TW201823448A - 高黏性之無菌的三維培養用培養基組成物的製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供無菌液狀培養基組成物的製造方法，其係包含下列製程：(I)將含有特定化合物及增稠性多醣類的第1液體加以過濾滅菌，獲得無菌的第1液體；(II)將含有連結物質及增稠性多醣類的第2液體加以過濾滅菌，獲得無菌的第2液體；及(III)將在製程(I)所得的無菌的第1液體與在製程(II)所得的無菌的第2液體混合，形成以均勻分散的狀態含有前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體及前述增稠性多醣類之無菌液狀培養基組成物。

Description

高黏性之無菌的三維培養用培養基組成物的製造方法

本發明是關於使用過濾滅菌而製造黏性高的無菌的三維培養用培養基組成物的方法。

以脫醯基化結冷膠(DAG)等具有陰離子性官能基的高分子化合物為代表的特定化合物，係經由2價金屬陽離子(例如鈣離子)等進行凝聚，在水中形成分散的三維網格(無定型的構造體)。在含有此三維網格液體培養基中培養細胞時，此三維網格表現使細胞浮遊的承載物的作用，培養基中的細胞被此三維網格所捕捉而不沉澱之故，不需要振盪、旋轉操作等即可將細胞以均勻分散的懸浮狀態進行培養(懸浮靜置培養)。又，實質上不需要提高液體培養基的黏度即可形成上述的三維網格之故，含有該三維網格之培養基組成物，在繼代等的操作性也優異(專利文獻1及2)。此可以懸浮靜置培養的培養基組成物，具有促進各種細胞的增殖活性等各式各樣的優異特性，對再生醫療、蛋白質等的大量生產等廣大的技術領域的應用備受 期待。

以下，將具有陰離子性官能基的高分子化合物等上述特定的化合物也稱為「特定化合物」，將該特定化合物互相鍵結的2價金屬陽離子等物質也稱為「連結物質」。

另一方面，由於甲基纖維素其水溶液有高黏性及對細胞不表現毒性之故，做為細胞培養用的培養基的添加劑而廣泛被使用。在非專利文獻1中，揭示在使用含有脫醯基化結冷膠的培養基組成物的人類多功性幹細胞的懸浮培養中，由於在該培養基組成物添加甲基纖維素，細胞的成長速度提高。在非專利文獻2中，記載在含有甲基纖維素的液體培養基中使人類多功性幹細胞分化的方法。使用含有甲基纖維素液體培養基時，在iPS細胞及ES細胞等多功性幹細胞的細胞塊(球)的懸浮培養中，容易抑制懸浮細胞塊的移動及黏著而防止細胞塊互相間的黏著融合。但是，在該等文獻中，只表示甲基纖維素的濃度而已，對於培養基添加甲基纖維素的步驟、或含有甲基纖維素之培養基的滅菌方法沒有任何記載。HSC001(R&D Systems公司)是市售的含有甲基纖維素的培養基，將3%(w/v)的甲基纖維素溶解於IMDM培養基做為儲備原液販賣。在HSC001的調製時，含有甲基纖維素的溶液的滅菌是以高壓蒸氣滅菌(高壓釜)實施。由於HSC001是非常黏稠的液體，要與其他的液體培養基混合非常繁雜。

[先行技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2014/017513號

[專利文獻2]美國專利申請公開第2014/0106348 A1號說明書

[非專利文獻]

[非專利文獻1]Stem Cell Reports, vol. 2, pages 734-745, 2014

[非專利文獻2]Molecular and Cellular Biology, vol. 13, no. 1, pages 473-486, 1993

如上所述，在非專利文獻1揭示的，含有脫醯基化結冷膠及甲基纖維素的懸浮培養用液狀培養基組成物是以高壓釜滅菌。高壓釜滅菌可以將混入於培養基中的細菌殺滅，但有細菌的屍骸及由菌體的破壞而遊離的內毒素殘留在培養基內的危險性。又，視培養基的成分如何，也有熱安定性低、在高壓釜中會有變性者。

本發明的目的是為了解決上述問題而提供不需要高壓釜滅菌即可調製無菌的液狀的培養基組成物的方法，其係含有將脫醯基化結冷膠等的特定化合物經由鈣離子等連結物質結合而成的構造體，以及甲基纖維素等增稠性多醣類。

過濾滅菌是周知的不需要高壓釜而將液體培養基滅菌的方法。使用過濾滅菌，可將在調製過程中將混入於液體培養基中的細菌，不破壞菌體而濾去，所以可將由菌體的破壞所遊離的內毒素的混入抑制於最小限度。於是，嘗試以過濾滅菌調製含有脫醯基化結冷膠等的特定化合物經由鈣離子等的連結物質結合而成的構造體，以及甲基纖維素的無菌的培養基組成物。

前述構造體在液狀的培養基組成物中形成分散的三維網格，因此即使將含有該構造體的液狀培養基組成物直接過濾滅菌，該構造物不能通過過濾膜的孔，或者通過孔時該構造體被破壞，細胞的懸浮靜置培養變成有困難。另一方面，在專利文獻1及2所述的含有脫醯基化結冷膠的液狀培養基組成物，通常是將無菌的液體培養基或濃縮液體培養基與無菌的脫醯基化結冷膠水溶液混合而調製。於是，藉由將濃縮液體培養基及脫醯基化結冷膠及甲基纖維素的水溶液，各自分別過濾滅菌之後混合，以調製含有脫醯基化結冷膠經由鈣離子結合而成的構造體以及甲基纖維素的無菌培養基組成物。但是，在上述方法中，需將在脫醯基化結冷膠及甲基纖維素的水溶液中的甲基纖維素濃度，調整為高於培養基組成物中的最終濃度，但含有高濃度的甲基纖維素的水溶液黏性高，難於通過過濾膜。於是，為了解決此問題經過精心檢討的結果，發現在濃縮液體培養基及脫醯基化結冷膠水溶液的雙方溶解甲基 纖維素，則可迴避只在一方溶液存在甲基纖維素而黏性過度上昇，使雙方的溶液可過濾滅菌。其結果，藉由將含有甲基纖維素的濃縮液體培養基及脫醯基化結冷膠及甲基纖維素的水溶液各自分別過濾滅菌之後將2液混合，成功製造不需要高壓釜滅菌之含有脫醯基化結冷膠經由鈣離子結合而成的構造體、以及含有甲基纖維素的無菌液狀培養基組成物。

甲基纖維素粉末具有在熱水中以非溶解狀態分散在冷水中有容易溶解的物性。將甲基纖維素粉末直接添加於冷水中，則形成「團塊」，添加的量的大部分不溶解而殘留。因此，要把甲基纖維素粉末溶解於水時，一般將甲基纖維素粉末添加於熱水中，攪拌使其分散，獲得熱的甲基纖維素懸浮液，將此懸浮液在攪拌下冷卻，而將甲基纖維素溶解。但是，在培養基含有熱不安定的成分時，不能在熱的濃縮液體培養基添加甲基纖維素粉末。於是，嘗試在25至37℃程度的溫熱的濃縮液體培養基添加甲基纖維素粉末並攪拌，但甲基纖維素的一部分形成「團塊」，所以即使將懸浮甲基纖維素的濃縮液體培養基，繼續在攪拌下冷卻，甲基纖維素完全溶解需要3天左右的長期間。以此條件，雖能在濃縮液體培養基溶解甲基纖維素粉末，但將濃縮液體培養基長期間曝露於不能保證無菌的條件下，有助長混入的細菌繁殖的危險。於是，為了解決此問題而精心檢討的結果，藉由預先調製冷卻的高濃度的甲基纖維素水溶液，將此與冷卻的濃縮液體培養基混合，將所 得的混合液在冷卻條件下攪拌，而成功在濃縮液體培養基迅速溶解甲基纖維素。依據該等發現，再加檢討，而完成本發明。

本發明的主要構成如下。

[1]無菌液狀培養基組成物的製造方法，其係包含下列製程：(I)將含有下述(i)的特定化合物及增稠性多醣類的第1液體加以過濾滅菌，獲得無菌的第1液體；(II)將含有下述(ii)的連結物質及前述增稠性多醣類的第2液體加以過濾滅菌，獲得無菌的第2液體；及(III)將在製程(I)所得的無菌的第1液體與在製程(II)所得的無菌的第2液體混合，形成以均勻分散的狀態含有前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體及前述的增稠性多醣類之無菌液狀培養基組成物：(i)特定化合物，係具有陰離子性官能基的高分子化合物，可經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體，(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。

[2]如[1]所述的製造方法，更包含將含有前述(ii)的連結物質的液體與含有前述增稠性多醣類的液體混合而獲得含有前述第2液體。

[3]如[1]或[2]所述的製造方法，其中，前述液狀培養基組成物中的增稠性多醣類濃度，係對該液狀的培養基組成物賦予相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度之 濃度。

[4]如[3]所述的製造方法，其中，前述液狀的培養基組成物中的增稠性多醣類濃度，係對該液狀的培養基組成物賦予相當於0.2%(w/v)以上的甲基纖維素濃度的黏度之濃度。

[5]如[3]或[4]所述的製造方法，其中，前述第1液體及前述第2液體中的增稠性多醣類濃度，係對該液體賦予相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度之濃度。

[6]如[1]至[5]中任一項所述的製造方法，其中，前述第1液體、前述第2液體、及前述液狀的培養基組成物中的增稠性多醣類濃度實質上相同。

[7]如[1]至[6]中任一項所述的製造方法，其中，前述增稠性多醣類是甲基纖維素。

[8]如[1]至[7]中任一項所述的製造方法，其中，前述(i)的特定化合物是脫醯基化結冷膠，第1液體是含有該脫醯基化結冷膠及前述增稠性多醣類的水溶液，前述(ii)的連結物質是鈣離子及鎂離子中的一方或雙方，第2液體是含有鈣離子及鎂離子中的一方或雙方以及前述增稠性多醣類的液體培養基或該液體培養基的濃縮液。

[9]如[1]至[8]中任一項所述的製造方法，其中，過濾滅菌所使用的過濾膜的孔徑是0.2至0.22μm。

[10]如[1]至[9]中任一項所述的製造方法，其中，不含高壓蒸氣滅菌製程。

依據本發明，不需要高壓釜滅菌即可調製無菌的液狀培養基組成物，其係含有醯基化結冷膠等特定化合物經由鈣離子等連結物質結合而成的構造體、以及甲基纖維素等增稠性多醣類。高壓釜滅菌有細菌的屍骸或由菌體的破壞而遊離的內毒素殘留在培養基內的危險性，但由本發明則可以減低此危險性。

又，依據本發明，可在維持低溫條件下，迅速在液體培養基中溶解甲基纖維素，所以在調製培養基組成物的過程中，可減低熱不安定的成分失去活性或在培養基中混入的細菌的繁殖等危險性。

本發明的製造方法，是將含有下述(i)的特定化合物及增稠性多醣類的無菌的第1液體，與含有下述(ii)的連結物質及前述增稠性多醣類的無菌的第2液體混合，而製造無菌的液狀培養基組成物的方法。

(i)特定化合物，係具有陰離子性官能基的高分子化合物，可經由2價金屬陽離子結合而形成使細胞或組織懸浮的構造體，(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。

本發明的製造方法的特徵是將無菌的第1液體及無菌的第2液體分別過濾滅菌進行調製。由於過濾滅菌的使用，不需要高壓釜滅菌，而可迴避由高壓釜滅菌 引起的細菌的屍骸及由菌體的破壞而遊離的內毒素殘留在培養基內的危險性。

又，本發明的製造方法的特徵是第1液體及第2液體雙方都含有增稠性多醣類。藉由在第1液體及第2液體雙方溶解增稠性多醣類，可迴避增稠性多醣類只存在於一方溶液而使其黏性過度上昇，因而使雙方溶液都可以過濾滅菌。

首先，詳細說明含有前述(i)的特定化合物及增稠性多醣類的第1液體，含有前述(ii)的連結物質及增稠性多醣類的第2液體，以及由該等液體的混合而形成的液狀培養基組成物(以均勻分散的狀態含有特定化合物經由連結物質結合而成的構造體及增稠性多醣類的液體)。

[第1液體]

第1液體含有有陰離子性的官能基的高分子化合物做為特定化合物，其可經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組識懸浮的構造體。

做為陰離子性的官能基而言，可舉羧基、磺基、磷酸基及該等的鹽，而以羧基或其鹽為佳。在本發明所使用的高分子化合物，含有由前述陰離子性官能基的群選出的1種或2種以上也可以。

做為本發明所使用的高分子化合物的理想的具體例而言，並無特別限制，但可舉10個以上的單醣類(例如，丙醣、丁醣、戊醣、己醣、庚醣等)聚合而成的多 醣類，較佳者可舉具有陰離子性官能基的酸性多醣類。這裡所稱的酸性多醣類，只要其構造中有陰離子性官能基則無特別限制，例如，具有醣醛酸(例如，葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多醣類，構造中的一部分具有硫酸基或磷酸基的多醣類，或持有其雙方構造的多醣類，不只是天然可得的多醣類而已，也包含由微生物產生的多醣類、由基因工程產生的多醣類、或使用酵素以人工合成的多醣類。更具體而言，可例示由玻尿酸、結冷膠、脫醯基化結冷膠(以下，有時稱為DAG)、鼠李聚糖膠(rhamsan gum)、代優堂膠(diutan gum)、黃原膠(xanthan gum)、海藻酸、鹿角菜膠(carrageenan gum)，黃原膠(xanthan gum)、刺槐豆膠(locust bean gum)、己醣醛酸、褐藻糖膠(fucoidan)、果膠、果膠酸，果膠酯酸、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、肝素，硫酸類肝素(heparitin sulfate)、硫酸角質、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)及該等的鹽所成之群的1種或2種以上所構成的多醣類。多醣類較佳者是玻尿酸、DAG、代優堂膠(diutan gum)、黃原膠、鹿角菜膠或該等的鹽，更佳者是DAG或其鹽。DAG也可使用磷酸化者。該磷酸化是可由公知的方法實施。

這裡所稱的鹽就是，例如，可舉鋰、鈉、鉀等鹼金屬的鹽，鈣、鋇、鎂等鹼土類金屬的鹽，或鋁、鋅、銅、鐵、銨、有機鹽基及胺基酸等的鹽。

該等的高分子化合物(多醣類等)的重量平均分子量，佳者是10,000至50,000,000，較佳者是100,000 至20,000,000，更佳者是1,000,000至10,000,000。例如，該分子量可利用凝膠滲透層析儀(GPC)換算聚三葡萄糖(pullulan)測定。

在本發明中，將有上述陰離子性官能基的多醣類單獨使用也可以，也可以將多數種(佳者是2種)組合使用。多醣類組合的種類，只要在液體培養基中能形成經由2價金屬陽離子結合的上述構造體則無特別的限定，但佳者是該組合至少含有DAG或其鹽。即，合適的多醣類的組合是包含DAG或其鹽，及DAG或其鹽以外的具有陰離子性的官能基的多醣類(例如黃原膠、海藻酸、鹿角菜膠、代優堂膠、刺槐豆膠或該等的鹽)。具體的多醣類的組合而言，可舉DAG與鼠李聚糖膠、DAG與代優堂膠、DAG與黃原膠、DAG與鹿角菜膠、DAG與黃原膠、DAG與刺槐豆膠、DAG與κ-鹿角菜膠、DAG與海藻酸鈉等，但不限定於該等。

脫醯基化結冷膠是以1-3結合的葡萄糖、1-4結合的葡萄糖醛酸、1-4結合的葡萄糖、及1-4結合的鼠李糖等4分子的醣做為構成單元的直鏈狀高分子多醣類，係在以下的一般式(I)中，R₁、R₂均為氫原子，n表示2以上的整數的多醣類。但是，R₁含有甘油基、R₂含有乙醯基也可以，但乙醯基及甘油基的含量佳者是10%以下，較佳者是1%以下。

[化1]

特定化合物是化學合成法所得者也可以，但該特定化合物是天然物時，由含有該化合物的各種植物、各種動物、各種微生物使用慣用技術萃取及分離精製所得者也可以。例如，結冷膠是以發酵培養基培養生產微生物，將在菌體外生產的黏膜物以通常的精製方法回收，經乾燥、粉碎等製程後製成粉末狀而製造。又，脫醯基化結冷膠的情況時，在回收黏膜物時施加鹼處理，將鍵結在1-3結合的葡萄糖殘基的甘油基及乙醯基脫醯基化後回收即可。結冷膠的生產微生物的例而言，並不限定於這些，但可舉Sphingomonas elodea及改變該微生物的基因的微生物。

脫醯基化結冷膠的情況時，可使用例如三晶股份公司製「KELCOGEL(CP‧Kelco公司的登錄商標)CG-LA」，三榮源F‧F‧I股份公司製「Kelco凝膠(CP‧Kelco公司的登錄商標)」等市售品。又，做為原生型結冷膠，可使用三榮源F‧F‧I股份公司製「Kelco凝膠(CP‧Kelco公司的登錄商標)HT」等。

第1液體是在上述特定化合物之外還含有增稠性多醣類。增稠性多醣類指可對水溶液(例如液體培養基)賦予黏性的多醣類。由本發明的製造方法製造的液狀培 養基組成物，藉由含有適當濃度的增稠性多醣類而具有適度的黏性，可防止懸浮培養中細胞塊的移動及細胞塊互相間的黏著。這裡所稱的適度的黏性，意指不妨礙培養基更換而不會發生細胞塊互相黏著程度的黏度。做為增稠性多醣類而言，只要是對培養基可賦予上述的適度的黏度者、在可賦予該黏度的濃度範圍內不會對細胞造成不好的影響(沒有細胞毒性)者，則任何增稠性多醣類都可使用。例如可舉纖維素、洋菜糖等多醣；甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基乙基纖維素、羥丙基乙基纖維素、乙基羥乙基纖維素、二羥丙基纖維素、羥乙基羥丙基纖維素等多醣的醚；玻尿酸、澱粉等生體高分子等。該等增稠性多醣類單獨使用也可以，做為幾種類的增稠性多醣類的混合物也可使用。佳者可使用甲基纖維素、羧甲基纖維素或該等的混合物，較佳者可使用甲基纖維素。

在理想的方式中，第1液體含有做為特定化合物之DAG或其鹽，以及做為增稠性多醣類之甲基纖維素。

第1液體通常是特定化合物及增稠性多醣類的溶液。用於該溶液的溶媒只要能溶解特定化合物及增稠性多醣類則沒有特別的限定，但通常是水或親水性溶媒，佳者是水。即，在理想的方式中第1液體是特定化合物及增稠性多醣類的水溶液。

第1液體中所含有的特定化合物的濃度， 只要與第2液體混合時，在混合液中特定化合物經由2價金屬陽離子結合而形成可將細胞或組織懸浮的構造體，並且該構造體在混合液中均勻分散，再者，最後所得的液狀培養基組成物是含有該構造體而可使細胞或組織懸浮培養，則無特別的限定。由以下詳述的可將細胞或組織懸浮培養的培養基組成物中特定化合物的濃度、與第1液體的體積相對於在最終產物所得的培養基組成物的體積的比率，可算出第1液體中特定化合物的濃度。例如，將體積V₁的第1液體與體積V₂的第2液體混合，最後得到體積V₁+V₂的液狀培養基組成物時，要使該液狀培養基組成物中特定化合物的濃度成為C_X%(w/v)，則將第1液體中的特定化合物的濃度設為C_X×(V₁+V₂)/V₁%(w/v)即可。

在第1液體中含有的增稠性多醣類的濃度，只要最後所得的液狀培養基組成物具有不妨礙培養基更換而不發生細胞塊互相黏著程度的黏度，則無特別的限定。由以下詳述的最後所得的液狀培養基組成物中增稠性多醣類的濃度，第1液體的體積相對於該液狀培養基組成物體積的比率，以及第2液體中的增稠性多醣類的濃度，可算出第1液體中增稠性多醣類的濃度。例如，將體積V₁的第1液體(增稠性多醣類濃度C_Y1)與體積V₂的第2液體(增稠性多醣類濃度C_Y2)混合，最後得到體積V₁+V₂的液狀培養基組成物時，將該液狀培養基組成物中增稠性多醣類的濃度設為C_Y%(w/v)時，調整第1液體中的增稠性多醣類濃度C_Y1為滿足下式即可。

C_Y1×V₁+C_Y2×V₂=C_Y×(V₁+V₂)

第1液體中增稠性多醣類的濃度是調整為第1液體可以通過過濾滅菌所使用的過濾膜的濃度。第1液體中的增稠性多醣類濃度的上限值，隨增稠性多醣類的種類及過濾膜的孔徑而變動。例如，做為增稠性多醣類使用甲基纖維素時，第1液體中的甲基纖維素濃度佳者是0.422%(w/v)以下。使用其他的增稠性多醣類的情況時，如是本行業者的話，可適宜設定第1液體的濃度，使其具有相當於上述的甲基纖維素濃度(0.422%(w/v)以下)的黏度。第1液體的增稠性多醣類濃度若是可使第1液體具有相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度之濃度，則使用0.2μm以上(例如0.2至0.22μm)孔徑的過濾膜，可將第1液體順暢的加以過濾滅菌。

第1液體中的2價金屬陽離子濃度，需要低於第1液體中的特定化合物形成構造體的濃度。做為2價金屬陽離子而言，可舉鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。尤其是鈣離子及鎂離子中的一方或雙方(以下，也表現為「鈣離子及/或鎂離子」)，對DAG等特定化合物的構造體形成有貢獻。

在第1液體，也可以含有特定化合物、增稠性多醣類、及溶媒以外的因子。做為該因子而言，可舉生理上可容許的緩衝劑、鹽、等張劑，但不限定於該等。

第1液體可將特定化合物及增稠性多醣類溶解於上述溶媒(例如水)而調製。在這裡，脫醯基化結冷 膠等具有陰離子性官能基的酸性多醣類，一般對熱水容易溶解，對冷水不容易溶解。與此相比，甲基纖維素等多醣的醚，在熱水中以非溶解狀態分散，在冷水中容易溶解，但將該醚的粉末直接添加於冷水中，則形成「團塊」，添加量的大部分不溶解而殘留。考慮這般溶質的溶解特性差異，有需要對於溶媒的溫度或特定化合物及增稠性多醣類添加於溶媒的順序適切的下工夫。例如，將特定化合物(例如脫醯基化結冷膠)添加於上述溶媒(例如水)，在該特定化合物可以溶解的溫度(例如，60℃以上，80℃以上，90℃以上)攪拌至成為透明的狀態進行溶解。其次，在維持此高溫(例如，60℃以上，80℃以上，90℃以上)的狀態下，在水溶液添加增稠性多醣類(例如甲基纖維素)的粉末，攪拌使其分散。然後，將所得的懸浮液在低溫(例如4℃以下且超過凝固點)，藉由攪拌或靜置使增稠性多醣類(例如甲基纖維素)成為透明的狀態為止進行溶解。特定化合物的溶解也可在高壓釜(例如121℃、20分鐘)實施，但由迴避在高壓釜被破壞的菌體遊離內毒素殘留的危險性的觀點，在100℃以下的溫度溶解也可以。使用經去2價金屬陽離子處理的特定化合物(DAG等)時，不需要加熱也可溶解於水，溶解操作容易。有必要時，將所得的特定化合物的溶液，加以去2價金屬陽離子處理，將溶液中的2價金屬陽離子濃度降低至構造體形成濃度以下。視必要在溶媒中預先添加特定化合物及增稠性多醣類以外的因子也可以，在所得的特定化合物及增稠性多醣類的溶液中添加特定化合物及增 稠性多醣類以外的因子也可以。本發明的製造方法含有如上述的第1液體的調製製程也可以。

[第2液體]

第2液體含有做為連結物質之2價金屬陽離子。做為2價金屬陽離子而言，可舉鈣離子、鎂離子、鋅離子、錳離子、鐵離子、銅離子等。2價金屬陽離子的種類只要在第1液體中所含的特定化合物可以經由該2價金屬陽離子結合而形成使細胞或組織懸浮的構造體則沒有特別的限定，佳者是鈣離子及鎂離子中的一方或雙方，較佳者是鈣離子。

第2液體除了上述連結物質之外，尚含有增稠性多醣類。做為增稠性多醣類而言，可舉上述者。增稠性多醣類之佳者是甲基纖維素、羧甲基纖維素或該等的混合物，較佳者是甲基纖維素。理想的方式中，第1液體所含的增稠性多醣類的種類與第2液體所含的增稠性多醣類相同。理想的方式中，第1液體及第2液體含有甲基纖維素做為增稠性多醣類。

理想的方式中，第2液體含有鈣離子及/或鎂離子做為連結物質，並含有甲基纖維素做為增稠性多醣類。

第2液體通常是連結物質(即2價金屬陽離子)及增稠性多醣類(例如甲基纖維素)的溶液。用於該溶液的溶媒，只要能溶解連結物質及增稠性多醣類者，則沒有 特別的限定，但通常是水或親水性溶媒，佳者是水。即，理想的方式中第2液體是連結物質(即2價金屬陽離子)及增稠性多醣類(例如甲基纖維素)的水溶液。

在第2液體中含有的2價金屬陽離子量，是將第1液體及第2液體混合，最後所得的液狀的培養基組成物中的2價金屬陽離子濃度，是使第1液體中的特定化合物形成構造體所需的充分量。

第2液體中的2價金屬陽離子濃度，可由最後所得的液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子濃度，及第1液體與第2液體的混合比算出。

在第2液體，含有連結物質(即2價金屬陽離子)、增稠性多醣類、及溶媒以外的因子也可以。做為該因子而言，可舉適合於培養目的細胞(例如哺乳動物的多功性幹細胞)的培養基構成成分。該培養基的構成成分而言，可舉緩衝劑(碳酸緩衝劑、磷酸緩衝劑、HEPES等)、無機鹽(NaCl等)、各種胺基酸、各種維生素(膽鹼、葉酸等)、醣類(葡萄糖等)、抗氧化劑(硫代甘油等)、丙酮酸、脂肪酸、血清、抗生物質、胰島素、運鐵蛋白(transferrin)、乳鐵蛋白(lactoferrin)、膽固醇、各種細胞介素(例如培養哺乳動物的多功性幹細胞時之bFGF、LIF等未分化維持因子)、各種激素、各種增殖因子、各種細胞外基質等，但不限定於該等。

理想的方式中，第2液體是含有構造體形成濃度的2價金屬陽離子(佳者是鈣離子及/或鎂離子)及增 稠性多醣類(例如甲基纖維素)的液體培養基，或液體培養基的濃縮液。

依據本發明，即使第1液體的特定化合物濃度高(即，即使第1液體所含的溶媒(水)的量少時)，第1液體與第2液體仍可良好混合。因此，第1液體的特定化合物濃度高、第1液體是少量時，可以忽視由第1液體對第2液體(液體培養基)的稀釋，所以第2液體亦可不是濃縮液而是可以不稀釋直接使用的液體培養基。

另一方面，第1液體的特定化合物的濃度比較低時(即，第1液體所含的溶媒(水)的量比較多時)，第1液體與第2液體有容易混合良好的傾向，構造體可分散良好。因此，第1液體的特定化合物濃度低時(溶媒(水)的量對第2液體而言不能忽視時)，第2液體(液體培養基)是以考慮被第1液體所稀釋、在混合後成為良好的液體培養基的濃縮液為佳。

第2液體除了2價金屬陽離子(佳者是鈣離子及/或鎂離子)、增稠性多醣類(例如甲基纖維素)及水之外，尚含有適合於培養目的細胞的培養基構成成分。一般被使用的細胞培養用液體培養基中鈣離子濃度的範圍是0.1至2.0mM左右，鎂離子濃度是0.1至1.0mM左右，所以對由DAG等特定化合物的構造體形成是充分的。在第2液體中，2價金屬陽離子(佳者是鈣離子及/或鎂離子)的濃度是考慮與第1液體的混合比，將最後所得的液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子濃度，調整為構造體形成濃 度。對於其他的連結物質也是同樣。又，在第2液體中，適合於培養目的細胞的培養基構成成分的濃度是考慮與第1液體的混合比，將最後所得的液狀培養基組成物中的培養基構成成分的濃度調整為適合於培養目的細胞的濃度範圍內。例如，將體積V₁的第1液體與體積V₂的第2液體混合，最後得到體積V₁+V₂的液狀培養基組成物時，要使該液狀培養基組成物中的2價金屬陽離子的濃度成為Ci時，將第2液體中2價金屬陽離子的濃度調整為Ci×(V₁+V₂)/V₂即可。對於其他的連結物質也是同樣。同樣的，將體積V₁的第1液體與體積V₂的第2液體混合，最後得體積V₁+V₂的液狀培養基組成物時，要使該液狀培養基組成物中培養基構成成分的濃度成為Cm時，將第2液體中的培養基構成成分的濃度調整為Cm×(V₁+V₂)/V₂即可。

在第2液體中含有的增稠性多醣類的濃度，只要最後所得的液狀培養基組成物具有不妨礙培養基更換、不發生細胞塊互相黏著程度的黏度，就無特別的限定。由以下詳述的最後所得的液狀的培養基組成物中的增稠性多醣類的濃度、第2液體的體積對該液狀培養基組成物體積的比率、以及第1液體中增稠性多醣類的濃度，可算出第2液體中的增稠性多醣類的濃度。例如，體積V₁的第1液體(增稠性多醣類濃度C_Y1)與體積V₂的第2液體(增稠性多醣類濃度C_Y2)混合，最後得體積V₁+V₂的液狀培養基組成物時，要使該液狀培養基組成物中的增稠性多醣類的濃度成為C_Y%(w/v)的話，將第2液體中的增稠性多 醣類濃度C_Y2調整為滿足下式即可。

C_Y1×V₁+C_Y2×V₂=C_Y×(V₁+V₂)

第2液體中的增稠性多醣類的濃度是調整為第2液體可通過過濾滅菌所使用的過濾膜的濃度。第2液體中的增稠性多醣類濃度的上限值隨增稠性多醣類的種類及過濾膜的孔徑而變動。例如，做為增稠性多醣類而使用甲基纖維素時，第2液體中的甲基纖維素濃度佳者是0.422%(w/v)以下。使用其他的增稠性多醣類的情況時，如是本行業者的話，可適宜設定第1液體的濃度，使其具有相當於上述的甲基纖維素濃度(0.422%(w/v)以下)的黏度。在第2液體的增稠性多醣類濃度，若是使第2液體的黏度相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度之濃度，則使用0.2μm以上(例如0.2至0.22μm)的孔徑的過濾膜，可將第2液體順利過濾滅菌。

在本方式中，由本發明的製造方法，將第1液體與第2液體混合，可得到做為目的的液狀培養基組成物，其中以均勻分散的狀態含有在第1液體含有的特定化合物經由第2液體含有的連結物質結合而成的構造體及增稠性多醣類。

在合適的方式中，由本發明的製造方法製造的液狀培養基組成物中含有的特定化合物的90莫耳%以上(佳者是95莫耳%以上，較佳者是99莫耳%以上，最佳者是100莫耳%)來自於第1液體，在該培養基組成物中含有的2價金屬陽離子的90莫耳%以上(佳者是95莫耳% 以上，較佳者是99莫耳%以上，最佳者是100莫耳%)來自於第2液體。

第2液體可將連結物質及增稠性多醣類溶解於上述溶媒(例如水)而調製。在一方式中，第2液體是將含有連結物質的適合於培養目的細胞的培養基構成成分及增稠性多醣類溶解於上述溶媒(例如水)而調製。在調製第2液體時，將連結物質(含有連結物質的培養基構成成分)及增稠性多醣類添加於溶媒的順序並無特別限定。例如，將含有連結物質的培養基構成成分溶解於水，得到液體培養基或其濃縮物(濃縮液體培養基)，在這裡添加增稠性多醣類的粉末使其溶解也可以。但是，甲基纖維素等多醣的醚，在熱水中以非溶解狀態分散，在冷水中容易溶解，但如將該醚的粉末直接添加於冷水中，則形成「團塊」，添加的量的大部分不溶解而殘留。因此，要將甲基纖維素等多醣的醚溶解於水時，一般將該多醣的醚的粉末添加於熱水中，攪拌使其分散，獲得熱的多醣的醚的懸浮液，將此懸浮液在攪拌中冷卻，而將甲基纖維素溶解。但是，細胞培養用的培養基在許多情況下含有熱不安定的成分，所以不能推薦將其加熱。在加溫至25至37℃程度的液體培養基或其濃縮物，添加甲基纖維素等多醣的醚的粉末而攪拌時，該粉末的一部分會形成「團塊」，所以即使將懸浮液繼續在攪拌下冷卻，至該多醣的醚完全溶解為止需要長時間。又，在無法保證無菌的條件下將液體培養基或其濃縮物加溫至25至37℃程度後，將其長期間放置，有助長混 入的細菌繁殖的疑慮。於是，將含有連結物質(含有連結物質的培養基構成成分)的液體(例如液體培養基或其濃縮物)及含有增稠性多醣類的液體(例如增稠性多醣類的水溶液)混合調製第2液體為佳。由此方法，則無需在無法保證無菌的條件下將液體培養基或其濃縮物加溫，維持在冷卻條件(例，0至4℃)下即可迅速調製第2液體，所以可抑制混入的細菌繁殖的危險性於最小限度。在一方式中，將冷卻(例如0至4℃)的含有連結物質(含有連結物質的培養基構成成分)的液體(例如液體培養基或其濃縮物)，以及冷卻(例如0至4℃)的含有增稠性多醣類的液體(例如增稠性多醣類的水溶液)，在冷卻條件(例如0至4℃)下混合。2液混合良好，在攪拌下將2液混合成為均勻的溶液為佳。由於是液體互相間的混合，可在短時間內獲得均勻的第2的溶液。混合時間例如為24小時以內，佳者是12小時以內。含有連結物質(含有連結物質的培養基構成成分)的液體(例如液體培養基或其濃縮物)，可在冷卻的溶媒(例如水)溶解連結物質(含有連結物質的培養基構成成分)而調製。含有增稠性多醣類的液體(例如增稠性多醣類的水溶液)，可在加熱的溶媒(例如水)添加增稠性多醣類，分散之後將所得的懸浮液在攪拌下冷卻，將增稠性多醣類溶解於溶媒(例如水)而得。在理想的方式中，在含有增稠性多醣類的液體，除了該增稠性多醣類以外不含助長細菌繁殖的榮養素。本發明的製造方法含有如上述的第2液體的調製製程也可以。

[液狀的培養基組成物]

由本發明的製造方法可得的液狀培養基組成物，含有在第1液體所含有的特定化合物經由第2液體所含有的連結物質(即2價金屬陽離子)結合而成的構造體，並且該構造體均勻分散於該培養基組成物中，所以使用該培養基組成物，可以在維持懸浮狀態下培養細胞或組織。

成為培養對象的細胞或組織所由來的生物種類，沒有特別限定，不只是動物(昆蟲、魚類、兩棲類、爬蟲類、鳥類、泛甲殻類、六脚類、哺乳類等)，也包含植物。

在一方式中，成為培養的對象細胞是立足地依賴性的細胞。使用本發明的製造方法可得的液狀培養基組成物，可將立足地依賴性的細胞，不使用成為立足地的承載物，在維持懸浮狀態下進行培養。在一方式中，成為培養的對象細胞是哺乳動物的多功性幹細胞。理想的方式中，哺乳動物的多功性幹細胞的細胞塊(球)為培養對象。

在本發明中，細胞及/或組織的懸浮是指對培養容器細胞及/或組織對底面可接觸但不黏著的狀態(非黏著)之謂。再者，在本發明中，使細胞及/或組織增殖、分化或維持時，對液體的培養基組成物不需要由外部加上壓力或振動或者在該組成物中的振盪、旋轉操作等而細胞及/或組織在該液狀培養基組成物中均勻分散並且處於懸浮狀態的狀態稱為「懸浮靜置」，在該狀態下培養細胞及/ 或組織稱為「懸浮靜置培養」。又，在「懸浮靜置」中可以懸浮的期間而言，可包括5分鐘以上，1小時以上，24小時以上，48小時以上，7日以上等，但只要能保持懸浮狀態不限定於該等的期間。

本發明的製造方法可得的液狀培養基組成物，在可維持或培養細胞或組織的溫度範圍(例如0至40℃)的至少1點，可以將細胞及/或組織懸浮靜置。本發明可得的液狀培養基組成物，佳者是在25至37℃的溫度範圍的至少1點，最佳者是在37℃，可以將細胞及/或組織懸浮靜置。

懸浮靜置的可能與否，例如可藉由將培養對象的細胞以2×10⁴cells/mL的濃度在評定對象的培養基組成物中均勻分散，在15mL三角管中注入10mL，在4℃至10℃程度的溫度下靜置至少5分鐘以上(例如1小時以上，24小時以上，48小時以上，7日以上)，由觀察該細胞的懸浮狀態能否維持加以評定。全細胞中的70%以上在懸浮狀態時，可結論為維持懸浮狀態。以聚苯乙烯珠(Size 500-600μm，Polysciences Inc.製)代替細胞進行評定也可以。

本發明的製造方法可得的液狀培養基組成物中特定化合物的濃度，可依照特定化合物的種類，特定化合物在液狀培養基組成物中形成上述的構造體，在可使細胞及/或組織均勻懸浮(佳者是懸浮靜置)的範圍適宜設定。例如，在DAG的情況時為0.001%至1.0%(w/v)，佳者 是0.003%至0.5%(w/v)，較佳者是0.005%至0.3%(w/v)，更佳者是0.01%至0.05%(w/v)，最佳者是0.01%至0.03%(w/v)。在黃原膠的情況時為0.001%至5.0%(w/v)，佳者是0.01%至1.0%(w/v)，較佳者是0.05%至0.5%(w/v)，最佳者是0.1%至0.2%(w/v)。在κ-鹿角菜膠及刺槐豆膠混合系的情況時，兩化合物的總和為0.001%至5.0%(w/v)，佳者是0.005%至1.0%(w/v)，較佳者是0.01%至0.1%(w/v)，最佳者是0.03%至0.05%(w/v)。在原生型結冷膠的情況時為0.05%至1.0%(w/v)，佳者是0.05%至0.1%(w/v)。

做為特定化合物將上述多醣類多數種(佳者是2種)組合使用時，該多醣類的濃度可在該多醣類的組合可將上述的構造體在液狀培養基組成物中形成、可使細胞及/或組織均勻懸浮(佳者是懸浮靜置)的範圍內適宜設定。例如，DAG或其鹽與DAG或其鹽以外的多醣類組合使用時，做為DAG或其鹽的濃度而言，可例示0.005至0.02%(w/v)，佳者是0.01至0.02%(w/v)，做為DAG或其鹽以外的多醣類的濃度而言，可例示0.0001至0.4%(w/v)，佳者是0.005至0.4%(w/v)，較佳者是0.1至0.4%(w/v)。做為具體的濃度範圍的組合而言，可以舉下面的例示。

DAG或其鹽：0.005至0.02%(佳者是0.01至0.02%)(w/v)

DAG以外的多醣類

黃原膠：0.1至0.4%(w/v)

海藻酸鈉：0.0001至0.4%(w/v)(佳者是0.1至0.4%(w/v))

原生結冷膠：0.0001至0.4%(w/v)

刺槐豆膠：0.1至0.4%(w/v)

鹿角菜膠：0.05至0.1%(w/v)

代優堂膠(diutan gum)：0.05至0.1%(w/v)

在一方式中，將脫醯基化結冷膠或其鹽與可維持二價金屬陽離子在媒體中之無規線團(random coil)狀態、並且可經由二價金屬離子交聯的酸性多醣類或其鹽組合，做為特定化合物使用。該酸性多醣類之佳者是由海藻酸、果膠及果膠酸所成之群選出的任一種，較佳者是海藻酸。做為鹽而言，可舉鋰、鈉、鉀等鹼金屬的鹽；鈣、鋇、鎂等鹼土類金屬的鹽；鋁、鋅、銅、鐵等的鹽；銨鹽等，佳者是鈉鹽。該酸性多醣類或其鹽而言，可合適使用海藻酸鈉。在本方式中，本發明的製造方法可得的液狀培養基組成物中的脫醯基化結冷膠或其鹽的濃度，例如是0.002至0.01(w/v)%，佳者是0.002至0.009(w/v)%，較佳者是0.003至0.009(w/v)%，前述酸性多醣類或其鹽(例如海藻酸鈉)的濃度，例如是0.004至0.1(w/v)%，佳者是0.004至0.02(w/v)%，較佳者是0.004至0.015(w/v)%，更佳者是0.005至0.015(w/v)%。

又該濃度，可依照下述式算出。

濃度[%(w/v)]=特定化合物的重量(g)/培養基組成物的體積(mL)×100

又，本發明的製造方法可得的液狀培養基 組成物，含有增稠性多醣類。做為增稠性多醣類而言，可舉上述者。增稠性多醣類之佳者是甲基纖維素、羧甲基纖維素或該等的混合物，較佳者是甲基纖維素。

由本發明的製造方法製造的液狀培養基組成物，藉由以適當濃度含有增稠性多醣類，而具有適度的黏性，可防止在懸浮培養中的細胞塊的移動及細胞塊互相間的黏著。在這裡適度的黏性就是不妨礙培養基更換而不發生細胞塊互相黏著程度的黏度之意。例如，做為增稠性多醣類使用甲基纖維素時，由本發明的製造方法製造的液狀培養基組成物中的甲基纖維素濃度，通常在0.422%(w/v)以下，例如0.2至0.422%(w/v)，佳者是0.211至0.422%(w/v)，較佳者是0.26至0.35%(w/v)，更佳者是0.28至0.32%(w/v)(例如0.3%(w/v))。使用其他的增稠性多醣類時，本行業者的話，為了要得到上述的適度的培養基組成物黏度，可以適宜設定增稠性多醣類濃度，使液狀培養基組成物具有相當於上述甲基纖維素濃度的黏度。

理想的方式中，特定化合物是脫醯基化結冷膠或其鹽，連結物質是鈣離子及/或鎂離子(佳者是鈣離子)，增稠性多醣類是甲基纖維素。由本發明的製造方法所製造的液狀的培養基組成物的脫醯基化結冷膠或其鹽的濃度，例如是0.001%至1.0%(w/v)，佳者是0.003%至0.5%(w/v)，較佳者是0.005%至0.3%(w/v)，更佳者是0.01%至0.05%(w/v)，最佳者是0.01%至0.03%(w/v)。由本發明的製造方法所製造的液狀培養基組成物的鈣離子及/或鎂 離子的濃度，是脫醯基化結冷膠經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體的濃度。一般所使用的細胞培養用液體培養基中鈣離子濃度的範圍是0.1至2.0mM程度，鎂離子濃度是0.1至1.0mM程度，所以對於由DAG等特定化合物形成構造體是充分的。由本發明的製造方法所製造的液狀培養基組成物中的甲基纖維素濃度，通常是0.422%(w/v)以下，例如0.2至0.422%(w/v)，佳者是0.211至0.422%(w/v)，較佳者是0.26至0.35%(w/v)，更佳者是0.28至0.32%(w/v)(例如0.3%(w/v))。

使用由本發明的製造方法所得的液狀培養基組成物，則不需要附帶具有引起細胞或組織的障礙或機能喪失的危險性的振盪或旋轉等操作而可將細胞及/或組織以懸浮狀態培養。再者，使用該培養基組成物，則在培養時，可以容易更換培養基，並且容易回收所培養的細胞及/或組織。使用該培養基組成物時，可將以往需要在培養皿上以單層黏著於細胞容器的狀態培養的細胞在懸浮狀態培養，所以可將黏著性的細胞在不損傷其機能下有效率的大量調製。

第1液體與第2液體的混合液，其本身是製造目的之培養基組成物也可以，但在該混合液再添加添加物而製造成為目的之培養基組成物者也可以。

其次，詳細說明本發明的製造方法。

本發明的製造方法，包含將上述的第1液體及第2液體加以過濾滅菌，而得到無菌的第1液體及無菌的第2液 體。由於使用過濾滅菌，不需要高壓釜滅菌，而可迴避附帶於高壓釜滅菌的細菌的屍骸及因菌體的破壞而遊離的內毒素在培養基內殘留的危險性。做為過濾滅菌所使用的過濾膜而言，可使用液體培養基的過濾滅菌用的商品。過濾膜的孔徑通常是0.1至0.8μm，佳者是0.2至0.8μm，較佳者是0.2至0.45μm，更佳者是0.2至0.22μm。

又，本發明的製造方法的特徵是第1液體及第2液體雙方含有增稠性多醣類。由於在第1液體及第2液體雙方溶解增稠性多醣類，可迴避增稠性多醣類僅存在於一方的溶液中而黏性過度上昇，可將雙方的溶液過濾滅菌。在第1液體及第2液體的增稠性多醣類的濃度，被調整為各別的液體可通過過濾滅菌所使用的過濾膜的濃度。在第1液體及第2液體中的增稠性多醣類濃度的上限值，隨增稠性多醣類的種類及過濾膜的孔徑而變動。例如，做為增稠性多醣類使用甲基纖維素時，在第1液體及第2液體中的甲基纖維素濃度，佳者是分別為0.422%(w/v)以下。使用其他的增稠性多醣類時，如是本行業者的話，可適宜設定其濃度，使各液體具有相當於上述的甲基纖維素濃度(0.422%(w/v)以下)的黏度。在第1液體及第2液體中的增稠性多醣類濃度，若是使各液體具有相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度之濃度，則各溶液可順利通過0.2μm以上(例如0.2至0.8μm，佳者是0.2至0.45μm，較佳者是0.2至0.22μm)孔徑的過濾膜而可滅菌。

第1液體與第2液體的增稠性多醣類濃度的差沒有特別限定，該濃度差越小，2液可越順利混合成為均勻的液狀的培養基組成物因而為理想。第1液體與第2液體的增稠性多醣類濃度的差，一方的濃度設為100%時，例如為±30%以下，佳者是±20%以下，較佳者是±10%以下，更佳者是±5%以下。

第1液體與第2液體的體積混合比率，相對於第1液體的體積100，第2液體的體積通常是50至200，佳者是60至166，較佳者是70至142，更佳者是80至125，又更佳者是90至111(例如100)。

再者，將由過濾滅菌所得的無菌第1液體與由過濾滅菌所得的無菌第2液體混合，得到無菌的液狀培養基組成物，其係含有均勻分散狀態的前述特定化合物經由與前述連結物質結合而成的構造體及前述增稠性多醣類。將第1液體與第2液體混合的順序並沒有特別限定，對第1液體添加第2液體也可以，對第2液體添加第1液體也可以，但由對第2液體添加第1液體，可有效率的抑制在混合時由只存在於一方的前述構造體造成的固形凝膠的形成。例如，將第1液體與第2液體中任何一方的液體(佳者是第2液體)通過滅菌用過濾膜先放入於無菌的容器，其次將另一方的液體(佳者是第1液體)通過滅菌用過濾膜注入於該容器內而將兩者混合。

第1液體與第2液體迅速混合，在以適切的方法攪拌下將第1液體與第2液體混合，使特定化合物 互相經由2價金屬陽離子等連結物質連結而形成的構造體不會只在局部形成，該構造體及增稠性多醣類能在液狀的培養基組成物中均勻分散為佳。做為攪拌的方法而言，可舉吸管吸取法、漩渦攪拌器、反轉混和等手動的攪拌法；使用電磁攪拌器、機械攪拌器、均質混合器、均質器等機器的攪拌等，但不限定於該等。

在一方式中，照以下所述的要領，依照本發明的方法，將第1液體與第2液體混合，而獲得液狀培養基組成物。

第1液體：體積V₁

增稠性多醣類濃度C_Y1

第2液體：體積V₂

增稠性多醣類濃度C_Y2

液狀培養基組成物：體積V₁+V₂

特定化合物濃度C_X

增稠性多醣類濃度C_Y

連結物質濃度C_Z

此時，在第1液體的特定化合物濃度，可算出為C_X×(V₁+V₂)/V₁。又，在第2液體的連結物質濃度，可算出為C_Z×(V₁+V₂)/V₂。

第1液體及第2液體中的增稠性多醣類濃度，分別調整使其滿足下式。

C_Y1×V₁+C_Y2×V₂=C_Y×(V₁+V₂)

在這裡，要使第1液體及第2液體能通過過濾滅菌所 使用的過濾膜，將C_Y1及C_Y2設定為使液體具有相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度的增稠性多醣類濃度為佳。因此，C_Y也設定為使液體具有相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度的增稠性多醣類濃度為佳。

C_Y1與C_Y2的差，例如是±30%以下(即C_Y1=0.7×C_Y2至1.3×C_Y2)，佳者是±20%以下，較佳者是±10%以下，更佳者是±5%以下。

在理想的方式中，C_Y1、C_Y2、及C_Y實質上是相同的。「實質上是相同」是指差異在±5%以下之謂。

設V₁為100時，V₂通常是50至200，佳者是60至166，較佳者是70至142，更佳者是80至125，又更佳者是90至111(例如100)。

理想的方式中，做為特定化合物使用DAG或其鹽，做為連結物質使用鈣離子，做為增稠性多醣類使用甲基纖維素。第1液體是DAG或其鹽及甲基纖維素的水溶液。第2液體是含有鈣離子及甲基纖維素的液體培養基的濃縮液。第2液體之佳者是含有鈣離子的液體培養基的濃縮液與甲基纖維素的水溶液混合而得者。該混合之佳者是在冷卻條件下(例如0至4℃)實施。第1液體及第2液體是通過0.2至0.8μm、佳者是0.2至0.45μm、較佳者是0.2至0.22μm孔徑的過濾膜而滅菌，將無菌的第1液體與無菌的第2液體混合，得無菌的液狀的培養基組成物，其係含有均勻分散狀態的DAG經由鈣離子結合而成的構 造體及甲基纖維素。第1液體與第2液體的體積混合比是如上所述，相對於第1液體的體積(V₁)100，第2液體的體積(V₂)為50至200，佳者是60至166，較佳者是70至142，更佳者是80至125，又更佳者是90至111(例如100)。混合的結果所得的液狀培養基組成物中的DAG濃度，佳者是0.01%至0.05%(w/v)，最佳者是0.01%至0.03%(w/v)。混合的結果所得的液狀培養基組成物中的鈣離子濃度是DAG形成構造體的濃度，通常是0.1至2.0mM程度。混合的結果所得的液狀培養基組成物中的培養基構成成分的濃度，是適合於培養目的細胞(例如哺乳動物細胞)的濃度範圍內。混合的結果所得的液狀培養基組成物中的甲基纖維素濃度，通常是0.422%(w/v)以下，例如0.2至0.422%(w/v)，佳者是0.211至0.422%(w/v)，較佳者是0.26至0.35%(w/v)，更佳者是0.28至0.32%(w/v)(例如0.3%(w/v))。

第1液體中的DAG濃度，是在上述混合結果所得的液狀培養基組成物中的DAG濃度乘以(V₁+V₂)/V₁(亦即150/100至300/100，佳者是160/100至266/100，較佳者是170/100至242/100，更佳者是180/100至225/100，又更佳者是190/100至211/100(例如200/100))所得的濃度。

第2液體中的鈣離子濃度，是在上述的混合的結果所得的液狀的培養基組成物中的鈣離子濃度乘以(V₁+V₂)/V₂(亦即150/50至300/200，佳者是160/60至266/166，較佳者是170/70至242/142，更佳者是180/80至225/125，又更佳者是190/90至211/111(例如200/100))所得的濃度。

第2液體中的培養基構成成分的濃度，是在上述混合結果所得的液狀培養基組成物中培養基構成成分的濃度乘以(V₁+V₂)/V₂(亦即150/50至300/200，佳者是160/60至266/166，較佳者是170/70至242/142，更佳者是180/80至225/125，又更佳者是190/90至211/111(例如200/100))所得的濃度。

第1液體及第2液體中甲基纖維素濃度，是分別調整使其滿足下式。

C_Y1×V₁+C_Y2×V₂=C_Y×(V₁+V₂)

在這裡，C_Y1及C_Y2設定為0.422%(w/v)以下為佳。C_Y1與C_Y2的差是例如±30%以下(亦即C_Y1=0.7×C_Y2至1.3×C_Y2)，佳者是±20%以下，較佳者是±10%以下，更佳者是±5%以下。

理想的方式中，C_Y1、C_Y2、及C_Y是實質上相同。

在該液狀培養基組成物中，由於含有均勻分散的DAG經由鈣離子結合而成的構造體及甲基纖維素，可使細胞及/或組織均勻懸浮(佳者是懸浮靜置)。

上述混合操作的結果，不需要高壓釜滅菌即可調製無菌的液狀的培養基組成物，其係以均勻分散的狀態含有特定化合物經由連結物質結合而成的構造體及增稠性多醣類。高壓釜滅菌有細菌的屍骸或由菌體的破壞而遊離的內毒素在培養基內殘留的危險性，但由本發明的方法所製造的液狀培養基組成物，此危險性減低。

在這裡所述的包括專利及專利申請說明書 全部的刊行物所述的內容，是經由在這裡引用，將其與全部明示之相同程度編入於本說明書者。

以下由具體陳述本發明的製造方法及本發明的評定方法的實施例更詳細說明本發明，但本發明不受該等所限定。

[實施例] (試驗例1：含有甲基纖維素(MC)的培養基組成物的過濾器過濾)

在滅菌精製水(Nipro Pharma公司製)，溶解相當於通常使用濃度的2.11倍DMEM/F12粉末(12400-024，Life Technologies公司製)與重碳酸氫鈉(S5761-500G，Sigma公司製)，藉以調製濃縮培養基(2.11 x DMEM/F12培養基)。將含有3%(w/v)甲基纖維素的培養基組成物(HSC001，3% Methylcellulose in IMDM，R&D公司製)，使用上述2.11 x DMEM/F12培養基稀釋，調整所含有的甲基纖維素濃度分別成為0.633%(w/v)，0.422%(w/v)，0.211%(w/v)。

將所得的各培養基組成物50mL，添加於250mL規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES，Thermo Fisher公司製)，調查是否可由過濾器過濾。

其結果，如含有的甲基纖維素(MC)濃度是在0.422%(w/v)以下的培養基組成物，則可以通過0.2μm孔徑的過濾器。各濃度的過濾器通過能力的驗證結果示於第1表。

(試驗例2：使用甲基纖維素(MC)粉末調製的含有甲基纖維素的培養基組成物的過濾器過濾) (1)甲基纖維素水溶液的調製

將甲基纖維素粉末(Methyl Cellulose~1500cps，0215549590，MP Biomedicals公司製)及滅菌精製水(Nipro Pharma製)，與攪拌子一起加入於500mL廣口玻璃瓶，在121℃實施高壓釜滅菌20分鐘。高壓釜滅菌完成後，以攪拌子實施攪拌至水溶液的溫度冷卻至室溫，然後在冷藏下(4℃)保存1晝夜。確認各甲基纖維素水溶液成為透明後，再添加滅菌精製水，將甲基纖維素濃度調整為0.3%(w/v)及0.6(w/v)%，再度在121℃實施高壓釜滅菌20分鐘。將甲基纖維素水溶液冷卻至室溫，再度在冷藏下(4℃)保存一晝夜，獲得透明的水溶液。

(2)甲基纖維素/脫醯基化結冷膠水溶液的調製

將甲基纖維素粉末(Methyl Cellulose~1500cps， 0215549590，MP Biomedicals公司製)、脫醯基化結冷膠(KELCOGEL CG-LA，三晶股份公司製)、及滅菌精製水(Nipro Pharma公司製)，與攪拌子一起加入於500mL廣口玻璃瓶，在121℃實施高壓釜滅菌20分鐘。高壓釜滅菌完成後，以攪拌子實施攪拌至水溶液的溫度冷卻至室溫，然後在冷藏下(4℃)保存1晝夜。確認各甲基纖維素/脫醯基化結冷膠水溶液成為透明之後，再添加滅菌精製水，分別將甲基纖維素濃度各分別調整為0.3%及0.6%、將脫醯基化結冷膠濃度調整為0.075%，再度在121℃實施高壓釜滅菌20分鐘。將甲基纖維素/脫醯基化結冷膠水溶液冷卻至室溫，再度在冷藏下(4℃)保存一晝夜，獲得透明的水溶液。

將100mL的各甲基纖維素水溶液及各甲基纖維素/脫醯基化結冷膠水溶液，分別添加於150mL規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES，Thermo Fisher公司製)，調查是否可由過濾器過濾。

其結果，甲基纖維素濃度為0.3%(w/v)時，不論有無脫醯基化結冷膠，水溶液可以通過0.2μm的過濾器。另一方面，甲基纖維素濃度為0.6%(w/v)時，因高黏性之故，水溶液不能通過0.2μm的過濾器。在各條件下的過濾器通過能力示於第2表。

(試驗例3：含有0.325%(w/v)甲基纖維素(MC)之TeSR-E8培養基的非加熱條件的調製法)

將各種甲基纖維素粉末(1.Nacalai Tesque公司製(甲基纖維素# 1500，22223-65)，2.純正化學公司製(甲基纖維素1500，74208-9001)，3.東京化成公司製(甲基纖維素，M0294))，添加於TeSR-E8 basal medium(ST-05940，Stem Cell Technologies公司製)，以攪拌子攪拌至甲基纖維素粉末的團塊幾乎消失之後，在冷藏下保存一晝夜獲得透明的含有各甲基纖維素的TeSR-E8培養基(甲基纖維素濃度：0.325%(w/v))。

將含有各甲基纖維素的TeSR-E8培養基100mL，添加於150mL規模的過濾器過濾系統(0.2μm PES，Thermo Fisher公司製)，判斷是否可由過濾器過濾。又將含有各甲基纖維素的TeSR-E8培養基及TeSR-E8培養基分別使用1mL，使用pH測定計(pH METER F-72， HORIBA公司製)實施pH測定。

將以各條件調製的培養基組成物的過濾器通過能力示於第3表，pH測定結果示於第4表。使用任一種甲基纖維素粉末，都可調製可通過0.2μm過濾器的含有0.325%(w/v)甲基纖維素的培養基。培養基的pH的變動也都幾乎沒有看到。由以上的結果，確立在不加熱的條件(亦即在室溫下攪拌與冷藏保存組合的條件)，含有0.3%(w/v)以上的甲基纖維素且可通過0.2μm過濾器的培養基的調製法。

(試驗例4：含有甲基纖維素及脫醯基化結冷膠的培養基組 成物500mL的製造)

在純水250mL，添加並溶解相當於通常使用濃度的2.11倍量的DMEM/F12粉末(12400-024，Life Technologies公司製)與重碳酸氫鈉(純正化學公司製)，調製濃縮培養基(2.11xDMEM/F12培養基)，在4℃保管。其次，在加熱至70℃的純水25mL添加甲基纖維素(純正化學公司製，甲基纖維素1500，74208-9001)0.79g，使其均勻懸浮之後，將所得的懸浮液在攪拌下以冰水冷卻。甲基纖維素溶解而上述懸浮液成為透明之後，將預先調製在4℃保管的濃縮培養基添加於甲基纖維素水溶液，攪拌使其均勻，將所得的混合液再度在4℃保管。

另一方面，在純水225mL添加脫醯基化結冷膠(Kelco凝膠(登錄商標)，三榮源F‧F‧I股份公司製)0.105g後以高壓釜(121℃，20分鐘)加熱溶解。趁熱由高壓釜取出水溶液，添加甲基纖維素(純正化學公司製，甲基纖維素1500，74208-9001)0.79g，使其均勻懸浮之後，將所得的懸浮液在攪拌下以冰水冷卻。

將在4℃保管的含有甲基纖維素的濃縮培養基，以1L規模的過濾器過濾系統(0.22μm，Corning公司製)過濾，然後迅速將上述冰冷的含有甲基纖維素的脫醯基結冷膠水溶液添加於同一過濾器過濾系統。在添加時，為使過濾器下部的瓶內部的液體被攪拌，將該瓶以手動振盪下使含有甲基纖維素的濃縮培養基與含有甲基纖維素的脫醯基化結冷膠水溶液混合。過濾器過濾完成後，卸下過 濾器，關閉下部瓶的蓋後以手動攪拌約1分鐘，完成含有甲基纖維素及脫醯基化結冷膠的培養基組成物的調製。

[產業上的利用可能性]

依照本發明，不需要高壓釜滅菌即可調製無菌的液狀培養基組成物，其係含有醯基化結冷膠等特定化合物經由鈣離子等連結物質結合而成的構造體，及甲基纖維素等增稠性多醣類。高壓釜滅菌，有細菌的屍骸及由菌體破壞而遊離的內毒素在培養基內殘留的危險性，但依照本發明可減低此危險性。

本申請案是以在日本申請的特願2016-213653(申請日：2016年10月31日)做為基礎，將其內容全部包含於本說明書者。

Claims (10)

1. 一種無菌液狀培養基組成物的製造方法，其係包含下列製程：(I)將含有下述(i)的特定化合物及增稠性多醣類的第1液體加以過濾滅菌，獲得無菌的第1液體；(II)將含有下述(ii)的連結物質及前述增稠性多醣類的第2液體加以過濾滅菌，獲得無菌的第2液體；及(III)將在製程(I)所得的無菌的第1液體，與在製程(II)所得的無菌的第2液體混合，形成以均勻分散的狀態含有前述特定化合物經由前述連結物質結合而成的構造體及前述增稠性多醣類之無菌液狀培養基組成物：(i)特定化合物，係具有陰離子性官能基的高分子化合物，可經由2價金屬陽離子結合而形成可使細胞或組織懸浮的構造體，(ii)連結物質，係2價金屬陽離子。
2. 如申請專利範圍第1項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，更包含：將含有前述(ii)的連結物質的液體與含有前述增稠性多醣類的液體混合而獲得前述第2液體。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項中所述的無菌液狀的培養基組成物的製造方法，其中，前述液狀培養基組成物中的增稠性多醣類濃度係 對該液狀培養基組成物賦予相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度之濃度。
4. 如申請專利範圍第3項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述液狀培養基組成物中的增稠性多醣類濃度，係對該液狀培養基組成物賦予相當於0.2%(w/v)以上的甲基纖維素濃度的黏度之濃度。
5. 如申請專利範圍第3項或第4項中所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述第1液體及前述第2液體中的增稠性多醣類濃度，係對該液體賦予相當於0.422%(w/v)以下的甲基纖維素濃度的黏度之濃度。
6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述第1液體、前述第2液體、及前述液狀培養基組成物中的增稠性多醣類濃度實質上相同。
7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述增稠性多醣類是甲基纖維素。
8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，前述(i)的特定化合物是脫醯基化結冷膠，第1液體是含有該脫醯基化結冷膠及前述增稠性多醣類的水溶液， 前述(ii)的連結物質是鈣離子及鎂離子中的一方或雙方，第2液體是含有鈣離子及鎂離子中的一方或雙方及前述增稠性多醣類的液體培養基或該液體培養基的濃縮液。
9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，過濾滅菌所使用的過濾膜的孔徑是0.2至0.22μm。
10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項所述的無菌液狀培養基組成物的製造方法，其中，不含高壓蒸氣滅菌製程。