TW201718001A - 豬物種中增強之免疫反應 - Google Patents

Abstract

本發明大體上是有關在豬物種個體中誘發免疫反應的方法。特別地，使用免疫調節劑組合物來引起免疫反應，以增強個體對抗傳染性病原的能力。

Description

豬物種中增強之免疫反應 交叉參考

依據35 U.S.C §119(e)，本申請案請求在2015年7月31日提申之美國臨時專利申請案第62/199,848號，並且命名為「ENHANCED IMMUNE RESPONSE IN PORCINE SPECIES」的權益，其內容以其整體引用的方式併入本文。

本發明大體上是有關在個體中藉由活化先天性免疫力來誘發免疫反應的方法。特別地，在豬物種成員中使用免疫調節劑組合物來刺激先天性免疫力。

本發明是有關使用免疫刺激性質體在豬物種個體中調節先天性免疫力的方法。免疫刺激性質體可包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4，或其組合的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含與SEQ ID NO：4的序列具有至少84%序列一致性的核酸分子。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含SEQ ID NO：1的序列。在某些態樣中，免疫刺激性質體可包含SEQ ID NO：4的序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含SEQ ID NO：2的序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含SEQ ID NO：3的序列。

在其他態樣中，免疫刺激性質體可由與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或其組合的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由與SEQ ID NO：4的序列具有至少84%序列一致性的核酸分子組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由SEQ ID NO：1的序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由SEQ ID NO：4的序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由SEQ ID NO：2的序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體可由SEQ ID NO：3的序列組成。

在一些態樣中，免疫刺激性質體較佳不包含編碼全長或功能性可選擇標記或可篩選標記的核酸序列。在其他態樣中，免疫刺激性質體包含編碼並非抗生素抗性基因之可選擇或可篩選標記的核酸序列。

本發明亦有關包含本文所述任一種免疫刺激性質體或DNA序列，以及醫藥上可接受之載體的藥物調配物。

本發明亦有關包含陽離子脂質體遞送載劑(vehicle)及本文所述任一種免疫刺激性質體或DNA序列的免疫調節劑組合物。

在一些態樣中，本發明是有關使用本文所述免疫刺激性質體或DNA序列的方法。合適的使用方法包括治療性投與給豬物種個體。這樣的治療投與包括個體(們)的預防性治療、後期預防性治療，以及感染後治療。

本發明是有關在個體中刺激或誘發免疫反應的方法。在一些態樣中，該等方法包括藉由向個體投與本文所述免疫調節劑組合物來刺激個體的免疫反應。在一些態樣中，該等方法包括藉由向個體投與本文所述免疫刺激性質體或DNA序列來刺激個體的免疫反應。在一些態樣中，免疫調節劑還可包含一生物劑或與該生物劑組合投與，該生物劑為例如疫苗。

本發明亦提供減少豬隻腹瀉的方法，包含向豬隻投與有效量的免疫調節劑組合物，其中該免疫調節劑包含陽離子脂質遞送載劑及不編 碼免疫原的核酸分子，其中在用大腸桿菌攻毒之後，該投與會減少該豬隻的腹瀉。

本發明亦提供增加豬隻增重的方法，包含向豬隻投與免疫調節劑組合物，該免疫調節劑包含陽離子脂質遞送載劑及不編碼免疫原的核酸分子，其中在用豬生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)攻毒之後，該投與會增加該豬隻的增重。

其他目的及特徵有一部分將會是明顯的而有一部分將在下面指出。

下面圖式構成本說明書的一部分，並且被納入以進一步說明本發明的某些態樣。可以透過參照這些圖式中的一或多個以及本文呈現之特定具體例的詳細說明而更充分理解本發明。

圖1顯示pMB75.6質體的圖譜(SEQ ID NO：2)；圖2顯示pGCMB75.6質體的圖譜(SEQ ID NO：1)；圖3顯示pLacZ75.6質體的圖譜(SEQ ID NO：4)；圖4以圖式圖解說明各治療組(Txt 1：只有疫苗；Txt 2：疫苗和200μg免疫調節劑組合物；Txt 3：疫苗和50μg免疫調節劑組合物；Txt 4：疫苗和10μg免疫調節劑組合物；以及Txt 5：稀釋劑(5%葡萄糖和水))在第0天(實心，淺灰色)、第3天(實心，深灰色)、第7天(斜紋)、第10天(黑色菱形)、第14天(實心，暗紅色)、第18天(實心，粉紅色)、第21天(實心，藍色)、第24天(實心，淺藍色)，以及第28天(實心，深藍色)對抗H1N1的凝血抑制幾何平均數；圖5以圖式圖解說明各治療組(Txt 1：只有疫苗；Txt 2：疫苗和200μg免疫調節劑組合物；Txt 3：疫苗和50μg免疫調節劑組合物；Txt 4：疫苗和10μg免疫調節劑組合物；以及Txt 5：稀釋劑(5%葡萄糖和水))在第0天(實心，淺灰色)、第3天(實心，深灰色)、第7天(斜紋)及第21天(實心，藍色)對抗H1N1的凝血抑制幾何平均數；圖6以圖式圖解說明各治療組(Txt 1：只有疫苗；Txt 2：疫苗和200μg免疫調節劑組合物；Txt 3：疫苗和50μg免疫調節劑組合物；Txt 4：疫苗和10μg免疫調節劑組合物；以及Txt 5：稀釋劑(5%葡萄糖和水))在第0天(實心，淺灰色)、第3天(實心，深灰色)、第7天(斜紋)、第10天(黑色菱形)、第14天(實心，暗紅色)、第18天(實心，粉紅色)、第21天(實心，藍色)、第24天(實心，淺藍色)，以及第28天(實心，深藍色)對抗H1N1的凝血抑制實際平均數；圖7以圖式圖解說明各治療組(Txt 1：只有疫苗；Txt 2：疫苗和200μg免疫調節劑組合物；Txt 3：疫苗和50μg免疫調節劑組合物；Txt 4：疫苗和10μg免疫調節劑組合物；以及Txt 5：稀釋劑(5%葡萄糖和水))在第0天(實心，淺灰色)、第3天(實心，深灰色)、第7天(斜紋)及第21天(實心，藍色)對抗H3N2的凝血抑制實際平均數；圖8以圖式圖解說明各治療組(Txt 1：只有疫苗；Txt 2：疫苗和200μg免疫調節劑組合物；Txt 3：疫苗和50μg免疫調節劑組合物；Txt 4：疫苗和10μg免疫調節劑組合物；以及Txt 5：稀釋劑(5%葡萄糖和水))在第21天血清轉化成H1N1以及H3N2分離株的豬隻百分率；圖9以圖式圖解說明各治療組豬隻在攻毒之後的每日平均姿態計分，治療組包括無疫苗/未攻毒(空心菱形)、無疫苗/經攻毒(實心方形)、Rx I疫苗加10μg免疫調節劑加攻毒(空心三角形)、Rx II疫苗加50μg免疫調節劑加攻毒(空心方塊)、Rx III疫苗加攻毒(星形)；圖10以圖式圖解說明各治療組豬隻從攻毒前到第10天的平 均體溫，治療組包括無疫苗/未攻毒(空心菱形)、無疫苗/經攻毒(空心方形)、Rx I疫苗加10μg免疫調節劑加攻毒(實心三角形)、Rx II疫苗加50μg免疫調節劑加攻毒(實心方塊)、Rx III疫苗加攻毒(星形)；圖11以圖式圖解說明各治療組在用毒性PRRS病毒攻毒之前與之後按照組別的平均體重，治療組包括無疫苗/未攻毒(實心菱形)、無疫苗/經攻毒(實心方形)、Rx I疫苗加10μg免疫調節劑加攻毒(空心三角形)、Rx II疫苗加50μg免疫調節劑加攻毒(十字)、Rx III疫苗加攻毒(星形)；圖12以圖式圖解說明從第-39天至第10天按照組別的平均增重，包括從第-39天至第0天的增重(黑色)、第-39天至第6天的增重(灰色)，以及第-39天至第10天(虛線)的增重；圖13以圖式圖解說明在第0天(黑色)、第6天(灰色)，以及第10天(虛線)按照組別的攻毒後平均體重；圖14以圖式圖解說明在第0至6天(黑色)、第0至10天(灰色)，以及第6至10天(虛線)的攻毒後增重；圖15以圖式圖解說明在第0至6天(黑色)、第0至10天(灰色)，以及第6至10天(虛線)的攻毒後增重百分率；圖16以圖式圖解說明按照組別的肺重量，組別包括未攻毒(實心方形)、經攻毒(空心菱形)、Rx I疫苗加10μg免疫調節劑加攻毒(實心與空心方形)、Rx II疫苗加50μg免疫調節劑加攻毒(空心方形)，以及Rx III(實心與空心菱形)；圖17以圖式圖解說明如體重百分率之按照組別的肺重量，組別包括無疫苗/未攻毒、無疫苗/經攻毒、Rx I疫苗加10μg免疫調節劑/攻毒、Rx II疫苗加50μg免疫調節劑/經攻毒，以及Rx III疫苗/經攻毒；圖18以圖式圖解說明從治療組分離而來的PRRS病毒，治療 組包括未攻毒(空心圓形)、無疫苗/經攻毒(實心方形)、Rx I疫苗加10μg免疫調節劑/經攻毒(實心三角形)、Rx II疫苗加50μg免疫調節劑/經攻毒(實心圓形)，以及Rx III疫苗/經攻毒(實心菱形)；圖19以圖式圖解說明按照組別分離的肺病毒效價；圖20以圖式圖解說明治療組基於肺泡隔增厚以及增厚分布的肺部病理學計分，治療組包括對照、攻毒、Rx I疫苗加10μg免疫調節劑/經攻毒、Rx II疫苗加50μg免疫調節劑/經攻毒，以及Rx III疫苗/經攻毒；圖21以圖式圖解說明各治療組中個別動物的干擾素效價，治療組包括無疫苗/無攻毒、無疫苗/攻毒、Rx I疫苗加10μg免疫調節劑/經攻毒、Rx II疫苗加50μg免疫調節劑/經攻毒，以及Rx III疫苗/經攻毒；圖22描繪被取出以評估微觀損傷之組織樣品的肺部區域；圖23以圖式圖解說明治療組相對於安慰劑治療豬隻的PRRSV肺病毒負荷；圖24顯示對照組與每一免疫調節劑治療組之間的巨觀肺部病理學，由每隻動物的肺葉總計分表示(第-1天、第0天，以及第2天)；圖25顯示對照組與每一免疫調節劑治療組的IFN-α血清含量(第-1天、第0天，以及第2天)；圖26以圖式圖解說明治療組在第-2、4、7、10和14天的血清病毒血症平均數，治療組包括安慰劑、25μg免疫調節劑、50μg免疫調節劑、75μg免疫調節劑，和陰性對照；圖27顯示治療組之間的肺部PRRSV病毒負荷平均數，治療組包括安慰劑、25μg免疫調節劑、50μg免疫調節劑、75μg免疫調節劑，和陰性對照；圖28顯示治療組之間的微觀肺損傷計分，治療組包括安慰 劑、25μg免疫調節劑、50μg免疫調節劑、75μg免疫調節劑，和陰性對照；及圖29顯示在治療組的斷奶豬隻中，與腸毒素大腸桿菌相關的腹瀉盛行率(F18菌毛、EAST1、STa和STb毒素，及AIDA黏附素基因)。

圖30顯示使用磁性細胞分離來分離的不同血球類型。

圖31顯示生理學相關濃度的IC-Ex.1刺激CD172a+細胞中的IFN-α表現

圖32以圖式顯示CD172a-細胞在用IC-Ex.1或用已知免疫刺激劑予以刺激後不會產生IFN-α。

圖33以圖式顯示TNF α不在CD172a-細胞中產生。

圖34A-D圖解說明在CD14+、兩種類型的傳統樹突細胞和漿細胞樣樹突細胞中，在分別用細胞培養基對照刺激之後的IFN-α產生。

圖35 A-D圖解說明在CD14+、兩種類型的傳統樹突細胞和漿細胞樣樹突細胞中，在分別用細胞培養基對照刺激之後的IFN-α產生。

圖36 A-D圖解說明在CD14+、兩種類型的傳統樹突細胞和漿細胞樣樹突細胞中，在分別用IC-Ex.1(100ng/mL)刺激之後的IFN-α產生。

圖37 A-D圖解說明在CD14+、兩種類型的傳統樹突細胞和漿細胞樣樹突細胞中，在分別用IC-Ex.1(10ng/mL)刺激之後的IFN-α產生。

圖38 A-D圖解說明在CD14+、兩種類型的傳統樹突細胞和漿細胞樣樹突細胞中，在分別用IC-Ex.1(100ng/mL)刺激之後的IFN-α產生。

圖39 A-D圖解說明在CD14+、兩種類型的傳統樹突細胞和漿細胞樣樹突細胞中，在分別用脂質體(100ng/mL)刺激之後的IFN-α產生。

圖40 A-D圖解說明在CD14+、兩種類型的傳統樹突細胞和漿細胞樣樹突細胞中，在分別用IC-Ex.1(10ng/mL)刺激之後的IFN-α產生。

圖41 A-D圖解說明在CD14+、兩種類型的傳統樹突細胞和漿細胞樣樹突細胞中，在分別用脂質體(10ng/mL)刺激之後的IFN-α產生。

圖42以圖式圖解說明產生IFN-α的細胞百分率。

圖43以圖式顯示由產生IFN-α的細胞所產生的平均螢光強度。

圖44以圖式顯示在用不同免疫刺激劑或免疫調節劑濃度刺激之後的比較性IFN-γ生產。

圖45圖解說明在用IC-Ex.1與已知免疫刺激劑刺激之後，CD172a+細胞中的IL-4產生。

圖46圖解說明在用IC-Ex.1與已知免疫刺激劑刺激之後，CD172a+細胞中的IL-1β產生。

圖47圖解說明在用IC-Ex.1與已知免疫刺激劑刺激之後，CD172a+細胞中的IL-6產生。

圖48圖解說明在用IC-Ex.1與已知免疫刺激劑刺激之後，CD172a+細胞中的IL-8產生。

圖49在用對照或IC-Ex.1治療之後，比較感染豬生殖及呼吸病毒的巨噬細胞百分率。

依據本發明，已發現能夠在接受者個體中誘發免疫反應的組合物，以及使用方法。特別地，本發明是有關核酸組合物或免疫調節劑組合物，及其用途。已發現到這樣的免疫調節劑組合物可以用於調節豬物種成員的免疫系統。本發明特別可用於治療並預防由微生物引起的傳染病，微生物為諸如(但不限於)病毒、細菌、黴菌、真菌、酵母菌，寄生蟲和技藝中已知的其他微生物。下文會更詳細地探討該等組合物及使用該等免疫調 節劑組合物的方法。

I. 組合物

如本文所述的那些可用於本發明中的組合物大體上能夠用作為傳染病的預防性療法、後期預防性療法或治療療法。此等組合物在本文中稱為免疫調節劑組合物。免疫調節劑組合物包括至少一種免疫刺激性質體或免疫刺激性DNA序列，其能夠在接受者個體中引起免疫反應。在一些態樣中，該免疫反應是先天性免疫反應。在一些態樣中，該免疫反應是先天性免疫反應和後天性免疫反應的組合。在一些態樣中，該等免疫調節劑組合物也可包括脂質體遞送載劑。

A. 核酸

在一些態樣中，本發明是有關用於治療或預防傳染病致病原的核酸分子。本文所述核酸分子可以包括在免疫刺激性質體(作為線性雙股或單股DNA)、胺基酸序列、核糖核酸(RNA)，或其組合中。在一些態樣中，本發明是有關核酸分子、載體和宿主細胞(活體外、活體內或離體)，其含有免疫刺激性質體或免疫刺激性DNA序列。

本文所述核酸分子高度富含CpG基序。在一些態樣中，核酸分子含有超過20%的CpG基序，超出在脊椎動物核酸序列中所發現到的CpG基序頻率。這樣的CpG基序包括免疫刺激性和非刺激性CpG基序。

在一些態樣中，本發明是有關免疫刺激性質體或DNA序列，其不包含抗生素抗性基因。質體可以是不含有任何可選擇或可篩選標記基因。例如，本文所述pGCMB75.6質體不包含任何全長或功能性可選擇或可篩選標記基因。於SEQ ID NO：1中提供pGCMB75.6的序列。

在一些態樣中，本文所述免疫刺激性質體較佳不包含編碼全長或功能性可選擇或可篩選標記的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性 質體不包含抗生素抗性基因。例如，質體不包含康黴素抗性基因。在一些態樣中，本文所述質體較佳不編碼免疫原。

在一些態樣中，免疫刺激性質體可包含編碼可選擇或可篩選標記基因的核酸序列，可選擇或可篩選標記基因並非抗生素抗性基因。例如，本文所述pLacZMB75.6質體包含LacZ基因作為可篩選標記。於圖3中提供pLacZMB75.6的圖譜，而pLacZMB75.6的核苷酸序列提供如SEQ ID NO：4。如圖3中所示，pLacZMB75.6類似於pGCMB75.6，但含有一個LacZ可篩選標記。

應理解，pMB75.6質體、pGCMB75.6質體或pLacZMB75.6質體的核苷酸序列可以在不明顯有害影響其免疫刺激性性質的情況下有某種程度的改變。在一些態樣中，本發明是有關包含與pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少89%序列一致性之核酸序列的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳包含與pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳包含pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)。

在一些態樣中，本發明是有關包含與pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)具有至少84%序列一致性之核酸序列的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳包含與pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、 至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳包含pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)。

在一些態樣中，本發明是有關包含與SEQ ID NO：2的序列具有至少80%序列一致性之核酸序列的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳包含與SEQ ID NO：2的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、在至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳包含SEQ ID NO：2的序列。

在一些態樣中，本發明是有關包含與SEQ ID NO：3的序列具有至少80%序列一致性之核酸序列的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳包含與SEQ ID NO：3的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、在至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳包含SEQ ID NO：3的序列。

在一些態樣中，本發明是有關一種由與pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少89%序列一致性之核酸序列組成的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳由與pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、 至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳由pGCMB75.6的序列(SEQ ID NO：1)組成。

在一些態樣中，本發明是有關一種由與pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)具有至少84%序列一致性之核酸序列組成的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳由與pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳由pLacZMB75.6的序列(SEQ ID NO：4)組成。

在一些態樣中，本發明是有關一種由與SEQ ID NO：2的序列具有至少80%序列一致性之核酸序列組成的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳由與SEQ ID NO：2的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳由SEQ ID NO：2的序列組成。

在一些態樣中，本發明是有關一種由與SEQ ID NO：3的序列具有至少80%序列一致性之核酸序列組成的免疫刺激性質體。免疫刺激性質體較佳由與SEQ ID NO：3的序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、 至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列一致性的核酸序列組成。在一些態樣中，免疫刺激性質體更佳由SEQ ID NO：3的序列組成。

本發明的另一個重要態樣提供能夠刺激免疫反應的免疫刺激性DNA序列或免疫刺激性質體，其包括在高度嚴苛條件下雜交至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核酸序列。合適的核酸序列包括那些同源的、實質上類似或等同於本發明的核酸者。在一些態樣中，同源核酸序列將與SEQ ID NO：1或各自互補序列具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%的序列相似性。在其他態樣中，同源核酸序列將與SEQ ID NO：4或各自互補序列具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%的序列相似性。在其他態樣中，同源核酸序列將與SEQ ID NO：2或各自互補序列具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%的序列相似性。在其他態樣中，同源核酸序列將與SEQ ID NO：3或各自互補序列具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%的序列相似性。序列相似性可以使用多種本技藝中已知的演算法(例如BLAST，描述於Altschul,S.F.,et al.,J.Mol.Biol.215：403-10,1990中)來計算。核酸可能因為遺傳密碼子簡併性而在序列 方面與上述核酸有所差異。大體上，一個參考序列將有18個核苷酸，更通常為30個或更多個核苷酸，並且可以包含該組合物的整個核酸序列以供進行比較。

在本文中預期可雜交至SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：4的核苷酸序列。嚴苛雜交條件包括例如在50℃或更高以及0.1X SSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)下雜交的條件。另一實例是在42℃下於50%甲醯胺、5X SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5X丹哈特氏(Denhardt’s)溶液、10%硫酸葡聚醣與20μg/ml變性、經剪切的鮭魚精子DNA的溶液中培育過夜，接著在0.1X SSC中在約65℃下洗滌。例示性嚴苛雜交條件是與上述特定條件至少約80%、85%、90%，或95%般嚴苛的雜交條件。其他嚴苛雜交條件為本技藝已知的，也可以用來鑑定本發明核酸的同源物(Current Protocols in Molecular Biology,Unit 6,pub.John Wiley & Sons,N.Y.1989)。

也可以使用本文所述DNA分子的突變體核苷酸，只要突變體包括保有如本文所述刺激先天性免疫反應之能力的核酸序列即可。這種突變的DNA序列通常差別在於一個或多個核苷酸。該序列變化可能是取代、插入，缺失或其組合。用於經選殖基因的誘變技術是本技藝中已知的。用於位點特異性誘變的方法可以在Gustin et al.,Biotechniques 14：22,1993；Barany,Gene 37：111-23,1985；Colicelli et al.,Mol.Gen.Genet.199：537-9,1985；以及Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,CSH Press 1989,pp.15.3-15.108中找到，且全部以引用的方式併入本文。歸納來說，本發明是有關核酸序列，及其變異體或突變體，它們能夠在個體中刺激先天性免疫反應。此外，本發明含括由所述核酸序列編碼的中介RNA，以及本文所述核酸序列編碼之任何所得胺基酸序列。

在一些態樣中，當免疫刺激性質體的核苷酸序列是由SEQ ID NO：1、2，3和4中提供之序列變化時，則在質體中的CpG二核苷酸較佳地保持不變。或者，如果質體的核苷酸序列改變，使得一個CpG二核苷酸被消除，則該質體的序列可以在另一位置處改變，使得CpG二核苷酸在質體中的總數保持不變。除了那些已經存在於pGCMB75.6或pLacZMB75.6核苷酸序列中的以外，可引入更多CpG二核苷酸至質體中。因此，舉例而言，本文所述免疫刺激性質體較佳包含至少約200個、至少約220個、至少約240個、至少約260個、至少約270個、至少約275個、至少約280個、至少約283個、至少約285個，或至少約288個CpG二核苷酸。例如，免疫刺激性質體可包含283個CpG二核苷酸。

在一些態樣中，當免疫刺激性質體的核苷酸序列是由本文提供的序列變化時，則在該質體中的CpG基序類型改變，以調節細胞溶質DNA監視分子的所得活化。例如，可以增加免疫刺激性CpG基序的數目，以增加對免疫刺激性質體/DNA的特定閾值具有反應性的特定細胞溶質DNA監視分子活化。透過更多實例，可以增加非免疫刺激性CpG基序的數目，以減少特定細胞溶質DNA監視分子的活化及/或增加其他DNA監視分子的活化。

特別是，本發明是有關包含本文所述任一種免疫刺激性質體或DNA序列及醫藥上可接受載體的醫藥調配物。

B. 免疫調節劑

在美國專利申請公開案第2012/0064151 A1號與第2013/0295167 A1號中描述與本文所述免疫刺激性質體一起使用的合適免疫調節劑組合物，這兩者的內容以整體引用的方式併入。

免疫調節劑組合物包含脂質體遞送載劑及本文所述免疫刺激性質體，或DNA序列中的至少一者。

合適的脂質體遞送載劑包含脂質組合物，其能夠將核酸分子遞送至待治療個體的組織。脂質體遞送載劑較佳能夠在個體體內維持一段充分時間的穩定，以遞送核酸分子及/或生物劑。例如，脂質體遞送載劑於接受者個體中穩定歷時至少約五分鐘、歷時至少約1小時，或歷時至少約24小時。

本發明脂質體遞送載劑包含脂質組合物，其能夠與細胞的質膜融合，以便將核酸分子遞送至細胞內。當核酸分子編碼一或多種蛋白質時，核酸：脂質體複合物較佳具有每微克(μg)遞送核酸每毫克(mg)總組織蛋白至少約1皮克(pg)表現蛋白的轉染效率。例如，核酸：脂質體複合物的轉染效率可以是每μg遞送核酸每mg總組織蛋白至少約10pg的表現蛋白；或每μg遞送核酸每mg總組織蛋白至少約50pg的表現蛋白。該複合物的轉染效率可以是低至每μg遞送核酸每mg總組織蛋白1毫微微克(fg)表現蛋白，其中上述量更佳。

本發明的較佳脂質體遞送載劑的直徑介於約100至500奈米(nm)之間。例如，脂質體遞送載劑的直徑可介於約150至450nm或介於約200與400nm之間。

合適的脂質體包括任何脂質體，例如習於技藝者所熟知的基因遞送方法。較佳的脂質體遞送載劑包括多層囊泡(MLV)脂質和擠壓脂質(extruded lipids)。製備MLV的方法在本技藝中是已知的。更佳的脂質體遞送載劑包括具有聚陽離子脂質組合物的脂質體(即，陽離子脂質體)及/或具有接合至聚乙二醇的膽固醇骨架的脂質體。例示性陽離子脂質體組合物包括，但不限於：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇、N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇、1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉鎓氯化物(DOTIM) 和膽固醇、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇，及其組合。用作為遞送載劑的最佳脂質體組合物包括DOTIM和膽固醇。

合適的核酸分子包括本文所述免疫刺激性質體中的任一者。編碼核酸序列編碼至少一部分蛋白質或肽，而非編碼序列不編碼蛋白質或肽的任何部分。根據本發明，「非編碼」核酸可包括一個轉錄單元的調控區，例如啟動子區。術語「空載體」可與術語「非編碼」交換使用，且特別是指在沒有蛋白質編碼部分的核酸序列，諸如不具有基因插入物的質體載體。本文所述質體編碼的蛋白質的表現對於引起免疫反應來說並非必要；因此質體不必包含任何可操作地連接至轉錄控制序列的編碼序列。然而，可以透過在組合物中納入編碼免疫原及/或細胞介素的核酸序列(DNA或RNA)得到更多優點(即，抗原特異性和增強的免疫力)。編碼免疫原及/或細胞介素的此等核酸序列可以被納入本文所述的免疫刺激性質體中，或者可以被納入組合物的單獨核酸(例如，一個單獨質體)中。

可使用技藝中的標準方法或如美國專利第6,693,086號(其內容以整體引用的方式併入)中所述方法將脂質體與本文所述免疫刺激性質體，或免疫刺激性DNA序列複合。添加至脂質體的適宜質體濃度包括有效遞送足量質體至個體中，使得全身性免疫反應得以被誘發的濃度。例如，約0.1μg至約10μg質體可以與約8nmol脂質體組合，約0.5μg至約5μg質體可以與約8nmol脂質體組合，或者約1.0μg質體可以與約8nmol脂質體組合。在組合物中，質體對脂質的比率(μg質體：nmol脂質)可以是至少約1：1以重量計的質體：脂質(例如，1μg質體：1nmol脂質)。例如，質體對脂質的比率可以是至少約1：5，至少約1：10或至少約1：20。本文所表示的比率均是基於組合物中陽離子脂質的量，而不是組合物中脂質的總量。在本發明的組合物中，質體對脂質的比率適當地為約1：1至約1：80以重量計的質 體：脂質；約1：2至約1：40以重量計的質體：脂質；約1：3至約1：30以重量計的質體：脂質；或約1：6至約1：15以重量計的質體：脂質。

C. 生物劑

除了脂質體遞送載劑和本文所述質體中的至少一者以外，本文所述免疫調節劑組合物中的任一者可進一步包含至少一種生物劑。

合適的生物劑是能有效地預防或治療疾病的藥劑。這樣的生物劑包括免疫增強蛋白、免疫原、疫苗，抗微生物劑或其任何組合。合適的免疫增強蛋白是那些已知會增強免疫力的蛋白質。透過一個非限制性實例的方式，細胞介素(其包括一個家族的蛋白質)是一種已知的免疫力增強蛋白家族。合適的免疫原是蛋白質，其會誘發體液性及/或細胞性免疫反應，使得向個體投與免疫原會發動對抗在個體組織內遭遇到之相同或類似蛋白質的免疫原特異性免疫反應。免疫原可包括由細菌、病毒，寄生蟲或真菌表現的致病性抗原。較佳的抗原包括從在個體中導致傳染病之生物衍生而來的抗原。根據本發明，免疫原可以是蛋白質的任何部分，天然存在的或合成衍生的，其誘發體液性及/或細胞性免疫反應。這樣，抗原或免疫原的大小可以是小到約5至12個胺基酸，且大至全長蛋白質，包括其間的任何大小。抗原可以是多聚體蛋白或融合蛋白。抗原可以是經純化的抗原。或者，免疫增強蛋白或免疫原可以是由免疫刺激性質體或由被納入免疫調節劑組合物的另一個核酸所編碼。當免疫增強蛋白或免疫原是由免疫調節劑組合物中的核酸分子所編碼時，將編碼免疫增強蛋白或免疫原的核酸序列可操作地連接至轉錄控制序列，使得免疫原在個體的組織中表現，藉此除了非特異性免疫反應外，還在個體體內誘發免疫原特異性免疫反應。篩選免疫原性(諸如病原體抗原免疫原性或細胞介素活性)的技術為那些習於技藝者所熟知且包括各種活體外與活體內分析。

當生物劑為疫苗時，該疫苗可以包括活的、傳染性、病毒性、細菌性，或寄生蟲疫苗或殺死的、滅活的、病毒性、細菌性或寄生蟲疫苗。一或多種疫苗、活的或殺死的病毒疫苗可以與本發明的免疫調節劑組合物組合使用。合適的疫苗包括那些在本技藝中已知用於豬物種者。

生物劑可以是抗微生物劑。合適的抗微生物劑包括：喹諾酮類，較佳是氟喹諾酮類；β-內醯胺；以及巨環內酯-林可醯胺-鏈黴殺陽素(macrolide-lincosamide-streptogramin；MLS)抗生素。

合適的喹諾酮類包括培諾沙星(benofloxacin)、賓氟沙星(binfloxacin)、西諾沙星(cinoxacin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)、達氟沙星(danofloxacin)、二氟沙星(difloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、恩諾沙星(enrofloxacin)、氟羅沙星(fleroxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、依巴沙星(ibafloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、麻保沙星(marbofloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、奧比沙星(orbifloxacin)、帕珠沙星(pazufloxacin)、普多沙星(pradofloxacin)、培氟沙星(perfloxacin)、沙拉沙星(sarafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、替馬沙星(temafloxacin)和妥舒沙星(tosufloxacin)。較佳的氟喹諾酮類包括環丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、莫西沙星，和普多沙星。合適的萘啶酮類(naphthyridones)包括萘啶酮酸。

合適的β-內醯胺包括青黴素(例如，阿莫西林(amoxicillin)、胺芐青黴素(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、芐星青黴素(benzathine penicillin)、芐青黴素(benzylpenicillin)、羧芐青黴素(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、拉維酸(co-amoxiclav)[即阿莫西林(amoxicillin)/克拉維酸(clavulanic acid)]、得克西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、甲氧西林(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林 (oxacillin)、青黴素V(phenoxymethylpenicillin)、必倍西林(piperacillin)、普魯卡因青黴素(procaine penicillin)、替莫西林(temocillin)，和替卡西林(ticarcillin))；頭孢菌素(例如頭孢克洛(cefaclor)、頭孢羅寧(cefalonium)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢立林(cefapririn)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢匹羅(cefpirome)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢喹肟(cefquinome)、頭孢他啶(ceftazidime)、頭孢噻呋(ceftiofur)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢胺芐(cephalexin)、頭孢噻吩(cephalothin)，和defotetan)；碳青黴烯類和青黴烯(例如多利培南(doripenem)、厄他培南(ertapenem)、法羅培南(faropenem)、亞胺培南(imipenem)和美羅培南(meropenem))；單內醯胺(例如胺曲南(aztreonam)、諾卡殺菌素A(nocardicin A)、煙草毒素-β-內醯胺(tabtoxinine-β-lactam)，和替吉莫南(tigemonam))；以及β-內醯胺酶抑制劑(例如克拉維酸、舒巴坦(sulbactam)，和他唑巴坦(tazobactam))。較佳的β-內醯胺類包括頭孢菌素，特別是頭孢唑啉。

合適的MLS抗生素包括克林黴素(clindamycin)、林可黴素(lincomycin)、吡利黴素(pirlimycin)，以及任何巨環內酯抗生素。較佳的林可醯胺抗生素是吡利黴素。

其他抗微生物劑包括胺基糖苷類、氯羥吡啶(clopidol)、地美硝唑(dimetridazole)、紅黴素(erythromycin)、新黴素B(framycetin)、呋喃唑酮(furazolidone)、鹵夫酮(halofuginone)、2-吡啶酮、氯苯胍(robenidine)、磺醯胺類、四環素類、甲氧芐啶(trimethoprim)、各種截短側耳素(pleuromutilin)(例如泰妙素(tiamulin)和萬尼黴素(valnemulin))，以及各種鏈黴素(如莫能菌素(monensin)、甲基鹽黴素(narasin)，和鹽黴素(salinomycin))。

II. 方法

本發明的一個目的是提供免疫調節劑組合物、免疫刺激性質體(或DNA序列)以及方法，其刺激免疫力並為未感染個體提供保護性免疫力、為已感染的個體提供保護性免疫力、為未感染個體提供增強的免疫力、為已感染個體提供增強的免疫力、為已感染個體提供治療性免疫力，或其組合。這樣，本發明組合物可以用於預防性保護個體或用於治療個體。本文所述方法包括向個體投與免疫刺激性質體或DNA序列，並且刺激個體體內的免疫系統。

A. 刺激個體之免疫系統的方法

本發明是有關在接受者個體體內刺激，或增強免疫系統的方法。該等方法包含向個體投與有效量的本文所述免疫調節劑組合物。在一些態樣中，免疫調節劑組合物在接受者個體中刺激免疫反應，而免疫反應有助於抵禦感染。在一些態樣中，免疫調節劑組合物活化細胞溶質DNA監視分子。在一些態樣中，當在疫苗之前投與、與疫苗共同投與、在接種疫苗之後投與，或與疫苗混合時，該免疫調節劑組合物提高了至少一種生物劑(諸如疫苗)的操作。在一些態樣中，該等方法為保護接受者個體免於傳染病以及治療患有傳染病的族群提供了嶄新的治療策略。在一些態樣中，該等方法當免疫調節劑與疫苗組合使用時，與使用沒有免疫調節劑組合物的疫苗相較之下，更為快速、更長久與更充分的保護以對抗疾病。

免疫反應可以在接受者個體中透過投與有效量的免疫調節劑組合物而被活化，該免疫調節劑組合物包括本文所述的任一種脂質體遞送載劑、本文所述任一種免疫刺激性質體(或DNA序列)，以及視情況選用組合本文所述任一種生物劑。如本文所用，「與…組合」應理解為表示生物劑可以與免疫調節劑混合或共同投與或單獨投與。這種單獨投與可以是在免疫調節劑投與之前或之後。還預期，組合投與可包括使用超過一次投與 的免疫調節劑或生物劑。此外，超過一種生物劑可以與免疫調節劑共同投與、在免疫調節劑之前投與、在免疫調節劑投與之後投與，或者與免疫調節劑同時投與。

B. 增進個體存活率的方法

本發明是有關增進豬物種成員之存活率的方法。增進存活率的方法包括向個體投與有效量的本文所述免疫調節劑組合物。在一些態樣中，與未接受免疫調節劑組合物的個體相比，該等方法提供了接受者個體增進的存活率。

C. 增進產量的方法

本發明是有關增進豬物種成員產量的方法。增進產量的方法包括向個體投與有效量的本文所述免疫調節劑組合物。在一些態樣中，與未接受免疫調節劑組合物的個體相比，該等方法提供了接受者個體增進的產量。評估產量增進的方法在本技藝中是已知的。習於技藝者將認知到，產量增進可以藉由比較接受該免疫調節劑組合物之個體與那些未接受免疫調節劑組合物之個體間的健康、重量、尺寸、肉質，以及其他參數來進行測量。

有效量的本文所述任一免疫調節劑組合物可以被投與給個體。有效量足以在接受者個體中活化免疫反應。測量活化的方法在本技藝中是已知的。此外，習於技藝者將認知到，有效量將取決於年齡、重量，個體物種和感染階段，以及本技藝中已知的其他因素。合適的有效量範圍可以從每位受試者約0.1μg至1,000μg。在一些態樣中，有效量範圍可為約0.1μg到約10μg、約0.1μg至約5μg、約0.5μg到約5μg、約0.25μg至約5μg、約0.05μg到約10μg、約5μg至約15μg、約10μg至約15μg、約10μg至約20μg、約20μg至約30μg、約30μg至約40μg、約40μg至約50μg、約50μg至 約70μg、約70μg至約90μg、約50μg至約100μg、約100μg至約150μg、約150μg至約200μg、約200μg至約250μg、約250μg至約300μg、約300μg至約350μg、約350μg至約400μg、約400μg到約450μg、約450μg至約500μg、約500μg至約550μg、約550μg至約600μg、約600μg至約650μg、約650μg至約700μg、約700μg至約750μg、約750μg至約800μg、約800μg至約850μg、約850μg至約900μg、約900μg至約950μg、約950μg至約1000μg。較佳地，在一些態樣中，有效量範圍為約0.5μg至約10μg。又較佳地，在其他態樣中，有效量範圍為約50μg至約100μg。且較佳地，在其他態樣中，有效量範圍為約40μg至約70μg。

D. 使用條件

本發明方法在個體體內活化免疫反應，使得個體受到保護免於會誘發免疫反應的疾病。如本文所用，詞組「保護免於疾病」是指減少疾病的症狀；降低疾病的發生；降低疾病的臨床或病理嚴重性；或減少引起疾病的病原體散布。保護個體可以指本發明的治療性組合物投與給個體時，防止疾病的發生、治癒，及/或減輕或減少疾病症狀、臨床徵象、病理學或病因的能力。這樣，保護個體免於疾病同時含括預防疾病發生(預防性治療)和治療患有疾病的個體(治療性治療)。術語「疾病」是指個體的正常健康狀態的任一種偏離，並且包括當出現疾病症狀時的一種狀態時，以及出現偏離(例如感染、基因突變、基因缺陷等)但症狀尚未顯露的病況。

本發明方法可用於預防疾病、刺激效應細胞免疫力對抗疾病、消除疾病、減輕疾病，並且防止因為原發性疾病發生所導致的繼發性疾病。

在一些態樣中，相較於投與疫苗本身，本文所述方法當與疫苗共同投與時可用於增進個體的先天性免疫反應。在一些態樣中，相較於 投與疫苗本身，本文所述方法當與疫苗共同投與時可用於增進個體的後天性免疫反應。通常疫苗在投與之後不會立即保護個體，因為它需要時間來刺激後天性免疫力。術語「增進」指在本發明中，在個體體內誘發先天性免疫反應直到疫苗開始保護個體及/或經由疫苗所提供的後天性免疫力來延長保護期。

在一些態樣中，本發明的方法包括投與組合物以保護免於各種各樣病原體的感染。投與的組合物可以或可以不包括誘發特定反應的特定抗原。可預期的是，本發明方法將保護接受者個體免於因為傳染性微生物劑所導致的疾病，傳染性微生物劑包括，但不限於病毒、細菌，真菌和寄生蟲。在一些態樣中，本發明方法包括投與化合物以減輕或降低因為感染物所致感染之症狀或嚴重性。習於技藝者將認知並理解到，免疫調節劑組合物，如本文所述，有效對抗眾多感染物(其不勝枚舉)。本文所提供的感染物是基於舉例為目的提供，且不受限於使用範疇來提供。

本文所述免疫調節劑組合物可供利用的例示性病況包括那些在個體體內由感染物引起的病況。此等病況可包括，但不限於放線桿菌病(Actinobacillosis)、非洲豬瘟、炭疽病(anthrax)、萎縮性鼻炎(atrophic rhinitis)、假性狂犬病(Aujeszky’s disease)、肉毒桿菌中毒(botulism)、布氏桿菌病(brucellosis)、慢性鼻炎(bullnose)、典型豬瘟、梭狀腸毒血症(clostridial enterotoxaemia)、大腸桿菌病(colibacillosis)、乳豬中的接觸性膿皮病(contagious pyoderma)、腦心肌炎(encephalomyocarditis)、腸病毒感染、滲出性表皮炎(exudative epidermitis)、手足口病(foot and mouth disease)、腐蹄病(foot rot)、格拉氏病(Glasser’s disease)、油豬病(greasy pig disease)、豬瘟(hog cholera)、包涵體性鼻炎(inclusion body rhinitis)、腸腺瘤病(intestinal adenomatosis)、關節病、鉤端螺旋體病(leptospirosis)、李斯特菌病 (listeriosis)(敗血性/內臟)、肝臟損傷、乳房炎-子宮炎-無乳症候群、惡性水腫、黴漿菌肺炎、黴漿菌多發性關節炎、黴漿菌多漿膜炎、豬的壞死性耳症候群、壞死性鼻炎、壞死性口炎、浮腫病、骨髓炎、外耳炎、小病毒感染、巴氏桿菌病(pasteurellosis)、玫瑰糠疹(pityriasis rosea)、胸膜肺炎、多發性關節炎、豬流行性腹瀉、豬生殖及呼吸症候群(PPRS)、增生性出血性腸病、假性結核病(pseudotuberculosis)、腎盂腎炎(pyelonephritis)、狂犬病、癬、輪狀病毒感染、沙門氏菌病(salmonellosis)、鏈球菌性腦膜炎(streptococcal meningitis)、鏈球菌腦膜炎和關節炎、豬痢疾(dysentery)、豬丹毒(erysipelas)、豬瘟、豬流感、豬痘、豬水泡病、他爾番病(talfan)、鐵縣病(teschen)、破傷風、傳染性胃腸炎、水泡性疾病、豬水泡性皮疹、水泡性口炎、嘔吐和消瘦症、白點腎，以及本技藝中已知的其他病況。

本文所述免疫調節劑組合物可供利用治療或預防之例示性感染物包括那些受到個體先天性免疫反應所衝擊之感染物。此等感染物可以包括，但不限於放線菌屬(Actinobacillus sp.)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、化膿放線桿菌(Actinomyces pyogenes)、阿爾法型皰疹病毒科(Alphaherpersvirinae)、口蹄疫病毒(Aphthovirus)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis)、貝他型皰疹病毒科(Betaherpesvirinae)、支氣管炎敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica)、流產布氏桿菌(Brucella abortus)、豬布氏桿菌(Brucella suis)、杯狀病毒(Calicivirus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter sp.)、豬腸彎曲桿菌(Campylobacter hyointestinalis)、黏膜彎曲桿菌(Campylobacter mucosalis)、心肌炎病毒(Cardiovirus)、產氣莢膜梭狀桿菌(Clostridial perfringens)、肉毒梭狀桿菌(Clostridium botulinum)、敗血梭狀桿菌(Clostridium septicum)、破傷風梭狀桿菌(Clostridium tetani)、冠狀病毒、巨 細胞病毒、腸病毒、豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、大腸桿菌、豬真細菌(Eubacterium suis)、丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、黃病毒科、壞死梭桿菌(Fusobacterium necrophorum)、血球凝集性腦脊髓炎病毒(Haemagglutinating encephalomyelitis virus)、豬副嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)、鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、賴利斯德病毒(Lelystad virus)、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、狂犬病病毒(Lyssavirus)、小孢癬菌(Microsporum nanum)、黴漿菌屬、豬肺炎黴漿菌、豬鼻黴漿菌(Mycoplasma hyorhinis)、豬關節滑膜黴漿菌(Mycoplasma hyosynoviae)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)、瘟疫病毒(Pestivirus)、小核糖核酸病毒屬、豬動脈炎病毒、豬環狀病毒(PCV)、豬腸病毒、豬流行性腹瀉病毒(PEDv)、豬皰疹病毒第1型、豬皰疹病毒第2型、豬小病毒、瘟疫病毒、彈狀病毒(Rhabdoviridae)、輪狀病毒(Rotavirus)、沙門氏菌屬(Salmonella sp.)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonella choleraesuis)、豬赤痢螺旋體(Serpulina hyodysenteriae)、螺旋體、葡萄球菌、豬葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、鏈球菌、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、豬痘病毒、豬流感病毒、披膜病毒科(Togaviridae)、未分類的DNA病毒、水泡性病毒(Vesiculovirus)、假性結核耶氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)，和本技藝中已知的其他感染物。

本文所述免疫調節劑組合物尤其可用於治療或預防由感染物所致的腸病況。此等病況包括影響個體消化/腸道系統的腸病況。此等腸病況包括，但不限於非洲豬瘟、典型豬瘟、梭狀腸毒血症、大腸桿菌病、手足口病、豬瘟、腸腺瘤病、壞死性口炎、浮腫病、豬流行性腹瀉、增生性出血性腸病、輪狀病毒感染、沙門氏菌病、豬痢疾、豬水泡性疾病、傳染性胃腸炎、豬水泡性皮疹、水泡性口炎，以及本技藝中已知的其他病況。

本文所述免疫調節劑組合物可供利用的例示性感染物包括那些受到個體先天性免疫反應所衝擊之感染物。此等感染物可以包括，但不限於但不限於放線菌屬、胸膜肺炎放線桿菌、豬放線桿菌、化膿放線桿菌、非洲豬瘟病毒、阿爾法型冠狀病毒、阿爾法型皰疹病毒、口蹄疫病毒、非洲豬瘟病毒(Asfivirus)、動脈病毒(Arterivirus)、炭疽桿菌、貝他型冠狀病毒、貝他型皰疹病毒、支氣管炎敗血性博德氏桿菌、豬痢疾短螺旋體(Brachyspira hyodysenteriae)、流產布氏桿菌、豬布氏桿菌、杯狀病毒、彎曲桿菌屬、豬腸彎曲桿菌、黏膜彎曲桿菌、心肌炎病毒、環狀病毒、典型豬瘟病毒、產氣莢膜梭狀桿菌、肉毒梭狀桿菌、敗血梭狀桿菌、破傷風梭狀桿菌、冠狀病毒、巨細胞病毒、腦心肌炎病毒、腸病毒、豬丹毒桿菌、大腸桿菌、豬真細菌、丹毒絲菌、大腸桿菌、黃病毒科、壞死梭桿菌、血球凝集性腦脊髓炎病毒、豬副嗜血桿菌、鉤端螺旋體、腎臟鉤端螺旋體血清型(Leptospira interrogans serovars)、賴利斯德病毒、單核細胞增生李斯特菌、狂犬病病毒、小孢癬菌、黴漿菌屬、豬肺炎黴漿菌、豬鼻黴漿菌、豬關節滑膜黴漿菌、多殺性巴氏桿菌、瘟疫病毒、小核糖核酸病毒屬、豬動脈炎病毒、豬腸病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬皰疹病毒第1型、豬皰疹病毒第2型、豬小病毒、豬生殖及呼吸症候群病毒、豬薩佩洛病毒(Porcine sapelovirus)、豬鐵士古病毒(Porcine teschorivus)、瘟疫病毒、狂犬病病毒、彈狀病毒、輪狀病毒、沙門氏菌屬、豬霍亂沙門氏菌、豬赤痢螺旋體、螺旋體、葡萄球菌、豬葡萄球菌、鏈球菌、豬鏈球菌、豬痘病毒、豬流感病毒、披膜病毒科、未分類的DNA病毒、水泡性病毒、假性結核耶氏菌，和本技藝已知的其他感染物。

本文所述免疫調節劑組合物尤其可用於治療或預防由感染物或癌症所致的病況。此等病況包括，但不限於放線桿菌病、非洲豬瘟、 炭疽病、萎縮性鼻炎、假性狂犬病、肉毒桿菌中毒、布氏桿菌病、慢性鼻炎、典型豬瘟、梭狀腸毒血症、大腸桿菌病、先天性CNS徵象、乳豬中的接觸性膿皮病、腦心肌炎、腸病毒感染、滲出性表皮炎、手足口病、腐蹄病、格拉氏病、油豬病、豬瘟、包涵體性鼻炎、腸腺瘤病、關節病、鉤端螺旋體病、李斯特菌病(敗血性/內臟)、肝臟損傷、乳房炎-子宮炎-無乳症候群、惡性水腫、黴漿菌肺炎、黴漿菌多發性關節炎、黴漿菌多漿膜炎、豬的壞死性耳症候群、壞死性鼻炎、壞死性口炎、浮腫病、骨髓炎、外耳炎、小病毒感染、巴氏桿菌病、玫瑰糠疹、胸膜肺炎、多發性關節炎、豬流行性腹瀉、豬生殖及呼吸症候群(PPRS)、增生性出血性腸病、假性結核病、腎盂腎炎、狂犬病、癬、輪狀病毒感染、沙門氏菌病、鏈球菌性腦膜炎、鏈球菌腦膜炎和關節炎、豬痢疾、豬丹毒、豬瘟、豬流感、豬痘、豬水泡病、他爾番病、鐵縣病、破傷風、傳染性胃腸炎、水泡性疾病、豬水泡性皮疹、水泡性口炎、嘔吐和消瘦症、白點腎，以及本技藝中已知的其他病況。

E. 投與

多種投與路徑可供選擇。選擇的特定模式，當然將取決於具體的選定生物劑、個體的年齡和整體健康狀況、待治療的具體病況和治療效力所需的劑量。本發明方法可以使用產生有效程度免疫反應活化而不引起臨床上無法接受之不利影響的任何投與模式來實施。該等組合物可以方便地以單位劑型存在並且可以透過任何技藝中熟知的方法來製備。

免疫調節劑組合物可以靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、乳房內、經皮、直腸內、黏膜、皮下、透過噴霧、口服、眼內、氣管內、鼻內、局部、經眼，或透過本技藝中已知的其他方法投與。在一個態樣中，皮下投與免疫調節劑。在另一個態樣中，肌肉內投與該免疫調節劑。在另 一個態樣中，該免疫調節劑作為噴霧投與。在另一個態樣中，可以口服投與該免疫調節劑。在另一個態樣中，可以皮下投與該免疫調節劑。

在一個態樣中，該免疫調節劑本身可以在攻毒(或感染)之前投與給個體。在另一個態樣中，該免疫調節劑本身可以在攻毒(或感染)之後投與給個體。在另一個態樣中，該免疫調節劑本身可以在攻毒(或感染)同時投與給個體。

在一些態樣中，該免疫調節劑組合物可以在攻毒之前與接種疫苗同時共同投與。在一些態樣中，該免疫調節劑組合物可以在攻毒(或感染)同時與接種疫苗在同時共同給與。在一些態樣中，共同投與可以包括在彼此相鄰兩個不同位點處投與接種疫苗及免疫調節劑至個體的相同大致位置中(即，在個體頸部的彼此相鄰處注射)、在大致相同位置處之個體的相反側(即，一個在頸部的一側)，或在同一個體的不同位置處。在一些態樣中，免疫調節劑組合物可以在接種疫苗與攻毒之前投與。在一些態樣中，免疫調節劑組合物可在接種疫苗之後但在攻毒之前投與。免疫調節劑組合物可以在攻毒後投與給在攻毒(或感染)之前已接種疫苗的個體。

習於技藝者將認知到，投與路徑可根據個體以及個體的健康狀況或狀態而改變。所提供的投與路徑是以示範為目的，並且在不受限制的情況下提供。

接種疫苗可在任何年齡執行。可以皮下、透過噴霧、經口、肌肉內、乳房內、皮內、經皮、直腸內、經黏膜、眼內、氣管內、鼻內、局部、經眼，或透過技藝中已知的其他方法投與疫苗。口服疫苗可以在飼料或水中投與。此外，可預期的是，本發明方法可根據常規接種疫苗時間表來使用。

免疫調節劑組合物也可經皮下、透過噴霧、經口、肌肉內、 乳房內、皮內、經皮、直腸內、經黏膜、眼內、氣管內、鼻內、局部、經眼，或透過技藝中已知的其他方法投與。例如，免疫調節劑組合物可肌肉內投與。或者，免疫調節劑組合物可經皮下投與。

免疫調節劑可在攻毒之前約1天至約14天，或在攻毒之後約1天至約14天被投與給個體。例如，免疫調節劑可以在攻毒前約1天至約7天或攻毒後約1天至約7天被投與。免疫調節劑適合在攻毒前1、2、3、4、5、6、7天或攻毒後1、2、3、4、5、6、7天被投與。

其他遞送系統可以包括時間-釋放、延遲釋放，或持續釋放遞送系統。此等系統可避免重複投與組合物，因而增加便利性。許多類型的釋放遞送系統是可用的且為技藝中具有通常知識者所熟知。它們包括基於聚合物的系統，例如聚(乳酸交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己內酯、聚酯醯胺、聚原酸酯、聚羥基丁酸以及聚酐。含有藥物的前述聚合物的微膠囊描述於例如美國專利第5,075,109號中。

遞送系統亦包括本身為脂質之非聚合物系統，脂質包括甾醇(例如膽固醇、膽固醇酯)，以及脂肪酸或中性脂肪(例如單-、二-和三甘油酯)；水凝膠釋放系統；矽橡膠系統；基於肽的系統；蠟塗料；壓縮錠劑，使用常規黏合劑和賦形劑；部分融合的植入物；以及類似物。具體實例包括，但不限於本發明的藥劑呈某個形式納入基質中的侵蝕系統，例如那些在美國專利第4,452,775號、第4,675,189號與第5,736,152號中所述者，以及擴散系統，其中活性組分以控制速率從聚合物滲入，如在美國專利第3,854,480號、第5,133,974號與第5,407,686號中所述。此外，可使用基於泵的硬體遞送系統，其中一些適於植入。

由於在上述組合物、產品及方法中可在不偏離本發明範疇的情況下進行改變，希望上述說明中以及下文實例中所包含的所有內容應被 解釋為說明性的而不具有限制意義。

定義

術語「有效量」指需要或足以實現期望生物學效果的數量。例如，用於治療或預防傳染病的有效量免疫調節劑是在暴露於微生物之後發展出免疫反應，從而使個體內的微生物數量減少且較佳根除微生物所必要的數量。任何特定應用的有效量可依據如下的因素而改變：待治療的疾病或病況、個體的大小，或疾病或病況的嚴重性。本技藝中具有通常技術者可憑經驗確定免疫調節劑的有效量而不需要過度實驗。

術語「細胞介素」是指一個免疫增強蛋白家族。細胞介素家族包括造血生長因子、介白素、干擾素、免疫球蛋白超家族分子、腫瘤壞死因子(TNF)家族分子及趨化介素(即調控細胞，特別是吞噬細胞之遷移和活化的蛋白質)。例示性細胞介素包括，但不限於介白素-2(IL-2)、介白素-12(IL-12)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)、干擾素α(IFN-α)以及干擾素γ(IFN-γ)。

術語「誘發」可與術語活化、刺激、產生或上調交替使用。

術語在個體中「誘發免疫反應」是指特異性地控制或影響免疫反應活性，且可包括活化免疫反應、上調免疫反應、增強免疫反應及/或改變免疫反應(例如透過誘發某型免疫反應，從而將個體體內的一個主要免疫反應類型從有害或無效轉換成有益或具有保護性)。

術語「可操作地連接」意指以分子在轉染(亦即轉形、轉導或轉染)至宿主細胞中時能夠被表現的方式，將核酸分子連接至轉錄控制序列。轉錄控制序列是控制轉錄的起始、延長和終止的序列。特別重要的轉錄控制序列是那些控制轉錄起始的序列，諸如啟動子、增強子、操縱子和抑制子序列。各種這樣的轉錄控制序列是習於技藝者已知的。較佳的轉錄 控制序列包括那些在禽類、魚類、哺乳動物、細菌、病毒，植物和昆蟲細胞中產生作用的序列。儘管本發明可使用任一種轉錄控制序列，但該等序列可以包括天然的轉錄控制序列，其與編碼免疫原或免疫刺激蛋白的序列自然締合。

術語「核酸分子」與「核酸序列」可交替使用，並包括DNA、RNA，或DNA或RNA的衍生物。該等術語還包括寡核苷酸，以及較大的序列(諸如質體，諸如本文所述免疫刺激性質體)，並且包括編碼蛋白質或其片段的核酸分子，還有包含調控區、內含子或其他非編碼DNA或RNA的核酸分子。通常，寡核苷酸具有約1個至約500個核苷酸的核酸序列，且更通常長度為至少約5個核苷酸。核酸分子可以衍生自任何來源，包括哺乳動物、魚類、細菌、昆蟲、病毒、植物、合成來源或其組合。核酸分子可以透過技藝中普遍已知的方法(諸如重組DNA技術(例如，聚合酶鏈反應(PCR)、擴增、選殖)或化學合成來製造。核酸分子包括天然的核酸分子及其同源物，包括但不限於天然對偶基因變異體和經修飾核酸分子，其中以此等修飾實質上不干擾核酸分子誘發可用於本發明方法中之免疫反應之能力這樣的方式插入、缺失、取代，或倒置核苷酸。核酸同源物可以使用多種習於技藝者已知的方法來生產(參見，例如Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press,1989)，其以引用的方式併入本文。

術語「可選擇標記」與「可選擇標記基因」意指編碼保護生物體之產物的基因或通常會殺死生物體或抑制其生長的條件，其中基因是從選擇劑(例如，抗生素)表現。可選擇標記基因是最常見的抗生素抗性基因(例如，康黴素抗性基因、胺芐青黴素抗性基因、氯黴素抗性基因、四環素抗性基因等)。因此，例如當大腸桿菌細胞進行轉形程序而引入編碼康黴素 抗性基因的質體，然後生長在含有康黴素的培養基之上或其中時，只有已成功攝入質體並表現康黴素抗性基因的大腸桿菌細胞會存活下來。術語「可選擇標記」與「可選擇標記基因」也包括編碼涉入化合物合成之酶的基因，該化合物對於生物體生長來說不可或缺。在引入不能合成必需化合物的營養缺陷型生物體時，這些基因允許生物體生長在已補充有必需化合物的培養基中。例如，因為在一個涉及離胺酸生物合成的酶突變或不存在，胺基酸離胺酸營養缺陷型的細菌細胞通常無法在未補充離胺酸的培養基上生長。當此等細菌進行轉形程序而引入編碼涉及離胺酸生物合成的酶的質體時，已成功攝入質體並表現酶的細菌將會在未補充離胺酸的培養基上生長而存活下來。術語「可選擇標記」與「可選擇標記基因」進一步包括允許毒物/解毒劑選擇的基因。例如，ccdB基因編碼結合至DNA迴旋酶的蛋白質，DNA迴旋酶對細胞分裂來說是必要的酶。在結合至DNA迴旋酶之後，ccdB基因產物削弱基因複製且引起細胞死亡。因此，表現ccdB基因產物的細菌無法存活下來。ccdA基因編碼充當ccdB基因產物的天然抑制劑的蛋白質(「解毒劑」)。因此，當在其細菌基因組中具有ccdB基因的細菌接受轉形程序而引入編碼ccdA基因產物的質體時，只有成功攝入質體並表現ccdA基因的細胞會存活下來。

術語「可篩選標記」與「可篩選標記基因」意指編碼一種產物的基因，該產物允許觀察者區別表現可篩選標記基因的細胞以及未表現可篩選標記基因的細胞。可篩選標記基因系統是本技藝中已知的，包括例如lacZ基因和編碼螢光蛋白的基因，螢光蛋白為諸如綠色螢光蛋白(GFP)、黃色螢光蛋白(YFP)、紅色螢光蛋白(RFP)、藍色螢光蛋白(BFP)，或青色螢光蛋白(CFP)。

如本文所用，術語「個體」意指豬科或豬物種，無論是豢養 或野生的。具體地，術語「個體」意指那些在商業上為了繁殖或產肉而飼養者。適宜豬個體包括，但不限於豬(swine)、肉豬(hog)、豬(pig)、母豬(gilt)、乳豬、斷奶豬、架子豬、山豬，和本技藝中已知的其他豬物種成員。在一些態樣中，個體可以被診斷為患有傳染病，可能處於傳染病風險下，或者可能正在經歷傳染病。個體可以是任何年齡，包括在子宮內、新生、少年、成年、中年或老年。

當介紹本發明的要素或其較佳具體例時，冠詞「一(a、an)」、「該(the)」和「該(said)」意欲表示有一或多個要素。術語「包含」、「包括」與「具有」意欲具有包容性，並且表示可以有所列要素之外的其他要素。

實例

提供了下面的非限制性實例以進一步圖例說明本發明。

實例1：當與商用死毒豬流感疫苗共同投與時，免疫調節劑複合物增強誘發凝血抑制抗體

本實例之目的在於評估當與商用死毒豬流感疫苗共同投與時，免疫調節劑對於誘發凝血抑制(HI)抗體的效用。

方法

現場接收三十五頭豬並放入五個欄舍(治療組T1、T2、T3、T4和T5)。將豬隻隨機分組以在每一治療組得到類似的體重。在第0天與第14天，T2至T4接受不同量的免疫調節劑與建議劑量的SIV商用疫苗。免疫調節劑和商用疫苗是透過皮下接種被投與至肩胛下區域中的淋巴結附近。T1只接受商用疫苗，而T5只接受稀釋劑。關於血清，除了豬ID 114在第18天以外，其餘豬隻在第0、3、7、10、14、18、21、24及28天針對血清來收集血液。處理血液以供血清使用並轉移至實驗室進行最後處理與凝血抑制 (HAI)測試。

根據標準方法進行所有實驗室程序。血清樣品是用受體破壞酶進行預處理，並且在開始HAI分析之前吸附至雞紅血球以減少對cRBC的非特異性結合。非特異性交互作用可能導致偽陽性，暗示存在有凝血抑制。預處理導致的初始1：5稀釋度，使得在HAI分析中測試的第一個稀釋度為1：10。經預處理的血清連續稀釋兩倍。然後恆定量(4-8個凝血單位)的病毒與每個稀釋度一起培育。約45分鐘的培育期之後，加入1%經培養的紅血球(cRBC)溶液。觀察盤的凝血抑制。效價計算為在所有重複實驗中完全抑制4至8個凝血單位的血清的最後稀釋度。

就對抗豬流感病毒(SIV)H1N1的抗凝血抗體，測試第0、3、7、10、14、18、21、24與28天的血清樣品。另外，也從第0、3、7與21天的血清樣品測試SIV H3N2的抗凝血抗體。因為用H1N1初始測試期間所獲得的結果，測試這些特定日子。

免疫調節劑

在本研究中使用如本文所述的免疫調節劑組合物。特別是，使用包括SEQ ID NO：2、DOTIM以及醫藥載體的本文所述免疫調節劑組合物(「IC-Ex.1」)。

¹ 微克

² 原液體積以及在移出稀釋用的體積之前的稀釋液的總體積

³ 剩下用於投與的體積(治療組2與5使用的劑量為200ug/2mL，總共14隻動物；治療組3使用的劑量為50ug/2mL，總共7隻動物；治療組4使用的劑量為10ug/2mL，總共7隻動物)

動物

豬是純種的或雜交的，並且被剝奪初乳直至運送到測試地點。共有35隻、性別混雜、購自於無豬流感農場且35頭動物被納入研究中。豬在抵達時的初始年齡約為八週大且接種時為九至十週大。初始體重對於在接種當時的豬隻年齡來說是恰當的。

仔豬出生後未接種疫苗，而且並沒有用任何已知會干擾接種的治療予以治療。抵達臨床地點之後，觀察所有仔豬的整體健康狀態。在研究開始之前，讓動物適應歷時7天。每天觀察動物的臨床症狀一次。一天測量體溫一次。

從豬群中選擇沒有現存豬流感病史和親代公豬/母豬沒有接種過SIV的仔豬。評估每頭個體，並確認為健康狀況良好。依據血清學(凝血抑制(HAI))，仔豬為豬流感病毒陰性。在第-1天或第0天，所有仔豬進行臨床觀察，並且放置到治療組或被汰除，其中每個治療組最多有7隻仔豬。若動物在治療投與之前的21天內接受會干擾接種的治療，便將它們從研究予以汰除。

研究設計

¹ SIV=經USDA許可的豬流感病毒商用疫苗-例如，FLUSURE Pfizer Animal Health，在肩胛下區域以IM給與2mL劑量

² IM=肌肉內注射路徑

³ 每一組份個別投與至肩胛下區域

⁴ 免疫調節劑

⁵ SC=皮下注射路徑-肩胛下區域內

⁶ 第0天是投與當天

在整個研究期間以及在適應期間觀察動物的臨床徵象。攻毒-投與當天開始，每天早上評估每隻研究動物的臨床徵象(異常呼吸、姿態異常以及發熱)並且持續直至屍體剖檢日。

下表被用作指引呼吸與姿態異常之臨床徵象的臨床計分分類的分派。臨床計分在現場定義為相對於類似、正常、健康的動物。

觀察動物的異常臨床徵象，包括厭食、咳嗽、發熱、眼部與鼻子的稀薄排泄物、共濟失調、昏迷、抽搐、紅斑、過度興奮、過度流涎、跛行、橫臥、急後重以及震顫。

研究第0天對所有動物來說是相同的並且是向T2、T3和T4組的動物投與免疫調節劑治療的那天。所有接受免疫調節劑的動物為皮下注射。所有接受疫苗的動物是根據標籤指示投藥。所有接受免疫調節劑的動物在肩胛下區域淋巴結附近注射。疫苗和免疫調節劑是彼此接近地個別施用。

斷奶與運送之前，在來源農場將動物抽血獲得血清，以供決定納入研究的妥適性。每窩至少三頭豬進行採樣。

在研究第0天(接種之前)，以及在第3天、第7天、第10天、第14天、第18天、第21天、第24天與第28天收集用於SIV血清學的血液樣品(每隻動物每次收集大約5-7mL)。

使用BBL標準操作程序(SOP)處理血液樣品用於血清，且每個樣品等分成兩個獨立的體積。透過使用BBL SOP以8個單位凝血(HA)病毒的HAI分析測試血清樣品。用同源和異源病毒測試血清樣品。

在研究第-7、0、7、14和21天，以及第28天或屍體剖檢前將動物秤重。只有死亡或出於人道原因進行安樂死的動物進行屍體剖檢，由獸醫來確定疾病的病因。由主治獸醫施用過量巴比妥將豬安樂死。屍體剖檢是在測試機構當場依據SOP處理。在研究第28天，所有剩餘動物透過人道方法，按照設施SOP由主治獸醫投與過量巴比妥而被安樂死。

結果

沒有因為免疫調節劑測試物品產生明顯的臨床表現。兩隻豬在研究期間死亡。兩個案例中的死亡原因都是脫肛。另外兩頭豬由於跛行和產生壓力而從研究汰除。在第28天，將所有剩餘的豬秤重並於採血後安樂死。

表4提供第0、3、7、10、14、18、21、24與28天針對SIV H1N1分離株之抗凝血抗體進行測試之血清樣品的數據。參見表5是從第0、3、7，和21天針對Sly H3N2分離株之抗凝血抗體進行測試之血清樣品而來的數據。用HI效價為20對抗H1N1而用HI效價為10對抗H3N2的測試血清樣品報告為陽性。這是因為血清對每個病毒類型的非特異性背景。

NS-無樣品

5-表示效價<10

10-非特異性背景

攻毒病毒-H1N1 SIV Lot VS24Nov09lowa73-SIVp1

接種日=第0天以及第14天

NS-無樣品

5-表示效價<10

10-非特異性背景

攻毒病毒-H1N1 SIV Lot VS24Nov09lowa73-SIVp1

接種日=第0天與第14天

討論

本研究之目的在於評估免疫調節劑組合物當與商用豬死毒流感疫苗共同投與時，對於誘發凝血抑制(HI)抗體的效用。為此，總計三十五頭剝奪初乳的豬被分至五個治療組，而每個治療組接受初始接種以及在十四天後追加接種不同量的免疫調節劑與商用SIV疫苗。在二十八天的研究期間，沒有因為免疫調節劑測試物品導致明顯臨床表現。然而，總計有四頭豬因死亡或人道原因安樂死而從研究被汰除。

就針對H1N1的凝血抑制來分析所有收集的血清樣本。也在選定的研究天數分析針對H3N2的凝血抑制。圖4及5呈現每一天分析每個治療組計算出的幾何平均數。相比於僅接種疫苗的組別對H1N1分離株，就接受200ug和10ug免疫調節劑加上商用疫苗的治療組來說，幾何平均數有明顯增加。相比於僅接種疫苗的組別，接受50ug免疫調節劑加上商用疫苗的治療組的幾何平均數也有明顯增加，特別是在第21天。當接種免疫調節劑時，血清轉化成H3N2似乎也更早。

HAI效價的實際平均數也呈現在圖6和7中，這些圖式代表每個治療組內更多的個別效價。這在第14天追加接種之後的治療組3最明顯。雖然只有兩隻豬血清轉化為H1N1，一頭豬有高HAI效價(見表5)。

有血清轉化成兩種SIV分離株。參見表6A和6B以及圖8(第21天結果)，呈現出與各治療組的豬隻總數相比，使用這個方法偵測到血清轉化的豬隻數目。

總結，當與商用死毒豬流感疫苗共同投與時，免疫調節劑複合物增強凝血抑制抗體的誘發。

實例2：免疫調節劑與豬生殖與呼吸症候群(PRRS)疫苗有助於在豬肺部中早期清除病毒

進行研究，以評估透過給予PRRS經修飾活毒疫苗(MLV)疫苗同時還有50μg(RXII)或10μg(RXI)劑量的免疫調節劑，在豬隻體內誘發之免疫反應的強度和特性，還有保護性免疫力的程度。將參數與在未投與免疫調節劑的情況下用相同MLV疫苗予以免疫的相同宿主反應進行比較。保護性免疫力的程度是透過相比於未接種以及攻毒對照，測量在經接種和毒性PRRS病毒攻毒的動物體內觀察到的臨床症候群降低來確定。

在對照的PRRS攻毒時，相較於只接受PRRS疫苗之組別中的動物(RxIII)，RxII(PRRS疫苗+50微克免疫調節劑)組有較高的體重增加，在 肺部中的病毒負荷較低且可在所有動物中偵測到干擾素。研究暗示，免疫調節劑加上PRRS疫苗有助於肺部的早期病毒清除，而這沒有在經PRRS免疫(RxIII)的動物中觀察到。

研究設計

組別Rx I(T5)接受PRRS MLV PrimePac疫苗+10μg免疫調節劑。組別Rx II(T4)接受PRRS MLV PrimePac疫苗+50μg免疫調節劑。組別Rx III(T5)單獨接受PRRS MLV PrimePac疫苗。

SC=皮下注射路徑

免疫調節劑

在此研究中使用的免疫調節劑是實例1中在上文所述的免疫調節劑。

動物

免疫調節劑陽離子脂質體-質體複合物是以含於5mL(1.25mL填充)小瓶內的凍乾粉末提供。在2-8℃下運送與儲存測試物品且未凍結。免疫調節劑被調配在Tris-HCl乳糖緩衝液中，pH 6.8。免疫調節劑在使用前立即透過添加無菌注射用水(SWFI)USP進行還原。容器和還原體積如 下：5mL小管含有425μg(參見CoA)：用1.25mL SWFI、10mL水、無菌、不含防腐劑(注射用/USP)，Abbott No.：488710100(Fisher Scientific AB4887-10-1)還原

免疫調節劑是使用無菌技術，以無菌注射用水在層流罩下進行還原。凍乾的免疫調節劑是從冷藏儲存裝置(2-8℃)取出並容許小瓶在還原之前達到室溫歷時約5分鐘。注射器和18號針頭被用來測量0.5mL(2mL小瓶)或1.25mL(5mL小瓶)的無菌注射用水且分別逐漸注入經凍乾免疫調節劑的一個2mL或5mL小瓶中。還原時間記錄在標籤和研究藥物的準備工作表上。將小瓶輕輕迴盪(未渦旋)歷時至少30秒，並且靜置至少5分鐘。將小瓶再次輕輕迴盪(未渦旋)歷時至少30秒。還原的免疫調節劑材料具有白色半透明的外觀。還原的小瓶與冰包一起儲存，直到要使用。在4-6小時內使用時，還原的免疫調節劑的材料是穩定的。經還原免疫調節劑是稀釋在5%葡萄糖的無菌水中，如表8所示。

在研究中共計使用39頭體重相似的SPF豬隻(表9至13)，牠們不含所有主要豬病原體(包括PRRS病毒、黴漿菌和環狀病毒)。依據血清學， 所有動物均為PRRS抗體陰性。在適應時，豬的初始年齡約為7至9週大。所有仔豬於出生後未接種疫苗，且沒有使用任何已知會干擾PRRS疫苗接種的治療處理過。在研究開始之前，動物適應歷時7天。一天觀察動物的臨床徵象一次。一天記錄體溫一次。

在整個研究期間以及在適應期間觀察動物的臨床徵象。攻毒投藥當天開始，每天早上評估每隻研究動物的臨床徵象(呼吸異常、姿態異常以及發熱)並且持續直至屍體剖檢日。基於福祉，有些動物每天觀察超過一次。沒有動物具有呼吸道或姿態計分為3，因此不需要藥物，且沒有出於人道原因由研究人員實施安樂死。

下文被用作指引呼吸與姿態異常之臨床徵象的臨床計分分類的分派。臨床計分在現場定義為相對於類似、正常、健康的動物。謹慎解釋動物之間正常的差異，並區分正常生理學反應與病理學反應。

呼吸計分：

0=正常。胸式呼吸，有一些腹部運動

1=輕度呼吸窘迫。有些腹式呼吸

2=中度呼吸窘迫。誇張的腹式呼吸及呼吸困難

3=嚴重呼吸窘迫。呼吸相當吃力，腹式呼吸。張嘴，鼻子和耳朵發紺

活動/抑鬱計分：

0=正常。豬在打開門的反應輕快/咕嚕。豬活躍，好玩和好奇。看向門口，靠近門並嗅聞。對食物和水有興趣。如果興奮不已，他們可能會排尿和排便。

1=輕微。在刺激後起床，但是緩慢或顯示沒有太大興趣或好奇。回去快速躺著。對食品有些興趣

2=中等。明顯不活動和不願起床/移動。虛脫、搖搖晃晃、協調。

3=嚴重。不反應，不起身。

治療方法

在七天適應期之後，對T3至T5組(RxIII至RX I)的那些動物進行接種疫苗。所有接受免疫調節劑的動物(T4 & T5)是皮下注射。所有接受PRRS疫苗的動物(T3到T5)用約5×10⁴組織培養物感染劑量50(TCID50)的劑量於2mL體積的PRRS MLV病毒株PrimePac中進行肌肉內投與。如本文中所用，「TCID50」意指在經接種的50%細胞中產生病理學變化所需的致病劑數量。所有接受免疫調節劑的動物注射在肩胛下區域淋巴結附近。疫苗和免疫調節劑是接近彼此地分開施用。T1和T2組中的動物注射2ml從用於生長病毒的未感染細胞(MARC-145細胞)而來的廢棄細胞培養物上清液。

接種疫苗後四週，T2至T5組的動物用約2×10⁴ TCID50的PRRS病毒株NADC-20於2ml體積(一半劑量肌肉內投與而另一半鼻內投與)來進行攻毒。分配至T2組的未接種疫苗和經攻毒動物用來建立因為毒性NADC-20 PRRS病毒導致之感染的臨床症候群嚴重性，而分配至T1組的動物被用來提供生長和健康狀態的正常參數。

透過接種疫苗誘發的保護性免疫力的程度經是基於血清和肺部中的病毒負荷以及透過比較體重(BW)變化，與抑鬱和呼吸徵象的表現來確定。在攻毒後，每天監測臨床參數測歷時十天。病毒血症(血液)的程度在攻毒後第0、4、7與10天，透過測定AMZC細胞中血清的傳染性病毒效價予以確認。肺組織中的病毒負荷是由病毒學方法測定。

攻毒後十天，將所有研究動物安樂死，並收集肺部樣品供病毒負荷用。有經驗的病理學家在巨觀和微觀層面評估肺部的病理學變化。

為了測量病毒特異性免疫力的生成，在第-7、0、4、7、14和28天(攻毒前)和在免疫後和第38天(安樂死前)從每隻動物收集周邊血液樣 品。從這些樣品中，得到血清和PBMC並測定每隻動物的體液性和細胞媒介的免疫力強度。使用血清病毒中和測試來測定抗體效價，並且進行PRRS病毒特異性干擾素(IFN)分泌細胞(IFN-SC)分別針對疫苗病毒(PrimePac)還有攻毒病毒(NADC-20)的頻率。

在研究日第-7、0、7、14和21天，與第28天還有安樂死前(第38天)將動物秤重。沒有動物在研究期間死亡或基於人道原因安樂死，因此沒有進行中途屍體剖檢。

統計分析

所接收與分析的數據是由血清(在第4、7與10天測得)和肺部與IFN效價、體重(在第0、6與10天測得)、臨床計分和溫度(治療後每天測量歷時10天)，還有在屍體剖檢時的三種類型計分所組成。紀錄肺泡隔增厚、增厚的分布，以及在氣道中的發炎性細胞，範圍從0到3。

所有肺部效價是透過在分析之前將一加(+1)至每一效價而轉換，使用自然對數進行變換。計算最小平方平均數並逆轉換以表示每組在任何時間段的集中趨勢(亦即幾何平均數)並製作成表格。IFN效價未經變換。

在記錄多個測量值時，使用方差的重複測量分析(如果基線-最近的研究第0天-可用，則使用共變量分析)。如果只測量參數一次，則使用方差分析。在所有模型中，針對5個治療組之間的差異檢定TRT的固定效用。因為有多個治療組，對p值使用Bonferroni校正。

對於屍體剖檢計分和臨床計分，使用卡方分析。0.05的α級別被視為在統計上顯著。所有分析均採用SAS 9.2軟體進行。

結果與討論

注意到沒有與治療相關的不良事件。在圖9中包括在攻毒之 後按照組別的平均每日姿態計分(平均每日姿態得分)。在圖9至13中包括在攻毒之後按照組別的個別動物姿態計分。未接種疫苗以及未攻毒組在整個研究中具有姿態計分為0(表9：每日姿態計分-Rx)。未接種疫苗以及攻毒組在研究第2至10天有範圍0.3至1的平均姿態計分(表10：每日姿態計分未接種疫苗/攻毒)。經PPRS接種疫苗+免疫調節劑10μg和攻毒組(RxI)在研究第2至10天具有範圍0.1至0.7的平均姿態計分(表11：每日姿態計分-RxI)。經PPRS接種疫苗+免疫調節劑50μg和攻毒組(RxII)在研究第4至8天具有範圍0.1至0.2的平均姿態計分而在研究第7、9和10天無姿態計分(表12：每日姿態計分-RxII)。經PPRS接種疫苗和攻毒組(RxIII)在研究第2與4至10天具有範圍0.1至0.8的平均姿態計分(表13：每日姿態計分-III)。

表11：每日姿態計分-RxI

按照組別，在研究第-1天的平均體溫範圍從103.7℉至104.3℉。經攻毒的動物在研究第5天有峰體溫且按照組別範圍在104.0℉至107.1℉間，如圖10中所示。個別動物體溫按日納入表14至18中。

在圖11中包括在用毒性PPRS病毒攻毒之前與之後，按照組別的平均體重。從第-39天起，在圖12中包括從第-39天至第10天按照組別的平均增重(第10天體重-第-39天體重)。在經PRRS病毒攻毒的組別中，與未接種疫苗或經PRRS接種(RxIII)的組別相比，投與IC-Ex.1免疫調節劑的組別(RxI和RxII)有更高增重。在表19至23中包括個別動物體重。在研究結束(第10天)時，在經PRRS病毒攻毒的組別中，IC-Ex.1免疫調節劑組(RxI和RxII)具有較高的體重，分別為125.5磅和125.7磅；相比於未經接種疫苗或PRRS接種(RxIII)的組別分別為116.9磅和117.7磅(圖13)。在攻毒之後，在經PRRS病毒攻毒的組別中，IC-Ex.1免疫調節劑+經PRRS接種疫苗的組別(RxI和RxII)具有較高的增重，分別為14.2磅(12.7%)和13.9磅(12.5%)(圖14及15)；相比於未接種疫苗或經PRRS接種(RxIII)的組別分別為7.5磅(6.8%)和11.4磅(10.8%)。在表19至23中包括在攻毒之後的個別動物體重。

在圖16中按照組別包括平均肺重量。在圖17中按照組別包括平均肺重量占體重的百分率。經攻毒組的所有動物有較高的肺對體重比率且範圍從1.06(RxI)至1.19(未接種疫苗對照)，相較於未攻毒對照的0.77。

攻毒之後，在第4、7與10天從血清樣品分離出PRRS病毒。未攻毒的對照動物就病毒分離來說維持陰性，支持在研究中實施生物安全的完整性。在研究第10天，所有未接種疫苗的經攻毒動物就病毒分離來說為陽性，且範圍自每ml 0.06X10⁴至3.16X10⁴ TCID50。在第10天，用PRRS疫苗接種的動物在血清中具有較低的病毒效價。在RxI組中，於第10天9隻動物中有7隻就病毒分離來說為陰性。在RxII組中，於第10天9隻動物中有5隻就病毒分離來說為陰性。在RxIII組中，於第10天9隻動物中有7隻就病毒分離來說為陰性，如表29中所示。

PRRS病毒是從個別動物的肺樣品中分離。未攻毒的對照動物的肺樣品就病毒分離來說為陰性，支持在研究中實施生物安全的完整性。在RxII組中，九隻動物有兩隻的肺樣品中就病毒分離來說為陰性，而一隻動物只有不到10²個病毒。在經攻毒組的所有其他動物中，肺樣品具有範圍在1.78X10²至1.0×10⁵的效價(圖18和19)。每隻動物的微觀肺部病變描述於表30至34中。在經攻毒的動物中，RxII組動物的肺部具有最低平均肺泡隔增 厚以及增厚分布，對應於這個組中的低病毒回收(圖20)。

3-嚴重的(相對)

表34：肺病理學-經接種疫苗且經攻毒RxIII

在圖21與表35中包括個別動物的干擾素效價。相較於RxIII(PRRS疫苗)組九隻動物中的4隻，RxII(PRRS疫苗+50μg免疫調節劑)組的全部九隻動物以及RxI(PRRS疫苗+10μg免疫調節劑)組的9隻動物中有7隻具有可檢測到的干擾素效價。

總結來說，相較於僅接受PRRS疫苗之組別(RxIII)中的動物，在受控的PRRS攻毒中RxII(PRRS疫苗+50μg免疫調節劑)組具有較高的增重，在肺部中的病毒負荷較低且具有可偵測到的干擾素。研究暗示，免疫調節劑加上PRRS疫苗在肺部的早期病毒清除方面有助益，而這沒有在經PRRS接種疫苗(RxIII)的動物中觀察到。

實例3：在用PRRS病毒進行實驗室攻毒之前或之後，單一肌肉內注射投與給豬隻的免疫調節劑會降低肺病變

進行研究以確定免疫調節劑降低經PRRS攻毒以及最近斷奶之仔豬的肺部病變的有效性。豬隻在研究第0天用PRRS病毒進行人工攻毒。研究評估5個治療組，4個經攻毒(B組[在研究第2天投與免疫調節劑]、C組[在研究第-1天投與免疫調節劑]、D組[在研究第0天投與免疫調節劑]和E組[投與5%葡萄糖作為安慰劑對照])，其中在研究第0天有一次4x10⁶ PRRSV(病毒株NADC-20)鼻內接種以及1個假攻毒(A組)組。豬隻在研究第0天時為約九至十週大。四個經PRRSV攻毒組的每一者代表每一個欄舍。從 研究第-2天至研究第16天每天記錄臨床計分。以兩天期間(研究第15至16天)進行豬隻的屍體剖檢以評估肺部病變並且藉由肺灌洗和病毒分離回收PRRSV。相較於E組安慰劑對照豬隻的總體肺葉受累平均為32.9%，在C組和D組中經免疫調節劑治療的豬隻在統計上(p-值分別為0.0095和0.0247)的肺病變計分較低(分別為9.7%和13.9%)。該研究的時間過程期間報導有一件不良事件，但經鑑定為與研究獸醫產品不相關。

研究設計

透過職責分離來實現隱瞞(masking)。就治療組數目及投與測試材料之間的相關性來說，參加每日觀察結果、臨床計分、巨觀和微觀肺部病理學評估、樣品處理或實驗室結果解釋的任何研究人員是被隱瞞的。從研究地點取走分配表和處理碼鍵，並在研究進行期間由贊助者保管。

動物

豬隻為約克夏(Yorkshire)X藍瑞斯(Landrace)X漢普夏(Hampshire)雜交。豬隻在測試材料投與時為九至十週大。研究族群的族群統計學提供在下表38中。

在研究第-14天(2011年4月27日)，使用IDEXX實驗室Herdchek PRRSV病毒抗體測試套組序號09418-LF113到期日：2011年11月01日，針對PRRSV抗體來分析所有n=46隻候選豬隻收集而來的血清。所有候 選豬隻經測定為PRRSV陰性。

關於納入研究，豬隻必須是不能在任何時候接受過PRRSV接種疫苗；有可追踪的記錄核實估算年紀、來源地以及PRRS和黴漿菌的SPF狀態認證；在研究第-1天的直腸溫度為104℉；在研究第-1天與第0天的呼吸計分及抑鬱計分為0；在投與測試材料的個別天數沒有併發損傷或與PRRS攻毒相關的疾病；以及在研究第-1天的整體健康狀態觀察確定為身體健康。

若豬隻在測試材料投與與攻毒感染的個別天數時具有下列特質，則豬隻被汰除具有測試材料投與和攻毒感染的適格性：受到混淆研究結果或使研究無法完成的併發損傷或非目標全身性疾病所影響；或在研究第-1天與第0天的呼吸計分不等於0。

免疫調節劑

本研究中使用的免疫調節劑描述於上文實例1中。

被分派到免疫調節劑治療組的豬隻接受了2mL免疫調節劑懸浮液和5%葡萄糖水的單獨一次性肌肉內注射，以提供50μg的免疫調節劑質體DNA。每天觀察豬隻的整體健康狀況兩次。

研究程序

在第-2、-1、0、2、4、7、10、14天及屍體剖檢當天記錄所有豬隻的直腸體溫。直腸體溫是採用Welch Allyn SureTemp-plus®數字溫度計來進行收集。

在研究第-14(分配至治療組)、-7、0、7、10與14天獲得所有豬隻的體重。因為紀錄表格遺失，使得研究第10天的資料集不完整，因此在研究第10天紀錄的體重被取消資格。

本研究的接種物是由ZMAC細胞(豬肺泡巨噬細胞)的單一繼代回收之NADC-20 PRRSV的兩個單獨原液(原液# 31411和# 41911)的池 製備。原液# 31411具有5X10⁶的效價，並隨後以1：25稀釋，得到2X10⁶ TCID50/ml。稀釋後的原液隨後與原液41911合併，而具有2X10⁶ TCID50/ml的原始效價。合併的接種物經滴定和測量具有1.8×10⁶ TCID50/ml的效價。為了確定效價，製備接種物的十倍連續稀釋液並將100μl/孔的各稀釋液以四重複的方式進行鋪盤。基於在個別孔中觀察到的ZMAC細胞的細胞凋亡及/或細胞死亡對病毒的存在進行評分。效價是透過使用Reed與Muench法計算。

每頭豬隨後鼻內投與2mL的1.8×10⁶ TCID50/mL PRRS病毒(每個鼻孔1mL)，最終接種物為約4X10⁶ TCID50/mL的PRRSV。為了便於程序的進行且盡可能減少對豬隻的壓力，每頭豬被安置在購自於Lomir Biomedical Inc.(Malone,NY)的吊索上。

為了增加感染的成功，使用附接至拋棄式3mL注射器末端的兒科黏膜霧化裝置(Wolfe Tory Medical,Inc.Salt Lake City,UT)來投與PRRSV懸浮液。在吸氣期間遞增投與接種物。

在研究第-2、4、7、10及14天，相對於在研究第0天之PRRSV攻毒來測定血清病毒血症的程度。從凝結靜脈血液樣品獲得之血清來確定在豬隻周邊血液中存在傳染性PRRS病毒。將靜脈血液(5-10cc)收集在紅色頂部Vacutainer管中，使其凝固。在收集之後的兩個小時內從這些管中收取血清(1-2cc)，以等分試樣儲存在-80℃下直至進一步分析。病毒血症的測定是透過在RPMI-1640中製備血清的十倍連續稀釋液來完成。將0.1ml體積的經稀釋血清樣品以三重複的方式轉移到含有0.1ml體積之約3×10⁴ ZMAC細胞(豬肺泡巨噬細胞)懸浮液的96孔組織培養盤中。在5% CO2氛圍中於37℃下培養3天後，評定經病毒誘導的細胞病變效應的存在。使用Reed與Muechen法測定組織培養物感染劑量50(TCID50)的數量。

在屍體剖檢時收集的肺組織樣品中測定肺組織的病毒負 荷。從右中葉收集的支氣管肺泡灌洗(BAL)液來測定肺病毒負荷。使用連接至放入連接至右中葉之支氣管的導管的20mL注射器，透過輸注10ml無菌鹽水至右中葉獲得BAL樣品。在輕柔按摩肺葉之後，透過抽吸用來輸注的同一注射器中的液體來移除輸注液。回收約5ml灌洗液。肺組織中的病毒負荷的測定是透過在RPMI-1640中製備BAL液的十倍連續稀釋液來完成。將0.1ml體積的經稀釋血清樣品以三重複的方式轉移到在0.1ml體積中含有3×10⁴豬肺泡巨噬細胞的96孔組織培養盤。在5% CO2氛圍中於37℃下培養3天後，評定經病毒誘導的細胞病變效應的存在。使用Reed與Muechen法測定TCID50。

屍體剖檢時，從胸腔取出肺部，拍照(背側與腹側，並在每張照片中記錄豬耳標)和按照獸醫病理學住院醫師依據由Halbur等人(1995年)所述的計分系統評比的巨觀損傷。簡言之，將五(5.0)潛在點分配至前葉、中葉和副葉之背側與腹側的每一者。十五個點(15.0)被分配到背尾葉而十二點五(12.5)被分配至尾葉的腹側。觀察每片肺葉(肺部的背側，腹側)並在贊助商提供的資料擷取表格上記錄帶有巨觀損傷之肺的估計百分率。透過將肺葉的最大計分乘以受影響肺葉百分率對每片肺葉分配最終損傷計分。例如，如果背尾葉的20%有觀察到損傷，則該片肺葉的損傷計分計算為損傷計分(20*15)/100=3。

為了評估肺部組織切片中的微觀損傷，從每個肺取出約1cm厚×5cm長×5cm寬的樣品(參見圖22)：a)該左前葉的前部，b)左前葉的尾部及c)左尾葉的前部。

在10%中性緩衝福馬林中固定樣品至少48小時，然後使用自 動組織處理器進行處理且包埋在石蠟中。切出3-5μm厚的切片，並用蘇木精和伊紅染色。組織處理(石蠟包埋，切片和染色)是在伊利諾大學獸醫診斷實驗室大學的組織學實驗室進行。

檢查肺部切片並且基於以下四個標準提供間質性肺炎嚴重性的估算計分：

A. 肺泡隔增厚：0-無增厚(正常)；1-輕微(相對)；2-中等(相對)；3-嚴重(相對)

B. 肺泡隔增厚分布：0-無病變(正常)；1-局部性隔增厚；2-多灶性隔增厚；3-瀰漫性隔增厚

C. 支氣管相關淋巴組織(BALT)生長：0-最少細胞至正常BALT；1-在數目上輕微增加；2-在數量上略有增加；3-在數字上遽增。

D. 氣道中發炎的證據：0-沒有；1-輕微；2-中等；3-嚴重。

在研究第-2、4、7及14天，使用綠色頂部Vacutainer管(肝素鈉)靜脈穿刺從研究動物獲得靜脈血液(8-10mL)。周邊血液單核細胞是在收集血液之後的四個小時內透過用Ficoll-Hypaqe1077密度離心從這些樣品分離而來。將分離的細胞懸浮於補充10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中。在沒有任何外源性刺激劑的情況下培育細胞(以測量細胞介素的自發性生產)，或在2μg/mL的類鐸受體9(TLR9)激動劑ODN D19(Qiagen,Valencia,CA)存在下培育細胞，類鐸受體9(TLR9)激動劑ODN D19是一個含有CpG的A型寡去氧核苷酸(ODN)。在培養16小時後收集細胞培養物上清液，並隨後冷凍直至進一步使用。使用專一性ELISA如前述(Calzada-Nova et al.,2010)測定在所得培養物上清液中的IFN-α量。

統計方法

疾病模型的評估包括分析兩個對照組之間的巨觀肺數據和 微觀肺數據。需要有一個統計差異顯著，以顯示經攻毒的對照組與未經攻毒之嚴格對照組相比表現出適當的疾病。使用群體效應的變異測試分析來比較巨觀肺計分(每個肺葉的總和)。三(3)個微觀肺計分(肺泡隔增厚、氣道發炎和BALT生成)的每一者是使用非參數威爾卡森等級和檢定來進行比較。若符合上述疾病模型驗證，則納入對第2至5組(經攻毒對照和免疫調節劑組)的其餘分析。

用重複測量值(即，IFN-α)，使用方差的重複測量分析來分析數據，且若適用的話包括一個基線共變量。使用具有最小AIC結果的共變量結構。若需要的話，應用反正弦變換，以便能更貼切逼近正常的數據分布。

具有單一評估標準(巨觀肺計分)的數據是使用方差分析來進行分析。上述全部模型併入欄舍作為模型的一個係數。使用非參數威爾卡森等級和檢定來分析微觀肺(隔、氣道和BALT)計分。所有分析是使用SAS 9.2進行，並且使用0.1的α來區分顯著效用。

結果

當比較嚴格對照組以及經攻毒對照組時，巨觀和微觀肺計分均有顯著治療效用(就巨觀、隔，氣道和BALT的p值分別為0.0015、0.0037、0.0249和0.0010)。因此，符合疾病模型驗證。

巨觀肺病理學，由每隻動物的肺葉計分總和所表示，對照組與各免疫調節劑組間表現出統計顯著差異(就免疫調節劑第-1天、免疫調節劑第0天與免疫調節劑第2天的p-值分別為0.0095、0.0247和0.0736)，如圖24所示。治療組之間的微觀肺總病理學計分並沒有表現出任何統計顯著差異(隔、氣道與BALT組織為0.8786，0.5788和0.5865)。

圖25中顯示的IFN-α結果，沒有在研究的任一天造成任何統計顯著差異(整 體治療效用是0.1653)。 討論與結論

在本研究中，相對於安慰劑對照組動物，研究組的每一者中的巨觀肺損傷評分顯著降低。根據這些數據，免疫調節劑可以減輕有限度地暴露於其他病毒或細菌呼吸道病原體之最近斷奶健康豬隻的肺損傷計分：換言之僅PRRSV呼吸攻毒。

在面對PRRSV攻毒時，干擾素含量一如預測般振盪。IFN-α含量的抑制是PRRSV感染的指標後遺症且在這項研究中是明顯的，其中IFN-α含量在研究第4天與第7天收集的樣品中相對於研究第-2天大幅降低。免疫調節劑並沒有在任何收集期間導致IFN-α含量顯著差異。但耐人尋味的，在研究第14天，由在研究第-1天受免疫調節劑治療(C組)以及在研究第0天受免疫調節劑治療(D組)的豬隻收集之巨噬細胞的IFN-α產量增加近2倍。這些數據暗示，免疫調節劑或許透過在之後活化TLR9訊號傳遞事件來增強固有巨噬細胞生產更高含量IFN-α的能力，在肺部提供一個啟動效應。這個發現也許有必要在兩個治療PRRSV模式中進一步探討，使得豬隻在攻毒之前於自-14天且於第-1天再次以免疫調節劑治療。

在經免疫調節劑治療的組別中沒有觀察到PPRS病毒血症有統計顯著減少。但是在第7天，於在第-1天經治療的組別中，血清病毒血症有一個明顯的，雖然不顯著的降低。肺部病毒負荷，顯示於圖23中，相對於經安慰劑治療的豬隻，在兩個研究中除了一個免疫調節劑治療組以外，所有組別在算術上均有下降；然而，這些下降在統計上不顯著。沒有證據或跡象表示投與免疫調節劑會提高肺部病毒負荷或病毒血症。後面的陳述反駁了先前在文獻中所報導的觀察結果，該觀察結果暗示以高濃度IFN-α在活體外培育豬周邊血液單核細胞會提高PRRSV攝入。在本研究中沒有跡象 顯示免疫調節劑會增強PRRSV血清病毒血症或肺部負荷。

實例4：在用PRRS病毒的NADC.2-病毒株之實驗室攻毒前一天，作為單次肌肉內注射被投與給豬隻的免疫調節劑的正效應

進行一項研究來測定免疫調節劑在生長中的豬隻的劑量。測試系統評估五個治療組，四個經PRRS病毒攻毒組(A組[在研究第-1天投與50μg免疫調節劑]、B組[在研究第-1天投與5%葡萄糖水]、C組[在研究第-1天投與75μg免疫調節劑]和D組[在研究第-1天一次性鼻內投與2mL的5.38×10⁵ TCID50 PRRSV(病毒株NADC-20)懸浮液)，以及一個在研究第0天的假攻毒組(E組-嚴格對照)。豬隻為約7.5至8.5週齡大。各免疫調節劑治療組是由每個欄舍中的兩頭豬代表，以使得豬隻住在具有八頭豬的六個欄舍中(三個欄舍在一個套房中，而三個豬圈在相鄰套房)，且一個欄舍的八頭嚴格對照豬隻在第三個套房中。

結果被認為在0.10的p-值下是統計顯著的。在研究第12天觀察到一個關於呼吸計分顯著的治療效用(p-值為0.0719)。關於對照組(B組)相對於各免疫調節劑組在研究第3、4、6、7及12日時的成對比較，觀察到在研究第7天免疫調節劑50pg治療組相較於對照組有明顯更高的姿態計分(更昏昏欲睡)(p-值為0.0902)。相反，在研究第12天免疫調節劑75μg治療組相較於對照組觀察到有明顯更低的姿態計分(接近正常)(p值為0.0932)。對照組與各個免疫調節劑組在每一天的成對比較結果是，以25μg(第4與7天)和75μg(僅第7天)的劑量投與免疫調節劑有明顯較低的血清病毒血症，且在研究第14天投與50μg劑量有明顯更高的血清病毒血症。但是，25μg組和75μg組只有在研究第7天觀察到的降低才被認為是臨床上相關，因為25μg組在第4天觀察到的轉化病毒血症計數僅有28相對於18。在巨觀或微觀肺損傷、臨床計分、肺部病毒負荷、體重，體溫或體重對肺的重量比率方面觀察到沒 有顯著差異。在本研究中報導有一例不良事件，經確定為與研究獸醫產品無關。

本研究之目的在於研究第0天用PRRSV的NADC-20病毒株進行實驗室攻毒之前的一天(研究第-1天)，透過將25μg、50μg或75μg免疫調節劑一次性肌肉內投與給剛斷奶的豬隻，以便測定免疫調節劑的劑量。與經安慰劑治療的PRRSV攻毒豬隻比較免疫調節劑的有效性。

效力的主要反應變量是姿態和呼吸的每日臨床計分(研究第-2天至研究第14天)、血清病毒血症(研究第-2、4、7、10天和屍體剖檢當天)、屍體剖檢當天的巨觀和微觀肺病理學和肺病毒血症(PRRSV攻毒後14或15[±1天]天)。記錄體溫(研究第-2、-1、0、4、7、10天和屍體剖檢當天)和體重(研究第0、7、10和14天)做為效力的次要與間接測量值。也在研究第7天(2011年6月7日)收集體重以便將豬隻分配至治療組和欄舍。

研究設計

這是一個實驗性攻毒研究，利用商業來源的剛斷奶仔豬，其經確認為PRRSV和豬肺炎黴漿菌血清陰性。治療組的列表提供在下面表40和表41中。

透過職責分離來實現隱瞞(masking)。就治療組數目及投與測試材料之間的相關性來說，參加每日觀察結果、臨床計分、巨觀和微觀肺部病理學評估、樣品處理或實驗室結果解釋的任何研究人員是被隱瞞的。從研究地點取走分配表和處理碼鍵，並在研究進行期間由贊助者保管。

使用Excel中的RAND()函數，不分性別依次從最高體重至最低體重按照體重遞減將豬隻進行分類並鎖定。

動物

在本研究中使用的豬源於未接受過任何PRRSV疫苗接種的單一商業豬場，是無PRV階段和無布氏桿菌狀態的豬群。豬隻經確認為PRRSV和豬肺炎黴漿菌的血清陰性。ELISA結果保留在研究文件中。

關於納入研究，豬隻必須是不能在任何時候接受過PRRSV接種疫苗；有可追踪的記錄核實估算年紀、來源地以及PRRSV狀態認證；在研究第-1天的直腸溫度為105℉；在研究第-1天與第0天的呼吸計分及抑鬱計分為0；以及在研究第-1天與第0天的整體健康狀態觀察確定為身體健康。

免疫調節劑

在此研究中使用的免疫調節劑是實施例1中上述的相同免疫調節劑。

分配到免疫調節劑治療組的豬隻接受了2mL懸浮液的免疫調節劑和5%葡萄糖水的單次肌肉內注射，遞送25、50或75μg的免疫調節劑質體DNA。每天兩次觀察豬隻的整體健康觀察並且每天一次特別針對與呼吸和姿態相關的臨床計分進行評估和記錄。

研究程序

研究第-2天與第-1天(給藥前)、第0天(攻毒前)、2、4、7、10天(屍體剖檢前)，以及屍體剖檢當天，透過直腸量測每隻參與豬隻的體溫。在研究第-7天(只有治療和欄舍分配)、第0、7、10和14天取得豬隻的體重。

NADC(國家動物疾病中心)-20 PRRS病毒原先是在MARC-145細胞中分離出來，而MARC-145細胞是用來自1996年一場在非典型PRRS流產風暴中夭折並且作為診斷研究的一部分之被安樂死的種豬(NO 35358)的肝組織接種。分離物保存於Ames，IA的NADC。

每頭豬隨後鼻內投與2mL的5.38 X10⁵ TCID50/ml懸浮液(每鼻孔1mL)。為了增加感染的成功，使用附接至拋棄式3.0mL注射器末端的兒科黏膜霧化裝置((Wolfe Tory Medical,Inc.Salt Lake City,UT)來投與PRRSV懸浮液。在吸氣期間遞增投與接種物。

在研究第-2、4、7、10天以及屍體剖檢當天，依據下面程序藉由病毒分離(VI)對所有豬隻決定傳染性PRRS病毒負荷的量化評估。

病毒血症的測定是透過在含有2%馬血清、1x抗生素/抗真菌 劑，和1x L-麩醯胺酸的MEM培養基製備血清十倍連續稀釋液來完成。0.2ml體積的經稀釋血清樣品以三重複的方式轉移至含有預先接種Marc-145細胞的96孔組織培養盤中。之後，在5% CO2氛圍、37℃下培養4天後，使用PRRSV單株抗體SDOW-17-F在免疫螢光分析(IFA)中測定病毒的存在。TCID50是使用斯皮爾曼-卡柏法(Spearman-Karber method)計算。

肺組織中的病毒負荷是在屍體剖檢時收集的肺組織樣品中進行測定。從右中葉收集而來的支氣管肺泡灌洗(BAL)液來確定肺的病毒負荷。從樣品達到病毒的量化。

屍體剖檢時，從胸腔取出肺部，拍照(背側與腹側，並在每張照片中記錄豬耳標)和由病理學家評比依據由Halbur等人(1995年)所述計分系統的巨觀損傷。簡言之，將五(5.0)潛在點分配至前葉、中葉和副葉之背側與腹側的每一者。十五個點(15.0)被分配到背尾葉而十二點五(12.5)被分配至尾葉的腹側。

觀察每個肺葉(肺部的背側與腹側)並在贊助商提供的資料擷取表格上記錄患有巨觀損傷之肺的估計百分率。透過將肺葉的最大計分乘以罹病肺葉百分率對每片肺葉分配最終損傷計分。例如，如果背尾葉的20%有觀察到損傷，則該片肺葉的損傷計分計算損傷計分為(20x15)/100=3。

為了評估肺部組織切片中的微觀損傷，從每個肺取出約1cm厚×5cm長×5cm寬的樣品(參見圖22)：a)該左前瓣的前部，b)左前葉的尾部及c)左尾葉的前部。

在10%中性緩衝福馬林中固定樣品至少48小時，然後使用自動組織處理器進行處理且包埋在石蠟中。

檢查肺部切片並且基於以下四個標準提供間質性肺炎嚴重性的估算計分：

A. 肺泡隔增厚：0-無增厚(正常)；1-輕微(相對)；2-中等(相對)；3-嚴重(相對)

B. 肺泡隔增厚分布：0-無病變(正常)；1-局部性隔增厚；2-多灶性隔增厚；3-瀰漫性隔增厚

C. BALT生成：0-最少細胞至正常BALT；1-在數目上輕微增加；2-在數量上略有增加；3-在數字上遽增。

D. 氣道中發炎的證據：0-沒有；1-輕微；2-中等；3-嚴重。

研究第-2天開始至研究第14天，每日觀察一次並依據以下計分標準對所有豬隻的呼吸和姿態進行計分。

統計方法

疾病模型的評估包括分析兩個對照組之間的巨觀肺數據和肺微觀數據。需要有一個統計差異顯著，以顯示經攻毒的對照組與未經攻 毒之嚴格對照組相比表現出適當的疾病。使用群體效應的方差測試分析來比較巨觀肺計分(每個肺葉的總和)。四(4)個微觀肺計分(肺泡隔增厚、隔分布)增厚、氣道發炎和BALT生成的每一者是使用非參數威爾卡森等級和檢定來進行比較。

若上述疾病模型驗證得到滿足，則納入對第2至5組(經攻毒對照和免疫調節劑治療組)的其餘分析。

依照費雪精準檢定，每天分析臨床計分(呼吸和姿態計分)。若整體治療組在任一天的效果顯著，則本研究在對照組與免疫調節劑的任一者之間進行成對比較(3個比對)。

用重複測量值(即，血清病毒血症、體重、體溫)，使用方差的重複測量分析來分析數據，且若適用的話納入一個基線共變量。使用具有最小AIC結果的共變量結構。若需要的話，應用反正弦變換，以便能更貼切逼近正常的數據分布。

具有單一評估指標(巨觀肺計分、肺病毒血症(BAL)與體重對肺重量的比率)的數據是使用方差分析來進行分析。若適合的話，上述所有模型併入欄舍作為模型與獨立變量轉換的一個係數。

使用非參數威爾卡森等級和檢定來分析微觀肺(隔、D隔、氣道和BALT)計分。

所有分析是使用SAS 9.2進行，並且使用0.1的α來區分顯著效用。

結果

當比較嚴格對照組以及經攻毒對照組時，巨觀和微觀肺計分均展現顯著治療效用(就巨觀、隔、隔分布、氣道和BALT的p-值分別為0.0021、0.0038、0.0631、0.0001和0.0016)。因此，符合疾病模型驗證。

呼吸計分證明，只有在研究第12天有顯著治療組差異(p-值為0.0719)。就其他研究日來說，呼吸計分沒有顯著治療組差異(p-值為0.1202或更高)。對照組與免疫調節劑組的每一者間在研究第12天的成對比較(3個比較)顯示無顯著成對治療差異(p-值為0.2174或更高)。

在第3、4、6、7與12天，姿態計分證明有顯著治療組差異(p-值分別為0.0349、0.0831、0.0349、0.0073、0.0699)。就其他研究日來說，呼吸計分沒有產生顯著治療組差異(p-值為0.1960或更高)。就對照組與免疫調節劑治療組之每一者在研究第3、4、6、7和12天的成對比較來說。免疫調節劑50μg治療組相對於對照組在研究第7天觀察到有明顯更高的姿態計分(p-值為0.0902)。相反，免疫調節劑75μg治療組相對於對照組在研究第12天觀察到有明顯較低的姿態計分(p-值為0.0932)。

血清病毒血症數據產生如圖26中所示統計顯著治療x天交互作用(p=0.0797)。與免疫調節劑組的每一者在每一天的成對對照組比較，結果為免疫調節劑25μg(第4與7天)以及免疫調節劑75μg(僅第7天)有顯著較低的血清病毒血症，而免疫調節劑50μg在研究第14天有明顯更高的血清病毒血症。

巨觀肺病理學(由每隻動物的肺葉總計分表示)沒有表現出統計顯著治療組差異(整體治療效用為0.8685)。

微觀肺病理學總計分，顯示於圖28中，在治療組之間沒有表現出任何統計顯著差異(隔、氣道和BALT組織的p-值為0.6726、0.2801和0.2901)。總隔增厚分布計分顯示顯著治療差異(p-值為0.0075)。就對照組與免疫調節劑組之每一者間的成對比較來說，只在對照組和免疫調節劑75μg組之間觀察到顯著差異(p值=0.0043)。

討論與結論

在研究第7天，所有免疫調節劑治療組中的幾何平均數血清病毒血症相對於安慰劑攻毒組大幅減少。另外，平均肺病毒負荷在經25μg與50μg治療的豬隻中相對於經安慰劑治療的攻毒豬隻明顯更低，如圖27中所示。在另一項研究中觀察到類似結果，於經免疫調節劑治療的豬隻中，平均肺病毒負荷表現出顯著降低。免疫調節劑在減少PRRSV肺負荷方面明顯提供可測量水平的效力。

實例5. 免疫調節劑組合物在新生仔豬的大腸桿菌攻毒模型中的效力

透過毒性大腸桿菌K88攻毒，在易感型新生仔豬中進行研究來評估免疫調節劑組合物的效力。所有研究的母豬在其糞便樣品中為大腸桿菌K88陰性。報導沒有與治療有關的不良事件。在研究中，所有仔豬分娩後幾小時遭受攻毒。母豬4009、2694、10040、4001和2088的仔豬是用大腸桿菌培養物批次1攻毒。母豬2082、217和215的仔豬是用大腸桿菌培養物批次2攻毒。

在研究期間對32隻仔豬進行屍體剖檢。31頭仔豬死亡或提前終止的原因在於大腸桿菌病。一頭仔豬(305 T2)是母豬產下後被發現死亡。除了一頭豬(331 T1)以外，所有仔豬(31頭豬)因為大腸桿菌病減重而死亡或被安樂死。研究期間倖存下來的所有仔豬(37頭豬)增重。體重增加範圍從240至1,540公克。相較於其他母豬產下的仔豬，母豬2088產下的仔豬沒有臨床徵象。只有兩頭仔豬(342 T1和336 T3)在一次觀察時的糞便計分為2。在納入或不納入這頭母豬的仔豬的情況下來進行分析。23隻經鹽水治療的豬隻有13隻(57%)死於大腸桿菌病。22隻用免疫調節劑組合物1X治療的豬隻有9隻(41%)死於大腸桿菌病。23隻用免疫調節劑組合物5X治療的豬隻有9隻(39%)死於大腸桿菌病。排除某頭母豬(2088)之仔豬，分析結果如下：20隻用鹽水處理的豬隻有13隻(65%)死於大腸桿菌病。19隻用免疫調節劑組合物1X治療 的豬隻有9隻(53%)死於大腸桿菌病。

20隻用IC-Ex.1 5X治療的豬隻有9隻(45%)死於大腸桿菌病。大腸桿菌菌株MVS # 2能夠在於出生當日受到攻毒的易感型新生仔豬體內引起死亡、臨床徵象和腹瀉。相較於對照組，用免疫調節劑組合物治療仔豬在數值上降低了治療組(1X和5X)的死亡率，但無統計差異。

材料與方法

測試動物。測試由鄉村West Point，NE的Klitz農場所擁有的九頭赫密母系-典型雜交^TM懷孕母豬，並在其糞便中驗證為大腸桿菌K88陰性。購買八頭懷孕母豬並且移至Klitz農場設施內的分娩場。在分娩前至少30天，母豬沒有接受大腸桿菌K88疫苗和抗微生物劑。八窩新生仔豬加入研究。母豬和仔豬同時沒有其他疾病，同時有其他疾病會混淆臨床數據的解讀。

動物飼料和水。母豬透過給料機依據泌乳配給自由進食並且經由自動飲水器自由飲水。每天檢查飲水器和給料機並根據需要進行清洗。仔豬的唯一食物來源是母豬的母乳(哺乳)。

伴隨用藥。給與母豬混合莫能菌素鈉的飼料。

住屋。母豬住在分娩場4。在研究期間，動物暴露於每天約12小時光照以及範圍在70℉至73℉的高溫與低溫間，且濕度範圍從49到69%。

研究設計摘要

治療組的詳細內容列於表52中。研究有三組仔豬。在T1，T2和T3組中的仔豬分別接受鹽水、IC-Ex.1 1X和5X。研究中的所有仔豬是藉由肌肉內路徑注射2mL適當測試材料。

K88菌毛抗原的測試。自懷孕母豬收集糞便樣品並且運到實 驗室。將樣品稀釋並劃線接種到MacConkey瓊脂盤上，且在~37℃下培育過夜。從盤選出大腸桿菌樣菌落且在凝集測試中使用對大腸桿菌K88菌毛具有特異性的抗血清(Abcam Scientifics)進行測試。選擇並購買的研究用懷孕母豬對大腸桿菌K88菌毛為陰性。

隨機分組。每頭母豬產下7至12頭仔豬。仔豬經鑑定具有重複的獨特耳標。在一窩仔豬中，按照體重級別遞減將仔豬排序，且排列頭6隻(一隻產下7隻仔豬的母豬)或頭9隻(7隻產下10至12隻仔豬的母豬)的仔豬被納入這項研究。在本研究中，各窩的仔豬被隨機分配到三個治療組中的一個(表52)。69頭仔豬被納入研究中。

攻毒培養物製備。製備兩批攻毒培養物。就每個批次來說，從超低溫冷凍庫中取出一小瓶大腸桿菌K-88分離物(MVS # 2，第4代)並在室溫下解凍。從小瓶中取出一個接種環的大腸桿菌K-88培養物，並劃線接種到5%綿羊血瓊脂(BA)盤。該BA盤在37℃、5% CO2培養箱中培育過夜。針對純度以及β溶血區觀察BA盤上的菌落。從BA盤挑出五個β溶血菌落並轉移到含有10mL預溫熱胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)的一個管中且透過抽吸數次將其分散以形成均勻的懸浮液。將懸浮液轉移至含有200mL預溫熱TSB的燒瓶中。在37℃下培育燒瓶約六小時。培育後，針對光學密度(OD)在600nm下測試培養物。批次1和2培養物的OD分別為1.16和1.12。將培養物稀釋至0.85 OD，並將500mL和450mL的批次1和2分別轉送分娩場進行攻毒。

攻毒程序。在攻毒前約一小時以及攻毒後一小時(總計兩小時)，仔豬與母豬隔離。在研究中，所有仔豬用5mL的製備攻毒培養物進行經口攻毒。

測試材料

鹽水：鹽水批號A110901-3，到期日為2013年9月，購自於 Vedco。每100mL的鹽水含有0.9公克氯化鈉以及注射用水。鹽水用作為對照材料。

無菌水：注射用無菌水，批號6000844，到期日為2013年9月，從APP Pharmaceuticals,LLC購得100mL小瓶裝。無菌水用於再水合免疫調節劑組合物。

5%葡萄糖：五%葡萄糖USP，批號19-112-JT，到期日為2014年1月，從Hospira Inc.購得250mL袋裝。五%葡萄糖用於稀釋再水合的免疫調節劑組合物。

免疫調節劑組合物製備：從冰箱取出免疫調節劑小瓶，並溫熱至室溫。每個小瓶就在要使用前藉由加入2mL無菌水而被再水合。將小瓶渦旋30秒，並在室溫下放置5分鐘。依據表45中的稀釋方案，用5%葡萄糖稀釋經再水合的免疫調節劑組合物。以冷裝(cold pack)儲存經稀釋免疫調節劑組合物直到要使用(約2小時)。

治療。在攻毒後約兩小時，治療仔豬。在頸部的右側，透過肌肉內路徑給與每隻仔豬2mL的適當治療(參見表48至51)。在T1、T2和T3組中的仔豬分別接受鹽水、免疫調節劑組合物1X與5X。

臨床評估。在加入之前，研究獸醫觀察母豬和仔豬並且被認為是健康的。在攻毒之後，一天觀察仔豬兩次，直到第5天。

計分詳情。個別檢查仔豬且將棉花拭子輕柔地插入直腸，以助於評估糞便硬度。在攻毒之後，一天對動物進行計分兩次(參見表46與47)。

體重。在攻毒之前，終止之前或死亡或安樂死當天對仔豬進行秤重(表48至51)。

統計分析。若動物在五天觀察期期間具有2或更高的整體身體計分歷時至少一天，則牠們在臨床上被認為是罹病的。若動物在五天觀察期期間具有2或更高的糞便計分歷時至少兩天，則牠們被認為是具有陽性的糞便得分。

結果

研究中的所有母豬在其糞便樣品中為大腸桿菌K88陰性。仔豬沒有治療相關不良事件。在研究中，所有仔豬在產下之後的數小時進行攻毒。母豬4009、2694、10040，4001和2088的仔豬用大腸桿菌培養物批次1攻毒，且前效價與後效價分別為1.04×10⁹ CFU/mL和9.6×10⁸ CFU/mL。母豬2082，217和215的仔豬用大腸桿菌培養物批次2攻毒，且前效價與後效價分別為9.9X10⁸ CFU/mL和9.0×10⁸ CFU/mL。

在研究期間，對三十二頭仔豬進行屍體剖檢。31頭仔豬死亡或提前終止的原因在於大腸桿菌病。一頭仔豬(305 T2)由母豬生下但被發現死亡。

除了一頭豬(331 T1)，所有仔豬因為大腸桿菌病喪失體重而死亡或被安樂死(31頭豬)。存活下來的所有豬隻(37頭豬)在研究期間增重。

增重240至1,540公克。相較於其他母豬產下的仔豬，母豬2088產下的仔豬沒有臨床徵象。只有兩頭仔豬(342 T1和336 T3)在一次觀察時的糞便計分為2。在納入或不納入這頭母豬之仔豬的情況下進行分析。用鹽水治療的23隻豬有13隻(57%)死於大腸桿菌病。用免疫調節劑組合物1X治療的22隻豬有9隻(41%)死於大腸桿菌病。用免疫調節劑組合物5X治療的23隻豬有9隻(39%)死於大腸桿菌病。排除某頭母豬(2088)之仔豬，分析如下：20隻用鹽水治療的豬有13隻(65%)死於大腸桿菌病。用免疫調節劑組合物1X治療的19隻豬有9隻(53%)死於大腸桿菌病。用免疫調節劑組合物5X治療的20隻豬有9隻(45%)死於大腸桿菌病。

大腸桿菌菌株MVS # 2能夠在於出生當日受到攻毒的易感型新生仔豬體內引起死亡、臨床徵象和腹瀉。相較於對照，用免疫調節劑組合物治療仔豬在數值上降低了治療組(1X及5X)的死亡率，但無統計差異。以更大量樣品重複研究，提供更充分的統計分析檢定力。

實例6. 於自然攻毒斷奶豬隻模型中，(IC-Ex.1)組合物在預防或減輕與大腸桿菌有關之腹瀉方面的效力

本研究之目的在於確定投與IC-Ex.1在豢養於商用畜舍條件下之斷乳豬隻體內預防或減輕大腸桿菌病相關腹瀉的臨床有效性。

測試系統採用兩個不同來源農場的兩群商用斷奶豬群：散播豬群(seeder pig)(N=50)及候選豬群(N=454)。散播豬在研究第-8天到達定點。在研究第-4天，50%的散播豬在臨床上記錄患有大腸桿菌病且確認為β溶血型大腸桿菌(bHEC)。依據糞便計分(0=正常，1=腹瀉)判定豬隻在臨床上罹病。當應用至參與的豬隻時，糞便計分方法用作研究的效力評估指標。在研究第-1天將所有候選豬(參與的候選豬)秤重。候選豬的平均抵達體重為13.6磅。候選豬為21天大及在抵達當天斷奶。為了要在候選豬群中建立大腸桿菌病爆發，所有候選豬隻在抵達後與單獨一個欄舍的散播豬隻混合。之後的日曆天，候選豬隻有8%(36/454)記錄為在臨床上患有大腸桿菌病，與在開始研究第0天所需的5%閾值相符。

在研究第0天，從研究中汰除所有散播豬隻，記錄每隻候選豬隻的個別糞便計分，汰除臨床上罹病的候選豬隻，並將十個欄舍的41頭臨床上正常的候選豬隻加入研究且投與測試材料。紀錄所有參與豬隻的糞便計分連續5天(研究第1至5天)。測試系統由五個治療組所組成：經口服(PO)投與2mL體積的5%葡萄糖水(D5W)、以2mL體積投與的20μg劑量IC-Ex.1(PO_2)、以10mL體積PO投與的20μg劑量IC-Ex.1(PO_10)、以2mL體積肌肉內投與的20μg劑量IC-Ex.1(IM)，以及以1mL體積直腸內投與的20μg劑量IC-Ex.1(IR)。所有劑量的IC-Ex.1如在D5W中的懸浮液般製備。治療組之間在第0天的體重統計分析沒有統計差異(p=0.1725)。在這項研究中，相對於對照組，於斷奶時投與20μg IM劑量的IC-Ex.1會預防與腸毒素大腸桿菌(F18)相關的腹瀉發生達33.3%(信賴區間[CI]；21.9%、43.1%)。此外，PO_2、PO_10，IM和IR治療組相對於對照減輕腹瀉頻率分別達22.4%(CI；17.8%、27.1%)、18.5%(CI；8.6%、28.4%)、65.1%(CI；58.7%、71.5%)與20.4%(CI；12.8%、28%)。五個治療組間沒有觀察到死亡率有統計顯著差異(p>0.05)。在收集並提交培養的50個(散播豬隻)糞便樣品中，於92.0%(n=46)的提交樣品中偵測到大腸桿菌F18菌毛抗原。在這個樣品群中沒有偵測到其他菌毛抗原。此外，在這個樣品群中回收大腸桿菌毒素基因EAST1(100.0%，n=50)、STa(92.0%，n=46)，以及STb(100.0%，n=50)與AIDA黏附基因一起(12.0%，n=6)。

在這項研究中，在斷奶時肌肉內投與20μg劑量的IC-Ex.1能預防腸毒素大腸桿菌(F18菌毛抗原、EAST1、STa和STb毒素基因，與AIDA黏附基因)相關的腹瀉發生率。此外，所有治療組相對於對照減輕腹瀉頻率。

表70. 研究組別

測試系統的建立

大腸桿菌在bHEC+豬隻中的實驗室診斷

來自潛在bHEC+豬隻的直腸拭子收集物。在抵達當天收集散播豬隻的直腸拭子並送到MRI進行分離與β溶血型(bHEC)大腸桿菌的半定量評估。當有約50%或更多的散播豬隻/bHEC+豬隻表現出大腸桿菌病的臨床徵象時，再次於研究現場從牠們身上收集直腸樣品。約50%的散播豬隻/bHEC+豬隻在臨床上罹病並確認為bHEC+時，購買有454隻豬的候選池並在抵達研究現場後與散播豬隻/bHEC+豬隻混合在一個欄舍內。

拭子收集，處理和實驗室程序。收集直腸拭子並置於具有Amies運送介質的管內。試管標有豬隻ID、研究編號、樣品類型和收集日期。樣品與冰包一起放置且在收集後24小時內發送。所有直腸拭子是根據以下程序進行處理：直腸拭子直接劃線接種於5%綿羊血瓊脂(BA)和MacConkey瓊脂(MAC)上。BA盤劃線到第一象限和交叉劃線分離以允許bHEC的半定量。最多四個拭子樣品劃線到一個MAC盤上。BA盤和MAC盤在36℃±2℃下有氧培育過夜。分別依據bHEC的以下方案對主要分離BA盤進行計分。MAC用於協助確認是否存在有典型大腸桿菌菌落。

從主要BA的一個假定bHEC菌落繼代培養至新鮮BA和 MAC。一個(或多個)分離株在評估技術人員的判斷下被選出。相同的接種物用於接種三糖鐵瓊脂(TSI)和西蒙氏(Simmon’s)檸檬酸鹽瓊脂(SC)斜面。BA、MAC和TSI斜面在36±2℃下培育過夜，而SC斜面在36±2℃下培育歷時2天。

若滿足以下標準，分離株便被確認為bHEC：

●分離株在MAC上具有典型菌落型態，並在BA上顯示β溶血

●酸/酸/H2S-/氣體的典型TSI反應

●典型的陰性SC反應

進一步使用MALDI Biotyper Classification系統來證實大腸桿菌分離株。

於愛荷華州立大學對所有經確認分離株進行基因型檢測，以評估下列基因的存在：EAST 1毒素、LT毒素、STa毒素、STb毒素、Stx1毒素、Stx2毒素、Stx2e毒素、F18菌毛、F41菌毛、K88菌毛、K99菌毛、987P菌毛、AIDA黏附、EAEA黏附和PAA黏附。

動物納入標準

散播豬隻被證實在購買前帶有bHEC及/或在被送至研究地點時確認為bHEC+的同代豬隻群於送至研究地點之前14天內沒有接受任何抗生素投與。散播豬隻最近斷奶且由視覺評估沒有明顯損傷或身體異常，但可顯示出大腸桿菌病的臨床徵象。而且，散播豬隻經實驗室證實帶有bHEC(約50%)，歸類為「臨床上罹病」的豬隻(如程序第14段項目9中所定 義)，並在與候選豬隻混合之前有鹼性糞便pH。

候選豬隻在抵達研究地點的14天內未接受任何抗生素治療，並且在抵達研究地點之前2天或較少天數內斷奶，斷奶當天是19天大或更大且在與散播豬隻混合之前根據視覺評估被認為大體上健康；抵達後負重跛行的豬隻仍有資格參與本研究，除非根據獸醫觀察結果，被認為病況嚴重。預期一些動物在運送後會輕度跛行。在研究第0天，候選豬隻被分類為臨床上正常，如程序第15段項目8中所定義，但是依據所記錄的計分，大約5%或更多的欄舍同伴在臨床上罹患大腸桿菌病。

動物汰除標準

若候選豬隻在研究第0天於欄舍安置/治療分派或治療投與時具有一或多個下列特質，牠們會被排除加入：腹股溝疝及/或臍疝；直腸脫垂或其他明顯的身體異常或損傷，經獸醫判定病況影響動物的正常生長機能，分類為「臨床上罹病」，如程序第15段項目9中所定義；如經獸醫鑑定為非負重跛足；神經學疾病的徵象；垂死或末期疾病的豬，額外豬隻。被汰除的豬隻記錄在動物汰除表格上。

治療後汰除標準

被認為是因為大腸桿菌病而垂死的參與豬隻從研究予以汰除，並且在臨床獸醫判斷下予以安樂死。這些豬被認為是治療失敗。汰除因為大腸桿菌病以外的因素而變得垂死或死亡的參與豬隻。在最終分析中，這些豬不會被認為是治療失敗。罹患任何其他疾病或病況之可能混淆研究目的或防止研究完成的參與豬隻從研究被汰除且安樂死。這些動物不被認為是治療失敗並從最終分析中被汰除。

分派至陰性對照組的豬隻投與單一PO給藥的D5W，如被分派至PO IC-Ex.1治療組的豬隻所述般進行遞送。

研究

採購五十頭散播豬隻並在一部分豬隻已確認患有bHEC之後被運送到研究現場。在抵達研究現場後收集所有散播豬隻的直腸拭子。拭子被送到MRI實驗室進行bHEC分離和鑑定。每日使用程序中所述臨床計分標準來評定散播豬隻的大腸桿菌病臨床徵象。只有臨床上罹病的豬隻會在觀察期間被記錄下來。將個別直腸拭子的pH記錄在腹瀉計分為1至少一天處。當約50%的一群散播豬隻被分類為臨床上罹病並證實帶有bHEC，購買候選豬隻池並與散播豬隻混合。

自然攻毒階段候選：散播混合及參與

自然攻毒階段開始是候選豬隻與散播豬隻混合的日期：研究第-1天。自然攻毒階段結束是大約5%或更多的候選豬隻池經證實在臨床上患有大腸桿菌病的日期。在研究第0天，36頭豬隻(7.9%；454中的36)被認為在臨床上罹病，具有「1」的腹瀉計分並從研究中被汰除(未治療)。另外八頭符合納入標準的豬隻被汰除(多餘的豬)。所有剩餘的豬隻滿足如上所列的納入標準，並在研究中被加入。在研究第0天汰除並記錄所有散播豬隻。

本研究採用從商用畜舍豬隻設施而來的豬隻並且在斷奶之 前或斷奶時不投與抗生素。候選豬隻是健康的，並在購買時並沒有正在發生中的大腸桿菌病。所有豬隻在21日齡大，就在牠們抵達研究現場那天。在研究第-1天記錄所有候選豬隻的體重並且記錄在體重表格上。在豬隻抵達後一天起，對所有候選豬隻與散播豬隻進行每日整體健康觀察且紀錄，直到自然感染階段結束(研究第0天)。在這個階段期間，僅對臨床上罹病或異常結果進行計分。每天觀察所有候選豬隻的大腸桿菌病臨床徵象。

臨床有效性階段：臨床計分和不良事件報告

當研究人員確信約5%或更多候選池在單日內臨床上罹患大腸桿菌病時，測定候選池內所有豬隻的糞便計分。當大腸桿菌病爆發的閾值獲得臨床腹瀉計分證實，候選池的豬隻被認為有資格投與測試材料。按編號(例如欄舍1、2、3…)依序將所有研究欄舍補入符合資格的候選豬隻。盡量維持所有欄舍的豬隻數量平衡。從研究第0天開始，每天觀察所有參與的豬隻(410)的不良事件與糞便計分至研究第5天。在臨床觀察時對所有參與的豬隻進行每日整體健康觀察。

使用的統計方法。具有信賴區間的預防和減輕分率計算(R第3.1.3版中的PF與MF套裝軟體)，廣義線性混合模型(GLMM)和方差分析(ANOVA)(SAS®第9.3版；SAS Institute，Cary，NC)被用來分別評估腹瀉、死亡率和每日平均增重的主要參數，使用α為0.05作為統計顯著。豬隻在本研究中被認為是實驗單位。然而，預防分率分析認為欄舍(每組n=2)作為分析的實驗單位。

模型驗證。在5天研究期的過程期間表現出腹瀉的對照組豬隻(研究組T01)數量證實這個疾病模型足以測試治療組是否對預防腹瀉發生及/或減輕與bHEC相關之腹瀉的頻率具有正向效用。這圖例說明在圖29和表75中。

STa和STb毒素、EAST1毒素、F18菌毛和AIDA黏附素基因被發現存在於50隻bHEC+散播豬隻中的大多數。在D5W治療組中，腹瀉的發生率高(99%，依據SD4)證明候選豬隻透過與散播豬隻群混合而以bHEC 適當攻毒。

IC-Ex.1在斷奶豬隻中預防或減輕大腸桿菌病的有效性。在這項研究中，於斷奶時投與2mL肌肉內20μg劑量的IC-Ex.1會預防與內毒素大腸桿菌相關的腹瀉發生(F18菌毛、EAST1、STa和STb毒素，與AIDA黏附素基因)。此外，所有治療組相對於對照減輕腹瀉的頻率。

實例8. 在用IC-Ex.1治療之後產生的免疫路徑和細胞介素

實驗程序之目的是要確定受到IC-Ex.1刺激的免疫學路徑。

從豬隻抽血並且由血液樣品使用磁性細胞分離來分離免疫細胞(圖30)。在活體外培養包含樹突細胞以及單核細胞的172a+細胞，以及包含天然殺手T細胞與B細胞的172a-細胞。參照表77，將培養物用不同濃度的IC-Ex.1、經充分表徵的免疫刺激劑CpG ODN、嘎德莫特(Gardiquimod)、PAM3Cys和LPS，或空對照脂質刺激並培養18小時。上清液用ELISA或Luminex Multiplexing分析IFN-α、TNF-α、IL1β、IL10、IL12p40、IL4、IL6、IL8、IFN-γ的存在。

使用流式細胞術來確定在IC-Ex.1治療之後，負責生產細胞介素的細胞類型。以布雷菲德菌素A(brefeldin A)處理細胞培養物。布雷菲德菌素A抑制高爾基複合體，使得在細胞中產生的細胞介素保留在細胞內。這些保留的細胞介素可用經螢光團標記的抗體來檢測。

結果 A. 生理學相關劑量的IC-Ex.1誘導大量的IFN-α。

圖31顯示，生理學相關濃度的IC-Ex.1會刺激CD172a+細胞中的IFN-α表現。IFN-α在宿主對抗病毒與其他細胞內病原體的防禦方面非常重要。

相反地，CD172a-細胞在用IC-Ex.1刺激之後不會產生細胞介素，暗示著IC-Ex.1在這些細胞的細胞介素表現中並不是有力的活化劑。因為這些細胞需要從活化的單核細胞或樹突細胞的訊息來變得被活化，它們很可能不是IC-Ex.1的主要標的。但是，這些細胞可能涉及活體內IC-Ex.1反應，但它們的參與可能不包括與IC-Ex.1直接交互作用。參見圖32，CD172a-細胞在用IC-Ex.1或用已知免疫刺激劑刺激後並不會產生IFN-α。出於同樣的原因，CD172a-不會產生INFα，CD172a-細胞在用IC-Ex.1或已知刺激劑刺激之後也不會產生TNF-α(圖33)。

B. 漿細胞樣樹突細胞透過IC-Ex.1被活化而產生IFN-α。

採用流式細胞術來識別由IC-Ex.1所活化的細胞類型，以及 因為IC-Ex.1刺激所生產的細胞介素。參見圖34 A-D，用對照脂質刺激的CD14+單核細胞、傳統樹突細胞(cCD)，或漿細胞樣樹突細胞(pDC)無法生產數量顯著的INFα。同樣的，圖35 A-C、圖36 A-C與圖37 A-C顯示，CpG ODN、IC-Ex.1(100ng/mL)以及IC-Ex.1(10ng/mL)分別不會刺激CD14+單核細胞或cDC。但是，CpG ODN、IC-Ex.1(100ng/mL)以及IC-Ex.1(10ng/mL)確實會在pDC中刺激IFN-α產生(分別為圖35D、36D，以及37D)。

IC-Ex.1與脂質體的直接比較顯示，在pDC中的刺激效用最有可能不是因為單獨脂質體，而是脂質體與本文所述核酸分子的組合。圖38 A-C和圖39 A-C顯示，100ng/mL濃度的IC-Ex.1或100ng/mL的脂質體都不會在CD14+單核細胞或cDC中誘發IFN-α產生。圖38 D和圖39 D圖例說明IC-Ex.1(100ng/mL)在pDC中刺激IFN-α產生的能力，而脂質體(100ng/mL)未能在pDC中生產IFN-α。

即使10ng/mL的IC-Ex.1就足以使得細胞介素產生。而IC-Ex.1(10ng/mL)和脂質體(10ng/mL)未能在CD14+單核細胞或cDC中產生IFN-α(圖40 A-C和圖41 A-C)，10ng/mL的IC-Ex.1就足以在pDC中刺激IFN-α產生。10ng/mL脂質體未能產生類似於10ng/mL IC-Ex.1的結果(圖40 D和圖41 D)。

參見圖42，鑑定為干擾素生產細胞的細胞百分率最高為CpG ODN和IC-Ex.1(100ng/mL和10ng/mL)。pDC中的最高平均螢光強度(MFI)也是CpG ODN和IC-Ex.1(100ng/mL和10ng/mL)(圖43)。

C. 生理學相關劑量的IC-Ex.1誘發IFN-γ和IL-4。

當用生理學相關劑量的IC-Ex.1刺激時，CD172+富集細胞產生IFN-γ。這種產生可能是源自殘留在CD172+細胞部分中的CD172-細胞，因為細胞類型之間的相互作用對於IFN-γ生產來說是必要的。參見圖44，相 較於其他已知免疫刺激劑，IC-Ex.1出乎意料是IFN-γ生產的最有力誘導劑，甚至測試最不濃的IC-Ex.1(1ng/mL)也會誘發可偵測到數量的IFN-γ。也測試cGAMP誘導IFN-γ生產的能力。圖44還顯示，cGAMP誘導IFN-γ生產，這指出IFN-γ生產的STING路徑活化能力。

當受到生理學相關劑量的IC-Ex.1刺激時，CD172+富集細胞也生產IL-4。圖45顯示，1μg/mL的IC-Ex.1誘導的IL-4生產在含量上可與最高劑量的CpG ODN(5μg/mL)相比擬。

在用IC-Ex.1刺激後，也產生其他細胞介素，儘管與陽性對照相比是在較低的水平。例如，IC-Ex.1是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10的弱誘導劑。圖46-48顯示，IC-Ex.1以類似於CpG ODN的水平誘導這些細胞介素的表現，但低於LPS(1μg/mL)和PAM3Cys(10μg/mL)。

實例9：IC-Ex.1保護單核細胞衍生的巨噬細胞免於PRRS病毒。

探究IC-Ex.1賦予對病毒感染抗性的能力，因為IC-Ex.1是IFN-α的誘導劑，且因為IFN-α是宿主防禦對抗病毒感染的關鍵成分。如實例8中所述，衍生自豬隻血液之單核細胞活體外培養物用IC-Ex.1或IFN-γ處理，IFN-γ已知會增加對細菌感染的抵抗力。處理後，細胞接種PRRS且評估感染率。

結果

相較於未經處理的細胞，在暴露於PRRS之前用IC-Ex.1處理的細胞較少受到感染。圖49顯示，IC-Ex.1預處理會產生與用IFN-γ預處理之細胞般的經PRRS感染的細胞百分率。IC-Ex.1預處理後，細胞感染的百分率小於在沒有預處理的情況下感染PRRS之細胞百分率的一半。

鑑於上述情況，可以看出本發明的數個目的並獲得其他有利結果。

由於在上述產物、組合物及方法中可在不偏離本發明範疇的情況下進行改變，希望上述說明中所含以及下面圖式中所示的全部內容應被解釋為說明性的而不具有限制意義。

<110>

<120> 豬物種中增強之免疫反應

<130> BAYR

<150> 62/199,848

>151> 2015-07-31

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pGCMB75.6的核苷酸序列

<400> 1

<210> 2

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pMB75.6的核苷酸序列

<400> 2

<210> 3

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pMB75.6_AscI的核苷酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 4242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 質體pLacZMB75.6的核苷酸序列

<400> 4

Claims (25)

1. 一種在接受者豬物種個體中誘發免疫反應的方法，其包含向豬物種個體投與有效量的免疫調節劑組合物，其中該免疫調節劑組合物包含含有至少一個免疫刺激性CpG基序、至少一個非免疫刺激性CpG基序的核酸序列，以及陽離子脂質體。
2. 如請求項1之方法，其中該脂質體遞送載劑包含選自由多層囊泡脂質和擠壓脂質(extruded lipid)組成之群的脂質。
3. 如請求項1之方法，其中該脂質體遞送載劑包含選自由以下組成之群的成對脂質：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和膽固醇；二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇。
4. 如請求項1之方法，其中該免疫調節劑組合物進一步包含生物劑或與生物劑組合投與。
5. 如請求項1之方法，其中該投與是在暴露於感染物之前。
6. 如請求項1之方法，其中該投與是在暴露於感染物之後。
7. 如請求項1之方法，其中該免疫調節劑組合物包含與選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4組成之群的序列具有至少80%序列一致性的核酸序列。
8. 如請求項4之方法，其中該生物劑是選自由免疫增強蛋白、免疫原、疫苗，抗微生物劑及其任何組合組成之群。
9. 如請求項1之方法，其中該豬物種個體為食物生產豬動物。
10. 如請求項1之方法，進一步包含醫藥上可接受之載體。
11. 一種增進在農場中養殖之豬產量的方法，其包含向豬投與免疫調節劑組 合物，其中該免疫調節劑組合物包含含有至少一個免疫刺激性CpG基序的核酸序列，以及陽離子脂質體。
12. 一種增進在農場中養殖之豬的存活率的方法，包含向豬投與免疫調節劑組合物，其中該免疫調節劑組合物包含含有至少一個免疫刺激性CpG基序的核酸序列，以及陽離子脂質體。
13. 一種在豬隻中減少腹瀉的方法，包含向豬隻投與有效量的免疫調節劑組合物，其中該免疫調節劑包含：a. 陽離子脂質遞送載劑；以及b. 不編碼免疫原的核酸分子，其中該投與會在用大腸桿菌攻毒之後降低該豬隻的腹瀉。
14. 如請求項13之方法，其中該核酸分子為細菌衍生的核酸分子載體或其片段。
15. 如請求項13之方法，其中該核酸分子為DNA質體。
16. 如請求項13之方法，其中該脂質體遞送載劑包含選自由以下組成之群的成對脂質：N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和膽固醇；二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇。
17. 如請求項13之方法，其中投與發生在用大腸桿菌攻毒之前。
18. 如請求項13之方法，其中該免疫調節劑組合物進一步包含生物劑或與生物劑組合投與。
19. 一種在豬隻中增加增重的方法，其包含向豬隻投與免疫調節劑組合物，其中該免疫調節劑包含：a. 陽離子脂質遞送載劑；以及 b. 不編碼免疫原的核酸分子，其中該投與會在用豬生殖及呼吸症候群病毒(PRRSV)攻毒之後增加該豬隻的增重。
20. 如請求項18之方法，其中該核酸分子為細菌衍生的核酸分子載體或其片段。
21. 如請求項18之方法，其中該核酸分子為DNA質體。
22. 如請求項18之方法，其中該脂質體遞送載劑包含選自由以下組成之群的成對脂質：N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)和膽固醇；N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTAP)和膽固醇；1-[2-(油醯氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羥乙基)-咪唑啉鎓氯化物(DOTIM)和膽固醇；二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和膽固醇。
23. 如請求項18之方法，其中投與發生在用PRRSV攻毒之前。
24. 如請求項18之方法，其中該免疫調節劑組合物進一步包含生物劑或與生物劑組合投與。
25. 如請求項23之方法，其中該生物劑為PRRSV疫苗。