TW201815825A - 經修飾之抗原結合fab片段及包含其之抗原結合分子 - Google Patents
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Abstract
本發明提供經修飾之抗原結合Fab片段。亦提供包含該抗原結合Fab片段之抗原結合分子及包含該分子之組合物。
Description
本發明係關於經修飾之抗原結合Fab片段，其包含輕鏈可變結構域(VL)、輕鏈恆定結構域(CL)、重鏈可變結構域(VH)及重鏈恆定結構域1 (CH1)，其中該VL結構域之C末端經由連接體連接至該VH結構域之N末端，或該VH結構域之C末端經由連接體連接至該VL結構域之N末端。
雙特異性抗體(BsAb)係可同時結合至兩種不同類型抗原之人工蛋白質。治療性單株抗體(Mab)廣泛地用於治療人類疾病。然而，僅靶向一種抗原對於諸如癌症之適應症通常是不足夠的且經常會發生復發。由於此現象，愈來愈多之靶向既存生物標記之組合療法正在研究中。 在2014年，美國食品藥品管理局加速批准布利莫單抗(Blinatumomab)(Amgen Inc.)標誌著美國首次批准之BsAb。FDA對BsAb之批准激發愈來愈多之研究人員對BsAb進行廣泛研究以用於治療癌症、傳染病、其他疾病或病症。 BsAb可以諸多結構形式製造，例如「IgG樣BsAb」或「非IgG樣BsAb」。舉例而言，「非IgG樣BsAb」可係僅由Fab區組成之化學連接抗原結合Fab片段，或各種類型之二價及三價單鏈可變片段(scFv)。「IgG樣BsAb」包含兩個Fab臂及一個Fc區，兩個Fab位點結合不同抗原之情形除外。IgG樣BsAb可對稱或不對稱，此取決於兩條重鏈是否一致。 BsAb可經設計同時結合細胞毒性細胞(使用諸如CD3之受體)及諸如癌細胞之靶標(例如，癌細胞上之抗原)。此等BsAb可接合細胞毒性T細胞以獲得針對界定靶細胞(例如，癌細胞)之T細胞介導之細胞毒性。BsAb (或雙特異性結合分子)設計之一個方法係使兩個結合結構域附接至橋接結構域(例如抗體之恆定區)之兩端(N末端及C末端)。此一方法之實例揭示於美國專利申請公開案第2013/0165638A1號中。雙特異性抗體構築(或雙特異性結合分子)之替代方法係使不同結合結構域佔據天然IgG抗體上之兩個抗原-結合位點。 不對稱BsAb之產生可藉由採取隆凸-孔洞(knobs-into holes，KiH)策略(US 7695936 B2)來達成。具體而言，KiH策略之概念依賴於兩個CH3結構域間之界面的修飾。將巨大殘基引入至一條抗體重鏈之CH3結構域中並以與密鑰類似之方式起作用。在另一條重鏈中，形成能夠容納該巨大殘基之模擬鎖之「孔洞」。所得異二聚體Fc-部分可進一步藉由人工二硫橋穩定化。 KiH策略之一個缺點在於仍存在與輕鏈之隨機締合(即輕鏈錯配，參見圖1)。輕鏈錯配之問題可藉由產生具有常見輕鏈之雙特異性分子(Merchant AM等人，An efficient route to human bispecific IgG；Nat Biotechnol 1998；16:677-81)或藉由一條重鏈與輕鏈之間之結構域交換以產生CrossMab (Schaefer W等人，Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies；Proc Natl Acad Sci USA 2011；108:11187-92)來解決。 US 9,382,323 B2係關於雙特異性抗體，其包含「全長抗體」及經由肽連結體在該全長抗體之重鏈之C或N末端與該全長抗體融合之「一或兩個單鏈Fab片段」。然而，US 9,382,323 B2之全長抗體係包含兩條相同重鏈及輕鏈之對稱抗體且對一種抗原係單價的。US 9,382,323 B2既未提及在雙特異性抗體製備中之輕鏈錯配問題，亦未提及解決輕鏈錯配之技術手段。 業內仍需要在保留對一或多種抗原特異性之強親和力的同時，研發新穎策略以克服不對稱BsAb製備中之輕鏈錯配問題。
本發明提供用以修飾Fab區之結構以降低抗原結合分子形成期間之錯配率並改良分子產生之方法。 因此，本發明之一個態樣係提供抗原結合Fab片段，其包含輕鏈可變結構域(VL)、輕鏈恆定結構域(CL)、重鏈可變結構域(VH)及重鏈恆定結構域1 (CH1)，其中該VL結構域之C末端經由連接體連接至該VH結構域之N末端；或該VH結構域之C末端經由連接體連接至該VL結構域之N末端。 在本發明之抗原結合Fab片段之較佳實施例中，VL結構域之C末端經由連接體連接至VH結構域之N末端，且及其中(1) VH結構域之C末端經由肽鍵連接至CH1結構域之N末端；(2) VH結構域之C末端經由肽鍵連接至CL結構域之N末端；(3) VH結構域之C末端經由肽鍵連接至CL結構域之N末端，且CL結構域之C末端經由連接體連接至CH1結構域之N末端；或(4) VH結構域之C末端經由肽鍵連接至CH1結構域之N末端，且CH1結構域之C末端經由連接體連接至CL結構域之N末端。 在本發明之抗原結合Fab片段之另一較佳實施例中，VH結構域之C末端經由連接體連接至VL結構域之N末端，且其中(1) VL結構域之C末端經由肽鍵連接至CH1結構域之N末端；(2) VL結構域之C末端經由肽鍵連接至CL結構域之N末端；(3) VL結構域之C末端經由肽鍵連接至CL結構域之N末端，且CL結構域之C末端經由連接體連接至CH1結構域之N末端；或(4) VL結構域之N末端經由肽鍵連接至CH1結構域之C末端，且CH1結構域之N末端經由連接體連接至CL結構域之C末端。 在本發明之抗原結合Fab片段之另一較佳實施例中，(1) VL結構域經由二硫鍵連接至CL結構域；(2) VH結構域經由二硫鍵連接至CL結構域；(3) VL結構域經由二硫鍵連接至CH1結構域；或(4) VH結構域經由二硫鍵連接至CH1結構域。 在本發明之另一實施例中，抗原結合Fab片段視情況包含Fc區。 本發明之另一態樣係提供包含兩種或更多種本發明之抗原結合Fab片段之抗原結合分子，其中該兩種或更多種片段對相同或不同抗原具有特異性。 本發明之另一態樣係提供編碼本發明之抗原結合Fab片段之多核苷酸。 本發明之另一態樣係提供用於表現本發明之抗原結合Fab片段或抗原結合分子之載體及宿主細胞。 本發明之另一態樣係提供製備本發明之抗原結合分子之方法。 本發明之另一態樣係提供包含本發明之抗原結合分子之醫藥組合物。 在以下部分中詳細闡述本發明。本發明之其他特性、目的及優點可在本發明之詳細闡述及申請專利範圍中容易地發現。
相關申請案交叉參考
本申請案主張於2016年7月21日提出申請之美國臨時申請案第62/364,854號之優先權；該申請案之揭示內容係以全文引用的方式併入本文中。定義
除非本文中另有定義，否則與本發明結合使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者所通常瞭解之含義。該等術語之含義及範圍應明確，然而，本文中所提供之定義即使有任何潛在歧義亦優先於任何辭典或非固有定義。 除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。舉例而言，如本文中所使用之術語「一(a或an)」定義為一個或一個以上。 如本文中所使用，除非明確指示僅替代項或該等替代項相互排斥，否則在申請專利範圍中使用術語「或」表示「及/或」。 本文中所使用，術語「第一」、「第二」等係指不同單元(例如，第一核酸、第二核酸)。本文中該等術語之使用不一定意味著排序(例如一個單元或事件在另一單元或事件之前發生或到來)，而係提供區分特定單元之機制。 如本文中所使用，術語「抗原結合Fab片段」係指包含重鏈可變結構域(VH)、輕鏈可變結構域(VL)、重鏈恆定結構域(CH)及輕鏈恆定結構域(CL)之片段。每一Fab片段關於抗原結合均係單價的。Fab片段可進一步包含IgG抗體之Fab區(含有CH2及CH3結構域)。 如本文中所使用，術語「抗原結合分子」係指特異性結合一或多種抗原之分子。抗原結合分子之實例係IgG樣分子或非IgG樣分子。 如本文中所使用，術語「單鏈可變片段(scFv)」係指經連接體連結之免疫球蛋白之VH與VL之融合蛋白，該連接體可連結VH之N末端與VL之C末端，或連結VL之N末端與VH之C末端。 如本文中所使用，術語「半胱胺酸工程化抗體」係指包含一或多個通常不存在於天然抗體輕鏈或重鏈中之半胱胺酸殘基之抗體。因此，此半胱胺酸殘基稱為「工程化半胱胺酸」。工程化半胱胺酸可藉由使用習用技術(例如Molecular Immunology, 第32卷, 第4期, 第249-258頁, 1995中之彼等)引入。 如本文中所使用，術語「多核苷酸」或「核酸」係指核苷酸之聚合物，且可呈DNA或RNA形式。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基，及/或其類似物或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。 如本文中所使用，術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。載體可為「質體」，其係指一種環狀雙股DNA迴圈，其他DNA區段可引入至該環狀雙股DNA迴圈中。 如本文中所使用，術語「轉染」係指將多核苷酸引入真核細胞中之過程。 如本文中所使用，術語「啟動子」係指起始特定基因轉錄之DNA區域。啟動子位於基因之轉錄起始位點附近，在同一條鏈上，且在DNA上游(朝有義鏈之5’區)。 如本文中所使用，術語「修飾」係指與原始胺基酸序列相比，胺基酸序列之改變。修飾包括(例如)以另一胺基酸取代胺基酸殘基、插入一或多個胺基酸及使一或多個胺基酸殘基缺失。 如本文中所使用，術語「醫藥組合物」係指調配物或製劑，其包含具有生物學或藥理學活性之活性成分及醫藥上可接受之載劑。醫藥組合物可呈以下形式：錠劑、粉劑、糰粒、珠粒、顆粒、微球、膠囊、丸劑等。 如本文中所使用，術語「醫藥上可接受之載劑」係指業內熟知之用於製造醫藥組合物之溶劑、稀釋劑、黏合劑、黏著劑、佐劑、賦形劑、接受劑、穩定劑、類似物、矯味劑、甜味劑、乳化劑及/或防腐劑。醫藥上可接受之載劑之實例包括(但不限於)水、鹽水、緩衝劑、惰性及非毒性固體。一般技術
本發明可使用分子生物學、化學、生物化學、細胞生物學、微生物學及免疫學之習用技術。闡述習用技術之先前技術文獻/參考文獻包括Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第四版)、Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (第一版)及Current Protocols in Molecular Biology。細胞培養條件
宿主細胞 本發明之Fab片段或抗原結合分子可在宿主細胞中產生，包括原核、真核及植物宿主細胞。舉例而言，原核宿主細胞可係大腸桿菌(E. coli
)。適於產生本發明之Fab片段或抗原結合分子之真核宿主細胞包括(但不限於)非洲綠猴腎(COS)細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、骨髓瘤細胞(例如SP 2/0、YB 2/0、NS0及P3X63.Ag8.653)、幼小倉鼠腎(BHK)細胞、人類胚腎(HEK-293)細胞、Freestyle 293細胞及人類視網膜源之PER-C6細胞(PER.C6®
人類細胞)。在本發明之較佳實施例中，細胞係CHO細胞或Freestyle 293細胞。 啟動子 為達成本發明之抗原結合分子之高程度表現，使用強啟動子以驅動抗體重鏈及輕鏈表現。啟動子可係真核啟動子或原核啟動子。適於產生本發明之Fab片段或抗原結合分子之原核啟動子包括(但不限於) T7、T7lac、Sp6、araBAD、trp、lac、Ptac及pL。適於產生本發明之Fab片段或抗原結合分子之真核啟動子包括(但不限於)巨細胞病毒(CMV)、延長因子α (EF1α)、SV40、PGK1、Ubc、人類β肌動蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、多角體蛋白、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、H1及U6。在本發明之較佳實施例中，所使用之啟動子係CMV啟動子。 載體設計 在本發明之一個實施例中，載體含有編碼VL-連接體-VH-CH1或VH-連接體-VL-CH1區段之核酸序列及編碼CL結構域之核酸序列，其中該兩個核酸序列之表現分別係由兩個啟動子驅動。在本發明之另一實施例中，編碼VL-連接體-VH-CH1或VH-連接體-VL-CH1區段之核酸序列在3’端進一步包括編碼Fc區(包括CH2結構域及CH3結構域)之核酸序列。 在本發明之一個實施例中，載體含有編碼VL-連接體-VH-CL或VH-連接體-VL-CL區段之核酸序列及編碼CH1結構域之核酸序列，其中該兩個核酸序列之表現分別係由兩個啟動子驅動。在本發明之另一實施例中，編碼VL-連接體-VH-CL及VH-連接體-VL-CL區段之核酸序列在3’端進一步包括編碼Fc區(包括CH2結構域及CH3結構域)之核酸序列。 在本發明之一個實施例中，載體含有編碼VH-連接體-VL-CL-連接體-CH1、VL-連接體-VH-CL-連接體-CH1、VH-連接體-VL-CH1-連接體-CL或VL-連接體-VH-CH1-連接體-CL區段之核酸序列。在本發明之另一實施例中，編碼VH-連接體-VL-CL-連接體-CH1、VL-連接體-VH-CL-連接體-CH1、VH-連接體-VL-CH1-連接體-CL及VL-連接體-VH-CH1-連接體-CL區段之核酸序列在3’端進一步包括編碼Fc區(包括CH2結構域及CH3結構域)之核酸序列。 在本發明之一個實施例中，將兩種或更多種載體轉染至宿主細胞以產生本發明之抗原結合分子(例如，圖4A至4C)。載體分別表現對不同抗原具有特異性之抗原結合片段。本發明中所使用之連接體之序列及長度
本發明中可使用任何業內已知之連接體。連接體可為3至50個胺基酸、較佳5至40個胺基酸、更佳5至30個胺基酸、甚至更佳10至25個胺基酸且最佳15個胺基酸之肽。連接體通常富含甘胺酸以獲得撓性，以及絲胺酸或蘇胺酸以獲得溶解性。表1顯示可用於本發明中之實例連接體之序列及長度(Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 2013, 第29卷, 第2期, 175-186)。在本發明之實施例中，連接體具有GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1)之序列。 表1 本發明之 Fab 片段及抗原結合分子之構象
本發明提供一系列在構象上不同於已知Fab之Fab片段。 如圖2A中所示，在天然Fab中，VL之C末端經由肽鍵連接至CL之N末端，VH之C末端經由肽鍵連接至CH1之N末端，且CL經由二硫鍵連接至CH1。 本發明之一個態樣係提供經修飾之Fab片段，其包含： (a) VL結構域、CL結構域及VH-CH1區，其中該VL結構域之C末端經由連接體連接至該VH結構域之N末端，且其中該VL結構域視情況經由二硫鍵連接至該CL結構域(圖2B)； (b) VH結構域、CL結構域及VL-CH1區，其中該VH結構域之C末端經由連接體連接至該VL結構域之N末端，且其中該VH結構域視情況經由二硫鍵連接至該CL結構域(圖2C)； (c) VL結構域、CH1結構域及VH-CL區，其中該VL結構域之C末端經由連接體連接至該VH結構域之N末端，且其中該VL結構域視情況經由二硫鍵連接至該CH1結構域(圖2D)； (d) VH結構域、CH1結構域及VL-CL區，其中該VH結構域之C末端經由連接體連接至該VL結構域之N末端，且其中該VH結構域視情況經由二硫鍵連接至該CH1結構域(圖2E)； (e) VH、CH1及VL-CL區，其中該VH結構域之C末端經由第一連接體連接至該VL結構域之N末端；且該CH1結構域之N末端經由第二連接體連接至該CL結構域之C末端，其中該第一連接體及該第二連接體相同或不同，且其中該VH結構域視情況經由二硫鍵連接至該CH1結構域(圖2F)； (f) VL、CH1及VH-CL區，其中該VL結構域之C末端經由第一連接體連接至該VH結構域之N末端；且該CH1結構域之N末端經由第二連接體連接至該CL結構域之C末端，其中該第一連接體及該第二連接體相同或不同，且其中該VL結構域視情況經由二硫鍵連接至該CH1結構域(圖2G)； (g) VH、CL及VL-CH1區，其中該VH結構域之C末端經由第一連接體連接至該VL結構域之N末端；且該CL結構域之N末端經由第二連接體連接至該CH1結構域之C末端，其中該第一連接體及該第二連接體相同或不同，且其中該VH結構域視情況經由二硫鍵連接至該CL結構域(圖2H)；或 (h) VL、CL及VH-CH1區，其中該VL結構域之C末端經由第一連接體連接至該VH結構域之N末端；且該CL結構域之N末端經由第二連接體連接至該CH1結構域之C末端，其中該第一連接體及該第二連接體相同或不同，且其中該VL結構域視情況經由二硫鍵連接至該CL結構域(圖2I)。 二硫鍵可藉由採用如本文中所闡述之半胱胺酸工程化技術來形成。具有此二硫鍵之本發明之Fab片段或抗原結合分子稱為「二硫鍵穩定化」形式。 在本發明之另一實施例中，VH-CH1、VL-CH1、VH-CL及VL-CL區之每一者可進一步包括Fc區。 慮及本發明之經修飾之Fab片段，抗原結合分子之構象之實例可包括圖3A-K中所示之彼等，且本發明之抗原結合分子可為單特異性或雙特異性(Roland Kontermann (2012) Dual targeting strategies with bispecific antibodies, mAbs, 4:2, 182-197)。 在本發明之實施例中，任何業內已知之策略(例如KiH策略及Christian Klein等人(「Progress in overcoming the chain association issue in bispecific heterodimeric IgG antibodies」，MAbs. 2012年11月1日；4(6): 653-663)中所揭示之彼等)可用於具有Fc區之抗原結合分子之形成中。舉例而言，在KiH策略中，兩個Fc區中之兩個CH3結構域之核酸序列之位置可如表2中所示經修飾。 表2
* 編號係根據EU索引。製備本發明之經修飾之 Fab 片段或抗原結合分子之方法
本發明之一個態樣係提供製備本申請案之Fab片段及抗原結合分子之方法。該方法包含在適於表現本發明之Fab片段或抗原結合分子之條件下培育如上文所闡述之宿主細胞之步驟。根據本發明，宿主細胞可包含一或多種如上文所闡述之載體。適於表現Fab片段及抗原結合分子之條件端視所使用啟動子、載體及宿主細胞之種類有所變化，且可基於先前技術來確定。 提供以下實例以有助於熟習此項技術者實踐本發明。即使如此，該等實例不應解釋為過度限制本發明，此乃因熟習此項技術者可在不背離本發明發現之精神或範圍之情形下對本文中所論述實施例做出修改及改變。實例 1 ：用於表現本發明之抗原結合分子之載體之製備 I. 產生圖 3A 之抗原結合分子之方法
編碼圖3A之抗原結合分子之多核苷酸序列之構象示於圖4A中，且表現載體示於圖5A及5B中。 藉由基因合成來產生編碼對兩種不同抗原具有特異性之兩個VL-連接體-VH-CH1-CH2片段(「VL1-連接體-VH1-CH1-CH2-CH3 (隆凸)」及「VL2-連接體-VH2-CH1-CH2-CH3 (孔洞)」)之兩種多核苷酸序列。在經MluI及MfeI限制酶消化之後，將該兩種多核苷酸序列亞選殖至抗體表現質體pTACE8中。連接體具有GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列。 藉由PCR擴增來修飾編碼兩個CH3結構域之兩種多核苷酸序列以將隆凸臂基因S354C及T366W納入一個CH3結構域之序列中；且將孔洞臂基因Y349C、T366S、L368A及Y407V納入另一CH3結構域之序列中。在經MfeI及BamHI限制酶消化之後，將該兩種經修飾之多核苷酸序列亞選殖至抗體表現質體pTACE8中以形成VL-連接體-重鏈隆凸或孔洞。 藉由基因合成來產生編碼κ片段之多核苷酸序列。在經Bgl II及EcoRI限制酶消化之後，將多核苷酸序列亞選殖至包括VL-連接體-重鏈隆凸或孔洞臂之抗體表現質體pTACE8中。 胺基酸序列示於表3中。 表3 II. 產生圖 3E 之抗原結合分子之方法
編碼圖3E之抗原結合分子之多核苷酸序列之構象示於圖4B中，且表現載體示於圖5C及5D中。 來自4A之編碼對兩種不同抗原具有特異性且具有隆凸-孔洞修飾之兩種VL-連接體-VH-CH1-CH2-CH3片段(「VL1-連接體-VH1-CH1-CH2-CH3 (隆凸)」及「VL2-連接體-VH2-CH1-CH2-CH3 (孔洞)」)之兩種質體係藉由上文所闡述之方法產生。連接體具有GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列。 藉由基因合成來產生編碼對兩種不同抗原具有特異性之兩種VL-半胱胺酸突變連接體-VH片段之兩種多核苷酸序列。在經MluI及NheI限制酶消化之後，將該兩種含有工程化半胱胺酸之多核苷酸序列亞選殖至來自4A之抗體表現載體pTACE8中。 藉由基因合成來產生編碼具有工程化半胱胺酸之κ片段之多核苷酸。在經BglII及EcoRI限制酶消化之後，將該多核苷酸亞選殖至抗體表現載體中。 胺基酸序列示於表4中。 表4 III. 產生圖 3K 之抗原結合分子之方法
編碼圖3K之抗原結合分子之多核苷酸序列之構象示於圖4C中，且表現載體示於圖5E及5F中。 藉由PCR擴增來修飾編碼兩個CH3結構域之兩種多核苷酸序列以將隆凸臂基因S354C及T366W納入一個CH3結構域之序列中；且將孔洞臂基因Y349C、T366S、L368A及Y407V納入另一CH3結構域之序列中。經MfeI及BamHI限制酶消化之後，將該兩種經修飾之多核苷酸序列亞選殖至抗體表現載體pTCAE9.11中。 藉由合成方法來產生編碼對兩種不同抗原具有特異性之兩種VH-連接體1-VL-CL-連接體2-CH1-CH2片段(「VH1-連接體-VL1-CL-連接體-CH1-CH2-CH3 (隆凸)」及「VH2-連接體-VL2-CL-連接體-CH1-CH2-CH3 (孔洞)」)之兩種多核苷酸序列。連接體1及2具有GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1)之相同胺基酸序列。經MluI及MfeI限制酶消化之後，將該兩種多核苷酸序列亞選殖至抗體表現載體pTCAE9.11中。 胺基酸序列示於表5中。 表5 Ⅳ . 產生圖 3I 之抗原結合分子之方法
編碼圖3I之抗原結合分子之多核苷酸序列之構象示於圖4D中，且表現載體示於圖5G中。 VH1-連接體-VL1-CL-連接體-CH1-連接體-VH2-連接體-VL2-CL-連接體-CH1片段係藉由基因合成來產生並在經MluI及BamHI限制酶消化之後亞選殖至抗體表現載體pTACE9.11中。連接體具有GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列。 胺基酸序列示於表6中。 表6 V. 產生圖 3J 之抗原結合分子之方法
編碼圖3J之抗原結合分子之多核苷酸序列之構象示於圖4E中，且表現載體示於圖5H中。 藉由基因合成產生κ結構域(CL)MT(T109C)
及VL1-連接體MT(G1C)
-VH1-CH1-連接體-VL2-連接體MT(G1C)
-VH2-CH1。在經Bgl II及EcoRI限制酶消化之後，將κ結構域MT(T109C)
亞選殖至抗體表現載體pTACE9.11中。在經MluI及Bgl II限制酶消化(載體藉由MluI及BamHI限制酶處理)之後，將VL1-連接體MT(G1C)
-VH1-CH1-連接體-VL2-連接體MT(G1C)
-VH2-CH1亞選殖至上文所闡述之抗體表現載體中。連接體具有GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列。 胺基酸序列示於表7中。 表7 實例 2 ：本發明之抗原結合分子之表現及純化
在37℃及8% CO2
下將Freestyle 293細胞於15 mL Freestyle293表現培養基中培育直至細胞密度為2×106
個細胞/mL為止。將37.5 μg來自實例1之每一抗原結合分子表現載體於1.5 mL 150 mM NaCl中培育作為載體溶液，且將37.5 μl (2 mg/ml) PEI(聚乙亞胺)於1.5 mL NaCl中作為PEI/NaCl溶液並在室溫(RT)下靜置5 min。將PEI/NaCl溶液添加至載體溶液並在RT下靜置10分鐘作為載體/PEI混合溶液。將所獲得之載體/PEI混合溶液添加至Freestyle 293細胞製劑中，並在37℃及8% CO2
下在135-150 rpm之振盪下培育4小時。將新鮮細胞培養培養基添加至細胞。在生長5-7天之後，收集上清液並經由無菌過濾器過濾。根據製造商之方案(MontageA)將抗體純化。表8顯示所獲得抗體之特徵。 表8
註釋： 縮寫「K」係指「隆凸」引入至各別重鏈之CH3結構域中。 縮寫「H」係指「孔洞」引入至各別重鏈之CH3結構域中。 縮寫「Kds」係指在κ結構域中存在二硫鍵。 縮寫「KiH」係指使用隆凸孔洞結構策略製備之抗體或雙特異性抗體。 縮寫「ds」係指「二硫鍵穩定化」形式。 術語「IgG(天然)」係指包含天然Fab之IgG抗體。 術語「IgG(Fab*)」係指包含本發明之Fab之IgG (1個連接體)。 術語「IgG(Fab**)」係指包含本發明之Fab之IgG (2個連接體)。 術語「Fab***」係指包含本發明之Fab之IgG(兩個彼此連結之Fab) (1個連接體)。實例 3 ：十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯醯胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)
在還原或非還原條件下藉由SDS-PAGE對自實例2獲得之純系進行分析。圖6A顯示純系編號: 005構築體內之重鏈及輕鏈片段具有預期大小及分佈。可觀察到純系編號: 006構築體之重鏈片段之大小略有增加且輕鏈片段之大小減小。大小之輕微變化係如純系編號: 006以及其他構築體所預期。圖6B顯示，在非還原條件下，經純化之純系編號: 005抗體之分子量(MW)與天然形式抗體之分子量相一致。另一方面，當與天然抗體相比時，純系編號: 006抗體顯示重鏈區中之MW較高且輕鏈區中之MW低½。純系編號: 001及純系編號: 002顯示相似之條帶圖案且來自純系編號: 007至純系編號: 011之其他構築體亦如此(圖6C及5D)。在SDS-page之非還原條件下，所有抗體均顯示相同之主要MW條帶而無二聚體或異常聚集。對於其他純系亦如此(圖6E至6L)。純系編號: 042及純系編號: 043亦係藉由SDS-page進行分析，且結果分別示於圖6M及6N中。圖6M及6N二者中之泳道1-8分別係指純系編號: 042及純系編號: 043之8個級分樣品(自通過蛋白質L管柱之上清液獲得)之SDS-PAGE結果。圖6M及6N二者中之泳道9分別係指純系編號: 042及純系編號: 043之濃縮樣品之SDS-page結果。實例 4 ：毛細管電泳 (CE) 純度 / 異質性分析
用於CE純度/異質性分析之材料包括毛細管(50 μm I.D.)、裸熔融矽石、SDS-MW凝膠緩衝液專有調配物(pH 8, 0.2% SDS)、SDS-MW樣品緩衝液-100 mM Tris-HCl (pH 9.0, 1% SDS)、IgG對照標準品、內標準品(10 kDa蛋白質, 5 mg/mL)、酸性洗滌溶液(0.1 N HCl)及鹼性洗滌溶液(0.1 N NaOH)。步驟 1 ：準備 PA 800 plus 儀器
毛細管更換：將50 μm i.d.裸熔融矽石毛細管安裝至PA 800 plus筒設置中，總毛細管長度為30.2 cm。PDA檢測器之安裝：接通儀器並容許UV燈在實驗之前預熱至少30分鐘。步驟 2 ：烷基化試劑之製備
使用250 mM碘乙醯胺(IAM)溶液作為烷基化試劑。該溶液在室溫下穩定大約24小時。IAM溶液之製備包含以下步驟：稱量46 mg之高純度IAM；將IAM轉移至1.5 mL離心管中；將1 mL之DDI水添加至1.5 mL離心管；將小瓶緊密地蓋上並充分混合直至溶解為止；並使此混合每天均新鮮且不會將其曝露於光。步驟 3 ： IgG 對照標準品之製備
IgG對照標準品之製備包含以下步驟：取出1小瓶95 μL之IgG等分試樣(1 mg/mL)對照標準品並將其置於室溫下直至其完全解凍為止；將2 μL之10 kDa內標準品添加至IgG管；在通風櫥內將5 μL之250 mM IAM添加至IgG管；將管蓋上並充分混合；在300 g下離心1分鐘；用封口膜將小瓶蓋密封並在70℃下將混合物加熱10分鐘；將小瓶置於室溫水浴中以冷卻至少3分鐘；將100 μL所製備之樣品轉移至微量小瓶中；將微量小瓶置入通用小瓶中；並將通用小瓶蓋上。步驟 4 ： IgG 非還原樣品之製備
IgG非還原樣品之製備包含以下步驟：將100 μg IgG樣品移液至0.5 mL微量離心管中；添加50 μL至95 μL之樣品緩衝液以獲得95 μL之最終體積；將2 μL之內標準品添加至管中；將5 μL之250 mM IAM溶液添加至樣品管中；將小瓶緊密地蓋上並充分混合；將樣品管在300 g下離心1分鐘；用封口膜將樣品管密封並將混合物在70℃之水浴中加熱10分鐘；將樣品管置於室溫水浴中以冷卻至少3分鐘；將100 μL所製備之樣品轉移至200 μL微量小瓶中並使內容物旋轉向下以去除任何氣泡；將微量小瓶置於通用小瓶內；並將通用小瓶蓋上。實例 5: BIAcore 分析
使用(例如) BIAcore T100使用HBS-EP+作為運行緩衝液(GE Healthcare)實施表面電漿共振實驗以對BsAb之雙重結合行為進行評估。為測定結合動力學及親和力，在BIAcore T100上實施基於SPR之分析。結合動力學係藉由該軟體提供之單循環動力學(SCK)方法來量測。將抗人類Ab以將容許達成最大反應單元(RU)之密度固定於CM5晶片上。 選擇運行：方法，選擇分析/動力學/親和力。如下設置參數：數據收集速率1Hz，檢測模式雙，溫度25℃，濃度單位nM，緩衝液A HBS-EP。 選擇流動路徑2-1，晶片CM5，再生1。 選擇啟動並將重複次數更改為3。 選擇樣品並如下設置參數：接觸時間：150 s，流速：40 μL/min，解離時間：500 s。 選擇再生並如下設置參數：再生溶液：25 mM 甘胺酸pH1.5，接觸時間：90 s，流速：30 μL /min，穩定時期：90 s。 利用運行緩衝液(HBS-EP+)對分析物進行連續稀釋。所獲得之連續濃度為40、20、10、5、2.5、0。製備樣品並根據支架位置定位樣品。 使用BIAcore T100評估軟體評估結果。 藉由減去來自空白流動槽之反應針對緩衝液效應校正結合反應。使用1:1朗繆爾(Langmuir)擬合模型來估計kon(結合速率)及koff(解離速率)。自kon與koff之比率確定KD值(抗體與其抗原之間之平衡解離常數)。實例 6 ：本發明之抗原結合分子之分析結果
根據實例5之BIAcore分析分析自實例2獲得之純系之其對靶標抗原之KD值且根據實例4之質譜及CE分析其回收率。結果示於下表9中。 表9
純系編號: 053抗體係指具有天然IgG形式且在CH3結構域中具有KiH修飾之BsAb。理論上而言，藉由使用KiH策略預期純系編號: 053抗體具有25%之回收率(參見圖1)。然而，結果顯示對於純系編號: 053純系未觀察到正確組裝之抗體。相比之下，純系編號: 013、014、016、017、019、020、022及023係指包含本發明之Fab且在CH3結構域中具有KiH修飾之BsAb，且具有多於80%之回收率。 BIAcore分析結果顯示純系編號: 001與純系編號: 002之結合親和力無顯著差異且純系編號: 005及純系編號: 006亦觀察到相同結果。對於雙特異性抗體構築體而言，純系編號: 008與純系編號: 011對gD2之結合親和力顯示無差異，類似於純系編號: 005及純系編號: 006。在純系編號: 008/純系編號: 011與純系編號: 009/純系編號: 010之間，觀察到對於VEGFA抗原之結合親和力差異50倍。該差異可能係由於抗體自二價轉變為單價所致(表8及9)。 純系編號: 026、028、030、032及034係半胱胺酸工程化BsAb，其發現具有極高之回收率(多於95%)。另外，在奈米DSC熱穩定性分析中，發現純系編號: 028之穩定性高於純系編號: 013。 該等結果顯示可在保留與抗原特異性之強親和力的同時穩健地產生本發明之包含新穎Fab形式之BsAb。 預期熟習此項技術者可想到上文說明性實例中所闡述之本發明之許多修改及改變。因此，僅如隨附申請專利範圍中出現之此等限制才應用於本發明。
圖 1
係關於IgG BsAb組裝之可能產物之示意圖。圖 2A
係關於天然Fab之構象。圖2B
至2I
係關於本發明之Fab片段之可能構象。圖 3A 至 3Q
係關於本發明之抗原結合分子之可能構象。圖 4A 至 4E
係關於用於編碼本發明之抗原結合分子之核酸序列。「*」表示隆凸孔洞引入至CH3結構域中。「#」表示工程化半胱胺酸引入至VL1結構域、VL2結構域及CL結構域中。「P」、「P1」及「P2」表示啟動子。圖 5A 至 5H
係關於用於表現本發明之抗原結合分子之載體。圖 6A 至 6N
係關於自實例2獲得之BsAb純系之SDS-PAGE結果。
Claims (11)
- 一種抗原結合Fab片段，其包含輕鏈可變結構域(VL)、輕鏈恆定結構域(CL)、重鏈可變結構域(VH)及重鏈恆定結構域1 (CH1)，其中該VL結構域之C末端經由連接體連接至該VH結構域之N末端；或該VH結構域之C末端經由連接體連接至該VL結構域之N末端。
- 如請求項1之抗原結合Fab片段，其中該VL結構域之C末端經由連接體連接至該VH結構域之N末端，且其中： (1) 該VH結構域之C末端經由肽鍵連接至該CH1結構域之N末端； (2) 該VH結構域之C末端經由肽鍵連接至該CL結構域之N末端； (3) 該VH結構域之C末端經由肽鍵連接至該CL結構域之N末端，且該CL結構域之C末端經由連接體連接至該CH1結構域之N末端；或 (4) 該VH結構域之C末端經由肽鍵連接至該CH1結構域之N末端，且該CH1結構域之C末端經由連接體連接至該CL結構域之N末端。
- 如請求項1之抗原結合Fab片段，其中該VH結構域之C末端經由連接體連接至該VL結構域之N末端，且其中： (1) 該VL結構域之C末端經由肽鍵連接至該CH1結構域之N末端； (2) 該VL結構域之C末端經由肽鍵連接至該CL結構域之N末端； (3) 該VL結構域之C末端經由肽鍵連接至該CL結構域之N末端，且該CL結構域之C末端經由連接體連接至該CH1結構域之N末端；或 (4) 該VL結構域之C末端經由肽鍵連接至該CH1結構域之N末端，且該CH1結構域之C末端經由連接體連接至該CL結構域之N末端。
- 如請求項1之抗原結合Fab片段，其中： (1) 該VL結構域經由二硫鍵連接至該CL結構域； (2) 該VH結構域經由二硫鍵連接至該CL結構域； (3) 該VL結構域經由二硫鍵連接至該CH1結構域；或 (4) 該VH結構域經由二硫鍵連接至該CH1結構域。
- 如請求項1至4中任一項之抗原結合Fab片段，其進一步包含Fc區。
- 一種抗原結合分子，其包含兩個或更多個如請求項1至5中任一項之抗原結合Fab片段，其中該兩個或更多個片段對於相同或不同抗原具有特異性。
- 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至5中任一項之抗原結合Fab片段。
- 一種載體，其包含一或多種編碼一或多個如請求項1至5中任一項之抗原結合Fab片段之多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項8之載體。
- 一種製備抗原結合分子之方法，其包含培育如請求項9之宿主細胞。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項6之抗原結合分子及醫藥上可接受之載劑。
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