之該編碼序列用於PCCB時，該封裝基因組進一步包含位於載體基因組元件(d)與(e)之間的人類PCCB 5'-UTR之截短或完整核苷酸序列。
104. 如請求項95至102中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之該編碼序列用於PCCA時，該封裝基因組進一步包含位於載體基因組元件(f)與(g)之間的人類PCCA 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列。
105. 如請求項95至101及103中任一項之rAAV，其中當該載體基因組中之該編碼序列用於PCCB時，該封裝基因組進一步包含位於載體基因組元件(f)與(g)之間的人類PCCB 3'-UTR之截短或完整核苷酸序列。
106. 如請求項95至105中任一項之rAAV，其中該載體基因組包含基因組元件(e)上游之共同科紮克序列。
107. 如請求項106之rAAV，其中該共同科紮克序列包含SEQ ID NO: 24。
108. 一種組合物，其包含如前述請求項中任一項之rAAV及醫藥學上可接受之載劑。
109. 一種治療人類個體之丙酸血症(PA)的方法，其包含向該人類個體投與治療有效量之如請求項1至107中任一項之rAAV或如請求項108之組合物。
110. 一種治療人類個體之丙酸血症(PA)的方法，其包含向該人類個體投與： 1. 治療有效量之包含如請求項1至7、9至16、21至25、31至37、40至55、57至64、69至74、77至83、87至89、93至102、104及106至107中任一項之rAAV的組合物，其中編碼序列係用於PCCA且不用於PCCB，啟動子為PCCA基因特異性內源性啟動子且並非PCCB基因特異性內源性啟動子，且聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列；及/或 2. 治療有效量之包含如請求項1至6、8至12、17至20、26至35、38至54、56至60、65至72、75至80、84至86、90至101、103及105至107中任一項之rAAV的組合物，其中該編碼序列係用於PCCB且不用於PCCA，該啟動子為PCCB基因特異性內源性啟動子且並非PCCA基因特異性內源性啟動子，且該聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
111. 如請求項110之方法，其中(1)及(2)之該等組合物係同時、依序或分別投與。
112. 一種治療經診斷在PCCA中具有至少一個突變之人類個體之丙酸血症(PA)的方法，該方法包含向該人類個體投與治療有效量之包含如請求項1至7、9至16、21至25、31至37、40至55、57至64、69至74、77至83、87至89、93至102、104及106至107中任一項之rAAV的組合物，其中編碼序列係用於PCCA且不用於PCCB，啟動子為PCCA基因特異性內源性啟動子且並非PCCB基因特異性內源性啟動子，且聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
113. 如請求項112之方法，其中PCCA中之該突變選自表1。
114. 一種治療經診斷在PCCB中具有至少一個突變之人類個體之丙酸血症(PA)的方法，該方法包含向該人類個體投與治療有效量之包含如請求項1至6、8至12、17至20、26至35、38至54、56至60、65至72、75至80、84至86、90至101、103及105至107中任一項之rAAV的組合物，其中編碼序列係用於PCCB且不用於PCCA，啟動子為PCCB基因特異性內源性啟動子且並非PCCA基因特異性內源性啟動子，且聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
115. 如請求項114之方法，其中PCCB中之該突變選自表2。
116. 如請求項109至115中任一項之方法，其中該rAAV或該組合物係經皮下、肌肉內、皮內、腹膜內或靜脈內投與。
117. 如請求項116之方法，其中該rAAV或該組合物經靜脈內投與。
118. 如請求項109至117中任一項之方法，其中該rAAV係以約1×10¹¹ 至約1×10¹⁴ 個基因組複本(GC)/kg之劑量投與。
119. 如請求項118之方法，其中該rAAV係以約1×10¹² 至約1×10¹³ 個基因組複本(GC)/kg之劑量投與。
120. 如請求項116至119中任一項之方法，其中投與該rAAV包含投與 a.)單次劑量之rAAV；或 b.)多次劑量之rAAV。
121. 一種編碼SEQ ID NO: 16之PCCA多肽的重組核酸，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 1之野生型編碼序列小於80%一致。
122. 如請求項121之重組核酸，其中該核酸序列包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少80%一致的序列。
123. 如請求項122之重組核酸，其中該核酸序列包含選自SEQ ID NO: 2-6之序列。
124. 一種編碼SEQ ID NO: 17之PCCB多肽之重組核酸，其中該核酸序列與SEQ ID NO: 7之野生型編碼序列小於80%一致。
125. 如請求項124之重組核酸，其中該核酸序列包含與選自SEQ ID NO: 8-12之序列至少80%一致的序列。
126. 如請求項125之重組核酸，其中該核酸序列包含選自SEQ ID NO: 8-12之序列。
127. 一種重組核酸，其包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少80%一致的序列。
128. 如請求項127之重組核酸，其中該重組核酸包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少90%一致的序列。
129. 如請求項128之重組核酸，其中該重組核酸包含與選自SEQ ID NO: 2-6之序列至少95%一致的序列。
130. 一種重組核酸，其包含選自SEQ ID NO: 2-6之序列。
131. 一種重組核酸，其包含與選自SEQ ID NO: 8-12之序列至少80%一致的序列。
132. 如請求項131之重組核酸，其中該重組核酸包含與選自SEQ ID NO: 8-12之序列至少90%一致的序列。
133. 如請求項132之重組核酸，其中該重組核酸包含與選自SEQ ID NO: 8-12之序列至少95%一致的序列。
134. 一種重組核酸，其包含選自SEQ ID NO: 8-12之序列。
135. 如請求項121至134中任一項之重組核酸，其中該核酸序列進一步包含一或多個選自3'末端處之TGA、TAA及TAG之終止密碼子。
136. 一種rAAV，其包含如請求項121至135中任一項之重組核酸。
137. 一種宿主細胞，其包含如請求項121至135中任一項之重組核酸或如請求項136之rAAV。
138. 如請求項137之宿主細胞，其中該宿主細胞選自HeLa、Cos-7、HEK293、A549、BHK、Vero、RD、HT-1080、ARPE-19或MRC-5細胞。
139. 如請求項1至7、9至16、21至25、31至37、40至55、57至64、69至74、77至83、87至89、93至102、104及106至107中任一項之rAAV，其中該編碼序列係用於PCCA且不用於PCCB，該啟動子為PCCA基因特異性內源性啟動子且並非PCCB基因特異性內源性啟動子，且該聚腺苷酸化信號序列為PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。
140. 如請求項1至6、8至12、17至20、26至35、38至54、56至60、65至72、75至80、84至86、90至101、103及105至107中任一項之rAAV，其中該編碼序列係用於PCCB且不用於PCCA，該啟動子為PCCB基因特異性內源性啟動子且並非PCCA基因特異性內源性啟動子，且該聚腺苷酸化信號序列為PCCB基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列且並非PCCA基因特異性內源性聚腺苷酸化信號序列。

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