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TW201809006A - 抗-pd-1抗體 - Google Patents

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TW201809006A
TW201809006A TW106125533A TW106125533A TW201809006A TW 201809006 A TW201809006 A TW 201809006A TW 106125533 A TW106125533 A TW 106125533A TW 106125533 A TW106125533 A TW 106125533A TW 201809006 A TW201809006 A TW 201809006A
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acid sequence
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TW106125533A
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伊寧那姆 漢斯 凡
伊爾薩斯 安卓 凡
朱思特 克萊茲
大衛 路特傑 休爾西克
都思 瑞思 卡洛斯 瑞卡多 羅德瑞古思
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艾杜諾生物科技控股歐洲公司
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Abstract

本發明係關於抗-PD-1抗體以及該等抗體用於治療諸如癌症及傳染病之疾病的用途。該等抗體具有如隨附序列中所提供之CDR。本發明之又一部分為編碼該等抗體之核酸、包含該等核苷酸序列之表現載體及包含該等核苷酸序列或表現載體之宿主細胞。

Description

抗-PD-1抗體
本申請案主張2016年7月29日申請之荷蘭專利申請案第2017267號之優先權,該案特此以全文引用之方式併入,包括所有表格、圖式及申請專利範圍。
本發明係關於治療藉由刺激免疫反應,特定而言藉由刺激抗原特異性T-淋巴細胞得以改善之病況。
在癌症治療領域中,增加對抗腫瘤之免疫反應強度的免疫療法已成為愈加重要之工具。在T細胞之情況下,藉由共刺激信號與抑制信號之間之平衡來調節抗腫瘤反應之穩固性,此稱為「免疫檢查點」。在其正常功能中,在維持自身耐受性及在周圍組織中調節生理學免疫反應的持續時間及幅度從而使得對旁系組織的損害最小化中涉及到免疫檢查點。在疾病中,咸信腫瘤指派某些免疫檢查點路徑以產生及維持針對對腫瘤抗原具有特異性的T細胞的免疫抗性。
由於許多免疫檢查點由配位體-受體相互作用引發,因此其可易於由抗體阻斷或由重組形式之配位體或受體來調節。程式性死亡1(PD-1)受體與其配位體PD-L1及PD-L2之間的相互作用有望作為檢查點阻斷標靶。PD-1由其配位體PD-L1及PD-L2嚙合引發抑制信號,導致T-細胞增殖、細胞激素產生及細胞毒活性減少,而阻斷PD-1或其配位體促進抗腫瘤活性。另外,PD-1據報導在慢性病毒感染期間在調節病毒特異性CD8+ T細胞之功能損耗中具有重要作用。活體內阻斷PD-1已證實恢復在慢性病毒感染期間損耗之 CD8+ T細胞的功能,諸如人類免疫缺乏病毒(HIV)、B型肝炎病毒(HBV)及C型肝炎病毒(HCV)。
PD-1之拮抗性抗體,稱為納武單抗(nivolumab)(Opdivo)及帕姆單抗(pembrolizumab)(Keytruda),已獲得FDA批准用於治療多種癌症(包括黑素瘤、非小細胞肺癌及腎細胞癌),且對於其他適應症正進行大量其他臨床試驗。也就是說,拮抗性PD-1抗體的使用不受限制。在一種研究中,少於30%的黑素瘤及肺癌患者對治療有反應,且此時不可能確定預測哪些患者將對PD-1抗體有反應。
可表示適用的PD-1拮抗性抗體之非限制性特徵集合包括以下中之一或多者:以奈莫耳級EC50及Kd特異性地結合至PD-1-表現細胞、以奈莫耳級IC50抑制PD-1與其配位體之間之結合、活體外促進抗原特異性T細胞反應、在T細胞中不介導抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及在T細胞中不介導補體依賴性細胞毒性(CDC)。
本發明之一目標在於提供包含下文規定之結構及功能特徵之PD-1拮抗性抗體、編碼該等PD-1拮抗性抗體之核酸以及其製造及使用方法。
在第一態樣中,本發明係關於結合至人類程式性死亡-1(PD-1)受體之抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包含以下中之一或多者,且視情況包含其每一者:重鏈可變區CDR1,其包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:1之胺基酸序列,重鏈可變區CDR2,其包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:2之胺基酸序列, 重鏈可變區CDR3,其包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:3之胺基酸序列,輕鏈可變區CDR1,其包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:4之胺基酸序列,輕鏈可變區CDR2,其包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:5之胺基酸序列,及輕鏈可變區CDR3,其包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
在一相關態樣中,本發明係關於編碼結合至人類程式性死亡-1(PD-1)受體之該等抗體或其抗原結合片段的核酸。
在某些實施例中,該等抗體或抗原結合片段包含重鏈序列,其包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:1之胺基酸序列;SEQ ID NO:2之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:2之胺基酸序列;及/或SEQ ID NO:3之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:3之胺基酸序列;及/或輕鏈序列,其包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:4之胺基酸序列;SEQ ID NO:5之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:5之胺基酸序列;及/或SEQ ID NO:6之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列,或 重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列;及輕鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列,或輕鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中,SEQ ID NO:7中之取代包括(但不限於)殘基A9、K12、I28、T30、T31及Y32處之一或多次取代突變。舉例而言,以下取代為較佳的:A9P、K12V、I28D、I28T、T30D、T31D、T31S、Y32D及其組合,諸如I28T_T31S、I28D_T30D、I28D_T31D、I28D_Y32D、A9P_K12V、A9P_I28T_T31S、K12V_I28T_T31S及A9P_K12V_I28T_T31S。此列表並非欲為限制性的。
因此,在某些較佳實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列, 重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列,重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列,或重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列;及輕鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列,或輕鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
在某些最佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些其他最佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些實施例中,SEQ ID NO:7之胺基酸序列由SEQ ID NO:9之核酸序列編碼;且SEQ ID NO:8之胺基酸序列由SEQ ID NO:10之核酸序列編碼。
在某些其他較佳實施例中,SEQ ID NO:31之胺基酸序列由SEQ ID NO:32之核酸序列編碼;且SEQ ID NO:33之胺基酸序列由SEQ ID NO:34之核酸序列編碼。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:35之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:36之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:37之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:38之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:39之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:40之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:41之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:44之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:46之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:47之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:48之胺基酸序列之重鏈可變區序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈可變區序列。
本發明之抗體或抗原結合片可由各種物種獲得。例如,本發明之抗體可包含免疫球蛋白序列,其為兔、小鼠、大鼠、豚鼠、雞、山羊、綿羊、驢、人類、美洲駝或駱駝序列或該等序列之組合(所謂嵌合抗體)。抗體或抗原結合片段最佳為人類或人源化抗體或抗原結合片段。
術語抗體包括抗原結合部分,亦即保留結合抗原能力之「抗原結合位點」(例如,片段、子序列、互補決定區(CDR)),包括(i)Fab片段,其為由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段;(ii)F(ab')2片段,其為包含在鉸鏈區由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段;(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段;(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段;(v)由VH結構 域組成之dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546);及(vi)經分離互補決定區(CDR)。術語「抗體」中以引用方式亦包括單鏈抗體。較佳治療抗體為完整IgG抗體。如本文所用之術語「完整IgG」意為屬於實質上由經識別免疫球蛋白γ基因編碼之抗體類別的多肽。在人類中,此類包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在小鼠中,此類包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。IgG類抗體中之已知Ig結構域為VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL及CL
在某些實施例中,抗體或抗原結合片段為完整人類或人源化IgG,其中Fab之pI為約8.2且在pH 7.4下之負荷為約6.5。術語「約」係指給定值之+/-10%且較佳+/-5%。
在某些實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段具有以下特徵中之一種、兩種、三種、四種或四種以上,且較佳具有以下每種特徵:以<10nM之EC50結合至表現人類PD-1之細胞;以<10nM之Kd結合至人類PD-1蛋白;以<10nM之Kd與食蟹猴(Macaca fascicularis)PD-1蛋白交叉反應;以<10nM之IC50抑制人類PD-1與PD-L1之間之結合;促進活體外抗原特異性T細胞反應;在PD-1陽性細胞(例如,T-細胞)中介導有限的或非抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);在T細胞中介導有限的或非補體依賴性細胞毒性(CDC);不抑制5C4結合至表現人類PD-1之細胞;及不抑制h409A11結合至表現人類PD-1之細胞;及不抑制H4H7798N結合至人類PD-1。
如上文所述,在相關態樣中,本發明係關於編碼如本文所述之抗體或抗原結合片段之經分離核酸;包含該經分離核酸之表現載體;及包含 該經分離核酸之宿主細胞。在宿主細胞之情形下,該細胞可為哺乳動物細胞(例如,諸如HEK293細胞之人類細胞、諸如CHO細胞之倉鼠細胞等)、細菌細胞(例如,大腸桿菌細胞)、酵母細胞(例如,巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞等)、植物細胞(例如,本生菸(Nicotiana benthamiana)細胞)等。哺乳動物細胞由於最有利之糖基化模式而為較佳的。
本發明亦係關於產生抗體或抗原結合片段之方法,其包括在有利於表現聚核苷酸之條件下培養該宿主細胞;且視情況自宿主細胞及/或培養基回收抗體或抗原結合片段。
在另一相關態樣中,本發明係關於包含本發明之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑之組合物。該等組合物可另外包含一或多種其他治療活性成分,諸如:以下各物之促效劑(例如,促效性抗體或其抗原結合片段或可溶性融合物):TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號轉導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、Toll樣受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAM7、BLAME (SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體;以下各物之抑制劑:PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、IDO、TDO、CD160及/或TGFRβ;環狀二核苷酸或其他STING路徑促效劑;基於細胞之疫苗,諸如重組表現所關注抗原之細菌菌株、腫瘤細胞疫苗等;多肽疫苗,其中該多肽為所關注之抗原;DNA疫苗;其中該DNA疫苗編碼所關注之多肽抗原;及病毒疫苗,其中該病毒疫苗重組表現所關注之抗原。
該等組合物可採用疫苗形式,其包含抗體或抗原結合片段且視情況包含所關注之抗原。該等疫苗可為癌症疫苗、病原體疫苗等,其為經投與用於引發或維持對特定疾病或病況之免疫性目的之組合物。
因此,本發明亦係關於治療人類受檢者之癌症的方法,其包括視情況與另一種治療劑或治療程序結合向該受檢者投與有效量之本發明之抗體或抗原結合片段;且係關於治療人類受檢者之感染或傳染病之方法,其包括視情況與另一種治療劑或治療程序結合向該受檢者投與有效量之本發明之抗體或抗原結合片段。
又在另一相關態樣中,本發明係關於增加免疫細胞活性之方法,其包括向有需要之受檢者投與有效量之本發明之抗體或抗原結合片段,通常用於以下目的:治療癌症;治療感染或傳染病;或作為疫苗佐劑;或 增加免疫細胞活化作用。
抗體或其結合片段亦可用於診斷目的。因此,在另一態樣中,本發明係關於偵測樣品中是否存在PD-1蛋白或其片段之方法,其包括使該樣品與本發明之抗體或片段接觸且偵測是否存在抗體或片段與肽之間之複合物;其中偵測到複合物表明存在PD-1蛋白或其片段。
熟習此項技術者熟知多種方法及裝置用於偵測及分析生物標記。參見例如美國專利6,143,576;6,113,855;6,019,944;5,985,579;5,947,124;5,939,272;5,922,615;5,885,527;5,851,776;5,824,799;5,679,526;5,525,524;及5,480,792及The Immunoassay Handbook,David Wild編.Stockton Press,New York,1994,其各自之全文特此以引用方式併入,包括所有表格、圖式及申請專利範圍。此項技術中已知之方法可在各種夾層、競爭性或非競爭性分析形式中利用標記分子以產生與所關注生物標記之存在或量相關之信號。合適之分析形式亦包括層析、質譜及蛋白「印漬」方法。另外,可採用某些方法及裝置(諸如生物感應器及光學免疫分析)來確定分析物之存在或量,而無需標記分子。另外,用於標記完整細胞以例如藉由流式細胞儀、免疫組織化學等進行生物標記偵測之方法可採用本發明之抗體或結合片段來偵測PD-1。
圖1展示證實針對人類PD-1之抗體hPD1.29H5L4結合至自三種不同人類供體分離之活化CD3+ T-細胞上之PD-1的實驗結果。
圖2A展示其中使用基於Jurkat之報告體分析證實hPD-1/hPD-L1阻斷之實驗結果。圖2B展示證實健康供體血細胞經SEB刺激產生IL-2在抗-PD-1抗體存在下得以增強之實驗結果。
圖3展示證實針對人類PD-1之抗體hPD1.29H5L4結合至在活化食 蟹猴PBMC上表現之食蟹猴PD-1的實驗結果。
圖4展示證實hPD1.29H5L4抗體不誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性的實驗結果。
圖5展示證實hPD1.29H5L4抗體不誘發補體依賴性細胞毒性之實驗結果。
在本發明之實施方式及實例中,將使用以下縮寫:
以下為本說明書中提及之序列清單(表1):
定義
為了可更易於理解本發明,下文特別定義某些技術及科技術語。除非此文獻其他處特別定義,否則本文使用之所有其他技術及科技術語具有本發明所屬領域普通技術人員通常所理解之含義。
如本文(包括隨附申請專利範圍)所用,除非上下文另外明確指示,單數形式之詞彙(諸如「一(a/an)」及「該(the)」)包括其對應複數提及物。
「投藥(Administration)」及「治療(treatment)」在應用於動物、人類、實驗受檢物、細胞、組織、器官或生物流體時係指外源性醫藥劑、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人類、受檢物、細胞、組織、器官或生物流體接觸。對細胞之治療涵蓋使試劑與細胞接觸以及使試劑與流體接觸,其中該流體與細胞接觸。「投藥」及「治療」藉由試劑、診斷劑、結合化合物或由另一種細胞來活體外及離體治療(例如)細胞。
「治療(Treat或treating)」意謂經內部或外部向具有一或多種疾病症狀或疑似患病之受檢者或患者投與治療劑(諸如含有本發明之任何抗體或抗原結合片段之組合物),其中該藥劑具有治療活性。藥劑通常以在受治療受檢者或人群中有效緩解一或多種疾病症狀之量投與,無論藉由以任何臨床上可量測之程度誘發該等症狀退化或抑制該等症狀發展。有效緩解任何特定疾病症狀之治療劑的量可根據諸如以下因素而變化:患者之疾病狀態、年齡及體重,及藥物在受檢者中引發所需反應之能力。疾病症狀是否 已緩解可藉由醫師或其他熟練健康護理提供者通常使用之任何臨床量測工具來評估,從而評估該症狀之嚴重性或發展狀態。
「經分離核酸分子」或「經分離聚核苷酸」意謂基因組、mRNA、cDNA或合成來源或其某些組合之DNA或RNA,其與其中天然發現經分離聚核苷酸之聚核苷酸的全部或部分無關,或與與其天然無關之聚核苷酸有關。對於本公開案之目的而言,應瞭解「包含特定核苷酸序列之核酸分子」不涵蓋完整之染色體。「包含」指定核酸序列之經分離核酸分子除指定序列以外可包括多達十個或甚至多達二十個或二十個以上其他蛋白或其部分或片段之編碼序列,或可包括控制所引用核酸序列之編碼區表現的可操作連接之調節序列及/或可包括載體序列。
短語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作連接之編碼序列所必需之DNA序列。適合原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況之操縱子序列及核糖體結合位點。真核生物細胞已知使用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。
核酸或聚核苷酸在與另一核酸序列處於功能關係時係「可操作連接的」。例如,前序列或分泌性前導序列之DNA若表現為參與多肽分泌之前蛋白,則與該多肽之DNA可操作連接;啟動子或增強子若影響編碼序列之轉錄,則與該序列可操作連接;或核糖體結合位點若位於便於轉譯位置處,則與編碼序列可操作連接。通常而言(但非總是如此),「可操作連接」意謂所連接之DNA序列係連續的,且在分泌性前導序列之情形下係連續的且處於讀取階段。然而,增強子並非必須為連續的。連接係藉由在便利之限制位點接合來完成。若該等位點不存在,則根據習知實踐使用合成之寡核苷酸接合體或連接子。
如本文所用,表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有該等表示均包括後代。因此,詞彙「轉化株」及「轉型細胞」包括初級受檢細胞及由其衍生之培養物,而不考慮轉移次數。亦應瞭解,由於有意或無意突變,並非所有後代均將具有精確相同之DNA含量。包括如在初始轉型細胞中所篩選具有相同功能或生物活性之突變體後代。當欲不同表示時,將由上下文顯而易見。
如本文所用,「生殖系序列」係指未重排免疫球蛋白DNA序列之序列。可使用任何合適來源之未重排免疫球蛋白序列。人類生殖系序列例如可由National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the United States National Institutes of Health網站上之JOINSOLVER生殖系資料庫獲得。小鼠生殖系序列例如可如Giudicelli等人(2005)Nucleic Acids Res.33:D256-D261中所述來獲得。
程式性細胞死亡蛋白1(PD-1)
在本發明之一實施例中,人類PD-1(Swiss-Prot登錄名Q15116)之胺基酸序列包含以下胺基酸序列(SEQ ID NO:11):
PD-1為單通道I型膜蛋白。人類PD-1中已知四種拓撲結構域:對應於殘基1至20之信號肽、對應於殘基21至170之細胞外結構域、對應於殘基171至191之跨膜結構域及對應於殘基192至288之細胞質結構域。存在天 然A215V變異體。另外,已知兩種精選序列衝突(S38F及P162S)。在本發明之一實施例中,馬來猴(cynomolgous monkey)(例如食蟹猴PD-1(Swiss Prot登錄名B0LAj3))之胺基酸序列包含以下胺基酸序列(SEQ ID NO:12):
抗-PD-1抗體及其抗原結合片段
本發明提供結合人類PD-1之抗體或其抗原結合片段、編碼該等抗體或抗原結合片段之核酸及該等核酸、抗體或片段之用途。在一些實施例中,分離抗-PD-1抗體或其編碼核酸。本發明包括人源化抗-PD-1抗體及其使用方法。
如上文所述,本發明之抗-PD-1抗體及其抗原結合片段在結構上可描述為包含以下中之一或多者,且視情況包含其每一者:重鏈可變區CDR1,其包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:1之胺基酸序列,重鏈可變區CDR2,其包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:2之胺基酸序列,重鏈可變區CDR3,其包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:3之胺基酸序列,輕鏈可變區CDR1,其包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:4之胺基酸序列, 輕鏈可變區CDR2,其包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:5之胺基酸序列,及輕鏈可變區CDR3,其包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
在某些較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包含重鏈序列,其包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:1之胺基酸序列;SEQ ID NO:2之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:2之胺基酸序列;及/或SEQ ID NO:3之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:3之胺基酸序列;及/或輕鏈序列,其包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:4之胺基酸序列;SEQ ID NO:5之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:5之胺基酸序列;及/或SEQ ID NO:6之胺基酸序列或經1次、2次、3次或3次以上保守取代而區別於SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
又在更佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列;及輕鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
在某些該等實施例中,SEQ ID NO:7包含殘基A9、K12、I28、T30、T31及Y32,諸如A9P、K12V、I28D、I28T、T30D、T31D、T31S、Y32D及其組合處之一或多次突變。
且在某些最佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包含(i)重鏈序列,其包含選自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48組成之群之胺基酸序列;及(ii)輕鏈序列,其包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列。
又在其他較佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包含重鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列;及輕鏈可變區序列,其包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列。
且在某些最佳實施例中,該等抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列之重鏈序列及包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列之輕鏈序列。
如本文所用之術語「抗體」係指源自能特異性地結合抗原或抗原決定基之免疫球蛋白基因或其片段、在其後建模或實質上由其編碼之肽或多肽。參見例如Fundamental Immunology,第3版,W.E.Paul編,Raven Press,N.Y.(1993);Wilson(1994;J.Immunol.Methods 175:267-273;Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。術語抗體包括抗原結合部分,亦即保留結合抗原能力之「抗原結合位點」(例如,片段、子序列、互補決定區(CDR)),包括(i)Fab片段,其為由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段;(ii)F(ab')2片段,其為包含在鉸鏈區由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段;(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段;(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段;(v)由VH結構域組成之dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546);及(vi)經分離互補決定區(CDR)。術語「抗體」中以引用方式亦包括單鏈抗體。
重鏈及輕鏈之可變域通常包含三個高變區,亦稱為互補決定區(CDR),位於相對保守之構架區(FR)內。CDR通常由構架區比對,使得可結合至特異性抗原決定基。一般而言,輕鏈及重鏈可變域自N末端至C末端包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。對每個結構域之胺基酸分配通常係根據Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人;National Institutes of Health,Bethesda,Md.,第5版;NIH公開案第91-3242號(1991);Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75;Kabat等人,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616;Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等人,(1989)Nature 342:878-883之定義。
如本文所用,術語「高變區」係指負責抗原結合之抗體或其抗原結合片段的胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(亦即,輕鏈可變域中之CDRL1、CDRL2及CDRL3及重鏈可變域中之CDRH1、CDRH2及CDRH3)。參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(由序列定義抗體之CDR區);亦參見Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(由結構定義抗體之CDR區)。如本文所用。術語「構架」或「FR」殘基係指除本文中定義為CDR殘基之高變區殘基以外的彼等可變域殘基。
IgG出於若干種實踐原因而為用於治療性抗體之較佳類別。IgG抗體在對於醫藥供應鏈而言實用之條件下係穩定的、易於純化且能夠儲存。在活體內,其具有不僅隨其大小而變化,而且係其與所謂Fc受體(或FcRn)相互作用之結果的長生物半衰期。此受體似乎保護IgG以免在細胞內分解代 謝且使其循環回血漿。
本發明之抗體或其結合片段特異性地結合PD-1。術語「特異性地結合」並非欲表示抗體僅結合至其預期之標靶,因為抗體結合至展示抗體所結合之抗原決定基的任何多肽。相反,若其對其預期標靶之親和力與其對未展示適當抗原決定基之非標靶分子的親和力相比大出約5倍,則抗體「特異性地結合」。抗體對標靶分子之親和力較佳比其對非標靶分子之親和力大至少約5倍、較佳10倍、更佳25倍、甚至更佳50倍且最佳100倍或100倍以上。在較佳實施例中,較佳抗體以至少約107M-1、且較佳約108M-1至約109M-1之間、約109M-1至約1010M-1或約1010M-1至約1012M-1之間之親和力結合。
如由Kd=koff/kon計算親和力(koff為解離速率常數、Kon為締合速率常數且Kd為平衡常數)。親和力可在平衡時藉由量測經標記配位體在各種濃度(c)下之結合分率(r)來確定。使用Scatchard公式:r/c=K(n-r)對資料繪圖:其中r=平衡時結合配位體之莫耳數/受體之莫耳數;c=平衡時之游離配位體濃度;K=平衡締合常數;且n=每個受體分子之配位體結合位點的數量。藉由圖解分析,相對於在X軸上之r在Y軸上繪製r/c,因此產生Scatchard曲線。此項技術中熟知藉由Scatchard分析量測抗體親和力。參見例如van Erp等人,J.Immunoassay 12:425-43,1991;Nelson及Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27:65-8,1988。
本發明之抗體可藉由抗原決定基定位進一步表徵,從而可選擇在本文所述之免疫分析中具有最大臨床功用之抗體及抗原決定基。術語「抗原決定基」係指能特異性結合抗體之抗原性決定子。抗原決定基通常由分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸或糖側鏈)組成,且通常具有特異性三維結構特徵以及特異性電荷特徵。構型與非構型抗原決定基之區別在於在變 性溶劑存在下喪失與前者結合而不與後者結合。較佳標靶在靶分子上存在,但在非靶分子上部分或完全不存在之抗原決定基。
在一些實施例中,抗體支架可為來自不同物種之序列混合物。因此,該抗體可為嵌合抗體及/或人源化抗體。一般而言,「嵌合抗體」及「人源化抗體」係指組合一種以上物種之區的抗體。例如,「嵌合抗體」傳統上包含來自小鼠(或在某些情形為大鼠)之可變區及來自人類之恆定區。「人源化抗體」通常係指可變域構架區交換為在人類抗體中發現之序列的非人類抗體。通常在人源化抗體中,整個抗體(除CDR以外)由人類來源之聚核苷酸編碼或與該抗體相同(除其CDR內以外)。將其中一些或全部由來源於非人類生物體之核酸編碼之CDR接枝至人類抗體可變區之β-摺疊構架中以產生抗體,其特異性由接枝之CDR來確定。該等抗體之產生例如在WO 92/11018,Jones,1986,Nature 321:522-525,Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536中描述。常需要選定之受體構架殘基「反突變」為相應供體殘基來恢復在初始接枝構築體中喪失之親和力(美國專利第5,530,101號;美國專利第5,585,089號;美國專利第5,693,761號;美國專利第5,693,762號;美國專利第6,180,370號;美國專利第5,859,205號;美國專利第5,821,337號;美國專利第6,054,297號;美國專利第6,407,213號)。人源化抗體最佳亦將包含免疫球蛋白恆定區之至少一部分,通常為人類免疫球蛋白之至少一部分,且因此通常將包含人類Fc區。人源化抗體亦可使用具有遺傳工程化免疫系統之小鼠產生。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此項技術中熟知用於人源化及改型非人類抗體之各種技術及方法(參見Tsurushita & Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)及其中引用之參考文獻)。人源化方法包括(但不限於)Jones等人,1986,Nature 321:522-525;Riechmann等人,1988; Nature 332:323-329;Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536;Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33;He等人,1998,J.Immunol.160:1029-1035;Carter等人,1992,Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9,Presta等人,1997,Cancer Res.57(20):4593-9;Gorman等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185;O'Connor等人,1998,Protein Eng 11:321-8中所述之方法。減小非人類抗體可變區免疫原性之人源化或其他方法可包括表面再建方法,例如Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973中所述。在一實施例中,如此項技術中已知,親本抗體已親和力成熟。可採用基於結構之方法用於人源化及親和力成熟,例如美國專利第11/004,590號中所述。可採用基於選擇之方法來人源化及/或親和力成熟抗體可變區,包括(但不限於)Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162;Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684;Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618;Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915;Krauss等人,2003,Protein Engineering 16(10):753-759中所述之方法。其他人源化方法可包涵僅接枝CDR之部分,包括(但不限於)美國專利第09/810,502號;Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125;De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084中所述之方法。
在一實施例中,抗體為完全人類抗體。「完全人類抗體」或「完整人類抗體」係指具有源自人類染色體之抗體的基因序列之人類抗體。完全人類抗體例如可使用轉基因小鼠獲得(Bruggemann等人,1997,Curr Opin Biotechnol 8:455-458)或由與選擇方法耦合之人類抗體庫獲得(Griffiths等人,1998,Curr Opin Biotechnol 9:102-108)。
本發明包括抗-PD-1抗原結合片段及其使用方法。如本文所用,除非另外指示,否則「抗體片段」或「抗原結合片段」係指抗體之抗原結 合片段,亦即保留與全長抗體結合之抗原特異性結合之能力的抗體片段,例如保留一或多個CDR區之片段。抗原結合片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2及Fv片段;雙功能抗體;線性抗體;單鏈抗體分子,例如sc-Fv;奈米抗體;及由抗體片段形成之多特異性抗體(例如,雙特異性抗體等)。
本發明包括抗-PD-1 Fab片段及其使用方法。「Fab片段」包含一個輕鏈及一個重鏈之CH1及可變區。Fab分子之重鏈無法與另一重鏈分子形成雙硫鍵。「Fab片段」可為木瓜蛋白酶裂解抗體之產物。
本發明包括包含Fc區之抗-PD-1抗體及其抗原結合片段及其使用方法。「Fc」區含有兩個包含抗體之CH1及CH2結構域的重鏈片段。該兩個重鏈片段由兩個或兩個以上雙硫鍵且藉由CH3結構域之疏水性相互作用固持在一起。
本發明包括抗-PD-1 Fab’片段及其使用方法。「Fab'片段」含有一個輕鏈及一個重鏈之一部分或片段,該重鏈含有VH結構域及CH1結構域以及CH1與CH2結構域之間之區域,以使得在兩個Fab'片段之兩個重鏈之間可形成鏈間雙硫鍵,從而形成F(ab')2分子。
本發明包括抗-PD-1 F(ab’)2片段及其使用方法。「F(ab')2片段」含有兩個輕鏈及兩個重鏈,該等重鏈含有CH1與CH2結構域之間之恆定區之一部分,以使得在兩個重鏈之間形成鏈間雙硫鍵。F(ab')2片段因此包含兩個由兩個重鏈之間之雙硫鍵固持在一起之Fab'片段。「F(ab')2片段」可為胃蛋白酶裂解抗體之產物。
本發明包括抗-PD-1 Fv片段及其使用方法。「Fv區」包含來自重鏈及輕鏈之可變區,但缺少恆定區。
本發明包括抗-PD-1 scFv片段及其使用方法。術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體係指包含抗體之VH及VL結構域之抗體片段,其中該等結構域 存在於單一多肽鏈中。Fv多肽通常另外包含位於VH與VL結構域之間之多肽連接子,其使得scFv可形成用於抗原結合所需之結構。關於scFv之綜述,參見Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES,第113卷,Rosenburg及Moore編.Springer-Verlag,New York,第269-315頁。亦參見國際專利申請案公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號。
本發明包括抗-PD-1結構域抗體及其使用方法。「結構域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能免疫球蛋白片段。在一些情形下,兩個或兩個以上VH區與肽連接子共價連接以產生二價結構域抗體。二價結構域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本發明包括抗-PD-1二價抗體及其使用方法。「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情形下,兩個結合位點具有相同之抗原特異性。然而,二價抗體可為雙特異性的(參見下文)。
本發明包括抗-PD-1駱駝化單結構域抗體及其使用方法。在某些實施例中,本文中之抗體亦包括駱駝化單結構域抗體。參見例如Muyldermans等人(2001)Trends Biochem.Sci.26:230;Reichmann等人(1999)J.Immunol.Methods 231:25;WO 94/04678;WO 94/25591;美國專利第6,005,079號)。在一實施例中,本發明提供單結構域抗體,其包含兩個具有使得可形成單結構域抗體之修飾的VH結構域。
本發明包括抗-PD-1雙功能抗體及其使用方法。如本文所用,術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段,該等片段包含連接至同一多肽鏈中之輕鏈可變域(VL)的重鏈可變域(VH)(VH-VL或VL-VH)。藉由使用太短而無法使同一鏈上之兩個結構域之間無法配對之連接子,迫使結構域與另一鏈之互補結構域配對且產生兩個抗原結合位點。 雙功能抗體例如在EP 404,097;WO 93/11161;及Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448中更全面描述。關於工程化抗體變異體之綜述,參見Holliger及Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136。
在基於莫耳表述活性時,以某種方式經修飾之本發明之抗體或抗原結合片段通常保留其結合親和力之至少10%(與親本抗體相比時)。本發明之抗體或抗原結合片段較佳保留作為親本抗體時之PD-1結合親和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或100%以上。亦預期本發明之抗體或抗原結合片段可包括實質上未改變其生物活性之保守或非保守胺基酸取代(稱為抗體之「保守變異體」或「功能保守變異體」)。
本發明包括經分離抗-PD-1抗體及其抗原結合片段及其使用方法。「經分離」抗體或其抗原結合片段至少部分地不含來自產生其之細胞或細胞培養物的其他生物分子。該等生物分子包括核酸、蛋白、脂質、碳水化合物或其他物質,諸如細胞碎片及生長培養基。經分離抗體或抗原結合片段可另外至少部分地不含表現系統組分(諸如來自宿主細胞之生物分子)或不含其生長培養基。術語「經分離」通常不欲係指完全不存在該等生物分子或不存在水、緩衝劑或鹽或包括抗體或片段之醫藥學調配物之組分。
本發明包括抗-PD-1嵌合抗體(例如,人類恆定域/小鼠可變域)及其使用方法。如本文所用,「嵌合抗體」為具有來自第一抗體之可變域及來自第二抗體之恆定域的抗體,其中第一及第二抗體來自不同物種。(美國專利第4,816,567號;及Morrison等人,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。可變域通常由來自實驗動物之抗體(「親本抗體」)獲得,諸如囓齒動物,且恆定域序列由人類抗體獲得,以使得所得嵌合抗體將比親本(例如,小鼠)抗體更不可能在人類受檢者中引發有害之免疫反應。
抗-PD-1抗體之產生
單株抗體製劑可使用此項技術中已知之多種技術產生,包括使用融合瘤、重組及噬菌體呈現技術或其組合。例如,單株抗體可使用融合瘤技術產生,包括此項技術中已知且例如在Harlow等人,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版.1988);Hammerling等人在MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOMAS,第563-681頁(Elsevier,N.Y.,1981)(兩者之全文均以引用方式併入中教示之彼等技術。如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指源自單一純系之抗體,包括任何真核生物、原核生物或噬菌體純系,而並非產生其之方法。
源自除大鼠及小鼠以外之動物之單株抗體提供獨特優勢。與信號轉導及疾病相關之多種蛋白標靶在小鼠、大鼠及人類之間高度保守,且因此可由小鼠或大鼠宿主識別為自身抗原,使其較不具有免疫原性。在使用兔子作為宿主動物時,可避免此問題。參見例如Rossi等人,Am.J.Clin.Pathol.,124,295-302,2005。
使用融合瘤產生及篩選特異性抗體之方法在此項技術中係常規且熟知的。在一非限制性實例中,小鼠可經所關注之抗原或表現該抗原之細胞免疫。一經偵測到免疫反應,例如在小鼠血清中偵測到對抗原具有特異性之抗體,即收集小鼠脾臟並分離脾細胞。隨後藉由熟知技術使脾細胞與任何合適之骨髓瘤細胞融合。藉由限制稀釋選擇並選殖融合瘤。隨後藉由此項技術中已知之方法分析融合瘤純系中分泌能結合抗原之抗體的細胞。藉由以陽性融合瘤純系腹膜內接種小鼠產生通常含有高含量抗體之腹水。
可用於抗體產生方法中之佐劑包括(但不限於)蛋白佐劑;細菌佐劑,例如全菌(BCG、短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)、明尼蘇達沙 門氏菌(Salmonella minnesota))及細菌組分,包括細胞壁骨架、海藻糖二黴菌酸酯、單磷醯基脂質A、結核菌之甲醇可萃取殘餘物(MER)、完全或不完全弗氏佐劑;病毒佐劑;化學佐劑,例如氫氧化鋁、碘乙酸鹽及半琥珀酸膽固酯;或裸DNA佐劑。可用於本發明之方法中之其他佐劑包括霍亂毒素(Cholera toxin)、paropox蛋白、MF-59(Chiron Corporation;亦參見Bieg等人(1999)「GAD65 And Insulin B Chain Peptide(9-23)Are Not Primary Autoantigens In The Type 1 Diabetes Syndrome Of The BB Rat,」Autoimmunity,31(1):15-24,其以引用方式併入本文中)、MPL®(Corixa Corporation;亦參見Lodmell等人(2000)「DNA Vaccination Of Mice Against Rabies Virus:Effects Of The Route Of Vaccination And The Adjuvant Monophosphoryl Lipid A(MPL),」Vaccine,18:1059-1066;Johnson等人(1999)「3-O-Desacyl Monophosphoryl Lipid A Derivatives:Synthesis And Immunostimulant Activities,」Journal of Medicinal Chemistry,42:4640-4649;Baldridge等人(1999)「Monophosphoryl Lipid A(MPL)Formulations For The Next Generation Of Vaccines,」Methods,19:103-107,其全部以引用方式併入本文中)、RC-529佐劑(Corixa Corporation;來自Corixa胺基烷基胺基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)化學庫之先導化合物,亦參見www.corixa.com)及DETOXTM佐劑(Corixa Corporation;DETOXTM佐劑包括MPL®佐劑(單磷醯基脂質A)及分枝桿菌細胞壁骨架;亦參見Eton等人(1998)「Active Immunotherapy With Ultraviolet B-Irradiated Autologous Whole Melanoma Cells Plus DETOX In Patients With Metastatic Melanoma,」Clin.Cancer Res.4(3):619-627;及Gupta等人(1995)「Adjuvants For Human Vaccines-Current Status,Problems And Future Prospects,」Vaccine,13(14):1263-1276,兩者均以引用方式併入本文中)。
多個公開案論述使用噬菌體呈現技術來產生及篩選用於結合至 選定分析物之多肽庫。參見例如Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990;Devlin等人,Science 249,404-6,1990,Scott及Smith,Science 249,386-88,1990;及Ladner等人,美國專利第5,571,698號。噬菌體呈現方法之基本概念係在編碼待篩選之多肽之DNA與該多肽之間建立物理關聯性。此物理關聯性係由噬菌體粒子提供,其將多肽呈現為封閉編碼多肽之噬菌體基因體的衣殼。在多肽與其遺傳物質之間建立物理關聯性使得可同時大規模篩選極大量之帶有不同多肽之噬菌體。呈現與標靶具有親和力之多肽的噬菌體結合至標靶且該等噬菌體藉由親和力篩選富集至標靶。由該等噬菌體呈現之多肽之特性可由其各自之基因組來確定。使用該等方法,隨後可藉由習知方式大量合成經識別與所需標靶具有結合親和力之多肽。參見例如美國專利第6,057,098號,其全文特此併入,包括所有表格、圖式及申請專利範圍。
藉由該等方法產生之抗體隨後可藉由首先篩選與所關注純化多肽之親和力及特異性,且若需要將結果與抗體與需要排除結合所需之多肽之親和力及特異性進行比較來選擇。篩選程序可涵蓋將經純化之多肽固定在微量滴定盤之單獨孔中。隨後將含有潛在抗體或抗體群組之溶液置於各自之微量滴定孔中並培育約30min至2h。隨後洗滌微量滴定孔並向各孔中添加經標記之二級抗體(例如,若產生之抗體為小鼠抗體,則為與鹼性磷酸酶結合之抗-小鼠抗體)並培育約30min且隨後洗滌。向各孔中添加受質,且當存在經固定多肽之抗體時,將出現顯色反應。
隨後可經選定之分析設計進一步分析所識別抗體之親和力及特異性。在研發用於標靶蛋白之免疫分析中,經純化之靶蛋白充當標準物,由其使用經選擇之抗體來判斷免疫分析之敏感性及特異性。由於各種抗體之結合親和力可能不同;某些抗體對(例如在夾層分析中)可能在空間上相互 干擾等,因此抗體之分析效能可能為比抗體之絕對親和力及特異性更重要之量測措施。
抗體亦可使用無法表現功能內源性免疫球蛋白,但可表現人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠來產生。例如,人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物可隨機或藉由同源重組引入小鼠之胚胎幹細胞中。或者,除人類重鏈及輕鏈基因以外,人類可變區、恆定區及多變區可引入小鼠之胚胎幹細胞中。可與藉由同源重組引入人類免疫球蛋白基因座單獨或同時對小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因賦予非功能性。特定而言,純合缺失JH區防止內源性抗體產生。經修飾之胚胎幹細胞經擴張且微注射至囊胚中以產生嵌合小鼠。隨後飼養嵌合小鼠以產生表現人類抗體之純合後代。使用習知方法,以選定抗原(例如全部或一部分本發明之多肽)對轉基因小鼠進行免疫。針對抗原之單株抗體可使用習知融合瘤技術自經免疫之轉基因小鼠獲得。轉基因小鼠所擁有之人類免疫球蛋白轉基因在B細胞分化期間重排,且隨後經歷類別轉換及體細胞突變。因此,使用該技術可能產生治療上適用之IgG、IgA、IgM及IgE抗體。關於此產生人類抗體之技術的概述,參見Lonberg等人(1995)「Human Antibodies From Transgenic Mice,」Int.Rev.Immunol.13:65-93,其全文以引用方式併入本文中)。關於此產生人類抗體及人類單株抗體之技術及產生該等抗體之實驗方案的詳細論述,參見例如國際公開案第WO 98/24893號、第WO 96/34096號及第WO 96/33735號;及美國專利第5,413,923號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,569,825號、第5,661,016號、第5,545,806號、第5,814,318號及第5,939,598號,其全文以引用方式併入本文中。另外,諸如Abgenix/Amgen(Freemont,Calif.)及Medarex/BMS(Princeton,N.J.)、Kymab(Cambridge,UK)及Merus(Utrecht,Netherlands)之公司可參與使用類似於上文所述之技術提供針對選定抗原之人類抗體。
抗-PD-1抗體之重組表現
一經獲得編碼本發明之抗體之核酸序列,即可使用此項技術中熟知之技術,藉由重組DNA技術產生用於產生抗體之載體。可使用熟習此項技術者熟知之方法來構建含有抗體編碼序列及適當轉錄與轉譯控制信號之表現載體。該等方法例如包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內基因重組。(參見例如Sambrook等人,1990,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.及Ausubel等人編,1998,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,NY中所述之技術)。
包含抗體之核苷酸序列之表現載體可藉由習知技術(例如,電穿孔、脂質體轉染及磷酸鈣沈澱)轉移至宿主細胞且隨後藉由習知技術培養經轉染之細胞以產生本發明之抗體。在特定實施例中,藉由組成性、誘導性或組織特異性啟動子調節抗體之表現。
本文揭示之抗-PD-1抗體亦可重組產生(例如,在大腸桿菌/T7表現系統、哺乳動物細胞表現系統或低等真核生物表現系統中)。在此實施例中,可將編碼本發明之抗體免疫球蛋白分子之核酸(例如,VH或VL)插入基於pET之質體中並在大腸桿菌/T7系統中表現。例如,本發明包括用於在宿主細胞(例如,細菌宿主細胞,諸如大腸桿菌,諸如BL21或BL21DE3)中表現抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈之方法,其包括在亦包括編碼與T7啟動子可操作連接之免疫球蛋白鏈之聚核苷酸的細胞中表現T7 RNA聚合酶。例如,在本發明之一實施例中,細菌宿主細胞(諸如大腸桿菌)包括編碼與lac啟動子可操作連接之T7 RNA聚合酶基因之聚核苷酸且藉由以IPTG(異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)培育宿主細胞來誘發聚合酶與鏈之表現。
因此,本發明包括用於製造本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈之重組方法,其包括引入編碼抗體或片段之一或多個免疫球蛋白鏈(例如,免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈)之聚核苷酸;在有利於該表現之條件下培養宿主細胞(例如,CHO或畢赤酵母菌(Pichia)或巴斯德畢赤酵母)及視情況自宿主細胞及/或宿主細胞生長之培養基分離抗體或片段或鏈。
抗-PD-1抗體亦可藉由美國專利第6,331,415號中所述之任何方法來合成。
真核生物及原核生物宿主細胞(包括作為用於表現本文揭示之抗體或片段或免疫球蛋白鏈之宿主的哺乳動物細胞)在此項技術中係熟知的且包括由美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)可得之多種永生化細胞株。該等細胞株尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0、SP2細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如,Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞及多種其他細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、狗、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。尤其較佳之細胞株經由確定何種細胞株具有高表現水平來選擇。可使用之其他細胞株為昆蟲細胞株,諸如Sf9細胞、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。真菌細胞包括酵母及絲狀真菌細胞,包括例如,巴斯德畢赤酵母、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、可克拉姆畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭畢赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、微小畢赤酵母(Pichia minuta)(小畢赤酵母(Ogataea minuta)、林氏畢赤酵母(Pichia lindneri))、仙人掌畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳畢赤酵母(Pichia salictaria)、柳畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮傑普畢赤酵母(Pichia pijperi)、樹幹畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬物種(Pichia sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母屬物種(Saccharomyces sp.)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬物種(Kluyveromyces sp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白假絲酵母(Candida albicans)、構巢麯黴(Aspergillus nidulans)、黑麯黴(Aspergillus niger)、米麯黴(Aspergillus oryzae)、瑞氏木黴(Trichoderma reesei)、盧克諾文思金色孢菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮孢菌屬物種(Fusarium sp.)、禾穀鐮孢菌(Fusarium gramineum)、金黃色鐮孢(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)及粗糙鏈孢黴(Neurospora crassa)。畢赤酵母屬物種、任何酵母屬物種、多形漢遜酵母、任何克魯維酵母屬物種、白假絲酵母、任何麯黴屬物種、瑞氏木黴、Chrysosporium lucknowense、任何鐮孢菌屬物種(Fusarium sp.)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)及粗糙鏈抱黴。當將編碼重鏈或其抗原結合部分或片段、輕鏈及/或其抗原結合片段之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時,藉由將宿主細胞培養足以允許在宿主細胞中表現抗體或片段或鏈或足以允許分泌至宿主細胞生長之培養基中的時間段來產生抗體。
可利用各種宿主表現載體系統來表現本發明之抗體。該等宿主表現系統不僅代表可產生抗體之編碼序列且隨後進行純化之媒劑,而且代表在經適當核苷酸編碼序列轉型或轉染時可就地表現本發明抗體之細胞。該等宿主表現系統包括(但不限於)經含有免疫球蛋白編碼序列之重組噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA表現載體轉型之微生物,諸如細菌(例如,大腸桿菌及枯草桿菌(B.subtilis));經含有免疫球蛋白編碼序列之重組酵母表現載體轉型之酵母(例如,釀酒畢赤酵母(Saccharomyces pichia));經含有免疫球蛋白編碼序列之重組病毒表現載體(例如,桿狀病毒)感染之昆蟲細胞 系統;經重組病毒表現載體(例如,花椰菜嵌紋病毒(CaMV)及菸草嵌紋病毒(TMV))感染或經含有免疫球蛋白編碼序列之重組質體表現載體(例如,Ti質體)轉型之植物細胞系統;或具有含有來源於哺乳動物細胞基因組之啟動子(例如,金屬硫蛋白啟動子)或來源於哺乳動物病毒之啟動子(例如,腺病毒晚期啟動子;痘苗病毒7.5K啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞系統(例如,COS、CHO、BHK、293、293T、3T3細胞、淋巴細胞(參見美國專利第5,807,715號)、Per C.6細胞(由Crucell研發之大鼠視網膜細胞))。
在細菌系統中,可視表現抗體預期之用途來有利地選擇多種表現載體。例如,當欲產生大量該種蛋白以產生抗體之醫藥組合物時,引導易於純化之融合蛋白產物之高水平表現的載體可為有利的。該等載體包括(但不限於)大腸桿菌表現載體pUR278(Ruther等人(1983)「Easy Identitication Of cDNA Clones,」EMBO J.2:1791-1794),其中抗體編碼序列可個別地接合至具有lac Z編碼區之構架中的載體以產生融合蛋白;pIN載體(Inouye等人(1985)「Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli,」Nucleic Acids Res.13:3101-3110;Van Heeke等人(1989)「Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli,」J.Biol.Chem.24:5503-5509);及其類似物。亦可使用pGEX載體將外來多肽表現為與麩胱甘肽S-轉移酶(GST)之融合蛋白。一般而言,該等融合蛋白可溶且可藉由吸附並結合至基質麩胱甘肽-瓊脂糖珠粒,繼而在游離麩胱甘肽存在下溶離而自溶解細胞純化。pGEX載體經設計為包括凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位點以便可自GST部分釋放經選殖之靶基因產物。
在昆蟲系統中,使用加州苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus,AcNPV)作為表現外來基因之載體。病毒在草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞中生長。抗體編碼序列 可個別地選殖至病毒之非必需區(例如,多角體蛋白基因)且處於AcNPV啟動子(例如,多角體蛋白啟動子)之控制下。
在哺乳動物宿主細胞中,可使用大量基於病毒之表現系統。若使用腺病毒作為表現載體,所關注之抗體編碼序列可接合至腺病毒轉錄/轉譯控制複合物,例如晚期啟動子及三聯前導序列。此嵌合基因隨後可藉由活體外或活體內重組插入腺病毒基因組中。插入病毒基因組之非必需區(例如,E1或E3區)將產生可存活且能夠在受感染宿主中表現免疫球蛋白分子之重組病毒。(參見例如,參見Logan等人(1984)「Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)81:3655-3659)。有效轉譯插入之抗體編碼序列亦可能需要特異性起始信號。該等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。此外,起始密碼子必須與所需編碼序列之閱讀框架同相以確保整個插入物之轉譯。該等外源性轉譯控制信號及起始密碼子可具有各種來源,天然及合成的。可藉由包括適當之轉錄增強子元件、轉錄終止子等來增強表現效率(參見Bitter等人(1987)「Expression And Secretion Vectors For Yeast,」Methods in Enzymol.153:516-544)。
另外,可選擇調節插入序列表現或以所需特定方式修飾及加工基因產物之宿主細胞菌株。對於蛋白產物之該等修飾(例如,糖基化)及加工(例如,裂解)對於蛋白之功能而言可為重要的。不同宿主細胞具有用於轉譯後加工及修飾蛋白及基因產物之特徵性及特異性機制。可選擇適當之細胞株或宿主系統以確保對所表現外來蛋白之正確修飾及加工。為此目的,可使用具備適當加工初級轉錄體、糖基化及磷酸化基因產物之細胞機制的真核生物宿主細胞。該等哺乳動物宿主細胞包括(但不限於)CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、293、293T、3T3、WI38、BT483、Hs578T、HTB2、 BT20及T47D、CRL7030及Hs578Bst。
對於長期高產率產生重組蛋白而言,較佳為穩定表現。例如,可工程化穩定表現本發明抗體之細胞株。不使用含有病毒複製來源之表現載體,相反可由受適當表現控制元件(例如,啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記來轉型宿主細胞。在引入外來DNA之後,可允許工程化細胞在富集培養基中生長1至2天,且隨後轉換為選擇性培養基。重組質體中之可選標記賦予選擇抗性且使得細胞可將質體穩定整合至其染色體中並生長形成病灶,該病灶又可經選殖且擴張至細胞株中。此方法可有利地用於工程化表現本發明抗體之細胞株。該等工程化細胞株可尤其適用於篩選及評估與本發明抗體直接或間接相互作用之化合物。
可使用多種選擇系統,包括(但不限於)在tk-、hgprt-或aprt-細胞中分別可採用單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人(1977)「Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells,」Cell 11:223-232)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska等人(1962)「Genetics Of Human Cess Line.IV.DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)48:2026-2034)及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等人(1980)「Isolation Of Transforming DNA:Cloning The Hamster Aprt Gene,」Cell 22:817-823)基因。又,可使用抗代謝物抗性作為選擇以下基因之基礎:dhfr,其賦予對甲胺喋呤之抗性(Wigler等人(1980)「Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:3567-3570;O'Hare等人(1981)「Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase,」 Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:1527-1531);gpt,其賦予對黴酚酸之抗性(Mulligan等人(1981)「Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)78:2072-2076);neo,其賦予對胺基糖苷G-418之抗性(Tachibana等人(1991)「Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV2-Neo Gene,」Cytotechnology 6(3):219-226;Tolstoshev(1993)「Gene Therapy,Concepts,Current Trials And Future Directions,」Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596;Mulligan(1993)「The Basic Science Of Gene Therapy,」Science 260:926-932;及Morgan等人(1993)「Human gene therapy,」Ann.Rev.Biochem,62:191-217)。可用之重組DNA技術領域中通常已知之方法在Ausubel等人(編),1993,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,NY;Kriegler,1990,GENE TRANSFER AND EXPRESSION,A LABORATORY MANUAL,Stockton Press,NY;及在第12及13章,Dracopoli等人(編),1994,CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS,John Wiley & Sons,NY.;Colbere-Garapin等人(1981)「A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells,」J.Mol.Biol.150:1-14中描述;及hygro,其賦予對潮黴素之抗性(Santerre等人(1984)「Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells,」Gene 30:147-156)。
本發明抗體之表現水平可藉由載體擴增而增加(關於綜述,參見Bebbington及Hentschel,「The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells,」在DNA CLONING,第3卷中(Academic Press,New York,1987))。當載體系統中表現抗體之標記可擴 增時,宿主細胞培養物中存在之抑制劑含量增加將增加標記基因複本之數量。由於擴增區與抗體之核苷酸序列相關,因此產生之抗體亦將增加(Crouse等人(1983)「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,」Mol.Cell.Biol.3:257-266)。
宿主細胞可與本發明之兩種表現載體共轉染,編碼源自重鏈之多肽的第一載體及編碼源自輕鏈之多肽的第二載體。兩種載體可含有相同之可選標記,其使得可等同表現重鏈及輕鏈多肽。或者,可使用編碼重鏈及輕鏈多肽之單一載體。在該等情形中,輕鏈應置於重鏈之前以避免過量無毒重鏈(Proudfoot(1986)「Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,」Nature 322:562-565;Kohler(1980)「Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines,」Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)77:2197-2199)。重鏈及輕鏈之編碼序列可包含cDNA或基因組DNA。
一般而言,在特定細胞株或轉基因動物中產生之糖蛋白將具有在細胞株或轉基因動物中產生之糖蛋白所特有之糖基化模式。因此,抗體之特定糖基化模式將取決於用以產生抗體之特定細胞株或轉基因動物。然而,由本文提供之核酸分子編碼或包含本文提供之胺基酸序列的所有抗體均包含本發明,而與抗體可能具有之糖基化模式無關。類似地,在特定實施例中,具有僅包含非岩藻糖基化N-聚糖之糖基化模式的抗體可為有利的,因為該等抗體已證實通常在活體外或活體內展示比其岩藻糖基化對應物更有效之功效(參見例如,Shinkawa等人,J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003);美國專利第6,946,292號及第7,214,775號)。該等具有非岩藻糖基化N-聚糖之抗體不可能具有免疫原性,因為其碳水化合物結構係存在於人類血清IgG中之群體的正常組分。
本發明之抗體一經重組表現,即可藉由此項技術中已知用於純化抗體之任何方法來純化,例如藉由層析(例如,離子交換、親和力,尤其藉由對蛋白A後之特異性抗原之親和力及尺寸化管柱層析)、離心、差別性溶解度或藉由用於純化蛋白之任何其他標準技術。
例示性抗-PD-1抗體之物理及功能特性
「本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段」包括:本文論述之任何抗體或其抗原結合片段(例如,hPD-1.29A)或其人源化形式(例如,hPD1.29H5L4)或其變異體(例如,序列變異體或功能變異體);包含SEQ ID NO:1-6中所述之任一或多個CDR之任何抗體或抗原結合片段。
與本發明之任何抗-PD-1抗體或其抗原結合片段結合相同抗原決定基之抗體及片段亦形成本發明之部分。存在若干種方法可用於將抗體抗原決定基定位在靶抗原上,包括:交叉競爭分析(以ELISA形式或生物膜層干涉法(BioLayer Interferometry)配置)、其中交換小鼠PD-1結構域與人類PD-1結構域之結構域交換、點突變(丙胺酸掃描;小鼠/人類單點突變)及肽陣列(以肽之間之大量胺基酸重疊覆蓋整個蛋白)。用於定位抗體之抗原決定基之其他方法包括(但不限於):H/D-Ex質譜法、X射線結晶學、NMR及肽庫掃描。
在其他實施例中,本發明提供結合人類PD-1(例如,人源化抗體)且具有與SEQ ID NO:7及8具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之VL結構域及VH結構域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中,本發明提供結合人類PD-1(例如,人源化抗體)且具有與SEQ ID NO:8、18、19、20或33之一具有至少95%序列一致性之VL結構域以及與SEQ ID NO:7、14、15、16、17或31之一具有至少95%序列一致性之VH結構域的抗體或其抗原結合片段。
「經保守修飾之變異體」或「保守取代」係指以具有類似特徵(例如,電荷、側鏈尺寸、疏水性/親水性、主鏈構型及硬度等)之其他胺基酸取代蛋白中之胺基酸,以使得可常進行變化而不改變蛋白之生物學活性。熟習此項技術者意識到,一般而言在多肽非必需區中之單一胺基酸取代並不實質上改變生物學活性(參見例如Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁(第4版))。另外,取代結構上或功能上類似之胺基酸較不可能破壞生物學活性。例示性保守取代列於表2中。
本發明亦涵蓋本發明抗體之功能保守變異體。如本文所用,「功能保守變異體」係指其中一或多個胺基酸殘基已改變但未改變所需特性(諸 如抗原親和力及/或特異性)之抗體或片段。該等變異體包括(但不限於)將一胺基酸用具有類似特性之胺基酸置換,諸如表2之保守胺基酸取代。亦提供包含本發明之抗-PD-1抗體之VL結構域的經分離多肽(例如,SEQ ID NO:8、18、19、20或33)及包含本發明之抗-PD-1抗體之VH結構域的經分離多肽(例如,SEQ ID NO:7、14、15、16、17或31),在每種情形下均具有多達0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上保守胺基酸取代。
在另一實施例中,提供結合PD-1且具有與本文所述之VL結構域或VH結構域中之一或多者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%或75%序列一致性之VL結構域及VH結構域並展示特異性結合至PD-1之抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中,本發明之結合抗體或其抗原結合片段包含具有多達0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或25個以上胺基酸取代且展示特異性結合至PD-1之VL及VH結構域(具有及不具有信號序列)。
聚核苷酸及多肽
本發明進一步包含編碼本發明之抗-PD-1抗體及其抗原結合片段之任何多肽或免疫球蛋白鏈的聚核苷酸。例如,本發明包括編碼SEQ ID NO:1-8中任一者所述之胺基酸之聚核苷酸。
在一實施例中,提供編碼本文所述之經分離抗體或抗原結合片段之多肽鏈的經分離聚核苷酸,例如DNA。在一實施例中,經分離之聚核苷酸編碼包含至少一個根據本發明之成熟免疫球蛋白輕鏈可變(VL)域及/或至少一個根據本發明之成熟免疫球蛋白重鏈可變(VH)域之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中,經分離之聚核苷酸編碼單一聚核苷酸分子上之輕鏈及重鏈,且在其他實施例中,編碼單獨聚核苷酸分子上之輕鏈及重鏈。 在另一實施例中,聚核苷酸進一步編碼信號序列。
在一實施例中,本發明包含編碼SEQ ID NO:1-6中所列之一或多個CDR結構域的經分離聚核苷酸。
在一實施例中,本發明包含編碼SEQ ID NO:7、較佳SEQ ID NO:9之免疫球蛋白重鏈可變區序列之經分離聚核苷酸或編碼選自由SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48組成之群之免疫球蛋白重鏈可變區序列之經分離聚核苷酸。
在一實施例中,本發明包含編碼SEQ ID NO:8、較佳SEQ ID NO:10之免疫球蛋白輕鏈可變區序列之經分離聚核苷酸。
本發明亦提供包含本發明之經分離聚核苷酸之載體,例如表現載體,諸如質體,其中當宿主細胞經載體轉染時,聚核苷酸可操作地連接至該宿主細胞所識別之控制序列。亦提供包含本發明之載體之宿主細胞及用於產生本文所揭示之抗體或其抗原結合片段或多肽之方法,其包括在培養基中培養具有表現載體或編碼抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白鏈之核酸的宿主細胞且自宿主細胞或培養基分離抗原或其抗原結合片段。
本發明中亦包括多肽,例如免疫球蛋白多肽,其包含與本文提供之抗體之胺基酸序列至少約75%一致、80%一致、更佳至少約90%一致且最佳至少約95%一致(例如,95%、96%、97%、98%、99%、100%)之胺基酸序列(當藉由BLAST演算法進行對比時),其中選擇演算法之參數以在各自參考序列之整個長度上在各自序列之間達成最大匹配(例如,期望閾值:10;字長:3;查詢範圍內之最大匹配:0;BLOSUM 62矩陣;空位罰分:現存值11,延伸值1;條件性組成分值矩陣調整)。
序列一致性係指當兩個序列最佳比對時,兩種多肽之胺基酸在同樣位置相同之程度。
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抗-PD-1抗體阻斷PD-1與PD-L1/PD-L2結合之能力
在一些實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或抗原結合片段能阻斷人類PD-1與人類PD-L1及/或PD-L2結合。可使用此項技術中已知之任何方法確定阻斷人類PD-1與人類PD-L1/PD-L2結合之能力。在一實施例中,使用ELISA分析來確定抗體阻斷人類PD-1與人類PD-L1/PD-L2結合之能力。
抗體工程化
另外包括其中抗-PD-1抗體及其抗原結合片段為工程化抗體以在親本hPD-1.29A單株抗體之可變域中包括對構架殘基之修飾,例如用以改良抗體或片段之特性的實施例。通常進行該等構架修飾以減小抗體或片段之免疫原性。此通常藉由以來自將使用抗體之物種之免疫組庫之類似殘基(例如在人類治療劑之情形下為人類殘基)置換親本(例如,囓齒動物)抗體或片段之可變域中之非CDR殘基(亦即,構架殘基)來實現。該種抗體或片段稱為「人源化」抗體或片段。在某些情形下有利的係增加工程化(例如人源化)抗體之親和力,或改變其特異性。一種方式係使一或多個構架殘基「反突變」為相應生殖系序列。更特定而言,經歷體細胞突變之抗體或片段可含有不同於抗體所來源之生殖系序列的構架殘基。該等殘基可藉由將抗體或片段構架序列與抗體或片段所來源之生殖系序列相比較來識別。另一種方式係在工程化(例如人源化)抗體之一或多個位置處恢復為初始親本(例如囓齒動物)殘基,例如用以恢復在置換構架殘基過程中所損失之結合親和力。(參見例如美國專利第5,693,762號、美國專利第5,585,089號及美國專利第5,530,101號。)
在某些實施例中,抗-PD-1抗體及其抗原結合片段經工程化(例如人源化)以在構架及/或CDR中包括修飾從而改良其特性。該等工程化改變可基於分子建模。可構建親本(非人類)抗體序列之可變區的分子模型來理解 抗體之結構特徵並用於識別可與抗原相互作用之抗體上之潛在區域。習知CDR係基於比對免疫球蛋白序列及識別可變區。Kabat等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人;National Institutes of Health,Bethesda,Md.;第5版;NIH公開案第91-3242號;Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75;Kabat等人,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616。Chothia及合作者謹慎檢查抗體晶體結構中之環及所提議高變環之構型。Chothia等人,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等人,(1989)Nature 342:878-883。分類為「CDR」及「高變環」之區域之間存在變化。後期研究(Raghunathan等人,(2012)J.Mol Recog.25,3,103-113)分析了若干種抗體-抗原晶體複合物且觀察到抗體中之抗原結合區並非必需與「CDR」殘基或「高變」環嚴格相符。可使用非人類抗體之可變區的分子模型來引導選擇可潛在地結合至抗原之區域。實際上,基於模型之潛在抗原結合區不同於習知之「CDR」或「高變」環。可使用諸如Discovery Studio(Dassault Systèmes BIOVIA)之市售科技軟體進行分子建模。人類構架可基於構架及CDR中與非人類序列最佳匹配來選擇。對於VH中之FR4(構架4)而言,將人類生殖系之VJ區與相應非人類區相比較。在VL中之FR4(構架4)之情形下,將人類生殖系序列之J-κ及J-λ區與相應非人類區相比較。一經識別合適之人類構架,即將CDR接枝至選定之人類構架中。在某些情形下,VL-VH界面中之某些殘基可原樣保留在非人類(親本)序列中。分子模型亦可用於識別可潛在地改變CDR構型之殘基且因此可用於結合至抗原。在某些情形下,該等殘基原樣保留在非人類(親本)序列中。分子模型亦可用於識別可導致不利作用(諸如糖基化、脫醯胺作用及氧化作用)之溶劑暴露胺基酸。可在設計階段早期引入可顯影過濾器來消除/最小化該等潛在問題。
另一類型之構架修飾涵蓋使構架區內或甚至一或多個CDR區內 之一或多個殘基突變來移除T細胞抗原決定基,從而減小抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」且在美國專利第7,125,689號中進一步詳細描述。
在特定實施例中,將需要將含有暴露側鏈之某些胺基酸變為另一種胺基酸殘基以對最終抗體提供更大之化學穩定性,從而避免脫醯胺化或異構化。天冬醯胺酸之脫醯胺化可發生在NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或QS序列上且導致產生在多肽鏈中引入扭結且減小其穩定性之異天冬胺酸殘基(異天冬胺酸作用)。異構化可發生在DG、DS、DA或DT序列處。在某些實施例中,本公開案之抗體不含有脫醯胺化或天冬醯胺酸異構位點。
例如,天冬醯胺酸(Asn)殘基可變為Gln或Ala以減小在任何Asn-Gly序列中,尤其在CDR內形成異天冬胺酸酯之可能性。類似問題可發生在Asp-Gly序列中。Reissner及Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60:1281。異天冬胺酸酯形成可減弱或完全消除抗體與其靶抗原之結合。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731第734頁。在一實施例中,天冬醯胺酸變為麩醯胺酸(Gln)。亦可需要改變與天冬醯胺酸(Asn)或麩醯胺酸(Gln)殘基相鄰之胺基酸以減小脫醯胺化之可能性,當小的胺基酸出現在與天冬醯胺酸或麩醯胺酸相鄰處時,將以更大速率發生脫醯胺化。參見Bischoff & Kolbe(1994)J.Chromatog.662:261。另外,CDR中之任何甲硫胺酸殘基(通常為溶劑暴露之Met)可變為Lys、Leu、Ala或Phe或其他胺基酸以減小甲硫胺酸硫氧化之可能性,此將減小抗原結合親和力而且導致最終抗體製劑中之分子異質性。另外,為防止或最小化可能易斷裂之Asn-Pro肽鍵,可能需要將在CDR中發現之任何Asn-Pro組合改變為Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。具有該等取代之抗體隨後經篩選以確保該等取代不以不可接受之水平減小抗體對 PD-1之親和力或特異性,或其他有利之生物學活性。
Fc區之抗體工程化
本文揭示之抗體(例如,人源化抗體)及其抗原結合片段亦可經工程化以在Fc區內包括修飾,通常用以改變抗體之一或多種特性,諸如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或效應功能(例如,抗原依賴性細胞之細胞毒性)。此外,本文揭示之抗體及其抗原結合片段可經化學修飾(例如,一或多個化學部分可連接至抗體)或經修飾以改變其糖基化,從而再次改變抗體或片段之一或多種特性。該等實施例各自在下文中進一步詳述。Fc區中殘基之編號係Kabat之EU索引的編號。
本文揭示之抗體及其抗原結合片段亦包括具有經修飾(或阻斷)之Fc區以提供改變之效應功能的抗體及片段。參見例如美國專利第5,624,821號;WO2003/086310;WO2005/120571;WO2006/0057702。該等修飾可用於增強或抑制免疫系統之各種反應,在診斷及治療中可能具有有益作用。Fc區之改變包括胺基酸變化(取代、刪除及插入)、糖基化或去糖基化以及添加多個Fc區。Fc之變化亦可改變抗體在治療性抗體中之半衰期、使得給藥頻率降低且因此增加便利性並減少材料之使用。參見Presta(2005) J.Allergy Clin.Immunol.116:731在第734-35頁。
在一實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段為在對應於重鏈恆定區之鉸鏈區中之228位(S228P;EU索引)的位置處包含絲胺酸至脯胺酸突變之IgG4同型抗體或片段。據報導此突變消除了鉸鏈區中重鏈間二硫橋之異質性(Angal等人(1993)Mol.Immunol.30:105-108;241位係基於Kabat編號系統)。
在本發明之一實施例中,CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數量增加或減少。此方法在美國專利第5,677,425號中進一步描述。改變CH1鉸鏈區中半胱胺酸殘基之數量例如促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或減小抗體之穩定性。
在另一實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段之Fc鉸鏈區發生突變以減小抗體或片段之生物學半衰期。更特定而言,在Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中引入一或多個胺基酸突變以使得抗體或片段相對於天然之Fc-鉸鏈結構域SpA結合而言具有受損之葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。此方法在美國專利第6,165,745號中進一步詳述。
在另一實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段經修飾以增加其生物學半衰期。各種方法均係可能的。例如,如美國專利第6,277,375號中所述,可引入一或多個以下突變:T252L、T254S、T256F。或者,如美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述,為增加生物學半衰期,抗體可在CH1或CL區中進行改變以含有來自IgG之Fc區之CH2結構域之兩個環的挽救受體結合抗原決定基。
又在其他實施例中,藉由以不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區從而改變抗體或抗原結合片段之效應功能。例如,選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一或多個胺基酸 可由不同胺基酸殘基置換以使得抗體對效應配位體具有改變之親和力且保留親本抗體之抗原結合能力。與其親和力發生改變之效應配位體例如可為Fc受體或補體之C1組分。此方法在美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中進一步詳述。
在另一實例中,選自胺基酸殘基329、331及322之一或多個胺基酸可由不同胺基酸殘基置換以使得抗體具有改變之C1q結合及/或減小或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方法在美國專利第6,194,551號中進一步詳述。
在另一實例中,胺基酸231及239位之一或多個胺基酸殘基發生改變,由此改變抗體固定補體之能力。此方法在PCT公開案WO 94/29351中進一步描述。
在又一實例中,Fc區經修飾以減小本發明之抗體或抗原結合片段介導抗體依賴性細胞之細胞毒性(ADCC)的能力及/或減小抗體或片段對Fcγ受體之親和力,其係藉由修飾以下位置處之一或多個胺基酸:238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方法在PCT公開案WO 00/42072中進一步描述。此外,已定位人類IgG1上用於FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已描述具有改良結合之變異體(參見Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。
在本發明之一實施例中,藉由修飾殘基243及264來修飾Fc區以減小本發明之抗體介導效應功能之能力及/或增加消炎特性。在一實施例中, 藉由將243及264位之殘基變為丙胺酸來修飾抗體或片段之Fc區。在一實施例中,藉由修飾殘基243、264、267及328來修飾Fc區以減小抗體或片段介導效應功能之能力及/或增加消炎特性。
產生具有經修飾糖基化之抗體
在又一實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段包含特定糖基化模式。例如,可產生非岩藻糖基化或非糖基化抗體或片段(亦即,抗體分別缺少岩藻糖或糖基化)。可改變抗體或片段之糖基化模式例如以增加抗體或片段對PD-1抗原之親和力或親和性。該等修飾例如可藉由改變抗體或片段序列中之一或多個糖基化位點來實現。例如,可進行導致移除一或多個可變區構架糖基化位點之一或多個胺基酸取代,由此消除此位點之糖基化作用。該非糖基化可增加抗體或片段對抗原之親和力或親和性。參見例如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號。
本文揭示之抗體及抗原結合片段可進一步包括在低等真核生物宿主細胞,尤其真菌宿主細胞中產生之彼等抗體及抗原結合片段,該等宿主細胞諸如酵母及絲狀真菌,其經遺傳工程化以產生具有哺乳動物-或人類樣糖基化模式之糖蛋白(參見例如,Choi等人,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022-5027;Hamilton等人,(2003)Science 301:1244-1246;Hamilton等人,(2006)Science 313:1441-1443;Nett等人,Yeast 28(3):237-52(2011);Hamilton等人,Curr Opin Biotechnol.Oct;18(5):387-92(2007))。該等遺傳修飾宿主細胞優於目前所用哺乳動物細胞株之特定優勢在於控制在細胞中產生之糖蛋白之糖基化分佈以使得可產生糖蛋白組合物之能力,其中特定N-聚糖結構佔主導地位(參見例如美國專利第7,029,872號及美國專利第7,449,308號)。該等遺傳修飾宿主細胞已用於產生主要具有特定N-聚糖結構之抗體(參見例如,Li等人,(2006)Nat.Biotechnol.24:210-215)。
在特定實施例中,本文揭示之抗體及其抗原結合片段進一步包括在低等真核生物宿主細胞中產生之彼等抗體及其抗原結合片段,且其包含岩藻糖基化及非岩藻糖基化混合及複合N-聚糖,包括平分及多觸角物種,包括(但不限於)N-聚糖,諸如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2;Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2;NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2
在特定實施例中,本文提供之抗體及其抗原結合片段可包含具有至少一個選自由GlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2及NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2組成之群之混合N-聚糖之抗體或片段。在特定態樣中,混合N-聚糖係組合物中之主要N-聚糖物種。
在特定實施例中,本文提供之抗體及其抗原結合片段包含具有至少一個選自由GlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2組成之群之複合N-聚糖之抗體及片段。在特定態樣中,複合N-聚糖係組合物中之主要N-聚糖物種。在其他態樣中,複合N-聚糖為佔組合物中複合N-聚糖之約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之特定N-聚糖物種。在一實施例中,本文提供之抗體及其抗原結合片段包含複合N-聚糖,其中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之複合N-聚糖包含結構NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,其中該結構為非岩藻糖基化的。該等結構例如可在工程化巴斯德畢赤酵母宿主細胞中產生。
在特定實施例中,N-聚糖係岩藻糖基化的。一般而言,岩藻糖為在N-聚糖之還原端與GlcNAc處於α1,3-鍵聯、在N-聚糖之還原端與GlcNAc處於α1,6-鍵聯、在N-聚糖之非還原端與Gal處於α1,2-鍵聯、在N-聚糖之非還 原端與GlcNac處於α1,3-鍵聯或在N-聚糖之非還原端與GlcNAc處於α1,4-鍵聯。
因此,在上文糖蛋白組合物之特定態樣中,糖型為α1,3-鍵聯或α1,6-鍵聯岩藻糖以產生選自Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、及NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)之糖型;為α1,3-鍵聯或α1,4-鍵聯岩藻糖以產生選自由GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2及NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2組成之群之糖型;或為α1,2-鍵聯岩藻糖以產生選自由Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2及NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2組成之群之糖型。
在其他態樣中,抗體(例如,人源化抗體)或其抗原結合片段包含高甘露糖N-聚糖,包括(但不限於)Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2 N-聚糖結構組成之群之N-聚糖。
在上文之其他態樣中,複合N-聚糖進一步包括岩藻糖基化及非岩藻糖基化平分及多觸角物種。
如本文所用,術語「N-聚糖」及「糖型」可互換使用且係指N-連接之寡糖,例如藉由天冬醯胺酸-N-乙醯基葡糖胺鍵聯至多肽之天冬醯胺酸殘基之寡糖。N-連接糖蛋白含有連接至蛋白中之天冬醯胺酸殘基之醯胺氮的N-乙醯基葡糖胺殘基。在糖蛋白上發現之主要糖為葡萄糖、半乳糖、 甘露糖、岩藻糖、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)及唾液酸(例如,N-乙醯基-神經胺酸(NANA))。糖基加工在ER之內腔中與轉譯同時進行,且在N-連接糖蛋白之高爾基體(Golgi apparatus)中在轉譯後繼續。
N-聚糖具有Man3GlcNAc2之共同戊糖核心(「Man」係指甘露糖;「Glc」係指葡萄糖;且「NAc」係指N-乙醯基;GlcNAc係指N-乙醯基葡糖胺)。通常,N-聚糖結構呈現為左側具有非還原端且右側具有還原端。N-聚糖之還原端為連接至包含蛋白上之糖基化位點之Asn殘基的末端。N-聚糖在分枝數量(觸角)方面不同,包含添加至Man3GlcNAc2(「Man3」)核心結構(亦稱為「三甘露糖核心」、「戊糖核心」或「寡甘露糖(paucimannose)核心」之外周糖(例如,GlcNAc、半乳糖、岩藻糖及唾液酸)。N-聚糖根據其分枝成分分類(例如,高甘露糖、複合或混合)。「高甘露糖」類型N-聚糖具有五個或五個以上甘露糖殘基。「複合」類型N-聚糖通常具有至少一個GlcNAc連接至「三甘露糖」核心之1,3甘露糖臂及至少一個GlcNAc連接至「三甘露糖」核心之1,6甘露糖臂。複合N-聚糖亦可具有半乳糖(「Gal」)或N-乙醯基半乳糖胺(「GalNAc」)殘基,其視情況經唾液酸或衍生物修飾(例如,「NANA」或「NeuAc」,其中「Neu」係指神經胺酸且「Ac」係指乙醯基)。複合N-聚糖亦可具有包含「平分」GlcNAc與核心岩藻糖(「Fuc」)之鏈內取代。複合N-聚糖亦可在「三甘露糖核心」上具有多個觸角,常稱為「多觸角聚糖」。「混合」N-聚糖在三甘露糖核心之1,3甘露糖臂末端上具有至少一個GlcNAc且在三甘露糖核心之1,6甘露糖臂上具有0個或0個以上甘露糖。各種N-聚糖亦稱為「糖型」。
關於複合N-聚糖而言,術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」意謂以下。「G-2」係指可表徵為Man3GlcNAc2N-聚糖結構;術語「G-1」係指可表徵為GlcNAcMan3GlcNAc2N-聚糖結構;術語「G0」係指可表徵為GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖結構;術語「G1」係指可表徵為GalGlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖結構;術語「G2」係指可表徵為Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖結構;術語「A1」係指可表徵為NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖結構;且術語「A2」係指可表徵為NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2N-聚糖結構。除非另外指示,否則術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」係指缺少連接至N-聚糖還原端之GlcNAc殘基之岩藻糖的N-聚糖物種。當術語包括「F」時,「F」表示在N-聚糖還原端之GlcNAc殘基上含有岩藻糖殘基之N-聚糖物種。例如,G0F、G1F、G2F、A1F及A2F全部表示另外包括岩藻糖殘基連接至N-聚糖還原端之GlcNAc殘基的N-聚糖。低等真核生物(諸如酵母及絲狀真菌)通常不產生產生岩藻糖之N-聚糖。
關於多觸角N-聚糖而言,術語「多觸角N-聚糖」係指在包含N-聚糖之1,6臂或1,3臂之非還原端之甘露糖殘基上另外包含GlcNAc殘基且在包含N-聚糖之1,6臂及1,3臂之每一甘露糖殘基上另外包含GlcNAc殘基之N-聚糖。因此,多觸角N-聚糖可由下式表徵:GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2。術語「1-4」係指1、2、3或4個殘基。
關於平分N-聚糖而言,術語「平分N-聚糖」係指其中GlcNAc殘基連接至N-聚糖還原端之甘露糖殘基的N-聚糖。平分N-聚糖可由式GlcNAc3Man3GlcNAc2表徵,其中每個甘露糖殘基在其非還原端連接至GlcNAc殘基。相反,當多觸角N-聚糖表徵為GlcNAc3Man3GlcNAc2時,該式表示兩個GlcNAc殘基連接至N-聚糖之兩個臂之一之非還原端的甘露糖殘基且一個GlcNAc殘基連接至N-聚糖另一臂之非還原端的甘露糖殘基。
抗體物理特性
本文揭示之抗體及其抗原結合片段在輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區中可另外含有一或多個糖基化位點。該等糖基化位點可導致抗體或片段之免疫原性增加或抗體之pK由於抗原結合改變而改變(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702;Gala及Mprrison(2004)J Immunol 172:5489-94;Wallick等人(1988)J Exp Med 168:1099-109;Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R;Parekh等人(1985)Nature 316:452-7;Mimura等人(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化發生在含有N-X-S/T序列之基元處。
每個抗體或抗原結合片段將具有獨特之等電點(pI),其通常在6與9.5之間之pH範圍內。IgG1抗體之pI通常在7至9.5之pH範圍內且IgG4抗體之pI通常在6至8之pH範圍內。
每個抗體或抗原結合片段將具有特徵性熔融溫度,熔融溫度愈高表示活體內之總體穩定性愈大(Krishnamurthy R及Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般而言,TM1(初始展開之溫度)可大於60℃、大於65℃或大於70℃。抗體或片段之熔點可使用差示掃描量熱法(Chen等人(2003)Pharm Res 20:1952-60;Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68:47-52)或圓二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40:343-9)來量測。
在另一實施例中,選擇不快速降解之抗體及其抗原結合片段。抗體或片段之降解可使用毛細管電泳(CE)及MALDI-MS來量測(Alexander AJ及Hughes DE(1995)Anal Chem 67:3626-32)。
在另一實施例中,選擇具有最小凝集作用之抗體及其抗原結合片段,其可導致觸發非吾人所樂見之免疫反應及/或發生改變或不利之藥物 動力學特性。抗體及片段發生25%或25%以下、20%或20%以下、15%或15%以下、10%或10%以下、5%或5%以下、1%或1%以下或0.5%或0.5%以下之凝集通常係可接受的。凝集可藉由若干種技術來量測,包括尺寸排阻層析(SEC)、高效液相層析(HPLC)及光散射。
抗體結合物
本文揭示之抗-PD-1抗體及其抗原結合片段亦可與化學部分結合。化學部分尤其可為聚合物、放射性核種或細胞毒性因子。在特定實施例中,化學部分為增加抗體或片段在受檢者體內之半衰期的聚合物。合適之聚合物包括(但不限於)親水性聚合物,其包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)(例如,分子量為2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa之PEG)、葡聚糖及單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人,(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)揭示PEG結合之單鏈抗體。Wen等人,(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)揭示具有連接至放射性金屬螯合劑(二乙烯三胺五乙酸(DTPA))之PEG的結合抗體。
本文揭示之抗體及其抗原結合片段亦可與諸如以下之標籤結合:99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th及40K、157Gd、55Mn、52Tr及56Fe。
本文揭示之抗體及抗原結合片段亦可經聚乙二醇化,例如以增加其生物學(例如,血清)半衰期。為聚乙二醇化抗體或片段,通常使抗體或片段與反應形式之聚乙二醇(PEG)(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在一或多個PEG基團連接至抗體或抗體片段之條件下反應。在特定實施例中,經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化或烷基化反應來進行聚乙二醇化。如本文所用,術語「聚乙二醇」欲涵蓋已用於衍生其他蛋 白之任何形式之PEG,諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中,欲聚乙二醇化之抗體或片段為非糖基化抗體或片段。用於聚乙二醇化蛋白之方法在此項技術中已知且可適用於本發明之抗體。參見例如EP 0 154 316及EP 0 401 384。
本文揭示之抗體及抗原結合片段亦可與螢光或化學發光標記結合,包括螢光團,諸如稀土螯合劑、螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛、螢光胺、152Eu、丹醯基、繖酮、螢光素、魯米那(luminal)標記、異魯米那標記、芳族吖啶酯標記、咪唑標記、吖啶鹽標記、草酸酯標記、水母素標記、2,3-二氫呔嗪二酮、生物素/親和素、旋轉標記及穩定自由基。
本發明之抗體及其抗原結合片段本亦可結合至細胞毒素因子,諸如白喉毒素、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、蒴蓮素A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白及化合物(例如,脂肪酸)、康乃馨蛋白、垂序商陸(Phytoiacca americana)蛋白PAPI、PAPII及PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、有絲分裂素、侷限麯黴素、酚黴素及伊諾黴素(enomycin)。
可採用此項技術中已知用於結合本發明之抗體及其抗原結合片段與各種部分之任意方法,包括Hunter等人,(1962)Nature 144:945;David等人,(1974)Biochemistry 13:1014;Pain等人,(1981)J.Immunol.Meth.40:219;及Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30:407所述之彼等方法。用於結合抗體及片段之方法係習知的且在此項技術中極為熟知。
抗體或其他多肽可固定至各種固體支撐物上以用於分析。可用於固定特異性結合構件之固相包括在固相結合分析中經研發及/或用作固相 之彼等固相。合適固相之實例包括膜濾器、纖維素基紙、珠粒(包括聚合物、乳膠及順磁性粒子)、玻璃、矽晶圓、微粒、奈米粒子、TentaGel、AgroGel、PEGA凝膠、SPOCC凝膠及多孔培養盤。可藉由在固體支撐物上塗佈抗體或陣列形式之多種抗體來製備試紙條。隨後可將此試紙條浸入測試樣品中且隨後經洗滌及偵測步驟快速處理以產生可量測之信號,諸如色斑。抗體或其他多肽可藉由與分析裝置表面直接結合或藉由間接結合而結合至分析裝置之特定區域。在後者情形之實例中,抗體或其他多肽可固定在粒子或其他固體支撐物上,或該固體支撐物固定至裝置表面。
生物學分析需要偵測方法,且用於定量結果之最常用方法之一係使可偵測標記與對所研究生物系統中之組分之一具有親和力之蛋白或核酸結合。可偵測標記可包括本身可偵測之分子(例如,螢光部分、電化學標記、金屬螯合劑等)以及可藉由產生可偵測反應產物(例如,酶,諸如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶等)或藉由本身可偵測之特異性結合分子(例如,生物素、地高辛(digoxigenin)、麥芽糖、寡組胺酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸酯、ssDNA、dsDNA等)間接偵測之分子。
固相及可偵測標記結合物之製備常包含使用化學交聯劑。交聯試劑含有至少兩個反應性基團,且通常分為同功能交聯劑(含有相同反應性基團)及異功能交聯劑(含有不同反應性基團)。經胺、氫硫基偶合或非特異性反應之同雙功能交聯劑可購自多種商業來源。順丁烯二醯亞胺、烷基及芳基鹵化物、α-鹵醯基及吡啶基二硫化物為硫醇反應性基團。順丁烯二醯亞胺、烷基及芳基鹵化物及α-鹵醯基與氫硫基反應形成硫醇醚鍵,而吡啶基二硫化物與氫硫基反應產生混合二硫化物。吡啶基二硫化物產物係可裂解地。醯亞胺基酯亦極適用於蛋白-蛋白交聯。各種異雙功能交聯劑係可售的,其各自合併不同特性用於成功結合。
抗-PD-1抗體之治療用途
另外提供以本文揭示之經分離抗體或其抗原結合片段治療需要治療之受檢者(包括人類受檢者)之方法。在本發明之一實施例中,該受檢者罹患感染或傳染病。在本發明之另一實施例中,該受檢者罹患癌症。在一實施例中,癌症例如為骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、威爾姆氏癌(Wilm's cancer)、卵巢癌、胰腺癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如,非小細胞肺癌)、胃癌、結腸直腸癌、宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、黑素瘤、腎橫紋肌樣瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層瘤、神經管胚細胞瘤、星形細胞瘤、退行性星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅血球增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌、類癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在本發明之一實施例中,癌症為例如上述各種之轉移癌。
在一實施例中,本發明提供使用本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段治療受檢者之方法,其中該受檢者罹患病毒感染。在一實施例中,病毒感染係感染選自由以下組成之群之病毒:人類免疫缺乏病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如,VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II及CMV、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯沙奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、痘苗病毒、HTLV病毒、登革病毒(dengue virus)、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或蟲媒病毒性腦炎病毒。
在一實施例中,本發明提供使用本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段治療受檢者之方法,其中該受檢者罹患細菌感染。在一實施例中,細菌感染係感染選自由以下組成之群之細菌:披衣菌(Chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌、克雷伯氏桿菌(klebsiella)、變形桿菌、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、軍團桿菌(Legionella)、白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙門氏菌(Salmonella)、桿菌、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、破傷風梭孢桿菌(Clostridium tetan)、肉毒桿菌(Clostridium botulinum)、炭疽桿菌(Bacillus anthricis)、鼠疫桿菌(Yersinia pestis)、麻風桿菌(Mycobacterium leprae)、瀰漫型麻風分枝桿菌(Mycobacterium lepromatosis)及伯疏氏螺旋體(Borriella)。
在一實施例中,本發明提供使用本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段治療受檢者之方法,其中該受檢者罹患真菌感染。在一實施例中,真菌感染係感染選自由以下組成之群之真菌:念珠菌屬(Candida)(白色念珠菌(albicans)、可柔念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麯黴屬(菸麯黴(fumigatus)、黑麯黴(niger)等)、毛黴菌屬(Genus Mucorales)(毛黴菌(mucor)、犁頭黴(absidia)、根黴(rhizopus))、申克氏孢絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球黴菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。
在一實施例中,本發明提供使用本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段治療受檢者之方法,其中該受檢者罹患寄生蟲感染。在一實施例中,寄生蟲感染係感染選自由以下組成之群之寄生蟲:痢疾阿米巴 (Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、棘阿米巴(Acanthamoeba)、梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、微小巴貝蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)及巴西日圓線蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
「受檢者」可為哺乳動物,諸如人類、狗、貓、馬、牛、小鼠、大鼠、猴(例如馬來猴,例如食蟹猴)或兔。在本發明之較佳實施例中,受檢者為人類受檢者。
在特定實施例中,本文揭示之抗體或其抗原結合片段可單獨或與其他進一步之治療劑及/或治療程序結合用於在需要治療或預防之受檢者中治療或預防例如本文論述之諸如癌症之任何疾病。組合物,例如包含醫藥學上可接受之載劑、包含該等抗體及片段以及其他治療劑之醫藥組合物亦為本發明之部分。
在特定實施例中,本文揭示之抗體或其抗原結合片段可單獨或與腫瘤疫苗結合使用。
在特定實施例中,本文揭示之抗體或其抗原結合片段可單獨或與化療劑結合使用。
在特定實施例中,本文揭示之抗體或其抗原結合片段可單獨或與輻射治療結合使用。
在特定實施例中,本文揭示之抗體或其抗原結合片段可單獨或與靶向治療結合使用。靶向治療之實例包括:激素治療、信號轉導抑制劑(例如,EGFR抑制劑,諸如西妥昔單抗(cetuximab)(Erbitux)及埃羅替尼 (erlotinib)(Tarceva));HER2抑制劑(例如,曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)及帕妥珠單抗(pertuzumab)(Perjeta));BCR-ABL抑制劑(諸如伊馬替尼(imatinib)(Gleevec)及達沙替尼(dasatinib)(Sprycel));ALK抑制劑(諸如克唑替尼(crizotinib)(Xalkori)及色瑞替尼(ceritinib)(Zykadia));BRAF抑制劑(諸如威羅菲尼(vemurafenib)(Zelboraf)及達拉菲尼(dabrafenib)(Tafinlar))、基因表現調節劑、細胞凋亡誘導子(例如,硼替佐米(bortezomib)(Velcade)及卡非佐米(carfilzomib)(Kyprolis))、血管生成抑制劑(例如,貝伐單抗(bevacizumab)(Avastin)及雷莫盧單抗(ramucirumab)(Cyramza)、連接至毒素之單株抗體(例如,本妥昔單抗藥物結合物(brentuximab vedotin)(Adcetris)及曲妥珠單抗藥物結合物(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla))。
在特定實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段可與抗癌治療劑或免疫調節藥物(諸如免疫調節受體抑制劑,例如特異性結合至受體之抗體或其抗原結合片段)組合使用。
因此,本發明包括包含本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段以及一或多種靶向PD-1/PD-L1相互作用或CTLA-4/CD80-CD86相互作用之其他抗體的組合物。該等抗體之非限制性實例包括(但不限於):帕姆單抗、納武單抗、匹敵單抗(pidilizumab)及REGN2810、MEDI-0680、PDR-001、SHR-1210、BGB-A317、PF-06801591、TSR-042、伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、阿特珠單抗(atezoluzimab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、BMS-936559;以及在受檢者中治療或預防癌症之方法,其包括向受檢者投與有效量之本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段及一或多種靶向PD-1/PD-L1相互作用之其他抗體。
視情況,亦可對受檢者投與另一治療劑。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片 段與Tim-3路徑拮抗劑聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與Vista路徑拮抗劑聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與BTLA路徑拮抗劑聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與LAG-3路徑拮抗劑聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與TIGIT路徑拮抗劑聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-PDL1抗體聯合
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-CTLA4抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-CS1抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL1/2/3抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-CD137抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-GITR抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-PD-L2抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ILT1抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ILT2抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ILT3抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ILT4抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ILT5抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ILT6抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ILT7抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ILT8抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-CD40抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-OX40抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL1抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL2/3抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL4抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL5A抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL5B抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR3DL1抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR3DL2抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-KIR3DL3抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-NKG2A抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-NKG2C抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-ICOS抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-SIRPα抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-CD47抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-4-1BB抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-IL-10抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗_TSLP抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與IL-10或聚乙二醇化IL-10聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-APRIL抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與抗-CD27抗體聯合較佳作為醫藥組合物之部分。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與STING促效劑聯合較佳作為醫藥組合物之部分。環狀-二-核苷酸(CDN)環狀-二-AMP(由單核球增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)及其他細菌產生)及其類似物環狀-二-GMP及環狀-GMP-AMP由宿主細胞識別為病原體相關分子模式(PAMP),其結合至稱為干擾素基因刺激蛋白(STING)之病原體識別受體(PRR)。STING為宿主哺乳動物細胞之細胞質中之轉接蛋白,其活化TANK結合激酶(TBK1)-IRF3及NF-κB信號轉導軸,導致誘發強烈活化先天免疫之IFN-β及其他基因產物。現已意識到,STING係宿主胞質監測路徑之組分(Vance等人,2009),其感應胞內病原體之感染且相應誘發產生IFN-β,導致發生由抗原特異性CD4+及CD8+ T細胞以及病原體特異性抗體組成之適應性保護性病原體特異性免疫反應。環狀嘌呤二核苷酸之實例例如在美國專利7,709458及7,592,326;專利申請案WO2007/054279、 WO2014/093936及WO2014/189805;及Yan等人,Bioorg.Med.Chem Lett.18:5631(2008)中相當詳細地描述。
在一些實施例中,本發明之抗體或抗原結合片段增加免疫細胞之活性。免疫細胞之活性增加可使用此項技術中已知之任何方法來偵測。在一實施例中,免疫細胞之活性增加可藉由量測免疫細胞之增殖來偵測。例如,T細胞之活性增加可藉由量測T細胞之增殖或信號轉導事件來偵測,該等信號轉導事件諸如向轉錄調節因子傳輸信號之免疫受體或下游激酶之酪胺酸磷酸化作用。在其他實施例中,免疫細胞之活性增加可藉由量測特異性靶細胞上之CTL或NK細胞細胞毒性功能或IFNγ細胞激素反應來偵測,該等反應與刺激抗腫瘤免疫性有關。又在其他實施例中,免疫細胞之活性增加可藉由量測來源於受檢者之樣品中之離體T細胞活化作用來偵測。在一實施例中,T細胞之活性增加係藉由以下來確定:(i)量測SEB(葡萄球菌腸毒素B)誘發產生一或多種選自由IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13組成之群之促炎性細胞激素;或(ii)量測混合淋巴細胞反應或直接抗-CD3 mAb刺激T細胞受體(TCR)信號轉導以誘發產生選自由IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13組成之群之細胞激素。在某些實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或抗原結合其片段將刺激抗原特異性T細胞產生IL-2及/或IFNγ及/或使CD25及/或CD69上調至少1.5倍。
有益於增加溶細胞T細胞反應之其他藥劑可與本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段組合使用。該等藥劑包括(不限於)B7共刺激分子、介白素-2、干擾素-γ、GM-CSF、CTLA-4拮抗劑、OX-40/OX-40配位體、CD40/CD40配位體、沙格司亭(sargramostim)、左旋咪唑(levamisol)、痘苗病毒、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)、脂質體、礬、弗氏完全或不完 全佐劑(Freund's complete or incomplete adjuvant)、解毒內毒素、礦物油、表面活性物質(諸如脂卵磷脂)、泊洛尼克(pluronic)多元醇、聚陰離子、肽及油或烴乳液。
相對於抗體反應而言優先刺激溶細胞T細胞反應之用於誘發T細胞免疫反應之組合物係較佳的,儘管亦可使用刺激兩種類型反應之彼等組合物。若藥劑為多肽,則可投與多肽本身或編碼多肽之聚核苷酸。載劑可為細胞,諸如抗原呈現細胞(APC)或樹突狀細胞。抗原呈現細胞包括諸如巨噬細胞、樹突狀細胞及B細胞之細胞類型。其他專門抗原呈現細胞包括單核細胞、邊緣區科弗氏細胞(marginal zone Kupffer cell)、微神經膠質細胞、郎格罕細胞(Langerhans' cell)、交錯樹突狀細胞、濾泡樹突狀細胞及T細胞。亦可使用兼性抗原呈現細胞。兼性抗原呈現細胞之實例包括星形膠質細胞、濾泡細胞、內皮及纖維母細胞。
組合物可包含細菌細胞,其經轉型來表現多肽或傳遞隨後在經疫苗接種個體之細胞中表現之聚核苷酸。可添加諸如氫氧化鋁或磷酸鋁之佐劑來增加疫苗觸發、增強或延長免疫反應之能力。
組合物可包含細菌細胞,其經轉型來表現多肽或傳遞隨後在經疫苗接種個體之細胞中表現之聚核苷酸。已研發大量細菌物種用作疫苗且可用作本發明中之疫苗平台,包括(但不限於)副痢疾桿菌(Shigella flexneri)、大腸桿菌(Escherichia coli)、單核球增多性李斯特氏菌、小腸大腸炎耶氏桿菌(Yersinia enterocolitica)、鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium)、傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhi)或分枝桿菌屬(mycobacterium)物種。此清單並非欲限制。本發明涵蓋減毒、共生及/或殺死但具有代謝活性之細菌菌株作為疫苗平台之用途。在較佳實施例中,細菌為單核球增多性李斯特氏菌。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片 段具有失活腫瘤細胞疫苗。「失活腫瘤細胞疫苗」意謂經處理以防細胞分裂之腫瘤細胞(患者「自體的」或「同種異體的」)。為本發明之目的,該等細胞保留其免疫原性及其代謝活性。該等腫瘤細胞經遺傳修飾以表現在患者中表現為癌症治療之部分的轉基因。因此,本發明之組合物或疫苗包含經歷治療之患者自體或同種異體之贅生性(例如,腫瘤)細胞且最佳為與折磨患者之腫瘤細胞相同之通用類型。例如,通常將向罹患黑素瘤之患者投與來源於黑素瘤之遺傳修飾細胞。此項技術中熟知本發明中所用之用於使腫瘤細胞失活之方法,諸如使用輻射。
在一些實施例中,本發明之失活腫瘤細胞經修飾來表現及分泌一或多種熱休克蛋白。例如,gp96-Ig融合蛋白可經表現及分泌以刺激免疫反應(Yamazaki等人,The Journal of Immunology,1999,163:5178-5182;Strbo等人,Immunol Res.2013 Dec;57(1-3):311-25)。在一些實施例中,失活腫瘤細胞經修飾來表現及分泌gp96-Ig融合蛋白。
本發明之失活腫瘤細胞與一或多種共刺激分子或共刺激劑一起投與至患者。較佳之共刺激劑包含一或多種刺激樹突狀細胞誘導、募集及/或成熟之細胞激素。文獻中熟知用於評估該等共刺激劑之方法。DC之誘導及成熟通常藉由某些膜分子(諸如CD80及CD86)之表現及/或促炎性細胞激素(諸如IL-12及I型干擾素)之分泌在刺激後增加來評估。
在較佳實施例中,失活腫瘤細胞本身經修飾來表現及分泌一或多種刺激樹突狀細胞誘導、募集及/或成熟之細胞激素。本發明關於GM-CSF之使用以例示方式進行描述。因此,舉例而言,如美國專利第5,637,483號、第5,904,920號、第6,277,368號及第6,350,445號以及在美國專利公開案第20100150946號中所述,腫瘤細胞可表現編碼GM-CSF之轉基因。一種形式之表現GM-CSF之遺傳修飾癌細胞或一種用於治療胰腺癌之「表現細胞激素 之細胞疫苗」在美國專利第6,033,674號及第5,985,290號中描述。
可由該等失活腫瘤細胞及/或旁鄰細胞代替GM-CSF或與GM-CSF一起表現之其他合適之細胞激素包括(但不限於)CD40配位體、FLT-3配位體、IL-12、CCL3、CCL20及CCL21中之一或多者。此清單並非欲限制。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段結合一或多種欲刺激對一或多種預定抗原之免疫反應的疫苗一起投與。抗原可直接投與至個體或可在個體內例如由可為自體或同種異體之腫瘤細胞疫苗(例如,GVAX)、樹突狀細胞疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗、病毒基疫苗、細菌或酵母疫苗(例如,單核球增多性李斯特氏菌或釀酒酵母)等來表現。參見例如Guo等人,Adv.Cancer Res.2013;119:421-475;Obeid等人,Semin Oncol.2015年8月;42(4):549-561。發現可用於本發明之靶抗原之實例列於下文表4中。靶抗原亦可為包含表中所列抗原之免疫活性部分之片段或融合多肽。此清單並非欲限制。
此項技術中熟知其合適抗原之其他生物體包括(但不限於)沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)、產膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A群鏈球菌)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactia)(B群鏈球菌)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿 菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟氏淋病雙球菌(Neisseria gonorrheae)、霍亂弧菌、沙門氏菌物種(包括傷寒(typhi)、鼠傷寒(typhimurium))、腸道沙門菌(包括幽門螺旋菌(Helicobactor pylori)、副痢疾桿菌及其他D群志賀氏桿菌物種)、鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)、類鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)、克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)、梭菌物種(包括艱難梭狀芽孢桿菌(C.difficile)、腸炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)及創傷弧菌(V.vulnificus)。此清單並非欲為限制性的。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與諸如以下之一或多種抑制劑(例如,小有機分子或抗體或其抗原結合片段)聯合:MTOR(雷帕黴素(rapamycin)之哺乳動物標靶)抑制劑、細胞毒性劑、鉑劑、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、微管穩定劑、紫杉烷、CD20抑制劑、CD52抑制劑、CD30抑制劑、RANK(核因子κ-B之受體活化劑)抑制劑、RANKL(核因子κ-B配位體之受體活化劑)抑制劑、ERK抑制劑、MAP激酶抑制劑、AKT抑制劑、MEK抑制劑、PI3K抑制劑、HER1抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、Bcl2抑制劑、CD22抑制劑、CD79b抑制劑、ErbB2抑制劑、IDO抑制劑、TDO抑制劑或法呢基蛋白轉移酶抑制劑。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與以下中之一或多者聯合:13-順-視黃酸、3-[5-(甲磺醯基哌啶甲基)-吲哚基]-喹諾酮、4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、5-去氧尿苷、5'-去氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巰嘌呤、7-羥基星孢菌素、A-443654、乙酸阿比特龍(abirateroneacetate)、亞伯杉(abraxane)、ABT-578、阿考比芬(acolbifene)、ADS-100380、ALT-110、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、胺魯米特(aminoglutethimide)、安柔比星(amrubicin)、安丫啶(Amsacrine)、阿那 格雷(anagrelide)、安美達錠(anastrozole)、血管抑制素、AP-23573、ARQ-197、阿佐昔芬(arzoxifene)、AS-252424、AS-605240、天冬醯胺酶(asparaginase)、AT-9263、阿曲生坦(atrasentan)、阿西替尼(axitinib)、AZD1152、卡介(Bacillus Calmette-Guerin,BCG)疫苗、巴他布林(batabulin)、BC-210、貝索杜托(besodutox)、貝伐單抗、比卡魯胺(bicalutamide)、Bio111、BIO140、博萊黴素(bleomycin)、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米(bortezimib)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、骨化三醇(calcitriol)、喜樹鹼(camptothecin)、卡奈替尼(canertinib)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、CC8490、西地尼布(Cediranib)、CG-1521、CG-781、克林黴素(chlamydocin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯毒素(chlorotoxin)、西侖吉肽(cilengitide)、希每得定(cimitidine)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯屈膦酸鹽(clodronate)、COL-3、CP-724714、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環丙孕酮(cyproterone)、乙酸環丙孕酮(cyproteroneacetate)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、達卡巴嗪(dacarbazine)、達西斯特(dacinostat)、放線菌素D(dactinomycin)、達妥珠單抗(dalotuzumab)、達奴舍替(danusertib)、達沙替尼(dasatanib)、道諾黴素(daunorubicin)、德卡替尼(decatanib)、魚藤素(deguelin)、地尼白介素(denileukin)、去氧助間黴素(deoxycoformycin)、縮酚酞(depsipeptide)、二芳基丙腈、二乙基已烯雌酚、白喉毒素(diftitox)、多烯紫杉醇(docetaxel)、多韋替尼(dovitinib)、阿黴素(doxorubicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、依多替康(edotecarin)、釔-90標記之依多曲肽(edotreotide)、依多曲肽、EKB-569、EMD121974、內皮抑制素(endostatin)、恩雜魯胺(enzalutamide)、恩紮妥林(enzastaurin)、表柔比星(epirubicin)、埃坡黴素(epithilone B)、ERA-923、Erbitux、埃羅替尼、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀 (estramustine)、依託泊苷(etoposide)、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、非那雄胺(finasteride)、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、FOLFOX方案、氟維司群(Fulvestrant)、格萊特龍(galeterone)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉馬替康(gimatecan)、戈舍瑞林(goserelin)、乙酸戈舍瑞林、棉酚(gossypol)、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羥基孕酮、羥基脲、IC87114、黃膽素(idarubicin)、吲哚西芬(idoxyfene)、異環磷醯胺(ifosfamide)、IM862、伊馬替尼、IMC-1C11、INCB24360、INO1001、干擾素、介白素-12、伊匹單抗、伊立替康(irinotecan)、JNJ-16241199、酮康唑(ketoconazole)、KRX-0402、拉帕替尼(lapatinib)、拉索昔芬(lasofoxifene)、來曲唑(letrozole)、亞葉酸(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、左旋咪唑、脂質體截留之太平洋紫杉醇(liposome entrapped paclitaxel)、洛莫司汀(lomustine)、洛那法尼(lonafarnib)、胺甲硫蒽酮(lucanthone)、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、馬立馬司他(marimastat)、氮芥(mechlorethamine)、醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、醋酸甲地孕酮(megestrolacetate)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、美司鈉(mesna)、甲胺喋呤、光神黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、陶紮色替(tozasertib)、MLN8054、癌立消(neovastat)、來那替尼(Neratinib)、neuradiab、尼羅替尼(nilotinib)、尼魯米特(nilutimide)、諾拉曲特(nolatrexed)、NVP-BEZ235、奧利莫森(oblimersen)、奧曲肽(octreotide)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、奧特羅那(orteronel)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕布昔利布(palbociclib)、帕米磷酸 二鈉(pamidronate)、帕尼單抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、PD0325901、PD184352、PEG-干擾素、培美曲塞(pemetrexed)、噴司他丁(pentostatin)、哌立福新(perifosine)、苯丙胺酸氮芥、PI-103、匹替利斯(pictilisib)、PIK-75、哌噴昔芬(pipendoxifene)、PKI-166、普卡黴素(plicamycin)、卟吩姆鈉(porfimer)、強的松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、孕酮(progestin)、PX-866、R-763、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、丙亞胺(razoxin))、地磷莫司(ridaforolimus)、利妥昔單抗(rituximab)、羅米地辛(romidepsin)、RTA744、魯比替康(rubitecan)、思瑞普坦(scriptaid)、Sdx102、塞利西利(seliciclib)、司美替尼(selumetinib)、司馬沙尼(semaxanib)、SF1126、西羅莫司(sirolimus)、SN36093、索拉非尼(sorafenib)、螺內酯(spironolactone)、角鯊胺(squalamine)、SR13668、鏈脲佐菌素(streptozocin)、SU6668、辛二醯苯胺異羥肟酸(suberoylanalide hydroxamic acid)、舒尼替尼(sunitinib)、合成雌激素、他侖帕奈(talampanel)、talimogene laherparepvec、他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、替西羅莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、替米利芬(tesmilifene)、睪酮(testosterone)、粉防己鹼(tetrandrine)、TGX-221、薩力多胺(thalidomide)、硫鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替昔木單抗(ticilimumab)、替吡法尼(tipifarnib)、替沃紮尼(tivozanib)、TKI-258、TLK286、拓朴替康(topotecan)、檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、曲貝替定(trabectedin)、曲妥珠單抗、維甲酸(tretinoin)、曲古抑菌素(trichostatin A)、曲西立濱磷酸鹽單水合物(triciribinephosphate monohydrate)、雙羥萘酸曲普瑞林(triptorelin pamoate)、TSE-424、尿嘧啶氮芥、丙戊酸(valproic acid)、戊柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、VEGF阱、長春鹼、長春新鹼、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、vitaxin、維特斯朋(vitespan)、 伏立諾他(vorinostat)、VX-745、渥曼青黴素(wortmannin)、Xr311、紮木單抗(zanolimumab)、ZK186619、ZK-304709、ZM336372、ZSTK474。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與一或多種止吐劑聯合,包括(但不限於):卡索匹坦(casopitant)(GlaxoSmithKline)、奈妥吡坦(Netupitant)MGI-Helsinn)及其他NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊(palonosetron)(由MGI Pharma以Aloxi銷售)、阿瑞吡坦(aprepitant)(由Merck及Co.;Rahway,NJ以Emend出售)、苯海拉明(diphenhydramine)(由Pfizer;New York,NY以Benadryl®出售)、羥嗪(由Pfizer;New York,NY以Atarax®出售)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(由AH Robins Co,;Richmond,VA以Reglan®出售)、勞拉西泮(lorazepam)(由Wyeth;Madison,NJ以Ativan®出售)、阿普唑侖(alprazolam)(由Pfizer;New York,NY以Xanax®出售)、氟哌啶醇(haloperidol)(由Ortho-McNeil;Raritan,NJ以Haldol®出售)、氟哌利多(droperidol)(Inapsine®)、屈大麻酚(dronabinol)(由Solvay Pharmaceuticals,Inc.;Marietta,GA以Marinol®出售)、地塞米松(dexamethasone)(由Merck及Co.;Rahway,NJ以Decadron®出售)、甲潑尼龍(由Pfizer;New York,NY以Medrol®出售)、普魯氯嗪(prochlorperazine)(由Glaxosmithkline;Research Triangle Park,NC以Compazine®出售)、格拉司瓊(granisetron)(由Hoffmann-La Roche Inc.;Nutley,NJ以Kytril®出售)、昂丹司瓊(ondansetron)(由Glaxosmithkline;Research Triangle Park,NC以Zofran®出售)、多拉司瓊(dolasetron)(由Sanofi-Aventis;New York,NY以Anzemet®出售)、托烷司瓊(tropisetron)(由Novartis;East Hanover,NJ以Navoban®出售)。
癌症治療之其他副作用包括紅血球及白血球缺乏。因此,在本發明之一實施例中,抗-PD-1抗體或其抗原結合片段與治療或預防該缺乏之藥劑聯合,諸如非格司亭(filgrastim)、PEG-非格司亭、紅血球生成素、阿法 依泊汀(epoetin alfa)或阿法達貝泊汀(darbepoetin alfa)。
在本發明之一實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段聯合抗癌輻射治療一起投與。例如,在本發明之一實施例中,輻射治療為外射束治療(EBT):一種將高能X射線束傳遞至腫瘤位置之方法。在患者體外產生射束(例如藉由線性加速器)且靶向腫瘤位點。該等X射線可破壞癌細胞且謹慎之治療計劃將使得周圍之正常組織免受傷害。患者體內不放置放射源。在本發明之一實施例中,輻射治療為質子束治療:一種以質子代替X射線攻擊患病組織之順形治療類型。在本發明之一實施例中,輻射治療為順形外射束輻射治療:一種使用高級技術來調節輻射治療使其適合個體之身體結構的程序。在本發明之一實施例中,輻射治療為近程治療:在體內臨時放置放射性材料,通常用於對某一位置產生額外劑量-或增強量-之輻射。
在本發明之一實施例中,聯合抗-PD-1抗體或其抗原結合片段投與之手術程序為外科腫瘤切除術。
術語「與......聯合」表示在本發明之方法中投與之組分(例如,抗-PD-1抗體(例如,人源化抗體)或其抗原結合片段以及本文中引用之一或多種其他藥劑)可調配為單一組合物以供同時傳遞或經單獨調配為兩種或兩種以上組合物(例如,套組)。每種組分可在投與另一組分之不同時間投與至受檢者;例如,每次投藥可在給定時間段以若干次間隔非同時(例如,單獨或連續)給與。此外,單獨組分可藉由相同或不同途徑投與至受檢者。
實驗及診斷用途
本文揭示之抗-PD-1抗體及其抗原結合片段可用作親和力純化劑。在此方法中,抗-PD-1抗體及其抗原結合片段經使用此項技術中熟知之方法固定在諸如Sephadex、玻璃或瓊脂糖樹脂或濾紙之固相上。使固定之抗 體或片段與含有待純化PD-1蛋白(或其片段)之樣品接觸,且此後以將實質上移除樣品中除PD-1蛋白(其結合至經固定抗體或片段)以外之所有物質的合適溶劑洗滌支撐物。最後,以溶離結合PD-1(例如,蛋白A)之溶劑洗滌支撐物。該等固定抗體及片段形成本發明之部分。
進一步提供用於產生二級抗體之抗原,其例如適用於進行西方印漬法及本文論述之其他免疫分析。
抗-PD-1抗體(例如,人源化抗體)及其抗原結合片段亦可適用於PD-1蛋白之診斷分析,例如偵測其在特異性細胞、組織或血清(例如,腫瘤細胞,諸如黑素瘤細胞)中之表現。該等診斷方法可適用於各種疾病診斷中。
本發明包括ELISA分析(酶聯結免疫吸附劑分析),其合併有使用本文揭示之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人源化形式)。
例如,該方法包括以下步驟:
(a)以抗-PD-1抗體或其抗原結合片段塗佈基板(例如,微量滴定盤之孔表面,例如塑料盤);
(b)向基板塗覆待測試是否存在PD-1之樣品;
(c)洗滌培養盤,以便移除樣品中未結合之物質;
(d)塗覆對PD-1抗原亦具有特異性之可偵測標記抗體(例如,酶聯結抗體)。
(e)洗滌基板,以便移除未結合之標記抗體;
(f)若標記抗體經酶聯結,則塗覆經酶轉化為螢光信號之化學品;及
(g)偵測是否存在經標記抗體。
偵測到與基板結合之標記表示存在PD-1蛋白。
在另一實施例中,經標記之抗體或其抗原結合片段以與ABTS(例如,2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3',5,5'-四甲基 聯苯胺反應之過氧化物酶進行標記以產生可偵測之顏色變化。或者,經標記之抗體或片段以在閃爍劑存在下可由閃爍計數器進行偵測之可偵測放射性同位素(例如,3H)來標記。
本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段可用於西方印漬法或免疫-蛋白印漬法程序中。該程序形成本發明之部分且包括例如使用此項技術中已知之方法(例如,半乾燥印漬法或槽式印漬法)視情況將蛋白自欲測試是否存在PD-1之樣品(例如,來自PAGE或SDS-PAGE電泳分離樣品中之蛋白)轉移至膜或其他固體基板上;使欲測試是否存在結合PD-1或其片段之膜或其他固體基板與本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段接觸;將膜洗滌一或多次以移除未結合之抗-PD-1抗體或片段及其他未結合之物質;及偵測結合之抗-PD-1抗體或片段。
該膜可採用基於硝基纖維素或乙烯基(例如聚偏二氟乙烯(PVDF))膜之形式,已向該膜轉移(例如,在凝膠中電泳分離後)欲在非變性PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)凝膠或SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)凝膠中測試是否存在PD-1之蛋白。在使膜與抗-PD-1抗體或片段接觸之前,視情況例如以脫脂乾奶粉或其類似物阻斷膜以結合膜上之非特異性蛋白結合位點。
偵測到結合之抗體或片段表示在膜或基板上以及在樣品中存在PD-1蛋白。可藉由使抗體或片段與可偵測標記之二級抗體(抗免疫球蛋白抗體)結合,且隨後偵測是否存在二級抗體來偵測結合之抗體或片段。
本文揭示之抗-PD-1抗體及其抗原結合片段亦可用於免疫組織化學。該方法形成本發明之部分且包括例如使欲測試是否存在PD-1蛋白之細胞(例如,腫瘤細胞,諸如黑素瘤細胞)與本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段接觸;及偵測細胞上或細胞中之抗體或片段。
若抗體或片段本身可偵測標記,則可直接偵測。或者,抗體或片段可結合有可偵測標記之二級抗體來進行偵測。
本文揭示之某些抗-PD-1抗體及其抗原結合片段亦可用於活體內腫瘤成像。該方法可包括將經放射性標記之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段注射至欲測試是否存在與PD-1表現(例如,其例如在腫瘤細胞表面上表現PD-1)相關之腫瘤的患者體內,繼而對患者身體進行核成像以偵測例如在包含高濃度與腫瘤結合之抗體或片段的基因座處是否存在經標記之抗體或片段。偵測到基因座表示存在PD-1+腫瘤及腫瘤細胞。
成像技術包括SPECT成像(單光子發射計算機斷層掃描)或PET成像(正電子發射斷層掃描)。例如,標記包括例如與SPECT成像結合使用之碘-123(123I)及鍀-99m(99mTc),或例如與PET成像結合使用之11C、13N、15O或18F,或銦-111(參見例如,Gordon等人,(2005)International Rev.Neurobiol.67:385-440)。
醫藥組合物及投藥
為製備本發明之抗-PD-1抗體及抗原結合片段之醫藥學或無菌組合物,將抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合。參見例如Remington's Pharmaceutical SciencesU.S.Pharmacopeia:National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。
治療劑及診斷劑之調配物可藉由與例如凍乾粉末、漿料、水性溶液或懸浮液形式之可接受載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備(參見例如Hardman等人(2001)Goodman及Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY;Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott、Williams及Wilkins,New York,NY;Avis等人(編)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY;Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker,NY;Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY;Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
單獨或與另一治療劑組合投與之本發明抗體之毒性及治療功效可藉由標準醫藥學程序在細胞培養物或實驗動物中確定,例如用於確定LD50(對50%之群體致命之劑量)及ED50(在50%群體中治療有效之劑量)。毒性作用與治療作用之間之劑量比為治療指數(LD50/ED50)。由該等細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配用於人類之一系列劑量。該等化合物之劑量較佳在包括ED50之循環濃度範圍內,幾乎無毒性或無毒性。視採用之劑型及投藥途徑而定,劑量可在此範圍內變化。
在另一實施例中,根據Physicians' Desk Reference 2003(Thomson Healthcare;第57版(2002年11月1日))結合本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段一起向受檢者投與另一治療劑。
投藥模式可變化。投藥途徑包括經口、直腸、透黏膜、腸道、非經腸;肌肉內、皮下、皮內、髓內、鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內、眼內、吸入、吹入、局部、皮膚、經皮、腫瘤內或動脈內。
在特定實施例中,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段可藉由諸如注射之侵襲性途徑投與。在本發明之其他實施例中,抗-PD-1抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物經靜脈內、皮下、肌肉內、動脈內、瘤內或藉由吸入、氣霧劑傳遞來投與。藉由非侵襲性途徑(例如經口;例如以藥丸、膠囊或錠劑形式)投藥亦在本發明之範疇內。
本發明提供一種包含本發明之任意抗體或抗原結合片段或其醫 藥組合物之容器(例如,塑料或玻璃小瓶,例如具有蓋或層析管柱、中空孔針或注射筒)。本發明亦提供一種包含本發明之任意抗體或抗原結合片段或其醫藥組合物之注射裝置。注射裝置為經由非經腸途徑(例如,肌肉內、皮下或靜脈內)將物質引入患者體內之裝置。例如,注射裝置可為注射器(例如,預填充以醫藥組合物,諸如自動注射器),其例如包括用於固持欲注射流體(例如抗體或片段或其醫藥組合物)之圓筒或圓桶、用於刺穿皮膚及/或血管以供注射流體之針;及用於從圓筒推出流體並使其穿過針孔之柱塞。在本發明之一實施例中,包含本發明之抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物之注射裝置為靜脈內(IV)注射裝置。該裝置在套管或套管針/針頭中包括抗體或片段或其醫藥組合物,該套管或套管針/針頭可連接至一管,該管可連接至用於固持將經由套管或套管針/針頭引入患者體內之流體(例如,鹽水;或包含NaCl、乳酸鈉、KCl、CaCl2且視情況包括葡萄糖之乳酸化林格溶液(lactated ringer solution))的袋子或貯器。在本發明之一實施例中,抗體或片段或其醫藥組合物可引入裝置中,一旦將套管針及套管插入受檢者靜脈中,即自插入之套管移除套管針。IV裝置例如可插入外周靜脈(例如,手或臂中);上腔靜脈或下腔靜脈或右心房中(例如,中心IV);或插入鎖骨下靜脈、頸內靜脈或股靜脈中且例如深入至心臟直至到達上腔靜脈或右心房(例如,中心靜脈導管)。在本發明之一實施例中,注射裝置為自我注射器、噴射注射器或外部輸液泵。噴射注射器使用穿透表皮之高壓狹窄噴射液體將抗體或片段或其醫藥組合物引入患者體內。外部輸液泵係以受控量向患者體內傳遞抗體或片段或其醫藥組合物之醫用裝置。外部輸液泵可由電力或機械來提供動力。不同泵以不同方式操作,例如注射泵將流體固持在注射器之貯器中,且可移動之活塞控制流體傳遞,彈性泵將流體固持在可伸縮之氣球貯器中且來自氣球彈性壁之壓力驅動流體傳遞。在蠕動泵中,一組滾輪向下 擠壓一段可撓性管道,推動流體前進。在多通道泵中,流體可由多個貯器以多種速率來傳遞。
本文揭示之醫藥組合物亦可由無針皮下注射裝置來投與;諸如美國專利第6,620,135號、第6,096,002號、第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中揭示之裝置。包含醫藥組合物之該等無針裝置亦為本發明之部分。本文揭示之醫藥組合物亦可藉由輸液來投與。用於投與醫藥組合物之熟知植入體及模組之實例包括在美國專利第4,487,603號(其揭示用於以受控速率施配藥物之可植入式微量輸液泵)、美國專利第4,447,233號(其揭示用於以精確輸液速率傳遞藥物之藥物輸液泵)、美國專利第4,447,224號(其揭示用於連續藥物傳遞之變速流可植入式輸液裝置)、美國專利第4,439,196號(其揭示具有多腔隔室之滲透性藥物傳遞系統)中揭示之彼等植入體及模組。熟習此項技術者熟知多種其他該等植入體、傳遞系統及模組,且包含本發明醫藥組合物之彼等植入體、傳遞系統及模組在本發明之範疇內。
或者,吾人例如可經由直接向腫瘤(例如PD-L1+腫瘤)注射抗體或片段,以非全身性方式之局部方式投與本發明之抗-PD-1抗體或抗原結合片段。此外,吾人可由靶向藥物傳遞系統來投與抗體或片段,例如以塗有組織特異性抗體之脂質體來投與,該脂質體例如靶向例如具有免疫病理學特徵之腫瘤(例如PD-1+腫瘤)。該等脂質體將靶向患病組織且由其選擇性吸收。該等方法及脂質體係本發明之部分。
投藥方案取決於若干種因素,包括治療抗體或抗原結合片段之血清或組織轉換速率、症狀等級、治療抗體之免疫原性及靶細胞在生物學基質中之可達性。投藥方案較佳傳遞足量治療抗體或片段以實現對標靶疾病狀態之改良,並同時最小化不良之副作用。因此,所傳遞之生物量部分 取決於特定治療抗體及所治療病況之嚴重性。可獲得關於選擇治療抗體或片段之適當劑量的指引(參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK;Kresina(編)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY;Bach(編)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY;Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348:601-608;Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973;Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792;Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619;Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348:24-32;Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
臨床醫師例如使用此項技術中已知或疑似影響治療之參數或因素來確定適當劑量。劑量通常由略小於最佳劑量之量開始,且此後以小增量增加直至相對於任何消極副作用而言達成所需或最佳作用。重要之診斷性量測包括對例如炎症症狀或所產生之發炎性細胞激素含量之彼等診斷性量測。一般而言,有利的係將使用之生物來源於與靶向治療之動物相同之物種,由此使得對試劑之任何免疫反應最小化。例如在人類受檢者之情形下,人源化及完全人類抗體可為有利的。
本文揭示之抗體或其抗原結合片段可藉由連續輸液或藉由例如每天、每週1至7次、每週、每兩週、每月、每兩月、每季度、每半年、每年等分次投藥來提供。例如可經靜脈內、皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、肌肉內、大腦內、錐管內或藉由吸入來提供給藥。總的每週劑量通常為至少0.05μg/kg體重,更通常為至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或50mg/kg以上(參見例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med. 349:427-434;Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698;Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456;Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:151-144)。亦可提供在受檢者血清中達成抗-PD-1抗體預定靶濃度之劑量,諸如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或300μg/ml以上。在其他實施例中,例如經皮下或靜脈內每週、每兩週、「每4週」、每月、每兩月或每季度以每個受檢者10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg投與本發明之抗-PD-1抗體。
如本文所用,術語「有效量」係指本發明之抗-PD-1或其抗原結合片段在單獨或與另一治療劑組合投與至細胞、組織或受檢者時對疾病(例如癌症)之一或多種症狀或癌症之發展有效產生可量測改良的量。有效劑量進一步係指足以導致至少部分緩解症狀(例如腫瘤萎縮或消除)、腫瘤生長缺乏、存活時間增加的抗體或片段之量。在用於單獨投與之個別活性成分時,有效劑量係指單獨成分。在用於組合時,有效劑量係指產生治療作用之活性成分的組合量,而無論組合、連續或同時投與。有效量之治療劑將導致診斷性量測或參數改良至少10%、通常至少20%、較佳至少約30%、更佳至少40%且最佳至少50%。若主觀量測用來評估疾病嚴重性,則有效量亦可導致對主觀量測之改良。
套組
進一步提供套組,其包含一或多種組分,包括(但不限於)如本文論述之抗-PD-1抗體或抗原結合片段以及一或多種其他組分,包括(但不限於)如本文論述之醫藥學上可接受之載劑及/或治療劑。抗體或片段及/或治療劑可經調配為純組合物或與醫藥學上可接受之載劑組合調配為醫藥組合物。
在一實施例中,套組包括本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物在一個容器中(例如,在無菌玻璃或塑料小瓶中)及其醫藥組合物及/或治療劑在另一容器中(例如,在無菌玻璃或塑料小瓶中)。
在另一實施例中,套組包含本發明之組合,包括本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段以及醫藥學上可接受之載劑,視情況與一或多種治療劑組合一起視情況在單一常用容器中調配成醫藥組合物。
若套組包括用於非經腸投藥給受檢者之醫藥組合物,則該套組可包括用於進行該投藥之裝置。例如,套組可包括如上文論述之一或多種皮下針頭或其他注射裝置。
套組可包括包裝插頁,其包括有關套組中之醫藥組合物及劑型之信息。該信息通常有助於患者及醫師有效且安全地使用封裝之醫藥組合物及劑型。例如,在插頁中可提供關於本發明之組合之以下信息:藥物動力學、藥效學、臨床研究、功效參數、適應症及用法、禁忌症、警告、預警、不良反應、過量、適當劑量及投藥、如何使用、適當儲存條件、參考文獻、製造商/經銷商信息及專利信息。
偵測套組及治療套組
為方便起見,本發明之抗-PD-1抗體或其抗原結合片段可由套組提供,亦即預定量之試劑與關於進行診斷或偵測分析之說明的封裝組合。當以酶標記抗體或片段時,套組將包括酶所需之受質及輔因子(例如,提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體)。另外,可包括其他添加劑,諸如穩定劑、緩衝劑(例如,阻斷緩衝劑或溶解緩衝劑)及其類似物。各種試劑之相對量可廣泛變化以提供試劑溶液中實質上使分析之敏感度最優化之濃度。試劑尤其可呈乾燥粉末形式(通常為凍乾的)提供,包括在溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液的賦形劑。
亦提供診斷或偵測試劑及包含一或多種該等試劑用於各種偵測分析之套組,該等偵測分析例如包括免疫分析,諸如ELISA(夾層型或競爭形式)。套組之組分可預先貼附至固體支撐物上,或在使用套組時施用於固體支撐物表面上。在本發明之一些實施例中,信號產生構件在使用之前可與本發明之抗體或片段預先關聯或可能需要與一或多種組分(例如,緩衝劑、抗體-酶結合物、酶受質或其類似物)組合。套組亦可包括其他試劑,例如用於減少與固相表面非特異性結合之阻斷試劑、洗滌試劑、酶受質及其類似物。固相表面可為適合固定蛋白、肽或多肽之管、珠粒、微量滴定盤、微球體或其他材料之形式。在特定態樣中,催化化學發光或發色產物之形成或化學發光或發色受質之還原的酶為信號產生構件之組分。該等酶在此項技術中熟知。套組可包含本文所述之任何捕集劑及偵測試劑。套組視情況亦可包含用於進行本發明方法之說明。
亦提供一種套組,其包含封裝在諸如小瓶或瓶之容器中之抗-PD-1抗體(例如,人源化抗體)或其抗原結合片段,且進一步包含貼附在容器上或封裝在容器中之標籤,該標籤描述容器之內容物且提供關於容器內容物用於治療如本文所述之一或多種疾病狀態之適應症及/或說明。
在一態樣中,套組用於治療癌症且包含抗-PD-1抗體(例如,人源化抗體)或其抗原結合片段及另一治療劑或疫苗。套組可視情況進一步包括用於非經腸(例如靜脈內)投藥之注射器。在另一態樣中,套組包含抗-PD-1抗體(例如,人源化抗體)或其抗原結合片段及貼附或封裝在容器中之描述抗體或片段與疫苗或進一步與治療劑一起使用之標籤。在又一態樣中,套組包含疫苗或進一步之治療劑及貼附或封裝在容器中之描述疫苗或進一步之治療劑與抗-PD-1抗體或片段一起使用之標籤。在某些實施例中,抗-PD-1抗體及疫苗或進一步之治療劑在單獨小瓶中或一起組合在相同之醫藥組合 物中。
如上文在組合治療部分中所論述,同時投與兩種治療劑不需要同時或藉由相同途徑投與該等藥劑,只要藥劑發揮其治療作用之時間段重疊即可。涵蓋同時或相繼投藥,如在不同天或不同週投藥。
本文揭示之治療及偵測套組亦可製備為包含本文揭示之抗體、肽、抗原結合片段或聚核苷酸中之至少一者及關於使用該組合物作為偵測試劑或治療劑之說明。用於該等套組中之容器通常可包含至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他合適容器,其中可放置一或多種偵測及/或治療組合物,且較佳經合適等分試樣。當亦提供第二治療劑時,套組亦可含有第二個不同容器,其中可放置此第二偵測及/或治療組合物。或者,複數種化合物可製備成單一醫藥組合物,且可封裝於單一容器構件中,諸如小瓶、燒瓶、注射器、瓶或其他合適之單一容器。本文揭示之套組通常亦將包括封閉式含有小瓶以供商業銷售之構件,諸如其中保留所需小瓶之射出成型或吹塑成型之塑料容器。當套組中包括放射性標記、發色、螢光發生或其他類型之可偵測標記或偵測構件時,可在與偵測相同之容器中或在治療組合物本身中提供標記劑,或者標記劑可置放於第二不同容器構件中,該構件中可放置此第二組合物且經適當等分試樣。或者,偵測試劑及標記可在單一容器構件中製備,且在大多數情形中,套組通常亦將包括封閉式含有小瓶以供商業銷售及/或方便包裝及傳遞之構件。
亦提供一種用於進行本文所述之偵測或監控方法之裝置或設備。該設備可包括可向其中輸入樣品之腔室或管、視情況包括閥或泵以引導樣品流經裝置之流體操作系統、視情況包括使血漿或血清與血液分離之過濾器、用於添加捕集劑或偵測試劑之混合室及視情況包括用於偵測與捕集劑免疫複合物結合之可偵測標記之量的偵測裝置。樣品之流動可為被動的(例 如,藉由毛細管力、流體靜力或其他力,一旦施加樣品,則無需進一步操縱裝置)或主動的(例如,藉由施加經由機械泵、電滲泵、離心力或增加空氣壓力產生之力),或藉由主動力與被動力之組合。
在其他實施例中,亦提供一種處理器、一種計算機可讀記憶體及一種儲存在計算機可讀記憶體上且適於在處理器上執行來進行本文所述之任何方法之常用程式。合適計算系統、環境及/或構型之實例包括個人電腦、伺服器電腦、手持式或膝上型裝置、多處理器系統、基於微處理器之系統、視訊轉接器、可程式化消費型電子設備、網路PC、微型電腦、主機電腦、分散式計算環境(包括任何以上系統或裝置)或此項技術中已知之任何其他系統。
通用方法
分子生物學中之標準方法在以下描述:Sambrook,Fritsch及Maniatis(1982 & 1989第2版,2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Wu(1993)Recombinant DNA,第217卷,Academic Press,San Diego,CA)。標準方法亦出現在Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第1-4卷,John Wiley及Sons,Inc.New York,NY中,其描述在細菌細胞中選殖及DNA突變(第1卷)、在哺乳動物細胞及酵母中選殖(第2卷)、糖結合物及蛋白表現(第3卷)及生物信息學(第4卷)。
描述用於蛋白純化之方法,包括免疫沈澱、層析、電泳、離心及結晶(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley及Sons,Inc.,New York)。描述化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融 合蛋白產生、蛋白糖基化(參見例如Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,第2卷,John Wiley及Sons,Inc.,New York;Ausubel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,第3卷,John Wiley及Sons,Inc.,NY,NY,第16.0.5-16.22.17頁;Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO;第45-89頁;Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,第384-391頁)。描述多株及單株抗體之產生、純化及片段化(Coligan等人(2001)Current Protcols in Immunology,第1卷,John Wiley及Sons,Inc.,New York;Harlow及Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY;Harlow及Lane,上文)。可獲得用於表徵配位體/受體相互作用之標準技術(參見例如Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology,第4卷,John Wiley,Inc.,New York)。
可製備單株、多株及人源化抗體(參見例如Sheperd及Dean(編)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY;Kontermann及Dubel(編)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York;Harlow及Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,第139-243頁;Carpenter等人(2000)J.Immunol.165:6205;He等人(1998)J.Immunol.160:1029;Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378;Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684;Chothia等人(1989)Nature 342:877-883;Foote及Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499;美國專利第6,329,511號)。
人源化之替代方式係使用在噬菌體上呈現之人類抗體庫或轉基因小鼠中之人類抗體庫(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314;Barbas(1995)Nature Medicine 1:837-839;Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156;Hoogenboom及Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377;Barbas等人(2001)Phage Display:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York;Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA;de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
描述單鏈抗體及雙功能抗體(參見例如Malecki等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213-218;Conrath等人(2001)J.Biol.Chem.276:7346-7350;Desmyter等人(2001)J.Biol.Chem.276:26285-26290;Hudson及Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231:177-189;及美國專利第4,946,778號)。提供雙功能抗體(參見例如Mack等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7021-7025;Carter(2001)J.Immunol.Methods 248:7-15;Volkel等人(2001)Protein Engineering 14:815-823;Segal等人(2001)J.Immunol.Methods 248:1-6;Brennan等人(1985)Science 229:81-83;Raso等人(1997)J.Biol.Chem.272:27623;Morrison(1985)Science 229:1202-1207;Traunecker等人(1991)EMBO J.10:3655-3659;及美國專利第5,932,448號、第5,532,210號及第6,129,914號)。
亦提供多特異性抗體(參見例如Azzoni等人(1998)J.Immunol.161:3493;Kita等人(1999)J.Immunol.162:6901;Merchant等人(2000)J.Biol.Chen.74:9115;Pandey等人(2000)J.Biol.Chem.275:38633;Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276:12999;Propst等人(2000)J.Immunol.165:2214;Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17:875);Labrijn等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110:5145-50,2013;de Jong等人,PLOS Biol 14(1):e1002344,2016(doi:10.1371/journal.pbio.1002344)。
對於產生抗體而言並非必需純化抗原。動物可經帶有所關注抗原之細胞免疫。隨後可自免疫動物分離脾細胞,且可將脾細胞與骨髓瘤細胞株融合以產生融合瘤(參見例如Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290;Wright等人(2000)Immunity 13:233-242;Preston等人,上文;Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
抗體例如可與小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇(PEG)結合。抗體適用於治療、診斷、套組或其他目的,且包括例如與染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠體金)偶合之抗體(參見例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175;Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898;Hsing及Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811;Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。
可獲得用於流式細胞儀之方法,包括螢光活化細胞揀選(FACS)(參見例如Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley及Sons,Hoboken,NJ;Givan(2001)Flow Cytometry,第2版;Wiley-Liss,Hoboken,NJ;Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley及Sons,Hoboken,NJ)。可獲得適用於修飾核酸之螢光試劑,包括核酸引子及探針、多肽及抗體,例如用作診斷試劑(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR;Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
描述免疫系統組織學之標準方法(參見例如Muller-Harmelink(編)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY;Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,及Wilkins,Phila,PA;Louis等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
可獲得用於確定例如抗原片段、前導序列、蛋白摺疊、功能結構域、糖基化位點及序列比對之套裝軟體及資料庫(參見例如GenBank,Vector NTI® Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD);GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA);DeCypher®(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada);Menne等人(2000)Bioinformatics 16:741-742;Menne等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742;Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181;von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21;von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
實例 實例1:抗-hPD-1抗體之免疫及選擇
為分離對抗人類PD-1蛋白之抗體,以hPDCD1(編碼hPD-1之表現構築體)DNA對小鼠進行免疫。將編碼hPD-1之全長開放閱讀框之cDNA次選殖至pCI-neo載體中(Promega,Madison,WI)。hPD-1 DNA之序列如下(來自NM_005018.2)(SEQ ID NO:13):
根據製造商說明,藉由使用Helios基因槍(BioRad,Hercules,CA)及DNA塗金子彈(BioRad)之基因槍免疫法對小鼠進行免疫。簡言之,對於2:1:1比率之小鼠Flt3L及小鼠GM-CSF(兩者均來自Aldevron,Fargo,ND)而言,以pCI-neo-hPD1 cDNA及市售表現載體塗佈1μm金粒子。使用總計1μg質體DNA塗佈500μg金粒子。特定而言,以基因槍在耳朵中對7至8週大之雌性BALB/C小鼠進行免疫,兩隻耳朵均接受3次投藥循環。
大致而言,在三次DNA免疫後,在小鼠血清中藉由CELISA偵測1:625-3,125抗-hPD-1效價。在此分析中,所有培育步驟後均緊接三次PBST(具有0.01% Tween 20之PBS)洗滌步驟。為此目的,以hPDCD1穩定轉染CHO-K1細胞(美國典型培養物保藏中心,Manassas,VA)。將親本CHO-K1或CHO-K1.hPDCD1細胞接種於組織培養盤中之培養基(具有10%胎牛血清(Hyclone)及Pen/Strep(Gibco)之DMEM-F12(Gibco))中且在37℃下培育隔夜。隨後移除培養基且將細胞在37℃下以血清稀釋液及對照抗體稀釋液培育1小時。接著,以磷酸鹽緩衝之生理食鹽水/0.05% Tween(PBST)洗滌細胞且在37℃下以1:5,000山羊-抗-小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology)培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌3次且以TMB穩定化色素原(Invitrogen)觀測抗-hPD1免疫反應性。以0.5M H2SO4終止反應且在450及620nm下讀取吸光度。
對展示對抗hPD-1之反應性的小鼠進行最終第四次免疫且在四天後處死。如前文所述製備紅血球耗盡之脾及淋巴結細胞群(Steenbakkers等人,1992,J.Immunol.Meth.152:69-77;Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134)且在-140℃下冷凍。
為特異性地選擇產生B細胞之抗-hPD-1抗體,設計並研發一種選擇策略,其藉由在Dynabeads套組中提供之結合/洗滌緩衝液中以5.25μg重組hPD1-Fc(R&D系統,目錄號#110-HG-100)在20℃下培育1小時而優先結合與hPD-1.5×107 ProtG Dynabeads(Invitrogen,Cat 100.07D)結合之表現B細胞的抗體。接著,抽出上清液且藉由在4℃下培育1小時而以PBS/10% FBS阻斷珠粒。將珠粒以PBS/10% FBS洗滌3次。最後,將珠粒再懸浮於PBS/10% FBS中。
如Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134所述培養選擇之B細胞。簡言之,將選擇之B細胞與7.5%(v/v)T細胞上清液及50,000個受輻射(2,500 RAD)之EL-4 B5餵養細胞在96孔平底組織培養盤中混合成200μl培養基之最終體積。在第8天,如上文所述藉由CELISA根據hPD-1反應性對上清液進行篩選。
藉由重複CELISA證實PD-1特異性B細胞純系且另外以ELISA形式進行配位體阻斷分析。在Maxisorp培養盤(Nunc)上,在4℃下隔夜塗佈重組hPD-1/Fc(R&D系統;目錄號#1086-PD-050)。接著將培養盤以PBS/1% BSA阻斷、以PBST洗滌三次且隨後將B細胞培養物之上清液添加至孔中。在37℃下培育1小時後,將培養盤以PBST洗滌三次且隨後向孔中添加hPD-L1/Fc(R&D系統;目錄號#156-B7-100)。在37℃下培育1小時且以PBST三次洗滌步驟後,添加生物素標記之抗-PD-L1抗體(eBioscience;目錄號#13-5983純系MIH1)。將此在37℃下培育1小時且在以PBST三次洗滌步驟後,向孔中添加抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物且37℃下培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌六次且由TMB穩定化Chromagen(Invitrogen;目錄號#SB02)觀測hPD-L1/Fc結合。以0.5M H2SO4終止反應且在450及610nm下讀取吸光度。
隨後,根據公開之程序,藉由微電融合使來自hPD-1反應性上清液之B細胞純系永生化,尤其產生hPD-1/hPD-L1相互作用阻斷劑之純系(Steenbakkers等人,1992,J.Immunol.Meth.152:69-77;Steenbakkers等人,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-34)。簡言之,將B細胞與106個Sp2/0-Ag14骨髓瘤細胞在電融合等莫耳緩衝劑(Eppendorf,目錄號53702)中混合。藉由30s、1MHz、15Vrms之交變電場,繼而10μs、3kV/cm之方形高壓電場脈衝,且再次藉由30s、1MHz、15Vrms之交變電場,在50μL之融合室中進行電融合。將室中之內容物轉移至融合瘤選擇性培養基中且在有限稀釋條件下塗在96孔培養盤中。在融合後第12天,如上文所述根據hPD-1結合活性篩選融合瘤上清液。藉由有限稀釋次選殖在識別hPD-1之上清液中分泌抗體之融合瘤以保護其完整性及穩定性。使用融合瘤培養物之上清液來同型融合瘤(Bio-rad;目錄號# MMT1)。回收之抗體全部識別為小鼠IgG1。
藉由有限稀釋獲得hPD-1融合瘤之選殖細胞群。將穩定融合瘤在不含血清之培養基中培養7至10天;收集上清液且根據製造商說明(GE Healthcare),使用MabSelect Sure蛋白A樹脂純化抗體。使用分光光度法定量抗體濃度。藉由對小鼠IgG1融合瘤材料之可變區進行選殖及測序來說明抗體序列。
表徵小鼠IgG1 hPD-1抗體與hPD-1之結合、對配位體結合(hPD-L1)之阻斷、功能性(以葡萄球菌腸毒素B(SEB)進行之全血分析及基於Jurkat之報告體分析(Promega))。亦測試抗體與非人類靈長類動物PD-1(更特定而言:食蟹猴PD-1)之交叉反應性。另外,如US8008449中所述測試抗體與5C4(稱為納武單抗)及如US8354509B2中所述與h409A11(稱為帕姆單抗)潛在交叉競爭結合至hPD-1。選擇小鼠抗體hPD1.29A,因為其結合hPD-1及馬來猴PD-1且阻斷PD-1/PD-L1相互作用,且不與5C4或h409A11競爭結合至 hPD-1(參見實例8)。
實例2:人源化抗體設計及CDR移植
藉由CDR移植技術人源化小鼠hPD1.29A抗體(參見例如美國專利第5,225,539號及Williams,D.G.等人,2010,Antibody Engineering,第1卷,第21章)。
首先,使用IgBLAST識別人類生殖系序列(Ye J.等人,2013,Nucleic Acids Res.41:W34-40)。對於hPD1.29A VH人類生殖系序列而言識別V-基因IGHV1-3*01(65.3%一致性)且對於VL人類生殖系序列而言識別IGKV1-16*01(65.3%一致性)。該兩個生殖系序列直接用於移植小鼠CDR。
接著,構建含有在IMGT資料庫(Lefranc,M.-P.等人,1999,Nucleic Acid Res.27:209-212)中可得之識別82,958個個別序列之所有人類序列的資料庫。使用TBLASTN(2.2.30+)查詢該等序列以識別與hPD1.29A VH及VL序列之框架展示最高一致性之模板序列。識別展示80%或80%以上之類似性分值且呈現較佳分別與hPD1.29A VH CDR1、CDR2、CDR3及VL CDR1、CDR2及CDR3中之CDR長度一致之類似CDR長度的四個VH及四個VL序列。
對於重鏈而言,選擇由GenBank(Benson,D.A.等人,2013,Nucleic Acids Res.41(D1):D36-42)登錄號# DJ011535、DD247024、DI109259及IGHV1-3*01編碼之構架作為直接移植hPD1.29A VH CDR之模板,分別產生以下模板:SEQ ID NO:14、15、16及17。對於輕鏈而言,選擇由GenBank登錄號# AY942002、DI112350、FR820880及IGKV1-16*01編碼之構架作為直接移植hPD1.29A VL CDR之模板,產生以下模板:SEQ ID NO:18、19、20及8。構架及CDR定義為如Kabat等人所述之彼等。
SEQ ID NO:14
EVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTTYYIHWVKQAPGKGLEWI GWIFPGDVSTQYNEKFQDKATITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREAYDYAVYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:15
EVQLQESGAEVVKPGASMKVSCKASGYIFTTYYIHWVKQAPGKNLEWIGWIFPGDVSTQYNEKFQDKATISVDKSASTAYMELLSLTSEDSAVYYCTREAYDYAVYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:16
EVQLVESGAEVVKPGASVKVSCKASGYIFTTYYIHWVRQAPGKGLEWIGWIFPGDVSTQYNEKFQDKATITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREAYDYAVYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:17
EVQLVQAGAEVKKPGASVKVSCKASGYRFTTYYIHWVRQAPGQRLEWMGWIFPGDVSTQYNEKFQDKATITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREAYDYAVYWGQATLVTVSA
SEQ ID NO:18
DIQLTQAPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:19
DIQMTQAPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYSGVPSRFSGSGSGTEFSLSISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:20
DIQMTQAPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWYQQKPGKAPKLLIY SASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:8
DIQMTQAPSSLSASVGDRVTITCKASQNVDTNVAWFQQKPGKAPKSLIFSASYRYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNNYPFTFGGGTKLEIK
為研究人源化構架殘基對Fv結構之作用,使用Discovery Studio 4.5中之『抗體建模級聯』(預設參數)建立小鼠hPD1.29A Fv之同源模型。基於PDB ID 3DIF建立同源模型。
電腦模擬移植CDR來研究接近任何CDR且可能影響環構型之殘基,稱為Vernier殘基。識別可能影響環構型且在距CDR表面<5Å以內之殘基且在此位置以小鼠胺基酸取代。使用Discovery Studio 4.5檢查所得模板是否存在轉譯後修飾(PTM)基元,且若可能(亦即,非-CDR、非-Vernier殘基)則改變以防止PTM。
如經實驗確定及計算,小鼠hPD1.29A之pI相對低,為6.2。人源化VH序列具有6.6與7.5之間範圍內之理論pI。基於同源模型所建議,hPD1.29A之VH1中之兩個麩胺酸由兩個麩醯胺酸(E6Q及E81Q)置換,產生另一人源化模板(SEQ ID 7)。由於該等取代,Fab片段之理論pI增加至8.2。此導致結合與表現得以改良(參見實例3及4)。
在每個識別之模板上移植CDR,表現為人類IgG4,其為在pcDNA3.1(+)載體中選殖之κ抗體且在HEK293 Free-style細胞中瞬時轉染。產生IgG4形式之人源化抗體,具有穩定之Adair突變(Angal S.等人,1993,Mol.Immunol.30:105-108),其中絲胺酸241(Kabat編號)轉化為脯胺酸。
實例3:人源化構築體之合成、表現及純化
將編碼VH及VL構築體之質體以1:1比率混合(總計30μg)且藉由根據製造商說明,使用293fectin轉染試劑(Invitrogen)轉染至FreeStyle 293-F-1.1.15人類胚胎腎細胞(HEK293T/17,ATCC-CRL-11268)中瞬時表現。7天後收集細胞上清液且測試抗體之表現。在Octet RED96系統(ForteBio)中使用蛋白A生物感應器定量來確定抗體之表現。
根據製造商說明(GE Healthcare),使用MabSelect Sure蛋白A樹脂純化抗體。使用Zeba脫鹽管柱(Thermo Scientific)將緩衝劑交換為10mM組胺酸、100mM NaCl pH 5.5緩衝劑。基於OD280(Nanodrop ND-1000)確定純化抗體之濃度。根據製造商說明(Lonza),藉由LAL測試確定內毒素含量。所有純化抗體含有低於10EU/mg。
類似地,三種其他hPD-1抗體藉由瞬時轉染CHO-細胞表現為人類IgG4(S241P)κ且藉由蛋白A快速蛋白液相層析(FPLC)純化:如US8354509B2中所述之h409A11、如US8008449中所述之5C4及如US20150203579A1中所述之H4H7798N(稱為RGN-2810)。
實例4:人源化PD-1抗體hPD1.29H5L4之結合
使用以編碼hPDCD1(hPD-1)之全長開放閱讀框之cDNA穩定轉染、次選殖至pCI-neo載體(Promega)中之CHO-K1細胞(美國典型培養物保藏中心,Manassas,VA),以CELISA形式研究人源化抗體與天然hPD-1之結合。將親本CHO-K1或CHO-K1.hPDCD1細胞接種於在組織培養盤中之培養基 (具有10%胎牛血清(Hyclone)及Pen/Strep(Gibco)之DMEM-F12(Gibco))中且在37℃下培育48小時。隨後移除培養基且將細胞在37℃下以hPD-1純化抗體(10μg/ml(=66nM)及其稀釋液)培育1小時。接著,以磷酸鹽緩衝之生理食鹽水/0.05% Tween(PBST)洗滌細胞且在37℃下以山羊-抗-人類IgG-HRP(Southern Biotech)培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌3次且以100μl TMB穩定化Chromagen(Invitrogen)觀測抗-hPD1免疫反應性。以100μl 0.5M H2SO4終止反應且在450及610nm下讀取吸光度。使用Graphpad Prism 6計算EC50值。EC50值表示觀察到50%總結合信號時之濃度。
為證實hPD-1結合,測試hPD1.29H5L4與人類T細胞之結合。圖1描繪一定濃度範圍之hPD1.29H5L4(實線)及hIgG4(虛線)與三種個別人類供體之CD3/CD28刺激之PBMC的結合。EC50(結合(%)=0.27nM±0.06nM)。如下自人類血沈棕黃層分離人類CD3+ T細胞。首先,在室溫下以PBS將血沈棕黃層稀釋至180ml之總體積。在混合細胞懸浮液之後,將等分試樣負載於Sepmate管(Stemcell)中之Ficoll-Paque Plus梯度上且在20℃下以1200g離心10min不中斷。接著,藉由抽吸移除血漿且自血漿/Ficoll界面回收PBMC。將PBMC在PBS中洗滌三次。隨後以磁性珠粒(CD3+T細胞生物素-Ab混合物;Miltenyi Biotec)進行CD3+T細胞分離。將細胞儲存在液氮中且在實驗當日自冷凍器獲取。由於hPD-1在休眠T細胞上之內源性表現低,因此以 αCD3/αCD28塗佈珠粒(Gibco)將解凍之CD3+ T細胞刺激48小時。刺激之後,收集細胞且藉由流式細胞儀分析細胞之hPD1.29H5L4結合。
實例5:藉由人源化PD-1抗體hPD1.29H5L4阻斷PD-L1及PD-L2
以CELISA形式評估hPD1.29H5L4之配位體阻斷。將親本CHO-K1或CHO-K1.hPDCD1細胞接種於組織培養盤中且在37℃下在培養基中培育72小時。隨後移除培養基且將細胞在37℃下以hPD1.29H5L4(10μg/ml(=66nM)及其稀釋液)培育1小時。接著,將細胞以PBST洗滌且在37℃下以生物素標記之重組hPD-L1 Fc-或hPD-L2 Fc-蛋白培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌三次,繼而在細胞上添加抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物,將其在37℃下培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌六次且以100μl TMB穩定化Chromagen(Invitrogen)觀測hPD-L1 Fc及hPD-L2 Fc之結合。以100μl 0.5M H2SO4終止反應且在450及610nm下讀取吸光度。由此資料計算hPD-L1及hPD-L2阻斷之IC50。IC50計算值表示觀測到一半抑止作用時之濃度。該等值可與5C4所見相比。
實例6:hPD1.29H5L4在Jurkat報告體分析及人類全血SEB分析中之功能性
基於Jurkat T細胞株,測試hPD1.29H5L4在報告體分析(Promega)中之功能性。簡言之,將表現hPD-L1之穩定轉染CHO細胞接種於平底細胞培養盤中且在37℃下培育隔夜。自細胞移除培養基且向細胞中添加抗體稀釋液(自300μg/ml開始及其稀釋液)。隨後向培養盤中添加表現人類PD-1且 含有與螢光素酶基因連接之NFAT啟動子的穩定轉染Jurkat細胞。在37℃下培育六小時後,藉由添加Bio-GloTM受質(Promega)讀取NFAT啟動子活性。信號愈高反映被通常抑制NFAT啟動子活性之PD1/PDL1路徑抗體阻斷。圖2A描繪在基於Jurkat之分析中hPD-1及hPD-L1相互作用之阻斷結果:hPD1.29H5L4結合hPD-1且阻斷與其配位體之相互作用,由此增強螢光素酶信號。如所示,hPD1.29H5L4與此項技術中已知之其他PD-1抗體之效能基本等同。
為研究人源化hPD1.29A抗體在人類全血中之作用,將血液在補充有10%胎牛血清(Hyclone)之RPMI 1640培養基(Gibco,52400)中稀釋10倍。將稀釋血液塗在96孔Nunclon△表面平底培養盤(每孔100μl)中。將抗體抗-hPD-1及人類IgG4同型對照物(Sigma,14639)(200μg/mL及其稀釋液)在PBS中稀釋且添加至稀釋血液中。最後向孔中添加在補充有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基中稀釋之葡萄球菌腸毒素B(Sigma S4881),最終濃度為25ug/ml。將細胞在37℃、5% CO2及95%濕度下培育三天。
為評估免疫活化水平,在上清液中確定IL-2分泌水平。為此目的,抽吸上清液且藉由離心清除任何細胞物質。接著,將上清液添加至已藉由在4℃下培育隔夜而在PBS中塗有2μg/ml抗-hIL-2抗體(BD Pharmiugen,555051)之Nunc maxisorp ELISA培養盤中。在添加上清液之前,將孔排空且在室溫(RT)下以每孔200μl PBS/1%BSA阻斷一小時。將上清液在室溫下培育一小時,以PBST(具有0.01% Tween 20之PBS)洗滌三次。隨後在PBS/PBS-1%BSA(1:1)中添加100μl 0.5μg/ml之抗-hIL2-生物素(BD Pharmingen 555040)且在室溫下培育一小時。在以PBST洗滌三次後,在100μl PBS/PBS-1% BSA(1:1)中添加1:5000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP(BD Pharmingen,554066)。在以PBST洗滌三次且以水洗滌一次後,藉由每孔添 加100μl TMB穩定化chromogen(Invitrogen,SBO2)偵測IL-2。以100μl 0.5M H2SO4終止反應且在450及610nm下讀取吸光度。在此分析中,使用重組人類IL-2(Sigma,H7041)來定量上清液中之IL-2蛋白含量。圖2B描繪全血SEB分析之結果,表明hPD1.29H5L4刺激IL-2產生。
實例7:hPD1.29H5L4與非人類靈長類動物(食蟹猴)PD-1之交叉反應性
使用經編碼馬來猴PD-1之全長開放閱讀框之cDNA瞬時轉染、次選殖至pCI-neo載體(Promega)中之CHO-K1細胞(美國典型培養物保藏中心,Manassas,VA)研究hPD-1抗體與天然馬來猴PD-1之結合。將親本CHO-K1或CHO-K1.cynoPD1細胞接種於組織培養盤中且在37℃下培育隔夜48小時。隨後移除培養基且將細胞在37℃下以純化hPD-1抗體(10μg/ml(=66nM)及其稀釋液)培育1小時。接著,以PBST洗滌細胞且在37℃下以山羊-抗-人類(Jackson Immuno Research)培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌3次且以100μL TMB穩定化Chromagen(Invitrogen)觀測抗-hPD1免疫反應性。以100μL 0.5M H2SO4終止反應且在450及610nm下讀取吸光度。證實hPD1.29H5L4與食蟹猴(馬來猴)PD-1之結合:EC50 0.45nM±0.08
為證實食蟹猴(馬來猴)PD-1結合,測試hPD1.29H5L4與食蟹猴(馬來猴)PBMC之結合。為此目的,將食蟹猴(馬來猴)血液以PBS 1:1稀釋且添加至含有13ml Lymphoprep 95%/PBS 5%之50ml管中。將細胞在450g及20℃下離心30分鐘不中斷。接著,藉由抽吸移除血漿且自血漿/Ficoll界面回收PBMC。將PBMC在PBS中洗滌兩次。將細胞冷凍在液氮中且在實驗當日自冷凍器獲取。由於PD-1在休眠T細胞上之內源性表現低,因此以αCD3/αCD28塗佈珠粒(Gibco)將解凍之PBMC刺激48小時。刺激之後,收集細胞且藉由流式細胞儀分析hPD1.29H5L4之結合。
圖3描繪一定濃度範圍之hPD1.29H5L4(實線)及hIgG4(虛線)與 三種個別動物之CD3/CD28刺激之食蟹猴(馬來猴)PBMC的結合。hPD1.29H5L4與食蟹猴(馬來猴)之結合EC50確定為1.6±0.4nM。
實例8:hPD1.29H5L4效應功能分析
在抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)分析及補體依賴性細胞毒性(CDC)分析中測試hPD1.29H5L4抗體之可能效應功能。為此目的,將如實例5中所述分離之人類CD3+ T細胞用作靶細胞,因為該等細胞表現hPD-1及MHC-I。後者用作引發NK細胞介導之靶細胞溶解的陽性對照抗體之參考抗原。
將CD3+ T細胞以PBS中之CFSE標記,隨後以PBS洗滌兩次且接種於平底細胞培養盤中。向細胞中添加hPD1.29H5L4之抗體稀釋液及對照抗體(hIgG1、hIgG4、aMHC-I),繼而添加來源於以4:1效應物:標靶比添加之3種不同人類供體之NK細胞。在37℃下培育隔夜之後,添加DAPI(Biolegend)作為標記來區別流式細胞儀中之活細胞及死細胞。藉由分析活的靶細胞(經CFSE標記之CD3+ T細胞)之%來評估ADCC。
如圖4中所示,hPD1.29H5L4在此分析中不引發ADCC。αMHC-I抗體在此分析中用作NK介導之細胞溶解的陽性對照。值在三種不同NK細胞群體與三種不同CD3+ T細胞群體之組合中進行平均。類似地,圖5展示hPD1.29H5L4受限或無CDC。αMHC-I抗體在此分析中用作補體介導之細胞溶解的陽性對照。值在三種不同CD3+ T細胞群體中進行平均。
實例9:與其他PD-1抗體對比
為進一步表徵hPD1.29H5L4之結合特徵,在Octet RED96上使用生物光干涉法描繪結合動力學及平衡結合常數之輪廓且與此項技術中已知之若干種抗體進行比較。此分析係使用標準胺化學,藉由使hPD-1/Fc融合蛋白(R&D系統)與胺反應性二代生物感應器(Fortebio)耦接來進行。隨後在各種 抗體濃度下觀測抗-hPD-1mAb與生物感應器結合及解離。胺反應性生物感應器藉由浸漬在含有0.1M MES pH=5.5之孔中10分鐘進行預濕潤。隨後使用0.1M NHS/0.4M EDC混合物將生物感應器活化5分鐘。藉由將生物感應器浸漬在12ug/mL hPD-1/Fc在0.1M MES中之溶液中7.5分鐘使hPD-1/Fc融合蛋白偶合。使用1M乙醇胺溶液淬滅生物感應器表面5分鐘。使生物感應器在Octet動力學緩衝劑(ForteBio)中平衡5分鐘。藉由將生物感應器置於含有各種抗體濃度(10-80nM純化抗體)之孔中且監控干涉法15分鐘來觀測抗-PD-1mAb之締合。在將生物感應器轉移至動力學緩衝劑中且監控干涉信號45分鐘後量測解離。分析在30℃之培養盤溫度下運行。使用包含測試之所有濃度的1:1結合整體擬合模型來擬合所觀測之締合與解離速率(kobs及kd),且計算平衡結合常數KD。在該等實驗中,證實hPD1.29H5L4與據報導具有臨床功用之其他抗體實質上等同。
競爭分析(Octet)
為表徵hPD1.29H5L4之結合位點與h409A11相比之差異,在Octet RED96上使用生物光干涉法描繪5C4及H4H7798N競爭及肽結合圖之概況。胺反應性生物感應器藉由浸漬在含有0.1M MES pH=5.5之孔中10分鐘進行預濕潤。隨後使用0.1M NHS/0.4M EDC混合物將生物感應器活化5分鐘。藉 由將生物感應器浸漬在80nM mAb(hPD1.29H5L4、h409A11、5C4或H4H7798N)在0.1M MES中之溶液中7.5分鐘使抗-PD-1mAb偶合。使用1M乙醇胺溶液淬滅生物感應器表面5分鐘。使生物感應器在Octet動力學緩衝劑(ForteBio)中平衡5分鐘。藉由將生物感應器置於含有固定hPD-1/Fc濃度(12μg/ml)之孔中且監控干涉法15分鐘來觀測hPD-1/Fc之締合。接著使與生物感應器偶合相同之抗-PD-1mAb再結合5分鐘,以確保所有可用之hPD-1/Fc結合位點結合。藉由將生物感應器置於含有固定濃度值不同抗-PD-1mAb之孔中或僅含有動力學緩衝劑之參考孔中10分鐘來確定競爭或非競爭。在此直接競爭分析中,如下表所示,hPD1.29H5L4與hPD-1之結合不阻斷5C4、h409A11及H4H7798N與hPD-1之結合(其中結合>0nm反映結合):
肽定位(Octet)
為確定hPD1.29H5L4之抗原決定基,將hPD-1之完整細胞外結構域合成為20個胺基酸之肽片段,N-末端具有生物素標籤(Sigma Aldrich)。將肽在動力學緩衝劑中溶解至1μM之濃度。抗生蛋白鏈菌素生物感應器藉由浸漬在含有動力學緩衝劑之孔中10分鐘進行預濕潤。藉由將生物感應器浸漬在動力學緩衝劑中之1μM溶液中5分鐘使肽偶合。使生物感應器在動力學緩衝劑中平衡5分鐘。藉由將生物感應器置於含有固定抗體濃度(1μM純化抗體)之孔中且監控干涉法15分鐘來觀測抗-PD-1mAb之締合。5C4與 h409A11兩者均結合至所用之肽子集,而hPD1.29H5L4及H4H7798N未結合。
實例10:展示產生水平增強之抗-hPD-1抗體
為研究抗-hPD-1抗體之凝集潛能,使用Discovery Studio 4.5中之『抗體建模級聯』(預設參數)構築hPD1.29.H5L4 Fv之同源模型。基於界面模板PDB ID 1T3F、輕鏈模板PDB ID 1UJ3及重鏈模板PDB ID 1I9R之座標建立同源模型。改進之同源模型隨後使用Discovery Studio 4.5中之『空間凝集傾向』分子模擬而用於識別潛在之凝集傾向區域。此使得可識別潛在暴露之空間相鄰凝集傾向胺基酸且在彼等胺基酸上進行靶向突變。 hPD1.29.H5L4之重鏈可變區上之單一突變包括A9P、K12V、I28D、I28T、T30D、T31D、T31S、Y32D。hPD1.29.H5L4之重鏈可變區上之突變組合包括I28T_T31S、I28D_T30D、I28D_T31D、I28D_Y32D、A9P_K12V、A9P_I28T_T31S、K12V_I28T_T31S及A9P_K12V_I28T_T31S。
根據製造商說明(Agilent Technologies),設計含有所需突變之引子且使用Quik Site-Change II定點突變套組在編碼VH構築體之pcDNA3.1(+)質體中引入變化。藉由DNA測序(Macrogen Europe)證明引入突變。將編碼VH與VL構築體之純化質體以1:1比率混合(總計30μg)且根據製造商說明使用293fectin轉染試劑(Invitrogen)轉染至FreeStyle 293-F-1.1.15人類胚胎腎細胞(HEK293T/17,ATCC-CRL-11268)中。7天後收集細胞上清液且測試抗體表現。在Octet RED96系統(ForteBio)中使用蛋白A生物感應器定量產生水平(表11),其中突變抗體展示與hPD1.29H5L4相比顯著增加之產生水平。根據製造商說明(GE Healthcare),使用MabSelect Sure蛋白A樹脂純化抗體。使用Zeba脫鹽管柱(Thermo Scientific)將緩衝劑交換為10mM組胺酸、100mM NaCl pH 5.5緩衝劑。基於OD280(Nanodrop ND-1000)確定純化抗體之濃度。根據製造商說明(Lonza),藉由LAL測試確定內毒素含量。所有純化抗體含有低於10EU/mg。
為進一步表徵該等突變hPD-1抗體,使用以編碼hPDCD1之全長開放閱讀框(hPD-1)之cDNA穩定轉染、次選殖至pCI-neo載體(Promega)中之CHO-K1細胞(美國典型培養物保藏中心,Manassas,VA)以CELISA形式測試其與hPD-1之結合。將親本CHO-K1或CHO-K1.hPDCD1細胞接種於組織培養盤中之培養基(具有10%胎牛血清(Hyclone)及Pen/Strep(Gibco)之DMEM-F12(Gibco))中且在37℃下培育48小時。隨後移除培養基且將細胞在37℃下以突變hPD-1抗體(10μg/ml(=66nM)及其稀釋液)培育1小時。接著,以磷酸鹽緩衝之生理食鹽水/0.05% Tween(PBST)洗滌細胞且在37℃下以山羊-抗-人類IgG-HRP(Southern Biotech)培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌3次且以100μl TMB穩定化Chromagen(Invitrogen)觀測抗-hPD1免疫反應性。以100μl 0.5M H2SO4終止反應且在450及610nm下讀取吸光度。EC50計算值展示於表12中。測試之所有hPD-1抗體均展示與hPD1.29H5L4相比類似之結合特性。以CELISA形式測試由突變hPD-1抗體阻斷hPD-L1結合。將親本CHO-K1或CHO-K1.hPDCD1細胞接種於組織培養盤中且在37℃下在培養基中培育72小時。隨後移除培養基且將細胞在37℃下以突變hPD-1抗體(10μg/ml(=66nM)及其稀釋液)培育1小時。接著,以PBST洗滌細胞且在37℃下以生物素標記之重組hPD-L1 Fc蛋白培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌三次,繼而在細胞上添加抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物,將其在37℃下培育1小時。隨後將細胞以PBST洗滌六次且由100μl TMB穩定化Chromagen(Invitrogen)觀測hPD-L1 Fc之結合。以100μl 0.5M H2SO4終止反應且在450 及610nm下讀取吸光度。表12中關於hPD-L1阻斷之IC50計算值表示觀測到一半抑制作用時之濃度。IC50計算值可與hPD1.29H5L4所見相比。
本文引用之所有參考文獻均以引用方式併入,該引用程度如同每個個別公開案、資料庫登錄名(例如Genbank序列或GeneID登錄名)、專利申請案或專利特定地且個別地指定以引用方式併入一般。根據37 C.F.R.§1.57(b)(1),申請人欲以此關於以引用方式併入之描述係指各個及每個個別公開案、資料庫登錄名(例如Genbank序列或GeneID登錄名)、專利申請案或專利,其各自明確地根據37 C.F.R.§1.57(b)(2)來識別,儘管該引用並非緊接以引用方式併入之專有描述。若存在,在說明書中包括以引用方式併入之專有描述並不以任何方式弱化此以引用方式併入之廣泛描述。本文中引用參考文獻並非欲承認該參考文獻係相關先前技術,亦並非構成對該等公開 案或文獻之內容或日期之任何認可。
本發明之範疇並不受限於本文所述之特定實施例。實際上,熟習此項技術者由上文描述及附圖將顯而易見除本文所述彼等以外之對本發明的各種修改。該等修改欲在隨附申請專利範圍之範疇內。
認為上文書寫之說明書足以使熟習此項技術者實踐本發明。熟習此項技術者由上文描述將顯而易見除本文展示及描述之彼等以外之對本發明的各種修改,且在隨附申請專利範圍之範疇內。
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
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<223> 允許與h409A11結合之肽
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<223> hPD1.29H5 I28D重鏈可變區
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<212> PRT
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<223> hPD1.29H5 A9P K12V I28T T31S重鏈可變區
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Claims (34)

  1. 一種結合至人類程式性死亡-1(PD-1)受體之人源化抗體或其抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包含以下中之一或多者,且視情況包含其每一者:重鏈可變區CDR1,其包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:1之胺基酸序列,重鏈可變區CDR2,其包含SEQ ID NO:2之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:2之胺基酸序列,重鏈可變區CDR3,其包含SEQ ID NO:3之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:3之胺基酸序列,輕鏈可變區CDR1,其包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:4之胺基酸序列,輕鏈可變區CDR2,其包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:5之胺基酸序列,及輕鏈可變區CDR3,其包含SEQ ID NO:6之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:6之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包含包含SEQ ID NO:1之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:1之胺基酸序列;SEQ ID NO:2之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:2之胺基酸序列;及SEQ ID NO:3之胺基酸序列 或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:3之胺基酸序列的每一重鏈序列;及/或包含SEQ ID NO:4之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:4之胺基酸序列;SEQ ID NO:5之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:5之胺基酸序列;及SEQ ID NO:6之胺基酸序列或經1次、2次或3次保守取代而區別於SEQ ID NO:6之胺基酸序列的每一輕鏈序列。
  3. 如申請專利範圍第2項之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包含以下中之一或兩者:包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列或與其至少95%一致之胺基酸序列的重鏈序列,或包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列或與其至少95%一致之胺基酸序列的重鏈序列;及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列或與其至少95%一致之胺基酸序列的輕鏈序列,或包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列或與其至少95%一致之胺基酸序列的輕鏈序列。
  4. 如申請專利範圍第3項之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之重鏈序列及包含SEQ ID NO:8之胺基酸序列之輕鏈序列,其中SEQ ID NO:7中之Gln5及Gln81之一或兩者 視情況經Glu取代。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包括包含SEQ ID NO:7之胺基酸序列之重鏈序列,其在殘基A9、K12、I28、T30、T31及Y32處經一或多次取代突變修飾。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗體或抗原結合片段,其中該等取代突變包含A9P、K12V、I28D、I28T、T30D、T31D、T31S及Y32D中之一或多者。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或抗原結合片段包含選自由SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47及SEQ ID NO:48組成之群之重鏈序列。
  8. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之抗體或抗原結合片段,其中該抗體為完整IgG。
  9. 如申請專利範圍第8項之抗體或抗原結合片段,其中該Fab之計算pI為約8.2且在pH 7.4下之電荷為約6.5。
  10. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之抗體或抗原結合片段,其中該抗體或其片段具有以下特徵中之一或多種,且較佳具有以下每種特徵:以<10nM之EC 50結合至表現人類PD-1之細胞;以<10nM之K d結合至人類PD-1蛋白;以<10nM之K d與食蟹猴( Macaca fascicularis)PD-1蛋白交叉反應;以<10nM之IC 50抑制人類PD-1與PD-L1之間之結合;促進活體外抗原特異性T細胞反應; 在T-細胞中介導有限的或非抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC);在T細胞中介導有限的或非補體依賴性細胞毒性(CDC);不抑制5C4結合至表現人類PD-1之細胞;不抑制h409A11結合至表現人類PD-1之細胞;及不抑制H4H7798N結合至表現人類PD-1之細胞。
  11. 一種經分離核酸,其編碼如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段。
  12. 一種表現載體,其包含如申請專利範圍第11項之經分離核酸。
  13. 一種宿主細胞,其包含如申請專利範圍第11項之經分離核酸。
  14. 如申請專利範圍第13項之宿主細胞,其為哺乳動物細胞。
  15. 如申請專利範圍第13項之宿主細胞,其為人類細胞。
  16. 如申請專利範圍第13項之宿主細胞,其為細菌細胞。
  17. 一種組合物,其包含如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段、或如申請專利範圍第12項之表現載體、或如申請專利範圍第13項至第16項中任一項之宿主細胞及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
  18. 如申請專利範圍第17項之組合物,其進一步包含一或多種選自由以下組成之群之藥劑:以下各物之促效劑:TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白、細胞激素受體、整合素、信號轉導淋巴細胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、Toll配位體受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、 NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(觸覺(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAM7、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體;以下各物之抑制劑:PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM(例如,CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、VISTA、BTLA、APRIL、TIGIT、LAIR1、IDO、TDO、CD160、2B4及/或TGFRβ;環狀二核苷酸或其他STING促效劑;表現所關注抗原之基於細胞之疫苗;多肽疫苗,其中該多肽為所關注之抗原;RNA疫苗;其中該RNA疫苗編碼所關注之多肽抗原;DNA疫苗;其中該DNA疫苗編碼所關注之多肽抗原;及表現所關注抗原之病毒疫苗。
  19. 一種產生抗體或抗原結合片段之方法,其包括:在有利於表現聚核苷酸之條件下培養如申請專利範圍第13項之宿主細胞;及視情況自該宿主細胞及/或培養基回收該抗體或抗原結合片段。
  20. 一種如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段、或如申請專利範圍第12項之表現載體、或如申請專利範圍第13項至第16項中任一項之宿主細胞之用途,其用於製備治療人類受檢者之癌症之藥劑,其中該藥劑視情況與另一治療劑或治療程序併用。
  21. 一種如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段之用途,其用於製備治療人類受檢者之感染或傳染病之藥劑,其中該藥劑視情況與另一治療劑或治療程序併用。
  22. 一種疫苗,其包含:如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段、或如申請專利範圍第12項之表現載體、或如申請專利範圍第13項至第16項中任一項之宿主細胞;及抗原或用於表現該抗原之表現系統。
  23. 如申請專利範圍第22項之疫苗,其中該用於表現該抗原之表現系統為表現該抗原之基於細胞之疫苗。
  24. 如申請專利範圍第23項之疫苗,其中該基於細胞之疫苗為細菌。
  25. 如申請專利範圍第23項之疫苗,其中該細菌係選自由副痢疾桿菌( Shigella flexneri)、大腸桿菌( Escherichia coli)、單核球增多性李斯特氏菌( Listeria monocytogenes)、小腸大腸炎耶氏桿菌( Yersinia enterocolitica)、鼠傷寒沙氏桿菌( Salmonella typhimurium)、傷寒沙氏桿菌( Salmonella typhi)或分枝桿菌屬( mycobacterium)物種組成之群。
  26. 如申請專利範圍第22項至第25項中任一項之疫苗,其中該抗體或抗原結合片段及該抗原或用於表現該抗原之表現系統經構造為單一組合物。
  27. 如申請專利範圍第22項至第25項中任一項之疫苗,其中該抗體或抗原結合片段及該抗原或用於表現該抗原之表現系統經構造為用於單獨投藥之單獨組合物。
  28. 一種如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之疫苗之用途,其用於製備治療人類受檢者之癌症之藥劑。
  29. 一種如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之疫苗之用途,其用於製備治療人類受檢者之感染或傳染病之藥劑,其中該藥劑視情況與另一治療劑或治療程序併用。
  30. 一種偵測樣品中是否存在PD-1蛋白或其片段之方法,其包括使該樣品與如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或片段接觸,且偵測是否存在該抗體或片段與該肽之間之複合物;其中偵測到該複合物表示存在該PD-1蛋白或其片段。
  31. 一種如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段、或如申請專利範圍第17項或第18項之組合物、或如申請專利範圍第12項之表現載體、或如申請專利範圍第13項至第16項中任一項之宿主細胞、或如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之疫苗之用途,其用於製備增加免疫細胞活性之藥劑。
  32. 如申請專利範圍第31項之用途,其中該藥劑係用於:治療癌症;治療感染或傳染病;或作為疫苗佐劑。
  33. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之抗體或抗原結合片段、或 如申請專利範圍第17項或第18項之組合物、或如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之疫苗,其係用於:增加免疫細胞活化作用;治療癌症;或治療感染或傳染病。
  34. 一種如申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗體或抗原結合片段、或如申請專利範圍第17項或第18項之組合物、或如申請專利範圍第22項至第27項中任一項之疫苗之用途,其係用於製造用以增加免疫細胞活化作用、用於治療癌症或用於治療感染或傳染病的藥物。
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