TW201903145A

TW201903145A - 將基因編輯用於產生通用型ｔ細胞受體重導向的ｔ細胞以進行輸入免疫治療的用途

Info

Publication number: TW201903145A
Application number: TW107112792A
Authority: TW
Inventors: 趙陽兵; 劉曉軍; 潘偉
Original assignee: 賓夕法尼亞大學董事會
Priority date: 2017-04-13
Filing date: 2018-04-13
Publication date: 2019-01-16
Also published as: US20210155667A1; US20190055297A1; US20250154223A1; US10934336B2; US12227555B2; WO2018191490A1

Abstract

本發明包含被修飾的免疫細胞或其前驅細胞的組合物及方法，該組合物及方法包含誘導型表現系統。本發明進一步提供了適用於T細胞療法的被基因編輯修飾的免疫細胞。本發明另外提供了使用本發明的被修飾的免疫細胞的治療方法。

Description

將基因編輯用於產生通用型T細胞受體重導向的T細胞以進行輸入免疫治療的用途

本申請案依據35 U.S.C.§ 119(e)要求以下美國臨時申請案之優先權：於2017年4月13日提交，申請號為62/485,166。前述案件通過引用而將其整體納為本申請案揭露之一部分。

由於細胞免疫療法可用來治療癌症，故其越來越受到重視。舉例來說，在臨床上，經過基因工程改造而靶向CD19的T細胞，已成功地用來治療某些B細胞白血病。隨著臨床上的成功，現在人們越來越重視治療實體腫瘤癌症的免疫細胞療法。然而，為了要產生療效，免疫細胞必須解決許多技術課題，其包含可能因暴露於腫瘤微環境而受到免疫抑制的情況下所引起的免疫細胞功能障礙(俗稱的「T細胞耗竭」情況)。在諸如實體腫瘤的疾病環境中，耗竭現象包含因T細胞長期暴露於抗原下而導致其功能障礙持續惡化、多種抑制性受體的表現量增加、逐漸喪失作用性細胞激素的分泌、細胞代謝的改變，以及顯著不同的轉錄譜。T細胞耗竭通常與無法有效控制的長期感染和腫瘤有關，但是復甦耗竭的T細胞可以使其重新獲得免疫力。

此外，雖然將同種異體免疫細胞(例如，嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)或T細胞受體(T cell receptor，TCR)修飾的T細胞)用作通用型作用細胞，提供了目前癌症和傳染病細胞療法的替代方案，且可能改善其效果，但是如果不從最終的T細胞產物中剔除這些存在於免疫細胞上的內源TCR/CD3複合體，則其可能會引發移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)。然而，要將表現有內源TCR(其會引發GVHD)的CD3+ T細胞，與表現有轉移TCR的CD3+ T細胞和表現有內源TCR以及轉基因TCR的CD3+ T細胞分離開來，是不可能的。此外，雖然可以使用多種策略來刺激和擴增不具TCR的CD3陰性T細胞(WO2016069283)，但是這些再刺激的CD3陰性T細胞難以轉導，使得無法透過轉導經再刺激而分選出且經基因編輯過的CD3陰性T細胞來產生通用型T細胞。此外，使用再刺激T細胞可能會降低治療效果，使得製造過程更加複雜並提高成本。

因此，目前仍需要有一種針對上述問題的新型免疫細胞治療製劑，而本發明滿足了這種需求。

本發明提供了經基因修飾的免疫細胞(例如，分離的T細胞)，其能夠在選定的條件下誘發外源受體(例如嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)或轉基因T細胞受體(T cell receptor，TCR)的表現。

在某些實施例中，本發明提供了經基因修飾的免疫細胞，其包含有一外源核酸，外源核酸編碼有一外源受體，其中外源受體是選擇性地結合至一腫瘤所表現的腫瘤抗原上。該細胞更包含一誘導型基因表現系統，當向細胞施用一誘導劑時，該基因表現系統會被誘導，並且外源受體係表現於免疫細胞的表面。

在某些實施例中，誘導型基因表現系統包含：(a)第一核酸，其包含組成型啟動子(constitutive promoter)，該組成型啟動子係可操作地連接至編碼有反式活化蛋白(transactivator protein)的核酸序列；以及(b)第二核酸，其包含誘導型啟動子，該誘導型啟動子係可操作地連接至編碼有外源受體的核酸序列，而第二核酸與第一核酸是反向的。

在某些實施例中，反式活化蛋白是反向Tet抑制蛋白(reverse Tet repressor，rTetR)。在某些實施例中，反式活化蛋白是反向四環素調控反式活化蛋白(reverse tetracycline-controlled transactivator protein，rtTA)。在某些實施例中，反式活化蛋白是Tet-On 3G反式活化蛋白。在其他實施例中，誘導型啟動子包含Tet操作子序列。在其他實施例中，誘導型啟動子包含一或多個重複的Tet操作子序列。在其他實施例中，誘導型啟動子是TRE3GS啟動子。

在其他實施例中，組成型啟動子係驅動反式活化蛋白的持續性表現(constitutive expression)。在其他實施例中，組成型啟動子是人類組成型啟動子，例如人類磷酸甘油酯激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)啟動子或人類延長因子1α(elongation factor 1 alpha，EF1α)啟動子。

在其他實施例中，誘導劑是一四環素或其衍生物，例如去氧羥四環素。

在某些實施例中，誘導型基因表現系統編碼有反向Tet反式活化(reverse Tet transactivator，rtTA)融合蛋白並包含至少一個啟動子，該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。

在某些實施例中，經基因修飾的免疫細胞包含四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統，且該Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化(reverse Tet transactivator，rtTA)融合蛋白和至少一個啟動子，而該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。

在某些實施例中，本發明提供一分離的核酸，其編碼有外源受體(例如嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)或轉基因T細胞受體(T cell receptor，TCR))，其表現受到四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統的控制。Tet-On誘導型基因表現系統包含有反向Tet反式活化(reverse Tet transactivator，rtTA)融合蛋白和至少一個啟動子，該啟動子融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。

在其他實施例中，本發明提供一經基因修飾的T細胞，其包含一外源核酸。該外源核酸編碼有一外源受體(例如嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)或轉基因T細胞受體)，其表現受到四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統的控制。該Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化融合蛋白和至少一個啟動子，而該啟動子融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。當向細胞施用去氧羥四環素(doxycycline， Dox)時，該基因表現系統會被誘導，並表現T細胞受體。

在其他實施例中，誘導型啟動子係誘發外源TCR或CAR的表現，且其表現量與誘導劑的劑量呈現依賴性。在某些實施例中，撤除(withdrawal)誘導劑會使外源受體表現量下降。

在某些實施例中，外源受體是T細胞受體(T cell receptor，TCR)，例如野生型T細胞受體、高親和力T細胞受體或嵌合T細胞受體。在某些實施例中，外源T細胞受體包含至少一個雙硫鍵。在某些實施例中，外源T細胞受體包含TCRα鏈(TCR alpha chain)及TCRβ鏈(TCR beta chain)。

在某些實施例中，外源受體是一嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)。在一實施例中，嵌合抗原受體包含一抗原結合結構域、一跨膜結構域及一細胞內結構域。在一實施例中，抗原結合結構域是選自於抗體、scFv及Fab所組成的群組。在一實施例中，嵌合抗原受體更包含一鉸鏈結構域(hinge domain)。示例性鉸鏈結構域包含抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區(hinge region)、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人工鉸鏈結構域、包含CD8核酸序列的鉸鏈、或其任何組合。在某些實施例中，跨膜結構域是選自於人工疏水序列和I型跨膜蛋白的跨膜結構域、T細胞受體的α鏈(alpha chain)、β鏈(beta chain)或ζ鏈(zeta chain)、CD28、CD3ε(CD3 epsilon)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在其他實施例中，細胞內結構域包含至少一個共刺激結構域，該至少一個共刺激結構域是選自TNFR超家族蛋白中的共刺激結構域所組成的群組：CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C及B7-H3。在其他實施例中，細胞內結構域包含選自於下列群組的細胞內結構域：人類CD3ζ鏈的細胞質訊息傳導結構域(cytoplasmic signaling domains of a human CD3 zeta chain)、FcyRIII、FcsRI、Fc受體的細胞質尾區(cytoplasmic tail)、免疫受體酪胺酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的細胞質受體、 TCR(TCR zeta)，FcRγ(FcR gamma)、FcRβ(FcR beta)、CD3γ(CD3 gamma)、CD3δ(CD3 delta)、CD3ε(CD3 epsilon)、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d。

在某些實施例中，免疫細胞是經基因修飾的T細胞。在其他實施例中，細胞是同種異體細胞。在其他實施例中，細胞是自體細胞。在其他實施例中，細胞是人類細胞。

在又一其他實施例中，經修飾的免疫細胞更包含在一個或多個基因座中的一插入及/或缺失，該一個或多個基因座編碼一內源免疫蛋白。該插入及/或缺失能夠下調該內源免疫蛋白的表現。在某些實施例中，插入及/或缺失中的至少一個是基因編輯的結果，例如CRISPR/Cas9基因編輯。在某些實施例中，內源免疫蛋白的表現在腫瘤存在時會被上調或下調。在某些實施例中，內源免疫蛋白是選自於TRAC、TRBC、B2M及CIIT所組成的群組。在其他實施例中，內源免疫蛋白是免疫查核點蛋白，例如PD1或PDL1。

在某些實施例中，免疫細胞更包含一轉換受體(switch receptor)。示例性的轉換受體包含PD1-CTM-CD28、PD1-PTM-CD28以及PD1^A132L-PTM-CD28。在其他實施例中，轉換受體是TGFβR-IL12Rβ1或TGFβR-IL12Rβ2。

在某些實施例中，經基因修飾的免疫細胞(例如T細胞)更包含至少一個經過基因編輯的基因(即其係經基因編輯)。在某些實施例中，是使用CRISPR/Cas9系統來進行基因編輯。

在某些實施例中，經基因修飾的免疫細胞，包含有四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統。該Tet-On誘導型基因表現系統包含有反向Tet反式活化融合蛋白和至少一個啟動子，該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。

在某些實施例中，本發明提供一分離的核酸，其編碼有外源受體(例如嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)或轉基因T細胞受體(T cell receptor，TCR))，其表現受到四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統的控制。該Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化融合蛋白和至少一個啟動子，而該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。在其他實施例中，本發明提供一經基因修飾的T細胞，其包含有一外源核酸。該外源核酸編碼一外源受體(例如嵌合抗原受體或轉基因T細胞受體)，其表現受到四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統的控制。該Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化融合蛋白和至少一個啟動子，而該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。當向細胞施用去氧羥四環素(doxycycline，Dox)時，該基因表現系統會被誘導，並表現T細胞受體。

在其他實施例中，本發明提供一種產生經基因修飾的免疫細胞的方法，該方法包括將一核酸引入免疫細胞中，該核酸包含一外源核酸。該外源核酸編碼一外源受體，而該外源受體的表現係在一誘導型表現系統的控制下，其中外源受體選擇性地結合至表現於一腫瘤上的腫瘤抗原。當向細胞施用一誘導劑時，該基因表現系統會被誘導，並在免疫細胞表面表現該外源受體。

在某些實施例中，誘導型基因表現系統包含：(a)一第一核酸，其包含一組成型啟動子，該組成型啟動子係可操作地連接至編碼有一反式活化蛋白(transactivator protein)的核酸序列；(b)一第二核酸，其包含一誘導型啟動子，該誘導型啟動子係可操作地連接至編碼有外源受體的核酸序列，該外源受體係選擇性地結合至表現於一腫瘤上的腫瘤抗原，而第二核酸與第一核酸是反向的。

在某些實施例中，核酸是透過一病毒轉導過程而引入的。在某些實施例中，病毒轉導過程包含使細胞與一病毒載體接觸，而該病毒載體包含核酸。在某些實施例中，該病毒載體是反轉錄病毒載體。

在某些實施例中，編碼有轉換受體的核酸是透過一病毒轉導過程而引入的。在某些實施例中，該病毒轉導過程包含使細胞與一病毒載體接觸，該病毒載體包含編碼有該轉換受體的該核酸。

在某些實施例中，該方法更包含在免疫細胞中引入一或多種多肽及/或核酸，前述一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源免疫蛋白的表現。在某些實施例中，前述一或多種能夠下調前述蛋白表現的多肽及/或核酸包含一CRISPR系統。在某些實施例中，該CRISPR系統包含一CRISPR核酸酶和一引導RNA(guide RNA)。在某些實施例中，引導RNA包含一引導序列，該引導序列與一內源基因的一目標序列互補，以便與內源基因的目標序列結合。在某些實施例中，CRISPR核酸酶及引導RNA包含一核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)複合體。

在某些實施例中，內源免疫蛋白的表現在腫瘤存在時會被上調或下調。在某些實施例中，內源免疫蛋白是選自於TRAC、TRBC、B2M及CIIT所組成的群組。在某些實施例中，目標序列係位在TRAC基因內，且引導RNA包含SEQ ID NOs：85~97中所示的任一個核酸序列。在某些實施例中，目標序列係位在TRBC基因內，且引導RNA包含SEQ ID NOs：1~24中所示的任一個核酸序列。在某些實施例中，目標序列係位在B2M基因內，且引導RNA包含SEQ ID NOs：73~84中所示的任一個核酸序列。在某些實施例中，目標序列係位在CIITA基因內，且引導RNA包含SEQ ID NOs：25~48中所示的任一個核酸序列。在某些實施例中，內源免疫蛋白是一免疫查核點蛋白，例如PD1或PDL1。在某些實施例中，目標序列係位在PD1基因內，且引導RNA包含SEQ ID NOs：49~72中所示的任一個核酸序列。

在其他實施例中，本發明提供一種用於過繼細胞轉移療法(adoptive cell transfer therapy)的方法，該方法包含向有需要的受試者施用如本發明所述的經修飾的免疫細胞群(例如T細胞)。

在其他實施例中，本發明提供一種產生經修飾的T細胞群的方法，該方法包含：a)刺激一被分離的T細胞群，從而產生一被刺激的T細胞群；b)向被刺激的T細胞群中引入包含有一誘導型TCR表現系統的一核酸，從而產生一經修飾的T細胞群；c)向經修飾的T細胞群中引入一或多種多肽及/或核酸，該一或多種多肽及/或核酸能夠下調所選擇的內源免疫蛋白表現，從而產生一經基因編輯所修飾的T細胞群；d)從經基因編輯所修飾的T細胞群中剔除CD3+ T細胞，並分離出一基因編輯所修飾的CD3陰性(CD3-)T細胞群；以及e)使基因編輯所修飾的CD3陰性(CD3-)T細胞群與一誘導劑接觸，以誘發外源TCR的表現，從而產生一經修飾的T細胞群。

在某些實施例中，刺激被分離的T細胞群的步驟包含使被分離的T細胞群與一抗CD3抗體及/或一抗CD28抗體接觸。在一實施例中，抗CD3抗體及/或抗CD28抗體係塗佈在一磁珠上。在另一實施例中，從經基因編輯所修飾的T細胞群中剔除CD3+ T細胞的步驟包含去除抗CD3抗體及/或抗CD28抗體。在另一實施例中，從經基因編輯所修飾的T細胞群中剔除CD3+ T細胞的步驟包含去除磁珠，該磁珠塗佈有抗CD3抗體及/或抗CD28抗體。

在其他實施例中，該方法更包含向被刺激的T細胞群中引入編碼有轉換受體的核酸。

在另一實施例中，本發明提供一種產生包含外源受體(例如嵌合抗原受體或轉基因T細胞受體)的基因修飾免疫細胞(例如T細胞)的方法。該方法包含：(a)用CD3及/或CD28來刺激一群免疫細胞(例如T細胞)，(b)用Tet-On基因誘導型基因表現系統來轉導該等免疫細胞，該Tet-On基因誘導型基因表現系統能夠誘發外源受體表現。該Tet-On誘導型基因表現系統包含一反向Tet反式活化融合蛋白和至少一個啟動子，而該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游，(c)以電穿孔方式將Cas9核醣核酸(RNA)或Cas9蛋白以及引導RNA引入該等免疫細胞中，(d)剔除CD3⁺ T細胞，(e)收取CD3^- T細胞，以及(f)向該等免疫細胞施用去氧羥四環素，以誘發免疫細胞上外源受體的表現。

在其他實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含透過本發明的方法產生的經修飾的免疫細胞和醫藥上可接受的載體。

在其他實施例中，本發明提供一種對有需要的受試者治療其腫瘤的方法，該方法包含向受試者施用本發明所述的醫藥組合物。在其他實施例中，該方法包含向受試者施用一誘導劑，從而誘發受試者中外源受體的表現。在某些實施例中，在將免疫細胞施用於受試者之前，使免疫細胞與誘導劑接觸。

在其他實施例中，本發明提供一種對有需要的受試者預防其T細胞耗竭的方法，該方法包含向受試者施用如本發明所述的醫藥組合物以及一誘導劑，該誘導劑會誘發受試者在腫瘤部位表現一外源性受體。在一實施例中，在將免疫細胞施用於受試者之前，將免疫細胞與誘導劑接觸。在其他實施例中，該方法更包含一步驟：將誘導劑連續施用於受試者，以誘發受試者在其體內的腫瘤部位表現該外源性受體。在其他實施例中，該方法更包含一步驟：不予(withholding)受試者施用誘導劑，以減少受試者體內外源性受體的表現，從而防止T細胞耗竭。在其他實施例中，該方法更包含一步驟：將誘導劑再施用於受試者，以再次誘發受試者體內外源性受體的表現。在某些實施例中，誘導劑是四環素、去氧羥四環素或其類似物。

在其他實施例中，本發明提供一種對有需要的受試者治療其疾病或病症的方法，其包含向受試者施用經修飾的免疫細胞群。前述經修飾的免疫細胞群包含本發明所述的經修飾的免疫細胞(T細胞)。在某些實施例中，該疾病或病症係選自於傳染病、自體免疫疾病和癌症所組成的群組。在某些示例性的實施例中，受試者是人類。在其他實施例中，該方法更包含進行二次治療。

在其他實施例中，本發明提供一種對有需要的受試者治療疾病或病症的方法，包含向受試者施用經基因修飾的同種異體免疫細胞(例如T細胞)。前述經基因修飾的同種異體免疫細胞包含有一外源核酸，該外源核酸編碼有一外源受體(例如CAR或轉基因TCR)，且包含四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統。其中，Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化融合蛋白和至少一個啟動子，該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。當向細胞施用去氧羥四環素(doxycycline，Dox)時，該基因表現系統會被誘導，並表現外源受體。

在又一其他實施例中，本發明提供一種對有需要的受試者治療疾病或病症的方法，包含向受試者施用經基因修飾的自體免疫細胞(例如T細胞)。該經基因修飾的自體免疫細胞包含有一外源核酸，該外源核酸編碼有一外源受體(例如CAR或轉基因TCR)，並包含四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統。其中，Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化融合蛋白和至少一個啟動子，而該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。當向細胞施用去氧羥四環素(doxycycline，Dox)時，該基因表現系統會被誘導，並表現外源受體。

以下本發明特定實施例的詳細描述，當與所附圖式共同閱讀時，將能更好地進行理解。為了說明本發明，在圖式中顯示了本發明的示例性實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於圖式中實施例所示的精確安排及手段。

圖1是一系列點陣圖，用以說明T細胞中TRAC基因的破壞效率，其係以CRISPR/CAS9核醣核酸進行電穿孔，以將靶向TRAC的gRNAs引入該T細胞後加以篩選。

圖2A至圖2B是一系列點陣圖和表格，用以說明T細胞中TRBC基因的破壞效率，其係以CRISPR/CAS9核醣核酸進行電穿孔，以將靶向TRBC的gRNAs引入該T細胞後加以篩選。

圖3是一系列點陣圖和表格，用以說明T細胞中B2M基因的破壞效率，其係以CRISPR/CAS9核醣核酸進行電穿孔，以將靶向B2M的gRNAs引入該T細胞後加以篩選。

圖4A至圖4C是一系列點陣圖和表格，用以說明T細胞中CIITA基因的破壞效率，其係以CRISPR/CAS9核醣核酸進行電穿孔，以將靶向CIITA的gRNAs引入該T細胞後加以篩選。

圖5A至圖5C是一系列點陣圖和表格，用以說明透過T細胞中PD-1基因的破壞效率，其係以CRISPR/CAS9核醣核酸進行電穿孔，以將靶向PD-1的gRNAs引入該T細胞後加以篩選。

圖6A至圖6B是一系列點陣圖和表格，用以說明T細胞中的基因破壞效率，其係選擇對下列基因具有高效靶向能力的短導引核醣核酸(sgRNA)並將其進行選殖：TRAC、TRBC、PD-1、B2M及CIITA。

圖7係為四環素(Tet)-On反轉錄病毒載體的載體圖譜，該載體係用於控制EGFP(pRetoX-TetONE.EGFP)及NY-ESO-1 TCR(8F) (pRetroX-TetONE.8F.TCR)等基因的表現。

圖8是一系列點陣圖，用以說明在pRetoX-TetONE.EGFP所轉導的GP2-293細胞中，EGFP的表現是依賴於去氧羥四環素(Dox)的。圖中顯示出EGFP表現為Dox劑量依賴性。

圖9是一柱狀圖，其係描繪如圖8所示以pRetoX-TetONE.EGFP進行轉導的GP2-293細胞，其EGFP表現的平均螢光強度(Mean Fluorescence Intensity，MFI)。

圖10是一系列點陣圖，用以說明在pRetoX-TetONE.EGFP所轉導的T細胞中，EGFP的表現是依賴於去氧羥四環素(Dox)的。圖中顯示出EGFP表現為Dox劑量依賴性。

圖11是一系列點陣圖，用以說明在pRetoX-TetONE.8.TCR所轉導的T細胞中，轉基因TCR(NY-ESO-1 8F TCR(vb8))的表現是依賴於去氧羥四環素(Dox)的。圖中顯示出TCR表現為Dox劑量依賴性。

圖12用以說明TETONE-8FTCR的表現為去氧羥四環素依賴性。向TETONE-8FTCR反轉錄病毒所轉導的T細胞，施用不同劑量的去氧羥四環素。8FTCR的表現在第0天會因施用去氧羥四環素而被誘發，並且在第2天撤除去氧羥四環素後逐漸停止。在第11天第二次施用去氧羥四環素也誘發了8FTCR的表現，其在第12天撤除去氧羥四環素後停止。

圖13用以說明如果沒有洗掉培養基中殘留的去氧羥四環素，其可以維持TETONE-8FTCR的表現。在第0天進行去氧羥四環素處理一次後監測TETONE-8FTCR的表現。在整個實驗過程中，細胞皆保持培養在含有去氧羥四環素的培養基中。

圖14用以說明透過重複施用去氧羥四環素，以維持TETONE-8FTCR的表現。去氧羥四環素係從第0天起，每隔一天施用一次。

圖15是一系列點陣圖，用以說明以pRetoX-TetONE.8.TCR轉導的T細胞，在不同濃度的去氧羥四環素存在下培養24小時的結果。透過流式細胞儀檢測TCR表現(vb8)(圖中上半部)，並以NY-ESO-1/HLA-A2陽性細胞株：M624、Nalm6-ESO及A549-ESO(A549作為NY-ESO-1/HLA-A2的陰性對照組)來刺激T細胞24小時，之後檢測被刺激的T細胞的細胞激素(IL2 和IFN-γ)分泌。

圖16用以說明以pRetoX-TetONE.8.TCR轉導的T細胞，在不同濃度的去氧羥四環素存在下培養24小時的結果，其係測試該些T細胞針對NY-ESO-1/HLA-A2陽性細胞株及A549-ESO的裂解活性。裂解活性是透過基於螢光素酶的CTL分析進行檢測。

圖17是通用型TCR T細胞的產生流程示意圖。CD3/CD28 Dynabead所刺激的T細胞，在第2天以pRetoX-TetONE.8TCR(TETON RVV)進行轉導。在第3天和第4天，以CRISPR/CAS9核醣核酸(RNA)來電穿孔被轉導的T細胞。在第8天剔除CD3+ T細胞，並在第10天收取T細胞。

圖18是一系列圖，用以說明了在慢病毒載體pTRP.8F.TCR所轉導的T細胞(LVV T細胞)和pRetoX-TetONE.8.TCR所轉導的T細胞中，於不同濃度的100ng/ml去氧羥四環素存在下培養24小時(RVV TETONE T細胞)後，其NY-ESO-1 TCR(vb8)表現。

圖19是一系列點陣圖，用以說明vb8和CD3表現的檢測結果。圖中上半部為慢病毒載體所轉導的T細胞的結果，圖中下半部為pRetoX-TetONE.8TCR進行轉導並添加去氧羥四環素的結果。縮寫No TD表示未經轉導的；No KO表示未經CRISPR/CAS9基因編輯的；8F RVV表示pRetroX.TetONE.8F.TCR(TETONE.8F)；KO2表示TRAC和TRBC基因被破壞；KO4表示TRAC、TRBC、B2M和CIITA基因被破壞；8F LVV表示pTRP.8F.TCR(8FTCR LVV)。

圖20一系列點陣圖，用以說明將慢病毒載體pTRP.8F.TCR所轉導的T細胞(LVV)或pRetoX-TetONE.8.TCR所轉導的T細胞(TETON RVV)，以CRISPR/CAS9進行電穿孔，來破壞TRAC及TRBC(KO2)或TRAC、TRBC B2M及CIITA(KO4)等多重基因。在刺激後第8天檢測到CD3和B2M。縮寫No TD表示未經轉導的；No KO表示未經CRISPR基因編輯的T細胞。

圖21是一系列點陣圖，用以說明CD3表現的檢測結果：1.)以pRetoX-TetONE.8.TCR所轉導的CD3預分選T細胞，添加或不添加去氧羥四環素(圖中上層區段)；2.)經分選後的T細胞其CD3+或CD3-部分(圖中中間區段)在加入去氧羥四環素前(分離後，無去氧羥四環素)和加入去氧羥四環素後(分離後，100ng/ml去氧羥四環素)的結果，以及3.)未經分選而以慢病毒載體所轉導的T細胞。縮寫No TD表示未經轉導的；No KO表示未經CRISPR/CAS9基因編輯的；8F RVV表示pRetroX.TetONE.8F.TCR TETONE-8FTCR RVV)；KO2表示TRAC和TRBC基因被破壞；KO4表示TRAC、TRBC、B2M和CIITA基因被破壞；8F LVV表示pTRP.8F.TCR(8FTCR LVV)。

圖22是一系列圖，用以說明vb8表現的檢測結果：1.)以pRetoX-TetONE.8.TCR所轉導的CD3預分選T細胞，添加去氧羥四環素的結果(圖中上層區段)；2.)經分選後的T細胞其CD3+或CD3-部分(圖中中間區段)在加入去氧羥四環素前(分離後，無去氧羥四環素)和加入去氧羥四環素後(分離後，100ng/ml去氧羥四環素)，以及3.)未經分選而以慢病毒載體所轉導的T細胞。縮寫No TD表示未經轉導的；No KO表示未經CRISPR/CAS9基因編輯的；8F RVV表示pRetroX.TetONE.8F.TCR(TETONE-8FTCR RVV)；KO2表示TRAC和TRBC基因被破壞；KO4表示TRAC、TRBC、B2M和CIITA基因被破壞；8F LVV表示pTRP.8F.TCR(8FTCR LVV)。

圖23是一系列點陣圖，用以說明在經分選的T細胞其CD3+或CD3-部分，vb8和CD3表現的檢測結果。圖中上半部是添加去氧羥四環素的結果，圖中下半部是不添加去氧羥四環素的結果。縮寫8F RVV表示pRetroX.TetONE.8F.TCR(TETONE-8FTCR RVV)；KO2表示TRAC和TRBC基因被破壞；KO4表示TRAC、TRBC、B2M和CIITA基因被破壞；8F LVV表示pTRP.8F.TCR(8FTCR LVV)。

圖24A至圖24C是一系列圖，用以說明轉基因TCR(vb8)和NY-ESO-1四聚體的檢測結果：1.)以慢病毒載體進行轉導，並經CRISPR基因編輯的T細胞；2.)以TETONE反轉錄病毒載體進行轉導，並經CRISPR基因編輯的T細胞，其係經過去氧羥四環素誘導，且尚未進行CD3剔除，以及3.)以TETONE反轉錄病毒載體進行轉導，並經CRISPR基因編輯和CD3剔除的T細胞，其係以去氧羥四環素進行誘導。縮寫8F LVV表示pTRP.8F.TCR； TETONE.8F表示pRetroX.TetONE.8F.TCR；KO2表示TRAC和TRBC基因被破壞；KO4表示TRAC、TRBC，B2M和CIITA基因被破壞；No TD表示未經轉導的。

圖25A至圖25C是一系列圖，用以說明在通用型NY-ESO-1 TCR T細胞中的CD107a上調現象。下述T細胞以NY-ESO-1/HLA-A2陽性腫瘤株A549-ESO及Nalm6-ESO(A549作為陰性對照組)進行刺激4小時後，分析CD107a的表現：1.)以慢病毒載體進行轉導，並經CRISPR基因編輯；2.)以TETONE反轉錄病毒載體進行轉導，並經CRISPR基因編輯的T細胞，其係經過去氧羥四環素誘導，且尚未進行CD3剔除；和3.)以TETONE反轉錄病毒載體進行轉導，並經CRISPR基因編輯及CD3剔除的T細胞，其係以去氧羥四環素進行誘導。縮寫8F LVV表示pTRP.8F.TCR；TETONE.8F表示pRetroX.TetONE.8F.TCR；KO2表示TRAC和TRBC基因被破壞；KO4表示TRAC、TRBC、B2M及CIITA基因被破壞；No TD表示未經轉導的；No KO表示未經基因編輯的。

圖26為一表格，其係顯示下列gRNA的序列：TRBC(左列)，CIITA(中間列)和PD-1(右列)。TRBC的gRNA 1~24(左列)對應於SEQ ID NO：1~24；CIITA的gRNA 1~24(中間列)對應於SEQ ID NO：25~48；PD1的gRNA1~24(右列)對應於SEQ ID NO：49~72。

圖27為一表格，其係顯示下列gRNA的序列：B2M(左列)和TRAC(右列)。B2M的gRNA 1~12(左列)對應於SEQ ID NO：73~84；TRAC的gRNA 1~13(右列)對應於SEQ ID NO：85~97。

圖28為一表格，其顯示選來進行選殖的gRNA。

圖29是生物發光成像的影像，其係顯示不同組別的腫瘤，其隨時間經過的生物發光變化。

圖30顯示不同組別中，在圖中所示的不同時間以測徑器所測得的腫瘤尺寸。

圖31顯示在下列不同條件下8FTCR+ T細胞的出現比例：在冷凍保存之前、第21天的血液中及第50天的腫瘤浸潤的白血球(tumor infiltrating leukocyte，TIL)中。

圖32A至圖32F顯示在與A549或A549ESO共培養後，TIL中CD107a(圖32A和圖32D)、IFNγ(圖32B和圖32E)和TNFα(圖32C和32F)的表現。

圖33顯示在圖中所示條件進行轉導的T細胞中，其Vβ8和PD1的表現。

圖34顯示在圖中所示的不同組別中，IL-2+ T細胞的出現頻率。

圖35顯示在圖中所示的不同組別中，IFNγ+ T細胞的出現頻率。

圖36A至圖36B顯示在如圖所示的不同組別中，其腫瘤的生物發光成像結果。圖36A為小鼠影像，而圖36B為其定量結果。

定義

除非另外定義，否則本文中所有技術和科學術語的涵義，均等同於本發明所屬技術領域具有通常知識之人所理解的一般意義。儘管在實施測試本發明時可以使用任何相似或等同於本文所描述的方法和材料，但是本文係以較佳的材料和方法進行描述。在描述本發明和界定本發明的保護範圍時，將使用以下術語。

應該理解的是，本文所使用的術語僅是為了描述特定實施例，而不是限制性的。

如本文所使用的，「一」及「一個」是指一個或多於一個(即至少一個)的物體。舉例來說，「一個元件」是指一個元件或多於一個元件。

當涉及例如量、持續時間等可測量值時，術語「約」意味著包括距離特定值±20%或±10%的變化範圍、更優選地為±5%、甚至更優選地為±1%、還更優選地為±0.1%，只要此種變化程度適合用於執行本文所揭露的方法。

如本文所使用的，術語「活化」在T細胞方面是指，其已經充分刺激而被誘發出細胞增生的狀態。T細胞的活化還與細胞激素(cytokine)的誘發產生有關，並使其產生可檢測的效用功能(effector function)。術語「活化的T細胞」表示正在進行細胞分裂的T細胞。

如本文所使用的，術語「減輕」疾病是指著降低該疾病的一或多種症狀的嚴重程度。

術語「同種異體」是指衍生自相同物種但不同動物體的移植物。

術語「同種異體抗原」是指僅存在於一物種某些個體中的抗原，並且能夠在缺乏它的個體中誘發其產生同種異體抗體。

如本文所使用的，術語「抗原」或「Ag」被定義為會引起免疫反應的分子。這種免疫反應可能涉及抗體產生，或特定的免疫活性細胞的活化，或兩者皆有。本領域技術人員能夠理解，任何大分子，包括幾乎所有的蛋白質或肽，都可以作為抗原。此外，抗原可以衍生自重組或基因體DNA。本領域技術人員能夠理解，任何DNA，包含編碼有會引發免疫反應之蛋白的核苷酸序列或其部分序列的DNA，其係編碼有如本文使用的術語「抗原」。此外，本領域技術人員能夠理解，抗原不需要由整段基因的核苷酸序列來編碼。很明顯地，本發明包括但不限於使用多於一個基因的部分核苷酸序列，而這些核苷酸序列係以各種方式進行組合排列，以引起所需的免疫反應。再者，本領域技術人員能夠理解抗原不需要由一「基因」所編碼。很明顯地，抗原可以是以合成方式產生或從生物樣品中獲得。這樣的生物樣品可以包括但不限於組織樣品、腫瘤樣品、細胞，或生物流體。

如本文所使用的，術語「自體的」是指源自同一個體的任何物質，其隨後被重新引入該個體中。

術語「同種異體」是指源自相同物種但不同動物體的任何物質。

如本文所使用的，術語「嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor)」或「CAR」是指人工的T細胞受體，其係經改造以表現在免疫反應細胞上，並與抗原產生專一性結合。CAR可用於過繼細胞轉移療法。從患者體內取出T細胞並進行修飾，使其表現對特定形式抗原具有專一性的受體。在一些實施例中，CAR對選定的目標具有專一性。CAR還可以包含細胞內活化結構域、跨膜結構域和細胞外結構域。前述細胞外結構域包含抗原結合區。在一些實施例中，CAR包含細胞外結構域，而前述細胞外結構域包含與CD8鉸鏈結構域融合的抗HLA結合結構域、CD28跨膜結構域和細胞內結構域，以及CD3-zeta結構域。

如本文所使用的，術語「共刺激配體」包括在抗原呈現細胞(例如，人造抗原呈現細胞(aAPC)、樹突細胞、B細胞等)上的分子，該分子係專一性結合到同源共刺激分子，而該同源共刺激分子在T細胞上。除了例如由TCR/CD3複合物與裝載有肽的MHC分子進行結合所提供的主要信號之外，該共刺激配體與其同源共刺激分子的結合也提供介導T細胞反應的信號，所述T細胞反應包括但不限於增殖、活化、分化等。共刺激配體可包括但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2,4-1BBL、OX40L，誘導型共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏著分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體(lymphotoxin beta receptor)、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配體受體的促效劑或抗體、以及與B7-H3專一性結合的配體。共刺激配體更包括與T細胞上存在的共刺激分子專一性結合的抗體，例如但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及與CD83專一性結合的配體。

術語「共刺激分子」是指T細胞上的同源結合配偶體，其專一性地與共刺激配體結合，從而介導T細胞的共刺激反應，例如但不限於增殖。共刺激分子包括但不限於MHC第I型分子、BTLA和Toll配體受體。

如本文所使用的，術語「共刺激信號」是指與主要信號(例如TCR/CD3連接)搭配的信號，兩者共同導致T細胞增殖及/或關鍵分子的上調或下調。

「疾病(disease)」是動物無法維持體內恆定的健康狀態，且如果疾病沒有改善則該動物的健康狀態會繼續惡化。相反地，動物的「病症(disorder)」是指動物能夠維持體內恆定的健康狀態，但該動物的健康狀態不如沒有病症時的那樣良好。如果不及時治療，病症並不一定會導致動物的健康狀態進一步變差。

如本文所使用的，術語「下調」是指減少或剔除一或多種基因的表現。

如本文所使用的，術語化合物的「有效劑量」或「治療有效劑量」是指如本文所述的化合物、製劑、材料或組合物的劑量，能有效實現特定的生物學結果、提供治療，或預防的益處。前述結果可包括但不限於將組合物投予至哺乳動物時，與不存在本發明組合物時所檢測到的免疫反應相比，該組合物的劑量可引起可檢測程度的免疫抑制反應或免疫耐受反應。該免疫反應可以容易地以許多本領域所認可的方法加以評估。本領域技術人員能夠理解，本文所施用的組合物其劑量變化可以基於許多因素所決定，例如所治療的疾病或病症、所治療的哺乳動物的年齡、健康狀況、身體狀況、疾病的嚴重程度以及所給予的特定化合物等。

「編碼」是指多核苷酸中特定核苷酸序列(例如基因、cDNA或mRNA)的固有特性。其在生物過程中用作合成其他具有確定核苷酸序列(即，rRNA、tRNA及mRNA)或確定胺基酸序列的聚合物和大分子的模板，該些聚合物和大分子會具有相應的生物學特性。因此，在細胞或其他生物系統中，如果對應於該基因的mRNA轉錄和轉譯產生一蛋白質，則該基因編碼有該蛋白質。編碼股(其核苷酸序列與mRNA序列相同並且通常顯示在序列表中)與非編碼股(係用作基因或cDNA轉錄的模板)均可被稱為編碼有蛋白質，或為該基因或cDNA的其他產物。

如本文所使用的，術語「內源」是指來自生物體、細胞、組織或系統的任何物質，或在生物體、細胞、組織或系統內部所產生的任何物質。

如本文所使用的，術語「表位」定義為抗原上的小化學分子，其可引發免疫反應，誘發B及/或T細胞反應。抗原可具有一或多個表位。大多數抗原具有多個表位。亦即，該些抗原是多價的。通常，表位的大小約為10個胺基酸及/或糖。優選地，表位為約4至18個胺基酸，更優選地約5至16個胺基酸，甚至更優選地為6至14個胺基酸，更優選地約7至12個胺基酸，最優選地約8至10個胺基酸。本領域技術人員能夠理解，一般來說，抗原專一性的主要條件是分子的整體三維結構，而其特定的一維序列，因而由此區分不同表位。基於本文的揭露內容，本發明的肽可以是一表位。

如本文所使用的，術語「外源」是指從生物體、細胞、組織或系統外引入的任何物質，或從生物體、細胞、組織或系統外所產生的任何物質。

如本文所使用的，術語「擴增」是指數量增加，例如T細胞數量的增加。在一個實施例中，離體擴增的T細胞數量相對於其於培養基中的初始數量有所增加。在另一個實施例中，相對於培養基中的其他細胞，離體擴增的T細胞其數量有所增加。如本文所使用的，術語「離體(ex vivo)」是指已經從活體(例如人類)中移出，並在體外繁殖的細胞(例如，在培養皿、試管或生物反應器中)。

如本文所使用的，術語「表現」係定義為特定核苷酸序列藉由其啟動子所驅動的轉錄及/或轉譯。

「表現載體」是指包含重組多核苷酸的載體，前述重組多核苷酸包含與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。表現載體包含有順式作用元件(cis-acting element)，且其數量足以進行表現。其他用於表現的元件可以由宿主細胞提供或在體外表現系統中提供。表現載體包括本領域已知的所有類型，例如黏接質體(cosmid)、質體(例如裸露的質體或包含在微脂體中的質體)及併入重組多核苷酸的病毒(例如，仙台病毒(Sendai viruses)、慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

如本文所使用的，術語「同源(的)」是指兩個聚合分子之間的次單元序列同一性(identity)，例如是在兩個核酸分子(DNA或RNA)之間，或在兩個多肽分子之間。當兩個分子中的次單元位置被相同的單體次單元所佔據時-例如，若兩個DNA分子中的一位置都被腺嘌呤所佔據-則它們在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性是其匹配或同源位置量的直接函數(direct function)。舉例來說，如果兩個序列中有一半位置(例如，長度為10個次單元的聚合物中有5個位置)是同源的，則這兩個序列的同源性是50%；如果90%的位置(例如10個中有9個)是匹配的或同源的，則兩個序列的同源性是90%。

如本文所使用的，術語「同一性(identity)」是指兩個聚合分子之間的次單元序列同一性(identity)，特別是在兩個胺基酸分子之間，例如兩個多肽分子之間。當兩個胺基酸序列的相同位置具有相同的殘基時-例如，若兩個多肽分子中的一位置都被精胺酸所佔據-則它們在該位置是具有同一性的。兩個胺基酸序列在相同比對位置中相同殘基的同一性或箱同程度通常以百分比進行表示。兩個胺基算序列之間的同一性是匹配或相同位置量的直接函數。舉例來說，如果兩個序列中有一半位置(例如，長度為10個次單元的胺基酸聚合物中有5個位置)是相同的，則這兩個序列的同一性為50%；如果90%的位置(例如10個中有9個)是匹配的或相同，則兩個序列的同一性為90%。

如本文所使用的，術語「免疫反應」定義為對於抗原的細胞反應，這種反應發生在淋巴細胞將抗原性分子鑑定為外來物並誘發抗體形成和/或活化淋巴細胞以除去抗原時。

如本文所使用的，術語「免疫刺激」是指總體免疫反應的增加。

如本文所使用的，術語「免疫抑制」是指總體免疫反應的降低。

如本文所使用的，術語「教學材料(instructional material)」包括出版物、記錄、圖表或任何其他表現的媒體，其可用於傳達本發明組合物和方法的效果。舉例來說，本發明試劑盒的教學材料可以固定在含有本發明核酸、肽及/或組合物的容器上，或者與含有本發明核酸、肽及/或組合物的容器一起運輸。或者，教學材料可以基於讓接收者與化合物一起使用之目的與容器分開運輸。

「分離的」是指從自然狀態改變或移除。舉例來說，自然存在於活體動物中的核酸或肽即不屬於「分離的」，但是與其自然狀態下的共存物質部分或完全分離開來的相同核酸或肽，即屬於「分離的」。分離的核酸或蛋白質可以純化的形式存在，或者可以存在於非自然環境中，例如宿主細胞內。

如本文所使用的，術語「敲落(knockdown)」是指降低一或多種基因的基因表現。

如本文所使用的，術語「剔除(knockout)」是指消除一種或多種基因的基因表現。

如本文所使用的，術語「慢病毒(lentivirus)」是指反轉錄病毒科的一個屬。慢病毒屬於反轉錄病毒中獨特的一種類，因其能感染非分裂細胞。它們可以將大量遺傳信息傳遞到宿主細胞的DNA中，因此是基因傳遞載體中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒。衍生自慢病毒的載體提供了在體內實現顯著水平基因轉移的手段。

如本文所使用的，術語「有限毒性」是指本發明的肽、多核苷酸、細胞及/或抗體，在體外或體內，對於健康細胞、非腫瘤細胞、非患病細胞、非目標細胞或此些細胞的群體，缺乏實質負面的生物效應、抗腫瘤作用或實質負面的生理症狀。

如本文所使用的，術語「經修飾的」是指本發明的分子或細胞狀態或結構的改變。分子可以以多種方式進行修飾，包括以化學上地、結構上地和功能上地方式來進行。細胞可以藉由引入核酸來進行修飾。

如本文所使用的，術語「調節」，是指相較於沒有治療或化合物的個體及/或在其他方面相同但未經治療的個體，在受試者中介導了可檢測程度的增加或減少的反應。該術語包括擾亂及/或影響天然信號或反應，從而介導受試者(優選地為人類)的有益治療反應。

在本文中，以下列縮寫來表示常見的核酸鹼基。「A」是指腺苷(adenosine)、「C」是指胞嘧啶(cytosine)、「G」是指鳥苷(guanosine)、「T」是指胸苷(thymidine)、「U」是指尿苷(uridine)。

除非另有說明，否則「編碼一胺基酸序列的核苷酸序列」包括所有編碼相同胺基酸序列的核甘酸序列以及該等核苷酸序列之簡併形式。編碼蛋白質或RNA的「核苷酸序列」也可包括內含子，以至於編碼蛋白質的核苷酸序列在某些形式中可含有內含子。

免疫原性組合物的「非腸胃道」給藥包括例如皮下(subcutaneous，s.c.)、靜脈內(intravenous，i.v.)、肌肉內(intramuscular，i.m.)、或胸骨內注射(intrasternal injection)、或輸注技術。

如本文所使用的，術語「多核苷酸」定義為核苷酸鏈。此外，核酸是指核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領域技術人員能夠理解核酸是多核苷酸，其可以水解成單體「核苷酸」。單體核苷酸可以水解成核苷。如本文所使用的，多核苷酸包括但不限於透過本領域可用的任何方法獲得的所有核酸序列，此些方法包括但不限於重組方法及合成方法。重組方法係即使用傳統選殖(cloning)技術及PCR^TM等方式從重組文庫或細胞基因體進行選殖以獲得核酸序列。

如本文所使用的，術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可交替使用，並且指由透過肽鍵共價連接的胺基酸殘基所組成的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且不限制蛋白質或肽序列可包含的胺基酸的最大數量。多肽包括任何肽或蛋白質，其包含透過肽鍵彼此連接的兩個或更多個胺基酸。如本文所使用的，該術語是指短鏈，其在本領域中通常也稱為肽、寡肽及寡聚物；例如較長的鏈，其在本領域通常稱為蛋白質，其中有很多種類。「多肽」包括，例如，生物活性片段、基本上同源的多肽(substantially homologous polypeptides)、寡肽、同二聚體(homodimers)、異二聚體(heterodimers)、多肽變異體(variants)、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。

如本文所使用的，術語「自體抗原」定義為由宿主細胞或組織所表現的抗原。自體抗原可以是腫瘤抗原，但在某些實施例中，在正常細胞和腫瘤細胞中都有表現。本領域的技術人員能夠理解，自體抗原可在細胞中過度表現。

如本文關於抗體所使用的術語「專一性結合」是指辨識特定抗原但基本上不辨識或結合樣品中的其他分子的抗體。例如，專一性結合來自一個物種抗原的抗體，也可以與來自一或多個物種的該抗原結合。但是，這種跨物種反應性本身並不會改變抗體為專一性的分類。在另一個實例中，專一性結合至一抗原的抗體，也可以結合至該抗原的不同等位基因形式。然而，這種交叉反應性本身並不會改變抗體為專一性的分類。在一些情況下，術語「專一性結合」或「特異性結合」可用於指稱抗體、蛋白質或肽與第二化學物質間的相互作用，以表示該相互作用係取決於該化學物質上存有特定結構(例如，抗原決定位(antigenic determinant)或表位(epitope))。舉例來說，抗體通常辨識並結合至蛋白質的特定結構而不是通常的蛋白質。如果抗體對表位「A」具有專一性，則在有標記的「A」和抗體的反應中，存在有表位A(或游離的，未標記的A)分子時，則有標記的A與抗體的結合量將會降低。

術語「刺激」是指透過刺激分子(例如，TCR/CD3複合體)與其同源配體的結合所誘導的初級反應，進而介導訊息傳遞事件，例如但不限於透過TCR/CD3複合體所介導的訊息傳遞。刺激可以介導某些分子的表現改變，例如TGF-β的下調及/或細胞骨架結構的重組等。

如本文所使用的，術語「刺激分子」是指T細胞上的分子，其係專一性結合至抗原呈現細胞上的同源刺激配體。

如本文所使用的，術語「刺激配體」是指當存在於抗原呈現細胞(例如，人造抗原呈現細胞、樹突細胞、B細胞等)上時，該配體可以專一性結合至T細胞上的同源結合配偶體(請參考本文中「刺激分子」的描述)，從而介導T細胞的初級反應，包括但不限於活化、免疫反應的引發、增殖等。刺激配體是本領域習知的，並且，特別是包括載有肽的MHC第I型分子、抗CD3抗體、抗CD28抗體的超級促效劑、及抗CD2抗體的超級促效劑。

術語「受試者」是指包括可以被引發免疫反應的活體(例如哺乳動物)。如本文所使用的，「受試者」或「患者」可以是人類或非人類哺乳動物。非人哺乳動物包括例如家畜和寵物，例如綿羊，牛，豬，犬科動物，貓科動物和鼠類哺乳動物。優選地，受試者是人。

如本文所使用的，「基本上純化的」細胞是指基本上不含其他細胞類型的細胞。基本上純化的細胞還指已經從通常與其自然存在狀態相關的其他細胞類型分離開來的細胞。在一些實例中，基本上純化的細胞群是指同源的細胞群。在其他實例中，該術語僅指已經從通常與自然狀態相關的細胞分離開來的細胞。在一些實施例中，細胞在體外培養。在其他實施例中，細胞不在體外培養。

「目標位」或「目標序列」是指基因體核酸序列，其定義出在足以發生結合的情況下會與結合分子進行專一性結合的核酸的一部分。

如本文所使用的，術語「T細胞受體」或「TCR」是指一種膜蛋白複合體，其響應抗原的呈現而參與T細胞的活化。TCR負責辨識與主要組織相容性複合體分子結合的抗原。TCR由α(alpha)和β(beta)鏈的異二聚體組成，但是在一些細胞中TCR由γ和δ(gamma/delta)鏈組成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，其在結構上相似，但其解剖位置及功能並不相同。每條鏈由兩個細胞外結構域組成，即可變區和恆定區。在一些實施例中，TCR可以在任何包含有TCR的細胞上進行修飾，包括例如輔助型T細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節T細胞、自然殺手T細胞及γδT細胞。

如本文所使用的，術語「治療」(therapeutic)意指治療處理及/或預防。治療效果係透過抑制、緩解或根除疾病狀態來獲得。

「移植物」是指待移植的生物相容性晶格(biocompatible lattice)或捐贈者組織、器官或細胞。移植的實例可包括但不限於皮膚細胞或組織、骨髓及臟器器官，例如心臟、胰臟、腎臟、肺臟及肝臟。移植也可以意指任何要向宿主施用的材料。例如，移植可以意指核酸或蛋白質。

如本文所使用的，術語「轉染的(transfected)」或「轉化的」或「轉導的」是指將外源核酸轉移或引入宿主細胞的過程。轉染的(transfected)」或「轉化的」或「轉導的」細胞是已經用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。細胞包括受試者初代細胞及其後代。

如本文所使用的，術語「治療」是指降低受試者所經歷的疾病或病症的至少一種體徵或症狀的頻率或嚴重性。

「載體」是物質組合物，其包含分離的核酸並可用於將分離的核酸遞送至細胞內部。本領域已知許多載體，包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親性化合物相關的多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質體或病毒。該術語還應解釋為包括促進核酸轉移到細胞中的非質體和非病毒化合物，例如聚離胺酸化合物、微脂體等。病毒載體的實例包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體等。

「異種」是指源自不同物種的動物的任何物質。

範圍：在本發明全文中，各個實施例可以以範圍的形式呈現。應該理解的是，範圍形式的描述僅僅是為了方便及簡潔，不應該被解釋為對本發明範圍的限制。因此，範圍的描述應被視為是具體公開了所有可能的子範圍以及該範圍內的單一數值。例如，從1到6的範圍的描述應該被視為具有特定公開的子範圍，例如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及在該範圍內的單一及部分數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。無論何種大小的範圍皆適用。

實施例

本發明包括經修飾的T細胞的組合物和方法，前述經修飾的T細胞作為通用型作用細胞。去氧羥四環素係用以治療許多不同的細菌感染，例如痤瘡、尿道感染、腸道感染、眼部感染、淋病、披衣菌感染、牙周病(牙齦疾病)等。四環素(Tet)-On系統是哺乳動物細胞的誘導型基因表現系統，其中反向Tet反式活化(rtTA)融合蛋白是由去氧羥四環素結合Tet-抑制因子突變蛋白及C端活化結構域組成。前述C端活化結構域是來自單純皰疹病毒VP16蛋白，其被設計來用於控制去氧羥四環素(Dox)的基因表現。在Dox存在下，rtTA會活化最小啟動子。前述最小啟動子是融合至七個重複的Tet-操縱子序列陣列的下游(Loew et al.(2010)BMC biotechnology 10,81)。近來有研究開發出單載體系統(Heinz et al.(2011)Human gene therapy 22,166-176)，使得目標基因能夠容易地被轉導到初代免疫細胞中(Sakemura et al.(2016)Cancer Immunol Res 4,658-668)。使用前述誘導型基因表現系統，外源受體(例如，轉基因TCR或CAR)會僅在有誘導物(Dox)的環境下進行表現。在某些實施例中，當該等T細胞用於同種異體環境時，此一系統有助於剔除會引起GVHD的非基因編輯的CD3+T細胞，而在最終的T細胞產物中留下TCR轉導和表現有非內源TCR的T細胞。

在某些示例性實施例中，首先係以CRISPR/gRNAs針對下列5個基因位點進行篩選：TRAC、TABC、B2M、CIITA及PD-1，以進行高效基因破壞。利用四環素誘導型基因表現系統，成功開發出一種策略，該策略可以有效地從僅含有TCR轉導的和表現有非內源TCR的T細胞最終產物中，剔除內源TCR衍生和非基因編輯的CD3+ T細胞。此外，在培養物中提供去氧羥四環素進行誘導時，轉基因TCR可以以高轉導效率有效地表現。由於在T細胞產物中沒有內源TCR的表現，因此與用一般非Tet慢病毒載體所轉導的T細胞相比，用去氧羥四環素所誘發TCR表現的T細胞，其抗腫瘤活性更好，因此，前述方式提供了通用型TCR T細胞，將可用於癌症治療或傳染病患者等臨床用途。此外，使用四環素(Tet)-On系統來控制轉基因TCR的表現，使得TCR表現可受到調節，並確保產品在引入受試者時的安全性。

儘管本文提供了實施例，但本領域技術人員能夠理解，本文所公開的Tet-On誘導系統可用於調節非內源受體(例如外源TCR或CAR)的表現。特別地，本領域技術人員可以容易地使用本發明中所述的Tet-On誘導系統，來調節免疫細胞表面上目標受體在時間上或空間中的表現。特別地，誘導型表現系統係使受體在免疫細胞表面上能定期的表現，從而抵消T細胞耗竭和腫瘤微環境的影響。

誘導型表現系統

在疾病狀態下，T細胞持續暴露於抗原及/或發炎信號。前述情況通常與T細胞功能的惡化有關，即一種稱為「耗竭」的狀態。耗竭的T細胞會失去強效的效用功能、並表現多種抑制性受體，且其為轉錄譜的改變所定義。T細胞耗竭通常與無法有效控制的長期感染和腫瘤有關，但是復甦耗竭的T細胞可以使其重新獲得免疫力。

本發明提供了一種誘導型表現系統，以在免疫細胞中表現外源受體，例如T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)。使用本發明誘導型表現系統所產生的TCR重定向T細胞提供了優異的功效。在誘導劑(即誘導物)的存在下，誘導型表現系統會驅動外源受體(例如TCR或CAR)的表現。在誘導系統中，撤除誘導劑可以減少及/或停止TCR或CAR的表現。在重新引入誘導劑後，系統可以被重新誘導並重新開始TCR或CAR的表現。本發明的誘導型系統可以解決當前T細胞療法所面臨的T細胞耗竭問題。例如，可以在有需要的受試者體內，誘導所施用的T細胞表現TCR 或CAR一段時間。TCR或CAR的連續表現可能導致T細胞耗竭。因此，撤除誘導劑(例如，透過正常的代謝過程)可以防止耗竭的發生，並且之後重新引入誘導劑可以復甦T細胞功能。

在一些實施例中，本發明的誘導型表現系統還可以對經修飾的T細胞中TCR或CAR表現提供可調節的控制(tunable control)。如本文所使用，術語「可調節的控制」是指控制TCR或CAR的表現量的能力。例如，TCR或CAR的誘導表現量可取決於誘導劑的劑量。例如，與較低劑量相比，較高劑量的誘導劑可以誘導較高量的TCR或CAR表現。因此，TCR或CAR的可誘導或可調節表現相對於誘導劑是具有劑量依賴性的。

在一些實施例中，本發明的誘導型TCR或CAR表現系統包含：第一核酸，其包含一組成型啟動子，前述組成型啟動子係可操作地連接至編碼有一反式活化蛋白的核酸序列；以及第二核酸，包含一誘導型啟動子，該誘導型啟動子係可操作地連接至編碼有TCR或CAR的核酸序列。第一核酸和第二核酸可以位於不同的表現構築體(expression construct)上。在示例性實施例中，第一核酸和第二核酸位於相同的表現構築體上。在一個示例性實施例中，第一核酸的方向與第二核酸的方向相反(即，第二核酸與第一核酸反向)。在前述的實施例中，誘導型表現系統在一個雙向表現構築體內。

任何組成型啟動子皆可用於本發明的誘導型TCR或CAR表現系統。組成型啟動子可操作地連接至編碼有反式活化蛋白的下游核酸序列(即，組成型啟動子在編碼反式活化蛋白的核酸序列的上游)，並用來進行反式活化蛋白的持續性表現。在一些實施例中，組成型啟動子是人類組成型啟動子。組成型啟動子的實例在本文其他段落中有詳細的描述。在一個示例性實施例中，組成型啟動子是人類磷酸甘油酯激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)啟動子。在一些實施例中，組成型啟動子是人類延長因子1α(elongation factor 1 alpha，EF1α)啟動子。

在一些實施例中，上述反式活化蛋白是一種會在存有誘導劑時活化表現的反式活化蛋白。在一實施例中，反式活化蛋白是經修飾的四環素抑制蛋白(tetracycline repressor，TetR)。在一實施例中，反式活化蛋白是反向Tet抑制蛋白(reverse Tet repressor，rTetR)。在一實施例中，反式活化蛋白是反向四環素調控的反式活化蛋白(reverse tetracycline-controlled transactivator protein，rtTA)。在一示例性實施例中，反式活化蛋白是Tet-On 3G反式活化蛋白。

上述誘導型啟動子係可操作地連接至編碼TCR或CAR的下游核酸序列(即，誘導型啟動子在編碼TCR或CAR的核酸序列的上游)，並提供TCR或CAR的誘導型表現。在一些實施例中，誘導型啟動子包含Tet操縱子序列。在一些實施例中，誘導型啟動子包含最小啟動子。在一些實施例中，誘導型啟動子包含最小啟動子上游的Tet操縱子序列。在一些實施例中，誘導型啟動子包含最小啟動子上游的一個或多個Tet操縱子序列(即，幾個Tet操縱子序列的重複序列)。在前述的實施例中，誘導型啟動子也可稱為四環素反應元件(tetracycline response element，TRE)。在一示例性實施例中，誘導型啟動子是TRE3GS啟動子。

在本發明的誘導型系統中，反式活化蛋白僅在反式活化蛋白被誘導劑結合時才能結合並激活誘導型啟動子。在一些實施例中，反式活化蛋白選自於經修飾的TetR、rTetR、rtTA及Tet-On 3G反式活化蛋白，誘導型啟動子包含Tet操縱子序列，誘導劑是四環素或其衍生物。在前述實施例中，當反式活化蛋白與四環素或其衍生物結合時，經修飾的TetR、rTetR、rtTA或Tet-On 3G反式活化蛋白僅能夠結合並激活誘導型啟動子。四環素的衍生物是本領域已知的，包括去氧羥四環素(Dox)。

因此，在一示例性實施例中，本發明的誘導型TCR或CAR表現系統包含第一核酸及第二核酸。第一核酸包含人類磷酸甘油酯激酶1啟動子，其可操作地連接至編碼有Tet-On 3G反式活化蛋白的核酸序列的上游。第二核酸包含可誘導的TRE3GS啟動子，其可操作地連接至編碼TCR或CAR的核酸序列的上游。而第二核酸與第一核酸反向的。在一些實施例中，在四環素或其衍生物(例如去氧羥四環素)存在下誘導TCR或CAR的表現。

在一些實施例中，將本發明的誘導型TCR或CAR表現系統連續暴露於四環素或其衍生物下，會導致TCR或CAR的連續表現。在一些實施例中，在撤除誘導劑(例如去氧羥四環素)後，可以減少或停止TCR或CAR的表現。在一些實施例中，TCR或CAR的表現會依暴露於誘導型系統的誘導劑(例如去氧羥四環素)的劑量而有微調。例如，較高劑量的去氧羥四環素可以誘發較高量的TCR或CAR表現。因此，本發明的誘導型TCR或CAR表現系統是可調節的TCR或CAR表現系統，並且TCR或CAR的表現量相對於誘導劑是呈劑量依賴性的。

在一些實施例中，在撤除誘導劑(例如去氧羥四環素)後，不再表現TCR或CAR。在一些實施例中，重新引入誘導劑(例如去氧羥四環素)可再誘導TCR或CAR的表現。

T細胞受體

本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅物(例如，經修飾的T細胞)的組合物和方法，前述經修飾的免疫細胞或其前驅物包含外源(例如轉基因)T細胞受體(TCR)。本發明包括分離的轉基因T細胞受體(TCR)，其用於本發明的經修飾細胞。在另一實施例中，本發明包括分離的核酸，前述核酸編碼有轉基因T細胞受體(TCR)，用於本發明經修飾的細胞。在另一實施例中，本發明包括經基因修飾的T細胞，其包含外源核酸，前述外源核酸編碼有轉基因TCR。TCR表現系統包含四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統，其中Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化蛋白(Tet-On 3G)蛋白，並包含至少一個啟動子。前述啟動子融合至至少一個Tet-操作子序列(PTRE3GS誘導型啟動子)的下游。前述Tet-操作子序列在去氧羥四環素的存在下，會驅動轉基因TCR的表現。在一實施例中，本發明提供了經修飾的免疫細胞(例如，T細胞)，前述經修飾的免疫細胞包含外源TCR，其中外源TCR由Tet-On誘導型系統表現。Tet-On誘導型系統包含與編碼有反向Tet反式活化蛋白(例如Tet-On 3G)的核酸序列可操作地連接的啟動子(例如組成型啟動子)，以及與編碼有外源TCR的核酸序列可操作地連接的誘導型啟動子。

在另一實施例中，本發明包括產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如，經修飾的T細胞)的方法，前述細胞包含轉基因TCR。該方法包括用CD3及/或CD28刺激T細胞群並用Tet-On誘導型基因表現系統轉導T細胞。Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化因子(rtTA)融合蛋白和至少一個啟動子，前述啟動子係融合至至少一個Tet-操縱子序列的下游。接著，對T細胞進行電穿孔，以引入Cas9核醣核酸或Cas9蛋白與引導RNA。剔除CD3⁺ T細胞並收取CD3^- T細胞。接著向T細胞施用去氧羥四環素。

在一實施例中，T細胞中外源TCR的Tet-On可誘導表現使經修飾的T細胞具有增強的效力(例如，抗腫瘤活性)。

T細胞受體是一種膜蛋白複合體，其參與T細胞對於抗原呈現的活化反應。TCR的刺激係由抗原呈現細胞上的主要組織相容性複合體分子(MHC)所觸發，前述抗原呈現細胞將抗原肽呈現給T細胞，並結合TCR複合體以誘發一系列細胞內訊息傳遞的級聯反應。

TCR通常由六個不同的膜結合鏈組成，其形成負責配體辨識的TCR異二聚體，並參與T細胞對於抗原的反應的活化。TCR以α/β和γ/δ形式存在，其在結構上相似，但解剖位置和功能不同。α/βTCR包含TCRα鏈和TCRβ鏈。表現包含TCRα鏈和TCRβ鏈的TCR的T細胞通常被稱為α/βT細胞。γ/δTCR包含TCRγ鏈和TCRδ鏈。表現包含TCRγ鏈和TCRδ鏈的TCR的T細胞通常被稱為γ/δT細胞。本文的TCR是包含TCRα鏈和TCRβ鏈的TCR。在一實施例中，TCR包含TCRα鏈和β鏈，例如編碼TCR的核酸包含編碼TCRα鏈和TCRβ鏈的核酸。在另一實施例中，α鏈或β鏈或兩者包含至少一個N-去醣化。

每條鏈由兩個細胞外結構域組成，即可變區和恆定區。TCRα鏈和TCRβ鏈各自包含兩個細胞外結構域，即可變區和恆定區。TCRα鏈可變區和TCRβ鏈可變區是TCR對目標抗原的親和力是必需的。每個可變區包含三個高度變異區或互補性決定區(CDR)，其用以與目標抗原的結合。TCRα鏈的恆定區和TCRβ鏈的恆定區靠近細胞膜。TCR還包含跨膜區和短的細胞質尾區。CD3分子與TCR異二聚體組裝在一起。CD3分子包含特徵序列基序，用於酪胺酸磷酸化，稱為免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)。近端訊息傳導事件是透過CD3分子所介導，因此，TCR-CD3複合體的相互作用在介導細胞辨識事件中起重要的作用。

在一實施例中，TCR包含至少一個鼠類恆定區。恆定結構域靠近細胞膜，接著是跨膜結構域和短的細胞質尾區。可變結構域有助於確定與TCR具有結合專一性的特定抗原和MHC分子。換句話說，T細胞對獨特抗原-MHC複合體的專一性存在於由T細胞所表現的特定TCR中。

每個恆定結構域和可變結構域可包括鏈內雙硫鍵。在一實施例中，TCR包含至少一個雙硫鍵。可變結構域包括類似於抗體的互補性決定區(CDR)的高度多形性環。TCR序列的多樣性是透過體細胞重排產生，前述體細胞重排包括鏈接的可變性(variable，V)、多樣性(diversity，D)、結合(joining，J)及恆定基因。

功能性α和γ鏈多肽由重排的V-J-C區形成，而β和δ鏈由V-D-J-C區組成。細胞外恆定結構域包括近膜區和免疫球蛋白區。

TCR可包括野生型TCR、高親和力TCR及/或嵌合TCR。當TCR被修飾時，它對目標細胞抗原的親和力可能高於野生型TCR。高親和力TCR可以是野生型TCR被修飾的結果，其與野生型TCR相比對於目標抗原具有較高的親和力。高親和力TCR可以是親和力成熟的TCR。修飾TCR及/或TCR的親和力成熟的方法是本領域技術人員已知的。用於改造和表現TCR的技術包括但不限於TCR異二聚體的產生，其包括連接對應次單元的天然雙硫橋(Garboczi等人，(1996)，Nature 384(6605)：134-4；Garboczi等人，(1996)，J Immunol 157(12)：5403-10、Chang等人，(1994)，PNAS USA 91：11408-11412、Davodeau等人，(1993)，J.Biol.Chem.268(21)：15455-15460、Golden等人，(1997)，J.Imm.Meth.206：163-169；美國專利號6,080,840)。

在實施例中，當TCR是嵌合TCR時，TCR可以包括嵌合結構域。例如，TCR在至少一個鏈的C’端包含有共刺激訊息傳導結構域。在其他實施例中，TCR可包括經修飾的鏈，例如修飾的α鏈或β鏈。前述修飾可包括但不限於N-去醣化、改變的結構域(例如靶向特定抗原或增加親和力的工程化可變區)、添加一個或多個雙硫鍵、源自不同的物種的鏈的全部或片段及其任何組合。

在一實施例中，外源TCR是完整TCR、其抗原結合部分，或其抗原結合片段。在一實施例中，TCR是完整或全長TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。在一些實施例中，TCR是抗原結合部分，其小於全長TCR但與MHC分子中特定肽鍵結合，例如與MHC-肽複合體結合。在一些情況下，TCR的抗原結合部分或片段可以僅包含全長或完整TCR的結構域的一部分，但是其仍然與完整TCR一樣，都能夠結合肽表位，例如MHC-肽複合體。在一些情況下，抗原結合部分含有TCR的可變結構域，例如TCR的可變鏈和可變β鏈，足以形成與特定MHC-肽複合體結合的結合位點。通常，TCR的可變鏈含有參與辨識肽、MHC及/或MHC-肽複合體的互補性決定區(CDR)。

在一實施例中，TCR的可變結構域含有高度變異環或CDR，其通常是抗原辨識和結合能力及專一性的主要貢獻者。在一些實施例中，TCR的CDR或其組合形成一特定TCR分子其全部或基本上全部的抗原結合位點。TCR鏈可變區內的各種CDR通常由框架區(framework region，FR)分開，在TCR分子中，與CDR相比，框架區的變異度通常較低(參見例如，Jores等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87：9138,1990、Chothia等人，EMBO J.7：3745,1988、並參見Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.27：55,2003)。在一些實施例中，CDR3是主要負責抗原結合或專一性的CDR，或者是在一特定TCR可變區的三個CDR中，最主要進行抗原辨識及/或與肽-MHC中已處理過的肽部分產生相互作用的CDR。在一些情況下，α鏈的CDR1可以與某些抗原肽的N端部分產生相互作用。在一些情況下，β鏈的CDR1可以與肽的C端部分產生相互作用。在一些情況下，在辨識MHC-肽複合體中的MHC部分或與其產生相互作用時，CDR2的作用最強或是主要負責的CDR。在一些實施例中，β-鏈的可變區可含有額外的高度變異區(CDR4或HVR4)，其通常參與超級抗原結合而非抗原辨識(Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8：411-426)。

在一些實施例中，TCR含有可變α結構域(Va)及/或可變β結構域(V)或其抗原結合片段。在一些實施例中，TCR的α-鏈及/或β-鏈還可含有恆定結構域、跨膜結構域及/或短細胞質尾區(參見，例如，Janeway等人，Immunobiology：The Immune System in Health and Disease, 3 Ed.,Current Biology Publications,p.4：33,1997)。在一些實施例中，α-鏈恆定結構域是由TRAC基因(IMGT命名法)所編碼或是其變體。在一些實施方案中，β-鏈恆定區由TRBC1或TRBC2基因(IMGT命名法)所編碼或是其變體。在一些實施例中，恆定結構域與細胞膜相鄰。例如，在一些情況下，由兩條鏈所形成的TCR在其細胞外部分含有兩個近膜恆定結構域和兩個遠膜可變結構域，而可變結構域各自含有CDR。

確定或鑑定TCR的各種結構域或區域是技術人員習知的。在一些實施例中，TCR的殘基是已知的，或可以根據國際免疫遺傳學訊息系統(International Immunogenetics Information System，IMGT)的編號系統來鑑定(參見例如www.imgt.org、並參見Lefranc等人(2003)Developmental and Comparative Immunology,2&；55-77、以及The T Cell Factsbook 2nd Edition,Lefranc and LeFranc Academic Press 2001)。使用該系統，在TCR Va鏈及/或vβ鏈內的CDR1序列對應於殘基編號27至38的胺基酸，在TCR Va鏈及/或vβ鏈中的CDR2序列對應於殘基編號56至65胺基酸，在TCR Va鏈及/或vβ鏈內的CDR3序列對應於殘基編號105至117的胺基酸。IMGT編號系統不應被解釋為本發明的限制，因為仍有其他本領域技術人員已知的編號系統，並且使用任何可用的編號系統來辨識前述TCR的各個結構域或區域，對於本領域技術人員來說是已知的。

在一些實施例中，TCR可以是兩條鏈a和β(或可選地為γ和δ)的異二聚體，其例如通過雙硫鍵或雙硫鍵連接。在一些實施例中，TCR的恆定結構域可含有短連接序列，其中半胱胺酸殘基形成二硫鍵，進而連接TCR的兩條鏈。在一些實施例中，TCR可以在a和β鏈中各具有額外的半胱胺酸殘基，使得TCR在恆定結構域中含有兩個雙硫鍵。在一些實施例中，恆定結構域和可變結構域中各含有由半胱胺酸殘基形成的雙硫鍵。

在一些實施例中，所述用於改造細胞的TCR是從已知的TCR序列所產生，例如vα、β鏈的序列，對於該序列，基本上全長的編碼序列是容易取得的。從細胞來源獲得全長TCR序列(包括V鏈序列)的方法是眾所周知的。在一些實施例中，編碼TCR的核酸可以從多種來源獲得，例如透過聚合酶連鎖反應(PCR)來擴增在特定細胞內或從特定細胞所分離出的TCR編碼核酸，或合成公眾可得的TCR去氧核醣核酸(DNA)序列。在一些實施例中，TCR取自生物來源，例如來自細胞、又例如來自T細胞(例如毒殺性T細胞)、T細胞融合瘤或其他可公開可得的來源。在一些實施例中，T細胞可以取自體內所分離出的細胞。在一些實施例中，T細胞可以是培養的T細胞融合瘤或殖株(clone)。在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分可以從已知的TCR序列產生。在一些實施例中，用於目標抗原(例如癌症抗原)的高親和力T細胞殖株，係從患者中被分離，並引入細胞中。在一些實施例中，針對目標抗原的TCR殖株已經可以從經人類免疫系統基因(例如，人類白細胞抗原系統或HLA)所改造的轉基因小鼠來產生。目標抗原例如是腫瘤抗原(參見例如，Parkhurst et al.(2009)Clin Cancer Res.15：169-180 and Cohen et al.(2005)J Immunol.175：5799-5808)。在一些實施例中，係使用噬菌體顯現法來分離針對目標抗原的TCR(參見例如，Varela-Rohena et al.(2008)Nat Med.14：1390-1395 and Li(2005)Nat Biotechnol.23：349-354)。

在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分是經修飾或經改造的部分。在一些實施例中，係以定向進化方法來產生具有改變性質的TCR，例如對特定MHC-肽複合體具有更高的親和力。在一些實施例中，係透過顯現法實現定向進化(directed evolution)，包括但不限於酵母顯現法(Holler et al.(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler et al.(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92)、噬菌體顯現法(Li et al.(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)、或T細胞顯現法(Chervin et al.(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些實施例中，顯現法會涉及改造或修改已知的親代或參考TCR。例如，在一些情況下，野生型TCR可用作突變TCR的生產模板，其CDR中有一或多個殘基發生突變，且其突變體具有所需的改變性質，例如對目標抗原的更高親和力。

在前述的一些實施例中，TCR可含有引入的雙硫鍵或鍵。在一些實施例中，則沒有天然的雙硫鍵。在一些實施例中，形成鏈間天然雙硫鍵的一或多個天然半胱胺酸(例如在α鏈和β鏈的恆定結構域中)係被另一個殘基取代，例如被絲胺酸或丙胺酸取代。在一些實施例中，可以透過將α鏈和β鏈上的非半胱胺酸殘基(例如在α鏈和β鏈的恆定結構域中)突變為半胱胺酸來形成引入的雙硫鍵。TCR的示例性非天然雙硫鍵如國際專利號WO2006/000830及WO2006037960中所描述。在一些實施例中，半胱胺酸可以在α鏈的殘基Thr48及β鏈的Ser57、在α鏈的殘基Thr45及β鏈的Ser77、在α鏈的殘基Tyr10及β鏈的Ser17、在α鏈的殘基Thr45和β鏈的Asp59及/或在α鏈的殘基Ser15及β鏈的Glu15處被引入。在一些實施例中，重組TCR中非天然半胱胺酸殘基的存在(例如，產生一個或多個非天然雙硫鍵)有利於在引入它的細胞中，產生所需的重組TCR，而非表現含有天然TCR鏈的不匹配TCR對(mismatched TCR pair)。

在一些實施例中，TCR鏈含有跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域帶正電荷。在某些情況下，TCR鏈含有細胞質尾區。在一些實施例中，TCR的每條鏈(例如α或β)可具有一個N-端免疫球蛋白可變結構域、一個免疫球蛋白恆定結構域、跨膜區和C-端的短細胞質尾區。在一些實施例中，例如透過細胞質尾區，TCR係與參與介導訊息轉導的CD3複合體的不變蛋白質相連。在一些情況下，該結構使TCR與其他分子如CD3及其次單元結合。例如，具有跨膜區的恆定結構域的TCR，可以將蛋白質固定在細胞膜中並與CD3訊息傳遞器或複合物的不變次單元結合。CD3訊息傳遞次單元(例如CD3y、CD35、CD3s和CD3ζ鏈)的細胞內尾區，含有一或多種免疫受體酪胺酸活化基序或ITAM，其與TCR複合體的訊息傳遞能力有關。

在一些實施例中，TCR是全長TCR。在一些實施例中，TCR是抗原結合部分。在一些實施例中，TCR是二聚體TCR(dimeric TCR，dTCR)。在一些實施例中，TCR是單鏈TCR(single-chain TCR，sc-TCR)。TCR可以是與細胞結合的或可溶性形式。在一些實施例中，依據所提供方法的目的，TCR是表現在細胞表面上的細胞結合形式。在一些實施例中，dTCR含有第一多肽及第二多肽。在第一多肽中，對應於TCRa鏈可變區序列的一序列，融合至對應於TCRa鏈恆定區細胞外序列的一序列之N端；在第二多肽中，對應於TCRβ鏈可變區序列的一序列，融合至對應於TCRβ鏈恆定區細胞外序列的一序列之N端，而第一多肽和第二多肽透過雙硫鍵連接。在一些實施例中，前述的鍵可以對應於天然二聚體αβTCR中的鏈間天然雙硫鍵。在一些實施例中，天然TCR不具有鏈間雙硫鍵。例如，在一些實施例中，可以將一個或多個半胱胺酸併入dTCR多肽對的恆定區細胞外序列中。在一些情況下，可能需要天然和非天然雙硫鍵。在一些實施例中，TCR含有跨膜序列以固定至膜上。在一些實施例中，dTCR含有TCRα鏈及TCRβ鏈。其TCRα鏈含有可變α結構域、恆定α結構域和連接到恆定α結構域的C端第一二聚化基序。其TCRβ鏈含有可變β結構域、恆定β結構域和連接到恆定β結構域的C端第一二聚化基序，其中第一和第二二聚化基序能夠產生相互作用以在第一二聚化基序中的胺基酸和第二二聚化基序中的胺基酸之間形成共價鍵，將TCR鏈和TCRβ鏈連接在一起。

在一些實施例中，TCR是單鏈TCR(scTCR)，其是胺基酸單鏈並含有能夠結合至MHC-肽複合體的α鏈和β鏈。一般來說，本領域技術人員可以使用已知的方法來產生scTCR，參見例如國際專利號WO 96/13593、WO 96/18105、WO99/18129、WO04/033685、WO2006/037960、WO2011/044186；美國專利號7,569,664、及Schlueter,C.J.et al.J.Mol.Biol.256,859(1996)中所述的方法。在一些實施例中，scTCR含有第一片段、第二片段，以及連接第一片段的C端與第二片段的N端的連接序列。前述第一片段由對應於TCRα鏈可變區的胺基酸序列所構成，而前述第二片段由與TCRβ鏈恆定區細胞外序列N端融合的TCRβ鏈可變區序列的胺基酸序列所構成。在一些實施例中，scTCR含有第一片段、第二片段，以及，可選地，連接第一片段的C端與第二片段的N端的連接序列。前述第一片段由對應於TCRβ鏈可變區的胺基酸序列所構成，而前述第二片段由與TCRα鏈恆定區細胞外序列N端融合的TCRβ鏈可變區序列的胺基酸序列所構成。在一些實施例中，scTCR含有第一片段、第二片段，以及連接第一片段的C端與第二片段的N端的連接序列。前述第一片段由與鏈細胞外恆定區序列N端融合的α鏈可變區序列的胺基酸序列所構成，而前述第二片段由與序列β鏈細胞外恆定及跨膜序列N端融合的β鏈可變區序列所構成。在一些實施例中，scTCR含有第一片段、第二片段，以及，可選地，連接第一片段的C端與第二片段的N端的連接序列。前述第一片段由與β鏈細胞外恆定區序列N端融合的TCRβ鏈可變區序列所構成，而前述第二片段由與鏈細胞外恆定及跨膜序列N端融合的α鏈可變區序列所構成。在一些實施例中，為了將scTCR與MHC-肽複合體結合，a鏈和β鏈必須配對，使其可變區序列的方向係被安排為針對前述結合。多種促進scTCR中α和β配對的方法是本領域習知的。在一些實施例中，係包括有連接序列，其連接α和β鏈以形成單一多肽鏈。在一些實施例中，連接序列應該具有足夠的長度以跨越α鏈的C端和β鏈的N端之間的距離，或足以跨越跨越α鏈的N端和β鏈的C端之間的距離，同時連接序列的長度還須確保不能太長，以避免其阻斷或降低scTCR與目標肽-MHC複合體的結合。在一些實施例中，連接第一和第二TCR片段的scTCR的連接序列可以是任何能夠形成單個多肽鏈的連接序列，同時保留TCR結合專一性。在一些實施例中，連接序列可以例如具有公式-P-AA-P-，其中P是脯胺酸，AA代表一胺基酸序列，該胺基酸是甘胺酸和絲胺酸。在一些實施例中，第一和第二片段配對，使其可變區序列的方向被安排為針對這種結合。因此，在某些情況下，連接序列具有足夠的長度以跨越第一片段的C端和第二片段的N端之間的距離，或足以跨越第一片段的N端和第二片段的C端之間的距離，但是不能太長以避免阻斷或降低scTCR結合到目標配體。在一些實施例中，連接序列可含有或約10至45個胺基酸，例如10至30個胺基酸或26至41個胺基酸殘基，例如29、30、31或32個胺基酸。在一些實施方例中，scTCR在單個胺基酸鏈的殘基之間含有雙硫鍵，在一些情況下，其可以促進單鏈分子的α和β區之間配對的穩定性(參見例如美國專利號7,569,664)。在一些實施例中，scTCR含有共價雙硫鍵，其將α鏈恆定結構域的免疫球蛋白區的殘基連接至單鏈分子的β鏈恆定結構域的免疫球蛋白區域的殘基。在一些實施例中，雙硫鍵對應於天然dTCR中存在的天然雙硫鍵。在一些實施例中，天然TCR中不具有雙硫鍵。在一些實施例中，雙硫鍵是引入的非天然雙硫鍵，例如，透過將一個或多個半胱胺酸併入scTCR多肽的第一和第二鏈區的恆定區細胞外序列。示例性的半胱胺酸突變包括如前所述的任何突變。在一些情況下，天然和非天然雙硫鍵可同時存在。

在一些實施例中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)都可以連接至訊息傳遞結構連接域，以在T細胞表面上產生有活性的TCR。在一些實施例中，TCR係表現在細胞表面上。在一些實施例中，TCR確實含有對應於跨膜序列的序列。在一些實施例中，跨膜結構域可以是Ca或CP跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域可以來自非TCR來源，例如來自CD3z、CD28或B7.1的跨膜區。在一些實施例中，TCR確實含有對應於細胞質序列的序列。在一些實施例中，TCR含有CD3z訊息傳遞結構域。在一些實施例中，TCR能夠與CD3形成TCR複合體。在一些實施例中，TCR或其抗原結合部分可以是重組產生的天然形式蛋白質或其突變形式。在其突變形式中，有一或多種性質(例如結合特徵)已被改變。在一些實施例中，TCR可以衍生自各種動物物種的其中之一，例如人類、小鼠、大鼠或其他哺乳動物。

在一實施例中，本發明包括經修飾的T細胞群，其包含由電穿孔所引入的RNA，前述RNA編碼有經修飾的T細胞受體(TCR)，前述T細胞受體對目標細胞上抗原具有親和力，前述T細胞群係在以電穿孔方式引入該編碼有前述TCR的RNA前經過擴增。

另一實施例中，本發明包括經修飾的T細胞，其包含外源核酸及以電穿孔所引入的一核酸。前述外源核酸編碼有T細胞受體(TCR)。前述T細胞受體對目標細胞上的抗原具有親和力，而前述以電穿孔所引入的核酸編碼有共刺激分子。該T細胞表現TCR和共刺激分子。共刺激分子可選自於CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD-1及PD-1L所組成的群組。

在一個實施例中，本發明包括將一核酸引入經擴增的T細胞中，前述核酸編碼有經修飾的T細胞受體(TCR)，而前述經修飾的T細胞受體對目標細胞上的抗原具有親和力。在該實施例中，前述T細胞能夠表現經修飾的TCR。

在一個實施例中，TCR對目標細胞抗原具有專一性。目標細胞抗原可包括與目標細胞有關的任何類型蛋白質。例如，目標細胞抗原可經選擇以辨識目標細胞的特定疾病狀態。因此，細胞表面標記物可以作為TCR抗原結合結構域的配體實例，包括與病毒、細菌及寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌細胞相關的配體。在某些實施例中，目標細胞抗原包括任何腫瘤相關抗原(tumor associated antigen，TAA)或任何病毒抗原，或其任何片段。在一些實施例中，TCR對目標細胞上的目標抗原具有親和力。目標抗原可包括與目標細胞有關的任何類型蛋白質或其表位。在一些實施例中，目標抗原係經MHC處理和呈現。目標細胞抗原可包括任何經由主要組織相容性複合體所處理和呈現的蛋白質。例如，目標抗原可以與特定疾病狀態相關。例如，TCR可以對目標細胞上的目標抗原具有親和力，其指出目標細胞的特定疾病狀態。因此，可以作為TCR所靶向的細胞標記物其實例包括與病毒、細菌及寄生蟲感染、自體免疫疾病及癌細胞相關的抗原。在某些實施例中，目標抗原包括任何腫瘤相關抗原(TAA)或任何病毒抗原、或其任何片段。

在一實施例中，目標細胞抗原是紐約食道-1(New York esophageal-1，NY-ESO-1)肽。NY-ESO-1屬於癌症-睾丸(cancer-testis，CT)抗原蛋白質群組。NY-ESO-1是體外高度免疫原性的抗原，並透過MHC呈現給T細胞。辨識A2呈現的表位NY-ESO_157-165、SLLMWITQC(SEQ ID NO：98)的CTL係生長自骨髓瘤患者的血液和淋巴結。對該表位具有專一性的T細胞殖株已被證實可殺死腫瘤細胞。辨識NY-ESO_157-165表位的高親和力TCR可辨識HLA-A2陽性、NY-ESO-1陽性細胞株(但不辨識缺乏HLA-A2或NY-ESO的細胞)。因此，本文的TCR可以是對HLA-A2限制(HLA-A2-restricted)的NY-ESO-1(SLLMWITQC；SEQ ID NO：98)有專一性的TCR。在一實施例中，本文的NY-ESO-1 TCR是野生型NY-ESO-1 TCR。野生型NY-ESO-1 TCR可包括但不限於8F NY-ESO-1 TCR(在本文中也被稱為「8F」或「8F TCR」)和1G4 NY-ESO-1 TCR(在本文中也被稱為「1G4」或「1G4 TCR」)。在一實施例中，本文的NY-ESO-1 TCR是親和力增強的1G4 TCR，也稱為Ly95。1G4 TCR和親和力增強的1G4 TCR已描述於美國專利號8,143,376中。

本發明的一實施例中，其提供了包含有外源TCR的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如，經修飾的T細胞)，其外源TCR的表現受Tet-On誘導系統所調節。例如，前述經修飾的細胞可以透過向細胞中引入包含有Tet-On誘導型基因表現系統的核酸來產生，前述基因表現系統係可操作地連接至編碼有外源TCR的核酸。

在一實施例中，本發明經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如，經修飾的T細胞)包含8F TCR，其中8F TCR係在Tet-On誘導型基因表現系統的調控下進行表現(例如，8F TCR的表現受到Tet-On系統的調控)。例如，前述經修飾的細胞可以透過向細胞中引入包含有Tet-On誘導型基因表現系統的核酸來產生，前述基因表現系統係可操作地連接至編碼有8F TCR的核酸。

嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)

本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如修飾的T細胞)的組合物和方法，其包含嵌合抗原受體(CAR)。因此，在一些實施例中，免疫細胞已經過基因修飾以表現CAR。本發明的CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、鉸鏈結構域及細胞內訊息傳遞結構域。

在本發明的一實施例中，經基因修飾的T細胞係包含嵌合抗原受體(CAR)。CAR包含抗原結合結構域。抗原結合結構域可包含結合目標抗原的抗體或其片段。優選地，抗原結合結構域是結合目標抗原的scFv抗體。抗原結合結構域的選擇取決於目標細胞表面上的抗原的類型和數量。例如，可以選擇抗原結合結構域以辨識一抗原，該抗原係為目標細胞上的一細胞表面標記物並與特定疾病狀態相關。

本文所述的抗原結合結構域可以組合至任何本文所述的跨膜結構域、細胞內結構域，或細胞質結構域、或可組合至其他任何本文所述涵括在CAR中的結構域。本發明的標的CAR還可包括如本文所述的間隔結構域。在一些實施例中，每個抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域係透過連接子(linker)分開。

抗原結合結構域

抗原結合結構域可包括任何與抗原結合的結構域，並且可包括但不限於單株抗體、多株抗體、合成抗體、人類抗體、人源化抗體、非人類抗體及其任何片段。因此，在一實施例中，抗原結合結構域部分包含哺乳動物抗體或其片段。

在一些情況下，抗原結合結構域可以源自最終該CAR將被使用的相同物種。例如，為了要在人類中使用，CAR的抗原結合結構域可包含如本文所述的人類抗體或其片段。

抗原結合結構域係可操作地連接至CAR的另一個結構域，以在細胞中表現，例如其係可操作地連接至本文所述的跨膜結構域或細胞內結構域。在一實施例中，編碼有抗原結合結構域的核酸係可操作地連接與編碼有跨膜結構域的核酸和編碼有細胞內結構域的核酸。

CAR的抗原結合結構域是CAR的細胞外區域，其係結合至特定的目標抗原，該抗原包括蛋白質、碳水化合物和醣脂類。在一些實施例中，CAR對目標細胞上的目標抗原具有親和力。目標抗原可包括與目標細胞有關的任何類型蛋白質或其表位。例如，CAR可以對目標細胞上的目標抗原具有親和力，其代表目標細胞的特定疾病狀態。

如本文所述，對目標細胞上的特定目標抗原具有親和力的本文CAR，可包含有目標專一性的結合結構域。在一些實施例中，目標專一性的結合結構域是鼠類目標專一性的結合結構域，例如，目標專一性的結合結構域是鼠類來源的。在一些實施例中，目標專一性的結合結構域是人類目標專一性的結合結構域，例如，目標專一性的結合結構域是人類來源的。

在一些實施例中，本文的CAR可以對一或多種目標細胞上的一或多種目標抗原具有親和力。在一些實施例中，CAR可以對目標細胞上的一或多種目標抗原具有親和力。在前述實施方案中，CAR是雙專一性CAR或多專一性CAR。在一些實施例中，CAR包含一或多種目標專一性的結合結構域，其賦予對一或多種目標抗原的親和力。在一些實施例中，CAR包含一或多種目標專一性的結合結構域，其賦予對相同目標抗原的親和力。例如，包含對相同目標抗原具有親和力的一或多個標靶專一性結合結構域的CAR，可以結合至目標抗原的不同表位。當CAR中存在多個標靶專一性結合結構域時，該等結合結構域可以串聯排列並且可以透過連接肽分開。舉例來說，在包含有兩個目標專一性結合結構域的CAR中，該等結合結構域係透過寡肽或多肽連接子、Fc鉸鏈區或膜鉸鏈區在單個多肽鏈上共價連接。

在一些實施例中，抗原結合結構域選自於抗體、抗原結合片段(antigen binding fragment，Fab)及單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)所組成的群組。

如本文所使用，術語「單鏈可變片段」或「scFv」是免疫球蛋白(例如，小鼠或人類)的重鏈可變區(heavy chain，VH)和輕鏈可變區(light chain，VL)的融合蛋白，其共價連接以形成VH：VL異二聚體。重鏈(VH)和輕鏈(VL)直接連接或透過肽編碼連接子連接，前述連接子連接VH的N端與VL的C端，或連接VH的C端與VL的N端。在一些實施例中，抗原結合結構域(例如，TAA結合結構域)包含scFv，其從N端到C端的構型為VH-連接子-VL。在一些實施例中，抗原結合結構域包含scFv，其從N端到C端的構型為VL-連接子-VH。本領域技術人員能夠選擇適用於本發明的構型配置。

連接子通常富含甘胺酸以獲得可撓性，以及富含絲胺酸或蘇胺酸以獲得溶解性。連接子可以連接細胞外抗原結合結構域的重鏈可變區和輕鏈可變區。連接子的非限制性實例已公開於Shen等人，Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008)及WO2014/087010中，其內容通過引用而將其整體併入本文。各種連接子通序列是本領域已知的，包括但不限於甘胺酸絲胺酸(GS)連接子，例如(GS)_n、(GSGGS)_n(SEQ ID NO：99)、(GGGS)_n(SEQ ID NO：100)及(GGGGS)_n(SEQ ID NO：101)，其中n表示至少為1的整數。示例性的連接子序列可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：102)、GGSGG(SEQ ID NO：103)、GSGSG(SEQ ID NO：104)、GSGGG(SEQ ID NO：105)、GGGSG(SEQ ID NO：106)、GSSSG(SEQ ID NO：107)、GGGGS(SEQ ID NO：108)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：109)等。本領域技術人員能夠選擇適合用於本發明的連接子序列。在一實施例中，本發明的抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH和VL由具有胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：110)的連接子序列分開。前述連接子序列可以由核酸序列ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct(SEQ ID NO：111)編碼。

儘管去除了恆定區並引入了連接子，但scFv蛋白仍保有原始免疫球蛋白的專一性。單鏈Fv多肽抗體可以由包含VH和VL編碼序列的核酸來表現，如Huston等人於Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85：5879-5883,1988中所述的。也請參見美國專利號5,091,513、5,132,405及4,956,778、以及美國專利公開號20050196754及20050196754。下列文獻中已經描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(參見例如，Zhao et al.,Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6)：455-51、Peter et al.,J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12、Shieh et al.,J Imunol 2009 183(4)：2277-85、Giomarelli et al.,Thromb Haemost 2007 97(6)：955-63、Fife eta.,J Clin Invst 2006 116(8)：2252-61、Brocks et al.,Immunotechnology 1997 3(3)：173-84、Moosmayer et al.,Ther Immunol 1995 2(10：31-40))。下列文獻中已經描述了具有刺激活性的促效性scFv(參見例如，Peter et al.,J Bioi Chem 2003 25278(38)：36740-7、Xie et al.,Nat Biotech 1997 15(8)：768-71、Ledbetter et al.,Crit Rev Immunol 1997 17(5-6)：427-55、Ho et al.,BioChim Biophys Acta 2003 1638(3)：257-66)。

如本文所使用，「Fab」是指抗體結構的片段，其結合抗原但是是單價且不具有Fc部分，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗體產生兩個Fab片段和一個Fc片段(例如，重(H)鏈恆定區；不與抗原結合的Fc區)。

如本文所使用，「F(ab')2」是指透過胃蛋白酶消化完整IgG抗體產生的抗體片段，而該片段具有兩個抗原結合(ab')(二價)區，其中每個(ab')區包含兩個獨立的胺基酸鏈，各H鏈的一部分和輕鏈(L)透過S-S鍵連接以與抗原結合，且該等H鏈的剩餘部分則連接在一起。「F(ab')2」片段可以分成兩個獨立的Fab'片段。

在一些實施例中，抗原結合結構域可以衍生自最終該CAR將被使用的相同物種。例如，為了要在人類中使用，CAR的抗原結合結構域可包含人類抗體或其片段。

跨膜結構域

關於跨膜結構域，CAR可以設計為包含有一跨膜結構域，其係將CAR的抗原結合結構域連接到細胞內結構域。在一實施例中，在天然情況下，該跨膜結構域係與CAR中的一或多個結構域相連。在一些情況下，跨膜結構域可經選擇或以胺基酸取代來進行修飾，以避免前述結構域與相同或不同表面膜蛋白的跨膜結構域結合，從而最小化其與受體複合體其他成員間的相互作用。

跨膜結構域可以來自天然來源或來自合成來源。在來自天然來源的情況下，結構域可以衍生自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白，例如I型跨膜蛋白。在來自合成來源的情況下，跨膜結構域可以是任何促進CAR插入細胞膜的人工序列，例如人工疏水序列。在本發明中特別使用的跨膜區的實例包括但不限於衍生自(即至少包含以下列分子的跨膜區)T細胞受體α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε(CD3 epsilon)、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、類Toll受體1(Toll-like receptor 1，TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9。在某些情況下，也可以使用各種鉸鏈，包括Ig(免疫球蛋白)鉸鏈。

在一些實施例中，跨膜結構域可以是合成的。在這種情況下，它主要包含疏水性殘基，例如白胺酸和纈胺酸。優選地，在合成跨膜結構域的每個末端會發現苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。

本文所述的跨膜結構域可組合至任何本文所述的抗原結合結構域、細胞內結構域、或其他任何可包括在標的CAR中的結構域。

在一些實施例中，跨膜結構域還包含鉸鏈區。本發明的標的CAR還可包括鉸鏈區。CAR的鉸鏈區是親水區，其位於抗原結合結構域和跨膜結構域之間。在一些實施例中，該結構域促進CAR進行適當的蛋白質折疊。鉸鏈區是CAR的可選組件。鉸鏈區包括一結構域，而該結構域可選自於抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人工鉸鏈序列或其組合。鉸鏈區的實例包括但不限於CD8a鉸鏈、由多肽製成的人工鉸鏈，其可以小至三個甘胺酸(Gly)，也可以為IgG的CH1和CH3結構域(例如人類IgG4)。

在一些實施例中，本文的標的CAR包括一鉸鏈區，其係將抗原結合結構域連接至跨膜結構域，而前述跨膜結構域又連接至細胞內結構域。鉸鏈區優選地能夠支持抗原結合結構域以辨識並結合目標細胞上的目標抗原(參見例如，Hudecek et al.,Cancer Immunol.Res.(2015)3(2)：125-135)。在一些實施例中，鉸鏈區是可撓性結構域，因此使抗原結合結構域具有最佳的辨識結構，辨識如腫瘤細胞上目標抗原的特定結構和密度(Hudecek等人，同上註)。鉸鏈區的可撓性使鉸鏈區域適應於許多不同的構型中。

在一些實施例中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區是衍生自受體(例如，CD8衍生的鉸鏈區)的鉸鏈區多肽。

鉸鏈區的長度可為約4個胺基酸至約50個胺基酸，例如約4個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、約20個胺基酸至約25個胺基酸、約25個胺基酸至約30個胺基酸、約30個胺基酸至約40個胺基酸、或約40個胺基酸至約50個胺基酸。

適合的鉸鏈區可以很容易地選擇，並且可以是任何一種的適合長度，例如1個胺基酸(例如，Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸、4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸，且可以是1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。

例如，鉸鏈區包括甘胺酸聚合物((G)_n)、甘胺酸-絲胺酸聚合物(包括例如(GS)_n、(GSGGS)_n(SEQ ID NO：99)及(GGGS)_n(SEQ ID NO：100)，其中n是至少為一的整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物，及本領域已知的其它可撓性連接子。可以使用甘胺酸及甘胺酸-絲胺酸聚合物；Gly和Ser都是相對非結構化的，因此可以作為組分之間的中性系鏈(neutral tether)。可以使用甘胺酸聚合物；甚至與丙胺酸相比，甘胺酸獲得顯著更多的phi-psi空間，並且其所受到的限制比更長側鏈的殘基要來得更少(參見例如，Scheraga,Rev.Computational.Chem.(1992)2：73-142)。示例性鉸鏈區可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：102)、GGSGG(SEQ ID NO：103)、GSGSG(SEQ ID NO：104)、GSGGG(SEQ ID NO：105)、GGGSG(SEQ ID NO：106)、GSSSG(SEQ ID NO：107) 等。

在一些實施例中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈的鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列是本領域已知的：參見例如，Tan et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1)：162-166、及Huck et al.,Nucleic Acids Res.(1986)14(4)：1779-1789。作為非限制性實例，免疫球蛋白鉸鏈區可包括以下胺基酸序列的其中之一：DKTHT(SEQ ID NO：112)、CPPC(SEQ ID NO：113)、CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO：114)(參見例如，Glaser et al.,J.Biol.Chem.(2005)280：41494-41503)、ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：115)、KSCDKTHTCP(SEQ ID NO：116)、KCCVDCP(SEQ ID NO：117)、KYGPPCP(SEQ ID NO：118)、EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：119，人類IgG1鉸鏈)、ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：120，人類IgG2鉸鏈)、ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：121，人類IgG3鉸鏈)、SPNMVPHAHHAQ(SEQ ID NO：122，人類IgG4鉸鏈)等。

鉸鏈區可包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4、鉸鏈區的胺基酸序列。在一實施例中，與野生型(天然存在的)鉸鏈區相比，鉸鏈區可包括一或多個胺基酸取代及/或插入及/或缺失。例如，人類IgG1鉸鏈的His229可以被Tyr取代，因此該鉸鏈區包含序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO：123)，參見例如Yan et al.,J.Biol.Chem.(2012)287：5891-5897。在一實施例中，鉸鏈區可包含衍生自人類CD8的胺基酸序列或其變體。

在一實施例中，跨膜結構域包含CD28跨膜結構域。在另一實施例中，跨膜結構域包含CD8鉸鏈結構域及CD28跨膜結構域。跨膜結構域可以組合至任何本文所述鉸鏈結構域及/或可以包含本文所述的一或多個跨膜結構域。

本文所述的跨膜結構域，例如T細胞受體的α鏈、β鏈或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、類Toll受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8及TLR9等分子的跨膜區，可以組合至任何本文所述的抗原結合結構域、細胞內結構域或細胞質結構域、或其他任何本文所述的可包括在CAR中的結構域。

在CAR的細胞外結構域及跨膜結構域之間、或在CAR的細胞內結構域及跨膜結構域之間，可以併入間隔結構域。如本文所使用，術語「間隔結構域」通常是指任何將跨膜結構域連接至前述多肽鏈中的細胞外結構域或細胞內結構域的寡肽或多肽。間隔結構域可包含最多300個胺基酸，例如10至100個胺基酸、或25至50個胺基酸。在一些實施例中，間隔區結構域可以是短的寡肽或多肽連接子，例如長度為2至10個胺基酸。例如，甘胺酸-絲胺酸雙聯體，特別合適作為在標的CAR的跨膜結構域及細胞內訊息傳遞結構域之間的連接子。

細胞內結構域

本發明的標的CAR還包括細胞內訊息傳遞結構域。術語「細胞內訊息傳遞結構域」和「細胞內結構域」在本文中可交替使用。CAR的細胞內訊息傳遞結構域負責活化表現有該CAR的細胞(例如免疫細胞)的至少一種效用功能。細胞內訊息傳遞結構域轉導效用功能信號並引導該細胞(例如免疫細胞)執行其特化功能，例如，損傷及/或破壞目標細胞。

CAR的細胞內結構域或其他細胞質結構域包括與相似或等同於本文所述的嵌合細胞內訊息傳遞分子的細胞內結構域，並且負責活化有表現CAR的細胞。在一實施例中，細胞內結構域包含CD3ζ。在另一實施方案中，細胞內結構域包含CD28和CD3ζ。

用於本發明的細胞內結構域其實例包括但不限於表面受體、共刺激分子、以及任何分子的細胞質部分，前述分子係共同作用以啟動T細胞中的訊息傳遞。其實例也包括任何前述分子的衍生物或其變體、以及任何具有相同功能的合成序列。

細胞內訊息傳遞結構域的實例包括但不限於T細胞受體複合體的ζ鏈或其任何同源物，例如η鏈、FcεRIγ及β鏈、MB1(Iga)鏈， B29(Ig)鏈等、人類CD3 ζ鏈、CD3多肽(△、δ及ε)，syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和其他涉及T細胞轉導的分子，例如CD2、CD5及CD28。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域可以是人類CD3ζ鏈、FcγRIII、FcsRI、Fc受體的細胞質尾區、具有細胞質受體的免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)，及其組合。

在一實施例中，CAR的細胞內結構域包括一或多種共刺激分子的任何部分，例如來自CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-IBB、PD-1、任何其衍生物或其變體、任何具有相同功能的合成序列、及其任意組合。

細胞內結構域的其他實例包括來自一或多種分子或受體的片段或結構域，該一或多種分子或受體包括但不限於TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、常見FcRγ(common FcR gamma)、FcRβ(Fc Epsilon Rib)、CD79a、CD79b、Fcgamma Rlla、DAP10、DAP 12、T細胞受體(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)專一性結合的配體、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 Id、ITGAE、CD 103、ITGAL、CD 11a、LFA-1、ITGAM、CD lib、ITGAX、CD 11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD 18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(觸覺，Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、類Toll受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其他共刺激分子、其任何衍生物、變體或片段、任何具有相同功能的共刺激分子的合成序列、及其任何組合。

細胞內結構域的其他實例包括但不限於各種其他免疫信號受體中某些類型的細胞內訊息傳遞結構域。該些免疫信號受體包括但不限於第一代、第二代和第三代T細胞訊息傳遞蛋白，其包括CD3、B7家族共刺激，及腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族受體(參見例如，Park and Brentjens,J.Clin.Oncol.(2015)33(6)：651-653)。另外，細胞內訊息傳遞結構域可包括NK及NKT細胞所使用的訊息傳遞結構域(參見例如，Hermanson and Kaufman,Front.Immunol.(2015)6：195)，例如NKp30(B7-H6)的訊息傳遞結構域(參見例如，Zhang et al.,J.Immunol.(2012)189(5)：2290-2299)及DAP 12(參見例如，Topfer et al.,J.Immunol.(2015)194(7)：3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10及CD3ζ。

適用於本發明受試者的CAR細胞內訊息傳遞結構域，包括任何所需訊息傳遞結構域，該訊息傳遞結構域係響應於CAR的活化(即，被抗原和二聚化劑所活化)而提供獨特和可檢測信號(例如，細胞一或多種細胞激素的產量增加、目標基因的轉錄變化、蛋白質活性的改變；細胞行為的變化：例如細胞死亡、細胞增殖、細胞分化、細胞存活、細胞信號反應的調節等)。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域包括至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個、六個等)如下所述的ITAM基序。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域包括DAP10/CD28型訊息傳遞鏈。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域並非共價連接至膜結合的CAR，而是散布在細胞質中。

適用於本發明標的CAR的細胞內訊息傳遞結構域，包括基於免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)的細胞內訊息傳遞多肽。在一些實施例中，ITAM基序在細胞內訊息傳遞結構域中重複兩次，其中ITAM基序的第一重複和第二重複彼此間隔6至8個胺基酸。在一實施例中，標的CAR的細胞內訊息傳遞結構域包含3個ITAM基序。

在一些實施例中，細胞內訊息傳遞結構域包括人類免疫球蛋白受體的訊息傳遞結構域，其含有基於免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAM)，例如但不限於FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(參見例如，Gillis et al.,Front.Immunol.(2014)5：254)。

合適的訊息傳遞結構域可以是含有ITAM基序的部分，其衍生自含有ITAM基序的多肽。例如，合適的細胞內訊息傳遞結構域可以是來自任何含有ITAM基序蛋白質的含ITAM基序結構域。因此，合適的細胞內訊息傳遞結構域不需要包含衍生它的整個蛋白質的完整序列。含有ITAM基序的合適多肽其實例包括但不限於：DAP12、FCER1G(Fcε受體Iγ鏈)、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD3Z(CD3ζ)及CD79A(抗原受體複合體相關蛋白α鏈)。

在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域衍生自DAP12(也稱為TYROBP、TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白、KARAP、PLOSL、DNAX-活化蛋白12、KAR相關蛋白、TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白、殺傷活化受體相關蛋白、殺傷活化受體相關蛋白等)。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域衍生自FCER1G(也稱為FCRG、Fcε受體Iγ鏈、Fc受體γ鏈、fc-epsilon RI-γ、fcRgamma、fceR1γ、高親和力免疫球蛋白epsilon受體次單元γ、免疫球蛋白E受體、高親和力γ鏈等)。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3δ鏈(也稱為CD3D、CD3-DELTA、T3D、CD3抗原、δ次單元、CD3δ、CD3d抗原、δ多肽(TiT3複合體)、OKT3、δ鏈、T細胞受體T3δ鏈、T細胞表面醣蛋白CD3δ鏈等)。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3ε鏈(也稱為CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4 ε鏈，T細胞表面醣蛋白CD3ε鏈、AI504783、CD3、CD3 epsilon、T3e等)。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3γ鏈(也稱為CD3G、T細胞受體T3γ鏈、CD3-GAMMA、T3G、γ多肽(TiT3複合體)等)。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域衍生自T細胞表面醣蛋白CD3ζ鏈(也稱為CD3Z、T細胞受體T3ζ鏈、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域衍生自CD79A(也稱為B細胞抗原受體複合體相關蛋白α鏈、CD79a抗原(免疫球蛋白相關α)、MB-1膜醣蛋白、ig-α、膜結合免疫球蛋白相關蛋白、表面IgM相關蛋白等)。在一實施例中，適用於本文的FN3 CAR的細胞內訊息傳遞結構域包括DAP10/CD288型訊息傳遞鏈。在一實施例中，適用於本文的FN3 CAR的細胞內訊息傳遞結構域包括ZAP70多肽。在一實施例中，細胞內訊息傳遞結構域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的細胞質訊息傳遞結構域。在一實施例中，CAR中的細胞內訊息傳遞結構域包括人類CD3ζ的細胞質訊息傳遞結構域。

雖然通常可以使用整個細胞內訊息傳遞結構域，但在許多情況下不必使用整個鏈。在使用細胞內訊息傳遞結構域的截短部分的情況下，可以使用前述截短部分來代替完整的鏈，只要其長度足夠轉導效用功能信號。細胞內訊息傳遞結構域包括足以轉導效用功能信號的細胞內訊息傳遞結構域的任何截短部分。

本文所述的細胞內訊息傳遞結構域可組合至下列結構域：任何本文所述的抗原結合結構域、跨膜結構域、或其他任何可包含在CAR中的結構域。

本文所述的細胞內結構域可組合至下列結構域：任何本文所述的抗原結合結構域、跨膜結構域、及/或其他任何可包含在CAR中的結構域。

在另一實施例中，間隔結構域可以併入CAR的抗原結合結構域及跨膜結構域之間，或併入CAR的細胞內結構域及跨膜結構域之間。如本文所使用，術語「間隔結構域」通常是指任何將跨膜結構域連接至多肽鏈中的抗原結合結構域或細胞內結構域的寡肽或多肽。在一實施例中，間隔結構域可包含最多300個胺基酸，優選地為10至100個胺基酸，最優選地為25至50個胺基酸。在另一實施例中，短寡肽或短多肽連接子，其優選長度為2至10個胺基酸，而可以形成跨膜結構域和CAR的細胞內結構域之間的連接。連接子的實例包括甘胺酸-絲胺酸雙聯體。

人類抗體

前述CAR的抗原結合結構域可優選地包含有人類抗體或其片段。全人類抗體對人類受試者的治療處理來說是特別理想的。人類抗體可以透過本領域的多種已知方法製備，包括使用衍生自人類免疫球蛋白序列抗體文庫的噬菌體顯現法，以及對前述技術的改進方法。請參見美國專利號4,444,887及4,716,111、以及PCT公開號WO 98/46645、WO 98/50433、 WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及WO 91/10741，前述文獻的全部內容通過引用併入本文。

人類抗體也可以使用不能表現功能性內源免疫球蛋白但可以表現人類免疫球蛋白基因的轉基因小鼠來產生。例如，人類重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合體可以隨機方式或同源重組方式引入小鼠胚胎幹細胞中。或者，除了人重鏈和輕鏈基因之外，可以將人類可變區、恆定區及多樣性區引入小鼠胚胎幹細胞中。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因可以同源重組方式各自或同時引入人類免疫球蛋白基因座而變得無功能。例如，先前文獻已顯示嵌合和種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(heavy chain joining region，JH)基因的同型合子缺失，會導致內源抗體產生的完全抑制。將經修飾的胚胎幹細胞擴增，並將其顯微注射到囊胚中以產生嵌合小鼠，接著繁殖嵌合小鼠以產生表現人類抗體的同型合子子代。用選定的抗原，例如本發明多肽的全部或部分，以正常方式使轉基因小鼠免疫。可以使用常規融合瘤技術從被免疫的轉基因小鼠獲得針對所選目標的抗體。轉基因小鼠所攜帶的人類免疫球蛋白轉基因會在B細胞分化期間重排，隨後進行類型轉換(class switching)和體細胞突變。因此，使用這種技術，可以產生治療上有用的IgG、IgA、IgM及IgE抗體，包括但不限於IgG1(γ1)和IgG3。關於用於產生人類抗體的先前技術概述，請參見Lonberg及Huszar的文獻(Int.Rev.Immunol.,13：65-93(1995))。關於用於產生人類抗體和人類單株抗體的先前技術詳細討論以及用於產生這種抗體的方法，請參見例如PCT公開號WO 98/24893、WO 96/34096及WO 96/33735、及美國專利號5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318、及5,939,598，前述文獻各自通過引用而將其整體併入本文。此外，諸如Abgenix,Inc.(Freemont，CA)及Genpharm(San Jose，CA)等公司可以使用與上述類似的技術來提供針對所選抗原的人類抗體。對於在種系突變小鼠中轉移人種系免疫球蛋白基因陣列，將導致其在抗原攻擊後產生人類抗體，其特定討論請參見例如Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：2551(1993)、Jakobovits et al.,Nature,362：255-258(1993)、Bruggermann et al.,Year in Immunol.,7：33(1993)及Duchosal et al., Nature,355：258(1992)。

人類抗體也可以衍生自噬菌體顯現文庫(Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,227：381(1991)、Marks etal.,J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)、Vaughan et al.,Nature Biotech.,14：309(1996))。噬菌體顯現技術(McCafferty et al.,Nature,348：552﹁553(1990))可用於在體外產生人類抗體和抗體片段，前述產生是從未免疫供體的免疫球蛋白可變結構域(V domain)基因庫中來產生。根據前述技術，以符合讀取框的方式，將抗體可變結構域的基因轉殖(cloned in-frame)到絲狀噬菌體(例如M13或fd)的主要或次要外殼蛋白基因中，並在噬菌體顆粒的表面顯現出功能性抗體片段。因為絲狀顆粒所含有的噬菌體基因體複本為單股DNA，因此以其抗體功能特性所進行的挑選，也會等同於挑選那些編碼有所顯現性質的抗體基因。因此，噬菌體模擬出B細胞的某些特性。噬菌體顯現可以以多種形式進行，對於這些技術的綜合敘述，請參見例如Johnson,Kevin S,and Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。適用於噬菌體顯現的變異域基因片段有多種不同來源。Clackson等人(Clackson et al.,Nature,352：624-628(1991))從來自未免疫小鼠脾臟中的變異域基因的小隨機組合庫中分離出抗噁唑酮抗體的的多樣型陣列。按照下列文獻所述的技術可以建構來自未免疫人類捐贈者的變異域基因庫，並且可以基本上分離出針對多種抗原(包括自體抗原)的抗體：Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)、或Griffith et al.,EMBO J.,12：725-734(1993)，也請參見美國專利號5,565,332及5,573,905。前述文獻各自通過引用而將其整體併入本文。

人類抗體也可以透過體外活化的B細胞產生(參見美國專利號5,567,610及5,229,275，其各自通過引用而將其整體併入本文)。人類抗體也可以使用融合瘤技術在體外產生，例如但不限於Roder等人描述的技術。(Methods Enzymol.,121：140-167(1986))。

人源化抗體

或者，在一些實施例中，非人類抗體可以是人源化的，其中抗體的特定序列或區域經修飾以增加與人體自然產生的抗體的相似性。例如，在本發明中，抗體或其片段可包含非人類哺乳動物scFv。在一實施例中，抗原結合結構域部分是人源化的。

本領域已有多種知技術可用來產生人源化抗體，其包括但不限於CDR移植(參見例如，歐洲專利號239,400、國際公開號WO 91/09967及美國專利號5,225,539、5,530,101及5,585,089，其各自通過引用而將其整體併入本文)，飾面(veneering)或表面重修(resurfacing)(參見例如，歐洲專利號EP 592,106及EP 519,596、Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498、Studnicka etal.,1994,Protein Engineering,7(6)：805-814及Roguska et al.,1994,PNAS,91：969-973，其各自通過引用而將整體併入本文)，鏈改組(chain shuffling)(參見例如美國專利號5,565,332，其通過引用而將其整體併入本文)，以及在例如美國專利申請公開號US2005/0042664、US2005/0048617、美國專利號6,407,213、5,766,886、國際公開號WO 9317105、Tan etal.,J.Immunol.,169：1119-25(2002)、Caldas etal.,Protein Eng.,13(5)：353-60(2000)、Morea et al.,Methods,20(3)：267-79(2000)、Baca et al.,J.Biol.Chem.,272(16)：10678-84(1997)、Roguska et al.,Protein Eng.,9(10)：895-904(1996)、Couto et al.,Cancer Res.,55(23 Supp)：5973s-5977s(1995)、Couto etal.,Cancer Res.,55(8)：1717-22(1995)、Sandhu J S,Gene,150(2)：409-10(1994)及Pedersen et al.,J.Mol.Biol.,235(3)：959-73(1994)中所公開的技術，其各自通過引用而將整體併入本文。通常，框架區中的框架殘基將被來自CDR供體抗體的相應殘基取代，以改變(優選為改善)與抗原的結合。這些框架的取代透過本領域公知的方法鑑定。例如，透過模擬CDR和框架殘基的相互作用以鑑定對抗原結合重要的框架殘基，和透過序列比較以鑑定特定位置處的異常框架殘基。(參見例如，Queen等人的美國專利號5,585,089、和Riechmann等人，1988,Nature,332：323，其通過引用而將其整體併入本文)。

人源化抗體具有從非人源引入的一個或多個胺基酸殘基。這些非人類胺基酸殘基通常稱為「外來(import)」殘基，其通常取自「外來」(import)可變結構域。因此，人源化抗體包含來自非人類免疫球蛋白分子的一或多個CDR及來自人類的框架區。抗體的人源化在本領域中是眾所周知的，並且基本上可以按照Winter和其同事的方法進行(Jones et al.,Nature, 321：522-525(1986)、Riechmann etal.,Nature,332：323-327(1988)、Verhoeyen etal.,Science,239：1534-1536(1988))，其係用囓齒動物的一或多個的CDR序列來取代人類抗體的相應序列，即CDR移植(EP 239,400、PCT公開號WO 91/09967、及美國專利號4,816,567、6,331,415、5,225,539、5,530,101、5,585,089、6,548,640，其內容通過引用而將其整體併入本文)。在前述人源化嵌合抗體中，至少部分的人類可變結構域已被來自非人類物種的相應序列取代。在實施時，人源化抗體通常是人類抗體，其中一些CDR殘基和可能的一些框架(FR)殘基被來自囓齒動物抗體中類似位點的殘基取代。抗體的人源化也可透過飾面或表面重修來實現(EP 592,106、EP 519,596、Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498、Studnicka et al.,Protein Engineering,7(6)：805-814(1994)、及Roguska et al.,PNAS,91：969-973(1994))或鏈改組(美國專利號5,565,332)，前述文獻的內容皆通過引用而將其整體併入本文。

選用人類可變結構域(輕鏈和重鏈)來製備人源化抗體，其目的是要降低抗原性。根據所謂的「最佳擬合」方法，針對已知的人類可變結構域序列的整個文庫，來篩選囓齒動物抗體的可變結構域的序列。然後將最接近囓齒動物的人類序列作為人源化抗體的人類框架(FR)(Sims et al.,J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.,196：901(1987)，其內容通過引用而將其整體併入本文)。另一種方法係使用衍生自所有人類抗體之特定輕鏈或重鏈次群組的共有序列所取得的特定框架。相同的框架可用於不同的人源化抗體(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta et al.,J.Immunol.,151：2623(1993)。其內容通過引用而將其整體併入本文)。

抗體可以人源化，且保留對目標抗原的高親和力和其他有益的生物學特性。根據本發明的一實施例，其係透過使用親代和人源化序列的三維模型來分析親代序列和各種概念性人源化產物的方法製備人源化抗體。

免疫球蛋白的立體模型是容易獲得的，且為本領域技術人員習知的。說明和顯示候選免疫球蛋白候選序列的可能立體構型結構的計算機程序是可取得的。檢視這些結構，能夠分析殘基在免疫球蛋白候選序列發揮其功能時所可能扮演的角色，亦即其係分析影響候選免疫球蛋白與目標抗原間結合能力的殘基。以前述方式，框架區(FR)的殘基可以從受體和外來序列中進行選擇和組合，從而達到所需的抗體特徵，例如提高對目標抗原的親和力。一般來說，CDR殘基係直接影響該抗體與抗原的結合，且與該抗體與抗原間的結合有最實質性的相關性。

人源化抗體保留與原始抗體相似的抗原專一性。然而，使用某些人源化方法，可以使用「定向進化」的方法增加抗體與目標抗原結合的親和力及/或專一性，如Wu等人於J.Mol.Biol.,294：151(1999)中所述的內容，其通過引用而將其整體併入本文。

轉換受體(Switch Receptor)

本發明提供了包含轉換受體的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如經修飾的T細胞)的組合物和方法。因此，在一些實施例中，免疫細胞已經經過基因修飾以表現轉換受體。如本文所使用，術語「轉換受體」是指一種分子，其係設計來降低負向訊息傳遞分子的作用，例如負向訊息傳遞分子對本發明經修飾的免疫細胞的作用。除了減少負向訊息傳遞分子的作用之外，本發明的轉換受體可以設計成將負向信號轉換成正向信號，其係藉由具有與正向信號相關的細胞內結構域。設計用於將負向信號轉換為正向信號的轉換受體如本文中所描述的。因此，轉換受體包含有與負向信號相關的細胞外結構域和與正向信號相關的細胞內結構域。舉例來說，具有轉換受體的經修飾免疫細胞可以結合該經修飾免疫細胞所處之微環境中的負向訊息傳遞分子，並將負向訊息傳遞分子可能對該經修飾免疫細胞所產生的作用轉化為正向信號。

腫瘤細胞會產生免疫抑制微環境，以保護其免受免疫辨識及消除。前述免疫抑制微環境會限制免疫抑制療法(如CAR-T或TCR-T細胞療法)的有效性。分泌的細胞激素轉化生長因子β(TGFβ)會直接抑制毒殺性T細胞的功能，並另外誘發調節性T細胞形成以進一步抑制免疫反應。先前文獻已經證實了在前列腺癌中TGFβ會引發T細胞的免疫抑制(Donkor et al.,2011；Shalapour et al.,2015)。為了降低TGFβ的免疫抑制作用，可以修飾免疫細胞以表現TGFβR-IL12轉換受體。

在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是TGFβR-IL12Rβ1受體。當在細胞中表現時，TGFβR-IL12Rβ1受體將TGF-β的負向信號轉換成IL-12的正向信號。在一實施例中，TGFβR-IL12Rβ1受體包含下述胺基酸序列： (SEQ ID NO：124)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：125)。

TGFβR-IL12Rβ1受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，其係同時維保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時，會將TGF-β的負向信號轉化為IL-12的正向信號)。因此，本發明的TGFβR-IL12Rβ1受體與SEQ ID NO：124所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼有TGFβR-IL12Rβ1受體的核酸與SEQ ID NO：125所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是TGFβR-IL12Rβ2受體。當在細胞中表現時，TGFβR-IL12Rβ2受體將TGF-β的負向信號轉換成IL-12的正向信號。在一實施例中，TGFβR-IL12Rβ2受體包含下述胺基酸序列： (SEQ ID NO：126)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：127)。

TGFβR-IL12Rβ2受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將TGF-β負向信號轉化為IL-12正向信號)。因此，本發明的TGFβR-IL12Rβ2受體與SEQ ID NO：126所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼TGFβR-IL12Rβ2受體的核酸與SEQ ID NO：127所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是PD1-CTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1-CTM-CD28受體將PD1的負向信號轉換成CD28的正向信號。PD1-CTM-CD28受體包含PD1細胞外結構域的變體、CD28跨膜結構域及CD28細胞質結構域。在一實施例中，PD1-CTM-CD28受體包含下述胺基酸序列： (SEQ ID NO：128)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：129)。

PD1-CTM-CD28受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將PD1的負向信號轉化為CD28的正向信號)。因此，本發明的PD1-CTM-CD28受體與SEQ ID NO：128所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼PD1-CTM-CD28受體的核酸與SEQ ID NO：129所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是PD1-PTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1-PTM-CD28受體將PD1的負向信號轉換成CD28的正向信號。PD1-PTM-CD28受體包含PD1細胞外結構域的變體、PD1跨膜結構域及CD28細胞質結構域。在一實施例中，PD1-PTM-CD28受體包含下述胺基酸序列： (SEQ ID NO：130)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：131)。

PD1-PTM-CD28受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將PD1的負向信號轉化為CD28的正向信號)。因此，本發明的PD1-PTM-CD28受體與SEQ ID NO：130所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼PD1-PTM-CD28受體的核酸與SEQ ID NO：131所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

在一實施例中，適用於本發明的轉換受體是PD1^A132L-PTM-CD28受體。當在細胞中表現時，PD1^A132L-PTM-CD28受體將PD1的負向信號轉換成CD28的正向信號。先前文獻發現用胺基酸位置132處的點突變(用丙胺酸取代白胺酸，A132L)的PD1，使其與PD-L1的親和力增加兩倍(參見例如，Zhang et al.,Immunity(2004)20(3),337-347)。PD1^A132L-PTM-CD28受體包含PD1細胞外結構域的變體、其在132位置具有胺基酸取代(A132L)、PD1跨膜結構域及CD28細胞質結構域。在一實施例中，PD1^A132L-PTM-CD28受體包含下述胺基酸序列： (SEQ ID NO：132)，其可以由下列核酸序列所編碼： (SEQ ID NO：133)。

PD1^A132L-PTM-CD28受體的可耐受變異是本領域技術人員已知的，同時保持其所預期的生物學活性(例如，當在細胞中表現時將PD1的負向信號轉化為CD28的正向信號)。因此，本發明的PD1^A132L-PTM-CD28受體與SEQ ID NO：132所示的胺基酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。因此，本發明編碼PD1^A132L-PTM-CD28受體的核酸與SEQ ID NO：133所示的核酸序列相比，可包含具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。

用於本發明的其他合適的轉換受體如PCT公開號WO2013019615A2中所描述，其內容通過引用併入本文。

核酸和表現載體

本發明提供了一核酸，其編碼對目標抗原具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)。本發明提供了一核酸，其編碼對目標抗原具有親和力的T細胞受體(TCR)。本發明還提供了編碼轉換受體的核酸。

在一些實施例中，本文的核酸係用來例如在哺乳動物細胞中產生如本文所述的TCR。在一些實施例中，本文的核酸係用來擴增編碼有 TCR的核酸。

如本文所述的，本文的TCR包含TCRα鏈和TCRβ鏈。因此，本文提供了編碼TCRα鏈的核酸以及編碼TCRβ鏈的核酸。在一些實施例中，編碼TCRα鏈的核酸與編碼TCRβ鏈的核酸是分開的。在一示例性實施例中，編碼TCRα鏈的核酸以及編碼TCRβ鏈的核酸位於同一個核酸內。

在一些實施例中，本發明的核酸包含含有TCRα鏈編碼序及和TCRβ鏈編碼序列的核酸。在一些實施例中，本發明的核酸包含有TCRα鏈編碼序列和TCRβ鏈編碼序列，前述序列透過連接子分開。用於本發明的連接子允許多個蛋白質可以由同一個核酸序列(例如，多順反子或雙順反子序列)編碼，其被轉譯為多蛋白(polyprotein)，前述多蛋白被解離成獨立的蛋白質組分。例如，用於本文核酸的連接子包含TCRα鏈編碼序列和TCRβ鏈編碼序列，使TCRα鏈和TCRβ鏈會轉譯為多蛋白，該多蛋白解離成獨立的TCRα鏈和TCRβ鏈組分。

在一些實施例中，連接子包含一核酸序列，其編碼內部核醣體進入位點(internal ribosome entry site，IRES)。如本文所使用的，「內部核醣體進入位點」或「IRES」是指促進內部核醣體直接進入蛋白質編碼區的起始密碼子(例如ATG)的元件，從而使基因進行端帽不依賴性(cap-independent)的轉譯。各種內部核醣體進入位點是本領域技術人員已知的，其包括但不限於，可從病毒或細胞mRNA來源所獲得的IRES，例如免疫球蛋白重鏈結合蛋白(binding protein，BiP)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、纖維母細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor)、轉譯起始因子eIF4G、酵母菌轉錄因子TFIID及HAP4、及IRES可從例如心臟病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV，朋友鼠類白血病病毒(Friend murine leukemia virus，FrMLV)和莫洛尼氏鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)所獲得的。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的IRES。

在一些實施例中，連接子包含編碼自我截切肽的核酸序列。如本文所使用，「自我截切肽」或「2A肽」是指一種寡肽，其使多個蛋白質被編碼為多蛋白，其在轉譯時解離成組分蛋白。術語「自我截切」的使用並非意指蛋白質的水解切割反應。各種自我截切肽或2A肽是本領域技術人員已知的，包括但不限於在小核糖核酸病毒科中所發現的下列病毒，例如口蹄疫病毒(FMDV)，馬鼻炎A病毒(ERAV0)、Thosea asigna病毒(TaV)及豬鐵士古病毒-1(porcine tescho virus-1，PTV-1)、及心臟病毒例如泰勒病毒(Theilovirus)及腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)。來自FMDV、ERAV、PTV-1，和TaV的2A肽在本文中分別稱為「F2A」、「E2A」、「P2A」和「T2A」。本領域技術人員將能夠選擇適合用於本發明的自我截切肽。

在一些實施例中，連接子還包含編碼furin切割位的核酸序列。furin是一種普遍表現的蛋白酶，其存在於反式高基氏體中，並在蛋白質分泌之前對其前驅物進行加工。furin在其共有(consensus)辨識序列的COOH-末端進行切割。各種furin的共有辨識序列(或「furin切割位」)是本領域技術人員已知的，其包括但不限於Arg-X-Lys-Arg(SEQ ID NO：134)或Arg-X-Arg-Arg(SEQ ID NO：135)、X1-Arg-X-X1-Arg(SEQ ID NO：136)及Arg-XX-Arg(SEQ ID NO：137)，例如Arg-Gln-Lys-Arg(SEQ)ID NO：138)，其中X是任何天然存在的胺基酸，X1代表Arg或Lys。本領域技術人員將能夠選擇合適的furin切割位用於本發明。

在一些實施例中，連接子包含編碼furin切割位和2A肽的組合的核酸序列。其實例包括但不限於包含編碼furin和F2A的核酸序列的連接子、包含編碼furin和E2A的核酸序列的連接子、包含編碼furin和P2A的核酸序列的連接子、包含編碼furin和T2A的連接子。本領域技術人員將能夠選擇適用於本發明的組合。在前述實施方案中，連接子可進一步包含furin和2A肽之間的間隔序列。各種間隔序列是本領域已知的，包括但不限於甘胺酸絲胺酸(GS)間隔子，例如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：99)及(GGGS)n(SEQ ID NO：100)，其中n表示至少為1的整數。示例性間隔序列可包含胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：102)、GGSGG(SEQ ID NO：103)、GSGSG(SEQ ID NO：104)、GSGGG(SEQ ID NO：105)、GGGSG(SEQ ID NO：106)、GSSSG(SEQ ID NO：107)等。本領域技術人員將能夠選擇適合用於本發明的間隔序列。

在一示例性實施例中，本發明的核酸包含核酸序列，前述核酸序列包含TCRα鏈編碼序列及TCRβ鏈編碼序列，前述編碼序列被Furin-(G4S)2-T2A(F-GS2-T2A)連接子分開。F-GS2-T2A連接子可以由核酸序列 CC(SEQ ID NO：139)編碼，並且可以包含胺基酸序列RAKRGGGGSGGGGSEGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：140)。本領域技術人員能夠理解，本發明的連接子可包括可耐受的序列變異。

在一些實施例中，本發明提供了核酸，其包含編碼如本文所述之轉換受體的核酸序列。在一些實施例中，核酸包含編碼轉換受體的核酸序列和編碼TCR的核酸序列(例如，8F TCR)。在一實施例中，編碼轉換受體的核酸序列和編碼TCR的核酸序列存在於不同的核酸上。在一實施例中，編碼轉換受體的核酸序列和編碼TCR的核酸序列存在於同一個核酸內。在前述實施例中，編碼轉換受體的核酸序列和編碼TCR的核酸序列係以如本文所述的連接子分開。

舉例來說，本發明的核酸可包含編碼轉換受體的核酸序列、連接子和編碼TCR的核酸序列。在一實施例中，連接子包含編碼2A肽(例如F2A)的核酸序列。在示例性實施例中，本發明的核酸可包含編碼轉換受體的核酸序列和編碼TCR的核酸序列，前述核酸序列被編碼F2A的核酸序列分開。在一示例性實施例中，編碼TCR的核酸序列包含TCRα鏈編碼序列和TCRβ鏈編碼序列，前述核酸序列被編碼F-GS2-T2A的核酸序列分開。

因此，在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼連接子的核酸序列，以及編碼TCR的核酸序列。在一實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼TCR的核酸序列、編碼連接子的核酸序列，以及編碼轉換受體的核酸序列。在一示例性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼F2A的核酸序列，以及編碼TCR的核酸序列。在另一示例性實施例中，本發明的核酸從5'至3'包含：編碼轉換受體的核酸序列、編碼F2A的核酸序列、編碼TCRα鏈的核酸序列、編碼F-GS2-T2A的核酸序列，以及編碼TCRβ鏈的核酸序列。

在一些實施例中，本發明的核酸可以與轉錄控制單元(例如啟動子和促進子(enhancer)等)可操作地連接。適合的啟動子和促進子是本領域技術人員已知的。額外的啟動子單元，例如促進子，其係調節轉錄起始的頻率。一般來說，前述促進子係位於起始點上游30至110bp的區域，儘管最近已有文獻顯示，許多啟動子也包含起始點下游的功能單元。啟動子單元之間的間隔通常是有彈性的，因此當單元相對於彼此反轉或移動時啟動子仍能保持其功能。在胸苷激酶(thymidine kinase，tk)啟動子中，啟動子單元之間的間隔長度可以長至50bp，而不會使其活性降低。根據啟動子，個別單元應可以協同或獨立地在轉錄的活化中發揮作用。

為了在細菌細胞中表現，合適的啟動子包括但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP及trc。為了在真核細胞中表現，合適的啟動子包括但不限於輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子及促進子單元、巨細胞病毒立即早期啟動子(cytomegalovirus immediate early promoter)、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的長末端重複中的啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子，以及各種本領域已知的組織專一性啟動子。合適的可逆啟動子(reversible promoter)，係包括可逆誘導型啟動子(reversible inducible promoter)，是本領域已知的。前述可逆啟動子可以分離並衍生自許多生物，例如真核生物和原核生物。對來自第一生物體的可逆啟動子的修飾以用於第二生物體(例如，第一生物為原核生物而第二生物為真核生物、或是一第一生物為真核生物而第二生物為原核生物等)是本領域公知的。前述可逆啟動子，和基於前述可逆啟動子但也包含其他控制蛋白的系統，係包括但不限於醇調節啟動子(alcohol regulated promoter)(例如，乙醇去氫酶I(alcA)基因啟動子、對乙醇反式活化蛋白(alcohol transactivator proteins，A1cR)產生反應的啟動子)等、四環素調節啟動子(例如包括TetActivators、TetON、TetOFF等的啟動子系統)、類固醇調節啟動子(例如，大鼠糖皮質素受體啟動子系統、人類雌激素受體啟動子系統、類視色素啟動子系統，甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素啟動子系統、美服培酮啟動子系統等)、金屬調節啟動子(如金屬硫蛋白啟動子系統等)、相關病原調節之啟動子(如水楊酸調節啟動子、乙烯調節啟動子、苯并噻二唑調節啟動子等)、溫度調節啟動子(例如，熱休克誘導型啟動子(如HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等))、光調節啟動子、合成誘導型啟動子及前述啟動子的類似物等。

在一些實施例中，啟動子是CD8細胞專一性啟動子、CD4細胞專一性啟動子、嗜中性球專一性啟動子或NK專一性啟動子。例如，啟動子可以是CD4基因啟動子：參見例如，Salmon et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：7739、及Marodon et al.(2003)Blood 101：3416。另一個實例啟動子可以是CD8基因啟動子。NK細胞的專一性表現可以藉由使用NcrI(p46)啟動子來達成：參見例如，Eckelhart et al.Blood(2011)117：1565。

為了在酵母菌細胞中表現，合適的啟動子是組成型啟動子，例如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子等；或可調控的啟動子，如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子及AOX1(例如，用於畢赤酵母菌屬(Pichia))。選擇合適的載體和啟動子是本領域普通技術人員的公知常識。適用於原核宿主細胞的啟動子包括但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子、trp啟動子、lac操縱子啟動子、雜交啟動子(hybrid promoter)，例如lac/tac雜交啟動子、tac/trc雜交啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子、trc啟動子、tac啟動子等、araBAD啟動子、體內調控的啟動子，例如ssaG啟動子或相關啟動子(參見例如，美國專利公開號20040131637)、pagC啟動子(Pulkkinen and Miller,J.Bacteriol.(1991)173(1)：86-93、Alpuche-Aranda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21)：10079-83)，nirB啟動子(Harborne et al.Mol.Micro.(1992)6：2805-2813)等(參見例如，Dunstan et al.,Infect.Immun.(1999) 67：5133-5141、McKelvie et al.,Vaccine(2004)22：3243-3255、及Chatfield et al.,Biotechnol.(1992)10：888-892)、sigma70啟動子，例如共有(consensus)sigma70啟動子(參見例如，GenBank登錄號AX798980、AX798961及AX798183)、固定相啟動子(stationary phase promoter)，例如dps啟動子、spv啟動子等、源自致病島(pathogenicity island)SPI-2的啟動子(參見例如WO96/17951)、actA啟動子(參見例如，Shetron-Rama et al.,Infect.Immun.(2002)70：1087-1096)、rpsM啟動子(參見例如，Valdivia and Falkow Mol.Microbiol.(1996).22：367)、tet啟動子(參見例如，Hillen,W.and Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.and Heinemann,U.(eds),Topics in Molecular and Structural Biology,Protein--Nucleic Acid Interaction.Macmillan,London,UK,Vol.10,pp.143-162)、SP6啟動子(參見例如，Melton et al.,Nucl.Acids Res.(1984)12：7035)等等。適用於原核生物如大腸桿菌的強效啟動子包括但不限於Trc、Tac、T5、T7和PLambda。用於細菌宿主細胞的操縱子的非限制性實例包括乳糖啟動操縱子(當與乳糖接觸時，LacI抑制蛋白改變結構，進而阻止Lad抑制蛋白與操縱子結合)、色胺酸啟動操縱子(當與色氨酸複合時，TrpR抑制蛋白具有結合操縱子的結構；在不存在色胺酸的情況下，TrpR抑制蛋白具有不與操縱子結合的結構)及tac啟動操縱子(參見例如deBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80：21-25)。

合適的啟動子的其他實例包括立即早期巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子序列。該啟動子序列是強效組成型啟動子序列，其能夠驅動任何與其可操作地連接的多核苷酸序列的高水平表現。然而，也可以使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(mouse mammary tumor virus，MMTV)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)長末端重複序列(long terminal repeat，LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、家禽白血病病毒啟動子(avian leukemia virus promoter)，艾伯斯坦-巴爾病毒迅早期啟動子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)、EF-1α啟動子、以及人類基因啟動子，例如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌胺酸激酶啟動子。此外，本發明不應僅限於使用組成型啟動子，本發明亦涵蓋誘導型啟動子。誘導型啟動子可以作為一種分子開關，在有需要時，可用來啟動與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現，或是在不想要發生這種表現時，用來關閉與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現。誘導型啟動子的實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質素啟動子、黃體素啟動子及四環素啟動子。

在一些實施例中，含有合適啟動子的基因座或構築體或轉基因，係透過誘導系統的誘導來進行不可逆轉換。適用於誘導不可逆轉換的系統是本領域熟知的，例如，不可逆轉換的誘導可以利用Cre-lox介導的重組(參見例如，Fuhrmann-Benzakein,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28：e99，其公開內容通過引用併入本文)。任何本領域已知的重組酶、核酸內切酶、連接酶，重組位點等的合適組合，皆可用於產生不可逆轉換的啟動子。本文中所述的進行位點專一性重組的方法、機制及需求，可用於產生不可逆轉換的啟動子，並且是本領域熟知的，參見例如Grindley et al.Annual Review of Biochemistry(2006)567-605、及Tropp,Molecular Biology(2012)(Jones & Bartlett Publishers,Sudbury,Mass.)中所述內容，其公開內容以引用方式而納入本文。

在一些實施例中，本發明的核酸還包含編碼有CAR誘導型表現盒(inducible expression cassette)的核酸序列。在一實施例中，CAR誘導型表現盒係用於產生在CAR訊息傳遞後所釋放的轉基因多肽產物。參見例如，Chmielewski and Abken,Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8)：1145-1154、及Abken,Immunotherapy(2015)7(5)：535-544。

如本文所述的，載體可用於將T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)引入免疫細胞(例如T細胞)中。在一實施例中，本發明包括載體，其包含編碼有TCR的核酸序列。在另一實施例中，本發明包括含有編碼有CAR核酸序列的載體。如本文所述的，載體可將轉換受體引入免疫細胞(例如T細胞)。在另一實施例中，本發明包括載體，其包含編碼有轉換受體的核酸序列。

載體可包含質體載體、病毒載體、反轉錄轉位子 (retrotransposon，例如piggyback、sleeping beauty)，定點插入載體(site directed insertion vector，例如CRISPR、Zn指核酸酶、TALEN)、自殺表現載體、慢病毒載體、RNA載體或其他本領域已知的載體。

本發明還提供了插入本發明DNA的載體。載體，包括來自反轉錄病毒如慢病毒的載體，是實現長期基因轉移的合適工具，因為前述載體使轉基因能夠長期、穩定地嵌入在細胞內，及在其子細胞中增殖。慢病毒載體相對於衍生自腫瘤反轉錄病毒(例如鼠類白血病病毒)的載體具有額外的優勢，因為該慢病毒載體可以轉導非增殖的細胞，例如肝細胞。前述慢病毒載體還具有額外的優點，即在引入其的受試者中所導致的免疫原性較低。

天然或合成核酸的表現通常是透過將核酸或其部分可操作地連接至啟動子，並將構築體併入表現載體中來達成。前述載體通常能夠在哺乳動物細胞中複製、及/或能夠嵌入到哺乳動物的細胞基因體中。典型的載體含有轉錄和轉譯終止子、起始序列及可用於調控所需表現的核酸序列的啟動子。

可以將核酸轉殖到任何數量的不同類型的載體中。例如，可以將核酸轉殖到載體中，前述載體包括但不限於質體、噬菌體、噬菌體衍生物、動物病毒和黏接質體。特別感興趣的載體包括表現載體、複製載體、探針生成載體和定序載體。

表現載體可以以病毒載體的形式提供給細胞。病毒載體技術是本領域公知的，並且描述於例如Sambrook等人，2012，分子選殖：實驗室手冊，第1-4卷，冷泉港出版，紐約(Sambrook et al.,2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,volumes 1-4,Cold Spring Harbor Press,NY)、以及其他病毒學和分子生物學手冊中。可用作載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒及慢病毒。傳統上，合適的載體含有可在至少一種生物中發揮功能的複制起始序列、啟動子序列、方便的限制性內切核酸酶位點及一或多個可篩選擇標記(例如，WO 01/96584、WO 01/29058及美國專利號6,326,193)。

本發明的核酸可以存在於表現載體及/或轉殖載體中。表現載體可包括可篩選標記、複製起始序列及提供載體複製及/或維持的其他特徵。合適的表現載體包括例如質體、病毒載體等。本領域技術人員已知大量合適的載體和啟動子、且目前已有許多商售可購得而用於產生標的重組構築體。可透過實例提供以下載體，且不應解釋為本發明的限制：細菌：pBs、噬菌體、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，Calif，美國)、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核生物：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL(Pharmacia)。

表現載體通常具有位於啟動子序列附近的方便限制性位點(convenient restriction site)，讓編碼有異源蛋白質的核酸序列得以插入。表現宿主可具有操作性的可篩選標記。合適的表現載體包括但不限於病毒載體(例如基於痘病毒的病毒載體、小兒麻痺病毒、腺病毒(參見例如，Li et al.,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35：2543-2549、Borras et al.,Gene Ther.(1999)6：515-524、Li and Davidson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：7700-7704、Sakamoto et al.,H.Gene Ther.(1999)5：1088-1097、WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984及WO 95/00655)、腺相關病毒(參見例如，Ali et al.,Hum.Gene Ther.(1998)9：81-86、Flannery et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6916-6921、Bennett et al.,Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38：2857-2863、Jomary et al.,Gene Ther.(1997)4：683 690、Rolling et al.,Hum.Gene Ther.(1999)10：641-648、Ali et al.,Hum.Mol.Genet.(1996)5：591-594、Srivastava in WO 93/09239、Samulski et al.,J.Vir.(1989)63：3822-3828、Mendelson et al.,Virol.(1988)166：154-165及Flotte et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：10613-10617))、SV40、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(參見例如，Miyoshi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：10319-23、Takahashi et al.,J.Virol.(1999)73：7812-7816)、反轉錄病毒載體(例如，鼠類白血病病毒、脾臟壞死病毒及衍生自反轉錄病毒的載體，例如勞氏肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、家禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)及乳癌病毒)及前述病毒載體的類似物等。

在一些實施例中，表現載體(例如，慢病毒載體)可用於將CAR及/或TCR及/或轉換受體引入免疫細胞或其前驅細胞(例如T細胞)中。因此，本發明的表現載體(例如，慢病毒載體)可包含編碼有CAR及/或TCR及/或轉換受體的核酸。在一些實施例中，表現載體(例如，慢病毒載體)將包含有助於CAR及/或TCR及/或其所編碼的轉換受體的功能性表現的其他單元。在一些實施例中，包含編碼CAR及/或TCR及/或轉換受體核酸的表現載體，還包含哺乳動物啟動子。在一實施例中，載體還包含延長因子-1-α啟動子(EF-1α啟動子)。使用EF-1α啟動子可以提高下游轉基因(例如CAR及/或顯性負性受體(dominant negative receptor)及/或轉換受體編碼核酸序列)的表現效率。生理啟動子(例如，EF-1α啟動子)可能較不會誘發由嵌入所介導的遺傳毒性，並且可消除反轉錄病毒載體轉化幹細胞的能力。適用於載體(例如慢病毒載體)的其他生理學啟動子是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體中。在一些實施例中，載體(例如，慢病毒載體)還包含非必需順式作用序列(non-requisite cis acting sequence)，前述序列可以改善效價和基因表現。非必需順式作用序列的一個非限制性實例是中心多嘌呤管道和中心終止序列(central polypurine tract and central termination sequence，cPPT/CTS)，其對於有效的反轉錄和細胞核輸入是重要的。其他非必需的順式作用序列是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。在一些實施例中，載體還包含轉錄後調控元件。轉錄後調控元件可以改善RNA轉譯、改善轉基因表現並穩定RNA轉錄物。轉錄後調控元件的一個實例是土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element，WPRE)。因此，在一些實施例中，用於本發明的載體還可包含WPRE序列。各種轉錄後調節元件是本領域技術人員已知的，並且可以併入本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。本發明的載體可以進一步包含其他元件，例如用於RNA轉運的rev反應元件(rev response element，RRE)、包裝序列(packaging sequences)和5'和3'長末端重複(LTR)。術語「長末端重複」或「LTR」是指位於反轉錄病毒DNA末端的鹼基對的結構域，其包含U3、R和U5區。LTR通常提供表現反轉錄病毒基因所需的功能(例如，基因轉錄物的促進、起始及多腺苷酸化)和病毒複製。在一實施例中，本發明的載體(例如，慢病毒載體)包括3'U3缺失的LTR。因此，本發明的載體(例如，慢病毒載體)可包含本文所述元件的任何組合，以增強轉基因功能性表現的效率。例如，除了編碼CAR及/或編碼TCR及/或開關受體的核酸之外，本發明的載體(例如，慢病毒載體)可以包含WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5'LTR、3'U3缺失的LTR'。

本發明的載體可以是自動失活載體(self-inactivating vector)。如本文所使用的，術語「自動失活載體」是指其中3'LTR促進子啟動子區(U3區)已被修飾(例如，透過缺失或取代)的載體。自動失活載體可以在病毒第一次複製後阻止病毒轉錄。因此，自動失活載體可以僅感染一次，然後嵌入到宿主基因體(例如哺乳動物基因體)中，且不能進一步被傳遞。因此，自動失活載體可以大幅的降低產生出具有複製能力病毒的風險。

在一示例性實施例中，如圖7所示，本發明提供了包含Tet-On基因表現系統的載體。如圖7所示，pRetroX-TetOne.EGFP載體包含Tet-On誘導型表現系統。人類PGK(hPGK)啟動子會驅動Tet-On 3G(反向Tet反式活化蛋白)的表現。誘導型TRE3GS啟動子會驅動轉基因(例如EGFP，如pRetroX-TetOne.EGFP載體中所示)的表現。在去氧羥四環素(Dox)的存在下，Tet-On 3G係專一性結合至PTRE3G，並活化下游轉基因(例如EGFP)的轉錄。圖7中也顯示本發明的pRetroX-TetOne.8F.TCR載體。如圖所示，pRetroX-TetOne.8F.TCR載體包含Tet-On誘導型表現系統，其在Dox存在下會驅動8F TCR的表現。

圖7(本發明的一個實施例)中顯示載體的「整合式(all-in-one)」設計，其將反式活化蛋白組分和誘導型啟動子組分都常駐在單一載體上。Tet-On 3G反式活化因子係沿人類磷酸甘油酸激酶1啟動子(hPGK啟動子)的正向進行表現，外源TCR及/或CAR及/或轉換受體係從TRE3GS啟動子以反向進行表現。任何啟動子可用於驅動反式活化蛋白的正向表現，例如任何本文所述的組成型啟動子(例如EF-1α啟動子)。

因此，本發明提供了一種載體，其在正向方向上包含有與編碼反式活化蛋白的核酸可操作地連接的組成型啟動子，並且在反向方向上，提供與編碼有TCR及/或CAR及/或轉換受體的核酸可操作地連接的誘導型啟動子。

在另一實施例中，本發明提供了包含Tet-On誘導型系統的載體，其驅動如本文所述的CAR及/或TCR及/或轉換受體的表現。該載體可以是自動失活載體。載體可以進一步包含EF-1α啟動子、rev反應元件(RRE)、土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)及cPPT序列。

在一實施例中，編碼TCR/CAR的核酸和編碼轉換受體的核酸存在於同一個核酸上。編碼TCR/CAR的核酸和編碼轉換受體的核酸可以透過如本文所述的連接子(例如，F-GS2-T2A連接子)分開。因此，本發明的表現載體包含編碼有TCR/CAR的核酸和編碼有轉換受體的核酸。

在一實施例中，編碼有TCR/CAR的核酸和編碼有轉換受體的核酸存在於不同的核酸上。因此，本發明提供了獨立的表現載體，一個表現載體包含有編碼TCR/CAR的核酸、另一個表現載體包含有編碼轉換受體的核酸。在實施例中，當包含表現載體各自包含有編碼TCR/CAR的核酸和編碼轉換受體的核酸時，該些表現載體可各自包含相同的骨架序列。在其他實施例中，該些表現載體可各自包含不同的骨架序列。例如，在一實施例中，慢病毒載體包含有編碼TCR/CAR的核酸、反轉錄病毒載體包含有編碼轉換受體的核酸。每個表現載體還可以包含如本文所述的Tet-On誘導型系統。技術人員能夠決定合適的表現載體。

在一些實施例中，本發明的核酸可以是RNA，例如體外合成的RNA。用於體外合成RNA的方法是本領域技術人員已知的，任何已知的方法皆可用來合成包含編碼本發明CAR及/或TCR及/或轉換受體序列的RNA。將RNA引入宿主細胞的方法是本領域已知的。參見例如，Zhao et al.Cancer Res.(2010)15：9053。將包含編碼本發明的CAR及/或TCR及/或轉換受體的核苷酸序列的RNA引入宿主細胞，係可在體外或離體或體內進行。例如，宿主細胞(例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等)可以用包含本發明編碼CAR及/或TCR及/或轉換受體核苷酸序列的RNA，在體外或離體進行電穿孔。

可以透過定序驗證本文描述的任何分子的產生。可以使用免疫墨點法、免疫組織化學染色法、流式細胞儀或本領域習知和可獲得的其他技術來驗證全長蛋白質的表現。

為了評估多肽或其部分的表現，待引入細胞的表現載體還可含有可篩選標記基因或報導基因，或兩者皆有，以便於從被病毒載體所轉染或感染的細胞群中鑑定和選出有表現的細胞。在其他實施例中，可篩選標記可以在獨立的DNA片段上攜帶，並用於共轉染步驟。可篩選標記和報導基因的兩側可以接有適當的調控序列，以使其能夠在宿主細胞中表現。有用的可篩選標記例如包括抗生素抗藥性基因，例如neo及其類似物等。

報導基因係用來鑑定潛在被轉染的細胞和評估調控序列的功能。一般來說，報導基因在受體生物體或組織中是不存在或不表現的，且編碼有一多肽，該多肽的表現可透過一些易於檢測的特性(例如酵素活性)顯現出來。在將DNA引入受體細胞後，在適當的時間評估報導基因的表現。合適的報導基因可包括但不限於下列基因：編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌的鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白的基因(例如，Ui-Tei et al.,2000 FEBS Letters 479：79-82)。合適的表現系統是公知的，可以使用已知技術來製備或商售購得。傳統上，帶有最小5'側翼區(flanking region)且其報導基因具有最高表現量的構築體會被鑑定為啟動子。此類啟動子區可以與報導基因連接，並用於評估試劑調節啟動子驅動轉錄的能力。

產生經修飾的免疫細胞的方法

本發明提供了產生/生成經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如，經修飾的T細胞)的方法。其通常是透過引入編碼如本文所述的TCR及/或CAR及/或轉換受體的核酸來改造細胞。將核酸引入細胞的方法包括物理、生物及化學方法。以物理方式將多核苷酸(例如RNA)引入宿主細胞的方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、基因槍法(particle bombardment)、顯微注射、電穿孔或其類似方法等。可以使用商業上可獲得的方法將RNA引入目標細胞中，前述方法包括電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany)、ECM 830(BTX,Harvard Instruments,Boston,Mass.)、或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.、Multiporator(Eppendort,Hamburg Germany))。RNA還可以透過下列方法引入細胞中：使用陽離子微脂體所介導的脂質轉染、使用聚合物包覆、使用肽所介導的轉染、或使用例如「基因槍(gene guns)」的生物顆粒遞送系統(參見例如Nishikawa,et al.Hum Gene Ther.,12(8)：861-70(2001))。

以生物學方式將目標多核苷酸引入宿主細胞的方法，包括使用DNA和RNA載體。病毒載體，尤其是反轉錄病毒載體，已成為將基因插入哺乳動物例如人類細胞中最廣泛使用的方法。其他病毒載體可以衍生自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒及腺相關病毒等。參見例如，美國專利號5,350,674及5,585,362。

在一些實施例中，係透過表現載體將編碼CAR及/或TCR及/或轉換受體的核酸引入細胞中。本文提供了包含編碼有TCR及/或CAR及/或轉換受體的核酸的表現載體。合適的表現載體包括慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒(adeno associated virus，AAV)載體、腺病毒載體、經改造的雜交病毒、裸DNA(包括但不限於轉位子所介導的載體，例如Sleeping Beauty轉位子、Piggybak轉位子及Integrases轉位子(如Phi31))。其他某些合適的表現載體包括單純皰疹病毒(HSV)和反轉錄病毒表現載體。

腺病毒表現載體係基於腺病毒，而腺病毒嵌入到基因體DNA中的能力不好，但轉染宿主細胞的效率高。腺病毒表現載體含有足夠的腺病毒序列，其足以：(a)支持表現載體的包裝，及(b)最終在宿主細胞中表現CAR及/或TCR及/或轉換受體。在一些實施例中，腺病毒基因體是36kb的線性雙股DNA。其中，為了製備本發明的表現載體，可以插入外源DNA序列(例如，編碼TCR及/或CAR及/或轉換受體的核酸)以取代大片段的腺病毒DNA(參見例如，Danthinne and Imperiale,Gene Therapy(2000)7(20)：1707-1714)。

另一種表現載體是基於腺相關病毒的，其係利用腺病毒偶合系統。該AAV表現載體嵌入到宿主基因體中的頻率很高。它可以感染非分裂中的細胞，進而使其可將基因遞送到哺乳動物細胞中，例如，在組織培養物中或體內。AAV載體能夠感染相當多種的宿主。關於AAV載體的產生和使用的細節，係描述於美國專利號5,139,941及4,797,368中。

反轉錄病毒表現載體能夠嵌入到宿主基因體中，遞送大量外來遺傳物質，感染許多不同的物種和細胞類型，並被包裝在特殊細胞株中。透過在某些位置將核酸(例如，編碼TCR及/或CAR及/或轉換受體的核酸)插入病毒基因體中，以產生具有複製缺陷的病毒，來構築反轉錄病毒載體。儘管反轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型，但TCR及/或CAR及/或轉換受體的嵌入和穩定表現需要宿主細胞的分裂。

慢病毒載體係衍生自慢病毒。慢病毒是複雜的反轉錄病毒，除了常見的反轉錄病毒基因gag、pol和env之外，其還含有具有調節或結構功能的其他基因(參見例如，美國專利號6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)。透過將HIV毒力基因進行多次減毒以產生慢病毒載體，例如，讓env、vif、vpr、vpu和nef等基因產生缺失，而使載體具備生物安全性。慢病毒載體能夠感染非分裂中的細胞，並且可以用於體內和離體的基因轉移和表現，例如編碼TCR及/或CAR及/或轉換受體的核酸(參見例如美國專利號5,994,136)。

可以透過本領域技術人員已知的任何方法將包括本發明內容的核酸的表現載體引入宿主細胞中。如果需要，表現載體可包括用於轉染的病毒序列。或者，可以透過融合、電穿孔、基因槍法、轉染、脂質轉染或其類似方式等引入表現載體。宿主細胞可以在引入表現載體之前，係在培養基中生長和擴增，接著進行適當的處理以引入和嵌入載體。然後可以將宿主細胞擴增，並可以藉助載體中存有的標記來進行篩選。可以使用本領域已知的各種標記，並且可以包括hprt、新黴素抗藥性、胸苷激酶、潮黴素抗藥性等。如本文所使用的，術語「細胞」、「細胞株」和「細胞培養物」可以是可以交替使用的。在一些實施例中，宿主細胞是免疫細胞或其前驅細胞，例如T細胞、NK細胞或NKT細胞。

本發明還提供了基因改造細胞，其包括並穩定表現有本發明的TCR及/或CAR及/或轉換受體。在一些實施例中，基因改造細胞是基因改造T-淋巴細胞(T細胞)、初級T細胞(naive T cells，TN)，記憶T細胞(例如，中樞記憶T細胞(TCM)、作用記憶細胞(effector memory cell，TEM))、自然殺手細胞(NK細胞)和能夠產生治療相關子代的巨噬細胞。在一實施例中，基因改造細胞是自體細胞。

將具有本發明內容的核酸的表現載體穩定的轉染至宿主細胞，可以用來產生經修飾的細胞(例如，包含TCR及/或CAR及/或轉換受體)。其他產生本發明經修飾細胞的方法，包括但不限於化學轉化方法(例如，使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物(dendrimer)、微脂體及/或陽離子聚合物)、非化學轉化方法(例如，電穿孔、光學轉化、基因電轉移及/或流體動力學遞送)，及/或基於顆粒的方法(例如，使用基因槍及/或磁性轉染進行的基因交付(impalefection))。表現本發明的TCR及/或CAR及/或轉換受體的轉染細胞可以離體方式進行擴增。

以物理方式將表現載體引入宿主細胞的方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、基因槍法(particle bombardment)、顯微注射、電穿孔或其類似方法等。產生包括載體及/或外源核酸的細胞的方法是本領域習知的。參見例如，Sambrook et al.(2001),Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。以化學方式將表現載體引入宿主細胞的方法包括膠體分散系統(例如巨分子複合體、奈米膠囊、微球體、珠子)和基於脂質的系統(包括水包油的乳劑、微胞(micelles)、混合微胞和微脂體)。

以化學方式將多核苷酸引入宿主細胞的方法包括膠體分散系統(例如巨分子複合體、奈米膠囊、微球體、珠子)和基於脂質的系統(包括水包油的乳劑、微胞、混合微胞和微脂體)。作為體外和體內用遞送載體的膠體系統，其中一種可以是脂質體(例如，人造膜囊泡)。

適合使用的脂質可以由市面上購得。例如，二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(dimyristyl phosphatidylcholine，「DMPC」)可購自Sigma，St.Louis，MO、雙二十六烷基磷酸(dicetyl phosphate，「DCP」)可購自K&K實驗室 (Plainview，NY)、膽固醇(cholesterol，「Choi」)可購自Calbiochem-Behring、二肉荳蔻醯磷脂醯甘油酯(dimyristyl phosphatidylglycerol，「DMPG」)和其他脂質可購自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham，AL)。脂質在氯仿或氯仿/甲醇中的儲備原液，可以儲存在約-20℃。因為氯仿比甲醇更容易蒸發，因此被用作唯一的溶劑。「微脂體」是通用術語，其係指因雙層脂質進行封閉生成或聚集而產生的各種單層及多層脂質載體。微脂體之特徵為具有囊泡結構，其具有雙層磷脂膜，而內部為水性介質。多層微脂體具有多個脂質層，其係藉由水性介質所分隔。當磷脂懸浮在過量的水溶液中時，它們會自動的形成。在形成封閉結構之前，脂質組分會進行自體重排，並在雙層脂質之間截留水和溶於水中的溶質(Ghosh et al.,1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，本實施例還包括在溶液中具有與正常囊泡結構不同結構的組合物。例如，脂質可呈現微胞結構(micellar structure)或僅以脂質分子之不均勻聚集體的形式存在。本實施例還包括脂質轉染試劑-核酸複合體(lipofectamine-nucleic acid complexes)。

無論是將外源核酸引入宿主細胞中的方法、或是以其他使細胞暴露於本發明抑制劑的方法，為了要證實核酸在宿主細胞中之存在，可以進行多種檢測。前述檢測包括，例如，本領域技術人員所習知的「分子生物學」檢測(例如南方墨點法和北方Northern墨點法、RT-PCR和PCR)、例如檢測特定肽的存在或不存在的「生物化學」檢測(例如透過免疫學方法(ELISA和蛋白質墨點法))，或透過本文所述的測定法鑑定落入本發明範圍內的試劑。

此外，核酸的引入可以藉由任何方式進行，其例如是轉導擴增的宿主細胞、轉染擴增的宿主細胞、和電穿孔擴增的宿主細胞。可以透過一種方法引入一種核酸，並且可以透過另一種不同的方法將另一種核酸引入宿主細胞中。

RNA

在一實施例中，引入宿主細胞的核酸是RNA。在另一實施例中，RNA是mRNA，其包含體外轉錄RNA或人工合成RNA。RNA係利用聚合酶連鎖反應(PCR)所產生的模板透過體外轉錄方式所產生。任何來源的目標DNA可以藉由PCR直接轉化成模板，並利用適合的引子和RNA聚合酶來進行體外mRNA合成。DNA的來源可以是，例如，基因體DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它合適的DNA來源。用於體外轉錄的所需模板是嵌合膜蛋白。舉例來說，模板可編碼有抗體、抗體片段或抗體的一部分。作為另一個實例，模板包含有細胞外結構域和共刺激分子的細胞內結構域，該細胞外結構域包含一抗體(例如抗CD3抗體)的單鏈可變結構域。在一實施例中，RNA嵌合膜蛋白的模板可編碼有嵌合膜蛋白，前述嵌合膜蛋白包含細胞外結構域和細胞內結構域，前述細胞外結構域包含衍生自針抗共刺激分子抗體的抗原結合結構域，前述細胞內結構域衍生自CD28和4-1BB細胞內結構域的一部分。

使用PCR產生mRNA體外轉錄用的模板，然後將其引入細胞。進行PCR的方法是本領域習知的。用於PCR的引子係經設計而具有與可作為PCR模板的DNA區域實質上互補的區域。如本文所使用的，「實質上互補的」是指係指引子序列中之大部分或全部鹼基為互補，或一或多個鹼基為不互補或錯誤配對的。實質上互補的序列能夠在PCR的退火條件下與預期的DNA目標發生黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板的任何部分實質上互補。例如，可以設計引子以擴增一基因在細胞中通常會發生轉錄的部分(開放閱讀框)，其包括5'和3'UTR。引子還可以經設計以擴增一基因的一部分，其係編碼有特定目標結構域。在一實施例中，引子係經設計以擴增人類cDNA的編碼區，包括全部或部分的5'和3'UTR。適用於PCR的引子，可透過本領域習知的合成方法來產生。「正向引子」是指含有一核苷酸片段的引子，前述核苷酸片段與待擴增DNA序列上游的DNA模板核苷酸實質上互補。「上游」在本文中用於指相對於編碼股中待擴增DNA序列的5'位置。「反向引子」是指含有一核苷酸片段的引子，前述核苷酸片段與待擴增DNA序列下游的雙股DNA模板基本上互補。「下游」在本文中用於指相對於編碼股中待擴增DNA序列的3'位置。

本文也可以利用能夠促進RNA穩定性及/或轉譯效率的化學結構。RNA優選地具有5'和3'UTR。在一實施例中，5'UTR的長度為0至3000個核苷酸。待添加到編碼區的5'和3'UTR序列的長度可以不同方法來改變，包括但不限於設計會黏接至UTR不同區域的PCR引子。使用前述方法，本發明所屬技術領域具有通常知識者可以修飾所需的5'和3'UTR的長度，用以使所轉錄出的RNA於轉染後有最佳的轉譯效率。

5'和3'UTR部分可以是目標基因天然存在的內源性5'和3'端的UTR。或者，可以透過在正向和反向引子中併入UTR序列，或透過其他任何對模板的修飾，來添加對目標基因而言不是內源性的UTR序列。使用對目標基因而言不是內源的UTR序列，有助於修飾RNA的穩定性及/或轉譯效率。例如，目前已知3'UTR序列中的AU富含單元(AU-rich elements)會降低mRNA的穩定性。因此，基於本領域熟知的UTR特性來選擇或設計3'UTR，可以增加所轉錄出的RNA穩定性。

在一實施例中，5'UTR可含有內源基因的克紮克(Kozak)序列。或者，當如上所述係透過PCR添加對目標基因而言不是內源性的5'UTR時，可以透過添加5'UTR序列來重新設計共有Kozak序列。Kozak序列可以提高某些RNA轉錄物的轉譯效率，但似乎並非所有的RNA都需要此種序列來進行有效率的轉譯。本領域中已知有許多mRNA需要Kozak序列。在其他實施例中，5'UTR可以衍生自RNA病毒，其RNA基因體在細胞中是穩定的。在其他實施例中，各種核苷酸類似物可用於3'或5'UTR中以阻止mRNA的核酸外切酶降解。

為了能夠在無需基因轉殖也能夠從DNA模板進行RNA合成，轉錄啟動子應連接到待轉錄序列上游的DNA模板上。當充當RNA聚合酶啟動子的序列被添加到正向引子的5'末端時，RNA聚合酶啟動子在PCR產物中會被併入待轉錄的開放閱讀框的上游。在一實施例中，啟動子是T7聚合酶啟動子，如本文其他部分所述。其他有用的啟動子包括但不限於T3和SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3和SP6啟動子的共有核苷酸序列是本領域已知的。

在一實施例中，mRNA在5'末端具有封帽並在3'端具有Poly(A)尾部，其確定細胞中核醣體結合，轉譯起始和mRNA的穩定性。在環狀DNA模板上，例如質體DNA，RNA聚合酶會產生長多聯體(concatemeric)產物，其不適於在真核細胞中表現。質體DNA的轉錄物，其於3' UTR末端線性化後會產生正常尺寸之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化，轉染至真核細胞後亦不會發生作用。

在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可將轉錄物的3'末端延伸超出模板的最後一個鹼基(Schenborn and Mierendorf,Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)、Nacheva and Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003))。

將聚腺苷酸/胸腺苷酸(polyA/T)延伸部嵌入到DNA模板中的常規方法是分子轉殖。然而，嵌入到質體DNA中的polyA/T序列可能導致質體不穩定，這就是造成從細菌所獲得的質體DNA模板經常混摻有缺失和其他畸變(aberration)的原因。這種情況不僅會讓轉殖程序費力且耗時，且穩定度通常不高。因此現仍亟需一種方法，可以在不進行轉殖的情況下構築出帶有polyA/T 3'端延伸部的DNA模板。

在PCR期間使用含有聚胸腺苷酸尾(例如，100個胸腺苷酸所聚合而成，尺寸可為50至5000個胸腺苷酸)之反向引子，或在PCR之後藉由其他任何方法-包括但不限於DNA接合或體外重組，可以在轉錄用DNA模板上生成polyA/T區段。聚腺苷酸尾也讓RNA穩定且減少其降解。一般而言，聚腺苷酸尾的長度與經轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施例中，聚腺苷酸尾為100至5000個腺苷。

在使用Poly(A)聚合酶(例如大腸桿菌polyA聚合酶，E-PAP)進行體外轉錄後，可以進一步延長RNA的聚腺苷酸尾部。在一實施例中，將聚腺苷酸尾部的長度從100個核苷酸增加至300至400個核苷酸，可導致RNA的轉譯效率增加約2倍。另外，不同化學基團與3'末端的連接可以增加mRNA穩定性。這種連接可含有修飾的/人工的核苷酸、適配體和其他化合物。例如，可以使用聚腺苷酸聚合酶將ATP類似物併入聚腺苷酸尾部。ATP類似物可以進一步增加RNA的穩定性。

5'端帽也為RNA分子提供穩定性。在優選的實施例中，本文公開的方法所產生的RNA包括5'端帽。提供5'端帽的方法是本領域已知的，且描述於下列文獻中：Cougot,et al.,Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)、Stepinski,et al.,RNA,7：1468-95(2001)、Elango,et al.,Biochim. Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005)。

透過本文公開的方法產生的RNA還可以含有內部核醣體進入位點(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色體或人工設計的序列，其會引發核糖體不依賴端帽(cap-independent)的方式結合mRNA，並促進轉譯的起始。本文可以包括任何適用於細胞電穿孔的溶質，其可以包含促進細胞滲透性和活性的因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑和介面活性劑。

在一實施例中，將RNA電穿孔到細胞中，例如體外轉錄的RNA。

本文所公開的方法可應用於基礎研究和治療領域中關於宿主細胞活性的調節，用於癌症、幹細胞，急性和慢性感染以及自體免疫疾病，包括分析經遺傳修飾的宿主細胞殺死目標癌細胞的能力。

該方法還提供了大範圍地控制表現量的能力，其係透過改變例如啟動子或輸入RNA的量，裨能單獨調節表現量。此外，基於PCR的mRNA產生技術，對於設計出具有不同結構和其結構域組合之mRNA，有很大的幫助。

本發明RNA轉染方法其中一個優點是，RNA轉染基本上是暫時性的且無需載體。RNA轉基因可以被遞送至淋巴細胞，並在簡短的體外細胞活化後於其中表現，其係作為最小表現卡匣而不需要任何額外的病毒序列。在這些條件下，轉基因不會嵌入到宿主細胞基因體中。由於RNA的轉染效率及其一致性地修飾整個淋巴細胞群的能力，故無須進行細胞轉殖。

用體外轉錄的RNA(in vitro-transcribed RNA，IVT-RNA)對宿主細胞來進行基因修飾，係利用兩種不同的策略，這兩種策略都已經在各種動物模型中測試過。透過脂質轉染或電穿孔用體外轉錄的RNA轉染細胞。理想的是能夠使用各種修飾來穩定IVT-RNA，以使轉移的IVT-RNA的表現能夠延長。

在文獻中已知有某些IVT載體，其以標準化方式用作體外轉錄的模板，並且以產生穩定RNA轉錄物的方式進行基因修飾。目前，本領域所使用的方法是基於具有以下結構的質體載體：能使RNA進行轉錄的5'RNA聚合酶啟動子，接著是目標基因(其3'及/或5端為'非轉譯區(UTR))、以及，含有50至70個腺核苷酸的3'端多腺苷酸卡匣。在體外轉錄之前，透過II型限制酶將環狀質體在多腺苷酸卡匣的下游進行線性化(辨識序列對應於切割位點)。因此，多腺苷酸卡匣對應於轉錄物中後面的聚腺苷酸序列。該程序的結果，一些核苷酸在線性化後保留為酶切位點的一部分，並在3'末端延伸或掩蔽聚腺苷酸序列。目前尚不清楚這種非生理性突出物是否會影響這種構築體在細胞內所產生的蛋白量。

與傳統的質體或病毒方法相比，RNA具有幾個優點。由RNA開始的基因表現不需要轉錄，並且在轉染後會快速產生蛋白質產物。此外，RNA僅需進入細胞質，而無需進入細胞核，因此典型的轉染方法能就會產生極高的轉染率。另外，在基於質體的方法中，在研究時，其驅動目標基因表現的啟動子，在細胞中需具有活性。

在另一實施例中，透過電穿孔將RNA構築體遞送到細胞中。參見例如，US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所教示的將核酸構築體電穿孔到哺乳動物細胞中的製劑和方法。前述方式的各種參數，包括任何已知細胞類型所需的電穿孔電場強度，基本上已揭露於相關研究文獻以及本領域許多專利和申請案中。參見例如美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264及美國專利號7,173,116。應用於治療的電穿孔裝置可以在市面上買到，例如MedPulser^TM DNA電穿孔處理系統(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif.)，並且描述於下列專利中，例如美國專利號4,522,517、6,567,694、6,516,223、5,993,434、6,181,964、6,241,701及6,233,482。電穿孔也可用於體外轉染細胞，例如在US 20070128708A1中所述的。電穿孔也可用於在體外將核酸遞送到細胞中。因此，利用本領域技術人員已知的各種可用裝置和電穿孔系統中的任何一種，透過電穿孔所介導的將核酸(包括表現構築體)施用於細胞，提供了一種將目標RNA遞送至目標細胞的新方法。

治療方法

本文所述的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如，經修飾的T細胞)可包含在用於治療的組合物中。該組合物可包括醫藥組合物，並且還包括醫藥上可接受的載體。包括有經修飾免疫細胞的醫藥組合物，可以一治療有效量的方式進行投予。

在一實施例中，本發明包括用於過繼細胞轉移療法的方法，其包括向有需要的受試者施用本發明經修飾的免疫細胞。在另一實施例中，本發明包括治療受試者疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用經修飾的免疫細胞群。

本發明還包括治療受試者疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用經基因修飾的同種異體免疫細胞(例如，T細胞)。該細胞包含編碼轉基因TCR及/或CAR及/或包含轉換受體的外源核酸，並包含四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統。Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化(rtTA)融合蛋白及至少一個啟動子，而該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。當向細胞施用去氧羥四環素(Dox)時，該基因表現系統會被誘導並表現出TCR及/或CAR及/或轉換受體。

本發明另外包括治療受試者疾病或病症的方法，包括向有需要的受試者施用經基因修飾的自體免疫細胞(例如，T細胞)，該細胞包含編碼轉基因TCR及/或CAR及/或包含轉換受體的外源核酸，並包含四環素(Tet)-On誘導型基因表現系統。Tet-On誘導型基因表現系統包含反向Tet反式活化(rtTA)融合蛋白及至少一個啟動子，而該啟動子與至少一個Tet-操作子序列的下游融合。當向細胞施用去氧羥四環素(Dox)時，基因表現系統被誘導並表現TCR及/或CAR及/或轉換受體。

本發明提供了一種治療癌症的方法。在一些實施例中，該方法包括向有需要的受試者施用經修飾的免疫細胞(例如，T細胞)，該細胞包含如本文其他部分所述的誘導型TCR或CAR表現系統。

在一實施例中，在有需要的受試者中治療癌症的方法包括向受試者施用包含經修飾的免疫細胞的組合，前述免疫細胞包含誘導型TCR或CAR表現系統和去氧羥四環素。在一些實施例中，將經修飾的免疫細胞(例如，T細胞)係與去氧羥四環素共同施用。

在一些實施例中，在施用於受試者之前，經修飾的免疫細胞 (例如，T細胞)係與去氧羥四環素接觸。在前述實施方案中，在施用於受試者之前，係「預先誘導」經修飾的細胞。在一些實施例中，在施用被預誘導過的經修飾細胞後，再向患者連續施用去氧羥四環素，使TCR或CAR連續表現。在這種情況下，可能發生免疫細胞(例如T細胞)耗竭。在一些實施例中，預誘導的經修飾細胞(例如，T細胞)在患者體內會表現TCR或CAR一段時間，並且由於不連續施用去氧羥四環素，TCR或CAR的表現將減少及/或停止。在一些實施例中，隨後向患者施用去氧羥四環素將重新誘導TCR或CAR的表現。在隨後施用去氧羥四環素以重新誘導TCR或CAR表現的情況下，去氧羥四環素可以透過正常過程被患者代謝掉。一旦去氧羥四環素被完全代謝，TCR或CAR的表現會減少及/或停止。

前述過程可以重複多次以「再治療」受試者，而不必重新施用經修飾的免疫細胞。例如，在具有復發的癌症的受試者中(例如，癌症在以經修飾細胞進行初次治療後存活)，再施用去氧羥四環素可以靶向復發的癌症。

本發明還提供了治療有需要的受試者的癌症的方法，其包括施用TCR重定向的T細胞和去氧羥四環素的組合，前述T細胞包含誘導型TCR表現系統。因此，在一實施例中，在有需要的受試者中治療癌症的方法包括向受試者施用包含通用型T細胞受體(TCR)重定向的T細胞和去氧羥四環素的組合。其中，T細胞在一或多個基因座中包含有插入及/或缺失，而每個基因座都編碼有內源蛋白。前述內源蛋白係選自TRAC、TRBC、B2M及CIITA所組成的群組，其中插入及/或缺失能夠下調內源蛋白的表現。而誘導型TCR表現系統包含：第一核酸以及第二核酸。第一核酸包含人類磷酸甘油酯激酶1，其可操作地連接至編碼有Tet-On 3G反式活化蛋白的核酸序列的上游。而前述第二核酸包含可誘導的TRE3GS啟動子，其可操作地連接至編碼有外源TCR的核酸序列的上游。前述第二核酸與第一核酸反向，而去氧羥四環素會誘導外源TCR的表現。

在另一實施例中，治療有需要的受試者的癌症的方法包括向受試者施用包含通用型T細胞受體(TCR)重定向的T細胞和去氧羥四環素的組合。前述T細胞包含在一個或更多基因座的插入及/或缺失、轉換受體，及誘導型TCR表現系統。前述每個基因座編碼有一內源蛋白，前述內源蛋白係選自TRAC、TRBC、B2M及CIITA所組成的群組，而前述插入及/或缺失能夠下調內源蛋白的表現。前述誘導型TCR表現系統包含：第一核酸以及第二核酸。第一核酸包含人類磷酸甘油酯激酶1，其可操作地連接至編碼有Tet-On 3G反式活化蛋白的核酸序列的上游，而前述第二核酸包含可誘導的TRE3GS啟動子，其可操作地連接至編碼有外源TCR的核酸序列的上游。前述第二核酸與第一核酸反向，而該去氧羥四環素會誘導外源TCR的表現。

本發明還提供了在有需要的受試者中預防T細胞耗竭的方法，包括向受試者施用包含通用型T細胞受體(TCR)重定向的T細胞和去氧羥四環素的組合。該T細胞包含在一個或更多基因座的插入及/或缺失、轉換受體，及誘導型TCR表現系統。前述每個基因座各自編碼有一內源蛋白，前述內源蛋白係選自TRAC、TRBC、B2M及CIITA所組成的群組，而前述插入及/或缺失能夠下調內源蛋白的表現。前述誘導型TCR表現系統包含：第一核酸以及第二核酸。前述第一核酸包含人類磷酸甘油酯激酶1，其可操作地連接至編碼有Tet-On 3G反式活化蛋白的核酸序列的上游，而前述第二核酸包含可誘導的TRE3GS啟動子，其可操作地連接至編碼有外源TCR的核酸序列的上游。前述第二核酸與第一核酸反向，而該去氧羥四環素會誘導外源TCR的表現。

如本文所述的，去氧羥四環素可用於預誘導通用型TCR定向的T細胞。如本文所述的，去氧羥四環素可用於再次誘導通用型TCR定向的T細胞。

如本文所述所產生的經修飾的T細胞具有T細胞功能。此外，可以將經修飾的T細胞施用於哺乳動物(優選是人類)以抑制免疫反應，例如自體免疫疾病中所常見的，前述自體免疫疾病例如糖尿病、乾癬、類風濕性關節炎、多發性硬化症、GVHD，增強同種異體移植耐受誘導、移植排斥等。此外，本發明的細胞可用於治療任何需要減少或以其他方式來抑制免疫反應的病症，尤其是由細胞所介導的免疫反應來治療或減輕疾病。在一實施例中，本發明包括治療受試者的病症(例如是自體免疫疾病)，其包括以一治療有效劑量向受試者施用一醫藥組合物，其係包含經修飾的T細胞群。

自體免疫疾病的實例包括但不限於，後天性免疫缺陷症候群(AIDS，其是具有自體免疫組分的病毒性疾病)、斑禿(alopecia areata)、關節黏連性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、抗磷脂質症候群(antiphospholipid syndrome)，自體免疫性愛迪生氏病、自身免疫性溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫性內耳疾病(autoimmune inner ear disease，AIED)、自體免疫性淋巴球增生症候群(autoimmune lymphoproliferative syndrome，ALPS)、自體免疫性血小板減少性紫癜症(autoimmune thrombocytopenic purpura，ATP)、貝西氏病(Behcet's disease)、心肌病、乳糜口瘡泡疹樣皮炎(celiac sprue-dermatitis hepetiformis)、皰疹病毒、慢性疲勞免疫功能障礙症候群(chronic fatigue immune dysfunction syndrome，CFIDS)、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病變(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy，CIPD)、瘢痕性天疱瘡(cicatricial pemphigold)、冷凝集素疾病(cold agglutinin disease)、塉症候群(crest syndrome)、克隆氏病(Crohn's disease)、惡性萎縮性丘疹病(Degos' disease)、青少年皮肌炎(dermatomyositis-juvenile)、圓盤紅斑(discoid lupus)、原發性冷凝球蛋白症(essential mixed cryoglobulinemia)，纖維肌痛-纖維肌炎(fibromyalgia-fibromyositis)、格雷氏病(Graves' disease)、格巴二氏症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)、特發性血小板減少性紫癜症(idiopathic thrombocytopenia purpura，ITP)、IgA腎病、胰島素依賴型糖尿病、幼年型慢性關節炎(Still's病)、幼年型類風濕性關節炎、梅尼爾氏症(Meniere's disease)、混合型結締組織疾病、多發性硬化症、重症肌無力、惡性貧血、結節性多動脈炎、多發性軟骨炎、多腺性症候群、風濕性多肌痛、多發性肌炎和皮肌炎、原發性無γ球蛋白血症、原發性膽道性肝硬化、乾癬、牛皮癬性關節炎、雷諾氏現象、雷德氏症候群、風濕熱、類風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮症(進行性系統性硬皮症(progressive systemic sclerosis，PSS)，也被稱為系統性硬化症(SS))、乾燥症候群(Sjogren's syndrome)、僵體症候群(stiff-man syndrome)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、高安氏動脈炎(Takayasu arteritis)、顳動脈炎/巨細胞血管炎、潰瘍性大腸炎、眼色素層炎、白斑病和華格納氏肉芽病。

如本文所述產生的經修飾的T細胞也可以加以擴增並用於治療發炎性疾病。發炎性疾病的實例包括但不限於慢性和急性發炎性疾病。發炎性疾病的實例包括阿茲海默症、氣喘、異位性皮膚炎、過敏，動脈粥狀硬化、支氣管性氣喘、濕疹、腎絲球腎炎、移植物抗宿主病、溶血性貧血，骨關節炎、敗血症、中風，組織和器官移植、血管炎、糖尿病性視網膜病變和呼吸器引起的肺損傷。

在另一實施例中，本文所述的T細胞可用來製備藥物，而該藥物係用於治療有需要的受試者的免疫反應。在另一實施例中，本發明包括本文所述的經修飾細胞，其係用於治療有需要的受試者的免疫反應的方法。

本發明的細胞可以施用於動物以治療癌症，該動物優選地是哺乳動物，更優選地是人類。此外，本發明的細胞可用於治療任何與癌症有關的病症，尤其是細胞介導而針對腫瘤細胞的免疫反應，其係被寄望治療或減輕該疾病。癌症的實例包括但不限於乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰腺癌、大腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、甲狀腺癌等。本發明的組合物和方法可用於治療任何類型的腫瘤，包括但不限於實體腫瘤或非實體腫瘤。

在某些實施例中，向受試者提供二級治療。二級治療包括但不限於化療、放射、手術和藥物治療。

本發明的細胞可以以適當的臨床前和臨床實驗和試驗中所決定的劑量、途徑和時間來施用。細胞組合物可以在這些劑量範圍內進行多次給藥。如本領域技術人員所決定的，本發明細胞的施用可以與其他治療所需疾病或病症的方法組合。

對於接受治療的受試者，待施用的本發明細胞可以是自體的、同種異體的或異種的。

本發明細胞的施用可以以任何本領域技術人員已知的方便方式來進行。其可以透過噴霧式吸入(aerosol inhalation)、注射、攝食、輸血、植入或移植等方法將本發明的細胞施用於受試者。本文所述的組合物可透過靜脈內(i.v.)注射、腹腔內、經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌肉內的方式給予患者。在其他情況下，係將本發明的細胞直接注射到受試者的發炎部位、受試者的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。

本文所述的細胞還可以使用任何數量的基質來施用。本發明係利用前述基質來充當人工淋巴器官的新環境，以支持、維持或調節免疫系統，其通常係透過對T細胞的調節來進行。因此，本發明可以利用已經實在組織工程中有用的基質組合物和製劑。因此，可用於本發明的組合物、裝置和方法的基質其類型實際上是無限的，並且可包括生物基質和人工合成基質。在一特定的實例中，其如美國專利號5,980,889、5,913,998、5,902,745、5,843,069、5,787,900或5,626,561中所述的組合物和裝置，係皆通過引用而將其整體併入本文。基質具有施用於哺乳動物宿主時為生物相容性的相關特性。基質可以由天然及/或合成材料所形成。如果要在動物體內留下永久性結構或可移除結構的情況下，例如植入物，基質可以是非生物降解的。基質也可以是可生物降解的。基質可以採用海綿、植入物、管、不黏墊(telfa pad)、纖維、中空纖維、凍乾組分、凝膠、粉末、多孔組合物或奈米顆粒的形式。此外，基質可以經過設計以持續釋放其中的細胞、或所產生的細胞激素或其他活性劑。在某些實施例中，本發明的基質是可撓的和具有彈性的，並且可以描述為半固體支架，且對例如無機鹽、含水流體和溶解的氣態劑(包括氧氣)等物質來說是可通透的。

本文使用基質作為生物相容性物質的實例。然而，本發明不限於基質，因此，無論術語單個基質(matrix)或多個基質(matrices)出現在哪裡，這些術語應該被理解為包括允許細胞保留或細胞通過(traversal)的裝置和其他物質，且前述裝置和其他物質是生物相容的，並且能夠使大分子直接通過本身是半透膜的物質，或因與特定的半透性物質結合使用而能使大分子通過。

免疫細胞的來源

在擴增之前，免疫細胞的來源是從受試者獲得，將其用於離體操作。用於離體操作的目標細胞的來源還可以包括例如自體的或異體捐贈者的血液、臍帶血或骨髓。例如，免疫細胞的來源可以來自待用本發明的經修飾免疫細胞治療的受試者，例如是受試者的血液，受試者的臍帶血或受試者的骨髓。受試者的非限制性實例包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。優選地，受試者是人類。

免疫細胞可以從許多來源獲得，包括血液、周邊血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾組織、臍帶、淋巴或淋巴器官。免疫細胞是免疫系統的細胞，例如先天性或適應性的免疫細胞，例如骨髓類(myeloid)或淋巴類(lymphoid)細胞(包括淋巴細胞，通常是T細胞及/或NK細胞)。其他示例性細胞包括幹細胞，例如全能性幹細胞和多功能幹細胞，多功能幹細胞包括誘導性多功能幹細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。在一些實施例中，細胞是人類細胞。關於待治療的受試者，細胞可以是同種異體的及/或自體的。細胞通常是初代細胞，例如直接從受試者分離及/或從受試者分離並冷凍的細胞。

在某些實施例中，免疫細胞是T細胞，例如CD8+ T細胞(例如，CD8+初級T細胞、中樞記憶T細胞或作用性記憶T細胞)、CD4+ T細胞、自然殺手T細胞(NKT細胞)、調節性T細胞(Treg)、幹細胞記憶T細胞、淋巴前驅細胞、造血幹細胞、自然殺手細胞(NK細胞)或樹突細胞。在一些實施例中，細胞是單核球或顆粒性白血球，例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性白血球及/或嗜鹼性白血球。在一實施例中，目標細胞是誘導性多功能幹細胞(iPS)或源自iPS細胞的細胞，例如，從受試者產生的iPS細胞，被操縱以改變(例如，誘導突變)或操縱以表現一或多個目標基因的分子，並分化成例如T細胞、例如CD8+ T細胞(例如，CD8+初級T細胞、中樞記憶T細胞或作用性記憶T細胞)、CD4+ T細胞、幹細胞記憶T細胞、淋巴前驅細胞或造血幹細胞。

在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型的一個或多個亞組，例如整個T細胞群、CD4+細胞、CD8+細胞及其亞群，其亞群可例如由功能、活化狀態、成熟度、分化的潛力、擴增、再循環、定位及/或持久性能力、抗原專一性、抗原受體類型、在特定器官或腔室中的存在、標記或細胞激素分泌圖譜、及/或分化程度所定義。在T細胞及/或CD4+及/或CD8+ T細胞的亞型和亞群中，有初級T(TN)細胞、作用性T細胞(TEFF)、記憶T細胞及其亞型，其例如為幹細胞記憶T(stem cell memory T，TSCM)細胞、中樞記憶T(TCM)細胞、作用性記憶T(TEM)細胞或終極分化作用性記憶T細胞(terminally differentiated effector memory T cell)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助型T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T(mucosa-associated invariant T，MAIT)細胞，天然存在和適應性調節T(Treg)細胞、輔助型T細胞，如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助型細胞T細胞、α/β T細胞和δ/γ T細胞。在某些實施例中，可以使用本領域可獲得的任何數量的T細胞株。

在一些實施例中，所述方法包括從受試者中分離免疫細胞、製備、加工、培養及/或改造前述細胞。在一些實施例中，改造細胞的製備包括一個或多個培養及/或製備步驟。如上所述的改造細胞可以從樣品中分離，例如生物樣品，例如從受試者獲得、或來自受試者的樣品。在一些實施例中，分離細胞的受試者是患有疾病或病症、或需要細胞療法、或將施用細胞療法的受試者。在一些實施例中，受試者是需要特定治療干預的人類，例如過繼細胞療法，其中細胞被分離，加工及/或改造。因此，在一些實施例中，細胞是初代細胞，例如初代人類細胞。樣品包括直接取自受試者的組織、液體和其他樣品，以及來自一個或多個處理步驟的樣品，處理步驟可例如是分離、離心、基因改造(例如用病毒載體轉導)、清洗及/或孵育。生物樣品可以是直接從生物來源或經過處理的樣品所獲得的樣品。生物樣品包括但不限於體液，例如血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑液、尿液和汗、組織和器官樣品，也包括由其衍生的加工樣品。

在一些實施例中，衍生出或分離出細胞的樣品是血液或血液衍生樣品，或為或來源於血球分離術或白血球分離術的產物。示例性樣品包括全血、周邊血單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺，組織活檢、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾、其他淋巴組織、肝、肺、胃、小腸、大腸、腎、胰臟、乳房、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃腺或其他器官、及/或由其衍生的細胞。在細胞療法的情況下，樣品包括例如過繼細胞療法，來自自體和同種異體來源的樣品。

在一些實施例中，細胞衍生自細胞株，例如T細胞株。在一些實施例中，細胞獲取自異種來源，例如，來自小鼠、大鼠、非人靈長類動物及豬。在一些實施例中，細胞的分離包括一種或多種製備及/或基於細胞的非親和力分離步驟。舉例來說，在一些實例中，細胞係在一種或多種試劑的存在下進行清洗、離心及/或孵育，以除去不需要的組分、當集所需組分、裂解，或除去對特定試劑敏感的細胞。在一些實例中，基於一或多種性質來分離細胞，例如密度、黏附性質、尺寸、靈敏度及/或對特定組分的抗性。

在一些實例中，來自受試者循環血液的細胞係例如透過血球分離或白血球分離而獲得。在一些實施例中，樣品含有淋巴細胞(其包括T細胞、單核細胞、顆粒性白血球、B細胞，其他有核的白血球)、紅血球及/或血小板，並且在一些實施例中，包含除了紅血球和血小板之外的細胞。在一些實施例中，從受試者所收集到的血球細胞被清洗，以例如除去血漿部分，並將細胞置於合適的緩衝液或培養液中用於後續處理步驟。在一些實施例中，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)清洗細胞。在一些實施例中，根據製造商的說明透過切向流過濾(tangential flow filtration，TFF)完成清洗步驟。在一些實施例中，在清洗後將細胞重新懸浮於各種生物相容性緩衝液中。在某些實施例中，去除血球細胞樣品的組分並將細胞直接重新懸浮於培養液中。在一些實施例中，所述方法包括基於密度的細胞分離方法，例如，裂解紅血球並透過Percoll或Ficoll梯度進行離心而從周邊血製備白血球。

在一些實施例中，分離方法包括基於細胞中一或多種特定分子的表現或存在，來分離不同細胞類型。前述特定分子可例如表面蛋白、細胞內標記物或核酸等表面標記物。在一些實施例中，可以使用任何已知基於這些標記的分離方法。在一些實施例中，分離是基於親和力或免疫親和力來分離。例如，在一些實施例中，分離包括根據欲分離的細胞和細胞群其是否表現有一或多種標記物(通常是細胞表面標記物)，或其表現量。舉例來說，其係透過與標記物專一性結合的抗體或結合配偶體一起孵育。接著，通常透過清洗步驟，並將結合至抗體或結合搭配物的細胞與未結合至抗體或結合搭配物的細胞進行分離。

前述分離步驟可以基於正向選擇及/或負向選擇，正向選擇保留了與試劑結合的細胞供進一步的使用，負向選擇保留了未與抗體或結合配偶體結合的細胞。在一些實例中，兩種部分皆被保留以供進一步使用。在一些實施例中，當無法取得能從一混雜群體中專一性識別出單一細胞類型的抗體時，此時負向篩選的方式特別好用。因此，分離所根據的標記物最好是非目標群體細胞所表現的標記物。分離率不需要到達100%，也不需要完全去除特定的細胞群體或表現有特定標記物的細胞。舉例而言，特定類型細胞(例如，該些表現有標記物的細胞)的正向篩選或富集，係指增加這些細胞的數量或百分比，但不表示完全去除不表現該標記的細胞。同樣地，特定類型細胞(例如，該些表現有標記物的細胞)的負向篩選、去除或耗乏，是指減少這些細胞的數量或百分比，但無須完全去除這些細胞。

在一些實例中，進行多次分離步驟，其係將一步驟所得出的正向選擇或負向選擇部分進行另一次的分離步驟，例如隨後的正向或負向選擇。在一些實例中，單次分離步驟可以同時剔除表現多種標記物的細胞，例如透過將細胞與多個抗體或結合配偶體一起孵育，每個抗體或結合配偶體能夠專一性地辨識出負向選擇用的標記物。同樣地，透過將細胞與多種抗體或在各種細胞類型上表現的結合配偶體一起孵育，可以同時對多種細胞類型進行正向選擇。

在一些實施例中，一種或多種T細胞群為富含有或被剔除掉一或多種特定標記物(例如表面標記物)呈陽性(標記物+)或表現高水平(標記物^hlgh)的細胞，或者為富含有或被剔除掉一或多種標記物為陰性(標記物^-)或表現相對低水平(標記物^low)。例如，在一些實施例中，其係透過正向或負向選擇技術來分離出T細胞的特定亞群。舉例來說，其可以是一或多種表面標記物為陽性或高表現量的細胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及/或CD45RO+ T細胞。在某些情況下，此類標記物是在某些T細胞群(例如非記憶細胞)上不存在或其表現量相對較低，但這些標記物存在在某些其他T細胞群(如記憶細胞)中或其表現量相對較高。在一實施例中，細胞(例如CD8+細胞或T細胞，例如CD3+細胞)富含有(即正向選擇出)CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127及/或CD62L為陽性或高表面表現量的細胞，及/或剔除(例如，用負向選擇以去除)CD45RA為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實施例中，細胞富含有或剔除掉CD122、CD95、CD25、CD27及/或IL7-Ra(CD127)為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實例中，CD8+ T細胞富含有CD45RO為陽性(或CD45RA為陰性)和CD62L為陽性的細胞。舉例來說，可以使用CD3/CD28綴合的磁珠(例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)來正向選擇CD3+、CD28+ T細胞。

在一些實施例中，將T細胞與PBMC樣品分離的方式係對不會在T細胞(例如，B細胞、單核球或其他白血球)上表現的標記物(例如，CD14)進行負向選擇。在一些方面，係使用CD4+或CD8+篩選步驟來分離出CD4+輔助細胞與CD8+細胞毒性T細胞。藉由對在一或多個初始、記憶和/或作用T細胞亞群上有表現或表現量較高的標記物進行正向或負向選擇，以將這些CD4+和CD8+群體進一步分選成亞群。在一些實施例中，舉例而言，藉由以基於與相應亞群相關的表面抗原進行正向或負向選擇，CD8+細胞會進一步富含或剔除掉初始、中樞記憶、作用記憶和/或中樞記憶幹細胞。在一些實施例中，會對中樞記憶T(TCM)細胞進行富集，以增加療效，例如改善投與後的長期存活率、擴增程度和/或移植狀況。在某些方面，這些亞群的療效尤其顯著。在一些實施例中，將富含有TCM的CD8+ T細胞和CD4+ T細胞合併起來，會進一步增強療效。

在實施例中，記憶T細胞存在於CD8+周邊血淋巴細胞的CD62L+和CD62L-亞群中。PBMC可以富含有或剔除掉CD62L-CD8+及/或CD62L+CD8+部分，例如使用抗CD8和抗CD62L抗體。在一些實施例中，CD4+ T細胞群和CD8+ T細胞亞群，例如富含中樞記憶(TCM)細胞的亞群。在一些實施例中，中樞記憶T(TCM)細胞的富集是基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及/或CD127的陽性或高表面表現；在某些實施例中，前述富集是基於對表現有或有高度表現的CD45RA及/或顆粒酶B的細胞的負向選擇。在一些實施例中，其係透過剔除表現有CD4、CD14、CD45RA的細胞以及對表現有CD62L的細胞進行正向選擇或富集，來分離出富含有TCM細胞的CD8+群體。在一實施例中，中樞記憶T(TCM)細胞的富集是藉由以下方式進行：選出沒有CD4表現的細胞，將其作為起始物，接著以CD14和CD45RA的表現進行負向選擇，並且以CD62L進行正向選擇。在某些情況下，前述選擇是同時進行的，而在其他情況是依序進行，但其順序不拘。在一些方面，用在製備CD8+細胞群體或亞群過程中針對CD4表現進行選擇的相同步驟也會用在產生CD4+細胞群體或亞群的過程中，致使針對以CD4進行分離後，且視情況在一或多個進一步的正向或負向選擇步驟之後，陽性和陰性部分兩者都會保留下來，且其會用於所述方法的後續步驟中。

透過鑑定具有細胞表面抗原的細胞群，將CD4+ T輔助型細胞分類為初級、中樞記憶和作用性細胞。CD4+淋巴細胞可透過標準方法獲得。在一些實施例中，初級CD4+ T淋巴細胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+ T細胞。在一些實施例中，中樞記憶CD4+細胞是CD62L+和CD45RO+。在一些實施例中，作用性CD4+細胞是CD62L-和CD45RO。在一實例中，為了以負向選擇來富集出CD4+細胞，所用的單株抗體混合物通常會包括抗-CD14、抗-CD20、抗-CD11b、抗-CD16、抗-HLA-DR和抗-CD8的抗體。在一些實施例中，抗體或結合搭配物係結合於固體載體或基質(例如，磁珠或順磁珠)，以便在正向和/或負向選擇中分離細胞。

在一些實施例中，在基因改造前或於基因改造過程中，將細胞進行孵育及/或培養。孵育步驟可包括培養、栽培(cultivation)、刺激、活化及/或繁殖。在一些實施例中，組合物或細胞在刺激條件或刺激劑的存在下進行孵育。前述條件包括經設計以模擬抗原暴露及/或使細胞俾便進行基因改造(例如，引入重組抗原受體)等條件，前述條件係用來誘導群體中細胞的增殖、擴增、活化及/或存活。前述條件可包括一或多種特定介質、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑，例如營養素、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，例如細胞激素、趨化因子、抗原、結合配偶體、融合蛋白、重組可溶性受體及任何其他細胞活化試劑。在一些實施例中，刺激條件或試劑包括一或多種試劑，例如配體，其能夠活化TCR複合體的細胞內訊息傳遞結構域。在一些實施例中，該試劑在T細胞中開啟或啟動TCR/CD3細胞內訊息級聯。前述試劑可包括抗體，例如對TCR組分及/或共刺激受體具有專一性的抗體，例如抗CD3、抗CD28、例如與固體支持物如珠子結合的抗體、及/或一種或多種細胞激素。任選地，擴增方法可以進一步包括向培養基中加入抗CD3及/或抗CD28抗體的步驟(例如，濃度至少約0.5ng/ml)。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15。舉例來說，刺激劑包括濃度為至少約10個單位/mL的IL-2。

在另一實施例中，其係透過裂解紅血球和剔除單核細胞以從周邊血中分離出T細胞，例如，透過PERCOLL^TM梯度離心。或者，T細胞可以從臍帶中分離出來。在任何情況下，以正向或負向選擇技術可進一步分離出T細胞的特定亞群。

以前述方式所分離出的臍帶血單核細胞可以剔除掉表現有某些抗原的細胞，包括但不限於CD34、CD8、CD14、CD19和CD56。剔除掉前述細胞，可使用經分離的抗體，包含抗體的生物樣品(如腹水)、與物理支持物結合的抗體，及與細胞結合的抗體。

以負向選擇來富集T細胞群，可以使用針對被負向選擇過的細胞所特有的表面標記物的抗體組合。優選的方法是透過負向磁性免疫黏附或流式細胞儀來進行細胞分選及/或選擇，前述方法係使用一單株抗體混合物，該單出抗體混合物係針對會表現在經負向選擇過的細胞上的細胞表面標記物。舉例來說，為了以負向選擇來富集CD4+細胞，所使用的單株抗體混合物通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗體。

為了透過正向或負向選擇來分離出所需的細胞群，可以改變細胞和表面(例如珠子等顆粒)的濃度。在某些實施例中，可能需要顯著降低珠子和細胞混合在一起的體積(即，增加細胞濃度)，以確保細胞和珠子的最大接觸。舉例來說，在一實施例中，其係使用20億個細胞/毫升的濃度。在一實施例中，其係使用10億個細胞/毫升的濃度。在另一實施例中，其係使用大於1億個細胞/毫升。在另一實施例中，其係使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百萬個細胞/毫升的細胞濃度。在另一實施例中，其係使用75、80、85、90、95或100百萬個細胞/毫升的細胞濃度。在進一步的實施例中，其可以使用125或150百萬個細胞/毫升的濃度。使用高濃度可導致細胞產量增加、細胞活化程度提高和細胞擴增情況更好。

在清洗步驟後也可以將T細胞冷凍，這不需要單核細胞去除步驟。雖然不希望受理論約束，但冷凍和隨後的解凍步驟可透過去除細胞群中的顆粒性白血球和一定程度的單核細胞提供了更均勻的產物。在去除血漿和血小板的清洗步驟之後，可以將細胞懸浮在冷凍溶液中。雖然許多冷凍溶液和參數在本領域中是已知的並且在這種情況下是有用的，但在非限制性實例中，其中一種方法係涉及使用含有20% DMSO和8%人類血清白蛋白的PBS、或其他合適的細胞冷凍介質。接著，將細胞以每分鐘1℃的速率冷凍至-80℃，並將其儲存在液態氮儲存槽的氣相中。本發明可以使用其他受控制冷凍方法，也可以用不受控地在-20℃或液態氮中進行的立即冷凍法。

在一實施例中，T細胞群包含在下列細胞內，例如周邊血單核細胞、臍帶血細胞、純化的T細胞群和T細胞株。在另一實施例中，周邊血單核細胞包含T細胞群。在另一實施例中，純化的T細胞包含T細胞群。

在某些實施例中，可以從樣品中分離出T調節細胞(Tregs)。前述樣品可包括但不限於臍帶血或周邊血。在某些實施例中，其係透過流式細胞儀的分選來分離出T調節細胞。在分離之前，可透過任何本領域已知的方法對樣品中的T調節細胞進行富集。經分離的Tregs可以在使用前進行冷凍保存及/或擴增。分離T調節細胞的方法係描述於美國專利號7,754,482、8,722,400和9,555,105以及美國專利申請號13/639,927中，其內容以及其整體併入本文。

免疫細胞的擴增

無論是在將細胞進行修飾以表現CAR及/或TCR及/或轉換受體之前還是之後，都可以使用如下列文獻中所述的方法對細胞進行活化和擴增。例如美國專利號6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041、以及美國專利申請號20060121005。舉例來說，本發明的免疫細胞可以透過與一表面接觸來擴增，而該表面係附著有一刺激試劑與一配體。前述刺激試劑會刺激CD3/TCR複合體相關信號，而前述配體會刺激免疫細胞表面的共刺激分子。具體而言，免疫細胞群可以透過與下列物質接觸而被刺激：抗CD3抗體或其抗原結合片段，或固定在表面上的抗CD2抗體，或與鈣離子載體結合的蛋白質激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素)。為了共刺激免疫細胞表面上的輔助分子，會使用結合輔助分子的配體。例如，可以在適於刺激免疫細胞增殖的條件下，使免疫細胞與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。抗CD28抗體的實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，France)，前述抗體都可以用於本發明，其他本領域的已知方法和試劑也可以用於本發明(參見例如，ten Berge et al.,Transplant Proc.(1998)30(8)：3975-3977、Haanen et al.,J.Exp.Med.(1999)190(9)：1319-1328、及Garland et al.,J.Immunol.Methods(1999)227(1-2)：53-63)。

透過本文所公開的方法來擴增免疫細胞，其可以增加約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及可以是前述數值間的任一、所有、全部，或部分整數之倍數。在一實施例中，免疫細胞的擴增範圍約20倍至約50倍之間。

培養後，免疫細胞可以在培養裝置中的細胞培養基中培養一段時間，或直到細胞達到匯合滿度(confluency)或高細胞密度，以便在將細胞傳遞到另一個培養裝置之前到達最佳傳代。培養裝置可以是通常用於體外培養細胞的任何培養裝置。優選地，在將細胞傳遞到另一個培養裝置之前，滿度為70%或更高。更優選地，滿度為90%或更高。前述一段時間可以是適合於體外培養細胞的任何時間。免疫細胞培養基可在免疫細胞培養期間的任何時間被替換。優選地，免疫細胞培養基每2至3天更換一次，然後從培養裝置中收取免疫細胞，免疫細胞可立即使用或冷凍保存以備後續使用。在一實施例中，本發明包括冷凍保存的擴增的免疫細胞。在將核酸引入免疫細胞之前，會將冷凍保存的免疫細胞解凍。

在另一實施例中，該方法包括分離免疫細胞和擴增免疫細胞。在另一實施例中，本發明還包括在擴增前冷凍免疫細胞以保存之。在另一實施例中，冷凍保存的免疫細胞會被解凍，以用於將編碼嵌合膜蛋白的RNA進行電穿孔。

另一種離體擴增細胞的方法，係描述於美國專利號4,522,587中(其通過引用併入本文)。美國專利號4,522,587中所述的擴增細胞的方法，可以是本文所述的擴增方法的替代形式或與其他擴增方法一起使用。簡而言之，離體培養和免疫細胞的擴增，包括添加例如美國專利號5,199,942中所述的因子或其他因子到細胞生長因子中，例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配體。在一實施例中，免疫細胞之擴增包括將免疫細胞與選自於由flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit所組成之群組的因子一起培養。

如本文所述的培養步驟(與本文所述的與試劑接觸或在電穿孔後)時間可以非常短，例如小於24小時，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小時。如本文進一步描述的培養步驟(與本文所述的藥劑接觸)可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。

有各種術語用於描述培養中的細胞。細胞培養通常用來指稱自活體生物中取出並在受控制的條件下生長的細胞。初代細胞培養是指直接自生物體中取出細胞、組織或器官，並在進行第一次繼代培養之前的培養。當細胞在促進細胞生長及/或分裂的條件下置於生長培養基中時，細胞在培養下擴增，產生更大的細胞群。當細胞在培養下擴增時，細胞增殖速率通常透過細胞倍增所需的時間量來測量，也稱為倍增時間。

每一輪的繼代培養稱為一次繼代。當細胞進行繼代培養時，它們被稱為已經繼代。特定的細胞群或細胞有時被稱為或透過其繼代的次數來表徵。例如，已繼代十次的培養細胞群可稱為P10培養物。初代培養物，即從組織中所分離出的細胞的第一次培養物，命名為P0。在第一次繼代培養後，將細胞稱為二級培養物(P1或第1代)。在第二次繼代培養後，該些細胞變成三級培養物(P2或第2代)，依此類推。本領域技術人員將理解，在繼代期間可能存在許多群體倍增。因此，培養群體倍增的次數會大於繼代次數。在繼代期間細胞的擴增(即群體倍增的數量)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基質、培養基和繼代之間的時間。

在一實施例中，細胞可以培養數小時(約3小時)至約14天或期間的任何整數值的小時數。適合免疫細胞培養的條件包括適當的培養基(例如，MEM培養基(Minimal Essential Media)、或RPMI 1640培養基、或X-vivo 15，(Lonza))，其可包含增殖和活性所必需的因子，包括血清(例如，胎牛或人類血清)，介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α、或本領域技術人員已知的任何其他用於細胞生長的添加劑。其他用於細胞生長的添加劑，包括但不限於介面活性劑、血漿蛋白(plasmanate)及還原劑，例如N-乙醯基-半胱胺酸和2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，並可添加胺基酸、丙酮酸鈉和維生素，且可不含血清，或可補充有適當量的血清(或血漿)或一組確定的激素，及/或足以使免疫細胞生長和擴增的細胞激素的量。抗生素，例如青黴素和鏈黴素，僅在實驗培養物中添加，而不包括在要注入受試者的細胞培養物中。目標細胞係維持在支持生長所需的條件下，例如適當的溫度(例如37℃)和氣體環境下(例如空氣加5% CO₂)。

用於培養免疫細胞的培養基可包括可共刺激免疫細胞的試劑。例如，可以刺激CD3的試劑是抗CD3的抗體，可以刺激CD28的試劑是抗CD28的抗體。這是因為，如本文公開的數據所證實的，透過本文公開的方法所分離的細胞可以擴增大約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600 倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多。在一實施例中，透過培養經過電穿孔處理的群體，免疫細胞擴增到約20倍至約50倍，或更多。在一實施例中，其係透過抗CD3抗體所披覆的KT64.86人工抗原呈現細胞(aAPC)來擴增人類T調節細胞。擴增和活化免疫細胞的方法可以在美國專利號7,754,482、8,722,400及9,555,105中找到，其內容以及其整體併入本文。

在一實施例中，擴增免疫細胞的方法可以進一步包括分離經擴增的免疫細胞，以供進一步的應用。在另一實施例中，擴增方法可以進一步包括將擴增過的免疫細胞進行後續的電穿孔，然後進行培養。後續的電穿孔可以包括將編碼有介質的核酸引入到擴增過的免疫細胞群中，例如轉導擴增的免疫細胞、轉染擴增的免疫細胞，或用電穿孔方式將核酸引入擴增過的免疫細胞，其中前述試劑會進一步刺激免疫細胞。前述試劑可以刺激免疫細胞，例如透過刺激其進一步的擴增、反應功能或其他免疫細胞功能。

經基因編輯的免疫細胞

本發明提供了經基因編輯修飾的細胞。在一些實施例中，基因編輯本發明的經修飾細胞(例如，包含可調節的TCR或CAR表現系統的經修飾細胞)以破壞一或多種內源基因的表現。在一些實施例中，基因編輯的免疫細胞(例如，T細胞)在一或多種內源基因的表現上有減少、缺失、消除、剔除或破壞。

在一些實施例中，係對本發明經修飾的細胞進行基因編輯，以破壞選自下列群組的一或多種內源基因的表現：T細胞受體α恆定區(T Cell Receptor Alpha Constant，TRAC)、T細胞受體β恆定(TRBC)、β-2-微球蛋白(B2M)、第II型主要組織相容性複合體反式活化因子(Class II Major Histocompatibility Complex Transactivator，CIITA)和程序性細胞死亡1(Programmed Cell Death 1，PD1)。

在某些實施例中，係使用標準化療法，其中同種異體治療細胞係預先製造、經過詳細分析，並且可立即施用於患者。同種異體細胞是指從屬於同一物種但在遺傳上不相似的個體所獲得的細胞。在具有免疫活性的宿主中，同種異體細胞會被迅速排斥，這一過程被稱為宿主與移植物間的排斥，其實質上會限制轉移細胞的功效。在免疫功能不全的宿主中，同種異體細胞能夠進行移植，但它們的內源T細胞受體(TCR)特異性可能將宿主組織辨識為外來的，導致移植物抗宿主病，這可能導致嚴重的組織損傷和死亡。不受任何理論約束，破壞TRAC及/或TRBC的表現會導致：1)內源TCR和外源TCR(例如，NY-ESO-1 TCR)的錯誤配對減少，從而降低自體反應性的風險；以及2)透過與內源TCR錯誤配對的減少，增強細胞表面的外源TCR表現，從而提高經修飾的細胞的功效。β-2微球蛋白，也稱為B2M，是MHC第I型分子的輕鏈，並且是主要組織相容性複合體的組成部分。缺乏β-2微球蛋白的小鼠模型已顯示B2M對於MHC第I型的細胞表面表現和肽結合溝(peptide binding groove)的穩定性是必需的。CIITA蛋白作為第II型主要組織相容性複合體基因轉錄(包括B2M基因的轉錄)的正調節因子，並且通常被稱為這些基因表現的「主要控制因子」。

在其他實施例中，係對本發明經修飾的細胞進行基因編輯以破壞內源PDCD1基因產物(程序性死亡1受體，PD-1)的表現。破壞內源PD-1(PD1)的表現可以產生具有「查核點」抗性的修飾細胞，而提高對腫瘤的控制。還可以透過破壞例如但不限於下列蛋白的表現來產生查核點抗性修飾細胞：腺苷A2A受體(A2AR)、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B和T淋巴細胞衰弱蛋白(BTLA/CD272)、CD96、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4/CD152)、吲哚胺2,3-二氧酶(Indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)、殺傷細胞類免疫球蛋白受體(Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor，KIR)、淋巴細胞活化基因-3(LAG3)、具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體(TIGIT)、T細胞免疫球蛋白結構域和黏蛋白結構域3(TIM-3)、或T細胞活化的V結構域Ig抑制劑(VISTA)。

因此，本發明經修飾細胞係經基因編輯以破壞任何本文所述的內源基因的表現。因此，在一些實施例中，本發明經修飾的細胞(例如，包含可調節的TCR或CAR表現系統的經修飾細胞)係經基因編輯以破壞一或多個本文所述的內源基因的表現。

在TRAC、TRBC、B2M和CIITA中的一或多種被破壞的實施例中，其係產生通用型免疫細胞。如本文所使用的，術語「通用型免疫細胞」或「通用型T細胞」是指同種異體免疫細胞和T細胞，其係被預先修飾/預先製備以施用於任何患者。

據此，本文提供了產生通用型T細胞受體(TCR)定向T細胞群的方法，該方法包括：a)刺激被分離的T細胞群，從而產生被刺激的T細胞群；b)向被刺激的T細胞群中引入包含有誘導型TCR表現系統的核酸，從而產生經修飾的T細胞群。前述系統包含：第一核酸及第二核酸。第一核酸包含人類磷酸甘油酯激酶1啟動子，其可操作地連接至編碼有Tet-On 3G反式活化蛋白的核酸序列的上游，而前述第二核酸可誘導TRE3GS啟動子，其可操作地連接至編碼有外源TCR的核酸序列的上游。前述第二核酸與第一核酸是反向的；c)向經修飾的T細胞群中引入一或多種多肽及/或核酸，從而產生被基因編輯修飾的T細胞群。前述一種或多種多肽及/或核酸能夠下調選自於TRAC、TRBC、B2M和CIITA的內源蛋白質所組成的群組的表現；d)從被基因編輯修飾的T細胞群中剔除CD3+ T細胞並分離CD3基因編輯修飾的T細胞群；以及，e)使CD3-基因編輯修飾的T細胞群與去氧羥四環素接觸，以誘發外源TCR的表現，從而產生通用型TCR定向T細胞群。

從CD3+和CD3-T細胞群中剔除CD3+ T細胞的方法是本領域已知的。例如，T細胞的刺激包括使T細胞接觸塗佈有抗CD3及/或抗CD28抗體的磁珠，隨後去除磁珠可從細胞群中除去CD3+ T細胞。

各種基因編輯技術是本領域技術人員已知的。基因編輯技術包括但不限於歸巢內切酶(homing endonucleases)、鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、類轉錄活化因子反應物(transcription activator-like effector，TALE)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和常間回文重複序列叢集-常間回文重複序列叢集關聯蛋白系統9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)-CRISPR-associated protein 9(Cas9))。歸巢內切酶通常將其DNA基質切割為二聚體，並且不具有不同的結合和切割結構域。ZFN會辨識由兩個鋅指結合位點所組成的目標位點，前述鋅指結合位點係位於長度為5至7鹼基對(base pair，bp)的FokI切割結構域辨識間隔序列的兩旁。TALEN辨識由兩個TALE DNA結合位點所組成的目標位點，其位於長度為12至20鹼基對的FokI切割結構域辨識間隔序列的兩旁。Cas9核酸酶由引導RNA(gRNA)導向位於相容的前間隔區相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)上游的目標序列。據此，本領域技術人員將能夠為本發明選擇合適的基因編輯技術。

在一些實施例中，其係透過使用RNA引導的核酸酶系統，例如對基因(例如，TRAC、TRBC、CIITA、B2M、PD1)具有專一性的CRISPR-Cas系統(例如CRISPR-Cas9系統))來進行基因編輯以破壞前述基因。在一些實施例中，將含有Cas9和引導RNA(gRNA)的介質引入細胞中。在一些實施例中，前述介質為，或包含有，Cas9多肽和gRNA(Cas9/gRNA RNP)的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)複合體。在一些實施例中，前述介質包含含有Cas9和gRNA的核酸(例如質體)。在一些實施例中，引入過程係包括以體外方式使介質或其部分與細胞接觸，其可包括將該細胞及介質培養或孵育達24、36或48小時或3、4、5、6、7、或8天。在一些實施例中，引入過程還可以包括向細胞中遞送試劑。在各種實施例中，根據本發明的方法，組合物和細胞係利用Cas9和gRNA的核糖核蛋白(RNP)複合體直接遞送至細胞，例如透過電穿孔。在一些實施例中，RNP複合體包括已被修飾為包含3'端poly-A尾部和5'端抗-反向端帽類似物(Anti-Reverse Cap Analog，ARCA)端帽的gRNA。

CRISPR/Cas9系統是用於誘發目標基因改變的簡便且有效的系統。Cas9蛋白的目標辨識，需要位在引導RNA(gRNA)內的「種子」序列和位在gRNA結合區上游而含有保守雙核苷酸的PAM序列。因此，可以透過重新設計細胞株(例如293T細胞)、初代細胞及/或TCR T細胞中的gRNA來設計CRISPR/Cas9系統，以切割幾乎任何DNA序列。透過共表現單個Cas9蛋白與兩個或更多個的gRNA，CRISPR/Cas9系統得以同時靶向多個基因體基因座，使得該系統適於進行多基因編輯或目標基因的協同活化。

Cas9蛋白和引導RNA會形成辨識和切割目標序列的複合體。Cas9由六個結構域組成：REC I、REC II、Bridge Helix、PAM相互作用、HNH和RuvC。REC I結構域會結合引導RNA，而Bridge Helix係結合至目標DNA。HNH和RuvC結構域是核酸酶結構域。引導RNA被設計為具有與目標DNA序列互補的5'端。在引導RNA與Cas9蛋白結合後，會發生結構變化，以活化蛋白質。一旦活化，Cas9會透過與其PAM序列所匹配的序列相結合來搜索目標DNA。PAM一個長度為兩個或三個核苷酸鹼基的序列，並且緊接於引導RNA的互補區域下游。在一個非限制性實例中，PAM序列是5'-NGG-3'。當Cas9蛋白質以適當的PAM發現其目標序列時，它會將PAM上游的鹼基解鏈並將它們與引導RNA上的互補區域配對，然後RuvC和HNH核酸酶結構域會在PAM上游第三個核苷酸鹼基的後方對目標DNA進行切割。

用於抑制基因表現的CRISPR/Cas系統的一個非限制性實例(CRISPRi)係描述於美國專利申請公開號US20140068797。CRISPRi係誘發永久性基因破壞，其係利用RNA引導的Cas9內切核酸酶來引入DNA雙股斷裂，而觸發易誤修復(error-prone repair)途徑以導致移碼突變(frame shift mutation)。不具催化活性(catalytically dead)的Cas9缺乏內切核酸酶活性。當與引導RNA共表現時，會產生一DNA辨識複合體，其專一性地干擾轉錄延伸、RNA聚合酶結合或轉錄因子結合。前述CRISPRi系統能有效抑制目標基因的表現。

當將目標基因專一性的引導核酸序列和Cas內切核酸酶引入細胞並形成能夠使Cas內切核酸酶在目標基因處引入雙股斷裂的複合體時，會發生CRISPR/Cas基因破壞。在某些實施例中，CRISPR/Cas系統包含有表現載體，例如但不限於pAd5F35-CRISPR載體。在其他實施例中，Cas表現載體會誘發Cas9內切核酸酶的表現。本發明也可使用其他內切核酸酶，包括但不限於Cas12a(Cpf1)、T7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、以及其他本領域已知的核酸酶及其任何組合。

在某些實施例中，誘導Cas表現載體的過程包括將細胞暴露於介質中，前述介質會活化Cas表現載體中的誘導型啟動子。在前述實施例中，Cas表現載體包括誘導型啟動子，例如其係透過暴露於抗生素(例如，透過四環素或四環素的衍生物，例如去氧羥四環素)來誘導的。本發明也可以使用其他本領域技術人員已知的誘導型啟動子。誘導劑可以是選擇性條件(例如，暴露於試劑，例如抗生素)，其會導致誘導型啟動子的誘發，這將導致Cas表現載體的表現。

引導RNA(gRNA)，也稱為「短引導RNA(short guide RNA)」或「sgRNA」，為Cas9核酸酶提供了目標向專一性和支架/結合能力。gRNA可以是由目標序列和源自內源細菌crRNA和tracrRNA的支架序列所組成的合成RNA。在基因體改造實驗中，gRNA用於將Cas9靶向特定的基因體基因座。可以使用本領域習知的標準工具來設計引導RNA。如本文所使用的，術語「指導RNA」或「gRNA」是指任何核酸，前述核酸能夠將RNA引導的核酸酶(如Cas9)引導至細胞中的目標序列(例如基因體或游離序列)。本領域技術人員能夠理解，在gRNA序列中，可以用胸腺嘧啶或「T」核苷酸來代替尿嘧啶或「U」核苷酸。

引導RNA對目標基因體區域具有專一性，並且靶向Cas內切核酸酶所誘發的雙股斷裂區域。引導RNA序列的目標序列，可以位在基因的基因座內，或位在基因體的非編碼區內。在某些實施例中，引導核酸序列的長度至少為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多個核苷酸。

如本文所使用的，「模組化(modular)」或「雙RNA」引導係包含多於一種，通常為兩種，獨立的RNA分子，例如CRISPR RNA(crRNA)和反式活化crRNA(tracrRNA)，其通常與彼此相聯，例如透過雙工(duplexing)。在下列文獻中描述了gRNA及其組成部分(參見例如，Briner et al.Mol.Cell,56(2),333-339(2014)，其通過引用併入本文)。

如本文所使用的，「單分子gRNA」、「嵌合gRNA」或「單引導RNA(single guide RNA，sgRNA)」係包含單個RNA分子。sgRNA 可以是連接在一起的crRNA和tracrRNA。舉例來說，crRNA的3'端可以與tracrRNA的5'端連接。舉例來說，透過橋接crRNA的互補區域的4個核苷酸(例如，GAAA)」「四環(tetraloop)」或「連接子」序列(在其3'端)和tracrRNA(在其5'端)，crRNA和tracrRNA可以連接成單一個單分子或嵌合gRNA。

關於引導RNA結構和功能的其他細節，包括用於基因體編輯的gRNA/Cas9複合體，至少可以在下列文獻中找到相關描述：Mali et al.Science,339(6121),823-826(2013)、Jiang et al.Nat.Biotechnol.31(3).233-239(2013)、及Jinek et al.Science,337(6096),816-821(2012)，其通過引用併入本文。

如本文所使用的，「引導序列」或「靶向序列」是指gRNA的核苷酸序列，無論是單分子的還是模組化的，其與需要編輯的細胞基因體中的目標序列完全或部分互補。通常引導序列的長度為10至30個核苷酸，優選的長度為16至24個核苷酸(例如，長度為16、17、18、19、20、21、22、23或24個核苷酸)，並且位於或接近於gRNA的5'端。

如本文所使用的，「目標結構域」或「目標多核苷酸序列」或「目標序列」是細胞基因體中與gRNA引導序列互補的DNA序列。

在形成CRISPR複合體的情況下，「目標序列」是指一序列，而引導序列係被設計為對該序列具有一些互補性。目標序列和引導序列之間的雜交會促進CRISPR複合體的形成。如果存在足夠的互補性以引起雜交並促進CRISPR複合體的形成，則兩者不一定需要完全互補。目標序列可包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。在某些實施例中，目標序列係位於細胞的細胞核或細胞質中。在其他實施例中，目標序列可以位在真核細胞的細胞胞器內，例如粒線體或細胞核。通常，在CRISPR系統下，形成CRISPR複合體(包含與目標序列雜交並與一或多種Cas蛋白複合的引導序列)，會導致目標序列的一條或兩條股中或附近(例如，在約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多個鹼基對)被切割。與目標序列一樣，只要足以起作用，前述切割被認為不需要完全互補。

在某些實施例中，係將驅動CRISPR系統的一或多種元件表現的一或多種載體引入宿主細胞中，使得CRISPR系統元件的表現會導向在一或多個目標位點形成有CRISPR複合體。舉例來說，Cas核酸酶、crRNA和tracrRNA各自可以與獨立載體上的個別調節元件為可操作地連接。或者，可以將由相同或不同調節元件所表現的兩種或更多種元件組合在單一載體中，而有一或多個額外的載體以提供任何不為第一載體的CRISPR系統中所含括的組分。在單個載體中組合的CRISPR系統元件，可以以任何合適的方向排列，例如位於5'的一個元件是相對於第二元件的(「上游」)或位於3'的一個元件是相對於第二元件的(「下游」)。一個元件的編碼序列可以與第二元件的編碼序列位在同一股或另一股上，並且以相同或相反的方向排列。在某些實施例中，單個啟動子會驅動下列單元的表現：編碼有CRISPR酶的轉錄物和一或多個引導序列、tracr配對序列(其係可選擇性地與引導序列可操作地連接)和嵌在一或多個內含子序列內的tracr序列(例如，在不同的內含子中的每個、在至少一個內含子中的兩個或更多個，或全部都在單個內含子中)。

在某些實施例中，CRISPR酶是一融合蛋白的一部分，該融合蛋白係包含有一或多個異源蛋白結構域(例如，約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個除了CRISPR酶之外的結構域)。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何額外的蛋白質序列，並且可選擇性地包含任何兩個結構域之間的連接子序列。可以與CRISPR酶融合的蛋白質結構域其實例包括但不限於表位標籤、報導基因序列，和具有以下一或多種活性的蛋白質結構域：申基化酶活性、去甲基化酶活性、轉錄活化活性、轉錄抑制活性、轉錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA切割活性和核酸結合活性。其他可以形成包含有CRISPR酶的融合蛋白的結構域，係描述於美國專利申請公開號US20110059502，在此以引用方式而納入本文。在某些實施例中，標記的CRISPR酶用於找出目標序列的位置。

常規基於病毒和非病毒的基因轉移方法，可在哺乳動物和非哺乳動物細胞或目標組織中引入核酸。前述方法係可將編碼有CRISPR系統單元的核酸施用於培養中的細胞或宿主生物中。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、RNA(例如，本文所述載體的轉錄物)、裸核酸和與遞送載體複合的核酸，其例如是微脂體。病毒載體遞送系統包括DNA和RNA病毒，其在遞送至細胞後具有附加型或嵌入的基因體(Anderson,1992,Science 256：808-813；and Yu,et al.,1994,Gene Therapy 1：13-26)。

在一些實施例中，CRISPR/Cas係衍生自第II型CRISPR/Cas系統。在其他實施例中，CRISPR/Cas系統係衍生自Cas9核酸酶。可用於本發明的示例性Cas9核酸酶包括但不限於化膿性葡萄球菌Cas9(S.pyogenes Cas9，SpCas9)、金黃色葡萄球菌Cas9(S.aureus Cas9，SaCas9)、嗜熱鏈球菌Cas9(S.thermophilus Cas9，StCas9)、腦膜炎雙球菌Cas9(N.meningitidis Cas9，NmCas9)、空腸曲桿菌Cas9(C.jejuni Cas9，CjCas9)和嗜熱細菌Cas9(Geobacillus Cas9，GeoCas9)。

一般來說，Cas蛋白包含至少一個RNA辨識及/或RNA結合結構域。RNA辨識及/或RNA結合結構域會與引導RNA相互作用。Cas蛋白還可以包含核酸酶結構域(即，DNase或RNase結構域)、DNA結合結構域、解旋酶結構域、RNA酶結構域、蛋白質-蛋白質相互作用結構域、二聚化結構域以及其他結構域。Cas蛋白可經修飾以增加核酸結合親和力及/或專一性，改變酶活性、及/或改變蛋白質的另一性質。在某些實施例中，融合蛋白中的類Cas蛋白可以衍生自野生型Cas9蛋白或其片段。在其他實施例中，Cas可以衍生自經修飾的Cas9蛋白。例如，Cas9蛋白的胺基酸序列可經修飾以改變蛋白質的一或多種性質(例如，核酸酶活性、親和力、穩定性等)。或者，可以從蛋白質中除去不參與RNA所引導的切割的Cas9蛋白結構域，使得經修飾的Cas9蛋白質較野生型Cas9蛋白質來得小。通常，Cas9蛋白包含至少兩個核酸酶(即DNase)結構域。舉例來說，Cas9蛋白可包含類RuvC核酸酶結構域和類HNH核酸酶結構域。RuvC和HNH結構域係共同作用以切割單股，進而在DNA中形成雙股斷裂(Jinek,et al.,2012,Science,337：816-821)。在某些實施例中，可以將Cas9衍生的蛋白質修飾為僅含有一個功能性核酸酶結構域(類RuvC或類HNH核酸酶結構域)。舉例來說，可以修飾Cas9衍生的蛋白質，使得一個核酸酶結構域發生缺失或突變，而不再發揮作用(即，不存在核酸酶活性)。在一些實施例中，其中一個核酸酶結構域無活性時，Cas9衍生的蛋白質能夠將切口 (nick)引入雙股核酸(這種蛋白質被稱為「切口酶(nickase)」)，但不能切割雙股DNA。在上述任何實施例中，任何或所有核酸酶結構域可以用眾所周知的方法(例如是定點突變、PCR介導的突變及總基因合成、以及其他本領域已知的方法)來產生一或多種缺失突變、插入突變及/或取代突變，進而使其滅活。

在一個非限制性實施例中，載體會驅動CRISPR系統的表現。本領域充滿了適用於本發明的載體。所用的載體係適用於複製，並且係可選擇性地嵌入到真核細胞中。典型的載體含有轉錄和轉譯終止子、起始序列，和可調節所需核酸序列表現的啟動子。本發明的載體也可用於核酸標準基因遞送方法。用於基因遞送的方法是本領域已知的(美國專利號5,399,346、5,580,859和5,589,466，其全部內容通過引用併入本文)。

此外，載體可以以病毒載體的形式提供給細胞。病毒載體技術在本領域中是公知的，並且在例如Sambrook等人的下列文獻(4th Edition,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,2012)、以及其他病毒學和分子生物學手冊中有描述。可用作載體的病毒包括但不限於，反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)、γ反轉錄病毒和慢病毒。一般來說，合適的載體含有在至少一種生物體中起作用的複製起始序列、啟動子序列、便利的限制性內切核酸酶位點，和一或多種可選擇標記(例如，WO 01/96584、WO 01/29058、及美國專利號6,326,193)。

在一些實施例中，引導RNA和Cas9可以核糖核蛋白(RNP)複合體的形式(例如Cas9/RNA-蛋白質複合體)遞送至細胞。RNP係由與gRNA所複合的純化Cas9蛋白來組成。並且，如本領域中是眾所周知的，會有效遞送至多種細胞中，包括但不限於幹細胞和免疫細胞(A Addgene,Cambridge,MA,Mirus Bio LLC,Madison,WI)。在一些實施例中，其係透過電穿孔將Cas9/RNA-蛋白質複合體遞送到細胞中。

在一些實施例中，其係使用CRISPR/Cas9來編輯本發明被基因編輯所修飾的細胞，以破壞經修飾細胞(例如，經修飾的T細胞)中的一或多種內源基因。在一些實施例中，CRISPR/Cas9係用來破壞內源性 TRAC、TRBC、B2M及/或CIITA中的一或多種。在某些示例性實施例中，CRISPR/Cas9係用來破壞內源TRAC、TRBC、B2M、CIITA及/或PD1基因座中的一或多個，從而導致TRAC、TRBC、B2M、CIITA及/或PD1的下調。適合用來破壞內源TRAC、TRBC、B2M、CIITA及/或PD1中的一或多種的gRNA，係如圖26和圖27中所示。

因此，對本發明經修飾細胞進行基因編輯的方法，係包括向細胞中引入一或多個核酸，其能下調選自TRAC、TRBC、B2M、CIITA和PD1的一或多種內源基因的基因表現。在一實施例中，對本發明經修飾細胞進行基因編輯的方法，係包括向細胞中引入一或多個核酸，其能下調選自TRAC、TRBC、B2M和CIITA的一或多種內源基因的基因表現。在一實施例中，對本發明經修飾細胞進行基因編輯的方法，係包括向細胞中引入一或多個核酸，其能下調內源TRAC基因的表現。在一實施例中，對本發明經修飾細胞進行基因編輯的方法，係包括向細胞中引入一或多個核酸，其能下調內源TRBC基因的表現。在一實施例中，對本發明經修飾細胞進行基因編輯的方法，係包括向細胞中引入一或多個核酸，其能下調內源B2M基因的表現。在一實施例中，對本發明經修飾細胞進行基因編輯的方法，係包括向細胞中引入一或多個核酸，其能下調內源CIITA基因的表現。在一實施例中，對本發明經修飾細胞進行基因編輯的方法，係包括向細胞中引入一或多個核酸，其能下調內源PD1基因的表現。

在一實施例中，產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：向免疫細胞中引入包含可調節T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)表現系統的核酸，其包含：第一核酸及第二核酸，該第一核酸包含組成型啟動子，前述組成型啟動子係可操作地連接至編碼有反式活化蛋白的核酸序列，而該第二核酸包含誘導型啟動子，前述誘導型啟動子係可操作地連接至編碼有外源TCR或CAR的核酸序列，而前述第二核酸與前述第一核酸是反向的，其中前述外源TCR或CAR的表現在存在誘導劑時被誘導；以及將一種或多種能夠下調內源蛋白表現的多肽及/或核酸引入免疫細胞中。

在一實施例中，產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：向免疫細胞中引入包含可調節T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)表現系統的核酸，其包含：第一核酸及第二核酸，該第一核酸包含組成型啟動子，前述組成型啟動子係可操作地連接至編碼有反式活化蛋白的核酸序列，該第二核酸包含誘導型啟動子，前述誘導型啟動子係可操作地連接至編碼有外源TCR或CAR的核酸序列，而前述第二核酸與前述第一核酸是反向的，其中前述外源TCR或CAR的表現在存在誘導劑時被誘導；將編碼轉換受體的核酸引入免疫細胞中；以及將一種或多種能夠下調內源蛋白表現的多肽及/或核酸引入免疫細胞中。

在一實施例中，產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：向免疫細胞中引入包含可調節T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)表現系統的核酸，其包含：第一核酸及第二核酸，該第一核酸包含人類磷酸甘油酯激酶1啟動子，前述人類磷酸甘油酯激酶1啟動子係可操作地連接至編碼有Tet-On 3G反式活化蛋白的核酸序列的上游，該第二核酸包含誘導型TRE3GS啟動子，前述誘導型TRE3GS啟動子係可操作地連接至編碼有外源TCR或CAR的核酸序列的上游，而前述第二核酸與前述第一核酸是反向的，其中前述外源TCR或CAR的表現在存在誘導劑時被誘導；以及將一種或多種能夠下調內源蛋白表現的多肽及/或核酸引入免疫細胞中。

在一實施例中，產生經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括：向免疫細胞中引入包含可調節的T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)表現系統的核酸，其包含：第一核酸及第二核酸，該第一核酸包含人類磷酸甘油酯激酶1啟動子，前述人類磷酸甘油酯激酶1啟動子係可操作地連接至編碼有Tet-On 3G反式活化蛋白的核酸序列的上游，該第二核酸包含誘導型TRE3GS啟動子，前述誘導型TRE3GS啟動子係可操作地連接至編碼有外源TCR或CAR的核酸序列的上游，而前述第二核酸與前述第一核酸是反向的，其中前述外源TCR或CAR的表現在存在誘導劑時被誘導；將編碼轉換受體的核酸引入免疫細胞中；以及將一種或多種能夠下調內源蛋白表現的多肽及/或核酸引入免疫細胞中。

在示例性實施例中，能夠下調內源蛋白表現的一或多種多肽及/或核酸，會下調選自TRAC、TRBC、B2M、CIITA及PD1內源蛋白所組成的群組中的一或多種的表現。

在示例性實施例中，能夠下調表現的一或多種多肽及/或核酸中的每一種係包含CRISPR相關系統。在一些實施例中，CRISPR相關系統是CRISPR核酸酶和引導RNA。

在一示例性實施例中，引導RNA包含一引導序列，前述引導序列與選自TRAC、TRBC、B2M、CIITA及PD1內源基因的目標序列充分互補。

在一些實施例中，目標序列在TRAC基因內，且引導RNA包含SEQ ID NO：85至97中任一個所示的核酸序列。在一些實施例中，目標序列在TRBC基因內，且引導RNA包含SEQ ID NO：1至24中任一個所示的核酸序列。在一些實施例中，目標序列在B2M基因內，且引導RNA包含SEQ ID NO：73至84中任一個所示的核酸序列。在一些實施例中，目標序列在CIITA基因內，且指導RNA包含SEQ ID NO：25至48中任一個所示的核酸序列。在一些實施例中，目標序列在PD1基因內，且引導RNA包含SEQ ID NO：49至72中任一個所示的核酸序列。

在一些實施例中，所提供的組合物和方法包括在一免疫細胞組合物中，有至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的免疫細胞具有所需的基因修飾。舉例來說，被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞內源基因(如TRAC、TRBC、B2M、CIITA、PD1)的細胞組合物中有約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的免疫細胞具有基因破壞情況、不表現目標內源多肽、不含有目標基因的相鄰(contiguous)及/或功能性拷貝。在一些實施例中，根據本發明的方法，組合物和細胞包括被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞一目標基因的細胞組合物中有至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的細胞，係不表現目標多肽，例如不在免疫細胞的表面表現。在一些實施例中，被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞一目標基因的細胞組合物中有細胞組合物中，有至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的細胞(例如gRNA) 其等位基因雙雙被剔除，即在前述比例的細胞中包含雙對偶基因缺失(biallelic deletion)。

在一些實施例中提供了組合物和方法，在被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞一目標基因的細胞組合物中，其中在目標基因內或附近(例如在切割位點上游或下游的：在或大約在100個鹼基對內、在或大約在50個鹼基對內、在或大約在25個鹼基對內、在或大約在10個鹼基對內)由Cas9介導的切割效率(插入或缺失%)為至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的細胞。

在一些實施例中，所提供的細胞、組合物和方法在被引入一介質(例如gRNA/Cas9)以剔除或破壞一目標基因的細胞組合物中，導致了有至少或大於約50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的細胞，其透過內源所遞送的信號發生減少或破壞。

在一些實施例中，根據本發明提供的組合物，係包含用重組受體改造的細胞，且其內源受體表現有減少、缺失、消除、剔除或破壞(例如TRAC、TRBC、B2M、CIITA和TRAC的基因破壞)。而在相同的條件下，與由相應或參考組合物改造的細胞所表現的受體(該細胞包含受體但不包含基因的基因破壞或多肽表現)相比，本發明組合物的受體仍有功能或活性。在一些實施例中，在相同的條件下，與包含改造細胞(其係以重組受體改造但不包含基因破壞或表現被靶向的多肽)的相應或參考組合物相比，由所提供的組合物改造的細胞係保留功能特性或活性。在一些實施例中，與前述相應或參考組合物相比，該細胞係保留細胞毒性、增殖能力、存活特性或細胞激素分泌能力。

在一些實施例中，當在相同條件下評估時，組合物中的免疫細胞與相應或參考組合物中的細胞表型相比，保留了一或多個免疫細胞的表型。在一些實施例中，組合物中的細胞係包括初級細胞、作用性記憶細胞、中樞記憶細胞、中樞記憶幹細胞、作用性記憶細胞及長壽作用性記憶細胞。在一些實施例中，表現重組受體(例如TCR或CAR)並且包含被基因破壞之目標基因(例如，TRAC、TRBC、B2M、CIITA、PD1)的T細胞或T細胞的百分比，係表現出非活化的、長壽記憶或中樞記憶表型，其與以重組受體改造但沒有基因破壞的相應或參考細胞群或細胞組合物相同或基本上相同。在一些實施例中，前述性質、活性或表型可以在體外檢測中測量，例如以下列方式孵育該細胞來進行：孵育在TCR或CAR所靶向的抗原中、與表現該抗原的細胞一起孵育，及/或孵育在抗原受體活化培養基中。在一些實施例中，可以在電穿孔或其他介質引入後的不同天數來評估任何所欲評估的活性、性質或表型，例如在3、4、5、6、7天後或之後。在一些實施例中，在相同條件下評估時，與含有重組受體改造細胞(其目標基因未被破壞)的相應組合物的活性相比，組合物中的前述活性、性質或表型保留至少80%、85%、90%、95%或100%。

如本文所使用的，「相應組合物」或「相應的免疫細胞群」(也稱為「參考組合物」或「參照細胞群」)是指在相同或基本相同的條件所下獲得、分離、生成、產生，及/或孵育的免疫細胞(例如，T細胞)，而該免疫細胞或免疫細胞群，係不引入前述介質。在一些實施例中，除了不含有介質的引入之外，前述免疫細胞與係與引入有試劑的免疫細胞接受相同或實質上相同的處理，使得任何一種或多種可以影響細胞的活性或性質(包括抑制性分子的上調或表現)的條件，除了有引入介質之外，在細胞之間不變或實質上不變。

用於評估T細胞標誌物有無表現及/或表現量的方法和技術是本領域已知的。用於檢測前述標記物的抗體和試劑是本領域熟知的，並且容易獲得。用於檢測前述標記物的檢測法和方法包括但不限於流式細胞分析法，包括細胞內流式細胞分析法、ELISA、ELISPOT、磁珠陣列術(cytometric bead array)或其他多重方法、西方墨點法和其他基於免疫親和性的方法。在一些實施例中，表現抗原受體(例如TCR或CAR)的細胞可以透過流式細胞分析法或其他基於免疫親和性的方法，來檢測前述細胞所特有的標記物之表現，接著可以將前述細胞對另一個T細胞表面標記或標記物進行共染色。

在一些實施例中，細胞、組合物和方法係用來將過繼轉移的免疫細胞(前述細胞係例如經改造以表現外源TCR或CAR的細胞，例如T細胞)中目標基因的表現進行缺失、剔除、破壞或減少處理。在一些實施例中，所述方法係以離體方式在初代細胞上進行，前述初代細胞係例如來自受試者的初代免疫細胞(例如T細胞)。在一些實施例中，產生或生成前述基因改造T細胞的方法，係包括向一群含有免疫細胞(例如T細胞)的細胞中引入一或多種編碼重組受體的核酸(例如外源TCR或CAR)和一或多種介質，前述介質能夠破壞一編碼有內源受體的基因。如本文所使用的，術語「引入」包括各種以體外或體內方式將DNA引入細胞的方法，這些方法包括轉化、轉導、轉染(例如電穿孔)和感染。載體可將編碼DNA的分子引入細胞中。可能的載體包括質體載體和病毒載體。病毒載體包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體或其他載體，例如腺病毒載體或腺相關載體。

含有T細胞的細胞群可以是從受試者獲得的細胞，例如從下列來源獲得：周邊血單核細胞(PBMC)樣品、未分級(unfractionated)的T細胞樣品、淋巴細胞樣品、白血球樣品、血球分離產品或白血球分離產品。在一些實施例中，可以使用正向或負向選擇和富集方法來分離或選擇T細胞以富集群體中的T細胞。在一些實施例中，群體含有CD4+、CD8+或CD4+和CD8+ T細胞。在一些實施例中，引入編碼基因改造抗原受體核酸的步驟和引入介質的步驟(例如Cas9/gRNA/RNP)可以同時發生或以任何順序相繼發生。在一些實施例中，在引入外源受體和一或多種基因編輯介質(例如Cas9/gRNA/RNP)之後，在一定條件下培養或孵育細胞以刺激細胞的擴增及/或增殖。

因此，本發明提供了增強免疫細胞(例如T細胞)的細胞，組合物和方法，其在過繼細胞療法中發揮功用，包括提供改善的功效，其係例如透過增加所施用的基因改造細胞的活性和效力，同時保持持久性或暴露於轉移細胞的時間。在一些實施例中，與某些習知方法相比，當施用於受試者體內時，基因改造的細胞會表現出擴增及/或持久性的增加。在一些實施例中，當施用於受試者體內時，所提供的免疫細胞會表現出持久性的增加。在一些實施例中，與透過替代方法實現的基因改造免疫細胞相比(例如未引入介質，以減少或破壞編碼內源受體基因表現的T細胞)，在施用於受試者時，本發明的基因改造免疫細胞的持久性增加。在一些實施例中，持久性增加至少或約至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7 倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。

在一些實施例中，施用細胞其持久性的程度或範圍，可在施用於受試者後進行檢測或定量。例如，在一些實施例中，其係以定量PCR(qPCR)來評估在受試者血液或血清或器官或組織(例如，疾病部位)中表現有外源受體(例如，TCR或CAR)細胞的數量。在一些實施例中，持久性被量化為每微克的DNA中編碼有外源受體的DNA或質體的拷貝數，或者是每微升樣品(例如血液或血清)中表現有受體的細胞數量，或在每微升樣品的總周邊血單核細胞(PBMC)數中每微升樣品的總白細胞數中，或每微升樣品的總T細胞數中，表現有受體的細胞數量。在一些實施例中，也可以用流式細胞分析來檢測表現受體的細胞，其係使用對受體具有專一性的抗體來進行。基於細胞的測定也可用來檢測功能細胞的數量或百分比，其例如是能夠結合及/或中和及/或誘導反應(例如細胞毒性反應、針對疾病或病症，或表現辨識抗原受體)的細胞。在任何前述實施例中，與外源受體(例如外源TCR或CAR)相關的另一種標記物的表現程度或表現量可用來區分受試者中被施用的細胞與內源細胞。

醫藥組合物

本發明的醫藥組合物可包含本文所述的經修飾的免疫細胞，以及一或多種醫藥上或生理學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。前述組合物可包含緩衝液，例如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或聚葡萄醣、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑如EDTA或麩胺基硫；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。本發明的組合物優選地被配製用於靜脈內施用。

本發明的醫藥組合物可以以適合用於待治療(或預防)疾病的方式施用。給藥的數量和頻率將由例如患者的狀況以及患者的疾病類型和嚴重性等因素決定，但適當的劑量可以透過臨床試驗決定。

對接受治療的受試者而言，待施用的本發明的細胞可以是自體的、同種異體的或異種的。

本發明的細胞可以以適當的臨床前和臨床實驗和試驗中所決定的劑量、途徑和時間來施用。細胞組合物可以在這些劑量範圍內進行多次給藥。如本領域技術人員所決定的，本發明細胞的施用可以與其他治療所需疾病或病症的方法進行組合。

本文還提供了免疫細胞群、含有前述細胞及/或富含前述細胞的組合物。舉例來說，表現重組受體的細胞占組合物內總細胞數的比例為，或占某特定類型細胞(如調節性T細胞)的比例為，50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。這些組合物中包含適用於投與的醫藥組合物和調配物，例如用於過繼性細胞療法。本文還提供了將細胞和組合物投與至受試者(例如患者)的治療方法。

本文還提供了包括用於投與之細胞的組合物，其包括醫藥組合物和調配物，例如單位劑量形式的組合物，其包括於給定劑量或其部分中所投與的細胞數量。醫藥組合物和調配物通常包括一種或多種可選的醫藥上可接受的載體或賦形劑。在一些實施例中，組合物包括至少一種額外的治療試劑。

術語「醫藥製劑」是指一種調配物，其所呈形式允許所含活性成分之生物活性得以有效發揮，且不含有其他會對所投與之個體產生不可接受毒性之成分。「醫藥上可接受的載體」是指醫藥製劑中除了活性成分以外的成分，其對受試者是無害的。醫藥上可接受的載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在一些實施例中，載體的選擇在某種程度上係由特定細胞及/或透過施用方法來決定。因此，有多種製劑係適合用於本發明。例如，醫藥組合物可含有防腐劑。合適的防腐劑可包括，例如，對羥苯甲酸甲酯、羥苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及羥基氯苯胺。在一些實施例中，其係使用兩種或更多種防腐劑的混合物。防腐劑或其混合物通常佔組合物總重量約0.0001%至約2%。載體係描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed中。醫藥上可接受的載體通常在所用劑量和濃度下對受試者是無害的，並且其係包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨、氯化六甲雙銨、羥基氯苯胺、氯化本索寧、苯酚、丁基或芐基醇、對羥苯甲酸酯類，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇、及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)的多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或賴胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA；醣類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子(salt-forming counterion)如鈉；金屬複合體(例如鋅-蛋白質複合體)；及/或非離子介面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。

在一些實施例中，緩衝劑包括在組合物中。合適的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀和各種其他酸和鹽類。在一些實施例中，其係使用兩種或以上緩衝劑的混合物。緩衝劑或其混合物的種量通常佔組合物總重量約0.001%至約4%。製備可施用的醫藥組合物的方法是已知的。示例性方法更詳細地描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams & Wilkins；21st ed.(May 1,2005)中。

製劑可包括水溶液。製劑或組合物還可含有一種以上適用以細胞治療的特定適應症、疾病或病症的活性成分，前述活性成分優選地具有與細胞互補的活性，各活性不會相互作用而產生不利的影響。前述活性成分適合以對預期目的有效的劑量組合存在。因此，在一些實施例中，醫藥組合物還包含其他醫藥活性劑或藥物，例如化學治療劑，例如天冬醯胺酸酶、硫酸布他卡因(busulfan)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(Cisplatin)、唐黴素(daunorubicin)、艾黴素(doxorubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲(hydroxyurea)、滅殺除癌錠(methotrexate)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔單抗(rituximab)，長春鹼(vinblastine)、及/或長春新鹼(vincristine)。在一些實施例中，醫藥組合物含有有效治療或預防疾病或病症的細胞量，例如治療有效劑量或預防有效劑量。某些實施例中的治療或預防功效，係透過定期評估接受治療的受試者來進行監測。所需劑量可透過單次推注施用細胞、透過多次推注施用細胞、或透過連續輸注施用細胞來遞送。

製劑包括口服、靜脈內、腹腔內、皮下、肺、經皮、肌肉內、鼻腔內、口腔、舌下或栓劑給藥的製劑。在一些實施例中，其係非經腸胃道來施用細胞群。本文所用的術語「非經腸胃道」包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道和腹腔內給藥。在一些實施例中，係透過靜脈內、腹腔內或皮下注射等周邊全身遞送方式將細胞施用於受試者。一些實施例中的組合物係以無菌液體製劑的形式來提供，其例如等張性水溶液、懸浮液、乳液、分散體或黏性組合物，在一些實施例中其可以緩衝至選定的pH值。液體製劑通常比凝膠、其他黏性組合物和固體組合物更容易製備。另外，液體組合物在某些程度上更便於給藥，特別是透過注射。另一實施例中，黏性組合物可以配製在適當的黏度範圍內，使其能與特定組織接觸的更久。液體或黏性組合物可包含載體，其可以是溶劑或分散介質，其含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其合適的混合物。

無菌的注射溶液可以透過將細胞摻入溶劑中來製備，例如與合適的載體，稀釋劑或賦形劑(如無菌水、生理食鹽水、葡萄糖、右旋糖等)混合。組合物可含有輔助物質，例如潤濕劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH值緩衝劑、凝膠或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑及/或顏色，這取決於給藥途徑和所需的製劑。在某些實施例中，可以參考標準文本來製備合適的製劑。

在本文的組合物中可以加入各種增強組合物穩定性和無菌性的添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可用來確保防止微生物的作用。延長可注射藥物形式的吸收，可透過使用延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明膠)來實現。

一般來說，用於體內施用的製劑是無菌的。舉例來說，透過無菌過濾膜過濾可以容易地達到無菌。

包含本文所述的經修飾免疫細胞的醫藥組合物，一般的施用劑量可以是10⁴至10⁹個細胞/公斤體重，在一些情況下為10⁵至10⁶個細胞/公斤體重(包括彼等範圍內之所有整數值)。免疫細胞組合物也可以用前述劑量多次給藥。可以透過使用免疫療法中通常已知的輸注技術來施用細胞(參見例如，Rosenberg et al.,New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。透過監測患者的疾病跡象並對應地調整治療，醫學領域的技術人員可以輕易地決定特定患者的最佳劑量和治療方案。

本發明的經修飾免疫細胞的施用，可以任何本領域技術人員已知的方便方式來進行。可以透過噴霧式吸入、注射、攝食、輸血、植入或移植等方法來將本發明的細胞施用於受試者。本文所述的組合物可透過靜脈內(i.v.)注射、腹腔內、經動脈、皮下、皮內、腫瘤內、結節內、髓內、肌肉內的方式給予患者。在其他情況下，本發明的細胞係直接注射到受試者的發炎部位、受試者的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。

應當理解的是，可用於本發明的方法和組合物不限於實施例中所述的特定配方。以下實施例，係用以向本領域普通技術人員提供關於如何製備和使用本發明的細胞、擴增和培養方法以及治療方法的完整揭露和說明，而非對本發明的範圍做出限制。

除非另有說明，否則在實踐本發明時，可採用熟習此項技術者所習知的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的習知技術。前述技術在文獻中有充分的解釋，例如「分子轉殖：實驗手冊」，第四版(Sambrook，2012)、「寡核苷酸合成」(Gait，1984)、「動物細胞培養」(Freshney，2010)、「酵素學方法」、「實驗免疫學手冊」(Weir，1997)、「用於哺乳動物細胞的基因轉移載體」(Miller和Calos，1987)、「分子生物學短方法(Short Protocols in Molecular Biology)」(Ausubel，2002)、「聚合酶連鎖反應：原理、應用和故障排除」(Babar，2011)、「免疫學現行方法」(Coligan，2002)。這些技術可用來產生本發明的多核苷酸和多肽，因此，可以在製備和實施本發明時參考前述技術。特別適用於特定實施例的技術將在以下說明中討論。

本文提及或引用的文章、專利和專利申請案的內容以及所有其他文獻和電子可用資訊在此通過引用而將其整體併入本文，其程度如同每個單獨的公開文獻被具體地且單獨地指明為以引用方式納入本文。申請人保留將任何此類文章、專利、專利申請或其他實體文獻和電子文獻中任何和所有材料與資訊實際併入本申請的權利。

雖然已經參考本發明的特定實施例描述了本發明，但是本領域技術人員應該理解，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以進行各種改變並且可以替換等同物。對於本領域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本文公開的實施例的範圍的情況下，可以使用合適的等同物進行本文所述方法的其他合適的修改和改變。另外，可以進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、過程、過程步驟或步驟適用本發明的目的、精神和範圍。所有這些修改都包括在權利要求的範圍內。現在已經詳細描述了某些實施例，透過參考以下實驗例將更清楚地理解前述實施例，前述實施例僅用以說明，而非對本發明的限制。

實驗例

以下實施例用於描述本發明，這些實施例僅用於說明而非對本發明造成限制，本發明涵蓋由本文提供的教示以及顯而易見的所有變化。

材料和方法：

實驗中使用的材料和方法如下所述。

初代人類淋巴細胞。初代人類CD4和CD8 T細胞係從健康志願捐贈者經過白血球分離術後所分離出來的，其係使用RosetteSep試劑盒(Stem Cell Technologies，Vancouver BC，Canada)來進行負向選擇。所有樣本均在大學機構審查委員會批准的方案下進行收集，並且都以書面方式從每個捐贈者獲得其知情同意。初代淋巴細胞係用抗CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies，Grand Island，NY)來刺激。

CRISPR的設計和構築。基於文獻(Cong et al.(2013)Science 339,819-823；Slaymaker et al.(2016)Science 351,84-88)所述的方法，Cas9的去氧核醣核酸係透過PCR合成並轉殖到RNA體外轉錄(IVT)載體pD-A vector7中。以基於網路的CRISPR演算法(crisprdotmitdotedu and chopchopdotrcdotfasdotharvarddotedu)來選擇gRNA。五個基因座(TRAC、TRBC、B2M、CIITA及PD-1)中選擇具有較高分數的gRNA序列(圖26和圖27)。sgRNA的設計方式如文獻(Ren et al.(2016)Clinical Cancer Research,clincanres-1300)中所載，以合成gBloclk。將所選擇的sgRNA進行PCR擴增，用XhoI/EcoRI消化並轉殖到pD-A IVT載體中。如Ren等人於論文(2016，Clinical Cancer Research，clincanres-1300)中所述的方法來產生並儲存體外轉錄的Cas9 mRNA和sgRNA。

四環素((Tet)-On誘導型基因表現系統的構築。首先用EcoRI和BstZ17I消化pRetroX-TetOne 3G載體(Takara Bio Inc.)。EGFP或NY-ESO-1 TCR(8F TCR)是從pGEM-EGFP和pTRP.8F TCR用PCR擴增的，分別在5'端和3'端引入EcoRI和BstZ17I，並轉殖到pRetroX-TetOne 3G載體中，以產生pRetroX-TetONE.EGFP和pRetroX-TetONE.8F TCR(圖7)。

流式細胞分析。其係使用以下具有特定的專一性的單株抗體和試劑，與適當的同型對照組。來自BD Biosciences(San Jose，CA)：APC綴合的抗CD3(555335)、FITC-抗-CD8(555366)、PE-抗-CD8(555635)、PE-抗-CD107a(555801)和PE-抗-β-2微球蛋白(551337)、FITC-抗-HLA-1(555552)、APC-抗-PD-1(114102)、(Pasadena，CA)：PE-抗-Vb13.1(來自Beckman Coulter)。數據在Fortessa(BD Biosciences，San Jose，CA)上獲得，數據用FlowJo 7.6.1版(Tree Star，Inc.，Ashland，OR)分析。

富集CD3neg T細胞。用Auto MACS緩衝液所清洗的細胞，係與CD3微珠(Miltenyi Biotec，130-050-101，Auburn，CA)在4℃孵育30分鐘。清洗兩次後，使細胞通過LD管柱(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，收集通過的部分，以供進一步實驗。

ELISA檢測。清洗目標細胞，並以1x10⁶個細胞/毫升的濃度將其懸浮於R10培養基中。接下來，每種目標細胞類型係以100μl進行三重複，各自加到96孔圓底盤(Corning)中。清洗作用性T細胞，並以1x10⁶個細胞/毫升的濃度重新懸浮於R10培養基中，然後將100μl的T細胞與指定孔中的目標細胞進行混合。將96孔盤在37℃下孵育18至24小時。孵育後，收取上清液，並進行ELISA檢測(eBioscience)。

CD107a染色。將細胞以1：1的E：T(1x10⁵作用細胞：1x10⁵個目標細胞)比例放在160μl的R10培養基中並將其接種在96孔盤中。接下來，加入20μl以藻紅素所標記的抗CD107a抗體，並將96孔盤在37℃下孵育1小時，然後加入Golgi Stop(於3ml R10培養基中具有2μl Golgi Stop，20μl/孔；BD Biosciences，51-2092KZ)後，再孵育2.5小時。然後，加入5μl的FITC-抗-CD8和5μl的APC-抗-CD3，在37℃下孵育30分鐘。孵育後，用FACS緩衝液清洗樣品，並透過流式細胞儀進行分析。

基於螢光素酶的CTL檢測。產生Nalm6-CBG腫瘤細胞，並將其用於基於螢光素酶的CTL檢測的修改版本8。簡言之，將叩頭蟲綠螢光素酶(click beetle green luciferase，CBG)-T2A-EGFP以慢病毒轉導到Nalm6腫瘤細胞中，並分選出有GFP表現的細胞。將所得到的Nalm6-CBG細胞以1 x 10⁵個細胞/毫升的濃度重新懸浮於R10培養基中，並與不同比例的T細胞(例如，30：1、15：1等)在37℃下孵育至隔天。然後，將100μl的混合物轉移到96孔白色照度計盤上。接下來，添加100μl基質，並立即檢測螢光。檢測結果為殺傷百分比，其係以具有腫瘤細胞但沒有T細胞的孔中的螢光素酶活性作為基準(殺傷%=100-((作用細胞和目標細胞共培養的孔中所測得的RLU)/(目標細胞的孔中所測得的RLU)100))。

實驗結果如下所述。

實驗例1：高基因破壞效率的sgRNA被選擇用於TRAC、TRBC、B2M、CIITA和PD-1

在經刺激的T細胞中檢測24個T細胞受體β恆定區(TRBC)、24個第II型主要組織相容性複合體反式活化蛋白(CIITA)、24個程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)、12個β-2-微球蛋白(B2m)及13個T細胞受體α恆定區(TRAC)的gRNA(圖26至圖27)，以篩選出用於高效率基因破壞的gRNA(圖1、圖2A至圖2B、圖3、圖4A至圖4C及圖5A至圖5C)。選出具有高基因破壞效率的gRNA，並將其轉殖到pD-A IVT載體中(圖6A至圖6B及圖28)。

實驗例2：使用四環素(Tet)-On系統來誘發轉基因TCR的表現

四環素(Tet)-On反轉錄病毒載體系統係用來構築EGFP(pRetoX-TetONE.EGFP)和NY-ESO-1 TCR(pRetoX-TetONE.8.TCR)(圖7)。首先，透過將Tet-On EGFP轉導到GP2-293細胞株中，以測試該系統。如果培養物中不存在去氧羥四環素(Dox)，則GFP沒有表現(圖8)。在添加去氧羥四環素(Dox)後，可以誘發EGFP，並且EGFP的表現與所添加的去氧羥四環素(Dox)劑量呈正相關(圖8和圖9)。接下來，用Tet-On EGFP來轉導T細胞(圖10)。與GP2-293所轉導的細胞類似，當培養物中不存在去氧羥四環素(Dox)時，GFP沒有表現(圖8)。在添加去氧羥四環素(Dox)後，可以誘發EGFP，並且EGFP的表現與所添加的去氧羥四環素(Dox)劑量呈正相關。當用Tet-On NY-ESO-1 TCR來轉導T細胞時，如果培養物中不存在去氧羥四環素(Dox)，則僅會檢測到背景TCR(內源TCR，4至5%)(圖11)。然而，在加入去氧羥四環素(Dox)後，可以誘使TCR的表現增加，並且TCR的表現與所添加的去氧羥四環素(Dox)劑量呈正相關。一旦去氧羥四環素(Dox)被撤除，所誘發的TCR表現會降低，並且在添加去氧羥四環素(Dox)6天後，所誘發的TCR表現會降低至背景水平(圖12)。在不洗掉添加的去氧羥四環素(Dox)時，TCR的誘發表現可持續更長時間，尤其是當使用高濃度的去氧羥四環素(Dox)時(圖13)。如果連續供應去氧羥四環素(Dox)，即使在低濃度下也可以維持誘發的TCR有長期表現(圖14)。此外，在以去氧羥四環素(Dox)進行誘發時，Tet-On NY-ESO-1 TCR轉導T細胞的抗腫瘤活性，例如細胞激素產生(IL-2及IFN-γ，圖15)和裂解活性(圖16)，在去氧羥四環素(Dox)的誘發和腫瘤刺激下，也與所添加的去氧羥四環素(Dox)劑量呈正相關。

實驗例3：使用四環素(Tet)-On系統產生具有可誘導轉基因TCR表現的CD3-T細胞

產生通用型TCR轉導T細胞的方法如圖17所示。同步產生具有CRISPR/CAS9雙重(TRAC和TRBC)或四重(TRAC、TRBC、B2M和CIITA)基因破壞的8F NY-ESO-1 TCR慢病毒轉導T細胞，以作為T細胞效力的對照組。如圖18所示，當pRetoX-TetONE.8.TCR(RVV TETONE)轉導T細胞以100ng/ml的Dox誘導24小時時後，會檢測到54.5%的轉基因TCR，而pTRP.8F.TCR慢病毒轉導T細胞為82.5%的vb8。在pRetoX-TetONE.8.TCR轉導的T細胞用CAS9/gRNA電穿孔以進行雙重(KO2)或四重(KO4)基因破壞後，以100ng/ml的Dox誘導24小時後，可檢測到45.1%和43.3%的vb8+/Cd3+ T細胞。與未經CRISPR編輯且經Dox誘導的T細胞相比，其為46.2%(圖19)。透過流式細胞分析來檢測CD3和B2M，以驗證其基因破壞效率。對於雙重基因消除和四重基因破壞的結果，都證實有高效率的基因破壞，如TCR/CD3或B2M都顯示基因剔除超過70%(圖20)。

實驗例4：產生TCR轉導的T細胞，其不含內源性TCR相關的CD3表現

為了產生不含內源TCR相關CD3表現的通用型TCR T細胞，在刺激後第8天使用Miltenyi CD3 MicroBeads進行CD3負向選擇，從經pRetoX-TetONE.8.TCR(8F RVV)轉導的T細胞收取CD3陽性和CD3陰性T細胞，並以電穿孔來進行CRISPR雙重剔除(KO2)或四重剔除(KO4)。如圖21所示，可以富集出CD3陰性T細胞。對分離出的T細胞添加去氧羥四環素(分離後)以誘發轉導TCR的表現，CD3的表現會被誘發出來(圖21、圖22和圖23)。

實驗例5：通用型TCR T細胞增強的功能

測試以四環素(Tet)-On系統、CRISPR基因編輯和CD3剔除所產生的通用型TCR T細胞其抗腫瘤活性。使用常規NY-ESO-1 TCR慢病毒轉導/CRISPR基因編輯的T細胞和四環素(Tet)-On系統轉導CRISPR基因編輯(無CD3剔除)，儀的NY-ESO-1四聚體結合試驗的結果經過流式細胞分析顯示，通用型TCR T細胞(CD3-TETONE.8F.KO2和CD3-TETONE.8F.KO4)的四聚體染色結果有顯著增加，並且CD4 T細胞(CD8陰性群體)的四聚體結合結果有顯著增加(圖24A至圖24C)。用NY-ESO-1/HLA-A2陽性腫瘤株A549-ESO和Nalm6-ESO來刺激T細胞4小時後，與常規NY-ESO-1 TCR慢病毒轉導/CRISPR基因編輯的T細胞和四環素(Tet)-On系統轉導CRISPR基因編輯(無CD3剔除)的T細胞相比，通用型TCR T細胞(CD3-TETONE.8F.KO2和CD3- TETONE.8F.KO4)的CD107a的染色結果有顯著增加。(圖25A至圖25C)。

實驗例6：Tet-On-8FTCR轉導的T細胞在體內的功能

將500萬個A549ESO細胞皮下注射到小鼠中以建立異種移植腫瘤。八天後，當腫瘤尺寸達到約100mm³時，靜脈內注射1000萬個轉導的T細胞。連續供應含有去氧羥四環素的食物，以在慢病毒Tet-On 8F和反轉錄病毒Tet-On 8F組中誘發8FTCR表現。生物發光成像結果顯示，反轉錄病毒Tet-On 8F KO和KO CD3-組的抗腫瘤活性比其他組別更高(圖29)。測徑器測量結果顯示，反轉錄病毒Tet-On 8F KO CD3-組的腫瘤控制能力最高，其次是反轉錄病毒Tet-On 8F KO組和慢病毒8F KO組(圖30)。

在接種腫瘤細胞後的第50天，從腫瘤中分離出腫瘤浸潤的白血球(TIL)。在冷凍保存之前、在第21天的血液中，和在第50天的TIL中檢查細胞中8FTCR+細胞的出現比率。在慢病毒8F和慢病毒Tet-On 8F組的血液和TIL中，其8FTCR+細胞的出現比率係被維持。反轉錄病毒Tet-On 8F組的出現比率顯著增加(No KO：從16.5%到40.6%；KO：從15.3%到37.8%；KO CD3-：從15%到70.1%，圖31)。不受任何理論的約束，這顯示相較於其他T細胞，在受到腫瘤刺激時，反轉錄病毒Tet-On 8F轉導T細胞較容易有增殖反應。

為了研究TIL是否具有專一性活性(包括CD107a、INFγ和TNFα的表現)，係將TIL與A549或A549ESO進行共培養。A549細胞未引起反應。反轉錄病毒Tet-On 8F KO CD3-組和反轉錄病毒Tet-On 8F KO組顯示與A549ESO共培養時，所誘發的CD107a、INFγ和TNFα最多(圖32A至圖32F)，顯示TIL對腫瘤細胞具有專一性活性。

實驗例7：透過與PD1-CD28或TGFbR-IL12轉換受體組合，以改善Tet-On-8FTCR的功能

使用8FTCR(慢病毒)、TetON-8FTCR(慢病毒)或TetON-8F(反轉錄病毒)以及PD1-CD28或TGFbR-IL12轉換受體(反轉錄病毒)來共轉導T細胞。TetOn-8F組中，其內源TCR被剔除(在圖33和圖34中用「CD3-」標記)。Vβ8和PD1的表現如圖33所示。將T細胞與下列腫瘤細胞株進行共培養：A549細胞株(不表現NY-ESO-1並用作陰性對照組)；A549ESO株(強制表現NY-ESO-1)；A549ESO_PDL1株(強制表現NY-ESO-1和PD-L1)。將外源TGFβ加入有標記樣本的培養基中，以檢測它們是否可以活化TGFbR-IL12轉換受體。

當與A549ESO_PDL1細胞共培養時，與用A549細胞共培養相比，單獨表現8FTCR的T細胞顯示出會產生IL-2的細胞的出現比率有降低(圖34)。與A549細胞相比，共表現8FTCR和PD1-CD28轉換受體的T細胞與A549ESO_PDL1細胞共培養時，IL-2的產生頻率有增加(圖34)，其係證實在腫瘤細胞中表現的PD-L1配體可活化T細胞中的PD1-CD28轉換受體。

當培養基中存在外源TGFβ時，單獨表現8FTCR的T細胞顯示會產生INFγ的細胞的出現比率有降低(圖35)。共表現8FTCR和TGFbR-IL12轉換受體的T細胞顯示INFγ的產生頻率增加(圖35)，其係證實TGFβ可以活化T細胞中的TGFbR-IL12轉換受體。

將500萬個A549ESO細胞皮下注射到小鼠中以建立異種移植腫瘤。8天後，當腫瘤尺寸達到約100mm³時，靜脈內注射800萬個反轉錄病毒TetOn-8FTCR+ T細胞。連續供應含有去氧羥四環素的食物，以誘發8FTCR表現。生物發光成像結果顯示，8FTCR+PD1-CD28和8FTCR+TGFbR-IL12轉換受體組與僅有8FTCR的組別相比，具有更高的抗腫瘤活性(圖36A和圖36B)。

其他實施例

本文中對變量的任何定義中的元件列表的敘述包括將該變量定義為所列元件的任何單個元件或組合(或子組合)。本文對實施例的描述包括作為任何單個實施例的該實施例或者與任何其他實施例或其部分的組合。

各專利、專利申請案、以及本文所引用的公開文獻，其全部內容皆藉由引用而納為本文揭露之一部。本發明雖已參照前述實施例方式進行揭露，但對於其他本發明所屬技術領域具有通常知識者來說，仍可設計出未脫離本發明精神與範疇的其他實施例與變形，至為灼然。後附之申請專利範圍之解釋應包含所有此種實施例及其等效變更。

<110> 賓夕法尼亞大學董事會趙陽兵劉曉軍潘偉

<120> 將基因編輯用於產生通用型T細胞受體重導向的T細胞以進行輸入免疫治療的用途

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 52

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 53

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 54

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 55

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 56

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 57

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 58

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 59

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 60

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 61

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 62

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 63

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 64

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 65

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 66

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 67

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 68

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 69

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 70

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 71

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 72

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 73

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 74

<210> 75

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 75

<210> 76

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 76

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 77

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 78

<210> 79

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 79

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 80

<210> 81

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 81

<210> 82

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 82

<210> 83

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 83

<210> 84

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 84

<210> 85

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 85

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 86

<210> 87

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 87

<210> 88

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 88

<210> 89

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 89

<210> 90

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 90

<210> 91

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 91

<210> 92

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 92

<210> 93

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 93

<210> 94

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 94

<210> 95

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 95

<210> 96

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 96

<210> 97

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> gRNA

<400> 97

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> NY-ESO表位

<400> 98

<210> 99

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<220>

<221> misc特徵

<222> (1)..(5)

<223> 可以重複n次，其中n是至少為1的整數

<400> 99

<210> 100

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<220>

<221> misc特徵

<222> (1)..(4)

<223> 可以重複n次，其中n是至少為1的整數

<400> 100

<210> 101

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<220>

<221> misc特徵

<222> (1)..(5)

<223> 可以重複n次，其中n是至少為1的整數

<400> 101

<210> 102

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 102

<210> 103

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 103

<210> 104

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 104

<210> 105

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 105

<210> 106

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 106

<210> 107

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 107

<210> 108

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 108

<210> 109

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 109

<210> 110

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 110

<210> 111

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子

<400> 111

<210> 112

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 112

<210> 113

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 113

<210> 114

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 114

<210> 115

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 115

<210> 116

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 116

<210> 117

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 117

<210> 118

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 118

<210> 119

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 119

<210> 120

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 120

<210> 121

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 121

<210> 122

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 122

<210> 123

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 鉸鏈

<400> 123

<210> 124

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TGFBR-IL12RB1受體

<400> 124

<210> 125

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TGFBR-IL12RB1受體

<400> 125

<210> 126

<211> 403

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> TGFBR-IL12RB2受體

<400> 126

<210> 127

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TGFBR-IL12RB2受體

<400> 127

<210> 128

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD1-CTM-CD28受體

<400> 128

<210> 129

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD1-CTM-CD28受體

<400> 129

<210> 130

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD1-PTM-CD28受體

<400> 130

<210> 131

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD1-PTM-CD28受體

<400> 131

<210> 132

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD1A132L-PTM-CD28受體

<400> 132

<210> 133

<211> 693

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PD1A132L-PTM-CD28受體

<400> 133

<210> 134

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> furin切割位

<220>

<221> misc特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸

<400> 134

<210> 135

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> furin切割位

<220>

<221> misc特徵

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸

<400> 135

<210> 136

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> furin切割位

<220>

<221> misc特徵

<222> (1)..(1)

<223> Xaa是K或R

<220>

<221> misc特徵

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸

<220>

<221> misc特徵

<222> (4)..(4)

<223> Xaa是K或R

<400> 136

<210> 137

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> furin切割位

<220>

<221> misc特徵

<222> (2)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的胺基酸

<400> 137

<210> 138

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> furin切割位

<400> 138

<210> 139

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> F-GS2-T2A連接子

<400> 139

<210> 140

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F-GS2-T2A連接子

<400> 140

Claims

一種經基因修飾的免疫細胞，包含有一外源核酸，該外源核酸編碼有一外源受體，其中該外源受體是選擇性地結合至一腫瘤所表現的腫瘤抗原，該外源核酸更包含一誘導型基因表現系統，其中當向該細胞施用一誘導劑時，該基因表現系統會被誘導，並且該外源受體係表現於該免疫細胞的表面。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該誘導型基因表現系統包含：(a)一第一核酸，其包含一組成型啟動子，該組成型啟動子係可操作地連接至編碼有一反式活化蛋白(transactivator protein)的核酸序列；以及(b)一第二核酸，其包含一誘導型啟動子，該誘導型啟動子係可操作地連接至編碼有該外源受體的核酸序列，而該第二核酸與該第一核酸是反向的。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該反式活化蛋白是反向Tet抑制蛋白(reverse Tet repressor，rTetR)。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該反式活化蛋白是反向四環素調控反式活化蛋白(reverse tetracycline-controlled transactivator protein，rtTA)。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該反式活化蛋白是Tet-On 3G反式活化蛋白。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該誘導型啟動子包含一Tet操作子序列。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該誘導型啟動子包含一或多個重複的該Tet操作子序列。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該誘導型啟動子是TRE3GS啟動子。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該組成型啟動子係驅動該反式活化蛋白的持續性表現。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該組成型啟動子是人類組成型啟動子。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該組成型啟動子是人類磷酸甘油酯激酶1(phosphoglycerate kinase 1，PGK1)啟動子。
如申請專利範圍第2項所述的免疫細胞，其中該組成型啟動子是人類延長因子1α(elongation factor 1 alpha，EF1α)啟動子。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該誘導劑是一四環素或其衍生物。
如申請專利範圍第13項所述的免疫細胞，其中該四環素的衍生物是去氧羥四環素。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該誘導型基因表現系統編碼一反向Tet反式活化(reverse Tet transactivator，rtTA)融合蛋白並包含至少一個啟動子，該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該外源受體的表現與該誘導劑的劑量呈現依賴性。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中撤除(withdrawal)該誘導劑會使該外源受體表現量的下降。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該外源受體是一T細胞受體(T cell receptor，TCR)。
如申請專利範圍第18項所述的免疫細胞，其中該外源T細胞受體是選自於野生型T細胞受體，高親和力T細胞受體及嵌合T細胞受體所組成的群組。
如申請專利範圍第19項所述的免疫細胞，其中該外源T細胞受體包含至少一個雙硫鍵。
如申請專利範圍第18項所述的免疫細胞，其中該外源T細胞受體包含一TCRα鏈(TCR alpha chain)及一TCRβ鏈(TCR beta chain)。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該外源受體是一嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)。
如申請專利範圍第22項所述的免疫細胞，其中該嵌合抗原受體包含一抗原結合結構域、一跨膜結構域及一細胞內結構域。
如申請專利範圍第23項所述的免疫細胞，其中該抗原結合結構域是選自於抗體、scFv及Fab所組成的群組。
如申請專利範圍第23項所述的免疫細胞，更包含一鉸鏈結構域(hinge domain)。
如申請專利範圍第25項所述的免疫細胞，其中該鉸鏈結構域是選自於抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區(hinge region)、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人工鉸鏈結構域、包含CD8核酸序列的鉸鏈、或其任何組合所組成的群組。
如申請專利範圍第23項所述的免疫細胞，其中該跨膜結構域是選自於人工疏水序列和I型跨膜蛋白的跨膜結構域、T細胞受體的α鏈(alpha chain)、β鏈(beta chain)或ζ鏈(zeta chain)、CD28、CD3ε(CD3 epsilon)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154所組成的群組。
如申請專利範圍第23項所述的免疫細胞，其中該細胞內結構域包含至少一個共刺激結構域，該至少一個共刺激結構域是選自TNFR超家族蛋白中的共刺激結構域所組成的群組：CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-1、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS、NKG2C及B7-H3。
如申請專利範圍第23項所述的免疫細胞，其中該細胞內結構域包含選自於下列群組的細胞內結構域：人類CD3ζ鏈的細胞質訊息傳導結構域(cytoplasmic signaling domains of a human CD3 zeta chain)、FcyRIII、FcsRI、Fc受體的細胞質尾區(cytoplasmic tail)、攜帶免疫受體酪胺酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的細胞質受體、TCRζ(TCR zeta)，FcRγ(FcR gamma)、FcRβ(FcR beta)、CD3γ(CD3 gamma)、CD3δ(CD3 delta)、CD3ε(CD3 epsilon)、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該細胞是經基因修飾的T細胞。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該細胞是同種異體細胞。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該細胞是自體細胞。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該細胞是人類細胞。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，其中該經修飾的免疫細胞更包含在一個或多個基因座中的一插入及/或缺失，該一個或多個基因座編碼一內源免疫蛋白，其中該插入及/或缺失能夠下調該內源免疫蛋白的表現。
如申請專利範圍第34項所述的免疫細胞，其中該插入及/或缺失中的至少一個是基因編輯的結果。
如申請專利範圍第34項所述的免疫細胞，其中該基因編輯是CRISPR/Cas9基因編輯。
如申請專利範圍第34項所述的免疫細胞，其中該內源免疫蛋白的表現在該腫瘤存在時會被上調或下調。
如申請專利範圍第34項所述的免疫細胞，其中該內源免疫蛋白是選自於TRAC、TRBC、B2M及CIIT所組成的群組。
如申請專利範圍第34項所述的免疫細胞，其中該內源免疫蛋白是一免疫查核點蛋白。
如申請專利範圍第39項所述的免疫細胞，其中該免疫查核點蛋白是PD1或PDL1。
如申請專利範圍第1項所述的免疫細胞，更包含一轉換受體(switch receptor)。
如申請專利範圍第41項所述的免疫細胞，其中該轉換受體是選自於PD1-CTM-CD28、PD1-PTM-CD28以及PD1 ^A132L-PTM-CD28所組成的群組。
如申請專利範圍第41項所述的免疫細胞，其中該轉換受體是TGFβR-IL12Rβ1或TGFβR-IL12Rβ2。
一種產生經基因修飾的免疫細胞的方法，該方法包括將一核酸引入免疫細胞中，該核酸包含一外源核酸，該外源核酸編碼有一外源受體，該外源受體的表現係在一誘導型表現系統的控制下，其中該外源受體選擇性地結合至表現於一腫瘤上的一腫瘤抗原，其中當向該細胞施用一誘導劑時，該基因表現系統會被誘導，並在該免疫細胞表面表現該外源受體。
如申請專利範圍第44項所述的方法，其中該誘導型基因表現系統包含：(a)一第一核酸，包含一組成型啟動子，該組成型啟動子係可操作地連接至編碼有一反式活化蛋白(transactivator protein)的核酸序列；(b)一第二核酸，包含一誘導型啟動子，該誘導型啟動子係可操作地連接至編碼有該外源受體的核酸序列，該外源受體選擇性地結合至表現於該腫瘤上的該腫瘤抗原，而該第二核酸與該第一核酸是反向的。
如申請專利範圍第44項所述的方法，其中該核酸是透過一病毒轉導過程而引入的。
如申請專利範圍第46項所述的方法，其中該病毒轉導過程包含使該細胞與一病毒載體接觸，而該病毒載體包含該核酸。
如申請專利範圍第47項所述的方法，其中該病毒載體是反轉錄病毒載體。
如申請專利範圍第44項所述的方法，更包含將編碼有一轉換受體的一核酸引入該免疫細胞中，其中該核酸是透過一病毒轉導過程而引入的。
如申請專利範圍第49項所述的方法，其中該病毒轉導過程包含使該細胞與一病毒載體接觸，該病毒載體包含編碼有該轉換受體的該核酸。
如申請專利範圍第44項所述的方法，該方法更包含在該免疫細胞中引入一或多種多肽及/或核酸，該一或多種多肽及/或核酸能夠下調一或多種內源免疫蛋白的表現。
如申請專利範圍第51項所述的方法，其中該一或多種能夠下調該一或多種內源免疫蛋白表現的多肽及/或核酸包含一CRISPR系統。
如申請專利範圍第52項所述的方法，其中該CRISPR系統包含一CRISPR相關(CRISPR-associated，Cas)核酸酶和一引導RNA(guide RNA)。
如申請專利範圍第53項所述的方法，其中該引導RNA包含一引導序列，該引導序列與一內源基因的一目標序列互補。
如申請專利範圍第53項所述的方法，其中該Cas核酸酶及該引導RNA包含一核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)複合體。
如申請專利範圍第51項所述的方法，其中該內源免疫蛋白的表現在該腫瘤存在時會被上調或下調。
如申請專利範圍第51項所述的方法，其中該內源免疫蛋白是選自於TRAC、TRBC、B2M及CIIT所組成的群組。
如申請專利範圍第54項所述的方法，其中該目標序列係位在TRAC基因內，且該引導RNA包含SEQ ID NOs：85~97中所示的任一個核酸序列。
如申請專利範圍第54項所述的方法，其中該目標序列係位在TRBC基因內，且該引導RNA包含SEQ ID NOs：1~24中所示的任一個核酸序列。
如申請專利範圍第54項所述的方法，其中該目標序列係位在B2M基因內，且該引導RNA包含SEQ ID NOs：73~84中所示的任一個核酸序列。
如申請專利範圍第54項所述的方法，其中該目標序列係位在CIITA基因內，且該引導RNA包含SEQ ID NOs：25~48中所示的任一個核酸序列。
如申請專利範圍第51項所述的方法，其中該內源免疫蛋白是一免疫查核點蛋白。
如申請專利範圍第62項所述的方法，其中該免疫查核點蛋白是PD1或PDL1。
如申請專利範圍第63項所述的方法，其中該目標序列位在PD1基因內，且其中該引導RNA包含SEQ ID NOs：49~72中所示的任一個核酸序列。
一種用於過繼細胞轉移療法(adoptive cell transfer therapy)的方法，該方法包含向有需要的一受試者施用一被修飾的免疫細胞群，該被修飾的免疫細胞群包含如申請專利範圍第1項所述的該被修飾的免疫細胞。
一種產生經修飾的T細胞群的方法，該方法包括： a)刺激一被分離的T細胞群，從而產生一被刺激的T細胞群；b)向該被刺激的T細胞群中引入包含有一誘導型TCR表現系統的一核酸，從而產生一經修飾的T細胞群；c)向該被修飾的T細胞群中引入一或多種多肽及/或核酸，該一或多種多肽及/或核酸能夠下調所選擇的內源免疫蛋白表現，從而產生一被基因編輯所修飾的T細胞群；d)從該經基因編輯所修飾的T細胞群中剔除CD3+ T細胞，並分離出一基因編輯所修飾的CD3陰性(CD3-)T細胞群；以及e)使該基因編輯所修飾的CD3陰性(CD3-)T細胞群與一誘導劑接觸，以誘發外源TCR的表現，從而產生一經修飾的T細胞群。
如申請專利範圍第66項所述的方法，其中刺激該被分離的T細胞群包含使該被分離的T細胞群與一抗CD3抗體及/或一抗CD28抗體接觸。
如申請專利範圍第66項所述的方法，其中該抗CD3抗體及/或該抗CD28抗體係塗佈在一磁珠上。
如申請專利範圍第66項所述的方法，其中從該被基因編輯所修飾的T細胞群中剔除CD3+ T細胞包含去除該抗CD3抗體及/或該抗CD28抗體。
如申請專利範圍第66項所述的方法，其中從該被基因編輯所修飾的T細胞群中剔除CD3+ T細胞包含去除該磁珠，該磁珠塗佈有該抗CD3抗體及/或該抗CD28抗體。
如申請專利範圍第66項所述的方法，更包含向該被刺激的T細胞群中引入編碼有轉換受體的核酸。
一種用於產生經基因修飾的T細胞群的方法，該方法包括：用CD3及/或CD28來刺激一群T細胞，用一Tet-On基因誘導型基因表現系統轉導該等T細胞，用於TCR或CAR表現，且該Tet-On誘導型基因表現系統包含一反向Tet反式活化(reverse Tet transactivator，rtTA)融合蛋白和至少一個啟動子，而該啟動子係融合至至少一個Tet-操作子序列的下游，以電穿孔方式將Cas9和引導RNA引入該等T細胞中，剔除CD3 ⁺ T細胞，收取CD3 ^- T細胞，以及向該等T細胞施用去氧羥四環素，以誘發TCR或CAR表現。
一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含如申請專利範圍第1項所述的經修飾的免疫細胞和醫藥上可接受的載體。
一種對有需要的一受試者治療其腫瘤的方法，該方法包括向該受試者施用如申請專利範圍第73項所述的醫藥組合物。
如申請專利範圍第74項所述的方法，更包含向該受試者施用一誘導劑，從而誘發該受試者中外源受體的表現。
如申請專利範圍第75項所述的方法，其中在將該免疫細胞施用於該受試者之前，使該免疫細胞與該誘導劑接觸。
一種對有需要的一受試者預防其T細胞耗竭的方法，該方法包括向該受試者施用如申請專利範圍第73項所述的醫藥組合物；以及一誘導劑，該誘導劑會誘發該受試者在腫瘤部位表現一外源受體。
如申請專利範圍第77項所述的方法，其中在將該免疫細胞施用於該受試者之前，將該免疫細胞與該誘導劑接觸。
如申請專利範圍第77項所述的方法，更包含一步驟：將該誘導劑連續施用於該受試者，以誘發該受試者在其體內的腫瘤部位表現該外源性受體。
如申請專利範圍第77項所述的方法，更包含一步驟：不予(withholding)該受試者施用該誘導劑，以減少該受試者體內該外源受體的表現，從而防止T細胞耗竭。
如申請專利範圍第77項所述的方法，更包含一步驟：將該誘導劑再施用於該受試者，以再次誘發該受試者體內該外源受體的表現。
如申請專利範圍第77項所述的方法，其中該誘導劑是四環素、去氧羥四環素或其類似物。