TW201734049A - 抗－ｒｏｒ１抗體、ｒｏｒ１ ｘ ｃｄ３雙特異性抗體及使用其之方法 - Google Patents
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Abstract
在本文中所提供者是免疫特異性結合至ROR1的單離抗體、包含免疫特異性結合至ROR1之抗原結合位及免疫特異性結合至CD3之抗原結合位的雙特異性抗體、及使用彼等之方法。
Description
在本文中所提供者是免疫特異性結合至ROR1的單離抗體、包含免疫特異性結合至ROR1之抗原結合位及免疫特異性結合至CD3之抗原結合位的雙特異性抗體、及使用彼等之方法。
受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)是106-kDa的受體酪胺酸激酶家族成員。就結構而言，ROR1受體的胞外域(extracellular domain)由三個相異域(domain)組成：膜遠端之免疫球蛋白樣域；膜近端之克林格(Kringle)域；及中介之捲曲(Frizzled)域。在缺乏ROR1之小鼠上的研究顯示此受體在胚胎形成期間在肺發育發揮作用，但其在成人的表現受到嚴重限制，其表現受限於在肺及胰臟、以及脂肪細胞及B細胞譜系的低量表現。雖然在正常成人組織中的ROR1表現受到嚴密調控，但已注意到在血液及實性腫瘤中都呈高量。在早期發育期間，ROR1是正常表現的，但受到腫瘤特異性機制而變得活化且可促成在成人的疾病進程。
咸信ROR1的配體係wnt5a及NKX1-2。在ROR1的胞外部分已顯示Wnt5a結合到捲曲域且在轉染細胞中已顯示調變正常及肺腫瘤細胞株的NF-κB活化及增生。NKX1-2與ROR1之結合已顯示同時透過激酶依賴性及非激酶依賴性機制在肺癌細胞株的存活發揮作用。ROR1已顯示透過克林格域與EGFR相互作用，及此相互作用調變在肺癌細胞株中控
制細胞凋亡的傳訊路徑。雖然ROR1表現與卵巢癌的不良預後確實相關，但對肺癌已顯示在ROR1表現與臨床階段或存活降低之間沒有聯結。此外，雖然肺腫瘤細胞株的ROR1 siRNA減量法在體外引起生存力降低，但沒有靶向原發性肺癌細胞上的ROR1導致細胞死亡增加的證據。
在本文中所揭示者是免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段，該等抗體或某抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；b.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ D NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；d.包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈
CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；e.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；f.包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的輕鏈CDR3；h.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的輕鏈CDR3；i.包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈
CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR3；j.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；l.包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；m.包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；n.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈
CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；o.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR3；p.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或q.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列的輕鏈CDR3；其中該等CDR是根據Kabat所定義。
進一步所提供者是免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段，該等抗體或其抗原結合片段包含：a.包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；
b.包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；c.包含與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；d.包含與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；e.包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；f.包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；g.包含與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；h.包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；i.包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；
j.包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；k.包含與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；l.包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；m.包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；n.包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；o.包含與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；p.包含與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；或q.包含與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
所揭表示者係結合至在包含T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378、及D387之ROR1上的表位的單離抗體、或其抗原結合片段。
進一步所提供者是編碼該等所揭示的單離抗體或其抗原結合片段的核酸分子、包含該等核酸分子的載體、及表現該等單離抗體、或其抗原結合片段之細胞。
所揭示者是與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至RORI的單離抗體、或其抗原結合片段，該參考抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；b.包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；c.包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；d.包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；e.包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；f.包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的輕鏈；g.包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的輕鏈；
h.包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的輕鏈；i.包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的輕鏈；j.包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的輕鏈；k.包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的輕鏈；l.包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；m.包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；n.包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；o.包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的輕鏈；p.包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的輕鏈；或q.包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的輕鏈。
在本文中所提供者是與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1的單離抗體、或其抗原結合片段，其中該參考抗體或抗原結合片段結合至在包含T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378、及D387之ROR1上的表位。
所揭示者是單離的ROR1×CD3雙特異性抗體及其雙特異性抗原結合片段。在一些實施例中，該等單離的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段包含：a)免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位包含重鏈CDR1、CDR2、及CDR3及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3；及b)免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位包含重鏈CDR1、CDR2、及CDR3及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。合適的免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位包括包含下列者：a.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；b.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；d.包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：20之胺基
酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；e.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；f.包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的輕鏈CDR3；h.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的輕鏈CDR3；i.包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：48之胺基
酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR3；j.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；l.包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；m.包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；n.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：72之胺基
酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；o.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR3；p.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或q.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列的輕鏈CDR3；其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在該等ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段中，該免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列的輕
鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該等單離的ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：第一重鏈(HC1)；第二重鏈(HC2)；第一輕鏈(LC1)；及第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1形成免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位，且該HC2及該LC2形成免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位。在一些態樣中，該等ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段包含HC1及LC1，其中：a.該HC1具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；b.該HC1具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.該HC1具有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸
序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；d.該HC1具有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；e.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；f.該HC1具有包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.該HC1具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基
酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的輕鏈CDR3；h.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的輕鏈CDR3；i.該HC1具有包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR3；j.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基
酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；l.該HC1具有包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LCI具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；m.該HC1具有包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；n.該HC1具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；o.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基
酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR3；p.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或q.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列的輕鏈CDR3；其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些態樣中，該等ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段包含HC1及LC1，其中a.該HC1包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；b.該HC1包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；
c.該HC1包含與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；d.該HC1包含與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；e.該HC1包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；f.該HC1包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；g.該HC1包含與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；h.該HC1包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；i.該HC1包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；j.該HC1包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；
k.該HC1包含與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；l.該HC1包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；m.該HC1包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；n.該HC1包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；o.該HC1包含與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；p.該HC1包含與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；或q.該HC1包含與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列的輕
鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。在一些實施例中，該HC2包含與SEQ ID NO：90至少90%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91至少90%相同的胺基酸序列。
亦揭示者是編碼該等所揭示的ROR1×CD3雙特異性抗體及其雙特異性抗原結合片段的核酸分子、包含該等核酸分子的載體、及表現該等ROR1×CD3雙特異性抗體及其雙特異性抗原結合片段的細胞。
所提供者是治療具有癌症之對象的方法，該等方法包含投予該對象治療有效量的任何所揭示的該等ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段。
進一步所揭示者是有效量的任何所揭示的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段在治療癌症之用途，及任何該等所揭示的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段在製造用於治療癌症之組成物的用途。
當結合附圖閱讀時可進一步理解發明內容以及下文之實施方式。為說明所揭示的單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法的目的，在圖式中顯示該等單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法的例示性實施例；然而，該等單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法不限於所揭示之具體實施例。在圖式中：圖1說明細胞表面ROR1在下列各種肺腫瘤細胞株中的表現：小細胞肺癌(NCI-H1417)；NSCLC腺癌(HCC-827)；NSCLC鱗狀細胞癌(SK-MES-1)；及支氣管肺泡癌(bronchioalveolar carcinoma)(NCI-H358)。使用0.5μl 2A2抗ROR1殖株(Biolegend cat# 357806)進行流動式細胞測量術表現分析。使用在相同的濃度下mIgG1同型對照抗體(Biolegend
cat# 400120)之結合以計算超過背景的變化倍數而將MFI值正規化。對每個樣本進行單次重複。
圖2A、圖2B、及圖2C說明被進一步表現及純化為IgG4 PAA分子之24種抗ROR1抗體的分級(binning)。(A)Ig域結合劑。(B)捲曲域結合劑。(C)克林格域結合劑。
圖3說明克林格域結合劑對人類ROR1交叉競爭的數據。在此實驗中，1μM的競爭mAb置換來自標記的RR1B69分子之信號。
圖4A、圖4B、及圖4C說明藉由對HCC827細胞的流動式細胞測量術評估的抗ROR1抗體之結合親和力。(A)Ig域結合劑。(B)捲曲域結合劑。(C)克林格域結合劑。
圖5A、圖5B、及圖5C說明指定的ROR1×CD3雙特異性抗體的體外標靶細胞殺滅數據。數據表示克林格域結合劑在標靶細胞殺滅中是最有效的。(A)Ig域結合劑。(B)捲曲域結合劑。(C)克林格域結合劑。
圖6A、圖6B、及圖6C說明以指定的ROR1×CD3雙特異性抗體進行的DiscoveRx® T細胞媒介的細胞毒性檢定。在此實驗中，使用改性的SK-MES-1細胞。數據表示克林格域結合劑在標靶細胞殺滅中是最有效的。(A)Ig域結合劑。(B)捲曲域結合劑。(C)克林格域結合劑。
圖7A及圖7B說明ROR1×CD3雙特異性抗體、RCDB5、及其親系抗ROR1抗體、RR1B67的結合曲線圖，如藉由Biacore(分別是左上圖及左下圖)使用重組ROR1所得到的及經由MSD-CAT(分別是右上圖及右下圖)使用工程化以過度表現ROR1之HEK293細胞所得到的。此處顯示之數據為3或更多個實驗之一的實例。
圖8說明在無胸腺裸鼠的混雜體內研究。數據表示在實性腫瘤模型的劑量依賴性效果。
圖9A及圖9B說明結合FcγRIIa之抗ROR1親系RR1B67及ROR1×CD3雙特異性抗體RCDB5。(A)n=1；(B)n=2。
圖10A及圖10B說明結合FcγRIIIa之抗ROR1親系RR1B67及ROR1×CD3雙特異性抗體RCDB5。(A)n=1；(B)n=2。
圖11A、圖11B、圖11C、及圖11D基於RR1B67 Fab/ROR1克林格的晶體結構說明RR1B67表位的位置及與人類ROR1的相互作用(A)結合到人類ROR1的膜近端克林格域的RR1B677 Fab的整體結構。顯示ROR1的胞外域(ECD)的示意圖以供參考。(B)在ROR1克林格域上的RR1B67表位的位置的概觀。亦顯示在人類ROR1克林格域上的三個二硫鍵及單個醣化位。(C)相互作用地圖顯示在ROR1與RR1B67之間的直接接觸。凡得瓦(Van der Waals)相互作用係顯示為虛線，及氫鍵為實線且有指向骨架原子的箭頭。(D)在ROR1與RR1B67輕鏈及重鏈之間之界面的近視圖。氫鍵係顯示為虛線
圖12說明RR1B67的表位及互補位(paratope)殘基。CDR區(Kabat定義)及Ig樣、捲曲及克林格域有加底線。表位及互補位殘基有加陰影。只有顯示人類ROR1的胞外域及RR1B67 Fab的序列。
圖13A、13B、及13C說明由ROR1×CD3雙特異性抗體RCDB5及先前技術抗體所活化的肺腫瘤細胞之重導T細胞殺滅，該先前技術抗體係發表於WO2014167022A1，實例3C，對ROR1為二價且對CD3為單價之雙特異性(Fab)2x(Fab)抗體，具有Fc，簡便起見稱為「Engmab」抗體。(A)在以RCDB5或Engmab抗體任一者治療後，出於鋪板(plated)之細胞總數的活肺腫瘤細胞百分比。(B)在所使用的最高抗體濃度(6.67nM)下每孔存活的腫瘤細胞的總數。(C)在不同抗體濃度下，T(效應子)細胞的活化，如藉由CD25+ T細胞的百分比所指明的。
圖14A及14B說明在血基質癌細胞株中的ROR1表現。(A)ROR1表現以流動式細胞測量術在MCL/CLL(黑條)、B淋巴瘤(灰條)及MM(斜線條)中的平均螢光強度(MFI)呈現。對應的螢光扣除對照(Fluorescence Minus One,FMO)染色(白條)作為陰性對照組。(B)在MAVER-1細胞株(空心直方圖)及FMO(實心直方圖)中的代表性ROR1表現。
圖15說明以流動式細胞測量術在MCL細胞株中ROR1受體密度(每細胞的ROR1分子的數目)。
圖16A、16B、16C、16D、及16E說明以流動式細胞測量術在原發性冷凍保存的CLL及MCL樣本中的ROR1表現。(A)在淋巴閘門(lymphoid gate)的腫瘤細胞%。腫瘤細胞係定義為CD19+CD5+活細胞%。(B)CD19+CD5+腫瘤細胞中的ROR1+細胞%。(C)在ROR1+族群上所測量的ROR1 MFI。(D)在CLL上的代表性ROR1表現，供體ID 110029386。(E)在MCL上的代表性ROR1表現，供體ID 120137190腫瘤細胞。空心直方圖-ROR1、實心直方圖-FMO對照組。
圖17A至圖17F說明在體外全血細胞毒性檢定中ROR1×CD3媒介的MCL株之殺滅。(A)、(B)、及(C)分別顯示在MAVER-1、JeKo-1、及Z-138細胞的細胞毒性%(100%-活CFSE+細胞%)。(D)、(E)、及(F)分別顯示在MAVER-1、JeKo-1、及Z-138細胞的T細胞活化(在CD4+及CD8+淋巴球上的CD25表現%)。D1-供體10347；D2-供體10207。
圖18A至圖18D說明使用PBMC作為效應子細胞在體外細胞毒性檢定中ROR1×CD3媒介的MCL株之殺滅。(A)在MAVER-1細胞的細胞毒性%(100%-活CFSE+細胞%)。(B)在Z-138細胞的細胞毒性%(100%-活CFSE+細胞%)。(C)在MAVER-1細胞的T細胞活化(在CD4+及
CD8+淋巴球的CD25表現%)。(D)在Z-138細胞的T細胞活化(在CD4+及CD8+淋巴球的CD25表現%)。D1-供體M7444；D2-供體M7267。
所揭示的單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法可結合附圖(其形成本揭露的一部分)藉由參考下面的詳細說明而更容易地理解。應理解所揭示的單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法不限於該等描述於本文及/或顯示於本文者，且本文中使用之用語目的是僅僅以示例的方式描述具體實施例並且不意欲限制所請之單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法。
除非特別另外提及，否則任何有關可能機制或改善之作用模式或理由之描述係僅係用以說明，且所揭示的單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法不受限於任何此建議機制或改善之作用模式或理由之正確性或不正確性。
在整個本文中，本敘述提及抗體及使用該抗體之方法。當本揭露描述或請求與抗體有關之特徵或實施例時，這樣的特徵或實施例同樣適用於使用該抗體之方法。同樣地，當本揭露描述或請求與使用抗體之方法有關的特徵或實施例時，這樣的特徵或實施例同樣適用於該抗體。
當表示為一個值範圍時，另一個實施例包括從一個具體值及/或到另一個具體值。此外，提及以範圍說明的值時包括該範圍內的每個值。所有範圍均被包括在內且為可組合的。當數值係以近似值表示時，藉由使用先行詞「約(about)」，將可明瞭特定數值形成另一實施例。提及一具體數值時包括至少該具體值，除非上下文另有明確說明。
應當理解的是，為了明確起見，在本文中於不同實施例的內文中描述的所揭示的單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法的某些特徵
亦可於單一實施例中組合提供。相反地，為了簡潔起見，於單一實施例的內文中所述之所揭示的單離抗體、單離雙特異性抗體、及方法的各種特徵亦可單獨或以任何次組合來提供。
當用於本文時，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數。
各種關於實施方式之態樣的用語係用於說明書與申請專利範圍的各個部分中。這些用語係以其在該項技術領域中之原始意義來使用，除非另有指明。其他經特別定義之用語的解讀係與本說明書中所提供之定義一致。
用語「約(about)」當用以指涉數值範圍時，截值(cutoffs)或特定數值係用以指示所載明之數值可與該列舉數值有多達10%之差異。因此，用語「約(about)」係用以涵蓋自特定值±10%或更少之變異、±5%或更少之變異、±1%或更少之變異、±0.5%或更少之變異、或±0.1%或更少之變異。
「抗體(antibody)」係指免疫球蛋白之所有同型(IgG、IgA、IgE、IgM、IgD、及IgY)，包括各種單體、聚合及嵌合形式，除非另有指定。用語「抗體(antibody)」所具體涵蓋者為多株抗體、單株抗體(mAb)、及類抗體多肽，諸如嵌合抗體及人化抗體。
「抗原結合片段(antigen-binding fragment)」或「雙特異性抗原結合片段(bispecific antigen-binding fragment)」為可對特定抗原展現結合親和力之任何蛋白質結構。抗原結合片段包括藉由任何習知技術所提供者，諸如酶切割、肽合成、及重組技術。一些抗原結合片段係由保有親系抗體分子之抗原結合特異性的完整抗體之部分組成。舉例而言，抗原結合片段可包含已知結合特定抗原之抗體的至少一個可變區(重鏈或輕鏈可變區)或一或多個CDR。合適抗原結合片段之實例包括但不限於雙價抗體
(diabody)及單鏈分子以及Fab、F(ab’)2、Fc、Fabc、及Fv分子、單鏈(Sc)抗體、個別抗體輕鏈、個別抗體重鏈、在抗體鏈或CDR與其他蛋白質之間的嵌合融合物、蛋白質支架、重鏈單體或二聚體、輕鏈單體或二聚體、由一個重鏈及一個輕鏈所組成之二聚體、由VL、VH、CL及CH1域所組成之單價片段、或如WO2007059782中所述之單價抗體、包含兩個由鉸鏈區之雙硫橋所聯接之Fab片段之二價片段、基本上由V.sub.H及C.sub.H1域所組成之Fd片段；基本上由抗體單臂之VL及VH域所組成的Fv片段、dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))(其基本上由VH域組成且亦稱為域抗體(domain antibody)(Holt et al；Trends Biotechnol.2003 Nov.；21(11)：484-90)；駱駝或奈米抗體(Revets et al；Expert Opin Biol Ther.2005 Jan.；5(1)：111-24)；單離互補決定區(CDR)、及類似者。所有抗體同型皆可用來生產抗原結合片段。此外，抗原結合片段可包括非抗體蛋白質架構諸如蛋白質支架，以成功地將多肽區段納入可賦予對所關注之指定抗原的親和力之位向。抗原結合片段可經重組生產，或藉由酶或化學切割完整抗體來生產。用語「抗體或其抗原結合片段(an antibody or antigen-binding fragment thereof)」可用來代表指定抗原結合片段納入該用語中所指涉之抗體的一或多個胺基酸區段。
當用於本文時，在二或更多抗體或抗原結合片段的上下文中，用語「與...競爭(competes with)」或「與...交叉競爭(cross-competes with)」是指二或更多抗體或抗原結合片段競爭結合至ROR1，例如在所揭示的實例中敘述之檢定中競爭ROR1結合。
用語「CD3」係指人類CD3蛋白質之多重次單元複合體(multi-subunit complex)。CD3蛋白質多重次單元複合體由6個不同之多肽鏈組成。這些多肽鏈包括CD3γ鏈(SwissProt P09693)、CD3δ鏈(SwissProt P04234)、兩個CD3ε鏈(SwissProt P07766)、及一個與T細胞受體α及β鏈
相關聯之CD3 ζ鏈同二聚體(homodimer)(SwissProt 20963)。用語「CD3」包括任何CD3變異體、異構體及物種同源物，其係由細胞(包括T細胞)所天然表現，或者可表現在經編碼這些多肽之基因或cDNA轉染的細胞上，除非另有註明。
「有效量(effective amount)」或「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指達到所欲治療成果所需之有效劑量量及時間量。ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段之治療有效量可依不同因素而異，諸如個體之疾病狀態、年齡、性別及體重、及抗體在個體中引發所欲回應之能力。治療有效量亦為抗體或抗體部分之治療有益效果超過其任何毒性或有害效果之量。
用語「表位(epitope)」意指能夠特異性結合至抗體之蛋白質決定位(determinant)。表位通常由分子(諸如胺基酸或糖側鏈)之表面分群所組成，且通常具有特定三維結構特性以及特定電荷特性。構形及非構形表位的差別在於與前者的結合在變性溶劑存在下即失去，但後者並不會。表位可包含直接涉及結合之胺基酸殘基及其他非直接涉及結合之胺基酸殘基，諸如被特異性抗原結合肽有效阻斷或覆蓋之胺基酸殘基(換言之，該胺基酸殘基位在該該特異性抗原結合肽之足跡內)。
當「免疫特異性(immunospecifically)」用於抗體、或抗體片段的上下文時，代表經由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段所編碼之域結合至所關注蛋白質之一或多個表位，並且在含有混合分子群體之樣本中不會優先結合其他分子。典型而言，抗體以小於約1×10-8M之Kd結合至同源(cognate)抗原，如由表面電漿共振測定或細胞結合測定所測得者。諸如「抗[抗原]抗體(anti-[antigen]antibody)」之用語(例如抗ROR1抗體)係意欲表達該引述之抗體特異性結合該引述之抗原。
「單離(isolated)」意指生物組分(諸如抗體)已經與該組分所天然出現於內之生物體中的其他生物組分(即其他染色體及染色體外DNA及RNA、和蛋白質)實質上分開、與該等其他生物組分分開生產、或經純化而遠離該等其他生物組分。已「單離(isolated)」之抗體因此包括藉由標準純化方法純化之抗體。「單離抗體(isolated antibodies)」可為組成物之一部分且仍為單離的，只要該組成物並非該抗體之原生環境的一部分。該用語亦包含藉由在宿主細胞中重組表現所製備之抗體以及化學合成之抗體。本文中所使用之「單離抗體或其抗原結合片段(isolated antibody or antigen-binding fragment thereof)」意指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體或抗原結合片段的抗體或其抗原結合片段(例如，特異性結合至ROR1之單離抗體係實質上不含特異性結合ROR1以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合至ROR1之表位、異構體或變異體的單離抗體可對於其他相關抗原例如來自其他物種之相關抗原(諸如ROR1物種同源物)具有交叉反應性。
本文中所用之用語「kd」(sec-1)係指特定抗體-抗原交互作用之解離速率常數。該值亦稱為koff值。
本文中所使用之用語「ka」(M-1 sec-1)係指特定抗體-抗原交互作用之締合速率常數。
本文中所用之用語「KD」(M)係指特定抗體-抗原交互作用之解離平衡常數。
本文中所用之用語「KA」(M-1)係指特定抗體-抗原交互作用之締合平衡常數並且係藉由將ka除以kd獲得。
「對象(subject)」係指人類及非人類動物，包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，諸如非人類靈長動物、小鼠、兔、綿羊、
狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、及爬蟲動物。在所述方法之許多實施例中，該對象為人類。
「ROR1」(受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1(Receptor Tyrosine Kinase-Like Orphan Receptor 1))係指具有Q01973(人類)及Q9Z139(小鼠)UniProt登錄號之106-kDa的受體酪胺酸激酶家族成員。
「治療(treating或treatment)」係指任何成功地或有成功跡象地減輕或改善傷害、病理變化或病況，包括任何客觀或主觀參數，諸如症狀之減少、緩解或消退或者使病況對於病患而言更可忍受、減慢退化或衰退速率、使退化終點較不耗弱、改善對象之身體或心理健康、或延長存活時間。治療可藉由客觀或主觀參數評定，包括身體檢查、神經檢查、或精神狀況評估的結果。
下列縮寫係用在本文中：受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)；小細胞肺癌(SCLC)、非小細胞肺癌(NSCLC)；循環腫瘤細胞(CTC)；胞外域(ECD)。
在本文中所揭示者是免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段。所揭示的單離抗體、或其抗原結合片段包括該等提供於表20中者。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些實施例中，該重鏈可包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：1胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B65或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：9胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或
b.包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段可為RR1B66或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：13胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段可為RR1B67或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，
e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：17胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B69或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，
b.包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：21胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B70或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列、由其
組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：25胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B71或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：
a.與SEQ ID NO：33胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B72或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及
f.包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：39胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B74或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，
c.包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：45胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B76或其抗原結合片段。
單離抗體及其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：53胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1R77或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步具有該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：61胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或
b.包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B78或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：63胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B82或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，
e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：66胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B83或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，
b.包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：70胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B84或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列、由其
組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：73胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B85或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及f.包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：
a.與SEQ ID NO：79胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B86或其抗原結合片段。
單離抗體或其抗原結合片段可包含包含與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列的輕鏈。在一些態樣中，該重鏈可包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成且該輕鏈可包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成。
單離抗體或其抗原結合片段可包含：a.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR1，b.包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR2，c.包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈CDR3，d.包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR1，e.包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR2，及
f.包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可進一步包含該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：a.與SEQ ID NO：84胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的重鏈胺基酸序列及與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的輕鏈胺基酸序列；或b.包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列、由其組成、或基本上由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之單離抗體、或其抗原結合片段為RR1B88或其抗原結合片段。
單離抗體、或其抗原結合片段結合至在ROR1的胞外域(ECD)內之表位。在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可結合至Ig樣域。在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可結合至捲曲域。在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可結合至克林格域。
單離抗體、或其抗原結合片段可結合至ROR1胞外域(ECD)擴充殘基324-387(TVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDEN FKSDLCD-SEQ ID NO：98)之區。在一些態樣中，單離抗體或其抗原結合片段的表位包含SEQ ID NO：98。在一些態樣中，單離抗體或其抗原結合片段的表位基本上由SEQ ID NO：98組成。在一些態樣中，單離抗體或其抗原結合片段的表位由SEQ ID NO：98組成。在一些態樣中，
單離抗體或其抗原結合片段的表位與SEQ ID NO：98之胺基酸序列90%、95%、或99%相同。
在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可結合至在包含T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378、及D387之ROR1上的表位。在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可結合至在基本上由T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378、及D387組成之ROR1上的表位。在一些實施例中，單離抗體或其抗原結合片段可結合至在由T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378、及D387組成之ROR1上的表位。
亦所提供的是與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1之單離抗體或其抗原結合片段。合適的參考抗體包括任何上文揭露之單離抗ROR1抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合
至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結
合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結
合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
在一些實施例中，該參考抗體或其抗原結合片段可包含包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。因此，單離抗體或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
本文亦提供的是與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1的單離抗體、或其抗原結合片段，其中該參考抗體或其抗原結合片段結合在ROR1胞外域(ECD)的殘基324-387(TVSVTKSGRQCQPWNSQYPHTHTFTALRFPELNGGHSYCRNPGNQKEAPWCFTLDEN FKSDLCD-SEQ ID NO：98)內之表位。在一些態樣中，單離抗體、或其抗原結合片段與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，其中該參考抗體或其抗原結合片段結合包含SEQ ID NO：98之表位。在一些態樣中，單離抗體、或其抗原結合片段與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，其中該參考抗體或其抗原結合片段結合基本上由SEQ ID NO：98組成之表位。在一些態樣中，單離抗體、或其抗原結合片段與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，其中該參考抗體或其抗原結合片段結合由SEQ ID NO：98組成之表位。在一些態樣中，單離抗體、或其抗原結合片段與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，其中該參考抗體或其抗原結合片段結合與SEQ ID NO：98之胺基酸序列90%、95%、或99%相同的表位。
單離抗體、或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，其中該參考抗體或抗原結合片段結合在包含T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378、及D387之ROR1上的表位。在一些實施例中，單離抗體、或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，其中該參考抗體或抗原結合片段結合在基本上由T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378、及D387組成之ROR1上的表位。在一些實施例中，單離抗體、或其抗原結合片段可與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，其中該參考抗體或抗原結合片段結合在由T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378、及D387組成之ROR1上的表位。在一些態樣中，該參考抗體或其抗原結合片段包含包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈。
所揭露的抗ROR1抗體或其抗原結合片段包括所有同型(IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及四鏈免疫球蛋白(Ig)結構之合成性多聚體。所揭露的抗體或抗原結合片段亦包括通常在母雞或火雞血清及母雞或火雞蛋黃中所發現之IgY同型。
所揭露的抗體或抗原結合片段亦可衍生自任何Ig子類。例如，所揭露的抗體、或其抗原結合片段可衍生自IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4同型。該等亞型在Fc區之胺基酸序列具有超過95%的同源性，但在鉸鏈區的胺基酸組成及結構顯示主要差異。Fc區媒介效應功能，諸如抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。在ADCC中，
抗體之Fc區結合至免疫效應細胞(諸如自然殺手細胞或巨噬細胞)表面上之Fc受體(FcgR)，導致吞噬或溶解標靶細胞。在CDC中，抗體藉由在細胞表面引發補體級聯反應(complement cascade)來殺滅標靶細胞。所揭露的抗體包括具有所述可變域特性與任何IgG同型組合的抗體，包括其中Fc序列已經修飾以致使不同效應子功能之經修飾版本。
在許多治療性抗體之應用中，Fc媒介之效應功能並非作用機制之一部分。這些Fc媒介之效應功能可能有害並且由於造成偏離機制毒性(off-mechanism toxicity)而可能造成安全風險。修改效應功能可藉由工程改造Fc區以降低其對FcgR或補體因子之結合來達成。IgG對於活化性(FcgRI、FcgRIIa、FcgRIIIa及FcgRIIIb)和抑制性(FcgRIIb)FcgR或補體之第一成分(C1q)的結合取決於位在鉸鏈區和CH2域中之殘基。可將突變引入IgG1、IgG2及IgG4中以降低或靜默Fc功能性。靜默突變可包括但不限於IgG1 AA(F234A、L235A)、IgG4 PAA(S228P、F234A、L235A)、IgG2 AA(V234A、G237A)、IgG1 FEA(L234F、L235E、D265A)、或IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)。在一些實施例中，所揭露的抗體或其抗原結合片段可含有IgG1 AA(F234A、L235A)突變。在一些實施例中，所揭露的抗體或其抗原結合片段可含有IgG4 PAA(S228P、F234A、L235A)突變。在一些實施例中，所揭露的抗體或其抗原結合片段可含有IgG2 AA(V234A、G237A)突變。在一些實施例中，所揭露的抗體或其抗原結合片段可含有IgG1 FEA(L234F、L235E、D265A)突變。在一些實施例中，所揭露的抗體或其抗原結合片段可含有IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)突變。在一些實施例中，所揭露的抗體或其抗原結合片段可含有IgG1 L234A、L235A、及/或F405L突變。在一些實施例中，所揭露的抗體或其抗原結合片段可含有S228P、L234A、L235A、F405L、及/或R409K突變。在一些
實施例中，所揭露的抗體或其抗原結合片段可含有IgG-AA Fc-L234A、L235A、及F405L。
所揭露的抗體或其抗原結合片段可包含具有一或多個下列特性之Fc區：(a)當相較於親系Fc時，降低的效應子功能；(b)降低的對FcgRI、Fcg RIIa、Fcg RIIb、Fcg RIIIb及/或Fcg RIIIa之親和力；(c)降低的對FcgRI之親和力；(d)降低的對FcgRIIa之親和力；(e)降低的對FcgRIIb之親和力；(f)降低的對Fcg RIIIb之親和力；或(g)降低的對FcgRIIIa之親和力。
抗ROR1抗體及其抗原結合片段可藉由重組手段而衍生自任何物種。舉例而言，該等抗體或抗原結合片段可為小鼠、大鼠、山羊、馬、豬、牛、雞、兔、駱駝、驢、人、或其等之嵌合版本。針對投予至人類之用途，非人類衍生性抗體或抗原結合片段可經基因或結構改造以在投予至人類病患時較不具抗原性。
在一些實施例中，該等抗體或抗原結合片段可為嵌合者。本文中所用之用語「嵌合(chimeric)」係指抗體、或其抗原結合片段具有衍生自非人類哺乳動物、囓齒動物、或爬蟲動物之抗體胺基酸序列的至少一個可變域之至少一些部分，並且該抗體、或其抗原結合片段之剩餘部分係衍生自人類。
在一些實施例中，該等抗體可為人化(humanized)抗體。人化抗體可為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗體之其他抗原結合子序列)。大體上，人化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體(recipient antibody))，其中來自該接受者抗體之互補決定區(CDR)的殘基係經來自具有所欲特異性、親和力、及能力之非人類物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔之CDR的殘基置換。一般而言，該人化抗體將包含實
質上所有至少一個及典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有CDR區對應非人類免疫球蛋白之CDR區，並且所有或實質上所有架構區係人類免疫球蛋白序列之架構區。人化抗體可包括免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型為人類免疫球蛋白之恆定區。
本文中所述之抗ROR1抗體或其抗原結合片段對於ROR1具有包括小於約5×10-7M、較佳小於約5×10-8M之解離常數(KD)的結合親和力。在一些實施例中，本文中所述之抗ROR1抗體或其抗原結合片段對於ROR1具有包括小於約5×10-7M、較佳小於約5×10-8M之解離常數(KD)的結合親和力。所述抗ROR1抗體或其抗原結合片段之親和力可藉由所屬技術領域中所習知之各式方法來決定，諸如表面電漿共振或基於ELISA之方法。用於藉由SPR測量親和力之檢定包括使用BIAcore T200機器所執行之檢定，其中檢定係在室溫(例如25℃或接近25℃)下執行，其中能夠結合至ROR1之抗體係藉由抗Fc抗體(例如山羊抗人類IgG Fc特異性抗體，Jackson ImmunoResearch laboratories Prod # 109-005-098)捕獲至BIAcore感測晶片上達300Ru左右之量，接著在50μl/min之流率下收集締合及解離數據。
除了所述之抗ROR1抗體及其抗原結合片段外，亦提供編碼所揭露的抗體及其抗原結合片段之多核苷酸序列。
亦提供包含該等多核苷酸之載體。該等載體可為表現載體(expression vector)。含有編碼所揭露的抗體或其抗原結合片段之重組表現載體因而被考慮為在本揭示之範疇內。該表現載體可含有一或多個額外序列，諸如但不限於調節序列(例如，啟動子、增強子)、選擇標記、及多腺核苷酸化信號。用於轉形廣泛各種宿主細胞之載體係廣為周知，並且包括但不限於質體、噬菌體質體(phagemid)、黏質體(cosmid)、桿狀病毒、桿
粒(bacmid)、人造細菌染色體(BAC)、人造酵母菌染色體(YAC)、以及其他細菌、酵母及病毒載體。
亦描述表現及能夠表現所揭露之載體的細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞(諸如293F細胞、CHO細胞)、昆蟲細胞(諸如Sf7細胞)、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞(諸如E.coli)。所揭露的抗體亦可藉由融合瘤細胞產生。
本文揭露的是結合至ROR1及CD3之單離雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段(ROR1×CD3雙特異性抗體)。ROR1×CD3雙特異性抗體至少具有免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位(ROR1臂)及免疫特異性結合之第二抗原結合位CD3(CD3臂)。
單離的ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a)免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位包含重鏈CDR1、CDR2、及CDR3及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3；及b)免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位包含重鏈CDR1、CDR2、及CDR3及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
合適的免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位包括任何上文揭露之抗ROR1抗體。在一些實施例中，該免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位具有：a.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列、
基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；b.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；c.包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；
d.包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；e.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；f.包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列、基
本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；g.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；h.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；i.包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈
CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；j.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；k.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；l.包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：65之胺基酸序
列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；m.包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；n.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；
o.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；p.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；或q.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列、基
本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自CD3B219。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於美國專利第8,236,308號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於美國專利申請公開第2010/0260668號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於美國專利申請公開第2013/0018174號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於EP2647707中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於美國專利申請公開第2012/0321626號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於國際公開第WO2012/162067號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於美國專利申請公開第2013/0060011號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於美國專利申請公開第2013/0058936號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於美國專利申請公開第2013/0078249號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於美國專利申請公開
第2013/0058937號中之CD3抗體。免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自揭露於國際公開第WO2013/065708號中之CD3抗體。
在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可包含在Fc區之突變，其包括但不限於IgG1 AA(F234A、L235A)、IgG4 PAA(S228P、F234A、L235A)、IgG2 AA(V234A、G237A)、IgG1 FEA(L234F、L235E、D265A)、或IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG1 AA(F234A、L235A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG4 PAA(S228P、F234A、L235A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG2 AA(V234A、G237A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG1 FEA(L234F、L235E、D265A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG1 L234A、L235A、及/或F405L突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有S228P、L234A、L235A、F405L、及/或R409K突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG-AA Fc-L234A、L235A、及F405L。
在一些實施例中，單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID
NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及
b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序
列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基
本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：
a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：35之胺基酸
序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、基本上由其組成、或
由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組
成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈
CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或
由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之
胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的
重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序
列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及
b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，該單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈
CDR2、及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
亦所提供的是單離ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段，其包含：a.第一重鏈(HC1)；b.第二重鏈(HC2)；c.第一輕鏈(LC1)；及d.第二輕鏈(LC2)，
其中該HC1及該LC1形成免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位，且該HC2及該LC2形成免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中：a.該HC1具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；b.該HC1具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、
包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；c.該HC1具有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；d.該HC1具有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由
其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；e.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；f.該HC1具有包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列、
基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；g.該HC1具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；h.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列、
基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；i.該HC1具有包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；j.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、
基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；k.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；l.該HC1具有包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、
基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；m.該HC1具有包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；n.該HC1具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、
基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；o.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；p.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列、
基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；或q.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC1具有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位係由下列形成：a.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；
b.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成c.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成d.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成
e.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成f.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成g.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成
h.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成i.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成j.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成
k.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成l.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成m.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成
n.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成o.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成p.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成
q.HC1及LC1，其中i.該HC1與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同且該LC1與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同；或ii.該HC1包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
在一些實施例中，免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位可包含：a.上述a至q任一者之重鏈CDR及輕鏈CDR及b.該等CDR外之重鏈及輕鏈，其包含：i.上述a.i.至q.i.任一者之該HC1及LC1或ii.上述a.ii.至q.ii.中任一者之該HC1及LC1。
例如，且不意圖為限制性的，該免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位可包含：HC1，其具有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，與LC1，其具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其
組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義；及該等CDR外，與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同之HC1及該等CDR外之，與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同之LC1。
免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可由HC2及LC2形成，其中該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3、及該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可由HC2及LC2形成，其中該HC2與SEQ ID NO：90至少90%、95%、或99%相同與及該LC2與SEQ ID NO：91至少90%、95%、或99%相同。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中該HC2包含SEQ ID NO：90
之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成及該LC2包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之按基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可包含：a.免疫特異性結合至ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位由HC1及LC1形成，其中i.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC1包含與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC1包含與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或
iii.該HC1包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC1包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成；及b.免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位、該第二抗原結合位由HC2及LC2形成，其中i.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成的輕鏈CDR3；ii.該HC2包含與SEQ ID NO：90之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列且該LC2包含與SEQ ID NO：91之胺基酸序列至少90%、95%、或99%相同的胺基酸序列；或iii.該HC2包含SEQ ID NO：90之胺基酸序列、基本上由其組成、或由其組成且該LC2包含SEQ ID NO：91之胺
基酸序列、基本上由其組成、或由其組成，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以小於約100nM、小於約75nM、小於約50nM、小於約30nM、小於約25nM、小於約20nM、小於約15nM、小於約10nM、或小於約7.5nM之KD結合至ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約5nM至約100nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約5nM至約75nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約5nM至約50nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約5nM至約30nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約5nM至約25nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約5nM至約20nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約5nM至約15nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異
性抗原結合片段可以約5nM至約10nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約10nM至約100nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約15nM至約100nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約20nM至約100nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約25nM至約100nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約30nM至約100nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約50nM至約100nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段可以約75nM至約100nM之KD結合ROR1，如藉由Biacore所測量的。
在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位可衍生自具有一或多個以下突變之IgG：IgG1 AA(F234A、L235A)；IgG4 PAA(S228P,F234A,L235A)；IgG2 AA(V234A,G237A)；IgG1 FEA(L234F,L235E,D265A)；或IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)。在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之
第一抗原結合位可含有IgG1 AA(F234A、L235A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位可含有IgG4 PAA(S228P、F234A、L235A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位可含有IgG2 AA(V234A、G237A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位可含有IgG1 FEA(L234F、L235E、D265A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位可含有IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位可含有IgG1 L234A、L235A、及/或F405L突變。在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位可含有S228P、L234A、L235A、F405L、及/或R409K突變。在一些實施例中，免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位可含有IgG-AA Fc-L234A、L235A、及F405L。
在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可衍生自具有一或多個以下突變之IgG：IgG1 AA(F234A、L235A)；IgG4 PAA(S228P,F234A,L235A)；IgG2 AA(V234A,G237A)；IgG1 FEA(L234F,L235E,D265A)；或IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG1 AA(F234A、L235A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG4 PAA(S228P、F234A、L235A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合
CD3之第二抗原結合位可含有IgG2 AA(V234A、G237A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG1 FEA(L234F、L235E、D265A)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG1 FES(L234F/L235E/P331S)突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG1 L234A、L235A、及/或F405L突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有S228P、L234A、L235A、F405L、及/或R409K突變。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可含有IgG-AA Fc-L234A、L235A、及F405L。
在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位可結合在初代人類T細胞及/或初代馬來猴T細胞上的CD3ε。在一些實施例中，免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位活化初代人類CD4+ T細胞及/或初代馬來猴CD4+ T細胞。
在一些實施例中，所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體能夠以小於500、或小於100或小於20nM之解離常數結合至人類或馬來猴T細胞上的CD3，如由用具有已知親和力之標記的抗CD3抗體進行競爭結合判定的。
ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可為單鏈雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段。ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可為BITE
(Micromet)。ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可為DART(MacroGenics)。ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可為Fcab及Mab2(F-star)。ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可為經Fc工程化之IgG1s(Xencor)。ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可為DuoBodies(Genmab)。ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段可為TetBiAbs(Merck)。
製備雙特異性抗體發明之方法包括該等描述於WO2008/119353、WO2011/131746、van der Neut-Kolfschoten et al.(Science.2007 Sep.14；317(5844)：1554-7)、PCT/US2015/051314、WO2005/061547、US2014/0170148、及US2016/0009824中者。
除了所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體及其雙特異性抗原結合片段外，所提供的是編碼所述ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段之多核苷酸序列。在一些實施例中，提供編碼ROR1×CD3雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段之該HC1、該HC2、該LC1或該LC2的多核苷酸。亦提供包含所述多核苷酸之載體，如表現ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段的細胞。這些細胞可為哺乳動物細胞(諸如293F細胞、CHO細胞)、昆蟲細胞(諸如Sf7細胞)、酵母菌細胞、植物細胞、或細菌細胞(諸如E.coli)。所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體及其雙特異
性抗原結合片段亦可藉由融合瘤細胞產生。在一些實施例中，提供用於藉由培養細胞產生ROR1×CD3雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段之方法。
本文進一步提供的是包含ROR1×CD3雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
本文揭露的是治療具有癌症之對象的方法，該方法包含投予該對象治療有效量的任何上文揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體、或其雙特異性抗原結合片段。
亦提供有效量的任何所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段在治療癌症之用途。
所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體及其雙特異性抗原結合片段可用於抑制表現ROR1之癌細胞或其他患病細胞的生長及/或增生。所提供的是用於抑制癌細胞的生長或增生之方法，其包含投予治療有效量的任何所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段以抑制癌細胞的生長或增生。
所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體及其雙特異性抗原結合片段可藉由將表現CD3之T細胞靶向到表現ROR1之細胞而進一步用來增強表現ROR1之患病細胞(如癌細胞)的殺滅。本文提供的是將T細胞重導到表現ROR1之癌細胞之方法，其包含投予
治療有效量的任何所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或雙特異性抗原結合片段以將T細胞重導到癌症。
在一些實施例中，該癌為表現ROR1之癌，如肺癌、血液性癌症、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、結腸癌、卵巢癌、腎癌、子宮癌、或黑色素瘤。表現ROR1之癌可為肺癌、如非小細胞肺癌(NSCLC)或小細胞肺癌(SCLC)。表現ROR1之癌可為血液性癌症，如急性骨髓性白血病(AML)、骨髓造血不良症候群(MDS，低或高風險)、急性淋巴性白血病(ALL，包括所有亞型)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性骨髓性白血病(CML)、或急漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm)(DPDCN)。表現ROR1之癌可為乳癌。表現ROR1之癌可為前列腺癌。表現ROR1之癌可為胰腺癌。表現ROR1之癌可為結腸癌。表現ROR1之癌可為卵巢癌。表現ROR1之癌可為腎癌。表現ROR1之癌可為子宮癌。表現ROR1之癌可為黑色素瘤。
在一些實施例中，可將ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段作為醫藥組成物投予給對象。因此，亦揭露的是任何所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段在製造用於治療癌症之組成物的用途。
本文提供的醫藥組成物可包含：a)有效量的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段、及b)醫藥上可接受之載劑，其可為惰性或生理活性。本文中所用之用語「醫藥上可接受
之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」包括生理相容之任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌和抗真菌劑、及類似者。合適載劑、稀釋劑及/或賦形劑之實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似物之一或多者，以及上述者之任何組合。在許多情況中，較佳的是將等張劑(諸如糖、多元醇、或氯化鈉)納入該組成物中。特定而言，合適載劑之相關實例包括：(1)達爾伯克氏(Dulbecco)磷酸鹽緩衝鹽水，pH約7.4，含有或未含有約1mg/mL至25mg/mL人類血清白蛋白、(2)0.9%鹽水(0.9% w/v氯化鈉(NaCl))、及(3)5%(w/v)葡萄糖；並且亦可含有抗氧化劑如色胺(tryptamine)及穩定劑如Tween 20®。
當接受治療之具體病症需要時，ROR1×CD3雙特異性抗體、雙特異性抗原結合片段、或包含該相同物之組成物亦可含有額外治療劑。ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段及該額外治療劑較佳具有不會不利地彼此影響之補充活性。在較佳實施例中，該額外治療劑可為阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。在較佳實施例中，該額外治療劑係化學治療劑。
ROR1×CD3雙特異性抗體、雙特異性抗原結合片段、或包含該相同物之組成物可呈各種型式，包括例如液體、半固體、及固體劑型。較佳型式取決於所意圖的投予及治療應用模式。ROR1×CD3雙特異性抗體、雙特異性抗原結合片段、或包含該相同物之組
成物可呈注射溶液或不溶溶液的型式。ROR1×CD3雙特異性抗體、雙特異性抗原結合片段、或包含該相同物之組成物可非經腸投予(例如靜脈、肌肉、腹膜內、皮下投予)。ROR1×CD3雙特異性抗體、雙特異性抗原結合片段、或包含該相同物之組成物可作為一推注或藉由經一段時間連續輸液而靜脈內投予。ROR1×CD3雙特異性抗體、雙特異性抗原結合片段、或包含該相同物之組成物可藉由肌肉、皮下、關節內、滑膜內、腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內、或病灶周圍途徑注射，以發揮局部以及全身治療效果。ROR1×CD3雙特異性抗體、雙特異性抗原結合片段、或包含該相同物之組成物可經口投予。
用於非經腸投予之無菌製備物可藉由將該等抗體、或其抗原結合片段以所需量納入適當溶劑中，接著藉由微過濾進行滅菌來製備。在溶劑或媒劑方面，可使用水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇、及類似者，以及上述者之任何組合。在許多情況中，可將等張劑(諸如糖、多元醇、或氯化鈉)包括於該組成物中。這些組成物亦可含有佐劑，尤其是潤濕、等張、乳化、分散及穩定劑。用於非經腸投予之無菌組成物亦可製備為無菌固體組成物之形式，其可在使用時溶於無菌水或任何其他注射用無菌介質中。
可使用經口投予之固體，包括錠劑、丸劑、粉劑(明膠膠囊、囊劑(sachet))或粒劑。在這些組成物中，雙特異性抗體或其抗原結合片段可於氬氣流下與一或多種惰性稀釋劑(諸如澱粉、纖維素、蔗糖、乳糖、或二氧化矽)混合。這些組成物亦可包含非為稀
釋劑之物質，例如一或多種潤滑劑(諸如硬脂酸鎂或滑石)、著色劑、塗層(糖衣錠)或糖釉(glaze)。
在經口投予之液體組成物方面，可使用含有惰性稀釋劑(諸如水、乙醇、甘油、植物油或石蠟油)之醫藥上可接受之溶液、懸浮液、乳液、糖漿及酏劑。這些組成物可包含非為稀釋劑之物質，例如潤濕、增甜、增稠、調味或穩定用產品。
ROR1×CD3雙特異性抗體、雙特異性抗原結合片段、或包含該相同物之組成物的劑量取決於所欲的效果、治療的持續時間、及所用的投予途徑。一般而言，醫師將會視待治療對象之年齡、體重及任何其他特定因素來決定適當劑量。
以上治療方法及用途中之劑量方案係經調整以提供最佳之所欲反應(例如，治療回應)。舉例而言，可投予單次推注、可在一段時間內投予數次分開之劑量、或者可依治療情況之急迫性所示來按比例提高或降低劑量。非經腸組成物可配製為劑量單元形式以增、進投予便利性及劑量一致性。
ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段亦可以組合療法來投予，即與所欲治療之疾病或病況的其他相關治療劑組合。在一些實施例中，所提供的是用於治療或預防癌症之方法，該方法包含投予對象治療有效量的任何所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段、及化學治療劑。在一些實施例中，該其他治療劑係阿糖胞苷(cytarabine)、蒽環素(anthracycline)、
組織胺二鹽酸鹽、或介白素2。在一些實施例中，所提供的是用於治療或預防癌症之方法，該方法包含投予對象治療有效量的任何所揭露的ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段、及放射性療法。放射性療法可包含放射線照射或相關聯之放射性藥品投予。放射線源可位於受治療病患外部或內部(放射線治療例如可為體外放射治療(external beam radiation therapy,EBRT)或近程放射治療(brachytherapy,BT)之形式)。放射性元素包括例如鐳、銫-137、銥-192、鋂-241、金-198、鈷-57、銅-67、鎝-99、碘-123、碘-131、及銦-111。所揭露的雙特異性ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段及其他治療劑之組合投予可以是同時的、分開的或以任何順序依序的。針對同時投予，該等劑可作為一個組成物或作為分開之組成物(視情況而定)投予。
下列實例係經提供以進一步描述本文中所揭露之一些實施例。該等實例意欲說明而非限制所揭露之實施例。
ROR1胞外域c-Mer原致癌基因酪胺酸激酶跨膜域(ROR1 ECD MERTK tm)係為了下列者而暫時地在細胞中表現：抗
ROR1抗體反應性確認(HEK293F)、特徵分析商業抗ROR1抗體(HEK293F及CHO-S)、測試噬菌體及融合瘤項目組(panel)對抗ROR2的交叉篩檢(CHO-S)、檢查ROR1 mAb靶物(hit)對抗ROR2-ECD MERTK的交叉反應性(CHO-S)、測試抗CD3及抗ROR1抗體對ROR1暫時轉染細胞之結合(HEK293F)、及檢查ROR1 mAb靶物對抗ROR2-ECD MERTK的交叉反應性(CHO-S)。ROR1 ECD MERTK tm(本文稱為RR1W1；SEQ ID NO：99)具有下列胺基酸序列：
ROR2-ECD MERTK(本文稱為RR1W2；SEQ ID NO：100)具有下列胺基酸序列：
在轉染前，以6e5細胞/ml之密度將HEK 293F細胞置於FreestyleTM 293培養基(Gibco #12338)到體積為30mls並在125ml透氣蓋搖瓶中以130RPM振盪24小時。在轉染當天，藉由Cedex將細胞計數且判定為具有在8e5細胞/ml與1.2e6細胞/ml之間的密度及超過98%的生存力。使用Freestyle max試劑(Invitrogen #16447)進行轉染。對於單一份30ml轉染，在一試管中，將37.5μl的freestyle max試劑稀釋在1ml的OptiMEM培養基(Gibco #31985)中。在另一試管中，將37.5μg的DNA(18.75μg靶及18.75μg pAdVAntage)混合到1ml OptiMEM中。然後將這二個試管混合在一起，在生物安全櫃培育3分鐘及然後使混合物直接加入到HEK293F細胞的燒瓶中。
對於CHO-S轉染，在轉染前，以6e5細胞/ml之密度將CHO-S細胞置於Freestyle CHO培養基(Gibco #12651)到體積為30mls並在125ml透氣蓋搖瓶中以130RPM振盪24小時。在轉染
當天，藉由Cedex將細胞計數且判定為具有在8e5細胞/ml與1.2e6細胞/ml之間的密度及超過98%的生存力。使用Freestyle max試劑(Invitrogen #16447)進行轉染。對於單一份30ml轉染，在一試管中，將37.5μl的freestyle max試劑稀釋在1ml的OptiMEM培養基(Gibco #31985)中。在另一試管中，將37.5μg的DNA(18.75μg靶及18.75μg pAdVAntage)混合到1ml OptiMEM中。然後將這二個試管混合在一起，在生物安全櫃培育3分鐘及然後使混合物直接加入到CHO-S細胞的燒瓶中。
以Expi293F轉染程序(Expi293表現系統套組(Life Technologies Corporation Cat # A14635))實施暫時性表現。使Expi293F細胞(Life Technologies Corporation Cat #A14527)在Expi293表現培養基中(Life Technologies Corporation Cat # A14351-01)在37℃；7% CO2；130RPM下生長。在轉染之前的二天，使細胞在7e5細胞/ml下分裂。在轉染時，將細胞計數及驗證為在至少30e5細胞/ml的濃度下且高於95%活菌。對於各30-mL轉染，將30μg的質體DNA於Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Life Technologies Corporation Cat # 31985-070)中混合成1.5mL的總體積。(15μg的pAdvantage DNA與15μg的表現載體DNA(對於抗體，此為1：3比例的HC：LC表現建構)。然後在Opti-MEM I培
養基中將81μL的ExpiFectamine 293試劑(Life Technologies Corporation Cat # A14525)稀釋成1.5mL的總體積。然後將稀釋的DNA及ExpiFectamine溶液輕輕地混合並在室溫下培育5分鐘。將稀釋的DNA加到稀釋的ExpiFectamine 293試劑、輕輕地混合、及在室溫下培育20分鐘。在培育後，然後將混合物加到於125ml搖瓶中的25.5ml的細胞。轉染後隨即將150μL的ExpiFectamine 293轉染增強子1及1.5mL的ExpiFectamine 293轉染增強子2加到各燒瓶(Life Technologies Corporation Cat # A14525)。在轉染之後五天，藉由離心收穫細胞上清液並透過0.2微米濾器澄清化。
藉由MabSelect SuReTM蛋白質A樹脂捕獲在澄清化的培養上清液中的抗體並以100mM乙酸鈉(pH 3.5)洗提。將含有該些抗體的部分(fraction)合併並立即以2.5M Tris HCl(pH 7.2)中和，接著將緩衝液置換為1×D-PBS或其他所欲緩衝液(若經指定)。蛋白濃度係藉由在NanoDrop分光光度計上測量OD280來判定，並用其吸光係數計算。抗體的純度及同質性係以SDS-PAGE及SE-HPLC進行評估。通常，如果依照SE-HPLC測得之單體低於95%，則使用Superdex 200進行SEC精製步驟(polishing step)。
以每孔50μL的檢定緩衝液將Meso scale discovery(MSD)Streptavidin-Standard(SA-STD)板封阻5分鐘。將板反轉移除檢定緩衝液並在紙巾上輕拍。將1μg/mL的50μL的於檢定緩衝液中的生物素化ROR1加到板的每個孔中並在4℃下培育過夜。將150μL的檢定緩衝液加到經塗覆的板的每個孔且不移除塗覆試劑並培育~一小時。以洗滌緩衝液將板洗滌三次。將板在紙巾上輕輕地拍以移除殘留的洗滌緩衝液。將50μL的於檢定緩衝液中之人類抗ROR1 DuoBody® Ab加到板的每個孔並在環境溫度下培育~一小時。以洗滌緩衝液將板洗滌三次。將50μL的1.4μg/mL的於檢定緩衝液中的釕標記的抗人類IgG(H+L)抗體加到板的每個孔。在環境溫度下伴隨溫和渦旋使板培育~一小時。以洗滌緩衝液將板洗滌三次。將150μL的讀取緩衝液(read buffer)加到板的每個孔。立即在MSD sector imager 6000ä Reader上讀取板的發光量。
使用流動式細胞測量術檢定實施細胞毒性評估。為完成這個，將GFP標記的NCI-H358標靶細胞以2×104細胞/孔鋪板到96-孔平底板中。第二天，將在培養基中與適當的雙特異性分子組合之1×105初代泛T細胞加到每個孔。共培養物係在分析前在37℃下培育72小時。使用細胞解離緩衝液(Life Technologies,USA)收穫細胞並以可固定的live/dead染料(Life Technologies,USA)及抗CD25
標記。這些標記係用來分別藉由在GFP+細胞上閘控(gating)評估標靶細胞的死亡及藉由在GFP- T細胞上閘控評定T細胞的活化。在IntelliCyt iQue High Throughput Flow Cytometry HTFC系統上收集樣本及使用ForeCyt軟體分析。在GraphPad Prism V6計算EC50值。非線性回歸曲線擬合的驗收準則為小於1.4的信賴區間(CI)範圍。
SPR實驗係以四通道Biacore T200光學生物感測器系統在25℃下進行。對於可溶性ROR1之實驗，CM5感測器晶片的四個流動檢測室(flowcell)係固著有高量(>6000回應單位(RU))的山羊抗人類Fc抗體((Jackson ImmunoResearch,cat # 109-005-098)。在此步驟後，在流動檢測室2、3及4捕獲對照組及測試抗體直到得到所欲的捕獲量以產生足夠的抗原結合回應(~350RU)。流動檢測室1沒有任何被捕獲的抗體且係用來作為參考表面。在經過濾及脫氣之PBSTE緩衝液(Bio-Rad # 176-2730)中，從400nM開始到在3倍稀釋液的5nM製備重組人類ROR1(圖7A，左；圖7B，左)。以50μL/min的流速將這些溶液注射到所有4個流動檢測室並監測締合4分鐘，接著監測解離10分鐘。在各相互作用後，使用pH 1.5的甘胺酸將感測器晶片表面再生產生穩定基線用於後續循環。
抗ROR1抗體與ROR1的相互作用的結合動力學分析係使用1：1 Langmuir Model藉由感測圖(sensorgram)的總體動力學擬合進行。
為了評估在ROR1表現與肺癌之間的關聯，評估70種肺癌細胞株(包括衍生自腺癌及鱗狀細胞亞型之NSCLC、及SCLC-衍生株)的ROR1表現。使用基於螢光活化細胞分類(FACS)的方式評估不與ROR2交叉反應的市售藻紅素(PE)接合之單株抗ROR1-抗體(2A2；Biolegend catalog # 357803/357804)的結合。當顯示比PE接合mIgG1同型對照組大2倍之平均螢光強度(MFI)信號時得分為陽性。顯著百分比的所測試的細胞株的(54%)顯現ROR1之表現，包括NSCLC及SCLC-衍生株二者(數據未顯示)。使用此偵測方法，在陽性株內，來自細胞株之表現範圍有表現高量ROR1的(如NCI-1155、LU1901R2及NCI-H446)、中等量的(如NCI-H1975及NCI-H358)、及低至無表現的(如SKMES-1、NCI-H520及NCI-H1417)。主要為中等至低表現之數種株被選來用於本文揭露的體外及體內檢定。圖1說明來自選定之肺癌細胞株的ROR1表現。
亦評估結腸、攝護腺、及細胞株的ROR1表現。雖然結腸及攝護腺項目組(panel)有限，但識別出可用於結合及功能檢定之具有高ROR1表現之數種株，包括HT-29。
使用接合至Alexa Fluor 647之自主研發的抗ROR1單株抗體(RR1B121)根據製造商的指示(A647,ThermoFisher)將融合性被套細胞淋巴瘤(MCL)、B細胞淋巴瘤、及多發性骨髓瘤(MM)細胞的ROR1表現染色。在磷酸鹽緩衝液(PBS)中，將細胞洗滌二次及在室溫下，以Live/Dead(Aqua；ThermoFisher)染色10分鐘。用PBS將Live/Dead染料洗掉。細胞係未染色的或係在4℃下，在FACS染料緩衝液(BD Biosciences)中，以在50uL最終體積抗ROR1-A647中之300ng抗體，將細胞染色30分鐘。所有染色步驟係在黑暗中進行。未染色的樣本係用作為陰性對照組；螢光扣除對照
(FMO)。用PBS將細胞洗滌二次並在染料緩衝液中重建以在BDFACS Canto細胞儀上採集。
在來自選定的血液性惡性腫瘤的25個細胞株評定ROR1表現(圖14)。在所有測試的MCL株及約一半的MM株中偵測到特定ROR1表現。然而，只有二個B淋巴瘤株顯示ROR1表現。
使用接合到藻紅素(PE)之抗ROR1 MAb(殖株2A2,Biolegend)將融合性被套細胞淋巴瘤(MCL)細胞株的ROR1表現染色。在磷酸鹽緩衝液(PBS)中，將細胞洗滌二次及在室溫下，以Live/Dead(Aqua；ThermoFisher)染色10分鐘。用PBS將Live/Dead染料洗掉。細胞係未染色的或係在4℃下，在FACS染料緩衝液(BD Biosciences)中，以1uL/樣本於50uL最終體積的抗ROR1-PE中，將細胞染色30分鐘。所有染色步驟係在黑暗中進行。未染色的樣本係用作為陰性對照組；螢光扣除對照(FMO)。根據製造商的指示使用PE Quantibrite Beads(BD)測量受體密度。用PBS將細胞洗滌二次並在染料緩衝液中重建以在BD FACS Canto細胞儀上採集。
在5個MCL細胞株評定ROR1表現及使用ABC方法定量受體密度(每細胞的ROR1分子數目)(圖15)。數據係以每細胞株二個獨立實驗的平均值(平均值±SD)呈現。
亦使用4102多株抗體(Cell Signaling Technology)評定包含正常組織之廣延陣列的腫瘤微陣列(TMA)的ROR1陽性。結果表示ROR1表現存在於一些正常組織中，包括乳腺、結腸、腎、攝護腺及子宮(表2)。值得注意的是，12個分析的肺樣品中，二個顯示一定程度的陽性，以及一個顯現一定量的膜染色。此外，輸卵管切片表現為唯一具有一致的膜表現證據之組織，其中7個樣本中的5個展現此染色圖形。總體而言，相當數目的正常組織展現一定頻率的陽性，這未在文獻中有所敘述。有鑒於此以及在對照的腫瘤細胞株上顯著的可觀量的非特異性染色，假定許多以此抗體看到的陽性係藉由非特異性染色引起。
因為顯著數目的小細胞肺癌(SCLC)細胞株已顯現ROR1表現，在來自具有此疾病之患者的初代腫瘤細胞上進行分析。SCLC的特徵在於高轉移(metastases)傾向，及因此患者在周圍血液具有遠較高的循環腫瘤細胞(CTC)發病率，而能夠分析在此類型的肺惡性腫瘤中ROR1的發病率。對於此分析，使用甲醛的緩釋調配物將新鮮血液固定在CellSave試管中。測試二個結合ROR1捲曲域之偵測抗體：2A2和抗ROR1抗體RR1B78(見下文)。摻加對照組ROR1+細胞株到全血中顯現RR1B78明顯地比2A2更敏感。因此，使用RR1B78進行在初代SCLC樣本的CTC分析。來自7個樣本的周圍血液樣本之分析顯示5個患者具有可偵測的ROR1 CTC。在該等樣品中，3個樣本具有10個或更多的可分析ROR1表現之CTC。來自所有三個患者的腫瘤細胞在7至45%的細胞之間上顯現可察覺的的ROR1，表示ROR1表現為某些SCLC腫瘤的特徵(表3)。
自Conversant Bio購買來自具有慢性淋巴性白血病(CLL，皆BMMC)或被套細胞淋巴瘤(MCL，2捐贈者匹配PBMC及BMMC)之患者的冷凍的周圍血液單核細胞(PBMC)或骨髓單核細胞(BMMC)。使樣本在37C快速解凍並轉移至溫熱的12mL的RPMI培養基(含有10%胎牛血清)(Invitrogen)。在冰冷的PBS(Invitrogen)洗滌及過濾後，將細胞計數並以1×106活細胞/孔種在96孔圓底板中。首先，根據製造商的規程，在室溫下，在黑暗中，以50uL的NearIR L/D IR(ThermoFisher)將細胞染色10至15min。在
以冰冷的PBS及FACs染料緩衝液(BD)洗滌後，在50uL最終體積Brilliant染料緩衝液(BD Bioscience)中，以抗體雞尾酒、抗CD45-PerCP-Cy5.5(eBioscience)、抗-CD5-FITC及抗CD19-PE-Cy7(BD Bioscience)、抗CD38-PE、抗CD40-BV605及抗CD137-BV421(BioLegend)，在4℃下在黑暗中將細胞染色30min。以FACs緩衝液洗滌過後，以200uL FACS緩衝液將細胞重建並藉由Fortessa II細胞儀分析。使用FlowJo及Prism軟體進行數據分析。腫瘤細胞係識別為活淋巴球的CD19+CD5+。
ROR1在多數腫瘤細胞上的所有CLL樣本都高度表現(MFIavg=853)且獨立於在樣本中的腫瘤細胞%(圖16)。在>50%腫瘤細胞上，相較於在CLL，ROR1在MCL之表現為低~1.5倍的量(MFIavg=575)(圖16)。
ROR1結合Fabs係選自重新式(de novo)pIX噬菌體顯示庫，如於Shi,L.等人(2010)De novo selection of high-affinity antibodies from synthetic fab libraries displayed on phage as pIX fusion proteins J Mol Biol 397,385-396中所述。簡單地說，該等庫係藉由將人類支架(scaffold)分歧化(diversifying)產生，其中生殖系VH基因IGHV1-69*01、IGHV3-23*01、及IGHV5-51*01係與人類
IGHJ-4袖珍基因經由H-CDR3迴圈來重組，而人類生殖系VL kappa基因O12(IGKV1-39*01)、L6(IGKV3-11*01)、A27(IGKV3-20*01)、及B3(IGKV4-1*01)與IGKJ-1袖珍基因重組以組裝出完整的VH及VL域。庫設計係詳細描述於Shi等人，J Mol Biol 397：385-96,2010中。將三個重鏈庫與四個生殖系輕鏈組合(已知為第2版)、或與分歧化的輕鏈庫組合(已知為第3版)以產生12個獨特的VH：VL組合。該等庫之後根據重鏈基因進一步組合產生六個用於對抗ROR1之淘選實驗的庫。
根據相同重鏈(1-69、3-23、5-51)及生殖系輕鏈(A27、B3、L6、012)的額外重新pIX庫係藉由Sloning Biotech誘變技術產生。這些被製成噬菌體庫，並根據重鏈基因組合產生三個額外的庫以用於對抗ROR1之淘選實驗。
淘選對抗生物素化人類ROR1-Fc(Sino Biological Inc Cat #13968-H02H1)的該等庫。在鏈黴親和素(streptavidin)磁珠(Dynal)上捕獲生物素化抗原並以100nM或10nM的最終濃度將其暴露於重新pIX Fab庫。在PBS-Tween中洗掉非特異性噬菌體並藉由接種MC1061F’大腸桿菌細胞回收結合的噬菌體。噬菌體係由該等細胞擴增過夜並重複進行總共四輪的淘選。在四輪生物淘選後，以二種形式篩檢單株Fabs對於人類ROR1 Fc之結合：1)以藉由羊抗人類FD在ELISA板上捕獲Fab之ELISA，將生物素化ROR1-Fc加到所捕獲的Fab，接著以鏈黴親和素HRP偵測btROR-Fc；及2)以藉由
鏈黴親和素在ELISA板上捕獲btROR1-Fc之ELISA，將Fab上清液加到所捕獲的抗原，接著以山羊抗Fab’2：HRP偵測Fabs。將在任一形式已顯現超過背景10倍結合至btROR1-Fc的殖株予以定序重鏈及輕鏈可變區。
自基於人類ROR1-Fc結合之重新(de novo)選擇選出69種殖株。69種Fabs中的64種(標記為RR1B1-RR1B64)被選殖至IgG2sigma/κ骨架中以產生全長抗體、表現，並進一步在下面的段落中特徵分析。
對於親和力成熟ROR1抗體，建構使用Sloning Biotech誘變技術產生之輕鏈庫。來自ROR1克林格域結合劑的重鏈可變區-RR1B66、RR1B67、RR1B69、RR1B82、RR1B83、及RR1B84(表9)-被選殖至含有此分歧化的VLk3-11庫之pIX噬菌粒載體中。一旦表現且顯示這些噬菌體庫，接著嚴格淘選對抗ROR1的這些噬菌體庫以得到較高親和力結合劑。
具體來說，淘選對抗生物素化人類ROR1-Fc(Sino Biological Inc Cat #13968-H02H1)的該等庫。在鏈黴親和素磁珠上(Dynal)捕獲生物素化ROR1並以10nM或1nM的最終濃度將其暴露於成熟pIX Fab庫。在PBS-Tween中洗掉非特異性噬菌體並藉由感染MC1061F’大腸桿菌細胞回收結合的噬菌體。噬菌體係由該等細
胞擴增過夜並重複進行總共三輪的淘選。在三輪生物淘選後，以三種形式篩檢單株Fabs對於人類ROR1Fc之結合：1)以藉由羊抗人類FD在ELISA板上捕獲Fab之ELISA，將生物素化ROR1-Fc加到所捕獲的Fab，接著以鏈黴親和素HRP偵測btROR-Fc；2)以藉由鏈黴親和素在ELISA板上捕獲btROR1-Fc之ELISA，將Fab上清液加到所捕獲的抗原，接著以山羊抗Fab’2：HRP偵測Fabs；及3)以基於近接發光免疫檢定，使Fabs在具有bt-ROR-1、抗Fab’2：HRP、及SA-吖啶(BMG LabTech Lumistar Omega)之溶液中結合。將顯現信號對背景之比率大於10倍之殖株定序重鏈及輕鏈可變區。然後選擇獨特且不匹配親系VL序列的殖株用於進一步特徵分析。以藉由羊抗人類FD在ELISA板上捕獲Fabs之排序ELISA測試這些Fab，以稀釋系列將生物素化的ROR1-Fc加到所捕獲的Fabs，接著以鏈黴親和素HRP偵測bt-ROR-1-Fc。亦考量缺少可能的PTM風險、及LC序列的多樣性，然後選擇相對於親系Fabs顯現改良的結合曲線之Fabs用於轉化成mAb。總共36種殖株被選殖至IgG4-PAA骨架中以產生全長抗體、表現、及進一步特徵分析(見表22)。
使用ProteOn XPR36系統(Bio-Rad)在25℃下進行SPR實驗以測量親和力成熟的抗人類ROR1抗體及親系RR1B67對人類ROR1的結合。在GLC感測器晶片上(Bio-Rad，目錄號176-5011)，伴隨30μL/min流速之含有0.005% Tween-20的PBS歷時300秒，經由胺偶合，直接將於30μg/mL之乙酸鹽緩衝液(pH 5.0)
中的山羊抗人類Fc IgG(Jackson Immunoresearch,cat # 109-005-098)水平定向固著在所有6個配體通道上。固著密度平均為約6000回應單位(RU)且在不同通道間變異小於5%。在呈垂直配體定向、0.5ug/ml(~400RU)之抗人類Fc IgG表面上捕獲五種不同的mAb，以及第6個配體通道作為無配體表面對照組。在以5種濃度的3倍稀釋系列的300nM濃度下，使具有C端人類血清蛋白素(HSA)融合之重組人類ROR1-ECD及組胺酸標籤(his tag)，RR1W27(自主研發的)進入作為分析物以結合至呈水平定向之捕獲的mAb。亦注射緩衝樣本以監測所捕獲的mAb之解離及基線穩定性。在100μL/min的流速下，監測所有Ag濃度之解離相30分鐘。使用0.8%磷酸的18秒脈衝將結合表面再生以用於下一次相互作用循環。藉由自回應數據減去二組參考數據來處理原始數據：1)減去間點信號以校正在Ag與空晶片表面之間的非特異性相互作用；2)減去緩衝通道信號以校正導因於所捕獲的mAb隨時間解離之基線漂移。將經處理之在各mAb所有濃度下的數據全面地擬合為1：1簡單Langmuir結合模型以提取動力(kon、koff)及親和力(K D)常數。設定使用%Chi2/Rmax<30%之任意準則來測量擬合的品質，在彙總表3A中只有那些具有有效擬合之定量的動力結果應可被認為是數量上可靠的。
在一些實驗中，編碼在人類血清蛋白素(C34S)-6xHis(RR1W27)的N端融合之人類ROR1胞外域(Uniprot Accession #Q01973|殘基30-406)的哺乳動物表現建構係用來暫時地轉染
Expi293F細胞。轉染六天後，藉由離心收穫培養上清液。藉由固著金屬親和力層析法(IMAC)自Expi293F上清液純化RR1W27接著藉由徹底透析緩衝交換至1×PBS中。
藉由結合至表現ROR1或ROR2之CHO-S細胞株表徵64種抗ROR1抗體。轉染的CHO-S細胞ROR1(RR1W1)及ROR2(RR1W2)及模擬對照組CHO-S係提供用於一組結合實驗。除了基於流動之分析，在表徵噬菌體衍生之靶物前，使用西方印漬確認ROR1在CHO-S細胞上的表現。
在轉染後，使用暫時性轉染的CHO-S細胞篩檢抗ROR1抗體24小時。使用四種商業單株抗ROR1抗體(Creative Diagnostics catalog # DMAB8606MH；Biolegend(2A2 Ab)catalog #357803,357804；AVIVA Systems Biology catalog # OAAD00316；ACRIS Antibodies,Inc.catalog #AM06399SU-N)及來自R&D系統之山羊多株抗體(catalog # AF2000)作為陽性對照組。親系及模擬轉染的CHO細胞、以及RSV同型對照組(B23B31)係用作為陰性對照組。使用以alexafluor 674標記之多株抗人類抗體判定測試抗體之結合。64種所測試的抗體中，63種對於ROR1轉染之CHO-S細胞顯示堅固的結合。使用自測試製品之平均的標準偏差(SD)測量結合親和力，其中那些小於平均減1SD的被稱為低結合劑，那些在平均的1SD內的被稱為中等結合劑，及那些比平均加1SD更強的結合被稱
為強結合劑。使用此方式，識別出12種低的、44種中等的及7種強的ROR1結合劑。藉由流動及西方印漬使用內源性表現腫瘤細胞株進一步表徵此組抗體。
亦在此實驗中分析暫時性轉染ROR2 CHO細胞。沒有ROR2表現被任何所測試的陽性對照組抗體偵測到(數據未顯示)。以該等抗ROR1抗體，11/64被認為是高ROR2結合劑；根據數據排除RR1B3、B11、B14、B15、B17、B32、B43、B46、B51、B55及B61。
重複抗ROR1抗體對暫時性轉染ROR1胞外域(ROR1-ECD)之CHO-S細胞的結合。抗人類二代(山羊抗人類IgG AlexaFluor 647；Life Technologies catalog #A21445)係用於將結合視覺化。操作三份來自Biolegend之單株抗ROR1抗體(A2A；Biolegend)作為陽性對照組。親系及模擬轉染的CHO細胞、以及同型對照組(B23B31)係作為陰性對照組操作。使用以alexafluor 674(山羊抗人類IgG AlexaFluor 647；Life Technologies cat#A21445)標記之多株抗人類抗體讀取抗體的結合。64種所測試的抗體中，62種對於一部份的ROR1-ECD轉染細胞顯示堅固結合，其與由陽性對照組抗體所顯示的相互關聯(數據未顯示)。將其與在上個實驗識別出的64種中的63種相比較。RR1B31(在上個實驗表現出結合良好)在此實驗中未結合。將數據與來自使用MFI值最初實驗之數據相比以排序抗體(表4)。在二個實驗之間的排序有差異可能是由於結合
劑大多在非常小範圍的MFI值內結合之事實。然而，鑑於研究內部變異，數據表示多數的這些抗體結合藉由在暫時性轉染後之CHO細胞表現的ROR1。
除了這些CHO-S轉染細胞外，評估各種細胞株以用於抗ROR1抗體項目組之表徵。MCF-7細胞被判定為對ROR1及ROR2是陰性(數據未顯示)。細胞株U266被判定為對ROR1是陰性及對ROR2是陽性(數據未顯示)。MDA-MB231細胞對ROR1是強陽性(表5及表6)。HEK293對ROR2表現為陽性(數據未顯示)。相較於HEK293及3T3細胞，CHO-S顯示相對小的位移，其與缺乏西方印漬法的特異性條帶相互關聯(數據未顯示)。有趣的是，表示抗體(R&D Systems catalog #AF2000；Goat polyclonal)可結合至藉由該等細胞表現之蛋白質的印漬中存在更小的條帶。此是否為ROR1的截斷形式或不同蛋白質還不清楚且需要進一步調查。然而，在所有細胞株中觀察到的位移可係由結合到此較小的物種造成。亦顯示HEK293細胞可用ROR1暫時性轉染且偵測到細胞表面表現(數據未顯示)。
評定抗ROR1抗體對於二種乳腺腫瘤株之結合：表現內源性ROR1之MDA-MB231乳腺腫瘤細胞(表5及表6)及MCF-7，其為ROR1陰性(數據未顯示)。抗人類二代係用於將結合視覺化。使用四種單株抗ROR1商業抗體(Creative Diagnostics catalog # DMAB8606MH；Biolegend(2A2 Ab)catalog #357803,357804；AVIVA Systems Biology catalog # OAAD00316；ACRIS Antibodies,Inc.catalog #AM06399SU-N)及來自R&D系統之山羊多株抗體(catalog # AF2000)作為陽性對照組。操作六個RSV對照組(B23B31)
的項目組以規範背景結合。使用以alexafluor 674標記之多株抗人類抗體讀取測試抗體之結合。使用接合至相同螢光染料之適當的多株二代抗體偵測小鼠及山羊陽性對照組抗體。64種所測試的抗體中，61種顯示結合高於同型對照組之平均。三十九種(39)抗體顯現結合優於最佳的陽性對照組抗體。使用自測試製品之平均的標準偏差(SD)測量相對親和力，其中那些大於平均的被稱為中等及那些大於平均加1SD的被稱為高結合劑。使用此方式，識別出24種中等的及7種強的ROR1結合劑。
接著，藉由西方印漬法評定抗ROR1抗體對於ROR1陽性細胞株、SKMES-1及CHO-S ROR1之結合(數據未顯示)。在使用噬菌體靶物上清液的SKMES-1溶菌液中沒有偵測到條帶。ROR1多株抗體作為對照組。在ROR1-CHO-S轉染溶菌液中觀察到多個條帶，可能是因為醣化。在利用噬菌體RR1B31、RR1B20、RR1B51、RR1B61及RR1B28的西方法中分別觀察到大約70kDa的條帶。此觀察到的條帶咸信為ROR1的醣基化形式。使用在SKMES-1溶菌液中的對照組抗體在~130kDa觀察到模糊的條帶。此條帶咸信為全長ROR1。
使用流動式細胞測量術評定抗ROR1抗體對二種肺腫瘤細胞株之結合：H358及SKMES-1、以及被套細胞癌株，JEKO-1。這些株全部都已顯示表現內源性ROR1蛋白質。JEKO-1(被套細胞株)顯示顯著背景(數據未顯示)。亦操作SK-SH5Y細胞(在文獻
中顯示為表現ROR2的神經母細胞瘤株)，雖然這些細胞的ROR1狀態是未知的(數據未顯示)。使用四種單株抗ROR1商業抗體(Creative Diagnostics catalog # DMAB8606MH；Biolegend(2A2 Ab)catalog #357803,357804；AVIVA Systems Biology catalog # OAADOO316；ACRIS Antibodies,Inc.catalog #AM06399SU-N)及來自R&D系統之山羊多株抗體(catalog # AF2000)作為陽性對照組。六個RSV同型對照組(B23B31)的項目組係用來規範背景結合。使用以alexafluor 674標記之多株抗人類抗體讀取測試抗體之結合。使用接合至相同螢光染料之適當的多株二代抗體偵測小鼠及山羊抗ROR1陽性對照組抗體。
64種所測試的抗ROR1抗體中，超過一半顯示結合高於同型對照組之平均。少數抗體顯示結合高於在陽性對照組中所觀察到。在各個所測試的細胞株中，RR1B48顯示一貫良好的結合，RR1B46、RR1B11、RR1B55及RR1B58亦然，其對於SKMES-1、H358及MDA-MB231全都排在前10(表6)。RR1B48及RR1B11似乎不像RR1B46、RR1B55及RR1B58那麼多地受基於甲醛之固定影響。這可表示這二個群組分別結合至非固定與固定敏感的表位。RR1B48及RR1B11可用於需要在標記之前固定的IHC。總體而言，此數據表示超過一半的項目組結合至內源性ROR1及允許選擇親和力測試與表位結合的最佳結合劑。固定數據亦允許選擇數種抗體用於作為IHC的工具試劑進一步測試。
大多數噬菌體靶物抗體結合到二ROR1+細胞株，SKMES-1、及MDA-MB-231。藉由平均螢光指數(MFI)揀選噬菌體靶物，首先在SKMES上，及接著在MDA-MB-231上揀選。總體而言，強度在每種情況下關聯性良好。噬菌體靶物可被鬆散地分組為高結合劑、中等結合劑、及低或非結合劑，無論其是否在SKMES-1或MDA-MB-231上被揀選。商業抗體對照組對此檢定未如預期起作用。以H358及SH-SY-5Y細胞進行類似的實驗。一般而言，對H358為良好結合劑的噬菌體靶物對SH-SY-5Y亦為良好結合劑，及那些不良結合劑對這二種細胞株也是不良的(數據未顯示)。噬菌體靶物一般在相同的「類」，不論其是否藉由排列在H358上或在SH-SY-5Y上而揀選。也就是說，高結合劑對這二種細胞株一般是相同的，中等結合劑對這二種一般是相同的，且低或非結合劑對這二種細胞株亦是相同的。此外，結合排序一般依照在其他所測試的ROR1+細胞株(SKMES-1及MDA-MB-231)中觀察到趨勢。
為了表徵噬菌體衍生之抗ROR1抗體的初始項目組，創造一組Fc融合蛋白質(RR1W4 IgC2域、RR1W5捲曲域、及RR1W6克林格域)作為關鍵試劑。在此實驗中，各mAb對該等Fc-
融合蛋白質之結合係藉由MSD進行。簡單來說，使5μL的10μg/mL的ROR1 ECD域建構(RR1W4 IgC2域、RR1W5捲曲域、及RR1W6克林格域)在Meso Scale Discovery(MSD)HighBind plates(Gaithersburg,MD)上吸收2小時，然後以150μl 0.1M HEPES洗滌3次。在4℃下，以5% BSA緩衝液將板封阻過夜。第二天，將板洗滌3次，準備添加抗ROR mAb上清液。對各變異體添加25μL的10μg/ml mAb上清液，並使樣本在室溫下伴隨輕輕搖動培育2hrs。將板洗滌3次，然後將25μL的20nM Ru標記的抗人類Kappa鏈(Clone# SB81a,Southernbiotech,Birmingham,AL)加到每個孔以偵測mAb對各種ROR1域建構之結合。培育為在室溫下伴隨輕輕搖動1小時。使域變體與20nM Ru標記的抗人類Kappa鏈及200nM的商業抗ROR1(MAB2000；Clone # 291608,R&D Systems)混合作為對照組。然後以HEPES洗滌緩衝液將板洗滌3次。將MSD讀取緩衝液(150μl)加到每個孔，及然後使用MSD Sector Imager 6000(MSD,Gaithersburg,MD)分析板。
分級評定的結果提供一致的mAbs分級，其用於後續分析。捲曲及克林格域選擇性結合表現強；當紀錄時，IgC2結合整體非常弱。RR1B46及RR1B55似乎明顯優於平均IgC2結合劑。RR1BO1及RR1B20分子明顯沒有結合至任何ROR1或ROR2蛋白質。在表7中，層級1、2、及3是指為了評估而被分群在一起的
mAb組。表7顯示抗ROR1抗體項目組被相當均勻地分在ROR1的ECD的3個域各處。
亦藉由Meso scale discovery(MSD)進行實驗以評估噬菌體衍生之項目組對ROR1-Fc(Sino Biologics)及ROR2-His(Origene)蛋白質之結合。RR1B43、RR1B45及RR1B55分子顯示低量的ROR2結合及RR1B11、RR1B44、RR1B46具有可測量的ROR2結合(數據未顯示)。RR1B36分子被識別為潛在的ROR2結合劑及RR1B25具有非常低量的ROR2結合。比較對CHO-ROR2細胞之結合數據表示一定的重疊(粗體)：RR1B3、B11、B14、B15、B17、B32、B43、B46、B51、B55及B61(數據未顯示)。
測試一系列的抗體上清液與ROR1及ROR2 wt、單一域Fc融合蛋白質、及ROR1/ROR2域交換變異體結合的能力以識別結合域。在實驗中，將ROR1-ECD-Fc及ROR2-ECD-Fc結合數據與其中IgC2域被ROR1 IgC2域置換之ROR2 ECD版本(IgC2(1)-Fz-(2)-Kg(2)-Fc)及其中ROR2 IgC2域將被呈現之類似的域再建構嵌合ECD(IgC2(2)-Fz(1)-Kr(2)-Fc)比較。在這些實驗中，人們會預期ROR1-ECD-Fc結合將與IgC2(1)嵌合體有關。同樣地，ROR2-ECD-Fc結合將被預期與IgC2(2)嵌合體有關。在一些實驗中觀察到預期的配對：RR1B26、RR1B49、RR1B50、RR1B58、RR1B59及
RR1B60。然而，對嵌合體之結合一般非常低及沒有嵌合體高於50%的WT ECD的結合值的情況(數據未顯示)。
抗ROR1抗體的分級數據係用來判定商業抗體2A2的表位。使用親系抗ROR1抗體進行競爭實驗。測試三種細胞株：H520細胞作為陰性對照組、及H358與SK-MES-1作為ROR1+測試細胞。如所預期的，H520細胞顯示缺乏結合，如在無mAb對照組(沒有以封阻mAb預處理)與無2A2對照組(孔D12)之間(數據未顯示)的MFI值所相似地顯示的。相反地，來自H358及SKMES之數據明確顯現2A2抗體結合至Ig樣域。以抗體RR1B76(RR1B58)、RR1B85(RR1B44)及RR1B86(RR1B47)預培育抑制2A2結合。有趣的是，RR1B65(RR1B12)僅稍微抑制2A2結合，而RR1B88完全不抑制2A2結合，表示在Ig樣區有至少二個表位。
採用證據權重方式以能夠選擇被進一步表現及純化為IgG4 PAA分子的一群抗ROR1抗體。將表6中的數據與ROR2選擇性數據組合。在排除非結合劑及交叉反應性ROR2結合劑後，一些非常弱結合劑被去優先化。然後將分子藉由表位劃分並針對在ROR1ECD的三種表位的每一者選定高結合劑、中等結合劑及弱結合劑。然後針對這些分子的每一者選定備份分子。此選擇進行導致各分12種到二個項目組的24種分子的表(表8及圖2)。此組分子被進一步表現及純化。
在IgG4 PAA平台上製備24種抗ROR1抗體，其自然包括R409(表9)。
一些選定的mAb表現不佳-mAb RR1B68、RR1B73、RR1B75、RR1B79、RR1B80、RR1B81及RR1B87未被進階(在上表中灰色陰影)。此導致17種抗ROR1 mAb用於評估。
抗CD3抗體CD3B219之結合。在H358細胞、初代T-細胞、SK-MES-1細胞、及在HEK293F細胞表現之ROR1上進行實驗。結合結果顯示商業小鼠抗ROR1抗體對ROR1表現H358細胞的濃度依賴性結合及抗CD3抗體對這些細胞無特異性結合。結合結果顯示抗CD3抗體對T細胞的濃度依賴性結合及抗ROR1抗體對T細胞無特異性結合。這些結果如預期的確認抗CD3抗體特異性結合至T細胞。結合結果顯示抗ROR1抗體對ROR1表現SK-MES-1細胞的濃度依賴性結合及抗CD3抗體對ROR1表現SK-MES-1細胞無特異性結合。結合結果顯示抗ROR1抗體對ROR1暫時性轉染HEK293F細胞及親系HEK293F細胞的濃度依賴性結合及抗CD3抗體對ROR1暫時性轉染HEK293F細胞及親系HEK293F細胞無特異性結合。這些數據係彙總於下表10中。
在交叉競爭實驗評估IgG4 PAA K409R抗ROR1抗體的項目組。在室溫下，將五μL的重組人類ROR1-Fc嵌合體(10μg/mL；Sino Biologics,Cat# 13968-H02H1)直接塗覆在MSD HighBind板上2小時，然後在室溫下用5% MSD Blocker A緩衝液再封阻2小時。以0.1M HEPES緩衝液(pH 7.4)將板清洗3次，接著加入釕(Ru)標記的抗ROR1 mAb的混合物，其在室溫下以自1μM至1nM不同濃度的其他抗ROR1 mAb預培育30分鐘。在室溫下伴隨輕輕搖動培育2小時後，以0.1M HEPES緩衝液(pH 7.4)將板清洗3次。以蒸餾水將MSD讀取緩衝液T稀釋(4倍)並分配到每個孔中。用SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)分析板並用GraphPad處理數據。
已被分配到克林格域結合家族之IgG4 PAA K409R抗ROR1抗體(包括RR1B67)產生非常明確的交叉競爭讀數。RR1B66、RR1B67、RR1B69、RR1B82、RR1B83及RR1B84競爭結合Ru標記的RR1B69分子(圖3及表11)。自此數據推斷到所有克林格結合分子結合到相同表位。此外，商業抗體2A2顯示出結合到Ig樣域(表11)。
表11：交叉競爭數據的彙總
交叉競爭實驗識別出6種在ROR1的ECD上的結合群組(表12)。發現克林格結合分子的一個競爭群組(群組1)。除RR1B71外，所有捲曲域結合分子結合到相同表位(群組2)。RR1B71形成群組3。識別出Ig樣域的三個表位群組。商業分子2A2形成群組5。
使用DuoBody®平台製備ROR1×CD3雙特異性抗體。參見，例如，美國專利申請公開第US2014/0170148號。簡單來說，在2個有意設計之單株抗體(一個懷有F405L突變及另一個具有K409R)之間的經控制Fab臂交換(cFAE)。藉由以75mM(最終濃度)的半胱胺HC1(2-MEA)混合相等莫耳比例的2個親系抗體-IgG4 PAA K409R抗ROR1抗體(ROR1臂)及CD3B219(CD3臂)-啟動cFAE，或在一些情況下，6%額外的一個親系以耗盡另一個。在31℃下培育5小時後，使抗體混合物對抗1×D-PBS而透析，在這段期間，將2-MEA移除以使二硫鍵減少以重新連接。藉由陽離子交換(CEX)HPLC或疏水性相互作用層析(HIC)HPLC來分析DuoBody®異二聚體的形成。藉由製備型CEX或HIC精製雙特異性抗體以移除殘餘的親系。使用此方式創造的17種ROR1×CD3雙特異性抗體係列於表13中。
用於本研究其餘部分的ROR1×CD3 DuoBody®分子是那些具有CD3B219臂者。因此，如在實例段落的其餘部分使用的，ROR1×CD3雙特異性抗體係指那些具有CD3B219臂者，除非另有說明。
測試17種ROR1×CD3雙特異性抗體組對ROR1表現HCC827細胞之結合。簡單地說，使用細胞解離緩衝液(Gibco,USA)收穫細胞並在PBS中洗滌。在4℃下，在FACS染色緩衝液(BD Biosciences,USA)中，以雙特異性抗體進行標記45分鐘。在以alexa-fluor 647-標記之抗人類二代抗體(Life Technologies,USA)培育之前，在染色緩衝液中洗滌細胞。在IntelliCyt High Throughput Flow Cytometry HTFC系統上收集樣本及使用ForeCyt軟體分析。
在GraphPad Prism V6計算EC50值。非線性回歸曲線擬合的驗收準則為小於1.4的信賴區間(CI)範圍。
所使用的對照組抗體為CD3×B21M同型及來自BioLegend之商業抗ROR1抗體(2A2)及對應的同型。自15μg/mL或約100nM開始滴定抗體。以一式兩份操作各抗體稀釋及CD3×B21M同型被包括在所有板上。所有ROR1 CD3雙特異性抗體以濃度依賴性方式結合到細胞，而CD3×B21M及BioLegend同型未以濃度依賴性方式結合到細胞。所有樣本的減去同型之幾何平均螢光指數(geoMFI)數據係用於分析。藉由在各濃度下自抗體GeoMFI減去個別板CD3×B21M同型GeoMFI計算同型減去值。使用減去同型之geoMFI值計算EC50值。以Prism繪製數據，nM濃度值被LOG變換及使用以log(促效劑)對回應的非線性回歸計算EC50值-可變斜率(四個參數)分析具有限制到0的底部，因為該數據減去同型背景。一些曲線在所測試的抗體的最高濃度下未表現完全平線區及一些曲線亦具有不同的最大結合信號。
這些數據是根據域結合分組重新繪製為圖形表示(圖4)。以Prism繪製減去同型之數據，nM濃度值被LOG變換及使用以log(促效劑)對回應的非線性回歸擬合曲線-可變斜率(四個參數)具有限制到0的底部，因為該數據減去同型背景。計算EC50結合值並顯示於表14中。
結合數據表明捲曲及Ig樣域分子的相對親和力較強，而克林格域結合劑平均而言較不強。這些數據係在CD3臂的條件下並僅在一ROR1表現細胞株上判定。捲曲域結合劑的EC50值比最佳的Ig樣或最佳的克林格域結合ROR1×CD3雙特異性抗體任一者略微更緊。
利用多種方式評估17種ROR1×CD3雙特異性抗體組的功能活性。在一個實驗中，在T細胞重導殺滅檢定中測試這些分子的子集。使用基於IncuCyte之檢定，因為其更適合測量黏著性細胞株之殺滅的研究且與基於流動之檢定相反，允許計算每孔的絕對
標靶細胞數目及其擴張的動力學。這可能是因為使用了RFP-標記之標靶細胞，其係使用來自Essen BioSciences的慢病毒建構而產生。在此實驗中，使用二個獨立的讀數測量細胞毒性：標靶細胞生長抑制(圖5)及凋亡蛋白酶(Caspase)3,7活性(數據未顯示)。這使得標靶細胞損失及凋亡標靶細胞死亡(其為T細胞媒介殺滅的特徵)相關聯。開發能夠根據在實驗的每個時間點自標靶細胞/孔的數目產生的擴張指數計算生長抑制的分析實驗程序。這些動力學曲線係用來產生在所繪製的曲線下面積以產生各ROR1×CD3雙特異性抗體的滴定曲線。然後使用內插以產生能夠用來直接比較測試分子效力的單一值。使用內插而非EC50的，係因為當比較根據結合域劃分之不同組的分子時，最大值非常不同。比較來自生長抑制及凋亡蛋白酶讀數之排序且，雖然不相同，顯示強關聯性(數據未顯示)。
生長抑制數據明顯顯示在結合到相異域的分子群組之間在其殺滅能力有差異(圖5及表15)。藉由克林格域結合劑產生的曲線相較於捲曲域結合劑具有較高最大值。Ig樣域結合劑對標靶細胞生長抑制顯現最低的最大值，表示在表位位置與殺滅潛力之間有關係，其中結合更多膜近端區者的比結合更多ECD分子遠端部分者的更有效。在各分子群組內，具有最高相對親和力者顯現最佳的殺滅，表示親和力是重要的，但次於表位位置。
凋亡蛋白酶讀數亦顯示，相較於結合到捲曲及Ig樣域者，克林格結合劑大致上具有較大殺滅潛力。然而在數據中有一些差異。RCDB11及RCDB5未產生曲線擬合，雖然個別數據點顯現類似於用標靶細胞生長抑制讀數觀察到的良好殺滅。RCDB13及RCDB9是捲曲群組的最佳殺滅劑，而在克林格群組內，RCDB5及RCDB15表現稍微優於RCDB4及RCDB16。這些觀察類似於從其他讀數所觀察到的。
總體而言，此數據強烈表示膜近接是殺滅潛力的關鍵決定因素，而親和力具有次要影響。在所測試的ROR1×CD3雙特異性抗體項目組中，克林格域結合劑顯示最佳的殺滅效能。在捲曲及Ig樣域結合群組的較高親和力分子亦顯示良好活性，表示數種相異分子可用於引導選擇。
亦在新穎T細胞媒介的細胞毒性檢定中評定ROR1×CD3雙特異性抗體。在此檢定中，藉由DiscoveRx以細胞溶質融合將標靶細胞工程化到half-BetaGal，其產生以由與部分b-gal分子融
合之非分泌型管家基因組合的融合蛋白質轉染的標靶細胞株。這可在細胞裂解後被釋放到培養基中，及可用來讀數(化學發光)。在加入b-gal的補充部分與受質後，裂解釋放的b-gal將完全重建。轉染三種細胞株：H520(陰性對照組)、H358及SKMES-1。
在細胞株中使用二種不同管家蛋白質。根據初步數據，在非裂解ADO-融合轉染細胞的背景信號比所欲的高。因此，選擇FKBP1A細胞用於嚮導(pilot)T細胞殺滅實驗。藉由流動式細胞測量術分析檢視H520細胞株且顯示對ROR1為陰性的(如預期)。如預期的H358及SK-MES-1細胞株呈陽性。
DiscoveRx殺滅檢定提供與其他T-細胞媒介的細胞毒性檢定相當之數據。在此實例中(圖6)，克林格域結合ROR1×CD3雙特異性抗體是最佳的殺滅分子之一並構成單一分子群組。在捲曲及Ig樣域結合劑觀察到更分歧化的回應。然而，二種捲曲結合劑及Ig樣結合劑中的一種與克林格結合ROR1×CD3雙特異性抗體組相當。
進一步分析ROR1×CD3雙特異性抗體RR1B69、B67、B78、B76、B72、B77、及B89。
在RCDB5與現有技術抗體之間比較由ROR1×CD3雙特異性抗體所活化的肺腫瘤細胞之重導T細胞殺滅，該現有技術
抗體係公開於WO2014167022A1，實例3C，對ROR1為二價且對CD3為單價之雙特異性(Fab)2x(Fab)抗體，具有Fc，簡便起見稱為「Engmab」抗體。使用基於流動式細胞測量術之檢定來測量細胞毒性。每個條件設置三份樣本。簡單地說，將10,000GFP-轉染NCI-H1975肺腫瘤細胞鋪板到96孔平底板中的每個孔中並使其黏著4-6小時。然後將冷凍保存的、純化T細胞解凍並伴隨雙特異性抗體以50,000細胞/孔(5：1 E：T)加到每個孔，雙特異性抗體係以0.0064至6667pM的最終滴定範圍鋪板。板係在37℃下培育72小時。
收穫時，以胰蛋白酶釋放細胞，以可固定的生存力染料(Thermo Fisher Scientific,Bridgewater)及抗人類CD25(殖株M-A251；BioLegend,San Diego)標記、及使用IntelliCyt iQue高通量流式細胞儀收集。在ForeCyt軟體(IntelliCyt,Albuquerque)進行數據分析並匯出到Microsoft Excel。然後於Prism v6.02(GraphPad,La Jolla)中使用「S形劑量-回應(可變斜率)」函數，將對數轉化值用於非線性回歸。小於1.4的LogEC50 95%信賴區間範圍係設置為曲線擬合的允收標準(acceptance criteria)。圖表顯示平均值±SEM。使用不成對雙尾t-檢定進行統計分析。
數據顯現在各種抗體濃度下，RCDB5活化的細胞毒性大於Engmab活化的細胞毒性(圖13A)。在所測試的最高濃度下(6.67nM，圖13B)，以RCDB5處理之孔比起以Engmab處理之孔每孔的活肺腫瘤細胞數目低4.6倍。因為在T細胞上誘導CD25表
現與其活化有關，數據顯示標靶細胞損失係以T細胞依賴性方式媒介(圖13C)。
在PBS洗滌融合性MCL細胞、MAVER-1、JeKo-1、Z-138及NAMALWA、Burkitt氏淋巴瘤株(數據未顯示)並在室溫下以500nM羧基螢光素琥珀亞胺酯(CFSE)染料(Invitrogen)標記5分鐘。以熱失活的胎牛血清將反應焠滅1min。以培養基洗滌CFSE標記的腫瘤細胞並以1×106細胞/mL重建。在RPMI培養基(含有10% FBS)重建之ROR1×CD3 RCDB13或空臂對照組MAb(空xCD3或RORI×空)任一者的存在下，將20,000個腫瘤細胞與40uL來自4位健康捐贈者之全血共培養。在37℃5% CO2下以200uL/孔的最終體積，在96-孔板中培養細胞60小時。使用在冰上用水稀釋1：10之Multispecies Red Cell Lysis Buffer(eBioscience)將紅血液細胞裂解3分鐘。以PBS洗滌細胞並根據製造商的規程用Live/Dead(Near-IR；ThermoFisher)染色。在4℃下，在黑暗中，以抗CD4-PerCP/Cy5.5、抗CD8-PE-Cy7、抗CD25-PE(BioLegend)於50uL體積之FACs染料緩衝液液(BD)中將細胞沉澱物染色30分鐘。以染料緩衝液將細胞洗滌二次並以染料緩衝液重建。藉由流動式細胞測量術測量%細胞毒性(100%-活CFSE+%)及T細胞活化(在CD4+及CD8+淋巴部份上的CD25%)。在BD FACs Canto細胞儀上採集數
據並藉由CytoBank軟體及GraphPad Prism 6分析。數據代表兩個獨立實驗。
在體外全血細胞毒性檢定中，ROR1×CD3媒介之MCL株的強效殺滅(圖17A至圖17F)需要由ROR1×CD3媒介的T細胞與腫瘤細胞的特異性囓合以誘導劑量依賴性的T細胞活化(活化標記，CD25上調節，圖17D至圖17F)及細胞毒性(圖17A至圖17C)。亦藉由當使用空對照組時，缺少低於1nM的細胞毒性確認T細胞的特異性-腫瘤囓合。雖然△Emax(最大細胞毒性的百分比-在沒有抗體時的自發細胞毒性百分比)在捐贈者之間變化，但在所有所測試的細胞株之間的EC50是相當的且範圍在0.2至1nM之間。
在PBS洗滌融合性MCL細胞、MAVER-1、Z-138、JeKo-1、REC-1、Mino(JeKo-1、REC-1、Mino的數據未顯示)並在室溫下以500nM羧基螢光素琥珀亞胺酯(CFSE)染料(Invitrogen)標記5分鐘。以熱失活的胎牛血清將反應焠滅1min。以RPMI培養基(含有10%胎牛血清)洗滌CFSE標記的腫瘤細胞並以1×106細胞/mL重建。在RPMI培養基中洗滌PBMC並調整至2.5×106細胞/mL。在培養基重建之ROR1×CD3 RCDB13或空臂對照組MAb(空×CD3或ROR1×空)任一者的存在下，將20,000個腫瘤細胞與100,000個
來自2位健康捐贈者之PBMC(E：T=1：5)共培養。在37℃5% CO2下以200uL/孔的最終體積，在96-孔板中培養細胞60小時。如在圖4進行染色及數據分析。數據代表2個獨立實驗。
在體外細胞毒性檢定中，當PBMC係用作為效應物細胞時，ROR1×CD3媒介MCL株之強殺滅(圖18A、C顯示MAVER-1細胞之數據，及圖18B、D顯示Z-138細胞之數據)。需要由ROR1×CD3 DuoBody媒介的T細胞與腫瘤細胞的特異性囓合以誘導劑量依賴性的T細胞活化(活化標記，CD25上調節，圖18C至圖18D)及細胞毒性(圖18A至圖18B)。亦藉由當使用空對照組時，缺少低於1nM的細胞毒性確認T細胞的特異性-腫瘤囓合。EC50在所有所測試的細胞株之間是相當的且範圍在0.2-1nM之間，類似於衍生自使用相同的MCL株作為標靶細胞的全血檢定的EC50。這些數據亦表示在ROR1受體密度(圖15)與EC50之間缺乏締合。
在ROR1×CD3雙特異性抗體的分析中，在所有釋放樣本的CD3重鏈CDR3上觀察CD3脫醯胺作用，其在高pH下隨應力增加。進行二次CD3脫醯胺作用的分析評估。相較於先前研究(17±2%及20±4%)，RCDB5及RCDB11釋放樣本展現類似量的脫醯胺作用量(17±2%及19±3%)。在RCDB13A觀察到稍微較高的量(24±2%對19±5%)，雖然在誤差範圍內(表16)。
根據早前的細胞結合結果(圖5)，預期Ig樣及捲曲域結合劑可能比克林格域結合劑更緊地結合至ROR1表現細胞。因為克林格域結合劑明顯為T細胞引導的細胞毒性的更佳介質，所以充實地理解細胞結合是所欲的。
使用MesoSeale Discovery technology(MSD-CAT)利用細胞親和力技術評估選擇的ROR1×CD3雙特異性抗體對ROR1的親和力。使用H358細胞內源性表現ROR1或HEK293轉染人類ROR1任一者進行MSD-CAT實驗。HEK293轉染人類ROR1的受體密度係藉由流動式細胞測量術測量，其然後轉成在反應混合物中的受體莫耳濃度並用在這些研究中。具有單一空臂的抗RSV之DuoBody® CD3B288係用作為陰性對照組。親系(模擬)HEK293細胞係用來評估對細胞表面的非特異性結合。為了測量相互作用的親和力，使用MSD-CAT方法，製備具有固定濃度的可溶性反應物(A)及不同濃度的細胞(B)的一系列混合物，並使其達到平衡。平衡後，
判定游離A的濃度並針對親和力分析數據。對於這些研究，藉由添加在四個不同但固定之濃度下的抗體並將細胞在6e7細胞/mL下開始連續稀釋而製備反應混合物。在反應混合物的培育及平衡後，經由在SA板上捕獲的生物素-ROR1-DDK捕獲游離的抗ROR1並接著使用釕標記的抗人類IgG偵測。藉由使用1：1結合模型非線性最小平方擬合結合曲線執行ROR1×CD3雙特異性抗體與ROR1的相互作用的結合曲線圖。
為了執行MSD-CAT實驗，發展用於偵測在反應混合物中的游離mAb之檢定。測試二種偵測方法。第一種方法(使用抗旗幟標誌抗體捕獲旗幟標誌(flag-tagged)之ROR1(又名ROR1-DDK)，接著將游離的抗ROR1結合到捕獲的ROR1-DDK並以釕標記的抗人類IgG偵測)失敗了，因為檢定性能不良：低檢定信號及窄檢定窗口。因此發展第二種偵測檢定且最終用於MSD-CAT實驗。在此偵測檢定中，經由在SA板上的生物素-ROR1-DDK捕獲游離的抗ROR1及使用釕標記的抗人類IgG偵測捕獲的mAb。
產生用於結合至HEK細胞表現hu ROR1(慢病毒質體pDR25226)之ROR1 DuoBody的MSD-CAT並用來轉染HEK293F細胞。使用此細胞株分析ROR1×CD3雙特異性抗體(RCDB5、RCDB6、RCDB9、RCDB11、RCDB12、RCDB13)(表17)。使用如藉由流動式細胞測量術測量每HEK293 180萬個人類ROR1之受體密度擬合這些數據(數據未顯示)。實例數據係顯示於
圖7A及7B中。由這些測量，DuoBody RCDB5具有331+/-152pM之KD及RR1B67親系(二價)抗體具有55+/-13pM的表觀KD。RR1B67 Mab顯示比RCDB5更緊密~6倍之結合(該DuoBody為RR1B67xCD3B219)。此親系對HEK293 ROR1表現細胞的更高親和力歸因於結合性效果(avidity effect)。RCDB13、RCDB11、RCDB12、RCDB5、RCDB6的結合曲線圖與在次nM(sub-nM)範圍的親和力類似；然而，在nM範圍的RCDB9觀察到較弱的親和力。對於RCDB9，在對照組(模擬)細胞上有細胞濃度依賴性滴定顯示對RCDB9的非特異性結合。陰性DuoBody® CD3B288顯示沒有結合至ROR1表現細胞也沒有結合至HEK293模擬細胞。
Biacore(表面電漿共振；SPR)亦用來判定ROR1×CD3雙特異性抗體(RCDB5、RCDB6、RCDB9、RCDB11、RCDB12、RCDB13)對重組人類ROR1的親和力(表18)。實例SPR傳感圖係顯示於圖7A及7B中。
無論所使用的抗原形式(重組或細胞-表面表現)，Biacore(SPR)及MSD-CAT二者皆顯現對ROR1的最弱結合劑為RCDB9。此外，這二種方法皆顯示其他5種ROR1×CD3雙特異性抗體(RCDB5、RCDB13、RCDB6、RCDB11、RCDB12)以彼此的3.6倍內或更小的親和力結合。ROR1×CD3雙特異性抗體對於細胞表面ROR1的MSD-CAT親和力比對於重組ROR1的SPR數據更緊密>20倍。對於細胞表面ROR1之SPR與MSD-CAT親和力數據之間的差異，最有可能是因為抗原呈現於細胞表面上所致(相較於重組抗原)。由SPR所觀察到的結合代表單價親和力，無論所分析的分子之類型(單特異性或雙特異性抗體)，其不受結合性效果影響，但在細胞檢定的條件下，單特異性抗體之結合，與ROR1×CD3雙特異性抗體相反，由於抗體的二價性質受到結合性影響。此結合性效果的實例係藉由RCDB5與其親系抗ROR1 mAb(RR1B67)之結合顯示(圖7)。在Biacore中，親系mAb顯示二倍RCDB5的回應(左圖)表示在親系mAb中占有二臂，但結合曲線圖是類似的。然而，在MSD-CAT的情況下(右圖)，親系mAb的曲線向左偏移且斜率更陡表示更緊密的結合。
綜上所述，RCDB5及RR1B67的SPR數據表示低的奈莫耳KD。這與在此實驗中對於單價的預期一致。ROR1-ECD係以單體形式結合到感測器表面捕獲的抗體。RCDB5對細胞之結合約更
強25倍(~300pM)。如在細胞表面上表現的ROR1的膜錨定形式可能以對於結合更有利的構形呈現抗原。RR1B67分子對細胞在效能的大位移很可能是由於結合性效果。在HEK293細胞上的高密度的外源性ROR1表面表現可表示受體交互關聯可發生且增加表觀結合常數。
混雜小鼠模型係用來評估RCDB13及RCDB5的體內效能。在模型中，將5百萬個H1975細胞與1百萬個人類T細胞(5：1的E：T比例)於50% Cultrex中混合。將混合物注入到雌性無胸腺裸鼠的右脅腹(0.1ml/小鼠)。第0天開始以ROR1×CD3雙特異性抗體治療並持續5劑量(IV)。PBS對照組群組，及對於各ROR1×CD3雙特異性抗體，以0.1、1、及10ug/小鼠投予(圖8)。當相較於PBS對照組時，在1及10ug/小鼠下的ROR1×CD3雙特異性抗體RCDB5壓制H1975腫瘤之生長。以RCDB13觀察到整體較弱之效果。
此研究的目的是藉由競爭AlphaScreen而表徵ROR1×CD3雙特異性抗體RCDB5相對於野生型hIgG1及相關的IgG4 PAA對照組親系(二價)及空臂(單價)分子的集合與人類FcγR1、
FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、及FcRn的相互作用。在AlphaScreen中使用的抗體係提供於表19中。AlphaScreen是基於珠的檢定系統，用來以微板形式研究生物分子相互作用。AlphaScreen檢定使用二種類型的珠：供體珠及受體珠。二種珠類型都經水凝膠塗覆的，這使非特異性結合及自聚集最小化，同時提供反應性群組以用於將分子接合到珠的表面。供體珠中含有光敏劑，其在680nm照射時將環境氧轉換成單重態氧。單重態氧並非為自由基，且像其他激發分子，在其回復到基態之前具有有限的壽命。在其4μsec半衰期內，單重態氧可在溶液中擴散大約200nm。如果受體珠是該距離之內，在接受器珠內，化學能可從單重態氧轉移到2,3-二甲噻吩衍生物，這導致在520至620nm產生光。近接依賴性的化學能轉移是AlphaScreen的均勻性的基礎。在所揭露的實驗中，當AlphaScreen信號減少時記為競爭。簡單地說，對照組生物素化IgG結合的鏈黴親和素供體珠將His標誌的FcγR/FcRn結合的Ni2+受體珠帶到近接產生化學發光信號(在照射時)。將未標記的競爭者測試Abs連續稀釋及應用。當測試Ab與對照組生物素化IgG競爭結合到FcγR/FcRn時，信號減少。
在競爭結合檢定中的排序經常係在自劑量回應曲線導出的EC50值的基礎上進行。然而在AlphaScreen檢定中，競爭者Abs並不總是產生S形劑量回應曲線。因此不能總是導出EC50值。取而代之的，藉由比較在任何給定濃度下，遍及整隊所測試的Abs的最大信號%建立靜默程度。在不同日子進行的二次重複實驗回合上檢定測試Abs。僅顯示一(代表)組結果。
在FcγRI上，RCDB5以與hIgG4 PAA同型對照組相同之程度結合(未顯示)。RCDB5以與IgG4 PAA同型對照組幾乎相同的方式結合到FcγRIIa(圖9)及FcγRIIb(未顯示)。在FcγRIIIa上，RCDB5並不比hIgG4 PAA同型Abs更具有競爭力(圖10)。RCDB5如hIgG1 WT有效地結合FcRn(參見圖10A；B21M IgG1代表RSV IgG1 WT對照組)。綜上所述，ROR1×CD3
雙特異性抗體RCDB5以基本上匹配IgG4 PAA同型相同的程度結合所有所測試的Fc受體。
藉由四步驟程序製備人類ROR1克林格域/RR1B67Fab複合物。首先，將Fab及克林格域混合在一起(1.2莫耳過量的Fab)並在4℃下培育過週末，同時透析到20mM Tris(pH 8.0)中。第二，在20mM Tris(pH 8.0)中使複合物結合至monoS 5/50管柱(GE Healthcare)並以NaCl梯度使用ÄKTA淨化系統(GE Healthcare)洗提。由於分離不佳，將峰值部份合併在一起，在20mM Hepes pH 7.5中稀釋8倍，並使用mono S 5/50管柱於20mM Hepes pH 7.5及NaCl梯度將複合物純化。最後，藉由超過濾(Amicon Ultra-4 3kDa)將複合物濃縮至7.8mg/mL。
使用坐滴蒸氣擴散法，Corning 3550 96孔板(Hampton,cat no.HR8-146)，在20℃下，進行游離Fab及克林格/Fab複合物的結晶試驗及結晶篩檢IH1M、IH2M、JCSG+、CS等。以Liquidator 96、模型200uL(Mettler Toledo)將篩檢溶液分配到板孔中並以Mosquito LCP機器人(TTP Labtech)在室溫下製備奈米滴(nanodrops)。使用自動記錄滴圖像的Formulatrix成像器偵測結晶滴至少21天。ROR1克林格/RR1B67 Fab複合物的繞射級晶體係由18% PEG 3k、0.2M(NH4)2SO4、0.1M乙酸鹽pH 4.5生長，其中複
合物最初在7.8mg/mL下。自2M(NH4)2SO4、5% MPD、0.1M MES pH 6.5得到RR1B67 Fab晶體，其中Fab最初在13mg/mL下。關於數據收集，將晶體在含有對應母液並用20%甘油增補的冷凍保護液中浸泡幾秒鐘，然後在液態氮中急速冷凍。
在Argonne National Laboratory的Advanced Photon Source(APS)的光束線22-ID，以Pilatus 6M偵測器收集X射線繞射數據組。將X射線繞射數據組用程式HKL2000處理。藉由程式Phaser之分子置換解析結構，人類生殖系抗體1-69/B3(PDB代碼3QOT)作為游離RR1B67 Fab的檢索模型，及人類纖維蛋白溶酶原克林格3域(PDB代碼：2LOS，NMR模型1)與游離RR1B67 Fab作為ROR1克林格/RR1B67 Fab複合物的檢索模型。以程式PHENIX將結構細化。使用程式COOT進行模型調整及結構重疊。以CCP4套裝程式進行結晶計算、定義表位及互補位殘基的接觸距離、及表位面積計算。以PyMol(PyMOL Molecular Graphics System,Version 1.4.1,Schrödinger,LLC)產生所有分子圖形並使用Kabat所定義判定CDR。
結合到單離的人類ROR1克林格域(藉由TEV消化移除Fc)的RR1B67的Fab的晶體結構被判定為3.2Å解析度。抗體/抗原複合物的結構允許以原子細節特徵分析相互作用，增加抗體作用機制的理解，及增強關於ROR1胞外區的知識。在公開的文獻中，沒有可得的ROR1胞外域任何部分的結構。ROR1結構包括對應
於整個克林格域的殘基310-391，及在Asn-315的一個聯接N的聚醣。結構顯露所有與Fab的重要相互作用。一些蛋白質殘基存在於晶體環境中，但並不規則：六個N末端及15個C末端ROR1殘基，以及來自Fc融合的14個胺基酸殘基殘餘物。這些無序的殘基未在結構中解析並被排除在最終模型外。RR1B67 Fab結構包括輕鏈殘基1-213及重鏈殘基1-220(重鏈殘基134-140除外，其是無序的並不包括在內)。在非對稱單元中有一RR1B67/克林格複合物，其具有藉由電子密度地圖良好定義之Fab/抗原組合位，這允許結合殘基的可靠定位。在所有圖中，將Fab依序編號及ROR1編號在信號肽開始。
在RR1B67 Fab與ROR1克林格域之間的複合物結構顯現表位是不連續的並涉及分布在膜近端克林格域的整個環區之殘基(殘基T324-T328、S330-Q333、P336、N338、S339、Y341、H359-Y361、L377、D378、及D387)(圖11及圖12)。被Fab埋藏之克林格表面積為約882Å2及在克林格與Fab之間有廣延接點(圖11C至圖11D)，其與藉由SPR判定的抗體/抗原次奈莫耳親和力一致的。RR1B67互補位由在CDR-L1、-L3、-H2、及-H3的殘基組成(圖12)。Gly331、Gln333、及His359同時接觸RR1B67的重鏈及輕鏈，而所有其他表位殘基接觸重鏈或輕鏈的任一者。(圖11C至圖11D)。在人類/馬來猴與小鼠ROR1克林格之間不同的唯一殘基為T396S。此殘基未在抗體/抗原界面。
所屬技術領域中具有通常知識者將瞭解到可以對所揭露的單離抗ROR1抗體、ROR1×CD3雙特異性抗體、及使用彼等之方法的較佳實施例做出許多變化及修改，且可在不背離本發明精神的情況下做出該等變化及修改。因此，文後所附申請專利範圍是要含括所有此類相等變異，其係屬於本發明的真實精神及範疇。
本文件中所引用或描述之各個專利、專利申請案、及公開案之揭露內容其全文皆以引用方式併入本文中。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 49
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 50
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 51
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 52
<210> 53
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 53
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 54
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 55
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 56
<210> 57
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：
合成多肽
<400> 57
<210> 58
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 58
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 60
<210> 61
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 61
<210> 62
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 62
<210> 63
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 63
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 64
<210> 65
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 65
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 66
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 67
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 70
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 75
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 76
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 77
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 78
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 79
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 80
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 81
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 84
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 85
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 86
<210> 87
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 87
<210> 88
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 88
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 89
<210> 90
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 90
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 91
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 92
<210> 93
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 93
<210> 94
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 94
<210> 95
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 95
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 96
<210> 97
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 97
<210> 98
<211> 64
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知之敘述：人類或小鼠多肽
<400> 98
<210> 99
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 99
<210> 100
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 100
<210> 101
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 101
<210> 102
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 102
<210> 103
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 103
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 104
<210> 105
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 108
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 109
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 110
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<211> 5
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<220>
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 122
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 125
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 126
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<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 127
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 128
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 129
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 130
<210> 131
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 131
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 132
<210> 133
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：
合成多肽
<400> 133
<210> 134
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 134
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 135
<210> 136
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 136
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：
合成胜肽
<400> 137
<210> 138
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 138
<210> 139
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 139
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 140
<210> 141
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 141
<210> 142
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 142
<210> 143
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 143
<210> 144
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 144
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 145
<210> 146
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 146
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 147
<210> 148
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 148
<210> 149
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 149
<210> 150
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 150
<210> 151
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 151
<210> 152
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 152
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 153
<210> 154
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 154
<210> 155
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 155
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 156
<210> 157
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 157
<210> 158
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 158
<210> 159
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 159
<210> 160
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 160
<210> 161
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 161
<210> 162
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 162
<210> 163
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<223> 人工序列說明：合成多肽
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列說明：合成多肽
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<223> 人工序列說明：
合成胜肽
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<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<223> 人工序列說明：
合成胜肽
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<223> 人工序列說明：合成多肽
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<223> 人工序列說明：合成胜肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 368
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 369
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 370
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 371
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 372
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 373
<210> 374
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 374
<210> 375
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 375
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 376
<210> 377
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 377
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 378
<210> 379
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 379
<210> 380
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 380
<210> 381
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 381
<210> 382
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 382
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 383
<210> 384
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 384
<210> 385
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 385
<210> 386
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 386
<210> 387
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 387
<210> 388
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成胜肽
<400> 388
<210> 389
<211> 377
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知之敘述：人類或小鼠多肽
<400> 389
<210> 390
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 390
<210> 391
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成多肽
<400> 391
Claims (39)
- 一種免疫特異性結合至ROR1之單離抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；b.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；d.包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3； e.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；f.包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的輕鏈CDR3；h.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的輕鏈CDR3；i.包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR3； j.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；l.包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；m.包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；n.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3； o.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR3；p.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或q.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列的輕鏈CDR3；其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項1所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項1所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基 酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項1所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中：a.(a)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；b.(b)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；c.(c)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；d.(d)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；e.(e)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；f.(f)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；g.(g)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈； h.(h)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；i.(i)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；j.(j)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；k.(k)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；l.(l)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；m.(m)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；n.(n)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；o.(o)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈； p.(p)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；或q.(q)的該抗體或其抗原結合片段具有包含與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
- 如請求項4所述之單離抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列及輕鏈具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
- 如請求項4所述之單離抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列及輕鏈具有SEQ ID NO：57之胺基酸序列。
- 一種免疫特異性結合至ROR1之單離抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含：a.包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；b.包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；c.包含與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；d.包含與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈； e.包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；f.包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；g.包含與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；h.包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；i.包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；j.包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；k.包含與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；l.包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈； m.包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；n.包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；o.包含與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；p.包含與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈；或q.包含與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的重鏈及包含與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列的輕鏈。
- 一種單離抗體或其抗原結合片段，其結合至包含T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378及D387之ROR1上的表位。
- 如請求項1至8中任一項所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類抗體或抗原結合片段。
- 如請求項1至9中任一項所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係重組者。
- 如請求項1至10中任一項所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段係Fab片段、Fab2片段或單鏈抗體。
- 一種核酸分子，其編碼如請求項1至11中任一項所述之單離抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體，其包含如請求項12所述之核酸分子。
- 一種細胞，其表現如請求項1至11中任一項所述之單離抗體或其抗原結合片段。
- 一種單離抗體或其抗原結合片段，其與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，該參考抗體或其抗原結合片段包含：a.包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；b.包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；c.包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；d.包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；e.包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；f.包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列的輕鏈；g.包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的輕鏈；h.包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的輕鏈；i.包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列的輕鏈； j.包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的輕鏈；k.包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：57之胺基酸序列的輕鏈；l.包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；m.包含SEQ ID NO：66之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；n.包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈；o.包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的輕鏈；p.包含SEQ ID NO：79之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：81之胺基酸序列的輕鏈；或q.包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：87之胺基酸序列的輕鏈。
- 一種單離抗體或其抗原結合片段，其與參考抗體或其抗原結合片段競爭結合至ROR1，其中該參考抗體或抗原結合片段結合至包含T324、V325、S326、V327、T328、S330、G331、R332、Q333、P336、N338、S339、Y341、H359、S360、Y361、L377、D378及D387之ROR1上的表位。
- 如請求項16所述之單離抗體或其抗原結合片段，其中該參考抗體包含了包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列的輕鏈。
- 一種單離ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其包含：a)免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位，該第一抗原結合位包含重鏈CDR1、CDR2及CDR3與輕鏈CDR1、CDR2及CDR3；及b)免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位，該第二抗原結合位包含重鏈CDR1、CDR2及CDR3與輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
- 如請求項18所述之單離ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中該免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位具有：a.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；b.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3； d.包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；e.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；f.包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的輕鏈CDR3；h.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的輕鏈CDR3； i.包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR3；j.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；l.包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；m.包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3； n.包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；o.包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR3；p.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或q.包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列的輕鏈CDR3；其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項18至19中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中該免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈 CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項20所述之單離ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中：a.該免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；及b.該免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項20所述之單離ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中：a.該免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含 SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；及b.該免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈CDR3、包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 一種單離ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其包含：a)第一重鏈(HC1)；b)第二重鏈(HC2)；c)第一輕鏈(LC1)；及d)第二輕鏈(LC2)，其中該HC1及該LC1形成免疫特異性結合ROR1之第一抗原結合位，且該HC2及該LC2形成免疫特異性結合CD3之第二抗原結合位。
- 如請求項23所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中a.該HC1具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3； b.該HC1具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；c.該HC1具有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；d.該HC1具有包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；e.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3； f.該HC1具有包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列的輕鏈CDR3；g.該HC1具有包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的輕鏈CDR3；h.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的輕鏈CDR3；i.該HC1具有包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：52之胺基酸序列的輕鏈CDR3；j.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：56之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；k.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；l.該HC1具有包含SEQ ID NO：64之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：65之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；m.該HC1具有包含SEQ ID NO：67之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：68之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；n.該HC1具有包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；o.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈CDR3；p.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：80之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：82之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：83之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或q.該HC1具有包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：85之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：86之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：88之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：89之胺基酸序列的輕鏈CDR3；其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項24所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中 a.(a)的該HC1包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(a)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；b.(b)的該HC1包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(b)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；c.(c)的該HC1包含與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(c)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；d.(d)的該HC1包含與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(d)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；e.(e)的該HC1包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(e)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；f.(f)的該HC1包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(f)的該LC1包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；g.(g)的該HC1包含與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(g)的該LC1包含與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；h.(h)的該HC1包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(h)的該LC1包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列； i.(i)的該HC1包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(i)的該LC1包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；j.(j)的該HC1包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(j)的該LC1包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；k.(k)的該HC1包含與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(k)的該LC1包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；l.(l)的該HC1包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(l)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；m.(m)的該HC1包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(m)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；n.(n)的該HC1包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(n)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；o.(o)的該HC1包含與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(o)的該LC1包含與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；p.(p)的該HC1包含與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(p)的該LC1包含與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；或 q.(q)的該HC1包含與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(q)的該LC1包含與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
- 如請求項23所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中a.(a)的該HC1包含與SEQ ID NO：1之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(a)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；b.(b)的該HC1包含與SEQ ID NO：9之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(b)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；c.(c)的該HC1包含與SEQ ID NO：13之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(c)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；d.(d)的該HC1包含與SEQ ID NO：17之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(d)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；e.(e)的該HC1包含與SEQ ID NO：21之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(e)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；f.(f)的該HC1包含與SEQ ID NO：25之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(f)的該LC1包含與SEQ ID NO：29之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列； g.(g)的該HC1包含與SEQ ID NO：33之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(g)的該LC1包含與SEQ ID NO：36之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；h.(h)的該HC1包含與SEQ ID NO：39之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(h)的該LC1包含與SEQ ID NO：41之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；i.(i)的該HC1包含與SEQ ID NO：45之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(i)的該LC1包含與SEQ ID NO：49之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；j.(j)的該HC1包含與SEQ ID NO：53之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(j)的該LC1包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；k.(k)的該HC1包含與SEQ ID NO：61之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(k)的該LC1包含與SEQ ID NO：57之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；l.(l)的該HC1包含與SEQ ID NO：63之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(l)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；m.(m)的該HC1包含與SEQ ID NO：66之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(m)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；n.(n)的該HC1包含與SEQ ID NO：70之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(n)的該LC1包含與SEQ ID NO：5之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列； o.(o)的該HC1包含與SEQ ID NO：73之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(o)的該LC1包含與SEQ ID NO：76之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；p.(p)的該HC1包含與SEQ ID NO：79之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(p)的該LC1包含與SEQ ID NO：81之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列；或q.(q)的該HC1包含與SEQ ID NO：84之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列且(q)的該LC1包含與SEQ ID NO：87之胺基酸序列至少90%相同的胺基酸序列。
- 如請求項23至26中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈CDR3、且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列的輕鏈CDR2、及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項23至27中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中該HC2包含與SEQ ID NO：90至少90%相同的胺基酸序列，且該LC2包含與SEQ ID NO：91至少90%相同的胺基酸序列。
- 如請求項23至27中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中：a.該HC1具有包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列的輕鏈CDR3；及b.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項23至27中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中：a.該HC1具有包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：55之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC1具有包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列的輕鏈CDR3；及b.該HC2具有包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列的重鏈CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列的重鏈CDR2、包含SEQ ID NO：94之胺基酸序列的重鏈CDR3，且該LC2具有包含SEQ ID NO：95之胺基酸序列的輕鏈CDR1、包含SEQ ID NO：96之胺基酸序列的輕鏈CDR2及包含SEQ ID NO：97之胺基酸序列的輕鏈CDR3，其中該等CDR是根據Kabat所定義。
- 如請求項23至28中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中： a.該HC1具有SEQ ID NO：13之胺基酸序列且該LC1具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及b.該HC2具有SEQ ID NO：90之胺基酸序列且該LC2具有SEQ ID NO：91之胺基酸序列。
- 如請求項23至28中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中：a.該HC1具有SEQ ID NO：61之胺基酸序列且該LC1具有SEQ ID NO：57之胺基酸序列；及b.該HC2具有SEQ ID NO：90之胺基酸序列且該LC2具有SEQ ID NO：91之胺基酸序列。
- 如請求項18至32中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段，其中該雙特異性抗原結合片段為單鏈。
- 一種單離細胞，其表現如請求項18至33中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段。
- 一種治療患有癌症之對象之方法，該方法包含：投予該對象治療有效量的如請求項18至33中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段。
- 如請求項35所述之方法，其中該癌症為肺癌或血液性癌症。
- 一種有效量的如請求項18至33中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段在治療癌症的用途。
- 一種如請求項18至33中任一項所述之ROR1×CD3雙特異性抗體或其雙特異性抗原結合片段在製造用於治療癌症之組成物的用途。
- 如請求項37或38所述之用途，其中該癌症為肺癌、血液性癌症、乳癌、前列腺癌、胰腺癌、結腸癌、卵巢癌、腎癌、子宮癌或黑色素瘤。
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