TW201712016A

TW201712016A - 刻痕（ｎｏｔｃｈ）路徑傳訊抑制化合物

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Publication number: TW201712016A
Application number: TW105119456A
Authority: TW
Inventors: 茱莉亞瑪麗克雷; 亞伯特艾吉; 約翰Ｃ吉爾; 菲利普亞瑟希普斯金; 巴哈瑞溫柯瑪派特爾; 艾司海矛斯漢里庫司吉拉杜斯范; 亞隆Ｄ伍羅伯里斯基; 蕭佳音
Original assignee: 美國禮來大藥廠; 奧迪恩治療公司
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2016-06-21
Publication date: 2017-04-01
Also published as: IL255726B; HK1247187B; JO3491B1; WO2017007702A1; EP3319967B1; CA2987431C; MX376082B; ES2735139T3; HUE044666T2; EA032634B1; MX2017016555A; PH12018500047A1; EP3319967A1; TWI625332B; CR20220368A; DK3319967T3; KR102078946B1; KR20180011314A; CO2018000224A2; EA201792478A1

Abstract

本發明提供可用作刻痕路徑傳訊抑制劑之化合物或其醫藥上可接受的鹽、及含該等化合物或其醫藥上可接受的鹽之醫藥組合物，用於治療指定癌症、由聽覺毛細胞損失引起之感覺神經性(sensorineural)聽力損失，及誘導聽覺毛細胞生成。

Description

刻痕(NOTCH)路徑傳訊抑制化合物

每年，由於老齡化、曝露於噪音、曝露於化學劑、藥品、疾病及遺傳疾病使內耳感覺毛細胞損失導致許多人出現聽力障礙。無論病源學如何，位於耳蝸柯蒂氏(Corti)器官內的機械感覺毛細胞死亡或功能障礙係感覺神經性聽力損失(SNHL)之主要病因。抑制聽力損失之預防措施主要限於外周保護，諸如耳塞或減噪或消噪耳機。當前SNHL治療主要基於電子技術，諸如利用助聽器放大聲音或透過利用耳蝸植入物以電學方式刺激存活的螺旋神經節神經元來繞道毛細胞。亦已建議針對突發性感覺神經性聽力損失投與類固醇來達到全身治療或鼓室內治療。

耳蝸感覺上皮包含適應檢測聲音振動之毛細胞，聲音振動係由位於毛細胞頂端表面之硬纖毛轉換成電脈沖，並透過第VIII腦神經傳遞至腦。發育期間產生之聽覺毛細胞係有絲分裂後，且在哺乳動物中喪失後無法替換，或作為正常細胞更新的一部分。因此，由於聽覺毛細胞損失引起之SNHL係不可逆的。胚胎期內聽覺毛細胞發育包括分化，其中前感覺(prosensory)上皮細胞透過側抑制過程(由刻痕傳訊介導)具有不同命運，成為毛細胞或支柱細胞。前感覺上皮細胞藉由由相鄰毛細胞上之配體刺激之主動刻痕傳訊防止分化為毛細胞。此等細胞變成支柱細胞。

刻痕傳訊為在哺乳動物發育及組織穩衡作用中發揮不可或缺作用之保守進化路徑。刻痕受體及配體包含單次跨膜結構域，在細胞表面上表現，且基於此原因，刻痕傳訊在介導表現該等受體及配體之鄰近細胞之間的通訊上尤為重要。已在齧齒動物及人類中發現4種已知刻痕受體，稱之為刻痕1至刻痕4。該等刻痕受體為由胞外及胞內結構域組成之雜二聚蛋白質，其在最初係以單多肽形式合成。受體-配體相互作用觸發刻痕受體多肽發生一系列蛋白質水解裂解，其中涉及γ分泌酶活性。γ-分泌酶活性可裂解來自質膜內側之刻痕胞內結構域，其移位至細胞核，而形成轉錄因子複合體。刻痕胞內結構域(NICD)為蛋白質之活性形式。不同刻痕傳訊功能包括增殖、分化、細胞凋亡、血管生成、遷移及自行更新。此等刻痕傳訊於正常組織發育及維持期間之不同角色可在不同形式之癌症中被異常激活。刻痕傳訊之致癌功能包括抑制細胞凋亡及促進細胞增殖。

γ-分泌酶在刻痕活化級聯中發揮樞轉作用。因此，已積極探討γ-分泌酶之抑制劑於阻斷刻痕受體活化以治療癌症上之潛力。儘管繼續進行臨床試驗，但市面上尚未出現刻痕抑制劑化療藥物。

透過刻痕傳訊路徑，γ-分泌酶亦在前感覺細胞分化中發揮樞轉作用。因此，已積極探討γ-分泌酶之抑制劑於阻斷刻痕受體活化以治療SNHL上之潛力。不藉由各種方法投與刻痕抑制劑以進入系統循環來誘導長時間、異常高水平地表現無調性(atonal)同源物1(Atoh1或Math1)，誘導耳蝸環境中以更靶向表現水平表現Atoh1一段時間將係有效且令人滿意的。無法調節Atoh1仍係聽覺毛細胞研究及針對聽覺毛細胞再生之治療劑研發之障礙。雖然還在繼續探究，諸如WO 2014/039781，但市面上尚未出現用於治療由聽覺毛細胞損失引起之感覺神經性聽力損失之刻痕抑制劑。

需要尋找具有刻痕路徑傳訊抑制活性之化合物。另外需要尋找藉由γ-分泌酶抑制活性抑制刻痕路徑傳訊之化合物。亦需要尋找具有可促進刻痕路徑傳訊及γ-分泌酶抑制活性之獨特結構特徵的化合物。另外需要尋找藉由刻痕路徑傳訊誘導Atoh1表現之化合物。另外需要尋找顯示期望吸收、分佈、代謝及排泄性質之化合物。

本發明之一態樣提供一種具有以下結構之化合物：

4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺、或其實質上非對映異構純異構體、或以上任一者之醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣係一種具有以下結構之化合物：

N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺、或其實質上非對映異構純異構體、或以上任一者之醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供一種醫藥組合物，其包含化合物1或其實質上純的對映異構體；或化合物2或其實質上純的對映異構體；或以上任一者之醫藥上可接受的鹽、及醫藥上可接受的載劑。

本發明之另一態樣提供一種治療患者之癌症之方法，該癌症係T-細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、三陰性乳癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭頸癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、口腔鱗狀細胞癌、皮膚癌、神經管胚細胞瘤、血管肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、肝細胞癌、肝內及肝外膽管癌及腺樣囊性癌，其包括向有需要之患者投與治療上有效量之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供一種治療患者肺癌之方法，其包括向有需要之患者投與治療上有效量之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供一種治療有需要之患者之由聽覺毛細胞損失引起之感覺神經性聽力損失之方法，其包括向該患者投與治療上有效量之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供一種誘導有需要之患者之聽覺毛細胞生成之方法，其包括向該患者投與治療上有效量之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供用於治療之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供用於治療以下疾病之化合物1、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受的鹽：T-細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、三陰性乳癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭頸癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、口腔鱗狀細胞癌、皮膚癌、神經管胚細胞瘤、血管肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、肝細胞癌、肝內或肝外膽管癌或腺樣囊性癌。

本發明之另一態樣提供用於治療肺癌之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供用於治療由聽覺毛細胞損失引起之感覺神經性聽力損失之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供用於誘導聽覺毛細胞生成之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供化合物1、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受的鹽之用途，其用於製造用於治療以下疾病之藥劑：T-細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、三陰性乳癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭頸癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、口腔鱗狀細胞癌、皮膚癌、神經管胚細胞瘤、血管肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、肝細胞癌、肝內或肝外膽管癌或腺樣囊性癌。

本發明之另一態樣提供化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽之用途，其用於製造用於治療肺癌之藥劑。

本發明之另一態樣提供化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽之用途，其用於製造用於治療由聽覺毛細胞損失引起之感覺神經性聽力損失之藥劑。

本發明之另一態樣提供化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽之用途，其用於製造用於誘導聽覺毛細胞生成之藥劑。

本發明之另一態樣提供一種治療犬科伴侶動物之由聽覺毛細胞損失引起之感覺神經性聽力損失之方法，其包括向該犬科伴侶動物投與治療上有效量之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

本發明之另一態樣提供一種誘導有需要之犬科伴侶動物之聽覺毛細胞生成之方法，其包括向該犬科伴侶動物投與治療上有效量之化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。

片語「化合物1、其非對映異構體」意指4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺；或非對映異構體4,4,4-三氟 -N-((S)-1-(((S)-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺或4,4,4-三氟-N-((S)-1-(((R)-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺。片語「化合物2、其非對映異構體」意指N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺；或非對映異構體N-((S)-1-(((S)-8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺或N-((S)-1-(((R)-8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺。

術語「患者」意指哺乳動物，且「哺乳動物」包括(但不限於)出生後時期的人類。人類的出生後時期係從剛分娩後開始並持續30天的時期。

「治療上有效量」或「有效量」意指化合物1、其實質上純非對映異構體(異構體1或異構體2)、或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體(異構體1或異構體2)、或其醫藥上可接受的鹽、或含以上任一者之醫藥組合物抑制癌症患者之刻痕傳訊，且破壞目標癌細胞或減緩或阻止患者癌症進展所必需之劑量。類似地，「治療上有效量」或「有效量」意指化合物1、其實質上純非對映異構體(異構體1或異構體2)、或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體(異構體1或異構體2)、或其醫藥上有效的鹽、或含以上任一者之醫藥組合物抑制由聽覺毛細胞損失或損傷引起之感覺神經性聽力損失患者之刻痕傳訊、或誘導聽覺毛細胞生成所必需之劑量。

「化合物1或化合物2之實質上純非對映異構體」意指實質上不含其他異構體之異構體1或異構體2。當化合物1之6-位或化合物2之5-位之異構體純度大於90%對映異構性超量時，化合物1或化合物2係「實質上非對映異構純」。在另一實施例中，化合物1之6-位或化合物2之5-位之異構體純度大於95%對映異構性超量。在還有另一實施例中，化合物1之6-位或化合物2之5-位之異構體純度大於98%對映異構性超量。在又一實施例中，化合物1之6-位或化合物2之5-位之異構體純度大於99%對映異構性超量。本發明內涵蓋化合物1或化合物2之所有立體異構體(包括非對映異構混合物)。

化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽用於治療癌症之預期劑量在0.1至100mg/患者/天之範圍內。預期較佳劑量在1.0至75mg/患者/天之範圍內。預期最佳劑量在2.0至50mg/患者/天之範圍內。化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽用於治療由聽覺毛細胞損失或損傷引起之感覺神經性聽力損失、或誘導聽覺毛細胞生成之預期劑量在0.01至100mg/患者/天之範圍內。預期較佳劑量在0.1至10mg/患者/天之範圍內。預期最佳劑量在0.2至1.0mg/患者/天之範圍內。

就癌症、感覺神經性聽力損失或誘導聽覺毛細胞生成而言，治療患者所需之確切劑量及治療時長將由醫生基於疾病階段及嚴重性以及個別患者之具體需求及反應決定。雖然基於每日給出劑量，但可調整投與方案以為患者提供更佳治療益處及管理及改善任何藥物相關毒性。除每日投與以外，亦可適當採用每隔一天投與(Q2D)；五天內每隔一天投與，隨後兩天不給藥(T.I.W.)；每隔兩天(Q3D)；在21天給藥週期內每週一次(Q.I.W.)；或其他投與方案。

術語「治療」意在包括干預癌症、由聽覺毛細胞損失或損傷引起之感覺神經性聽力損失、或誘導聽覺毛細胞生成之全部範圍，諸如投與活性化合物以改善、減緩或逆轉一或多種症狀及延遲患者罹患之癌症或聽覺毛細胞損失或損傷之進展、或誘導患者之聽覺毛細胞生成。

「犬科伴侶動物」意指馴化及家養犬科動物，包括(但不限於)寵物、服務犬、搜救犬、放牧犬及牲畜保衛犬。

人類之「聽覺聽力損失」、「感覺神經性聽力損失」或「聽力損失」意指患者之聽閾(具體頻率下聽到之最輕聲音(強度))，輕度為21至40dB；中度為41至55dB；中度至重度為56至70dB；重度為71至90dB；且深度為91dB及以上。測試強度通常在0dB至120dB之範圍內。測試頻率通常為250、500、1000、2000、4000及8000Hz。診斷聽力評估係藉由熟習此項技術者已知並使用之常規測試進行，包括純音測聽法(包括純音聽閾均值)、言語測聽法(包括言語感受閾)、聽覺腦幹反應評估(ABR或BAER)、經鼓膜耳蝸電描計術(ECOG)及耳聲發射測試(OAE)。小兒及嬰兒評估亦藉由熟習此項技術者已知並使用之常規測試進行，包括視覺強化測聽法、遊戲測聽法、耳聲發射(OAE)及聽覺腦幹反應評估。

本發明化合物較佳係使用醫藥上可接受之載劑調配成醫藥組合物並藉由各種途徑投與。較佳地，就治療癌症而言，此等組合物係口服投與。

就治療由聽覺毛細胞損失或損傷引起之感覺神經性聽力損失、或誘導聽覺毛細胞生成而言，可調配及投與適合口服或非經腸投與以實現局部或全身治療之醫藥組合物。口服組合物包括錠劑、包衣錠劑、硬或軟明膠膠囊、溶液、乳液或懸浮液。可調配非經腸組合物以允許投與，包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸膜內、胸骨內、經鼓膜、迷路內(intralabryinthine)或耳蝸內注射或輸注。可調配醫藥組合物以允許在向患者投與本發明組合物時該化合物具有生物可利用性，或經調配以控釋或緩釋方式釋放活性醫藥成分。適合經鼓膜投與至中耳腔之醫藥組合物係較佳，且投與至中耳圓窗龕之醫藥組合物亦係較佳。亦包括迷路內注射及耳蝸內注射。聽力損失治療之較佳投與途徑係局部經鼓膜注射，然而，此並不排除適合替代投與途徑以實現全身遞送之醫藥組合物，且可包括替代局部經鼓膜投與或除此之外之組合物及給藥方案。緩釋局部遞送組合物亦係較佳，其中釋放間隔可介於三(3)天至九十(90)天之範圍內，端視與化合物1、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受的鹽相關之遞送媒劑、或遞送媒劑混合物而定。

此項技術中熟知靶向遞送藥物之醫藥組合物、製備方法及遞送系統。參見例如REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(A.Gennaro等人編，第19版，Mack Publishing Co.,1995)；Salt及Plontke,「Principles of Local Drug Delivery to the Inner Ear」,Audiol Neurotol,2009,(14)；350-360；Rhee等人，「Sustained-Release Injectable Drug Delivery,」Pharmaceutical Technology,Special Issue Drug Delivery,01 Nov.2010。該等醫藥組合物可包含防腐劑、增溶劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、矯味劑、用於改變滲透壓之鹽、緩衝液、掩蔽劑或抗氧化劑。

本發明化合物能與諸多無機及有機酸反應以形成醫藥上可接受之酸加成鹽。該等醫藥上可接受之鹽及其常見製法係此項技術中熟知。參見例如P.Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2002)；S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts,」Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，第1期，1977年1月。

可藉由此項技術中已知之各種程序及彼等下文所述者製備化合物1、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽。具體合成步驟可以不同方式組合以製備化合物1、其非對映異構體、或其醫藥上可接受的鹽、或化合物2、其非對映異構體、或其醫藥上可接受的鹽。

化合物1命名為：4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺，且亦可命名為4,4,4-三氟-N-{(1S)-2-[(9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-6-基)胺基]-1-甲基-2-側氧基乙基}丁醯胺；且亦可命名為：4,4,4-三氟-N-[(1S)-1-甲基-2-側氧基-2-[(2,3,5,6-四氫-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-6-基)胺基]乙基]-丁醯胺；且亦可使用其他名稱來明確指定化合物1。非對映異構體命名為4,4,4-三氟-N-((S)-1-(((S)-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺及4,4,4-三氟-N-((S)-1-(((R)-9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺。亦可使用其他名稱來明確指代每種非對映異構體。

化合物2命名為：N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺，且亦可命名為N-{(1S)-2-[(8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基]-1-甲基-2-側氧基乙基}-4,4,4-三氟丁醯胺；且亦可命名為：4,4,4-三氟-N-[(1S)-1-甲基-2-側氧基-2-[(6,8,9,10-四氫-8,8-二甲基-6-側氧基-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基]乙基]-丁醯胺；且亦可使用其他名稱來明確指定化合物2。非對映異構體命名為N-((S)-1-(((S)-8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5- 基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺及N-((S)-1-(((R)-8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺。亦可使用其他名稱來明確指代每種非對映異構體。

應理解，化合物1及化合物2係用兩個固定對掌性中心中之一者來描繪。在本文中，使用(R)-及(S)-之Cahn-Ingold-Prelog命名法來指代具體異構體。可藉由立體特異性合成，使用對映異構純的或富集的起始物質製備具體立體異構體。起始物質、中間物或外消旋混合物(包括化合物1或化合物2)之具體立體異構體可藉由此項技術中熟知之技術解析，諸如彼等見於Stereochemistry of Organic Compounds,E.I.Eliel及S.H.Wilen(Wiley 1994)及Enantiomers,Racemates,and Resolutions,J.,Jacques、A.Collet及S.H.Wilen(Wiley 1991)中者，包括為此目的形成之非對映異構體(諸如非對映異構體鹽)於對掌性固定相上層析、酶法解析、或分段結晶或層析。當將對掌性化合物單離或解析成其異構體，但未確定絕對構型或旋光度時，對應於各自從對掌性層析溶離之次序將異構體任意地命名為異構體1及異構體2，且若早在合成時開始對掌性層析，則相同的命名適用於後續中間物及實例。雖然本發明內涵蓋所有含本發明化合物之混合物，但較佳實施例為化合物1異構體2、或化合物2異構體2。

在合成本發明化合物中用作初始起始物質之化合物係熟知，且在無法從市面上購得之程度上輕易使用所提供之特定參考文獻藉由一般技術者所採用或見於一般參考文本中之標準程序合成。

已知程序及方法之實例包括描述在一般參考文本中者，諸如Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers Inc,1989；Compendium of Organic Synthetic Methods，第1-10卷，1974-2002,Wiley Interscience；Advanced Organic Chemistry,Reactions Mechanisms,and Structure，第5版，Michael B.Smith及Jerry March,Wiley Interscience,2001；Advanced Organic Chemistry，第4版，Part B,Reactions and Synthesis,Francis A.Carey及Richard J.Sundberg,Kluwer Academic/Plenum Publishers,2000等，及其中所引用之參考文獻。

如本文所使用，以下術語具有所指示之含義：「mAtoh1」係指鼠科無調性(atonal)同源物1蛋白質；「hAtoh 1」係指人類無調性同源物1蛋白質；「Atoh1」係指人類基因無調性同源物1；「基本培養基」係指500ml DMEM/F12培養基+5ml N2 100X原液及10ml B27 50X原液加500μl胺苄西林(Ampicillin)原液(1000X，50mg/ml)及1667μl防治黴素(Fungizone)(300X)；「BFGF」係指基本成纖維生長因子；「DMEM」係指杜貝卡氏改良依格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle’s Medium)；「DMSO」係指二甲基亞碸；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「EGF」係指表皮生長因子；「EGTA」係指乙二醇-雙(2-胺基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸；ES/MS係指電噴霧質譜；「FBS」係指胎牛血清；「GFP」係指綠色螢光蛋白；「h」係指小時；「HBSS」係指漢克氏(Hank’s)平衡鹽溶液；「HEK」係指人類胚胎腎臟；「IC₅₀」係指藥劑產生該藥劑可能最大抑制反應之50%之濃度；「IgG」係指免疫球蛋白G；「Math1」係指人類基因無調性同源物1；「Medium A」係指200ml基本培養基+EGF bFGF+IGF-1+硫酸乙醯肝素，分別為20、10、50及50ng/ml；「MEM」係指最低必需培養基；「min」係指分鐘；「MS」係指質譜；「N1ICD」係指刻痕1細胞內結構域；「nGFP」係指核綠色螢光蛋白；「OC」係指柯蒂氏器官；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PBST」係指磷酸鹽緩衝鹽水+Tween®；「qPCR」係指定量聚合酶鏈反應；「qRT-PCR」係指定量逆轉錄聚合酶鏈反應；「rpm」係指每分鐘轉速；「RLT緩衝液」係指Rneasy溶解緩衝液；「RT」係指室溫；「Tbp」係指TATA-結合蛋白。

製備1

1-溴-3-(2-溴-4-甲氧基-苯基)丙-2-酮

在氮氣下，將三甲基矽烷基重氮甲烷(118.4mL，236.80mmol，2M含於己烷)逐滴添加至2-(2-溴-4-甲氧基-苯基)乙醯氯(52g，197.3mmol)含於四氫呋喃(197mL)及乙腈(197mL)之0℃攪拌溶液。在15分鐘後，容許溫熱至RT，並在氮氣下攪拌2h。濃縮得到紅色濃稠油(61g)。將溴化氫(36mL，197mmol，33%含於乙酸)逐滴添加至來自先前步驟之2-(2-溴-4-甲氧基-苯基)乙醯基疊氮化物含於乙酸(265mL)之5℃攪拌溶液。添加後，容許在氮氣下溫熱至RT。45分鐘，用冰/水(500mL)驟冷，得到棕色沉澱物。過濾固體，並用水(100mL)及己烷(100ml)清洗，並在45℃真空中乾燥2h，得到呈橙色油之標題化合物(63.0g，99%)。1H NMR(300MHz,CDCl₃)：7.17-7.12(m,2H),6.85(dd,J=2.5,8.5Hz,1H),4.03(s,2H),3.97(s,2H),3.79(s,3H)。

製備2

(3Z)-1-(2-溴-4-甲氧基-苯基)-3-(3,3-二甲基吡咯啶-2-亞基)丙-2-酮

在RT下，將3,3-二甲基吡咯啶-2-硫酮(26.5g，205mmol)一次性添加至製備1所提供之中間物1-溴-3-(2-溴-4-甲氧基-苯基)丙-2-酮(60.00g，186mmol)及碘化鉀(31g，86mmol)含於四氫呋喃(600mL)之懸浮液中，並攪拌1h。添加甲基第三丁醚(200mL)，過濾出固體，並用甲基第三丁醚(100mL)沖洗濾餅，得到呈淺黃色固體之1-(2-溴-4-甲氧基-苯基)-3-[(4,4-二甲基-2,3-二氫吡咯-1-鎓-5-基)硫基]丙-2-酮碘化物(100g)。向該固體(100g，201mmol)含於乙腈(1L)之懸浮液添加三乙胺(56mL，401毫莫耳)及三苯基膦(58g，221mmol)，並在65℃下攪拌2.5h。添加甲基第三丁醚(200ml)並濾出固體。蒸發濾液，用甲基第三丁醚(20mL)濕磨殘餘物並濾出固體(兩次)。蒸發合併之濾液，得到50g粗物質。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用20-50%之乙酸乙酯/己烷梯度溶離來純化殘餘物，得到呈灰白色固體之標題化合物(41g，70%)。MS(m/z)：338.0/340.0(M+/M+2)。

製備3

9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氫-1H-吡咯并[1,2-A][1]苯并氮呯-5(6H)-酮

用氮氣脫氣/沖洗(x3)由製備2提供之中間物(3Z)-1-(2-溴-4-甲氧基-苯基)-3-(3,3-二甲基吡咯啶-2-亞基)丙-2-酮(40.0g，118mmol)、乙酸鈀(2.7g，12mmol)、碳酸銫(77g，237mmol)、4,5-雙(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫噸(13.7g，24mmol)及N-甲基-2-吡咯啶酮(1.2L)之混合物。在150℃下加熱懸浮液4h。冷卻至RT，濾掉固體，用乙酸乙酯清洗並棄去固體。將乙酸乙酯(1L)及水(500mL)添加至濾液，通過矽藻土濾掉固體並棄去。分離濾液層，先後用乙酸乙酯(2 x 20mL)及二氯甲烷(3 x 100mL)從水中萃取。用5%碳酸氫鈉水溶液清洗合併之有機層兩次，在硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮得到100mL深棕色油。使材料濾過二氧化矽墊，先後用二氯甲烷及1%甲醇/二氯甲烷溶離，並濃縮濾液。將殘餘物分配於乙酸乙酯與5%碳酸氫鈉水溶液之間，用乙酸乙酯從水中反萃取，在硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮得到呈深棕色發泡體之粗製產物。將所得發泡體溶解於乙酸乙酯(250mL)中，添加SiliaBond Thiol®(80g)並在RT下攪拌過夜。濾出固體，用乙酸乙酯及二氯甲烷清洗濾餅，濃縮濾液得到呈淺棕色固體之標題化合物(19.6g，65%)。MS(m/z)：258.0(M+H)。

製備4

6-羥基亞胺基-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-5(6H)-酮

分幾份將第三丁醇鉀(11g，98mmol)添加至製備3所提供之中間物9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氫-1H-吡咯并[1,2-A][1]苯并氮呯-5(6H)-酮(16.8g，65mmol)含於四氫呋喃(336mL)中之0℃攪拌溶液，並攪拌15分鐘。逐滴添加亞硝酸戊酯(12.2mL，91mmol)，並在0℃下攪拌混合物30分鐘。將反應混合物傾倒於冰/水(200mL)上，並用乙酸乙酯(2 x 200mL)萃取混合物。濾出結晶固體，用二氯甲烷(2 x 100mL)從濾液中萃取。用鹽水(100mL)清洗合併之有機物，於硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮得到淺棕色固體。用1：1甲基第三丁醚/己烷濕磨固體，與先前收集的固體合併，得到呈淺黃色固體之標題化合物(16.5g，88%)。MS(m/z)：287.1(M+H)。

製備5

6-胺基-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-5(6H)-酮

歷時10分鐘將三氟乙酸(17mL，231mmol)逐滴添加至製備4提供之中間物6-羥基亞胺基-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-5(6H)-酮(16.5g，58mmol)及鋅粉(11.3g，173mmol)含於二氯甲烷(248mL)之5℃-10℃攪拌懸浮液，然後容許溫熱至RT。使混合物濾過矽藻土墊，將濾液傾倒於冰與飽和碳酸鈉水溶液之混合物(1：1，500mL)上。將所得懸浮液濾過矽藻土，並用二氯甲烷沖洗過濾墊。用二氯甲烷(100mL)從水層萃取，在硫酸鈉上乾燥合併之有機層，過濾並濃縮得到呈淺棕色發泡體之標題化合物(14.7g，94%)。MS(m/z)：273.1(M+H)。

製備6

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸芐酯

將L-丙胺酸芐酯鹽酸鹽(7g，32.5mmol)、二異丙基乙胺(28mL，162mmol)、羥基苯并三唑水合物(7.5g，49mmol)及1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(9.3g，49mmol)添加至4,4,4-三氟丁酸(7.1g，49mmol)含於二氯甲烷(162mL)之攪拌溶液，並在RT及N₂下攪拌20h。用20%檸檬酸水溶液(150mL)驟冷，攪拌混合物5分鐘，分離層並用二氯甲烷(100mL)從水中萃取。用飽和碳酸氫鈉水溶液(150mL)清洗合併之有機層，在硫酸鎂上乾燥，過濾並濃縮得到10.6g淡黃色固體。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用25-50%之乙酸乙酯/己烷梯度溶離來純化殘餘物，得到呈白色固體之標題化合物(9.2g，94%)。MS(m/z)：304.2(M+H)。

製備7

(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸

在RT下，將鈀(1.8g，0.8mmol，5%載於C上)添加至製備6所提供之中間物(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸芐酯(8.8g，29mmol)含於甲醇(88mL)之攪拌溶液。使混合物脫氣，在氫氣(氣球氛圍)下攪拌5h。使混合物濾過矽藻土，用甲醇清洗墊，並濃縮濾液得到白色固體。用二氯甲烷濕磨固體並於RT下真空下乾燥過夜，得到呈白色固體之標題化合物(6.11g，99%產率)。MS(m/z)：214.1(M+H)。

製備8

3-(3,3-二甲基-2-側硫基吡咯啶-1-基)丙酸甲酯

將3,3-二甲基吡咯啶-2-硫酮(15.7g，122mmol)及丙烯酸甲酯(12mL，134mmol)溶解於四氫呋喃(100mL)中，並在RT及氮氣下攪拌。添加氫氧化鈉(0.8g，20mmol)並在RT及氮氣下攪拌過夜。用鹽水稀釋，用乙酸乙酯萃取，分離層，用鹽水清洗有機層，在硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮得到27.5g粗製固體。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用20-50%之乙酸乙酯/己烷梯度溶離來純化殘餘物，得到呈白色固體之標題化合物(25.9g，99%)。MS(m/z)：216.2(M+H)。

製備9

3-[(2Z)-2-(2-乙氧基-2-側氧基-亞乙基)-3,3-二甲基-吡咯啶-1-基] 丙酸甲酯

將肆(乙酸基)二銠(II)(3.74g，8.5mmol)添加至製備8所提供之中間物3-(3,3-二甲基-2-側硫基吡咯啶-1-基)丙酸甲酯(41.4g，192mmol)含於甲苯(156mL)之攪拌溶液，並在氮氣下加熱至110℃。歷時約18h逐滴添加重氮乙酸乙酯(89mL，844mmol)，然後在110℃下加熱過夜。濃縮並經由急驟管柱層析於二氧化矽上用30%乙酸乙酯/己烷溶離來純化殘餘物，得到呈黃色油之標題化合物(34.5g，67%)。MS(m/z)：270.2(M+H)。

製備10

(2Z)-2-(3,3-二甲基吡咯啶-2-亞基)乙酸乙酯

在氮氣下，歷時45分鐘將六甲基二矽氮鉀(301mL，0.5M含於甲苯，151mmol)逐滴添加至製備9所提供之中間物3-[(2Z)-2-(2-乙氧基-2-側氧基-亞乙基)-3,3-二甲基-吡咯啶-1-基]丙酸甲酯(33.8g，126mmol)含於四氫呋喃(430mL)之攪拌溶液，用水/冰浴維持溫度<30℃。完成添加後，攪拌40分鐘。用飽和碳酸氫鈉水溶液(250mL)驟冷，然後濃縮。分配在乙醚與鹽水溶液之間，用乙酸乙酯從水中萃取(x 4)，在硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮得到37g物質。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用10%之乙酸乙酯/己烷溶離來純化殘餘物，得到標題化合物(9.1g，40%)。MS(m/z)：184.2(M+H)。

製備11

(2Z)-2-[3,3-二甲基-1-(3-甲基-2-吡啶基)吡咯啶-2-亞基]乙酸乙酯

在反應容器中將2-溴-3-甲基吡啶(1.5g，8.7mmol)、製備10所提供之中間物(2Z)-2-(3,3-二甲基吡咯啶-2-亞基)乙酸乙酯(1.6g，8.7mmol)及對稱-二甲基乙二胺(0.77mL，8.7mmol)於1,4-二噁烷(15mL)中合併。在攪拌下使氮氣鼓泡通過溶液持續10分鐘。一次性添加碳酸鉀(3.6g，26mmol)及碘化酮(I)(0.83g，4.4mmol)，密封並在120℃下加熱經攪拌混合物2天。用二氯甲烷稀釋，濾過矽藻土，並濃縮濾液。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用5-100%之乙酸乙酯/己烷梯度溶離來純化殘餘物，得到呈淡黃色油之標題化合物(1.58g，66%)。MS(m/z)：275.0(M+H)。

製備12

8,8-二甲基-9,10-二氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6(8H)-酮

經由注射器將雙(三甲基矽烷基)醯胺鈉(22mL，1M含於四氫呋喃，22mmol)添加至在反應容器中之製備11所提供之中間物(2Z)-2-[3,3-二甲基-1-(3-甲基-2-吡啶基)吡咯啶-2-亞基]乙酸乙酯(2.88g，10.5mmol)及四氫呋喃(60mL)之攪拌溶液。密封容器並在70℃下在攪拌下加熱3天。冷卻至RT，用鹽水驟冷，用乙酸乙酯萃取，在硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮得到棕色油。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用 50-100%之乙酸乙酯/己烷梯度溶離來純化殘餘物，得到呈黃色固體之標題化合物(1.70g，71%)。MS(m/z)：229.2(M+H)。

製備13

6-疊氮基-10-氮雜-3,3-二甲基-2,6-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-5-酮

在氮氣下，歷時10分鐘將二異丙基醯胺鋰(7.0mL，10.5mmol，1.5M含於己烷)添加至製備12所提供之中間物8,8-二甲基-9,10-二氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6(8H)-酮(1.85g，8.1mmol)含於四氫呋喃(50mL)之-78℃攪拌溶液。30分鐘後，經由注射器添加乙酸(2.3mL，41mmol)，然後容許在氮氣下溫熱至RT。用飽和碳酸氫鈉水溶液驟冷。將混合物分配在鹽水與乙酸乙酯之間，分離層，用鹽水清洗乙酸乙酯層，在硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮得到棕色固體。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用5-60%之乙酸乙酯/己烷梯度溶離來純化殘餘物，得到標題化合物(1.2g，55%)。MS(m/z)：270.2(M+H)。

製備14

5-胺基-3,3-二甲基-9,10-二氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6(8H)-酮

在RT下，先後將鋅粉(1.2g，18mmol)及氯化銨(5g，66mmol)添加至製備13所提供之中間物6-疊氮基-10-氮雜-3,3-二甲基-2,6-二氫- 1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-5-酮(1.2g，4.5mmol)含於乙醇(50mL)及水(15mL)之攪拌溶液。1h後，用乙酸乙酯稀釋，濾出固體並濃縮濾液。將殘餘物懸浮於乙酸乙酯於鹽水之間，分離層，在硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用5-40%[10%2M氨之甲醇/二氯甲烷溶液]/二氯甲烷梯度溶離來純化殘餘物，得到呈黃色固體之標題化合物(0.72g，67%)。MS(m/z)：244.2(M+H)。

製備15

N-[(1S)-2-[(10-氮雜-3,3-二甲基-5-側氧基-2,6-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-6-基)胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁酯

在氮氣下，將(2S)-2-(第三丁氧基羰基胺基)丙酸(0.69g，3.6mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(0.55g，3.6mmol)及二異丙基乙胺(0.67mL，3.9mmol)添加至製備14所提供之中間物5-胺基-3,3-二甲基-9,10-二氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6(8H)-酮(0.72g，3.0mmol)含於四氫呋喃(10mL)之0℃攪拌溶液。添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.68g，3.6mmol)並容許在氮氣下將混合物溫熱至RT。2h後，用水稀釋並用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，於硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用50-100%之乙酸乙酯/己烷梯度溶離來純化殘餘物，得到呈黃色固體之標題化合物(1.04g，84%)。MS(m/z)：415.0(M+H)。

製備16

(2S)-2-胺基-N-(10-氮雜-3,3-二甲基-5-側氧基-2,6-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-6-基)丙醯胺鹽酸鹽

將氯化氫(12.5mL，50mmol，4M含於二噁烷)添加至製備15所提供之中間物N-[(1S)-2-[(10-氮雜-3,3-二甲基-5-側氧基-2,6-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-6-基)胺基]-1-甲基-2-側氧基-乙基]胺基甲酸第三丁酯(1.04g，2.5mmol)含於1,4-二噁烷(40mL)之攪拌溶液，並在攪拌下溫熱至45℃。當LC/MS指示完全反應時，濃縮得到呈黃色固體之標題化合物(0.93g，粗物質)。MS(m/z)：315.2(M+1)。

實例1

4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺

第1部分

非對映異構性4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺

在RT下，將1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(12.4g，65mmol)添加至製備5所提供之中間物6-胺基-9-甲氧基-3,3-二甲基-2,3-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-5(6H)-酮及製備7所提供之中間物(2S)-2-(4,4,4-三氟丁醯基胺基)丙酸(10.9g，51mmol)含於二氯甲烷(294mL)之攪拌溶液。將混合物冷卻至5℃，添加1-羥基苯并三唑(8.75g，65mmol)，並在RT下繼續攪拌10分鐘。用水(3 x 100mL)清洗混合物，於硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮得到深色固體。用甲基第三丁醚濕磨，得到呈灰白色固體之標題化合物(非對映異構體之混合物)(22.0g，87%)。MS(m/z)：468.1(M+H)。

第2部分

4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺異構體1及2

在Chiralpak AD管柱上用10%乙腈/乙醇(0.2%二甲基乙胺)溶離從實例1第1部分分離非對映異構體之混合物，得到呈白色固體之異構體1化合物(R_t=3.20min)(9.8g，38%)及呈白色固體之異構體2化合物(Rt=7.37min)(9.0g，36%)。就兩種異構體而言，MS(m/z)：468.2(M+H)。

實例2

N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺

第1部分

非對映異構性N-{(1S)-2-[(8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基]-1-甲基-2-側氧基乙基}-4,4,4-三氟丁醯胺

在氮氣下，將4,4,4-三氟丁酸(0.45g，3.2mmol)、1-羥基苯并三唑水合物(0.49g，3.2mmol)及二異丙基乙胺(2.3mL，13.2mmol)添加至製備16所提供之中間物(2S)-2-胺基-N-(10-氮雜-3,3-二甲基-5-側氧基-2,6-二氫-1H-吡咯并[1,2-a][1]苯并氮呯-6-基)丙醯胺鹽酸鹽(0.93g，2.6mmol)含於四氫呋喃(50mL)之0℃攪拌溶液。添加1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(0.61g，3.2mmol)並容許在氮氣下將混合物溫熱至RT持續16h。用水稀釋，並用乙酸乙酯萃取。用鹽水清洗有機層，於硫酸鈉上乾燥，過濾並濃縮。經由急驟管柱層析在二氧化矽上用75-100%之乙酸乙酯/己烷梯度溶離來純化殘餘物，得到呈灰白色固體之標題化合物(非對映異構體之混合物)(0.82g，71%)。MS(m/z)：439.2(M+1)。

第2部分

N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺異構體1及2

在Chiralpak AD-H管柱上用15%MeOH/CO_2(氣體)溶離從實例2第1部分分離非對映異構體之混合物，得到呈白色固體之異構體1(R_t=1.60min)(194mg，24%，差向異構體化至32%DE(非對映異構性超量))及呈白色固體之異構體2(R_t=2.31min)(469mg，57%)。就兩種異構體而言，MS(m/z)：439.0(M+H)。

癌症日益被認作異質性疾病之統稱，其之開始及進展係因一或多個在細胞及組織微環境中調節DNA修復、基因組穩定性、細胞增殖、細胞死亡、黏著、血管生成、入侵及轉移之基因的功能發生異常所誘發。「癌症」基因之變異或異常功能可能起因於自然產生之DNA多態性，基因組複本數之變化(透過擴增、缺失、染色體損失或複製)，基因及染色體結構之變化(透過染色體移位、倒置或其他導致基因表現失調之重排)，及點突變。惡性腫瘤可由一種異常基因功能誘發，且由該相同異常基因功能維持，或由其他異常基因功能維持並進展惡化。

除了上述基因染色體異常之外，各種癌症亦可包括基因組之表觀遺傳修飾，包括DNA甲基化，基因組印記，及組織蛋白藉由乙醯化、甲基化或磷酸化修飾。表觀遺傳修飾可在誘發及/或維持惡性病中發揮作用。

人類癌症細胞遺傳學畸變之大量資料已經過編譯且維持定期線上更新(參見在美國國家癌症研究所(NCI)癌基因組解剖學計劃(CGAP)之癌症的染色體畸變之Mitelman資料庫(The Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer at the US National Cancer Institute(NCI)Cancer Genome Anatomy Project(CGAP)))。該資料庫包括至少一些本發明惡性病之染色體畸變。維爾康姆基金會桑格研究所癌症基因組計畫(Wellcome Trust Sanger Institute Cancer Genome Project)維持與腫瘤發生起因有關之所有人類基因之詳細線上「癌症基因普查」及人類癌症之體細胞突變的COSMIC(癌症中之體細胞突變目錄(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer))資料庫。包含與多種癌症起因有關之細胞遺傳學變化有關之大量資訊的另一資源為腫瘤學及血液學中之遺傳學及細胞遺傳學之圖集(Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology)。

吾人所已知且例行使用藉由活體組織檢查、免疫表型及其他測試法來診斷癌性惡性病。除高解析度染色體色帶及高級染色體成像技術以外，疑似癌症病例之染色體畸變可藉由諸如螢光原位雜交(FISH)、核型分析、光譜核型分析(SKY)、多重FISH(M-FISH)、比較性基因組雜交(CGH)、單核苷酸多態性陣列(SNP晶片)之細胞遺傳學分析法及熟習此項技術者已知且採用之其他診斷及分析測試法判定。

刻痕之致癌作用首先報導於人類T細胞白血病中，其涉及刻痕1胞內結構域移位至T細胞受體-β啟動子區，導致刻痕1胞內結構域過度表現(Grabher等人Nature Review Cancer,2006(6)：347-359；Weng等人 Science,2004(306)：269-271)。小鼠造血祖細胞內刻痕1胞內結構域之過度表現引起該小鼠出現類似人類之T-細胞急性淋巴母細胞白血病。除T細胞急性淋巴母細胞白血病以外，越來越多的證據顯示，刻痕信號在其他癌症中透過多重機轉(包括受體擴增及配體及/或受體過度表現)而致癌，該等其他癌症包括急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴母細胞白血病(Rosati等人，Blood,2009(113)：856-865)、急性骨髓性白血病(Sliwa等人，Int J Clin Exp Pathol,2014(7(3))：882-889)、慢性骨髓性白血病(Nakahara等人，Blood,2010(115(14))：2872-2881)及紅血球性白血病(Robert-Moreno等人，Leukemia,2007(21)：1496-1503)。因配體及/或受體之突變或過度表現所導致之異常組成型刻痕傳訊亦涉及許多實體腫瘤惡性病，包括三陰性乳癌(Stoeck等人，Cancer Discovery,2014(4)：1154-1167)、乳癌、卵巢癌(Park等人，Cancer Research,2006(66)：6312-6318)、黑色素瘤(Gast等人，Genes,Chromosomes & Cancer,2010(49)：733-745)、肺癌、非小細胞肺癌(Westhoff等人PNAS,2009(106)：22293-22298)、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭頸癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、鱗狀細胞癌(口腔)、皮膚癌及神經管胚細胞瘤(Rangathan等人，Nature Review Cancer,2011(11)：338-351及增補資訊S1(表))。因配體及/或受體之突變或過度表現所導致之異常組成型刻痕傳訊亦涉及血管肉瘤(Ravi等人，J Clin Oncol,2007,(25(18S,June 20 Supplement))：Abstract 10030)、橫紋肌肉瘤(Belyea等人，Clin Cancer Res,2011(17(23))：7324-7336；Roma等人，Clin Cancer Res,2011(17(3))：505-513)、脂肪肉瘤(J Clin Oncol,2009,(27(15S,Supplement))：Abstract 10526)、惡性纖維組織細胞瘤(Wang等人，Cancer Res,2012,(72)：1013-1022)、肝細胞癌(Villanueva等人，Gastroenterology,2012,(143)：1660-1669)、肝內及肝外膽管癌(Wu等人，Int J Exp Pathol, 2014,(7(6))：3272-3279；Sekiya等人，J Clin Invest,2012,(122(11))：3914-3918；Yoon等人，World J Gastroenterol,2011,(17(35))：4023-4030)及腺樣囊性癌(Bell等人，Annals of Diagnostic Pathology,2014,(18)：10-13；Stoeck等人，Cancer Discov,2014,(4)：1154-1167)。刻痕傳訊之抑制呈現吸引人之目標，為罹患由組成型刻痕傳訊路徑異常活化誘發疾病之癌症患者提供治療效益。Shih等人，Cancer Research,2007(67)1879-1882。

內耳毛細胞發育之決定性基因之一係基楚螺旋-環-螺旋轉錄因子無調性(atonal)-1(Atohl)之哺乳動物同源物。耳蝸細胞中Atohl之表現係聽覺毛細胞生成所必需。表現Atohl之柯蒂氏器官發育中之前感覺上皮細胞將分化為聽覺毛細胞(Helms等人，Development 2000,(127(6))：1185-1196)，且Atohl係聽覺毛細胞分化之最早標記物之一。柯蒂氏器官之支柱細胞保持發育毛細胞特徵之潛能，包括形成纖毛(Zheng等人，Nature Neuroscience,2000,(3(6))：580-586；Kawamoto等人，J Neurosci,2003,(23(11))：4395-4400；Izumikawa等人，Nat Med,2005,(11(3))：271-276；及正常毛細胞功能(Kawamoto等人，2003)。

耳蝸中的每個毛細胞被非感覺支柱細胞包圍，非感覺支柱細胞為毛細胞及神經節提供營養及結構支持，且在透過縫隙連接細胞間通信維持柯蒂氏器官中正常離子濃度中至關重要。有兩種毛細胞：內毛細胞及外毛細胞。哺乳動物(包括人類)中之耳蝸毛細胞由一排內毛細胞及三排外毛細胞組成。內毛細胞係真實感覺受體，且投射至腦之聽覺神經纖維之95%由此子群體產生。外毛細胞上之終端幾乎全部來自傳出軸突，其係由腦中細胞所產生，且此等細胞充當聽覺前置放大器。在聽覺細胞損失或損傷後，支柱細胞在聽覺毛細胞生成中發揮關鍵作用。在發育期間，毛細胞及支柱細胞從共同祖細胞發育而來，且出現毛細胞透過刻痕傳訊路徑介導之接觸抑制傳訊給周圍細胞發育成支柱細胞(Kelley,Nat Rev Neurosci,2006,(11)：837-849。

基於支柱細胞轉分化為聽覺毛細胞之能力及其共享之發育路徑，已經假定支柱細胞可以充當毛細胞祖細胞(Parker等人，Audiology and Neurootology,2004,(9(2))：72-80)。若干研究已證實，繞道支柱細胞中之細胞週期抑制可導致哺乳動物之聽覺毛細胞生成(Lowenheim等人，Proc Natl Acad Sci USA,1999,(96)：4084-4088；Torchinsky等人，J Neurocytol,1999,(28(10-11))：913-924；Minoda等人，Hear Res,2007,(232)：44-51)。因此，成年哺乳動物之支柱細胞保持一旦自由進入細胞週期便可轉分化為聽覺毛細胞之能力。

恢復聽覺毛細胞之藥物治療係一種新型方法，且鼓膜內投與至中耳流體，較佳投與至圓窗龕，而無需實際注射至耳蝸可以在治療劑量下有效誘導Atoh1表現，且持續適宜時間長度，以造成耳蝸內支柱細胞轉分化為聽覺毛細胞。Mizutari等人，Neuron,2013,(77(1))：58-69顯示，中耳遞送γ分泌酶抑制劑(LY411575)可用於使小鼠在聲創傷喪失之聽覺毛細胞再生，且此從支柱細胞生成新毛細胞導致顯著可量測的聽力恢復。此成果為刻痕路徑傳訊抑制對小鼠模型中聽覺毛細胞生成及聽力恢復之治療效果提供概念證據，且為生理效應提供機制(支柱細胞分化為聽覺毛細胞)解釋。在全身投與LY411575期間顯示劑量限制性毒性。

以下活體外及活體內研究證實化合物1及2或其實質上純非對映異構體對抗具體癌細胞系之刻痕路徑傳訊抑制活性及療效。該等分析法一般被熟習此項技術者認為人類臨床化療活性之指示。據信，抑制γ-分泌酶裂解刻痕胞內結構域可有效對抗刻痕1、刻痕2、刻痕3及刻痕4受體各者。證實刻痕路徑傳訊抑制活性及療效之分析法可大體上如下或藉由可提供類似資料之類似分析法進行。

刻痕1 N1ICD細胞核累積細胞成像分析法

以5000個細胞/孔，將HEK293△E12細胞(HEK293細胞經工程改造以穩定表現小鼠刻痕1 cDNA，其編碼胺基酸1703-2183，NP_032740.3，(全長小鼠刻痕1蛋白質前體：SEQ ID NO：1)，在其N-端具有23個胺基酸信號肽序列，MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR(SEQ ID NO：2))接種於96孔板中，於37℃，5%CO₂下培養在杜貝卡氏改良依格培養基(DMEM)-(高葡萄糖與5%胎牛血清(FBS))中培育24小時。使用測試化合物處理細胞，劑量為以經過1：3稀釋至1000nM至0.05nM範圍內且最終二甲基亞碸(DMSO)濃度為0.2%之10種。處理24小時後，依次以以下步驟處理細胞板：在室溫(RT)下，用100μl/孔PREFER^TM固定劑固定細胞30分鐘；在RT下，用100μl/孔含於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之0.1%TRITON® X100對細胞進行通透化處理20min；每次用100μl/孔PBS清洗3次；添加50μl/孔兔抗-N1ICD(刻痕1胞內結構域)抗體，以1：2000含於含1%胎牛血清白蛋白之PBS中，並在37℃下培育1.5小時；每次用100μl/孔PBS清洗3次；用50μl/孔山羊抗兔IgG(免疫球蛋白G)Alexa 488培育，以1：1000稀釋於含1%胎牛血清白蛋白之PBS中，並在37℃下培育1小時；每次用100μl/孔PBS清洗3次，並添加100μl/孔15μM碘化丙錠及50μg/ml RNAse，持續30分鐘，以使細胞核染色。用ACUMEN EXPLORER^TM雷射掃描螢光微量板細胞計數儀(TTP LABTECH LTD)掃描板，以測定總細胞核計數/孔及總細胞核面積/孔，其中螢光在655nm-705nm(由與碘化丙錠結合之DNA發射)，細胞核區中結合N1ICD之抗體之螢光在505nm-530nm。主要分析法輸出為細胞核N1ICD之總螢光與總細胞核面積之比率，標準化細胞核N1ICD信號。以細胞數%對0.2%DMSO對照細胞收集相對細胞毒性譜。使識別經裂解刻痕1或N1ICD之抗體凸現在對應人類刻痕1之胺基末端裂解位點在Val1744之人類肽。在未經處理之對照細胞中，由刻痕1生成之N1ICD將移位並在細胞核中累積。當藉由刻痕1裂解抑制性化合物處理細胞時，細胞核N1ICD之信號將減弱。由細胞核N1ICD信號之擬合至四參數邏輯斯之曲線確定濃度反應及IC₅₀，同時對於細胞毒性譜，將細胞數%繪製於同一圖中。基本上如上所述進行分析，化合物1異構體2之平均IC₅₀為0.37nM(+/- 0.16；n=2)，且化合物2異構體2之平均IC₅₀為1.55nM(+/- 1.12；n=2)。化合物在高達1000nM濃度下無一影響細胞數量。此等資料證明化合物1異構體2及化合物2異構體2各者對刻痕1具有親和力，並抑制刻痕1胞內結構域細胞傳訊肽之胞內累積。

活體內目標抑制研究

動物研究

為評估化合物1異構體2及化合物2異構體2對刻痕處理藥效動力學(PD)之抑制之活體內效果，在非荷瘤Balb/C小鼠(Charles River)中進行動物研究。每組總共使用5隻小鼠。小鼠隨意取食正常飼料。以0.2mL體積口服投與(胃管灌食法)化合物或媒劑(1%Na-CMC含於0.25%Tween-80)開始治療。在治療後之指定時間點(給藥後4或8小時)，藉由CO₂窒息及頸椎脫臼法處死動物。移除組織(肺)，並用於PD反應分析，其藉由裂解之N1ICD測量。

N1ICD分析

為評估肺中之N1ICD水平，從冷凍組織切出約75mg，並切碎，然後均質化(記錄之實際質量)。將冷凍腫瘤樣品轉移至Lysing Matrix-D^TM管，並以75mg/ml緩衝液之質量：體積比再懸浮於含1X Complete錠劑(Roche Complete^TM編號11697 498 001)及1X蛋白酶抑制劑混合劑(Sigma-Aldrich P8340)之冰冷XY溶解緩衝液(25mM Tris pH 7.5，10μg/ml胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑，10μg/ml抑肽酶，60mM β-甘油磷酸酯，1%Triton® X-100，10mM NaF，2.5mM焦磷酸鹽，150 mM NaCl，15mM乙二胺四乙酸(EDTA)pH 8.0，5mM乙二醇-雙(2-胺基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)pH 8.0，1mM釩酸鈉，10μg/ml亮肽素(Leupeptin)，1mM二硫蘇糖醇，1μM微囊藻毒素(microcystin)LR，10μg/ml N-對甲苯基-L-苯基丙胺酸氯甲酮(TPCK)，2mM Nα-對甲苯基-L-精胺酸甲酯鹽酸鹽(TAME)，15mM 4-硝基苯基磷酸二(tris)鹽(PNPP)，0.1mM 4-(2-胺基乙基)苯磺醯基氟鹽酸鹽(AEBSF)，5mM苄脒，1μM岡田酸(Okadaic Acid))。在4℃下，在Fast Prep FP120均質機(Thermo Scientific,Rockford,IL)中以6.0之速度使組織均質化30秒，隨後在冰上培育15分鐘。總共重複此過程2-3個循環，直至完全均質化。使溶胞產物在4℃ eppendorf離心機中以30,000rpm離心15分鐘，以移除碎片。移除400μl上清液，並轉移至新的eppendorf管，並接受凍/融循環。樣品再在4℃ eppendorf離心機中以30,000rpm離心30分鐘，並收集120μl上清液進行分析。利用Pierce BCA Protein Assay Kit^TM(Thermo Scientific,Rockford,IL)，使用Thermomax^TM板讀取器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)測定總蛋白質濃度。使用定制的N1ICD ELISA測定N1ICD水平。用裂解刻痕1(Val1744)-特異性定制兔單株抗體捕獲分析物，並用C-端刻痕1 SULFO-TAG^TM(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,Maryland)多株羊抗體(R&D Systems,Minneapolis,MN)檢測。將溶胞產物於含1X Complete錠劑(Roche Complete^TM mini編號11 836 153 001)及1X蛋白酶抑制劑混合劑(Sigma-Aldrich P8340)之冰冷ELISA tris溶解緩衝液(R6OTX)(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,Maryland)中稀釋至2μg/μl，將25μl添加至ELISA板。在RT下培育50μg蛋白質溶胞產物1小時，各者捕獲分析物，及檢測抗體。在Sector成像儀6000^TM(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,Maryland)上讀取板。將扣除背景之N1ICD標準化為總蛋白質，並表示為相對於經媒劑治療組之抑制%。基本上如上文所述分析在化合物1異構體2或化合物2異構體2之最後一次劑量後4小時收穫之腫瘤中之N1ICD抑制%及統計顯著性(p值)(由杜納(Dunett’s)法測定)並匯總於表1中。

表1之資料證明，小鼠肺組織中藉由化合物1異構體2及化合物2異構體2抑制N1ICD裂解。表1中之資料進一步提供上述功能活性資料之活體內相關性。

誘導耳球中之mAtoh1表現

一般而言，在第0天，大致上依照Oshima等人，Methods Mol Biol.,2009；493：141-162中之方法進行柯蒂氏器官細胞單離。進行細胞培養及繁殖，持續3-4天。在第3或4天進行細胞接種及測試化合物處理。在接下來的7天內允許進行附著及分化。在第10或11天，進行細胞裂解及RNA單離。在第12天進行TaqMan qRT-PCR，並在第13-15天分析Atoh1及Tbp1表現結果。

單離細胞

移除出生後1至4天大的兩性小鼠(轉基因品種：mAtoh1-驅動nGFP；Lumpkin EA等人，Gene Expr Patterns,2003；(36)：389-95)之顳骨之岩部之周圍組織。利用鑷子從前庭系統分離貝殼形耳蝸。在此發育階段，骨迷路並未完全鈣化，且容易使用鑷子分開。小心打開耳蝸之骨迷路，並藉由由頂點從耳蝸軸解開移除螺旋韌帶及沿著耳蝸軸之螺旋纏在一起之附接柯蒂氏器官。從底部開始，利用精細鑷子從柯蒂氏器官分離螺旋韌帶。

將切開的柯蒂氏器官(OC)轉移至具有850μl冰冷HBSS之個別1.5ml管中。將至多12個OC組織轉移至相同管中。快速使OC組織離心沉降，並移除HBSS。藉由添加100μl預熱TrypLE^TM Select(Life Technologies)使細胞解離，並在37℃下培育13min。快速使解離的OC組織離心沉降。移除TrypLE^TM Select。添加100μl培養基A(DMEM/F12、N2補充劑(LifeTechnologies)、B27補充劑(LifeTechnologies)、胺苄西林(50μg/ml)及防治黴素(LifeTechnologies)、EGF(20ng/ml)、bFGF(10ng/ml)、IGF-1 50ng/ml)及硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)(50ng/ml))。然後用P200吸管端濕磨經切開並消化的組織。移除任何細胞聚結體及碎片；轉移細胞懸浮液，並用預濕潤70μm細胞濾網充分清洗，以將細胞懸浮液彙集於單個新的培養管中。用充足培養基A沖洗解離管及細胞濾網，並與細胞懸浮液彙集。用血球計或Countess®(Life Technologies)計數細胞密度。將新製培養基A添加至細胞懸浮液，以達到1.0E5個細胞/ml之最終接種密度，並接種於超低附著力培養皿T-75(Greiner)。

在懸浮液中培養，使OC球繁殖

在37℃下，在5%CO₂加濕培養箱中，在超低黏附力培養皿(Greiner)之培養基A中培養解離之單細胞，以從漂浮細胞獲得無性繁殖方式生長的球，稱為第一代球。若細胞在培養期間黏附至非黏附皿，則其可藉由輕輕混合移開。

黏附培養及處理

培養該等球3-4天後，藉由顯微鏡以肉眼計數球，以使此步驟之耳球/ml之接種密度標準化。藉由離心收集細胞，並以約2000個球/ml之濃度將球再懸浮於基本培養基中。以150μl/孔之體積將球接種於經細胞培養物處理之96孔板中，以獲得約300個球/孔。一式四份地用實驗製劑處理球，最終體積為200μl含於基本培養基(DMEM/F12、N2補充劑(LifeTechnologies)、B27補充劑(LifeTechnologies)、胺苄西林(50μg/ml)及防治黴素(LifeTechnologies))中。在5%CO₂，37℃下，在加濕溫控培養箱中培養經處理球7天。移除培養基並進行RNA提取。

RNA提取

添加補充有1%β-巰基乙醇之緩衝液RLT plus(Qiagen)，每孔175μl。將2.5μl稀釋在緩衝液RLT Plus中之4ng/μl RNA載體(RNeasy® Plus微型套組；Qiagen)添加至每個孔中，然後提取RNA。利用RNeasy® Plus微型套組(Qiagen)，根據製造商指示提取總RNA。

cDNA合成

利用SuperScript® III第一股合成系統(LifeTechnologies，目錄18080-051)，按照製造商方案，使用用於cDNA合成之隨機六聚體進行cDNA合成。藉由添加21μl超純無核酸酶之水稀釋cDNA 50%。使用5μl經稀釋之cDNA進行qPCR。

qPCR

為定量分析來自經處理球培養物之毛細胞標記物之表現，在單一兩色多重反應中用探針進行qPCR，以檢測受關注mAtoh1基因及內源對照基因。根據製造商指示，使用TaqMan基因表現預混液(LifeTechnologies,4369016)及受關注探針(Atoh1；Mm00476035_s1及內源對照探針(Tbp1；Mm00446971_m1,LifeTechnologies)。使每種探針之條件保持恆定。利用△△C_T法分析治療組間之相對基因表現，並取重複測量之平均值。最少以一式三份進行實驗，並記錄為總平均值。

表2中資料顯示Atoh1表現(毛細胞生成之標記物)在以三種濃度(10nM、100nM及1μM)之化合物1異構體2及化合物2異構體2處理之耳球中之相對定量值(RQ)。資料(±平均值標準誤差，SEM)代表相對於陰性對照(DMSO載劑)-處理樣品之基因表現誘導倍率。(^*，與陰性對照相比具有顯著差異，p<0.05)。

誘導人類腫瘤細胞系中之hAtoh1表現

為評估化合物1異構體2及化合物2異構體2誘導hAtoh1表現之能力之效力，使用人類腫瘤細胞系。此細胞系之內源刻痕傳訊調節類似於內耳。一般而言，此分析係根據Kazanjian等人，Gastroenterology,2010,139(3)：918-928及增補材料及方法(Supplementary Materials and Methods)中之原理進行。

一般而言，使用標準細胞培養技術。將維持在生長培養基(MEM 10%FBS)中之低傳代數人類結腸直腸腺癌細胞系LS174T(ATCC CL-188)以含於100μl分析培養基(MEM 1%FBS)中之10,000個細胞/孔接種在96-孔組織培養處理板中。

第二天，對10mM測試化合物原液進行半對數連續稀釋(稀釋於100%DMSO中)，得到十一種遞減劑量之藥物化合物。最終濃度範圍為10μM至0.127nM。使用3.16-倍連續稀釋，每孔之DMSO濃度为100%。另外對初始DMSO稀釋液進行1：10稀釋至分析培養基中。另外再進行1：100稀釋至分析培養基中。

將100μl測試化合物稀釋液添加至每個含細胞及生長培養基之孔中，並在37℃及5%CO₂下生長72小時。

在第4天從該等板收集細胞，並提取RNA，並利用RNeasy® Plus 96 RNA(Qiagen)，根據製造商方案純化。

利用SuperScript® III第一股合成系統(LifeTechnologies,18080-051)，按照製造商方案，使用用於cDNA合成之隨機六聚體進行cDNA合成。藉由添加21μl超純無核酸酶之水將cDNA稀釋50%。使用5μl經稀釋cDNA進行qPCR。

qPCR

為定量分析經處理球培養物之毛細胞標記物之表現，在單一兩色多重反應中進行qPCR探針，以檢測hAtoh1或TBP表現。為測量各樣品之相對基因表現，根據製造商指示，使用TaqMan基因表現預混液(LifeTechnologies,4369016)及受關注探針(人類Atoh1；LifeTechnologies分析法ID Hs00944192_s1)加內源對照(人類TBP；LifeTechnologies分析法ID Hs00427620_m1)。使每種探針之條件保持恆定。利用△△C_T法分析治療組間之相對基因表現，並取重複測量之平均值。

進行四次獨立分析，得到每種測試化合物之IC₅₀值。藉由使用GraphPad Prism®軟體，將濃度反應資料擬合至「log(拮抗劑)對反應(三參數)」模型，測定IC₅₀值，其中12種劑量濃度範圍跨4.0E-11至1.0E-6M，每種化合物總共分析108點。表3中顯示化合物1異構體2及化合物2異構體2之IC₅₀值。

表3之資料顯示化合物1異構體2及化合物2異構體2之IC₅₀值，其係由hAtoh1之相對表現計算，hAtoh1係此分析中聽覺毛細胞生成之標記物。

柯蒂氏器官外植體分析中對化合物之反應

一般而言，在第0天根據Parker等人，Journal of Visualized Experiments,2010,(36),e1685中所述方法進行柯蒂氏器官器官型外植體培養。外植體培養進行4-7天，此時培養物準備進行細胞裂解供qRT-PCR用，或進行組織固定供免疫組織化學分析用。

單離及培養柯蒂氏器官外植體

從出生後1至4天大的兩性小鼠(轉殖基因品種：Atoh1-驅動nGFP；Lumpkin EA等人，Gene Expr Patterns,2003,(36)：389-95)移除顳骨岩部之骨泡及周圍組織。在漢克氏溶液中剖開柯蒂氏器官，移除螺旋韌帶，並將外植體置於經聚-L-鳥胺酸(0.01%，Sigma)及層黏連蛋白(50mg/ml，Becton Dickinson)塗佈之蓋玻片上，得到具有平坦耳蝸表面之製備物。然後將每個耳蝸外植體置於24孔板(Falcon)之單個孔中，並在具有5%胎牛血清、5%馬血清及盤尼西林(penicillin)-鏈黴素(streptomycin)(LifeTechnologies)之DMEM(Invitrogen)中培養。在第0天連同培養基添加實驗化合物，並每2-3天更換。將所有培養物維持在37℃下之5%CO₂加濕培養箱中。

藉由qRT-PCR進行基因表現分析

藉由用350μl RLT Plus緩衝液(Qiagen)/孔使外植體組織裂解進行 RNA提取，並藉由RNeasy® Plus迷你套組(Qiagen)純化總RNA。藉助SuperScript® III第一股合成系統(LifeTechnologies)，使用隨機六聚體進行cDNA合成。為定量分析毛細胞標記物表現之誘導，用TaqMan基因表現預混液(LifeTechnologies,4369016)及探針進行qPCR，以檢測受關注基因(例如hAtoh1；分析法ID Mm00476035_s1，Pou4f3；分析法ID Mm04213795_s1及Myo7a；分析法ID Mm01274015_m1,LifeTechnologies)及內源對照基因Tbp(分析法ID Mm00446971_m1,LifeTechnologies)。利用△△C_T法分析治療組間之相對基因表現，並取重複測量之平均值。最少以一式三份進行實驗，並記錄為總平均值。

表4之資料顯示經1μM化合物1異構體2及化合物2異構體2處理之柯蒂氏器官外植體中毛細胞生成標記物Atoh1、Pou4f3及Myo7a表現之相對定量值(RQ)。資料(±SEM)代表相對於陰性經對照處理樣品之基因表現之誘導倍率。

新Atoh1-表現毛細胞之免疫染色

外植體培養後，用200μl Cytofix/Cytoperm(BD)將組織固定在24孔板中30min，用含TritonX100之PBS(PBST)沖洗，並用200μl一級抗體溶液染色1小時，一級抗體溶液由4%正常驢血清之PBST溶液及山羊抗-GFP(1：2500；AbCAM,ab5450)及兔抗-肌球蛋白VIIa(1：1000；Proteus Bioscience #25-6790)組成。然後用PBST充分清洗組織，並用二級抗體溶液染色1小時，二級抗體溶液由Alexa Fluor 488驢抗-山羊IgG(1：1000；Invitrogen,A-11055)及Alexa Fluor 568驢抗-兔IgG(1：1000；Invitrogen,A10042)組成。然後用PBST充分清洗，並安裝在顯微鏡載玻片上。藉由Atoh1-替代標記物GFP(綠色)及肌球蛋白VIIa(紅色)之表現識別個別毛細胞，成像，然後在中切彎區域之100μM長度內計數，以檢查經化合物處理之實驗樣品中新生毛細胞之形成，與未經處理或陰性對照(無生物活性化合物)處理樣品中毛細胞數量對比。在五個獨立實驗中測量盲法細胞計數。

表5之資料顯示在1μM化合物1異構體2(n=13)或化合物2異構體2(n=15)存在下培養四天，並進行GFP(替代Atoh1標記物)及肌球蛋白VIIa之免疫染色之柯蒂氏器官外植體之外毛細胞數量。毛細胞之增加百分比係相對於陰性對照處理樣品(n=18)而言。

耳毒性損傷後之基因表現分析

利用柯蒂氏器官器官型外植體培養物之差異來對響應耳毒性損傷後後續進行化合物處理之毛細胞再生建模。根據Korrapati等人，PLOSOne,2013,8(8),e73276所述方法進行此損傷建模，其中記錄到中切彎毛細胞減少95%。在第0天，為損傷及選擇性殺死柯蒂氏器官外植體內之毛細胞，添加胺基糖苷類處理(慶大黴素(gentamicin)(100μM))，持續18至24小時。在第1天，移除慶大黴素，並開始用5μM化合物1異構體2及化合物2異構體2處理。外植體培養總共繼續4天，此時，培養物準備進行上述qRT-PCR方案。慶大黴素誘導之損傷之肉眼確認容易在用陰性對照化合物處理之培養物之間觀察到。然而，在前感覺毛細胞標記物Atoh1及Pou4f3以及毛細胞標記物Myo7A之基因表現方面，藉由qRT-PCR測得之耳毒性損傷後響應化合物1異構體2及化合物2異構體2處理之定量測量值增加。

表6之資料顯示在慶大黴素(100μM)損傷後經5μM化合物1異構體2及化合物2異構體2處理之柯蒂氏器官外植體中毛細胞生成標記物Atoh1、Pou4f3及Myo7a藉由qRT-PCR之基因表現之相對增加。資料代表相對於具有慶大黴素-誘導之毛細胞損傷之陰性對照處理樣品之基因表現之增加百分比。(*，與陰性對照相比具有顯著差異，p<0.05)

全耳囊培養物之毛細胞標記物誘導

大體上根據Parker等人，Journal of Visualized Experiments,2010,(36),e1685中所述方法，從出生後1至4天大的兩性小鼠(轉殖基因品種：Atoh 1-驅動nGFP；Lumpkin EA等人，Gene Expr.Patterns,2003,3(4)：389-95)剖開包含耳蝸骨迷路及前庭系統之耳囊(耳囊外植體)。從頂骨單離整個耳囊，並離體維持在旋管培養系統之培養基中至多3天，該培養基包含DMEM、高葡萄糖、5%FBS、5%馬血清、1μg/ml胺苄西林。

使用耳囊外植體評估在各種遞送媒劑中之化合物，刺入內耳。用化合物1異構體2(7.2mM)含於各種遞送媒劑之組合物進行測試。直接將少量(100-200nl)施加至耳蝸之圓窗龕。剖開耳蝸，處理，培育1-2小時，然後進入旋轉培養。48小時後，打開耳囊外植體，以從耳蝸之骨迷路移除柯蒂氏器官，並藉由RT-PCR分析。

容許組合物靜置1-2小時，然後用培養基洗去。然後在未經處理之培養基中培養耳囊外植體48小時。使耳蝸斷開，然後剖除整個柯蒂氏器官，並準備進行定量RT-PCR，以測量Atoh1毛細胞標記物表現水平(如上文柯蒂氏器官外植體分析中所述)。表7顯示指定遞送媒劑中之Atoh1誘導。在所有測試組合物中，測量在培養物中48小時後化合物1異構體2與經僅有媒劑之對照處理之耳囊外植體相比Atoh1之上調(2-3倍，n為12至17)。

進入內耳之活體內外淋巴測試化合物吸收

用酮胺(ketamine)/甲苯噻嗪(xylazine)混合物麻醉雌性白化Hartley豚鼠(Charles River,France)，然後藉由經鼓膜途徑注射以如上針對全耳囊培養分析所述之組合物之70μl化合物1異構體2，以完全填滿中耳。在注射後0.5、1、6、24及48小時時提取外淋巴(內耳流體)樣品，並藉由LCMS(n為5)分析測試化合物之濃度。表8顯示測試化合物在經鼓膜與此等遞送媒劑一起投與至中耳後吸收進入內耳。

胺基酸序列

SEQ ID NO：1(小鼠刻痕1蛋白質前體；全長)

SEQ ID NO：2(信號肽) MPRLLTPLLCLTLLPALAARGLR

參考序列(1)：1spec

同一性藉由對齊長度標準化。

上色依據：一致/70%及性質

參考序列(1)：1spec

同一性藉由對齊長度標準化。

上色依據：一致/70%及性質

<110> 美國禮來大藥廠荷蘭商奧迪恩治療公司

<120> 刻痕(NOTCH)路徑傳訊抑制化合物

<130> X20729

<150> 62/189,393

<151> 2015-07-07

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2531

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 1

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成構築體

<400> 2

Claims

一種以下結構的化合物： 4,4,4-三氟-N-((2S)-1-((9-甲氧基-3,3-二甲基-5-側氧基(oxo)-2,3,5,6-四氫-1H-苯并[f]吡咯并[1,2-a]氮呯-6-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)丁醯胺、其實質上非對映異構純異構體，或以上任一者之醫藥上可接受的鹽。
一種以下結構的化合物： N-((2S)-1-((8,8-二甲基-6-側氧基-6,8,9,10-四氫-5H-吡啶并[3,2-f]吡咯并[1,2-a]氮呯-5-基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)-4,4,4-三氟丁醯胺、其實質上非對映異構純異構體，或以上任一者之醫藥上可接受的鹽。
如請求項1或2之化合物、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療。
如請求項1或2之化合物、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療T-細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、三陰性乳癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭頸癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、口腔鱗狀細胞癌、皮膚癌、神經管胚細胞瘤(medulloblastoma)、血管肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、肝細胞癌、肝內或肝外膽管癌或腺樣囊性癌。
如請求項1或2之化合物、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療肺癌。
如請求項1或2之化合物、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受之鹽，其用於治療由聽覺毛細胞損失引起的感覺神經性(sensorineural)聽力損失。
如請求項1或2之化合物、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受之鹽，其用於誘導聽覺毛細胞生成。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1或2之化合物、或其實質上純非對映異構體、或其醫藥上可接受的鹽、及醫藥上可接受的載劑。
一種如請求項1或2之化合物或其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽之用途，其用於製造用於治療以下之藥劑：T-細胞急性淋巴母細胞白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、紅血球性白血病、三陰性乳癌、乳癌、卵巢癌、黑色素瘤、肺癌、非小細胞肺癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤、結腸直腸癌、頭頸癌、子宮頸癌、前列腺癌、肝癌、口腔鱗狀細胞癌、皮膚癌、神經管胚細胞瘤、血管肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、肝細胞癌、肝內或肝外膽管癌或腺樣囊性癌。
一種如請求項1或2之化合物或其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽之用途，其用於製造用於治療肺癌之藥劑。
一種如請求項1或2之化合物或其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽之用途，其用於製造用於治療由聽覺毛細胞損失引起的感覺神經性聽力損失之藥劑。
一種如請求項1或2之化合物或其實質上純非對映異構體或其醫藥上可接受的鹽之用途，其用於製造用於誘導聽覺毛細胞生成之藥劑。