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TW201922774A - 標靶bcma嵌合抗原受體、標靶cd19嵌合抗原受體及組合療法 - Google Patents

標靶bcma嵌合抗原受體、標靶cd19嵌合抗原受體及組合療法 Download PDF

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TW201922774A
TW201922774A TW107140662A TW107140662A TW201922774A TW 201922774 A TW201922774 A TW 201922774A TW 107140662 A TW107140662 A TW 107140662A TW 107140662 A TW107140662 A TW 107140662A TW 201922774 A TW201922774 A TW 201922774A
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TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
car
cell therapy
individual
bcma
Prior art date
Application number
TW107140662A
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English (en)
Inventor
亞當 大衛 柯恩
艾爾弗雷德 卡福爾
卡爾 H 琴
麥克 Ｃ 米隆
蓋伯拉 普莉莎
艾德華 Ａ 史黛德摩爾
Original Assignee
瑞士商諾華公司
賓夕法尼亞大學董事會
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商諾華公司, 賓夕法尼亞大學董事會 filed Critical 瑞士商諾華公司
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Abstract

本發明提供用於治療與BCMA之表現相關之疾病之組合物及方法。本發明亦係關於投與標靶BCMA嵌合抗原受體(CAR)療法及額外治療劑之方法。

Description

標靶BCMA嵌合抗原受體、標靶CD19嵌合抗原受體及組合療法
本發明概言之係關於經改造以表現標靶B細胞成熟抗原蛋白(BCMA)之嵌合抗原受體之細胞、視情況與額外治療劑組合以治療與BCMA之表現相關之疾病的用途。本發明進一步闡述標靶BCMA療法之預後生物標記物。
BCMA係在B細胞譜系之細胞上表現之腫瘤壞死家族受體(TNFR)成員。BCMA表現在假設長壽命之漿細胞死亡之終末分化的B細胞中最高，包括漿細胞、漿母細胞及活化B細胞及記憶B細胞之亞群體。BCMA參與介導漿細胞之存活以維持長期體液性免疫性。BCMA之表現最近與許多癌症、自體免疫病症及傳染病相關聯。BCMA表現增加之癌症包括一些血液癌症，例如多發性骨髓瘤(MM)、霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、各種白血病(例如慢性淋巴球性白血病(CLL))及神經膠母細胞瘤。
鑒於對標靶疾病(例如癌症)之改良策略之持續需求，高度期望用於改良標靶BCMA之治療劑之新組合物及方法，例如抗BCMA嵌合抗原受體(CAR)療法。
本揭示內容至少部分地特徵在於治療與B細胞成熟抗原(BCMA)之表現相關之疾病或病症的方法，其包含向個體投與BCMA CAR表現細胞療法。
在一態樣中，本文揭示治療個體之方法，其包含向個體投與BCMA CAR表現細胞療法，其中該個體患有III期高風險多發性骨髓瘤(例如依據修訂之國際分期系統，III期高風險多發性骨髓瘤)，藉此治療個體。
在一個實施例中，在投與BCMA CAR表現細胞療法之前，個體已接受一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁(lenalidomide)、硼替佐米(bortezomib)或地塞米松(dexamethasone))。在一個實施例中，個體已對或正對一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)有反應。在一個實施例中，在接受一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)後，個體已顯示完全反應、極佳部分反應或部分反應。
在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病(例如III期高風險多發性骨髓瘤，例如依據修訂之國際分期系統之III期高風險多發性骨髓瘤)的方法，其包含向個體投與BCMA CAR表現細胞療法，其中BCMA CAR表現細胞療法係在一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)之後投與，其中個體已對或正對一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)有反應，例如個體在一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)後已顯示完全反應、極佳部分反應或部分反應。
在一些實施例中，本文揭示之方法進一步包含向個體投與CD19 CAR表現細胞療法。不期望受限於理論，多發性骨髓瘤可至少部分由具有癌症幹細胞性質之多發性骨髓瘤細胞之較小亞組介導，該等多發性骨髓瘤細胞類似於B淋巴球且表現CD19。CD19 CAR表現細胞療法可藉由標靶早期譜系癌細胞(例如癌症幹細胞)、調節免疫反應、消耗調控B細胞及/或改良腫瘤微環境來提高BCMA CAR表現細胞療法之效能。在一些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法係在BCMA CAR表現細胞療法之投與之前、並行或之後投與。在一些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法係與BCMA CAR表現細胞療法之投與並行投與。
在一些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個細胞(例如活的CAR表現細胞)、例如約5×108 個細胞(例如活的CAR表現細胞)、例如約5×108 個細胞(例如活的CAR表現細胞)之劑量以單次輸注投與。
在一些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個細胞(例如活的CAR表現細胞)、例如約5×108 個細胞(例如活的CAR表現細胞)、例如約5×108 個細胞(例如活的CAR表現細胞)之劑量以單次輸注投與。
在一些實施例中，本文揭示之方法進一步包含在投與BCMA CAR表現細胞療法或CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺(cyclophosphamide)及/或氟達拉濱(fludarabine))。在一些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法及/或CD19 CAR表現細胞療法係在完成調節劑之投與之後(例如在投與最後一個劑量之淋巴清除劑，例如最後一個劑量之淋巴細胞清除性化學療法，例如最後一個劑量之環磷醯胺及/或氟達拉濱之後) 2、3或4天(例如3天)投與。在一些實施例中，本文揭示之方法進一步包含在投與調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)之前，自個體獲得樣本(例如血球分離樣本)及使用該樣本製造BCMA CAR表現細胞療法及/或CD19 CAR表現細胞療法。
在一些實施例中，本文揭示之方法進一步包含在投與BCMA CAR表現細胞療法及/或CD19 CAR表現細胞療法之後，例如在投與BCMA CAR表現細胞療法及/或CD19 CAR表現細胞療法之後28、29、30、31或32天，投與維持劑(例如雷利竇邁)。
在一態樣中，本文揭示評估CAR表現細胞療法在患有與BCMA表現相關之疾病(例如III期高風險多發性骨髓瘤，例如依據修訂之國際分期系統之III期高風險多發性骨髓瘤)之個體中的有效性之方法，其中個體已接受或正接受CAR表現細胞療法，且其中CAR表現細胞療法包含BCMA CAR表現細胞療法與CD19 CAR表現細胞療法之組合，該方法包含：在個體開始接受CAR表現細胞療法之後之至少一個時間點，
(i) 獲取個體中、例如個體之樣本中抗SOX2免疫反應(例如抗SOX2抗體反應或T細胞反應)之程度之第一值，及/或
(ii) 獲取個體中、例如個體之樣本中SOX2含量或活性(例如SOX2表現程度)之第二值，
其中：
(1)與第一參照值相比，第一值增加，及/或與第二參照值相比，第二值減小，指示CAR表現細胞療法在個體中有效(例如個體對CAR表現細胞療法有反應)；及
(2)與第一參照值相比，第一值減小，及/或與第二參照值相比，第二值增加，指示CAR表現細胞療法在個體中無效或最低效(例如，個體對CAR表現細胞療法沒有反應，或僅反應最低)；其中：
(i) 第一參照值係：
在至少一個時間點之前(例如在個體開始接受CAR表現細胞療法之前，或在個體開始接受CAR表現細胞療法之後但在至少一個時間點之前)個體中抗SOX2免疫反應(例如抗SOX2抗體反應或T細胞反應)之程度；
患有與BCMA表現相關之疾病之不同個體中抗SOX2免疫反應(例如抗SOX2抗體反應或T細胞反應)的程度；或
患有與BCMA表現相關之疾病之個體群體中抗SOX2免疫反應(例如抗SOX2抗體反應或T細胞反應)的平均程度；且
(ii) 第二參照值係：
在至少一個時間點之前(例如在個體開始接受CAR表現細胞療法之前，或在個體開始接受CAR表現細胞療法之後但在至少一個時間點之前)個體中SOX2含量或活性(例如SOX2表現程度)；
患有與BCMA表現相關之疾病之不同個體中SOX2含量或活性(例如SOX2表現程度)；或
患有與BCMA表現相關之疾病之個體群體中平均SOX2含量或活性(例如SOX2表現程度)；
藉此評估CAR表現細胞療法之有效性。
在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病(例如III期高風險多發性骨髓瘤，例如依據修訂之國際分期系統之III期高風險多發性骨髓瘤)之個體的方法，其包含：
因應確定個體在投與CAR表現細胞療法(包含BCMA CAR表現細胞療法及CD19 CAR表現細胞療法之組合)之後在個體中、例如在個體之樣本中尚未達成或尚未鑑別為達成抗SOX2免疫反應(例如抗SOX2抗體反應或T細胞反應)程度增加及/或SOX2含量或活性(例如SOX2表現程度)減少，向個體投與第二療法或程序，
藉此治療個體。
在一些實施例中，第二療法或程序係選自以下中之一或多者：化學療法、標靶抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子之活化劑、抑制分子之抑制劑、疫苗或細胞免疫療法。
在上述方法之某些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法包含表現BCAM CAR之細胞(例如細胞群體)，其中BCMA CAR包含表2或3中所列示之任何BCMA scFv結構域胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2及HCDR3中之一或多者(例如所有三者)及/或表2或3中所列示之任何BCMA scFv結構域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3中之一或多者(例如所有三者)，或與其具有95-99%一致性之序列。
在上述方法之某些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法包含表現BCAM CAR之細胞(例如細胞群體)，其中BCMA CAR包含表2或3中所列示之重鏈可變區(VH)及/或表2或3中所列示之輕鏈可變區(VL)，或與其具有95-99%一致性之序列。
在上述方法之某些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法包含表現BCAM CAR之細胞(例如細胞群體)，其中BCMA CAR包含表2或3中所列示之BCMA scFv結構域胺基酸序列(例如SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148及SEQ ID NO: 149)，或與其具有95-99%一致性之序列。
在上述方法之某些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法包含表現BCAM CAR之細胞(例如細胞群體)，其中BCMA CAR包含表2或3中所列示之全長BCMA CAR胺基酸序列(例如不成熟BCMA CAR之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 222、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232及SEQ ID NO: 233之胺基酸序列)，或與其具有95-99%一致性之序列。
在上述方法之某些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法包含表現BCAM CAR之細胞(例如細胞群體)，其中BCMA CAR係由表2或3中所列示之核酸序列(例如SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170)或與其具有95-99%一致性之序列編碼。
在上述方法之某些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法包含表現CD19 CAR之細胞(例如細胞群體)，其中CD19 CAR包含表6或7中所列示之重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2及HCDR3中之一或多者(例如所有三者)及/或表6或8中所列示之輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3中之一或多者(例如所有三者)，或與其具有95-99%一致性之序列。
在上述方法之某些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法包含表現CD19 CAR之細胞(例如細胞群體)，其中CD19 CAR包含表6中所列示之任何CD19 scFv結構域胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及/或表6中所列示之任何CD19 scFv結構域胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)，或與其具有95-99%一致性之序列。
在上述方法之某些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法包含表現CD19 CAR之細胞(例如細胞群體)，其中CD19 CAR包含表6中所列示之CD19 scFv結構域胺基酸序列，或與其具有95-99%一致性之序列。
在上述方法之某些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法包含表現CD19 CAR之細胞(例如細胞群體)，其中CD19 CAR包含表6中所列示之全長CD19 CAR胺基酸序列，或與其具有95-99%一致性之序列。
在上述方法之某些實施例中，CD19 CAR表現細胞療法包含表現CD19 CAR之細胞(例如細胞群體)，其中CD19 CAR係由表6中所列示之核酸序列或與其具有95-99%一致性之序列編碼。
在上述方法之某些實施例中，個體係人類患者。
在一態樣中，本文揭示治療個體之方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中個體患有多發性骨髓瘤，其中：
(i) 個體患有III期高風險多發性骨髓瘤，例如依據修訂之國際分期系統之III期高風險多發性骨髓瘤，
(ii) 個體顯示β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L及高風險FISH特徵：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)；
(iii) 個體顯示β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L且LDH大於正常值上限；
(iv)個體顯示中期核型，其中除超二倍體之外具有＞3個結構異常；
(v) 個體患有漿細胞白血病，例如個體在外周血中顯示＞20%漿細胞；
(vi) 對於Imid/PI組合(沙利竇邁(thalidomide)、雷利竇邁或泊馬竇邁(pomalidomide)與硼替佐米、阿西咗脒(ixazomib)或卡非佐米(carfilzomib)之組合)，個體不能達成部分反應或更佳反應(例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則)；或
(vii) 個體在開始療法之六個月內在利用Imid/PI組合之一線療法時惡化，
藉此治療個體。
在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係在一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)或二線療法(例如，一線療法或二線療法之至少三個週期)之後投與，其中個體已對或正對一線療法或二線療法有反應，例如個體已至少顯示最小反應，例如，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體在接受一線療法或二線療法後已顯示完全反應、極佳部分反應、部分反應或最小反應。
在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中第一BCMA CAR表現細胞療法係在一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)或二線療法(例如，一線療法或二線療法之至少三個週期)之後投與，其中個體已對或正對一線療法或二線療法有反應，例如個體已至少顯示最小反應，例如，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體在接受一線療法或二線療法後已顯示完全反應、極佳部分反應、部分反應或最小反應。
在一些實施例中，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體對於一線療法或二線療法尚未顯示或未顯示完全反應或嚴格完全反應。
在一些實施例中，個體對於一線療法或二線療法已顯示或正顯示完全反應或嚴格完全反應，其中個體已顯示或正顯示最少殘存疾病，例如如藉由骨髓流式細胞術所量測，例如純系漿細胞在骨髓中可藉由流式細胞術檢測到，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則。
在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係在二線療法之後投與，其中個體由於一線療法期間之疾病惡化而前進至二線療法，其中在開始一線療法之六個月內出現疾病惡化。
在一些實施例中，個體尚未接受高劑量美法侖(melphalan)或自體或同種異體幹細胞移植。
在一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與第一CD19 CAR表現細胞療法。
在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係在投與第一BCMA CAR表現細胞療法之前、並行或之後投與。
在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係與第一BCMA CAR表現細胞療法在同一天投與，視情況其中第一CD19 CAR表現細胞療法係在投與第一BCMA CAR表現細胞療法完成之後至少一小時投與。
在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係在第一BCMA CAR表現細胞療法之後投與，其中若個體在投與第一BCMA CAR表現細胞療法後發生急性輸注反應，則第一CD19 CAR表現細胞療法係在投與第一BCMA CAR表現細胞療法後最多48小時(例如24、36或48小時)投與。
在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量以單次輸注、例如靜脈內投與。
在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量以單次輸注、例如靜脈內投與。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與第一調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)。在一些實施例中，該方法包含在投與第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與環磷醯胺及氟達拉濱，視情況其中：
(i) 環磷醯胺係以300 mg/m2 靜脈內投與，每日一次，共三天；且
(ii) 氟達拉濱係以30 mg/m2 靜脈內投與，每日一次，共三天。
在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法係在完成第一調節劑之投與之後(例如在投與最後一個劑量之淋巴清除劑，例如最後一個劑量之淋巴細胞清除性化學療法，例如最後一個劑量之環磷醯胺及/或氟達拉濱之後) 2、3或4天(例如3天)投與。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)之前，自個體獲得第一樣本(例如血球分離樣本)及使用該樣本製造第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)之前且在獲得第一樣本之後，自個體獲得第二樣本(例如幹細胞)用於準備自體幹細胞移植。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法之後、例如在以下稍後向個體投與維持劑(例如雷利竇邁)：
(i) 在投與第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法之後26、27、28、29、30、31或32天，例如28天；或
(ii) ≤2級治療相關毒性消退。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與維持劑之後向個體投與第二BCMA CAR表現細胞療法，其中：
(i) 自從投與第一BCMA CAR表現細胞療法後已過去約80-100 (例如約90)天；
(ii) 在投與第一BCMA CAR表現細胞療法後，個體之多發性骨髓瘤已惡化；或
(iii) 在投與第一BCMA CAR表現細胞療法之後，個體已展現或正展現殘存多發性骨髓瘤之客觀證據。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與維持劑之後向個體投與第二CD19 CAR表現細胞療法，其中在投與第一CD19 CAR表現細胞療法之後，例如在投與第一CD19 CAR表現細胞療法之後7-28天，個體之＞ 3%外周血淋巴球係CD19+。
在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係在投與第二BCMA CAR表現細胞療法之前、並行或之後投與。
在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法與第二BCMA CAR表現細胞療法係在同一天投與，視情況其中第二CD19 CAR表現細胞療法係在投與第二BCMA CAR表現細胞療法完成之後至少一小時投與。
在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係在第二BCMA CAR表現細胞療法之後投與，其中若個體在投與第二BCMA CAR表現細胞療法後發生急性輸注反應，則第二CD19 CAR表現細胞療法係在投與第二BCMA CAR表現細胞療法後最多48小時(例如24、36或48小時)投與。
在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量以單次輸注、例如靜脈內投與。
在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量以單次輸注、例如靜脈內投與。
在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法與第一BCMA CAR表現細胞療法相同。
在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法與第一CD19 CAR表現細胞療法相同。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第二BCMA CAR表現細胞療法及/或第二CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與第二調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)。在一些實施例中，該方法包含在投與第二BCMA CAR表現細胞療法及/或第二CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與環磷醯胺及氟達拉濱，視情況其中：
(i) 環磷醯胺係以300 mg/m2 靜脈內投與，每日一次，共三天；且
(ii) 氟達拉濱係以30 mg/m2 靜脈內投與，每日一次，共三天。在一些實施例中，該方法包含在投與第二BCMA CAR表現細胞療法及/或第二CD19 CAR表現細胞療法之前，以例如1.5 g/m2 向個體投與環磷醯胺。
在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中個體患有高風險多發性骨髓瘤，例如依據修訂之國際分期系統之III期高風險多發性骨髓瘤。在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中個體正接受或已接受一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)或二線療法(例如一線療法或二線療法之至少三個週期)，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，且個體尚未因一線或二線療法惡化。在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中個體至少已顯示最小反應，例如，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體對個體所接受之最近療法(例如一線療法或二線療法)已顯示極佳部分反應、部分反應或最小反應。
在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中：(i) 個體患有高風險多發性骨髓瘤，例如依據修訂之國際分期系統之III期高風險多發性骨髓瘤；(ii) 個體正接受或已接受一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁、硼替佐米或地塞米松)或二線療法(例如一線療法或二線療法之至少三個週期)，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，且個體尚未自一線或二線療法惡化；及(iii) 個體至少已顯示最小反應，例如，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體對個體所接受之最近療法(例如一線療法或二線療法)已顯示極佳部分反應、部分反應或最小反應。
在一些實施例中，個體正接受或已接受一線療法且尚未接受二線療法。在一些實施例中，個體尚未自一線療法惡化。在一些實施例中，個體正接受或已接受二線療法且尚未接受三線療法，其中個體由於在接受一線療法期間或之後之疾病惡化而前進至二線療法，其中在開始一線療法之一年內或在完成一線療法之六個月內出現疾病惡化。在一些實施例中，個體尚未自二線療法惡化。
在一些實施例中，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體對個體所接受之最近療法(例如一線療法或二線療法)尚未顯示或未顯示完全反應或嚴格完全反應。
在一些實施例中，個體尚未接受細胞毒性化學療法(例如多柔比星(doxorubicin)、環磷醯胺、依託泊苷(etoposide)或順鉑(cisplatin))，以下除外：(a) 個體已接受低劑量每週環磷醯胺(例如≤ 500 mg/m2 /週)，或(b) 個體已接受單一週期之環磷醯胺連續輸注。在一些實施例中，在個體接受細胞毒性化學療法之前，自個體分離T細胞以製造第一BCMA CAR表現細胞療法。在一些實施例中，個體尚未接受自體或同種異體幹細胞移植。在一些實施例中，個體已在一年內起始針對多發性骨髓瘤之全身性療法。
在一些實施例中，個體顯示β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L及高風險FISH特徵：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)。在一些實施例中，個體顯示β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L且LDH大於正常值上限。在一些實施例中，個體顯示中期核型，其中除超二倍體之外具有＞3個結構異常。在一些實施例中，個體患有漿細胞白血病，例如個體在外周血中顯示＞20%漿細胞。在一些實施例中，對於Imid/PI組合(沙利竇邁、雷利竇邁或泊馬竇邁與硼替佐米、阿西咗脒或卡非佐米之組合)，個體不能達成部分反應或更佳反應(例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則)。在一些實施例中，個體在開始一線療法之一年內(例如六個月內)或在完成一線療法之六個月內在利用Imid/PI組合之一線療法時惡化。
在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中個體患有高風險多發性骨髓瘤。在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中個體之多發性骨髓瘤在至少兩個方案(例如，蛋白酶體抑制劑及/或沙利竇邁或其類似物(例如沙利竇邁、雷利竇邁或泊馬竇邁))之後復發或對於該至少兩個方案出現頑抗性。在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中個體至少已顯示最小反應，例如，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體對個體所接受之最近療法(例如三線療法，例如補救療法，例如標準補救療法)已顯示極佳部分反應、部分反應或最小反應。
在一態樣中，本文揭示治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中：(i) 個體患有高風險多發性骨髓瘤，(ii) 個體之多發性骨髓瘤在至少兩個方案(例如，蛋白酶體抑制劑及/或沙利竇邁或其類似物(例如沙利竇邁、雷利竇邁或泊馬竇邁))之後復發或對於該至少兩個方案出現頑抗性，及(iii) 個體至少已顯示最小反應，例如，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體對個體所接受之最近療法(例如三線療法，例如補救療法，例如標準補救療法)已顯示極佳部分反應、部分反應或最小反應。
在一些實施例中，例如依據如(例如)表5中所述之IMWG 2016準則，個體對個體所接受之最近療法(例如三線療法，例如補救療法，例如標準補救療法)尚未顯示或未顯示完全反應或嚴格完全反應。在一些實施例中，個體在接受最近療法(例如三線療法，例如補救療法，例如標準補救療法)之後顯示可檢測之殘存疾病。
在一些實施例中，個體尚未接受抗BCMA細胞療法，例如BCMA CAR表現細胞療法。在一些實施例中，個體在接受美法侖及幹細胞移植(例如自體幹細胞移植)之一年內惡化。
在一些實施例中，該方法進一步包含向個體投與第一CD19 CAR表現細胞療法。在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係在投與第一BCMA CAR表現細胞療法之前、並行或之後投與。在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係與第一BCMA CAR表現細胞療法在同一天投與，視情況其中第一CD19 CAR表現細胞療法係在投與第一BCMA CAR表現細胞療法完成之後至少一小時投與。在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係在第一BCMA CAR表現細胞療法之後投與，其中若個體在投與第一BCMA CAR表現細胞療法後發生急性輸注反應，則第一CD19 CAR表現細胞療法係在投與第一BCMA CAR表現細胞療法後最多48小時(例如24、36或48小時)投與。
在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係以分劑量輸注投與，例如，其中個體在第一輸注日接受總劑量之約10%，在第二輸注日接受總劑量之約30%，且在第三輸注日接受總劑量之約60%。在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量(例如)以單次輸注、例如靜脈內投與。
在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係以分劑量輸注投與，例如，其中個體在第一輸注日接受總劑量之約10%，在第二輸注日接受總劑量之約30%，且在第三輸注日接受總劑量之約60%。在一些實施例中，第一CD19 CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量(例如)以單次輸注、例如靜脈內投與。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與第一調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)。在一些實施例中，該方法包含在投與第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與環磷醯胺及氟達拉濱。在一些實施例中，環磷醯胺以係300 mg/m2 靜脈內投與，每日一次，共三天。在一些實施例中，氟達拉濱係以30 mg/m2 靜脈內投與，每日一次，共三天。在一些實施例中，第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法係在完成第一調節劑之投與之後(例如在投與最後一個劑量之淋巴清除劑，例如最後一個劑量之淋巴細胞清除性化學療法，例如最後一個劑量之環磷醯胺及/或氟達拉濱之後) 2、3或4天(例如3天)投與。在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)之前，自個體獲得第一樣本(例如血球分離樣本)及使用該樣本製造第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法。在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)之前且在獲得第一樣本之後，自個體獲得第二樣本(例如幹細胞)用於準備自體幹細胞移植。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法之後、例如在以下稍後向個體投與維持劑(例如雷利竇邁)：(i) 在投與第一BCMA CAR表現細胞療法及/或第一CD19 CAR表現細胞療法之後26、27、28、29、30、31或32天，例如28天；或(ii) ≤2級治療相關之毒性消退。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與維持劑之後向個體投與第二BCMA CAR表現細胞療法，其中自從投與第一BCMA CAR表現細胞療法之後已過去80-100天(例如90天)。在一些實施例中，該方法進一步包含在投與維持劑之後向個體投與第二BCMA CAR表現細胞療法，其中個體之多發性骨髓瘤在投與第一BCMA CAR表現細胞療法之後惡化。在一些實施例中，該方法進一步包含在投與維持劑之後向個體投與第二BCMA CAR表現細胞療法，其中在投與第一BCMA CAR表現細胞療法之後，個體已展現或正展現殘存多發性骨髓瘤之客觀證據。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與維持劑之後向個體投與第二CD19 CAR表現細胞療法，其中在投與第一CD19 CAR表現細胞療法之後，例如在投與第一CD19 CAR表現細胞療法之後7-28天，個體之＞ 3%外周血淋巴球係CD19+。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係在投與第二BCMA CAR表現細胞療法之前、並行或之後投與。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法與第二BCMA CAR表現細胞療法係在同一天投與，視情況其中第二CD19 CAR表現細胞療法係在投與第二BCMA CAR表現細胞療法完成之後至少一小時投與。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係在第二BCMA CAR表現細胞療法之後投與，其中若個體在投與第二BCMA CAR表現細胞療法後發生急性輸注反應，則第二CD19 CAR表現細胞療法係在投與第二BCMA CAR表現細胞療法後最多48小時(例如24、36或48小時)投與。
在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法係以分劑量輸注投與，例如，其中個體在第一輸注日接受總劑量之約10%，在第二輸注日接受總劑量之約30%，且在第三輸注日接受總劑量之約60%。在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量以單次輸注、例如靜脈內投與。
在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係以分劑量輸注投與，例如，其中個體在第一輸注日接受總劑量之約10%，在第二輸注日接受總劑量之約30%，且在第三輸注日接受總劑量之約60%。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量以單次輸注、例如靜脈內投與。
在一些實施例中，第二BCMA CAR表現細胞療法與第一BCMA CAR表現細胞療法相同。在一些實施例中，第二CD19 CAR表現細胞療法與第一CD19 CAR表現細胞療法相同。
在一些實施例中，該方法進一步包含在投與第二BCMA CAR表現細胞療法及/或第二CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與第二調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)。在一些實施例中，該方法包含在投與第二BCMA CAR表現細胞療法及/或第二CD19 CAR表現細胞療法之前向個體投與環磷醯胺及氟達拉濱。在一些實施例中，環磷醯胺以係300 mg/m2 靜脈內投與，每日一次，共三天。在一些實施例中，氟達拉濱係以30 mg/m2 靜脈內投與，每日一次，共三天。在一些實施例中，該方法包含在投與第二BCMA CAR表現細胞療法及/或第二CD19 CAR表現細胞療法之前，以例如1.5 g/m2 向個體投與環磷醯胺。
在上文所提及之方法之一些實施例中，第一或第二BCMA CAR表現細胞療法包含表現BCAM CAR之細胞(例如細胞群體)，其中：
(i) BCMA CAR包含表2或3中所列示之任何BCMA scFv結構域胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2及HCDR3中之一或多者(例如所有三者)及/或表2或3中所列示之任何BCMA scFv結構域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3中之一或多者(例如所有三者)，或與其具有95-99%一致性之序列；
(ii) BCMA CAR包含表2或3中所列示之重鏈可變區(VH)及/或表2或3中所列示之輕鏈可變區(VL)，或與其具有95-99%一致性之序列；
(iii) BCMA CAR包含表2或3中所列示之BCMA scFv結構域胺基酸序列(例如SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148及SEQ ID NO: 149)，或與其具有95-99%一致性之序列；
(iv) BCMA CAR包含表2或3中所列示之全長BCMA CAR胺基酸序列(例如不成熟BCMA CAR之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 222、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232及SEQ ID NO: 233之胺基酸序列)，或與其具有95-99%一致性之序列；或
(v) BCMA CAR係由表2或3中所列示之核酸序列(例如SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170)或與其具有95-99%一致性之序列編碼。
在上文所提及之方法之一些實施例中，第一或第二CD19 CAR表現細胞療法包含表現CD19 CAR之細胞(例如細胞群體)，其中：
(i) CD19 CAR包含表6或7中所列示之重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2及HCDR3中之一或多者(例如所有三者)及/或表6或8中所列示之輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3中之一或多者(例如所有三者)，或與其具有95-99%一致性之序列；
(ii) CD19 CAR包含表6中所列示之任何CD19 scFv結構域胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及/或表6中所列示之任何CD19 scFv結構域胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)，或與其具有95-99%一致性之序列；
(iii) CD19 CAR 包含表6中所列示之CD19 scFv結構域胺基酸序列或與其具有95-99%一致性之序列；
(iv) CD19 CAR包含表6中所列示之全長CD19 CAR胺基酸序列或與其具有95-99%一致性之序列；或
(v) CD19 CAR係由表6中所列示之核酸序列或與其具有95-99%一致性之序列編碼。
在上文所提及之方法之一些實施例中，個體係人類患者。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本發明所屬領域技術者通常所理解之含義相同的含義。儘管本發明之實踐或測試中可使用類似或等效於本文所述之方法及材料的方法及材料，但下文闡述適宜方法及材料。本文所提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻之全部內容皆以引用方式併入本文中。另外，材料、方法及實例僅為闡釋性而並不意欲具有限制性。標題、子標題或經編號或有字母之要素(例如，(a)、(b)、(i)等)僅為便於閱讀而呈現。在此文件中使用標題或經編號或有字母之要素無需以字母順序實施步驟或要素或該等步驟或要素不必彼此離散。
根據本說明及圖示以及申請專利範圍，本發明之其他特徵、目標及優點將變得顯而易見。
相關申請案
本申請案主張於2017年11月15日提出申請之美國系列第62/586,834號及於2017年11月20日提出申請之美國系列第62/588,836號的優先權，其各自之內容係全文以引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，其已用ASCII格式電子提交，且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII拷貝於2018年11月8日創建，命名為N2067-7145WO_SL.txt且大小為676,612個位元組。
定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習此項技術者通常所理解的含義相同之含義。
如本文所用術語「BCMA」係指B細胞成熟抗原。BCMA (亦稱為TNFRSF17，BCM或CD269)係腫瘤壞死受體(TNFR)家族之成員且主要在最終分化之B細胞(例如記憶B細胞及漿細胞)上表現。其配體係TNF家族(BAFF)及增殖誘導配體(APRIL)之所謂B細胞活化劑。BCMA參與介導漿細胞之存活用於維持長期體液性免疫性。BCMA之基因係在產生994個核苷酸長之初級mRNA轉錄本(NCBI登錄號NM_001192.2)之染色體16上編碼，該初級mRNA轉錄本編碼184個胺基酸之蛋白質(NP_001183.2)。已闡述源自BCMA基因座之第二反義轉錄本，其可在調控BCMA表現中起作用。(Laabi Y.等人，Nucleic Acids Res., 1994, 22:1147-1154)。已闡述具有未知顯著性之額外轉錄本變體(Smirnova AS等人 Mol Immunol., 2008, 45(4):1179-1183。已鑑別第二同種型，亦稱為TV4 (Uniprot標識符Q02223-2)。如本文所用之「BCMA」包括包含全長野生型BCMA之突變(例如點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。
如本文所用術語「CD19」係指分化簇19蛋白，其係可在白血病前體細胞上檢測到之抗原決定子。人類及鼠類胺基酸及核酸序列可參見公共數據庫，例如GenBank、UniProt及Swiss-Prot。舉例而言，人類CD19之胺基酸序列可參見UniProt/Swiss-Prot登錄號P15391，且人類CD19之核苷酸序列編碼可參見登錄號NM_001178098。如本文所用之「CD19」包括包含全長野生型CD19之突變(例如，點突變)、片段、插入、缺失及剪接變體之蛋白質。CD19在大部分B譜系癌症上表現，包括(例如)急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球白血病及非霍奇金氏淋巴瘤。表現CD19之其他細胞提供於下文「與CD19之表現相關之疾病」之定義中。其亦係B細胞祖細胞之早期標記物。參見(例如) Nicholson等人Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)。在一態樣中，CART之抗原結合部分識別並結合CD19蛋白之細胞外結構域內之抗原。在一態樣中，CD19蛋白在癌細胞上表現。
術語「一(a及an)」係指一個或一個以上(即，至少一個)物品之語法對象。舉例而言，「一個要素」意指一個要素或一個以上要素。
術語「約」在提及諸如量、時間長度及諸如此類等可量測值時意欲涵蓋自指定值±20%、或在一些情況下為±10%、或在一些情況下為±5%、或在一些情況下為±1%、或在一些情況下為±0.1%的變化，只要該等變化適於實施所揭示之方法即可。
如本文所使用之術語「嵌合抗原受體」或另一選擇「為CAR」係指至少包含以下之重組多肽構築體：細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及包含源自如下文所定義之刺激分子之功能信號傳導結構域之細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「細胞內信號傳導結構域」)。在一些實施例中，CAR多肽構築體中之結構域係在相同多肽鏈中，例如包含嵌合融合蛋白。在一些實施例中，CAR多肽構築體中之結構域並不彼此鄰接，例如在不同多肽鏈中，例如如本文所述RCAR中所提供。
在一態樣中，CAR之刺激分子係與T細胞受體複合物締合之ζ鏈。在一態樣中，細胞質信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域(例如CD3-ζ之初級信號傳導結構域)。在一態樣中，細胞質信號傳導結構域進一步包含一或多個源自至少一個如下文所定義之共刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一態樣中，共刺激分子係選自4-1BB (即CD137)、CD27、ICOS及/或CD28。在一態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及包含源自刺激分子之功能性信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域，該細胞質信號傳導結構域包含源自共刺激分子之功能信號傳導結構域及源自刺激分子之功能信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含兩個源自一或多個共刺激分子之功能信號傳導結構域及源自刺激分子之功能信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含細胞外抗原識別結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含至少兩個源自一或多個共刺激分子之功能信號傳導結構域及源自刺激分子之功能信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包含在CAR融合蛋白之胺基末端(N-ter)之可選前導序列。在一態樣中，CAR進一步包含在細胞外抗原識別結構域之N末端之前導序列，其中該前導序列視情況在細胞處理及CAR至細胞膜定位期間自抗原識別結構域(例如scFv)裂解。
包含標靶特異性腫瘤標記物X (其中X可為如本文所述之腫瘤標記)之抗原結合結構域(例如scFv、單一結構域抗體或TCR (例如TCR α結合結構域或TCR β結合結構域))的CAR亦稱為XCAR。舉例而言，包含標靶BCMA之抗原結合結構域之CAR稱為BCMACAR。CAR可在任何細胞(例如如本文所述之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞))中表現。
術語「信號傳導結構域」係指蛋白質之藉由在細胞內傳送資訊經由所定義信號傳導途徑藉由產生第二信使或藉由因應該等信使發揮效應子作用來起調控細胞活性作用的功能部分。
如本文所用之術語「抗體」係指源自與抗原特異性結合之免疫球蛋白分子之蛋白質或多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整免疫球蛋白，且可源自天然來源或重組來源。抗體可係免疫球蛋白分子之四聚體。
術語「抗體片段」係指完整抗體之至少一部分或其重組變體，且係指足以使抗體片段識別並特異性結合至靶標(例如抗原)之抗原結合結構域，例如完整抗體之抗原決定可變區。抗體片段之實例包括(但不限於) Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段、scFv抗體片段、直鏈抗體、單一結構域抗體(例如sdAb (VL或VH))、駱駝科動物VHH結構域、及自抗體片段(例如包含在鉸鏈區由二硫橋連接之兩個或更多個(例如兩個) Fab片段或所連接抗體之兩個或更多個(例如兩個)經分離CDR或其他表位結合片段之二價片段)形成的多特異性分子。亦可將抗原結合片段納入單一結構域抗體、馬克西抗體(maxibodies)、微小抗體、奈米抗體、胞內抗體、二價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及雙-scFv中(參見(例如) Hollinger及Hudson，Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005)。亦可基於多肽(例如III型纖連蛋白(Fn3))將抗體片段移植至支架中(參見美國專利第6,703,199號，其闡述纖連蛋白多肽微小抗體)。
術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段之融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區經由短撓性多肽連接體以鄰接方式連接，且能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留衍生出其之完整抗體之特異性。除非說明，否則如本文所用之scFv可具有例如關於多肽之N末端及C末端呈任一順序之VL及VH可變區，scFv可包含VL-連接體-VH或可包含VH-連接體-VL。
如本文所用之術語「互補決定區」及「CDR」係指抗體可變區內賦予抗原特異性及結合親和力之胺基酸序列。舉例而言，每一重鏈可變區中通常存在三個CDR (例如，HCDR1、HCDR2及HCDR3)，且在每一輕鏈可變區中存在三個CDR (LCDR1、LCDR2及LCDR3)。可使用多種業內熟知之方案測定給定CDR之精確胺基酸序列邊界，該等方案包括以下中所述之彼等：Kabat等人 (1991), 「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」 第5版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)，Al-Lazikani等人，(1997) JMB 273,927-948 (「Chothia」編號方案)或其組合。在Kabat編號方案下，在一些實施例中，重鏈可變結構域(VH)中之CDR胺基酸殘基編號為31-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；且輕鏈可變結構域(VL)中之CDR胺基酸殘基編號為24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)。在Chothia編號方案下，在一些實施例中，VH中之CDR胺基酸編號為26-32 (HCDR1)、52-56 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；且VL中之CDR胺基酸殘基編號為26-32 (LCDR1)、50-52 (LCDR2)及91-96 (LCDR3)。在合併之Kabat及Chothia編號方案中，在一些實施例中，CDR對應於作為Kabat CDR、Chothia CDR或二者之部分之胺基酸殘基。例如，在一些實施例中，CDR對應於VH (例如哺乳動物VH，例如人類VH)中之胺基酸殘基26-35 (HCDR1)、50-65 (HCDR2)及95-102 (HCDR3)；及VL (例如哺乳動物VL，例如人類VL)中之胺基酸殘基24-34 (LCDR1)、50-56 (LCDR2)及89-97 (LCDR3)。
包含抗體或其抗體片段之本發明CAR組合物之部分可以多種形式存在，例如，其中抗原結合結構域表現為多肽鏈之部分，包括(例如)單一結構域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)或(例如)人類化抗體(Harlow等人，1999，Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY；Harlow等人，1989, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York；Houston等人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；Bird等人，1988, Science 242:423-426)。在一態樣中，本發明CAR組合物之抗原結合結構域包含抗體片段。在另一態樣中，CAR包含含有scFv之抗體片段。
如本文所用術語「結合結構域」或「抗體分子」(在本文中亦稱為「抗靶標(例如BCMA)結合結構域」)係指包含至少一個免疫球蛋白可變結構域序列之蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段。術語「結合結構域」或「抗體分子」涵蓋抗體及抗體片段。在實施例中，抗體分子係多特異性抗體分子，例如其包含複數個免疫球蛋白可變結構域序列，其中該複數個中第一免疫球蛋白可變結構域序列具有針對第一表位之結合特異性，且該複數個中第二免疫球蛋白可變結構域序列具有針對第二表位之結合特異性。在實施例中，多特異性抗體分子係雙特異性抗體分子。雙特異性抗體具有針對不超過兩種抗原之特異性。雙特異性抗體分子之特徵在於具有針對第一表位之結合特異性之第一免疫球蛋白可變結構域序列及具有針對第二表位之結合特異性的第二免疫球蛋白可變結構域序列。術語「抗體重鏈」係指以其天然構象存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較大者，且該抗體重鏈通常決定抗體所屬之類別。
術語「抗體輕鏈」係指以其天然構象存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。卡帕(κ)及蘭姆達(λ)輕鏈係指兩種主要的抗體輕鏈同型。
術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生之抗體，例如由噬菌體或酵母表現系統表現之抗體。該術語亦應理解為意指已藉由合成編碼抗體之DNA分子產生且該DNA分子表現抗體蛋白或指定該抗體之胺基酸序列的抗體，其中DNA或胺基酸序列已利用業內可用且熟知之重組DNA或胺基酸序列技術獲得。
術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異性免疫勝任細胞之活化或二者皆有。熟習此項技術者將理解，包括幾乎所有蛋白質或肽在內之任何大分子皆可用作抗原。此外，抗原可源自重組或基因組DNA。熟習此項技術者將理解，任何包含編碼誘發免疫反應之蛋白質之核苷酸序列或部分核苷酸序列之DNA因此編碼如本文所使用之該術語「抗原」。此外，熟習此項技術者將理解，抗原無需僅由基因之全長核苷酸序列編碼。容易地明瞭，本發明包括(但不限於)一個以上基因之部分核苷酸序列之用途且該等核苷酸序列係以多種組合排列以編碼引發期望免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者將理解抗原完全不必由「基因」編碼。容易地明瞭，抗原可以合成方式產生或可源自生物樣本，或可係除多肽外之大分子。此一生物樣本可包括(但不限於)組織樣本、腫瘤樣本、細胞或含有其他生物組分之流體。
術語「抗腫瘤效應」係指可以多種方式呈現之生物效應，包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數減少、轉移數減少、預期壽命增加、腫瘤細胞增殖減少、腫瘤細胞存活率減小或與癌性病況相關之各種生理學症狀改善。「抗腫瘤效應」亦可呈現為本發明之肽、多核苷酸、細胞及抗體在第一時間預防腫瘤發生之能力。
術語「抗癌效應」係指可以多種方式呈現之生物效應，包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、癌細胞數減少、轉移數減少、預期壽命增加、癌細胞增殖減少、癌細胞存活率減小或與癌性病況相關之各種生理症狀改善。「抗癌效應」亦可呈現為肽、多核苷酸、細胞及抗體在第一時間預防癌症發生之能力。術語「抗腫瘤效應」係指可以多種方式呈現之生物效應，包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活率減小。術語「自體」係指源自同一個體之任何材料，稍後將該材料再引入個體中。
術語「同種異體」係指源自與材料欲引入之個體同一物種之不同動物之任何材料。當一或多個基因座之基因不同時，認為兩個或更多個個體互為同種異體。在一些態樣中，來自同一物種之個體之同種異體材料可在遺傳學上足夠不同以在抗原上相互作用。
術語「異種」係指源自不同物種之動物之移植物。
如本文所用術語「血球分離」係指業內公認之體外過程，藉由該過程，供體或患者之血液自供體或患者移除並通過分離出所選特定成分之裝置並(例如)藉由再轉輸將其餘部分返回至供體或患者之循環。因此，在「血球分離樣本」之上下文中係指使用血球分離獲得之樣本。
術語「組合」係指呈一個劑量單位形式之固定組合、或如下組合投與：其中本發明化合物及組合配偶體(例如如下文所揭示之另一藥物，亦稱為「治療劑」或「助劑」)可在相同時間獨立地投與或在時間間隔內分開投與，尤其其中該等時間間隔容許組合配偶體顯示協作、例如協同效應。單一組分可包裝於套組中或分開包裝。組分中之一者或二者(例如粉末或液體)可在投與之前重構或稀釋至期望劑量。如本文所用，術語「共投與」或「組合投與」或諸如此類意欲涵蓋向有需要之單一個體(例如患者)投與所選組合配偶體，且意欲包括不必藉由相同投與途徑或同時投與藥劑之治療方案。本文所用術語「醫藥組合」意指自一種以上活性成分混合或組合產生之產物且包括活性成分之固定及不固定組合兩種情況。術語「固定組合」意指將活性成分(例如本發明化合物)與組合配偶體二者以單一實體或劑量之形式同時投與患者。術語「未固定組合」意指將活性成分(例如本發明化合物)及組合配偶體二者作為分開之實體同時、並行或依序且無具體時間限制地投與患者，其中此投與在患者體內提供治療有效量之兩種化合物。後者亦適用於雞尾酒療法，例如投與3種或更多種活性成分。
術語「癌症」係指特徵在於異常細胞快速且不受控生長之疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。各種癌症之實例闡述於本文中，且包括(但不限於)乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及諸如此類。藉由本文所述方法治療之較佳癌症包括多發性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。
術語「腫瘤」及「癌症」在本文中可互換使用，例如兩個術語涵蓋實體及液體，例如瀰漫性或循環腫瘤。如本文所用術語「癌症」或「腫瘤」包括癌前以及惡性癌症及腫瘤。
當「源自」用於本文中時該術語指示第一分子與第二分子之間之關係。其通常係指第一分子與第二分子之間之結構相似性，且不暗示或包括對源自第二分子之第一分子之過程或來源限制。舉例而言，在源自CD3ζ分子之細胞內信號傳導結構域之情形下，細胞內信號傳導結構域保留足夠CD3ζ結構，使得其具有所需功能，即，在適當條件產生信號之能力。其並不暗示或包括對產生細胞內信號傳導結構域之特定過程之限制，例如，其並不意味著，為了提供細胞內信號傳導結構域，必須以CD3ζ序列開始並刪除不需要之序列，或強加突變，以到達細胞內信號傳導結構域。
片語「與BCMA表現相關之疾病」包括(但不限於)與表現BCMA (例如野生型或突變BCMA)之細胞相關之疾病或與表現BCMA (例如野生型或突變BCMA)之細胞相關之病況，包括(例如)增殖疾病，例如癌症或惡性病或癌前病況，例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期；或與表現BCMA (例如野生型或突變BCMA)之細胞相關之非癌症相關適應症。為免生疑問，與BCMA表現相關之疾病可包括與當前不表現BCMA之細胞相關之病況，例如，此乃因BCMA表現因(例如)利用標靶BCMA、但不同時表現BCMA之分子(例如，本文所述BCMA抑制劑)治療而下調。在一態樣中，與BCMA (例如野生型或突變BCMA)表現相關之癌症係血液癌症。在一態樣中，血液癌症係白血病或淋巴瘤。在一態樣中，與BCMA (例如野生型或突變BCMA)表現相關之癌症係分化之血漿B細胞之惡性病。在一態樣中，與BCMA (例如野生型或突變BCMA)表現相關之癌症包括癌症及惡性病，包括但不限於，例如一或多種急性白血病，包括但不限於例如B細胞急性淋巴性白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴性白血病(「TALL」)、急性淋巴性白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括但不限於例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)。與BCMA (例如野生型或突變BCMA)表現相關其他癌症或血液病況包含(但不限於)例如B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤、柏基特淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、多毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增殖病況、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣帶淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)及「白血病前期」(其係因骨髓樣血球之無效產生(或發育不良)集合在一起之血液病況之不同集合)及諸如此類。在一些實施例中，癌症係多發性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤或神經膠母細胞瘤。在實施例中，與BCMA表現相關之疾病包括漿細胞增殖病症，例如無症狀骨髓瘤(燜燃型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤)、意義不明的單株丙種球蛋白病(MGUS)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤及多發性漿細胞瘤)、系統性類澱粉輕鏈類澱粉變性及POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群(Crow-Fukase syndrome)、高月病(Takatsuki disease)及PEP症候群)。與BCMA表現(例如野生型或突變BCMA)表現相關之其他疾病包括(但不限於)例如與BCMA (例如野生型或突變BCMA)表現相關之非典型及/或非經典癌症、惡性病、癌前病況或增殖疾病，例如本文所述癌症，例如前列腺癌(例如去勢抗性或治療抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、胰臟癌或肺癌。
與BCMA (例如野生型或突變BCMA)相關之非癌症相關病況包括病毒感染；例如HIV、真菌感染(例如新型隱球菌(C. neoformans))；自體免疫疾病；例如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡(SLE或狼瘡)、尋常天疱瘡及薛格連氏症候群(Sjogren’s syndrome)；發炎性腸病、潰瘍性結腸炎；與黏膜免疫性相關之移植相關之異種特異性免疫性病症；及對生物劑(例如因子VIII)不需要的免疫反應，其中體液性免疫性係重要的。在實施例中，與BCMA之表現相關之非癌症相關適應症包括(但不限於)例如自體免疫疾病(例如，狼瘡)、發炎性病症(過敏及氣喘)及移植。在一些實施例中，腫瘤抗原表現細胞表現或在任何時間表現編碼腫瘤抗原之mRNA。在實施例中，腫瘤抗原表現細胞產生腫瘤抗原蛋白(例如，野生型或突變體)，且腫瘤抗原蛋白可以正常含量或降低的含量存在。在實施例中，腫瘤抗原表現細胞在一點處產生可檢測含量之腫瘤抗原蛋白，且隨後產生實質上無法檢測之腫瘤抗原蛋白。
術語「保守序列修飾」係指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵的胺基酸修飾。該等保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由業內已知之標準技術(例如定點誘變及PCR介導之誘變)將修飾引入本發明抗體或抗體片段中。保守取代係其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基置換者。業內已定義具有相似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，本發明CAR內之一或多個胺基酸殘基可經來自同一側鏈家族之其他胺基酸殘基置換，且可利用本文所述之功能分析來測試改變之CAR。
術語「刺激」意指藉由刺激分子(例如TCR/CD3複合物)與其同源配體結合由此介導信號轉導事件(例如(但不限於)經由TCR/CD3複合物之信號轉導)引起之初級反應。刺激可介導某些分子改變其表現，例如TGF-β之下調及/或細胞骨架結構之重組及諸如此類。
術語「刺激分子」係指由提供初級細胞質信號傳導序列之T細胞表現之分子，該(等)信號傳導序列對於T細胞信號傳導途徑之至少一些態樣以刺激性方式調控TCR複合物之初級活化。在一些實施例中，CAR內含有ITAM之結構域重述獨立於內源TCR複合物之初級TCR的信號傳導。在一態樣中，初級信號係由例如TCR/CD3複合物與加載有肽之MHC分子之結合起始，且該結合引起T細胞反應之介導，包括(但不限於)增殖、活化、分化及諸如此類。以刺激方式起作用之初級細胞質信號傳導序列(亦稱為「初級信號傳導結構域」)可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM之信號傳導基序。尤其用於本發明中之含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列的實例包括(但不限於)源自以下之彼等：TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (亦稱為「ICOS」)、FcεRI及CD66d、DAP10及DAP12。在本發明之特定CAR中，本發明之任一或多個CARS中之細胞內信號傳導結構域包含細胞內信號傳導序列，例如CD3-ζ之初級信號傳導序列。
術語「抗原呈遞細胞」或「APC」係指在其表面上顯示與主要組織相容性複合物(MHC)複合之外源抗原之免疫系統細胞(例如輔助細胞，例如B細胞、樹突狀細胞及諸如此類)。T細胞可利用其T細胞受體(TCR)識別該等複合物。APC處理抗原且將其呈遞至T細胞。
如本文所使用術語「細胞內信號傳導結構域」係指分子之細胞內部分。在實施例中，細胞內信號結構域轉導效應功能信號且引導細胞實施專門功能。儘管可採用整個細胞內信號傳導結構域，但在許多情形下無需使用整條鏈。就使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言，可使用該截短部分來替代完整鏈，只要其轉導效應功能信號即可。因此，術語細胞內信號傳導結構域意欲包括細胞內信號傳導結構域之足以轉導效應功能信號之任何截短部分。
細胞內信號傳導結構域產生促進含有CAR之細胞(例如，CART細胞)之免疫效應功能之信號。例如CART細胞中免疫效應功能之實例包括細胞溶解活性及輔助活性，包括分泌細胞介素。
在實施例中，細胞內信號傳導結構域可包含初級細胞內信號傳導結構域。實例性初級細胞內信號傳導結構域包括源自負責主要刺激或抗原依賴性模擬之分子之彼等。在實施例中，細胞內信號傳導結構域可包含共刺激細胞內結構域。實例性共刺激細胞內信號傳導結構域包括源自負責共刺激信號或非抗原依賴性刺激之分子之彼等。舉例而言，在CART之情形下，初級細胞內信號傳導結構域可包含T細胞受體之細胞質序列，且共刺激細胞內信號傳導結構域可包含來自共受體或共刺激分子之細胞質序列。
初級細胞內信號傳導結構域可包含信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括(但不限於)源自以下之彼等：CD3 ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (亦稱為「ICOS」)、FcεRI、CD66d、DAP10及DAP12。
術語「ζ」或另一選擇為「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」係指CD247。Swiss-Prot登錄號P20963提供實例性人類CD3 ζ胺基酸序列。「ζ刺激性結構域」或另一選擇為「CD3-ζ刺激性結構域」或「TCR-ζ刺激性結構域」係指CD3-ζ或其變體(例如具有突變(例如點突變)、片段、插入或缺失之分子)之刺激性結構域。在一個實施例中，ζ之細胞質結構域包含基因庫登錄號BAG36664.1之殘基52至164或其變體(例如具有突變(例如點突變)、片段、插入或缺失之分子)。在一個實施例中，「ζ刺激性結構域」或「CD3-ζ刺激性結構域」係提供為SEQ ID NO: 18之序列或20或其變體(例如具有突變(例如點突變)、片段、插入或缺失之分子)。
術語「共刺激分子」係指在T細胞上與共刺激配體特異性結合、由此介導T細胞之共刺激反應(例如(但不限於)增殖)之同源結合配偶體。共刺激分子係有效免疫反應所需之除抗原受體或其配體外之細胞表面分子。共刺激分子包括(但不限於) MHC I類分子、TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整聯蛋白、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、BTLA、類鐸配體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、4-1BB (CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS (CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM (LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及特異性結合CD83之配體。
共刺激細胞內信號傳導結構域係指共刺激分子之細胞內部分。
細胞內信號傳導結構域可包含衍生出其之分子或其功能片段之整個細胞內部分或整個天然細胞內信號傳導結構域。
術語「4-1BB」係指CD137或腫瘤壞死因子受體超家族成員9。Swiss-Prot登錄號P20963提供實例性人類4-1BB胺基酸序列。「4-1BB共刺激結構域」係指4-1BB或其變體(例如具有突變(例如點突變)、片段、插入或缺失之分子)之共刺激結構域。在一個實施例中，「4-1BB共刺激結構域」係提供為SEQ ID NO: 14之序列或其變體(例如具有突變(例如點突變)、片段、插入或缺失之分子)。
在「免疫效應細胞」用於本文中時該術語係指參與免疫反應(例如，促進免疫效應反應)之細胞。免疫效應細胞之實例包括T細胞(例如α/β T細胞及γ/δ T細胞)、B細胞、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T (NKT)細胞、肥大細胞及骨髓源性吞噬細胞。
當「免疫效應功能或免疫效應反應」用於本文中時該術語係指例如免疫效應細胞增強或促進靶細胞之免疫攻擊之功能或反應。例如，免疫效應功能或反應係指T細胞或NK細胞促進靶細胞之殺死或抑制其生長或增殖之性質。在T細胞之情形下，主要刺激及共刺激係免疫效應功能或反應之實例。
術語「效應功能」係指細胞之專門功能。例如，T細胞之效應功能可為細胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細胞介素。
術語「編碼」係指多核苷酸中核苷酸之特異性序列(例如基因、cDNA或mRNA)用作合成生物過程中具有所定義核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或所定義胺基酸序列之其他聚合物及大分子的模板之固有性質及由其產生之生物性質。因此，若對應於基因之mRNA之轉錄及翻譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因、cDNA或RNA編碼蛋白質。編碼鏈(與mRNA序列一致且通常提供於序列表中之核苷酸序列)及非編碼鏈(用作基因或cDNA轉錄之模板)二者皆可稱為編碼該基因或cDNA之蛋白質或其他產物。
除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此為簡並形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。就編碼蛋白質之核苷酸序列可在某一形式中含有內含子而言，編碼蛋白質或RNA之片語核苷酸序列亦可包括內含子。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且係指如本文所述可有效地達成特定生物結果之化合物、調配物、材料或組合物的量。
術語「內源」係指來自生物體、細胞、組織或系統或在其內部產生之任何材料。
術語「外源」係指自生物體、細胞、組織或系統引入或在其外部產生之任何材料。
術語「表現」係指由啟動子驅動之具體核苷酸序列之轉錄及/或翻譯。
術語「轉移載體」係指包含經分離核酸且可用於將經分離核酸遞送至細胞內部之物質的組合物。多種載體為業內已知，包括(但不限於)直鏈多核苷酸、與離子型或兩親性化合物締合之多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應理解為進一步包括有利於核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、脂質體及諸如此類。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及諸如此類。
術語「表現載體」係指包含包括可操作地連接至欲表現之核苷酸序列之表現控制序列之重組多核苷酸的載體。表現載體包含用於表現之足夠順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中供應。表現載體包括所有業內已知納入重組多核苷酸之彼等，包括黏粒、質體(例如，裸露或含於脂質體中)及病毒(例如，慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「慢病毒」係指反轉錄病毒科之屬。慢病毒在反轉錄病毒中之獨特之處在於，能夠感染未分裂細胞；其可將大量遺傳資訊遞送至宿主細胞之DNA中，因此其係基因遞送載體之最有效方法之一。HIV、SIV及FIV皆係慢病毒之實例。
術語「慢病毒載體」係指源自慢病毒基因組之至少一部分之載體，尤其包括如Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中所提供之自失活慢病毒載體。可用於臨床中之慢病毒載體之其他實例包括(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因遞送技術、來自Lentigen之LENTIMAX™載體系統及諸如此類。慢病毒載體之非臨床類型亦可用且將為熟習此項技術者已知。
術語「同源」或「一致性」係指兩個聚合物分子之間、例如兩個核酸分子(例如兩個DNA分子或兩個RNA分子)之間或兩個多肽分子之間的亞單位序列一致性。當兩個分子二者中之亞單位位置由相同單體亞單位佔據時；例如若在兩個DNA分子中每一者中之位置由腺嘌呤佔據，則其在該位置處同源或一致。兩個序列之間之同源性係匹配或同源位置數之正函數；例如若兩個序列中之一半(例如聚合物10個亞單位長度上之5個位置)位置同源，則該兩個序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩個序列為90%同源。
非人類(例如鼠類)抗體之「人類化」形式係嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)，其含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列。在極大程度上，人類化抗體及其抗體片段係人類免疫球蛋白(接受者抗體或抗體片段)，其中來自接受者之互補決定區(CDR)的殘基經來自諸如小鼠、大鼠或兔等非人類物種(供體抗體)之CDR且具有期望特異性、親和力及能力的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基由相應非人類殘基置換。此外，人類化抗體/抗體片段可包含在接受者抗體與導入之CDR或框架序列中皆未發現之殘基。該等修飾可進一步完善且最佳化抗體或抗體片段性能。通常，人類化抗體或其抗體片段將包含至少一個且通常兩個可變結構域之實質上全部，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白之CDR區，且FR區之全部或一大部分為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc) (通常為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。關於其他詳情，參見Jones等人，Nature, 321: 522-525, 1986；Riechmann等人，Nature 332: 323-329, 1988；Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596, 1992。
「全人類」係指免疫球蛋白，例如抗體或抗體片段，其中整個分子為人類來源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致之胺基酸序列組成。
術語「經分離」意指自天然狀態改變或移除。例如，天然存在於活動物中之核酸或肽未「經分離」，但部分或全部自其天然狀態之共存材料分離之相同核酸或肽為「經分離」。經分離核酸或蛋白質可以實質上純化之形式存在，或可存在於非天然環境(例如宿主細胞)中。
在本發明上下文中使用普遍存在之核酸鹼基之以下縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸腺嘧啶，且「U」係指尿嘧啶。
術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調控序列與異源核酸序列之間之功能連接，以使後者表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列呈功能關係放置時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接，且例如在需要連結兩個蛋白質編碼區時處在同一閱讀框中。
術語免疫原性組合物之「非經腸」投與包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌內(i.m.)或胸骨內注射、腫瘤內或輸注技術。
術語「核酸」或「多核苷酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有與參考核酸具有類似結合性質且以類似於天然核苷酸之方式代謝之天然核苷酸之已知類似物的核酸。除非另有說明，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾變體(例如，簡並密碼子取代，例如保守取代)、對偶基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定地，藉由產生其中一或多個所選(或全部)密碼子之第三位經混合鹼基及/或去氧次黃嘌呤核苷殘基取代的序列可達成簡並密碼子取代(例如保守取代) (Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人，Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指包括由肽鍵共價連接之胺基酸殘基之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸之最大數量無限制。多肽包括包含由肽鍵彼此連結之兩個或更多個胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所用術語係指例如兩條短鏈(業內亦通常稱為肽、寡肽及寡聚物)及較長鏈(業內通常稱為蛋白質，其具有許多類型)。「多肽」尤其包括(例如)生物活性片段、實質上同源之多肽、寡肽、同源二聚體、異源二聚體、多肽之變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。
術語「啟動子」係指由細胞之合成機構或所引入合成機構所識別之起始多核苷酸序列之特定轉錄所需之DNA序列。
術語「啟動子/調控序列」係指為表現可操作地連接至啟動子/調控序列之基因產物所需之核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下此序列亦可包括增強子序列及為表現基因產物所需之其他調控元件。啟動子/調控序列可係例如以組織特異性方式表現基因產物之序列。
術語「組成型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞之大多數或所有生理學條件下在細胞中產生基因產物之核苷酸序列。
術語「誘導型」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，實質上僅在對應於啟動子之誘導劑存在於細胞中時在細胞中產生基因產物之核苷酸序列。
術語「組織特異性」啟動子係指當與由基因編碼或指定之多核苷酸可操作地連接時，實質上僅在細胞係對應於啟動子之組織類型之細胞時在細胞中產生基因產物的核苷酸序列。
術語「癌症相關抗原」或「腫瘤抗原」互換地指在癌細胞表面上整個或作為片段(例如MHC/肽)表現且用於將藥理學藥劑優先標靶癌細胞的分子(通常蛋白質、碳水化合物或脂質)。在一些實施例中，腫瘤抗原係由正常細胞及癌細胞二者表現之標記物，例如譜系標記物，例如B細胞上之CD19。在一些實施例中，腫瘤抗原係與正常細胞相比在癌細胞中過表現(例如與正常細胞相比，1倍過表現、2倍過表現、3倍過表現或更多)之細胞表面分子。在一些實施例中，腫瘤抗原係在癌細胞中不適當地合成之細胞表面分子，例如與在正常細胞上表現之分子相比含有缺失、添加或突變之分子。在一些實施例中，腫瘤抗原將僅在癌細胞之細胞表面上整個或作為片段(例如MHC/肽)表現，而不在正常細胞表面上合成或表現。在一些實施例中，本發明之CAR包括包含結合至MHC呈遞肽之抗原結合結構域(例如抗體或抗體片段)的CAR。通常，源自內源性蛋白質之肽填充在主要組織相容性複合物(MHC) I類分子之袋中，且由CD8 + T淋巴球上之T細胞受體(TCR)識別。MHC I類複合物由所有有核細胞組成型表現。在癌症中，病毒特異性及/或腫瘤特異性肽/MHC複合物代表免疫療法之一類獨特之細胞表面靶標。已闡述在人類白血球抗原(HLA)-A1或HLA-A2之背景下源自病毒或腫瘤抗原之TCR樣抗體標靶肽(參見(例如) Sastry等人，J Virol. 2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等人，Blood, 2011 117(16):4262-4272；Verma等人，J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther 2001 8(21) :1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med 2013 5(176) :176ra33；Tassev等人，Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。舉例而言，可自篩選文庫(例如人類scFv噬菌體展示文庫)鑑別TCR樣抗體。
術語「支持腫瘤之抗原」或「支持癌症之抗原」互換地指在細胞表面上表現、亦即自身而非癌性，但例如藉由促進癌細胞之生長或存活(例如，對免疫細胞之抗性)支持癌細胞的分子(通常蛋白質、碳水化合物或脂質)。此類型之實例性細胞包括基質細胞及髓樣源抑制細胞(MDSC)。支持腫瘤之抗原自身無需在支持腫瘤細胞中起作用，只要抗原存在於支持癌細胞之細胞上即可。
如在scFv背景下使用之術語「撓性多肽連接體」或「連接體」係指將可變重鏈與可變輕鏈區連接在一起之由單獨或以組合使用之諸如甘胺酸及/或絲胺酸等胺基酸殘基組成之肽連接體。在一個實施例中，撓性多肽連接體係Gly/Ser 連接體且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n係等於或大於1之正整數。舉例而言，n=1、n=2、n=3、n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10 (SEQ ID NO: 28)。在一個實施例中，撓性多肽連接體包括(但不限於) (Gly4 Ser)4 (SEQ ID NO: 29)或(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 30)。在另一實施例中，連接體包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser) (SEQ ID NO: 31)之多個重複序列。WO2012/138475中所述之連接體亦包括在本發明範疇內，該專利以引用方式併入本文中。
如本文所用之5'帽(亦稱為RNA帽、RNA 7-甲基鳥苷帽或RNA m7G帽)係在轉錄起始後不久即添加至真核信使RNA之「前面」或5'端之經修飾鳥嘌呤核苷酸。5'帽係由連接至第一轉錄核苷酸之端基組成。其存在對於核糖體之識別及針對RNA酶之保護至關重要。帽添加與轉錄偶合且以共轉錄方式發生，以使其相互影響。轉錄起始後不久，所合成mRNA之5'端藉由與RNA聚合酶締合之帽合成複合物結合。此酶複合物催化為mRNA加帽所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應進行。加帽部分可經修飾以調節mRNA之功能，例如其穩定性或翻譯效率。
如本文所使用，「活體外轉錄RNA」係指已在活體外合成之RNA，較佳為mRNA。通常，活體外轉錄RNA係自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄RNA之模板。
如本文所使用，「聚(A)」係一系列藉助多腺苷酸化連接至mRNA之三磷酸腺苷。在用於瞬時表現之構築體之較佳實施例中，聚A介於50與5000之間(SEQ ID NO: 32)，較佳大於64，更佳大於100，最佳大於300或400。聚(A)序列可經化學或酶促修飾以調節諸如定位、穩定性或翻譯效率等mRNA功能。
如本文所使用，「多腺苷酸化」係指將多腺苷醯基部分或其經修飾變體共價連接至信使RNA分子。在真核生物體中，大部分信使RNA (mRNA)分子在3'端經多腺苷酸化。3'聚(A)尾係經由酶(多腺苷酸化聚合酶)之作用添加至mRNA前體之長腺嘌呤核苷酸序列(通常數百個)。在高等真核生物中，聚(A)尾添加至含有特異性序列(多腺苷酸化信號)之轉錄本上。聚(A)尾及其結合之蛋白質幫助保護mRNA免於由外切酶降解。多腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自核之輸出及翻譯亦係重要的。多腺苷酸化在DNA轉錄成RNA後在核中立即發生，但此外亦可後來在細胞質中發生。在轉錄終止後，mRNA鏈經由與RNA聚合酶締合之核酸內切酶複合物之作用裂解。裂解位點之特徵通常在於在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA。在mRNA裂解後，腺苷殘基添加至裂解位點之游離3'端。
如本文所用之「瞬時」係指非整合轉基因經數小時、數天或數週時段之表現，其中該表現時間段小於基因在宿主細胞中整合至基因組中或含於穩定質體複製子內時表現之時間段。
如本文所用術語「治療(treat、treatment及treating)」係指由投與一或多種療法(例如一或多種治療劑，例如本發明之CAR)引起減少或改善增殖病症之惡化、嚴重程度及/或持續時間，或改善增殖病症之一或多種症狀(較佳一或多種可辨別之症狀)。在具體實施例中，術語「治療(treat、treatment及treating)」係指改善增殖病症之至少一個不一定是患者可辨別之可量測之物理參數，例如腫瘤之生長。在其他實施例中，術語「治療(treat、treatment及treating)」-係指藉由(例如)穩定可辨別症狀在物理上、藉由(例如)穩定物理參數在生理上或二者皆有抑制增殖病症惡化。在其他實施例中，術語「治療(treat、treatment及treating)」係指腫瘤大小或癌細胞計數減少或穩定。
術語「信號轉導路徑」係指在信號自細胞之一部分傳遞至細胞之另一部分中起作用之多種信號轉導分子之間的生物化學關係。片語「細胞表面受體」包括能夠接收信號且穿過細胞膜傳送信號之分子及分子複合物。
術語「個體」意欲包括其中可引發免疫反應之活生物體(例如，哺乳動物、人類)。
術語「實質上純化」之細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上純化之細胞亦指已與在其天然狀態下與其天然締合之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，實質上純化之細胞群體係指細胞之同源群體。在其他情況下，此術語僅僅指已與在其天然狀態下與其天然締合之細胞分離之細胞。在一些態樣中，細胞係在活體外培養。在其他態樣中，細胞未在活體外培養。
如本文所使用之術語「治療(therapeutic)」意指治療(treatment)。治療效應係藉由減輕、阻抑、緩解或消滅疾病狀態來獲得。
如本文所用之術語「預防」意指疾病或疾病狀態之預防或保護性治療。
在本發明上下文中，「腫瘤抗原」或「過度增生性病症抗原」或「與過度增生性病症相關之抗原」係指為特定過度增生性病症所共有之抗原。在某些態樣中，本發明之過度增殖病症抗原係源自癌症，包括(但不限於)原發性或轉移性黑色素瘤、胸腺瘤、淋巴瘤、肉瘤、肺癌、肝癌、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、白血病、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌及腺癌，例如乳癌、前列腺癌(例如去勢抗性或治療抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、卵巢癌、胰臟癌及諸如此類；或漿細胞增殖病症，例如無症狀骨髓瘤(燜燃型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤)、意義不明的單株丙種球蛋白病(MGUS)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤及多發性漿細胞瘤)、系統性類澱粉輕鏈類澱粉變性及POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群、高月病及PEP症候群)。
術語「轉染」或「轉變」或「轉導」係指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中之過程。「轉染」或「轉化」或「轉導」之細胞係經外源核酸轉染、轉變或轉導之細胞。該細胞包括原代個體細胞及其子代。
術語「特異性結合」係指識別並與存在於樣本中之結合配偶體(例如，T細胞上存在之刺激及/或共刺激分子)蛋白結合之抗體或配體，但該抗體或配體實質上並不識別或結合樣本中之其他分子。
如本文所用術語「可調控嵌合抗原受體(RCAR)」係指多肽之集合，在最簡單實施例中通常為兩種多肽之集合，其在免疫效應細胞中時向該細胞提供針對靶細胞(通常為癌細胞)之特異性及細胞內信號產生。在一些實施例中，RCAR包含至少細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「細胞內信號傳導結構域」)，該細胞質信號傳導結構域包含源自在CAR分子背景下如本文所定義之刺激分子及/或共刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一些實施例中，RCAR中多肽之集合並不彼此鄰接，例如在不同多肽鏈中。在一些實施例中，RCAR包括在二聚化分子存在時可使多肽彼此偶合(例如，可使抗原結合結構域偶合至細胞內信號傳導結構域)之二聚化開關。在一些實施例中，RCAR在如本文所述之細胞(例如免疫效應細胞)、例如RCAR表現細胞(在本文中亦稱為「RCARX細胞」)中表現。在實施例中，RCARX細胞係T細胞，且稱為RCART細胞。在實施例中，RCARX細胞係NK細胞，且稱為RCARN細胞。RCAR可為RCAR表現細胞提供針對靶細胞(通常癌細胞)之特異性及可調控細胞內信號生成或增殖，其可最佳化RCAR表現細胞之免疫效應性質。在實施例中，RCAR細胞至少部分取決於抗原結合結構域以提供針對包含由抗原結合結構域結合之抗原之靶細胞的特異性。
當「膜錨」或「膜系鏈結構域」用於本文中時該術語係指足以使細胞外或細胞內結構域錨定至漿膜之多肽或部分，例如肉豆蔻醯基。
當「開關結構域」用於本文中時，該術語例如在提及RCAR時係指在二聚化分子存在下與另一開關結構域締合之實體，通常基於多肽之實體。締合產生連接至(例如，融合至)第一開關結構域之第一實體與連接至(例如，融合至)第二開關結構域之第二實體之功能偶合。第一及第二開關結構域統稱為二聚化開關。在實施例中，第一及第二開關結構域彼此相同，例如，其係具有相同的一級胺基酸序列之多肽，且統稱為同二聚化開關。在實施例中，第一及第二開關結構域彼此不同，例如，其係具有不同的一級胺基酸序列之多肽，且統稱為異二聚化開關。在實施例中，開關在細胞內。在實施例中，開關在細胞外。在實施例中，開關結構域係基於多肽之實體，例如基於FKBP或FRB，且二聚化分子為小分子，例如雷帕黴素類似物(rapalogue)。在實施例中，開關結構域係基於多肽之實體，例如結合myc肽之scFv，且二聚化分子為多肽、其片段或多肽之多聚體，例如myc配體或myc配體之結合至一或多個myc scFv之多聚體。在實施例中，開關結構域係基於多肽之實體，例如myc受體，且二聚化分子為抗體或其片段，例如myc抗體。
當「二聚化分子」用於本文中時，該術語例如在提及RCAR時係指促進第一開關結構域與第二開關結構域締合之分子。在實施例中，二聚化分子並非天然存在於個體中，或並不以將產生顯著二聚化之濃度存在。在實施例中，二聚化分子為小分子，例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕黴素類似物，例如RAD001。
術語「生物等效」係指產生與由參考劑量或參考量之參考化合物(例如，RAD001)產生之效應等效的效應所需之除參考化合物(例如，RAD001)外之藥劑的量。在實施例中，效應係mTOR抑制之程度，例如如藉由P70 S6激酶抑制所量測，例如如在活體內或活體外分析中所評估，例如如藉由本文所述之分析(例如，Boulay分析)所量測，或藉由西方墨點量測磷酸化S6含量。在實施例中，效應係改變PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率，如藉由細胞分選所量測。在實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量係與參考劑量或參考量之參考化合物達成相同P70 S6激酶抑制程度之量或劑量。在實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量係與參考劑量或參考量之參考化合物達成相同的PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率變化程度之量或劑量。
術語「低免疫增強劑量」在與mTOR抑制劑(例如別位mTOR抑制劑，例如RAD001或雷帕黴素，或催化mTOR抑制劑)連同使用時係指mTOR抑制劑之部分、而非完全抑制mTOR活性之劑量，例如如藉由P70 S6激酶活性之抑制所量測。例如藉由抑制P70 S6激酶評估mTOR活性之方法論述於本文中。該劑量不足以產生完全免疫阻抑，但足以增強免疫反應。在實施例中，mTOR抑制劑之低免疫增強劑量引起PD-1陽性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之數目減少、及/或PD-1陰性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之數目增加、或PD-1陰性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞) /PD-1陽性免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之比率增加。
在實施例中，mTOR抑制劑之低免疫增強劑量會使原初T細胞數增加。在實施例中，mTOR抑制劑之低免疫增強劑量會引起以下中之一或多者：
增加以下標記物中之一或多者在例如記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現：CD62L高、CD127高、CD27+及BCL2；
減少KLRG1例如在記憶T細胞(例如，記憶T細胞前體)上之表現；及
增加記憶T細胞前體(例如，具有以下特徵中之任一者或該等特徵之組合之細胞)數：增加的CD62L高、增加的CD127高、增加的CD27+、減少的KLRG1及增加的BCL2；
其中例如與未經治療之個體相比，例如至少瞬時出現上述任一變化。
如本文所用之「難治性」係指對治療無反應之疾病，例如癌症。在實施例中，難治性癌症可在治療前或治療開始時抵抗治療。在其他實施例中，難治性癌症可在治療期間變得難治。難治性癌症亦稱為抗性癌症。
如本文所用之「復發的」或「復發」係指在改良或反應性時段之後、例如在療法(例如癌症療法)之先前治療之後再次出現疾病(例如癌症)或疾病(例如癌症)之症狀之體徵。舉例而言，反應性時段可涉及癌細胞之含量落在特定臨限值之下，例如低於20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。再次出現可涉及癌細胞之含量上升高於特定臨限值，例如高於20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。
範圍：在本發明通篇中，本發明之多個態樣可以範圍格式呈現。應理解，呈範圍格式之說明僅出於方便及簡潔之目的，且不應理解為對本發明範疇之硬性限制。因此，範圍之說明應視為特定揭示所有可能的子範圍以及該範圍內之個別數值。例如，諸如1至6等範圍之說明應視為特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子範圍以及該範圍內之個別數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95%至99%一致性之範圍包含具有95%、96%、97%、98%或99%一致性之範圍，且包括諸如96%至99%、96%至98%、96%至97%、97%至99%、97%至98%及98%至99%一致性等子範圍。此無論範圍之寬度如何皆適用。
如本文所用術語「基因編輯系統」係指在由系統標靶之基因體DNA之位點處或附近引導及實現一或多個核酸之改變(例如缺失)的系統，例如一或多個分子。基因編輯系統為業內已知，且下文更全面闡述。
下文更詳細闡述特定官能基及化學術語之定義。化學元素係依照元素週期表，CAS版，Handbook of Chemistry and Physics ，第75板，封裡來鑑別，且具體官能基通常如本文中所闡述來定義。另外，有機化學之一般原理以及具體官能部分及反應性闡述於以下中：Thomas Sorrell,Organic Chemistry , University Science Books, Sausalito, 1999；Smith及March,March’s Advanced Organic Chemistry , 第5版，John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations , VCH Publishers, Inc., New York, 1989；及Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis , 第3版，Cambridge University Press, Cambridge, 1987。
如本文所用術語「烷基」係指單價飽和、直鏈或具支鏈烴，例如1-12、1-10或1-6個碳原子之直鏈或具支鏈基團，在本文中分別稱作C1 -C12 烷基、C1 -C10 烷基及C1 -C6 烷基。烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第二戊基、異戊基、第三丁基、正戊基、新戊基、正己基、第二己基及諸如此類。
如本所用術語「烯基」及「炔基」係指與上述烷基在長度及可能取代上類似、但分別含有至少一個雙鍵或三鍵之不飽和脂肪族基團類似物。實例性烯基包括(但不限於) -CH=CH2 及-CH2 CH=CH2 。
如本文所用術語「芳基」係指單環、二環或多環烴環系統，其中至少一個環係芳香族。代表性芳基包括完全芳香族環系統，例如苯基(例如(C6 )芳基)、萘基(例如(C10 )芳基)及蒽基(例如(C14 )芳基)；及其中芳香族碳環稠合至一或多個非芳香族碳環之環系統，例如二氫茚基、鄰苯二甲醯亞胺基、萘亞胺基或四氫萘基，及諸如此類。
如本文所用術語「碳環基」係指含有3-18個碳原子之單環或稠合、螺稠合及/或橋接二環或多環烴環系統，其中每一環完全飽和或含有一或多個不飽和單元，但其中無一環係芳香族。代表性碳環基包括環烷基(例如環戊基、環丁基、環戊基、環己基及諸如此類)及環烯基(例如環戊烯基、環己烯基、環戊二烯基及諸如此類)。
如本文所用術語「羰基」係指-C=O。
如本文所用術語「氰基」係指-CN。
如本文所用術語「鹵基」或「鹵素」係指氟(氟，-F)、氯(氯，-Cl)、溴(溴，-Br)或碘(碘，-I)。
如本文所用術語「雜烷基」係指單價飽和直鏈或具支鏈烷基鏈，其中鏈中之至少一個碳原子經雜原子(例如O、S或N)置換，條件係在取代時，鏈包含至少一個碳原子。在一些實施例中，雜烷基可包含(例如) 1-12、1-10或1-6個碳原子，在本文中稱作C1 -C12 雜烷基、C1 -C10 雜烷基及C1 -C6 雜烷基。在某些情況下，雜烷基包含1、2、3或4個獨立地選擇之雜原子代替烷基鏈中之1、2、3或4個個別碳原子。代表性雜烷基包括-CH2 NHC(O)CH3 、-CH2 CH2 OCH3 、-CH2 CH2 NHCH3 、-CH2 CH2 N(CH3 )CH3 及諸如此類。
如本文所用術語「雜芳基」係指單環、二環或多環系統，其中至少一個環係芳香族且包含雜原子；且其中其他環不為雜環基(如下文所定義)。代表性雜芳基包括環系統，其中(i) 每一環包含雜原子且係芳香族，例如咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嗒嗪基、嘧啶基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基及蝶啶基；(ii) 每一環係芳香族或碳環基，至少一個芳香族環包含雜原子且至少一個其他環係烴環或例如吲哚基、異吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、異喹啉基、㖕啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喏啉基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、吡啶并[2,3-b ]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮、噻唑并-[4,5-c ]-吡啶基、4,5,6,7-四氫噻吩并[2,3-c ]吡啶基、5,6-二氫-4H-噻吩并[2,3-c ]吡咯基、4,5,6,7,8-四氫喹啉基及5,6,7,8-四氫異喹啉基；及(iii) 每一環係芳香族或碳環基，且至少一個芳香族環與另一芳香族環共用橋頭雜原子，例如4H-喹嗪基。在某些實施例中，雜芳基係單環或二環，其中該等環中之每一者含有5或6個環原子，其中該等環原子中之1、2、3或4者係獨立地選自N、O及S之雜原子。
如本文所用術語「雜環基」係指單環或稠合、螺稠合及/或橋接二環及多環系統，其中至少一個環係飽和或部分不飽和的(但並非芳香族)且包含雜原子。雜環基可在產生穩定結構之任一雜原子或碳原子處連接至其側基，且任一環原子可視情況經取代。代表性雜環基包括如下環系統，其中(i) 每一環係非芳香族且至少一個環包含雜原子，例如四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯啶基、吡咯啶酮基、六氫吡啶基、吡咯啉基、十氫喹啉基、噁唑啶基、六氫吡嗪基、二噁烷基、二氧戊環基、二氮呯基、氧氮呯基、硫氮呯基、嗎啉基及奎寧環基；(ii) 至少一個環係非芳香族且包含雜原子且至少一個其他環係芳香族碳環，例如1,2,3,4-四氫喹啉基；及(iii) 至少一個環係非芳香族且包含雜原子且至少一個其他環係芳香族且包含雜原子，例如3,4-二氫-1H-吡喃并[4,3-c]吡啶基及1,2,3,4-四氫-2,6-萘啶基。在某些實施例中，雜環基係單環或二環，其中該等環中之每一者含有3-7個環原子，其中該等環原子中之1、2、3或4者係獨立地選自N、O及S之雜原子。
如本文中所闡述，本發明化合物可含有「視情況經取代」部分。一般而言，不論是否前面具有術語「視情況」，術語「經取代」意指指定部分之一或多個氫經適宜取代基置換。除非另外指示，否則「視情況經取代」之基團可在該基團之每一可取代位置具有適宜取代基，且在任一給定結構中之一個以上之位置可經一個以上選自指定基團之取代基取代時，每一位置之取代基可相同或不同。本發明所設想之取代基之組合較佳係使得形成穩定或化學上可行之化合物之彼等。如本文所用術語「穩定」係指如下化合物：在出於本文所揭示之一或多個目的而經受容許其製備、檢測且在某些實施例中其回收、純化及使用之條件時，其並不發生實質性變化。
如本文所用之術語「側氧基」係指=O。
如本文所用之術語「硫代羰基」係指C=S。
如本文所用之術語「醫藥上可接受之鹽」係指彼等在合理醫學判斷範圍內適用於接觸人類及低等動物組織而不會產生過度毒性、刺激、過敏反應及諸如此類且具有相稱之合理效益/風險比之鹽。醫藥上可接受之鹽為業內所熟知。舉例而言，Berge等人在引用方式併入本文中之J. Pharmaceutical Sciences , 1977, 66, 1-19中詳細闡述醫藥上可接受之鹽。本發明化合物之醫藥上可接受之鹽包括原子適宜無機及有機酸及鹼之彼等。醫藥上可接受之無毒酸加成鹽之實例係胺基與無機酸(例如，鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及高氯酸)或與有機酸(例如，乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸)或藉由使用業內已知之其他方法(例如，離子交換)形成之鹽。其他醫藥上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、已酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酯酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對-甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及諸如此類。源自適當鹼之鹽包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽及N+ (C1-4 烷基)4 ‑ 鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及諸如此類。若適當，其他醫藥上可接受之鹽包括無毒銨、四級銨及胺陽離子，其係使用諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳烷基磺酸根及芳基磺酸根等抗衡離子來形成。
術語「溶劑合物」係指通常藉由溶劑分解反應與溶劑締合之化合物形式。此物理締合可包括氫鍵結。習用溶劑包括水、甲醇、乙醇、乙酸、DMSO、THF、二乙醚及諸如此類。式(I)、式(I-a)及/或式(II)化合物可(例如)以結晶型製備，且可溶劑化。適宜溶劑合物包括醫藥上可接受之溶劑合物，且進一步包括化學計量溶劑合物及非化學計量溶劑合物二者。在某些情況中，舉例而言，在結晶固體之晶格中納入一或多種溶劑分子時，溶劑合物能夠分離。「溶劑合物」涵蓋溶液相及可分離溶劑合物。代表性溶劑合物包括水合物、乙醇合物及甲醇合物。
術語「水合物」係指與水締合之化合物。通常，化合物之水合物中所含有之水分子之數目與水合物中化合物分子之數目呈一定比率。因此，化合物之水合物可由(例如)通式R×x H2 O表示，其中R係化合物且其中x係大於0之數。給定化合物可形成一種以上水合物，包括例如一水合物(x係1)、較低水合物(x係大於0且小於1之數，例如半水合物(R×0.5 H2 O))及多水合物(x係大於1之數，例如二水合物(R×2 H2 O)及六水合物(R×6 H2 O))。
亦應理解，具有相同分子式但其原子之鍵結的性質或順序不同或其原子空間排列不同之化合物稱為「異構物」。原子空間排列不同之異構物稱為「立體異構物」。
彼此非鏡像之立體異構物稱為「非鏡像異構物」，且彼此為不可重疊鏡像之彼等稱為「鏡像異構物」。當化合物具有不對稱中心(例如其與4個不同基團鍵結)時，可能存在一對鏡像異構物。鏡像異構物之特徵在於其不對稱中心之絕對構形且可由Cahn及Prelog之R-及S排序規則或由分子旋轉偏振光平面之方式來闡述並指定為右旋或左旋(亦即分別為(+)-或(-)異構物)。對掌性化合物可以單獨鏡像異構物或以其混合物之形式存在。含有相同比例之鏡像異構物之混合物稱為「外消旋混合物」。
術語「互變異構物」係指具有特定化合物結構之可相互轉換形式且在氫原子及電子置換方面不同之化合物。因此，兩個結構可經由π電子及原子(通常為H)運動達到平衡。例如，烯醇及酮係互變異構物，此乃因其可藉由使用酸或鹼處理快速地發生互變。互變異構現象之另一實例係苯基硝基甲烷之酸-及硝基形式，其同樣係藉由使用酸或鹼處理形成。
互變異構形式可能與達成所關注化合物之最佳化學反應性及生物活性有關。
除非另有說明，否則本文中繪示之結構亦意欲包括結構之所有異構物(例如鏡像異構物、非鏡像異構物及幾何(或構象))形式；例如，每一不對稱中心之R及S構形、Z及E雙鍵異構物以及Z及E構象異構物。因此，本發明化合物之單一立體化學異構物以及鏡像異構物、非鏡像異構物及幾何異構物(或構象異構物)混合物皆在本發明範圍內。除非另外陳述，否則本發明化合物之所有互變異構物形式皆在本發明範圍內。另外，除非另外陳述，否則本文所繪示之結構亦意欲包括僅在一或多個同位素富集原子存在時不同的化合物。舉例而言，具有包括用氘或氚置換氫或用13 C-或14 C富集碳置換碳之本結構的化合物在本發明範疇內。根據本發明，該等化合物可用作(例如)分析工具、生物分析中之探針或治療劑。
若特定鏡像異構物較佳，則在一些實施例中，其可實質上無相應鏡像異構物地提供，且亦可稱作「光學富集」。如本文所用「光學富集」意指該化合物由顯著較大比例之一種鏡像異構物構成。在某些實施例中，化合物由至少約90重量%之較佳鏡像異構物構成。在其他實施例中，化合物由至少約95重量%、98重量%或99重量%之較佳鏡像異構物構成。較佳鏡像異構物可藉由熟習此項技術者已知之任何方法(包括手性高壓液相層析(HPLC))自外消旋混合物分離且形成及結晶手性鹽或藉由不對稱合成製備。參見(例如) Jacques等人，Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981)；Wilen等人，Tetrahedron 33:2725 (1977)；Eliel, E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962)；Wilen, S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions 第268頁(E.L. Eliel編輯，Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)。
下文進一步詳細闡述本文之組合物及方法之各個態樣。其他定義闡述於說明書通篇中。
詳細說明
本發明至少部分提供治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向個體投與有效量之表現結合BCMA之CAR分子的細胞(例如細胞群體) (「BCMA CAR表現細胞」)。在一些實施例中，與BCMA表現相關之疾病係血液癌症，例如ALL、CLL、DLBCL或多發性骨髓瘤。在一些實施例中，個體患有III期高風險多發性骨髓瘤(例如依據修訂之國際分期系統之III期高風險多發性骨髓瘤)，藉此治療個體。在一些實施例中，基於自患者樣本獲取生物標記物之含量投與BCMA CAR表現細胞療法。在一些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法係與第二療法組合投與個體。在一些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法及第二療法係同時或依序投與。在一些實施例中，第二療法係CD19 CAR表現細胞療法。
嵌合抗原受體 (CAR)
在一態樣中，本文揭示使用表現CAR分子之細胞(例如細胞群體)之方法。在一態樣中，實例性CAR構築體包含可選前導序列(例如本文所述前導序列)、抗原結合結構域(例如本文所述抗原結合結構域)、鉸鏈(例如本文所述鉸鏈區)、跨膜結構域(例如本文所述跨膜結構域)及細胞內刺激性結構域(例如本文所述細胞內刺激性結構域)。在一態樣中，實例性CAR構築體包含可選前導序列(例如本文所述前導序列)、細胞外抗原結合結構域(例如本文所述抗原結合結構域)、鉸鏈(例如本文所述鉸鏈區)、跨膜結構域(例如本文所述跨膜結構域)、細胞內共刺激信號傳導結構域(例如本文所述共刺激信號傳導結構域)及/或細胞內初級信號傳導結構域(例如本文所述初級信號傳導結構域)。
可作為本文所述CAR分子之一部分之各種組分之非限制性實例的序列列示於表1 中，其中「aa」表示胺基酸，且「na」表示編碼相應肽之核酸。
表 1. CAR之各種組分之序列(aa -胺基酸序列，na - 核酸序列).
SEQ ID NO: SEQ ID NO: 說明 序列
SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 1a EF-1啟動子 CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA
SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 2a 前導序列(aa) MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 3a 前導序列(na) ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
SEQ ID NO: 33 SEQ ID NO: 33a 前導序列(na) ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 4a CD 8鉸鏈(aa) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 5a CD8鉸鏈(na) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 6a Ig4鉸鏈(aa) ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 7a Ig4鉸鏈(na) GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 8a IgD鉸鏈(aa) RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH
SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 9a IgD鉸鏈(na) AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT
SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 10a GS鉸鏈/連接體(aa) GGGGSGGGGS
SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 11a GS鉸鏈/連接體(na) GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC
SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 12a CD8TM (aa) IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 13a CD8 TM (na) ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
SEQ ID NO: 34 SEQ ID NO: 34a CD8 TM (na) ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 14a 4-1BB細胞內結構域(aa) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 15a 4-1BB細胞內結構域(na) AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
SEQ ID NO: 35 SEQ ID NO: 118a 4-1BB細胞內結構域(na) AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 16a CD27 (aa) QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 17a CD27 (na) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 18a CD3-ζ (aa) RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 19a CD3-ζ (na) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 36 SEQ ID NO: 119a CD3-ζ (na) CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 20a CD3-ζ (aa) RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 21a CD3-ζ (na) AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 22a 連接體 GGGGS
SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 23a 連接體 GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC
SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 24a PD-1細胞外結構域(aa) Pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlv
SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 25a PD-1細胞外結構域(na) Cccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtc
SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 26a 具有信號之PD-1 CAR (aa) Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 27a PD-1 CAR (na) Atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc
SEQ ID NO: 28 SEQ ID NO: 28a 連接體 (Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n = 1-10
SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 29a 連接體 (Gly4 Ser)4
SEQ ID NO: 30 SEQ ID NO: 30a 連接體 (Gly4 Ser)3
SEQ ID NO: 31 SEQ ID NO: 31a 連接體 (Gly3Ser)
SEQ ID NO: 32 SEQ ID NO: 32a 聚A [a]50-5000
SEQ ID NO: 37 SEQ ID NO: 39a PD1 CAR (aa) Pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlv tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 120a ICOS細胞內結構域(aa) TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL
SEQ ID NO: 271 SEQ ID NO: 1111a ICOS細胞內結構域(na) ACAAAAAAGAAGTATTCATCCAGTGTGCACGACCCTAACGGTGAATACATGTTCATGAGAGCAGTGAACACAGCCAAAAAATCCAGACTCACAGATGTGACCCTA
SEQ ID NO: 272 SEQ ID NO: 972a ICOS TM結構域(aa) TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWL
SEQ ID NO: 273 SEQ ID NO: 973a ICOS TM結構域(na) ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATTTCTGGTTACCCATAGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTCTGCATTTTGGGATGCATACTTATTTGTTGGCTT
SEQ ID NO: 274 SEQ ID NO: 124a CD28細胞內結構域(aa) RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO: 275 SEQ ID NO: 1113a CD28細胞內結構域(na) AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
CAR 抗原結合結構域
在一態樣中，包含抗原結合結構域之CAR之部分包含標靶腫瘤抗原(例如本文所述腫瘤抗原)之抗原結合結構域。在一些實施例中，抗原結合結構域結合至：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素樣分子-1、CD33；表皮生長因子受體變體III (EGFRvIII)；神經節苷酯G2 (GD2)；神經節苷酯GD3；TNF受體家族成員；B細胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特異性膜抗原(PSMA)；受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)；Fms樣酪胺酸激酶3 (FLT3)；腫瘤相關之醣蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮細胞黏著分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；介白素-13受體亞單位α-2；間皮素；介白素11受體α (IL-11Ra)；前列腺幹細胞抗原(PSCA)；蛋白酶絲胺酸21；血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板源生長因子受體β (PDGFR-β)；階段特異性胚胎抗原-4 (SSEA-4)；CD20；葉酸鹽受體α；受體酪胺酸-蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；細胞表面相關黏蛋白1 (MUC1)；表皮生長因子受體(EGFR)；神經細胞黏著分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸磷酸酶(PAP)；突變之延伸因子2 (ELF2M)；Ephrin B2；纖維母細胞活化蛋白α (FAP)；胰島素樣生長因子1受體(IGF-I受體)、碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶體(蛋白體，巨蛋白因子)亞單位，β型，9 (LMP2)；醣蛋白100 (gp100)；由斷裂點簇集區(BCR)及Abelson鼠類白血病病毒致癌基因同系物1 (Abl)組成之致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪胺酸酶；ephrin A型受體2 (EphA2)；岩藻糖基GM1；sialyl Lewis黏著分子(sLe)；神經節苷酯GM3；轉麩醯胺酸酶5 (TGS5)；高分子量黑色素瘤相關抗原(HMWMAA)；o-乙醯基-GD2神經節苷酯(OAcGD2)；葉酸鹽受體β；腫瘤內皮標記物1 (TEM1/CD248)；7相關之腫瘤內皮標記(TEM7R)；密連蛋白6 (CLDN6)；甲狀腺刺激激素受體(TSHR)；G蛋白偶聯受體C類5組，成員D (GPRC5D)；染色體X開放閱讀框61 (CXORF61)；CD97；CD179a；退行發育性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盤特異性1 (PLAC1)；globoH甘神經醯胺(GloboH)之六醣部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；uroplakin 2 (UPK2)；A型肝炎病毒細胞受體1 (HAVCR1)；腎上腺素受體β 3 (ADRB3)；泛連接蛋白3 (PANX3)；G蛋白偶聯受體20 (GPR20)；淋巴球抗原6複合物，基因座K 9 (LY6K)；嗅覺接受器51E2 (OR51E2)；TCRγ交替閱讀框蛋白(TARP)；威爾姆氏瘤(Wilms tumor)蛋白(WT1)；癌症/睪丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睪丸抗原2 (LAGE-1a)；黑色素瘤相關之抗原1 (MAGE-A1)；ETS易位變體基因6，位於染色體12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族成員1A (XAGE1)；血管生成素結合細胞表面受體2 (Tie 2)；黑色素瘤癌睪丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤癌睪丸抗原-2 (MAD-CT-2)；Fos相關之抗原1；腫瘤蛋白p53 (p53)；p53突變體；前列腺特異性蛋白(prostein)；存活素；端粒酶；前列腺癌腫瘤抗原-1、由T細胞1識別之黑色素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突變體；人類端粒酶反轉錄酶(hTERT)；肉瘤易位斷裂點；細胞凋亡之黑色素瘤抑制劑(ML-IAP)；ERG (跨膜蛋白酶，絲胺酸2 (TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙醯基葡糖胺基-轉移酶V (NA17)；成對盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受體；細胞週期蛋白B1；v-myc禽類髓細胞瘤病病毒致癌基因神經胚細胞瘤源同系物(MYCN)；Ras同系物家族成員C (RhoC)；酪胺酸酶相關蛋白2 (TRP-2)；細胞色素P450 1B1 (CYP1B1)；CCCTC結合因子(鋅指蛋白)樣，由T細胞3識別之鱗狀細胞癌抗原(SART3)；成對盒蛋白Pax-5 (PAX5)；頂體蛋白原結合蛋白sp32 (OY-TES1)；淋巴球特異性蛋白酪胺酸激酶(LCK)；A激酶錨蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤，X斷裂點2 (SSX2)；晚期醣化終產物受體(RAGE-1)；腎遍在1 (RU1)；腎遍在2 (RU2)；天冬醯胺內肽酶；人類乳頭瘤病毒E6 (HPV E6)；人類乳頭瘤病毒E7 (HPV E7)；腸羧基酯酶；突變之熱休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白血球相關之免疫球蛋白樣受體1 (LAIR1)；IgA受體之Fc片段(FCAR或CD89)；白血球免疫球蛋白樣受體亞家族A成員2 (LILRA2)；CD300分子樣家族成員f (CD300LF)；C型凝集素結構域家族12成員A (CLEC12A)；骨髓基質細胞抗原2 (BST2)；含有EGF樣模組之黏蛋白樣激素受體樣2 (EMR2)；淋巴球抗原75 (LY75)；磷脂醯肌醇聚糖-3 (GPC3)；Fc受體樣5 (FCRL5)；或免疫球蛋白λ樣多肽1 (IGLL1)。
抗原結合結構域可為結合至抗原之任何結構域，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、重組抗體、鼠類抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能片段，包括(但不限於)單一結構域抗體，例如重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)及駱駝科動物源性奈米抗體之可變結構域(VHH)，及業內已知用作抗原結合結構域之替代性支架，例如重組纖連蛋白結構域、T細胞受體(TCR)或其片段，例如單鏈TCR，及諸如此類。在一些情況下，使抗原結合結構域源自其中最終將使用CAR之同一物種有益。例如，對於人類中之使用，CAR之抗原結合結構域包含抗體或抗體片段之抗原結合結構域之人類或人類化殘基可能有益。
CAR 跨膜結構域
關於跨膜結構域，在各個實施例中，CAR可經設計以包含連接至CAR之細胞外結構域之跨膜結構域。跨膜結構域可包括一或多個毗鄰跨膜區之其他胺基酸，例如一或多個與衍生出跨膜之蛋白質之細胞外區域締合之胺基酸(例如細胞外區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、至多15個胺基酸)及/或一或多個與衍生出跨膜蛋白的蛋白質之細胞內區域締合之其他胺基酸(例如細胞內區域之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、至多15個胺基酸)。在一態樣中，跨膜結構域係與所CAR之其他結構域中之一者締合者。在一些情況下，跨膜結構域可藉由胺基酸取代選擇或修飾以避免該等結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域結合，例如以最小化與受體複合物之其他成員的相互作用。在一態樣中，跨膜結構域能夠與CAR表現細胞之細胞表面上之另一CAR同二聚化。在不同態樣中，跨膜結構域之胺基酸序列可經修飾或取代以最小化與存在於同一CART中之天然結合配偶體之結合結構域的相互作用。
跨膜結構域可源自天然或重組來源。在來源為天然時，該結構域可源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一態樣中，每當CAR已結合至靶標時，跨膜結構域皆能夠信號傳導至細胞內結構域。具體用於本發明中之跨膜區可包括至少例如以下之跨膜區：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD27、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些實施例中，跨膜結構域可包括至少以下之跨膜區：例如KIR2DS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C。
在一些情況下，跨膜結構域可經由鉸鏈(例如，來自人類蛋白質之鉸鏈)連接至CAR之細胞外區域，例如CAR之抗原結合結構域。例如，在一個實施例中，鉸鏈可係人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈)或CD8a鉸鏈。在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列(例如，由其組成)。在一態樣中，跨膜結構域包含SEQ ID NO: 12之跨膜結構域(例如，由其組成)。
在一態樣中，鉸鏈或間隔體包含IgG4鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈或間隔體包含由SEQ ID NO: 7之核苷酸序列編碼之鉸鏈。
在一態樣中，鉸鏈或間隔體包含IgD鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔體包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列之鉸鏈。在一些實施例中，鉸鏈或間隔體包含由SEQ ID NO: 9之核苷酸序列編碼之鉸鏈。
在一態樣中，跨膜結構域可為重組結構域，在該情形下其將主要包含疏水殘基，例如白胺酸及纈胺酸。在一態樣中，可在重組跨膜結構域之每一端發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。
視情況，長度介於2個與10個胺基酸之間之短寡肽或多肽連接體可在CAR之跨膜結構域與細胞質區域之間形成連接。甘胺酸-絲胺酸雙聯體提供尤其適宜之連接體。舉例而言，在一態樣中，連接體包含SEQ ID NO: 10之胺基酸序列。在一些實施例中，連接體係由SEQ ID NO: 11之核苷酸序列編碼。
在一態樣中，鉸鏈或間隔體包含KIR2DS2鉸鏈。
細胞質結構域
CAR之細胞質結構域或區域包括細胞內信號傳導結構域。細胞內信號傳導結構域通常負責活化其中已引入CAR之免疫細胞之至少一種正常效應功能。
用於本文所述CAR中之細胞內信號傳導結構域之實例包括T細胞受體(TCR)及在抗原受體參與後協同起起始信號轉導作用之共受體之細胞質序列以及該等序列之任何衍生物或變體及具有相同功能性能力之任何重組序列。
已知僅經由TCR產生之信號不足以完全活化T細胞，且亦需要第二次或共刺激信號。因此，可認為T細胞活化係藉由兩類不同的細胞質信號傳導序列來介導：經由TCR (初級細胞內信號傳導結構域)起始抗原依賴性初級活化之彼等，及以非抗原依賴性方式起提供第二次或共刺激信號(第二次細胞質信號傳導結構域，例如共刺激結構域)作用之彼等。
初級信號傳導結構域以刺激方式或以抑制方式調控TCR複合物之初次活化。以刺激方式起作用之初級細胞內信號傳導結構域可含有信號傳導基序，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基序或ITAM。
具體用於本發明中之含有ITAM之初級細胞內信號傳導結構域之實例包括TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ 、CD3 δ 、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (亦稱為「ICOS」)、FcεRI、DAP10、DAP12及CD66d之彼等。在一個實施例中，本發明CAR包含細胞內信號傳導結構域，例如CD3-ζ之初級信號傳導結構域，例如本文所述CD3-ζ序列。
在一個實施例中，初級信號傳導結構域包含經修飾ITAM結構域，例如與天然ITAM結構域相比具有改變(例如，增加或降低)之活性之突變ITAM結構域。在一個實施例中，初級信號傳導結構域包含經修飾含有ITAM之初級細胞內信號傳導結構域，例如最佳化及/或截短之含有ITAM之初級細胞內信號傳導結構域。在實施例中，初級信號傳導結構域包含一個、兩個、三個、四個或更多個ITAM基序。
共刺激信號傳導結構域
CAR之細胞內信號傳導結構域可包含CD3-ζ信號傳導結構域本身，或其可與在本發明CAR背景下使用之任何其他期望細胞內信號傳導結構域組合。例如，CAR之細胞內信號傳導結構域可包含CD3 ζ鏈部分及共刺激信號傳導結構域。共刺激信號傳導結構域係指包含共刺激分子之細胞內結構域之CAR部分。在一個實施例中，細胞內結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD28之信號傳導結構域。在一態樣中，細胞內結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及ICOS之信號傳導結構域。
共刺激分子可為淋巴球有效因應抗原所需之除抗原受體或其配體外之細胞表面分子。該等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及與CD83特異性結合之配體及諸如此類。例如已展現，CD27共刺激增強活體外人類CART細胞之擴增、效應功能及存活率，且增加活體內人類T細胞持久性及抗腫瘤活性(Song等人，Blood. 2012；119(3):696-706)。該等共刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、NKG2D、NKG2C及PAG/Cbp。
CAR之細胞質部分內之細胞內信號傳導序列可以隨機或指定順序彼此連接。視情況，例如長度介於2個與10個胺基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)之間之短寡肽或多肽連接體可在細胞內信號傳導序列之間形成連接。在一個實施例中，可使用甘胺酸-絲胺酸雙聯體作為適宜連接體。在一個實施例中，可使用單一胺基酸(例如，丙胺酸、甘胺酸)作為適宜連接體。
在一態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包含兩個或更多個(例如，2個、3個、4個、5個或更多個)共刺激信號傳導結構域。在實施例中，兩個或更多個(例如，2個、3個、4個、5個或更多個)共刺激信號傳導結構域由連接體分子(例如，本文所述之連接體分子)分開。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域包含兩個共刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，連接體分子係甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接體係丙胺酸殘基。
在一態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD28之信號傳導結構域。在一態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域。在一態樣中，4-1BB之信號傳導結構域係SEQ ID NO: 14之信號傳導結構域。在一態樣中，CD3-ζ之信號傳導結構域係SEQ ID NO: 18之信號傳導結構域。
在一態樣中，細胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD27之信號傳導結構域。在一態樣中，CD27之信號傳導結構域包含SEQ ID NO: 16之胺基酸序列。在一態樣中，CD27之信號傳導結構域係由SEQ ID NO: 17之核酸序列編碼。
在一態樣中，本文所述CAR表現細胞可進一步包含例如針對相同靶標或不同靶標(例如除本文所述癌症相關抗原或本文所述不同癌症相關抗原(例如CD19、CD33、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸鹽受體β)之外之靶標)的第二CAR，例如包括不同抗原結合結構域之第二CAR。在一個實施例中，第二CAR包括針對與癌症相關抗原相同之癌細胞類型表現之靶標的抗原結合結構域。在一個實施例中，CAR表現細胞包含第一CAR，其標靶第一抗原且包括具有共刺激信號傳導結構域而非初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域；及第二CAR，其標靶第二不同抗原且包括具有初級信號傳導結構域而非共刺激信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域。儘管不希望受限於理論，但將共刺激信號傳導結構域(例如4-1BB、CD28、ICOS、CD27或OX-40)放置於第一CAR上及將初級信號傳導結構域(例如CD3 ζ)放置於第二CAR上可限制針對表現兩種靶標之細胞的CAR活性。在一個實施例中，CAR表現細胞包含第一癌症相關抗原CAR，其包括結合本文所述靶抗原之抗原結合結構域、跨膜結構域及共刺激結構域；及第二CAR，其標靶不同靶抗原(例如在與第一靶抗原相同之癌細胞類型上表現之抗原)且包括抗原結合結構域、跨膜結構域及初級信號傳導結構域。在另一實施例中，CAR表現細胞包含第一CAR，其包括結合本文所述靶抗原之抗原結合結構域、跨膜結構域及初級信號傳導結構域；及第二CAR，其標靶除第一靶抗原(例如在與第一靶抗原相同之癌細胞類型上表現之抗原)之外之抗原且包括針對抗原之抗原結合結構域、跨膜結構域及共刺激信號傳導結構域。
在另一態樣中，本揭示內容提供CAR表現細胞(例如CART細胞)之群體。在一些實施例中，CAR表現細胞群體包含表現不同CAR之細胞之混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞之群體可包括第一細胞，其表現具有針對本文所述癌症相關抗原之抗原結合結構域的CAR；及第二細胞，其表現具有不同抗原結合結構域(例如針對本文所述不同癌症相關抗原之抗原結合結構域，例如針對本文所述癌症相關抗原但不同於由第一細胞表現之CAR之抗原結合結構域結合的癌症相關抗原之抗原結合結構域)的CAR。作為另一實例，CAR表現細胞之群體可包括第一細胞，其表現包括針對本文所述癌症相關抗原之抗原結合結構域的CAR，及第二細胞，其表現包括針對除如本文所述腫瘤相關抗原之外之靶標的抗原結合結構域之CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如第一細胞，其表現包括初級細胞內信號傳導結構域之CAR；及第二細胞，其表現包括次級信號傳導結構域之CAR。
在另一態樣中，本揭示內容之特徵在於細胞群體，其中群體中至少一個細胞表現具有針對本文所述癌症相關抗原之抗原結合結構域的CAR；及第二細胞，其表現另一藥劑(例如增強CAR表現細胞之活性之藥劑)。舉例而言，在一個實施例中，藥劑可係抑制抑制性分子之藥劑。在一些實施例中，抑制性分子(例如PD-1)可降低CAR表現細胞引起免疫效應反應之能力。抑制性分子之實例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I類MHC、II類MHC、GAL9、腺苷及TGF (例如TGFβ)。在一個實施例中，抑制抑制性分子之藥劑包含會與向細胞提供正信號之第二多肽(例如，本文所述之細胞內信號傳導結構域)締合之第一多肽，例如：抑制性分子。在一個實施例中，藥劑包含例如抑制性分子(例如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM (CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFβ)的第一多肽或該等分子中任一者之片段，及作為本文所述細胞內信號傳導結構域(例如，包含共刺激結構域(例如，41BB、CD27、OX40或CD28，例如如本文所述)及/或初級信號傳導結構域(例如，本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。在一個實施例中，藥劑包含PD-1之第一多肽或其片段及本文所述細胞內信號傳導結構域(例如本文所述CD28信號傳導結構域及/或本文所述CD3 ζ信號傳導結構域)之第二多肽。
BCMA CAR
在一態樣中，本文揭示之CAR結合至BCMA。實例性BCMA CAR可包括以引用方式併入本文中之WO2016/014565之表1或16中所揭示之序列。BCMA CAR構築體可包括可選前導序列；可選鉸鏈結構域，例如CD8鉸鏈結構域；跨膜結構域，例如CD8跨膜結構域；細胞內結構域，例如4-1BB細胞內結構域；及功能信號傳導結構域，例如CD3 ζ結構域。在某些實施例中，結構域係鄰接的且在相同閱讀框中以形成單一融合蛋白。在其他實施例中，結構域在分開多肽中，例如如在如本文所述之RCAR分子中。
實例性BCMA CAR分子或其片段之序列揭示於表2及3中。在某些實施例中，全長BCMA CAR分子包括一或多個CDR、VH、VL、scFv或以下之全長序列：如表2及3中所揭示之BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2或C13F12.1，或與其實質上(例如95-99%)一致之序列。
可用於抗BCMA CAR構築體之其他實例性標靶BCMA序列揭示於以下中：WO 2017/021450、WO 2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO 2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO 2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US 2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US 2017/0051252、US 2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO 2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US 2015/0368351、US 2017/0051068、US 2016/0368988及US 2015/0232557，其全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，其他實例性BCMA CAR構築體係使用PCT公開案WO2012/0163805 (其內容全文以引用方式併入本文中)之VH及VL序列生成。
表 2. 實例性抗BCMA scFv結構域及BCMA CAR分子之胺基酸及核酸序列。亦提供每一scFv之胺基酸序列可變重鏈及可變輕鏈序列。
名稱 / 說明 SEQ ID NO: 序列
139109
139109- aa ScFv 結構域 49 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK
139109- nt ScFv 結構域 64 GAAGTGCAATTGGTGGAATCAGGGGGAGGACTTGTGCAGCCTGGAGGATCGCTGAGACTGTCATGTGCCGTGTCCGGCTTTGCCCTGTCCAACCACGGGATGTCCTGGGTCCGCCGCGCGCCTGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCGGGTATTGTGTACAGCGGTAGCACCTACTATGCCGCATCCGTGAAGGGGAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAGGAACACTCTGTACCTCCAAATGAATTCGCTGAGGCCAGAGGACACTGCCATCTACTACTGCTCCGCGCATGGCGGAGAGTCCGACGTCTGGGGACAGGGGACCACCGTGACCGTGTCTAGCGCGTCCGGCGGAGGCGGCAGCGGGGGTCGGGCATCAGGGGGCGGCGGATCGGACATCCAGCTCACCCAGTCCCCGAGCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGAGATCGGGTCACCATCACGTGCCGCGCCAGCCAGTCGATTTCCTCCTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCCCCGAAGCTTCTCATCTACGCCGCCTCGAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCCTCACGGTTCTCCGGCTCCGGTTCCGGTACTGATTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAACCGGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCAGCAGTCGTACTCCACCCCCTACACTTTCGGACAAGGCACCAAGGTCGAAATCAAG
139109- aa VH 79 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS
139109- aa VL 94 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIK
139109- aa 全 CAR 109 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
139109- nt 全 CAR 124 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAGTGCAATTGGTGGAATCAGGGGGAGGACTTGTGCAGCCTGGAGGATCGCTGAGACTGTCATGTGCCGTGTCCGGCTTTGCCCTGTCCAACCACGGGATGTCCTGGGTCCGCCGCGCGCCTGGAAAGGGCCTCGAATGGGTGTCGGGTATTGTGTACAGCGGTAGCACCTACTATGCCGCATCCGTGAAGGGGAGATTCACCATCAGCCGGGACAACTCCAGGAACACTCTGTACCTCCAAATGAATTCGCTGAGGCCAGAGGACACTGCCATCTACTACTGCTCCGCGCATGGCGGAGAGTCCGACGTCTGGGGACAGGGGACCACCGTGACCGTGTCTAGCGCGTCCGGCGGAGGCGGCAGCGGGGGTCGGGCATCAGGGGGCGGCGGATCGGACATCCAGCTCACCCAGTCCCCGAGCTCGCTGTCCGCCTCCGTGGGAGATCGGGTCACCATCACGTGCCGCGCCAGCCAGTCGATTTCCTCCTACCTGAACTGGTACCAACAGAAGCCCGGAAAAGCCCCGAAGCTTCTCATCTACGCCGCCTCGAGCCTGCAGTCAGGAGTGCCCTCACGGTTCTCCGGCTCCGGTTCCGGTACTGATTTCACCCTGACCATTTCCTCCCTGCAACCGGAGGACTTCGCTACTTACTACTGCCAGCAGTCGTACTCCACCCCCTACACTTTCGGACAAGGCACCAAGGTCGAAATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
139103
139103- aa ScFv 結構域 39 QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLGWVSGISRSGENTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSPAHYYGGMDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQYHSSPSWTFGQGTKLEIK
139103- nt ScFv 結構域 54 CAAGTGCAACTCGTGGAATCTGGTGGAGGACTCGTGCAACCCGGAAGATCGCTTAGACTGTCGTGTGCCGCCAGCGGGTTCACTTTCTCGAACTACGCGATGTCCTGGGTCCGCCAGGCACCCGGAAAGGGACTCGGTTGGGTGTCCGGCATTTCCCGGTCCGGCGAAAATACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCAAGGGACAACAGCAAAAACACCCTGTACTTGCAAATGAACTCCCTGCGGGATGAAGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCGCCTGCCCATTACTACGGCGGAATGGACGTCTGGGGACAGGGAACCACTGTGACTGTCAGCAGCGCGTCGGGTGGCGGCGGCTCAGGGGGTCGGGCCTCCGGGGGGGGAGGGTCCGACATCGTGCTGACCCAGTCCCCGGGAACCCTGAGCCTGAGCCCGGGAGAGCGCGCGACCCTGTCATGCCGGGCATCCCAGAGCATTAGCTCCTCCTTTCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCGAGGCTGCTGATCTACGGCGCTAGCAGAAGGGCTACCGGAATCCCAGACCGGTTCTCCGGCTCCGGTTCCGGGACCGATTTCACCCTTACTATCTCGCGCCTGGAACCTGAGGACTCCGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACCACTCATCCCCGTCGTGGACGTTCGGACAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAG
139103- aa VH 69 QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLGWVSGISRSGENTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSPAHYYGGMDVWGQGTTVTVSS
139103- aa VL 84 DIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQYHSSPSWTFGQGTKLEIK
139103- aa 全 CAR 99 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLGWVSGISRSGENTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCARSPAHYYGGMDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYYCQQYHSSPSWTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
139103- nt 全 CAR 114 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAAGTGCAACTCGTGGAATCTGGTGGAGGACTCGTGCAACCCGGAAGATCGCTTAGACTGTCGTGTGCCGCCAGCGGGTTCACTTTCTCGAACTACGCGATGTCCTGGGTCCGCCAGGCACCCGGAAAGGGACTCGGTTGGGTGTCCGGCATTTCCCGGTCCGGCGAAAATACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCAAGGGACAACAGCAAAAACACCCTGTACTTGCAAATGAACTCCCTGCGGGATGAAGATACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGGTCGCCTGCCCATTACTACGGCGGAATGGACGTCTGGGGACAGGGAACCACTGTGACTGTCAGCAGCGCGTCGGGTGGCGGCGGCTCAGGGGGTCGGGCCTCCGGGGGGGGAGGGTCCGACATCGTGCTGACCCAGTCCCCGGGAACCCTGAGCCTGAGCCCGGGAGAGCGCGCGACCCTGTCATGCCGGGCATCCCAGAGCATTAGCTCCTCCTTTCTCGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGACAGGCCCCGAGGCTGCTGATCTACGGCGCTAGCAGAAGGGCTACCGGAATCCCAGACCGGTTCTCCGGCTCCGGTTCCGGGACCGATTTCACCCTTACTATCTCGCGCCTGGAACCTGAGGACTCCGCCGTCTACTACTGCCAGCAGTACCACTCATCCCCGTCGTGGACGTTCGGACAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
139105
139105- aa ScFv 結構域 40 QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCSVHSFLAYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK
139105- nt ScFv 結構域 55 CAAGTGCAACTCGTCGAATCCGGTGGAGGTCTGGTCCAACCTGGTAGAAGCCTGAGACTGTCGTGTGCGGCCAGCGGATTCACCTTTGATGACTATGCTATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCGGGAATTAGCTGGAACTCCGGGTCCATTGGCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCCGCGACAACGCAAAGAACTCCCTGTACTTGCAAATGAACTCGCTCAGGGCTGAGGATACCGCGCTGTACTACTGCTCCGTGCATTCCTTCCTGGCCTACTGGGGACAGGGAACTCTGGTCACCGTGTCGAGCGCCTCCGGCGGCGGGGGCTCGGGTGGACGGGCCTCGGGCGGAGGGGGGTCCGACATCGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCTTGCCCGTGACTCCCGGAGAGCCTGCATCCATCTCCTGCCGGTCATCCCAGTCCCTTCTCCACTCCAACGGATACAACTACCTCGACTGGTACCTCCAGAAGCCGGGACAGAGCCCTCAGCTTCTGATCTACCTGGGGTCAAATAGAGCCTCAGGAGTGCCGGATCGGTTCAGCGGATCTGGTTCGGGAACTGATTTCACTCTGAAGATTTCCCGCGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTACTGTATGCAGGCGCTGCAGACCCCCTATACCTTCGGCCAAGGGACGAAAGTGGAGATCAAG
139105- aa VH 70 QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCSVHSFLAYWGQGTLVTVSS
139105- aa VL 85 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK
139105- aa 全 CAR 100 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCSVHSFLAYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
139105- nt 全 CAR 115 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAAGTGCAACTCGTCGAATCCGGTGGAGGTCTGGTCCAACCTGGTAGAAGCCTGAGACTGTCGTGTGCGGCCAGCGGATTCACCTTTGATGACTATGCTATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCAGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCGGGAATTAGCTGGAACTCCGGGTCCATTGGCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCCGCGACAACGCAAAGAACTCCCTGTACTTGCAAATGAACTCGCTCAGGGCTGAGGATACCGCGCTGTACTACTGCTCCGTGCATTCCTTCCTGGCCTACTGGGGACAGGGAACTCTGGTCACCGTGTCGAGCGCCTCCGGCGGCGGGGGCTCGGGTGGACGGGCCTCGGGCGGAGGGGGGTCCGACATCGTGATGACCCAGACCCCGCTGAGCTTGCCCGTGACTCCCGGAGAGCCTGCATCCATCTCCTGCCGGTCATCCCAGTCCCTTCTCCACTCCAACGGATACAACTACCTCGACTGGTACCTCCAGAAGCCGGGACAGAGCCCTCAGCTTCTGATCTACCTGGGGTCAAATAGAGCCTCAGGAGTGCCGGATCGGTTCAGCGGATCTGGTTCGGGAACTGATTTCACTCTGAAGATTTCCCGCGTGGAAGCCGAGGACGTGGGCGTCTACTACTGTATGCAGGCGCTGCAGACCCCCTATACCTTCGGCCAAGGGACGAAAGTGGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
139111
139111- aa ScFv 結構域 41 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLRNDGKTPLYWYLQKAGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGAYYCMQNIQFPSFGGGTKLEIK
139111- nt ScFv 結構域 56 GAAGTGCAATTGTTGGAATCTGGAGGAGGACTTGTGCAGCCTGGAGGATCACTGAGACTTTCGTGTGCGGTGTCAGGCTTCGCCCTGAGCAACCACGGCATGAGCTGGGTGCGGAGAGCCCCGGGGAAGGGTCTGGAATGGGTGTCCGGGATCGTCTACTCCGGTTCAACTTACTACGCCGCAAGCGTGAAGGGTCGCTTCACCATTTCCCGCGATAACTCCCGGAACACCCTGTACCTCCAAATGAACTCCCTGCGGCCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGTTCCGCGCATGGAGGAGAGTCCGATGTCTGGGGACAGGGCACTACCGTGACCGTGTCGAGCGCCTCGGGGGGAGGAGGCTCCGGCGGTCGCGCCTCCGGGGGGGGTGGCAGCGACATTGTGATGACGCAGACTCCACTCTCGCTGTCCGTGACCCCGGGACAGCCCGCGTCCATCTCGTGCAAGAGCTCCCAGAGCCTGCTGAGGAACGACGGAAAGACTCCTCTGTATTGGTACCTCCAGAAGGCTGGACAGCCCCCGCAACTGCTCATCTACGAAGTGTCAAATCGCTTCTCCGGGGTGCCGGATCGGTTTTCCGGCTCGGGATCGGGCACCGACTTCACCCTGAAAATCTCCAGGGTCGAGGCCGAGGACGTGGGAGCCTACTACTGCATGCAAAACATCCAGTTCCCTTCCTTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATTAAG
139111- aa VH 71 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS
139111- aa VL 86 DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLRNDGKTPLYWYLQKAGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGAYYCMQNIQFPSFGGGTKLEIK
139111- aa 全 CAR 101 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLLRNDGKTPLYWYLQKAGQPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGAYYCMQNIQFPSFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
139111- nt 全 CAR 116 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAGTGCAATTGTTGGAATCTGGAGGAGGACTTGTGCAGCCTGGAGGATCACTGAGACTTTCGTGTGCGGTGTCAGGCTTCGCCCTGAGCAACCACGGCATGAGCTGGGTGCGGAGAGCCCCGGGGAAGGGTCTGGAATGGGTGTCCGGGATCGTCTACTCCGGTTCAACTTACTACGCCGCAAGCGTGAAGGGTCGCTTCACCATTTCCCGCGATAACTCCCGGAACACCCTGTACCTCCAAATGAACTCCCTGCGGCCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGTTCCGCGCATGGAGGAGAGTCCGATGTCTGGGGACAGGGCACTACCGTGACCGTGTCGAGCGCCTCGGGGGGAGGAGGCTCCGGCGGTCGCGCCTCCGGGGGGGGTGGCAGCGACATTGTGATGACGCAGACTCCACTCTCGCTGTCCGTGACCCCGGGACAGCCCGCGTCCATCTCGTGCAAGAGCTCCCAGAGCCTGCTGAGGAACGACGGAAAGACTCCTCTGTATTGGTACCTCCAGAAGGCTGGACAGCCCCCGCAACTGCTCATCTACGAAGTGTCAAATCGCTTCTCCGGGGTGCCGGATCGGTTTTCCGGCTCGGGATCGGGCACCGACTTCACCCTGAAAATCTCCAGGGTCGAGGCCGAGGACGTGGGAGCCTACTACTGCATGCAAAACATCCAGTTCCCTTCCTTCGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATTAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
139100
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139100- aa VL 87 DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLNWYLQKPGQSPQLLIYLGSKRASGVPDRFSGSGSGTDFTLHITRVGAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK
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139101
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139101- aa VL 88 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASTLASGVPARFSGSGSGTHFTLTINSLQSEDSATYYCQQSYKRASFGQGTKVEIK
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139102
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139104
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139104- aa VL 90 EIVLTQSPATLSVSPGESATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYGSSLTFGGGTKVEIK
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139106
139106- aa ScFv 結構域 46 EVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSKLAWYQQKPGQAPRLLMYGASIRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSSWTFGQGTKVEIK
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139106- aa VH 76 EVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS
139106- aa VL 91 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSKLAWYQQKPGQAPRLLMYGASIRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSSWTFGQGTKVEIK
139106- aa 全 CAR 106 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSKLAWYQQKPGQAPRLLMYGASIRATGIPDRFSGSGSGTEFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYGSSSWTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
139106- nt 全 CAR 121 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAGTGCAATTGGTGGAAACTGGAGGAGGACTTGTGCAACCTGGAGGATCATTGAGACTGAGCTGCGCAGTGTCGGGATTCGCCCTGAGCAACCATGGAATGTCCTGGGTCAGAAGGGCCCCTGGAAAAGGCCTCGAATGGGTGTCAGGGATCGTGTACTCCGGTTCCACTTACTACGCCGCCTCCGTGAAGGGGCGCTTCACTATCTCACGGGATAACTCCCGCAATACCCTGTACCTCCAAATGAACAGCCTGCGGCCGGAGGATACCGCCATCTACTACTGTTCCGCCCACGGTGGAGAGTCTGACGTCTGGGGCCAGGGAACTACCGTGACCGTGTCCTCCGCGTCCGGCGGTGGAGGGAGCGGCGGCCGCGCCAGCGGCGGCGGAGGCTCCGAGATCGTGATGACCCAGAGCCCCGCTACTCTGTCGGTGTCGCCCGGAGAAAGGGCGACCCTGTCCTGCCGGGCGTCGCAGTCCGTGAGCAGCAAGCTGGCTTGGTACCAGCAGAAGCCGGGCCAGGCACCACGCCTGCTTATGTACGGTGCCTCCATTCGGGCCACCGGAATCCCGGACCGGTTCTCGGGGTCGGGGTCCGGTACCGAGTTCACACTGACCATTTCCTCGCTCGAGCCCGAGGACTTTGCCGTCTATTACTGCCAGCAGTACGGCTCCTCCTCATGGACGTTCGGCCAGGGGACCAAGGTCGAAATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
139107
139107- aa ScFv 結構域 47 EVQLVETGGGVVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSTNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGGGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPWTFGQGTKVEIK
139107- nt ScFv 結構域 62 GAAGTGCAATTGGTGGAGACTGGAGGAGGAGTGGTGCAACCTGGAGGAAGCCTGAGACTGTCATGCGCGGTGTCGGGCTTCGCCCTCTCCAACCACGGAATGTCCTGGGTCCGCCGGGCCCCTGGGAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTACTCGGGTTCCACCTACTACGCGGCCTCAGTGAAGGGCCGGTTTACTATTAGCCGCGACAACTCCAGAAACACACTGTACCTCCAAATGAACTCGCTGCGGCCGGAAGATACCGCTATCTACTACTGCTCCGCCCATGGGGGAGAGTCGGACGTCTGGGGACAGGGCACCACTGTCACTGTGTCCAGCGCTTCCGGCGGTGGTGGAAGCGGGGGACGGGCCTCAGGAGGCGGTGGCAGCGAGATTGTGCTGACCCAGTCCCCCGGGACCCTGAGCCTGTCCCCGGGAGAAAGGGCCACCCTCTCCTGTCGGGCATCCCAGTCCGTGGGGTCTACTAACCTTGCATGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGCCTGCTGATCTACGACGCGTCCAATAGAGCCACCGGCATCCCGGATCGCTTCAGCGGAGGCGGATCGGGCACCGACTTCACCCTCACCATTTCAAGGCTGGAACCGGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTATGGTTCGTCCCCACCCTGGACGTTCGGCCAGGGGACTAAGGTCGAGATCAAG
139107- aa VH 77 EVQLVETGGGVVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS
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139107- aa 全 CAR 107 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVETGGGVVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVGSTNLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPDRFSGGGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPPWTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
139107- nt 全 CAR 122 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAGTGCAATTGGTGGAGACTGGAGGAGGAGTGGTGCAACCTGGAGGAAGCCTGAGACTGTCATGCGCGGTGTCGGGCTTCGCCCTCTCCAACCACGGAATGTCCTGGGTCCGCCGGGCCCCTGGGAAAGGACTTGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTACTCGGGTTCCACCTACTACGCGGCCTCAGTGAAGGGCCGGTTTACTATTAGCCGCGACAACTCCAGAAACACACTGTACCTCCAAATGAACTCGCTGCGGCCGGAAGATACCGCTATCTACTACTGCTCCGCCCATGGGGGAGAGTCGGACGTCTGGGGACAGGGCACCACTGTCACTGTGTCCAGCGCTTCCGGCGGTGGTGGAAGCGGGGGACGGGCCTCAGGAGGCGGTGGCAGCGAGATTGTGCTGACCCAGTCCCCCGGGACCCTGAGCCTGTCCCCGGGAGAAAGGGCCACCCTCTCCTGTCGGGCATCCCAGTCCGTGGGGTCTACTAACCTTGCATGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGCCTGCTGATCTACGACGCGTCCAATAGAGCCACCGGCATCCCGGATCGCTTCAGCGGAGGCGGATCGGGCACCGACTTCACCCTCACCATTTCAAGGCTGGAACCGGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTATGGTTCGTCCCCACCCTGGACGTTCGGCCAGGGGACTAAGGTCGAGATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
139108
139108- aa ScFv 結構域 48 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESGDGMDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTLAFGQGTKVDIK
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139108- aa VH 78 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARESGDGMDVWGQGTTVTVSS
139108- aa VL 93 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTLAFGQGTKVDIK
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139110
139110- aa ScFv 結構域 50 QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGNTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTMVREDYWGQGTLVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIVLTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSESLVHNSGKTYLNWFHQRPGQSPRRLIYEVSNRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPGTFGQGTKLEIK
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139110- aa VL 95 DIVLTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSESLVHNSGKTYLNWFHQRPGQSPRRLIYEVSNRDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPGTFGQGTKLEIK
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139112
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139112- nt ScFv 結構域 66 CAAGTGCAACTCGTGGAATCTGGTGGAGGACTCGTGCAACCCGGTGGAAGCCTTAGGCTGTCGTGCGCCGTCAGCGGGTTTGCTCTGAGCAACCATGGAATGTCCTGGGTCCGCCGGGCACCGGGAAAAGGGCTGGAATGGGTGTCCGGCATCGTGTACAGCGGGTCAACCTATTACGCCGCGTCCGTGAAGGGCAGATTCACTATCTCAAGAGACAACAGCCGGAACACCCTGTACTTGCAAATGAATTCCCTGCGCCCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCTCCGCCCACGGAGGAGAGTCGGACGTGTGGGGCCAGGGAACGACTGTGACTGTGTCCAGCGCATCAGGAGGGGGTGGTTCGGGCGGCCGGGCCTCGGGGGGAGGAGGTTCCGACATTCGGCTGACCCAGTCCCCGTCCCCACTGTCGGCCTCCGTCGGCGACCGCGTGACCATCACTTGTCAGGCGTCCGAGGACATTAACAAGTTCCTGAACTGGTACCACCAGACCCCTGGAAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGATGCCTCGACCCTTCAAACTGGAGTGCCTAGCCGGTTCTCCGGGTCCGGCTCCGGCACTGATTTCACTCTGACCATCAACTCATTGCAGCCGGAAGATATCGGGACCTACTATTGCCAGCAGTACGAATCCCTCCCGCTCACATTCGGCGGGGGAACCAAGGTCGAGATTAAG
139112- aa VH 81 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS
139112- aa VL 96 DIRLTQSPSPLSASVGDRVTITCQASEDINKFLNWYHQTPGKAPKLLIYDASTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDIGTYYCQQYESLPLTFGGGTKVEIK
139112- aa 全 CAR 111 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSDIRLTQSPSPLSASVGDRVTITCQASEDINKFLNWYHQTPGKAPKLLIYDASTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDIGTYYCQQYESLPLTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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139113
139113- aa ScFv 結構域 52 EVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSETTLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPGQGPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYNDWLPVTFGQGTKVEIK
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139113- aa VH 82 EVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS
139113- aa VL 97 ETTLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPGQGPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYNDWLPVTFGQGTKVEIK
139113- aa 全 CAR 112 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSETTLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPGQGPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFAVYYCQQYNDWLPVTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
139113- nt 全 CAR 127 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAGTGCAATTGGTGGAAACTGGAGGAGGACTTGTGCAACCTGGAGGATCATTGCGGCTCTCATGCGCTGTCTCCGGCTTCGCCCTGTCAAATCACGGGATGTCGTGGGTCAGACGGGCCCCGGGAAAGGGTCTGGAATGGGTGTCGGGGATTGTGTACAGCGGCTCCACCTACTACGCCGCTTCGGTCAAGGGCCGCTTCACTATTTCACGGGACAACAGCCGCAACACCCTCTATCTGCAAATGAACTCTCTCCGCCCGGAGGATACCGCCATCTACTACTGCTCCGCACACGGCGGCGAATCCGACGTGTGGGGACAGGGAACCACTGTCACCGTGTCGTCCGCATCCGGTGGCGGAGGATCGGGTGGCCGGGCCTCCGGGGGCGGCGGCAGCGAGACTACCCTGACCCAGTCCCCTGCCACTCTGTCCGTGAGCCCGGGAGAGAGAGCCACCCTTAGCTGCCGGGCCAGCCAGAGCGTGGGCTCCAACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGGTCCCAGGCTGCTGATCTACGGAGCCTCCACTCGCGCGACCGGCATCCCCGCGAGGTTCTCCGGGTCGGGTTCCGGGACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTCCAACCGGAGGACTTCGCGGTGTACTACTGTCAGCAGTACAACGATTGGCTGCCCGTGACATTTGGACAGGGGACGAAGGTGGAAATCAAAACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
139114
139114- aa ScFv 結構域 53 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSIGSSSLAWYQQKPGQAPRLLMYGASSRASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYAGSPPFTFGQGTKVEIK
139114- nt ScFv 結構域 68 GAAGTGCAATTGGTGGAATCTGGTGGAGGACTTGTGCAACCTGGAGGATCACTGAGACTGTCATGCGCGGTGTCCGGTTTTGCCCTGAGCAATCATGGGATGTCGTGGGTCCGGCGCGCCCCCGGAAAGGGTCTGGAATGGGTGTCGGGTATCGTCTACTCCGGGAGCACTTACTACGCCGCGAGCGTGAAGGGCCGCTTCACCATTTCCCGCGATAACTCCCGCAACACCCTGTACTTGCAAATGAACTCGCTCCGGCCTGAGGACACTGCCATCTACTACTGCTCCGCACACGGAGGAGAATCCGACGTGTGGGGCCAGGGAACTACCGTGACCGTCAGCAGCGCCTCCGGCGGCGGGGGCTCAGGCGGACGGGCTAGCGGCGGCGGTGGCTCCGAGATCGTGCTGACCCAGTCGCCTGGCACTCTCTCGCTGAGCCCCGGGGAAAGGGCAACCCTGTCCTGTCGGGCCAGCCAGTCCATTGGATCATCCTCCCTCGCCTGGTATCAGCAGAAACCGGGACAGGCTCCGCGGCTGCTTATGTATGGGGCCAGCTCAAGAGCCTCCGGCATTCCCGACCGGTTCTCCGGGTCCGGTTCCGGCACCGATTTCACCCTGACTATCTCGAGGCTGGAGCCAGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGCGGGGTCCCCGCCGTTCACGTTCGGACAGGGAACCAAGGTCGAGATCAAG
139114- aa VH 83 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSS
139114- aa VL 98 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSIGSSSLAWYQQKPGQAPRLLMYGASSRASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYAGSPPFTFGQGTKVEIK
139114- aa 全 CAR 113 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFALSNHGMSWVRRAPGKGLEWVSGIVYSGSTYYAASVKGRFTISRDNSRNTLYLQMNSLRPEDTAIYYCSAHGGESDVWGQGTTVTVSSASGGGGSGGRASGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSIGSSSLAWYQQKPGQAPRLLMYGASSRASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYAGSPPFTFGQGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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149362
149362-aa ScFv 結構域 129 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSYYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSAYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARHWQEWPDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSETTLTQSPAFMSATPGDKVIISCKASQDIDDAMNWYQQKPGEAPLFIIQSATSPVPGIPPRFSGSGFGTDFSLTINNIESEDAAYYFCLQHDNFPLTFGQGTKLEIK
149362-nt ScFv 結構域 150 CAAGTGCAGCTTCAGGAAAGCGGACCGGGCCTGGTCAAGCCATCCGAAACTCTCTCCCTGACTTGCACTGTGTCTGGCGGTTCCATCTCATCGTCGTACTACTACTGGGGCTGGATTAGGCAGCCGCCCGGAAAGGGACTGGAGTGGATCGGAAGCATCTACTATTCCGGCTCGGCGTACTACAACCCTAGCCTCAAGTCGAGAGTGACCATCTCCGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTTCCCTGCGCCTGAGCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTCGGCATTGGCAGGAATGGCCCGATGCCTTCGACATTTGGGGCCAGGGCACTATGGTCACTGTGTCATCCGGGGGTGGAGGCAGCGGGGGAGGAGGGTCCGGGGGGGGAGGTTCAGAGACAACCTTGACCCAGTCACCCGCATTCATGTCCGCCACTCCGGGAGACAAGGTCATCATCTCGTGCAAAGCGTCCCAGGATATCGACGATGCCATGAATTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCGAAGCGCCGCTGTTCATTATCCAATCCGCAACCTCGCCCGTGCCTGGAATCCCACCGCGGTTCAGCGGCAGCGGTTTCGGAACCGACTTTTCCCTGACCATTAACAACATTGAGTCCGAGGACGCCGCCTACTACTTCTGCCTGCAACACGACAACTTCCCTCTCACGTTCGGCCAGGGAACCAAGCTGGAAATCAAG
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149362-aa VL 192 ETTLTQSPAFMSATPGDKVIISCKASQDIDDAMNWYQQKPGEAPLFIIQSATSPVPGIPPRFSGSGFGTDFSLTINNIESEDAAYYFCLQHDNFPLTFGQGTKLEIK
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149362-nt 全 CAR 234 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCCAAGTGCAGCTTCAGGAAAGCGGACCGGGCCTGGTCAAGCCATCCGAAACTCTCTCCCTGACTTGCACTGTGTCTGGCGGTTCCATCTCATCGTCGTACTACTACTGGGGCTGGATTAGGCAGCCGCCCGGAAAGGGACTGGAGTGGATCGGAAGCATCTACTATTCCGGCTCGGCGTACTACAACCCTAGCCTCAAGTCGAGAGTGACCATCTCCGTGGATACCTCCAAGAACCAGTTTTCCCTGCGCCTGAGCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTACTACTGTGCTCGGCATTGGCAGGAATGGCCCGATGCCTTCGACATTTGGGGCCAGGGCACTATGGTCACTGTGTCATCCGGGGGTGGAGGCAGCGGGGGAGGAGGGTCCGGGGGGGGAGGTTCAGAGACAACCTTGACCCAGTCACCCGCATTCATGTCCGCCACTCCGGGAGACAAGGTCATCATCTCGTGCAAAGCGTCCCAGGATATCGACGATGCCATGAATTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCGAAGCGCCGCTGTTCATTATCCAATCCGCAACCTCGCCCGTGCCTGGAATCCCACCGCGGTTCAGCGGCAGCGGTTTCGGAACCGACTTTTCCCTGACCATTAACAACATTGAGTCCGAGGACGCCGCCTACTACTTCTGCCTGCAACACGACAACTTCCCTCTCACGTTCGGCCAGGGAACCAAGCTGGAAATCAAGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
149363
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149363-aa VH 172 QVNLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLRTSGMCVSWIRQPPGKALEWLARIDWDEDKFYSTSLKTRLTISKDTSDNQVVLRMTNMDPADTATYYCARSGAGGTSATAFDIWGPGTMVTVSS
149363-aa VL 193 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYNNLAWFQLKPGSAPRSLMYAANKSQSGVPSRFSGSASGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYYRFPYSFGQGTKLEIK
149363-aa 全 CAR 214 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVNLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLRTSGMCVSWIRQPPGKALEWLARIDWDEDKFYSTSLKTRLTISKDTSDNQVVLRMTNMDPADTATYYCARSGAGGTSATAFDIWGPGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIYNNLAWFQLKPGSAPRSLMYAANKSQSGVPSRFSGSASGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHYYRFPYSFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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149364
149364-aa ScFv 結構域 131 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTIAAVYAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPLSLPVTPEEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK
149364-nt ScFv 結構域 152 GAAGTGCAGCTTGTCGAATCCGGGGGGGGACTGGTCAAGCCGGGCGGATCACTGAGACTGTCCTGCGCCGCGAGCGGCTTCACGTTCTCCTCCTACTCCATGAACTGGGTCCGCCAAGCCCCCGGGAAGGGACTGGAATGGGTGTCCTCTATCTCCTCGTCGTCGTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGAAGATTCACCATTTCCCGCGACAACGCAAAGAACTCACTGTACTTGCAAATGAACTCACTCCGGGCCGAAGATACTGCTGTGTACTATTGCGCCAAGACTATTGCCGCCGTCTACGCTTTCGACATCTGGGGCCAGGGAACCACCGTGACTGTGTCGTCCGGTGGTGGTGGCTCGGGCGGAGGAGGAAGCGGCGGCGGGGGGTCCGAGATTGTGCTGACCCAGTCGCCACTGAGCCTCCCTGTGACCCCCGAGGAACCCGCCAGCATCAGCTGCCGGTCCAGCCAGTCCCTGCTCCACTCCAACGGATACAATTACCTCGATTGGTACCTTCAGAAGCCTGGACAAAGCCCGCAGCTGCTCATCTACTTGGGATCAAACCGCGCGTCAGGAGTGCCTGACCGGTTCTCCGGCTCGGGCAGCGGTACCGATTTCACCCTGAAAATCTCCAGGGTGGAGGCAGAGGACGTGGGAGTGTATTACTGTATGCAGGCGCTGCAGACTCCGTACACATTTGGGCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAG
149364-aa VH 173 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTIAAVYAFDIWGQGTTVTVSS
149364-aa VL 194 EIVLTQSPLSLPVTPEEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIK
149364-aa 全 CAR 215 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTIAAVYAFDIWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPLSLPVTPEEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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149365
149365-aa ScFv 結構域 132 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQSPSVSAAPGYTATISCGGNNIGTKSVHWYQQKPGQAPLLVIRDDSVRPSKIPGRFSGSNSGNMATLTISGVQAGDEADFYCQVWDSDSEHVVFGGGTKLTVL
149365-nt ScFv 結構域 153 GAAGTCCAGCTCGTGGAGTCCGGCGGAGGCCTTGTGAAGCCTGGAGGTTCGCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCGACTACTACATGTCCTGGATCAGACAGGCCCCGGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTACATCTCGTCATCGGGCAGCACTATCTACTACGCGGACTCAGTGAAGGGGCGGTTCACCATTTCCCGGGATAACGCGAAGAACTCGCTGTATCTGCAAATGAACTCACTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGATCTCCGCGGGGCATTTGACATCTGGGGACAGGGAACCATGGTCACAGTGTCCAGCGGAGGGGGAGGATCGGGTGGCGGAGGTTCCGGGGGTGGAGGCTCCTCCTACGTGCTGACTCAGAGCCCAAGCGTCAGCGCTGCGCCCGGTTACACGGCAACCATCTCCTGTGGCGGAAACAACATTGGGACCAAGTCTGTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCGGGCCAAGCTCCCCTGTTGGTGATCCGCGATGACTCCGTGCGGCCTAGCAAAATTCCGGGACGGTTCTCCGGCTCCAACAGCGGCAATATGGCCACTCTCACCATCTCGGGAGTGCAGGCCGGAGATGAAGCCGACTTCTACTGCCAAGTCTGGGACTCAGACTCCGAGCATGTGGTGTTCGGGGGCGGAACCAAGCTGACTGTGCTC
149365-aa VH 174 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRGAFDIWGQGTMVTVSS
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149365-aa 全 CAR 216 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLRGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQSPSVSAAPGYTATISCGGNNIGTKSVHWYQQKPGQAPLLVIRDDSVRPSKIPGRFSGSNSGNMATLTISGVQAGDEADFYCQVWDSDSEHVVFGGGTKLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
149365-nt 全 CAR 237 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAGTCCAGCTCGTGGAGTCCGGCGGAGGCCTTGTGAAGCCTGGAGGTTCGCTGAGACTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCGACTACTACATGTCCTGGATCAGACAGGCCCCGGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTACATCTCGTCATCGGGCAGCACTATCTACTACGCGGACTCAGTGAAGGGGCGGTTCACCATTTCCCGGGATAACGCGAAGAACTCGCTGTATCTGCAAATGAACTCACTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCGATCTCCGCGGGGCATTTGACATCTGGGGACAGGGAACCATGGTCACAGTGTCCAGCGGAGGGGGAGGATCGGGTGGCGGAGGTTCCGGGGGTGGAGGCTCCTCCTACGTGCTGACTCAGAGCCCAAGCGTCAGCGCTGCGCCCGGTTACACGGCAACCATCTCCTGTGGCGGAAACAACATTGGGACCAAGTCTGTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCGGGCCAAGCTCCCCTGTTGGTGATCCGCGATGACTCCGTGCGGCCTAGCAAAATTCCGGGACGGTTCTCCGGCTCCAACAGCGGCAATATGGCCACTCTCACCATCTCGGGAGTGCAGGCCGGAGATGAAGCCGACTTCTACTGCCAAGTCTGGGACTCAGACTCCGAGCATGTGGTGTTCGGGGGCGGAACCAAGCTGACTGTGCTCACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
149366
149366-aa ScFv 結構域 133 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKPSGYTVTSHYIHWVRRAPGQGLEWMGMINPSGGVTAYSQTLQGRVTMTSDTSSSTVYMELSSLRSEDTAMYYCAREGSGSGWYFDFWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDGLSKKYVSWYQQKAGQSPVVLISRDKERPSGIPDRFSGSNSADTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDDTTVVFGGGTKLTVL
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149367
149367-aa ScFv 結構域 134 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAGIAARLRGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVIITCRASQGIRNWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGADFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPFTFGPGTKVDIK
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149367-aa VL 197 DIVMTQSPSSVSASVGDRVIITCRASQGIRNWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGADFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPFTFGPGTKVDIK
149367-aa 全 CAR 218 MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAGIAARLRGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVIITCRASQGIRNWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGADFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPFTFGPGTKVDIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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149368
149368-aa ScFv 結構域 135 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGYQLLRWDVGLLRSAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVLYGKNNRPSGVPDRFSGSRSGTTASLTITGAQAEDEADYYCSSRDSSGDHLRVFGTGTKVTVL
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149369
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149369-aa VH 178 EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYSFYAISLKSRIIINPDTSKNQFSLQLKSVTPEDTAVYYCARSSPEGLFLYWFDPWGQGTLVTVSS
149369-aa VL 199 SSELTQDPAVSVALGQTIRITCQGDSLGNYYATWYQQKPGQAPVLVIYGTNNRPSGIPDRFSASSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGHHLLFGTGTKVTVL
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149369-nt 全 CAR 241 ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAAGTGCAGCTCCAACAGTCAGGACCGGGGCTCGTGAAGCCATCCCAGACCCTGTCCCTGACTTGTGCCATCTCGGGAGATAGCGTGTCATCGAACTCCGCCGCCTGGAACTGGATTCGGCAGAGCCCGTCCCGCGGACTGGAGTGGCTTGGAAGGACCTACTACCGGTCCAAGTGGTACTCTTTCTACGCGATCTCGCTGAAGTCCCGCATTATCATTAACCCTGATACCTCCAAGAATCAGTTCTCCCTCCAACTGAAATCCGTCACCCCCGAGGACACAGCAGTGTATTACTGCGCACGGAGCAGCCCCGAAGGACTGTTCCTGTATTGGTTTGACCCCTGGGGCCAGGGGACTCTTGTGACCGTGTCGAGCGGCGGAGATGGGTCCGGTGGCGGTGGTTCGGGGGGCGGCGGATCATCATCCGAACTGACCCAGGACCCGGCTGTGTCCGTGGCGCTGGGACAAACCATCCGCATTACGTGCCAGGGAGACTCCCTGGGCAACTACTACGCCACTTGGTACCAGCAGAAGCCGGGCCAAGCCCCTGTGTTGGTCATCTACGGGACCAACAACAGACCTTCCGGCATCCCCGACCGGTTCAGCGCTTCGTCCTCCGGCAACACTGCCAGCCTGACCATCACTGGAGCGCAGGCCGAAGATGAGGCCGACTACTACTGCAACAGCAGAGACTCCTCGGGTCATCACCTCTTGTTCGGAACTGGAACCAAGGTCACCGTGCTGACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
BCMA_EBB-C1978-A4
BCMA_EBB-C1978-A4 - aa ScFv 結構域 137 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVEGSGSLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSAYLAWYQQKPGQPPRLLISGASTRATGIPDRFGGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSFNGSSLFTFGQGTRLEIK
BCMA_EBB-C1978-A4 - nt ScFv 結構域 158 GAAGTGCAGCTCGTGGAGTCAGGAGGCGGCCTGGTCCAGCCGGGAGGGTCCCTTAGACTGTCATGCGCCGCAAGCGGATTCACTTTCTCCTCCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCCCCCGGAAAGGGACTGGAATGGGTGTCCGCCATCTCGGGGTCTGGAGGCTCAACTTACTACGCTGACTCCGTGAAGGGACGGTTCACCATTAGCCGCGACAACTCCAAGAACACCCTCTACCTCCAAATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTCTACTACTGCGCCAAAGTGGAAGGTTCAGGATCGCTGGACTACTGGGGACAGGGTACTCTCGTGACCGTGTCATCGGGCGGAGGAGGTTCCGGCGGTGGCGGCTCCGGCGGCGGAGGGTCGGAGATCGTGATGACCCAGAGCCCTGGTACTCTGAGCCTTTCGCCGGGAGAAAGGGCCACCCTGTCCTGCCGCGCTTCCCAATCCGTGTCCTCCGCGTACTTGGCGTGGTACCAGCAGAAGCCGGGACAGCCCCCTCGGCTGCTGATCAGCGGGGCCAGCACCCGGGCAACCGGAATCCCAGACAGATTCGGGGGTTCCGGCAGCGGCACAGATTTCACCCTGACTATTTCGAGGTTGGAGCCCGAGGACTTTGCGGTGTATTACTGTCAGCACTACGGGTCGTCCTTTAATGGCTCCAGCCTGTTCACGTTCGGACAGGGGACCCGCCTGGAAATCAAG
BCMA_EBB-C1978-A4 - aa VH 179 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVEGSGSLDYWGQGTLVTVSS
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BCMA_EBB-C1978-A4 - aa 全 CART 221 MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVEGSGSLDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSAYLAWYQQKPGQPPRLLISGASTRATGIPDRFGGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSFNGSSLFTFGQGTRLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
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BCMA_EBB-C1978-G1
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BCMA_EBB-C1979-C1
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BCMA_EBB-C1978-C7
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BCMA_EBB-C1978-D10
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BCMA_EBB-C1979-C12
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BCMA_EBB-C1980-G4
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BCMA_EBB-C1981-C3
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BCMA_EBB-C1978-G4
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表 3. 其他實例性BCMA CAR序列
RNA 轉染
本文揭示用於產生活體外轉錄RNA CAR之方法。本發明亦包括可直接轉染至細胞中之CAR編碼RNA構築體。產生用於轉染中之mRNA之方法可涉及使用特殊設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，然後添加聚A，以產生長度通常為50-2000個鹼基之含有以下各項之構築體(SEQ ID NO:276)：3'及5'非翻譯序列(「UTR」)、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾。由此產生之RNA可有效地轉染不同種類之細胞。在一態樣中，模板包括針對CAR之序列。
在一態樣中，抗BCMA CAR係由信使RNA (mRNA)編碼。在一態樣中，將編碼抗BCMA CAR之mRNA引入免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)中，用於產生CAR表現細胞(例如，CART細胞或CAR表現NK細胞)。
在一個實施例中，活體外轉錄之RNA CAR可以瞬時轉染形式引入細胞。RNA係利用聚合酶鏈式反應(PCR)產生之模板藉由活體外轉錄產生。來自任何來源之所關注DNA可利用適宜引子及RNA聚合酶藉由PCR直接轉化至模板中用於活體外mRNA合成。DNA之來源可係例如基因組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或DNA之任何其他適宜來源。用於活體外轉錄之期望模板係本發明CAR。舉例而言，用於RNA CAR之模板包含包括抗腫瘤抗體之單鏈可變結構域之細胞外區；鉸鏈區、跨膜結構域(例如，CD8a之跨膜結構域)；及包括細胞內信號傳導結構域(例如，包含CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域)之細胞質區。
在一個實施例中，欲用於PCR之DNA含有開放閱讀框。DNA可來自生物體基因組之天然DNA序列。在一個實施例中，核酸可包括5'及/或3'非翻譯區(UTR)中之一些或所有。核酸可包括外顯子及內含子。在一個實施例中，欲用於PCR之DNA係人類核酸序列。在另一實施例中，欲用於PCR之DNA係包括5'及3' UTR之人類核酸序列。或者，DNA可係通常不在天然生物體中表現之人工DNA序列。實例性人工DNA序列係含有基因之連接在一起形成編碼融合蛋白之開放閱讀框之部分者。DNA之連接在一起之部分可來自單一生物體或一種以上生物體。
使用PCR來產生用於活體外轉錄用於轉染之mRNA之模板。實施PCR之方法為業內所熟知。用於PCR中之引子經設計以具有實質上與欲用作PCR模板之DNA之區域互補的區。如本文所使用，「實質上互補」係指其中引子序列中之大部分或全部鹼基互補或一或多個鹼基不互補或錯配之核苷酸序列。實質上互補之序列能夠在用於PCR之退火條件下退火或與預期DNA靶雜交。引子可經設計以實質上與DNA模板之任一部分互補。舉例而言，引子可經設計以擴增核酸之通常在細胞中轉錄之部分(開放閱讀框)，包括5'及3' UTR。引子亦可經設計以擴增核酸之編碼所關注具體結構域之部分。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區，包括5'及3' UTR之全部或部分。可用於PCR之引子可藉由業內所熟知之合成方法來產生。「前置引子」係在欲擴增DNA序列上游之含有實質上與DNA模板上核苷酸互補之核苷酸區域的引子。在本文中使用「上游」係指欲擴增之DNA序列相對於編碼鏈之位置5。「後置引子」係在欲擴增之DNA序列下游之含有實質上與雙鏈DNA模板互補之核苷酸區域之引子。在本文中使用「下游」係指欲擴增之DNA序列相對於編碼鏈之位置3'。
可在本文所揭示之方法中使用可用於PCR之任何DNA聚合酶。試劑及聚合酶可自多種來源購得。
亦可使用具有促進穩定性及/或翻譯效率能力之化學結構。RNA較佳具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5' UTR之長度介於1個與3000個核苷酸之間。欲添加至編碼區中之5'及3' UTR序列之長度可藉由不同方法來改變，該等方法包括(但不限於)設計黏著至UTR之不同區域之針對PCR之引子。利用此方式，熟習此項技術者可改變在轉錄RNA轉染後達成最佳翻譯效率所需之5'及3' UTR長度。
5'及3' UTR可係所關注核酸之天然內源性5'及3' UTR。或者，可藉由將UTR序列納入前置及後置引子中或藉由模板之任何其他修飾來添加不為所關注核酸內源之UTR序列。可使用不為所關注核酸內源之UTR序列來改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知3' UTR序列中富含AU之元件可降低mRNA之穩定性。因此，可基於業內熟知UTR之性質來選擇或設計3' UTR以增加轉錄RNA之穩定性。
在一個實施例中，5' UTR可含有內源核酸之Kozak序列。或者，當藉由如上文所述之PCR添加不為所關注核酸內源之5' UTR時，可藉由添加5' UTR序列重新設計共有Kozak序列。Kozak序列可增加一些RNA轉錄本之翻譯效率，但似乎並不為所有RNA能夠有效翻譯所必需。業內已知對許多mRNA之Kozak序列之要求。在其他實施例中，5' UTR可係RNA基因組在細胞中穩定之RNA病毒之5'UTR。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR中以阻礙外切酶降解mRNA。
為了能夠在不需要基因選殖的情況下自DNA模板合成RNA，應將轉錄之啟動子連接至欲轉錄序列之DNA模板上游。當將用作RNA聚合酶啟動子之序列添加至前置引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子被納入欲轉錄開放閱讀框之PCR產物上游中。在一較佳實施例中，啟動子係T7聚合酶啟動子，如本文在別處所述。其他有用啟動子包括(但不限於) T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子之共有核苷酸序列為業內已知。
在較佳實施例中，mRNA在5'端及3'聚(A)尾上皆具有決定細胞中之核糖體結合、mRNA翻譯起始及穩定性之帽。在環形DNA模板(例如質體DNA)上，RNA聚合酶產生不適於在真核細胞中表現之長多聯產物。在3' UTR之末端線性化之質體DNA之轉錄產生正常大小之mRNA，該mRNA即使在轉錄後經多腺苷酸化仍在真核轉染中無效。
在直鏈DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄本之3'末端延伸超出模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf，Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva及Berzal-Herranz，Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)。
將聚A/T段整合至DNA模板中之習用方法係分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可使質體不穩定，此係自細菌細胞獲得之質體DNA模板通常經缺失及其他畸變高度污染之原因。此使得選殖程序不僅費力且耗時，且通常使其不可靠。此係在不選殖情況下構築具有聚A/T 3'段之DNA模板之方法高度合意之原因。
轉錄DNA模板之聚A/T區段可藉由以下方式來產生：在PCR期間藉由利用含有聚T尾(例如100T尾(SEQ ID NO: 277))之後置引子(大小可為50-5000 T (SEQ ID NO: 278))，或在PCR後藉助任何其他方法(包括(但不限於) DNA連接或活體外重組)。聚(A)尾亦為RNA提供穩定性且減少其降解。通常，聚(A)尾之長度與轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施例中，聚(A)尾介於100個與5000個腺苷之間(SEQ ID NO: 279)。
RNA之聚(A)尾可在活體外轉錄後利用聚(A)聚合酶(例如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))進一步延伸。在一個實施例中，將聚(A)尾之長度自100個核苷酸增加至介於300個與400個核苷酸之間(SEQ ID NO: 280)使得RNA翻譯效率增加約兩倍。另外，不同化學基團至3'端之連接可增加mRNA穩定性。該連接可含有經修飾/人工核苷酸、適配體及其他化合物。例如，可利用聚(A)聚合酶將ATP類似物納入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步增加RNA之穩定性。
5'帽亦為RNA分子提供穩定性。在較佳實施例中，藉由本文所揭示方法產生之RNA包括5'帽。5'帽係使用業內已知且本文所述之技術提供(Cougot,等人，Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski等人，RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango等人，Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005))。
藉由本文所揭示方法產生之RNA亦可含有內部核糖體進入位點(IRES)序列。IRES序列可係起始非帽依賴性核糖體與mRNA之結合且有利於翻譯起始之任何病毒、染色體或人工設計序列。可包括任何適用於細胞電穿孔之溶質，該等溶質可含有有利於細胞滲透及活力之因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及表面活性劑。
可利用多種不同方法中之任一者(例如市售方法)將RNA引入靶細胞中，該等方法包括(但不限於)電穿孔(Amaxa Nucleofector-II (Amaxa Biosystems, Cologne, Germany))、(ECM 830 (BTX) (Harvard Instruments, Boston, Mass.)或Gene Pulser II (BioRad, Denver, Colo.)、Multiporator (Eppendort, Hamburg Germany)、利用脂質轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或生物彈射粒子遞送系統(例如「基因槍」) (參見(例如) Nishikawa等人 Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)。
非病毒遞送方法
在一些態樣中，可利用非病毒方法將編碼本文所述CAR之核酸遞送至細胞或組織或個體中。
在一些實施例中，非病毒方法包括利用轉座子(亦稱為可轉座元件)。在一些實施例中，轉座子係可插入自身基因組中之位置處之DNA片段，例如能夠自我複製且將其拷貝插入基因組中之DNA片段，或可自較長核酸剪接出且插入基因組中之另一位置中之DNA片段。舉例而言，轉座子包含由反向重複側接基因構成之DNA序列用於換位。
利用轉座子之核酸遞送之實例性方法包括睡美人轉座子系統(SBTS)及piggyBac (PB)轉座子系統。參見(例如) Aronovich等人，Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20；Singh等人Cancer Res. 15(2008):2961-2971；Huang等人，Mol. Ther. 16(2008):580-589；Grabundzija等人，Mol. Ther. 18(2010):1200-1209；Kebriaei等人，Blood. 122.21(2013):166；Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16；Bell等人，Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65；及Ding等人，Cell. 122.3(2005):473-83，所有該等文獻皆以引用方式併入本文中。
SBTS包括兩種組分：1) 含有轉基因之轉座子及2) 轉座酶之來源。轉座酶可使轉座子自載體質體(或其他供體DNA)換位至靶DNA，例如宿主細胞染色體/基因組。舉例而言，轉座酶結合至載體質體/供體DNA，自質體切割出轉座子(包括轉基因)，並將其插入宿主細胞之基因組中。參見(例如) Aronovich等人，同上文。
實例性轉座子包括基於pT2之轉座子。參見(例如) Grabundzija等人Nucleic Acids Res 41.3(2013):1829-47；及Singh等人Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971，所有該等文獻皆以引用方式併入本中。實例性轉座酶包括Tc1/水手(mariner)型轉座酶，例如SB10轉座酶或SB11轉座酶(可自例如巨細胞病毒啟動子表現之過度活性轉座酶)。參見(例如) Aronovich等人；Kebriaei等人；及Grabundzija等人，所有該等文獻皆以引用方式併入本文中。
使用SBTS允許轉基因(例如編碼本文所述CAR之核酸)之有效整合及表現。本文提供例如利用轉座子系統(例如SBTS)產生穩定地表現本文所述CAR之細胞(例如，T細胞或NK細胞)的方法。
根據本文所述之方法，在一些實施例中，將一或多種含有SBTS組分之核酸(例如，質體)遞送至細胞(例如，T或NK細胞)。舉例而言，核酸係藉由標準核酸(例如，質體DNA)遞送方法(例如本文所述之方法，例如電穿孔、轉染或脂轉染)來遞送。在一些實施例中，核酸含有包含轉基因(例如，編碼本文所述CAR之核酸)之轉座子。在一些實施例中，核酸含有包含轉基因(例如，編碼本文所述CAR之核酸)以及編碼轉座酶之核酸序列的轉座子。在其他實施例中，提供具有兩種核酸之系統，例如雙質體系統，例如其中第一質體含有包含轉基因之轉座子且第二質體含有編碼轉座酶之核酸序列。舉例而言，第一及第二核酸係共遞送至宿主細胞中。
在一些實施例中，表現本文所述CAR之細胞(例如，T或NK細胞)係藉由使用利用SBTS之基因插入及利用核酸酶(例如，鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas系統或經改造大範圍核酸酶重改造之歸巢核酸內切酶)之遺傳編輯的組合來產生。
在一些實施例中，使用非病毒遞送方法允許再程式化細胞(例如，T或NK細胞)，並將細胞直接輸注至個體中。非病毒載體之優點包括(但不限於)易於且相對低成本地製造滿足患者群、儲存期間之穩定性及缺少免疫原性所需之足量。
編碼 CAR 之核酸構築體
本發明亦提供編碼一或多種本文所述之CAR構築體之核酸分子。在一態樣中，核酸分子係以信使RNA轉錄本提供。在一態樣中，核酸分子係以DNA構築體提供。
因此，在一態樣中，本發明係關於編碼嵌合抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含刺激結構域，例如共刺激信號傳導結構域及/或初級信號傳導結構域，例如ζ鏈。
編碼期望分子之核酸序列可利用業內已知之重組方法來獲得，例如利用標準技術藉由自表現該基因之細胞篩選文庫、自已知包括該基因之載體衍生出基因或自含有該基因之細胞及組織直接分離來獲得。或者，所關注基因可以合成方式而非選殖來產生。
本發明亦提供其中插入本發明DNA之載體。源自反轉錄病毒(例如慢病毒)之載體係達成長期基因轉移之適宜工具，此乃因其容許轉基因長期穩定整合及其在子細胞中繁殖。慢病毒載體比源自致癌反轉錄病毒(例如鼠類白血病病毒)之載體的額外優點在於，其可轉導非增殖細胞(例如肝細胞)。其亦具有低免疫原性之額外優點。反轉錄病毒載體亦可係例如γ反轉錄病毒載體。γ反轉錄病毒載體可包括例如啟動子、封裝信號(ψ)、引子結合位點(PBS)、一或多個(例如，兩個)長末端重複(LTR)及所關注轉基因(例如，編碼CAR之基因)。γ反轉錄病毒載體可能缺少病毒結構基因，例如gag、pol及env。實例性γ反轉錄病毒載體包括鼠類白血病病毒(MLV)、脾病灶形成病毒(SFFV)及骨髓增殖性肉瘤病毒(MPSV)及源自其之載體。其他γ反轉錄病毒載體闡述於(例如) Tobias Maetzig等人，「Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application」 Viruses. 2011年6月；3(6): 677-713中。
在另一實施例中，包含編碼本發明期望CAR之核酸之載體係腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中，編碼CAR之核酸之表現可利用轉座子(例如睡美人、CRISPR、CAS9及鋅指核酸酶)來實現。參見下文June等人 2009Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716，其以引用方式併入本文中。
在簡述中，編碼CAR之天然或合成核酸之表現通常係藉由將編碼CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子並將構築體納入表現載體中來達成。載體可適於在真核生物中複製及整合。典型選殖載體含有轉錄及翻譯終止子、起始序列及可用於調控期望核酸序列表現之啟動子。
本發明之表現構築體亦可利用標準基因遞送方案用於核酸免疫及基因療法。用於基因遞送之方法為業內已知。參見(例如)美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，該等專利之全文皆以引用方式併入本文中。在另一實施例中，本發明提供基因療法載體。
核酸可選殖至多種類型之載體中。舉例而言，核酸可選殖至包括(但不限於)以下各項之載體中：質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏粒。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及測序載體。
此外，可向細胞提供呈病毒載體形式之表現載體。病毒載體技術為業內所熟知且闡述於例如Sambrook等人，2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press, NY)及其他病毒學及分子生物學手冊中。可用作載體之病毒包括(但不限於)反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適宜載體含有在至少一種生物體中發揮功能之複製起點、啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及一或多個選擇標記物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已研發多種基於病毒之系統用於基因轉移至哺乳動物細胞中。舉例而言，反轉錄病毒為基因遞送系統提供方便的平臺。可利用業內已知技術將所選基因插入載體中且封裝在反轉錄病毒粒子中。然後可以活體內或離體方式將重組病毒分離並遞送至個體細胞中。多種反轉錄病毒系統為業內已知。在一些實施例中，使用腺病毒載體。多種腺病毒載體為業內已知。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
其他啟動子元件(例如增強子)調控轉錄起始之頻率。通常，該等元件位於起始位點上游之30-110 bp區域中，但已顯示多種啟動子亦含有位於起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間之間距通常較靈活，以使得在相對於彼此插入或移動元件時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間之間距可在活性開始下降之前增加至50 bp。端視啟動子，似乎個別元件可協同或獨立地發揮活化轉錄之功能。
能夠在哺乳動物T細胞中表現CAR轉基因之啟動子之實例係EF1a啟動子。天然EF1a啟動子驅動負責將胺基醯基tRNA酶促遞送至核糖體之延伸因子-1複合物之α亞單位的表現。EF1a啟動子已廣泛地用於哺乳動物表現質體中，且已展示可有效地驅動來自選殖至慢病毒載體中之轉基因之CAR表現。參見(例如) Milone等人，Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)。
啟動子之另一實例係立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列係能夠驅動與其可操作地連接之任何多核苷酸序列之高表現量的強組成型啟動子序列。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，包括(但不限於)猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子以及人類基因啟動子，例如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、延伸因子-1α啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明應不限於使用組成型啟動子。亦涵蓋誘導型啟動子作為本發明之一部分。使用誘導型啟動子提供能夠在期望該表現時啟動可操作地連接之多核苷酸序列的表現或在不期望該表現時關閉表現之分子開關。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
啟動子之另一實例係磷酸甘油酸鹽激酶(PGK)啟動子。在實施例中，可期望經截短PGK啟動子(例如在與野生型PGK啟動子序列相比時具有一或多個(例如1、2、5、10、100、200、300或400個核苷酸缺失)之PGK啟動子)。下文提供實例性PGK啟動子之核苷酸序列。
WT PGK 啟動子
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
(SEQ ID NO: 281)
實例性經截短 PGK 啟動子：
PGK100：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
(SEQ ID NO: 282)
PGK200：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
(SEQ ID NO: 283)
PGK300：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
(SEQ ID NO: 284)
PGK400：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
(SEQ ID NO: 285)
載體亦可包括例如促進分泌之信號序列、多腺苷酸化信號及轉錄終止子(例如來自牛生長激素(BGH)基因)、容許進行附加型複製及在原核生物中複製之元件(例如SV40來源及ColE1或其他業內已知者)以及容許進行選擇之元件(例如胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因及/或吉歐黴素(zeocin)標記物)。
為評估CAR多肽或其部分之表現，欲引入細胞中之表現載體亦可含有選擇標記物基因或報導基因或二者，以有利於自欲經由病毒載體轉染或感染所尋求之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，選擇標記物可攜載於DNA之單獨片段上且用於共轉染程序中。選擇標記物及報導基因二者可側接有適宜調控序列以使得能夠在宿主細胞中表現。有用可選標記物包括(例如)抗生素抗性基因，例如neo及諸如此類。
報導基因係用於鑑別潛在轉染之細胞且用於評估調控序列之功能。一般而言，報導基因係不存在於接受者生物體或組織中或不由其表現且編碼其表現係由一些可容易檢測之性質(例如酶促活性)呈現之多肽的基因。報導基因之表現係在將DNA引入接受者細胞之後之適宜時間分析。適宜報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶之基因或綠色螢光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適宜表現系統為一般所熟知且可利用已知技術製備或以商業方式獲得。一般而言，將顯示報導基因之最高表現量之具有最小5'側接區之構築體鑑別為啟動子。可將該等啟動子區域連接至報導基因且用於評估藥劑調節啟動子驅動之轉錄之能力。
在一個實施例中，載體可進一步包含編碼第二CAR之核酸。在一個實施例中，第二CAR包括針對在急性骨髓性白血病細胞上表現之靶標之抗原結合結構域，例如CD123、CD34、CLL-1、葉酸鹽受體β或FLT3；或針對在B細胞上表現之靶標之抗原結合結構域，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a。在一個實施例中，載體包含編碼第一CAR之核酸序列，該第一CAR特異性結合第一抗原且包括具有共刺激信號傳導結構域而非初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域；及編碼第二CAR之核酸，該第二CAR特異性結合第二不同抗原且包括具有初級信號傳導結構域而非共刺激信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域。在一個實施例中，載體包含編碼第一BCMA CAR之核酸，該第一BCMA CAR包括BCMA 結合結構域、跨膜結構域及共刺激結構域；及編碼第二CAR之核酸，該第二CAR標靶除BCMA之外之抗原(例如在AML細胞上表現之抗原，例如CD123、CD34、CLL-1、葉酸鹽受體β或FLT3；或在B細胞上表現之抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)且包括抗原結合結構域、跨膜結構域及初級信號傳導結構域。在另一實施例中，載體包含編碼第一BCMA CAR之核酸，該第一BCMA CAR包括BCMA結合結構域、跨膜結構域及初級信號傳導結構域；及編碼第二CAR之核酸，該第二CAR特異性結合除BCMA之外之抗原(例如在AML細胞上表現之抗原，例如CD123、CD34、CLL-1、葉酸鹽受體β或FLT3；或在B細胞上表現之抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)且包括針對抗原之抗原結合結構域、跨膜結構域及共刺激信號傳導結構域。
在一個實施例中，載體包含編碼本文所述BCMA CAR之核酸及編碼抑制性CAR之核酸。在一個實施例中，抑制性CAR包含結合在正常細胞而非癌細胞(例如亦表現BCMA之正常細胞)上發現之抗原的抗原結合結構域。在一個實施例中，抑制性CAR包含抑制性分子之抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內結構域。舉例而言，抑制性CAR之細胞內結構域可為PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I類MHC、II類MHC、GAL9、腺苷及TGFR β之細胞內結構域。
在實施例中，載體可包含兩個或更多個編碼CAR之核酸序列，例如本文所述BCMA CAR及第二CAR，例如抑制性CAR或特異性結合至除BCMA之外之抗原(例如在AML細胞上表現之抗原，例如CD123、CLL-1、CD34、FLT3或葉酸鹽受體β；或在B細胞上表現之抗原，例如CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、CD123、FLT-3、ROR1、CD79b、CD179b或CD79a)之CAR。在該等實施例中，兩個或更多個編碼CAR之核酸序列係由單一核酸分子在相同框中且作為單一多肽鏈編碼。在此態樣中，兩個或更多個CAR可(例如)由一或多個肽裂解位點分開。(例如自動裂解位點或細胞內蛋白酶之受質)。肽裂解位點之實例包括以下，其中GSG殘基係可選的：
T2A： (GSG) E G R G S L L T C G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 286)
P2A： (GSG) A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P (SEQ ID NO: 287)
E2A： (GSG) Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 288)
F2A： (GSG) V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P (SEQ ID NO: 289)
業內已知將基因引入細胞中且在細胞中表現之方法。在表現載體之背景下，可藉由業內之任何方法將該載體容易地引入宿主細胞(例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。例如，可藉由物理、化學或生物方式將表現載體轉移至宿主細胞中。
用於將多核苷酸引入宿主細胞中之物理方法包括硫酸鈣沈澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及諸如此類。用於產生包含載體及/或外源核酸之細胞之方法為業內所熟知。參見(例如) Sambrook等人，2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press, NY)。用於將多核苷酸引入宿主細胞中之較佳方法係磷酸鈣轉染。
用於將所關注多核苷酸引入宿主細胞中之生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體且尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入哺乳動物(例如人類)細胞中之方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、疱疹單純型病毒I、腺病毒及腺相關病毒及諸如此類。參見(例如)美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
用於將多核苷酸引入宿主細胞中之化學方式包括膠質分散系統，例如大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、膠束、混合膠束及脂質體。用作活體外及活體內遞送媒劑之實例性膠質系統係脂質體(例如人工膜囊泡)。可獲得目前最佳技術標靶遞送核酸之其他方法，例如使用標靶微粒子或其他適宜亞微米大小之遞送系統遞送多核苷酸。
在利用非病毒遞送系統之情形下，實例性遞送媒劑係脂質體。預期使用脂質調配物將核酸引入宿主細胞中(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質締合。與脂質締合之核酸可囊封於脂質體之水性內部，散置在脂質體之脂質雙層內，經由與脂質體及寡核苷酸二者締合之連接分子連接至脂質體，包埋於脂質體中，與脂質體複合，分散在含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有膠束或與其複合或以其他方式與脂質締合。脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體締合之組合物並不限於溶液中之任何具體結構。例如，其可以雙層結構、膠束或「塌陷」結構存在。其亦可簡單地散置於溶液中，可能形成大小或形狀不均勻之聚集物。脂質係可為天然或合成脂質之脂肪物質。舉例而言，脂質包括天然存在於細胞質中之脂肪小滴以及含有長鏈脂肪族烴及其衍生物之化合物類別，例如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛。
適於使用之脂質可自商業來源獲得。例如，雙十四烷基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可自Sigma, St. Louis, MO獲得；磷酸雙十六烷基酯(「DCP」)可自K & K Laboratories (Plainview, NY)獲得；膽固醇(「Choi」)可自Calbiochem-Behring獲得；雙十四烷基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可自Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL.)獲得。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中之儲備溶液可儲存在約-20℃下。使用氯仿作為唯一溶劑，此乃因其比甲醇更容易蒸發。「脂質體」係涵蓋多種藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成之單一及多層脂質媒劑的一般術語。脂質體之特徵可在於具有磷脂雙層膜及內部水性介質之囊泡狀結構。多層脂質體具有多個藉由水性介質分開之脂質層。其係在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發形成。脂質組分在閉合結構形成之前經受自我重排且將水及所溶解溶質包埋在脂質雙層之間(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5: 505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡狀結構不同之結構之組合物。舉例而言，脂質可呈膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦涵蓋lipofectamine-核酸複合物。
無論將外源核酸引入宿主細胞中所使用之方法抑或以其他方式將細胞暴露於本發明抑制劑下，為確認在宿主細胞中存在重組DNA序列，可實施多種分析。該等分析包括例如彼等熟習此項技術者所熟知之「分子生物學」分析，例如南方墨點法及北方墨點法、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析，例如檢測具體肽之存在或不存在，例如藉由免疫學方式(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所闡述之分析，以鑑別屬本發明範疇內之藥劑。
本發明進一步提供包含編碼CAR之核酸分子之載體。在一態樣中，CAR載體可直接轉導至細胞(例如T細胞或NK細胞)中。在一態樣中，載體係選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下各項之載體：一或多種質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及慢病毒載體構築體。在一態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞或NK細胞中表現CAR構築體。在一態樣中，哺乳動物T細胞係人類T細胞。在一態樣中，哺乳動物NK細胞為人類NK細胞。
細胞之來源
在擴增及遺傳修飾之前，自個體獲得細胞之來源，例如免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)。術語「個體」意欲包括其中可誘發免疫反應之活的生物體(例如哺乳動物)。個體之實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。T細胞可自多種來源獲得，該等來源包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染位點之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤。
在本發明之某些態樣中，可使用業內可獲得之任何數量之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)。在本發明之某些態樣中，T細胞可自利用任何數量之熟習此項技術者已知之技術(例如Ficoll™分離)自個體收集之一單位血液獲得。在一較佳態樣中，來自個體循環血液之細胞係藉由血球分離獲得。血球分離產物通常含有淋巴球(包括T細胞)、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球、紅血球及血小板。在一態樣中，藉由血球分離收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且使細胞置於適宜緩衝液或培養基中用於隨後處理步驟。在本發明之一態樣中，使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在替代態樣中，洗滌溶液缺乏鈣且可缺乏鎂或可缺乏許多但非所有二價陽離子。
在鈣不存在下之初始活化步驟可使得活化放大。如彼等熟習此項技術者將容易地瞭解，洗滌步驟可藉由彼等業內已知之方法完成，例如根據製造商之說明書藉由利用半自動「流過」離心機(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)來完成。洗滌後，可將細胞重懸浮於多種生物相容性緩衝液中，例如不含Ca、不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含緩衝液之鹽水溶液。或者，可移除血球分離樣本之不期望組分且將細胞直接重懸浮於培養基中。
認識到本申請案之方法可利用包含5%或更少、例如2%人類AB血清之培養基條件且採用已知培養基條件及組合物，例如以下中所述之彼等：Smith等人，「Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement」Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31；doi:10.1038/cti.2014.31。
在一態樣中，藉由溶解紅血球且清除單核球自外周血淋巴球分離T細胞，例如藉由PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘析來分離。可藉由正或負選擇技術進一步分離T細胞之特定亞群，例如CD3+、CD4+、CD8+、CD45RA+及/或CD45RO+T細胞。例如，在一態樣中，T細胞係藉由與抗CD3/抗CD28 (例如3×28)偶聯之珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以對期望T細胞進行正選擇之時間段來分離。在一態樣中，時間段為約30分鐘。在又一態樣中，時間段介於30分鐘至36小時或更長及其間之所有整數值範圍內。在又一態樣中，時間段係至少1、2、3、4、5或6小時。在又一態樣中，時間段為10小時至24小時。在一態樣中，培育時間段為24小時。在與其他細胞類型相比T細胞極少的任何情況下(例如在自腫瘤組織或自免疫受損個體分離腫瘤浸潤淋巴球(TIL)中)，可利用較長培育時間來分離T細胞。此外，利用較長培育時間可增加捕獲CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單地縮短或延長時間可使T細胞與CD3/CD28珠粒結合，及/或藉由增加或減小珠粒對T細胞之比率(如本文進一步所述)，可在培養起始時或該過程期間之其他時間點優先選擇或不選擇T細胞亞群。另外，藉由增加或減少珠粒或其他表面上之抗CD3及/或抗CD28抗體之比率，可在培養起始時或其他期望時間點優先選擇或不選擇T細胞亞群。熟習此項技術者將意識到亦可在本發明背景下使用多輪選擇。在某些態樣中，可期望在活化及擴增過程中實施選擇程序且使用「未經選擇之」細胞。亦可使「未經選擇之」細胞經歷多輪選擇。
藉助負選擇之T細胞群體之富集可使用針對負選擇細胞所獨有之表面標記物之抗體的組合來完成。一種方法係經由負磁免疫黏附或流式細胞術使用針對存在於負選擇細胞上之細胞表面標記物之單株抗體的混合物之細胞分選及/或選擇。例如，為藉由負選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些態樣中，可期望富集或正選擇通常表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及FoxP3+之調控T細胞。在某些態樣中，可能期望富集CD127低之細胞。或者，在某些態樣中，T調控細胞係藉由抗C25偶聯珠粒或其他相似選擇方法來清除。
本文所述之方法可包括例如利用例如負選擇技術(例如本文所述)選擇為T調控細胞清除群之特定免疫效應細胞(例如，T細胞)亞群CD25+清除細胞。較佳地，T調控清除細胞含有少於30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1%之CD25+細胞。
在一個實施例中，利用抗CD25抗體或其片段或CD25結合配體IL-2自該群移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)。在一個實施例中，抗CD25抗體或其片段或CD25結合配體偶聯至受質(例如，珠粒)，或以其他方式包覆於受質(例如，珠粒)上。在一個實施例中，抗CD25抗體或其片段偶聯至如本文所述之受質。
在一個實施例中，利用來自MiltenyiTM 之CD25清除試劑自該群移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)。在一個實施例中，細胞對CD25清除試劑之比率係1e7個細胞對20 uL、或1e7個細胞對15 uL、或1e7個細胞對10 uL、或1e7個細胞對5 uL、或1e7個細胞對2.5 uL、或1e7個細胞對1.25 uL。在一個實施例中，例如對T調控細胞，例如CD25+清除，使用大於500百萬個細胞/ml。在另一態樣中，使用600百萬、700百萬、800百萬或900百萬個細胞/ml之濃度。
在一個實施例中，欲清除之免疫效應細胞之群體包括約6 × 109 個CD25+ T細胞。在其他態樣中，欲清除之免疫效應細胞之群體包括約1 × 109 至1× 1010 個CD25+ T細胞及其之間之任何整數值。在一個實施例中，T調控清除細胞之所得群體具有2 × 109 個T調控細胞，例如CD25+細胞，或更少(例如1 × 109 、5 × 108 、1 × 108 、5 × 107 、1 × 107 或更少CD25+細胞)。
在一個實施例中，利用具有清除管設置(例如管162-01)之CliniMAC系統自該群體移除T調控型細胞(例如，CD25+細胞)。在一個實施例中，在清除環境(例如DEPLETION2.1)上運行CliniMAC系統。
不希望受限於具體理論，在血球分離之前或在製造CAR表現細胞產物期間減少個體中免疫細胞之陰性調節劑之含量(例如，減少不期望免疫細胞(例如，TREG 細胞)之數量)可降低個體復發之風險。舉例而言，清除TREG 細胞之方法為業內已知。減少TREG 細胞之方法包括(但不限於)環磷醯胺、抗GITR抗體(本文所述之抗GITR抗體)、CD25清除及其組合。
在一些實施例中，製造方法包含在製造CAR表現細胞之前減少(例如，清除)TREG 細胞之數量。舉例而言，製造方法包含使樣本(例如，血球分離樣本)與抗GITR抗體及/或抗CD25抗體(或其片段或CD25結合配體)接觸，例如以在製造CAR表現細胞(例如，T細胞、NK細胞)產物之前清除TREG 細胞。
在實施例中，用一或多種減少TREG 細胞之療法預治療個體，然後收集細胞用於CAR表現細胞產物製造，由此降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。在實施例中，減少TREG 細胞之方法包括(但不限於)向個體投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25清除中之一或多者或其組合。投與環磷醯胺、抗GITR抗體、CD25清除中之一或多者或其組合可發生在輸注CAR表現細胞產物之前、期間或之後。
在實施例中，用環磷醯胺預治療個體，然後收集細胞用於CAR表現細胞產物製造，由此降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。在實施例中，用抗GITR抗體預治療個體，然後收集細胞用於CAR表現細胞產物製造，由此降低個體對CAR表現細胞治療復發之風險。
在一個實施例中，欲移除之細胞群體並非調控T細胞或腫瘤細胞，而是以其他方式對CART細胞(例如表現CD14、CD11b、CD33、CD15或由潛在免疫阻抑細胞表現之其他標記物的細胞)之擴增及/或功能造成消極影響的細胞。在一個實施例中，設想該等細胞與調控T細胞及/或腫瘤細胞同時移除，或在該清除後移除，或以另一順序移除。
本文所述之方法可包括一個以上之選擇步驟，例如一個以上之清除步驟。可藉由負選擇與例如針對為負選擇細胞所獨有之表面標記物之抗體的組合完成T細胞群體之富集。一種方法係經由負磁免疫黏附或流式細胞術使用針對存在於負選擇細胞上之細胞表面標記物之單株抗體的混合物之細胞分選及/或選擇。例如，為藉由負選擇富集CD4+細胞，單株抗體混合物可包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。
本文所述之方法可進一步包括自表現腫瘤抗原(例如不包含CD25、例如CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b之腫瘤抗原)之群體移除細胞，由此提供適於表現CAR (例如，本文所述之CAR)之T調控清除細胞(例如，CD25+清除細胞)及腫瘤抗原清除細胞的群體。在一個實施例中，腫瘤抗原表現細胞係與T調控細胞(例如，CD25+細胞)同時移除。舉例而言，抗CD25抗體或其片段及抗腫瘤抗原抗體或其片段可連接至相同受質(例如，珠粒)，其可用於移除細胞，或抗CD25抗體或其片段或抗腫瘤抗原抗體或其片段可連接至單獨珠粒，其混合物可用於移除細胞。在其他實施例中，T調控細胞(例如，CD25+細胞)之移除及腫瘤抗原表現細胞之移除係依序進行，且可例如以任一順序進行。
亦提供包括以下步驟之方法：自表現檢查點抑制劑(例如本文所述之檢查點抑制劑)之群體移除細胞(例如PD1+細胞、LAG3+細胞及TIM3+細胞中之一或多者)，由此提供T調控清除細胞(例如，CD25+清除細胞)及檢查點抑制劑清除細胞(例如，PD1+、LAG3+及/或TIM3+清除細胞)之群體。實例性檢查點抑制劑包括PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I類MHC、II類MHC、GAL9、腺苷及TGFR β。在實施例中，檢查點抑制劑係PD1或PD-L1。在一個實施例中，檢查點抑制劑表現細胞係與T調控細胞(例如，CD25+細胞)同時移除。舉例而言，抗CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可連接至相同珠粒，其可用於移除細胞，或抗CD25抗體或其片段及抗檢查點抑制劑抗體或其片段可連接至單獨珠粒，其混合物可用於移除細胞。在其他實施例中，T調控細胞(例如，CD25+細胞)之移除及檢查點抑制劑表現細胞之移除係依序進行，且可例如以任一順序進行。
在一實施例中，可選擇表現以下中之一或多者之T細胞群體：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、粒酶B及穿孔蛋白或其他適當分子(例如其他細胞介素)。可藉由例如PCT公開案第WO 2013/126712號中所述之方法來確定用於細胞表現之篩選方法。
為藉由正或負選擇來分離期望細胞群體，可改變細胞及表面(例如粒子，例如珠粒)之濃度。在某些態樣中，可期望顯著減小珠粒及細胞混合在一起之體積(例如增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。例如，在一態樣中，使用20億個細胞/ml之濃度。在一態樣中，使用10億個細胞/ml之濃度。在又一態樣中，使用大於100百萬個細胞/ml。在又一態樣中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/ml之細胞濃度。在又一態樣中，使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125百萬或150百萬個細胞/ml之濃度。利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可更有效地捕獲可弱表現所關注靶抗原之細胞，例如CD28陰性T細胞，或來自存在許多腫瘤細胞之樣本(例如白血病血液、腫瘤組織等)。該等細胞群體可具有治療價值且將期望獲得。舉例而言，利用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在相關態樣中，可期望使用較低濃度之細胞。藉由大量稀釋T細胞與表面(例如粒子，例如珠粒)之混合物，最小化粒子與細胞之間之相互作用。此選擇表現大量與粒子結合之期望抗原之細胞。舉例而言，稀釋濃度之CD4+ T細胞比CD8+ T細胞表現更高量之CD28且更有效地被捕獲。在一態樣中，所使用細胞之濃度為5 × 10e6/ml。在其他態樣中，所使用之濃度可係約1 × 105 /ml至1 × 106 /ml及其間之任何整數值。
在其他態樣中，可在2℃-10℃或在室溫下在旋轉器上以不同速度將細胞培育不同時間長度。
亦可在洗滌步驟後冷凍用於刺激之T細胞。不希望受限於理論，冷凍及後續解凍步驟藉由在細胞群體中移除顆粒球且在一定程度上移除單核球來提供更均勻之產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為業內已知且可用於此背景下，但一種方法涉及利用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO或31.25% PlasmaLyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%葡聚糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基或其他含有例如羥乙基澱粉及PlasmaLyte A之適宜細胞冷凍培養基，然後以1°/分鐘之速率將細胞冷凍至-80℃且儲存在液氮儲存罐之氣相中。可使用其他受控冷凍方法以及立即在-20℃下或液氮中之不受控冷凍。
在某些態樣中，如本文所述將冷藏保存之細胞解凍且洗滌並在室溫下靜置1小時，然後利用本發明方法進行活化。
本發明亦涵蓋在可能需要如本文所述之擴增細胞之前之一定時間段自個體收集血液樣本或血球分離產物。因此，可在任何所需時間點收集欲擴增細胞之來源及期望細胞(例如免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞)，分離且冷凍，以供稍後於細胞療法(例如T細胞療法)中用於任何數量之將受益於細胞療法(例如T細胞療法)之疾病或病況(例如本文所闡述之彼等)。在一態樣中，血液樣本或血球分離物係取自一般健康個體。在某些態樣中，血液樣本或血球分離物係取自具有罹患疾病之風險、但尚未罹患疾病之一般健康個體，且分離並冷凍所關注細胞以供稍後使用。在某些態樣中，可使免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)擴增、冷凍且稍後使用。在某些態樣中，樣本係自診斷如本文所述之具體疾病後不久但在任何治療之前之患者收集。在另一態樣中，細胞係自在任何數量之相關治療模式之前的個體之血液樣本或血球分離物分離，該等治療模式包括(但不限於)使用以下各項之治療：藥劑，例如那他珠單抗(natalizumab)、依法利珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑；化學療法；輻射；免疫阻抑劑，例如環孢素、硫唑嘌呤、胺甲蝶呤、黴酚酸酯及FK506；抗體或其他免疫燒蝕劑，例如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺(cytoxan)、氟達拉濱(fludarabine)、環孢素、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228及輻照。
在本發明之另一態樣中，T細胞係在使個體保留功能性T細胞之治療後直接自患者獲得。就此而言，已觀察到，在某些癌症治療後，尤其在使用損害免疫系統之藥物治療後，在患者通常因治療而恢復之時段期間治療後不久，所獲得T細胞之品質可能最佳或其離體擴增能力得到改良。同樣，利用本文所述之方法進行離體操縱後，該等細胞可處於增強植入及活體內擴增之較佳狀態。因此，本發明涵蓋在此恢復期間收集血細胞，包括T細胞、樹突狀細胞或造血係之其他細胞。此外，在某些態樣中，可使用動員(例如利用GM-CSF之動員)及調理方案在個體中產生其中尤其在治療後所定義時間窗期間有利於具體細胞類型之重建、再循環、再生及/或擴增之條件。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及免疫系統之其他細胞。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如，本文所述之CAR分子)之免疫效應細胞係自已接受低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之個體獲得。在實施例中，在足夠時間後或在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑之足夠投藥後收穫經改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞)群體，使得個體中或自個體收穫之PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如，T細胞)之比率至少瞬時增加。
在其他實施例中，具有或經改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如，T細胞)群體可藉由與一定量之增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)之數量或增加PD1陰性免疫效應細胞(例如，T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率的mTOR抑制劑接觸來離體治療。
在一個實施例中，T細胞群體為二醯基甘油激酶(DGK)缺乏的。DGK缺乏細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質或具有降低或抑制的DGK活性之細胞。DGK缺乏細胞可藉由遺傳方式(例如投與RNA干擾劑，例如siRNA、shRNA、miRNA，以降低或防止DGK表現)來產生。或者，DGK缺乏細胞可藉由使用本文所述之DGK抑制劑治療來產生。
在一個實施例中，T細胞群體為伊卡洛斯(Ikaros)缺乏的。伊卡洛斯缺乏細胞包括不表現伊卡洛斯RNA或蛋白質或具有降低或抑制的伊卡洛斯活性之細胞，伊卡洛斯缺乏細胞可藉由遺傳方式(例如投與RNA干擾劑，例如siRNA、shRNA、miRNA，以降低或防止伊卡洛斯表現)來產生。或者，伊卡洛斯缺乏細胞可藉由使用伊卡洛斯抑制劑(例如，雷利竇邁(lenalidomide))治療來產生。
在實施例中，T細胞群體為DGK缺乏及伊卡洛斯缺乏的，例如不表現DGK及伊卡洛斯或具有降低或抑制的DGK及伊卡洛斯活性。該等DGK及伊卡洛斯缺乏細胞可藉由本文所述之任一方法產生。
在實施例中，NK細胞係自個體獲得。在另一實施例中，NK細胞係NK細胞系，例如NK-92細胞系(Conkwest)。
CAR 細胞 ( 包括同種異體 CAR 細胞 ) 之修飾
在本文所述之實施例中，免疫效應細胞可係同種異體免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。舉例而言，細胞可係同種異體T細胞，例如缺少功能性T細胞受體(TCR)及/或人類白血球抗原(HLA) (例如，I類HLA及/或II類HLA)及/或β-2微球蛋白(β2 m)表現之同種異體T細胞。同種異體CAR之組合物及其方法闡述於(例如) WO 2016/014565之第227-237頁中，該專利之全文以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，細胞(例如T細胞或NK細胞)經修飾以使用(例如)本文所述方法(例如siRNA、shRNA、規律成簇的間隔短迴文重複(CRISPR)轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)或鋅指內核酸酶(ZFN))減少TCR及/或HLA及/或β2 m及/或本文所述抑制性分子(例如PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM (例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、HVEM (TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、I類MHC、II類MHC、GAL9、腺苷及TGFR β)之表現。
在一些實施例中，細胞(例如T細胞或NK細胞)經改造以表現端粒酶亞單位，例如端粒酶之催化亞單位，例如TERT，例如hTERT。在一個實施例中，該等修飾改良細胞在患者中之持久性。
T 細胞之活化及擴增
T細胞通常可利用如例如以下專利中所闡述之方法來活化及擴增：美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國專利申請公開案第20060121005號。
通常，本發明之T細胞可藉由與表面接觸來擴增，該表面具有連接至其之刺激CD3/TCR複合物相關信號之藥劑及刺激T細胞表面上之共刺激分子之配體。具體而言，T細胞群體可如本文所闡述來刺激，例如藉由與固定在表面上之抗CD3抗體或其抗原結合片段或抗CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸來刺激。對於T細胞表面上輔助分子之共刺激，使用結合輔助分子之配體。舉例而言，可在適於刺激T細胞增殖之條件下使T細胞群體與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。為刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，使用抗CD3抗體及抗CD28抗體。抗CD28抗體之實例包括9.3，B-T3，可使用XR-CD28 (Diaclone, Besançon, France)，可使用業內通常已知之其他方法(Berg等人，Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen等人，J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland等人，J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)。
在某些態樣中，針對T細胞之主要刺激信號及共刺激信號藉由不同方案來提供。舉例而言，提供每一信號之藥劑可在溶液中或偶合至表面。當偶合至表面時，該等藥劑可偶合至相同表面(即呈「順式」形式)或偶合至單獨表面(即呈「反式」形式)。或者，一種藥劑可偶合至表面且另一藥劑在溶液中。在一態樣中，提供共刺激信號之藥劑與細胞表面結合，且提供初級活化信號之藥劑在溶液中或偶合至表面。在某些態樣中，兩種藥劑皆可在溶液中。在一態樣中，藥劑可呈可溶形式，且然後與表面交聯，例如表現Fc受體之細胞或抗體或將與該等藥劑結合之其他結合劑。就此而言，關於預期用於活化及擴增本發明中之T細胞的人工抗原呈遞細胞(aAPC)，參見(例如)美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號。
在一態樣中，將兩種藥劑固定在珠粒上，固定在同一珠粒上(即「順式」)，或固定在單獨珠粒上(即「反式」)。舉例而言，提供初級活化信號之藥劑係抗CD3抗體或其抗原結合片段，且提供共刺激信號之藥劑係抗CD28抗體或其抗原結合片段；且兩種藥劑以等效分子量共固定至同一珠粒。在一態樣中，使用與用於CD4+ T細胞擴增與T細胞生長之珠粒結合之每一抗體1:1的比率。在本發明之某些態樣中，使用與珠粒結合之抗CD3:CD28抗體之比率使得與利用1:1比率觀察到之擴增相比，觀察到T細胞擴增增加。在一態樣中，與利用1:1比率觀察到之擴增相比，觀察到約1倍至約3倍的增加。在一態樣中，與珠粒結合之CD3:CD28抗體之比率介於100:1至1:100及其間所有整數值範圍內。在本發明之一態樣中，與粒子結合之抗CD28抗體多於抗CD3抗體，例如CD3:CD28之比率小於1。在本發明之某些態樣中，與珠粒結合之抗CD28抗體對抗CD3抗體之比率大於2:1。在一具體態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1:100 CD3:CD28比率。在另一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1:75 CD3:CD28比率。在又一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1:50 CD3:CD28比率。在一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1:30 CD3:CD28比率。在一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1:10 CD3:CD28比率。在另一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之1:3 CD3:CD28比率。在又一態樣中，使用與珠粒結合之抗體之3:1 CD3:CD28比率。
可使用1:500至500:1及其間之任何整數值之粒子對細胞之比率來刺激T細胞或其他靶細胞。如彼等熟習此項技術者可容易地瞭解，粒子對細胞之比率可端視粒子相對於靶細胞之大小而定。舉例而言，大小較小之珠粒僅可結合少數細胞，而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中，細胞對粒子之比率介於1:100至100:1及其間之任何整數值範圍內，且在其他態樣中，該比率包含1:9至9:1及其間之任何整數值，其亦可用於刺激T細胞。引起T細胞刺激之抗CD3及抗CD28偶合粒子對T細胞之比率可如上所述來變化，然而某些較佳值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1及15:1，且一較佳比率為至少1:1粒子/T細胞。在一態樣中，使用粒子對細胞1:1或更小之比率。在一個具體態樣中，較佳粒子:細胞比率為1:5。在其他態樣中，粒子對細胞比率可端視刺激時間而變化。舉例而言，在一態樣中，在第一天時粒子對細胞之比率為1:1至10:1，且每天或每隔一天此後保持10天以1:1至1:10之最終比率(基於添加時間之細胞計數)將其他粒子添加至細胞中。在一個具體態樣中，在第一天刺激時粒子對細胞之比率為1:1，且在第三天及第五天刺激時調節至1:5。在一態樣中，在第一天時每天或每隔一天基於1:1之最終比率添加粒子，且在第三天及第五天刺激時基於1:5添加。在一態樣中，在第一天刺激時粒子對細胞之比率為2:1，且在第三天及第五天刺激時調節至1:10。在一態樣中，在第一天時每天或每隔一天基於1:1之最終比率添加粒子，且在第三天及第五天刺激時基於1:10添加。熟習此項技術者將瞭解，多種其他比率可適用於本發明中。具體而言，比率將端視粒子大小以及細胞大小及類型而變化。在一態樣中，在第一天時所使用之最典型比率為約1:1、2:1及3:1。
在本發明之其他態樣中，組合細胞(例如T細胞)與藥劑包覆之珠粒，隨後分離珠粒與細胞，且然後培養細胞。在替代態樣中，在培養之前，不分離藥劑包覆之珠粒與細胞但一起培養。在另一態樣中，首先藉由施加力(例如磁力)對珠粒及細胞進行濃縮，從而增加細胞表面標記物之連接，由此誘導細胞刺激。
舉例而言，可藉由使抗CD3及抗CD28所連接之順磁珠粒(3×28個珠粒)與T細胞接觸來連接細胞表面蛋白。在一態樣中，於緩衝液(例如PBS (不含諸如鈣及鎂等二價陽離子))中組合細胞(例如104 至109 個T細胞)與珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T順磁珠粒，比率為1:1)。而且，彼等熟習此項技術者可容易地瞭解，可使用任何細胞濃度。舉例而言，在樣本中靶細胞可極其稀少且僅佔樣本的0.01%或全部樣本(即100%)可包含所關注靶細胞。因此，任何細胞數量皆在本發明背景下。在某些態樣中，可期望顯著減小珠粒及細胞混合在一起之體積(即增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒之最大接觸。舉例而言，在一態樣中，使用約100億細胞/ml、90億/ml、80億/ml、70億/ml、60億/ml、50億/ml或20億細胞/ml之濃度。在另一態樣中，使用大於100百萬個細胞/ml。在又一態樣中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/ml之細胞濃度。在又一態樣中，使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，可使用125百萬或150百萬個細胞/ml之濃度。利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可更有效地捕獲可弱表現所關注靶抗原之細胞，例如CD28陰性T細胞。在某些態樣中，該等細胞群體可具有治療價值且將期望獲得。舉例而言，利用高濃度之細胞可更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在一個實施例中，經編碼CAR (例如，本文所述之CAR)之核酸轉導之細胞係例如藉由本文所述之方法擴增。在一個實施例中，使細胞在培養物中擴增若干小時(例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小時)至約14天(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)之時段。在一個實施例中，使細胞擴增4天至9天之時段。在一個實施例中，使細胞擴增8天或更短(例如7天、6天或5天)之時段。在一個實施例中，使細胞(例如，本文所述之BCMA CAR細胞)在培養物中擴增5天，且在相同培養條件下所得細胞比在培養物中擴增9天之相同細胞更強效。可藉由例如多種T細胞功能(例如增殖、靶細胞殺死、細胞介素產生、活化、遷移或其組合)來定義功效。在一個實施例中，在抗原刺激後與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，擴增5天之細胞(例如，本文所述之BCMA CAR細胞)展示細胞倍增增加至少一倍、兩倍、三倍或四倍。在一個實施例中，使細胞(例如，表現本文所述BCMA CAR之細胞)在培養物中擴增5天，且與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，所得細胞展現較高的促發炎細胞介素產生(例如，IFN-γ及/或GM-CSF含量)。在一個實施例中，與在相同培養條件下在培養物中擴增9天之相同細胞相比，擴增5天之細胞(例如，本文所述之BCMA CAR細胞)展示促發炎細胞介素產生(例如，IFN-γ及/或GM-CSF含量)增加至少一倍、兩倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更大(以pg/ml表示)。
在本發明之一態樣中，可將混合物培養若干小時(約3小時)至約14天或其間之任何小時整數值。在一態樣中，可將混合物培養21天。在本發明之一態樣中，將珠粒與T細胞一起培養約8天。在一態樣中，將珠粒與T細胞一起培養2-3天。若干刺激循環亦可能合意，使得T細胞之培養時間可為60天或更長適用於T細胞培養之條件包括可含有增殖及活力所需因子之適宜培養基(例如最小必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15 (Lonza))，該等因子包括血清(例如胎牛或人類血清)、介白素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟習此項技術者已知用於細胞生長之任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括(但不限於)表面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑(例如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇)。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20，最佳者具有所添加胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，不含血清或補充有適量血清(或血漿)或所定義之激素群及/或對於T細胞生長及擴增足夠之細胞介素量。抗生素(例如青黴素(penicillin)及鏈黴素(streptomycin))僅包括於實驗培養物而非欲輸注至個體中之細胞培養物中。將靶細胞維持在支持生長所需之條件下，例如適宜溫度(例如37℃)及氣氛(例如空氣加5% CO2 )。
在一個實施例中，使細胞在包括一或多種介白素之適宜培養基(例如，本文所述之培養基)中擴增，該等介白素使細胞在14天擴增時段內增加至少200倍(例如，200倍、250倍、300倍、350倍)，例如如藉由本文所述之方法(例如流式細胞術)所量測。在一個實施例中，在IL-15及/或IL-7 (例如，IL-15及IL-7)存在下擴增細胞。
在實施例中，本文所述之方法(例如，CAR表現細胞製造方法)包含例如利用抗CD25抗體或其片段或CD25結合配體IL-2自細胞群體移除T調控細胞(例如，CD25+ T細胞)。自細胞群體移除T調控細胞(例如，CD25+T細胞)之方法闡述於本文中。在實施例中，方法(例如，製造方法)進一步包含使細胞群體(例如，其中已清除T調控細胞(例如CD25+ T細胞)之細胞群體；或先前已接觸抗CD25抗體其片段或CD25結合配體之細胞群體)與IL-15及/或IL-7接觸。舉例而言，在IL-15及/或IL-7存在下擴增細胞群體(例如，先前已接觸抗CD25抗體、其片段或CD25結合配體之細胞群體)。
在一些實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間使本文所述CAR表現細胞與包含介白素-15 (IL-15)多肽、介白素-15受體α (IL-15Ra)多肽或IL-15多肽及IL-15Ra多肽二者之組合(例如hetIL-15)的組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽及IL-15 Ra多肽二者之組合的組合物接觸。在實施例中，在例如離體製造CAR表現細胞期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含hetIL-15之組合物接觸。
在一個實施例中，在離體擴增期間，使本文所述CAR表現細胞與包含hetIL-15之組合物接觸。在實施例中，在離體擴增期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽之組合物接觸。在實施例中，在離體擴增期間，使本文所述之CAR表現細胞與包含IL-15多肽及IL-15Ra多肽二者之組合物接觸。在一個實施例中，接觸使淋巴球亞群(例如，CD8+ T細胞)存活並增殖。
已暴露於多個刺激時間下之T細胞可展現不同特徵。例如，典型血液或血球分離之外周血單核細胞產品具有大於細胞毒性或阻抑T細胞群體之協助細胞T細胞群體(TH，CD4+)。T細胞藉助刺激CD3及CD28受體之離體擴增產生在約第8-9天之前主要由TH細胞組成而在約第8-9天之後T細胞群體包含日益增加之TC細胞群體的T細胞群體。因此，端視治療之目的，向個體輸注主要包含TH細胞之T細胞群體可能有利。類似地，若已分離TC細胞之抗原特異性亞組，則在較大程度上擴增此亞組可能有益。
此外，除CD4及CD8標記物外，其他表型標記物顯著變化，但在很大程度上在細胞擴增過程期間可再生。因此，該可再生性使得可針對特定目的來調適活化T細胞產物。
構築BCMA CAR後，可立即使用各自分析來評估分子之活性，例如(但不限於)在抗原刺激後使T細胞擴增之能力，在再刺激不存在下維持T細胞擴增之能力，及在適宜活體外及動物模型中之抗癌活性。評估BCMA CAR之效應之分析進一步詳細闡述於下文中。
可使用初級T細胞中之CAR表現之西方墨點分析來檢測單體及二聚體之存在。參見(例如) Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。極簡言之，使表現CAR之T細胞(CD4+ 及CD8+ T細胞之1:1混合物)在活體外擴增10天以上，然後溶解並在還原條件下實施SDS-PAGE。藉由西方墨點法利用針對TCR-ζ鏈之抗體檢測含有全長TCR-ζ細胞質結構域及內源TCR-ζ鏈之CAR。在非還原條件下使用相同T細胞亞組進行SDS-PAGE分析以允許評估共價二聚體形成。
可藉由流式細胞術量測抗原刺激後CAR+ T細胞之活體外擴增。舉例而言，用αCD3/αCD28 aAPC刺激CD4+ 及CD8+ T細胞之混合物，然後在欲分析之啟動子控制下用表現GFP之慢病毒載體轉導。實例性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在培養之第6天時在CD4+ 及/或CD8+ T細胞亞組中藉由流式細胞術評估GFP螢光。參見(例如) Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。或者，在第0天時用αCD3/αCD28包覆之磁珠刺激CD4+ 及CD8+ T細胞之混合物，並在第1天時利用表現CAR之雙順反子慢病毒載體以及eGFP利用2A核糖體跳躍序列用CAR轉導。將培養物用BCMA表現細胞(例如多發性骨髓瘤細胞系或K562-BCMA)再刺激，之後洗滌。將外源IL-2以100 IU/ml每隔一天添加至培養物中。藉由流式細胞術利用基於珠粒之計數來列舉GFP+ T細胞。參見(例如) Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。
亦可量測在再刺激不存在下之持續CAR+ T細胞擴增。參見(例如) Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。簡言之，在第0天用αCD3/αCD28包覆之磁珠刺激、並在第1天用所指示之CAR轉導後，在培養第8天時利用Coulter Multisizer粒子計數器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter量測平均T細胞體積(fl)。
亦可使用動物模型來量測CART活性。舉例而言，可使用利用人類BCMA特異性CAR+ T細胞之異種移植物模型來治療免疫缺陷小鼠之原發性人類多發性骨髓瘤。參見(例如) Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。極簡言之，在建立MM後，使小鼠隨機分配成治療組。可將不同數目之BCMA CART細胞注射至帶有MM之免疫缺陷小鼠。以每週間隔評估動物之疾病惡化及腫瘤負荷。利用對數等級檢測法比較各組之存活率曲線。另外，亦可分析在免疫缺陷小鼠中T細胞注射後4週之絕對外周血CD4+ 及CD8+ T細胞計數。向小鼠注射多發性骨髓瘤細胞，且3週後注射經改造以(例如)藉由編碼連接至eGFP之CAR之雙順反子慢病毒載體來表現BCMA CAR之T細胞。藉由與模擬物轉導之細胞混合將T細胞校正至45%-50%輸入GFP+ T細胞，然後注射，且藉由流式細胞術確認。以1週間隔評估動物之白血病。利用對數等級檢測法比較CAR+ T細胞組之存活率曲線。
依過去於例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)中之說明評估細胞增殖及細胞介素之產生。簡言之，在微量滴定板中，藉由混合已洗滌之T細胞與表現BCMA之K562細胞或在使用前經過γ-輻射輻照之其他表現BCMA之骨髓瘤細胞，評估CAR介導之增殖。將抗CD3 (純系OKT3)及抗CD28 (純系9.3)單株抗體添加至含有KT32-BBL細胞之培養物中，用作刺激T細胞增殖之陽性對照，此乃因該等信號支持長期CD8+ T細胞離體擴增。 在培養物中利用CountBright™螢光珠粒(Invitrogen, Carlsbad, CA)及流式細胞術，如製造商所述計算T細胞。藉由GFP表現，利用經eGFP-2A連接之表現CAR之慢病毒載體改造的T細胞鑑別CAR+ T細胞。對於不表現GFP之CAR+ T細胞，用生物素化重組BCMA蛋白及二級抗生物素蛋白-PE偶聯物檢測CAR+ T細胞。亦同時用特異性單株抗體(BD Biosciences)檢測T細胞上之CD4+及CD8+ 表現。根據製造商之說明書，利用人類TH1/TH2細胞介素細胞計數珠粒陣列套組(BD Biosciences, San Diego, CA)，收集經過再刺激24小時後之上清液，量測細胞介素。利用FACScalibur流式細胞儀評估螢光，且根據製造商之說明書分析數據。
可藉由標準51Cr釋放分析法評估細胞毒性。參見(例如) Milone等人，Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)。簡言之，在37℃下，使用51Cr (呈NaCrO4形式，New England Nuclear, Boston, MA)加載至靶細胞(例如，表現BCMA之K562系及初級多發性骨髓瘤細胞)上2小時，同時頻繁攪動，在完全RPMI中洗滌兩次，且平鋪於微量滴定板中。由效應T細胞與靶細胞依不同比率之效應細胞：靶細胞(E：T)，於孔中之完全RPMI中混合。亦製備僅含有培養基(自發釋放，SR)或triton-×100洗滌劑之1%溶液(總釋放，TR)的其他孔。在37℃下培育4小時後，收集每一孔之上清液。然後利用γ粒子計數器(Packard Instrument Co.，Waltham, MA)量測所釋放之51Cr。在每一條件下進行至少三重覆，且利用下式計算溶胞百分比：溶胞% = (ER− SR) / (TR - SR)，其中ER表示針對每一實驗條件釋放之平均51Cr。或者，亦可使用Bright-Glo™螢光素酶分析法評估細胞毒性。
可使用成像技術來評估CAR在帶有腫瘤之動物模型中之特定輸送及增殖。該等分析已闡述於(例如) Barrett等人，Human Gene Therapy 22:1575-1586 (2011)中。簡言之，向NOD/SCID/γc-/- (NSG)或其他免疫缺陷小鼠IV注射多發性骨髓瘤細胞，7天後，在用CAR構築體電穿孔4小時後，隨後注射BCMA CART細胞。用慢病毒構築體穩定轉染T細胞以表現螢火蟲螢光素酶，且使小鼠針對生物發光成像。或者，可如下量測多發性骨髓瘤異種移植物模型中單次注射CAR+ T細胞之治療效能及特異性：向NSG小鼠注射經轉導以穩定表現螢火蟲螢光素酶之多發性骨髓瘤細胞，之後在數天後單次尾靜脈注射經BCMA CAR電穿孔之T細胞。使動物在注射後之不同時間點成像。舉例而言，可產生在第5天(治療前2天)及第8天(CAR+ PBL後24 hr)代表性小鼠中之螢火蟲螢光素酶陽性腫瘤之光子密度熱圖。
或者，或與本文揭示之方法組合，揭示用於以下中之一或多者之方法及組合物：CAR表現細胞之檢測及/或量化(例如活體外或活體內(例如臨床監測))；免疫細胞擴增及/或活化；及/或CAR特異性選擇，其涉及使用CAR配體。在一個實例性實施例中，CAR配體係結合至CAR分子之抗體，例如結合至CAR之細胞外抗原結合結構域抗體(例如結合至抗原結合結構域之抗體，例如抗個體遺傳型抗體；或結合至細胞外結合結構域之恆定區之抗體) 在其他實施例中，CAR配體係CAR抗原分子(例如如本文所述CAR抗原分子)。
在一態樣中，揭示檢測及/或量化CAR表現細胞之方法。舉例而言，CAR配體可用於活體外或活體內檢測及/或量化CAR表現細胞(例如患者中CAR表現細胞之臨床監測，或投用患者)。該方法包括：
提供CAR配體(視情況，標記之CAR配體，例如包括標籤、珠粒、放射性或螢光標記之CAR配體)；
獲取CAR表現細胞(例如獲取含有CAR表現細胞之樣本，例如製造樣本或臨床樣本)；
在發生結合之條件下使CAR表現細胞與CAR配體接觸，藉此檢測存在之CAR表現細胞之含量(例如量)。CAR表現細胞與CAR配體之結合可使用標準技術(例如FACS、ELISA及諸如此類)檢測。
在另一態樣中，揭示擴增及/或活化細胞(例如免疫效應細胞)之方法。該方法包括：
提供CAR表現細胞(例如第一CAR表現細胞或瞬時表現CAR細胞)；
在發生免疫細胞擴增及/或增殖之條件下使該CAR表現細胞與CAR配體(例如如本文所述CAR配體)接觸，藉此產生活化及/或擴增之細胞群體。
在某些實施例中，CAR配體存在於(例如，固定或附著於基板，例如，非天然基板)。在一些實施例中，基板係非細胞基板。非細胞基板可為選自(例如)板(例如微量滴定板)、膜(例如硝化纖維膜)、基質、晶片或珠粒之固體載體。在實施例中，CAR配體存在於基板中(例如在基板表面上)。CAR配體可與基板共價或非共價(例如交聯)固定、連接或締合。在一個實施例中，CAR配體連接(例如共價連接)至珠粒。在上述實施例中，免疫細胞群體可活體外或離體擴增。該方法可以進一步包括在CAR分子之配體存在下例如使用本文所述任何方法培養免疫細胞群體。
在其他實施例中，擴增及/或活性細胞之方法進一步包含添加第二刺激性分子，例如CD28。舉例而言，CAR配體及第二刺激性分子可固定之基板(例如一或多個珠粒)，藉此提供增加之細胞擴增及/或活化。
在又一態樣中，提供用於選擇或富集CAR表現細胞之方法。該方法包括使CAR表達細胞與如本文所述CAR配體接觸；及基於CAR配體之結合選擇細胞。
在其他實施例中，提供用於清除、減少及/或殺死CAR表現細胞之方法。該方法包括使CAR表現細胞與如本文所述CAR配體接觸；並且基於CAR配體之結合，標靶細胞，藉此減少CAR表現細胞之數量及/或殺死CAR表現細胞。在一個實施例中，CAR配體與毒性劑(例如毒素或細胞消融藥物)偶聯。在另一實施例中，抗個體遺傳型抗體可引起效應細胞活性，例如，ADCC或ADC活性。
可用於本文揭示之方法之實例性抗CAR抗體闡述於以下中：WO 2014/190273及Jena等人，「Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials」, PLOS 2013年3月 8:3 e57838，其內容以引用方式併入。在一個實施例中，抗個體遺傳型抗體分子識別抗CD19抗體分子，例如，抗CD19 scFv。例如，抗個體遺傳型抗體分子可與Jena等人，PLOS 2013年3月 8:3 e57838中所述之CD19特異性CAR mAb純系號136.20.1競爭結合；可具有與CD19特異性CAR mAb純系號136.20.1相同之CDR (例如VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者，例如全部，使用Kabat定義、Chothia定義或Kabat及Chothia定義之組合)；可具有一或多個(例如2個)可變區作為CD19特異性CAR mAb純系號136.20.1，或可包含CD19特異性CAR mAb純系號136.20.1。在一些實施例中，抗個體遺傳型抗體係根據Jena等人中所述之方法製造。在另一實施例中，抗個體遺傳型抗體分子係WO 2014/190273中所述之抗個體遺傳型抗體分子。在一些實施例中，抗個體遺傳型抗體分子具有與WO 2014/190273之抗體分子(例如136.20.1)相同之CDR (例如VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者，例如全部)；可具有WO 2014/190273之抗體分子之一或多個(例如2個)可變區，或可包含WO 2014/190273之抗體分子(例如136.20.1)。在其他實施例中，抗CAR抗體結合至CAR分子之細胞外結合結構域之恆定區，例如如WO 2014/190273中所述。在一些實施例中，抗CAR抗體結合至CAR分子之細胞外結合結構域之恆定區，例如重鏈恆定區(例如CH2-CH3鉸鏈區)或輕鏈恆定區。例如，在一些實施例中，抗CAR抗體與WO 2014/190273中所述之2D3單株抗體競爭結合，具有與2D3相同之CDR (例如VH CDR1、VH CDR2、CH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3中之一或多者，例如全部)，或具有2D3之兩個或更多個(例如2個)可變區，或包含如WO 2014/190273中所述之2D3。
在一些態樣及實施例中，本文之組合物及方法對於T細胞之特定子集係最佳化的，例如，如2014年7月31日提出申請之美國系列號62/031,699中所述，其內容係全文以引用方式併入本文中。在一些實施例中，與對照T細胞(例如不同類型之表現相同構築體之T細胞(例如CD8+ 或CD4+ ))相比，T細胞之最佳化子集展示增強之持久性。
在一些實施例中，CD4+ T細胞包含本文所述CAR，該CAR包含適於CD4+ T細胞(例如對於其最佳化，例如導致增強之持久性)之細胞內信號傳導結構域，例如ICOS結構域。在一些實施例中，CD8+ T細胞包含本文所述CAR，該CAR包含適於CD8+ T細胞(例如對於其最佳化，例如導致增強之持久性)之細胞內信號傳導結構域，例如4-1BB結構域、CD28結構域或除ICOS結構域外之另一共刺激結構域。在一些實施例中，本文所述CAR包含本文所述抗原結合結構域，例如包含標靶BCMA之抗原結合結構域之CAR。
在一態樣中，本文闡述治療個體(例如患有癌症之個體)之方法。該方法包括向該個體投與有效量之以下物質：
1) 包含CAR之CD4+ T細胞(CARCD4+ )
其包含：
抗原結合結構域，例如本文所述抗原結合結構域，例如標靶BCMA之抗原結合結構域；
跨膜結構域；及
細胞內信號傳導結構域，例如第一共刺激結構域，例如ICOS結構域；及
2) 包含CAR之CD8+ T細胞(CARCD8+ )，其包含：
抗原結合結構域，例如本文所述抗原結合結構域，例如標靶BCMA之抗原結合結構域；
跨膜結構域；及
細胞內信號傳導結構域，例如第二共刺激結構域，例如4-1BB結構域、CD28結構域或除ICOS結構域外之另一共刺激結構域；
其中CARCD4+ 及CARCD8+ 彼此不同。
視情況，該方法進一步包括投與：
3) 包含CAR之第二CD8+ T細胞(第二CARCD8+ )，其包含：
抗原結合結構域，例如本文所述抗原結合結構域，例如特異性結合BCMA之抗原結合結構域；
跨膜結構域；及
細胞內信號傳導結構域，其中第二CARCD8+ 包含細胞內信號傳導結構域，例如不存在於CARCD8+ 上之共刺激信號傳導結構域，視情況不包含ICOS信號傳導結構域。
亦可使用其他分析(包括業內已知之彼等)評估本發明之BCMA CAR構築體。
治療性應用
BCMA 相關之疾病及 / 或病症
在一態樣中，本發明提供治療與BCMA表現相關之疾病之方法。在一態樣中，本發明提供用於治療疾病之方法，其中部分腫瘤對BCMA呈陰性且部分腫瘤對BCMA呈陽性。舉例而言，本發明之CAR可用於治療經歷與BCMA之升高表現相關之疾病的治療之個體，其中經歷針對BCMA之升高含量之治療的個體展現與BCMA之升高含量相關之疾病。在實施例中，本發明之CAR可用於治療經歷與BCMA表現相關之疾病的治療之個體，其中經歷與BCMA表現相關之治療的個體展現與BCMA表現相關之疾病。
在一個實施例中，本發明提供治療疾病之方法，其中BCMA在正常細胞及癌細胞上表現，但在正常細胞上以較低程度表現。在一個實施例中，該方法進一步包含選擇以如下親和力結合之本發明之CAR：容許BCMA CAR結合並殺死表現BCMA之癌細胞，但殺死少於30%、25%、20%、15%、10%、5%或更少表現BCMA之正常細胞，例如如藉由本文所述分析測定。舉例而言，可使用基於Cr51 CTL之殺死分析(例如流式細胞術)。在一個實施例中，BCMA CAR具有抗原結合結構域，該抗原結合結構域對靶抗原具有10-4 M至10-8 M、例如10-5 M至10-7 M、例如10-6 M或10-7 M之結合親和力KD。在一個實施例中，BCMA抗原結合結構域比參考抗體(例如本文所述抗體)之結合親和力小至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。
在一態樣中，本發明係關於用於在哺乳動物免疫效應細胞(例如，T細胞或NK細胞)中表現之包含可操作地連接至啟動子之BCMA CAR的載體。在一態樣中，本發明提供用於治療表現BCMA之腫瘤之表現BCMA CAR之重組免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)，其中表現BCMA CAR之重組免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)稱作BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)。在一態樣中，本發明之BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)能使腫瘤細胞與在其表面上表現之本發明之至少一種BCMA接觸，使得BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)標靶腫瘤細胞且抑制腫瘤生長。
在一態樣中，本發明係關於抑制表現BCMA之腫瘤細胞之生長的方法，其包含使腫瘤細胞與本發明之BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)接觸，使得因應抗原活化BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)且標靶癌細胞，其中抑制腫瘤生長。
在一態樣中，本發明係關於治療個體之癌症之方法。該方法包含向個體投與本發明之BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)，使得治療個體中之癌症。可藉由本發明之BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)治療之癌症之實例係與BCMA表現相關之癌症。
本發明包括向有需要之接受者輸注一類細胞療法，其中免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)經遺傳修飾以表現嵌合抗原受體(CAR)及BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)。所輸注細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。與抗體療法不同，CAR修飾之細胞(例如T細胞或NK細胞)能夠在活體內複製，從而產生可引起持續腫瘤控制之長期持久性。在各個態樣中，在將細胞(例如T細胞或NK細胞)投與患者後，投與患者之細胞(例如T細胞或NK細胞)或其子代在患者中持續至少4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、13個月、14個月、15個月、16個月、17個月、18個月、19個月、20個月、21個月、22個月、23個月、2年、3年、4年或5年。
本發明亦包括向有需要之接受者輸注一類細胞療法，其中免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)藉由(例如)活體外轉錄之RNA修飾以瞬時表現嵌合抗原受體(CAR)及免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)。所輸注細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。因此，在各個態樣中，在免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)投與患者後，投與患者之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)存在少於1個月，例如三週、兩週、一週。
不希望受限於任何具體理論，由CAR修飾之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)誘發之抗腫瘤免疫反應可為主動或被動免疫反應，或另一選擇為可歸因於直接對間接免疫反應。在一態樣中，CAR轉導之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)因應表現BCMA之人類癌細胞展現特異性促發炎細胞介素分泌及強效的細胞溶解活性，抵抗可溶性BCMA抑制，介導旁觀者殺死並介導已確立人類腫瘤之消退。例如，表現BCMA之腫瘤之異質場內的無抗原腫瘤細胞可能易受BCMA重定向免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)間接破壞之影響，該間接破壞係先前抵抗毗鄰抗原陽性癌細胞作出之反應。
在一態樣中，本發明之全人類CAR修飾之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)可係用於哺乳動物之離體免疫及/或活體內療法之一類疫苗。在一態樣中，哺乳動物係人類。
關於離體免疫，在將細胞投與哺乳動物之前在活體外進行以下中之至少一者：i) 擴增細胞，ii) 將編碼CAR之核酸引入細胞，或iii) 低溫保藏細胞。
離體程序為業內所熟知且更全面論述於下文中。簡言之，自哺乳動物(例如人類)分離細胞，且用表現本文所揭示CAR之載體進行遺傳修飾(例如活體外轉導或轉染)。可向哺乳動物接受者投與CAR修飾之細胞以提供治療益處。哺乳動物接受者可係人類，且CAR修飾之細胞可對於接受者而言可為自體的。或者，細胞對於接受者而言可係同種異體、同基因或異種。
造血幹細胞及祖細胞之離體擴增程序闡述於美國專利第5,199,942號中，該專利以引用方式併入本文中，該程序可應用於本發明之細胞。業內已知其他適宜方法，因此本發明並不限於任何具體的細胞離體擴增方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴增包含：(1) 自哺乳動物之外周血收穫物或骨髓外植體收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2) 離體擴增該等細胞。除美國專利第5,199,942號中所闡述之細胞生長因子外，可使用其他因子(例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體)來培養及擴增細胞。
除根據離體免疫利用基於細胞之疫苗外，本發明亦提供用於活體內免疫來誘發針對患者中之抗原之免疫反應的組合物及方法。
通常，如本文所闡述活化及擴增之細胞可用於治療及預防在免疫受損個體中產生之疾病。具體而言，本發明之CAR修飾之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)用於治療與BCMA表現相關之疾病、病症及病況。在某些態樣中，本發明細胞用於治療處於罹患與BCMA表現相關之疾病、病症及病況之風險的患者。因此，本發明提供治療或預防與BCMA表現相關之疾病、病症及病況的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明之CAR修飾之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)。
在一態樣中，本發明之CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)可用於治療增殖疾病，例如癌症或惡性病，或係癌前病況，例如骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群或白血病前期。在一態樣中，癌症係血液癌。血液癌症病況係癌症類型，例如影響血液、骨髓及淋巴系統之白血病及惡性淋巴球增生性病況。在一態樣中，血液癌症係白血病或血液病。與BCMA相關之疾病或病症之實例係多發性骨髓瘤(亦稱為MM) (參見Claudio等人，Blood . 2002, 100(6):2175-86；及Novak等人，Blood . 2004, 103(2):689-94)。多發性骨髓瘤(亦稱為漿細胞骨髓瘤或卡勒氏病(Kahler’s disease)係特徵在於異常或惡性漿B細胞在骨髓中累積之癌症。通常，癌細胞侵襲毗鄰骨，從而破壞骨骼結構且導致骨疼痛及破裂。骨髓瘤之大部分病例亦特徵在於產生副蛋白(亦稱為M蛋白或骨髓瘤蛋白)，其係由惡性漿細胞之純系增殖過量產生之異常免疫球蛋白。根據國際骨髓瘤工作組(IMWG)之診斷準則，血清副蛋白含量超過30g/L可診斷為多發性骨髓瘤(參見Kyle等人 (2009), Leukemia. 23:3-9)。多發性骨髓瘤之其他症狀或體徵包括腎功能下降或腎衰竭、骨病灶、貧血、高鈣血症及神經症狀。
用於區分多發性骨髓瘤與其他漿細胞增殖病症之準則已由國際骨髓瘤工作組確立(參見Kyle等人 (2009), Leukemia. 23:3-9)。必須滿足所有三個以下準則：
- 純系骨髓漿細胞 ≥10%
- 血清及/或尿單株蛋白之存在(患有真正非分泌多發性骨髓瘤之患者除外)
- 可歸因於潛在漿細胞增殖病症之終末器官損害之證據，具體為：
○ 高鈣血症：血清鈣 ≥11.5 mg/100 ml
○ 腎臟不足：血清肌酸酐 ＞ 1.73 mmol/l
○ 貧血：常色、正常紅血球，血紅素值＞2g/100 ml，低於正常下限，或血紅素值＜10g/100ml
○ 骨病灶：溶解病灶、嚴重骨量稀少或病理性破裂。
可藉由本文所述組合物及方法治療之其他漿細胞增殖病症包括(但不限於)無症狀骨髓瘤(燜燃型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤)、意義不明的單株丙種球蛋白病(MGUS)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤及多發性漿細胞瘤)、系統性類澱粉輕鏈類澱粉變性及POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群、高月病及PEP症候群)。
兩個分期系統用於多發性骨髓瘤之分期：國際分期系統(ISS)(參見Greipp等人 (2005), J. Clin. Oncol. 23 (15):3412-3420，其全部內容以引用方式併入本文中)及Durie-Salmon分期系統(DSS) (參見Durie等人 (1975), Cancer 36 (3): 842-854其全部內容以引用方式併入本文中)。兩個分期系統概述於下表中：
表 4. 用於多發性骨髓瘤之分期之分期系統
*Durie-Salmon分期系統亦包括指定腎功能狀態之亞分類。在期號之後添加「A」或「B」之名稱，其中「A」指示相對正常之腎功能(血清肌酸酐值＜2.0 mg/dL)，且B指示腎功能異常(血清肌酸酐值＞2.0 mg/dL)。
用於多發性骨髓瘤之第三分期系統稱為修訂之國際分期系統(R-ISS)(參見Palumbo A, Avet-Loiseau H, Oliva S等人 Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2015；33:2863-9，其全部內容以引用方式併入本文中)。R-ISS I期包括ISS I期(血清β2-微球蛋白含量＜ 3.5 mg/L且血清白蛋白含量≥ 3.5 g/dL)，無高風險CA [del(17p)及/或t(4；14)及/或t(14；16)]及正常LDH含量(小於正常值上限範圍)。R-ISS III期包括ISS III期(血清β2-微球蛋白含量＞ 5.5 mg/L)及高風險CA或高LDH含量。R-ISS II期包括所有其他可能之組合。
患者之反應可依據IMWG 2016準則確定，如以下中所揭示：Kumar S等人 International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346，其全部內容以引用方式併入本文中。表5提供IMWG 2016準則用於反應評估。
表 5. 用於反應評估之IMWG準則，包括用於最小殘存疾病(MRD)之準則
多發性骨髓瘤及相關疾病之標準治療包括化學療法、幹細胞移植(自體或同種異體)、放射療法及其他藥物療法。通常使用之抗骨髓瘤藥物包括烷基化劑(例如苯達莫司汀(bendamustine)、環磷醯胺及美法侖)、蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米)、皮質類固醇(例如地塞米松及普賴松(prednisone))及免疫調節劑(例如沙利竇邁及雷利竇邁或Revlimid®)或其任一組合。雙磷酸脂藥物亦通常與標準抗MM治療組合投與以治療骨損失。年齡大於65-70歲之患者不太可能係幹細胞移植之候選者。在一些情形下，雙自體幹細胞移植係年齡小於60歲之患者之選擇，對首次移植之次最佳反應。本發明之組合物及方法可與當前處方用於多發性骨髓瘤治療中之任一者組合投與。
多發性骨髓瘤之第一期治療係誘導療法。誘導療法之目標係減少骨髓中之漿細胞及由漿細胞產生之分子(例如蛋白質)的數目。誘導療法通常包含以下類型藥物中之2種或3種之組合：標靶療法、化學療法或皮質類固醇。
對於可進行幹細胞移植之患者之誘導療法
用於幹細胞移植之患者通常係70歲或更年輕且通常健康狀況良好。患者可進行誘導療法，之後係高劑量化學療法及幹細胞移植。誘導療法通常給予若干週期且可包括以下藥物中之一或多者：CyBorD方案 - 環磷醯胺(Cytoxan，Procytox)、硼替佐米(Velcade)及地塞米松(Decadron，Dexasone)；VRD方案 - 硼替佐米、雷利竇邁(Revlimid)及地塞米松；沙利竇邁(Thalomid)及地塞米松；雷利竇邁及低劑量地塞米松；硼替佐米及地塞米松；VTD方案 - 硼替佐米、沙利竇邁及地塞米松；硼替佐米、環磷醯胺及普賴松；硼替佐米、多柔比星(阿德力黴素(Adriamycin))及地塞米松；地塞米松；或脂質體多柔比星(Caelyx，Doxil)、長春新鹼(vincristine) (Oncovin)及地塞米松。
用於不可進行幹細胞移植之患者之誘導療法
不可進行幹細胞移植之患者可進行使用以下藥物中之一或多者之誘導療法：CyBorD方案 - 環磷醯胺、硼替佐米及地塞米松；雷利竇邁(Revlimid)及低劑量地塞米松；MPT方案 - 美法侖、普賴松及沙利竇邁；VMP方案 - 硼替佐米、美法侖及普賴松；MPL方案 - 美法侖、普賴松及雷利竇邁；美法侖及普賴松；硼替佐米及地塞米松；地塞米松；脂質體多柔比星、長春新鹼及地塞米松；沙利竇邁及地塞米松；VAD方案 - 長春新鹼、多柔比星及地塞米松；或VRD方案 - 硼替佐米、雷利竇邁及地塞米松。
與BCMA相關之疾病或病症之另一實例係霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤(參見Chiu等人，Blood . 2007, 109(2):729-39；He等人，J Immunol. 2004, 172(5):3268-79)。
霍奇金氏淋巴瘤(HL)，亦稱為霍奇金氏病，係起源於白血球或淋巴球之淋巴系統之癌症。包含淋巴瘤之異常細胞稱為Reed-Sternberg細胞。在霍奇金氏淋巴瘤中，癌症自一個淋巴結組傳播至另一淋巴結組。霍奇金氏淋巴瘤可基於Reed-Sternberg細胞形態及Reed-Sternberg細胞周圍之細胞組成(如藉由淋巴結生檢測定)細分為四種病理亞型：結節性硬化HL、混合細胞性亞型、富含淋巴球或淋巴球性為主型、淋巴球耗盡。一些霍奇金氏淋巴瘤亦可為結節性淋巴球為主型之霍奇金氏淋巴瘤，或可為未指明的。霍奇金氏淋巴瘤之症狀及體徵包括頸部、腋窩或腹股溝中之淋巴結無痛性腫脹；發熱；盜汗；體重減輕；疲勞；瘙癢或腹痛。
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)包含多組血癌，包括除霍奇金氏淋巴瘤以外之任何種類之淋巴瘤。非霍奇金氏淋巴瘤之亞型主要藉由細胞形態學、染色體畸變及表面標記物分類。NHL亞型(或NHL相關之癌症)包括B細胞淋巴瘤，例如但不限於柏基特淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病(B-CLL)、B細胞幼淋巴球性白血病(B-PLL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL) (例如血管內大B細胞淋巴瘤及原發性縱膈B細胞淋巴瘤)、濾泡性淋巴瘤(例如濾泡中心淋巴瘤、濾泡狀小型有裂隙細胞)、毛細胞白血病、高級B細胞淋巴瘤(柏基特氏樣)、淋巴漿細胞淋巴瘤(瓦登斯特隆巨球蛋白血症)、外套細胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤(例如結節外邊緣區B細胞淋巴瘤或黏膜相關之淋巴組織(MALT)淋巴瘤、結節邊緣區B細胞淋巴瘤及脾邊緣區B細胞淋巴瘤)、漿細胞瘤/骨髓瘤、前體B-淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤(PB-LBL/L)、原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤、原發性眼內淋巴瘤、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)；及T細胞淋巴瘤，例如但不限於退行發育性大細胞淋巴瘤(ALCL)、成人T細胞淋巴瘤/白血病(例如燜燃型、慢性、急性及淋巴瘤性)、血管中心性淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(例如蕈樣肉芽腫病、塞紮裡症候群(Sezary syndrome)等)、結節外天然殺手/T細胞淋巴瘤(鼻型)、腸病型腸T細胞淋巴瘤、大顆粒狀淋巴球白血病、前體T-淋巴母細胞性淋巴瘤/白血病(T-LBL/L)、T細胞慢性淋巴球性白血病/幼淋巴球性白血病(T-CLL/PLL)及未指定之外周T細胞淋巴瘤。霍奇金氏淋巴瘤之症狀及體徵包括頸部、腋窩或腹股溝中之淋巴結無痛性腫脹；發熱；盜汗；體重減輕；疲勞；瘙癢、腹痛、咳嗽或胸痛。
霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤之分期係相同的，且係指癌細胞在體內之擴散程度。在I期中，淋巴瘤細胞處於一個淋巴結組中。在II期中，淋巴瘤細胞存在於至少兩個淋巴結組中，但兩組皆在橫膈膜之同一側上，或在組織或器官之一部分中，及在橫膈膜之同一側上之該器官附近之淋巴結中。在III期中，淋巴瘤細胞在橫膈膜兩側上之淋巴結中，或在該等淋巴結組附近之組織或器官之一部分中或在脾臟中。在IV期中，在至少一個器官或組織之若干部分中發現淋巴瘤細胞，或淋巴瘤細胞在器官中且在橫膈膜之另一側上之淋巴結中。除了羅馬數字分期命名外，該等期亦可由字母A、B、E及S來闡述，其中A係指無症狀之患者，B係指具有症狀之患者，E係指其中在淋巴系統外之組織中發現淋巴瘤之患者，且S係指在脾中發現淋巴瘤之患者。
霍奇金氏淋巴瘤通常用放射療法、化學療法或造血幹細胞移植治療。非霍奇金氏淋巴瘤之最常見療法係R-CHOP，其由四種不同化學療法(環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼及潑尼松龍(prenisolone))及利妥昔單抗(rituximab) (Rituxan®)組成。常用於治療NHL之其他療法包括其他化學治療劑、放射療法、幹細胞移植(自體或同種異體骨髓移植)或生物療法(例如免疫療法)。生物治療劑之其他實例包括(但不限於)利妥昔單抗(Rituxan®)、托西莫單抗(tositumomab) (Bexxar®)、依帕珠單抗(epratuzumab) (LymphoCide®)及阿倫單抗(alemtuzumab) (MabCampath®)。本發明之組合物及方法可與當前處方用於霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤治療中之任一者組合投與。
BCMA表現亦與瓦登斯特隆巨球蛋白血症(WM) (亦稱為淋巴漿細胞淋巴瘤(LPL))相關。(參見Elsawa等人，Blood . 2006, 107(7):2882-8)。瓦登斯特隆巨球蛋白血症以前被認為與多發性骨髓瘤有關，但最近被歸類為非霍奇金氏淋巴瘤之亞型。WM之特徵在於不受控之B細胞淋巴球增殖，導致貧血並產生過量之副蛋白或免疫球蛋白M (IgM)，其使血液變稠並導致黏滯性過高症候群。WM之其他症狀或體徵包括發熱、盜汗、疲勞、貧血、體重減輕、淋巴結病或脾腫大、視力模糊、眩暈、鼻出血、牙齦出血、不尋常瘀傷、腎損害或衰竭、類澱粉變性或外周神經病變。
WM之標準治療由特別是利用利妥昔單抗(Rituxan®)之化學療法組成。可組合使用其他化學治療藥物，例如氮芥苯丁酸(Leukeran®)、環磷醯胺(Neosar®)、氟達拉濱(Fludara®)、克拉屈濱(cladribine) (Leustatin®)、長春新鹼及/或沙利竇邁。皮質類固醇(例如普賴松)亦可與化學療法組合投與。在患者之整個治療期間通常使用血漿去除或血漿交換，以藉由自血液去除副蛋白來緩解一些症狀。在一些情形下，幹細胞移植係某些患者之選擇。
與BCMA相關之疾病或病症之另一實例係腦癌。具體而言，BCMA之表現與星細胞瘤或神經膠母細胞瘤相關(參見Deshayes等人，Oncogene . 2004, 23(17):3005-12, Pelekanou等人，PLoS One .2013, 8(12):e83250)。星細胞瘤係由星狀細胞產生之腫瘤，星狀細胞係腦中之一類神經膠細胞。神經膠母細胞瘤(亦稱為多形性神經膠母細胞瘤或GBM)係星狀細胞瘤之最惡性形式，且被認為係腦癌最晚期(IV期)。神經膠母細胞瘤有兩個變體：巨細胞神經膠母細胞瘤及神經膠肉瘤。其他星細胞瘤包括青少年毛狀細胞星細胞瘤(JPA)、原纖維星細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤(PXA)、發育不良性神經上皮腫瘤(DNET)及分化不良星細胞瘤(AA)。
與神經膠母細胞瘤或星細胞瘤相關之症狀或體徵包括腦部壓力增加、頭痛、癲癇發作、記憶喪失、行為改變、身體一側運動或感覺喪失、語言功能障礙、認知損害、視力損害、噁心、嘔吐及手臂或腿部無力。
手術去除腫瘤(或切除術)係儘可能多地去除神經膠質瘤之標準治療，而不會對正常之周圍大腦造成損害或損害最小。放射療法及/或化學療法經常在手術後用於抑制及減緩任何剩餘之癌細胞或衛星病灶之復發性疾病。放射療法包括全腦放射療法(習用外線束輻射)、標靶三維適形放射療法及標靶放射性核種。常用於治療神經膠母細胞瘤之化學治療劑包括替莫唑胺(temozolomide)、吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)及順鉑。血管生成抑制劑(例如貝伐珠單抗(Bevacizumab) (Avastin®))亦通常與化學療法及/或放射療法組合使用。
支持性治療亦通常用於減輕神經症狀及改善神經功能，且與本文所述癌症療法中之任一者組合投與。主要支持劑包括抗痙攣劑及皮質類固醇。因此，本發明之組合物及方法可與標準或支持性治療中之任一者組合使用以治療神經膠母細胞瘤或星細胞瘤。
與BCMA表現相關之非癌症相關疾病及病症亦可藉由本文揭示之組合物及方法來治療。與BCMA表現相關之非癌症相關疾病及病症之實例包括(但不限於)：病毒感染；例如，HIV、真菌感染，例如新型隱球菌；腸易激病；潰瘍性結腸炎及與黏膜免疫性相關之疾病。
本發明之CAR修飾之免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)可單獨投與或作為醫藥組合物與稀釋劑及/或其他組分(例如IL-2或其他細胞介素或細胞群體)組合投與。
本發明提供用於治療癌症之組合物及方法。在一態樣中，癌症係血液癌，包括但不限於血液癌、白血病或淋巴瘤。在一態樣中，本發明之CAR表現細胞(例如CART細胞或CAR表現NK細胞)可用於治療癌症及惡性病，例如(但不限於)急性白血病，包括(但不限於)例如B細胞急性淋巴樣白血病(「BALL」)、T細胞急性淋巴樣白血病(「TALL」)、急性淋巴樣白血病(ALL)；一或多種慢性白血病，包括(但不限於)例如慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)；其他血液癌症或血液病況，包括(但不限於)例如B細胞前淋巴球性白血病、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、柏基特淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、毛細胞白血病、小細胞或大細胞濾泡性淋巴瘤、惡性淋巴組織增殖病況、MALT淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良及骨髓發育不良症候群、非霍奇金氏淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、漿細胞樣樹突狀細胞贅瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症及「白血病前期」(其係因骨髓樣血球之無效產生(或發育不良)集合在一起之血液病況之不同集合)及諸如此類。此外，與BCMA表現相關之疾病包括(但不限於，例如)表現BCMA之非典型及/或非典型癌症、惡性病、癌前病況或增殖疾病。
在實施例中，本文所述組合物可用於治療包括(但不限於)以下之疾病：漿細胞增殖病症，例如無症狀骨髓瘤(燜燃型多發性骨髓瘤或無痛骨髓瘤)、意義不明的單株丙種球蛋白病(MGUS)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症、漿細胞瘤(例如漿細胞惡液質、孤立性骨髓瘤、孤立性漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤及多發性漿細胞瘤)、系統性類澱粉輕鏈類澱粉變性及POEMS症候群(亦稱為克羅-富克斯症候群、高月病及PEP症候群)。
在實施例中，本文所述組合物可用於治療包括(但不限於)以下之疾病：癌症，例如本文所述癌症，例如前列腺癌(例如去勢抗性或治療抗性前列腺癌或轉移性前列腺癌)、胰臟癌或肺癌。
本發明亦提供抑制BCMA表現細胞群體增殖或減少BCMA表現細胞群體之方法，該等方法包含使包含BMCA表現細胞之細胞群體與本發明之結合至BCMA表現細胞之抗BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART細胞或BCMA CAR表現NK細胞)接觸。在具體態樣中，本發明提供抑制表現BCMA之癌細胞之群體增殖或減少表現BCMA之癌細胞之群體的方法，該等方法包含使BCMA表現癌細胞群體與本發明之結合至BCMA表現細胞之抗BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART細胞或BCMA CAR表現NK細胞)接觸。在一態樣中，本發明提供抑制表現BCMA之癌細胞之群體增殖或減少表現BCMA之癌細胞之群體的方法，該等方法包含使BCMA表現癌細胞群體與本發明之結合至BCMA表現細胞之抗BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART細胞或BCMA CAR表現NK細胞)接觸。在某些態樣中，在患有骨髓樣白血病或與表現BCMA之細胞相關之另一癌症之個體或該等疾病之動物模型中，本發明之抗BCMA CART表現細胞(例如BCMA CART細胞或BCMA CAR表現NK細胞)使細胞及/或癌細胞之量(quantity)、數量、量(amount)或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一態樣中，個體係人類。
本發明亦提供預防、治療及/或管控與BCMA表現細胞相關之疾病(例如表現BCMA之血液癌或非典型癌症)的方法，該等方法包含向有需要之個體投與本發明之結合至BCMA表現細胞之抗BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART細胞或BCMA CAR表現NK細胞)。在一態樣中，個體係人類。與BCMA表現細胞相關之病症之非限制性實例包括病毒或真菌感染及與黏膜免疫性有關之病症。
本發明亦提供預防、治療及/或管控與BCMA表現細胞相關之疾病的方法，該等方法包含向有需要之個體投與本發明之結合至BCMA表現細胞之抗BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART細胞或BCMA CAR表現NK細胞)。在一態樣中，個體係人類。
本發明提供預防與BCMA表現細胞相關之癌症復發的方法，該等方法包含向有需要之個體投與本發明之結合至BCMA表現細胞之抗BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART細胞或BCMA CAR表現NK細胞)。在一態樣中，該等方法包含向有需要之個體投與有效量之本文所述結合至BCMA表現細胞之抗BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART細胞或BCMA CAR表現NK細胞)與有效量之另一療法的組合。
使用生物標記物評估 CAR- 有效性、個體適合性或樣本適合性之方法
在另一態樣中，本發明之特徵在於評估或監測CAR表現細胞療法(例如BCMA CAR療法)在個體(例如患有諸如血液癌症等癌症之個體)中之有效性、或樣本(例如血球分離樣本)對CAR療法(例如BCMA CAR療法)之適合性的方法。該方法包括獲取CAR療法之有效性、個體適合性或樣本適合性的值，其中該值指示CAR表現細胞療法之有效性或適合性。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，CAR表現細胞療法包含複數個(例如群體) CAR表現免疫效應細胞，例如複數個(例如群體) T細胞或NK細胞或其組合。在一個實施例中，CAR表現細胞療法係BCMACAR療法。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，在接受CAR表現細胞療法之前、期間或接受之後對個體進行評估。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，反應者(例如完全反應者)具有或鑑別為具有與無反應者相比更大之GZMK、PPF1BP2或幼稚T細胞中之一者、兩者或更多者(全部)之含量或活性。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與反應者相比更大之IL22、IL-2RA、IL-21、IRF8、IL8、CCL17、CCL22、效應T細胞或調控性T細胞中之一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者或更多者(例如全部)之含量或活性。
在實施例中，復發者係具有或鑑別為具有與非復發者相比增加之以下基因MIR199A1、MIR1203、uc021ovp、ITM2C及HLA-DQB1之一或多者(例如2者、3者、4者或全部)之表現程度及/或降低之以下基因PPIAL4D、TTTY10、TXLNG2P、MIR4650-1、KDM5D、USP9Y、PRKY、RPS4Y2、RPS4Y1、NCRNA00185、SULT1E1及EIF1AY之一或多者(例如2者、3者、4者、5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者或全部)之表現程度的患者。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之免疫細胞耗竭標記物，例如一種、兩種或更多種免疫檢查點抑制劑(例如PD-1、PD-L1、TIM-3及/或LAG-3)。在一個實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與來自反應者之表現PD-1或LAG-3之免疫效應細胞之百分比相比更大百分比之表現PD-1、PD-L1或LAG-3之免疫效應細胞(例如CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞)(例如表現CAR之CD4+細胞及/或CD8+ T細胞)。
在一個實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之具有耗竭表型之免疫細胞，例如共表現至少兩個耗竭標記物、例如共表現PD-1、PD-L1及/或TIM-3之免疫細胞。在其他實施例中，無反應者具有或鑑別為具有更大百分比之具有耗竭表型之免疫細胞，例如共表現至少兩個耗竭標記物、例如共表現PD-1及LAG-3之免疫細胞。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為與針對CAR表現細胞療法之反應者(例如完全反應者)相比在CAR表現細胞群體(例如BCMACAR+ 細胞群體)中具有更大百分比之PD-1/ PD-L1+/LAG-3+細胞。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，部分反應者具有或鑑別為在CAR表現細胞群體(例如BCMACAR+ 細胞群體)中具有比反應者更大百分比之PD-1/ PD-L1+/LAG-3+細胞。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有PD1/ PD-L1+ CAR+之耗竭表型且共表現CAR表現細胞群體(例如BCMACAR + 細胞群體)中之LAG3。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，無反應者具有或鑑別為具有與反應者(例如完全反應者)相比在CAR表現細胞群體(例如BCMACAR + 細胞群體)中具有更大百分比之PD-1/ PD-L1+/TIM-3+細胞。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，部分反應者具有或鑑別為在CAR表現細胞群體(例如BCMACAR + 細胞群體)中具有比反應者更高百分比之PD-1/ PD-L1+/TIM-3+細胞。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，血球分離樣本中存在CD8+ CD27+ CD45RO- T細胞係對CAR表現細胞療法(例如BCMACAR療法)反應之個體之陽性預測因子。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，血球分離樣本中高百分比之PD1+ CAR+及LAG3+或TIM3+ T細胞細胞係對CAR表現細胞療法(例如BCMACAR療法)反應之個體之較差預後預測因子。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，反應者(例如完全或部分反應者)具有以下特性中之一者、兩者、三者或更多者(或全部)：
(i)與參照值(例如，CD27+免疫效應細胞之無反應者數目)相比，具有更大數目之CD27+免疫效應細胞；
(ii) 與參照值(例如，CD8+ T細胞之無反應者數目)相比，具有更大數目之CD8+ T細胞；
(iii) 與參照值(例如，表現一或多種檢查點抑制劑之細胞之無反應者數目)相比，具有較低數目之表現一或多種檢查點抑制劑(例如，選自PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或KLRG-1或組合之檢查點抑制劑)的免疫細胞；或
(iv) 與參照值(例如，休止TEFF 細胞、休止TREG 細胞、幼稚CD4細胞、未刺激之記憶細胞或早期記憶T細胞之無反應者數目)相比，具有更大數目之休止TEFF 細胞、休止TREG 細胞、幼稚CD4細胞、未刺激之記憶細胞或早期記憶T細胞或其組合中的一者、兩者、三者、四者或更多者(全部)。
在本文揭示之方法中之任一者之一些實施例中，(vi)之細胞介素含量或活性係選自細胞介素CCL20/MIP3a、IL17A、IL6、GM-CSF、IFN-γ、IL10、IL13、IL2、IL21、IL4、IL5、IL9或TNFα或其組合中之一者、兩者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或更多者(例如全部)。細胞介素可選自IL-17a、CCL20、IL2、IL6或TNFa中之一者、兩者、三者、四者或更多者(全部)。在一個實施例中，細胞介素之增加含量或活性係選自IL-17a及CCL20中之一者或二者，指示增加之反應或降低之復發。
在實施例中，可根據臨床準則進一步評估藉由本文方法鑑別之反應者、無反應者、復發者或非復發者。舉例而言，完全反應者患有或鑑別為患有疾病，例如癌症，其展現對治療之完全反應，例如完全緩解。完全反應可使用(例如)NCCN Guidelines® 或Cheson等人，J Clin Oncol 17:1244 (1999)及Cheson等人，「Revised Response Criteria for Malignant Lymphoma」, J Clin Oncol 25:579-586 (2007) (二者之全部內容皆以引用方式併入本文中)鑑別，如本文所述。部分反應者患有疾病(例如癌症)或鑑別為患有疾病(例如癌症)之個體，其展現對治療之部分反應，例如部分緩解。部分反應可利用例如如本文所述之NCCN Guidelines® 或Cheson準則來鑑別。無反應者患有疾病(例如癌症)或鑑別為患有疾病(例如癌症)之個體，其對治療展現反應，例如，患者患有穩定疾病或進行性疾病。無反應者可利用例如如本文所述之Cheson準則來鑑別。
或者，或與方法之本文揭示之相結合，響應該值，實施以下中之一者、二者、三者、四者或更多者：
向(例如)反應者或非復發者投與CAR表現細胞療法；
投與改變劑量之CAR表現細胞療法；
改變CAR表現細胞療法之時間表或時程；
向(例如)無反應者或部分反應者投與與CAR表現細胞療法組合之額外藥劑，例如檢查點抑制劑，例如本文所述檢查點抑制劑；
在用CAR表現細胞療法治療之前，向無反應者或部分反應者投與增加個體中較年輕之T細胞之數目之療法；
修改CAR表現細胞療法之製造過程，例如，在引入編碼CAR之核酸之前富集較年輕之T細胞、或增加例如鑑別為無反應者或部分反應者之個體的轉導效率；
向(例如)無反應者或部分反應者或復發者投與替代療法；或
若個體係或鑑別為無反應者或復發者，則例如藉由一或多種CD25清除、投與環磷醯胺、抗GITR抗體或其組合減少TREG 細胞群體及/或TREG 基因印記。
在某些實施例中，用抗GITR抗體預治療個體。在某些實施例中，在輸注或再輸注之前用抗GITR抗體治療個體。
組合療法
本文所闡述之CAR表現細胞可與其他已知藥劑及療法組合使用。如本文所用之「組合」投與意指，在個體患病期間將兩種(或更多種)不同治療遞送至個體，例如在個體已經診斷患有病症之後且在病症治癒或消除之前或治療已出於其他原因停止之前遞送兩種或更多種治療。在一些實施例中，一種治療之遞送仍在第二種治療開始遞送時進行，以使得存在投與重疊。這在本文中有時稱作「同時」或「並行遞送」。在其他實施例中，一種治療在開始遞送另一種治療之前結束遞送。在任一情形的一些實施例中，治療因組合投與而更為有效。例如，與不存在第一治療時投與第二治療所觀察者相比，第二治療更有效，例如，利用更少第二治療觀察到等效效應，或第二治療更大程度地減少症狀，或利用第一治療觀察到類似情況。在一些實施例中，遞送使得症狀或與病症相關的其他參數的減輕程度比利用在不存在另一種治療的情況下遞送一種治療所觀察到的減輕程度更高。兩次治療之效應可為部分加和、完全加和或大於加和。遞送可使得當遞送第二治療時仍可檢測所遞送的第一治療的作用。
本文所闡述之表現CAR之細胞與至少一種其他治療劑可以同一或單獨組合物同步或依序投與。對於依序投與，可首先投與本文所述之CAR表現細胞，且可其次投與另一藥劑，或可顛倒投與順序。
CAR療法及/或其他治療劑、程序或模式可在活性病症時段期間或在緩解或活性較低之疾病時段期間投與。CAR療法可在另一治療之前、與該治療同時、在治療後或在病症緩解期間投與。
在組合投與時，抗CAR療法及額外藥劑(例如，第二或第三藥劑)或所有皆可以高於、低於或等於每一藥劑個別使用(例如作為單一療法)之量或劑量的量或劑量來投與。在某些實施例中，CAR療法、額外藥劑(例如，第二或第三藥劑)或所有之所投與量或劑量低於(例如，低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)個別使用(例如，作為單一療法)之每一藥劑的量或劑量。在其他實施例中，CAR療法、額外藥劑(例如，第二或第三藥劑)或所有之產生期望效應(例如，治療癌症)之量或劑量低於(例如，低至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)個別使用(例如，作為單一療法)之每一藥劑達成相同治療效應所需的量或劑量。
CD19 CAR
在一些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法係與CD19 CAR表現細胞療法組合投與。
在一個實施例中，CD19 CAR之抗原結合結構域具有與Nicholson等人，Mol. Immun. 34 (16-17): 1157-1165 (1997)中所述之FMC63 scFv片段相同或類似之結合特異性。在一個實施例中，CD19 CAR之抗原結合結構域包括Nicholson等人，Mol. Immun . 34 (16-17): 1157-1165 (1997)中所述之scFv片段。
在一些實施例中，CD19 CAR包括根據以引用方式併入本文中之WO2014/153270之表3的抗原結合結構域(例如人類化抗原結合結構域)。WO2014/153270亦闡述分析各種CAR構築體之結合及效能的方法。
在一態樣中，親代鼠類scFv序列係PCT公開案WO2012/079000 (以引用方式併入本文中)中提供之CAR19構築體。在一個實施例中，抗CD19結合結構域係WO2012/079000中所述之scFv。
在一個實施例中，CAR分子包含PCT公開案WO2012/079000中提供為SEQ ID NO: 12之融合多肽序列，其提供鼠類來源之特異性結合至人類CD19之scFv片段。
在一個實施例中，CD19 CAR包含在PCT公開案WO2012/079000中提供為SEQ ID NO: 12之胺基酸序列。在實施例中，胺基酸序列係
(MALPVTALLLPLALLLHAARP)diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 290)，或與其實質上同源之序列。信號肽之可選序列示於大寫字母及括號中。
在一個實施例中，胺基酸序列係：
Diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr (SEQ ID NO: 291)，或與其實質上同源之序列。
在一個實施例中，CD19 CAR具有USAN名稱TISAGENLECLEUCEL-T。在實施例中，CTL019係藉由T細胞之基因修飾來製備，該基因修飾係在EF-1 α啟動子之控制下經由用含有CTL019轉基因之自我失活之複製缺陷慢病毒(LV)載體轉導藉由穩定插入來介導。CTL019可為基於轉基因陽性T細胞百分比遞送至個體之轉基因陽性及陰性T細胞的混合物。
在其他實施例中，CD19 CAR包含根據以引用方式併入本文中之WO2014/153270之表3的抗原結合結構域(例如人類化抗原結合結構域)。
鼠類CD19抗體之人類化期望用於臨床環境，其中小鼠特異性殘基可在接受CART19治療(即，使用經CAR19構築體轉導之T細胞治療)之患者中誘導人類抗小鼠抗原(HAMA)反應。人類化CD19 CAR序列之產生、表徵及效能闡述於國際申請案WO2014/153270 (其全部內容以引用方式併入本文中) (包括實例1-5 (第115-159頁))中。
在一些實施例中，CD19 CAR構築體闡述於以引用方式併入本文中之PCT公開案WO 2012/079000中，且鼠類CD19 CAR及scFv構築體之胺基酸序列示於下表6中，或與上述序列中之任一者實質上一致(例如與本文所述序列中之任一者具有至少85%、90%、95%或更大一致性)的序列
表6.CD19 CAR構築體
SEQ ID NO 區 序列
CTL019
SEQ ID NO: 292 CTL019全胺基酸序列 MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 293 CTL019全核苷酸序列 ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAGATCACAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
SEQ ID NO: 294 CTL019 scFv結構域 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
mCAR1
SEQ ID NO: 295 mCAR1 scFv QVQLLESGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYSCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTGGGSGGGSGGGSGGGSELVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQYNRYPYTSFFFTKLEIKRRS
SEQ ID NO: 296 mCAR1全胺基酸序列 QVQLLESGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYSCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTGGGSGGGSGGGSGGGSELVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQYNRYPYTSFFFTKLEIKRRSKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
mCAR2
SEQ ID NO: 297 mCAR2 scFv DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSE
SEQ ID NO: 298 mCAR2胺基酸序列 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRL
SEQ ID NO: 299 mCAR2全胺基酸序列 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRLEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPRMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
mCAR3
SEQ ID NO: 300 mCAR3 scFv DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO: 301 mCAR3全胺基酸序列 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SSJ25-C1
SEQ ID NO: 302 SSJ25-C1 VH序列 QVQLLESGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYSCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVT
SEQ ID NO: 303 SSJ25-C1 VL ELVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFYFCQYNRYPYTSGGGTKLEIKRRS
人類化 CAR1
SEQ ID NO: 304 CAR1 scFv結構域 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 305 CAR 1 -全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR2
SEQ ID NO: 306 CAR2 scFv結構域- aa (連接體加下劃線) EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGS QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 307 CAR2 scFv結構域- nt atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagccaccaccatcatcaccatcaccat
SEQ ID NO: 308 CAR 2 -全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 309 CAR 2 -全- nt atggccctccctgtcaccgccctgctgcttccgctggctcttctgctccacgccgctcggcccgaaattgtgatgacccagtcacccgccactcttagcctttcacccggtgagcgcgcaaccctgtcttgcagagcctcccaagacatctcaaaataccttaattggtatcaacagaagcccggacaggctcctcgccttctgatctaccacaccagccggctccattctggaatccctgccaggttcagcggtagcggatctgggaccgactacaccctcactatcagctcactgcagccagaggacttcgctgtctatttctgtcagcaagggaacaccctgccctacacctttggacagggcaccaagctcgagattaaaggtggaggtggcagcggaggaggtgggtccggcggtggaggaagccaggtccaactccaagaaagcggaccgggtcttgtgaagccatcagaaactctttcactgacttgtactgtgagcggagtgtctctccccgattacggggtgtcttggatcagacagccaccggggaagggtctggaatggattggagtgatttggggctctgagactacttactaccaatcatccctcaagtcacgcgtcaccatctcaaaggacaactctaagaatcaggtgtcactgaaactgtcatctgtgaccgcagccgacaccgccgtgtactattgcgctaagcattactattatggcgggagctacgcaatggattactggggacagggtactctggtcaccgtgtccagcaccactaccccagcaccgaggccacccaccccggctcctaccatcgcctcccagcctctgtccctgcgtccggaggcatgtagacccgcagctggtggggccgtgcatacccggggtcttgacttcgcctgcgatatctacatttgggcccctctggctggtacttgcggggtcctgctgctttcactcgtgatcactctttactgtaagcgcggtcggaagaagctgctgtacatctttaagcaacccttcatgaggcctgtgcagactactcaagaggaggacggctgttcatgccggttcccagaggaggaggaaggcggctgcgaactgcgcgtgaaattcagccgcagcgcagatgctccagcctacaagcaggggcagaaccagctctacaacgaactcaatcttggtcggagagaggagtacgacgtgctggacaagcggagaggacgggacccagaaatgggcgggaagccgcgcagaaagaatccccaagagggcctgtacaacgagctccaaaaggataagatggcagaagcctatagcgagattggtatgaaaggggaacgcagaagaggcaaaggccacgacggactgtaccagggactcagcaccgccaccaaggacacctatgacgctcttcacatgcaggccctgccgcctcgg
SEQ ID NO: 310 CAR2 - 可溶性scFv - aa MALPVTALLLPLALLLHAARP eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss hhhhhhhh
人類化 CAR3
SEQ ID NO: 311 CAR3 scFv結構域 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 312 CAR 3 -全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR4
SEQ ID NO: 313 CAR4 scFv結構域 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 314 CAR 4 -全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR5
SEQ ID NO: 315 CAR5 scFv結構域 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 316 CAR 5 -全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR6
SEQ ID NO: 317 CAR6 scFv結構域 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 318 CAR6 - 全 - aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR7
SEQ ID NO: 319 CAR7 scFv結構域 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 320 CAR 7全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYSSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR8
SEQ ID NO: 321 CAR8 scFv結構域 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 322 CAR 8 -全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYQSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR9
SEQ ID NO: 323 CAR9 scFv結構域 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 324 CAR 9 -全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR10
SEQ ID NO: 325 CAR10 scFv結構域 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 326 CAR 10全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR11
SEQ ID NO: 327 CAR11 scFv結構域 EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 328 CAR 11全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
人類化 CAR12
SEQ ID NO: 329 CAR12 scFv結構域 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 330 CAR 12 -全- aa MALPVTALLLPLALLLHAARPEIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISKYLNWYQQKPGQAPRLLIYHTSRLHSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSSLKSRVTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
鼠類 CART19
SEQ ID NO: 331 HCDR1 (Kabat) DYGVS
SEQ ID NO: 332 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYNSALKS
SEQ ID NO: 333 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY
SEQ ID NO: 334 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN
SEQ ID NO: 335 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS
SEQ ID NO: 336 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT
人類化 CART19 a
SEQ ID NO: 337 HCDR1 (Kabat) DYGVS
SEQ ID NO: 338 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYSSSLKS
SEQ ID NO: 339 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY
SEQ ID NO: 340 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN
SEQ ID NO: 341 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS
SEQ ID NO: 342 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT
人類化 CART19 b
SEQ ID NO: 343 HCDR1 (Kabat) DYGVS
SEQ ID NO: 344 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYQSSLKS
SEQ ID NO: 345 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY
SEQ ID NO: 346 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN
SEQ ID NO: 347 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS
SEQ ID NO: 348 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT
人類化 CART19 c
SEQ ID NO: 349 HCDR1 (Kabat) DYGVS
SEQ ID NO: 350 HCDR2 (Kabat) VIWGSETTYYNSSLKS
SEQ ID NO: 351 HCDR3 (Kabat) HYYYGGSYAMDY
SEQ ID NO: 352 LCDR1 (Kabat) RASQDISKYLN
SEQ ID NO: 353 LCDR2 (Kabat) HTSRLHS
SEQ ID NO: 354 LCDR3 (Kabat) QQGNTLPYT
含有人類化抗CD19 scFv結構域之CD19 CAR構築體闡述於以引用方式併入本文中之PCT公開案WO 2014/153270中。
抗CD19 scFv結構域之鼠類及人類化CDR序列之序列對於重鏈可變結構域示於表7中且對於輕鏈可變結構域示於表8中。SEQ ID NO係指表6中發現之彼等。
表7. CD19抗體之重鏈可變結構域CDR (Kabat) SEQ ID NO
表8. CD19抗體之輕鏈可變結構域CDR (Kabat) SEQ ID NO
可根據本發明使用業內任何已知CD19 CAR (例如任何已知CD19 CAR之CD19抗原結合結構域)。舉例而言，LG-740；CD19 CAR，其闡述於以下中：美國專利第8,399,645號；美國專利第7,446,190號；Xu等人，Leuk Lymphoma. 2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人，Blood 122(17):2965-2973 (2013)；Brentjens等人，Blood, 118(18):4817-4828 (2011)；Kochenderfer等人，Blood 116(20):4099-102 (2010)；Kochenderfer等人，Blood 122 (25):4129-39(2013)；及第16次Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (5月15-18日，Salt Lake City) 2013年，Abst 10。
實例性CD19 CAR包括例如本文所述一或多個表中之本文所述CD19 CAR，或以下中所述之抗CD19 CAR：Xu等人 Blood 123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人 Blood 122.25(2013):4129-39, Cruz等人 Blood 122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207，其各自係全文以引用方式併入本文中。
化學治療劑
在一些實施例中，BCMA CAR表現細胞療法係與化學治療劑組合投與。實例性化學治療劑包括蒽環(例如，多柔比星(例如，脂質體多柔比星))；長春花生物鹼(例如，長春鹼、長春新鹼、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine))；烷基化劑(例如，環磷醯胺、達卡巴嗪、美法侖、異環磷醯胺、替莫唑胺)；免疫細胞抗體(例如，阿倫單抗、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗、托西莫單抗)；抗代謝物(包括例如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷去胺酶抑制劑(例如，氟達拉濱))；mTOR抑制劑；TNFR糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)激動劑；蛋白酶體抑制劑(例如，阿克拉黴素A (aclacinomycin A)、黴膠毒素或硼替佐米)；免疫調節劑，例如沙利竇邁或沙利竇邁衍生物(例如，雷利竇邁)。
考慮用於組合療法中之一般化學治療劑包含阿那曲唑(anastrozole) (Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide) (Casodex®)、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate) (Blenoxane®)、白消安(busulfan) (Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine) (Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(carboplatin) (Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine) (BiCNU®)、氯芥苯丁酸(Leukeran®)、順鉑(Platinol®)、克拉屈濱(Leustatin®)、環磷醯胺(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside) (Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(DTIC-Dome®)、更生黴素(放線菌素D，Cosmegan)、道諾黴素鹽酸鹽(daunorubicin hydrochloride) (Cerubidine®、檸檬酸道諾黴素(daunorubicin citrate)脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松、多西紫杉醇(docetaxel) (Taxotere®)、多柔比星鹽酸鹽(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate) (Fludara®)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil) (Adrucil®、Efudex®)、氟利坦(flutamide) (Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(Gemcitabine) (雙氟去氧胞苷)、羥基脲(hydroxyurea) (Hydrea®)、艾達黴素(Idarubicin) (Idamycin®)、異環磷醯胺(ifosfamide) (IFEX®)、伊立替康(irinotecan) (Camptosar®)、L-天門冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲硫四氫葉酸鈣、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、胺甲蝶呤(methotrexate) (Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone) (Novantrone®)、滅髓瘤(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel) (Taxol®)、菲尼克斯(phoenix) (釔90/MX-DTPA)、噴司他汀(pentostatin)、聚苯丙生20 (polifeprosan 20)與卡莫司汀植入物(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate) (Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide) (Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine)、注射用托泊替坎鹽酸鹽(topotecan hydrochloride) (Hycamptin®)、長春花鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞濱(Navelbine®)。
實例性烷基化劑包括(但不限於)氮芥、乙烯亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲及三氮烯)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Mustard®、Chlorethaminacil®、Demethyldopan®、Desmethyldopan®、Haemanthamine®、Nordopan®、Uracil nitrogen mustard®、Uracillost®、Uracilmostaza®、Uramustin®、Uramustine®)、甲川氯(chlormethine，Mustargen®)、環磷醯胺(Cytoxan®、Neosar®、Clafen®、Endoxan®、Procytox®、RevimmuneTM )、異環磷醯胺(Mitoxana®)、美法侖(Alkeran®)、氮芥苯丁酸(Leukeran®)、哌血生(pipobroman，Amedel®、Vercyte®)、三乙烯三聚氰胺(Hemel®、Hexalen®、Hexastat®)、三乙烯磷醯胺、替莫唑胺(Temodar®)、噻替派(Thioplex®)、白消安(Busilvex®、Myleran®)、卡莫司汀(BiCNU®)、洛莫司汀(lomustine，CeeNU®)、鏈脲菌素(streptozocin，Zanosar®)及達卡巴嗪(DTIC-Dome®)。其他實例性烷基化劑包括(但不限於)奧利沙鉑(Oxaliplatin，Eloxatin®)；替莫唑胺(Temodar®及Temodal®)；放線菌素(亦稱為放線菌素-D，Cosmegen®)；美法侖(亦稱為L-PAM、L-沙可來新(sarcolysin)及苯丙胺酸氮芥，Alkeran®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲基三聚氰胺(HMM)，Hexalen®)；卡莫司汀(BiCNU®)；苯達莫斯汀(Bendamustine，Treanda®)；白消安(Busulfex®及Myleran®)；卡鉑(Paraplatin®)；洛莫司汀(亦稱為CCNU、CeeNU®)；順鉑(亦稱為CDDP、Platinol®及Platinol®-AQ)；氮芥苯丁酸(Leukeran®)；環磷醯胺(Cytoxan®及Neosar®)；達卡巴嗪(亦稱為DTIC、DIC及咪唑甲醯胺，DTIC-Dome®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲基三聚氰胺(HMM)、Hexalen®)；異環磷醯胺(Ifex®)；普瑞斯汀(Prednumustine)；丙卡巴肼(Matulane®)；甲基二氯乙胺(亦稱為氮芥、莫斯汀(mustine)及甲基二氯乙胺鹽酸鹽，Mustargen®)；鏈脲菌素(Zanosar®)；噻替派(亦稱為硫代磷醯胺、TESPA及TSPA，Thioplex®)；環磷醯胺(Endoxan®、Cytoxan®、Neosar®、Procytox®、Revimmune®)；及苯達莫斯汀HCl (Treanda®)。
實例性mTOR抑制劑包括(例如)替西羅莫司(temsirolimus)；瑞達福羅莫司(ridaforolimus) (先前稱作地磷莫司(deferolimus))，(1R ,2R ,4S )-二甲基亞磷酸4-[(2R )-2 [(1R ,9S ,12S ,15R ,16E ,18R ,19R ,21R ,23S ,24E ,26E ,28Z ,30S ,32S ,35R )-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23, 29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9 ]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669，且闡述於PCT公開案第WO 03/064383號中)；依維莫司(everolimus) (Afinitor®或RAD001)；雷帕黴素(AY22989，Sirolimus®)；塞馬莫德(simapimod) (CAS 164301-51-3)；青黴西羅莫司(emsirolimus)，(5-{2,4-雙[(3S )-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反式- 4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d ]嘧啶-7(8H )-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；及N 2 -[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H -1-苯并吡喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-(SEQ ID NO: 355)內鹽(SF1126，CAS 936487-67-1)；及XL765。
實例性免疫調節劑包括例如阿福圖珠單抗(afutuzumab) (可以Roche®購得)；聚乙二醇非格司亭(pegfilgrastim) (Neulasta®)；雷利竇邁(CC-5013，Revlimid®)；沙利竇邁(Thalomid®)、艾迪美(actimid) (CC4047)；及IRX-2 (人類細胞介素(包括介白素1、介白素2及干擾素γ)之混合物，CAS 951209-71-5，購自IRX Therapeutics)。
實例性蒽環包括例如多柔比星(Adriamycin®及Rubex®)；博來黴素(lenoxane®)；道諾黴素(鹽酸道諾黴素、道諾黴素及鹽酸紅比黴素(rubidomycin hydrochloride)，Cerubidine®)；道諾黴素脂質體(檸檬酸道諾黴素脂質體，DaunoXome®)；米托蒽醌(DHAD，Novantrone®)；泛艾黴素(epirubicin，Ellence™)；伊達比星(idarubicin，Idamycin®，Idamycin PFS®)；絲裂黴素C (Mutamycin®)；格爾德黴素(geldanamycin)；除莠黴素(herbimycin)；近灰黴素(ravidomycin)；及去乙醯拉維黴素(desacetylravidomycin)。
實例性長春花生物鹼包括例如酒石酸長春瑞濱(Navelbine®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春地辛(Eldisine®))；長春鹼(亦稱為硫酸長春鹼、長春花鹼(vincaleukoblastine)及VLB，Alkaban-AQ®及Velban®)；及長春瑞濱(Navelbine®)。
實例性蛋白體抑制劑包括硼替佐米(Velcade®)；卡非佐米(carfilzomib，PX-171-007，(S )-4-甲基-N -((S )-1-(((S )-4-甲基-1-((R )-2-甲基環氧乙烷-2-基)-1-側氧基戊-2-基)胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)-2-((S )-2-(2-嗎啉基乙醯胺基)-4-苯基丁醯胺基)-戊醯胺)；馬瑞佐米(marizomib，NPI-0052)；檸檬酸阿西咗脒(ixazomib citrate，MLN-9708)；德蘭佐米(delanzomib，CEP-18770)；及O -甲基-N -[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-絲胺醯基-O -甲基-N -[(1S )-2-[(2R )-2-甲基-2-環氧乙烷基]-2-側氧基-1-(苯基甲基)乙基]-L-絲胺醯胺(ONX-0912)。
生物聚合物遞送方法
在一些實施例中，可經由生物聚合物支架(例如生物聚合物植入物)如本文揭示之一或多個CAR表現細胞投與或遞送至個體。生物聚合物支架可支持或增強本文所述CAR表現細胞之遞送、擴增及/或分散。生物聚合物支架包含可為天然或合成之生物相容性(例如，實質上不引起發炎性或免疫反應)及/或生物可降解聚合物。
適宜生物聚合物之實例包括(但不限於)任何濃度及任何比率之瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鹽、海藻酸鹽/磷酸鈣水泥(CPC)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、(1,2,3,4,6-五乙醯基a-D-半乳糖)、纖維素、甲殼質、幾丁聚糖、膠原、彈性蛋白、明膠、玻尿酸膠原、羥基磷灰石、聚(丁酸3-羥基酯-共-己酸3-羥基酯) (PHBHHx)、聚(交酯)、聚(己內酯) (PCL)、聚(交酯-共-乙交酯) (PLG)、聚氧化乙烯(PEO)、聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)、聚氧化丙烯(PPO)、聚乙烯醇) (PVA)、牛乳、大豆蛋白及大豆蛋白分離物單獨或與任何其他聚合物組合物之組合。生物聚合物可經促進黏附或遷移之分子(例如，結合至淋巴球之膠原受體之膠原模擬肽及/或刺激分子)加強或修飾，以增強欲遞送細胞之遞送、擴增或功能，例如抗癌活性。生物聚合物支架可係可注射的，例如凝膠或半固體或固體組合物。
在一些實施例中，在遞送至個體之前將本文所述之CAR表現細胞接種至生物聚合物支架上。在實施例中，生物聚合物支架進一步包含一或多種本文所述之其他治療劑(例如，另一CAR表現細胞、抗體或小分子)或增強CAR表現細胞之活性(例如，納入或偶聯至支架之生物聚合物)的藥劑。在實施例中，生物聚合物支架係經例如腫瘤內注射或手術植入腫瘤處或腫瘤附近，以足以介導抗腫瘤效應。生物聚合物組合物及其遞送方法之其他實例闡述於Stephan等人，Nature Biotechnology , 2015, 33:97-101；及WO2014/110591中。
醫藥組合物及治療
本發明之醫藥組合物可包含CAR表現細胞(例如複數個如本文所述之CAR表現細胞)與一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。該等組合物可包含緩衝液，例如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及諸如此類；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或聚葡萄糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸，例如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，例如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；及防腐劑。在一態樣中，本發明組合物經調配以供靜脈內投與。
本發明之醫藥組合物可以適用於欲治療(或預防)疾病之方式投與。投與之量及頻率將由諸如患者之病況以及患者疾病之類型及嚴重程度等因素來確定，但適宜劑量可藉由臨床試驗來確定。
在一個實施例中，醫藥組合物實質上不含、例如無可檢測量之例如選自由以下組成之群之污染物：內毒素、微漿菌(mycoplasma)、複製勝任慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘餘抗CD3/抗CD28包覆之珠粒、小鼠抗體、所彙集之人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體封裝細胞或質體組分、細菌及真菌。在一個實施例中，細菌係選自由以下組成之群中之至少一者：糞產鹼菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。
當指示「免疫有效量」、「抗腫瘤有效量」、「腫瘤抑制有效量」或「治療量」時，欲投與之本發明組合物之精確量可由醫師考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤大小、感染或轉移程度及病況之個體差異來確定。通常可陳述為，包含本文所述T細胞之醫藥組合物可以104 至109 個細胞/kg體重、在一些情況下105 至106 個細胞/kg體重(包括彼等範圍內之所有整數值)之劑量來投與。T細胞組合物亦可以該等劑量投與多次。該等細胞可藉由利用免疫療法中通常已知之輸注技術來投與(參見(例如) Rosenberg等人，New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988)。
在某些態樣中，可期望向個體投與活化T細胞，且然後隨後再抽取血液(或實施血球分離)，根據本發明活化來自其之T細胞，且向患者再輸注該等活化及擴增之T細胞。此過程可每隔數週實施多次。在某些態樣中，T細胞可自10 cc至400 cc之血液抽取物活化。在某些態樣中，T細胞係自20 cc、30 cc、40 cc、50 cc、60 cc、70 cc、80 cc、90 cc或100 cc之血液抽取物活化。
個別組合物之投與可以任何方便方式實施，包括氣溶膠吸入、注射、攝取、輸液、植入或移植。本文所述之組合物可以下列方式投與患者：經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、鼻內、髓內、肌內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內。在一態樣中，本發明之T細胞組合物係藉由皮內或皮下注射投與患者。在一態樣中，本發明之CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)組合物係藉由i.v.注射來投與。可將CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)之組合物直接注射至腫瘤、淋巴結或注射位點中。
在特定實例性態樣中，可使個體經受白血球分離，其中以離體方式收集、富集或清除白血球以選擇及/或分離所關注細胞(例如免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞))。該等免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)分離株可藉由業內已知之方法擴增且可經處理，使得可引入本發明之一或多個CAR構築體，藉此產生本發明之CAR表現細胞(例如CAR T細胞或CAR表現NK細胞)。隨後可使有需要之個體經歷使用高劑量化學療法然後進行外周血幹細胞移植之標準治療。在某些態樣中，移植後或同時，對個體輸注本發明之擴增CAR表現細胞(例如CAR T細胞或NK細胞)。在另一態樣中，擴增細胞係在手術之前或之後投與。
在實施例中，例如在投與一或多個表現本文所述CAR (例如本文所述結合之BCMA之CAR)之細胞之前對個體實施淋巴清除。在實施例中，淋巴清除可包含投與美法侖、環磷醯胺(cytoxan)、環磷醯胺(cyclophosphamide)及氟達拉濱中之一或多者。
欲投與患者之上述治療之劑量將隨所治療病況之精確性質及治療之接受者而變化。用於人類投與之劑量之放大可根據業內接受之實踐來實施。例如，對於成年患者，CAMPATH之劑量通常將介於1 mg至約100 mg範圍內，通常每天投與持續1天與30天之間之時段。較佳每天劑量係1 mg/天至10 mg/天，但在一些情況下可使用高達40 mg/天之較大劑量(闡述於美國專利第6,120,766號中)。
在一個實施例中，使用(例如)活體外轉錄將CAR引入免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)中，且個體(例如人類)接受本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)的初始投與及本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)的一或多次隨後投與，其中一或多個隨後投與係在先前投與後少於15天(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)投與。在一個實施例中，本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)的一次以上投與係每週投與個體(例如人類)，例如每週投與本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)之2、3、或4次投與。在一個實施例中，個體(例如人類個體)每週接受一次以上CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)投與(例如每週2、3或4次投與) (在本文中亦稱為週期)，之後一週無CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)投與，及隨後向個體投與一或多次額外CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)投與(例如每週一次以上CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)投與)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受一個以上CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)週期，且每一週期之間之時間少於10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天。在一個實施例中，每隔一天投與CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)，每週共3次投與。在一個實施例中，將本發明之CAR免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)投與持續至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或更長。
在一態樣中，BCMA CAR表現細胞(例如BCMA CART或BCMA CAR表現NK細胞)係使用慢病毒病毒載體(例如慢病毒屬)來生成。該方式生成之CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)將具有穩定的CAR表現。
在一態樣中，CAR表現細胞(例如，CART)係利用病毒載體(例如γ反轉錄病毒載體，例如本文所述之γ反轉錄病毒載體)來生成。利用該等載體生成之CART可具有穩定的CAR表現。
在一態樣中，轉導後，CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)瞬時表現CAR載體達4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天。CAR之瞬時表現可藉由RNA CAR載體遞送來實現。在一態樣中，藉由電穿孔將CAR RNA轉導至細胞(例如T細胞或NK細胞)中。
使用瞬時表現CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)治療(特定而言利用帶有CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)之鼠類scFv)治療之患者中可產生之潛在問題係多次治療後過敏反應。
不受限於此理論，人們認為此一過敏性反應可係由發生體液抗CAR反應(即具有抗IgE同型之抗CAR抗體)之患者引起。人們認為當在暴露於抗原中存在10至14天中斷時，患者之產生抗體之細胞經歷自IgG同型(不會引起過敏反應)至IgE同型之類別轉換。
若患者在瞬時CAR療法進程期間處於產生抗CAR抗體反應之高風險(例如藉由RNA轉導產生之彼等)，則CAR表現細胞(例如CART或CAR表現NK細胞)輸注中斷不應持續超過10至14天。
實例
藉由參考以下實驗實例進一步詳細闡述本發明。除非另有說明，否則該等實例係僅出於說明目的而提供，且並不意欲具有限制性。因此，本發明決不應理解為限制以下實例，而應理解為涵蓋因本文所提供之教示而變得明瞭之任何及所有變化形式。
未加進一步闡述，據信，熟習此項技術者可使用前文說明及以下說明性實例來製備及利用本發明組合物並實踐所主張之方法。以下工作實例明確指出本發明之各個態樣，且不應理解為以任何方式限制本發明之其餘部分。
實例 1 ：作為高風險多發性骨髓瘤之標準一線或二線療法之鞏固的具有或無 huCART19 之 CART-BCMA 的 1 期研究
實驗設計：圖1繪示組合抗CD19 CAR T細胞及抗BCMA CAR T細胞作為高風險多發性骨髓瘤(MM)患者中之一線療法之鞏固的1期研究之總體設計。在此組合CAR T細胞研究中，CART-BCMA將在高風險MM之一線療法後與CART19 (亦稱為CTL119)共投與；此研究取代了在MM之一線療法後單獨投與CART19之先前開放之研究，高風險MM之一線療法早期關閉參與基於CART-BCMA之組合(NCT 02794246)。
對於CART-BCMA + CART19之此1期研究，靶標群體係對一線療法有反應之患有高風險多發性骨髓瘤之患者，在修訂之國際分期系統中定義為3期(Palumbo A, Avet-Loiseau H, Oliva S等人 Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2015；33:2863-9，其全部內容以引用方式併入本文中)。假設CAR T細胞在此環境下(與復發/難治性背景相比)將更有效，此乃因用於製造之T細胞在功能上受到高疾病負擔及多線先前MM療法之損壞較小；亦假設由於較低之疾病負擔，在此環境下CAR T細胞將更安全，預計此將導較不顯著之活體內初始CAR T細胞增殖。與1期研究相比，此研究亦增加了輸注前調節方案氟達拉濱，其已用於大部分其他CAR T細胞研究且可能促進CAR T細胞活體內之延長存活(Turtle CJ, Hanafi L-A, Berger C等人， Science translational medicine 2016；8:355ra116-355ra116)，並將CART-BCMA作為單次輸注而非分劑量輸注投與。最後，將向輸注後30天無過量毒性之個體投與標準護理之雷利竇邁維持療法。鑒於輸注方案之該等新態樣，研究將以單獨CART-BCMA之3-患者安全性準備開始，劑量為5×108 個CAR T細胞，來自1期研究之已確定之安全劑量。若未觀察到過量毒性，則額外3名患者將接受CART-BCMA及CART19，亦以5×108 個細胞之細胞劑量。此研究中之CART19劑量將比試驗CART19 + ASCT研究中使用之劑量高10倍，其中由於關於CART19與ASCT之毒性之問題，細胞劑量較低；此經設計以增加自添加CART19獲益之可能性。若利用組合方案未觀察到過量毒性，則研究將進入隨機化階段，其中個體將接受單獨CART-BCMA或CART-BCMA + CART19，直至總共20名個體經治療，10名每人接受CART- BCMA單一療法及CART-BCMA + CART19組合療法。研究之主要終點係此方法之安全性。儘管假設添加CART19將改善無惡化存活，但研究並未為此比較提供動力。相反，隨機化部分將允許比較單一療法與組合療法臂之間之相關終點以評估CART19消除了抵抗CART-BCMA之去分化之BCMAdim MM細胞(藉由對治療後獲得之骨髓(BM)細胞進行流式細胞術來分析)以及CART19是否是標靶MM幹細胞(MMSC)的證據。
CART19是否是標靶MMSC可藉由以下來分析：(1)確定CART19是否誘導針對幹細胞抗原Sox2之免疫反應；及/或(2)評估Sox2之表現作為患者樣本中MMSC之臨床生物標記。
實例 2 ： 作為高風險多發性骨髓瘤之標準一線或二線療法之鞏固的具有或無 huCART19 之 CART-BCMA 的 1 期研究
研究概述
研究設計
此係用於評估自體T細胞之安全性及藥效學的開放標籤、1期研究，其作為對高風險多發性骨髓瘤之一線或二線療法有反應之患者中的鞏固，該等自體T細胞表現具有串聯TCRζ及4-1BB (TCRζ /4-1BB)共刺激結構域(稱作「CART-BCMA」)之BCMA (B細胞成熟抗原)特異性嵌合抗原受體，具有或無huCART19 (亦稱為CTL119)。
此研究中評估之方案係基於UPCC 14415/IRB編號822756中展現之CART-BCMA之已確立安全性，該CART-BCMA係在患有復發/難治性骨髓瘤之患者中在1.5 g/m2 環磷醯胺後以5×108 個細胞之劑量分次輸注投與。此研究測試CART-BCMA (1)作為多發性骨髓瘤早期療法之鞏固，(2)作為單次而非分劑量輸注，(3)將氟達拉濱添加至淋巴細胞清除性化學療法方案中，(4)與huCART19組合，以及(5)在惡化或不能達到嚴格完全反應之個體中計劃重新輸注(Kumar S, Paiva B, Anderson KC等人 International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. The Lancet Oncology；17(8):e328-e346)。
研究入選將由兩個研究階段組成：a). 安全性準備階段，及b). 隨機化階段。在每個研究階段內，個體將入選至兩個同類群組中之一者中：
1.同類群組 1 ：在環磷醯胺 + 氟達拉濱化學療法後3天(+/- 1天)，以5×108 個CART-BCMA細胞之單次輸注形式投與之CART-BCMA單一療法
2.同類群組 2 ：在環磷醯胺 + 氟達拉濱化學療法後3天(+/- 1天)，以5×108 個CART-BCMA細胞之單次輸注 + 5×108 個huCART19細胞之單獨單次輸注形式投與的CART-BCMA + huCART19
隨機化階段
在隨機化階段，個體將經隨機化(1:1比率)以接受單獨CART-BCMA (同類群組1)或CART-BCMA + huCART19 (同類群組2)。在CAR T細胞療法之後，個體在輸注後28天第一正式反應評估後或在消退至≤2級方案有關之毒性時(以較晚者為準)，根據治療研究者之決定將適合接受標準護理之維持療法。
針對毒性及骨髓瘤反應實施標準臨床評估。將執行相關分析以評估CART-BCMA之藥物動力學/藥效學及huCART19擴增/持久性及表現靶抗原之細胞之清除對純系形成多發性骨髓瘤亞組之效應以及抗骨髓瘤免疫性(包括針對骨髓瘤幹細胞抗原之免疫性)。
額外 CAR T 細胞輸注
若符合以下條件，則初次輸注後個體將對於額外CAR T細胞劑量合格：
1. 個體未經歷任何先前CAR T細胞輸注之劑量限制性毒性(DLT)。
2. 可能/肯定與CAR T細胞及/或淋巴細胞清除性化學療法有關之不良事件已恢復至基線或≤2級。
3. 自從先前CAR T細胞輸注已過去90天，或個體之多發性骨髓瘤在最後之CAR T細胞輸注後已惡化。
4. 根據研究者之判斷，個體具有殘存多發性骨髓瘤之客觀證據。研究者將確定個體是否具有殘存多發性骨髓瘤之客觀證據。
5. 根據研究者之判斷，額外CAR T細胞輸注之風險及益處係平衡的。
6. 自初始製造保留CAR T細胞之最小可接受劑量。
7. 僅同類群組2個體：＞ 3%外周血淋巴球係CD19+。若＜3%外周血淋巴球係CD19+且個體符合上述所有其他準則，則個體可由研究者決定單獨接受CART-BCMA之額外輸注。
若滿足上述準則且只要研究保持開放，個體可僅接受最多兩次額外CAR T細胞輸注。
目標
主要目標 ：
1) 評估在用環磷醯胺 + 氟達拉濱淋巴清除後作為標準一線或二線多發性骨髓瘤療法之鞏固的呈5×108 個CAR+ 細胞之單一劑量形式之CART-BCMA的安全性。
2)評估在該臨床環境中與CART-BCMA一起投與之huCART19之安全性。
次要目標 ：
1)評估每個CAR T細胞方案(CART-BCMA單一療法或組合CART-BCMA + huCART19)後之臨床結果。
a. 評估習用反應準則、獲得最小殘存疾病(MRD)陰性(根據IMWG 2016準則(Kumar S等人 The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346))及獲得PET陰性反應(藉由PET/CT，不存在可檢測之FDG-avid疾病)。
i. 對第一劑量之反應
ii. 對隨後劑量之反應
b. 反應之持續時間、無惡化存活及整體存活
c. 藉由igH測序之分子MRD
2)評估在該臨床環境中CART-BCMA及huCART19擴增及持久性動力學。將初始輸注後之擴增程度及持久性以及生物活性與隨後之輸注進行比較。
3)評估huCART19對CART-BCMA抗性及純系形成多發性骨髓瘤細胞之相關參數的效應，例如以下：
a. 如藉由流式細胞術及免疫組織化學量測之純系BCMAdim/neg 或CD19+ 漿細胞之持久性
b. 如使用對骨髓樣本之活體外群落形成分析量測之多發性骨髓瘤純系形成的清除
c. 抗Sox2及其他抗骨髓瘤免疫反應之誘導
d. 純系CD19+ B細胞之清除
4)評估血球分離產物及CART-BCMA/huCART19細胞之細胞組成。
5)評估輸注後維持療法對CAR T細胞持久性及表型以及與CAR相關之不良事件的效應。
6) 表徵在CART-BCMA +/- huCART19後持續存在之多發性骨髓瘤細胞之表型(細胞表面免疫表型、基因表現特性)。
診斷及主要納入準則
患有高風險多發性骨髓瘤之成人患者，其在一線或二線療法後尚未達到嚴格完全反應。
研究藥劑、劑量及方案
研究藥劑 ：
• CART-BCMA細胞：表現具有串聯TCRζ及4-1BB (TCRζ/4-1BB)共刺激結構域之BCMA (B細胞成熟抗原)特異性嵌合抗原受體之自體T細胞
• huCART19細胞：經慢病毒載體轉導以表現抗CD19 scFV TCRζ:4-1BB之自體T細胞。亦稱為CTL119細胞。
• 環磷醯胺/氟達拉濱：在CAR T細胞產品投與之前用於淋巴清除之細胞毒性化學療法藥劑。
投與劑量及途徑 ：
• CART-BCMA細胞：藉由靜脈內輸注5×108 個細胞；輸注之最小可接受劑量為1×108 。
• huCART19細胞：藉由靜脈內輸注5×108 個細胞；輸注之最小可接受劑量為1×108 。
• 環磷醯胺及氟達拉濱：環磷醯胺300 mg/m2 及氟達拉濱30 mg/m2 ，藉由靜脈內輸注。
方案 ：
• CART-BCMA細胞：在第0天單次輸注。
• huCART19細胞：在完成CART-BCMA輸注後第0天單次輸注(在適用之個體中)。
• 環磷醯胺/氟達拉濱：給予超過3天；經排定使得化學療法之最後一天在第一CAR T細胞輸注(第0天)之前3天(+/- 1天)。
額外 CAR T 細胞輸注 ：
對於符合所需合格性準則之個體，可視情況以至少三個月之間隔或在疾病惡化時輸注額外CAR T細胞劑量。
對於第二次及隨後之CAR T細胞輸注，默認方案(單獨之CART-BCMA對比CART-BCMA + huCART19)將為個體在接受其初始輸注之方案。然而，若保留不足之huCART19細胞以調配可接受之劑量，及/或＜3%外周血淋巴球係CD19+，則CART-BCMA可單獨輸注至先前接受CART-BCMA及huCART19二者之個體。然而，未保留足夠CART-BCMA劑量之同類群組2個體將不適用額外輸注單獨huCART19。
導論
作為多發性骨髓瘤之鞏固療法之 CAR T 細胞之原理
「鞏固療法」係指在對先前療法反應後之治療以延長反應及/或降低復發/惡化之風險。在多發性骨髓瘤中，通常利用高劑量美法侖及自體幹細胞移植(ASCT)鞏固具有方案(例如雷利竇邁、硼替佐米及地塞米松)之標準一線療法。此研究涉及使用CAR T細胞療法而非ASCT作為一線療法之鞏固。
此研究將入選已對一線或二線療法有反應之個體且在廣泛暴露於細胞毒性化學療法之前收穫T細胞用於CAR T細胞製造。預計與在復發/難治性環境中收穫之細胞相比，在此臨床環境中收穫之T細胞將導致更具臨床活性之CAR T細胞產物。此預計源於來自經CART19治療之CLL患者之發現，顯示臨床結果與早期記憶T細胞表型之存在密切相關(Fraietta JA, Lacey SF, Wilcox NS等人 Biomarkers of Response to Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia. Blood. 2016;128(22):57)。多發性骨髓瘤惡化伴隨耗竭T細胞表型之發展(Chung DJ, Pronschinske KB, Shyer JA等人 T-cell Exhaustion in Multiple Myeloma Relapse after Autotransplant: Optimal Timing of Immunotherapy. Cancer Immunol Res. 2016；4(1):61-71)。由於患者經由多線療法而惡化，隨著疾病負擔之增加且患者接受愈來愈具侵襲性之療法(通常具有廣泛之細胞毒性作用機制)，T細胞庫可能逐漸受損。
鞏固療法之評估效能之挑戰係如何區分對研究療法之反應與對先前療法之反應。為了避免此限制，此方案限制入選已至少達成最小反應、但儘管已經接受至少三個週期對先前療法仍無完全反應的個體，此時反應通常「停止增加」(即，不能利用進一步療法明顯地改良)。此外，個體將使用高劑量美法侖及ASCT將標準鞏固推遲至後線療法，並接受環磷醯胺及氟達拉濱(其本身預計不會在此群體中實現顯著抗骨髓瘤反應)作為淋巴細胞清除性化學療法。因此，利用此研究設計，預計能夠將觀察到之任何多發性骨髓瘤反應歸因於CAR T細胞之臨床活性。
組合 CAR T 細胞療法
腫瘤純系之稀有靶標陰性亞組之選擇及生長係有記載之對CAR T細胞療法之抗性機制。同時標靶兩種抗原可繞過此抗性機制並增加用單一劑量消除純系之所有免疫表型亞組的可能性。在接受CART-BCMA之一些個體中，在初始反應後富集表現BCMA-dim及CD19之多發性骨髓瘤細胞，表明共投與huCART19可預防CART-BCMA後之惡化。
連續 CAR T 細胞輸注
由於在根除所有疾病之前輸注之CAR T細胞之活體內功能能力喪失，殘存疾病可在初始CAR T細胞輸注後持續存在。儘管CART-BCMA細胞之活體內持續性程度低，但最初對CART-BCMA有反應之許多個體稍後惡化。此發現表明在活體內擴增之初始波之後CAR T細胞功效損失。由於BCMA表現在所有分析之患者中在復發時仍然存在，因此殘存疾病可能對再輸注額外CART-BCMA劑量敏感。因此，此方案包括提供CAR T細胞之連續輸注，只要自初始製造之產品保留足夠之劑量即可。預計此提供可產生關於該臨床環境中連續CART-BCMA及huCART19輸注之安全性、藥物動力學及藥效學數據，以及初步臨床反應數據。此提供亦受到愈來愈多之以下認識驅動，即非常低程度之殘存骨髓瘤在臨床上很重要且將可能成為靶標。基於最小殘存疾病(MRD)之持久性，甚至習慣定義之完全反應中之個體的預後亦不同(Munshi NC, Avet-Loiseau H, Rawstron AC等人 Association of Minimal Residual Disease With Superior Survival Outcomes in Patients With Multiple Myeloma: A Meta-analysis. JAMA Oncol. 2017；3(1):28-35)。
個體選擇
納入凖則
1. 根據IMWG 2014準則(Rajkumar SV, Dimopoulos MA, Palumbo A等人 International Myeloma Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma. The lancet oncology. 2014；15(12):e538-548)，個體必須具有多發性骨髓瘤之診斷，其具有以下高風險特徵中之任一者：
a. β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L且LDH大於正常值上限。注意：在起始全身性療法之前未量測β-2-微球蛋白之個體可基於起始全身性療法後獲得之量測值來取得資格。
b. 高風險FISH特徵：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)，連同β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L (修訂之ISS 3期)。注意：在起始全身性療法之前未量測β-2-微球蛋白之個體可基於起始全身性療法後獲得之量測值來取得資格。
c. 中期核型，其中除超二倍體之外具有＞3個結構異常。
d. 在入選之前之任何時間，漿細胞白血病(外周血中＞ 20%之液細胞)。
e. 對於「imid/PI」組合(沙利竇邁、雷利竇邁或泊馬竇邁與硼替佐米、阿西咗脒或卡非佐米之組合)，無法達成部分反應或更佳反應(藉由IMWG 2016準則(Kumar S等人，The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346))。
f. 在開始療法之6個月內在利用「imid/PI」組合之一線療法時惡化(根據IMWG 2016準則(Kumar S等人，The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346))。
2. 關於先前骨髓瘤療法，個體必須符合以下準則：
a. 個體必須處於其多發性骨髓瘤療法之一線，但以下除外：若該惡化發生在開始一線療法之6個月內，則在一線療法期間由於疾病惡化而前進至二線療法之個體係合格的。療法之各線係由IMWG 2016準則(Kumar S等人， The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346)定義。
b. 個體必須尚未經歷同種異體幹細胞移植。
c. 個體必須在入選前≤1年針對多發性骨髓瘤起始全身性療法。
d. 個體必須已接受至少3個完整週期之其當前方案且對於先前療法而言總體已達成至少最小反應(如由IMWG 2016準則(Kumar S等人 The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346)所定義)。
e. 個體必須尚未接受細胞毒性化學療法(例如多柔比星、環磷醯胺、依託泊苷、順鉑)，但以下除外：
i. 每週低劑量環磷醯胺(≤500 mg/m2 /週)
ii. 若限於單一週期，則連續輸注環磷醯胺。
3. 根據IMWG 2016準則(Kumar S等人，The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346)，個體在入選時必須尚未達成完全或嚴格完全反應，除非藉由流式細胞術在骨髓中可檢測到純系漿細胞。(即，若最小殘存疾病可藉由骨髓流式細胞術記載，則完全或嚴格完全反應之個體係合格的)。
4. 個體必須簽署書面知情同意書。
5. 個體必須≥ 18歲。
6. 個體必須具有足夠的生命器官功能：
a. 血清肌酸酐≤2.5或肌酸酐清除率≥30 ml/min(根據CKD-EPI量測或估計)且不依賴於透析。
b. 絕對嗜中性球計數≥1000/μl且血小板計數≥50,000/μl (若骨髓漿細胞≥50%細胞性，則≥30,000/μl)。
c. SGOT ≤ 3x正常值上限且總膽紅素≤ 2.0 mg/dl (高膽紅素血症歸因於吉伯特氏症候群之患者除外)。
d. 左心室射血分數(LVEF)≥ 45%。必須在入選8週內實施LVEF評估。
7. 除了可歸因於多發性骨髓瘤療法之外周神經病變外，先前/正在進行之療法之毒性必須已根據CTCAE 4.03準則恢復至≤2級或恢復至個體之先前基線。
8. 患者之ECOG體能狀態必須為0-2。
9. 個體必須願意放棄一線ASCT。
10. 生殖潛能之個體必須同意使用可接受之節育方法。
排除凖則
1. 妊娠或哺乳女性
2. 對白血球分離之靜脈通路不足或禁忌白血球分離。
3. 活動性B型肝炎、C型肝炎或HIV感染或其他活動性、不受控制之感染。
4. 將如所概述排除參與之任何不受控醫學或精神病病症。
5. NYHA III類或IV類心臟衰竭、不穩定性心絞痛或最近(6個月內)心肌梗塞或持續(＞30秒)心室快速性心律不整之病史。
6. 具有活動性自體免疫疾病，包括結締組織疾病、眼色素層炎、類肉瘤病、發炎性腸病或多發性硬化，或具有需要延長免疫抑制療法之嚴重(由研究者判斷)自體免疫疾病病史。
7. 具有骨髓瘤之先前或活動性中樞神經系統(CNS)受累(例如柔腦膜病、實質腫塊)。除非存在可疑症狀或放射照相發現，否則不需要對此進行篩查(例如利用腰椎穿刺)。即使CSF對骨髓瘤呈陰性，亦排除患有顱內擴張並涉及硬腦膜之顱骨疾病的個體。
研究藥物
CART-BCMA 細胞
CART-BCMA細胞係已經改造以表現細胞外單鏈抗體(scFv)之自體T細胞，該細胞外單鏈抗體對連接至細胞內信號傳導分子之BCMA具有特異性，該細胞內信號傳導分子由包括連接至4-1BB共刺激結構域之TCRζ信號傳導模組的串聯信號傳導結構域組成。將CART-BCMA細胞在可輸注之低溫介質中冷凍保藏，並在輸液袋中分配。CART-BCMA細胞以單次輸注形式投與。目標CART-BCMA劑量為5×108 個轉導細胞，最小可接受輸注劑量為1×108 個轉導細胞。劑量將經調配以達成含有5×108 個CAR T細胞之最大劑量數；即，出於增加可用劑量之量的目的，劑量不會降低至低於5×108 個CAR T細胞之靶標。
huCART19 細胞
huCART19細胞係已經改造以表現細胞外單鏈抗體(scFv)之自體T細胞，該細胞外單鏈抗體對連接至細胞內信號傳導分子之CD19具有特異性，該細胞內信號傳導分子由包括連接至4-1BB共刺激結構域之TCRζ信號傳導模組的串聯信號傳導結構域組成。將CTL119細胞在可輸注之低溫介質中冷凍保藏，並在輸液袋中分配。huCART19細胞以單次輸注形式投與。靶標huCART19劑量為5×108 個轉導細胞，最小可接受輸注劑量為1×108 個轉導細胞。劑量將經調配以達成含有5×108 個CAR T細胞之最大劑量數；即，出於增加可用劑量之量的目的，劑量不會降低至低於5×108 個CAR T細胞之靶標。
CART-BCMA 及 huCART19 輸注
產品將以順序方式投與，首先解凍並輸注CART-BCMA細胞，之後huCART19細胞解凍及輸注，其必須在CART-BCMA輸注完成後至少一小時發生。在此期間，huCART19產品必須保持在乾冰上。
初始 CAR T 細胞輸注之前之淋巴細胞清除性化學療法
在初始CAR T細胞輸注之前，淋巴細胞清除性化學療法將作為環磷醯胺300 mg/m2 + 氟達拉濱30 mg/m2 每日一次共三天之方案投與。淋巴細胞清除性化學療法必須經排定使得療法之最後一天在CAR T細胞輸注之前3天(+/- 1天)。
儘管出於研究目的作為此研究之一部分投與，但環磷醯胺及氟達拉濱二者皆係FDA批准之藥劑，並將根據其FDA批准之標記及標準制度實踐進行製備及輸注。用於該方案之較佳止吐術前用藥係昂丹司瓊(ondansetron) 16 mg及地塞米松12 mg，各自在每次化學療法輸注之前每日投與；此方案可以由治療研究者決定改變。研究者可根據需要使用開立額外之標準家庭止吐藥(例如昂丹司瓊、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、氯羥去甲安定(lorazepam))的處方。對於估計GFR ＜80 mL/min之個體，研究者可決定減少氟達拉濱劑量。
隨後 CAR T 細胞輸注之前之淋巴細胞清除性化學療法
在隨後之CAR T細胞輸注之前，淋巴細胞清除性化學療法將作為環磷醯胺+氟達拉濱方案(如上所述)或環磷醯胺1.5 g/m2 之單次輸注投與。淋巴細胞清除性化學療法之該兩個選項之間之選擇將由第一CAR T細胞輸注之前投與之淋巴細胞清除性化學療法之耐受性及整體臨床情況引導由研究者決定。淋巴細胞清除性化學療法將經排定使得療法之最後一天在CAR T細胞輸注之前3天(+/- 1天)。
對於環磷醯胺1.5 g/m2 ，較佳止吐術前用藥為昂丹司瓊24 mg及地塞米松12 mg，之後在環磷醯後兩天每日兩次胺昂丹司瓊8 mg。接受環磷醯胺1.5 g/m2 之個體亦將接受1L生理鹽水之靜脈內預水化。
研究程序
該研究由以下組成：(1)篩選階段，(2)由血球分離及製備CAR T細胞產物組成之製造階段，(3)由淋巴細胞清除性化學療法及輸注CAR T細胞組成之治療階段，及(4)隨訪。
進入前評估 / 篩選
在進入前評估時段期間，個體將被要求提供知情同意書及骨髓抽出物及核心生檢，用於研究相關研究。可在個體仍在接受一線療法之同時實施此生檢。亦可由研究者決定將樣本發送用於標準解剖學病理學或遺傳分析(FISH、細胞遺傳學，下一代測序等)。
血球分離
在Hospital of the University of Pennsylvania apheresis center實施大體積血球分離程序。在此程序期間獲得用於CAR T細胞之PBMC。
自體幹細胞動員及收集
在未來線之療法中考慮高劑量美法侖及自體幹細胞移植之個體可在入選後但在CAR T細胞輸注之前經歷自體幹細胞動員及收集，只要對血球分離前化學療法有所限制，且重視骨髓樣生長因子之使用。預期(但無需)在用於CAR T細胞製造之白血球分離後將發生自體幹細胞動員及收集。
輸注前評估
個體將在CAR T細胞輸注之前7天內及淋巴細胞清除性化學療法之前經歷評估，以獲得輸注前基線臨床及骨髓瘤狀態且評估進行CAR T細胞輸注之合格性。
淋巴細胞清除性化學療法
淋巴細胞清除性化學療法將經排定使得淋巴細胞清除性化學療法之最後一天在CAR T細胞輸注之前3天(+/- 1天)。
CAR T 細胞輸注
CAR T細胞輸注將在化學療法完成後3天(+/- 1天)開始。每一CAR T細胞產物(CART-BCMA及huCART19)將作為單獨之單次注射投與。對於接受CART-BCMA及huCART19二者之個體，首先投與CART-BCMA，且在完成CART-BCMA輸注後立即開始huCART19輸注。
萬一在huCART19輸注之前對CART-BCMA發生急性輸注反應，則huCART19輸注可由研究者決定延遲至多48小時。若在術前用藥與huCART19輸注之間已經過了＞4小時，則將重新投與術前用藥。若huCART19輸注延遲且個體在初始排定的輸注時間之48小時內未穩定以允許huCART19輸注，則除非主辦方批准進一步延遲，否則將取消huCART19劑量。
輸注後評估
個體將在+2天、+4天、+7天、+10天、+14天及+21天(+/- 1天)及+28天(+/- 3天)返回診療所進行評估。
維持療法
在第28天評估後或一旦可能/肯定與CAR T細胞及/或淋巴細胞清除性化學療法相關之不良事件已恢復至基線或≤2級(以較晚者為準)，可開始投與維持療法。除了該等限制之外，是否以及何時起始維持療法之決定將基於研究者之決定。維持方案之選擇亦由研究者決定。雷利竇邁單一療法係較佳維持療法，且若可能，應避免含有類固醇之方案。
每月 (+/- 7 天 ) 評估及季度評估
個體將在每月(+/- 7天)評估後返回診療所，直至CAR T細胞輸注用於評估後六個月。6個月評估後，個體將經歷輸注後季度評估(+/- 14天)最多一年。
研究相關研究評估
標準研究外周血抽取物將由以下組成：
1. 在EDTA管(即，紫頂管)中約25 mL外周血用於PBMC及核酸分離
2. 在普通塑膠管(即，紅頂管)中約5 mL外周血用於血清分離
骨髓抽出物之目標收集體積為10-20 mL。對於指定用於標準解剖學病理學及相關研究之骨髓抽出物樣本，將約2-5 mL分配給標準解剖學病理學，且其餘用於相關研究。可用於相關研究之抽出物將分為如下：約1-3 mL分配至塑膠管(即，紅頂管)用於血清分離，且剩餘分配至EDTA管(即，紫頂管)用於PBMC及核酸分離。
對於標準解剖學病理學(若適用)及相關研究，骨髓核心生檢之靶長度各為1 cm。此長度可由實施該程序之臨床醫師決定自單獨生檢或單一生檢之劃分獲得。
以下係將計劃用於外周血及(若適用)骨髓抽出物之相關分析：
1. 流式細胞術及qPCR用於檢測huCART19及CART-BCMA細胞。
2. 流式細胞術用於多發性骨髓瘤細胞(骨髓抽出物)上之靶抗原表現及檢測/表徵最小殘存疾病。
3. 藉由流式細胞術及/或分子方法對T細胞亞組之表型分析。
4. 藉由免疫球蛋白重鏈測序對最小殘存疾病之分子檢測/表徵。
5. 對骨髓核心生檢的免疫組織化學分析用於T細胞及骨髓之其他細胞組分之靶抗原表現及表徵。
6. 可溶性標記物之sBCMA/BAFF/APRIL ELISA。
實例 3 ： 作為高風險多發性骨髓瘤之標準一線或二線療法之鞏固的具有或無 huCART19 之 CART-BCMA 的 1 期研究
研究概述
研究設計
此係用於評估在對高風險多發性骨髓瘤之一線或二線療法有反應之患者中及在對補救療法有反應之復發/難治性多發性骨髓瘤患者中在具有或無huCART19的情況下CART-BCMA之安全性、藥效學及抗骨髓瘤效應的開放標籤1期研究。
此研究中評估之方案係基於UPCC 14415/IRB編號822756中展現之CART-BCMA之已確立安全性，該CART-BCMA係在患有復發/難治性骨髓瘤之患者中在1.5 g/m2 環磷醯胺後以5×108 個細胞之劑量分次輸注投與。此研究測試CART-BCMA (1)作為多發性骨髓瘤早期療法之鞏固及作為復發/難治性多發性骨髓瘤之標準補救療法之鞏固，(2)將氟達拉濱添加至淋巴細胞清除性化學療法方案中，(3)與huCART19組合，以及(4)作為單一而非分劑量輸注。
研究將在三個入選階段中以逐步方式將該等變化引入CART-BCMA方案：
• 階段A：用於測試在患者中利用環磷醯胺 + 氟達拉濱之淋巴細胞清除性化學療法之後作為分劑量輸注之CART-BCMA + huCART19之安全性的安全性準備，該等患者在兩個先前方案之後患有復發/難治性骨髓瘤但仍對其當前療法有反應。
• 階段A擴展：擴展階段A同類群組以增加對於在復發/難治性環境中作為鞏固方法之組合CART-BCMA/huCART19方案之安全性、藥效學及抗骨髓瘤效應的理解。入選A階段擴展可能與階段B同時發生。
• 階段B：隨機化階段，其中對一線或二線療法有反應之患者將在利用環磷醯胺 + 氟達拉濱之淋巴細胞清除性化學療法後接受呈分劑量輸注形式之單獨CART-BCMA (同類群組1)或CART-BCMA + huCART19 (同類群組2)。
• 階段C：用於測試在對一線或二線療法有反應之患者中利用環磷醯胺 + 氟達拉濱之淋巴細胞清除性化學療法後呈單一劑量輸注形式之單獨CART-BCMA (同類群組1)及CART-BCMA + huCART19 (同類群組2)的單一劑量輸注之安全性的單一劑量輸注階段。
在整個研究中，對於每一產品，CART-BCMA及huCART19之目標劑量為5×108 個CAR表現細胞。「同類群組1」係指分配給接受單獨CART-BCMA之個體之組；「同類群組2」係指分配給接受CART-BCMA + huCART19之個體之組。分劑量輸注將由以下組成：在第一輸注日(一種或兩種產品之)10%劑量，在第二輸注日(一種或兩種產品之)30%劑量或在第三輸液日(一種或兩種產品之)60%劑量。由於排程限制或容許觀察可疑之早期細胞介素釋放症候群或其他毒性，輸注日可分佈在7個日曆日。輸注將在用環磷醯胺+氟達拉濱完成淋巴細胞清除性化學療法後3天(+/- 1天)開始。
安全性準備階段 ( 階段 A)
為了測試此新組合CAR T細胞方法之安全性，安全性準備將入選患有高風險多發性骨髓瘤之個體，其對於兩個先前線之療法復發/難治但對當前療法有反應。三個個體將在在環磷醯胺+氟達拉濱淋巴細胞清除性化學療法後3天(+/- 1天)開始接受CART-BCMA + huCART19。在每一個體之方案開始(即淋巴細胞清除性化學療法之第一天)之間將制定21天之等待期。安全性暫停將發生，直至所有三個個體皆完成28天之隨訪且由醫學主任及首席研究員實施正式DLT評估。若在前三個輸注個體中發生DLT，則延遲進一步入選/輸注，直至主辦方醫學主任及首席研究員實施正式安全性審查，且任何建議之方案改變已經由適當之監督機構執行及批准。然後，安全性準備將進一步擴展至入選最多六個可評估之個體。
若根據醫學主任及首席研究員之評估未鑑別到DLT，則將累積之安全性數據提交至FDA進行審查並確認研究可進行至隨機化階段(階段B)。
若根據醫學主任及首席研究員之平均鑑別到DLT且安全性準備階段擴展至入選最多六個可評估之個體，則在安全性準備階段結束時(在所有計劃之個體達到第+28天時間點之後)進行數據及安全性監測委員會(DSMB)會議以評估研究是否可惡化至隨機化階段(階段B)。同時，將累積之安全性數據提交至FDA用於審查及確認同類群組之惡化。
階段 A 擴展階段
一旦在階段A安全性準備階段確立CART-BCMA/huCART19組合療法之安全性(即根據醫學主任及首席研究員之評估未鑑別到DLT)，將發生階段A之擴展，其中階段A目標群體(對標準補救療法方案有反應之患有復發/難治性多發性骨髓瘤之患者)將接受CART-BCMA及huCART19二者。一旦開放，入選至階段A擴展可與階段B同時發生。
隨機化階段 ( 階段 B)
在安全性準備階段完成後，對一線或二線療法有反應之患有高風險骨髓瘤之個體將在環磷醯胺+氟達拉濱化學療法後3天(+/- 1天)開始隨機化(1:1)接受單獨CART-BCMA (同類群組1)或CART- BCMA + huCART19 (同類群組2)。入選將繼續，直至輸注總共20名個體，目標為每個同類群組10個可評估之個體(1:1隨機化)。在隨機化階段期間，個體之間無需等待期。
在隨機化階段結束時(在所有個體達到第+28天時間點之後)進行DSMB會議以評估研究是否可惡化至單一劑量輸注階段(階段C)。同時，將累積之安全性數據提交至FDA用於審查及確認同類群組之惡化。
單一劑量輸注階段 ( 階段 C)
此階段將評估CART-BCMA單一療法及CART-BCMA + huCART19組合之單一劑量輸注之安全性。此階段將入選對一線或二線療法有反應之患有高風險多發性骨髓瘤之個體。首先，在環磷醯胺 + 氟達拉濱化學療法後3天(+/- 1天)，三個個體將接受呈單一劑量輸注形式之CART-BCMA單一療法(同類群組1)。將發生安全性暫停，直至所有3名個體皆完成28天之隨訪。接下來，在環磷醯胺 + 氟達拉濱化學療法後同一天(同類群組2)、3天(+/- 1天)，個體將以單一劑量、依序輸注形式接受CART-BCMA + huCART19。在每一個體之方案開始(即淋巴細胞清除性化學療法之第一天)之間將制定21天之等待期。倘若DLT，則延遲進一步入選/輸注，直至主辦方醫學主任及首席研究員實施正式安全性審查，且任何建議之方案改變已經由適當之監督機構執行及批准。最多6個可評估之個體將參與階段C (每一同類群組中3個)。
在CAR T細胞療法之後，所有階段之個體在輸注後28天第一正式反應評估後或在消退至≤2級方案有關之毒性時(以較晚者為準)，根據治療研究者之決定將適合接受標準護理之維持療法。
針對毒性及骨髓瘤反應實施標準臨床評估。將執行相關分析以評估CART-BCMA之藥物動力學/藥效學及huCART19擴增/持久性及表現靶抗原之細胞之清除對純系形成多發性骨髓瘤亞組之效應以及抗骨髓瘤免疫性(包括針對骨髓瘤幹細胞抗原之免疫性)。
目標
主要目標
1) 評估在利用環磷醯胺 + 氟達拉濱淋巴清除後作為標準一線或二線多發性骨髓瘤療法之鞏固的CART-BCMA之安全性
2) 評估在患有最近診斷之多發性骨髓瘤之患者中作為一線或二線療法之鞏固及在患有復發/難治性多發性骨髓瘤之患者中作為補救療法之鞏固的與CART-BCMA一起投與之huCART19的安全性。
次要目標
1) 評估每個CAR T細胞方案(CART-BCMA單一療法或組合CART-BCMA + huCART19)後之臨床結果。
a. 評估習用反應準則、獲得MRD陰性(根據IMWG 2016準則(Kumar S等人 The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346))及獲得PET陰性反應(藉由PET/CT，不存在可檢測之FDG-avid疾病)。
b. 反應之持續時間、無惡化存活及整體存活
c. 藉由IgH測序之分子MRD
2) 評估在該臨床環境中CART-BCMA及huCART19擴增及持久性動力學。
3) 評估huCART19對CART-BCMA抗性及純系形成多發性骨髓瘤細胞之相關參數的效應，例如以下：
a. 如藉由流式細胞術及免疫組織化學量測之純系BCMAdim/neg或CD19+漿細胞之持久性
b. 如使用對骨髓樣本之活體外群落形成分析量測之多發性骨髓瘤純系形成的清除
c. 抗Sox2及其他抗骨髓瘤免疫反應之誘導
d. 純系CD19 + B細胞之清除
4) 評估血球分離產物及CART-BCMA/huCART19細胞之細胞組成。
5) 評估輸注後維持療法對CAR T細胞持久性及表型以及與CAR相關之不良事件的效應。
6) 表徵在CART-BCMA +/- huCART19後持續存在之多發性骨髓瘤細胞之表型(細胞表面免疫表型、基因表現特性)。
診斷及主要納入準則
階段A (安全性準備)：高風險多發性骨髓瘤成人患者，其對於兩個先前線之療法復發/難治但對當前療法有反應。
階段A擴展：患有多發性骨髓瘤之成人，其對於兩個先前線之療法復發/難治但對當前療法有反應。
階段B (隨機化階段)及階段C (單一劑量輸注階段)：患有高風險多發性骨髓瘤之成人患者，其在一線或二線療法後尚未達到嚴格完全反應。
研究藥劑、劑量及方案
研究藥劑 ：
• CART-BCMA細胞：表現具有串聯TCRζ及4-1BB (TCRζ/4-1BB)共刺激結構域之BCMA (B細胞成熟抗原)特異性嵌合抗原受體之自體T細胞。
• huCART19細胞：經慢病毒載體轉導以表現抗CD19 scFV TCRζ:4-1BB之自體T細胞。亦稱為CTL119細胞。
• 環磷醯胺及氟達拉濱：在CAR T細胞產品投與之前用於淋巴清除之細胞毒性化學療法藥劑。
投與劑量及途徑 ：
• CART-BCMA細胞：藉由靜脈內輸注5×108 個細胞；輸注之最小可接受劑量為0.5×108 。
• huCART19細胞：藉由靜脈內輸注5×108 個細胞；輸注之最小可接受劑量為0.5×108 。
• 環磷醯胺及氟達拉濱：環磷醯胺300 mg/m2 及氟達拉濱30 mg/m2 ，藉由靜脈內輸注。
方案 ：
• CART-BCMA細胞：分劑量及單一劑量輸注
• huCART19細胞：分劑量及單一劑量輸注。
• 環磷醯胺/氟達拉濱：給予超過3天；經排定使得化學療法之最後一天在第一CAR T細胞輸注(第0天)之前3天(+/- 1天)。
投與之持續時間
基於欲輸注之總體積及10-20mL/分鐘之建議輸注速率。
研究階段之概述
階段A：目標群體(N=3-6)包括以下患者：(1) 患有高風險多發性骨髓瘤，(2) 在2個先前方案後復發對於2個先前方案難治，及(3) 對當前方案顯示最小反應或更佳反應。CART-BCMA及huCART19係以分劑量輸注投與：
• 劑量1：0.5 × 108 CART-BCMA + 0.5 × 108 huCART19
• 劑量2：1.5 × 108 CART-BCMA + 1.5 × 108 huCART19
• 劑量3：3.0 × 108 CART-BCMA + 3.0 × 108 huCART19
階段A擴展：目標群體(N=7)包括以下患者：(1) 在2個先前方案後復發對於2個先前方案難治，及(2) 對當前方案顯示最小反應或更佳反應。CART-BCMA及huCART19係以分劑量輸注投與：
• 劑量1：0.5 × 108 CART-BCMA + 0.5 × 108 huCART19
• 劑量2：1.5 × 108 CART-BCMA + 1.5 × 108 huCART19
• 劑量3：3.0 × 108 CART-BCMA + 3.0 × 108 huCART19
階段B ：目標群體(N=20)包括以下患者：(1) 患有高風險多發性骨髓瘤，(2) 對一線或二線療法有反應，及(3) 對當前方案顯示最小反應或更佳反應。將患者隨機化成兩個同類群組。
在同類群組1中，患者以分劑量輸注接受單獨CART-BCMA：
• 劑量1：0.5 × 108 CART-BCMA
• 劑量2：1.5 × 108 CART-BCMA
• 劑量3：3.0 × 108 CART-BCMA
在同類群組2中，以分劑量輸注投與CART-BCMA及huCART19：
• 劑量1：0.5 × 108 CART-BCMA + 0.5 × 108 huCART19
• 劑量2：1.5 × 108 CART-BCMA + 1.5 × 108 huCART19
• 劑量3：3.0 × 108 CART-BCMA + 3.0 × 108 huCART19
階段C ：目標群體(N=3-6)包括以下患者：(1) 患有高風險多發性骨髓瘤，(2) 對一線或二線療法有反應，及(3) 對當前方案顯示最小反應或更佳反應。將患者隨機化成兩個同類群組。同類群組1 (N=3)中之患者以單一劑量輸注接受5 × 108 CART-BCMA細胞。同類群組2 (N=3)中之患者以單一劑量輸注接受5 × 108 CART-BCMA細胞及5 × 108 huCART19細胞。
導論
此係用於評估具有或無huCART19之CART-BCMA在患有多發性骨髓瘤之患者中作為鞏固療法的1期研究。該研究基於在患有復發/難治性多發性骨髓瘤(UPCC編號14415/IRB編號822756)之患者中Penn贊助之CART-BCMA之1期研究的結果建立。與UPCC編號14415/Penn IRB編號822756相比，此研究經設計以評估CART-BCMA投與之以下修改之安全性，研究者假設將增加CART-BCMA之反應率及反應持續時間並簡化其投與：
• 在患者疾病過程早期投與CART-BCMA：此修改之原理係CART-BCMA在患有復發/難治性疾病之個體中之臨床療效可能受到由高疾病負擔及廣泛先前療法強加之治療前T細胞庫之功能缺陷的限制。對一線或二線療法有反應之個體將具有較低之疾病負擔且將暴露於較少之細胞毒性化學療法。
• 投與CAR T細胞作為鞏固療法：在患有晚期多發性骨髓瘤之患者中，在患者對其最近之療法有反應而非惡化中時起始CAR T細胞製造可增加CAR T細胞產品之功效並降低在等待CAR T細胞製造的同時與疾病相關之併發症發展的可能性。
• 在淋巴細胞清除性化學療法中除環磷醯胺外亦使用氟達拉濱：預計添加氟達拉濱會增加活體內CAR T細胞擴增及持久性之可能性，這被認為是持續效能所必需的。
• 以單一劑量而非分劑量輸注形式投與：此意欲簡化輸注時間表並能夠共投與huCART19 (參見下文)。
• 共投與huCART19：添加huCART19之原理係表現CD19之多發性骨髓瘤細胞係純系形成的且介導針對CART-BCMA之抗性的證據。
階段A及階段A擴展同類群組標靶復發/難治性患者群體，其標準療法僅能實現短期疾病控制。儘管此研究之階段B及C在早線療法中引入了高風險介入，但研究群體係患有高風險多發性骨髓瘤之患者，其無法達成對一線療法之完全反應；在此群體中利用標準療法之預後較差證明與此新穎方法相關之風險。
作為多發性骨髓瘤之鞏固療法之 CAR T 細胞的原理
「鞏固療法」係指在對先前療法反應後之治療以延長反應及/或降低復發/惡化之風險。此研究將評估在兩種不同臨床環境中作為鞏固之CAR T細胞：(1) 在患有復發/難治性多發性骨髓瘤之患者中，其對標準補救療法(階段A及階段A擴展)有反應，及(2) 在患有最近診斷之高風險多發性骨髓瘤之患者中，其對標準一線或二線療法(階段B及階段C)有反應。
在復發/難治性環境中，一些患者在CAR T細胞製造期間惡化出多發性骨髓瘤併發症，其排除了CART-BCMA之投與。為了降低CAR T細胞製造期間中病態疾病惡化之可能性並潛在地增加耐久反應之可能性，此研究之階段A及階段A擴展將集中於對標準補救療法有反應之復發/難治性多發性骨髓瘤患者。對標準補救療法有反應但仍患有可檢測之殘存疾病的患者之預後仍然較差，且適用於研究藥劑之臨床試驗。
在多發性骨髓瘤中，通常利用高劑量美法侖及自體幹細胞移植(ASCT)鞏固具有方案(例如雷利竇邁、硼替佐米及地塞米松)之標準一線療法。利用ASCT鞏固可延長多發性骨髓瘤患者之總體存活60-62。現代多發性骨髓瘤療法過程中ASCT之最佳時間尚不確定。在對一線療法反應後，歷史上，ASCT係在在對一線療法反應後進行。此研究涉及使用CAR T細胞療法而非ASCT作為一線療法之鞏固。兩項正在進行之大型隨機化研究正在比較一線療法後之ASCT與後線療法後之ASCT。初始結果指示兩臂之間無總體存活差異3，指示延遲ASCT產生與作為一線療法之鞏固之ASCT相當的長期結果。因此，支持利用CAR T細胞療法之一線療法之研究鞏固的推遲ASCT預計不會危害個體之結果。
此研究之階段B及C將入選已對一線或二線療法有反應之個體且在廣泛暴露於細胞毒性化學療法之前收穫T細胞用於CAR T細胞製造。預計與在復發/難治性環境中收穫之細胞相比，在此臨床環境中收穫之T細胞將導致更具臨床活性之CAR T細胞產物。此預計源於來自經CART19治療之CLL患者之發現，顯示臨床結果與早期記憶T細胞表型之存在密切相關63。多發性骨髓瘤惡化伴隨著耗竭T細胞表型之發展64。由於患者經由多線療法而惡化，隨著疾病負擔之增加且患者接受愈來愈具侵襲性之療法(通常具有廣泛之細胞毒性作用機制)，T細胞庫可能逐漸受損。該等因素(增加疾病負擔及免疫抑制療法)可能限制CAR T細胞療法在患有復發/難治性疾病之患者中之臨床效能。
在Penn執行之用於評估作為多發性骨髓瘤之早期療法之鞏固的新穎細胞療法的先前研究已有先例。若干研究已使用成為CAR T細胞製造之基礎之相同技術研究在離體活化及擴增後標準護理ASCT後自體T細胞的輸注。在該等研究中，在對一線療法有反應之後但在ASCT之前收穫T細胞用於製造。此方法之初步研究展現，藉由組合疫苗接種與自體T細胞輸注，可增強ASCT後免疫重建65-70。在UPCC 01411中，在此環境中第一次使用基因修飾之T細胞。在此研究中，將T細胞用針對睪丸癌抗原(NY-ESO1或MAGE-A3，取決於個體之HLA類型)之親和力增強之T細胞受體轉導。在接受T細胞靶標NY-ESO1之同類群組中，9/10個體在輸注後≥2年在外周血中展現經改造細胞之持久性，指示由此患者群體製造之經改造T細胞可達成長期活體內持久性71。
鞏固療法之評估效能之挑戰係如何區分對研究療法之反應與對先前療法之反應。舉例而言，在UPCC 01411中，在高劑量美法侖及ASCT後立刻投與T細胞，此使得難以區分對美法侖之臨床反應與對經改造T細胞之臨床反應。為了避免此限制，此方案限制入選已至少達成最小反應、但儘管已經接受至少三個週期對先前療法仍無完全反應的個體，此時反應通常「停止增加」(即，不能利用進一步療法明顯地改良)。此外，個體將使用高劑量美法侖及ASCT將標準鞏固推遲至後線療法，並接受環磷醯胺及氟達拉濱(其本身預計不會在此群體中實現顯著抗骨髓瘤反應)作為淋巴細胞清除性化學療法。因此，利用此研究設計，預計能夠將觀察到之任何多發性骨髓瘤反應歸因於CAR T細胞之臨床活性。
個體選擇
納入凖則
1. 根據IMWG 2014準則(Rajkumar SV等人 The lancet oncology. 2014；15(12):e538-548)，個體必須具有多發性骨髓瘤之診斷，其具有以下高風險特徵中之任一者。階段A擴展中之個體無需具有任何高風險特徵：
a. β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L且LDH大於正常值上限。注意：在起始全身性療法之前未量測LDH及/或β-2-微球蛋白之個體可基於起始全身性療法後獲得之量測值來取得資格。
b. 高風險FISH特徵：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)，連同β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L (即，修訂之ISS 3期)。注意：在起始全身性療法之前未量測β-2-微球蛋白之個體可基於起始全身性療法後獲得之量測值來取得資格。
c. 中期核型，其中除超二倍體之外具有＞3個結構異常。
d. 在入選之前之任何時間，漿細胞白血病(外周血中＞ 20%之液細胞)。
e. 對於利用「imid/PI」組合(沙利竇邁、雷利竇邁或泊馬竇邁與硼替佐米、阿西咗脒或卡非佐米之組合)之初始療法，無法達成部分反應或更佳反應(藉由IMWG 2016準則(Kumar S等人，The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346))。
f. 在一線療法時早期惡化，定義為惡化(根據IMWG 2016準則(Kumar S等人，The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346))
i. 在開始利用「imid/PI」組合之一線療法之一年內
ii. 在完成利用「imid/PI」組合之一線療法之6個月內(即，接受「imid/PI」組合、過渡至觀察或維持療法且在此過渡之6個月內惡化之患者)
iii. 在高劑量美法侖及自體幹細胞移植之一年內(僅階段A個體)
2. 關於先前骨髓瘤療法，個體必須符合以下準則：
a. 階段A及階段A擴展：
a. 個體必須患有在至少兩個方案(包括蛋白酶體抑制劑及沙利竇邁類似物(沙利竇邁、雷利竇邁、泊馬竇邁)後復發或對於其難治的疾病。難治性定義為在療法中或在停止療法60天內疾病惡化。
b. 個體必須對其當前方案至少達成最小反應(如藉由IMWG 2016準則(Kumar S等人， The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346)所定義)。
c. 個體必須尚未接受利用抗BCMA細胞療法之先前治療 個體可能已接受其他BCMA定向藥劑(例如抗BCMA抗體-藥物偶聯物或雙特異性抗體)治療。
b. 階段B及C：
a. 個體必須處於其多發性骨髓瘤療法之一線，但以下除外：若該惡化發生在開始一線療法之6個月內，則由於在一線療法期間之疾病惡化而前進至二線療法之個體係合格的。療法之各線係由IMWG 2016準則(Kumar S等人， The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346)定義。
b. 個體必須尚未接受細胞毒性化學療法(例如多柔比星、環磷醯胺、依託泊苷、順鉑)，但以下除外：
i. 每週低劑量環磷醯胺(≤500 mg/m2 /週)
ii. 若限於單一週期，則連續輸注環磷醯胺。
c. 個體必須尚未經歷同種異體幹細胞移植。
d. 個體必須在入選前≤1年針對多發性骨髓瘤起始全身性療法。
e. 個體必須已接受至少3個完整週期之其當前方案且對於最近線之療法已達成至少最小反應(如由IMWG 2016準則(Kumar S等人， The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346)所定義)。
3. 根據IMWG 2016準則(Kumar S等人，The Lancet Oncology；2016；17(8):e328-e346)，個體在入選時必須尚未達成完全或嚴格完全反應，除非藉由流式細胞術在骨髓中可檢測到純系漿細胞。(即，若最小殘存疾病可藉由骨髓流式細胞術記載，則完全或嚴格完全反應之個體係合格的)。
4. 個體必須簽署書面知情同意書。
5. 個體必須≥ 18歲。
6. 個體必須具有足夠的生命器官功能：
a. 血清肌酸酐≤2.5或肌酸酐清除率≥30 ml/min (根據CKD-EPI量測或估計)且不依賴於透析。
b. 絕對嗜中性球計數≥1000/μl且血小板計數≥50,000/μl (若骨髓漿細胞≥50%細胞性，則≥30,000/μl)。
c. SGOT ≤ 3x正常值上限且總膽紅素≤ 2.0 mg/dl (高膽紅素血症歸因於吉伯特氏症候群之患者除外)。
d. 左心室射血分數(LVEF)≥ 45%。必須在入選8週內實施LVEF評估。
7. 除了可歸因於多發性骨髓瘤療法之外周神經病變外，先前/正在進行之療法之毒性必須已根據CTCAE 5.0準則恢復至≤2級或恢復至個體之先前基線。
8. 患者之ECOG體能狀態必須為0-2
9. 個體必須願意放棄一線ASCT。
10. 生殖潛能之個體必須同意使用可接受之節育方法，如方案部分4.3中所述。
排除凖則
1. 妊娠或哺乳女性
2. 對白血球分離之靜脈通路不足或禁忌白血球分離。
3. 活動性B型肝炎、C型肝炎或HIV感染或其他活動性、不受控制之感染。
4. 將如所概述排除參與之任何不受控醫學或精神病病症。
5. NYHA III類或IV類心臟衰竭(參見附錄2)、不穩定性心絞痛或最近(6個月內)心肌梗塞或持續(＞30秒)心室快速性心律不整之病史。
6. 具有活動性自體免疫疾病，包括結締組織疾病、眼色素層炎、類肉瘤病、發炎性腸病或多發性硬化，或具有需要延長免疫抑制療法之嚴重(由研究者判斷)自體免疫疾病病史。
7. 具有骨髓瘤之先前或活動性中樞神經系統(CNS)受累(例如柔腦膜病、實質腫塊)。除非存在可疑症狀或放射照相發現，否則不需要對此進行篩查(例如利用腰椎穿刺)。即使CSF對骨髓瘤呈陰性，亦排除患有顱內擴張並涉及硬腦膜之顱骨疾病的個體。
研究藥物
CART-BCMA 細胞
CART-BCMA細胞係已經改造以表現細胞外單鏈抗體(scFv)之自體T細胞，該細胞外單鏈抗體對連接至細胞內信號傳導分子之BCMA具有特異性，該細胞內信號傳導分子由包括連接至4-1BB共刺激結構域之TCRζ信號傳導模組的串聯信號傳導結構域組成。將CART-BCMA細胞在可輸注之低溫介質中冷凍保藏，並在輸液袋中分配。CART-BCMA細胞在階段A及B中以分劑量輸注(在第0天10%劑量、在第1天30%劑量及在第2天60%劑量)或在階段C中(在第0天以單次輸注)投與。目標CART-BCMA劑量為5×108 個轉導細胞，最小可接受輸注劑量為0.5×108 個轉導細胞。劑量經調配以至少達成10%劑量之最小可接受劑量。根據多少細胞可用調配隨後劑量。
huCART19 細胞
huCART19細胞係已經改造以表現細胞外單鏈抗體(scFv)之自體T細胞，該細胞外單鏈抗體對連接至細胞內信號傳導分子之CD19具有特異性，該細胞內信號傳導分子由包括連接至4-1BB共刺激結構域之TCRζ信號傳導模組的串聯信號傳導結構域組成。將huCART19細胞在可輸注之低溫介質中冷凍保藏，並在輸液袋中分配。huCART19細胞在階段A及B中以分劑量輸注(在第0天10%劑量、在第1天30%劑量及在第2天60%劑量)或在第0天(階段C)以單次輸注投與。目標huCART19劑量為5×108 個轉導細胞，最小可接受輸注劑量為0.5×108 個轉導細胞。劑量經調配以至少達成10%劑量之最小可接受劑量。根據多少細胞可用調配隨後劑量。
僅階段 A 、階段 A 擴展及階段 B ： 適用於接受 CAR T 細胞輸注 (30% + 60% 劑量 ) ：
1. 與在治療醫師或PI看來會增加實驗細胞輸注之風險之先前研究相比，患者不應經歷體能或臨床狀態之顯著變化。
2. 經歷在治療研究者或PI看來可能對個體安全性或個體接受CAR T細胞之進一步輸注之能力產生不利影響的新實驗室異常之患者可延遲其輸注，直至治療研究者及PI確定在臨床上適合進行CART-BCMA細胞輸注。
3. 若治療醫師及/或PI感覺患者可能正在經歷細胞介素釋放症候群(CRS)或其他嚴重CART相關毒性之體徵/症狀，則可預先延遲30%及60%輸注以容許在每次隨後輸注之前進行更長時間之觀察及監測。單個孤立之溫度升高本身並不定義CRS，但研究者應考慮將輸注延遲24小時以在該等情況下觀察個體。若發生預先延遲，則所有輸注必須在第+7天結束時完成。
淋巴細胞清除性化學療法
在初始CAR T細胞輸注之前，淋巴細胞清除性化學療法將作為環磷醯胺300 mg/m2 + 氟達拉濱30 mg/m2 每日一次共三天之方案投與。淋巴細胞清除性化學療法必須經排定使得療法之最後一天在第一CAR T細胞輸注之前3天(+/- 1天)。
儘管出於研究目的作為此研究之一部分投與，但環磷醯胺及氟達拉濱二者皆係FDA批准之藥劑，並將根據其FDA批准之標記及標準制度實踐進行製備及輸注。用於該方案之較佳止吐術前用藥係昂丹司瓊(ondansetron) 16 mg及地塞米松12 mg，各自在每次化學療法輸注之前每日投與；此方案可以由治療研究者決定改變。研究者可根據需要使用開立額外之標準家庭止吐藥(例如昂丹司瓊、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、氯羥去甲安定(lorazepam))的處方。對於估計GFR ＜80 mL/min之個體，研究者可決定減少氟達拉濱劑量。
等效內容
本文引用之每一及所有專利、專利申請案及公開案之揭示內容係全文以引用方式併入本文中。儘管已參照特定態樣揭示本發明，但顯然，在不背離本發明之真實精神及範圍之情況下，熟習此項技術者可想到本發明之其他態樣及變化形式。意欲將隨附申請專利範圍視為包括所有該等態樣及等效變化形式。
當連同附圖閱讀時，將更好地理解本發明之較佳實施例之以下詳細說明。出於闡釋本發明之目的，在圖示中顯示目前較佳之實施例。然而，應理解，本發明並不限於圖示中所示實施例之精確佈置及手段。
圖 1 係臨床試驗示意圖。PR = 部分反應。Cy/Flu = 環磷醯胺 + 氟達拉濱。

Claims (52)

  1. 一種治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向該個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中： (i) 該個體患有高風險多發性骨髓瘤，例如依據修訂之國際分期系統(Revised International Staging System)為第III期高風險多發性骨髓瘤； (ii) 該個體正接受或已接受一線療法(例如誘導療法，例如包含以下中之一者、二者或全部之誘導療法：雷利竇邁(lenalidomide)、硼替佐米(bortezomib)或地塞米松(dexamethasone))或二線療法，例如該一線療法或該二線療法之至少三個週期，例如依據如例如表5中所述之IMWG 2016準則，且該個體尚未自該一線或該二線療法惡化；且 (iii) 該個體至少已顯示最小反應，例如，例如依據如例如表5中所述之IMWG 2016準則，該個體對該個體所接受之最近療法(例如該一線療法或該二線療法)已顯示極佳部分反應、部分反應或最小反應， 藉此治療該個體。
  2. 如請求項1之方法，其中該個體正接受或已接受一線療法且尚未接受二線療法。
  3. 如請求項1之方法，其中該個體正接受或已接受二線療法且尚未接受三線療法，其中該個體由於在接受一線療法期間或之後之疾病惡化而前進至該二線療法，其中在開始該一線療法之一年內或在完成該一線療法之六個月內出現該疾病惡化。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中例如依據如例如表5中所述之IMWG 2016準則，該個體對該個體所接受之該最近療法(例如該一線療法或該二線療法)尚未顯示或未顯示完全反應或嚴格完全反應。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中： (i) 該個體尚未接受細胞毒性化學療法(例如多柔比星(doxorubicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、依託泊苷(etoposide)或順鉑(cisplatin))，但以下例外： (a) 該個體已接受每週低劑量環磷醯胺(例如≤ 500 mg/m2 /週)，或 (b) 該個體已接受單一週期之環磷醯胺連續輸注；或 (ii) 在該個體接受細胞毒性化學療法之前，自該個體分離T細胞，供製造第一BCMA CAR表現細胞療法。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該個體尚未接受自體或同種異體幹細胞移植。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該個體已在一年內開始針對多發性骨髓瘤之全身性療法。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中： (i) 該個體顯示β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L及高風險FISH特徵：缺失17p、t(14；16)、t(14；20)、t(4；14)； (ii) 該個體顯示β-2-微球蛋白≥ 5.5 mg/L且LDH大於正常值上限； (iii) 該個體顯示中期核型，其中除超二倍體之外，具有＞3個結構異常； (iv) 該個體患有漿細胞白血病，例如該個體在外周血中顯示＞20%漿細胞； (v) 對於Imid/PI組合(沙利竇邁(thalidomide)、雷利竇邁或泊馬竇邁(pomalidomide)與硼替佐米、阿西咗脒(ixazomib)或卡非佐米(carfilzomib)之組合)，該個體未能達成部分反應或更佳反應(例如，依據如例如表5中所述之IMWG 2016準則)；或 (vi) 該個體在開始該一線療法之一年內(例如六個月內)或在完成該一線療法之六個月內，在利用與Imid/PI組合之一線療法時惡化。
  9. 一種治療患有與BCMA表現相關之疾病之個體的方法，其包含向該個體投與第一BCMA CAR表現細胞療法，其中： (i) 該個體患有高風險多發性骨髓瘤， (ii) 該個體之多發性骨髓瘤在至少兩個方案(例如，蛋白酶體抑制劑及/或沙利竇邁或其類似物(例如沙利竇邁、雷利竇邁或泊馬竇邁))之後復發或對於該至少兩個方案出現頑抗性，且 (iii) 該個體至少已顯示最小反應，例如，該個體例如依據如例如表5中所述之IMWG 2016準則，對該個體所接受之最近療法(例如三線療法，例如補救療法，例如標準補救療法)已顯示極佳部分反應、部分反應或最小反應， 藉此治療該個體。
  10. 如請求項9之方法，其中該個體例如依據如例如表5中所述之IMWG 2016準則，對該個體所接受之該最近療法(例如三線療法，例如補救療法，例如標準補救療法)尚未顯示或未顯示完全反應或嚴格完全反應。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該個體在接受該最近療法(例如三線療法，例如補救療法，例如標準補救療法)之後顯示可檢測之殘存疾病。
  12. 如請求項9至11中任一項之方法，其中該個體尚未接受抗BCMA細胞療法。
  13. 如請求項9至12中任一項之方法，其中該個體在接受美法侖(melphalan)及幹細胞移植(例如自體幹細胞移植)之一年內惡化。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與第一CD19 CAR表現細胞療法。
  15. 如請求項14之方法，其中該第一CD19 CAR表現細胞療法係在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法之前、並行或之後投與。
  16. 如請求項14之方法，其中該第一CD19 CAR表現細胞療法係與該第一BCMA CAR表現細胞療法在同一天投與，視情況其中該第一CD19 CAR表現細胞療法係在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法完成之後至少一小時投與。
  17. 如請求項14之方法，其中該第一CD19 CAR表現細胞療法係在該第一BCMA CAR表現細胞療法之後投與，其中若該個體在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法後發生急性輸注反應，則在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法後最多48小時(例如24、36或48小時)投與該第一CD19 CAR表現細胞療法。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該第一BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。
  19. 如請求項18之方法，其中該第一BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。
  20. 如請求項18之方法，其中該第一BCMA CAR表現細胞療法係以分劑量輸注投與，例如，其中該個體在第一輸注日接受總劑量之約10%，在第二輸注日接受總劑量之約30%，且在第三輸注日接受總劑量之約60%。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該第一BCMA CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量例如以單次輸注，例如靜脈內投與。
  22. 如請求項14至21中任一項之方法，其中該第一CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。
  23. 如請求項22之方法，其中該第一CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。
  24. 如請求項22之方法，其中該第一CD19 CAR表現細胞療法係以分劑量輸注投與，例如，其中該個體在第一輸注日接受總劑量之約10%，在第二輸注日接受總劑量之約30%，且在第三輸注日接受總劑量之約60%。
  25. 如請求項14至24中任一項之方法，其中該第一CD19 CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量例如以單次輸注，例如靜脈內投與。
  26. 如請求項1至25中任一項之方法，其進一步包含在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法及/或該第一CD19 CAR表現細胞療法之前，向該個體投與第一調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱(fludarabine))。
  27. 如請求項26之方法，其包含在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法及/或該第一CD19 CAR表現細胞療法之前，向該個體投與環磷醯胺及氟達拉濱，視情況其中： (i) 環磷醯胺係每日以300 mg/m2 靜脈內投與，共三天；且 (ii) 氟達拉濱係每日以30 mg/m2 靜脈內投與，共三天。
  28. 如請求項26或27之方法，其中該第一BCMA CAR表現細胞療法及/或該第一CD19 CAR表現細胞療法係在完成該第一調節劑之投與之後(例如在投與最後一個劑量之該淋巴清除劑，例如最後一個劑量之該淋巴細胞清除性化學療法，例如最後一個劑量之環磷醯胺及/或氟達拉濱之後) 2、3或4天(例如3天)投與。
  29. 如請求項26至28中任一項之方法，其進一步包含在投與該第一調節劑(例如該淋巴清除劑，例如該淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)之前，自該個體獲得第一樣本(例如血球分離樣本)，及使用該樣本製造該第一BCMA CAR表現細胞療法及/或該第一CD19 CAR表現細胞療法。
  30. 如請求項29之方法，其進一步包含在投與該第一調節劑(例如該淋巴清除劑，例如該淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)之前且在獲得該第一樣本之後，自該個體獲得第二樣本(例如幹細胞)，用於準備自體幹細胞移植。
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其進一步包含在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法及/或該第一CD19 CAR表現細胞療法之後，例如： (i) 在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法及/或該第一CD19 CAR表現細胞療法之後26、27、28、29、30、31或32天，例如28天；或 (ii) 在≤2級治療相關毒性消退之後， 向該個體投與維持劑(例如雷利竇邁)。
  32. 如請求項31之方法，其進一步包含在投與該維持劑之後，向該個體投與第二BCMA CAR表現細胞療法，其中： (i) 從投與該第一BCMA CAR表現細胞療法後，經過80-100天(例如90天)； (ii) 在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法後，該個體之多發性骨髓瘤已惡化；或 (iii) 在投與該第一BCMA CAR表現細胞療法之後，該個體已展現或正展現殘存多發性骨髓瘤之客觀證據。
  33. 如請求項32之方法，其進一步包含在投與該維持劑之後，向該個體投與第二CD19 CAR表現細胞療法，其中在投與該第一CD19 CAR表現細胞療法之後，例如在投與該第一CD19 CAR表現細胞療法之後7-28天，該個體之＞ 3%外周血淋巴球係CD19+。
  34. 如請求項33之方法，其中該第二CD19 CAR表現細胞療法係在投與該第二BCMA CAR表現細胞療法之前、並行或之後投與。
  35. 如請求項33之方法，其中該第二CD19 CAR表現細胞療法係與該第二BCMA CAR表現細胞療法在同一天投與，視情況其中該第二CD19 CAR表現細胞療法係在投與該第二BCMA CAR表現細胞療法完成之後至少一小時投與。
  36. 如請求項33之方法，其中該第二CD19 CAR表現細胞療法係在該第二BCMA CAR表現細胞療法之後投與，其中若該個體在投與該第二BCMA CAR表現細胞療法後發生急性輸注反應，則在投與該第二BCMA CAR表現細胞療法後最多48小時(例如24、36或48小時)投與該第二CD19 CAR表現細胞療法。
  37. 如請求項32至36中任一項之方法，其中該第二BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。
  38. 如請求項37之方法，其中該第二BCMA CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。
  39. 如請求項37之方法，其中該第二BCMA CAR表現細胞療法係以分劑量輸注投與，例如，其中該個體在第一輸注日接受總劑量之約10%，在第二輸注日接受總劑量之約30%，且在第三輸注日接受總劑量之約60%。
  40. 如請求項32至39中任一項之方法，其中該第二BCMA CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞、例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量以單次輸注，例如靜脈內投與。
  41. 如請求項33至40中任一項之方法，其中該第二CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注或分劑量輸注投與。
  42. 如請求項41之方法，其中該第二CD19 CAR表現細胞療法係以單次輸注投與。
  43. 如請求項41之方法，其中該第二CD19 CAR表現細胞療法係以分劑量輸注投與，例如，其中該個體在第一輸注日接受總劑量之約10%，在第二輸注日接受總劑量之約30%，且在第三輸注日接受總劑量之約60%。
  44. 如請求項33至43中任一項之方法，其中該第二CD19 CAR表現細胞療法係以約1×108 、2×108 、3×108 、4×108 、5×108 、6×108 、7×108 、8×108 或9×108 個活的CAR表現細胞，例如約5×108 個活的CAR表現細胞，例如約5×108 個活的CAR表現細胞之劑量以單次輸注，例如靜脈內投與。
  45. 如請求項32至44中任一項之方法，其中該第二BCMA CAR表現細胞療法與該第一BCMA CAR表現細胞療法相同。
  46. 如請求項33至45中任一項之方法，其中該第二CD19 CAR表現細胞療法與該第一CD19 CAR表現細胞療法相同。
  47. 如請求項32至46中任一項之方法，其進一步包含在投與該第二BCMA CAR表現細胞療法及/或該第二CD19 CAR表現細胞療法之前，向該個體投與第二調節劑(例如淋巴清除劑，例如淋巴細胞清除性化學療法，例如環磷醯胺及/或氟達拉濱)。
  48. 如請求項47之方法，其包含在投與該第二BCMA CAR表現細胞療法及/或該第二CD19 CAR表現細胞療法之前，向該個體投與環磷醯胺及氟達拉濱，視情況其中： (i) 環磷醯胺係每日以300 mg/m2 靜脈內投與，共三天；且 (ii) 氟達拉濱係每日以30 mg/m2 靜脈內投與，共三天。
  49. 如請求項47之方法，其包含在投與該第二BCMA CAR表現細胞療法及/或該第二CD19 CAR表現細胞療法之前，以例如1.5 g/m2 向該個體投與環磷醯胺。
  50. 如請求項1至49中任一項之方法，其中該第一或該第二BCMA CAR表現細胞療法包含表現BCAM CAR之細胞(例如細胞群體)，其中： (i) 該BCMA CAR包含表2或3中所列示之任何BCMA scFv結構域胺基酸序列之重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2及HCDR3中之一或多者(例如所有三者)及/或表2或3中所列示之任何BCMA scFv結構域胺基酸序列之輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3中之一或多者(例如所有三者)，或與其具有95-99%一致性之序列； (ii) 該BCMA CAR包含表2或3中所列示之重鏈可變區(VH)及/或表2或3中所列示之輕鏈可變區(VL)，或與其具有95-99%一致性之序列； (iii) 該BCMA CAR包含表2或3中所列示之BCMA scFv結構域胺基酸序列(例如SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148及SEQ ID NO: 149)，或與其具有95-99%一致性之序列； (iv) 該BCMA CAR包含表2或3中所列示之全長BCMA CAR胺基酸序列(例如不成熟BCMA CAR之胺基酸序列包含SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219、SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 222、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232及SEQ ID NO: 233之胺基酸序列)，或與其具有95-99%一致性之序列；或 (v) 該BCMA CAR係由表2或3中所列示之核酸序列(例如SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170)或與其具有95-99%一致性之序列編碼。
  51. 如請求項14至50中任一項之方法，其中該第一或該第二CD19 CAR表現細胞療法包含表現CD19 CAR之細胞(例如細胞群體)，其中： (i) 該CD19 CAR包含表6或7中所列示之重鏈互補決定區1 (HCDR1)、HCDR2及HCDR3中之一或多者(例如所有三者)及/或表6或8中所列示之輕鏈互補決定區1 (LCDR1)、LCDR2及LCDR3中之一或多者(例如所有三者)，或與其具有95-99%一致性之序列； (ii) 該CD19 CAR包含表6中所列示之任何CD19 scFv結構域胺基酸序列之重鏈可變區(VH)及/或表6中所列示之任何CD19 scFv結構域胺基酸序列之輕鏈可變區(VL)，或與其具有95-99%一致性之序列； (iii) 該CD19 CAR包含表6中所列示之CD19 scFv結構域胺基酸序列或與其具有95-99%一致性之序列； (iv) 該CD19 CAR包含表6中所列示之全長CD19 CAR胺基酸序列或與其具有95-99%一致性之序列；或 (v) 該CD19 CAR係由表6中所列示之核酸序列或與其具有95-99%一致性之序列編碼。
  52. 如請求項1至51中任一項之方法，其中該個體係人類患者。
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