TW201728603A

TW201728603A - 凝血酶抗體、其抗原結合片段及醫藥用途

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Publication number: TW201728603A
Application number: TW106103649A
Authority: TW
Inventors: 應華; 劉佳建; 付雅媛; 張玲; 張昊穎; 孫嘉康; 張連山; 陶維康; 孫飄揚; 胡齊悅
Original assignee: 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司; 上海恆瑞醫藥有限公司
Priority date: 2016-02-05
Filing date: 2017-02-03
Publication date: 2017-08-16
Also published as: CA3013254A1; EP3412688A1; CN107531797A; EP3412688A4; WO2017133673A1; AU2017214132A1; US20190315886A1; CN107531797B; RU2018129180A3; RU2018129180A; JP2019510474A; BR112018015090A2; MX2018009264A

Abstract

本發明涉及凝血酶抗體、其抗原結合片段及醫藥用途。進一步地，本發明涉及包含該凝血酶抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含凝血酶抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗凝藥物的用途。特別地，本發明涉及一種人源化的凝血酶抗體在製備用於治療凝血酶介導的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

凝血酶抗體、其抗原結合片段及醫藥用途

本發明涉及凝血酶抗體以及其抗原結合片段，進一步地，本發明涉及包含所述凝血酶抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，本發明還涉及包含所述凝血酶抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗凝藥物的用途。

血液凝固是防止受損血管出血(止血)的重要過程。然而，阻塞血液流經血管(血栓形成)或脫落後沉積在體內其他部位的血管(血栓栓塞)的血凝塊對健康是嚴重的威脅。血栓症(如急性心肌梗塞(AMI)、靜脈血栓塞等)是一類嚴重危及人類健康及生命的心血管疾病。世界衛生組織2008年統計，到目前，心血管發病及死亡率已經躍居第一位。世界每年心血管病死亡人數約1733萬人，占死亡總數30%，中國心血管患者2.9億人，每年死亡約350萬人，占總死亡原因41%。2010年全球疾病負擔研究(GBD)統計，中風是我國居民第一大死因。所以近年來，研究有效的治療心血管疾病的藥物及方法引起了人們越來越多的關注。目前，一些抗凝血療法可以治療病理學血液凝固，例如使用傳統藥物肝素、小分子肝素或華法林，或者使用直接凝血酶抑制劑達比加群酯(Dabigatran)等。這些療法的普遍缺陷是增加出血風險。許多抗凝藥物起效劑量(阻止血栓形成)和安全劑量(最高無出血風險)之間的窗口不夠大，考慮到個體病人的反應差異，該視窗將進一步縮小。以凝血酶為靶點，用凝血酶拮抗劑來抑制血栓的生成即是臨床治療血栓的方法之一。

凝血反應是一個複雜的信號級聯過程，凝血酶(Thrombin)在其中佔有核心地位。凝血酶將循環系統的纖維蛋白原分解為纖維蛋白單體(可聚合形成纖維蛋白，血液凝塊的纖維基質)，對細胞也有很多直接調控。作為一種絲胺酸蛋白酶，它觸發血小板發生形變，釋放血小板活化劑ADP、血清素和血栓烷A2，以及趨化因子和生長因子。除此以外，還促進黏附分子P-選擇素和CD40配體遷移到血小板表面，進而啟動整合素aIIb/b3。後者結合纖維蛋白原和血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)，進而介導血小板的聚集。凝血酶還刺激血小板表面的促凝血活性，反過來促進凝血酶的表達。在內皮細胞的培養中，凝血酶促進vWF的釋放，細胞質膜的P-選擇素的出現和趨化因子的產生。這些反應被認為觸發體內血小板和白細胞與內皮細胞表面的結合。內皮細胞隨即改變形狀，內皮細胞層通透性增加。這些反應被預計將促進血漿蛋白的局部滲出，促進水腫。在非內皮組織中，凝血酶藉由作用於平滑肌細胞引起血管收縮。在成纖維細胞或血管平滑肌細胞的體外培養中，凝血酶調節細胞因子的產生並促進有絲分裂，在T淋巴細胞中它觸發鈣信號和其他的反應。這些細胞反應表明凝血酶將組織損傷與止血過程、炎症反應、甚至加強免疫應答的機體調控關聯在了一起。這些細胞反應也提出了一種可能性：除了組織受損外，內皮細胞和其他類型細胞的凝血酶可能在白細胞外滲，血管重塑和/或血管生成中也扮演了一定的角色。因此，凝血酶成為了一個極具潛力的，新的抗凝血抗栓靶標。

分離的抗凝血酶抗體分子可在體內抑制凝血酶，而不促進或大幅促進出血(bleeding)或溢血(haemorrhage)，即該抗體分子不抑制或大幅抑制對血管損傷的正常生理反應(即止血)。例如，止血不會被抗體分子抑制或會被其最低程度地抑制(即微小程度地抑制，不會影響病人的健康或需要進一步干預)。出血不會被抗體分子增加或會被其最低程度地增加。

儘管目前已有少量抗凝血酶抗體的專利公開，如WO2013123591、WO2014153195、WO2014202992和WO2014202993，但到目前為止，還沒有抗凝血酶抗體藥物上市或進入臨床研究，有必要進一步開發一種新的抗凝血酶抗體進行相關的臨床研究和應用。本發明即提供一種親和力高，對血栓生成具有顯著抑制活性的新型凝血酶抗體。

本發明提供一種凝血酶抗體或其抗原結合片段，其包含任意1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少 95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；其中該SEQ ID NO：21如通式(I)所示：DHYX₁G X₂SYVFD X₃ (I)；其中X₁選自H、I、L或M；X₂選自N或A；X₃選自Y、S、L或T。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該通式(I)SEQ ID NO：21的序列選自：DHYHGNSYVFDY SEQ ID NO：9；DHYIGASYVFDY SEQ ID NO：23；DHYLGNSYVFDS SEQ ID NO：24；DHYLGNSYVFDL SEQ ID NO：25；或DHYMGNSYVFDT SEQ ID NO：26。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其功能片段。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區進一步包含鼠源κ鏈或鼠源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者進一步包含鼠源λ鏈或鼠源λ鏈變體的輕鏈FR區；和/或其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段的抗體重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或進一步包含IgG2或其變體的重鏈FR區、或進一步包含IgG3或其變體的重鏈FR區。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：5的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：6的輕鏈可變區序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恒定區、或者鼠源λ鏈或其變體的輕鏈恒定區；和/或其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或進一步包含IgG2或其變體的重鏈FR區、或進一步包含IgG3或其變體的重鏈FR區。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其功能片段。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其功能片段。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV3-23*04和hjh6.1的組合序列及其突變序列；其中該人源化抗體或其功能片段包含人種系重鏈IGHV3-23*04的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區及其突變序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段包含SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區序列，或與SEQ ID NO：13具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區序列；較佳為與SEQ ID NO：13的胺基酸序列具有0-10的胺基酸變化。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的重鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為該回復突變選自R87K,K98R,Q3K和S49A的胺基酸回復突變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：15所示的重鏈可變區序列，或與SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：15具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區序列；其中該SEQ ID NO：22如通式(II)所示：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYX₁G X₂SYVFD X₃WGQGTTVTVSS (II)；其中X₁選自H、I、L或M；X₂選自N或A；X₃選自Y、S、L或T。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該通式(II)SEQ ID NO：22的序列選自：SEQ ID NO：14,SEQ ID NO：27,SEQ ID NO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：30。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈模板IGKV1-39*01和hjk4.1的組合序列及其突變序列；其中該人源化抗體或其功能片段包含人種系輕鏈IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3區和hjk4.1的FR4區及其突變序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段包含SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區序列，或與SEQ ID NO：16具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區序列；較佳與所述SEQ ID NO：16具有0-10的胺基酸變化。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的輕鏈FR區序列有0-10個胺基酸的回復突變，較佳為該回復突變選自Y49S,T69K,K45R,L47I和F71Y的胺基酸回復突變。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的輕鏈可變區序列，或與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含(a)重鏈可變區序列，該重鏈可變區序列選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15以及與SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；和/或(b)輕鏈可變區序列，該輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18以及與SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中凝血酶抗體或其抗原結合片段包含選自人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區，較佳為包含人源IgG4或其變體的重鏈恒定區，最佳為包含SEQ ID NO：19所示的恒定區；該凝血酶抗體或其抗原結合片段的輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的恒定區，最佳包含SEQ ID NO：20所示的恒定區。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。

在本發明另一個較佳的實施方案中，本發明所述凝血酶抗體或抗原結合片段，其結合一個或多個選自凝血酶的R70，Y71，E72，R73，N74，I75和Y114的殘基；較佳的，其進一步結合凝血酶的第9、24、60、62、64、66、69、78和113位的殘基。

本發明進一步提供一種分離的單株抗體或其抗原結合部分，其結合一個、二個、三個、四個、五個、六個或七個選自凝血酶的R70，Y71，E72，R73，N74，I75和Y114的殘基；較佳的，其進一步結合凝血酶的第9、24、60、62、64、66、69、78和113位的殘基。

本發明進一步提供一種醫藥組成物，其含有治療有效量的如上所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

本發明進一步提供一種編碼如上所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段的DNA分子。

本發明進一步提供一種如上所述的DNA分子的表達載體。

本發明進一步提供一種如上所述的表達載體轉化的宿主細胞，所述宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細胞，更佳哺乳動物細胞。

本發明進一步提供一種如上所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段或如上所述的醫藥組成物，在製備用於治療凝血酶介導的疾病或病症的藥物中的用途，其中所述的疾病或病症較佳為血栓性疾病(其包括血栓形成和血栓栓塞)；更佳為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病；最佳為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。

可以使用本發明的抗體診斷的示例性疾病包括血栓性疾病(其包括血栓形成和血栓栓塞)，其包括以下的任何一種或多種：靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病。

在一方面中，本發明提供治療或預防個體中的高膽固醇血症和/或至少一種以下症狀的方法：靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化，該方法包括向該個體施用有效量的抗凝血酶抗體。本發明還提供有效量的拮抗胞外或迴圈凝血酶的抗凝血酶抗體在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或預防個體的血栓形成和/或至少一種以下症狀：肺栓塞、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。

在一方面中，本發明用於檢測或測定人凝血酶的試劑，該試劑包含上述抗體或其抗原結合片段。

第1圖顯示抗凝血酶抗體CH-1601對人凝血酶酶活的影響；資料結果顯示CH-1601與凝血酶結合後並不影響其對受質S2228的酶解活性；第2圖顯示本發明抗凝血酶抗體對人凝血酶酶活的影響；資料結果顯示凝血酶抗體H1601-008與凝血酶結合後並不影響其對受質S2228的酶解活性；第3圖顯示不同濃度凝血酶抗體對正常人血漿APTT值的影響；資料結果顯示隨著抗體CH-1601和h1601-008濃度的增加，正常人血漿的APTT值也有所延長；h1601-008在最高濃度3200nM時，APTT值的增加也達到28.7秒的峰值；第4圖顯示H1601-008靜脈注射對猴AV-shunt靜脈血栓形成的影響；第5圖顯示本發明抗體對猴血漿的APTT值的影響。

第6圖顯示純化抗體H1601-008被木瓜蛋白酶切割。

第7圖顯示Fab的LCDR1,LCDR2,LCDR3,-HCDR3與凝血酶緊密結合的晶體結構圖。

第8圖顯示凝血酶的R62,Y71，E72，R73,Y114殘基分別與Fab的四個環有氫鍵作用。

一. 術語

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其他技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恒定區，所述的輕鏈恒定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，所述的重鏈恒定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恒定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDE2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。

本發明的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，較佳為人源化抗體。

術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技術製備的對人凝血酶的單克隆抗體。製備時用凝血酶抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源凝血酶抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、 λ鏈或其變體的輕鏈恒定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恒定區。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恒定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤细胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恒定區基因，將鼠可變區基因與人恒定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中，該凝血酶嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區。該凝血酶嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區，或者使用胺基酸突变(如YTE突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於携带大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的参考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A. 等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對所述的人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本發明的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。在本發明一個較佳的實施方案中，該凝血酶人源化抗體中鼠的CDR序列選自SEQ ID NO：7,8,9,10,11或12；人的抗體可變區框架經過設計選擇，其中該抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列，來源於人種系重鏈IGKV1-39*01和hjk4.1的組合序列；其中所述抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列，來源於人種系重鏈IGHV3-23*04和hjh6.1的組合序列。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。

CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的凝血酶抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人凝血酶抗體或其抗原結合片段的参予抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中發揮重要作用。

術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，凝血酶)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')₂片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；参見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1， IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。所述6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。

本文中使用的術語“抗體構架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作该可變結構域的抗原結合环(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，凝血酶分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-7M，例如大約小於10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的親和力(KD)結合。

術語"KD"或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本發明的抗體以小於大約10^-7M，例如小於大約10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合凝血酶，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。

本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關系中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增强子有效地連接至該編碼序列。

術語“載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質體”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA 環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而随宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人凝血酶或其片段免疫，所得到的抗體能被複性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因資料庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。

本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fe區的高度保守N端位點。藉由表達與人凝血酶特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍幹。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病症狀，而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其他專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其他胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。

“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括親代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程式或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列資訊，使得可以設計寡核苷酸引物；這些引物在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引物的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質體序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，所述方法包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

二. 實施例與測試例

以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子克隆手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1：凝血酶抗原及檢測用蛋白的製備

1、相關凝血酶及凝血酶原序列

編碼人凝血酶原(h-prothrombin)序列、小鼠凝血酶原(m-prothrombin)序列和食蟹獼猴凝血酶原(cyno-prothrombin)序列由CRO公司上海旭冠生物科技發展有限公司合成(以上凝血酶原蛋白均由本發明設計模版序列)，經過一步PCR在3’端帶上His或Flag編碼序列後，帶His標籤的人凝血酶原(h-prothrombin-his)，帶Flag標籤的人凝血酶原(h-prothrombin-flag)，帶His標籤的小鼠凝血酶原(m-prothrombin-his)和帶His標籤的食蟹獼猴凝血酶原(cyno-prothrombin-his)分別克隆到pTT5載體上(Biovector，Cat#：102762)，在HEK293E細胞內實現暫態表達。重組表達得到的凝血酶原(prothrombin)藉由初步純化和體外啟動得到thrombin，並經過進一步純化，得到的帶Flag標籤的人凝血酶(h-thrombin-flag)用於免疫，帶His標籤的人凝血酶(h-thrombin-His)，帶His標籤的小鼠凝血酶(m-thrombin-his)和帶His標籤的食蟹獼猴凝血酶(cyno-thrombin-his)用於體外篩選。

SEQ ID NO：1帶Flag標籤(DYKDDDDK)的人凝血酶原

SEQ ID NO：2帶His標籤(HHHHHH)的人凝血酶原

SEQ ID NO：3帶His標籤的食蟹獼猴凝血酶原

SEQ ID NO：4帶His標籤的小鼠凝血酶原

注：序列中雙下劃線部分為凝血酶序列，序列中單下劃線部分為相應標籤序列。

2．凝血酶原相關重組蛋白的純化、體外啟動，凝血酶相關重組蛋白以及雜交瘤抗體、重組抗體的純化

1)．帶His標籤的人凝血酶原、帶His標籤的小鼠凝血酶原和帶His標籤的食蟹獼猴凝血酶原的純化步驟：

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質。用PBS緩衝液(pH 7.4)平衡鎳管柱，沖洗2-5倍管柱體積，將上清樣品以一定流速上Ni Sepharose excel管柱。用PBS緩衝液沖洗管柱，至A₂₈₀讀數降至基線，再用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液，最後用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脫目的蛋白，並收集洗脫峰。收集的洗脫液濃縮後用脫鹽管柱將樣品緩衝液換成PBS溶液，以備後續體外啟動和進一步純化。

2)．帶Flag標籤的人凝血酶原重組蛋白的純化步驟：

將樣品高速離心去除雜質，並濃縮至適當體積。利用0.5×PBS(pH 7.4)平衡flag親和管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將除雜後的細胞表達上清樣品上管柱。用0.5×PBS沖洗管柱，至A₂₈₀讀數降至基線。用PBS沖洗管柱，沖洗雜蛋白，並收集。用含有100μg/ml 3xFlag多肽的TBS緩衝液洗脫目的蛋白，並收集，以備後續體外啟動和進一步純化。

3)．凝血酶原相關重組蛋白的體外啟動以及啟動後凝血酶相關蛋白的進一步純化：

經過上述初步親和層析(鎳管柱或Flag親和管柱)得到的凝血酶原，以品質比100：1與Ecarin酶混合均勻後於室溫孵育過夜。啟動後的樣品高速離心去除沉澱後，用離子交換管柱和分子排阻色譜法SEC做進一步純化。

3.1)離子交換

帶His標籤的人凝血酶、帶His標籤的小鼠凝血酶、帶His標籤的食蟹獼猴凝血酶用陽離子交換柱SP HP管柱來純化，帶Flag標籤的人凝血酶用陰離子交換管柱Q HP管柱進一步純化。陽離子交換選用緩衝液A為10mM PB,pH6.8緩衝液，緩衝液B為10mM PB,pH6.8，1M NaCl緩衝液，陰離子交換選用Buffer A為10mM Tris-HCl,pH8.5緩衝液，緩衝液B為10mM Tris-HCl,pH8.5，1M NaCl緩衝液。

離子交換管柱預先用5個管柱體積的緩衝液A緩衝液平衡，將換至緩衝液A緩衝液的啟動後凝血酶樣品以一定流速上樣，上樣結束後再以緩衝液A緩衝液平衡管柱至A280吸收值到基線。用緩衝液B緩衝液在20個管柱體積時間內從0%上升到80%的濃度梯度洗脫，收集各洗脫峰，經過SDS-PAGE鑒定目的蛋白所在組分，並進一步藉由質譜和肽圖驗證。

3.2)分子排阻色譜

SEC管柱(superdex75)預先用PBS(pH 7.4)平衡，樣品上樣後用PBS作為流動相洗脫，收集各洗脫峰，經過SDS-PAGE鑒定目的蛋白所在組分，並進一步藉由質譜和肽圖驗證。

3.3)融合瘤，重組抗體的純化

將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，融合瘤表達上清用Protein G管柱，重組抗體表達上清用Protein A管柱進行純化。用PBS(pH 7.4)沖洗管柱\，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0中和。洗脫樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。

實施例2：抗人凝血酶融合瘤單株抗體的製備

1．免疫

抗人凝血酶單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL 白小鼠，雌性，6週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原為帶Flag標籤的人凝血酶(SEQ ID NO：1雙下劃線所示)。

免疫方案：用TiterMax® Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)與Thermo Imject® Alum(Thermo Cat No.77161)交叉免疫。抗原與佐劑(TiterMax® Gold Adjuvant)比例為1：1，抗原與佐劑(Thermo Imject® Alum)比例為3：1，50μg/隻(初次免疫)，25μg/隻(加強免疫)。抗原乳化後進行接種，時間為第0、14、28、42、56天。

第0天腹膜內(IP)注射50μg/隻的乳化後抗原。第14天皮下(sc)多點(一般背部6-8點)注射25μg/隻。第28，42天根據背部結塊和腹部腫脹情況，選擇背部或腹膜內注射抗原。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射50μg/只的生理鹽水配製的抗原溶液。

於第22，36，50，64天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體滴度。在4免以後，選擇血清中抗體滴度高並且滴度趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。

2．脾細胞融合

採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-8287^TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合好的融合瘤細胞以0.5-1×10⁶/ml的密度用MC 半固體完全培養基(含20%FBS、1×HAT、1×OPI和2% Methyl cellulose的RPMI-1640培養基)重懸，分裝於35mm細胞培養皿中，37℃，5% CO₂孵育7-9天。融合後第7-9天，根據細胞純株大小，挑取單細胞純株至加有200μl/well的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)的96孔細胞培養板中，37℃，5% CO₂培養3天進行ELISA檢測。

3．融合瘤細胞篩選

根據融合瘤細胞生長密度，用凝血酶結合ELISA方法進行融合瘤培養上清檢測(見測試例1)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞上清進行和凝血酶原結合的ELISA檢測(見測試例3)。陽性孔細胞及時進行擴增凍存保種和二到三次亞克隆直至獲得單細胞純株。

每次亞純株細胞均需進行凝血酶結合ELISA和凝血酶原結合ELISA檢測。藉由以上實驗篩選得到融合瘤純株mAb-1601，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。

4．融合瘤陽性純株序列測定

從陽性融合瘤中選殖序列過程如下。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScript^TM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序。得到的陽性純株mAb-1601的DNA對應的胺基酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示：融合瘤細胞獲得重鏈可變區： SEQ ID NO：5

融合瘤細胞獲得輕鏈可變區： SEQ ID NO：6

注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。

藉由實施例4對陽性純株mAb-1601進行分子選殖和表達純化，得到嵌合抗體CH-1601，針對人凝血酶、凝血酶原進行結合活性鑒定(測試例1和測試例2)。同時，檢測嵌合抗體CH-1601與猴屬的凝血酶的交叉結合活性(見測試例3)，與人凝血酶的親和力(見測試例6)，以及對人凝血酶酶活的影響(見測試例5)。檢測結果如下表2和圖1所示：

表2結果表明，CH-1601與不同種屬的凝血酶，包括人、猴凝血酶均有強的結合力，但不與鼠源凝血酶結合。第1圖結果表明，CH-1601與凝血酶結合後並不影響其對受質S2228的酶解活性。

實施例3. 鼠抗人凝血酶單株抗體的人源化

1.融合瘤純株mAb-1601人源化構架選擇

藉由比對IMGT人類抗體重輕鏈可變區種系基因資料庫和MOE軟體，分別挑選與mAb-1601同源性高的重輕鏈可變區種系基因作為模板，將這兩個鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。其中胺基酸殘基由Kabat編號系統確定並注釋。

鼠源抗體mAb-1601的人源化輕鏈模板為IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV3-23*04和hjh6.1，人源化可變區序列如下：>h1601-001(CDR graft)人源化重鏈可變區 SEQ ID NO：13

>h1601-001(CDR graft)人源化輕鏈可變區 SEQ ID NO：16

2.融合瘤克隆CH-1601的回復突變設計，見下表3。

注：如Q3K表示依照Kabat編號系統，將3位元K突變回Q。

Graft代表鼠抗體CDR植入人種系FR區序列。

突變後的具體序列舉例如下：h1601_VH.1B： SEQ ID NO： 14

h1601_VH.1D： SEQ ID NO： 15

h1601_VL.1A： SEQ ID NO：17

h1601_VL.1C： SEQ ID NO：18

回復突變後的輕重鏈可變區進行重新組合，獲得的抗體包含的輕重鏈可變區組合舉例如下：

上述可變區根據後面實施例4的製備方法進行抗體克隆和表達純化，並藉由測試例1的ELISA實驗檢測其與人凝血酶蛋白的結合活性。根據檢測結果選擇抗體進行下一步的體內體外活性檢測.

實施例4. 嵌合抗體以及人源化抗體的製備

抗體選用人重鏈IgG4/輕鏈kappa的恒定區與各可變區組合，在Fc段做了S228P突變來增加IgG4抗體的穩定性，也可選用本領域其他已知的突變來增加其性能。

重鏈恒定區： SEQ ID NO：19

輕鏈恒定區： SEQ ID NO：20

1.嵌合抗體的分子選殖

融合瘤篩選所獲得的候選抗體分子經過測序後，得到可變區編碼基因序列。以測序所得序列設計引物首尾引子，以測序基因為模板，經過PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG4恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建重組抗體全長表達質體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。

2.人源化抗體的分子選殖

人源設計之後的抗體序列，經過密碼子優化後產生人密碼子偏好的編碼基因序列，設計引子PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恒定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建人源化抗體全長表達質體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。

3.嵌合以及人源化抗體的表達與純化

分別表達抗體輕重鏈的質體以1：1.5的比例轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用100mM乙酸pH3.0洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0中和。洗脫樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。

實施例5. 抗原表位的確定

純化抗體H1601-008被木瓜蛋白酶切割(第6圖)，分離Fab片段，與人PPACK-凝血酶組合。其中，PPACK為凝血酶抑制劑，購自ApexBio。凝血酶為本專利SEQ ID NO：1中帶雙下劃線的序列。人PPACK-凝血酶-FAB複合物經結晶並用於結構分析。獲得的結構統計結果如下：解析度為Rfactor=23.4%，Rfree=27.2%，不對稱單元內有兩個複合物，Ramachandran：favoured=93.5%，異常值=0%。晶體結構顯示Fab的LCDR1,LCDR2,LCDR3,HCDR3與凝血酶緊密結合(第7圖)。

特別地，凝血酶的R62,Y71，E72，R73,Y114殘基分別與Fab的四個環有氫鍵作用(第8圖8)。本實施例中凝血酶殘基號的編號規則為從本發明所述凝血酶片段序列的N端到C端順序編號。

對抗體-凝血酶連接的PISA分析表明，複合物中總的隱藏表面積是803Å²

重鏈中的接觸殘基是(Kabat編碼)：100、102、103、104、105、107、109。其均在CDR中。

CDRL1-KASEDIYNRLA、CDRL2-GATSLET、CDRL3-QQYWSTPWT、CDRH3-DHYHGNSYVFDY(下劃線的殘基接觸)。CDRL被發現較為重要，其提供抗體上57.3%的隱藏表面積。輕鏈中的接觸殘基是：30、31、32、46、49、50、53、55、91、92、96。

凝血酶中的接觸殘基為：9、24、60、62、64、66、69、70、71、72、73、74、75、78、113、114。對隱藏表面積最重要的獨立貢獻為：肽段R70-Y71-E72-R73-N74-I75和Y114。

實施例6、h1601-008選擇活性提高

我們決定對h1601-008進行親和力成熟，在提高對thrombin親和力的前提下，盡可能降低或保持其對pro-thrombin的結合活性，以提高h1601-008對兩種分子之間的選擇性。

提高選擇活性採用M13噬菌體展示技術。採用codon-based引子(在引子合成過程中，單個密碼子都由野生型密碼子和NNK組成)在每個CDR引入突變，每個CDR都構建一個單獨的噬菌體展示文庫。根據CDR的長短，調整每個CDR需要摻入的NNK比例和需要文庫的庫容大小，具體方案見表5。

構建好的6個文庫經包裝成噬菌體後，進行淘篩：在液相與高濃度pro-thrombin預結合後，加入生物素化 Thrombin結合，鏈黴親和素捕獲，淘洗，洗脫，重新侵染大腸桿菌，進行下一個循環的淘篩。每一輪淘篩將生物素化Thrombin濃度降低2-5倍。3輪淘篩之後，每個文庫挑取單純株進行測序驗證。發現只有HCDR3有明顯的胺基酸富集，根據CDR區胺基酸殘基富集程度，挑選獲得部分克隆如aTM-1、aTM-2、aTM-4、aTM-7，構建全長Ig進行哺乳動物細胞表達。

所挑選的純株與h1601-008僅在HCDR3上有差異。相關的HCDR3通式及其相應重鏈可變區如下所描述。

篩選獲得的HCDR3序列通式如下：DHYX₁G X₂SYVFD X₃ SEQ ID NO：21；進而獲得相關的重鏈可變區序列通式如下： SEQ ID NO： 22；其中X₁選自H、I，L，M；X₂選自N，A；X₃選自Y、S、L、T；獲得的具體相關序列包括但不限於表6所述：

純株蛋白經純化後，利用biacore測定Thrombin和pro-thrombin的親合力。

結果顯示，選擇活性aTM-1提高了1.8倍(18.2/9.9)，對Thrombin的親合力提高明顯，同時對pro-thrombin也有一定提高。結果見表10。

以下用生化測試方法驗證本發明抗體性能及有益效果。

測試例1. 凝血酶抗體結合人凝血酶蛋白的ELISA實驗

抗凝血酶抗體的結合力藉由抗體與帶His標籤的人凝血酶的ELISA實驗來檢測。用生物素標記試劑盒(東仁化學，Cat No.LK03)標記的帶His標籤的凝血酶藉由與包被在酶標板中的鏈黴親和素結合，從而固定到96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和凝血酶的結合活性，具體實驗方法如下。

用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)緩衝液將鏈黴親和素(Sigma，Cat No.S4762-5MG)稀釋至5μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(PH7.4 PBS含1%BSA)稀釋至0.5μg/ml的生物素標記的帶His標籤的人凝血酶(SEQ ID NO：2雙下劃線所示)，置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板6次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度的本發明凝血酶待測抗體，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗人二次抗體(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育10-15min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算凝血酶抗體對人凝血酶的結合EC50值。結果如表7所示。

結果顯示本發明篩選得到的人源化抗體與人凝血酶蛋白有較高的結合活性。

測試例2. 凝血酶抗體結合人凝血酶原蛋白的ELISA實驗

凝血酶原是酶解活化得到凝血酶的前體。抗凝血酶原抗體的結合力藉由抗體與h-prothrombin的ELISA實驗來檢測，具體實驗方法如下。

用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)緩衝液將帶His標籤的人凝血酶原(SEQ ID NO：2)稀釋至10μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標板中，4℃放置過夜(16-18小時)。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時進行封閉。封閉結束後棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(PH7.4 PBS含1%BSA)梯度稀釋的本發明凝血酶待測抗體，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗人二次抗體(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育10-15min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算凝血酶抗體對人凝血酶原的結合EC50值。

測試例3. 抗凝血酶抗體與不同種屬凝血酶的交叉結合實驗

為檢測篩選到的凝血酶抗體對於猴屬來源的凝血酶的體外結合能力，食蟹獼猴凝血酶被用於進行體外結合檢測。

用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)緩衝液將His-tag antibody(GenScript，Cat No.A00174)稀釋至0.5μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標板中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(PH7.4 PBS含1%BSA)稀釋至0.5μg/ml的帶His標籤的食蟹獼猴凝血酶蛋白(SEQ ID NO：3雙下劃線所示)，置37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板6次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度本發明凝血酶待測抗體，放於37℃孵育箱孵育2小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入100μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗人二次抗體(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育10-15min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用NOVOStar酶標儀在波長450nm處讀取吸收值，計算凝血酶抗體對食蟹獼猴凝血酶的結合EC50值。結果見表8。

結果表明，本發明抗體h1601-008與猴凝血酶有強的結合力。

測試例4. BIAcore檢測凝血酶抗體親和力實驗

按照人抗捕獲試劑盒(Cat.# BR-1008-39，GE)說明書中所述的方法將人抗捕獲抗體共價偶聯於CM5生物傳感晶片(Cat.# BR-1000-12，GE)上，從而親和捕獲待測抗體，然後於晶片表面流經凝血酶抗原帶His標籤的人凝血酶，利用Biacore儀器即時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線，藉由擬合得到親和力數值。在實驗中每個循環解離完成後，用人抗捕獲試劑盒裏配置的再生溶液將生物晶片洗淨再生。結果見表9。

結果表明本發明抗體h1601-008、h1601-009與CH-1601一樣，對人凝血酶有較強的結合活性和親和力。

對經噬菌體展示技術(實施例6)篩選獲得的抗體進行親和力測試，所得結果見表10。

由上可知，藉由噬菌體展示技術篩選得到的新抗體，在Thrombin的結合活性方面有了很大的提高，選擇性也略有增高。

測試例5. 凝血酶抗體對凝血酶酶活的影響

本實驗藉由測試凝血酶對其受質S2228的酶解活性，檢測本發明抗體對凝血酶酶活的影響。

用pH7.4的PBS梯度稀釋帶His標籤的人凝血酶至濃度為100nM，25μl/孔，加入黑壁透明底96孔板中。用PBS把本發明凝血酶待測抗體梯度稀釋至濃度為2000nM-62.5nM(1：2梯度稀釋)，25μl/孔，也加入此板中。室溫孵育30-60分鐘後，用PBS稀釋S2228(用於檢測凝血酶活性的受質，吉爾生化(上海)有限公司合成)至濃度為4mM，50μl/孔，加入到上一步驟的板中。陰性對照為僅加入凝血酶，或僅加入S2228的對照孔。室溫孵育30分鐘後，用NOVOStar酶標儀在波長405nm處讀取吸收值。結果見圖2，其中凝血酶和S2228表示陰性對照孔測出的OD值，0.625：1，1.25：1，2.5：1，5：1，10：1，20：1表示待測抗體與凝血酶的不同莫耳比時測出的OD值。

第2圖結果表明，h1601-008與凝血酶結合後，並不影響其對受質S2228的酶解活性。

凝血酶抗體藥效學實驗

測試例6. 正常人血漿APTT實驗

本實驗藉由將正常人血漿與IgG和不同濃度的凝血酶抗體共孵育，測試本發明抗體對APTT值(activated partial thromboplastin time，活化部分凝血活酶時間)的影響。

IgG為陰性對照，即利用傳統的親和層析方法如ProteinA純化獲得的人免疫球蛋白；h1601-008為本發明不同濃度待測抗體。

實驗結果如第3圖所示，隨著抗體CH-1601和h1601-008濃度的增加，正常人血漿的APTT值也有所延長。h1601-008在最高濃度3200nM時，APTT值的增加達到28.7秒的峰值(表11)。

測試例7. 食蟹猴動靜脈吻合模型

16隻健康食蟹猴(雌雄各半，海南金港生物技術股份有限公司提供)在實驗室環境中適應兩週，稱重，根據體重均衡分成4組，每組4隻。用舒泰進行麻醉，之後再追加戊巴比妥進行深度麻醉。術前對不同組分別緩慢下肢靜脈推注本發明抗體藥物及對照藥物(藥物及劑量見表12)。以下步驟均在37℃恒溫手術臺上操作。在腹股溝下手術分離出股動靜脈，先做左側再做右側。手術動靜脈插管。插管固定好之後，放開動脈夾(放開左側動脈夾時間為給藥後15分鐘，右側的時間為給藥後25分鐘)並同時開始計時，血流持續15分鐘。用止血鉗或者血管夾夾住插管的兩端防止栓子脫落，取出矽膠管放入有生理鹽水的培養皿，然後用手術剪取出帶有血栓的促凝線，在擦手紙上兩端各吸水3秒，後精密電子稱稱重，並算出血栓的淨重。

實驗結果如第4圖所示，在3mg/kg及6mg/kg的劑量下，H1601-008能顯著的抑制食蟹猴血栓的生成，與陰性抗體組(IgG-6mg/kg)的平均血栓重量相比較，具有統計學上的極顯著差異。

統計方法為One-way ANOVA及student t test。與IgG組相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

測試例8. CT ₂ 值的測定及治療窗口的估算

本實驗藉由將正常食蟹猴血漿與不同濃度的凝血酶抗體共孵育(參考測試6的方法)，測試本發明抗體對APTT值的影響。

實驗結果如圖5所示，隨著抗體H1601-008濃度的增加，正常猴血漿的APTT值也有明顯延長。H1601-008在最高濃度25600nM時，APTT值達到66.9秒的峰值(表13)。

測試例9：本發明凝血酶抗體的藥物代謝動力學測試

以食蟹猴為受試動物，用ELISA方法(見測試例4)檢測給藥後食蟹猴血清中的血藥濃度，用Winnolin軟體和EXCEL來計算受試藥物的t1/2及其主要參數。研究本發明的化合物在食蟹猴體內的藥物代謝動力學行為，評價其藥物動力學特徵。

實驗用食蟹猴，普通級，雄性，3-5歲，3.5-4.5公斤，成都華西海圻醫藥科技有限公司自養。飼養環境：普通區房間。實驗室環境適應性飼養不小於3天，12/12小時光/暗週期調節，溫度16-26℃，相對濕度40-70%。對食蟹猴進行分組，每組3隻。實驗當天，每隻食蟹猴分別靜脈注射受試藥物，給藥劑量為3mg/kg，10mg/kg。靜脈注射體積為10ml/kg，給藥速度2-4ml/分鐘。

給藥後採血時間點為0.25h,2h,4h,8h,1d,2d,3d,4d,7d,10d,14d,21d,28d,35d。每次約取血1mL，肝素鈉抗凝，冰盒暫存，2-8℃ 1800g離心10分鐘分裝，-70℃保存。

用ELISA方法檢測血清中的血藥濃度，用Winnolin軟體和EXCEL來計算受試藥物的t1/2及其主要參數，結果如下：本發明抗體的藥物代謝動力學參數見下表14：

結論：本發明抗體的藥物代謝性質良好。

<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司

<120> 凝血酶抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

<130> 2016

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 630

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h-prothrombin-Flag

<400> 1

<210> 2

<211> 628

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h-prothrombin-His

<400> 2

<210> 3

<211> 626

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cyno-prothrombin-His

<400> 3

<210> 4

<211> 624

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> m-prothrombin-His

<400> 4

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 5

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 6

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 7

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 8

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 9

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 12

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> h1601-001(CDR graft)，人源化重鏈可變區

<400> 13

<210> 14

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1601-004/h1601-005/h1601-006

<400> 14

<210> 15

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化重鏈可變區，h1601-007/h1601-008/h1601-009

<400> 15

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化序列輕鏈可變區，h1601-001/h1601-004/h1601-007

<400> 16

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化輕鏈可變區，h1601-002/h1601-005/h1601-008

<400> 17

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 回復突變後的人源化輕鏈可變區，h1601-003/h1601-006/h1601-009

<400> 18

<210> 19

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重鏈恆定區，S228P突變

<400> 19

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> kappa輕鏈恆定區

<400> 20

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 噬菌體展示技術篩選獲得的HCDR3序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa can be His, Ile,Leu or Met

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa can be Asn or Ala

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa can be Tyr,Ser,Leu or Thr

<400> 21

<210> 22

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 噬菌體展示技術獲得的重鏈可變區

<220>

<221> misc_feature

<222> (102)..(102)

<223> Xaa可為His,Ile,Leu或Met

<220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(104)

<223> Xaa可為Asn或Ala

<220>

<221> misc_feature

<222> (110)..(110)

<223> Xaa可為Tyr,Ser,Leu或Thr

<400> 22

<210> 23

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aTM-1重鏈可變區HCDR3序列

<400> 23

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aTM-2重鏈可變區HCDR3序列

<400> 24

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aTM-4重鏈可變區HCDR3序列

<400> 25

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> aTM-7重鏈可變區HCDR3序列

<400> 26

Claims

一種凝血酶抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；其中該SEQ ID NO：21如通式(I)所示：DHYX₁G X₂SYVFD X₃ (I)；其中X₁選自H、I、L或M；X₂選自N或A；X₃選自Y、S、L或T。
如申請專利範圍第1項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或與SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：21具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該通式(I)的序列選自：DHYHGNSYVFDY SEQ ID NO：9；DHYIGASYVFDY SEQ ID NO：23；DHYLGNSYVFDS SEQ ID NO：24；DHYLGNSYVFDL SEQ ID NO：25；或DHYMGNSYVFDT SEQ ID NO：26。
如申請專利範圍第1項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段包含分別如SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12具有至少95%序列同一性的胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其功能片段。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含鼠源κ鏈或鼠源κ鏈變體的輕鏈FR區、或者進一步包含鼠源λ鏈或鼠源λ鏈變體的輕鏈FR區；和/或其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈FR區、或進一步包含IgG2或其變體的重鏈FR區、或進一步包含IgG3或其變體的重鏈FR區。
如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：5的重鏈可變區序列和SEQ ID NO：6的輕鏈可變區序列。
如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含鼠源κ鏈或其變體的輕鏈恒定區、或者鼠源λ鏈或其變體的輕鏈恒定區；和/或其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含鼠源IgG1或其變體的重鏈恒定區、或進一步包含IgG2或其變體的重鏈恒定區、或進一步包含IgG3或其變體的重鏈恒定區。
如申請專利範圍第1項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其功能片段。
如申請專利範圍第1項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其功能片段。
如申請專利範圍第10項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的重鏈FR區序列來源於人種系重鏈IGHV3-23*04和hjh6.1的組合序列及其突變序列；其中該人源化抗體或其功能片段包含人種系重鏈IGHV3-23*04的FR1、FR2、FR3區和hjh6.1的FR4區及其突變序列。
如申請專利範圍第11項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段包含SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區序列，或與SEQ ID NO：13具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區序列。
如申請專利範圍第12項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段包含與SEQ ID NO：13的胺基酸序列具有1至10的胺基酸變化。
如申請專利範圍第11項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的重鏈FR區序列有1至10個胺基酸的回復突變。
如申請專利範圍第14項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該回復突變選自R87K,K98R,Q3K和S49A的胺基酸回復突變。
如申請專利範圍第11至15項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的包含SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：15所示的重鏈可變區序列，或與SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：15具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的重鏈可變區序列；其中該SEQ ID NO：22如通式(II)所示：EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMAWVRQAPGKGLEWVSNINSDGSSTYYLDSLKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLKAEDTAVYYCARDHYX₁G X₂SYVFD X₃WGQGTTVTVSS (II)；其中X₁選自H、I、L或M；X₂選自N或A；X₃選自Y、S、L或T。
如申請專利範圍第16項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該通式(II)的序列選自：SEQ ID NO：14,SEQ ID NQ：27，SEQ ID NO：28,SEQ ID NO：29,SEQ ID NO：30。
如申請專利範圍第10項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的輕鏈FR區序列來源於人種系輕鏈模板IGKV1-39*01和hjk4.1的組合序列及其突變序列；其中該人源化抗體或其功能片段包含人種系輕鏈IGKV1-39*01的FR1、FR2、FR3區和hjk4.1的FR4區及其突變序列。
如申請專利範圍第18項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段包含SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區序列，或與該SEQ ID NO：16具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區序列。
如申請專利範圍第19項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段與所述SEQ ID NO：16具有1至10的胺基酸變化。
如申請專利範圍第18項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的輕鏈FR區序列有1至10個胺基酸的回復突變。
如申請專利範圍第21項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該回復突變選自Y49S,T69K,K45R,L47I和F71Y的胺基酸回復突變。
如申請專利範圍第18至22項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段的包含SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所示的輕鏈可變區序列，或與SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少95%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈可變區序列。
如申請專利範圍第10項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體或其功能片段包含a)重鏈可變區序列，該重鏈可變區序列選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：15以及與SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：15具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；和/或b)輕鏈可變區序列，該輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18以及與SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；其中該SEQ ID NO：22如申請專利範圍第16項中所定義。
如申請專利範圍第9至24項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含選自人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區；該凝血酶抗體或其抗原結合片段的輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的恒定區。
如申請專利範圍第25項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含人源IgG4或其變體的重鏈恒定區。
如申請專利範圍第25項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段進一步包含SEQ ID NO：19所示的恒定區。
如申請專利範圍第25項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該凝血酶抗體或其抗原結合片段的輕鏈進一步包含SEQ ID NO：20所示的恒定區。
如申請專利範圍第1至28項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段是選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
如申請專利範圍第1至29項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其結合一個或多個選自凝血酶的R70，Y71，E72，R73，N74，I75和Y114的殘基。
如申請專利範圍第30項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段，其進一步結合凝血酶的第9、24、60、62、64、66、69、78和113位的殘基。
一種分離的單株抗體或其抗原結合部分，其結合一個或多個選自凝血酶的R70，Y71，E72，R73，N74，I75和Y114的殘基。
如申請專利範圍第32項所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，其進一步結合凝血酶的第9、24、60、62、64、66、69、78和113位的殘基。
一種醫藥組成物，其含有治療有效量的如申請專利範圍第1至31項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第32或33項所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
一種DNA分子，其編碼如申請專利範圍第1至31項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段或編碼如申請專利範圍第32或33項所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分。
一種表達載體，其含有如申請專利範圍第35項所述的DNA分子。
一種宿主細胞，其為用如申請專利範圍第36項所述的表達載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
如申請專利範圍第37項所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。
如申請專利範圍第37項所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞。
一種申請專利範圍第1至31項中任一項所述的凝血酶抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第32或33項所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分、申請專利範圍第34項所述的醫藥組成物或申請專利範圍第35項所述的DNA分子的用途，其用在製備用於治療凝血酶介導的疾病或病症的藥物。
如申請專利範圍第40項所述的用途，其中該疾病或病症為血栓性疾病。
如申請專利範圍第40項所述的用途，其中該疾病或病症為靜脈血栓形成和肺栓塞、動脈血栓形成、血栓形成引起的中風和末梢動脈形成、動脈粥樣硬化疾病、腦動脈病或末梢動脈病。
如申請專利範圍第40項所述的用途，其中該疾病或病症為靜脈血栓形成、血栓形成引起的中風和動脈粥樣硬化。
一種用於檢測或測定人凝血酶的試劑，該試劑包含如申請專利範圍第1至31項中任一項的抗體或其抗原結合片段或如申請專利範圍第32或33項所述的分離的單株抗體或其抗原結合部分。