TW202000905A

TW202000905A - 腺相關病毒（ａａｖ）組成物、製造方法及使用方法

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Publication number: TW202000905A
Application number: TW108112198A
Authority: TW
Inventors: 理查特魯倫; 圖嚴王; 維勒瑞吉拉德
Original assignee: 英商夜星Ｒｘ公司
Priority date: 2018-04-05
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2020-01-01
Also published as: WO2019195729A1; MX2020010191A; CL2020002566A1; KR20210005045A; CO2020013699A2; CR20200507A; EP3775234A1; CA3096051A1; CN112384626A; AU2019247866A1; JOP20200250A1; MA52200A; US20210145929A1; BR112020020174A2; JP2021520233A; SG11202009698PA; PH12020551642A1; IL277786A

Abstract

本發明揭示自哺乳動物宿主細胞培養純化重組腺相關病毒(rAAV)粒子之方法。本揭露進一步提供藉由本揭露之方法產生之醫藥組成物、醫藥組成物及使用在本文中描述之醫藥組成物治療疾病之方法。

Description

腺相關病毒（ＡＡＶ）組成物、製造方法及使用方法

本揭露關於人治療劑、生物藥品、病毒遞送人DNA序列及製造彼等之方法的領域。相關申請案

此申請案主張臨時專利申請案 USSN 62/653,139(2018年4月5日提出)、 USSN 62/746,980(2018年10月17日提出)及 USSN 62/773,975(2018年11月30日提出)之優先權，彼等全文以引用方式併入本文中。序列表之納入

在2019年4月4日建立及大小為60 KB之純文字檔“NIGH-013/001WO_SeqList.txt”的內容全文藉此以引用方式併入本文中。

長久以來，基於AAV之遞送載體及製造這些基於AAV之遞送載體的改善方法的需求仍未被滿足。

本揭露提供一種用於自哺乳動物宿主細胞培養純化AAV(AAV)粒子之方法，其包含下列步驟：(a)在適合形成複數個AAV粒子的條件下，在培養基中培養複數個哺乳動物宿主細胞，其中該複數個哺乳動物宿主細胞已用包含外源性序列之質體載體、輔助質體載體及包含編碼病毒Rep蛋白質及病毒Cap蛋白質之序列之質體載體來轉染以產生複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞；(b)收集包含該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞之該培養基；(c)自該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞收集複數個AAV粒子；(d)藉由切向流過濾(TFF)濃縮該複數個AAV粒子以產生經濃縮的複數個AAV粒子；(e)藉由密度梯度超離心富集該經濃縮的複數個AAV粒子的完整AAV粒子以產生經富集的複數個完整AAV粒子；(f)藉由陰離子交換(AEX)層析法或親和性層析法純化該經富集的複數個完整AAV粒子以產生包含經純化及經富集的複數個完整AAV粒子之洗出液；及(g)藉由切向流過濾(TFF)透析過濾及濃縮該來自(f)的洗出液至配方緩衝劑以產生包含該經純化及富集的複數個完整AAV粒子及該配方緩衝劑之最終組成物。在一些實施例中，完整AAV包含在能夠在哺乳動物或人細胞中表現外源性序列之啟動子控制下的外源性序列。

本揭露提供一種用於自哺乳動物宿主細胞培養純化重組AAV(rAAV)粒子之方法，其包含下列步驟：(a)在適合形成複數個rAAV粒子的條件下，在培養基中培養複數個哺乳動物宿主細胞，其中該複數個哺乳動物宿主細胞已用包含外源性序列之質體載體、輔助質體載體及包含編碼病毒Rep蛋白質及病毒Cap蛋白質之序列之質體載體來轉染以產生複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞；(b)收集包含該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞之該培養基；(c)自該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞收集複數個rAAV粒子；(d)藉由切向流過濾(TFF)濃縮該複數個rAAV粒子以產生經濃縮的複數個rAAV粒子；(e)藉由密度梯度超離心富集該經濃縮的複數個rAAV粒子的完整rAAV粒子以產生經富集的複數個完整rAAV粒子；(f)藉由陰離子交換(AEX)層析法或親和性層析法純化該經富集的複數個完整rAAV粒子以產生包含經純化及經富集的複數個完整rAAV粒子之洗出液；及(g)藉由切向流過濾(TFF)透析過濾及濃縮該來自(f)的洗出液至配方緩衝劑以產生包含該經純化及富集的複數個完整rAAV粒子及該配方緩衝劑之最終組成物。在一些實施例中，完整rAAV包含在能夠在哺乳動物或人細胞中表現外源性序列之啟動子控制下的外源性序列。

本揭露提供一種用於自哺乳動物宿主細胞培養純化重組AAV(rAAV)粒子之方法，其包含下列步驟：(a)在適合形成複數個rAAV-REP1粒子的條件下，在培養基中培養複數個哺乳動物宿主細胞，其中該複數個哺乳動物宿主細胞已用包含外源性序列之質體載體、輔助質體載體及包含編碼病毒Rep蛋白質及病毒Cap蛋白質之序列之質體載體來轉染以產生複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞，其中該外源性序列包含編碼人Rab護航蛋白質1(human Rab escort protein 1)(REP1)蛋白質之序列；(b)收集包含該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞之該培養基；(c)自該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞收集複數個rAAV粒子；(d)藉由切向流過濾(TFF)濃縮該複數個rAAV粒子以產生經濃縮的複數個rAAV粒子；(e)藉由密度梯度超離心富集該經濃縮的複數個rAAV粒子的完整rAAV粒子以產生經富集的複數個完整rAAV粒子；(f)藉由陰離子交換(AEX)層析法或親和性層析法純化該經富集的複數個完整rAAV粒子以產生包含經純化及經富集的複數個完整rAAV粒子之洗出液；及(g)藉由切向流過濾(TFF)透析過濾及濃縮該來自(f)的洗出液至配方緩衝劑以產生包含該經純化及富集的複數個完整rAAV粒子及該配方緩衝劑之最終組成物。

在本揭露之方法之一些實施例中，該編碼人REP1蛋白質之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

其中Kozac一致序列以畫底線標示且起始密碼子以粗體標示。

在本揭露之方法之一些實施例中，人REP1蛋白質包含下列胺基酸序列或由下列胺基酸序列組成：

在本揭露之方法之一些實施例中，該培養基包含減少的胎牛血清。在一些實施例中，該培養基不包含減少的胎牛血清。

在本揭露之方法之一些實施例中，該培養基包含Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM)。

在本揭露之方法之一些實施例中，該培養基包含甘胺酸、L-精胺酸鹽酸鹽、L-胱胺酸二鹽酸鹽、L-麩醯胺酸、L-組胺酸鹽酸鹽-H₂ O、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸鹽酸鹽、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸二鈉鹽去水物、L-纈胺酸、氯化膽鹼、D-泛酸鈣、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸噻胺、i-肌醇、氯化鈣(CaCl₂ )(無水)、硝酸鐵(Fe(NO₃ )₃ "9H2O)、硫酸鎂(MgSO₄ )(無水)、氯化鉀(KCl)、碳酸氫鈉(NaHCO₃ )、氯化鈉(NaCl)、磷酸二氫鈉(NaH₂ PO4-H₂ O)及D-葡萄糖(右旋糖)。

在本揭露之方法之一些實施例中，該培養基包含無血清培養基。在一些實施例中，該培養基係由無血清培養基組成。

在本揭露之方法之一些實施例中，該培養基包含經澄清的培養基。在一些實施例中，該培養基係由經澄清的培養基組成。在本揭露之方法之一些實施例中，該收集培養基包含無蛋白質培養基。在本揭露之方法之一些實施例中，該收集培養基係由無蛋白質培養基組成。

在本揭露之方法之一些實施例中，該哺乳動物細胞已用包含PEI轉導試劑之組成物來轉染。

在本揭露之方法之一些實施例中，該包含外源性序列之質體載體進一步包含編碼5’反向末端重複(ITR)之序列及編碼3’ ITR之序列。在一些實施例中，該編碼5’ ITR之序列係衍生自編碼血清型2 AAV(AAV2)之5’ITR之序列。在一些實施例中，該編碼5’ ITR之序列包含與編碼血清型2 AAV(AAV2)之5’ITR之序列相同的序列。在一些實施例中，該編碼5’ ITR之序列包含與編碼血清型2 AAV (AAV2)之5’ITR之序列不相同的序列。在一些實施例中，該編碼3’ ITR之序列係衍生自編碼血清型2 AAV(AAV2)之3’ITR之序列。在一些實施例中，該編碼3’ ITR之序列包含與編碼血清型2 AAV(AAV2)之3’ITR之序列相同的序列。在一些實施例中，該編碼3’ ITR之序列包含與編碼血清型2 AAV(AAV2)之3’ITR之序列不相同的序列。在一些實施例中，該編碼5’ ITR之序列或該編碼3’ ITR之序列包含145個鹼基對(bp)。

在本揭露之方法之一些實施例中，該包含外源性序列之質體載體、該輔助質體載體或該包含編碼病毒Rep蛋白質及病毒Cap蛋白質之序列之質體載體進一步包含編碼選擇標誌之序列。在一些實施例中，該包含外源性序列之質體載體進一步包含編碼選擇標誌之序列。在一些實施例中，該輔助質體載體進一步包含編碼選擇標誌之序列。在一些實施例中，該包含編碼病毒Rep蛋白質及病毒Cap蛋白質之序列之質體載體進一步包含編碼選擇標誌之序列。在一些實施例中，該編碼選擇標誌之序列傳達對康黴素(kanamycin)之抗性。

在本揭露之方法之一些實施例中，該收集步驟(c)包含機械破壞(mechanical disruption)該複數個經轉染的哺乳動物細胞以釋放該複數個經轉染的哺乳動物細胞所產生的重組AAV(rAAV)粒子。在一些實施例中，該機械破壞包含微流體法。

在本揭露之方法之一些實施例中，該濃縮步驟進一步包含(1)藉由深層過濾澄清該經濃縮的複數個rAAV粒子以產生經濃縮及經澄清的複數個rAAV粒子。

在本揭露之方法之一些實施例中，該濃縮步驟進一步包含(2)在-80℃下冷凍該經濃縮及經澄清的複數個rAAV粒子以產生製程中間物。

在本揭露之方法之一些實施例中，該富集步驟(e)包含碘克沙醇(iodixanol)密度梯度超離心以產生經富集的複數個rAAV粒子。在一些實施例中，該密度梯度係不連續性密度梯度。在一些實施例中，該碘克沙醇密度梯度包含分別具有15%、25%、40%及57%濃度之碘克沙醇組成物中一或多者。在一些實施例中，該經富集的複數個rAAV粒子係單離自碘克沙醇密度梯度。在一些實施例中，該經富集的複數個rAAV粒子係單離自具有40%濃度之碘克沙醇組成物及具有57%濃度之碘克沙醇組成物的界面。在一些實施例中，該經濃縮及經澄清的複數個rAAV粒子係經施用至本揭露之密度梯度且後續經超離心步驟處理。在一些實施例中，在超離心步驟之後，經富集的複數個rAAV或完整rAAV粒子係單離自密度梯度。

在本揭露之方法之一些實施例中，該純化步驟(f)之親和性層析法包含AVB Sepharose基質。

在本揭露之方法之一些實施例中，該配方緩衝劑包含Tris、MgCl₂ 及NaCl。在一些實施例中，該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl，pH為8。在一些實施例中，該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl、pH 8及0.001%的泊洛沙姆(poloxamer)188。

在本揭露之方法之一些實施例中，該AEX層析法包含使用UnoSphere Q或Poros AEX層析法。在一些實施例中，該AEX層析法進一步包含下列步驟：產製AEX層析圖，及選擇含有完整rAAV粒子之AEX層析圖上的尖峰。

在本揭露之用於純化重組AAV(rAAV)粒子之方法之一些實施例中，該方法進一步在步驟(g)之前包含稀釋步驟，其中該稀釋步驟包含：(1)當層析法包含使第一經純化的複數個rAAV粒子與UnoQ接觸時，則在步驟(e)之前，將來自步驟(d)之第一經純化的複數個rAAV粒子稀釋20倍、或(2)當層析法包含使第一經純化的複數個rAAV粒子與AVB接觸時，則在步驟(e)之前，將來自步驟(d)之第一經純化的複數個rAAV粒子稀釋6倍。在一些實施例中，該稀釋步驟包含添加稀釋緩衝劑至第一經純化的複數個rAAV粒子，其中層析法包含使第一經純化的複數個rAAV粒子與UnoQ接觸且其中稀釋緩衝劑包含10 mM Tris，pH為9。在一些實施例中，該稀釋步驟包含添加稀釋緩衝劑至第一經純化的複數個rAAV粒子，其中層析法包含使第一經純化的複數個rAAV粒子與AVB接觸且其中稀釋緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl，pH為8。在一些實施例中，步驟(e)產生包含第二經純化的複數個rAAV粒子及洗提緩衝劑之組成物。在一些實施例中，層析法包含UnoQ且其中洗提緩衝劑包含10 mM Tris、650 mM NaCl，pH為9。在一些實施例中，層析法包含AVB且其中洗提緩衝劑包含10.8 mM NaHPO₄ 、44.6 mM檸檬酸、400 mM NaCl，pH為2.6。在一些實施例中，洗提緩衝劑係經洗提至中和作用緩衝劑中。在一些實施例中，中和作用緩衝劑包含1M Tris，pH為8.8。

在本揭露之方法之一些實施例中，該步驟(d)或步驟(g)之TFF係使用100kDa中空纖維過濾器(HFF)執行。在一些實施例中，該步驟(d)或步驟(g)之TFF係使用70kDa HFF執行。在一些實施例中，該步驟(d)或步驟(g)之TFF係使用50kDa HFF執行。在一些實施例中，該方法的步驟(g)進一步包含第二TFF，該步驟(d)之TFF及該步驟(g)之第一TFF係使用100kDa HFF執行且該步驟(g)之第二TFF係使用50kDa或70kDa HFF執行。

在本揭露之方法之一些實施例中，該宿主細胞係單離自或衍生自經培養的細胞系。在一些實施例中，該宿主細胞係HEK293細胞。

在本揭露之方法之一些實施例中，該宿主細胞係單離自或衍生自初代細胞系。在一些實施例中，該宿主細胞係永生化細胞或幹細胞。

本揭露提供一種醫藥組成物，其包含本揭露之方法所產生的複數個rAAV粒子。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該醫藥組成物包含：(a)介於0.5與2.5×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)；(b)小於50%空殼體；(c)每1.0×10¹² vg/mL小於4 ng/mL的殘餘宿主細胞蛋白質；及(d)每1.0×10¹² vg/mL小於7×10^-3 pg/ml的殘餘宿主細胞DNA。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該醫藥組成物進一步包含(e)複數個功能性vg/mL，其中各功能性載體基因體能夠在轉導之後在細胞中表現外源性序列。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，在用該醫藥組成物轉導細胞之後，該複數個功能性vg/mL以相較於非轉導細胞中對應內源性序列增加2倍的表現水準表現該外源性序列。在一些實施例中，在用該醫藥組成物轉導細胞之後，該複數個功能性vg/mL以相較於非轉導細胞中對應內源性序列增加3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或任何其他介於之間的增加倍數的表現水準表現該外源性序列。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係不相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係不相同，但該對應多肽係相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同一性。在一些實施例中，該外源性序列相較於該對應內源性序列係經密碼子最佳化以在哺乳動物或人中表現。在一些實施例中，包括該些其中該外源性序列相較於該對應內源性序列係經密碼子最佳化以在哺乳動物或人中表現之實施例，該外源性序列及該對應內源性序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同源性。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，在用本揭露之醫藥組成物轉導細胞之後，該外源性序列編碼蛋白質。在一些實施例中，藉由該外源性序列所編碼之該蛋白質具有等於或大於藉由非轉導細胞之對應序列所編碼之蛋白質的活性水準之活性水準。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係不相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係不相同，但該對應多肽係相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同一性。在一些實施例中，包括該些其中該外源性序列相較於該對應內源性序列係經密碼子最佳化以在哺乳動物或人中表現之實施例，該外源性序列及該對應內源性序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同源性。在一些實施例中，該活性包含與配體或受質結合、活化配體或受質及/或將一或多個官能基轉移至配體或受質。在一些實施例中，該蛋白質包含REP-1蛋白質且該活性包含REP-1受質之異戊二烯化(prenylation)。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該醫藥組成物包含(a)介於1.0與2.0×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(AAV)。在一些實施例中，該醫藥組成物包含(a)約1.0×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(AAV)。在一些實施例中，該醫藥組成物包含(a)1.0×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(AAV)。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該醫藥組成物包含(b)小於50%空殼體。在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該醫藥組成物包含(b)小於30%空殼體。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)含有單離自或衍生自血清型2 AAV(AAV2)之序列。在一些實施例中，該單離自或衍生自AAV2之序列包含編碼反向末端重複(ITR)之序列。在一些實施例中，該複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)含有編碼5’ ITR之序列及編碼3’ ITR之序列。在一些實施例中，該編碼5’ ITR之序列及該編碼3’ ITR之序列包含AAV2 ITR之野生型序列。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該宿主細胞係單離自或衍生自經培養的細胞系。在一些實施例中，該宿主細胞係HEK293細胞。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該宿主細胞係單離自或衍生自初代細胞系。在一些實施例中，該宿主細胞係永生化細胞或幹細胞。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列，該核酸序列自5’至3’包含：(a)編碼AAV2 5’ ITR之序列，(b)編碼早期增強子元件之序列，(c)編碼啟動子之序列，(d)編碼外顯子及內含子之序列，(e)編碼剪接受體位點之序列，(f)編碼Rab護航蛋白質1(REP1)蛋白質之序列，(g)編碼轉錄後調節元件(PRE)之序列，(h)編碼聚腺苷酸化(polyA)位點之序列，及(i)編碼AAV2 3’ ITR之序列。(亦見美國專利第9,834,788號，其內容整體納入本文中)。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該早期增強子元件包含單離自或衍生自巨細胞病毒(CMV)之序列。在一些實施例中，該早期增強子元件包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

。在一些實施例中，該早期增強子元件包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該編碼啟動子之序列包含下列序列或由下列序列組成：單離自或衍生自編碼雞β肌動蛋白(CBA)基因之序列。在一些實施例中，該編碼啟動子之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該編碼外顯子及內含子之序列包含下列序列或由下列序列組成：單離自或衍生自編碼雞β肌動蛋白(CBA)基因之序列。在一些實施例中，該編碼外顯子及內含子之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該編碼剪接受體位點之序列包含單離自或衍生自編碼家兔(Oryctolagus cuniculus)β球蛋白剪接受體位點之序列。在一些實施例中，該編碼家兔β球蛋白剪接受體位點之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該包含早期增強子元件之序列、該包含啟動子之序列、該包含內含子及外顯子之序列及該包含剪接受體位點之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該編碼REP1蛋白質之序列包含單離自或衍生自哺乳動物REP1序列之序列。在一些實施例中，該哺乳動物REP1序列係單離自或衍生自小鼠、大鼠、兔、非人靈長動物或人。在一些實施例中，該哺乳動物REP1序列係單離自或衍生自人。在一些實施例中，該編碼人REP1蛋白質之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在一些實施例中，該人REP1蛋白質包含下列胺基酸序列或由下列胺基酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該編碼PRE之序列包含單離自或衍生自土撥鼠肝炎病毒(WPRE)之序列。在一些實施例中，該編碼WPRE之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該編碼聚腺苷酸化(polyA)位點之序列包含單離自或衍生自哺乳動物基因之序列。在一些實施例中，該編碼聚腺苷酸化(polyA)位點之序列包含單離自或衍生自牛生長激素基因(BGH)之序列。在一些實施例中，該編碼polyA位點之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該編碼AAV2 5’ITR之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該編碼AAV2 3’ITR之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該自5’至3’包含元件(a)至(i)之核酸包含DNA序列或由DNA序列組成。在一些實施例中，該自5’至3’包含元件(a)至(i)之核酸包含單股DNA序列或由單股DNA序列組成。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該最終組成物之該複數個完整rAAV的各rAAV包含單離自或衍生自AAV2之殼體蛋白質。在一些實施例中，該AAV2殼體蛋白質包含與下列胺基酸序列具有至少95%同一性之序列：

在一些實施態樣中，該AAV2殼體蛋白質包含下列胺基酸序列：

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該醫藥組成物進一步包含配方緩衝劑。在一些實施例中，該配方緩衝劑包含Tris、MgCl₂ 及NaCl。在一些實施例中，該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl，pH為8。在一些實施例中，該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl、pH 8及0.001%的泊洛沙姆(poloxamer)188。

在本揭露之醫藥組成物之一些實施例中，包括該些其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各完整rAAV進一步包含核酸序列且該核酸序列自5’至3’包含元件(a)至(i)之實施例，該複數個完整rAAV之濃度係介於1×10⁸ 個基因體粒子(gp)/mL與1×10¹⁴ gp/mL之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該複數個完整rAAV之濃度係介於0.5×10¹⁰ gp/mL與2.5×10¹² gp/mL之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該複數個完整rAAV之濃度係介於1×10¹¹ gp/mL與5×10¹³ gp/mL之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該複數個完整rAAV之濃度係介於1×10¹¹ gp/mL與2×10¹² gp/mL之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該複數個完整rAAV之濃度係1×10¹² gp/mL。在一些實施例中，該複數個完整rAAV之濃度係1×10¹¹ gp/mL。在一些實施例中，該複數個完整rAAV之濃度使用qPCR測量。在一些實施例中，該qPCR使用超螺旋質體載體作為標準。在一些實施例中，該qPCR使用線性化質體載體作為標準。

本揭露提供一種遞送裝置，其包含本揭露之醫藥組成物。在一些實施例中，該遞送裝置包含注射器、導管及針頭中一或多者。在一些實施例中，該遞送裝置適合用於藉由注射投予該醫藥組成物。在一些實施例中，該遞送裝置適合用於藉由輸注投予該醫藥組成物。在一些實施例中，該遞送裝置適合用於藉由視網膜下途徑投予該醫藥組成物。在一些實施例中，該遞送裝置適合用於藉由脈絡膜上途徑投予該醫藥組成物。

本揭露提供一種在有治療需要之個體中治療疾病或病症之方法，其包含向該個體投予治療有效量的如本揭露之醫藥組成物。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該疾病或病症係視網膜的疾病或病症。在一些實施例中，該疾病或病症係無脈絡膜症。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該治療有效量包含介於該醫藥組成物之最小有效量與最大耐受量之間的量。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該最小有效量包含足以轉導視網膜或其目標部分之至少一個神經元的該醫藥組成物的量。在一些實施例中，該最小有效量包含足以轉導視網膜或其目標部分之至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比神經元的該醫藥組成物的量。在一些實施例中，該最小有效量包含足以改善該個體之視敏度(visual acuity)的該醫藥組成物之量。在一些實施例中，該最小有效量包含足以減少視網膜疾病之徵候或症狀的該醫藥組成物之量。在一些實施例中，該視網膜疾病係無脈絡膜症。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該最大耐受量包含足以誘發不良事件的該醫藥組成物之量。在一些實施例中，該不良反應包含對該醫藥組成物之免疫反應。在一些實施例中，該免疫反應包含炎症。在一些實施例中，該炎症係全身性。在一些實施例中，該炎症係局部性。在一些實施例中，該不良事件係嚴重。在一些實施例中，該不良事件無法藉由向該個體投予二級醫學治療來預防、減少或控制。在一些實施例中，該二級醫學治療包含免疫系統之抑制劑。在一些實施例中，該抑制劑包含抗發炎劑。在一些實施例中，該抗發炎劑包含皮質類固醇。在一些實施例中，該皮質類固醇包含潑尼松(prednisone)或普賴蘇龍(prednisolone)。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該醫藥組成物之治療有效量包含具有介於10⁴ 與10⁷ 之間(終點包括在內)的感染複數(multiplicity of infection，MOI)之量。在一些實施例中，該醫藥組成物之治療有效量包含具有介於1×10⁶ 與9×10⁶ 之間(終點包括在內)的感染複數(MOI)之量。在一些實施例中，該醫藥組成物之治療有效量包含具有介於10⁴ 與9×10⁵ 之間(終點包括在內)的感染複數(MOI)之量。在一些實施例中，該醫藥組成物之治療有效量包含具有10⁵ 的感染複數(MOI)之量。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該治療有效量包含介於1×10⁸ gp與1×10¹³ gp之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該治療有效量包含介於6×10⁹ gp與1×10¹³ gp之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該治療有效量包含介於6×10⁹ gp與7×10¹² gp之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該治療有效量包含介於6×10⁹ gp與5×10¹² gp之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該治療有效量包含介於1×10¹⁰ gp與1×10¹² gp之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該治療有效量包含下列或由下列組成：1×10¹⁰ gp。在一些實施例中，該治療有效量包含下列或由下列組成：1×10¹¹ gp。在一些實施例中，該治療有效量包含下列或由下列組成：1×10¹² gp。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該治療有效量包含下列體積或由下列體積組成：介於10 µL與200 µL之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該治療有效量包含下列體積或由下列體積組成：介於10 µL與50 µL之間、介於50 µL與100 µL之間、介於100 µL與150 µL之間或介於150 µL與200 µL之間(各範圍的終點包括在內)。在一些實施例中，該治療有效量包含下列體積或由下列體積組成：介於70 µL與120 µL之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該治療有效量包含下列體積或由下列體積組成：100 µL。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該治療有效量包含下列或由下列組成：介於10 µL與200 µL之間(終點包括在內)的體積之至少一次注射。在一些實施例中，該治療有效量包含下列或由下列組成：介於10 µL與200 µL之間(終點包括在內)的體積之至少2、3、4、5、6、7、8、9、10次注射。在一些實施例中，二或更多次注射係在相同醫學程序期間對相同眼的視網膜下空間進行。在一些實施例中，二或更多次注射係在相同醫學程序期間對相同眼的二或更多個不同的視網膜下空間進行。在一些實施例中，由治療有效量之載體所接觸的視網膜下空間的面積包含下列或由下列組成：介於5與20 mm² 之間。在一些實施例中，由治療有效量之載體所接觸的視網膜下空間的面積包含下列或由下列組成：10 mm² 。在一些實施例中，一或多次注射係在眼的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個不同的視網膜區進行。在一些實施例中，一或多次注射係在單一程序期間在眼的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個不同的視網膜區進行。在一些實施例中，一或多次注射係在二或更多個程序期間在眼的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個不同的視網膜區進行。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該治療有效量包含下列或由下列組成：自相同裝置投予介於10 µL與200 µL之間(終點包括在內)的體積之至少一次注射。在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該治療有效量係以分成介於一或多次注射之間的分割劑量藉由相同裝置遞送。分割劑量可經投予至相同的視網膜下空間或相同眼中二或更多個不同的視網膜下空間。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該投予步驟包含注射或輸注。在一些實施例中，該投予步驟包含視網膜下、脈絡膜上或玻璃體內途徑。在一些實施例中，該投予步驟包含視網膜下注射或輸注。在一些實施例中，該視網膜下注射或輸注包含2步驟視網膜下注射。在一些實施例中，該投予步驟包含脈絡膜上注射或輸注。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該個體係男性。在一些實施例中，該個體係至少18歲。在一些實施例中，該個體具有經基因確診的無脈絡膜症。在一些實施例中，該個體經識別為具有REP1基因突變。在一些實施例中，該個體至少一眼的黃斑部呈現無脈絡膜症的臨床徵候。在一些實施例中，該個體至少一眼具有34至73個字母的最佳矯正視力(BCVA)分數。在一些實施例中，該個體具有輕微或早期階段的無脈絡膜症。在一些實施例中，該個體具有晚期或嚴重的無脈絡膜症。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該方法包含治療至少一眼之10 mm² 的視網膜。在一些實施例中，該方法包含治療至少一眼之介於5 mm² 與10 mm² 之間(終點包括在內)的視網膜。在一些實施例中，該方法包含治療至少一眼之介於2 mm² 與15 mm² 之間(終點包括在內)的視網膜。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該醫藥組成物係向該個體之一眼投予。在一些實施例中，該醫藥組成物係向該個體之雙眼投予。在一些實施例中，該個體之雙眼係同時治療。在一些實施例中，該個體之雙眼係依序治療。在一些實施例中，在向該個體投予該醫藥組成物之前，該個體之至少一眼已接受過無脈絡膜症之治療。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該方法包含每眼投予介於1與12劑之間(終點包括在內)。在一些實施例中，該方法包含至少每天一次、每週一次、每月一次、每三個月一次、每6個月一次或每年一次投予至少一劑。在一些實施例中，該方法包含投予多劑且其中各劑包含相同量的該醫藥組成物。在一些實施例中，該方法包含投予多劑且其中各劑不包含相同量的該醫藥組成物。在一些實施例中，該方法包含投予多劑且其中各後繼劑量比前一劑包含較大數量的完整rAAV。在一些實施例中，該方法包含投予多劑且其中各後繼劑量比前一劑包含較小數量的完整rAAV。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該方法包含每眼投予介於1與12劑之間(終點包括在內)。在一些實施例中，劑量係在恢復期之後提供。在一些實施例中，恢復期係至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60分鐘或介於之間的任何分鐘數。在一些實施例中，恢復期係至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時。在一些實施例中，恢復期係至少1、2、3、4、5、6或7天。在一些實施例中，恢復期係至少1、2、3或4週。在一些實施例中，恢復期係至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個月。在一些實施例中，恢復期係至少1、2、3、4、5或6年。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，包括該些其中該方法包含每眼投予介於1與12劑之間(終點包括在內)之實施例，該個體在治療有效劑量之後經歷不良事件且該後續劑量比誘發該不良事件之前一劑包含較小數量的完整rAAV。在一些實施例中，該個體從該不良事件恢復且向該個體投予後續劑量的該醫藥組成物。在一些實施例中，誘發該不良事件之該治療有效劑量及該後續劑量含有相等數量的完整rAAV。在一些實施例中，誘發該不良事件之該治療有效劑量及該後續劑量不含有相等數量的完整rAAV。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該方法在投予治療有效量之該醫藥組成物之前進一步包含向該個體投予複數個安慰劑rAAV之量，其中各安慰劑rAAV係空rAAV。在一些實施例中，該空rAAV不含有表現外源性序列之啟動子或外源性序列。在一些實施例中，投予該複數個安慰劑rAAV之量係全身性。在一些實施例中，投予該複數個安慰劑rAAV之量係局部性。在一些實施例中，該方法進一步包含(a)判定該複數個安慰劑rAAV是否誘發該個體之免疫反應及/或(b)判定該個體是否發展出對該複數個安慰劑rAAV之免疫耐受性，藉此表明投予治療有效量之該醫藥組成物應該不會誘發該個體之免疫媒介之不良事件。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該方法進一步包含向個體投予免疫反應之抑制劑。在一些實施例中，該抑制劑包含抗發炎劑。在一些實施例中，該抗發炎劑包含皮質類固醇。在一些實施例中，該皮質類固醇包含潑尼松(prednisone)或普賴蘇龍( prednisolone)。在一些實施例中，投予該免疫反應之抑制劑係全身性。在一些實施例中，該免疫反應之抑制劑係經口投予。在一些實施例中，投予該免疫反應之抑制劑係局部性。在一些實施例中，該免疫反應之抑制劑係向接受該醫藥組成物之治療之眼投予。在一些實施例中，該醫藥組成物及該免疫反應之抑制劑係同時投予。在一些實施例中，該醫藥組成物及該免疫反應之抑制劑係在同一天投予。在一些實施例中，該醫藥組成物及該免疫反應之抑制劑係依序投予。在一些實施例中，該抑制劑在投予該醫藥組成物至少一天之前投予。在一些實施例中，該醫藥組成物在投予該抑制劑至少一天之前投予。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，該方法進一步包含判定該個體之至少一眼的無脈絡膜症媒介之傷害的初始嚴重性。在一些實施例中，該方法進一步包含在向該至少一眼投予該醫藥組成物之後判定該個體之該至少一眼的無脈絡膜症媒介之傷害的後續嚴重性。在一些實施例中，該無脈絡膜症媒介之傷害的初始或後續嚴重性係藉由下列判定：判定最佳矯正視力(BCVA)檢查分數、測量存活視網膜組織之面積或體積、測量保留橢圓體區、測量視網膜敏感度、測量對比敏感度、測量色視覺、測量低輝度視敏度、測量速讀或彼等之任何組合。在一些實施例中，該BCVA檢查利用(糖尿病視網膜病早期治療研究)ETDRS表。在一些實施例中，該BCVA檢查包含數手指、手移動、光感知及彼等之組合中一或多者之評估。在一些實施例中，存活視網膜組織包含眼底自體螢光且其中測量存活視網膜組織包含偵測眼底自體螢光之水準或模式。在一些實施例中，測量保留橢圓體區包含光譜域光學同調斷層掃描(SD-OCT)。在一些實施例中，測量視網膜敏感度包含微視野檢查。

在本揭露之治療疾病或病症之方法之一些實施例中，投予該治療有效量之該醫藥組成物抑制或減少無脈絡膜症之徵候或症狀的進展。在一些實施例中，投予該治療有效量之該醫藥組成物減少無脈絡膜症之徵候或症狀。在一些實施例中，無脈絡膜症之徵候或症狀包含喪失感光受體細胞、喪失RPE細胞、視敏度降低、低輝度視敏度降低、保留自體螢光(AF)總面積、BCVA檢查分數低、保留橢圓體區的面積降低、視網膜敏感度降低、對比敏感度降低、色視覺降低或變淡、速讀速度降低或彼等之任何組合。在一些實施例中，該無脈絡膜症之徵候或症狀的嚴重性係相對於健康視網膜判定。在一些實施例中，該健康視網膜屬於年齡相符對照個體。

本揭露提供一種判定本揭露之醫藥組成物的治療有效量之方法，該方法包含：(a)測量所欲治療之個體的視網膜區，(b)判定該(a)之區是否在中央0.5 mm² 小窩區中或在黃斑部中，(c)計算該(a)之區中的桿狀細胞、錐狀細胞及視網膜色素上皮(RPE)細胞數量，及(d)將細胞總數乘以1×10⁵ 之感染複數(MOI)以計算待包括在該治療有效量中之基因體粒子(gp)的數量，其中該所欲治療之視網膜的最大面積係10 mm² ，其中該視網膜中RPE細胞之密度係每mm² 5,000個細胞，其中該視網膜中桿狀細胞之密度係每mm² 75,000個桿狀細胞(不包括中央0.5 mm² 小窩區)，其中該視網膜中錐狀細胞之密度在該中央0.5 mm² 小窩區係每mm² 150,000個錐狀細胞，且該視網膜中錐狀細胞之密度在該中央0.5 mm² 小窩區以外的黃斑部係每mm² 25,000個。

本揭露提供用於治療有治療需要之個體的疾病或病症之本揭露之醫藥組成物。

本揭露提供用於治療有治療需要之個體的疾病或病症之本揭露之載體。

本揭露提供用於治療有治療需要之個體的疾病或病症之本揭露之AAV或rAAV。

本揭露提供用於純化本揭露之重組AAV (rAAV)粒子之方法。本揭露提供醫藥組成物，其包含本揭露之方法所產生的rAAV粒子。在一些實施例中，包含本揭露之方法所產生的rAAV粒子之醫藥組成物包含：(a)介於0.5與2.5×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)；(b)小於50%空殼體；(c)每1.0×10¹² vg/mL小於4 ng/mL的殘餘宿主細胞蛋白質；及(d)每1.0×10¹² vg/mL小於7×10^-3 pg/ml的殘餘宿主細胞DNA。

本揭露提供一種在有治療需要之個體中治療疾病或病症之方法，其包含向該個體投予治療有效量的如本揭露之醫藥組成物。在一些實施例中，該疾病或病症係視網膜的疾病或病症。在一些實施例中，該疾病或病症係無脈絡膜症。

本揭露提供一種醫藥組成物，其包含：(a)介於0.5與2.5×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)；(b)小於50%空殼體；(c)每1.0×10¹² vg/mL小於4 ng/mL的殘餘宿主細胞蛋白質；及(d)每1.0×10¹² vg/mL小於7×10^-3 pg/ml的殘餘宿主細胞DNA。

在一些實施例中，該醫藥組成物包含：(a)介於0.5與2.5×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)；(b)小於50%空殼體；(c)每1.0×10¹² vg/mL小於4 ng/mL的殘餘宿主細胞蛋白質；(d)每1.0×10¹² vg/mL小於7×10^-3 pg/ml的殘餘宿主細胞DNA；及(e)複數個功能性vg/mL，其中各功能性載體基因體能夠在轉導之後在細胞中表現外源性序列。在一些實施例中，在用本揭露之醫藥組成物轉導細胞之後，該複數個功能性vg/mL以相較於非轉導細胞中對應內源性序列增加2倍的表現水準表現該外源性序列。在一些實施例中，在用本揭露之醫藥組成物轉導細胞之後，該複數個功能性vg/mL以相較於非轉導細胞中對應內源性序列增加3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或任何其他介於之間的增加倍數的表現水準表現該外源性序列。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係不相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同一性。

在一些實施例中，該醫藥組成物包含：(a)介於0.5與2.5×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)；(b)小於50%空殼體；(c)每1.0×10¹² vg/mL小於4 ng/mL的殘餘宿主細胞蛋白質；(d)每1.0×10¹² vg/mL小於7×10^-3 pg/ml的殘餘宿主細胞DNA；及(e)複數個功能性vg/mL，其中各功能性載體基因體能夠在轉導之後在細胞中表現外源性序列。在一些實施例中，在用本揭露之醫藥組成物轉導細胞之後，該外源性序列編碼蛋白質。在一些實施例中，藉由該外源性序列所編碼之該蛋白質具有等於或大於藉由非轉導細胞之對應序列所編碼之蛋白質的活性水準之活性水準。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列係不相同。在一些實施例中，該外源性序列及該對應內源性序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同一性。在一些實施例中，該活性包含與配體或受質結合、活化配體或受質及/或將一或多個官能基轉移至配體或受質。在一些實施例中，該蛋白質包含REP-1蛋白質且該活性包含REP-1受質之異戊二烯化(prenylation)。 AAV 組成物

本揭露之組成物包含適合向哺乳動物及較佳地向人全身性或局部性投予之治療性建構體。本揭露之例示性建構體包含編碼基因或其部分之序列。較佳地，本揭露之建構體包含編碼人基因或其部分之序列。本揭露之例示性建構體可進一步包含一或多個編碼調節元件之序列以使基因或其部分能夠表現或增強表現。例示性調節元件包括但不限於啟動子、內含子、增強子元件、反應元件(包括轉錄後反應元件或轉錄後調節元件)、聚腺苷(polyA)序列及促進轉錄有效終止之基因片段(包括β球蛋白基因片段及兔β球蛋白基因片段)。

在本揭露之組成物之一些實施例中，建構體包含對應人Rab護航蛋白質1型(REP-1)蛋白質或其部分之人基因或其部分。在本揭露之組成物之一些實施例中，建構體包含人基因或其部分，該人基因或其部分包含密碼子最佳化序列。在一些實施例中，序列係經密碼子最佳化以於哺乳動物表現。在一些實施例中，序列係經密碼子最佳化以於人表現。

在本揭露之組成物之一些實施例中，其中建構體包含人REP-1蛋白質或其部分，該建構體被稱為「AAV2-REP1或AAV2.REP1」且國際非專利藥品名稱(INN)係timrepigene emparvovec。在一些實施例中，建構體包含下列序列或由下列序列組成：

。在一些實施例中，建構體包含下列或由下列組成：與下列序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或介於之間的任何百分比同一性之序列：

在一些實施例中，建構體包含序列或由序列組成，該序列編碼具有下列序列之人REP1序列：

或該序列與下列序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或介於之間的任何百分比同一性：

在一些實施例中，建構體包含序列或由序列組成，該序列編碼具有下列序列之CAG啟動子：

在一些實施例中，建構體包含序列或由序列組成，該序列編碼具有下列序列之經突變的WPRE信號：

，或該序列與下列序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或介於之間的任何百分比同一性：

在一些實施例中，建構體包含序列或由序列組成，該序列編碼具有下列序列之牛生長激素的聚腺苷酸化信號：

在一些實施例中，建構體包含序列或由序列組成，該序列編碼具有下列序列之5’ITR：

在一些實施例中，建構體包含序列或由序列組成，該序列編碼具有下列序列之3’ITR：

在本揭露之組成物之一些實施例中，其中建構體包含人REP-1蛋白質或其部分，該建構體被稱為「AAV2-REP1或AAV2.REP1」且國際非專利藥品名稱(INN)係timrepigene emparvovec。在本揭露之組成物之一些實施例中，其中建構體包含人REP-1蛋白質或其部分，該AAV2-REP1產物係由編碼人Rab護航蛋白質1型(REP1)之cDNA的經純化的重組血清型2腺相關病毒載體(rAAV)組成。在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有長度4173 bp之單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：177 bp 5’反向末端重複(ITR)、934 bp巨細胞病毒增強子/雞β肌動蛋白(CBA)雜交啟動子、1962 bp人REP1 cDNA、589 bp土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)、242 bp牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)及165 bp 3’ ITR。在一些實施例中，用於產製AAV2-REP1載體之pAAV.REP-1-Kan質體顯示於圖18。在一些實施例中，1962 bp人REP1 cDNA包含下列核酸序列：

在本揭露之組成物之一些實施例中，建構體進一步包含對應5’反向末端重複(ITR)之序列及對應3’反向末端重複(ITR)之序列。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列係相同。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列係不相同。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列係單離自或衍生自血清型2之腺相關病毒(AAV2)載體。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列包含野生型序列。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列包含截短野生型AAV2序列。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列相較於相同AAV血清型之野生型序列包含變異。在一些實施例中，變異包含取代、插入、刪除、倒位或轉位。在一些實施例中，變異包含野生型或變體序列之截短或伸長。

在本揭露之組成物之一些實施例中，AAV包含對應5’反向末端重複(ITR)之序列及對應3’反向末端重複(ITR)之序列。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列係相同。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列係不相同。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列係單離自或衍生自血清型2之腺相關病毒(AAV2)載體。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列包含野生型序列。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列包含截短野生型AAV2序列。在一些實施例中，編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列相較於相同AAV血清型之野生型序列包含變異。在一些實施例中，變異包含取代、插入、刪除、倒位或轉位。在一些實施例中，變異包含野生型或變體序列之截短或伸長。

在本揭露之組成物之一些實施例中，AAV包含形成複製缺陷AAV所必需之病毒序列。在一些實施例中，病毒序列係單離自或衍生自與編碼5’ITR之序列或編碼3’ITR之序列中一或兩者相同血清型之AAV。在一些實施例中，病毒序列、編碼5’ ITR之序列或編碼3’ITR之序列係單離自或衍生自AAV2。在一些實施例中，病毒序列、編碼5’ ITR之序列及編碼3’ITR之序列係單離自或衍生自AAV2。

在本揭露之組成物之一些實施例中，AAV包含形成複製缺陷AAV所必需之病毒序列、編碼5’ITR之序列及編碼3’ITR之序列，但不包含任何其他單離自或衍生自AAV之序列。在一些實施例中，AAV係重組AAV (rAAV)，其包含形成複製缺陷AAV所必需之病毒序列、編碼5’ITR之序列、編碼3’ITR之序列及編碼本揭露之建構體之序列。

在一些實施例中，用於在宿主細胞中產生rAAV之質體DNA包含選擇標誌。例示性選擇標誌包括但不限於抗生素抗性基因。例示性抗生素抗性基因包括但不限於安比西林(ampicillin)及康黴素(kanamycin)。例示性選擇標誌包括但不限於藥物或小分子抗性基因。例示性選擇標誌包括但不限於dapD及抑制性操作子，包括但不限於控制或壓制dapD表現之lacO/P建構體，其中質體選擇係藉由用能夠進行操作子-抑制子滴定(ORT)之質體投予或接觸經轉形的細胞執行。例示性選擇標誌包括但不限於ccd選擇基因。在一些實施例中，ccd選擇基因包含編碼ccdA選擇基因之序列，其救援經工程改造以表現毒性ccdB基因之宿主細胞系。例示性選擇標誌包括但不限於sacB，其中RNA係向宿主細胞投予或接觸以抑制sacB基因在蔗糖培養基中表現。例示性選擇標誌包括但不限於分離殺滅機制諸如由Hok(宿主殺滅基因)及Sok(抑制殺滅)構成之parAB+基因座。 AAV 建構體結構

AAV2建構體產物係由編碼cDNA之經純化的重組血清型2腺相關病毒載體(rAAV)組成，該cDNA編碼治療性建構體。例示性圖示提供於圖3。

在一些實施例中，AAV2建構體包含編碼5’ ITR之序列、編碼3’ ITR之序列及編碼單離自及/或衍生自血清型2腺相關病毒載體(AAV2)之殼體蛋白質之序列中一或多者。在一些實施例中，AAV2建構體包含編碼5’ ITR之序列、編碼3’ ITR之序列及編碼單離自及/或衍生自血清型2腺相關病毒載體(AAV2)之殼體蛋白質之序列。在一些實施例中，AAV2建構體包含編碼5’ ITR之截短序列、編碼5’ ITR之序列及編碼單離自及/或衍生自血清型2腺相關病毒載體(AAV2)之3’ ITR之序列。在一些實施例中，AAV2建構體包含野生型AAV2 ITR(野生型5’ ITR及野生型3’ ITR)。

在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)5’反向末端重複(ITR)、(b)適合在哺乳動物細胞中表現之啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA及(d)3’ ITR。

在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)145 bp 5’反向末端重複(ITR)、(b)適合在哺乳動物細胞中表現之啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA及(d)145 bp 3’ ITR。在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)5’反向末端重複(ITR)、(b)適合在哺乳動物細胞中表現之啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA及(d)3’ ITR，其中5’ ITR或3’ ITR包含下列或由下列組成：134、135、136或137 bp。

在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)145 bp 5’反向末端重複(ITR)、(b)適合在哺乳動物細胞中表現之啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA、(e)聚腺苷酸化序列(polyA)及(f) 145 bp 3’ ITR。在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)5’反向末端重複(ITR)、(b)適合在哺乳動物細胞中表現之啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA、(e)聚腺苷酸化序列(polyA)及(f) 3’ ITR，其中5’ ITR或3’ ITR包含下列或由下列組成：134、135、136或137 bp。

在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)145 bp 5’反向末端重複(ITR)、(b)適合在哺乳動物細胞中表現之啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA、(d)轉錄後調節元件(PRE)、(e)聚腺苷酸化序列(polyA)及(f)145 bp 3’ ITR。在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)5’反向末端重複(ITR)、(b)適合在哺乳動物細胞中表現之啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA、(d)轉錄後調節元件(PRE)、(e)聚腺苷酸化序列(polyA)及(f)3’ ITR，其中5’ ITR或3’ ITR包含下列或由下列組成：134、135、136或137 bp。

在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)145 bp 5’反向末端重複(ITR)、(b)啟動子，可選地934 bp巨細胞病毒增強子/雞β肌動蛋白(CBA)雜交啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA、(d)589 bp土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)、(e)242 bp牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)及(f)145 bp 3’ ITR。在一些實施例中，各20 nm AAV病毒粒子含有單股DNA插入物序列(加上側接各元件之短選殖位點)，該單股DNA插入物序列包含：(a)5’反向末端重複(ITR)、(b)啟動子，可選地934 bp巨細胞病毒增強子/雞β肌動蛋白(CBA)雜交啟動子、(c)編碼治療性建構體之cDNA、(d)589 bp土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)、(e)242 bp牛生長激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)及(f)3’ ITR，其中5’ ITR或3’ ITR包含下列或由下列組成：134、135、136或137 bp。

本揭露之AAV或建構體可包含編碼能夠在哺乳動物細胞中表現之啟動子之序列。較佳地，本揭露之AAV或建構體可包含編碼能夠在人細胞中表現之啟動子之序列。本揭露之例示性啟動子包括但不限於組成性活性啟動子、細胞類型特異性啟動子、病毒啟動子、哺乳動物啟動子及雜交或重組啟動子。在本揭露之組成物之一些實施例中，AAV2建構體之治療性建構體係在雞β肌動蛋白啟動子(CBA)啟動子控制下。在本揭露之組成物之一些實施例中，CBA啟動子包含編碼巨細胞病毒(CMV)增強子之序列及編碼雞β肌動蛋白啟動子之序列(不同地稱為CBA或CAG)。

本揭露之AAV或建構體可包含編碼轉錄後調節元件(PRE)之序列。本揭露之例示性PRE包括但不限於土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。在本揭露之組成物之一些實施例中，AAV在編碼本揭露之治療性建構體之cDNA直接下游包含源自病毒S轉錄物之3’區域的589 bp WPRE。此WPRE對於天然mRNA轉錄物之高水準表現來說很重要，其作用為增強無內含子基因之mRNA處理及運輸。在本揭露之組成物之一些實施例中，WPRE係經修飾以藉由剝蝕轉譯起始位點來預防病毒X抗原的表現。此藉由刪除We2啟動子/增強子及突變We1啟動子達成。

本揭露之AAV或建構體可包含聚腺苷(polyA)序列。本揭露之例示性polyA序列包括但不限於牛生長激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)序列。BGH-polyA序列係用於增強基因表現且已顯示比起其他polyA序列諸如SV40及人膠原蛋白polyA產生三倍較高的表現水準。此增加的表現大多與上游啟動子之類型或轉殖基因無關。使用BGH-polyA及WPRE兩者序列之增加表現水準允許降低待注射之AAV或質體載體的整體劑量，因而較不可能產生宿主免疫反應。

在一示例性實施例中，pBC-hREP1載體包含下列或由下列組成：如SEQ ID NO:24所示之核酸序列。

在本揭露之組成物之一些實施例中，該組成物包含藥物物質。如本文中所使用，藥物物質包含本揭露之rAAV，該rAAV包含本揭露之建構體。

在本揭露之組成物之一些實施例中，該組成物包含藥物產品。如本文中所使用，藥物產品包含經調配以用於向個體投予以治療或預防疾病或病症之藥物物質。

本揭露之例示性藥物產品之組分、彼等之功能及規格係如表1所列。

劑型

本揭露之組成物可經調配以用於全身性或局部性投予。

本揭露之組成物可經調配為注射或輸注用懸浮液。

本揭露之組成物可經調配以用於藉由任何途徑注射或輸注，包括但不限於玻璃體內注射或輸注、視網膜下注射或輸注或脈絡膜上注射或輸注。

本揭露之組成物可經調配為介於1.0×10^10 DRP/mL與1.0×10^14 DRP/mL之間(終點包括在內)之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為約1.0×10^12 DRP/mL之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為1.0×10^12 DRP/mL之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為介於0.1×10^12 DRP/mL與10.0×10^12 DRP/mL之間(終點包括在內)之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為介於0.1×10^12 DRP/mL與5.0×10^12 DRP/mL之間(終點包括在內)之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為介於0.1×10^12 DRP/mL與2.0×10^12 DRP/mL之間(終點包括在內)之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為介於0.5×10^12 DRP/mL與1.5×10^12 DRP/mL之間(終點包括在內)之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為介於0.7×10^12 DRP/mL與1.3×10^12 DRP/mL之間(終點包括在內)之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為介於0.8×10^12 DRP/mL與1.2×10^12 DRP/mL之間(終點包括在內)之濃度。在一些實施例中，本揭露之組成物可經調配為介於0.9×10^12 DRP/mL與1.1×10^12 DRP/mL之間(終點包括在內)之濃度。

本揭露之組成物可在投予之前使用本揭露之稀釋劑稀釋。在一些實施例中，稀釋劑係與用於製備AAV2建構體藥物產品之配方緩衝劑相同。在一些實施例中，稀釋劑係與用於製備AAV2建構體藥物產品之配方緩衝劑不相同。

本揭露之組成物(包括表1所述之AAV2建構體藥物產品)可經調配為含有1.0×10^12 DRP/mL之注射用懸浮液。如計劃書有所規定，則AAV2建構體藥物產品可在投予之前於診間(即由醫療專業人員)使用本揭露之稀釋劑稀釋。在一些實施例中，此稀釋劑係用於製備AAV2建構體藥物產品之相同的配方緩衝劑。 醫藥調製劑

本揭露之組成物可包含藥物物質。在一些實施例中，藥物物質包含下列或由下列組成：AAV2建構體。在一些實施例中，藥物物質包含下列或由下列組成：AAV2建構體及配方緩衝劑。在一些實施例中，該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl，pH為8。在一些實施例中，該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl、pH 8及0.001%的泊洛沙姆(poloxamer)188。賦形劑本揭露之組成物可包含藥物產品。在一些實施例中，藥物產品包含下列或由下列組成：藥物物質及配方緩衝劑。在一些實施例中，藥物產品包含下列或由下列組成：稀釋於配方緩衝劑中之藥物物質。在一些實施例中，藥物產品包含下列或由下列組成：在配方緩衝劑中稀釋至最終藥物產品AAV2建構體載體基因體(vg)濃度之AAV2建構體藥物物質。眼配方

本揭露之組成物可經調配以包含下列、實質上由下列組成或由下列組成：用於眼注射或輸注之最佳濃度的AAV2建構體藥物物質。

本揭露之組成物可包含增加或增強本揭露之AAV的穩定性之一或多種緩衝劑。在一些實施例中，本揭露之組成物可包含確保或增強本揭露之AAV2的穩定性之一或多種緩衝劑。選擇性地或另外地，本揭露之組成物可包含預防、降低或最小化AAV粒子聚集之一或多種緩衝劑。在一些實施例中，本揭露之組成物可包含預防、降低或最小化AAV2粒子聚集之一或多種緩衝劑。

本揭露之組成物可包含誘導或維持中性或微鹼性pH之一或多種組分。在一些實施例中，本揭露之組成物包含誘導或維持中性或微鹼性pH為介於7與9之間(終點包括在內)之一或多種組分。在一些實施例中，本揭露之組成物包含誘導或維持pH約8之一或多種組分。在一些實施例中，本揭露之組成物包含誘導或維持pH介於7.5與8.5之間之一或多種組分。在一些實施例中，本揭露之組成物包含誘導或維持pH介於7.7與8.3之間之一或多種組分。在一些實施例中，本揭露之組成物包含誘導或維持pH介於7.9與8.1之間之一或多種組分。在一些實施例中，本揭露之組成物包含誘導或維持pH為8之一或多種組分。

在本揭露之組成物與細胞接觸之後，AAV2建構體表現基因或其部分，導致產生該基因或其部分所編碼之產物。在一些實施例中，細胞係目標細胞。在一些實施例中，目標細胞係視網膜細胞。在一些實施態樣中，視網膜細胞係神經元。在一些實施例中，神經元係感光受體。在一些實施例中，細胞係於活體內(in vivo)、體外(in vitro)、離體(ex vivo)或原位(in situ)。在一些實施例中，包括該些其中細胞係於活體內之實施例，接觸發生在向個體投予組成物之後。在一些實施例中，AAV2建構體表現基因或其部分，導致以治療有效的基因產物表現水準產生該基因或其部分所編碼之產物。在一些實施例中，基因產物係蛋白質。 批次配方

本揭露之組成物可以每批次介於1至1000小瓶之間(終點包括在內)的規模製造。在本揭露之組成物之一些實施例中，組成物、藥物物質或藥物產品可以每批次介於50至500小瓶之間(終點包括在內)的規模製造。在本揭露之組成物之一些實施例中，組成物、藥物物質或藥物產品可以每批次介於100至415小瓶之間(終點包括在內)的規模製造。

本揭露之例示性批次可包含介於0.01 mL與5 mL之間(終點包括在內)的本揭露之組成物、藥物物質或藥物產品。在一些實施例中，本揭露之批次可包含介於0.01 mL與1 mL之間(終點包括在內)的本揭露之組成物、藥物物質或藥物產品。在一些實施例中，本揭露之批次可包含介於0.1 mL與1 mL之間(終點包括在內)的本揭露之組成物、藥物物質或藥物產品。在一些實施例中，本揭露之批次可包含介於0.1 mL與5 mL之間(終點包括在內)的本揭露之組成物、藥物物質或藥物產品。在一些實施例中，本揭露之批次可包含介於0.25 mL與.35 mL之間(終點包括在內)的本揭露之組成物、藥物物質或藥物產品。在一些實施例中，本揭露之批次可包含約0.3 mL的本揭露之組成物、藥物物質或藥物產品。在一些實施例中，本揭露之批次可包含0.3 mL的本揭露之組成物、藥物物質或藥物產品。

在本揭露之用於製備藥物產品的方法之一些實施例中，藥物物質係在+35±2℃下解凍，且視需要以無菌配方緩衝劑稀釋成目標濃度(1.0×10^12 DRP/mL)。

在本揭露之組成物之一些實施例中，AAV2建構體藥物產品之目標最終DRP力價係1×10^12 DRP/mL，最小及最大可接受力價分別係0.8×10^12 DRP/mL及1.5×10^12 DRP/mL。AAV2建構體藥物產品係經無菌過濾且以每小瓶0.3 mL之體積填充至具有溴丁基橡皮塞之3 mL 2R第I型玻璃小瓶。接著將小瓶冷凍並儲存在≤-60℃下。在QP放行及運銷至試驗中心之前的產品標示及儲存方面，將藥物產品轉移至合格臨床運銷商。將藥物產品儲存在 ≤-60℃下的溫度監測冷凍器中直到QP放行及運銷。 組成物的儲存

在本揭露之組成物之一些實施例中，包括該些其中組成物包含藥物產品且組成物係以無菌小瓶供應之實施例，組成物可儲存在低於零度(℃)下。在一些實施例中，組成物可經解凍及冷凍而不喪失藥物產品之療效或無菌包裝的完整性。在一些實施例中，組成物可經歷多次解凍及冷凍而不喪失藥物產品之療效或無菌包裝的完整性。

在本揭露之組成物之一些實施例中，包括該些其中組成物包含藥物產品且組成物係以無菌小瓶供應之實施例，組成物可儲存在室溫下。 有機材料

用於製備本揭露之緩衝劑及培養基之起始材料經認證為不含動物來源材料。 藥典材料： 見表3。

非藥典材料 ：見表4。

表4.

CEP =歐洲藥典適用性證書 動物來源原料

胎牛血清係動物來源。這些原料的來源、製造商及用途係概述於表5。

表 5.

過濾器及層析基質

用於過濾藥物物質及藥物產品之過濾器係Sartopore 0.45 µm及0.2 µm過濾器。過濾器在購買時並非無菌，而是在合約製造商公司內部藉由高壓滅菌來滅菌。彼等係在3.2巴下藉由起泡點測試來測試完整性。

所有層析材料在使用前以檢驗證明書放行。購買預裝填管柱，且在使用前消毒。 AAV2 建構體藥物產品之製造方法 「原始製程」 ( 製程 1)

AAV2建構體藥物物質之例示性製造過程概覽係示於圖8。對應此製程之流程圖提供於圖9及10。圖8、9及10所述之製造過程可在本文中稱為「製程1」。

製程1之例示性變更提供於下表6。製程2之一些實施例可包括表6所述之變更。

表 6.

製程1(上游製程)的最佳化

製程1的起始材料係自發展細胞庫(DCB)之單一小瓶的HEK293細胞起始。此DCB係使用單一小瓶的ATCC HEK293細胞產生。CS10係用於培養HEK293細胞，但將此培養之規模從12 CS10增加至24 CS10以為後續同時執行之製程發展產製額外材料。程序以2 x 12 CS10進行直到轉導的時間點，此時在相同作業內處理24 CS10。

細胞培養容器及原料：表7強調用於二個不同製造過程的原料之間的關鍵差異且提供關於變更之任何重要性的備註。

細胞培養：用於改善製程之細胞來源係來自單一小瓶的DCB HEK293細胞。由於此與用於產生原始製程批次之庫不同，因此雖然ATCC細胞之原始來源相同，但培養規模增加(12 CS10至24 Cs10)且在細胞擴增期間使用不同來源的血清支持細胞生長，此階段據此調適。相較於原始製程產生批次的10次繼代，改善製程之預培養細胞生長包括8次繼代。此外，根據原始製程繼代後細胞密度可變，但根據改善製程則為固定。圖8繪示兩個試驗中心在細胞培養期製程的比較。

使用細胞密度測量值評估原始與改善製程之間的細胞生長。結果指示藉由改善製程產生的細胞生長較快。這可能潛在地歸因於不同血清來源及/或基於改善製程之固定接種密度的細胞繼代方案。對兩種製程而言，一旦細胞生長穩定之後，顯示族群倍增時間為20至30 hr(圖10)。

在製程2之一些實施例中，包括該些利用表7所列之原料(除血清以外)之實施例，細胞培養及/或細胞生長培養基包含下列或由下列組成：無血清培養基。

轉導：作為改善製程之一部分的轉導係使用與原始製程相同的方法執行。

細胞收集：根據改善製程，收集分成2次可代表原始製程(1x12 CS10)的12 CS10收集。在收集之後，使用PANDA裝置破壞細胞且判定載體力價。在改善製程期間使用的PANDA裝置與在原始製程期間使用的細胞破壞器的製造商不同(見下表8)，但具有在與原始製程的細胞破壞器相同的壓力下(80巴)執行細胞裂解的能力。

表8：在原始與改善製程中使用的細胞破壞設備比較

上游處理後的載體力價：來自1x2 CS10之上游製程載體材料的力價(6.4×10¹⁵ DRP/批次)(根據改善製程)與來自上游製程之相同規模所產製者(1.44×10¹⁵ DRP/批次)(根據原始製程)可相比。製程1(下游製程)的最佳化

自原始轉移至改善製程之下游製程係示於圖11。

實驗材料及原料：可能的話，在下游「改善」製程選擇使用與原始製程所使用者之相同的設備及原料及供應商。

下游表現：個別製程階段的觀察概述於下。

表 9 ：細胞破壞/裂解

表 10 ：冷凍/解凍步驟

表 11 ：澄清

表 12 ：濃度及滲濾

表 13 ：碘克沙醇梯度

*在原始製程期間，可在流份15%、25%及40%中目視觀察到雜質條帶(多個條帶)。然而，此特性並未在改善製程期間觀察到且只在40%流份中見到一個條帶。多餘條帶可連結至較高雜質含量。

肝素透析、滲濾及過濾步驟：從碘克沙醇梯度步驟到最終產品的產物係透明及無色。在這些步驟期間並無明確的非預期觀察。 「改善製程」 ( 製程 2)

一批產物係自由24個Corning 10層容器所組成之單一生產活動製備，該容器含有產生AAV2建構體生物產物之經質體DNA轉染的HEK293細胞。細胞塊及細胞培養基係自24個Corning 10層容器收集及彙集且隨後進行單一純化製程。自單一活動製備之一批產物預期可產生≥ 5× 10¹³ 個病毒粒子(vp；在本文中亦稱為載體粒子)的藥物物質。

AAV2建構體藥物物質之例示性製造過程概覽係示於圖1。對應此製程之流程圖係提供於圖2。在此實例中描述之製造過程可在本文中稱為「製程2」。

在製程2之一些實施例中，自24個Corning 10層容器收集及彙集之細胞培養基包含無血清培養基。在製程2之一些實施例中，自24個Corning 10層容器收集及彙集之細胞培養基由無血清培養基組成。細胞擴增及Corning Cell Stack接種

見圖2之對應以下提供之例示性製造過程的詳細說明之示意圖。

步驟1：解凍及接種用於產生AAV2建構體藥物物質之細胞。取決於所使用的細胞類型，以下的溫度、持續時間、離心速度及體積可經調整以得到最佳結果。就以下描述的例示性實施例而言，最佳化使用HEK293細胞的條件。

解凍HEK293細胞及接種至1個T75培養瓶：將一小瓶HEK293 MCB在37±2℃下解凍。將細胞轉移至含有9 mL冷生長培養基(含5% FBS之DMEM培養基)之15 mL試管。將小瓶以1 mL之生長培養基潤洗。將懸浮液在4℃下以300g離心5分鐘，丟棄上清液並將細胞懸浮於10 mL之預熱生長培養基。判定細胞密度並將細胞懸浮液轉移至含有10.5 mL之生長培養基之T75cm² 培養瓶以獲得20 mL的最終體積。將T75cm² 培養瓶轉移至在37±1℃、增濕之4至6% CO₂ 氣氛下的培育箱。解凍後24±4小時，將生長培養基置換成20mL之預熱生長培養基。

在解凍HEK293細胞及接種至1個T75培養瓶之步驟之一些實施例中，細胞係經轉移至含有9 mL冷生長培養基之15 mL試管。在一些實施例中，生長培養基包含下列或由下列組成：甘胺酸、L-精胺酸鹽酸鹽、L-胱胺酸二鹽酸鹽、L-麩醯胺酸、L-組胺酸鹽酸鹽-H₂ O、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸鹽酸鹽、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸二鈉鹽去水物、L-纈胺酸、氯化膽鹼、D-泛酸鈣、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸噻胺、i-肌醇、氯化鈣(CaCl₂ )(無水)、硝酸鐵(Fe(NO₃ )₃ "9H2O)、硫酸鎂(MgSO₄ )(無水)、氯化鉀(KCl)、碳酸氫鈉(NaHCO₃ )、氯化鈉(NaCl)、磷酸二氫鈉(NaH₂ PO4-H₂ O)及D-葡萄糖(右旋糖)。在一些實施例中，生長培養基包含下列或由下列組成：無血清培養基。在一些實施例中，生長培養基包含下列或由下列組成：澄清的培養基。

步驟2：擴增用於產生AAV2建構體藥物物質之細胞。取決於所使用的細胞類型，以下的溫度、持續時間及體積可經調整以得到最佳結果。就以下描述的例示性實施例而言，最佳化使用HEK293細胞的條件。

擴增1個T75培養瓶至1個T175CB或3個T75培養瓶：丟棄培養基並將細胞用預熱PBS洗滌。將細胞用TrypLE細胞解離試劑鬆動。使T培養瓶或Cell Stack在設定為37±1℃之培育箱中培養5至10分鐘並藉由溫和拍打容器使細胞完全脫壁。添加生長培養基以抑制TrypLE。用於不同支撐體之生長培養基、PBS及TrypLE的體積呈現在表14。接著彙集所有細胞懸浮液。

判定細胞計數及細胞存活性並根據表15將細胞接種、培養及繼代。

製程中管控(IPC)：細胞計數及細胞存活性

步驟3：擴增1個T175CB至4個T175CB或3個T75培養瓶至4個T175CB：見步驟2。

IPC：細胞計數及細胞存活性。

步驟4：擴增4個T175CB至8個T175CB：見步驟2。

IPC：細胞計數及細胞存活性。

步驟5：擴增6個T175CB至3個CS2CB：見步驟2。

IPC：細胞計數及細胞存活性。

步驟6：擴增2個CS2CB至3個CS10CB：見步驟2。

IPC：細胞計數及細胞存活性。

步驟7：擴增2個CS10CB至8個CS10CB：見步驟2。

IPC：細胞計數及細胞存活性。

步驟8：擴增8個CS10CB至24個CS10CB。見步驟2。

IPC：細胞計數及細胞存活性。質體DNA轉染

步驟9：轉染用於產生AAV2建構體藥物物質之細胞。取決於所使用的細胞類型，以下的溫度、持續時間、離心速度及體積可經調整以得到最佳結果。就以下描述的例示性實施例而言，最佳化使用HEK293細胞的條件。

使用聚乙烯亞胺(PEI)，將HEK293細胞以三個質體轉染。

依序添加特定比例的三個質體(pAAV.建構體-Kan、pHELP-Kan及pNLRep-Cap2-Kan)。

質體及PEI係用生長培養基製備。

所需之質體DNA的量呈現於表17。

將所需量的PEI混合物轉移至DNA混合物以形成PEI-DNA複合物，搖晃10秒並在室溫下培育。將PEI-DNA複合物轉移至8.2 L生長培養基中。將生長培養基及PEI-DNA複合物之混合物均質化，將PEI-DNA複合物瓶潤洗並將生長培養基及PEI-DNA複合物之混合物再次均質化。將培養基自CS10CB引流並將2L之生長培養基/PEI-DNA複合物混合物轉移至CS10CB。將經轉染的CS10CB轉移至設定在37±1℃、增濕之4至6% CO₂ 氣氛下的培育箱。

將轉染混合物留置在細胞上24±1小時且接著將培養基置換成DMEM Glutamax。

IPC：細胞計數及細胞存活性。

步驟10：收集用於產生AAV2建構體藥物物質之細胞。取決於所使用的細胞類型，以下的溫度、持續時間、離心速度及體積可經調整以得到最佳結果。就以下描述的例示性實施例而言，最佳化使用HEK293細胞的條件。

收集係在轉染後60±13小時進行。

產物藉由下列步驟收集： • 將一半的培養基轉移至收集袋。 • 振盪CS10CB並收集剩餘的培養基及細胞。 • 將200 mL的HBSS-EDTA轉移至CS10CB並在室溫下培養10分鐘。 • 培育時間結束時，將緩衝劑引流至收集袋。

對所有容器重複此收集製程。

在收集後，添加MgCl₂ 1M至最終濃度5 mM及添加benzonase核酸酶至最終濃度90 U/mL。

IPC：伺機病毒、生物負載、黴漿菌、物理力價(physical titre)。

步驟11：微流體法裂解。

將PANDA破壞器以最少3 L之Tris 20 mM、MgCl₂ 1 mM、NaCl 50 mM pH 8緩衝劑平衡。含有用benzonase核酸酶處理之收集物的袋子係連接至裂解總成。將產物以壓力80±10巴裝載在PANDA系統上並收集於新袋子中。在裝載產物後，將系統以2次200 mL之Tris 20 mM、MgCl₂ 1 mM、NaCl 50 mM pH 8緩衝劑潤洗。彙集兩次潤洗液與裂解產物。

IPC：物理力價

步驟12：benzonase核酸酶培育：

將微流體化細胞在室溫下培育Benzonase內切核酸酶活性隔夜達最大持續時間18小時。

步驟13：冷凍/解凍：

最終裂解步驟係在-15至-25℃下冷凍，隨後在室溫下解凍隔夜以促進細胞殘渣聚集以利澄清步驟。純化

步驟14：澄清微流體化裂解物。

過濾製程利用前過濾器(Sartopure GF 0.65 µm 0.4 m² )及隨後減少生物負載的過濾器(Sartopore 2, 0.2 µm, 0.2 m² )，並利用Tris 20 mM、MgCl₂ 1 mM、NaCl 50 mM pH 8緩衝劑沖洗。

IPC：Picogreen、物理力價

步驟15：大規模TFF濃縮及滲濾。

此製程使用切向流過濾(TFF)的原理達成體積減少及初始純化。體積減少可大至100倍。鹽及界面活性劑溶液(SSS，4.14 M NaCl +非離子界面活性劑)係以裂解物重量的1/10添加至澄清的裂解物。純化係藉由以20 mM Tris pH 8.0、1 mM MgCl₂ 、500 mM NaCl、0.1%非離子界面活性劑滲濾(100 kDa)濃縮物達成以「洗滌」樣本的較小分子量雜質。此部分係為了達成高濃度水準但無蛋白質/AAV粒子沉澱所必要。

IPC：物理力價、總粒子(ELISA)、完整/空粒子比例。

步驟16：碘克沙醇純化。

此製程係設計為使用四層不連續性碘克沙醇梯度(15%、25%、40%、57%)來純化rAAV。此正交純化步驟大幅富集含有DNA之rAAV粒子的製劑，同時移除大部分缺乏DNA之rAAV粒子(空粒子)，此係基於這些粒子在超離心之後在碘克沙醇梯度培養基中的差別浮力密度。含有DNA之rAAV的密度導致rAAV移動至40%碘克沙醇層，而大部分污染性細胞性蛋白質移動至25%/40%界面。具有蛋白質及DNA之rAAV的聚集可改變粒子的浮力密度，因此在15%碘克沙醇層中包括1M NaCl最小化此聚集。

分離係藉由經超離心之高g力處理之碘克沙醇(Optiprep 57%溶液)不連續性梯度達成。收集40%流份直到達到雜質條帶(約3mL)。

將所收集之流份彙集及儲存在+2/+8℃下直到後續純化步驟。

步驟17：稀釋：

純化步驟結束時所獲得的流份係以Tris 10mM，pH 9.0緩衝劑稀釋20倍以用於藉由陰離子交換層析法純化GMP批量G214/REP1/FC001。在藉由AVB親和性純化方面，純化(密度梯度)步驟結束時所彙集的流份係以20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl，pH為8緩衝劑稀釋6倍。

IPC：物理力價、總粒子(ELISA)、完整/空粒子比例、Picogreen

步驟18：陰離子交換層析法。

陰離子交換層析法係在室溫下執行，以 Unosphere Q (UnoQ)介質(Biorad)在14 mL/min流速之Tris 10 mM、NaCl 200 mM pH 9下裝填Vantage VL 11×250管柱(裝填體積約9.5 mL)。管柱首先經Tris 10 mM、NaCl 1 M pH 9緩衝劑且接著經Tris 10 mM，pH 9緩衝劑調理，以獲得pH等於pH 9.0±0.2且導電度等於Tris 10 mM，pH 9.0導電度±10%。

經稀釋的產物係過濾通過Sartoscale 0.2µm 17 cm² 過濾器。

將其裝載在管柱上且用平衡緩衝劑潤洗管柱。在Tris 10 mM、NaCl 45 mM pH 9緩衝劑第二次洗滌之後，將產物用最少30倍管柱體積之Tris 10 mM、NaCl 650 mM pH 9緩衝劑洗提。

洗提產物係儲存在+2/+8℃下直到下一步驟。

IPC：Picogreen、物理力價

步驟18：AVB Sepharose親和性層析法。

親和性層析法係在室溫下執行，以AVB Sepharose HP (GE Healthcare)裝填Vantage-L Vl22x250管柱(8±1cm床高度)，在Tris 20 mM、MgCl₂ 1 mM、NaCl 200 mM pH 8緩衝劑中裝填及沖洗且接著用H₃ PO₄ 0.17M、NaCl 1 M消毒30分鐘。在消毒之後，管柱以Tris 20 mM、MgCl₂ 1 mM、NaCl 200 mM pH 8緩衝劑平衡，接著裝載用Tris 20 mM、MgCl₂ 1 mM、NaCl 200 mM pH 8稀釋之產物(來自步驟16之彙集流份)。在管柱裝載之前，經稀釋的產物係過濾通過Sartoscale 0.2µm 17 cm² 過濾器。一旦完成裝載之後，用大約35倍管柱體積之Tris 20 mM、MgCl₂ 1 mM、NaCl 200 mM pH 8緩衝劑洗滌管柱且接著用大約20倍管柱體積之Na₂ HPO₄ 10.8 mM、檸檬酸44.6 mM、NaCl 400 mM pH 2.6緩衝劑洗提。在洗提之後，立即用大約4倍管柱體積之Tris 1 M pH8緩衝劑中和洗出液。

洗提產物係儲存在+2/+8℃下直到下一步驟。

IPC：Picogreen、物理力價。

步驟19：透析及最終配方。

此製程利用透析將AAV產物調配至所欲之最終配方緩衝劑(20 mM Tris，pH 8、1 mM MgCl₂ 、200 mM NaCl，可選地含有0.001%之泊洛沙姆)中。

洗提產物之切向流過濾係使用具有100 kDa分子量截留之中空纖維匣(Spectrum)進行。匣及系統係以Tris 20 mM、MgCl₂ 1mM、NaCl 200 mM pH 8緩衝劑平衡以在滲透(Permeate)側獲得pH8.0±0.2。

產物係濃縮至最小體積，之後以連續模式對最小6倍體積的配方緩衝劑進行滲濾。收集滯留物。用配方緩衝劑潤洗系統。將此潤洗液收集在不同容器中。

IPC：物理力價。

步驟20：次微米過濾經純化的主體藥物物質。

如果需要較長期儲存(＞60天)，則使用0.2 µm過濾器次微米過濾產物。一旦藥物物質完全過濾之後，用最終配方緩衝劑潤洗過濾器。

在QC取樣之後，經純化的主體藥物物質係儲存在＜-60℃下。 自藥物物質製造藥物產品之方法

本揭露提供數種自藥物物質(作為起始材料)製造藥物產品之例示性製程/方法。這些例示性方法中兩者係製程1(原始製程)及製程2(改善製程)。如本文所述，製程2包括對製程1的變更及/或改善。

在製程1及製程2中，藥物物質係經解凍、稀釋、無菌過濾及填充至直接包裝容器中。然而，改善製程(製程2)導入下列對原始程序的變更(製程中管控維持不變)： • 解凍溫度從室溫變更至+35±2℃ • 直接包裝從0.5 mL聚丙烯冷凍小瓶變更至3 mL第I型玻璃小瓶及溴丁基橡皮塞 • 每單一小瓶填充大小從0.1 mL/小瓶變更至0.3 mL /小瓶

本揭露之組成物可供應為液體。在本揭露之組成物之一些實施例中，包括該些其中組成物包含藥物產品之實施例，藥物產品係以無菌玻璃小瓶供應。在一些實施例中，無菌玻璃小瓶係無菌透明玻璃小瓶。在一些實施例中，無菌玻璃小瓶係以塞子加蓋。在一些實施態樣中，塞子係塑膠。在一些實施例中，無菌玻璃小瓶係加蓋且進一步以封緘封瓶。 製造過程的最佳化

在回顧原始製造過程(製程1)之後，識別出可改善未來臨床及商業產品品質及/或使製程更強健之機會且實施為製程2。所採取的製程發展活動分屬兩個類別：(1)製程變更；(2)製程最佳化。製程發展策略及原理之概述係提供於表18且各類別係於以下更詳細討論。

表 18 ：對製程1之變更的概述

MCB =種原細胞庫

簡言之，為了產製製程2，對產製MCB的細胞來源、三個質體的抗生素選擇基因、上游處理步驟的規模、轉導試劑、親和性層析法步驟及最終產品容器及密封做出變更。

HEK293 種原細胞庫

製程 1 ：用於產生第一臨床批次的MCB係自經AAV2產生最佳化之細胞產製。此細胞系就細胞如何最佳化及暴露動物來源材料方面之歷史的溯源性有限。

對製程 1 之變更： 寄存於ATCC(用於產製製程1之前驅細胞庫)之HEK293細胞原始小瓶係用於起始新的GMP MCB之製造。此MCB(現已經表徵及測試)係用於支持臨床AAV載體製造且可用於商業製造。細胞繼代數、所使用的材料、所遵循的方法及所執行的細胞庫特徵研究之完整溯源性提供增加對產品品質、溯源性及安全性的再保證。工作細胞庫係於後續在優良製造規範(GMP)的條件下自單一小瓶GMP MCB產製以形成GMP WCB。此WCB(現已經表徵及測試)可用於商業製造。細胞繼代數、所使用的材料、所遵循的方法及所執行的細胞庫特徵研究之完整溯源性提供增加對產品品質、溯源性及安全性的再保證。

遵照定義規程評估ATCC來源HEK293細胞的可相比性，藉此藉由基因體力價評估直接與原始 Stratagene細胞比較載體產生。載體力價係以三重複(in triplicate)評估且同時評估來自可相比繼代極限之細胞，包括低及高繼代兩者。亦評估細胞的生長動力學及存活性。此外，細胞用綠色螢光蛋白質(GFP)表現載體處理以評估轉導療效。

亦遵照與原始臨床批次相同的批次製造規程評估ATCC來源細胞作為完整規模非GMP工程改造運行與質體變更(見下)之組合的一部分。測試此批次完整的製程中管控測試、主體收集、藥物物質及藥物產品測試項目(生物負載、內毒素、無菌性及伺機劑(adventitious agents)除外)且與先前獲自臨床批次(原始製程)的相同測試結果比較。

一旦建立ATCC HEK293細胞的適用性之後，製備GMP MCB且測試完整的伺機劑、同一性、純度及安全性。GMP MCB經QA放行用於後續GMP製造。

載體質體

製程 1 ：三種用於產生AAV2建構體載體之質體建構體含有編碼安比西林抗性之基因，其係用於在質體產生期間選擇。雖然安比西林(一種β-內醯胺抗生素)並未使用於AAV2建構體載體之製造過程，移除AmpR係較佳的，因為可以避免來自質體產生製程之殘餘安比西林到AAV2建構體產生製程的任何留存效應之潛力且亦移除編碼安比西林抗性之基因存在於最終包裝產物的潛力。

對製程 1 之變更： 各質體經修飾以置換安比西林抗性基因成編碼康黴素抗性之基因。其餘質體骨架並未變更。在質體製造期間，用於質體選擇之安比西林可能留存到AAV2建構體產生製程且對具有β-內醯胺抗生素敏感性之患者構成潛在風險。此外，存在質體材料中之安比西林抗性基因最後可能被包裝至最終載體產物且理論上授予或轉移抗生素抗性給接受者。雖然認為任一風險的可能性低，但應理解可能的話應避免使用β-內醯胺。因此，產品的安全性輪廓藉由將AmpR置換成KanR來改善。

新的質體經完整定序且此定序提供只有抗性基因受到變更的確認。

評估使用新質體產生AAV2建構體的可相比性研究遵照定義規程進行。同時使用AmpR(舊)及KanR(新)質體兩者轉染HEK293細胞且藉由評估基因體力價來比較載體產生。執行三重複(Triplicate)測試並報告載體力價的比較。

在顯示可接受之力價之後，亦遵照與原始臨床批次相同的批次製造規程評估經修飾的質體作為完整規模非GMP產生運行與細胞變更(詳見上)之組合的一部分。測試該批次完整的主體收集、藥物物質及藥物產品測試項目(生物負載、內毒素、無菌性及伺機劑(adventitious agents)除外)且與獲自臨床批次(原始製程)的相同測試結果比較。一旦產製來自此技術運行之資料且認為資料可接受之後，實施適用於GMP產品製造之質體的製造。

肝素層析法

製程 1 ：親和性層析法管柱係用於選擇性純化AAV2建構體。管柱內使用之動物衍生性基質(例如肝素)可供應為適用於製造人治療性產品的GMP材料。雖然動物衍生性基質的來源、製造及供應從GMP及人用角度來看皆獲得認證，但使用任何動物衍生性原料仍有病毒安全性風險。

對製程 1 之變更： 替代地，探討非動物衍生性層析法基質作為現行填充動物衍生性基質(例如肝素)之親和性管柱的置換。起初根據改善製程在第一GMP批次使用離子交換層析法樹脂置換動物衍生性基質及後續導入非動物衍生性親和性層析法樹脂。實施此變更以達成減少與動物衍生性原料相關的生物安全性風險。

評估不同的層析法基質且適用性係基於最終產品的純度/雜質特性、力價及效力。

最終產品容器及容器密封

原始製程： 藥物產品係以每小瓶0.1 mL之體積填充至0.5 mL無菌聚丙烯旋蓋式墊片小瓶。

對製程 1 之變更： 將0.3 mL藥物產品填充至第1型硼矽酸玻璃注射小瓶，具有溴丁基塞子及捲縮(防破壞)小瓶封緘密封。實施此變更以達成改善最終藥物產品的完整性、改善使用期間的包護(containment)、改善一級容器產品接觸材料的醫藥可接受性、易於目視檢查及安全性(藉由防破壞封緘提供安全性)。

評估藥物產品在玻璃小瓶中的相容性係藉由產品回收及產品穩定性執行。

上游製程步驟的規模擴大

製程 1 ：將單一小瓶的HEK293 MCB透過連續繼代擴增及規模擴大至12個十層Cell Stack。

對製程 1 之變更： 將單一小瓶的HEK293 MCB透過連續繼代擴增及規模擴大至24個十層Cell Stack。實施此變更以達成增加上游製程的規模，以允許額外材料以供過程中測試及對照以及增加藥物物質體積以供測試及灌裝(fill finish)。另外，實施此變更以達成增加藥物產品可用性。

評估細胞存活性、生長速率及細胞產率分析以判定最佳及一致表現。

製程最佳化

原始製造過程的一些製程步驟就物理及化學定義而言維持不變；然而，進行進一步評估以改善製程理解及特徵且確保就製程一致性及強健性而言的最佳製程表現。

HEK293 細胞培養及擴增

製程 1 ：將單一小瓶的HEK293 MCB透過連續繼代擴增及規模擴大至12個十層Cell Factory。

製程最佳化： 連同細胞培養規模從12個CS10變更至24個CS10，執行研究以最佳化接種密度且評估生長動力學以得到最佳細胞培養表現。作業(非製程)變更係經最佳化以改善製程步驟的控制及再現性，以確保製程一致性及強健性。具體而言，此製程態樣經最佳化以從12個CS10增加到24個CS10以改善產率。

執行細胞存活性、生長速率及細胞產率分析以判定最佳及一致表現。

質體三重轉染及收集

製程 1 ：三種質體轉染HEK293細胞係在氯喹預處理細胞之後藉由磷酸鈣DNA沉澱執行。

製程最佳化： 最佳化轉染(包括細胞接種條件)，比較磷酸鈣及聚乙烯亞胺。最佳化質體濃度/比例。判定培養基交換及收集的最佳轉染後天數。作業(非製程)變更係經最佳化以改善製程步驟的控制及再現性，以確保製程一致性及強健性。自製程移除氯喹以改善安全性。

以小規模執行進一步最佳化，包括細胞接種密度、細胞生長的培養基、FBS濃度及DNA:PEI比例。一旦建立最佳化轉染製程之後，以完整規模使用PEI執行製程且與使用磷酸鈣之相同製程比較以顯示可相比性。

微流體法細胞破壞

製程 1 ：此製程使用微流體機來機械裂解細胞以增加細胞內病毒。

製程最佳化： 未執行此製程步驟的變更。發展研究著重於使用適合GMP製造及包護的衛生微流體機來最佳化及定義作業條件。作業(非製程)變更係經實施以改善製程步驟的控制及再現性且改善製程理解及特徵，以確保製程一致性及強健性。判定產物純度及載體力價製程中管控測試的一致性。

密度梯度超離心

製程 1 ：密度梯度純化以減少製程雜質。

製程最佳化： 由於現行梯度純化方法係手動，因此有可能造成製程變異性。在純化方法原理維持不變下，評估使此製程步驟更為強健且半自動化的機會。作業(非製程)變更係經實施以改善製程步驟的控制及再現性且改善製程理解及特徵，以確保製程一致性及強健性。判定產物純度及載體力價測試的一致性。

超過濾 (UF)/ 滲濾 (DF)

製程 1 ：緩衝劑透過UF/DF及透析交換。

製程最佳化： 涉及透過UF/DF及透析交換緩衝劑的各製程步驟係經最佳化以建立關鍵製程參數，同時為了產品品質確保接觸材料的可接受性。實施此變更以確保製程一致性及強健性、改善製程理解及特徵及確保產品接觸材料的適用性。評估病毒產率及雜質特性。 切換編碼抗生素抗性之質體

表現治療性建構體之AAV2建構體臨床載體係經由暫時轉導平台利用三種質體產生；含有治療性建構體/轉殖基因及啟動子和反向末端重複序列的載體質體、含有AAV2-rep及cap序列之AAV輔助質體及最後為編碼必需腺病毒基因E2A、E4及VA之輔助質體。所有根據原始製程產生之三種用於產生AAV2建構體臨床載體之質體含有安比西林(Amp)可選標誌。為了避免患者對殘餘安比西林的敏感性及理論轉移AmpR基因至最終載體的顧慮，質體經再工程改造以將Amp可選標誌序列交換成康黴素(Kan)抗性序列。執行完整定序以證實所有三種質體的其餘質體骨架維持相同。在小規模體外研究中評估這些質體產生rAAV的產率表現，以建立它們用於cGMP產生的適用性。此質體的實驗分析係經由與由先前用於產生AAV2建構體臨床載體之質體所組成的對照進行產率的頭對頭比較且描述於下。一旦在小規模體外研究中判定質體適用性之後，在完整規模、非GMP製程中評估KanR質體。 種原細胞庫細胞系的變更

從原始製程產生的AAV2建構體臨床載體利用HEK293細胞系(原始製程1)，該HEK293細胞系係由GMP機構衍生、測試及庫存自購自Stratagene的HEK293細胞系。此細胞庫係經完整測試及表徵，但沒有細胞庫的完整記載歷史。為了確保HEK293細胞的完整溯源性，新細胞係源自ATCC且評估其與原始製程1細胞的可相比性且用於GMP MCB產生。以頭對頭比較方式篩選三個細胞系(二個HEK293細胞系及一個293T細胞系)的下列參數以判定用於產生AAV2建構體載體之最佳細胞系：1)經由使用基於AAV之eGFP質體之GFP平均螢光強度及GFP百分比的一般轉導效率；2)經由DRP(DNA酶抗性粒子)分析評估AAV2建構體產率的AAV2建構體產物之特定轉導效率；3)藉由細胞計數及存活細胞百分比的生長動力學；及4)持續繼代且再測試產率及轉導效率以與較晚繼代之細胞比較轉導效率。改善 AAV2 純化層析法的強健性

原始第1/2期製造過程中的動物衍生性(例如肝素)親和性管柱步驟置換成非動物衍生性離子交換(AEX)管柱UnoQ，以改善潛在安全性顧慮(來自動物衍生性基質之伺機污染的潛力)。圖2顯示製程的流程圖，強調關鍵製程步驟及最終管柱層析法步驟(步驟18)。在最終UnoQ純化步驟之前，低鹽稀釋步驟減少導電度且支持AAV2建構體與管柱的有效結合。此階段成功表現可接受的鹽濃度(導電度)範圍顯示非常窄。如果導電度過高，則產物無法與AEX管柱結合且喪失在流出液中。如果導電度過低，則產物可能發生聚集導致在純化期間喪失產物。此影響產物產率及濃度且因此成功的批次(低產率批次)就支持臨床研究所需之材料而言將不可行。然而UnoQ步驟對產物療效或安全性沒有任何負面影響，正如使用此改善製程成功產生非臨床AAV2建構體批次及GMP批次所顯示。

為了處理在AEX之前必要的窄鹽範圍，評估替代性非動物衍生性親和性層析法管柱(來自GE Healthcare的AVB Sepharose)。在為了確保維持如下述之產物可相比性的全面發展期之後，將親和性管柱(具有動物衍生性基質)置換成AVB以製造後續的GMP批次。

AVB Sepharose係對腺相關病毒具有親和性的親和性培養基，其用於AAV2的純化以獲得高純度及產率產生。親和性配體係來自在酵母菌中表現之單鏈抗體的14 kDa片段。AVB管柱允許AAV2建構體的良好結合及洗提且可在較高鹽(導電度)下執行。因此，AVB管柱代表最小化產物喪失之強健製程步驟。AVB係非動物衍生性，因此其使用不構成安全性的伺機污染物風險。 本揭露之藥物物質的管控

例示性藥物物質係藉由表19所列之測試表徵。

表 19 ：

n/a：不適用

分析程序

物理力價：基因體力價係使用qPCR判定。此方法允許定量基因體拷貝數。用緩衝劑稀釋載體原液樣本。樣本經DNA酶處理且病毒殼體經蛋白酶K裂解以釋放基因體DNA。接著製作稀釋數列。使用對CAG序列具特異性之基於Taqman之引子/探針組，使各樣本的複製品經qPCR處理。取得標準質體稀釋數列的線性範圍中之各點的平均且將各點的對數拷貝數對平均C_T 值作圖以產生標準曲線。rAAV載體的力價可自標準曲線計算且表現為DNA酶抗性粒子(DRP)/mL。

感染單位(IU)力價：此測定定量AAV感染性粒子的數量。定量係藉由以載體樣本之連續稀釋及提供輔助功能的統一濃度之野生型腺病毒感染RC32細胞(表現AAV2 Rep/Cap之HeLa)執行。在感染後數天，將細胞裂解稀釋以減少PCR抑制劑且以與上述物理力價測定相同的方式藉由qPCR測定，不同的是省略DNA酶及蛋白酶K消化且僅執行qPCR部分。個別孔係評分為AAV擴增陽性或陰性。經評分的孔係用於使用Karber方法判定TCID₅₀ ，單位為IU/mL。

總粒子：測定使用ELISA技術(AAV2滴定ELISA套組)。將對經組裝的AAV2殼體上之構形表位具特異性之單株抗體包覆在微量滴定條上且用於捕捉來自樣品之AAV2粒子。經捕捉的AAV粒子係以二步驟偵測。首先抗AAV2之生物素接合單株抗體係與免疫複合物結合。在第二步驟中，鏈黴抗生物素蛋白過氧化酶接合物與生物素分子反應。添加受質溶液導致呈色反應，其與特異性結合之病毒粒子的量成正比。吸光度係在450 nm下以光度計測量。

完整:空比例(穿透式電子顯微鏡)：AAV2粒子的完整:空比例可使用負染色穿透式電子顯微鏡(TEM)判定。將樣本施加至固定網格。使用穿透式電子顯微鏡觀測樣本且基於完整(即含有DNA)及空AAV2殼體粒子的形態學執行計數。完整:空粒子的比例係自粒子計數計算。

完整:空比例(分析型超離心)：AAV2粒子的完整:空比例可使用分析型超離心(AUC)判定。AUC優於其他方法的優點在於非破壞性，意即樣本在AUC之後可回收進行額外測試。將包含空及完整AAV2粒子之樣本施加至液體組成物，在超離心期間AAV2移動經過該液體組成物。測量一或多個AAV2粒子的沉降速度提供關於AAV粒子的大小及形狀之流體動力學資訊。沉降平衡的測量提供關於AAV2粒子之溶液莫耳質量、化學計量、締合常數及溶液非理想性的熱力學資訊。在AUC期間獲得的例示性測量值係徑向濃度分布或「掃描」。在一些實施例中，掃描係以數分鐘(速度沉降)至數小時(平衡沉降)不等的間隔獲得。本揭露之方法的掃描可含有光學測量值(例如吸光度、干擾及/或螢光)。超離心速度可介於每分鐘10,000轉(rpm)與75,000 rpm之間(終點包括在內)不等。由於完整AAV2粒子及空AAV2粒子顯示不同的AUC測量值，因此樣本的完整/空比例可使用此方法判定。

載體同一性(DNA)：此測定提供病毒DNA序列的確認。測定係藉由消化病毒殼體及純化病毒DNA執行。可能的話，DNA係以前置及反置皆最小2倍覆蓋倍率定序(一些區域例如ITR難以定序)。DNA定序片段重疊係與預期序列比較以證實同一性。

總蛋白質：此測定藉由使用Micro-BCA套組定量存在測試物品中之蛋白質的總量。為了清除配方緩衝劑的基質效應，樣本係以丙酮沉澱且沉澱的蛋白質在分析之前以相等體積的水再懸浮。蛋白質濃度判定係藉由混合測試物品或經稀釋的測試物品與套組中提供的Micro-BCA試劑執行。相同者係使用牛血清白蛋白(BSA)標準之稀釋液執行。混合物係在60℃下培育且在562 nm下測量吸光度。標準曲線係使用線性回歸擬合自標準吸光度及已知濃度產製。未知樣本係根據線性回歸定量。

純度：此測定提供AAV純度的半定量判定。基於AAV2殼體粒子ELISA之結果，樣本係藉由SpeedVac濃縮並將4×10^10或1×10^11個粒子裝載至SDS-PAGE凝膠且分離殼體蛋白質。SYPRO Orange染色凝膠的密度測定法分析允許計算相對於殼體蛋白質(Vp1、Vp2及Vp3)之大約雜質水準。

複製勝任型AAV：在野生型腺病毒存在或不存在下，使用測試物品轉導HEK293細胞。將進行三次連續細胞擴增且在各擴增步驟萃取總基因體DNA。

rcAAV2係藉由即時定量PCR偵測。二個序列係單離的基因體DNA；一個對AAV2 Rep基因具特異性，一個對HEK293細胞之內源性基因(人白蛋白)具特異性。判定每個細胞之Rep基因的相對拷貝數。陽性對照係單獨測試或在rAAV載體製劑存在下的野生型AAV病毒血清型2。

測定的偵測極限在每個測試批次挑戰。偵測極限係測試樣本每1×10^8或1×10^10基因體拷貝數10個rcAAV。如果測試樣本係Rep序列陰性，則此樣本之結果將報告為：無複製，測試樣本每1×10^8(或1×10^10)基因體拷貝數＜10個rcAAV。如果測試樣本係Rep序列陽性，則此樣本之結果將報告為：複製。

HEK293宿主細胞蛋白質：HEK293宿主細胞蛋白質(HCP)測定係免疫酶測定。經純化的病毒樣本係於包覆親和性純化的捕捉抗體之微量滴定條中反應。二級辣根過氧化酶(HRP)接合酶同時反應，導致形成固相抗體-HCP-酶標示抗體之夾心式複合物。洗滌微量滴定條以移除任何未結合的反應物。HEK293 HCP的數量係藉由添加3,3’,5,5’四甲基聯苯胺過氧化酶(一種HRP之受質)至各孔偵測。在板讀取儀上讀取經水解的受質之量，其係與存在之HEK293 HCP的濃度成正比。

總DNA：Picogreen試劑係與雙股DNA結合且形成高度發光複合物之超敏感螢光核酸染色(λ激發=480 nm-λ發射=520 nm)。此螢光發射強度與溶液中的dsDNA數量成正比。使用具有已知濃度之DNA標準曲線，測試樣本中之DNA含量係藉由轉換測量螢光獲得。

HEK293宿主細胞DNA：原始製程測量3種不同擴增子之大小及數量，然而改善製程測量總hcDNA，包括高分子量及剪切DNA。改善製程之定性資料顯示測定具特異性且足夠敏感可符合評估每劑量hcDNA ＜10 ng/劑量之需求(WHO生物製劑標準化專家委員會，2013年)。

殘餘BSA：殘餘BSA使用市售ELISA套組(Bethyl製造及銷售)定量。該ELISA套組之科學原理非常類似於宿主細胞蛋白質ELISA所指明者。

殘餘Benzonase核酸酶：此測定使用對 Benzonase內切核酸酶具特異性之經純化的多株抗體，藉由夾心式ELISA偵測測試樣本中的殘餘Benzonase核酸酶。藉由比較樣本信號與在同一時間測定之Benzonase內切核酸酶標準達成正確測量。

生物負載測定：此程序用於定量判定(如果可偵測)存在於樣本中之生物負載的量。使用之方法涉及用二個膜各自膜過濾一半的樣本。將膜放置在分開的瓊脂培養基板上，將板依序在需氧及厭氧條件下在20-25℃及30-35℃下培育。在培育結束時，需氧菌、厭氧菌及真菌計數表現為CFU/樣本mL。

內毒素：此測定係用於判定細菌內毒素是否存在測試物品中。定量程序係藉由動力學-顯色方法執行。已知量的內毒素係與測試物品平行測試，以正確判定細菌內毒素的水準。測試物品干擾潛力係藉由以指明水準的內毒素加藥測試物品加上LAL試劑檢查。在抑制/增強測試之後，判定測試物品之內毒素含量。

殘餘AVB：殘餘AVB分析係使用商用ELISA套組CaptureSelect™ AVB Sepharose HP Ligand Leakage ELISA(Life Technologies製造)執行。夾心式ELISA原理涉及使用抗親和性配體多株山羊抗體包覆微量滴定板以捕捉存在於樣本中之AVB。偵測係經由生物素化親和性純化的抗AVB配體多株山羊抗體及鏈黴抗生物素蛋白辣根過氧化酶接合物。樣本中的殘餘AVB濃度係藉由標準曲線測量判定。 AAV 組成物之穩定性

本揭露之組成物當儲存在＜-60℃下時維持長期穩定性。例如，當儲存在介於-80℃與40℃(大約人體溫度)之間(終點包括在內)的溫度下，本揭露之組成物維持長期穩定性。例如，當儲存在介於-80℃與5℃之間(終點包括在內)的溫度下，本揭露之組成物維持長期穩定性。例如，當儲存在-80℃、-20℃或5℃下，本揭露之組成物維持長期穩定性。在一些實施例中，本揭露之組成物係調配為液體或懸浮液、等分至一或多個容器(例如小瓶)且儲存在＜-60℃下。在一些實施例中，本揭露之組成物係調配為液體或懸浮液、等分至一或多個容器(例如小瓶)且儲存在 -80℃、-20℃或5℃下。

當儲存在＜-60℃下，本揭露之組成物可以最佳表面積對體積比例提供於容器中以維持長期穩定性。當儲存在-80℃、-20℃或5℃下，本揭露之組成物可以最佳表面積對體積比例提供於容器中以維持長期穩定性。在一些實施例中，本揭露之組成物係調配為液體或懸浮液、等分至一或多個容器(例如小瓶)且當考慮所有儲存規定以盡可能大的表面積對體積比例儲存在一或多個容器中。

當儲存在環境相對濕度下，本揭露之組成物維持長期穩定性。 臨床劑量設計

無脈絡膜症(CHM)是一種遺傳性X性聯視網膜失養症，最早在19世紀描述。編碼REP1之CHM基因的刪除或突變導致脈絡膜、RPE及視網膜的退化。無脈絡膜症的特徵在發病男性中為進行性脈絡膜視網膜退化，在帶因女性的徵候則較輕。發病男性的症狀可從夜盲演變成周邊視野喪失，中央視力保留直到生命晚期。雖然帶因女性通常無症狀，但可利用仔細眼底檢查觀察到脈絡膜視網膜退化之徵候。這些徵候在十歲之後變得比較明顯可見。

CHM係由CHM基因(Xq21)的突變造成，該基因編碼Rab香葉草基-香葉草基轉移酶的組分A，稱為REP1。REP1係細胞內移動所必要，因此為正常視網膜功能所必需。當REP1缺乏時(如同CHM患者的情形)，視網膜色素上皮、感光受體及脈絡膜逐漸喪失功能及萎縮，最終導致眼盲。在發展本揭露之醫藥組成物之前，CHM無治療可用。

使用腺相關病毒(AAV)載體之視網膜基因療法給藥涉及計算可能給予終生效應之單次劑量。在傳統的全身性藥物給藥中，藥物的半衰期係在血液中測量且決定了一天當中重複劑量投予的頻率，以使尖峰水準無毒性且谷底水準足以維持藥效動力學活性。在傳統給藥方案中，使用健康志願者以得出藥物廓清且因此計算藥物半衰期是有可能的，藉此可估計必要血漿水準以計算投予的劑量及頻率。可作出調整，例如在肝衰竭情況下，經由肝臟代謝的藥物給藥可減少。在小兒病例中，給藥可根據體重調整以適合較小的血液體積及目標器官。這些主動滴定劑量的傳統方法對於眼科基因療法投予帶來挑戰，因為在本揭露之醫藥組成物的治療方法及用途之較佳實施例中，治療的目標係僅給與一個將達成終生治療效應的劑量。

在本揭露之方法之一些實施例中，醫藥組成物係經由視網膜下注射向眼投予以靶向RPE及感光受體細胞層。作為視網膜下注射手術程序的一部分，玻璃體切除術係在視網膜下注射之前在所欲治療之眼執行。此玻璃體切除術之後為視網膜下輸注平衡鹽溶液以形成半球狀泡。在本揭露之一些實施例中，半球狀泡的面積係大約10 mm² 或半球狀泡的面積係10 mm² 。在本揭露之一些實施例中，本揭露之醫藥組成物係調配為最終體積0.1 mL且經注射至預形成之泡，允許醫藥組成物自行均勻分布在視網膜表面(例如10 mm² 的視網膜表面)。因此，在該些其中形成半球狀泡以供注射醫藥組成物之實施例中，泡促進組成物之完整rAAV均勻分布在視網膜的RPE細胞層。在注射醫藥組成物之後，泡在手術後數小時內消失。

玻璃體切除術/視網膜下手術的潛在併發症係手術後立即減少視敏度(VA)。另一潛在及較長期的併發症係形成白內障。這兩個因素皆影響執行VA測試時的視力，因此當判定劑量範圍結果時，特別是當VA係有效劑量判定的單獨預測因子時，將考量這些因素。

選擇基因療法試驗中的適當劑量與傳統評估劑量範圍的方式不同。目標係投予已知為安全之可能的最高有效劑量。這麼做的主要原因是事實上視網膜感光受體的感染複數(MOI)非常高，大約是每視網膜細胞10⁵ 個基因體粒子(gp)。有鑑於此，在一些實施例中，及取決於所欲治療之個別受試者的生物學，可治療之視網膜的最大面積係大約10 mm² ，且可治療之視網膜區域在黃斑部周圍，此區域中之桿狀細胞、錐狀細胞及視網膜色素上皮(RPE)細胞總數相當於大約1×10⁶ 個細胞，研究(描述於實例13)中之低劑量研究世代(10¹⁰ gp)僅提供1×10⁴ gp之MOI，而相同研究中高劑量組(10¹¹ gp)提供1×10⁵ gp之MOI。

實例13提供第I/II期資料。本研究之高劑量(10¹¹ gp)已顯示安全及有效。在某些實施例中，類固醇療法方案可用於處理受試者對醫藥組成物之AAV的任何免疫反應。如實例13所述，一劑10¹¹ gp之本揭露之醫藥組成物導致10⁵ gp較佳範圍的MOI。 評估無脈絡膜症的治療劑量

要測量的一個參數是視力功能的改善。此假設視力功能參數受到遺傳缺陷的不良影響且可能因此可逆至某種程度，因此在成功基因轉移之後可測量改善。在治療CHM之方法之一些實施例中，測量之視力功能參數包括但不限於視敏度(VA)、視網膜敏感度及暗適應視力測量值。然而，對一些受試者而言，取決於缺陷的嚴重性及退化階段，一些上述視力功能參數可認為正常。在本揭露之治療方法之一些實施例中，受試者的視力功能參數在治療之後改善且改善導致的視力功能參數測量值等於該些獲自未接受治療之健康受試者(未罹患CHM)的測量值。在一些實施例中，健康受試者係例如年齡相符個體，以考慮與CHM無關之天然年齡相關視力惡化。再者，由於男性及女性的色視覺敏度可有所不同，因此在一些實施例中，健康受試者係具有相同XY染色體組成之個體。在本揭露之治療方法之一些實施例中，包括該些其中受試者已經歷顯著視網膜傷害(神經元喪失)或其中視網膜之未受影響區域小及/或不連續之實施例，可能無法預期完整視力功能恢復。在該些其中僅部分恢復係可能之實施例中，視力功能的改善當與受試者之基線功能(在投予醫藥組成物之前對此受試者及治療眼評估之功能)比較時，該改善可為明顯。即使在其中僅部分恢復係可能之實施例中，治療提高眼的基線功能及受試者的視力功能，以使CHM及/或年齡相關視網膜退化延緩或減少，藉此延長受試者可用視力的生命期。 目標區中視網膜細胞的解剖學密度

為了計算活體內臨床治療的MOI，判定載體粒子總數及所欲治療之區域中的目標細胞數量。這些數量取決於暴露至載體的視網膜面積及該區域中各不同細胞類型的密度。

本揭露之醫藥組成物係在誘導視網膜剝離之後經由視網膜下注射向CHM患者投予。例如，如果假設視網膜剝離具有大約2至3個盤直徑的線性尺寸，則此視網膜剝離的區域相當於直徑3-4 mm的圓或大約10 mm²的面積。

本揭露提供例示性細胞性密度以用於例示性劑量計算，然而本揭露之醫藥組成物的劑量不受限於這些例示性計算。在中央黃斑部，正常人受試者的RPE細胞密度係每mm² 5,000個細胞(基於40至50歲年齡組患者的死後研究)。在中央黃斑部，正常人受試者的桿狀細胞密度係每mm² 75,000個細胞，但排除大約0.5 mm² 的中央小窩區。在中央黃斑部，正常人受試者的錐狀細胞密度係在中央0.5 mm² 小窩每mm² 150,000個(總共75,000個)+小窩區以外的黃斑部每mm² 25,000個。因此，在本揭露之基於這些例示性細胞密度之一些實施例中，在標準10 mm² 剝離中暴露至本揭露之醫藥組成物之rAAV的三種細胞類型中各者之總數可自上述計算如下：(a)RPE：每mm² 5,000個細胞，在10 mm² 中總共=5×10⁴ 個；(b)桿狀細胞：每mm² 75,000個細胞，但排除中央0.5 mm² 小窩，在10 mm² 中總共= 7.1×10⁵ 個；及(c)錐狀細胞：在中央0.5 mm² 小窩中每mm² 150,000個細胞(75,000個)，但小窩外僅每mm² 25,000個，在10 mm² 中總共=3.1×10⁵ 個。RPE、桿狀細胞及錐狀細胞密度在黃斑部的中央10 mm² 中不同且有約一個對數單位的差異，其中最低密度(及因此最高MOI)見於RPE。縮寫表

實例實例 1 ：原始及改善過程之比較分析測試資料

除非另外說明，否則提供來自原始製程之樣本用於改善製程之資料分析，使得資料可使用相同方法(當適用時)自兩組批次產製，以允許直接相對比較所產製之資料。針對以下提供之資料，測量值係取自一或多批AAV2建構體，其中所有批次之建構體係相同。

分析藉由改善製程產製之中間產物的物理力價(qPCR)、總蛋白質(Micro-BCA)、總DNA (Picogreen)及純度(SDS-PAGE/Sypro Orange染色)。

來自原始製程之樣本的基因體力價資料係取自所提供的測試文件。

本文呈現之來自原始製程中中間樣本之總蛋白質及總DNA資料係根據改善製程自原始製程產生之起始材料產製。

用於判定完整對空粒子比例之電子顯微鏡(EM)分析在製程自原始轉移至改善製程時尚未完整建立。原始製程不涉及在製造之時的任何測試以判定臨床批次內的完整對空粒子比例，也不評估純化(密度梯度)步驟或測量最終藥物產品，因此無法取得資料進行改善製程與原始製程之純化(密度梯度)製程步驟的比較。因此，完整對空粒子比例不是用來作為可相比性的評估。相反地，藉由qPCR測量之物理力價(或基因體粒子)判定被視為成功轉移整個製程及成功轉移個別製程步驟的合適判定，因為此具有載體產物特異性且因此代表完整殼體。然而，對於原始製程而言，基於分析型超離心(AUC)之方法係用於評估僅供參考之完整對空比例。此測試之結果係呈現於表33。

EM係較佳方法且已在所有到目前為止製造的批次上執行。此外，回溯性使用EM分析以測試來自原始製程的兩個批次以給出完整對空比例的了解。此測試顯示改善製程能夠產製可相比的完整對空殼體比例(如表20所示)。

表 20 ：電子顯微鏡分析

* 無DS可用於測試。在DP上執行的測試僅供參考，然而藥物物質與藥物產品之間的處理有限，因此我們相信此可代表藥物物質的結果。 ** 注意此值稍微高於預期。根據改善製程，在此批次觀察到較高比例的空粒子似乎是因為在流份收集/選擇完整殼體期間自離心管移除較大體積的材料之作業操縱所致。在未來批次實施矯正行動以處理此問題，且在此次探討之後製造的批次2具有預期降低數量的空殼體。

起始材料及參考材料(兩者皆來自原始製程)之分析結果係總結於表21中。

改善製程所產生的收集材料比起原始製程所產生的收集材料含有較高的總蛋白質濃度。然而，原始與改善製程之間最終藥物物質的純度特性類似，並無偵測到大量雜質。原始與改善製程之間的回收力價也類似。

關於定義成功技術轉移製程的接受標準，改善製程受到控制且改善製程之個別製程步驟的表現類似於原始製程期間所觀察到的表現。改善製程之製程回收(載體力價)係原始製程所獲得之回收的20%以內。改善製程之最終產品純度(DNA/蛋白質含量)係原始製程所獲得之純度的20%以內，具有類似的SDS-PAGE特性。實例 2 ：製造過程的最佳化

針對以下提供之資料，測量值係取自一或多批AAV2建構體，其中所有批次之建構體係相同。

質體三重轉染及收集

執行載體力價產率分析。比較聚乙烯亞胺(PEI)轉染試劑與磷酸鈣(用於製程1)以判定前者是否可用於置換磷酸鈣作為更強健的轉染試劑。亦評估氯喹預處理的需求。所有參數藉由使用未經驗證方法藉由qPCR判定物理力價來評估。

表22呈現初始結果，其中在用PEI轉染之後的載體力價直接與使用磷酸鈣所獲得之力價比較，包括氯喹存在及不存在下的情況。所有研究係以含有Glutamax之DMEM培養基執行，此係所有上游製程步驟使用的培養基。

表 22 ：比較轉染試劑-物理力價

此實例顯示使用PEI成功轉導，雖然相較於使用磷酸鈣轉染具有較低物理力價結果。此實例亦顯示當使用PEI作為轉染試劑時，氯喹預處理沒有必要且可自製程移除。

基於此結果，以小規模執行進一步最佳化，包括細胞接種密度、細胞生長的培養基、FBS濃度及DNA:PEI比例。一旦建立最佳化轉染製程之後，以完整規模使用PEI執行製程且與使用磷酸鈣之相同製程比較以顯示可相比性。

表23顯示獲自完整規模製造之資料，其顯示PEI作為轉染試劑之適用性及可相比性。基於此資料，選擇PEI作為首選轉染試劑以允許相較於磷酸鈣更強健的製程步驟。

表 23 ：比較完整規模製造中的轉染試劑-物理力價

另外，改善製程所產生之批次的整體生產量及製程產率與原始製程所產生者可相比(表24)，顯示PEI作為轉染試劑之適用性。

表 24 ：整體生產量及製程產率的比較-來自原始及改善製程之批次

實例 3 ：切換質體編碼之抗生素抗性 -從 AmpR 至 KanR

研究材料及程序

用於產生藉由原始製程所產生之臨床批次的含有安比西林之質體作用為就DNA酶抗性粒子(DRP)/cm²方面分析AAV2.建構體載體產率的對照。實驗係自相同的細胞解凍事件執行，且所有細胞在整個實驗接受相同處理、培養基、試劑及生長條件。

測試之質體 ：pAAV.建構體(KAN)； pNLREP-CAP2 (KAN)； pHELP (KAN)； pAAV.建構體， CN1055CM(原始製程；Amp版本，用來作為對照組)； pNLREP-CAP2，CN1054CM(原始製程；Amp版本，用來作為對照組)；pHELP，CN2291CM(原始製程；Amp版本，用來作為對照組)。

各組質體皆執行三重複(triplicate)測試。三個1-Stack係經pAAV.建構體(KAN)、pNLREP-CAP2(KAN)及pHELP (KAN)轉染。三個1-Stack係經等效含有AmpR之質體轉染。細胞在轉導後16至26小時再餵養，並在轉導後44至52小時收集培養基及細胞，且判定各1-Stack之DRP產率。

結果

經由qPCR判定測試之3複製品的平均DRP /cm² 。分開分析培養基及細胞裂解物兩者之產率，接著相加以判定每複製品之總載體產率，接著除以平方公分數。

用於製造藥物物質及藥物產品之再工程改造(Kan)質體的接受標準定義為不小於對照質體產率的四倍。再選殖Kan版本的質體符合接受標準。基於所獲得之類似的DRP產率及序列確認，含有KanR之質體被認為適合用於產生臨床批次的AAV2建構體。實例 4 ：種原細胞庫細胞系變更成 ATCC HEK -293

研究材料及程序

用於藉由原始製程產生GMP批次的原始製程1細胞系作用為轉染效率及AAV2建構體載體產率的對照。持續繼代及再測試產率及轉染效率先前未針對原始製程1使用的細胞評估且測試係僅供參考。轉染效率、產率分析及生長動力學的實驗係自相同的細胞解凍事件執行，且所有細胞在整個篩選實驗接受相同處理、培養基、試劑及生長條件。

測試之細胞系 ：ATCC=[HEK-293](ATCC^® CRL-1573TM)；Bioreliance=293細胞(G95001 2)，製程1細胞系；及293T=293T/17 [HEK 293T/17](ATCC^® CRL-l 1268TM)。值得注意的是，包括293T細胞系作為替代來源。

針對轉染效率及產率分析，單層的各細胞系係經相關質體轉染且在轉染後16至26小時再餵養。在轉導後44至52小時收集細胞及培養基以進行GFP或AAV2建構體DRP分析。

生長動力學藉由以10^7或2.5×10^6個細胞/培養瓶接種T175培養瓶評估，且在接種後1、2、3、4及7天記錄細胞健康、長滿率、細胞計數及存活性。此於≥15之繼代重複。

結果

平均螢光強度 ：平均螢光強度係經由流動式細胞測量術分析以測量GFP蛋白質表現水準加上經轉染的細胞數量作為與病毒產率相關之整體基因表現的指標。

GFP 百分比： 藉由流動式細胞測量術所判定之GFP陽性細胞百分比係顯示於圖13及14。

AAV2 建構體產率分析： 產製DRP力價測定結果以進行各處理(1-Stack)所收集的細胞+培養基中按照qPCR分析之AAV2建構體產率的頭對頭比較分析。

適用於臨床製造之細胞系的接受標準視為每處理不大於對照組(原始製程1細胞)四倍的差異。實驗1 (Exp1)在細胞繼代7進行及實驗2(Exp2)在繼代15進行。

生長動力學： 生長動力學係藉由記錄以兩種密度同時接種之T175培養瓶在接種後1、2、3、4及7天之細胞計數及存活性評估。各實驗係由二個連續繼代之複製品組成。實驗1在繼代7進行且在繼代8自解凍重複。實驗2在繼代15進行且在繼代16自解凍重複。存活細胞的數量及百分比係由台盼藍染色判定。

所有四個細胞系以與預期基於先前相對於相關產率分析之經驗為良好轉導效率一致之水準表現GFP。二個來自ATCC、HEK293(CRL-1573)及293T(CRL-11268)之細胞系自解凍展現良好細胞生長及擴增。值得注意的是，Bioreliance細胞系具有較慢初始生長及擴增，其整體細胞健康相對於其他細胞系及對照組較差。兩個實驗中Bioreliance細胞系也無法符合產率在對照組四倍以內之接受標準，其中兩種ATCC細胞系皆在最小接受標準以內。

為了進一步產生AAV2建構體載體，基於以上呈現之本揭露之製造過程的例示性實施例結果，選擇ATCC細胞系HEK293 (CRL-1573)。實例 5 ：製造過程之分析發展

作為自原始轉移至改善製造過程之策略的一部分，平行發展分析策略。可能的話，將原始製程發展之方法轉移至改善製程或下一代製程。

表 29 ：分析方法摘要

NA =不適用

原始及改善的rcAAV測定皆利用人胚胎腎細胞(HEK293)，該細胞經AAV2建構體稀釋感染或經野生型(wt)AAV感染作為對照組。細胞接著經腺病毒血清型5 (Ad5)共感染以提供rcAAV之輔助功能(如果存在的話)。最大細胞病變效應(CPE)為細胞裂解。此構成載體之繼代0 (P0)的結束。在繼代1(擴增1)中，使用一部分P0裂解物接種共感染Ad5及不共感染Ad5之HEK293細胞。不具Ad5之細胞作用為判定輸入細胞之DNA水準，而具有Ad5之細胞允許rcAAV2建構體或對照組之wt AAV的擴增。在原始測定中，當Ad5陽性樣本在第一擴增之後達到最大CPE時，細胞藉由PCR分析。在改善測定中，細胞裂解/擴增步驟在PCR分析之前總共執行3次。

測定經驗證為改善製程之極限測試。原始臨床或工程改造批次皆未被分析作為此驗證之一部分，因此直接比較所獲得之結果是不可能的。原始測定未經驗證。總結來說，二種方法提供無顯著差異之結果。

原始及改善製程之hcDNA測量皆在Taqman儀器上使用qPCR。原始測定測量三種不同擴增子(102、401及765 bp)，其中各擴增子之敏感度(LOD)為20 pg/mL。改善製程所使用之測定具有單一擴增子且敏感度(LOQ)為1.3156 ng/mL。並未進行方法的頭對頭比較，然而，hcDNA方法後續符合資格且顯示適合目的。因此，對於可相比性評估並無不利衝擊。

原始製程使用市售ELISA套組(Bethyl Laboratories, Cat # E10-113)測量殘餘BSA。此原始製程使用套組之敏感度係12.6 ng/mL。市售ELISA套組(α Diagnostics Cat# 8100)係用於改善製程。此套組未經驗證但敏感度係定義為最低校正標準，即1 ng/mL。兩種套組所使用之一級抗體的製造商斷言該一級抗體特異性偵測人BSA。並未進行方法的頭對頭比較；然而，到目前所測試之所有批次皆顯示非常低水準的殘餘BSA(低於方法的敏感度)。

因此，結論是所有批次含有可相比之低水準的殘餘BSA。

此外，由於BSA可造成人的過敏反應，世界衛生組織(WHO)訂定每劑疫苗50 ng或更少殘餘BSA之準則。例如，以一劑100 µL之AAV2建構體而言，BSA之濃度極限將為500 ng/mL。原始及改善製程中使用的兩種ELISA套組測定皆具有低於此規定極限之敏感度水準，因此被認為在可接受之極限內測量殘餘BSA是可相比的。

感染力價

感染力價測定係自原始製程轉移至改善製程。測定的細胞培養部分及PCR皆作為此轉移的一部分遵照原始製程所使用的程序執行。AAV2建構體(非GMP)(藉由原始製程)在測定轉移期間的3個場合分析且所獲得的結果與感染力價2.90×10¹⁰ IU/mL比較。所獲得的結果提供於表30。

表 30 ：感染力價測定

獲自測定轉移研究之資料並無顯著差異，即在獲自原始製程的結果之4倍範圍以內。

原始製程所產生之AAV建構體(非GMP)根據改善製程在3個場合分析，且相對於報告力價(4.95× 10^12 DRP/mL)(原始製程)之結果提供於表31。如果在根據原始製程報告的結果之3倍範圍以內，則資料被視為可接受。

表 31 ：物理力價測定-可相比性資料

測定後續經驗證且獲得表32中之AAV建構體(非GMP)(來自原始製程)材料的額外值(僅1000及10,000倍稀釋結果)。

表 32 ：AAV建構體(非GMP)(原始製程)之物理力價結果(測定後驗證)

AAV2建構體(非GMP)材料(來自原始製程)係例行地在DS及DP樣本分析中分析作為內部參考對照(一級參考)，其中系統適用性接受標準設定為在標稱力價(4.95 ×10^12 DRP/mL)(藉由原始製程判定)的3倍差異以內，以確保方法的持續可比較表現。實例 6 ：改善製程所產製之組成物的比較

為了顯示製程變更/最佳化(變更製程1以產製製程2)並未影響所產生之載體材料的關鍵品質屬性，執行可相比性評估。

一旦對細胞、質體、轉染條件、親和性層析法管柱、規模及最終容器進行製程變更，且關於製程1之最佳化工作已完成之後，即定義製造臨床第3期材料的新製程且執行完整規模「工程改造」批次以測量製程表現及藥物物質及藥物產品與藉由原始製程所產生之材料的等效性。

以下分析比較改善製程之完整規模工程改造批次及GMP批次所產製的資料與原始製程所產製之工程改造批次及臨床材料。

對原始製程所產生之工程改造批次(AAV2建構體(非GMP))執行額外測試(見下表33)以提供與改善製程所產生之工程改造批次的比較資訊。

表 33 ：原始及改善製程所產生之AAV2建構體(非GMP)批次的比較

^Ⱡ 在藥物產品(最終容器)上執行之測試^{ⱡ ⱡ} 藉由分析型超離心、非電子顯微鏡執行之測試 *在經純化的主體(藥物物質)上執行之測試 **使用GMP分析執行之測試 ***所報告之物理力價係根據原始製程執行 ****根據改善製程在驗證研究中分析

額外分析資訊及資料

物理力價 ：填充藥物產品臨床材料(GMP產品)之目標物理力價係1×10^12 DRP/mL(藉由原始製程產生)。就原始製程所製造之工程改造批次(非GMP產品)而言並無目標力價，且AAV2建構體(非GMP)代表若此批次進展為藥物產品將被稀釋成目標填充濃度的藥物物質。就改善製程所產生之AAV2建構體(非GMP)而言，目標濃度係1-2×10^12 DRP/mL。AAV2建構體(非GMP)之報告力價1.87×10^11 DRP/mL低於預期，但這是因為最終切向流超過濾步驟(TFF2)中之最小佇留體積限制最終藥物物質可濃縮的程度。具體而言，此不完全濃縮導致該批次為6倍不濃縮。如果物理及感染力價經此6倍稀釋校正，則批次之間的物理力價、感染力價及物理:感染力價比例類似，如表34概述。評估使用較低佇留體積(較小)之TFF匣以達成較高濃縮係數。

純度： 純度係藉由Sypro Orange染色之還原SDS聚丙醯胺凝膠電泳分析測量。圖16顯示改善製程所產生之AAV2建構體(非GMP)批次產製的純度特性。資料顯示存在3個病毒殼體(VP1、VP2及VP3)蛋白質，且未偵測到額外雜質。

建構體蛋白質表現： 在導入建構體蛋白質表現的定量測定(經由ELISA方法)之前，使用定性非GMP測定執行初步分析。以下描述之此基於細胞的體外測定能夠在人細胞系中測量建構體表現及經表現的建構體之生物活性。該測定具有3組分： • 細胞培養及病毒載體轉導 • 用於偵測建構體蛋白質表現之西方墨點轉漬法 • 用於偵測建構體蛋白質活性之測定

細胞培養係使用HEK293細胞執行，該細胞經已知及可相比物理力價之AAV2建構體載體轉導。這些細胞以低於此測定中所偵測之水準或極限表現建構體蛋白質，允許因為AAV2建構體載體的細胞轉導及表現所致之建構體蛋白質表現增加的比較性定性評估。在轉導及培育之後，收集細胞裂解物且使用胞質液流份於西方墨點轉漬法及體外測定，以分別判定建構體蛋白質表現及活性。蛋白質偵測係使用對建構體蛋白質具特異性之單株抗體執行且表現水準標準化至例如細胞內B-肌動蛋白表現以提供半定量分析。

圖17顯示的資料說明在以原始及改善製程工程改造批量轉導經培養的HEK293細胞之後建構體表現及功能活性結果。兩個批量的建構體蛋白質染色皆係陽性，且指示建構體蛋白質表現水準相較於在未經轉導之對照293細胞中所見之基線建構體蛋白質表現水準增加。兩個批量的建構體蛋白質之受質偵測亦皆為陽性，且指示受質活性水準相較於在未經轉導之對照293細胞中所見之基線水準增加。另外原始及改善的工程改造運行之建構體表現及受質活性水準似乎可相比，顯示這些批次的效力可相比。GMP批次之資料亦顯示建構體表現及活性增加。

最佳化製程之產物：

安全性 ：生物負載及內毒素資料指示沒有與導入新污染物有關的安全性問題。就此而言，原始及改善製程批次並無顯著差異。

雜質：所有批次的製程相關雜質水準(HCP、殘餘benzonase核酸酶、BSA、總蛋白質)並無顯著差異。

注意到宿主細胞DNA(hcDNA)水準上有一些差異。皆由原始製程產生之AAV2建構體(非GMP)與AAV2建構體(GMP)之間的差異可能是因為事實上AAV2建構體(非GMP)係在非GMP實驗室產生，而AAV2建構體(GMP)係在對於製程步驟、製程作業、取樣、測試及原料有較多控制的GMP無塵室產生，因此允許獲得較佳且較可重現之結果。此外，在質體轉導細胞之後較長的培育時間係用於產生AAV2建構體(非GMP)；自細胞進料至收集72小時相較於用於產生AAV2建構體(GMP)之細胞的23小時。較長培育可允許更多細胞生長及更多由該些細胞所釋放的hcDNA。

這些差異可解釋原始製程所產生之2批材料之間觀察到的hcDNA水準差異。

相反地，就所有改善製程所產生之AAV2建構體(非GMP)及2個GMP批量而言，hcDNA水準降低許多(分別為530 pg/mL或＜LOD)。在用於產生這些批次的製程中，有能夠移除殘餘DNA之層析法純化及拋光(polishing)步驟。

產物特徵 ：所有批次的外觀、pH及滲透壓無顯著差異。

載體特徵 ：當以非定量測定評估時，改善製程所產生之非GMP及GMP批次顯示可相比之建構體表現及生物活性。這些批次亦具有與原始製程所產製之批次可相比之純度，無可偵測之雜質。

完整對空載體殼體比例的資料類似，且以上呈現之建構體表現及活性的資料證實改善製程所產生之(非GMP)批次的完整對空載體殼體比例相當於原始製程所產生之GMP批次，且不負面影響載體轉導人細胞的能力且顯示生物活性。

同一性(載體序列)的資料證實所有批次之完整序列的同源性，並無突變導入。同一性亦藉由偵測體外建構體表現及生物活性的能力證實，兩者皆依賴旁側連接AAV ITR之完整及功能性建構體蛋白質。

任何批次皆未偵測到複製勝任型AAV。由於質體及載體基因的本質，不太可能有rcAAV存在，但在放行用於臨床研究之前將持續評估任何GMP批次以確保患者安全性。

製程產率 ：

表35概述改善製程之整體製程產率。從二倍數量的10層Cell factory(原始製程之24 c.f. 12)，製造出二倍數量的病毒粒子(DRP)(原始製程之6.7×10^13 c.f. 3.4×10^13)。整體製程回收較低，但部分原因是在改善製程開發期間執行額外在原始批次產生期間不包括的製程中及品質管制測試。

表 35 ：相對製程產率及回收

*所報告之物理力價係使用原始製程執行 **約10%喪失在樣本中(IPC、QC)

基於以上呈現之資料，自新的最佳化製程所產生之AAV2建構體非臨床批次被認為與原始製程所產製之非臨床及臨床批次可相比。此製程用於產生根據改善製程之第一GMP批次。實例 7 ：改善 AAV2 純化層析法的強健性

在導入AVB之後評估所有與產品品質及療效有關的測試參數，且AVB層析法衍生性產物的品質或療效特性並無可偵測的變化，如表36至表41中詳述。

此外，導入偵測殘餘AVB配體之新方法且顯示在任何使用AVB Sepharose管柱製造的材料中並無可偵測之AVB配體。

以AAV2建構體收集材料(圖2，步驟13)執行七次AVB工程改造運行以評估聚集預防及步驟產率，其中5次運行為小規模(1.5至7L)及2次運行為較大規模(16L)。AVB步驟在所有實驗中執行良好，具有良好的步驟回收，產率40至78%(且平均產率為64%)。在任何實驗皆未偵測到顯著聚集。在AVB層析法之後，潛在雜質或製程污染物水準皆低且與先前顯示之水準一致，且最終載體產物顯示良好效力及感染力價。從AVB Sepharose純化步驟規模縮小運行得到的結論，所有測定結果(表36)顯示與原始期1/2製程(採用動物衍生性基質填充親和性層析法)及初始「改善」製程AAV2建構體GMP臨床材料(UnoQ陰離子交換製程)良好的可相比性。

表 36 ： AVB Sepharose純化步驟-測定結果

*完整規模等效力價 **校正喪失一支離心管的產率 ***評估聚集之R&D方法

表 37 ：AVB Sepharose純化步驟-測定結果

*樣本體積不允許濃縮至最終力價。

在藉由小規模開發運行顯示產物可相比性及改善製程強健性且使用AVB親和性層析法步驟擴大規模產生批量之後，使用AVB製程製造AAV2建構體GMP。此GMP批次的所有分析測試結果符合規格及預期。

(改善製程所產生之)AAV2建構體GMP藥物物質及藥物產品之初步分析結果概述於以下表38及表39。所有測試符合規格及預期。

表38：AAV2建構體GMP(來自改善製程)之初步放行測試結果

表 39 ：改善製程之AAV2建構體GMP藥物物質的初步表徵測試結果

當相較於原始製程之製程及產物，純化製程改善導致可相比的AAV2建構體藥物物質及改善的製程強健性。

在藉由改善製程製造期間，完整對空粒子比例係判定為特徵測試。

表40給出潛在產物相關雜質。

表 40 ：

*藥物物質放行測試。

表41給出潛在製程相關雜質及其控制。

表 41 ：

實例 8 ：藥物物質之控制

分析程序驗證：以下呈現若可行之方法驗證結果的摘要。

物理力價：此測定經驗證以實現下列標準(見表42)。「實際值」係本揭露之例示性AAV2建構體的值。

表 42 ：

DRP:IU比例-計算：無驗證必要。值藉由物理力價及感染單位力價測定資料之計算判定。

總粒子：總粒子測定已經驗證。驗證結果之摘要呈現於表43。「實際值」係本揭露之例示性AAV2建構體的測量值。

表 43 ：總粒子測定驗證摘要

完整:空比例：未執行藥物特定測定驗證。計數在GMP遵循機構執行之穿透式電子顯微鏡影像上的完整及空AAV2粒子。

載體同一性(DNA)：未執行藥物特定測定驗證。DNA定序係使用GMP遵循機構中之合格方法及設備執行。

總蛋白質測定：此測定經驗證以實現下列標準(見表44)。

表 44 ：總蛋白質測定驗證標準

純度測定(SDS-PAGE)：純度測定已經驗證。呈現驗證結果之摘要(表45)。「實際值」係本揭露之例示性AAV2建構體的測量值。

表 45 ：純度測定驗證摘要

複製勝任型AAV：複製勝任型AAV測定已經驗證以實現如ICH Q2(R1)所指明之關於雜質極限測試的相關驗證規定(見表46)。驗證結果之摘要呈現於下。「實際值」係本揭露之例示性AAV2建構體的測量值。

表 46 ：複製勝任型AAV測定驗證摘要

總DNA：總DNA測定已經驗證。呈現驗證結果之摘要(見表47)。所提供的「實際值」係本揭露之例示性AAV2建構體的測量值。

表 47 ：總DNA測定驗證摘要

HEK293宿主細胞DNA：HEK293宿主細胞DNA測定已經定性(見表48)。定性結果之摘要呈現於下。所提供的「實際值」係本揭露之例示性AAV2建構體的測量值。

表 48 ：宿主細胞DNA測定定性摘要

生物負載測定：此係經調和以符合EP 2.6.12及USP ＜61＞規定之藥典方法。定性/驗證係根據相關藥典專論進行。

內毒素測定：此係經調和以符合EP 2.6.14及USP ＜85＞規定之藥典方法。定性/驗證係根據相關藥典專論進行。實例 9 ：使用製程 2 製造之組成物的批次分析結果

來自2個非GMP及2個GMP批次之批次分析資料呈現於以下表50。

表 50 ：根據製程2所製造之AAV2建構體藥物物質的品質管制測試結果

腳註： (*)分析根據製程1進行。(**)未執行以保留材料用於穩定性研究。(***)結果不符合規格；獲得結果之後設定規格。(****)所獲得的結果作為測定驗證之一部分。藉由製程2判定力價，使用質體DNA作為測定標準(1.87 x 10^11 DRP/mL)而非使用報告的物理力價值。(*****)測定不符合效度標準。樣本不足以再分析。實例 10 ：使用製程 1 製造之組成物的批次分析結果

已根據製程1製造一個臨床GMP批次。來自此藥物物質批次之批次分析資料係提供於表51。

表51：品質管制測試結果

¹ 來自IPC測定之結果。實例 11 ： AAV 組成物之穩定性

分析AAV2建構體藥物物質之等分試樣的長期穩定性以支持＜-60℃的AAV2建構體藥物物質儲存條件。本研究放大在-80℃、-20℃及5℃下進行中的藥物產品即時穩定性及穩定性加速研究。

將AAV2建構體藥物物質等分至代表完整大小AAV2建構體藥物物質容器的小容器(5mL PETG旋蓋瓶)以確保有足夠容器可用於長時間的穩定性測試。這些容器具有相同的產物接觸材料且經選擇以最佳代表最終AAV2建構體藥物物質容器，例外為表面積對體積比例。小容器等分試樣之較小體積及較大表面積對體積比例據信代表關於AAV2建構體藥物物質長期穩定性之「最差情況」。

經等分之AAV2建構體藥物物質係放置在-80 ±10℃、環境相對濕度下。

如果可用於完成完整36個月研究之AAV2建構體藥物物質等分試樣不足，則研究將在較早時間點截短。

縮減型支持性穩定性研究使用來自小規模AAV2建構體(非GMP)批次之材料起始。此研究使用100 µl等分儲存在＜-60℃下的2 mL聚丙烯冷凍管中。小容器等分試樣之較小填充體積及較大表面積對體積比例據信代表關於AAV2建構體藥物物質長期穩定性之「最差情況」。研究將在2、6及12個月的時間點評估藥物物質穩定性。本研究之額外細節呈現於下。

測試要求

基於下列原理選擇用於基本穩定性規程的測定(見表52)。

表 52 ：用於基本藥物物質穩定性規程之測試

選擇用於支持性穩定性規程的測定包括如表53所示之物理力價、純度、總粒子及效力。這些穩定性測試及時間點(表54及表57)被視為最適合可用於執行研究的材料量。載體聚集的評估未包括在本研究中，因為方法目前係經發展以用於AAV2載體材料。容器完整性亦排除於研究之外，因為此係縮減型支持性穩定性研究。

表 53 ：用於支持性藥物物質穩定性規程之測試

表 57 ：儲存在＜-60℃下之AAV2建構體支持性藥物物質穩定性研究的穩定性資料

X：表示未來穩定性時間點。實例 12 ：臨床藥物產品之分析

除了各別規格之外，AAV2建構體藥物產品放行測試所執行之分析程序詳述於表58。

表 58 ：藥物產品規格

分析程序：用於控制藥物產品之方法概述於下。

外觀(EP 2.2.1、2.2.2及2.9.20及 USP ＜631＞)：目視檢查產品的透明度、顏色及外來粒子之不存在/存在。產品將對比白色及黑色背景檢查。

pH(EP 2.2.3及USP ＜791＞)：產品的pH將使用具溫度補償之微型pH電極判定。

滲透壓(EP 2.2.35及USP ＜785＞)：滲透壓係藉由凝固點下降方法判定。

物理力價：最終產品的物理力價將如本文所述執行。

感染單位力價測定：最終產品的感染力價測定將如本文所述執行。

效力：此測定係用於顯示建構體蛋白質在經測試物品轉導之細胞中過度產生且具有活性。細胞(HEK293)以非常低水準表現內源性建構體蛋白質，允許因為AAV2建構體載體的細胞轉導及表現所致之建構體蛋白質表現相較於非轉導細胞增加的比較性評估。在轉導之後，細胞經裂解且建構體在裂解物中之濃度係藉由西方墨點轉漬法或ELISA測量。經表現的建構體蛋白質之活性係在細胞裂解物上使用反應測量，該反應使用西方墨點轉漬法或ELISA測量併入受質之經生物素標示之GPP。

無菌性測試(EP 2.6.1及USP ＜71＞)：此程序係用於判定測試物品是否未經存活細菌及真菌污染。測試物品係無菌轉移至大豆-酪蛋白消化培養基(SCDM)及流體硫甘醇培養基(FTM)。將這些培養液培育14天且檢查細菌及真菌生長的證據。

內毒素(EP 2.6.14及USP ＜85＞)：此測定係用於判定細菌內毒素是否存在測試物品中。定量程序係藉由動力學-顯色方法執行。已知量的內毒素係與測試物品平行測試，以正確判定細菌內毒素的水準。測試物品干擾潛力係藉由以指明水準的內毒素加藥測試物品加上LAL試劑檢查。在抑制/增強測試之後，接著判定測試物品之內毒素含量。

分析程序驗證：以下呈現若可行之方法驗證結果的摘要。

外觀：此係經調和以符合EP 2.2.1/2.2.2及USP ＜631＞規定之藥典方法。定性/驗證係根據相關藥典專論進行。

pH：此係經調和以符合EP 2.2.3及USP ＜791＞規定之藥典方法。定性/驗證係根據相關藥典專論進行。

滲透壓：此係經調和以符合EP 2.2.35及USP ＜785＞規定之藥典方法。定性/驗證係根據相關藥典專論進行。

無菌性：此係經調和以符合EP 2.6.1及USP ＜71＞規定之藥典方法。定性/驗證係根據相關藥典專論進行。實例 13 ：臨床劑量設計

無脈絡膜症係目前無法治癒之罕見X性聯隱性視網膜退化，在兒童期晚期呈現且導致眼盲。此實例提供評估視網膜基因療法之非隨機、二年、第1至2期開放標籤臨床試驗的主要終點，使用腺相關病毒第2型(AAV2)載體表現無脈絡膜症轉殖基因(NCT01461213)。起初招募12名患者，其中5名接受1×10¹⁰ 基因體粒子(gp)之AAV.REP1及6名接受1×10¹¹ gp。一名患者的手術併發症導致視網膜變薄且減少載體劑量為小於10¹⁰ gp。安全性及療效的主要結果測量係二年的視敏度。視網膜敏感度及解剖學變化係次要終點。在整群14名患者中，二年中位數視敏度在治療眼改善4.5個字母，相較於未治療眼喪失1.5個字母(p=0.03)。對於12名接受基因療法且無併發症之患者，治療眼二年增加超過他們的基線水準5.5個字母(p=0.02)。相較於未治療眼，此代表有利於接受基因療法之眼二年中位數4.5個字母增加(p=0.003)。此時相較於12個未治療眼中沒有一眼，12個治療眼中6眼增加超過一行視力(＞5個字母)。在最後一次追蹤(範圍2至5年)，相較於12個未治療眼中僅4眼，所有12個按計劃書接受基因療法之研究眼維持或增加視敏度。此相當於眼之間15.9個字母(＞3行)的平均差異。在二年追蹤期期間，治療與未治療眼之間的次要終點未見統計顯著差異，諸如微視野檢查、視網膜厚度或喪失視網膜外緣。無脈絡膜症之視網膜基因療法似乎安全且可能有利於視敏度。

在此未加盲、非隨機分組、前瞻介入性基因療法臨床試驗中，以知情同意書招募14名參與者且使用AAV2.REP1載體對一眼進行基因療法治療。通常，選擇接受治療之眼在基線具有較差的視敏度，但在3例中，因為其他因素諸如視野縊縮選擇視敏度較佳之眼。所有參與者皆為年齡25至73歲的男性，且CHM 基因經證實為空突變。本試驗的主要目的是要評估手術後二年關於維持視力的安全性。最初12名患者被招募至二個六名患者的劑量研究世代，監測各名患者24個月。然而二名患者的併發症導致在試驗中途延遲24個月及與所使用的手術技術及免疫抑制方案有關的計劃書變更。倫理委員會核准試驗延長連同進一步招募二名患者，使得總共12名患者按計劃書接受基因療法治療且無併發症。

在第一研究世代的6名患者中，使用超螺旋質體載體參考測定之視網膜下注射至多1x10¹⁰ 基因體粒子(gp)係以二步驟程序注射視網膜下。此包含透過41號規(G)鐵氟龍導管(DORC BV, Zuidland, Netherlands)遞送平衡鹽溶液的初始剝離視網膜及繼發注射AAV.REP1載體至新產生的視網膜下空間。在第六名患者(C1)，難以剝離視網膜及拉伸乳突黃斑束導致減少基因療法劑量為＜6×10⁹ 及後續視網膜變薄，但所有其他患者按計劃書接受完整低劑量的1×10¹⁰ gp(L1-5)或高劑量的1×10¹¹ gp(C2及H1-7)。最初口服普賴蘇龍以1 mg/kg在基因療法之前投予3天及之後投予7天，但C2在手術後2週發展出玻璃體炎及視網膜炎，因而不良地影響他的視力。計劃書後續經修改，以使H1-7接受延長的普賴蘇龍方案：0.5 mg/kg(第8-14天)、0.25 mg/kg (第15-16天)、接著0.125 mg/kg(第17-18天)。注射系統中的氣泡擴張至H3視網膜下空間且延緩載體投予，因為認為載體將被視網膜下空氣換位。注射系統經修改以允許更受控的載體輸注至視網膜下空間及減少困住氣泡的可能性。計劃書允許如手術因素指示而延緩載體投予且H3在稍晚當投予完整劑量載體而無併發症的日期重新接受視網膜基因療法。

為了協助觀測視網膜剝離及監測視網膜拉伸，在H3-7導入術中光學同調斷層掃描(OCT)造影。此包含在不同階段移進及移出手術區以評估視網膜下注射平面及視網膜拉伸角度的垂直對齊之Heidelberg Spectralis。

在無脈絡膜症中，不像許多其他視網膜退化，喪失RPE導致下方脈絡膜的瘢痕形成反應，接著變成牢固附著至殘餘視網膜。然而功能性視網膜的中央小島仍維持完整且可在其內識別介於RPE與感光受體之間用於載體投予之組織平面。然而如果流體注射至此平面過於快速，則發展中的流體泡將形成緊繃氣泡且拉伸中央視網膜，因為周邊瘢痕組織將預防視網膜下流體向外傳播至視網膜周邊。此視網膜拉伸反應具有二個負面結果。首先其可能直接傷害神經感覺性視網膜-在C1中，乳突黃斑束受到如先前報告之拉伸，因為此區域缺乏外核層，因此比起中央視網膜此區域較薄且根據虎克定律在給定壓力下受到更多拉伸。其次，泡中的較高流體壓力將導致載體懸浮液透過加寬視網膜造孔回流到玻璃體中，因而減少遞送的治療劑量且增加發炎風險。因此在C1的併發症(其中載體係自1 ml注射器手動注射)之後，設計及測試新的載體投予裝置，其允許精確腳踏板控制載體的緩慢輸注。此成功用於H3-7，在這些人中載體投予並未引起併發症。重液體全氟-n-辛烷(Bausch & Lomb, Rochester, New York, USA)氣泡係用於穩定P10及P11在載體輸注期間視網膜變薄的局部區域。

視力功能係根據早期治療糖尿病視網膜病研究(ETDRS)計劃書以最佳矯正視力(BCVA)評估。此外，在基線、1年及2年執行Pelli-Robson對比敏感度測試。使用MAIA微視野計(CenterVue SpA, Padova, Italy)的微視野檢查測試遵照先前描述之規程[MacLaren et al., 2014]，除了H3-7以外，使用標準非客製化20°(38種刺激)中央網格。針對具有顯著視野限縮之參與者(H4-6)，他們在20°網格上可能達成幾乎不可偵測或0 dB平均臨限敏感度，則使用10°中央網格取代。在L3主觀報告色視覺改善之後，將使用Farnworth-Munsell 100 hue (FM100)測試的色視覺評估添加在計劃書變更中且包括於H1-7。雖然H2、H5、H6及H7報告進一步主觀描述治療眼的顏色感知改善，但該測試證實難以在晚期視野喪失的患者中執行。解剖學評估包括使用Spectralis(Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany)之光譜域光學同調斷層掃描(OCT)及眼底自體螢光(AF)造影(BluePeak, Heidelberg Engineering)。評估對AAV之T細胞反應的免疫學測試(ELISpot)遵照先前描述之方法 [MacLaren et al., 2014]。

由於在研究中包括近乎最大視敏度之眼的天花板效應，發現ETDRS分數偏斜(Shapiro-Wilk常態性檢定，α 0.05)，因此呈現為具四分位數範圍(IQR)之中位數值。使用Wilcoxon符號等級檢定比較治療與對照眼之間的變化。發現微視野檢查資料及解剖學評估為常態分布且使用成對t檢定比較。結果

在招募的總共14名患者中，其中13名接受1 ×10¹⁰ gp (L1-5)或1×10¹¹ gp(C2及H1-7)的AAV.REP1載體(表 59 )。有二名患者出現與載體投予有關的顯著不良事件(AE)：C1及C2。在C1中，手術併發症導致視網膜變薄及載體投予給藥不足。在C2中，手術後2週出現顯著視網膜發炎，其最有可能與載體相關。在H3中，視網膜下氣泡防止第一次嘗試時的載體投予，但第二次載體遞送成功且在稍晚日期並無併發症。針對計劃書(特別是關於手術方面)設計變更，以減少這些不良事件在未來發生的機會。倫理委員會核准進一步招募二名患者，藉此提供12名(包括5名低劑量(L1-5)及7名高劑量(H1-7))按計劃書治療的患者，追蹤期為二年。

所有參與者皆為高加索男性，具有經基因確診的無脈絡膜症且列出以進行基因療法手術。L1-5及H1-7分別以低劑量及高劑量進行未引起併發症的基因療法。在C1之手術引起視網膜拉伸的併發症導致給藥不足。C2發展出明顯的手術後眼內發炎，其導致視敏度急性減少及隨後一旦發炎緩解之後的緩慢反彈。

視敏度評估

總計來說，12名接受AAV.REP1載體視網膜下注射且無併發症及2名因為不良事件接受偏離計劃書的治療。在2年試驗終點，14個治療眼的中位數視敏度改善4.5個字母(IQR：-2.0至8.8)及14個未治療眼下降-1.5個字母(IQR：-5.0至0.0)。因此整體而言有利於治療眼，儘管2名患者有顯著的併發症(Wilcoxon符號等級檢定，W=68，z=2.12，p=0.034)。之後，為了評估研究性藥品(IMP)之療效的目的，12名按計劃書接受基因療法治療的患者(L1-5及H1-7)與2名具有手術或醫療併發症的患者(C1及C2)分開報告。

由於試驗中途延遲以最佳化手術技術，前5名患者(L1-5)具有5年追蹤，而最後5名(H3-7)最近才達到2年追蹤，具有介於之間的中間追蹤期。因此資料以二種方式呈現：第一種是按照計劃書所定義的原始終點所有12名患者為2年，第二種是最後追蹤點，其中L1-5及H1-2延長超過2年。

到2年時，12個治療眼的中位數視敏度改善5.5個字母(IQR：2.5至9.0)(Wilcoxon符號等級檢定，W=60，z=2.33，p=0.020)。相對地，未治療眼在這段期間小量喪失-1.0個字母(IQR：-5.0至+1.0)(表60及圖20)。此代表治療眼相較於未治療同儕眼中位數增加4.5個字母(IQR：2.0至14.0)(Wilcoxon符號等級檢定，W=76，z=2.96，p=0.003)。在最後一次追蹤，治療眼增加中位數6.5個字母(IQR：3.8至10.3)，然而未治療眼喪失-2.0個字母(IQR： -5.3至0.3)。此代表治療眼相較於未治療眼中位數增加8個字母(IQR：4.0至18.5)(Wilcoxon符號等級檢定，W=78，z=3.04，p=0.002)。

到最後一次追蹤，所有12個接受基因療法的治療眼視敏度維持或增加，但12個未治療眼中8眼在此期間有不同量的惡化。視敏度係可變的生物讀數，但測試以標準方式執行且到24個月沒有一個未治療眼增加超過一行(＞5個字母)。相對地，到24個月12個治療眼中6眼(50%)增加超過一行。相較於未治療眼，12名患者中4名在24個月見到增加二行或更多(表 60 ：粗體)。此到最後一次追蹤進一步增加至12人中6人(50%)，其中4人具有有利於治療眼的增加三行或更多(≥15個字母)(表 60 ：粗體)。在最後一次追蹤，12名患者中每一位之治療眼的視敏度相對於未治療眼改善(中位數= 8.5個字母，IQR：4.0至18.5)，相當於平均增加15.9個字母(＞3行)，有利於接受基因療法之眼。

表 60 ：所有12名參與者在2年及最後一次追蹤的視敏度結果(最佳矯正ETDRS分數)。gp= AAV2.REP1載體之基因體粒子；Med=中位數；TE=治療眼；CE=對照眼；m=月；y=年；DIFF=眼之間的差異；FU=追蹤；眼之間的視力變化2行(10個字母)或更高者以粗體顯示。

微視野檢查比起視敏度評估較寬廣黃斑部區域的平均視網膜敏感度，但執行的時間較長且需要專注，特別是固視(fixation)不良的患者[Jolly et al., 2017]。治療眼之平均視網膜敏感度在基線係4.0±0.7分貝(dB)及在2年係3.3±0.6，代表無統計顯著性的小幅下降(p=0.07)。相對地，未治療眼從基線4.8±0.8 dB顯著下降至2年3.3±0.7 dB (p=0.004)。雖然在2年研究終點有相較於未治療眼有利於治療眼的相對增加0.8±0.53 dB(95% CI：-0.3至1.8 dB)，但並無統計顯著性(p=0.17)。在1年的資料及期間分析顯示於圖21。到此階段，治療眼之平均視網膜敏感度喪失小於未治療眼0.9±0.5 dB(95% CI：0.0至1.8 dB)，建議在2年見到之相對於未治療眼的改善可能長期持久。

微視野檢查亦提供關於固視的有用資訊，也就是具有最大敏感度之視網膜區(通常是小窩)。所有患者除了L1之外仍保留一些程度的小窩或小窩旁固視，與此疾病之視野喪失的向心本質一致。先前注意到L1改變他的固視(或較佳視網膜區)成為使用此經治療的小島，然捨棄視網膜的未治療小島。此在此患者維持長達5年，與視敏度持續改善一致。

保留視網膜結構： 解剖學評估包括光學同調斷層掃描(OCT，其給出橫截面圖以測量視網膜厚度)及自體螢光(其產製可用來估計生存視網膜區域的地圖)。眼未經隨機分組，其中在12名研究患者中9名選擇就視敏度方面較晚期之眼進行基因療法(表 59 )。

OCT主要用於安全性以評估可能因為例如手術創傷或是否因為REP1蛋白質過度表現而有長期毒性效應所發生之視網膜變薄。12個計劃書治療眼在基線的固視點(如微視野檢查所示)平均厚度係224.8μm相較於未治療眼之251.9μm。到24個月，治療眼減少至平均207.7μm且未治療至245.6μm，此具有統計顯著性(n=12, p=0.04)。然而進一步子群分析顯示在前7個接受手動注射載體至視網膜下空間之眼(L1-5 & H1-2)，視網膜變薄在治療眼(平均23.1 μm)高於未治療眼(6.4μm) (n=7, p=0.02)。然而在改善載體遞送系統之後接受自動化注射之眼中(H3-7)，並未偵測到顯著差異(n=5, p=0.72)。

就區域測量而言，自體螢光區域與自橢圓體區的多個切片計算之生存感光受體的區域相關。在整群12名患者中，到2年時治療眼保留81.1±3.2%的自體螢光區域，而未治療眼保留類似的80.8±2.1%。然而應注意的是，AF縮小僅自退化前緣處之最外層的視網膜細胞發生，且2年的時間不足以以評估視網膜基因療法對於較健康中央區的長期效應。只有一名患者(H5)到2年時沒有可測量的下降(100%保留)且這僅在他的治療眼觀察到。5名患者的長期(5年)追蹤顯示類似模式，其中治療眼中66.1±5.0%的剩餘自體螢光相較於未治療眼中的64.9±3.6%(表S2B)。然而應注意的是此為好壞參半，因為患者視敏度大幅增加的表現遠優於他人。另外，在這段時間內，所測量之退化速率的顯著患者間差異甚至出現在未手術眼，範圍自58%至78%不等。這強調不需要過度解讀有限的非隨機分組資料組。

不良事件

所有收案患者在基線時沒有目視顯著的白內障，因為需要清楚視野以進行41號規視網膜造孔術，但白內障形成係玻璃體切除術手術廣為周知且幾乎不可避免的不良反應。在2名參與者中(H5及H6)，先前已進行白內障手術。一名患者發展出目視顯著的白內障，其在基因療法後1年移除(H3)，但四名其他患者(L2、L4、L5、H2)在完成2年追蹤後接受白內障手術。剩餘五名患者(L1、L3、H1、H4及H7)尚未進行白內障手術，雖然依照LOCS III白內障分級所有皆具有白內障進展徵候。在整群14名患者及甚至包括二名具有併發症之患者中，治療眼在這段期間內的視敏度相對於未治療眼改善。只考慮12名在沒有偏離計劃書的情況下進行未引起併發症的視網膜基因療法之患者，到2年終點時，治療眼的視敏度相較於他們的基線改善。在所分析之最近時間點即長達5年，所有12個治療眼維持或增加視敏度超過他們的基線水準，儘管在這段期間12個未治療眼中8眼的視敏度有可變的喪失。對於視敏度的有利效應與良好安全性輪廓之組合使得有必要進一步評估無脈絡膜症基因療法作為完全隨機分組前瞻性第III期臨床試驗的潛在治療(見實例14)。

雖然低劑量或高劑量研究世代在視敏度增加之間並無顯著差異，然而應注意的是這是一個非常小的研究組，只有5名患者以較低(1×10¹⁰ )劑量治療。考慮到人先天抗病毒免疫系統的異質性本質，臨限劑量有可能在一些患者具有治療性，但非所有患者。因此可能有利的是以最大耐受劑量治療，只要未見到毒性效應。高劑量患者長時間優異保留視力功能支持此方案。也值得注意的是，本研究選擇之患者通常是末期，殘餘視網膜中的小島非常小且因此沒有太多剩餘的視網膜細胞可治療。對於早期階段的患者低劑量可能不足夠，他們將暴露至載體的目標區域遠遠較大。也應注意的是用於本研究之醫藥配方不包含PRE或WPRE元件，其可能改善治療療效。

除了H5之外，剩餘患者自體螢光區域的進一步縊縮與其他臨床前模型不一致，其中因為單一基因置換所導致之視力功能的改善不變地與延緩視網膜退化相關。然而在此處，應記住的是在2年時段所測量之退化的惡化僅為視網膜退化的最邊緣且此部分可能過於惡化而無法救援。視敏度增加相對地主要發生在中央視網膜。同時無脈絡膜症之視網膜難以剝離超過生存視網膜邊緣導致其上之泡的拉伸。視網膜下空間的下凹形狀將增加泡的中央高度，因此當流體重吸收後，其將為視網膜重新貼附的最後部分。這可能潛在地提供中央視網膜相較於最周邊處額外數小時的載體暴露。最後應注意的是眼未經隨機分組且在基線一些患者中見到的生存視網膜區域的眼間差異指示不對稱的退化速率。藉由治療較差的眼，定義上將偏重於治療較快速退化之眼。

雖然在整個研究期間所有治療眼的視敏度維持或增加，但以微視野檢查所測量之視網膜敏感度顯示下降趨勢且雖然數值上優於未治療眼，二者之間並無統計顯著差異。這極有可能是因為相較於閱讀高對比視力表上之單一字母，微視野檢查的執行變異性增加。然而這些測試的測量結果確實具有些微差異。微視野檢查從平均分布在中央視網膜10至30度的許多點評估視網膜功能，然而視敏度係自通常具有最大敏感度且位於中央之單一點進行測量。維持視網膜敏感度因此因成功轉導所測量之直到生存視網膜邊緣的整個區域而有所改善。例如，如果僅20%的中央視網膜色素上皮細胞被載體成功轉導且如果這些細胞位於小窩之下，則這可能足以見到視敏度增加。然而剩餘80%的非轉導細胞將持續退化且此下降將反映在微視野檢查隨時間的逐漸下降，但視敏度仍將維持穩定。然而如果基因療法成功停止經成功轉導區域的退化，則最終只有經轉導的細胞仍維持且微視野檢查讀數穩定隨時間維持恆定。此「高原」效應目前出現在L1，他也維持視敏度增加且具有最長的追蹤期。或者可能是簡單因子，即藉由微視野檢查所測量的視網膜敏感度比起高對比視敏度對白內障形成更為敏感。在玻璃體切除術後2年時間點，10名有晶狀體計劃書治療患者中僅一名進行白內障手術。

當判讀本研究及任何其他涉及遞送載體至視網膜下之基因療法研究時，手術的成功係關鍵因子。一種視網膜拉伸的潛在性不良事件係與手術相關。其他發炎的顯著不良事件可能同樣與手術相關，像是在注射期間有載體回流進玻璃體，已知此會觸發發炎。在試驗中途的計劃書變更之後，採用自動化視網膜下注射系統，以允許精確及受控遞送載體至視網膜下空間。此進一步藉由術中視網膜掃描(OCT)促進，其提供被剝離的視網膜的即時橫截面影像且幫助識別一些更晚期患者的視網膜下空間。這些額外的手術優化將改善未來基因療法研究的安全性。然而此第I/II期臨床試驗的結果顯示用於無脈絡膜症之基因療法大致上是安全的。實例 14 ： Gemini 研究

這是一個AAV2-REP1用於具有經基因確診的CHM之成人男性受試者之多中心、開放標籤、前瞻性、雙側介入性安全性研究。

研究將由篩選回診及隨後的2個治療階段(第1階段及第2階段)組成，其中每個階段至多9次回診(圖22)。在篩選回診，評估受試者雙眼的參與資格。計劃主持人分配眼的治療順序(即分別為研究眼1[SE1]及研究眼2 [SE2])，每眼分配一個數字。此分配係與受試者合作完成；然而，通常選擇先治療較差之眼。SE1及SE2手術程序之間的目標間隔在篩選回診時判定。各研究眼治療後至少追蹤12個月，每個治療階段至多9次回診：回診1(第0天，注射日回診)；回診2(第1天，手術後追蹤回診)；回診3(第3天)；回診4(第7天)；回診5(第14天)；回診6(第1個月)；回診7(第3個月)；回診8(第6個月)及回診9(第12個月)。

在第1階段的回診1(第0天，SE1注射日回診)，受試者的SE1進行玻璃體切除術及視網膜剝離且接受視網膜下注射AAV2-REP1。回診2至9係根據研究程序的時程進行，除非第2階段在這段時間期間開始。在第1階段期間回診2至9的眼科評估係於雙眼執行。

在第2階段的回診1(第0天，SE2注射日回診)，受試者的對側、未治療眼(SE2)進行玻璃體切除術及視網膜剝離及視網膜下注射AAV2-REP1。受試者不再遵照第1階段的回診時程，而是根據研究程序的時程進入第2階段回診2至9。第2階段之回診2至9排定的眼科評估將於雙眼執行。

在整個研究期間評估受試者的安全性及療效；評估如研究程序之時程中概述。發展出白內障之受試者可視臨床需要進行白內障手術。如果執行白內障手術，係於各別眼第12個月(回診9)之前至少4週進行。

主要終點係評估雙側投予AAV2-REP1之後的安全性。研究的次要終點包括藉由糖尿病視網膜病早期治療研究(ETDRS)表所測量之最佳矯正視力(BCVA)相較於基線的變化、自體螢光(AF)相較於基線的變化、光譜域光學同調斷層掃描(SD-OCT)相較於基線的變化及微視野檢查相較於基線的變化。

納入標準 ：

在篩選回診時，如果受試者符合所有下列納入標準則有資格參與研究。納入標準：(1)願意且能夠簽署參與雙眼治療研究的知情同意書、(2)男性且年齡≥18歲、(3)具有經基因確診的CHM、(4)雙眼黃斑區內具有臨床可見之活性疾病、(5)若先前未接受AAV2-REP1治療，雙眼具有≥74個ETDRS字母之BCVA(相當於優於或等於6/9或20/32 Snellen、decimal 0.63、LogMar 0.2)，若在替代研究中接受AAV2-REP1的先前治療，則未治療眼≥74個ETDRS字母(相當於優於或等於6/9或20/32 Snellen、decimal 0.63、LogMar 0.2)。若先前在替代研究中經AAV2-REP1治療，則受試者在試驗委託者核准之後可能有資格參與。

排除標準：

在篩選回診時，如果受試者符合任何下列排除標準則沒有資格參與研究。排除標準：(1)任一眼具有弱視或發炎性病症之病史；(2)不願意在任一眼經AAV2-REP1治療之後的3個月期間使用屏障式避孕方法；(3)任一眼在篩選回診3個月以內曾接受先前眼內手術；(4)具有任何其他顯著的眼或非眼疾病/病症，因此計劃主持人認為可能使受試者因為參與研究而承受風險、或可能影響研究結果或受試者參與研究的能力；及(5)在過去12週已參與另一涉及研究性產品的試驗性研究或在先前任何時間接受基於基因/細胞的療法，除非是在另一AAV2-REP1的研究中接受治療。此計劃主持人認為可能使受試者因為參與研究而承受風險、或可能影響研究結果或受試者參與研究的能力之顯著眼或非眼疾病/病症包括但不限於具有下列之潛在受試者：a)口服皮質類固醇(例如普賴蘇龍/潑尼松)的禁忌症；b)任一眼有臨床顯著的白內障；c)計劃主持人臨床判斷認為不適合進行視網膜下手術者。

測試產品、劑量及投予模式： 受試者的每一眼將進行玻璃體切除術及視網膜剝離且接受體積0.1 mL視網膜下注射含有1×10¹¹ 個AAV2-REP1基因體粒子之研究藥物。

評估標準： 安全性評估係基於完整眼科檢查(包括眼內壓[IOP]、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度分級及散瞳眼底鏡)；眼底攝影；不良事件(AE)通報；載體脫落(shedding)及免疫原性取樣；及生命徵象。

療效： 療效評估係基於BCVA(藉由ETDRS表測量)、眼底自體螢光、SD-OCT及微視野檢查。

統計學方法： 未執行正式樣本大小計算。連續變數使用敘述統計學隨時間概述(即平均值、標準差、95%信賴區間[CI]、中位數、Q1、Q3、P05、P95、min及max)。類別變數使用計數、百分比及95% CI隨時間描述。摘要按回診及眼製表。未執行正式統計檢定。AE按系統器官分類、首選用語及眼概述。概述經歷AE之受試者數及眼數兩者以及事件數。將產生類似的研究藥物/程序相關AE、導致停藥AE及嚴重AE摘要。AE亦按最高嚴重性、與研究藥物/程序之關係及開始及緩解時間(time to onset and resolution)概述。將描述載體脫落及免疫反應特性。剩餘安全性評估使用敘述統計學分析。

CHM無法治癒且在發展本揭露之醫藥組成物之前，治療頂多為支持性。本試驗向受試者投予之醫藥組成物AAV2-REP1係AAV2粒子包封野生型人REP1基因之1.962kB互補去氧核糖核酸(cDNA)。AAV2-REP1表現高水準的人REP1蛋白質、恢復REP1至人CHM纖維母細胞、提供人CHM細胞的功能救援、在CHM小鼠視網膜活體內表現蛋白質且當過度表現一個對數單位時無毒性。另外，過度表現人REP1蛋白質不顯著負面影響視網膜功能。

考慮到CHM影響雙眼，本研究顯示雙側AAV2-REP1投予。來自AAV2載體非臨床及臨床研究的新資料顯示AAV2載體引發最小免疫反應，包括在雙側投予之後。本研究的目標在於提供AAV2-REP1之依序、雙側治療的安全性及耐受性之重要洞見。

投予之治療

有資格參與之受試者的各眼進行玻璃體切除術及視網膜剝離。在第1階段回診1(第0天，SE1注射日回診)，受試者的SE1接受體積0.1 mL視網膜下注射含有1× 10¹¹ AAV2-REP1 gp之研究藥物。在第2階段回診1(第0天，SE2注射日回診)，受試者的SE2接受相同視網膜下注射AAV2-REP1。

醫藥組成物之性狀

AAV2載體含有編碼REP1之重組人cDNA (AAV2-REP1)。載體基因體(AAV2-CBA-hREP1-WPRE-BGH)包含強烈組成性表現卡匣、雜交CBA啟動子、編碼REP1之人cDNA、經修飾的土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)序列及牛生長激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)序列且旁側連接AAV2反向末端重複。cDNA片段原始係單離自未受影響個體之人視網膜cDNA庫。

AAV2-REP1藥物產品係經調配於無菌、20 mM Tris緩衝溶液pH 8.0且含有1 mM MgCl2、200 mM NaCl及0.001% PF68。藥物產品係透明至微乳光、無色、無菌過濾懸浮液，目標濃度為1×10¹² gp/mL。

AAV2-REP1係供應於加塞及加蓋的無菌小瓶。總共供應0.3 mL載體懸浮液給所欲治療之各眼。在運送之前，各小瓶係放置於經標示的第二容器中。藥物產品待儲存在控制存取、溫度監測冷凍器中＜-60℃(＜-76℉)下。

玻璃體切除術程序及注射 AAV2-REP1

注射AAV2-REP1係由有適當資格及經驗的視網膜外科醫師執行。由於在CHM中剝離視網膜的複雜性及不可預測性(其中視網膜及脈絡膜中多處可能極薄且融合)，發展經修改的視網膜下基因療法技術。此涉及在玻璃體切除術後以2步驟執行載體遞送。2步驟程序的優點在於視網膜剝離的任何非預期併發症可保守處理，最小化關於載體逃脫進入玻璃體的顧慮。另外，注射可延緩至較晚日期，如果例如產生需要以氣體治療之黃斑孔洞。此外，由於剝離小窩所需之流體體積係可變的，藉由移除第一步驟中之載體，仍可將就基因體粒子而言精確一致的劑量施用至視網膜下空間。

起初，受試者的各別研究眼進行標準玻璃體切除術及後方類玻璃體的剝離(圖23)。所有手術將使用標準BIOM玻璃體切除術系統進行。通常偏好23號規縫合方案以避免任何傷口滲漏的潛在風險。視網膜將以透過連接玻璃體注射組之41號規視網膜下導管注射的0.1至0.5 mL平衡鹽溶液(BSS)剝離。單次劑量的AAV2-REP1將透過相同進入位點注射至視網膜下流體。

在程序的第二步驟中，自眼移除BSS導管且製備用於注射的AAV2-REP1。將一劑1.0×10¹¹ AAV2-REP1 gp透過相同進入位點注射至視網膜下空間。載體需要在1 mL注射器中預注(primed)以避免形成氣泡，且使用接頭以使1 mL注射器可與玻璃體切除術機器的恆壓管線連接。視網膜下注射將靶向任何黃斑部區域但可能的話也包括小窩。在各例中，載體係經注射以使視網膜下流體覆蓋所有如眼底自體螢光所識別之尚未經歷脈絡膜視網膜退化的中央區域邊緣界線。在封閉傷口後，小心清理所有可能通過眼的灌洗流體以限制潛在載體擴散。

併用療法：

受試者不可在過去12週參與另一涉及研究性產品的試驗性研究或在先前任何時間接受基於基因/細胞的療法，除非是在另一AAV2-REP1的研究中接受治療。在整個研究期間，計劃主持人可能開立任何併用藥物處方或給予認為必要的治療以提供適當支持照護。在篩選回診收集併用藥物的詳細資料且在每次研究回診更新(適用的話包括ET回診)。在研究期間使用的併用藥物(包括口服皮質類固醇)應記錄在受試者的病歷紀錄及eCRF中；例外為在進行研究程序期間使用的任何藥物(例如麻醉劑、散瞳眼藥水)。

為了最小化手術所導致的發炎及對載體/轉殖基因的潛在或非預期免疫反應，在每次手術之前將給予所有受試者21天療程的口服潑尼松/普賴蘇龍。因此每次手術將為1 mg/kg/天的潑尼松/普賴蘇龍總共10天(始於載體注射之前2天、注射當天及接著7天)；隨後0.5 mg/kg/天共7天；0.25 mg/kg/天共2天；及0.125 mg/kg/天共2天(總共21天)。皮質類固醇使用的詳細資料由受試者自行記載在日記卡。

研究程序

在每次研究回診時，應嘗試在雙眼執行所有程序。

篩選回診

計劃主持人向每位潛在研究受試者解釋研究目的、程序及受試者責任。篩選程序將由下列組成(所有眼科評估將在雙眼進行)：人口學、醫學及眼科病史、生命徵象、體重、載體脫落取樣-血液、淚液(雙眼)、尿液、唾液、免疫原性取樣(酶連接免疫吸附測定[ELISA]及酶聯免疫斑點法[ELISPOT])、BCVA、完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、SD-OCT、自體螢光、微視野檢查、7視野彩色眼底攝影(包括視野1、2及3的立體攝影)、嚴重AE(SAE)監測、用藥回顧。

符合所有納入標準且不符合任一排除標準的受試者將被分配一個受試者編號且收案至研究中。計劃主持人分配眼治療的順序(即分別為SE1及SE2)。此將與受試者合作完成；然而，通常選擇先治療較差之眼。SE1及SE2手術程序之間的目標間隔在本次回診時判定。

對每位受試者來說，SE1與SE2治療之間的間隔預期自數週至數月的範圍不等。雖然此間隔係根據個案決定，應盡量安排不同治療間隔時程(例如相隔1、3或6+個月)以更佳地表徵依序治療投予的免疫學及安全性輪廓。

下一次研究回診(第1階段回診1)排定在篩選回診的10週以內。受試者將出席第1階段回診2至9，除非第二手術回診(第2階段回診1)開始，此將代表研究第2階段的開始。由於第二手術回診(第2階段回診1)的時間將隨受試者而異，因此研究第1階段的持續時間也將可變。

在第1階段回診1(用於SE1)及第2階段回診1(用於SE2)給予受試者二個21天療程的口服皮質類固醇(例如普賴蘇龍/潑尼松)且指示他們在下一次手術之前2天開始服用藥物。將發放日記卡給受試者以記載各21天期間的皮質類固醇順從性。指示受試者從他們接受治療時起3個月期間使用屏障式避孕。

第1及第2階段的程序時程相同；在各階段期間，將在SE1及SE2兩者進行程序。

如果受試者先前參與AAV2-REP1用於治療CHM的臨床試驗且在一眼接受AAV2-REP1，則未治療眼將在篩選回診時被分配為SE2且受試者將直接進入第2階段。

第 1 及第 2 階段，回診 1( 第 0 天，注射日回診 )

在回診1(第0天，注射日回診)執行下列評估：完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、AE/SAE監測及併用藥物回顧(包括回顧皮質類固醇日記卡)。

受試者接著在他們的第一(SE1)眼進行玻璃體切除術且接受體積0.1 mL視網膜下注射AAV2-REP1(含有1×10¹¹ gp)。

小心監測受試者在程序期間的AE發生。受試者在手術後1、3、7及14天回到試驗中心進行手術後追蹤(分別為回診2[第1天]、回診3[第3天]、回診4[第7天]及回診5[第14天])。

為了允許正確表徵AAV2-REP1安全性及免疫原性特性，如果先前眼內手術在計畫治療日期的3個月內在相同眼執行，則不應發生SE2之治療。如果眼內手術在3個月內發生，則SE2之治療應延遲直到經過3個月間隔之時且眼完全術後恢復。

第 1 及第 2 階段，回診 2( 第 1 天手術後回診 )

回診2執行每一眼的眼科評估及程序。在回診2時(第1天)，受試者回到試驗中心進行他們在回診1(第1階段[SE1]或第2階段[SE2])進行手術之相同眼的第一次手術後回診。執行下列評估：生命徵象、載體脫落取樣-血液、淚液(雙眼)、尿液、唾液、免疫原性取樣(ELISA及ELISPOT)、BCVA、完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、SD-OCT、AE/SAE監測、用藥回顧(包括回顧皮質類固醇日記卡)。

第 1 及第 2 階段，回診 3( 第 3 天 )

回診3(第3天)執行每一眼的眼科評估及程序。在回診3時(第3天)，受試者回到試驗中心進行他們在回診1(第1階段[SE1]或第2階段[SE2])進行手術之相同眼的第二次手術後回診。將執行下列評估：生命徵象、載體脫落取樣-血液、淚液(雙眼)、尿液、唾液、BCVA、完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、AE/SAE監測及用藥回顧(包括回顧皮質類固醇日記卡)。

第 1 及第 2 階段，回診 4( 第 7 天 )

回診4(第7天±1天)執行每一眼的眼科評估及程序。在回診4時(第7天±1天)，受試者回到試驗中心進行他們在回診1(第1階段[SE1]或第2階段[SE2])進行手術之相同眼的第三次手術後回診。將執行下列評估：生命徵象、載體脫落取樣-血液、淚液(雙眼)、尿液、唾液、免疫原性取樣(ELISA及ELISPOT)、BCVA、完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、SD-OCT、自體螢光、AE/SAE監測及用藥回顧(包括回顧皮質類固醇日記卡)。

第 1 及第 2 階段，回診 5( 第 14 天 )

回診5(第14天±3天)執行每一眼的眼科評估及程序。在回診5時(第14天±3天)，受試者回到試驗中心進行他們在回診1(第1階段[SE1]或第2階段[SE2])進行手術之相同眼的第四次手術後回診。將執行下列評估：生命徵象、載體脫落取樣-血液、淚液(雙眼)、尿液、唾液、免疫原性取樣(ELISA及ELISPOT)、BCVA、完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、SD-OCT、自體螢光、AE/SAE監測及用藥回顧(包括回顧皮質類固醇日記卡)。

第 1 及第 2 階段，回診 6( 第 1 個月 ) 及回診 7( 第 3 個月 )

回診6(第1個月±7天)及回診7(第3個月±14天)將執行每一眼的眼科評估及程序。執行下列評估：生命徵象、載體脫落取樣-血液、淚液(雙眼)、尿液、唾液、免疫原性取樣(ELISA及ELISPOT)、BCVA、完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、SD-OCT、自體螢光、微視野檢查、AE/SAE監測及用藥回顧(包括回顧及繳回皮質類固醇日記卡)。

第 1 及第 2 階段，回診 8( 第 6 個月 ) 及回診 9( 第 12 個月 )

回診8(第6個月± 14天)及回診9(第12個月± 14天)執行每一眼的眼科評估及程序。執行下列評估：生命徵象(僅回診9，第12個月)、免疫原性取樣(ELISA及ELISPOT)、BCVA、完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、SD-OCT、自體螢光、微視野檢查、

視野彩色眼底攝影(包括視野1、2及3的立體攝影)(僅回診9，第12個月)、AE/SAE監測及用藥回顧。

提前終止

如果受試者在任何時間中止研究，試驗中心應窮盡所有合理努力確保進行ET回診。應執行下列評估(所有眼科評估將在雙眼進行)：生命徵象、載體脫落取樣-血液、淚液(雙眼)、尿液、唾液(只有在ET回診發生在治療後3個月以內的情況下)、免疫原性取樣(ELISA及ELISPOT)、BCVA、完整眼科檢查(包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查)、SD-OCT、自體螢光、微視野檢查、7視野彩色眼底攝影(包括視野1、2及3的立體攝影)、AE/SAE監測及用藥回顧。

不良事件

AE係臨床研究受試者的任何不良醫學事件，該事件不一定與研究藥物/手術程序具有因果關係。因此AE可為時間上與使用研究藥物/手術程序相關之任何有害且非預期的徵候(包括異常實驗室發現)、症狀或疾病，不論是否與研究性產品或本計劃書中描述之手術程序有關。AE亦包括在研究期間惡化(即頻率或強度增加)的任何既有病況(除CHM以外)或疾病。

嚴重不良事件

SAE定義為下列之任何不良醫學事件：導致死亡、危及生命、需要住院或延長目前的住院、導致持續或顯著失能/無能力、先天異常/先天缺陷、導致視力喪失或危及視力、另一重要醫學事件。「危險」定義中之用語「危及生命」係指受試者在事件發生時有死亡風險的事件。其並不是指如果更為嚴重，理論上可能造成死亡的事件。因既有病況住院(包括選擇性手術)但未惡化者不構成SAE。當其他不導致死亡、不危及生命或不需要住院的事件基於適當醫學判斷可能危害受試者且可能需要醫學或手術介入以預防上列結果之一時，該事件可視為SAE。

下列視力喪失或危及視力事件應被通報為SAE：相較於基線，VA持續降低≥15個ETDRS表上的字母，手術相關事件除外。持續定義為恢復前維持48小時或更久；恢復定義為VA回到基線VA的5個字母以內。

手術相關VA降低事件定義為VA降低的發生與手術投予研究藥物具有密切時間相關性(＜24小時以內)且在手術後第7天(第1/2階段，回診4)緩解。這些事件不應被通報為AE或SAE。然而，如果計劃主持人認為這些事件就持續時間或嚴重性的演變無法用程序解釋，則應被通報為AE。此將包括但不限於其中異常的手術後VA降低過程係與另一可歸因於手術或研究藥物之併發症相關或其中異常的手術後VA降低過程可歸因於另一可識別原因的案例。計劃主持人認為AE實際上或潛在性需要任何手術或醫學介入以預防永久視力喪失。

實驗室評估

載體脫落

收集血液、淚液(雙眼)、尿液及唾液樣本且使用適當測定測試載體脫落及分散的證據。

免疫原性

為了評估免疫原性，將在表61(研究程序時程)所示之時間收集血液。計畫免疫測定以評估基於抗體及細胞之對抗AAV2-REP1的反應。將使用ELISPOT測定對轉殖基因之T細胞媒介免疫反應且將使用基於ELISA之方法測定抗體反應。

生命徵象

生命徵象(脈搏、收縮壓及舒張壓)將在表61(研究程序時程)所示之時間測量。生命徵象應在受試者坐下至少5分鐘後測量。

完整眼科檢查

將在表61(研究程序時程)所示之時間執行雙眼的完整眼科檢查。每次眼科檢查將包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度分級及散瞳眼底鏡。任何給定受試者之研究回診皆應使用相同的裂隙燈機器及照明條件。除了上列參數之外，小心檢查受試者在載體投予後是否有眼內發炎存在。白內障亦可因玻璃體切除術程序發展且可潛在地影響VA。因此應記載手術前的晶狀體混濁度及顏色分級。發展出白內障之受試者可視臨床需要進行白內障手術。如果執行白內障手術，應於各別眼第12個月(回診9)之前至少4週進行。

7 視野彩色眼底攝影

將在表61(研究程序時程)所示之時間執行七視野彩色眼底攝影。眼底攝影將由認證技術人員在散瞳之後執行。應執行視野1、2及3的立體攝影。試驗中心應將所有眼底相片寄送至中央判讀中心(CRC)進行審查；CRC將輸入資料至電子資料擷取(EDC)系統。有關眼底攝影的完整技術規格，請參照研究作業手冊(其將包括關於如何取得測量值的CRC程序)。

療效評估

視敏度

為了評估視敏度(VA)在研究期間的變化，使用ETDRS VA表在表61(研究程序時程)所示之時間執行雙眼的BCVA評估。BCVA檢查應在散瞳之前執行，且在測量BCVA之前應進行遠距屈光(distance refraction)。起初，在距離表4公尺處閱讀字母。如果在4公尺閱讀＜20個字母，則應執行在1公尺處的測試。BCVA應報告為受試者正確閱讀之字母數。BCVA評估者將為具有進行評估的適當資格者。

眼底自體螢光

為了評估存活視網膜組織之區域的變化，在表61(研究程序時程)所示之時間執行雙眼的眼底自體螢光。

光譜域光學同調斷層掃描 (SD-OCT) 在表61(研究程序時程)所示之時間執行雙眼的SD-OCT。SD-OCT係用於量化橢圓體區的完整性及外核層及脈絡膜信號的減少。此外，評估小窩變化。

微視野檢查

在表61(研究程序時程)所示之時間進行雙眼的微視野檢查。進行微視野檢查以評估黃斑部內視網膜敏感度的變化。

實例 15 ： Star 研究

本研究係開放標籤、結果評估者加盲、前瞻性、隨機分組、平行對照組、多中心、全球、介入性研究。研究係由8次回診及12個月評估期組成。在篩選/基線回診時，評估每位受試者的參與資格。分配有資格參與受試者的研究眼，且受試者以2:1:2比例隨機分組以接受AAV2-REP1高劑量(1.0×10¹¹ 個基因體粒子[gp])、AAV2-REP1低劑量(1.0×10¹⁰ gp)或進入未治療對照組。

在注射日回診(回診2，第0天)時，AAV2-REP1高及低劑量治療組的受試者進行玻璃體切除術且以雙盲方式接受研究眼視網膜下注射經分配之治療劑量的AAV2-REP1；這些受試者接著在第1天(回診3)及第7天(回診4)回到試驗中心進行2次手術後追蹤回診。對照組的受試者不進行手術，他們的研究眼(即對照研究眼)不接受任何研究藥物也不出席2次試驗中心的手術後回診。相反地，試驗中心在第0天(回診2)、第1天(回診3)及第7天(回診4)以電話聯繫對照組。自回診2(第0天)起追蹤所有受試者12個月。

收集每位受試者雙眼的研究資料。由於AAV2-REP1治療需要在全身麻醉下進行侵入性手術程序，因此並未對試驗委託者、計劃主持人及受試者進行研究程序(即玻璃體切除術及視網膜下注射)的加盲，然而在治療組中，對試驗委託者、計劃主持人及受試者加盲經分配的劑量(1.0×10¹¹ gp或1.0×10¹⁰ gp)。為了進一步最小化治療及非治療眼評估的潛在偏差，所有篩選/基線回診(回診1)及自第1個月(回診5)以後(包括第12個月主要終點評估)的主觀眼科評估將由加盲評估者進行。

在整個研究期間如研究程序之時程中所示評估受試者的療效及安全性。發展出白內障之受試者可視臨床需要進行白內障手術；如果執行手術，應於第12個月回診/研究結束(EOS)回診之前至少4週進行。

受試者

大約140位受試者以2:1:2比例隨機分組；AAV2-REP1高劑量(1.0×10¹¹ gp)組56位受試者、AAV2-REP1低劑量(1.0×10¹⁰ gp) 28位受試者及未治療對照組56位受試者。

納入標準： 如果受試者符合所有下列納入標準則有資格參與研究：(1)願意且能夠簽署參與雙眼治療研究的知情同意書、(2)男性且年齡≥18歲、(3)具有經基因確診的CHM、(4)研究眼黃斑區內具有臨床可見之活性疾病、(5)研究眼具有34至73個ETDRS字母之BCVA(相當於劣於或等於6/12或20/40 Snellen敏度，但優於或等於6/60或20/200 Snellen敏度)。

排除標準： 如果受試者符合任何下列排除標準則沒有資格參與研究：(1)符合資格之眼具有弱視病史；(2)如果經AAV2-REP1治療，不願意在3個月期間使用屏障式避孕方法；(3)研究眼在回診1的3個月以內執行先前眼內手術；(4)具有任何其他顯著的眼或非眼疾病/病症，因此計劃主持人認為可能使受試者因為參與研究而承受風險、或可能影響研究結果或受試者參與研究的能力(包括但不限於口服皮質類固醇(例如普賴蘇龍/潑尼松)的禁忌症、有臨床顯著的白內障、計劃主持人臨床判斷認為不適合進行視網膜下手術者)；及(5)在過去12週已參與另一涉及研究性產品的試驗性研究或在先前任何時間接受基於基因/細胞的療法。

測試產品、劑量及投予模式： 所有接受活性治療之受試者在他們的研究眼進行玻璃體切除術且接受體積0.1 mL視網膜下注射含有高劑量(1.0×10¹¹ gp) AAV2-REP1或低劑量(1.0×10¹⁰ gp) AAV2-REP1之研究藥物。

評估標準：

主要療效終點係在第12個月藉由糖尿病視網膜病早期治療研究(ETDRS)表所測量之最佳矯正視力(BCVA)相較於基線改善≥15個字母的受試者比例。關鍵次要終點係當相較於BCVA在12個月內的變化第12個月的BCVA相較於基線改善≥15個字母的受試者比例。其他次要終點包括：(1)第12個月的BCVA相較於基線增加＞10個字母的受試者比例；(2)在第4、第8及第12個月所收集之BCVA相較於基線之平均變化的平均；(3)第12個月保留自體螢光(AF)總面積相較於基線的變化；(4)第12個月保留橢圓體區面積(光譜域光學同調斷層掃描[SD-OCT])相較於基線的變化；(5)第12個月微視野檢查相較於基線的變化；(6)第12個月對比敏感度分數相較於基線的變化；(7)第12個月色視覺相較於基線的變化；(8)第12個月閱讀速度測試相較於基線的變化；(9)第12個月藉由ETDRS表測量之BCVA維持；(10)第12個月25項視力功能問卷(VFQ-25)相較於基線的變化。探察性療效終點包括其他解剖學及功能性結果測量的評估。安全性終點包括安全性評估包括不良事件(AE)的評估。

療效： 療效評估係基於BCVA、眼底AF、SD-OCT、微視野檢查、對比敏感度、色視覺、閱讀速度測試評估、VFQ-25及低輝度視敏度(LLVA)。

安全性： 安全性評估係基於完整眼科檢查(包括眼內壓、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度分級及散瞳眼底鏡)、眼底攝影、AE通報、免疫原性及生命徵象。因療效評估(例如BCVA)所收集之任何安全性資訊視情況用於整體安全性評估。

研究設計

圖 24 提供本研究設計之示意圖。

在篩選/基線回診(回診1)時，評估每位受試者雙眼的參與資格。如果受試者僅具有1個符合資格之眼，則該眼被指定為「研究眼」且受試者的另一(無參與資格)眼被指定為「同儕眼」。如果受試者具有2個符合資格之眼，「研究眼」的選擇係根據臨床理由作出且通常是受到較嚴重影響之眼。此決定係作為知情同意過程的一部分，經過與每位受試者詳細討論及同意。如果雙眼之間的退化相對對稱，則考量受試者選擇。

在篩選/基線回診時，有資格參與之受試者將以2:1:2比例隨機分組至AAV2-REP1高劑量組(1.0×10¹¹ gp)、AAV2-REP1低劑量組(1.0×10¹⁰ gp)或未治療對照組。為了促進對研究設計的了解，基於治療組分配及研究/同儕眼的指定，將眼分成4類：AAV2-REP1研究眼(包括高及低劑量)；AAV2-REP1同儕眼(包括高及低劑量)；對照研究眼；及對照同儕眼。

在注射日回診(回診2，第0天)時，AAV2-REP1治療組的受試者進行玻璃體切除術及視網膜剝離，然後以雙盲方式接受研究眼(即AAV2-REP1研究眼)視網膜下注射AAV2-REP1高劑量(1.0×10¹¹ gp)或AAV2-REP1低劑量(1.0×10¹⁰ gp)；這些受試者接著在第1天(回診3)及第7天(回診4)回到試驗中心進行2次手術後追蹤回診。對照組的受試者不進行手術、不接受研究藥物也不出席2次試驗中心的安全性手術後回診。相反地，試驗中心在第0天(回診2)、第1天(回診3)及第7天(回診4)以電話聯繫對照組。自回診2(第0天)起追蹤所有受試者12個月。

收集每位受試者雙眼的研究資料。由於AAV2-REP1治療需要在全身麻醉下進行侵入性手術程序，因此並未對試驗委託者、計劃主持人及受試者進行研究程序(即玻璃體切除術及視網膜下注射)的加盲，然而在治療組中，對試驗委託者、計劃主持人及受試者加盲(即雙盲)經分配的劑量(1.0×10¹¹ gp或1.0×10¹⁰ gp)。為了進一步最小化治療及非治療眼評估的潛在偏差，所有篩選/基線回診(回診1)及自第1個月(回診5)以後的主觀眼科評估係由加盲評估者進行。在整個研究期間評估受試者的療效及安全性。療效評估係基於BCVA、眼底AF、SD-OCT、微視野檢查、對比敏感度、色視覺、閱讀速度測試、VFQ-25及低輝度視敏度(LLVA)。安全性評估係基於完整眼科檢查(包括眼內壓[IOP]、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度分級及散瞳眼底鏡)、眼底攝影、不良事件(AE)通報、實驗室評估(免疫原性)及生命徵象。因療效評估(例如BCVA)所收集之任何安全性資訊視情況用於整體安全性評估。

發展出白內障之受試者可視臨床需要進行白內障手術；如果執行手術，應於第12個月回診/研究結束(EOS)回診(主要終點)之前至少4週進行。

如果受試者完成第12個月評估，則被視為已完成研究。試驗結束係最後一位受試者完成他的第12個月評估(或如果過早停藥之提前終止[ET]評估)的日期，或如果最後一位受試者失去追蹤則為最後一次資料收集的日期。在研究完成之後，邀請經治療的受試者參與長期追蹤研究，允許在治療後5年期間進行持續療效及安全性監測。

投予之治療

在篩選/基線回診時，有資格參與之受試者以2:1:2比例隨機分組以接受AAV2-REP1低劑量(1.0×10¹⁰ gp)或AAV2-REP1高劑量(1.0×10¹¹ gp)，而未治療對照組之受試者不接受虛假手術或研究藥物。在注射日回診(回診2，第0天)時，AAV2-REP1係在AAV2-REP1組的受試者進行玻璃體切除術之後作為視網膜下注射投予。

醫藥組成物之性狀

玻璃體切除術程序及注射 AAV2-REP1

隨機分組

在篩選/基線回診時，所有患者係經分配篩選識別符，其包括中心編號及受試者編號。如果受試者在篩選/基線回診時符合所有資格標準，分配研究眼，且受試者以2:1:2比例隨機分組以接受AAV2-REP1高劑量(1.0×10¹¹ gp)、AAV2-REP1低劑量(1.0×10¹⁰ gp)或進入未治療對照組。隨機分組係使用經驗證的系統產製，該系統將治療組的隨機分配自動化為隨機分組號碼且依手術組分層。

併用療法：

研究回診及程序

研究程序之時程呈現於表62：研究程序時程。

回診 1( 篩選 / 基線回診 )

計劃主持人向每位潛在研究受試者解釋研究目的、程序及受試者責任。判定受試者符合計劃書規定的意願及能力。

獲得知情同意書之後，分配受試者識別編號給受試者且評估以判定參與資格。篩選/基線程序係由下列組成(若有需要可將評估分散在連續2天)：人口學、醫學及眼科病史(只有具有經基因確診的CHM之受試者可進入研究。基因確認必須在回診1之前取得)；生命徵象；體重；免疫測定取樣(酶連接免疫吸附測定[ELISA]及酶聯免疫斑點法[ELISPOT])；BCVA；LLVA；完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；SD-OCT；AF；微視野檢查；對比敏感度測試；色視覺測試；7視野彩色眼底攝影(包括視野1、2及3的立體攝影)；閱讀速度測試(適用的話)；VFQ-25；嚴重AE (SAE)監測；用藥回顧；及發放皮質類固醇(如果隨機分組至AAV2-REP1組)。為了在回診1(篩選/基線)捕捉正確的BCVA值，BCVA評估採用下列條件：如果研究眼回診1(篩選/基線)的BCVA值相較於先前NIGHT研究回診(適用的話)≥±10個字母增加或喪失，則必須再重複BCVA 2次，導致在回診1總共3次BCVA測量。為了促進額外BCVA測量，此回診應在2天進行，在第1天測量BCVA二次及第2天一次(在散瞳之前)。所有3個BCVA值必須記錄在eCRF中。使用最高分數決定受試者的參與資格。如果研究眼回診1(篩選/基線)的BCVA值相較於先前NIGHT研究回診＜±10個字母差異，則收集一次的BCVA且不再重複。

符合所有納入標準且不符合任一排除標準的受試者被分配一研究眼且收案至研究中。在此時，告知受試者隨機分組結果(即AAV2-REP1治療或對照組)且指示他們在研究期間不將治療組分配揭露給加盲評估者。經隨機分組至AAV2-REP1治療組的受試者(連同計劃主持人及試驗委託者)維持對經分配的劑量加盲。

下一次研究回診(回診2)排定在篩選/基線回診的8週以內。給予隨機分組至AAV2-REP1組的受試者21天療程的口服皮質類固醇(例如普賴蘇龍/潑尼松)且指示他們在下一次研究回診(回診2)之前2天開始服用藥物。指示隨機分組至AAV2-REP1組的受試者從他們接受治療時起3個月期間使用屏障式避孕。

如果受試者隨機分組至對照組，則回診2由電話聯繫組成。

回診 2( 第 0 天，注射日回診或電話聯繫 )

在回診2(第0天)時，所有AAV2-REP1組的受試者將到手術試驗中心且執行下列評估：完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；AE/SAE監測；併用藥物回顧；及皮質類固醇順從性回顧。

AAV2-REP1組的受試者在他們的研究眼進行玻璃體切除術且接受含有AAV2-REP1低劑量(1×10¹⁰ vg)或AAV2-REP1高劑量(1×10¹² vg)之AAV2-REP1視網膜下注射。小心監測受試者在程序期間的AE發生。受試者在手術後1及7天回到試驗中心進行手術後追蹤(分別為回診3[第1天]及4[第7天])。

對照組的受試者在同意的日期及時間接受研究回診電話聯繫。試驗中心在電話聯繫期間進行下列評估：AE/SAE監測及併用藥物回顧。

回診 3( 第 1 天手術後回診 )

在回診3(第1天)時，AAV2-REP1組的受試者回到手術試驗中心進行手術後回診。執行下列評估：生命徵象；免疫測定取樣(僅ELISA)；BCVA；完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；SD-OCT；AE/SAE監測；用藥回顧；及皮質類固醇順從性回顧。提醒受試者從治療時起3個月期間使用屏障式避孕的規定。

回診 4( 第 7 天手術後回診± 3 天 )

在回診4(第7天±3天)時，AAV2-REP1組的受試者回到他們的主試驗中心(即執行他們的回診1篩選/基線回診的相同試驗中心)進行第二次手術後回診。然而，對於該些從非手術試驗中心前往手術試驗中心的受試者，如果發生手術後併發症或任何其他研究外科醫師及手術試驗中心計劃主持人認為適當的安全性理由，回診4可在手術試驗中心進行。在此情況下，手術後追蹤應持續在手術試驗中心進行，直到外科醫師/手術試驗中心計劃主持人同意讓受試者出院到非手術試驗中心接受照護。執行下列評估：生命徵象；免疫測定取樣(ELISA及ELISPOT)；BCVA；LLVA；完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；SD-OCT；AF；微視野檢查；AE/SAE監測；用藥回顧；及皮質類固醇順從性回顧。

回診 5( 第 1 個月± 7 天 )

所有受試者從回診5以後出席他們的主試驗中心(即執行他們的回診1篩選/基線回診的相同試驗中心)。在回診5(第1個月±7天)時，所有受試者執行下列評估(若有需要可將評估分散在連續2天)：生命徵象；免疫測定取樣(ELISA及ELISPOT)；BCVA；LLVA；完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；SD-OCT；AF；微視野檢查；AE/SAE監測；用藥回顧；皮質類固醇順從性回顧。

回診 6( 第 4 個月± 7 天 )

在回診6(第4個月±7天)時，執行下列評估(若有需要可將評估分散在連續2天)：免疫測定取樣(ELISA及ELISPOT)；BCVA；LLVA；完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；SD-OCT；AF；微視野檢查；對比敏感度測試；色視覺測試；AE/SAE監測及用藥回顧。

回診 7( 第 8 個月± 14 天 )

在回診7(第8個月±14天)時，執行下列評估(若有需要可將評估分散在連續2天)：BCVA；LLVA；完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；SD-OCT；AF；微視野檢查；對比敏感度測試；色視覺測試；AE/SAE監測及用藥回顧。

回診 8( 第 12 個月± 14 天，研究結束回診 )

在回診8(第12個月±14天)時，執行下列評估(若有需要可將評估分散在連續2天)：生命徵象；BCVA；LLVA；完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；SD-OCT；AF；微視野檢查；對比敏感度測試；色視覺測試；7視野彩色眼底攝影(包括視野1、2及3的立體攝影)；閱讀速度測試(適用的話)；VFQ-25；AE/SAE監測及用藥回顧。

提前終止回診

如果受試者在任何時間中止研究，試驗中心應窮盡所有合理努力確保進行ET回診。應執行下列評估：生命徵象；免疫測定取樣(ELISA及ELISPOT)如果ET回診發生在第4個月以內；BCVA；LLVA；完整眼科檢查，包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度及散瞳眼底檢查；SD-OCT；AF；微視野檢查；對比敏感度測試；色視覺測試；7視野彩色眼底攝影(包括視野1、2及3的立體攝影)；閱讀速度測試(適用的話)；VFQ-25；AE/SAE監測及用藥回顧。

療效評估 所有回診時，應嘗試在雙眼執行所有程序。

最佳矯正視力

為了評估視敏度(VA)在研究期間的變化，使用ETDRS VA表在表62：研究程序時程所示之時間執行雙眼的BCVA評估。BCVA檢查應在散瞳之前執行，且在測量BCVA之前應進行遠距屈光(distance refraction)。起初，在距離表4公尺處閱讀字母。如果在4公尺閱讀＜20個字母，則應執行在1公尺處的測試。BCVA應報告為受試者正確閱讀之字母數。在篩選/基線回診時，具有34至73個ETDRS字母之BCVA(相當於劣於或等於6/12或20/40 Snellen敏度，但優於或等於6/60或20/200 Snellen敏度)的眼將有資格參與研究。如果受試者無法閱讀BCVA表上的任何字母，則測試受試者的數手指、手移動或光感知。

眼底自體螢光

為了評估存活視網膜組織之區域的變化，在表62：研究程序時程所示之時間執行雙眼的眼底AF。所有眼底AF影像係由試驗中心的認證技術人員在受試者散瞳之後執行。

光譜域光學同調斷層掃描 (SD-OCT)

將在表2：研究程序時程所示之時間執行雙眼的SD-OCT。SD-OCT測量係由試驗中心的認證技術人員在受試者散瞳之後進行。SD-OCT係用於評估一些變數，包括量化橢圓體區的完整性及外核層及脈絡膜信號的減少。此外，由於在早期階段的CHM注意到進行性小窩變厚，因此評估小窩變化。

微視野檢查

在表62：研究程序時程所示之時間進行雙眼的微視野檢查。微視野檢查係由認證技術人員進行以評估黃斑部內視網膜敏感度的變化。

對比敏感度

在表62：研究程序時程所示之時間測量雙眼的對比敏感度。對比敏感度係在散瞳之前使用Pelli-Robson表測量。

色視覺

在表62：研究程序時程所示之時間在散瞳之前測試雙眼的色視覺。每次評估以相同順序分開測試眼。

低輝度視敏度

在表62：研究程序時程所示之時間測量雙眼的LLVA。本測試應在BCVA測試之後、在散瞳之前執行，且在測量LLVA之前應進行遠距屈光。LLVA係藉由在各眼前方放置2.0對數單位中性密度濾光器並使受試者閱讀正常光照的ETDRS表來測量。起初，在距離表4公尺處閱讀字母。如果在4公尺閱讀＜20個字母，則應執行在1公尺處的測試。LLVA係報告為受試者正確閱讀之字母數。

閱讀速度測試

閱讀表現將在表62：研究程序時程所示之時間在散瞳之前使用國際閱讀速度文字(IReST)評估，其提供17種語言的閱讀表現標準化評估(Trauzettel-Klosinski et al., 2012)。

VFQ-25 問卷

受試者在表62：研究程序時程所示之時間填寫VFQ-25。此問卷測量對眼疾病人士而言最重要的自我報告視力靶向性健康狀態面相(Mangione et al, 2001)。VFQ-25的改善係使用個別分數、子量表分數及整體複合分數評估。

安全性評估

完整眼科檢查

在表62：研究程序時程所示之時間進行雙眼的完整眼科檢查。針對AAV2-REP1組的受試者，完整眼科檢查係在適用的研究回診在玻璃體切除術及投予研究藥物之前進行。眼科檢查將包括IOP、裂隙燈檢查、晶狀體混濁度分級及散瞳眼底鏡。任何給定受試者之研究回診皆應使用相同的裂隙燈機器及照明條件。

除了上列參數之外，小心檢查相關受試者在載體投予後是否有眼內發炎存在。白內障亦可因玻璃體切除術程序發展且可潛在地影響VA。因此應藉由已建立之臨床晶狀體混濁度分類系統記載手術前的晶狀體混濁度及顏色分級。白內障手術在CHM受試者係有效且無任何特定風險。因此如果臨床需要，發展出白內障之受試者可進行白內障手術。如果執行白內障手術，應於第12個月回診/EOS回診之前至少4週進行。

視野彩色眼底攝影

為了協助客觀臨床評估進行性視網膜變化，在表62：研究程序時程所示之時間執行雙眼的7視野彩色眼底攝影。眼底攝影係由認證技術人員在散瞳之後執行。應執行視野1、2及3的立體攝影。

不良事件

嚴重不良事件

療效分析

統計檢定係以0.05之α水準執行(除非另外指明)。統計檢定及95% CI將為雙邊。

主要療效終點

主要終點係計算為在第12個月回診時BCVA相較於基線增加≥15個字母的受試者比例。如果第12個月回診的VA缺失，則缺失值將使用LOCF方法插補。主要終點使用類別資料的摘要統計包括95% CI概述。使用費雪精準檢定比較研究組別之間(高劑量相較於對照、低劑量相較於對照)主要終點的成功比例。

關鍵次要療效終點

關鍵次要終點係STAR試驗中經治療的研究眼在第12個月回診時BCVA相較於基線增加≥15個字母之受試者比例，相較於NIGHT研究中自第4個月(回診2)至第16個月(回診5)BCVA增加≥15個字母之受試者比例(NSR-CHM-OS1)的成對樣本分析。關鍵次要終點分析係以歷史對照組全分析集執行。治療後(STAR資料)及治療前(NIGHT資料)的關鍵次要終點將使用類別資料的摘要統計包括95% CI概述。將使用McNemar檢定分開比較各治療組治療前及治療後之間類別變數的成功比例。

其他次要療效終點

使用和類別主要終點相同的程序概述及分析類別次要終點。

連續次要終點使用連續資料的摘要統計包括95% CI概述。相較於基線的平均變化及其95% CI的治療差異係基於ANCOVA模型的LSMEANS計算，包括手術組、評估之基線值、研究組及研究組與手術組之間的交互作用。使用上述ANCOVA模型比較研究組之間(高劑量相較於對照、低劑量相較於對照)相較於基線的變化。針對VFQ-25的整體複合分數，將年齡及種族共變數添加至模型。

安全性分析

安全性分析並未執行顯著性檢定。安全性分析係描述性，適當時計算95% CI。

不良事件

AE係使用藥事管理醫學字典編碼。將使用資料庫上鎖時現行的字典版本。事件按系統器官分類、首選用語及組別概述。概述經歷AE的眼/受試者數及事件數。產生類似的研究藥物/程序相關AE、導致停藥AE及SAE摘要。AE按最高嚴重性、與研究藥物/程序之關係及開始及緩解時間(time to onset and resolution)概述。

完整眼科檢查

IOP及IOP相較於基線的變化係依照回診、依照治療及依照眼概述。異常裂隙燈檢查發現及散瞳眼底鏡發現及相較於基線的偏移係依照回診、依照治療及依照眼概述。晶狀體混濁度類別及相較於基線的偏移係依照回診、依照治療及依照眼概述。

視野彩色眼底攝影

彩色眼底攝影類別及相較於基線的偏移係依照回診、依照治療及依照眼概述。

專利引文

除非明確排除或另有限制，否則本文中引用之每份文件(包括任何交叉參照或相關專利或申請案)特此以全文引用方式併入本文中。任何文件的引用並非認同其係本文中所揭示或主張之任何發明之先前技術或其單獨或與任何其他參照之任何組合教示、建議或揭示任何該發明。進一步言之，在此文件中之用語之任何意義或定義與以引用方式併入本文中之文件中的相同用語之任何意義或定義相衝突的情況下，以指派給此文件中之該用語之意義或定義為主。其他實施態樣

雖然已示範並描述本揭露之具體實施例，但是在不脫離本揭露之精神及範疇之情況下可作出各種其他變更及修改。隨附申請專利範圍之範疇包括屬於本揭露之範疇內之所有該等變更及修改。

圖1係例示性AAV2建構體藥物物質製造方法(製程2)之概覽。

圖2係對應圖1提供之概覽的流程圖。

圖3的圖示描繪例示性AAV2建構體之結構組織。

圖4係HEK293 MCB產生之概覽。

圖5係AAV2建構體藥物物質製造方法(原始製程)之概覽。

圖6係對應圖5提供之概覽的流程圖。

圖7係描繪AAV2建構體藥物產品製造方法(原始製程)之流程圖。

圖8的一對流程圖描繪原始及改善方法之細胞培養期的比較。

圖9的圖表描繪原始及改善方法之細胞培養期的比較。

圖10的圖表描繪原始及改善方法之細胞培養期的比較。

圖11的流程圖描繪自原始轉移至改善製程之下游方法。

圖12的圖表描繪AmpR(左長條)及KanR(右長條)質體之產率分析AVG DRP/cm²的比較。

圖13的圖表描繪闡明各細胞經AAV2建構體轉導之後的建構體表現之可偵測標籤的平均螢光強度。

圖14的圖表描繪藉由流動式細胞測量術所判定之GFP陽性細胞百分比，指示經AAV2建構體轉導之後表現建構體蛋白質之細胞的百分比。

圖15的圖表描繪AAV2建構體產率分析的平均產率結果。

圖16的凝膠電泳相片描繪AAV2建構體(非GMP)組成物(來自改善製程)之純度資料。

圖17的凝膠電泳相片描繪以等效MOI之來自原始及改善製程所產生之(非GMP)組成物之AAV2建構體載體體外轉導HEK293細胞之後的建構體表現及活性。

圖18係pAAV-REP1-Kan質體地圖。

圖19係pBC-hREP1載體的完整序列(SEQ ID NO: 24)。

圖20的圖表描繪治療及未治療眼在基因療法後2年的視敏度(實例13)。2年時使用早期治療糖尿病視網膜病研究(ETDRS)表測量12名接受視網膜下基因療法且無併發症的無脈絡膜症患者之視敏度(水平線代表中位數，盒形圖代表四分位數範圍及盒鬚代表極限)。治療眼以藍色顯示，未治療眼以綠色顯示(分別為各時間點的左長條及右長條)。亦顯示1年時的期間資料。治療眼的視敏度在基因療法後2年改善(p=0.020)。在這段期間內治療眼相對於未治療眼改善(p=0.003)。

圖21的圖表描繪治療及未治療眼在基因療法後2年的黃斑功能。微視野檢查測量的視網膜敏感度包括黃斑部各處的點且隨視網膜功能改善增加。未治療眼的視網膜敏感度到2年時相較於基線下降(p=0.004)，但治療眼在這段期間內並無顯著變化。亦顯示1年時的期間資料。治療眼以藍色顯示，未治療眼以綠色顯示(分別為各時間點的左長條及右長條)，誤差槓代表平均值的標準誤。

圖22係描繪實例14所述之GEMINI試驗的設計之示意圖。

圖23A至23B的示意圖描繪玻璃體切除術(A)及視網膜下注射(B)AAV2載體。(A)透過BIOM作業系統移除玻璃體凝膠的標準玻璃體切除術，隨後為(B)2步驟程序：1)藉由注射BSS剝離視網膜；2)透過41號規導管注射體積0.1 mL載體懸浮液至視網膜下空間。

圖24係描繪實例15所述之STAR試驗的設計之示意圖。

圖25的圖表顯示藉由PCR判定之AAV力價。X軸係初始力價1×10¹² DNA酶抗性粒子(DRP)/mL、1×10¹¹ DRP/mL及1×10¹¹ DRP/mL於平衡鹽水溶液(BSS)中之樣本。Y軸顯示樣本在經圖表右方所述處理之後所測量的力價。

圖26係一系列3張西方墨點轉漬法相片，顯示在使用高劑量1×10¹² DRP/mL的AAV2.REP1.ENG1014-A載體及10,000之MOI之相容性研究中，rAAV2.REP-1的異戊二烯化活性。從上到下顯示：hREP1(83 KDa)、肌動蛋白(42 KDa)及生物素化Rab6a(24 KDa)。蛋白質大小顯示於左側，從上到下為180、135、100、75、63、48、35、25、20、17及11 KDa。樣本(從左到右)三重複(in triplicate)係：未經轉導對照、經基線載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時之載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時且在180分鐘後注射之載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時且在注射器中180分鐘之載體轉導之細胞及作為陽性對照(單一樣本)之魚REP1。

圖27係一系列3張西方墨點轉漬法相片，顯示在使用低劑量1×10¹¹ DRP/mL的AAV2.REP1.ENG1014-A載體及10,000之MOI之相容性研究中，rAAV2.REP-1的異戊二烯化活性。從上到下顯示：hREP1(83 KDa)、肌動蛋白(42 KDa)及生物素化Rab6a(24 KDa)。蛋白質大小顯示於左側，從上到下為180、135、100、75、63、48、35、25、20、17及11 KDa。樣本(從左到右)三重複(in triplicate )係：未經轉導對照、經基線載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時之載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時且在180分鐘後注射之載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時且在注射器中180分鐘之載體轉導之細胞及作為陽性對照(單一樣本)之魚REP1。

圖28A至28B係在使用AAV2.REP1.ENG1014-A載體之相容性研究中，顯示rAAV2.REP-1的異戊二烯化活性之一對西方墨點轉漬法半定量圖表。(A)顯示標準化REP1。條帶密度值(a.u.)係y軸且高劑量1×10¹² DRP/mL及低劑量1×10¹¹ DRP/mL之AAV2-REP1係x軸。(B)顯示標準化生物素化Rab6a。條帶密度值(a.u.)係y軸且高劑量1×10¹² DRP/mL及低劑量1×10¹¹ DRP/mL之AAV2-REP1係x軸。在(A)及(B)中，各劑量的長條從左到右指示未經轉導細胞、經基線載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時之載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時且在20℃下180分鐘後注射之載體轉導之細胞、經在4℃下留置6小時且在20℃下注射器中180分鐘之載體轉導之細胞。

圖29係本揭露之例示性建構體，其包含下列核苷酸序列或由下列核苷酸序列組成：自5’至3’包含編碼5’反向末端重複(ITR)之序列、編碼CAG啟動子之序列、編碼人REP1蛋白質之序列、編碼經突變的WPRE信號之序列、編碼牛生長激素聚腺苷酸化信號之序列及編碼3’ ITR之序列。

Claims

一種用於自哺乳動物宿主細胞培養純化重組腺相關病毒(rAAV)粒子之方法，其包含下列步驟： (a)在適合形成複數個rAAV粒子的條件下，在培養基中培養複數個哺乳動物宿主細胞，其中該複數個哺乳動物宿主細胞已用包含外源性序列之質體載體、輔助質體載體及包含編碼病毒Rep蛋白質及病毒Cap蛋白質之序列之質體載體來轉染以產生複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞； (b)收集包含該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞之該培養基； (c)自該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞收集複數個rAAV粒子； (d)藉由切向流過濾(TFF)濃縮該複數個rAAV粒子以產生經濃縮的複數個rAAV粒子； (e)藉由密度梯度超離心富集該經濃縮的複數個rAAV粒子的完整rAAV粒子以產生經富集的複數個完整rAAV粒子； (f)藉由陰離子交換(AEX)層析法或親和性層析法純化該經富集的複數個完整rAAV粒子以產生包含經純化及經富集的複數個完整rAAV粒子之洗出液；及 (g)藉由切向流過濾(TFF)透析過濾及濃縮該來自(f)的洗出液至配方緩衝劑以產生包含該經純化及經富集的複數個完整rAAV粒子及該配方緩衝劑之最終組成物。
一種用於自哺乳動物宿主細胞培養純化重組腺相關病毒(rAAV)粒子之方法，其包含下列步驟： (a)在適合形成複數個rAAV-REP1粒子的條件下，在培養基中培養複數個哺乳動物宿主細胞，其中該複數個哺乳動物宿主細胞已用包含外源性序列之質體載體、輔助質體載體及包含編碼病毒Rep蛋白質及病毒Cap蛋白質之序列之質體載體來轉染以產生複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞，其中該外源性序列包含編碼人Rab護航蛋白質1 (human Rab escort protein 1)(REP1)蛋白質之序列； (b)收集包含該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞之該培養基； (c)自該複數個經轉染的哺乳動物宿主細胞收集複數個rAAV粒子； (d)藉由切向流過濾(TFF)濃縮該複數個rAAV粒子以產生經濃縮的複數個rAAV粒子； (e)藉由密度梯度超離心富集該經濃縮的複數個rAAV粒子的完整rAAV粒子以產生經富集的複數個完整rAAV粒子； (f)藉由陰離子交換(AEX)層析法或親和性層析法純化該經富集的複數個完整rAAV粒子以產生包含經純化及經富集的複數個完整rAAV粒子之洗出液；及 (g)藉由切向流過濾(TFF)透析過濾及濃縮該來自(f)的洗出液至配方緩衝劑以產生包含該經純化及經富集的複數個完整rAAV粒子及該配方緩衝劑之最終組成物。
如請求項1或2之方法，其中該培養基包含減少量的胎牛血清。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基不包含減少量的胎牛血清。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基包含無血清培養基。
如請求項1至3中任一項之方法，其中該培養基係由無血清培養基組成。
如請求項1至6中任一項之方法，其中該培養基包含無蛋白質培養基。
如請求項1至6中任一項之方法，其中該培養基係由無蛋白質培養基組成。
如請求項1至8中任一項之方法，其中該培養基包含甘胺酸、L-精胺酸鹽酸鹽、L-胱胺酸二鹽酸鹽、L-麩醯胺酸、L-組胺酸鹽酸鹽-H₂ O、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸鹽酸鹽、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸二鈉鹽去水物、L-纈胺酸、氯化膽鹼、D-泛酸鈣、葉酸、菸鹼醯胺、鹽酸吡哆醇、核黃素、鹽酸噻胺、i-肌醇、氯化鈣(CaCl₂ )(無水)、硝酸鐵(Fe(NO₃ )₃ "9H2O)、硫酸鎂(MgSO₄ )(無水)、氯化鉀(KCl)、碳酸氫鈉(NaHCO₃ )、氯化鈉(NaCl)、磷酸二氫鈉(NaH₂ PO4-H₂ O)及D-葡萄糖(右旋糖)。
如請求項1至9中任一項之方法，其中該哺乳動物細胞已用包含PEI轉導試劑之組成物來轉染。
如請求項1至10中任一項之方法，其中該包含外源性序列之質體載體進一步包含編碼5’反向末端重複(ITR)之序列及編碼3’ ITR之序列。
如請求項11之方法，其中該編碼5’ ITR之序列係衍生自編碼血清型2 AAV (AAV2)之5’ITR之序列。
如請求項11或12之方法，其中該編碼5’ ITR之序列包含與編碼血清型2 AAV (AAV2)之5’ITR之序列相同的序列。
如請求項11或12之方法，其中該編碼5’ ITR之序列包含與編碼血清型2 AAV(AAV2)之5’ITR之序列不相同的序列。
如請求項11至14中任一項之方法，其中該編碼3’ ITR之序列係衍生自編碼血清型2 AAV(AAV2)之3’ITR之序列。
如請求項15之方法，其中該編碼3’ ITR之序列包含與編碼血清型2 AAV (AAV2)之3’ITR之序列相同的序列。
如請求項16之方法，其中該編碼3’ ITR之序列包含與編碼血清型2 AAV (AAV2)之3’ITR之序列不相同的序列。
如請求項11至17中任一項之方法，其中該編碼5’ ITR之序列或該編碼3’ ITR之序列包含145個鹼基對(bp)。
如請求項11至17中任一項之方法，其中該編碼5’ ITR之序列或該編碼3’ ITR之序列包含134、135、136或137個鹼基對(bp)或由134、135、136或137個鹼基對組成。
如請求項1至19中任一項之方法，其中該包含外源性序列之質體載體、該輔助質體載體或該包含編碼病毒Rep蛋白質及病毒Cap蛋白質之序列之質體載體進一步包含編碼選擇標誌之序列。
如請求項20之方法，其中該編碼選擇標誌之序列傳達對康黴素(kanamycin)之抗性。
如請求項1至21中任一項之方法，其中該收集步驟(c)包含機械破壞(mechanical disruption)該複數個經轉染的哺乳動物細胞以釋放該複數個經轉染的哺乳動物細胞所產生的重組AAV(rAAV)粒子。
如請求項22之方法，其中該機械破壞包含微流體法。
如請求項1至23中任一項之方法，其中該濃縮步驟進一步包含(1)藉由深層過濾澄清該經濃縮的複數個rAAV粒子以產生經濃縮及經澄清的複數個rAAV粒子。
如請求項24之方法，其中該濃縮步驟進一步包含(2)在-80℃下冷凍該經濃縮及經澄清的複數個rAAV粒子以產生製程中間物。
如請求項1至25中任一項之方法，其中該富集步驟(e)包含碘克沙醇(iodixanol)密度梯度超離心以產生經富集的複數個rAAV粒子。
如請求項26之方法，其中該碘克沙醇密度梯度包含具有15%、25%、40%及57%濃度之碘克沙醇組成物。
如請求項1至27中任一項之方法，其中該純化步驟(f)之親和性層析法包含AVB Sepharose基質。
如請求項1至28中任一項之方法，其中該配方緩衝劑包含Tris、MgCl₂ 及NaCl。
如請求項1至27中任一項之方法，其中該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl，pH為8。
如請求項1至28中任一項之方法，其中該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 、200 mM NaCl、pH 8及0.001%的泊洛沙姆(poloxamer) 188。
如請求項1至31中任一項之方法，其中該AEX層析法進一步包含下列步驟：產製AEX層析圖，及選擇含有完整rAAV粒子之AEX層析圖上的尖峰。
如請求項1至32中任一項之方法，其中該步驟(d)或步驟(g)之TFF係使用100kDa中空纖維過濾器(HFF)執行。
如請求項1至33中任一項之方法，其中該步驟(d)或步驟(g)之TFF係使用50kDa HFF執行。
如請求項1至34中任一項之方法，其中該方法的步驟(g)進一步包含第二TFF，其中該步驟(d)之TFF及該步驟(g)之第一TFF係使用100kDa HFF執行且其中該步驟(g)之第二TFF係使用50kDa HFF執行。
如請求項2至35中任一項之方法，其中該編碼人REP1蛋白質之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項36之組成物，其中該人REP1蛋白質包含下列胺基酸序列或由下列胺基酸序列組成：
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至37中任一項之方法所產生的複數個rAAV粒子。
如申請專利範圍第38項之醫藥組成物，其包含： (a)介於0.5與2.5×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)； (b)小於50%空殼體； (c)每1.0×10¹² vg/mL小於4 ng/mL的殘餘宿主細胞蛋白質；及 (d)每1.0×10¹² vg/mL小於7×10^-3 pg/ml的殘餘宿主細胞DNA。
如請求項39之醫藥組成物，其中該組成物進一步包含 (e)複數個功能性vg/mL，其中各功能性載體基因體能夠在轉導之後在細胞中表現外源性序列。
如請求項40之醫藥組成物，其中在用該醫藥組成物轉導細胞之後，該複數個功能性vg/mL以相較於非轉導細胞中對應內源性序列增加2倍的表現水準表現該外源性序列。
如請求項40之醫藥組成物，其中在用該醫藥組成物轉導細胞之後，該複數個功能性vg/mL以相較於非轉導細胞中對應內源性序列增加3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍或任何其他介於之間的增加倍數的表現水準表現該外源性序列。
如請求項41或42之醫藥組成物，其中該外源性序列及該對應內源性序列係相同。
如請求項41或42之醫藥組成物，其中該外源性序列及該對應內源性序列係不相同。
如請求項41、42或44之醫藥組成物，其中該外源性序列及該對應內源性序列係不相同，但藉由該外源性序列所編碼之蛋白質及藉由該內源性序列所編碼之蛋白質係相同。
如請求項42或43之醫藥組成物，其中該外源性序列及該對應內源性序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同一性。
如請求項37至44中任一項之醫藥組成物，其中該外源性序列相較於該內源性序列係經密碼子最佳化。
如請求項47之醫藥組成物，其中該外源性序列及該對應內源性序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同源性。
如請求項38至48中任一項之醫藥組成物，其中在用本揭露之醫藥組成物轉導細胞之後，該外源性序列編碼蛋白質。
如請求項49之醫藥組成物，其中藉由該外源性序列所編碼之該蛋白質具有等於或大於藉由非轉導細胞之對應序列所編碼之蛋白質的活性水準之活性水準。
如請求項50之醫藥組成物，其中該外源性序列及該對應內源性序列係相同。
如請求項50之醫藥組成物，其中該外源性序列及該對應內源性序列係不相同。
如請求項52之醫藥組成物，其中該外源性序列及該對應內源性序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比之同一性。
如請求項49至52中任一項之醫藥組成物，其中該活性包含與配體或受質結合、活化配體或受質及/或將一或多個官能基轉移至配體或受質。
如請求項38至54中任一項之醫藥組成物，其中該蛋白質包含REP-1蛋白質且該活性包含REP-1受質之異戊二烯化(prenylation)。
如申請專利範圍第38至55項中任一項之醫藥組成物，其包含 (a)介於1.0與2.0×10¹² 個載體基因體(vg)/mL之間的複製缺陷及重組腺相關病毒(AAV)。
如申請專利範圍第38至55項中任一項之醫藥組成物，其包含 (a)約1.0×10¹² 個載體基因體(vg)/mL的複製缺陷及重組腺相關病毒(AAV)。
如申請專利範圍第38至55項中任一項之醫藥組成物，其包含 (a)1.0×10¹² 個載體基因體(vg)/mL的複製缺陷及重組腺相關病毒(AAV)。
如申請專利範圍第38至55項中任一項之醫藥組成物，其包含 (b)小於50%空殼體或小於30%空殼體。
如請求項38至59中任一項之醫藥組成物，其中該複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)含有單離自或衍生自血清型2 AAV (AAV2)之序列。
如請求項60之醫藥組成物，其中該單離自或衍生自AAV2之序列包含編碼反向末端重複(ITR)之序列。
如請求項60或61之醫藥組成物，其中該複製缺陷及重組腺相關病毒(rAAV)含有編碼5’ ITR之序列及編碼3’ ITR之序列。
如請求項62之醫藥組成物，其中該編碼5’ ITR之序列及該編碼3’ ITR之序列包含AAV2 ITR之野生型序列。
如請求項38至63中任一項之醫藥組成物，其中該宿主細胞係單離自或衍生自經培養的細胞系。
如請求項64之醫藥組成物項，其中該宿主細胞係HEK293細胞。
如請求項38至63中任一項之醫藥組成物，其中該宿主細胞係單離自或衍生自初代細胞系。
如請求項66之醫藥組成物，其中該宿主細胞係永生化細胞或幹細胞。
如請求項1至37中任一項之方法，其中該宿主細胞係單離自或衍生自經培養的細胞系。
如請求項68之方法，其中該宿主細胞係HEK293細胞。
如請求項1至37中任一項之方法，其中該宿主細胞係單離自或衍生自初代細胞系。
如請求項70之方法，其中該宿主細胞係永生化細胞或幹細胞。
如請求項38至67中任一項之醫藥組成物，其中該最終組成物之該複數個完整rAAV粒子的各完整rAAV進一步包含：核酸序列，該核酸序列自5’至3’包含： (a)編碼AAV2 5’ ITR之序列， (b)編碼早期增強子元件之序列， (c)編碼啟動子之序列， (d)編碼外顯子及內含子之序列， (e)編碼剪接受體位點之序列， (f)編碼Rab護航蛋白質1(REP1)蛋白質之序列， (g)編碼轉錄後調節元件(PRE)之序列， (h)編碼聚腺苷酸化(polyA)位點之序列，及 (i)編碼AAV2 3’ ITR之序列。
如請求項72之醫藥組成物，其中該早期增強子元件包含單離自或衍生自巨細胞病毒(CMV)之序列。
如請求項73之醫藥組成物，其中該早期增強子元件包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項73之醫藥組成物，其中該早期增強子元件包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至75中任一項之醫藥組成物，其中該編碼啟動子之序列包含下列序列或由下列序列組成：單離自或衍生自編碼雞β肌動蛋白(CBA)基因之序列。
如請求項72至75中任一項之醫藥組成物，其中該編碼外顯子及內含子之序列包含下列序列或由下列序列組成：單離自或衍生自編碼雞β肌動蛋白(CBA)基因之序列。
如請求項72至75中任一項之醫藥組成物，其中該編碼啟動子之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至78中任一項之醫藥組成物，其中該編碼外顯子及內含子之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至79中任一項之醫藥組成物，其中該編碼剪接受體位點之序列包含單離自或衍生自編碼家兔(Oryctolagus cuniculus)β球蛋白剪接受體位點之序列的序列。
如請求項80之醫藥組成物，其中該編碼家兔β球蛋白剪接受體位點之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至81中任一項之醫藥組成物，其中該包含早期增強子元件之序列、該包含啟動子之序列、該包含內含子及外顯子之序列及該包含剪接受體位點之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至81中任一項之醫藥組成物，其中該包含早期增強子元件之序列、該包含啟動子之序列、該包含內含子及外顯子之序列及該包含剪接受體位點之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至83中任一項之醫藥組成物，其中該編碼REP1蛋白質之序列包含單離自或衍生自哺乳動物REP1序列之序列。
如請求項84之醫藥組成物，其中該哺乳動物REP1序列係單離自或衍生自小鼠、大鼠、兔、非人靈長動物或人。
如請求項84之醫藥組成物，其中該哺乳動物REP1序列係單離自或衍生自人。
如請求項86之醫藥組成物，其中該編碼人REP1蛋白質之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項86或87之組成物，其中該人REP1蛋白質包含下列胺基酸序列或由下列胺基酸序列組成：
如請求項72至88中任一項之醫藥組成物，其中該編碼PRE之序列包含單離自或衍生自土撥鼠肝炎病毒(WPRE)之序列。
如請求項89之醫藥組成物，其中該編碼WPRE之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至90中任一項之醫藥組成物，其中該編碼聚腺苷酸化(polyA)位點之序列包含單離自或衍生自哺乳動物基因之序列。
如請求項91之醫藥組成物，其中該編碼聚腺苷酸化(polyA)位點之序列包含單離自或衍生自牛生長激素基因(BGH)之序列。
如請求項92之組成物，其中該編碼polyA位點之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至93中任一項之醫藥組成物，其中該編碼AAV2 5’ITR之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至93中任一項之醫藥組成物，其中該編碼AAV2 3’ITR之序列包含下列核酸序列或由下列核酸序列組成：
如請求項72至95中任一項之醫藥組成物，其中該自5’至3’包含元件(a)至(i)之核酸包含DNA序列或由DNA序列組成。
如請求項96之醫藥組成物，其中該自5’至3’包含元件(a)至(i)之核酸包含單股DNA序列或由單股DNA序列組成。
如請求項72至97中任一項之醫藥組成物，其中該最終組成物之該複數個完整rAAV的各rAAV包含單離自或衍生自AAV2之殼體蛋白質。
如請求項98之醫藥組成物，其中該AAV2殼體蛋白質包含與下列胺基酸序列具有至少95%同一性之序列：
如請求項98之醫藥組成物，其中該AAV2殼體蛋白質包含下列胺基酸序列：
如請求項72至100中任一項之醫藥組成物，其中該醫藥組成物進一步包含配方緩衝劑。
如請求項101之醫藥組成物，其中該配方緩衝劑包含Tris、MgCl₂ 及NaCl。
如請求項101之醫藥組成物，其中該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 及200 mM NaCl，pH為8。
如請求項101之醫藥組成物，其中該配方緩衝劑包含20 mM Tris、1 mM MgCl₂ 、200 mM NaCl、pH 8及0.001%的泊洛沙姆(poloxamer) 188。
如請求項72至104中任一項之醫藥組成物，其中該複數個完整rAAV之濃度係介於1×10⁸ 個基因體粒子(gp)/mL與1×10¹⁴ gp/mL之間(終點包括在內)。
如請求項105之醫藥組成物，其中該複數個完整rAAV之濃度係介於0.5×10¹⁰ gp/mL與2.5×10¹² gp/mL之間(終點包括在內)。
如請求項105之醫藥組成物，其中該複數個完整rAAV之濃度係介於1×10¹¹ gp/mL與5×10¹³ gp/mL之間(終點包括在內)。
如請求項105之醫藥組成物，其中該複數個完整rAAV之濃度係介於1×10¹¹ gp/mL與2×10¹² gp/mL之間(終點包括在內)。
如請求項105之醫藥組成物，其中該複數個完整rAAV之濃度係1×10¹² gp/mL。
如請求項105之醫藥組成物，其中該複數個完整rAAV之濃度係1×10¹¹ gp/mL。
如請求項72至110中任一項之醫藥組成物，其中該複數個完整rAAV之濃度使用qPCR測量。
如請求項111之醫藥組成物，其中該qPCR使用超螺旋質體載體作為標準。
如請求項111之醫藥組成物，其中該qPCR使用線性化質體載體作為標準。
一種遞送裝置，其包含如請求項72至113中任一項之醫藥組成物。
如請求項114之遞送裝置，其中該遞送裝置包含注射器、導管及針頭中一或多者。
如請求項114之遞送裝置，其中該遞送裝置適合用於藉由注射投予該醫藥組成物。
如請求項114之遞送裝置，其中該遞送裝置適合用於藉由輸注投予該醫藥組成物。
如請求項114至117中任一項之遞送裝置，其中該遞送裝置適合用於藉由視網膜下途徑投予該醫藥組成物。
如請求項114至117中任一項之遞送裝置，其中該遞送裝置適合用於藉由脈絡膜上途徑投予該醫藥組成物。
一種在有治療需要之個體中治療疾病或病症之方法，其包含向該個體投予治療有效量的如請求項38至113中任一項之醫藥組成物。
如請求項120之方法，其中該疾病或病症係視網膜的疾病或病症。
如請求項120或121之方法，其中該疾病或病症係無脈絡膜症。
如請求項120至122中任一項之方法，其中該治療有效量包含介於該醫藥組成物之最小有效量與最大耐受量之間的量。
如請求項123之方法，其中該最小有效量包含足以轉導視網膜或其目標部分之至少一個神經元的該醫藥組成物的量。
如請求項123之方法，其中該最小有效量包含足以轉導視網膜或其目標部分之至少1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或介於之間的任何百分比神經元的該醫藥組成物的量。
如請求項123至125中任一項之方法，其中該最小有效量包含足以改善該個體之視敏度(visual acuity)的該醫藥組成物之量。
如請求項123至125中任一項之方法，其中該最小有效量包含足以減少視網膜疾病之徵候或症狀的該醫藥組成物之量。
如請求項127所述之方法，其中該視網膜疾病係無脈絡膜症。
如請求項123至128中任一項之方法，其中該最大耐受量包含足以誘發不良事件的該醫藥組成物之量。
如請求項129之方法，其中該不良反應包含對該醫藥組成物之免疫反應。
如請求項130之方法，其中該免疫反應包含炎症。
如請求項131之方法，其中該炎症係全身性。
如請求項131之方法，其中該炎症係局部性。
如請求項129至133中任一項之方法，其中該不良事件係嚴重。
如請求項134之方法，其中該不良事件無法藉由向該個體投予二級醫學治療來預防、減少或控制。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該醫藥組成物之治療有效量包含具有介於10⁴ 與10⁶ 之間(終點包括在內)的感染複數(multiplicity of infection, MOI)之量。
如請求項136之方法，其中該醫藥組成物之治療有效量包含具有介於10⁴ 與10⁵ 之間(終點包括在內)的感染複數(MOI)之量。
如請求項136之方法，其中該醫藥組成物之治療有效量包含具有10⁵ 的感染複數(MOI)之量。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該治療有效量包含介於1×10⁸ gp與1×10¹³ gp之間(終點包括在內)。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該治療有效量包含介於6×10⁹ gp與1×10¹³ gp之間(終點包括在內)。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該治療有效量包含介於6×10⁹ gp與7×10¹² gp之間(終點包括在內)。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該治療有效量包含介於6×10⁹ gp與5×10¹² gp之間(終點包括在內)。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該治療有效量包含介於1×10¹⁰ gp與1×10¹² gp之間(終點包括在內)。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該治療有效量包含下列或由下列組成：1×10¹⁰ gp。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該治療有效量包含下列或由下列組成：1×10¹¹ gp。
如請求項120至135中任一項之方法，其中該治療有效量包含下列或由下列組成：1×10¹² gp。
如請求項120至146中任一項之方法，其中該治療有效量包含下列體積或由下列體積組成：介於10 µL與200 µL之間(終點包括在內)。
如請求項147之方法，其中該治療有效量包含下列體積或由下列體積組成：介於10 µL與50 µL之間、介於50 µL與100 µL之間、介於100 µL與150 µL之間或介於150 µL與200 µL之間(各範圍的終點包括在內)。
如請求項120至148中任一項之方法，其中該治療有效量包含下列體積或由下列體積組成：介於70 µL與120 µL之間(終點包括在內)。
如請求項120至149中任一項之方法，其中該治療有效量包含下列體積或由下列體積組成：100 µL。
如請求項120至150中任一項之方法，其中該投予步驟包含注射或輸注。
如請求項120至151中任一項之方法，其中該投予步驟包含視網膜下、脈絡膜上或玻璃體內途徑。
如請求項120至152中任一項之方法，其中該投予步驟包含視網膜下注射或輸注。
如請求項153之方法，其中該視網膜下注射或輸注包含2步驟視網膜下注射。
如請求項120至152中任一項之方法，其中該投予步驟包含脈絡膜上注射或輸注。
如請求項120至155中任一項之方法，其中該個體係男性。
如請求項156之方法，其中該個體係至少18歲。
如請求項120至157中任一項之方法，其中該個體具有經基因確診的無脈絡膜症。
如請求項154之方法，其中該個體經識別為具有REP1基因突變。
如請求項120至159中任一項之方法，其中該個體至少一眼的黃斑部呈現無脈絡膜症的臨床徵候。
如請求項120至160中任一項之方法，其中該個體至少一眼具有34至73個字母的最佳矯正視力(BCVA)分數。
如請求項120至161中任一項之方法，其中該個體具有輕微或早期階段的無脈絡膜症。
如請求項120至162中任一項之方法，其中該個體具有晚期或嚴重的無脈絡膜症。
如請求項120至163中任一項之方法，其中該方法包含治療至少一眼之10 mm² 的視網膜。
如請求項164之方法，其中該方法包含治療至少一眼之介於5 mm² 與10 mm² 之間(終點包括在內)的視網膜。
如請求項164之方法，其中該方法包含治療至少一眼之介於2 mm² 與15 mm² 之間(終點包括在內)的視網膜。
如請求項120至166中任一項之方法，其中該醫藥組成物係向該個體之一眼投予。
如請求項120至167中任一項之方法，其中該醫藥組成物係向該個體之雙眼投予。
如請求項168之方法，其中該個體之雙眼係同時治療。
如請求項169之方法，其中該個體之雙眼係依序治療。
如請求項120至170中任一項之方法，其中在向該個體投予該醫藥組成物之前，該個體之至少一眼已接受過無脈絡膜症之治療。
如請求項120至171中任一項之方法，其中該方法包含每眼投予介於1與12劑之間(終點包括在內)。
如請求項172之方法，其中該方法包含至少每天一次、每週一次、每月一次、每三個月一次、每6個月一次或每年一次投予至少一劑。
如請求項173之方法，其中該方法包含投予多劑且其中各劑包含相同量的該醫藥組成物。
如請求項173之方法，其中該方法包含投予多劑且其中各劑不包含相同量的該醫藥組成物。
如請求項172至175中任一項之方法，其中該方法包含投予多劑且其中各後繼劑量比前一劑包含較大數量的完整rAAV。
如請求項172至175中任一項之方法，其中該方法包含投予多劑且其中各後繼劑量比前一劑包含較小數量的完整rAAV。
如請求項172至177中任一項之方法，其中該個體在一劑之後經歷不良事件且其中該後續劑量比誘發該不良事件之前一劑包含較小數量的完整rAAV。
如請求項178之方法，其中該個體從該不良事件恢復且其中向該個體投予後續劑量的該醫藥組成物。
如請求項179之方法，其中誘發該不良事件之該劑量及該後續劑量含有相等數量的完整rAAV。
如請求項179之方法，其中誘發該不良事件之該劑量及該後續劑量不含有相等數量的完整rAAV。
如請求項120至181中任一項之方法，其中該方法在投予治療有效量之該醫藥組成物之前進一步包含向該個體投予複數個安慰劑rAAV之量，其中各安慰劑rAAV係空rAAV。
如請求項182之方法，其中該空rAAV不含有表現外源性序列之啟動子或外源性序列。
如請求項120至183中任一項之方法，其中投予該複數個安慰劑rAAV之量係全身性。
如請求項120至183中任一項之方法，其中投予該複數個安慰劑rAAV之量係局部性。
如請求項182至185中任一項之方法，其中該方法進一步包含 (a)判定該複數個安慰劑rAAV是否誘發該個體之免疫反應及/或 (b)判定該個體是否發展出對該複數個安慰劑rAAV之免疫耐受性，藉此表明投予治療有效量之該醫藥組成物應該不會誘發該個體之免疫媒介之不良事件。
如請求項120至186中任一項之方法，其中該方法進一步包含投予免疫反應之抑制劑。
如請求項187之方法，其中該抑制劑包含抗發炎劑。
如請求項188之方法，其中該抗發炎劑包含皮質類固醇。
如請求項189之方法，其中該皮質類固醇包含潑尼松(prednisone)或普賴蘇龍(prednisolone)。
如請求項187至190中任一項之方法，其中投予該免疫反應之抑制劑係全身性。
如請求項191之方法，其中該免疫反應之抑制劑係經口投予。
如請求項187至190中任一項之方法，其中投予該免疫反應之抑制劑係局部性。
如請求項193之方法，其中該免疫反應之抑制劑係向接受該醫藥組成物之治療之眼投予。
如請求項187至194中任一項之方法，其中該醫藥組成物及該免疫反應之抑制劑係同時投予。
如請求項195之方法，其中該醫藥組成物及該免疫反應之抑制劑係在同一天投予。
如請求項187至194中任一項之方法，其中該醫藥組成物及該免疫反應之抑制劑係依序投予。
如請求項197之方法，其中該抑制劑在投予該醫藥組成物至少一天之前投予。
如請求項193之方法，其中該醫藥組成物在投予該抑制劑至少一天之前投予。
如請求項120至199中任一項之方法，其中該方法進一步包含判定該個體之至少一眼的無脈絡膜症媒介之傷害的初始嚴重性。
如請求項120至200中任一項之方法，其中該方法進一步包含在向該至少一眼投予該醫藥組成物之後判定該個體之該至少一眼的無脈絡膜症媒介之傷害的後續嚴重性。
如請求項200或201之方法，其中該無脈絡膜症媒介之傷害的初始或後續嚴重性係藉由下列判定：判定最佳矯正視力(BCVA)檢查分數、測量存活視網膜組織之面積或體積、測量保留橢圓體區、測量視網膜敏感度、測量對比敏感度、測量色視覺、測量低輝度視敏度、測量速讀或彼等之任何組合。
如請求項202之方法，其中該BCVA檢查利用(糖尿病視網膜病早期治療研究)ETDRS表。
如請求項202或203之方法，其中該BCVA檢查包含數手指、手移動、光感知及彼等之組合中一或多者之評估。
如請求項202之方法，其中存活視網膜組織包含眼底自體螢光且其中測量存活視網膜組織包含偵測眼底自體螢光之水準或模式。
如請求項202之方法，其中測量保留橢圓體區包含光譜域光學同調斷層掃描(SD-OCT)。
如請求項202之方法，其中測量視網膜敏感度包含微視野檢查。
如請求項120至207中任一項之方法，其中投予該治療有效量之該醫藥組成物抑制或減少無脈絡膜症之徵候或症狀的進展。
如請求項120至207中任一項之方法，其中投予該治療有效量之該醫藥組成物減少無脈絡膜症之徵候或症狀。
如請求項120至207中任一項之方法，其中無脈絡膜症之徵候或症狀包含喪失感光受體細胞、喪失RPE細胞、視敏度降低、低輝度視敏度降低、保留自體螢光(AF)總面積、BCVA檢查分數低、保留橢圓體區的面積降低、視網膜敏感度降低、對比敏感度降低、色視覺降低或變淡、速讀速度降低或彼等之任何組合。
如請求項210之方法，其中該無脈絡膜症之徵候或症狀的嚴重性係相對於健康視網膜判定。
如請求項211之方法，其中該健康視網膜屬於年齡相符對照個體。
一種判定如請求項38至212中任一項之醫藥組成物的治療有效量之方法，該方法包含： (a)測量所欲治療之個體的視網膜區， (b)判定該(a)之區是否在中央0.5 mm² 小窩區中或在黃斑部中， (c)計算該(a)之區中的桿狀細胞、錐狀細胞及視網膜色素上皮(RPE)細胞數量，及 (d)將細胞總數乘以1×10⁵ 之感染複數(MOI)以計算待包括在該治療有效量中之基因體粒子(gp)的數量，其中該所欲治療之視網膜的最大面積係10 mm² ，其中該視網膜中RPE細胞之密度係每mm² 5,000個細胞，其中該視網膜中桿狀細胞之密度係每mm² 75,000個桿狀細胞(不包括中央0.5 mm² 小窩區)，其中該視網膜中錐狀細胞之密度在該中央0.5 mm² 小窩區係每mm² 150,000個錐狀細胞，且該視網膜中錐狀細胞之密度在該中央0.5 mm² 小窩區以外的黃斑部係每mm² 25,000個。