TW201701891A

TW201701891A - 大腸炎抑制劑

Info

Publication number: TW201701891A
Application number: TW105105949A
Authority: TW
Inventors: Kyosuke Kobayashi; Yukio Asami; Satomi KOYAMA
Original assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2017-01-16
Also published as: JP6723980B2; JPWO2016136942A1; WO2016136942A1

Abstract

本發明係關於安全且具有優異的大腸炎抑制效果之大腸炎抑制劑及其製造方法。更詳細而言，本發明係關於以具有大腸細胞中之熱休克蛋白(HSP)70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分之大腸炎抑制劑。

Description

大腸炎抑制劑

〔相關申請案之參照〕

本專利申請案係基於屬先申請之日本專利申請案的日本專利特願2015-038302號(申請日：2015年2月27日)而伴隨優先權的主張，該先前專利申請案中之所有揭示內容係藉由引用而視為本案發明之揭示之一部分。

本發明係關於以乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分之大腸炎抑制劑。

大腸炎係發生在大腸中之炎症性疾病，在大腸炎中，包含屬自體免疫性疾病的炎症性腸疾病、屬特發性疾病的貝賽特氏症(Behcet’s syndrome)、缺血性腸炎、及感染症性腸炎等。炎症性腸疾病(Inflammatory Bowel Disease)係大致區分成潰瘍性大腸炎及克隆氏病(Crohn’s disease)2種，此等係共同被指定為日本的特定疾病。此等之病因不明，腸內細菌的參與或免疫機能的異常等被認為是病因。目前，潰瘍性大腸炎的發病在日本係在美國的一半以下，人口每10萬人為100人左右，克隆氏病的發病在日本係在美國的約10分之1，人口每10萬人為27人左右，但一般認為在將來，在日本亦會隨著生活的歐美化，增加炎症性腸疾病的罹患率。

就潰瘍性大腸炎及克隆氏病而言，治療係屬困難，並未確立根本的治療方法。作為內科療法，在潰瘍性大腸炎中，主體上係使用藥物療法(5-胺基水楊酸藥(5-ASA)等磺胺劑、普賴蘇穠(prednisolone)等類固醇劑、免疫調節劑/抑制劑等)，在克隆氏病中，亦併用營養療法/飲食療法(完全靜脈營養療法、經腸營養療法、食餌療法)。

另一方面，就以炎症性腸疾病為首之大腸炎而言，一般認為係由於為了從外部刺激中保護腸黏膜而在哺乳動物的腸管中運作之各種防禦機構產生破綻而發病，遂正進行腸管保護劑的開發。舉例而言，在專利文獻1：日本專利特開2010-83881號公報中，已報告藉由短乳酸桿菌(Lactobacillus brevis)SBC8803菌株之加熱死菌體的經口投予，由DSS(葡聚糖硫酸鈉)所誘發之類似潰瘍性大腸炎的腸管炎症係受到抑制。

此外，在專利文獻2：日本專利第5116194號公報中，已報告以乳酸桿菌屬細菌之酪蛋白乳酸桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029、加氏乳酸桿菌(Lactobacillus gasseri)YIT0168之菌體或源自菌體之多醣部分作為有效成分之炎症性腸疾病預防治療劑。

另一方面，此等乳酸桿菌屬之大腸炎抑制效果並不充分，此外，僅使用特定的菌株。如此，並未報告有可在日常上安全簡單地攝取之以乳酸菌作為有效成分且效果高之大腸炎抑制劑。

〔先前技術文獻〕〔專利文獻〕

〔專利文獻1〕日本專利特開2010-83881號公報

〔專利文獻2〕日本專利第5116194號公報

本發明之目的為提供安全且具有優異的大腸炎抑制效果之大腸炎抑制劑及其製造方法。

本發明者等人此次發現在於活體外所共同培養之大腸細胞中，特定而言，顯示出熱休克蛋白70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌係安全且具有優異的大腸炎抑制作用。本發明係基於該種見解而得。

根據本發明，係提供以下發明。

(1)一種大腸炎抑制劑，其係以具有大腸細胞中之熱休克蛋白(HSP)70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分。

(2)如(1)所記載之大腸炎抑制劑，其中，乳酸桿菌屬乳酸菌為約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)。

(3)如(1)或(2)所記載之大腸炎抑制劑，其中，乳酸桿菌屬乳酸菌為選自約氏乳酸桿菌OLL203565株、約氏乳酸桿菌OLL204255株、及約氏乳酸桿菌OLL2978株者。

(4)如(1)~(3)中任一項所記載之大腸炎抑制劑，其中，乳酸桿菌屬乳酸菌可使於活體外所共同培養之大腸細胞中之HSP70的表現量相較於未添加前述乳酸桿菌屬乳酸菌所培養之大腸細胞中之HSP70的表現量而言增加至1.5倍以上。

(5)如(1)~(4)中任一項所記載之大腸炎抑制劑，其中，大腸炎為炎症性腸疾病。

(6)如(5)所記載之大腸炎抑制劑，其中，炎症性腸疾病為潰瘍性大腸炎。

(7)如(1)~(6)中任一項所記載之大腸炎抑制劑，其係用於改善便性。

(8)一種大腸炎抑制劑之製造方法，其特徵為使其含有具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌。

(9)一種具有HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌之用途，其係用在大腸炎抑制劑的製造中。

(10)一種具有HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌之用途，其係用於抑制大腸炎。

(11)一種具有HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌，其係用於抑制大腸炎。

(12)一種大腸炎之抑制方法，其係包含使對此有所需要的對象攝取具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌的有效量而成。

根據本發明之大腸炎抑制劑，可有效地抑制大腸炎，特別是炎症性腸疾病。由於本發明之大腸炎抑制劑係以乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分，故而可安全地抑制大腸炎，且在改善便性上有利地加以利用。

〔圖1〕圖1係示出Caco-2細胞中之數種約氏乳酸桿菌株的投予所引發之HSPA1A基因表現誘導中之HSPA1A基因的表現量/GAPDH基因的表現量之比率的圖表。N=3。

〔圖2〕圖2係示出動物實驗之時程概略的概念圖。第1組(10隻)：蒸餾水+PBS(磷酸緩衝液)之投予組、第2組(10隻)：蒸餾水+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組、第3組(10隻)：DSS水溶液(2.0 w/v%)+PBS之投予組、第4組(10隻)：DSS水溶液(2.0 w/v%)+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組。

〔圖3〕圖3係示出DSS的投予時之各組之平均體重之變化率的圖表(＊p<0.05，與G1組比較)。其係將day 1(第1日)視為100之情況之變化率。G1：蒸餾水 +PBS之投予組、G2：蒸餾水+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組、G3：DSS+PBS之投予組、G4：DSS+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組。

〔圖4〕圖4係示出解剖時之DSS之投予組(G3及G4)之炎症評分的圖表(＊p<0.05)。G3：DSS+PBS之投予組、G4：DSS+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組。

〔圖5〕圖5係示出解剖時之各組之大腸的長度及每單位長度之重量的圖表(＊＊p<0.01，與G1組比較)。G1：蒸餾水+PBS之投予組、G2：蒸餾水+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組、G3：DSS+PBS之投予組、G4：DSS+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組。

(大腸炎抑制劑)

本發明之大腸炎抑制劑之特徵為以具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分。具有HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌具有顯著的大腸炎抑制作用實屬意外的事實。

HSP70係會因熱或紫外線等而誘導表現之蛋白質之1種，例如由序列編號1的胺基酸序列所組成之蛋白質。此外，HSP70係HSPA1A所編碼出之蛋白質，HSPA1A的基因序列可藉由參照例如序列編號2而予以特定。因此，本發明之大腸炎抑制劑之特徵亦可為以具有大腸細胞中之HSPA1A的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分。

乳酸桿菌屬乳酸菌中之HSP70的表現增強活性之有無，如本案說明書之實施例之例1(活體外試驗)所記載，可藉由以編碼出HSP70之HSPA1A的表現量作為指標之比較試驗進行判定。於該種比較試驗中，在與乳酸桿菌屬乳酸菌所共同培養之大腸細胞中之HSPA1A的表現量相較於未添加前述乳酸桿菌屬乳酸菌所培養之大腸細胞中之HSPA1A的表現量而言係更高之情況，便認定為乳酸桿菌屬乳酸菌具有HSP70的表現增強活性。

HSPA1A的表現量，如本案說明書之實施例之例1所記載，可以大腸細胞中之管家基因(甘油醛-3-磷酸脫氫酵素(GAPDH))的表現量為基準而予以算出。

根據本發明之較佳態樣，乳酸桿菌屬乳酸菌可使於活體外所共同培養之大腸細胞中之HSP70的表現量相較於未添加前述乳酸桿菌屬乳酸菌所培養之大腸細胞中之HSP70的表現量而言增加至較佳為1.5倍以上，更佳為1.7倍以上，再佳為1.8倍以上，再佳為1.9倍以上，再佳為2.0倍以上，再佳為2.5倍以上，再佳為3.0倍以上，再佳為3.5倍以上，再更佳為4.0倍以上。

根據本發明之較佳態樣，乳酸桿菌屬乳酸菌可使於活體外所共同培養之大腸細胞中之HSPA1A的表現量相較於未添加前述乳酸桿菌屬乳酸菌所培養之大腸細胞中之HSPA1A的表現量而言增加至較佳為1.5倍以上，更佳為1.7倍以上，再佳為1.8倍以上，再佳為1.9倍以上，再佳為2.0倍以上，再佳為2.5倍以上，再佳為3.0倍以上，再佳為3.5倍以上，再更佳為4.0倍以上。

根據本發明之更佳態樣，乳酸桿菌屬乳酸菌可使於活體外所共同培養之大腸細胞中之HSPA1A的表現量(藉由除以管家基因(GAPDH)的表現量而修正實驗組間之偏差所得之值)相較於未添加前述乳酸桿菌屬乳酸菌所培養之大腸細胞中之HSPA1A的表現量(藉由除以管家基因(GAPDH)的表現量而修正實驗組間之偏差所得之值)而言增加至較佳為1.5倍以上，更佳為1.7倍以上，再佳為1.8倍以上，再佳為1.9倍以上，再佳為2.0倍以上，再佳為2.5倍以上，再佳為3.0倍以上，再佳為3.5倍以上，再更佳為4.0倍以上。

HSP70的表現增強活性之測定中所使用之大腸細胞，如本案說明書之實施例之例1所記載，較佳為Caco-2細胞。

根據本發明之更佳態樣，乳酸桿菌屬乳酸菌係例如為約氏乳酸桿菌、酪蛋白乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)等，較佳為約氏乳酸桿菌(L.johnsonii)。且，乳酸桿菌屬乳酸菌較佳為生菌體，藉由攝取此等，腸內環境係獲得改善，可改善排便的次數、便量、其形狀、顏色或臭味等便性。

約氏乳酸桿菌為革蘭氏陽性的桿菌，以同型乳酸發酵之形式，在好氧條件下具有發育性。且，約氏乳酸桿菌，若將其塗佈於MRS瓊脂培養基(BD)平板上，在使用AnaeroPack Kenki(三菱氣體化學)之厭氧的條件下於37℃以48小時進行培養，則會形成圓形、白色、扁平狀菌落。此外，約氏乳酸桿菌在有效地抑制大腸炎上可特別有利地加以使用。

約氏乳酸桿菌較佳為約氏乳酸桿菌OLL203565株、約氏乳酸桿菌OLL204255株、約氏乳酸桿菌OLL2978株，更佳為約氏乳酸桿菌OLL203565株、約氏乳酸桿菌OLL204255株，再佳為約氏乳酸桿菌OLL203565株。此等可使用單獨1種作為有效成分，亦可使用混合有2種以上者作為有效成分。

約氏乳酸桿菌OLL203565株係於2015年2月3日以受託編號為NITE BP-02003(識別的標示：Lactobacillus johnsonii OLL203565)之形式寄存於日本獨立行政法人製品評估技術基礎機構專利微生物寄存中心(〒292-0818千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)。

約氏乳酸桿菌OLL204255株係於2015年2月3日以受託編號為NITE BP-02004(識別的標示：Lactobacillus johnsonii OLL204255)之形式寄存於日本獨立行政法人製品評估技術基礎機構專利微生物寄存中心(〒292-0818千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)。

約氏乳酸桿菌OLL2978株係於2015年2月3日以受託編號為NITE BP-02002(識別的標示：Lactobacillus johnsonii OLL2978)之形式寄存於日本獨立行政法人製品評估技術基礎機構專利微生物寄存中心(〒292-0818千葉縣木更津市上總鎌足2-5-8 122號室)。

本發明之大腸炎抑制劑可依原樣使用乳酸桿菌屬乳酸菌，亦可與乳酸桿菌屬乳酸菌共同地併用經口上可容許之其他成分。

經口上可容許之其他成分，在不會妨礙本發明之效果之前提下，並無特別限定，例如為賦形劑、安定劑、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、潤滑劑、甜味料、著色料、香料、緩衝劑、抗氧化劑、pH調整劑等添加劑、或內科療法用之藥劑等。

本發明之大腸炎抑制劑的形態並無特別限制，可為粉末狀、錠劑狀、膠囊狀或飲劑狀。

本發明之大腸炎抑制劑的形態較佳係以乳酸桿菌屬乳酸菌成為用於抑制大腸炎之有效量之方式，由1次的攝取量之單位所構成。本發明之大腸炎抑制劑之1次的攝取量之單位較佳係以1×10⁷~1×10⁹CFU/ml，且以100ml以上，更佳係以200ml以上含有乳酸桿菌屬乳酸菌。

本發明之大腸炎抑制劑的形態較佳係以每1次的攝取量之單位進行包裝而提供。本發明之大腸炎抑制劑之每1次的攝取量之單位包裝的形態係可列舉以軟包裝、塑膠容器等包材規定一定量之形態，在該等包材等之表面，亦可附有每1次的攝取量之成分標示、或抑制大腸炎等之用途標示。該種單位包裝的形態可適當地例示補充品、醫藥製劑等。

本發明之大腸炎抑制劑的形態亦可作成緩釋性製劑。將本發明之大腸炎抑制劑的形態作成緩釋性製劑，就在經口攝取乳酸桿菌屬乳酸菌之後，使其活著到達大腸細胞之方面而言係較佳。

本發明之大腸炎抑制劑可將乳酸桿菌屬乳酸菌依所期望與經口上容許之其他成分共同進行混合而簡易地進行製造。從而，根據本發明之另一態樣，係提供大腸炎抑制劑之製造方法，其特徵為使其含有具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌。

本發明之製造方法亦可包含將乳酸桿菌屬乳酸菌與大腸細胞共同於活體外進行培養，並選擇大腸細胞中之HSP70的表現量高於預先設定之閾值的乳酸桿菌屬乳酸菌之步驟。

在前述進行選擇之步驟中，測定HSP70的表現量之方法並無特別限制，可使用直接或間接地測定HSP70的表現量之手法。作為該種測定方法，可列舉例如即時PCR、北方墨點法(Northern blot)、RNA定序等。

此外，在前述進行選擇之步驟中，預先設定之閾值，在不會妨礙本發明之效果之前提下，並無特別限定，可設為例如未添加乳酸桿菌屬乳酸菌所培養之大腸細胞中之HSP70的表現量。該種HSP70的表現量之閾值，如本案說明書之實施例之例1所記載，亦可以HSPA1A的表現量作為指標而予以測定。再者，HSPA1A的表現量亦可以大腸細胞中之管家基因的表現量作為基準而予以算出。作為該種管家基因，舉例而言，如本案說明書之實施例之例1所記載，較佳係使用GAPDH，但亦可使用次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶1(HPRT1)、β-肌動蛋白(ACTB)等。

再者，在前述進行選擇之步驟中，將乳酸桿菌屬乳酸菌與大腸細胞共同進行培養之方法，在不會妨礙本發明之效果之前提下，並無特別限定，只要是熟習該項技術者即可適宜設定。作為該種培養條件(溫度、培養基、培養時間)，舉例而言，在大腸細胞為Caco-2細胞之情況，可列舉37℃、高葡萄糖Dulbecco修飾Eagle培養基、於CO₂環境下、24小時。

根據本發明之另一態樣，可提供就本發明之大腸炎抑制劑而言，包含大腸炎抑制劑而成之組成物。即，就本發明之大腸炎抑制劑而言，雖然亦可依原樣單獨使用，但在可顯現出大腸炎抑制機能之前提下，對於食品或醫藥品等各種經口攝取用(經口投予用)之組成物而言，亦可使其作為原料(素材)或添加劑等包含在內，便可獲得具有大腸炎抑制效果之組成物。因此，根據本發明之一實施態樣，係提供包含本發明之大腸炎抑制劑而成之組成物。

根據本發明之一態樣，可提供以具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分之組成物。本發明之組成物可為食品組成物或醫藥組成物。該種態樣可按照上述之大腸炎抑制劑之記載予以實施。

食品組成物係指醫藥組成物以外者，只要是溶液、懸浮液、乳濁液、粉末、固體成形物等可經口攝取之形態即可，並無特別限定。具體而言，可列舉例如即食麵、殺菌袋裝食品、罐頭、微波爐食品、即食湯品/醬湯類、冷凍乾燥食品等即時食品類；清涼飲料、果汁飲料、蔬菜飲料、豆乳飲料、咖啡飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、酒精飲料等飲料類；麵包、義大利麵、麵、蛋糕混料粉、麵包粉等小麥粉製品；飴糖、焦糖、口香糖、巧克力、甜餅乾、軟餅、蛋糕、餡餅、零食、薄脆餅乾、日式點心、甜點心等點心類；醬汁、蕃茄加工調味料、風味調味料、調理混合料、佐料汁類、沙拉醬類、羹湯類、咖哩/燉物之原料類等調味料；加工油脂、奶油、人造奶油、美乃滋等油脂類；乳飲料、優格類、乳酸菌飲料、冰淇淋類、鮮奶油類等乳製品；農產罐頭、果醬/柑橘醬類、穀片等農產加工品；冷凍食品等。食品係較佳為乳製品，更佳為乳飲料、優格類、乳酸菌飲料或冰淇淋類。

此外，在食品中，亦包含諸如健康食品(包含補充品)、機能性食品、營養補助食品、機能性標示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼兒用調整奶粉、妊產婦或授乳婦用奶粉、或附有減低疾病風險之標示的食品之分類者。

根據本發明之較佳態樣，係提供以具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分之大腸炎抑制用乳製品，較佳為大腸炎抑制用乳飲料、優格類、乳酸菌飲料或冰淇淋類。該種態樣可按照上述之大腸炎抑制劑之記載予以實施。

醫藥組成物係指併用為了製劑化可容許之添加劑，並依照常法調製為經口製劑或非經口製劑者。在經口製劑之情況，可採取錠劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、緩釋劑等固形製劑、溶液、懸浮液、乳濁液等液狀製劑之形態。此外，在非經口製劑之情況，可採取注射劑或栓劑之形態。從簡易性之方面而言，較佳為經口製劑。作為為了製劑化可容許之添加劑，可列舉例如賦形劑、安定劑、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、潤滑劑、甜味料、著色料、香料、緩衝劑、抗氧化劑、pH調整劑等。在本發明之醫藥組成物中，係包含用於需要抑制大腸炎之疾病(例如炎症性腸疾病、貝賽特氏症、缺血性腸炎及感染症性腸炎)之醫藥組成物，更具體而言，預防用組成物及治療用組成物。

此外，根據本發明之另一態樣，係提供大腸炎之抑制方法，其係包含使對此有所需要的對象攝取具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌的有效量。此處，在「抑制」中，不僅包含治療已確立之病態，亦包含預防在將來有確立之可能性的病態之概念。再者，在本發明之「抑制」中，亦包含非治療性概念，例如改善或緩和起因於大腸中之炎症或與其相關連之症狀或狀態。從而，根據另一態樣，抑制大腸炎係改善或緩和起因於大腸中之炎症或與其相關連之症狀或狀態，較佳為非治療性。

大腸炎之抑制方法中，可將乳酸桿菌屬乳酸菌的有效量與上述之大腸炎抑制劑中之1次的攝取量之單位同樣地進行設定或調整。

使對此有所需要的對象攝取乳酸桿菌屬乳酸菌的有效量之方法，在不會妨礙本發明之效果之前提下，並無特別限定，例如為經口攝取或經腸攝取等，較佳為經口攝取。

本發明之乳酸桿菌屬乳酸菌之攝取計畫並無特別限定，配合對象的年齡、性別、症狀及狀態，熟習該項技術者可適宜設定。對於本發明之對象，可例如以每1日1~10次投予1次的經口攝取量之單位，較佳為以每1日1~3次進行投予，更佳為以每1日1次進行投予。此外，本發明之大腸炎抑制劑可在進食之同時進行攝取。

作為本發明之大腸炎，係例如為炎症性腸疾病、貝賽特氏症、缺血性腸炎及感染症性腸炎，較佳為炎症性腸疾病(潰瘍性大腸炎、克隆氏病)，更佳為潰瘍性大腸炎。

作為本發明之對象，係為哺乳動物，例如囓齒類、犬、貓、牛、靈長類、人類，較佳為人類，更佳為患有大腸炎之患者。此外，本發明之對象亦可為健康正常者。作為該種健康正常者之例，較佳為儘管並未被診斷為患有大腸炎之患者，但具有起因於大腸中之炎症或與其相關連之症狀或狀態、或者有產生該等症狀或狀態之疑懼者。另外，是否為患有大腸炎之患者，舉例而言，潰瘍性大腸炎係可基於Katsuyoshi Matsuoka and Tsung-Chun Lee,Guidelines for the Management of ulcerative colitis in Japan,IBP Research 4：189-239,2010(特定而言，參照(14)頁之2、(16)頁之圖1)等，克隆氏病係可基於Fumiaki Ueno et.al.Evidence-based clinical practice guidelines for Crohn’s disease,integrated with formal consensus of experts in Japan,J Gastroenterol(2013)48：31-72(特定而言，參照38頁之II、43頁之II-8、44頁之表5)等公知的診斷方法進行診斷。

根據本發明之一態樣，係提供具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌之用途，其係用在大腸炎抑制劑的製造中。此外，根據本發明之一態樣，係提供具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌用於抑制大腸炎之用途。根據本發明之一較佳態樣，該用途係非治療性用途。該種用途可按照上述之大腸炎抑制劑及大腸炎之抑制方法之記載予以實施。

根據本發明之一態樣，係提供具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌，其係用於抑制大腸炎。該種態樣可按照上述之大腸炎抑制劑之記載予以實施。

〔實施例〕

藉由以下之例詳細地說明本發明，但本發明並不限定於此。

〈例1：HSPA1A基因之表現誘導試驗(活體外試驗)〉

(1)生菌懸浮液及Caco-2細胞之調製

將約氏乳酸桿菌OLL2978株、約氏乳酸桿菌OLL203565株、約氏乳酸桿菌OLL204255株使用Difco(商標)Lactobacilli MRS broth培養基(BD)，在37℃、厭氧條件下以1次繼代進行培養。接著，將各菌進行離心分離處理(8,000rpm，5分鐘)並使其沉澱，以磷酸緩衝液(PBS，Phosphate Buffered Saline)洗淨後，使用分光光度計(U-2810 Spectrophotometer，HITACHI)，於波長650nm測定濁度(OD)。此處，PBS係將PBS(Phosphate Buffered Salts)錠片(TaKaRa公司)溶解於蒸餾水中而予以調製。然後，使用PBS，以各菌成為OD=5之方式進行調整，調製生菌懸浮液。

將屬源自人類結腸癌之細胞的Caco-2細胞(DS Pharma Biomedical公司)使用以成為10% FBS、2mM麩醯胺酸之方式摻合而得之高葡萄糖Dulbecco修飾 Eagle培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high glucose，D6546，Sigma-Aldrich公司)，在37℃、5% CO₂之環境下(NAPCO Series 5400 CO₂ Incubator，Thermo Scientific)進行培養。

在投予生菌懸浮液之前日，以成為1.0×10⁵個細胞/孔之方式，將Caco-2細胞繼代於6孔盤(TPP公司)中。

(2)HSP基因之表現誘導試驗

將生菌懸浮液以20μl/孔添加至前述包含繼代後之Caco-2細胞之6孔盤中，在37℃、5% CO₂之環境下以24小時進行共培養。在結束此共培養後，緊接著將此等培養液(培養基)吸引去除，於其中添加RNA later(Ambion公司)，浸漬細胞。藉由NucleoSpin RNA II(MACHEREY-NAGEL)自此等細胞萃取出RNA之後，使用PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time，TaKaRa公司)進行反轉錄反應。使用SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus，TaKaRa公司)，藉由Thermal Cycler Dice Real Time System TP-800(TaKaRa)，進行即時PCR，並進行Caco-2細胞之HSPA1A基因的表現解析。

將即時PCR所使用之引子及反應液的組成分別示於表1及表2。

即時PCR之反應條件係設為(95℃，30秒)→(95℃，5秒→60℃，30秒)×40個週期→95℃，15秒→60℃，30秒→95℃，15秒→4℃。

作為對照組，係使用投予PBS來代替生菌懸浮液並進行共培養而得者。

將結果示於圖1。

如圖1所示，相較於對照組而言，在約氏乳酸桿菌之生菌之投予組中，可見到HSPA1A基因的表現上升。

〈例2：活體內試驗〉

將約氏乳酸桿菌OLL203565株投予至小鼠，藉由動物實驗檢討對葡聚糖硫酸鈉(DSS，分子量：36,000~ 50,000Da，MP Biomedicals公司)所誘發之大腸炎之抑制效果。

就生菌懸浮液而言，係將約氏乳酸桿菌OLL203565株1×10⁸cfu懸浮於PBS 200μl中而予以調製。接著，藉由餵食管每日強制經口投予此生菌懸浮液。另外，將DSS水設為自由飲水。

使用BALB/c小鼠(4週齡，雄性，Charles River公司)，將各組設為各10隻。自DSS水(2.0 w/v%)的投予之1週前起，對小鼠每日投予生菌懸浮液。將DSS水的投予之首日設為第1日，在1週內(直至DSS水的投予後之第7日)每日投予DSS水及生菌懸浮液之混合物。

作為對照組，係使用投予蒸餾水來代替DSS水者、投予PBS來代替生菌懸浮液者、以及投予蒸餾水及PBS來代替DSS及生菌懸浮液者(參照圖2)。

在DSS之投予期間中，每日記錄小鼠的體重之測定值及炎症評分。

在炎症評分中，係附有下痢及血便的評分，依照表3，以0至3對評分進行評估。

在DSS的投予期間結束後(第8日)，將小鼠進行解剖，摘取大腸，測定其長度及重量。針對將下痢及血便的評分之合計加以平均作為解剖時之炎症評分者，在DSS之投予組間進行比較。

就小鼠的體重、大腸的長度/大腸的每單位長度之重量而言，係以Tukey檢定在組間進行比較。就炎症評分而言，係以Mann-Whitney U檢定在組間進行比較。統計處理之結果，p<0.05時，係判斷為顯著。在圖表中，係以平均值±標準偏差(SD)表示。

將各自之結果示於圖3~5。

如圖3所示，可確認由於DSS所誘發之大腸炎，小鼠的體重係減少，而藉由投予約氏乳酸桿菌OLL203565株，小鼠的體重減少係受到抑制。另外，G1：蒸餾水+PBS之投予組、G2：蒸餾水+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組、G3：DSS+PBS之投予組、G4：DSS+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組。

如圖4所示，相較於DSS+PBS之投予組而言，在DSS+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組中，炎症評分係顯著地減少。

如圖5所示，在DSS之投予組中，大腸的長度係縮短。此外，相較於蒸餾水+PBS之投予組而言，在DSS+PBS之投予組中，每單位長度之重量係顯著地增加，而在DSS+約氏乳酸桿菌OLL203565株之投予組中，則並未見到顯著差異。

就結論而言，可確認藉由投予約氏乳酸桿菌OLL203565株之生菌，DSS所誘發之大腸炎係受到抑制。

雖然未將數據示於此，但已確認在使用約氏乳酸桿菌OLL204255株來代替約氏乳酸桿菌OLL203565株之情況，亦與約氏乳酸桿菌OLL203565株同樣地，有DSS所誘發之大腸炎係受到抑制之傾向。

主張利用生物材料：

須寄存生物材料者：

國外生物材料【格式請依：寄存國家、機構、日期、號碼順序

1.日本；獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許

微生物寄；2015/03/06；NITE BP-02002

2.日本；獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許

微生物寄；2015/03/06；NITE BP-02003

3.日本；獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許

微生物寄；2015/03/06；NITE BP-02004

<110> 明治股份有限公司

<120> 大腸炎抑制劑

<130> 208829

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 641

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

<210> 2

<211> 2429

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 4

Claims

一種大腸炎抑制劑，其係以具有大腸細胞中之熱休克蛋白(HSP)70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌作為有效成分。
如請求項1之大腸炎抑制劑，其中，乳酸桿菌屬乳酸菌為約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)。
如請求項1或2之大腸炎抑制劑，其中，乳酸桿菌屬乳酸菌為選自約氏乳酸桿菌OLL203565株、約氏乳酸桿菌OLL204255株、及約氏乳酸桿菌OLL2978株者。
如請求項1至3中任一項之大腸炎抑制劑，其中，乳酸桿菌屬乳酸菌可使於活體外所共同培養之大腸細胞中之HSP70的表現量相較於未添加前述乳酸桿菌屬乳酸菌所培養之大腸細胞中之HSP70的表現量而言增加至1.5倍以上。
如請求項1至4中任一項之大腸炎抑制劑，其中，大腸炎為炎症性腸疾病。
如請求項5之大腸炎抑制劑，其中，炎症性腸疾病為潰瘍性大腸炎。
如請求項1至6中任一項之大腸炎抑制劑，其係用於改善便性。
一種大腸炎抑制劑之製造方法，其特徵為使其含有具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌。
一種具有HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌之用途，其係用在大腸炎抑制劑的製造中。
一種具有HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌之用途，其係用於抑制大腸炎。
一種具有HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌，其係用於抑制大腸炎。
一種大腸炎之抑制方法，其係包含使對此有所需要的對象攝取具有大腸細胞中之HSP70的表現增強活性之乳酸桿菌屬乳酸菌的有效量而成。