TW201634699A

TW201634699A - 現場去氧核醣核酸萃取、檢測與驗證之方法及其系統

Info

Publication number: TW201634699A
Application number: TW104110480A
Authority: TW
Inventors: 勞倫斯鍾; 明華梁
Original assignee: Ａｐｄｎ維京群島公司
Priority date: 2015-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2016-10-01

Abstract

本發明提供一種區別性標誌的現場檢測方法。該方法包括從一有興趣物品提供一樣本；以及分析該樣本以檢測該區別性標誌的存在。該分析係使用一現場檢測儀器執行。該現場檢測儀器包括一微系統，被配置以執行樣本入-結果出之分析以及檢測該樣本中該區別性標誌的存在。

Description

現場去氧核醣核酸萃取、檢測與驗證之方法及其系統

本發明係關於區別性標誌的用途與檢測，用於追蹤及驗證有興趣物品。該區別性標誌為存貨或安全的目的對於要被追蹤之物件或商業物品可係為獨特的。本發明亦係有關用於採樣與檢測該區別性標誌的方法及裝置，以及由該些裝置獲得之識別數據的管理、儲存、以及處理。

Dollinger於WO 90/14441中描述一種用於標籤及追溯含核酸物質的方法。該核酸標籤可為任何適合的直鏈或環形、單股或雙股DNA或RNA。該胜肽或蛋白質可為任何適合的天然或合成胜肽或蛋白質。該光學報導劑可為例如一上轉換磷光體或一螢光團。該化學標誌可為任何適合的化學標誌，例如一可供光學或化學鑑定物件特徵指紋之染色劑或信息素。

Hatfield於WO 00/55609描述一種於物件或物品上形成可檢測特徵指紋的方法。Schulz,M.M.與W.Reichert於"Archived or directly swabbed latent fingerprints as a DNA source for STR typing" Forensic science international127.1(2002)：128-130中描述DNA指紋鑑定的方法。

本發明提供一種區別性標誌現場檢測之儀器、系統、以及方法。

在本發明之一實施例中，該現場檢測區別性標誌的方法包括：從一有興趣物品提供一樣本；以及分析該樣本以檢測一區別性標誌的存在。該分析係使用一現場檢測儀器來執行。該現場檢測儀器包含一微系統，其被配置以執行樣本入-結果出之分析，以及檢測該樣本中該區別性標誌的存在。

該樣本可包括一樣本識別物(identifier)，該樣本識別物可包括一光學報導劑(optical reporter)、一數位碼、一QR碼或一條碼。該光學報導劑可包括一上轉換磷光體(upconverting phosphor)、一螢光團(fluorophore)(需要一顯影劑(developer)以展現螢光)、一染色劑、一著色劑、一磷光體、或一微粒(microdot)。

該區別性標誌可包括一生物分子或一有機非生物分子。該生物分子可為例如一胺基酸、一胜肽、一蛋白質、一脂質、一異戊二烯、一單醣、一多醣、一脂肪酸、一維生素、一核酸、一蛋白質-DNA複合體、一肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、一微量元素、或一同位素。

該區別性標誌可包括DNA。該區別性標誌可包括一或多個可複製以產生獨特擴增子分布(amplicon profile)的核酸序列。該獨特擴增子分布可包括一或多個不同長度的擴增子。

該現場檢測儀器與一伺服器溝通，該伺服器包含用於該有興趣物品的真實性(authenticity)數據。

該樣本可利用PCR、恆溫擴增法(isothermal amplification)、或核酸雜交法來分析。該樣本可利用次世代定序(next-generation sequencing)來分析。

該現場檢測儀器可為可攜式的。

可快速地檢測該區別性標誌的存在。例如，可實際上即刻地檢測該區別性標誌的存在。

根據本發明之一實施例，該方法包括從一有興趣物品提供一樣本；以及分析該樣本以檢測該區別性標誌的存在。該分析係利用一現場檢測儀器來執行。該現場檢測儀器包含一微系統，其被配置以執行樣本入-結果出之分析。藉由檢測該樣本中該區別性標誌的存在以證實該有興趣物品的真實性。

根據本發明之一實施例，用於收集從有興趣物品取得的樣本的一套組包括一樣本收集單元，被配置以收集一包括適合供現場檢測儀器分析之區別性標誌的樣本。

該套組可包括一緩衝溶液或一溶劑用於從一有興趣物品萃取出該區別性標誌。

根據本發明之一實施例，一種用於現場檢測區別性標誌的裝置包括一現場檢測儀器，該現場檢測儀器包括一微系統，被配置以執行樣本入-結果出之分析。該現場檢測儀器係被配置以分析一樣本以判定該樣本中一區別性標誌的存在。

100‧‧‧流程

110‧‧‧步驟

120‧‧‧步驟

130‧‧‧步驟

140‧‧‧步驟

150‧‧‧步驟

160‧‧‧步驟

170‧‧‧步驟

180‧‧‧步驟

190‧‧‧步驟

300、400、420、430‧‧‧正控制組

310、410‧‧‧負控制組

320‧‧‧樣本A

330‧‧‧樣本B

340‧‧‧樣本D

350‧‧‧樣本E

360、370、380、390‧‧‧曲線

第1圖係本發明方法之一實施例的流程圖；第2圖係依據本發明方法之一實施例的即時PCR結果圖，說明從緊固件(fastener)檢測一DNA標示體；第3圖係依據本發明方法之一實施例的即時PCR圖，說明檢測一DNA標示體；第4圖係顯示依據本發明一實施例的流程；以及第5圖係顯示依據本發明一實施例之現場檢測儀器的示例。

本發明係提供一種現場檢測區別性標誌之儀器、系統、以及方法。

根據本發明之一實施例，該現場檢測區別性標誌之方法包括從一有興趣物品提供一樣本；以及分析該樣本以檢測該區別性標誌的存在。該分析係利用一現場檢測儀器來執行。該現場檢測儀器包含一微系統，其被配置以執行樣本入-結果出之分析，以及檢測該樣本中該區別性標誌的存在。可藉由檢測該樣本中該區別性標誌的存在以證實該有興趣物品的真實性。

區別性標誌

本發明之方法係關於現場檢測區別性標誌，例如：核酸標誌 (如直鏈或環形、單股或雙股DNA)、蛋白質或胜肽標誌、光學報導劑、以及其他以安全、追蹤、以及防偽為目的之用於驗證、確認、追蹤被標記物件或物品的化學標誌。

一區別性標誌可為任何適合用於從其他物品區分一獨特物品的可檢測標誌。該區別性標誌可為一核酸(如：DNA)、一蛋白質、一胜肽、一光學報導劑、或一化學標誌。舉例而言，該區別性標誌可包括一或多個具有一或多個獨特核酸序列的核酸。該區別性標誌可包括一種獨特的兩個或多個核酸序列的組合。該區別性標誌可包括一核酸序列組合，其在複製時產生一具有特定長度之擴增子的獨特組合，也就是說，該擴增子的組合產生一獨特多變的擴增子分布。該區別性標誌的核酸可包括DNA。

該區別性標誌可包括一生物分子或一有機非生物分子。該生物分子係一由有生命的生物體產生的分子。該生物分子可為一胺基酸、一胜肽、一蛋白質、一脂質、一異戊二烯、一單醣、一多醣、一脂肪酸、一維生素、一核酸、一蛋白質-DNA複合體、或一肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)。

該區別性標誌可包括DNA。該區別性標誌可包括一或多個DNA序列，其可複製以產生一獨特的擴增子分布。舉例而言，一獨特的擴增子分布可包括對一特定物品而言是獨特的一或多個核酸序列特定組合。對該物品而言，一或多個DNA序列本身或是DNA序列的組合可以是獨特的。該獨特擴增子分布可包括不同長度的一或多個擴增子。舉例而言，該區別性標誌可包括一核酸序列之組合，其在複製時產生一具有特定長度之擴增子的獨特組合，也就是該擴增子的組合產生一獨特多變的擴增子分布。在一實施例中，該區別性標誌可包括一獨特DNA序列的組合，其可複製以產生一獨特擴增子的組合，同時包括特殊核酸序列以及特殊擴增子長度。

該核酸標誌可以利用一核酸合成儀或藉由從酵母菌、人類細胞株、細菌、動物、植物、或其類似來源分離核酸物質的方式來合成產生。在一實施例中，該核酸物質可由限制酶(restriction enzymes)處理接著純化以產生可接受的核酸標誌。Guo於WO 98/06084描述一種分析核酸碼的方法。該核酸標示體(taggant)可包含一特定核酸序列，亦或是可包含複數個不同的核酸序列。在一實施例中，包括短核苷酸重複序列(short tandem repeats，STRs)之多態性DNA片段，已作為片段長度多型性及/或單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphisms，SNP)可用於防偽核酸標籤。雖然使用單一序列核酸標誌可使標誌的檢測更簡單、快速，但是，一般而言，使用複數個包括STR與SNP的核酸序列可提供更高程度的安全性以打擊偽造者。

在本發明之一實施例所述的方法中，該核酸標誌係從一特定植物來源所萃取的DNA衍生而得，且經由特定分解與連接以產生世界上獨一無二的人工核酸序列。該所萃取之DNA的分解與連接係以分子生物學領域中具有通常知識者習知的標準酶解與連接技術來完成。產生修飾的DNA標示體後，該標示體能以物質包覆來抵抗紫外光及/或降解。該包覆DNA的物質可為植物來源。該DNA標誌序列可為任何適合的長度，例如該DNA標誌序列可為一具有約20至約1000鹼基之序列。

在該核酸片段與一已知核酸序列被製造或分離後，該方法進一步包含產生一DNA標誌化合物，其包含該選定的核酸片段。該產生的標誌化合物可為一固體或液體、水性或油性、一懸浮液、一集合體、或其類似物。該標誌化合物之一特徵可為保護該核酸片段，不受紫外光及/或其他可經時間降解該核酸標示體的降解因子，而該核酸係作為一特定產品之一驗證標籤。在實施例中，當該標示體為DNA，該核酸標籤可被包覆或懸浮於一溶劑(例如：一水性或有機溶劑)中產生一具有特定濃度的“儲備”DNA標示體溶液。可將該儲備DNA溶液依所欲驗證的產品樣式加入該標誌化合物混合至一合適的濃度。在實施例中，在不需要任何預先包覆處理下，該DNA標示體可與該標誌化合物的其他成分混合。處理過程應用如核酸片段封裝及其他技術，以避免核苷酸(特別是DNA)降解將更詳細地敘述如下。

該標誌化合物混合物之另一特徵係可用於偽裝或“隱蔽”該特定核酸標籤與外來的或非特定的核酸低聚物/片段，因而讓未授權個體(如：偽造者)不易識別該核酸標籤之序列。在實施例中，該標誌化合物包含一從已知來源(如：哺乳類、無脊椎動物、植物、及其相似物)而得之特定的單股DNA標示體，以及與其來源相關或相似之基因體DNA。一標誌化合物中DNA標示體的數量係取決於該特定欲驗證之產品、該標示體在驗證前需有效存在的期限(如：1天、1個月、1年、或多年)、預期暴露的環境、所使用的檢測方法等。

依據實施例，該標示體係單股DNA，而PCR技術係用於標示體的檢測。在一預定樣本大小下用於驗證之該標誌化合物中DNA標示體的拷貝數係約3個至約100,000個，例如：約10個至約50,000個、或約100個至約10,000個DNA標示體拷貝數。

官能基團之結合

在實施例中，在併入特定產品前，該核酸標籤係以至少一個化合物或“檢測分子”標記，以幫助於供應鏈中該產品核酸標誌的萃取/及或檢測。檢測分子係一具有至少一檢測基團的分子或化合物。舉例而言，在某些檢測方法中，螢光分子可被設置為與該核酸標誌結合並詳細敘述如下。

在本發明之實施例中，適合的染色劑包括但不限於香豆素(coumarin)染色劑、二苯并哌喃(xanthene)染色劑、試鹵靈(resorufin)、花青(cyanine)染色劑、氟硼二吡咯(difluoroboradiazaindacene，BODIPY)染色劑、ALEXA染色劑、吲哚(indoles)、雙環氮雜環化合物(bimanes)、異吲哚(isoindoles)、丹磺酰(dansyl)染色劑、萘醯亞胺(naphthalimides)、苯二醯亞胺(phthalimides)、二苯并哌喃、鑭系元素(lanthanide)染色劑、玫瑰紅(rhodamines)、以及螢光素。已習知某些可見光及近紅外線染色劑因發光充足且光穩定而可作為單一分子檢測。在這方面，可見光染色劑BODIPY R6G(525/545)以及一較大染色劑LI-COR's近紅外線染色劑IRD-38(780/810)具有單一分子敏感度而可被檢測，進而用於本文所述驗證流程的施行。在本發明之實施例中，合適的染色劑包括但不限於螢光素(fluorescein)、5-羧基螢光素(5-carboxyfluorescein，FAM)、玫瑰紅、5-(2’-胺乙基)胺基萘-1-礦酸(5-(2’-aminoethyl)amino naphthalene-1-sulfonic acid，EDANS)、氨茴內酐醯胺(anthranilamide)、香豆素、鋱螯合衍生物(terbium chelate derivatives)、活性紅4(Reactive Red 4)、BODIPY染色劑、以及花青染色劑。

已知多種連結基團與方法以將螢光團或可見光染色劑基團附著至核苷酸，係如下文獻所示例：Eckstein,editor,Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Zuckerman等人Nucleic Acids Research,15：5305-5321(1987)(3’ thiol group on oligonucleotide)；Zuckerman等人，Nucleic Acids Research,15：5305-5321(1987)(3’ thiol group on oligonucleotide)；Sharma等人，Nucleic Acids Research,19：3019(1991)(3’ sulfhydryl)；Giusti等，PCR Methods and pplications,2：223-227(1993)以及Fung等人，美國專利第4,757,141號(5’ phosphoamino group via Aminolink^TM II available from Applied Biosystems,Foster市，加州)，Stabinsky，美國專利第4,739,044號(3’ aminoalkylphosphoryl group)；AP3 Labeling Technology(美國專利第5,047,519及5,151,507號，轉讓予E.I.DuPont de Nemours & Co)；Agrawal等，Tetrahedron Letters,31：1543-1546(1990)(attachment via phosphoramidate linkages)；Sproat等人，Nucleic Acids Research,15：4837(1987)(5’ mercapto group)；Nelson等人，Nucleic Acids Research,17：7187-7194(1989)(3’ amino group)；或其相似者。

在實施例中，互補的核酸探針係標記至少一個具有可幫助檢測該核酸標籤/標誌功能的化合物或分子。用於標記該核酸標籤或該互補探針之技術及使用的染色劑可為相同，因為該核酸會被結合至該探針。

本發明之檢測分子可結合至探針模體(motifs)，如Held等人，Genome Res.6：986-994(1996)、Holland等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：7276-7280(1991)、Lee等人，Nucleic Acids Res.21：3761-3766(1993)所述的Taqman探針；Tyagi等人，Nature Biotechnol.,16：49-53(1998)、美國專利第5,989,823號，1999年11月23日核發之所述的分子信標(molecular becons)；Whitcomb等人，Nature Biotechnology 17：804-807(1999)所述的蝎型探針(scorpion probes)；Nazarenko等人，Nucleic Acids Res.25：2516-2521(1997)所述的sunrise探針；Cook,R.，待審及共同轉讓的美國臨時案申請第60/138,376號，1999年6月9日申請之所述的協助形態探針；Kubista et al.,WO 97/45539,1997年12月所述之以肽核酸為基礎的發光探針；Higuchi et al,Bio/Technology 10：413-417(1992)、Wittwer et al,Bio/Techniques 22：130-138(1997)所述的雙股特定DNA染色劑；及其相似者。上述這些與其他本發明之檢測分子可使用的探針模體係如Nonisotopic DNA Probe Techniques,Academic Press,Inc.1992中所評估的。

在實施例中，使用該分子信標系統以檢測及計數該有興趣產品的核酸標籤。“分子信標”係髮夾型核酸檢測探針，當結合至目標時產生形態轉換，使得其可被檢測。通常而言，分子信標之環(loop)部分係一探針核酸序列，其與該核酸標誌互補。分子信標之主幹(stem)部分係由連結存在探針序列兩端之分子信標之臂(arm)序列所構成。一功能基團如螢光團(例如：香豆素、EDNAS、螢光素、螢光黃(lucifier yellow)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)、德克薩斯紅(Texas Red)、及其類似物)係共價地附著至一臂序列之尾端，而一淬熄體(quencher)分子如一非螢光淬熄體(例如：DABCYL)係共價地附著至另一臂序列之尾端。當不存在目標(核酸標籤)時，該分子信標因為該功能基團與該淬熄體分子距離近而保持抑制該功能基團。然而，當分子信標與其特定的目標點，該分子信標會產生一形態轉變使得該主幹與環結構無法形成，故，增加該功能基團與該淬熄體之間的距離，導致目標的存在可被檢測。當該功能基團係一螢光團時，該分子信標與該核酸標籤之結合係以螢光光譜儀檢測。

在實施例中，使用具有多種序列的複數個核酸標籤來標記特定的產品。不同核酸標籤之可藉由複數個分子信標量化檢測，其各自具有不同顏色的螢光團以及至少與該複數個核酸標籤互補之獨特的探針序列。不同螢光團(即：不同核酸標籤)的量化提供更高程度的驗證與安全性。值得注意的是，上述其他用於標記該酸探針的功能基團亦可用於本發明之分子信標。

物品區別性標誌之應用

根據實施例，欲標記之物可為任何合適的物品，例如一微晶片、一標籤、一識別證、一徽標圖形、一印刷品、一文件、一紡織品、或一商品。Wiggins於WO 02/057548中描述生化標誌標記紙張。在一實施例中，本發明提供一種現場檢測與驗證一區別性標誌的方法，該區別性標記為例如：DNA、一蛋白質、一胜肽、一光學導劑、以及一標記化學物。根據一實施例，該發明的方法包括從一有興趣物提供一樣本；使用一特定依據該區別性標誌的檢測方法分析該樣本以檢測具有關於該物之獨特信息的區別性標誌，其中該檢測方法係利用一可攜式裝置來執行；以及藉由檢測該樣本中該區別性標誌的存在確認該有興趣物品的真實性。

在實施例中，該可被本發明之方法所驗證之DNA標記物係可為任何合適的物品，例如：一高價物品、或一獨特物品、或一具有重要功能的物品。該被標記物係可為電子產品，例如：一微晶片；或者，該物係可為一家用品、布料、紡織品、標籤、識別證、徽標圖形、衣物、或飾品。在一實施例中，該被標記之物係可為墨水、文件或印刷品、或一商品。在一實施例中，該被標記之物係可為一醫藥品，例如但不以之為限：一錠劑、一橢圓形錠劑、一粉末、或一口含片。在一實施例中，該物係選自於由現金、一貨幣紙幣、一硬幣、一寶石、一珠寶、一樂器、一護照、一古董、一傢俱、藝術品、財產契約、一股票證明、或一債券證明所組成之群組。該被標記之物係可為一保存的物品或運送中之非保存的物品。

在一實施例中，該可為本發明之方法所驗證的DNA標記之物係為一微晶片、一標籤、一識別證、一徽標圖形、一印刷品、一紡織品、或一商品。在一實施例中，該物係選自於由現金、一貨幣紙幣、一硬幣、一寶石、一珠寶、一樂具、一護照、一古董、一傢俱、藝術品、一財產契約、一股票證明、或一債券證明所組成之群組。

可使用任何可行且適合固定該區別性標誌於該有興趣物品上的方法來將該區別性標誌附於一有興趣物品，使得該區別性標誌在交易流通移動中或經刻意損害而不易脫落，而讓該區別性標誌之一樣本可在交易流通之任一點取得。在本說明書及圖式中，“物品”、“物”、或“有興趣之物”等詞可交互地使用。在本說明書及圖式中，“標誌”、“區別性標誌”、“安全標誌”、“標籤”、“標示體”等詞可交互地使用。一樣本可包括從該有興趣之物取得之任何部分或全部之該區別性標誌，該有興趣之物具有該區別性標誌附於其上。舉例而言，該區別性標誌之樣本可藉由任何合適的物理或化學方法取得。可在交易流通之多個點及/或在該物品移動於交易流通之不同時間點上取得相同有興趣物之相同區別性標誌的多數個樣本。多個相同的區別性標誌可置於該有興趣物上之多個位置，或者多個不同的區別性標誌可置於該有興趣之物上。舉例而言，該區別性標誌可被置於該有興趣物上的一個位置，而一非區別性標誌(例如：一偽裝物或假冒標誌)亦可被置於該相同的有興趣之物。

一有興趣之物係可為任何物品、產品、固體、液體、或氣體，例如：一微晶片、一標籤、一識別證、一徽標圖形、一印刷品、一紡織品、一商品、一墨水、或一溶液。

該有興趣之物可以一相對少量的區別性標誌來標記，使得有興趣之物上該區別性標誌的位置並非肉眼輕易可見，及/或非經由觸覺檢查該物品而可輕易發現。然而，區別性標誌的量並不受限制，可使用於任何希望的區別性標誌之量來標記一物品。舉例而言，可使用一相對大量的區別性標誌於該物品，因為可能希望該區別性標誌並非隱蔽的。Sleat於WO 03/080931中描述一種核酸標記物品的標記裝置。Mackay於GB 2434570 A中描述一種應用DNA樣本於物品的方法。Slater於WO 95/02702中描述一種標記固體物之方法。Garner等人於WO 95/06249中描述一種標記產品以用於識別的方法。Le Page等人於WO 87/06383中描述一種標記物品或物質的方法。Regan等人於WO 03/030129描述一種標記物品及/或文件之流程。

如上所述，將該核酸標籤結合至一產品的方法可依據所欲驗證產品之類型。該核酸標籤可以一“裸露”或包覆的形式在一預定濃度下加入一標誌化合物，達到精準檢測該核酸標示體。該標誌化合物在加入該核酸標示體後可為一液體，並可在附於一特定產品(例如：一藥物錠劑、或紡織品)前先乾燥。當該包含一核酸標示體的標誌化合物係液態，該標誌化合物可以一亮漆、塗料、或液體噴霧形式附於該產品上。

在一實施例中，本發明之微流體裝置利用一酵素處理以分解生物分子，例如：樣本中的蛋白質及脂質，該樣本可為一唾液樣本或一口腔取樣(swab)，並釋放該DNA內容物至下游分析與檢測。該釋放的DNA接著在該微流體通道中流動至一PCR溫度循環器模組進行放大反應，並由另一模組(例如：毛細管電泳模組)進行檢測。檢測可為任何數目之方法，例如：光學檢測、放射檢測、離子感測場效電晶體(Ion Sensitive Field Effect Transistor，ISFET)、或任何在寡核苷酸定序以及檢測領域中具有通常知識者習知之方法。所產生之數據可由模組進行分析或由一安全伺服器傳送至一網路伺服器或一雲端伺服器以與其他儲存的數據進行比較或進一步分析。如此的系統可設計為在90分鐘或90分鐘之內提供數據讀出。該方法之應用係為血緣生物測定，或是人員或旅客等的身分認證。

樣本識別物

在一實施例中，該DNA標誌係與一樣本識別物(例如：檢測報導劑)結合，而該方法進一步包括將該與DNA標誌結合之光學報導劑定位，以在現場檢測與驗證步驟中促進該DNA標誌樣本化。該樣本識別物可為一光學報導劑、一數位碼、一QR碼、或一條碼。該光學報導劑可包括一上轉換磷光體、一螢光團、一染色劑、一著色劑、或一磷光體。在一實施例中，該檢測報導劑係選自於由一化學報導劑、一數位報導劑、及/或一胜肽報導劑所組成之群組。在一實施例中，該數位報導劑可為任何合適的數位報導劑，例如：一條碼、一QR碼、一量子點、或一無線射頻辨識(Radio Frequency Identification，RFID)。在另一實施例中，該QR碼、量子點、條碼、或RFID可包括該DNA標誌所編碼之序列，例如Tran等人於WO 2013/170009(Verification or physical encryption taggants using digital representatives and authentications thereof)中所述。

一樣本識別物可與該區別性標誌結合。該樣本識別物可為任何合適的樣本識別物以促進定位該區別性標誌。舉例而言，該樣本識別物可用於識別連結至有興趣物之該區別性標誌的位置。與該區別性標誌相似，該樣本識別物可為由視覺或觸覺檢查該有興趣物而不易被檢測到的。舉例而言，該樣本識別物可為一光學報導劑，例如：一螢光染色劑，其僅在暴露於紫外線時活化。故，將具有區別性標誌結合該光學報導劑的有興趣物暴露於紫外線可視覺上顯示該有興趣物上區別性標誌的位置。Degott於EP 1403333 A1)中描述一種標記物品的方法與墨水組。

該樣本識別物可為一觸覺識別物，例如：一course pattern，且可設置於該有興趣物表面上該區別性標誌所在之位置。該觸覺識別物可為形成於該有興趣物表面上的一異常平滑圖案。然而，該區別性標誌可單獨施於該物品而不需要樣本識別物。

該DNA標誌本身可為一可檢測DNA標誌。該可檢測DNA標誌可被標記，舉例而言，以一螢光標籤或探針標記。

標誌樣本化

用於現場檢測與驗證一DNA標誌之樣本可為任何合適的樣本，例如：從一平面取得之一固體樣本、一碎屑、一切割物、一粉末、一液體、一霧狀物、或一取樣。該樣本可由一收集容器收集，例如：一塑膠或玻璃試管、一旋蓋管、一微蓋管、一分析盤之一孔、一微流體槽、接收容器、或其他合適的容器。

可從該有興趣物收集包括一些或全部該區別性標誌之樣本並分析以檢測該區別性標誌之存在。該樣本可由任何適合檢測該區別性標誌的方法來分析。舉例而言，該分析可使用一現場檢測儀器執行。該現場檢測儀器係可完成分析而不需將樣本傳送至實驗室的儀器。舉例而言，在將標記之產品從工廠運送至消費者前可先從該產品取得區別性標誌的樣本，該樣本可由工廠裡的現場檢測儀器分析而不需要將該樣本運送至實驗室以進行測試。因此，可快速執行分析，並實質上與收集該樣本同時執行或在收集樣本後數分鐘內完成分析。舉例而言，可實質上同時檢測該區別性標誌存在(例如：10-20秒內)，即時檢測，或是在將該樣本置於該現場檢測儀器中的數分鐘內檢測。舉例而言，分析及/或檢測該區別性標誌可於約5分鐘至約2小時完成。更特定而言，該分析及/或檢測該區別性標誌可於約10分鐘至約30分鐘完成。可藉由檢測該樣本中該區別性標誌的存在來驗證該有興趣之物的真實性。

根據一實施例，用於從一有興趣物收集樣本的套組包括一樣本收集單元，該樣本收集單元被配置以收集一包括適合以一現場檢測儀器分析之區別性標誌的樣本。可使用不同核酸萃取溶液(例如：溶劑或緩衝溶液)以從一有興趣的樣本萃取核酸序列。舉例而言，Green,Michael R.與Joseph Sambrook於Molecular cloning：a laboratory manual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012中描述核酸萃取的流程。在一實施例中，該樣本收集套組可包括一適合從一有興趣物萃取該區別性標誌之一緩衝溶液或一溶劑，且該緩衝溶液或溶劑是與進行現場檢測之儀器相容的。

核酸標籤之萃取與取得方法

近年來，已開發多種核酸萃取溶液，用於從一有興趣樣本萃取核酸序列，舉例而言，可參考Green,Michael R.與Joseph Sambrook之Molecular cloning：a laboratory manual.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012。這種方法典型地需要一或多個步驟，例如：一清潔劑介導(detergent-mediated)步驟、一蛋白酶處理步驟、一酚/及或氯仿萃取步驟、及/或一酒精沉澱步驟。一些核酸萃取溶液可包含一乙烯乙二醇類的反應劑或一乙烯乙二醇衍生物以增加核酸萃取的效率，而其他方法則僅使用研磨及/或將該樣本於水中煮沸。其他方法包括以溶劑為基礎的系統與超音波萃取亦可使用並與其他萃取方法共同進行。

在一實施例中，該驗證流程包含以一附著於固體支撐物之互補雜交探針直接取得該核酸標籤。通常而言，用於取得核酸標籤的方法包括在固態層中的一物質與在液態層中的一反應物交互作用。在實施例中，該核酸探針係附著於該固態層。該核酸可藉由任何習知的共價連結或非共價交互作用固定於一固體支撐物而存在於該固態層。在實施例中，該支撐物係包含不可溶物質，例如：可控孔徑玻璃、一玻璃盤或玻璃片、聚苯乙烯、丙烯醯胺膠、以及活化的葡萄聚糖。在實施例中，該支撐物具有一堅固或半堅固特性，並且可為任何形狀，例如：球體如珠子、方形物、膠狀物、微球體、或實質上平坦的支撐物。在實施例中，較佳為在該支撐物上製作一物理性分隔之區域，例如：孔、抬升區域、窩、針、溝、柱、針、管之內或外壁，以及類似者。其他合適的支撐物材料包括但不限瓊脂醣、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、羥乙基甲基丙烯酸、聚醯胺、聚乙烯、聚氧乙烯、或此類的共聚物以及接枝共聚物。示例性的固體支撐物包括小粒子、非多孔表面、可定址陣列、載體、質體、或多核苷酸固定基質。

如使用在取得該核酸標籤的方法中，可藉由共價鍵或其他親和交互作用將一核酸探針附著於該固體支撐物，以使該固體支撐物具有化學反應功能。該核酸可由其3’、5’醣或核鹼基附著至該固體支撐物。在實施例中，較佳為以3’端藉由一連接物(linker)附著於該支撐物，因為穩定或選擇性可分解連接物的選擇眾多，較佳為以該支撐物與該核酸間的共價連結達到固定。該連結單元，或稱之為連接物，係設計為可穩定且促進該固定之核酸與其互補序列接觸。另一方面，可使用非共價連結例如：生物素及卵白素或鏈親和素。其他功能基團連接物包括：酯、醯胺、胺基甲酸酯、尿素、磺酸鹽、醚、及硫酯。一5’或3’端生物素修飾之核苷酸可固定於連接在一支撐物(例如：玻璃)的卵白素或鏈親和素。

依據加入該有興趣產品之該核酸標籤的起始濃度，該標籤可被量化檢測而不需要經由PCR放大。在實施例中，一由檢測分子(例如：螢光團、生物素等)標記之單股DNA標籤可與附著在一固體支撐物上的一互補探針雜交，以使該設置於該標籤的“檢測分子”可被特定地檢測。該核酸DNA標籤亦可為雙股的，並至少有一股係以一檢測分子標記。就一雙股DNA標籤而言，該核酸標籤必須充分地加熱接著迅速冷卻以產生單股DNA，而在合適的雜交條件下，至少有具有一檢測分子的一股可與該互補DNA探針雜交。

在本發明之實施例中，該互補探針係以一檢測分子標記並可與該核酸標籤之一股雜交。當該產品為一紡織品時，該與探針之雜交可在該產品內完成；或者，當該產品為液態(例如：油、汽油、香水等)時，該與探針之雜交可在從該產品萃取出該核酸標籤/標誌後完成。本說明書中所述直接檢測的方法可根據嵌入該產品之核酸標籤的高起始濃度或精確的萃取/取得方法，其將從一大體積或質量特定產品萃取的核酸標籤濃縮。

目前已可做到人類的基因體完全定序之技術(即：全基因放大反應)以識別不同個體間基因碼的差異。研究發現，每個人之間約每一千個鹼基會有一個鹼基不同。這些差異稱為遺傳變異或單一核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)。在醫學領域如個人化藥物中，這些變異被廣泛地研究，以判斷一個體是否為疾病(例如：糖尿病)的好發個體。

樣本分析與標誌檢測

舉例而言，該樣本可利用PCR、恆溫放大反應、或核酸雜交來分析。該樣本可利用次世代定序來分析。樣本分析的方法將更詳細敘述如下。

DNA放大反應

在實施例中，該驗證流程包含以聚合酶連鎖反應發大該核酸標誌。在放大過程中，引子二聚物以及其他外來的核酸可與該核酸分析物一併放大。為了使之後分析PCR產物有足夠的量形成，使用一內部控制競爭物於量化的競爭PCR放大反應，並在產物形成之對數增殖期完成後停止。

在實施例中，PCR放大反應係在可被檢測之非引子探針的存在下進行，該可被檢測之非引子探針係特定地與該PCR放大反應產物結合(即：放大的DNA檢測部分)。PCR引子可依習知標準設計，而PCR可由市面上可購得儀器執行。該探針係可為一設計成特異性結合該放大檢測分子的DNA寡核苷酸。該探針可為一特別設計以與該放大的檢測分子結合的DNA寡核苷酸。較佳地，該探針具有一與該探針共價連接的5’報導染色劑以及一下游3’淬熄體染色劑，其傳導螢光共振能量。合適的螢光報導染色劑包括：6-羧基螢光素(6-carboxy-fluorescein，FAM)、四氯-6-羧基螢光素(tetrachloro-6-carboxy-fluorescin，TET)、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基螢光素(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxy-fluorescein，JOE)、以及六氯-6-羧基螢光素(hexachloro-6-carboxy-fluorescein，HEX)。一合適的報導染色劑係可為6-羧基四甲基-玫瑰紅(6-carboxytetramethyl-rhodamine，TAMRA)。這些染色劑係可由Perkin-Elmer,Philadelphia,Pa購得。可於各PCR放大反應循環檢測該PCR放大反應產物。在任一PCR放大反應的循環中，該PCR產物的量係與該起始樣本副本之數量成比例。該樣本副本之數量係可由該報導染色劑的螢光量檢測。當該探針係完整無缺時，該報導染色劑係因接近該淬熄體染色劑而抑制其螢光報導。在PCR反應中，該DNA聚合酶依5’至3’的方向切割分離該報導染色劑與該淬熄體染色劑，以增加該報導染色劑之螢光量，因為其已不接近該淬熄體染色劑，所測量到該螢光量的增加係與該PCR放大反應有直接的比例關係。此檢測系統係為市面上可購得Perkin-Elmer的TaqMan® PCR系統，可進行即時PCR檢測。Kubista、Mikael等人在WO 97/45539中描述核酸探針的分析。Whitcombe,David等人於“Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence" Nature biotechnology 17.8(1999)：804-807”中描述使用自我探針放大之PCR產物檢測。Nelson,Paul S.、Roy A.Frye、與Edison Liu於“Bifunctional oligonucleotide probes synthesized using a novel CPG support are able to detect single base pair mutations" Nucleic acids research 17.18(1989)：7187-7194”中描述使用控制的有孔玻璃(controlled pore glass，CPG)以合成寡核苷酸探針。Lee,Linda G.、Charles R.Connell、與Will Bloch在“Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorgenic probes" Nucleic acids research 21.16(1993)：3761-3766”中描述螢光基質探針用於切口平移轉譯(nick-translaton)PCR反應。

在實施例中，該報導染色劑與淬熄體染色劑係可位於兩個分開的探針上，該兩個探針與放大且鄰近到足以讓該淬熄體染色劑抑制該報導染色劑螢光訊的PCR檢測分子雜交。如上所述的檢測系統，該5’至3’的核酸酶作用中，聚合酶將一染色劑從含有該染色劑的探針上去除，以使報導染色劑與位於該鄰近探針上的淬熄體染色劑分離，防止該報導染色劑的抑制。如上方實施例所述，PCR產物的檢測係測量該報導染色劑之螢光的增加。

即時量化PCR反應係應用於核酸分析物或樣本。在這個方法中，PCR係用於在一非可延展雙標記螢光基質雜交探針存在下，放大一樣本中的DNA。一螢光染色劑作為一報導劑，而其發射光譜係由一第二螢光染劑抑制。該方法利用該5’端Taq聚合酶的核酸酶作用來在PCR反應中的延伸階段(extension phase)切斷一雜交的探針。該雜交探針的核酸酶降解作用釋放該被抑制的報導染色劑，導致該報導劑之發射峰值的上升。該反應係為即時地監測。Heid,Christian A等人於“Real time quantitative PCR" Genome research 6.10(1996)：986-994”、Gibson,U.E.,Christian A.Heid以及P.Mickey Williams於“A novel method for real time quantitative RT-PCR" Genome research 6.10(1996)：995-1001”均描述反轉錄酶PCR反應(RTPCR)及即時PCR反應。多種商業用溫度循環可用於連續監測PCR反應中的多個樣本的螢光光譜，因此PCR產物的累積可“即時”地監測而可避免實驗室擴增子污染的風險(如Heid,C.A.；Stevens,J.；Livak,K.L.；Williams,P.W.於“Real time quantitative PCR.Gen.Meth.6：986-994”(1996)中所述)。

在實施例中，可使用即時PCR檢測的策略，其包括已知的技術，例如：以嵌入的染色劑(如：溴化乙菲錠)使之為可見的、以其他用於檢測的雙股DNA結合染色劑(如：SYBR綠，一種高度敏感螢光著色劑，係由FMC Biotproducts購得)處理、使用雙螢光探針(如Wittwer等人於BioTechniques 22：176-181(1997))所述、以及使用鍋柄狀螢光探針(如：分子信標，如Tyagi及Kramer於“Nature Biotechnology 14：303-308(1996)”所述)。雖然嵌入染色劑與雙股DNA結合染色劑可即時量化PCR反應應用之產物的累積，其可能缺乏專一性，會導致檢測到引子二聚物、以及任何非專一性的放大產物。利用習知技術之謹慎的樣本準備、處理、以及引子設計可降低基質與污染DNA的存在並預防引子二聚體的形成。合適的PCR分析儀器軟體與熱裂解溫度分析可提供準確專一性的解決方法而可用於該些實施例。

分子信標系統可與即時PCR反應共同施行以專一性地量化檢測該樣本中的核酸樣本。舉例而言，為達成此目的可使用市場上可取得的Roche Light Cycler^TM(Roche Diagnostics Corporation,Indianapolis,Indiana)或其他這類的儀器。該設置於分子信標的檢測分子係可為在日光或傳統光源及/或螢光下可見。亦需注意的是，該檢測分子係可為一放射線發射物，例如：一典型的同位素。Tyagi、Sanjay、Diana P.Bratu以及Fred Russel Kramer於“Multicolor molecular beacons for allele discrimination" Nature biotechnology 16.1(1998)：49-53”中描述多色分子信標。Tyagi、Sanjay、以及Fred Russell Kramer於“Molecular beacons：probes that fluoresce upon hybridization" Nature biotechnology 14.3(1996)：303-308”中描述螢光分子信標。

在一實施例中，DNA可藉由奈米孔定序法(nanopore sequencing)來放大。奈米孔定序法包括使用一浸置於一導電液體並有一電壓施於該奈米孔的微小裝置(如：一直徑約為1奈米的奈米孔)。當各別核苷酸通過或靠近該奈米孔時，會產生一可測量的電壓變化，而該電壓變化可用於識別DNA一股之各別的核苷酸。舉例而言，Branton,Daniel等人於“The potential and challenges of nanopore sequencing" Nature biotechnology 26.10(2008)：1146-1153”、Deamer,David W.與Mark Akeson於“Nanopores and nucleic acids：prospects for ultrarapid sequencing" Trends in biotechnology 18.4(2000)：147-151”中均描述奈米孔定序法。

在一實施例中，DNA可藉由多重退化與成環放大循環法(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles，MALBAC)進行放大。MALBAC實質上可用於放大一整體基因組。MALBAC法可由準線性(quasi-linear)方式放大一基因組且可應用於單一細胞、整體基因組的放大。就MALBAC法而言，擴增子可具有互補的端點。該互補端點可形成環，該環可防止擴增子的指數複製，因而預防放大反應偏差。舉例而言，Zong,Chenghang等人於“Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell" Science 338.6114(2012)：1622-1626”中描述MALBAC法。

高敏感度、快速並準確地檢測以及量化生物相關分子為醫學技術、國家安全、大眾安全、市民及軍方醫學診斷之中心的議題。目前使用的方法，包括：酵素免疫分析法(enzyme linked immunosorbant assay，ELISAs)與PCR係為高度敏感的。然而，對PCR放大反應的需求可能會使得檢測的方法更加複雜、昂貴、以及費時。在實施例中，Graham等人於“美國專利第6,127,120號”中描述防偽核酸標籤係藉由表面增強拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scatter，SERS)檢測。SERS係一種檢測方法，其對於相對低目標物(核酸)濃度為敏感，較佳為直接用於一未放大的樣本。可標記或修飾核酸標籤及/或核酸探針以達到當該探針與該核酸標籤雜交時表面增強拉曼散射的改變。利用SERS量化檢測核酸提供一相對快速分析及驗證一特定產品的方法。

本發明中另一有用的檢測方法係Whitten等人於“美國專利第6,743,640號”所描述的淬熄體-連接臂-配體(Quencher-Tether-Liagnd，QTL)系統。該QTL系統提供一簡單、快速、且高敏感性的生物分子檢測，且具有結構專一性。該QTL系統提供由一淬熄體(Q)、一連接物質(Tethering element，T)、一配體(L)所組成的化學體。該系統係可藉由觀察螢光變化來檢測一樣本中的目標生物試劑。

該QTL系統係可快速並準確地檢測與量化一樣本中的目標生物分子。可用於聚合物-QTL方法之合適配體的示例包括：化學配體、賀爾蒙、抗體片段、寡核苷酸、抗原、聚胜肽、醣脂質、蛋白質、蛋白質片段、酵素、肽核酸、以及多醣。用於QTL之淬熄體的示例包括：甲基紫精(methyl viologen)、醌(quinones)、金屬複合體、螢光染色劑、以及電子接收、電子給予和能量接收體。該連接物質可為例如：一單鍵結、一單二價原子、一二價化學體、以及一多價化學體。然而，這些形成QTL分子之配體、連接物質、淬熄體的示例並非限制該QTL分子的組成，亦可使用其他合適的配體、連接物質、淬熄體示例。

傳統PCR運用反覆溫度循環以放大DNA。然而，根據本發明之實施例，DNA的放大可不需要溫度循環(例如：藉由恆溫放大)。舉例而言，DNA可藉由環形恆溫放大法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、股置換擴增法(Strand displacement amplification，SDA)、切口酶放大反應(Nicking enzyme amplification reaction，NEAR)、重組酶聚合酶擴增法(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)、解鏈酶擴增法(Helicase-dependent amplification，HAD)、或耐熱解鏈酶擴增法(thermophilic helices dependent amplification，tHDA)來恆溫地放大。舉例而言，Oriero,E.C.等人於“Comparison of two isothermal amplification methods：Thermophilic helicase dependent amplification(tHDA)and loop mediated isothermal amplification(LAMP)for detection of Plasmodium falciparum" International Journal of Infectious Diseases 21(2014)：381”、Li,Ying等人於“Detection and Species Identification of Malaria Parasites by Isothermal tHDA Amplification Directly from Human Blood without Sample Preparation" The Journal of Molecular Diagnostics 15.5(2013)：634-641”均描述恆溫放大。

根據本發明之實施例，DNA可由環形恆溫放大法(LAMP)放大。LAMP法係使用單一管來放大DNA，其中所有反應物皆培養於一單一的樣本管中。LAMP利用具有股置換特性的聚合酶，而不需要使用溫度循環器。對於一相對小的目標DNA序列，LAMP法可運用一引子組(例如：4或6個引子)來靶向一組區域(例如：6或8個區域)。LAMP法可運用2個內引子以及2個外引子、外加2個額外的環引子，環引子係可在LAMP法擴增子的環形結構處結合。這種分析方法設計提升放大反應的敏感性並加速反應時間。舉例而言，Oriero,E.C.等人於“Comparison of two isothermal amplification methods：Thermophilic helicase dependent amplification(tHDA)and loop mediated isothermal amplification(LAMP)for detection of Plasmodium falciparum" International Journal of Infectious Diseases 21(2014)：381”、Notomi,Tsugunori等人於“"Loop-mediated isothermal amplification of DNA"Nucleic acids research 28.12(2000)：e63-e63”均描述LAMP法。

根據本發明之一實施例，DNA可藉由股置換擴增法(SDA)放大。SDA法係一非序列專一性的DNA擴增法。就SDA法而言，隨機的六聚物引子係結合至一DNA樣本股，並由一高精準DNA聚合酶執行DNA的合成。舉例而言，“美國專利第5,455,166號”、“美國專利第5,712,124號”、Asiello,Peter J.與Antje J.Baeumner於“Miniaturized isothermal nucleic acid amplification,a review" Lab on a Chip 11.8(2011)：1420-1430”、Walker G.Terrance等人於“Miniaturized isothermal nucleic acid amplification,a review" Lab on a Chip 11.8(2011)：1420-1430；以及Walker,G.Terrance等人於"Strand displacement amplification-an isothermal,in vitro DNA amplification technique" Nucleic Acids Research 20.7(1992)：1691-1696”皆描述SDS法。

根據本發明之一實施例，DNA可藉由切口酶放大反應(NEAR)來擴增。NEAR法包括利用一股置換DNA聚合酶以從由切口酶形成的切口合成DNA。NEAR法可相對快速地從一目標序列產生許多短的核酸。交替循環之切口與DNA擴增可在約5至10分鐘內達到十億倍的放大。舉例而言，Ménová等人於“Scope and Limitations of the Nicking Enzyme Amplification Reaction for the Synthesis of Base-Modified Oligonucleotides and Primers for PCR" Bioconjugate Chemistry 24.6(2013)：1081-1093”中描述NEAR法。

根據本發明之一實施例，DNA可藉由重組酶聚合酶擴增法(RPA)放大。RPA法係一單管放大DNA的技術。RPA法可包括三種酵素：一重組酶、一單股DNA結合蛋白質(single-granded DNA-binding protein,SSB)、以及股置換聚合酶。該重組酶在雙鏈體DNA中可將寡核苷酸引子與相應的序列配對。該單股DNA結合蛋白質可與置換股的DNA結合並且可防止引子的置換。該股置換聚合酶可於該引子結合至一目標DNA之點開始DNA合成。可加入一反轉錄酶至一RPA反應以檢測RNA與DNA，而不需要產生cDNA。舉例而言，Lutz等人於“Microfluidic lab-ona-foil for nucleic acid analysis based on isothermal recombinase polymerase amplification(RPA)" Lab on a Chip 10.7(2010)：887-893”中描述RPA法。

根據本發明之一實施例，DNA可藉由耐熱解鏈酶擴增法(tHDA)放大。tHDA法可選擇性地放大一目標DNA序列(例如：一相對短的DNA序列約70bp至120bp)，該目標DNA序列係以2個引子定義。tHDA法運用一解鏈酶以分離DNA而非使用加熱，並產生單股DNA樣本供引子結合與DNA聚合酶擴增。舉例而言，Oriero,E.C.等人於“Comparison of two isothermal amplification methods：Thermophilic helicase dependent amplification(tHDA)and loop mediated isothermal amplification(LAMP)for detection of Plasmodium falciparum" International Journal of Infectious Diseases 21(2014)：381”、Li,Ying等人於“Detection and Species Identification of Malaria Parasites by Isothermal tHDA Amplification Directly from Human Blood without Sample Preparation" The Journal of Molecular Diagnostics 15.5(2013)：634-641”均描述tHDA法。

次世代定序法

根據本發明之實施例，DNA可藉由次世代定序法(NGS)技術來定序及/或檢測。NGS法係高通量定序技術之一群組(例如：大量同步定序(massively parallel sequencing))。NGS法可將相對大的核酸序列或整個基因組定序。NGS法中，許多相對小的核酸序列可同時由一DNA樣本定序且可形成一小片段(例如：讀取片段)庫。可接著重組該讀取片段以識別一大核酸序列或一完整核酸序列。舉例而言，可同步定序多達500,000的序列。舉例而言，可使用MALBAC法與傳統PCR反應於NGS技術。舉例而言，Mardis於“The impact of next-generation sequencing technology on genetics" Trends in genetics 24.3(2008)：133-141”、Metzker於“Sequencing technologies-the next generation" Nature Reviews Genetics 11.1(2009)： 31-46”均描述次世代定序法。

大量同步標誌定序法(Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)係為NGS技術之一示例。MPSS法藉由產生17至20鹼基對的標誌序列來識別mRNA轉錄體。可利用MPSS法同時識別及量化一樣本中的mRNA轉錄體。舉例而言，Brenner,Sydney等人於“Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing(MPSS)on microbead arrays" Nature biotechnology 18.6(2000)：630-634”中描述MPSS法。

波隆尼定序法係NGS技術之一示例，其將數百萬個DNA固定並可同步的讀取。波隆尼定序法極準確，錯誤率低。波隆尼定序法係一多工定序技術，其可在一單一反應/循環、或分析中測量多個分析物。舉例而言，Shendure等人於“Advanced sequencing technologies：methods and goals" Nature Reviews Genetics 5.5(2004)：335-344；and Shendure et al."Next-generation DNA sequencing" Nature biotechnol 26.10(2008)：1135-1145”中描述波隆尼定序法。

焦磷酸定序法(Pyrosequencing)係NGS技術之一示例，其使用螢光酵素以檢測加入一新生DNA之各核苷酸。焦磷酸定序法可放大存在於一油性溶液中之水滴的DNA。一水滴可包括例如一與附著於一引子包覆粒子的DNA樣本。舉例而言，Vera,J.Cristobal等人於“Rapid transcriptome characterization for a nonmodel organism using 454 pyrosequencing" Molecular ecology 17.7(2008)：1636-1647；and Ronaghi "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing" Genome research 11.1(2001)：3-11”中描述焦磷酸定序法。

Illumina定序法係NGS技術之一示例，其將DNA分子與引子附著至一玻片。該DNA分子可藉由一聚合酶放大而可形成DNA群落(例如：DNA群)。舉例而言，於Hanlee之“Next-generation DNA sequencing”Nature biotechnology 26.10(2008)：1135-1145以及於Meyer與Kircher之“Illumina sequencing library preparation for highly multiplexed target capture and sequencing" Cold Spring Harbor Protocols 2010.6(2010)：pdb-prot5448”中所描述的Illumina定序法。

寡核苷酸接合與檢測定序法(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection，SOLiD Sequenceing)係NGS技術之一示例，其可同時產生數千個小的序列讀取片段(例如：DNA片段)。該序列讀取片段可固定於一固體支撐物以定序。通常SOLiD定序係關於藉由接合來定序的方法。舉例而言，Hanlee Ji於“Next-generation DNA sequencing" Nature biotechnology 26.10(2008)：1135-1145”、以及Meyer,Matthia與Ansorge,Wilhelm J.於“Next-generation DNA sequencing techniques" New biotechnology 25.4(2009)：195-203”均描述寡核苷酸接合與檢測序法。

離子半導體定序法(Ion Torrent Semiconductor Sequencing)係NGS技術之一示例，其在DNA聚合反應中檢測所釋放的氫離子。離子半導體定序法係一合成定序(sequence-by-synthesis)法。可加入一去氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphate，dNTP)至一含有樣本DNA之微孔中。當該去氧核苷酸三磷酸係與一樣本核苷酸互補時，該去氧核苷酸三磷酸可結合至互補的DNA序列，導至一氫離子的釋放。舉例而言，Quail,Maichael A.等人於“A tale of three next generation sequencing platforms：comparison of Ion Torrent,Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers" BMC genomics 13.1(2012)：341”中描述離子半導體定序法。

DNA奈米球定序法係NGS技術之一示例，其使用滾環式複製放大基因體DNA之小片段以形成DNA奈米球。放大的DNA序列可接著依指示使用螢光探結合。舉例而言，Ansorge,Wilhelm J於“Next-generation DNA sequencing techniques" New biotechnology 25.4(2009)：195-203”、Drmanac等人於“Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays" Science 327.5961(2010)：78-81”均描述DNA奈米球定序法。

Heliscope單分子定序法(Heliscope Single Molecule Sequencing)係NGS技術之一示例，其不需要結合反應或PCR放大反應。Heliscope單分子定序法係一直接定序的方法，DNA可為切斷的，並具有一多腺核苷酸尾(poly-A-tail)而雜交至一流體細胞的表面。數量大的分子(例如：數十億個分子)可接著同時定序。舉例而言，Pushkarev等人於 “Single-molecule sequencing of an individual human genome" Nature biotechnology 27.9(2009)：847-850”中描述Heliscope單分子定序法。

單分子即時定序法(Single Molecule Real Time(SMRT)Sequencing)係NGS技術之一示例，其DNA可合成於零模波導(zero-mode waveguides,ZMW)的相對小孔狀容器。未修飾之聚合酶可附著於ZMW的底部。該未修飾的聚合酶可用於定序該DNA以及定序可在溶液中自由流動之螢光標記核苷酸。當該核苷酸結合至該DNA股時，螢光標記可由該核苷酸釋放。SMRT定序法係一種合成定序法的示例。舉例而言，Flusberg等人於“Direct detection of DNA methylation during single-molecule,real-time sequencing" Nature methods 7.6(2010)：461-465”中描述單分子即時定序法。

在一實施例中，本發明提供一種用於現場檢測與驗證由一或多個標誌謤記之物品的系統，該標誌係選自於由一DNA分子，一蛋白質、一胜肽、一光學報導劑、一化學標誌、以及一數位碼所組成的群組。該系統可包括一適合收集從一有興趣標記物所得樣本的容器；一或多個分析分子，各分析分子適合於使用一關於該標誌所訂定之特定檢測方法、提供檢測數據來檢測至少一個標誌的存在；以及一分析器，用於接收從該一或多個分析分子所得之檢測數據、以及判定樣本中存在或不存在該一或多個標誌；其中，該分析器被配置以藉由確認該樣本中該一或多個標誌的存在來判斷該被標記物的真實性。

標誌檢測

根據本發明實施例，有用的檢測系統的示例包括：PCR型DNA檢測(數位PCR、焦磷酸定序法、DNAe)、電泳分析(毛細管或膠體電泳微流體)、利用蛋白質孔洞進行DNA定序的奈米裝置、以及微陣列系統。本發明實施例包括利用手持、多功測量、或不含儀器之USB裝置以檢測DNA與RNA。可依該產品及使用者需求訂製樣本收集裝置、晶片大小、分析與數據呈現方式。本發明之實施例可由在利用標準CMOS流程之世界最大工廠處之晶片系統上來執行，該標準CMOS流程係提供動力予如筆記型電腦及智慧型手機裝置。此CMOS技術在降低成本下提供製造具有數十至數百萬感測器陣列的晶片，故，這些晶片實質上供實驗於一小型、單獨的晶片執行，並可用於解決廣大的應用。

Ermantraut等人於US2008/0207461 A1中揭露用於執行並分析微陣列檢測的裝置並揭露用於在一微滴定皿中量化或質化檢測探針與目標分子間特定交互作用之微陣列實驗同時執行的裝置、以及製造該等裝置的方法。此裝置可同時複製核酸並表現核酸的特徵，如Ehricht等人於US 7,888,074 B2所述。檢測螢光訊號之裝置的建構(如Ermantraut等人於US2004/0196455 A1所述)、以及檢測分析物之分析裝置與方法(如Ermantraut等人於US2011/0071038 A1所述)可進一步結合至保存及檢測該物質庫的裝置(如Ulrich等人於US2006/0147996 A1所述)。此微陣列方法及裝置適合用於本發明檢測與驗證核酸與其他化學標誌的方以及系統。

在實施例中，該微陣列裝置可置於一反應瓶中，該反應瓶被配置以接收一提供的樣本。該微陣列裝置可包括一客製化探針微陣列，其被配置以自動檢測在一所提供的樣本中一或多個目標核酸序列的存在。客製化探針微陣列可設計為檢測作為該區別性標誌的一或多個核酸序列之獨特組合的存在，該區別性標誌係對於一特定有興趣物是獨特的。客製化探針微陣列可包括點綴於該微陣列上一些位置的寡核苷酸探針。該寡核苷酸探針可各自與一特定區別性標誌的寡核苷酸序列相互補。該寡核苷酸探針可與互補的目標寡核苷酸序列雜交以檢測在所提供樣本中目標酸序列的存在。該客製化的探針微陣列可包括任何合適的微陣列而沒有限制。該客製化的探針微陣列可具有任何合適的尺寸且可依需要包括一或多個控制單元或比較單元。

包括該微陣列裝置的反應瓶可被配置以記錄及/或傳輸檢測數據至一整合的或外部的裝置以產生一區別性標誌檢測報告。舉例而言，該反應瓶可自動判定一特定區別性標誌之各核酸序列是否存在並傳送該數據至一整合的或外部的裝置以產生一報告，該報告係表示該所提供之樣本是否包括該區別性標誌。若檢測到一區別性標誌的存在，可產生一報告顯示該所提供的樣本並非來自於一非假冒的物品(例如：一偽造品)。檢測胜肽或蛋白質的微陣列亦可設計並執行，該微陣列並不受限制。

在一實施例中，該微陣列裝置可被配置以提供一訊號，該訊號係為檢測到所欲檢測的DNA存在於陣列之各孔或基質中。產生正檢測訊號的孔可被安排成對於一特定DNA標誌為獨特的形態。該形態可為隨機的或可為特定的設計，例如：徽標圖案或商標、或拼出一訊息。在一實施例中，可光學地辨別該形態並且可傳輸該數據至一伺服器或儲存於本地。Van de Rijke等人於“Up-converting phosphor reporters for nucleic acid microarrays" Nature biotechnology 19.3(2001)：273-276”中描述核酸微陣例之上轉換磷光體報導劑。

根據本發明之一實施例，一有興趣物品是否被標記的判斷可由一量化的恆溫系統執行，該量化的恆溫系統係可檢測一物品上核酸標示體的存在。舉例而言，一物品是否被標記之判斷可由市面上可購得之Alere-i^TM(i-NAT)裝置(由Alere Technologies,Jena,Germany購得)來完成。

根據本發明之一實施例，該有興趣物品是否被該區別性標誌所標記之判斷可由一現場檢測儀器執行，該現場檢測儀器運用RT-PCR並具有樣本進-分析結果出的能力。舉例而言，一Alere^TMq定點照護檢驗平台可應用於檢測一樣本中該區別性標誌的存在。該Alere^TMq定點照護檢驗平台係市面上可購得(Alere Technologies,Jena,Germany)。該Alere^TMq定點照護檢驗平台係為一完全自動的核酸檢測平台，其可自動化執行核酸萃取、分離、放大、以及檢測。數據分析、數據報導、以及數據儲存皆可自動化地完成。

根據一實施例，可運用一橫向流動條測試來判定一標誌的存在。橫向流動條測試係設計以檢測一樣本中一目標分析物(例如：核酸)的存在與否。橫向流動測試亦可視為橫向流動免疫層析分析。舉例而言，Corstjens等人於“Use of up-converting phosphor reporters in lateral-flow assays to detect specific nucleic acid sequences：a rapid,sensitive DNA test to identify human papillomavirus type 16 infection" Clinical chemistry 47.10(2001)：1885-1893”、Posthuma-Trumpie等人於“Lateral flow(immuno)assay：its strengths,weaknesses,opportunities and threats.A literature survey" Analytical and bioanalytical chemistry 393.2(2009)：569-582”均描述橫向流動測試法。

根據本發明之一實施例，可運用南方墨點法以判定一標誌的存在。南方墨點法係用於檢測一生物分子(例如：蛋白質或DNA)之存在。一包括該有興趣生物分子的混合物，可置於一膜上而不需將該生物分子從該混合物中分離，且該生物分子可用以一點的形式附著於該膜上。接著可用一核苷酸探針處理該有興趣的生物分子以判定該生物分子的存在與否。舉例而言，Dubeau等人於“Southern blot analysis of DNA extracted from formalin-fixed pathology specimens" Cancer research 46.6(1986)：2964-2969”、Englerblum等人於“Reduction of Background Problems in Nonradioactive Northern and Southern Blot Analyses Enables Higher Sensitivity Than ³²P-Based Hybridizations" Analytical biochemistry 210.2(1993)：235-244”均描述南方墨點法。

在本發明檢測方法之一實施例中，pH相關半導體ISFET技術係用於DNA檢測，其提供多種應用之非光學且可擴展的解決方案，例如：從單核苷酸多型性基因分型至全基因組定序之快速樣本至結果(sample-to-answer)解決方案。因為離子係在一生物反應流程中釋放，故，該離子的釋放可即時地追蹤。

在本發明方法與系統之一實施例中，一矽晶體管係用於檢測DNA以及RNA。舉例而言，在DNA合成的過程中，當互補的核苷酸結合至一擴增中的股時，會釋放氫離子。這可被檢測作為一電子訊號。相反地，若沒有配對，則不會釋放氫離子亦不會檢測到訊號。這個原理可應用於所有DNA以及RNA的分析而不需要螢光染色劑或標記或精準的光學儀器。該pH相關半導體(ISFET)技術使用未修飾的反應物與未修飾的微晶片技術(CMOS)，其提供這些系統為具有靈活、可拋棄式優點之以晶片為基礎的平台，且快速、簡單、又可擴展。在一實施例中，可整合感測器、電路、以及活性物質於一晶片，例如：一單一CMOS晶片(互補式金屬氧化物半導體或非易變單純輸入/輸出系統記憶體)，以獲得一多功能的晶片。

在實施例中，所收集樣本中該核酸標示體的數量或濃度係可與置於產品內該核酸標示體的起始量相比較，以檢測由偽造者用次等品稀釋該產品的方式所引發的假冒行為。通常而言，量化檢測的方法包含一內部或外部控制以評估從一樣本/分析至下一樣本/分析之檢測的效率。該檢測的效率可為多個因素影響，例如：探針雜交情形、產品中可能干擾檢測的分子或物質、及/或引子正確性、酵素品質、使用PCR檢測方法之溫度變化。經由控制檢測方法之可變的條件可標準化取得該樣本中一準確核酸標籤的最終濃度。

在一實施例中，本發明提供一種現場檢測以及驗證DNA標誌的方法，該方法包括從一有興趣物品提供一樣本；利用一可形成讓該DNA通過鹼基與鹼基之間的孔之膜孔蛋白(pore protein)來分析該樣本，以檢測一DNA標誌的存在，該DNA標誌編碼有對該物品為獨特的資訊，且其中該DNA序列係由一施於該膜孔蛋白之孔的電場特性的改變來檢測，該電場特性改變係由DNA通過該膜孔蛋白的孔而造成；以及紀錄/或輸出該序列數據至一數據儲存裝置，從而藉由判斷該DNA標誌存在於該分析樣本中來驗證該物品的真實性。DNA可逐個鹼基通過該孔，所以可檢測施於各孔電場特性的改變。

在一實施例中，本發明提供一種現場檢測及驗證DNA標誌的方法，包括：從一有興趣物品提供一樣本；利用一序列專一性DNA結合體來分析該樣本，以檢測一DNA標誌的存在，該DNA標誌編碼有對該物品為獨特的資訊；以及藉由判斷該DNA標誌存在於該分析樣本中來驗證該物品的真實性。該序列專一性DNA結合體可為任何合適的序列專一性DNA結合適合體，例如：一序列專一性DNA結合蛋白質、一膜孔蛋白、或一抗體。

由利用上述方法的系統所產生的結果數據可加密及/或以密碼保護。由利用上述方法的系統所產生的結果數據的分析可在一電腦網路系統中分析，如Grinkemeyer與Dailey於US 2011/001833 A1所揭露者。

在一實施例中，本發明提供一種現場檢測及驗證一DNA標誌的方法，該方法包括：從一有興趣物品提供一樣本；利用一DNA定序方法來分析該樣本，以檢測一DNA標誌的存在，該DNA標誌編碼有對該物品為獨特的資訊，其中該DNA定序方法係利用一可攜式DNA定序裝置來執行；以及藉由判斷該DNA標誌存在於該分析樣本中，來驗證該物品的真實性。該DNA定序法可為任何合適的方法，例如：Maxam & Gilbert化學定序法、雙脫氧定序法(dideoxy sequencing)、Sanger定序法、核酸雜交、奈米孔定序法、焦磷酸定序法、或次世代定序法；該次世代定序法包括：離子依賴性檢測或pH感測法。在實施例中，該DNA定序係利用微陣列雜交來執行。在一實施例中，該DNA定序係利用墨點雜交法來執行。

一PCR序列檢測系統可包括一分析裝置，其被配置以加密及/或以密碼保護來抵抗非授權的使用。該分析裝置可透過一無線聯結或一固線聯結與一伺服器連結。該伺服器可為一獨立的伺服器或一網路伺服器；該網路伺服器可為任何合適的網路伺服器，例如：一固線式伺服器或一雲端伺服器。在一實施例中，用於驗證真實性的數據係在該獨立的伺服器或該網路伺服器中處理以及儲存。在一實施例中，該驗證真實性步驟的數據係在該獨立的伺服器或該網路伺服器中處理以及儲存。在實施例中，該分析裝置係為模組化。

Tomazou等人(US 7,888,015 B2)基於引子擴增期中質子釋放的檢測，運用QPCR固態感應與一包含離子敏感場效電晶體(ISFET)的pH感測器執行核酸放大反應的即時檢測/量化。Tomazou等人(US 7,686,929 B2)利用此ISFET形式的感測裝置產生一電子輸出訊號作為離子帶電荷或鄰近該電晶體表面之局部波動的回應，並利用一種從該ISFET檢測該電子輸出訊號的方法，該離子帶電荷局部波動表示一化學反應過程中發生的事件。兩者之結合係總結於Tomazou等人US 2010/0159461 A1中所揭露之一種檢測化學反應的裝置、核酸序列的雜交、以及基因變異，係使用不含標記之核酸檢測以及解釋。該些雜交、核酸序列定序、或由核酸標誌序列衍生PCR擴增子的程序與系統可被配置以用於本發明檢測及驗證核酸與其他化學標誌的方法與系統。Nazarenko等人於“A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer" Nucleic Acids Research 25.12(1997)：2516-2521”中所描述之一種PCR放大DNA的直接檢測方法。

在一實施例中，DNA可由螢光原位雜交法(Fluorescent in situ Hybridization，FISH)結合至一螢光探針。就FISH法而言，一螢光探針可結合至一與該螢光探針互補之固定核酸序列的部分。一目標核酸序列可結合在該螢光探針之一所欲結合的位置，而可使用螢光顯微鏡觀察。舉例而言， Bianchessi等人於“Point-of-care systems for rapid DNA quantification in oncology" Tumori 94(2)(2008 Mar-Apr)：216-25”中所描述之螢光原位雜交法；Agrawal等人於“Site-specific functionalization of oligodeoxy-nucleotides for non-radioactive labelling" U.S.Patent 5,321,131”中所描述之一種寡核苷酸位置專一性的功能化。

在一實施例中，DNA的檢測可利用一BESt^TM匣(由Biohelix Corporation,Beverly,M.A.購得)來執行。舉例而言，Tang等人於“Nucleic acid assay system for tier II laboratories and moderately complex clinics to detect HIV in low-resource settings”Journal of Infectious Disease 201.Supplement 1(2010)：S46-S51”中所描述之使用BESt^TM匣之檢測。

在一實施例中，本發明提供一種現場檢測的方法，其中該區別性標誌及依據該區別性標誌所製定的特定檢測方法所形成之組合係選自於由下列標誌與檢測系統之組合：一核酸標誌與一PCR檢測系統、雜交檢測系統、或一核酸定序系統；一蛋白質標誌與一HPLC層析檢測系統或ELISA檢測系統；一光學報導劑與.光檢測系統；以及一化學標誌與一層析檢測系統。在一實施例中，檢測裝置與分析裝置之一係模組化。在一實施例中，檢測裝置與分析裝置均各模組化。

在一實施例中，本發明提供一種DNA檢測與驗證的系統，該系統包括：一可攜式檢測器，被配置以檢測一DNA標誌的存在，該DNA標誌編碼有對該有興趣物品為獨特的資訊，係從該物品之一樣本取得；以及一分析裝置，操作性地聯結至該可攜式檢測器，並被配置以藉由判斷該DNA是否存在於經該可攜式檢測器分析之樣本中來驗證該物品的真實性。本發明之檢測DNA的可攜式系統是有用的，例如應用於：防偽品牌保護、預防偷竊/犯罪、來源判斷、鑑定、追蹤與追溯、以及基因分型。

在一實施例中，本發明提供一種現場檢測與驗證DNA標誌的方法，其中該方法包括：從一有興趣物品提供一樣本：利用一聚合酶連鎖反應方法來分析該樣本，以檢測一DNA標誌的存在，該DNA標誌編碼有對該物品為獨特的資訊，且其中該PCR方法可利用一可攜式溫度循環裝置來執行；以及藉由判斷該DNA標誌存在於該分析樣本中來驗證該物品的真實性，且其中該真實性的驗證係利用一操作性地聯結至該PCR裝置的分析裝置來執行。該物品真實性的驗證可使用任何合適的方法來執行。在一實施例中，該DNA標誌的檢測與驗證係藉由判斷該DNA標誌是否存在於該樣本中來執行，該樣本係由一可攜式檢測器分析其擴增子的存在，例如：由一PCR方法放大之DNA標誌序列的部分放大的DNA複本。該PCR方法可為任何合適的PCR方法，例如：即時PCR、數位PCR、或qPCR。擴增子可由任何習知方法之不同的標準來決定與檢測，包括電泳法，如：膠體電泳或毛細管電泳。

蛋白質、抗體、及醣類檢測

根據本發明之實施例，除核酸標誌外，可檢測包含一或多個蛋白質及/或一或多個碳水化合物之標示體。

包含一或多個碳水化合物的標示體可由碳水化合物微陣列檢測。Feizi等人於“Carbohydrate microarrays-a new set of technologies at the frontiers of glycomics" Current opinion in structural biology 13.5(2003)：637-645”中更詳細地描述了一種碳水化合物微陣列。

包含一或多個蛋白質的標示體可由酵素免疫分析法(ELISA)檢測。ELISA係一相對快速、高通量之用於選擇性檢測目標抗原的量化免疫分析。ELISA基本的原則包括於一可測量基質上抗體相關的抓取與抗原的檢測。舉例而言，Jia等人於“Nano-ELISA for highly sensitive protein detection "Biosensors and Bioelectronics 24.9(2009)：2836-2841”中更詳細地描述了蛋白質的ELISA檢測。

根據一實施例，該有興趣化合物是否由包括一抗體或一蛋白質的區別性標誌標記的判斷可以利用具有樣本進-結果出能力的現場檢測裝置來執行。舉例而言，一Alere Determine^TM裝置(例如：Alere Determine^TM HIV-1/2 Ag/Ab Combo)可用於檢測一樣本中包括一抗體或一蛋白質的區別性標誌的存在。Alere DetermineTM裝置係市面上可購得之裝置。該Alere Determine^TMHIV-1/2 Ag/Ab Combo可檢測抗HIV抗體與HIV蛋白質並可由Alere Technologies,Jena,Germany購得。

Alere Determine^TMHIV-1/2 Ag/Ab Combo係用於檢測特定抗體之一定點照護快速試驗系統。該Alere Determine^TM平台可篩選並幫助在數分鐘內完成HIV、結核病、B型肝炎、以及梅毒的檢測。

真實性驗證

在一實施例中，本發明提供一種檢測與驗證DNA的檢測系統，包括：一可攜式檢測器，被配置以檢測一DNA標誌的存在，該DNA標誌係從該物品之一樣本所得且編碼有對有興趣物品為獨特的資訊；以及一分析裝置，其係可為任何合適的分析裝置，例如：一操作性地聯結至該可攜式檢測器並被配置以藉由判斷該DNA標誌是否存在於經該可攜式檢測器分析的樣本中來驗證該物品真實性的獨立裝置，例如：一桌上型電腦、一筆記型電腦、一智慧型手機、或一平板電腦。

在一實施例中，該分析裝置被配置以藉由判斷該DNA標誌是否存在於經該可攜式檢測器分析的樣本中以及比較與儲存於一資料庫中並可由該分析裝置存取之已知序列來驗證該物品真實性。在實施例中，本發明之方法的真實性驗證步驟可包括比較經分析之該樣本中的DNA標誌序列與儲存於一資料庫並可由該分析裝置存取的已知序列。

在一實施例中，該分析裝置被配置以藉由判斷該DNA標誌是否存在於由該可攜式檢測器分析之樣本中並藉由分辨一微陣列圖案以決定該DNA標誌係存在的，來驗證該物品的真實性。另一方面，該分析裝置被配置以藉由判斷該DNA標誌分子是否存在於由該可攜式檢測器分析之樣本中並藉由檢測由一互補核酸序列所檢測之放大或雜交的序列的存在，來驗證該物品的直實性。

在一實施例中，該有興趣物真實性的驗證係利用一操作性地聯結該可攜式DNA定序裝置的分析裝置來執行。該分析裝置可為任何合適的分析裝置，例如：一桌上型電腦、一筆記型電腦、一智慧型手機、一平板電腦、或其類似物。在實施例中，該分析裝置係為加密的或是具有密碼保護以抵抗未授權的使用。

在一實施例中，該真實性的驗證包括比較在樣本中所分析之該DNA標誌與儲存於一資料庫並可由該分析裝置存取之已知序列。該DNA序列可儲存於本地的一獨立伺服器中或一操作性地經由有線或無線聯結於該分析裝置的網路伺服器中。在一實施例中，該分析裝置可模組化。該真實性驗證的結果可由一本地伺服器或一網路伺服器處理以及儲存。該DNA標誌的序列可為任何合適的獨特序列。在一實施例中，該DNA標誌的序列為一具有從約20個至約1000個鹼基的序列。

該DNA標誌之習知的序列可為用於專一識別物品之任何獨特的序列，例如：一具有約20至約1000鹼基的序列。由該DNA標誌標記的物品亦可由一可檢測報導劑標記。在一實施例中，該檢測報導劑與該DNA標誌係在該物品上相同的位置，故，該檢測報導劑可作為一樣本識別物以顯示該DNA標誌的位置。另一方面，該檢測報導劑與該DNA標誌可互相關聯，使得獲得該檢測報導劑之一樣本的方法可作為取得該DNA標誌之樣本以進行驗證與確認的一指南。在一實施例中，本方法之檢測報導劑係選自於一化學報導劑、一數位報導劑、或一胜肽報導劑。在一實施例中，該檢測報導劑係一數位報導劑且為一條碼。

該序列檢測系統可包括一加密及/或密碼保護的分析裝置以抵抗未授權之使用。該分析裝置可透過一無線聯結或一固線聯結與一伺服器連結。該伺服器可為一獨立的伺服器或一網路伺服器。在一實施例中，該分析裝置可模組化。在一實施例中，該真實性驗證的數據係由該獨立的伺服器或該網路伺服器處理以及儲存。

在一實施例中，欲由本發明之系統所驗證之標記的物品係選自一微晶片、一標誌、一識別證、一徽標圖案、一印刷品、一紡織品、或一商品。在一實施例中，該系統所欲驗證之物品係選自於由現金、一貨幣紙幣、一硬幣、一寶石、一珠寶、一樂器、一護照、一古董、一傢俱、藝術品、財產契約、一股票證明、一債券證明或所組成之群組。本發明之檢測系統可被配置以經由一顯示器直接提供驗證數據予使用者或一安全的地方或總部以提供與一消費者之數據溝通、或儲存於一資料庫、或印出一報告。該驗證數據可讀取的方式可為一顯示或信號、或警示。

該現場檢測及驗證DNA方法之分析裝置可為任何合適的分析裝置，例如：一桌上型電腦、一筆記型電腦、一智慧型手機、或一平板電腦等。該些裝置可操作性地被配置作為一系統以在一網路中溝通。該網路可為任何合適的網路，例如但不限為一個或多個以RF、Wi-Fi、藍牙、或一固線式的聯結。

現場檢測儀器

該現場檢測儀器可包括一具有樣本進-結合出分析能力的微系統。該微系統可為一完備的單元，其可執行所有必須分析流程而不需要其他額外的實驗室器材。該微系統可為自動化且僅需要加入樣本至該微系統以及開啟該微系統以執行分析。該現場檢測儀器可為可攜式的或固定於單一地點。樣本進-結果出分析係指該微系統可在傳送該樣本至該微系統後執行所有分析步驟並自動化地提供結果的能力。該微系統可被配置以提供最小化必須經由操作者監測或調整的檢測。在一實施例中，該樣本係直接加入或從被配置以與該微系統之一樣本通道連接的一樣本收集裝置加入。接著啟動該微系統，而該現場檢測儀器提供與操作者互動的檢測數據。可儲存及/或輸出檢測數據。就檢測一區別性標誌存在而言，可提供並傳送一可能包括該區別性標誌之樣本至該現場檢測儀器的微系統，該微系統可自動化地判定該樣本中是否存在該區別性標誌。用於現場檢測之示例性的微系統將更詳細地敘述如下。

該現場檢測儀器可與一包含該有興趣物品真實性數據的伺服器溝通。該伺服器可包含儲存有與許多有興趣目標物相關之許多區別性標誌檔案資訊的真實性數據資料庫。真實性數據可為與該區別性標誌相關之一獨特的檔案。舉例而言，該區別性標誌可包括一或多個獨特的核酸序列，而該真實性數據可為該獨特的核酸序列之一數位化複本。Zorab於WO 01/99063中描述包括一驗證資料庫之合適的遠距驗證伺服器的一示例。

微流體樣本製備裝置

Jovanovich等人於US 7,745,207 B2中揭露一種利用適合作為本發明之方法示例性實施例的系統。進一步而言，如Janovich等人所述之奈米流體(US 2012/0115189 A1)以及如Green所述之樣本處理(US 8,110,397 B2)係對於本發明額外的實施例有用。如Green所述之PCR裝置(US 7,170,594 B2)亦可用於本發明之示例性實施例。利用微流體系統以及DNA溶液之分餾或劃分至每滴中含有約一DNA分子以在一量子點中識別多型性之分析方法係如Lo等人於US 2009/0263580 A1中所述。Davies等人則於US 2010/0092973 A1中揭露利用“油中水滴”技術之數位PCR的方法與裝置，可為本發明實施例所實行。利用寡核苷酸序列檢測蓖麻蛋白基因(ricin gene)與蓖麻蛋白毒素之方法係如Czajka於US 2006/0240447所述，並揭露檢測一樣本中此特定DNA的套組。

根據本發明之一實施例，微流體裝置可用於萃取、純化、以及延伸一DNA樣本。舉例而言，Benítez等人於“Microfluidic extraction,stretching and analysis of human chromosomal DNA from single cells" Lab on a Chip 12.22(2012)：4848-4854”中描述一種用於從單一細胞萃取、純化、以及延伸人類DNA的微流體。Zhao等人於“Electrochemical DNA detection using Hoechst dyes in microfluidic chips" Current Applied Physics 12.6(2012)：1493-1496”中描述一種微流體DNA晶片。Aboud於“The development of direct ultra-fast PCR for forensic genotyping using short channel microfluidic systems with enhanced sieving matrices"(January 1,2012),ProQuest ETD Collection for FIU.Paper AAI3541755)”中則描述一種用於鑑識基因定型的直接超快速PCR。

舉例而言，Wu,Jinbo等人於“Extraction,amplification and detection of DNA in microfluidic chip-based assays" Microchimica Acta(2013)：1-21”、Liu等人於“Integrated DNA purification,PCR,sample cleanup,and capillary electrophoresis microchip for forensic human identification" Lab on a Chip 11.6(2011)：1041-1048”、Jovanovich等人於美國專利第7,745,207 B2號以及美國專利申請第2012/0115189 A1號皆描述一般的微流體裝置與特定的微流體毛細管電泳裝置。

根據本發明之一實施例，可提供一或多個樣本，其包一或多個目標核苷酸序列、以及一或多個非目標核苷酸序列(例如：偽裝或誘餌序列)。該目標核苷酸序列可藉由從該偽裝核苷酸分離該目標核苷酸的方式純化。該樣本可清洗通過固定於一系列微流道的基質床。該基質可包括一或多個與該目標核苷酸互補的核苷酸探針，該些核苷酸探針被配置以透過雜交作用抓取該目標核苷酸。該基質可為任何合適的基質。舉例而言，該基質可為具有核苷酸探針結合於其上的一磁珠。該目標核苷酸可與該核苷酸探針結合以形成一核苷酸-探針偶聯物。該基質(例如：磁珠)結合至該目標核苷酸可傳輸至一檢測模組以判斷各目標核苷酸是否存在。該基質(例如：磁珠)結合至該目標核苷酸可傳輸至一擴增裝置或一擴增腔室。舉例而言，放大後的產物可傳輸至一毛細管電泳管柱。可應用根據習知標準毛細管電泳技術的電場來執行核苷酸的分離。可運用一雷射與一光學檢測器系統來檢測該目標核苷酸的存在。毛細管電泳以及DNA檢測技術係如Schwartz,Guttman於“Separation of DNA by capillary electrophoresis.Beckman,1995.”中所述。

整合的微系統

根據本發明之實施例，可藉由一整合的微系統來檢測一核酸標誌。舉例而言，整合的微系統可包括：一微流體晶片、一完全整合的微裝置、或一晶片實驗室(lab on a chip)配置。整合的微系統可在單一個裝置中製備一樣本、發大一目標核酸序列(若需要)、以及檢測一或多個目標核酸序列的存在。所有步驟可由一自主且自動的微系統執行而不需要進行任何實驗室中的人為測試。舉例而言，Wu等人於“Extraction,amplification and detection of DNA in microfluidic chip-based assays" Microchimica Acta(2013)：121”、Liu等人於“Integrated DNA purification,PCR,sample cleanup,and capillary electrophoresis microchip for forensic human identification" Lab on a Chip 11.6(2011)：1041-1048”、Ullrich,Thomas等人於“Competitive Reporter Monitored Amplification(CMA)-Quantification of Molecular Targets by Real Time Monitoring of Competitive Reporter Hybridization" PloS one 7.4(2012)：e35438”皆描述了整合的微系統。

在一實施例中，含有核酸標示體的樣本可由其他樣本成分中分離出來，例如：藉由power-free微晶片中微流體通道系統的毛細管現象，該含有核酸標示體的樣本可藉由結合至一標記且固定的雜交探針而被檢測，該探針與該核酸標示體序列的至少一部分互補。可直接檢測該核酸標示體，或將其放大(例如：透過恆溫放大或PCR)並以層流輔助樹枝狀擴增法(laminar flow assisted dendritic amplification，LFDA)檢測，該LFDA係利用用於結合至固定的雜交探針的標誌之特定的檢測抗體，並以一第二抗體於一樹枝狀串聯反應以及習知免疫分析反應中檢測。舉例而言，可參考Hosokawa等人於“DNA Detection on a Power-free Microchip with Laminar Flow-assisted Dendritic Amplification,Anal.Sci.(2010)26：1053-1057”中所述。

根據本發明之一實施例，一整合的微系統可運用一封入內部的微陣列系統而不需要自動化地螢光標記以及檢測。該整合的微系統可藉由利用PCR或恆溫放大反應來放大從所提供樣本而得的一或多個目標序列、螢光標記一或多個放大後產物，並檢測該螢光標記產物的存在。舉例而言，Liu等人於“Microarray-in-a-tube for detection of multiple viruses" Clinical chemistry 53.2(2007)：188-194”中更詳細地描述了一種微陣列於管中的檢測系統。

根據一實施例，一種現場檢測區別性標誌的裝置包括一現場檢測儀器，該儀器包括一被配置以執行樣本入-結果出的微系統。該現場檢測儀器被配置以分析一樣本以判斷樣本中一區別性標誌的存在。根據一實施例，該現場檢測儀器可被配置以執行任何合適之足以決定該區別性標誌之一個或多個獨特特徵的化學或物理特徵描述方法。

根據一實施例，該樣本收集單元可被配置以與該現場檢測裝置直接配對。

根據一實施例，該整合的微系統可運用一螢光背景位移技術。可固定寡核苷酸抓取探針陣例可設置於一含有反應混合物的反應腔室。亦可提供一包含螢光標記報導劑寡核苷酸探針的溶液於該反應腔室中，該螢光標記報導劑寡核苷酸探針係與該固定核苷酸探針互補。與該報導劑核苷酸探針互補之在該腔室中所產生的擴增子可與該抓取探針競爭，用於與該報導劑核苷酸探針結合。也就是說，該報導探針可各自與一特定目標核苷酸序列互補。因此，隨著一特定擴增子(例如：目標核苷酸序列)數目的增加，所檢測到相應固定核苷酸抓取探針的螢光訊號會下降，因為較少的報導核苷酸探針結合至相應的抓取探針。如此可同步地進行包括該核苷酸序列之目標核酸序列樣本質化與量化的檢測。可在任何時間點取得該抓取探針的光學圖像，包括在加入一樣本至該反應混合物之前的基準線時。因為該報導探針與該目標核酸序列之間的雜交專一性，可避免樣本中非目標核酸序列(例如：偽裝序列)與該報導探針的結合。該抓取探針亦可被配置以直接與該目標核酸序列以及該抓取探針結合。可排除該具有未結合報導探針的反應混合物，從而只有檢測結合的報導探針(結合至該抓取探針)。可透過任何合適的排除機制將該反應混合物排除。舉例而言，Ullrich等人於“Competitive Reporter Monitored Amplification(CMA)-Quantification of Molecular Targets by Real Time Monitoring of Competitive Reporter Hybridization" PloS one 7.4(2012)：e35438”中描述了機械式螢光背景排除技術。

以下將更詳細地描述示例性的整合微系統。

資訊DNA編碼

本領域中已習知核酸序列之龐大的編碼能力。在本發明之實施例中，用於識別一物品的核酸標誌以及用於編碼被標記物品之訊息內容的核酸標示體可在一陣列中檢測。該陣列可為任何合適的陣例，例如：一包含抓取DNA點的微陣列，各點包括結合的DNA分子，該些DNA分子包括一與核酸標誌或可能添加於該物品的標籤、標牌或包裝的核酸標示體互補之獨特序列。該陣列可適合於核酸標誌、核酸標示體、或所衍生擴增子進行雜交反應。該雜交陣列可為任何合適的型式，例如一板、一微滴定孔陣列、一具有點的基質、群落、或一微陣列。

該雜交陣列可具有合適的尺寸及/或與核酸標誌、核酸標示體互補DNA之點任何的排列。舉例而言，該陣列可包括一1,000 x 1,000的網格點。在其他實施例中，該陣列可排列為一30,000 x 30,000或更多的網格，使單一陣列上可包括十億或更多的點。根據實施例並詳述如下，可運用樣本點的安排提供一有興趣物品的真實性數據。

在一實施例中，複數個“單株群落”寡核苷酸可附著於一固體表面以形成一客製化的探針陣列，例如：各點或“單株群落”包括多個與一核酸標誌或一核酸標示體互補的DNA序列的複本。該單株群落可為由PCR或恆溫放大於一固體表面的次微米尺寸群落，例如：一次世代定序微流體晶片之表面。該固體表面可具有任何尺寸且該平面上單株群落的位置可任意安排。舉例而言，該單株群落可安排為一1,000 x 1,000的群落網格。該固體表面可為任何合適的表面，例如一具有聚丙烯醯胺膠塗層的顯微鏡玻片的表面。Ma等人於“Isothermal amplification method for next-generation sequencing," Proc.Natl Acad Sci 110.35(2013)：14320-14323”描述了產生DNA樣本之固定的單株群落的一示例。

根據進一步的實施例，該客製化的探針陣列可包括一組隨機排列的寡核苷酸雜交探針，該探針與一或多個核酸標誌序列或核酸標示體寡核苷酸序列互補。可將複數個偽裝寡核苷酸探針(例如：誘餌探針)設置於該客製化的探針陣例上一或多個位置，該位置係未被寡核苷酸雜交探針附著的，以提供非專一性結合以降低任何背景雜訊。該偽裝寡核苷酸較佳為不與任何目標核酸序列互補。該客製化探針陣列可包括任何數目的不與該核酸標誌或該酸標示體寡核苷酸序列互補的寡核苷酸序列。舉例而言，該偽裝探針可包括1,000至1,000,000或更多的不同核酸序列，該核酸序列不與任何目標核酸標誌或核酸標示體寡核苷酸序列雜交。該核酸標誌可與固定寡核苷酸雜交探針之互補序列的點雜交，以產生一獨特的“指紋”。該獨特的指紋係對應於在一特定陣列或晶片上寡核苷酸雜交探針的特定物理排列。因此，該客製化探針陣列可以至少兩種方式提供有興趣之物品一正向的識別：其一方式是藉由正向地識別一核酸標誌寡核苷酸序列或一核酸標示體的存在；其二方式是藉由正向地識別該獨特指紋的存在，其中正向地識別該核酸標誌寡核苷酸序列或該核酸標示體的存在並不需要了解與該獨特指紋相關的該客製化探針陣列的物理排列。

根據一實施例，結合的寡核苷酸雜交探針非隨機地排列，而是形成一可辨別的符號或圖案。該寡核苷酸雜交探針可置於該陣列上所欲放置的位置以形成一客製化的指紋。該客製化指紋可包括任何數目的寡核苷酸雜交探針，其係以任何位置的組合置於該客製化探針陣列。舉例而言，該客製化探針陣列的探針可排列為一網格，而該寡核苷酸探針的位置可在該陣列或網格中特定的位置排列為一“加號”或一星形。在該客製化探針陣列上未附著有對有興趣之物具有特定寡核苷酸雜交探針的探針的位置可附著其他寡核苷酸雜交探針，使該陣列可用於檢測多種不同的核酸標誌或核酸標示體。另一方面，在該客製化探針陣列上未附著有該寡核苷酸雜交探針的探針的位置可附著偽裝探針或其他DNA序列。

該偽裝探針係可為任何數目的寡核苷酸序列。舉例而言，該偽裝探針可包括1,000個不同隨機安排的核酸序列，其較佳為不與任何目標寡核苷酸序列雜交。在一實施例，該客製化探針陣列可包括對於有興趣物具有特定寡核苷酸雜交探針的排列，形成字母、文字、或甚至符號或二進位碼。

對於一特別物品，可運用不只一個寡核苷酸於該核酸標誌。該客製化探針陣列亦可包括不只一個寡核苷酸雜交探針，其對應於該核酸標誌寡核苷酸或連接於有興趣物標物或其包裝的核酸標示體，以提供重複與附加的安全性保障與檢測、驗證、追蹤的確認。

該寡核苷酸雜交探針的排列亦可用於編碼額外關於有興趣物之真實性之外的訊息。在多個製造、包裝、或銷售的程序中，額外的核酸標示體可加入或附於有興趣物品上，其各自對應於不同的在該陣列中用於檢測、驗證、或追蹤該物品的寡核苷酸雜交探針，且可用於表示或編碼任何關於有興趣物品的資訊。舉例而言，在該陣列中一特定位置點與該特定寡核苷酸雜交探針雜交作用之存在與否或該特定寡核苷酸雜交探針多個複本的排列可用於加密關於該物品特定的資訊。而所加密的資訊可為任何資訊，例如但不限於該有興趣物品之型號、序號、產地、成分，使用部分、生產日、銷售商、最後賣家、或買家。

如下所述係一種以特定核酸標籤標記物品或產品接著以一有效方式檢測在該物品或產品中該核酸標籤的方法。

第1圖顯示導入核酸標籤進入或在產品之上且可檢測結合至該產品的該核酸標籤或標誌之流程100。如第1圖所示，在步驟110中，該流程包含提供至少一特定核酸片段作為產品的真實性標籤或標誌。在步驟120中，係產生包含已知核酸片段的核酸標誌化合物。該核酸標誌可為DNA、cDNA、或任何包含核酸或核酸衍生物的核酸片段。在該核酸標誌的檢測流程中，該標誌可為單股或雙股的核酸片段且可依據該被標記產品與所使用的檢測方法而有不同的長度。

在製造或分離具有已知核酸序列的核酸片段並且將其加入標誌化合物混合後，該藉由檢測核酸標籤驗證特定產品的流程進一步包含施加一預定數目的核酸標誌至一特定的產品，如步驟130所述。該特定的產品可由核酸標誌標記於產品的全體或在產品上之一預定的區域。當所欲驗證之產品為一固體，一特定量的核酸標誌可結合至產品全部的體積、或僅在產品的表面、或如一些實施例所述，僅在產品上一預先選定的部分。當產品為一處方藥品時，無論為固體或液體形式，該藥品(例如：藥丸、凝膠、膠囊等)可具有該核酸標籤結合至產品的全體。若產品係一錠劑型的處方藥品，該核酸標誌化合物可為一固體且可於產品(藥品)壓製形成一錠劑時加入產品。若產品係一紡織服裝，該標誌可為一固體或液體並附於該服裝之一預定的區域。紡織品可能有一具有製造商名稱的標籤於其上，其可用於作為在產品上該核酸標誌放置的區域。上述示例僅作為清楚敘明表示之用途並非用於限制本發明之範圍。

第1圖所述驗證產品的方法的實施例進一步包含引導被標記的產品至一供應鏈或將該產品置於服務點，如步驟140所示。偽造者經常在當產品處於從製造商/製造者運送至一零售量販地點過程中有最佳的機會接觸到該產品。偽造者亦可在特定有興趣產品處於維修或服務的階段接觸到該產品，該特定有興趣產品會被檢查或替換，例如：飛機的緊固件。使製造者能追蹤、驗證其產品的方法可提供製造者對該產品可能被偽造者替換或竄改的時間與地點更佳的監控。

在步驟150中，在產品進入供應鏈或服務點之後，從包含核酸標籤的特定產品取得樣本。製造商或驗證人員可在該產品經過供應鏈、服務據點、或例行維修之任一點時從該產品取得樣本以供驗證使用。在實施例中，驗證可包含肉眼檢查該標誌、及/或削去、切割、或溶解該標誌化合物之一部分於一溶劑以進行分析。

第1圖所示之實施例進一步包括分析所取得樣本中核酸標示體的存在，如步驟160所述。從產品取得的樣本的分析可不需要進一步的純化，但可能需要萃取、分離、或純化一些從樣本中獲得的核酸標籤。該用於本發明之方法的萃取、濃縮、以及純化技術將更詳細地敘述如下以及本說明書中所述的示例中。

該樣本的分析可包括提供一“檢測分子”，其被配置以與核酸標籤結合。一檢測分子包括但不限於與核酸標示體序列互補的一核酸探針及/或引子組、被配置以結合並黏著於核酸標示體之一染色標記或顏色產生分子。當核酸標示體的檢測包含核酸標示體的放大反應(例如：使用PCR)時，該檢測分子可為特別結合至核酸標示體之一特定序列的引子。當使用即時PCR於該樣本的分析時，亦可提供一種可辨識的核苷酸探針以促進該核酸標示體的檢測，並提供半量化或質化的驗證結果。舉例而言，使用即時PCR時，該樣本分析的結果可在30分鐘至2小時內完成，並包括從取得之樣本萃取或純化該核酸標示體。實施例可利用PCR與即時PCR以外更廣泛的檢測方法，例如螢光探針，其被配置以當該核酸標籤結合至該探針時可由拉曼光譜、遠紅外線光譜、或其他核酸檢測領域中具有通常知識者使用的光譜技術來進行檢測。

在步驟170中，檢閱所取得樣本之分析結果以判定該特定核酸標示體是否在樣本中被檢測到。若在從有興趣物品取得的樣本中未發現或未檢測到該核酸標示體，則作出產品是假冒或遭竄改的分析結論，如第1圖的步驟180所示。若如步驟190所示在樣本中檢測到核酸標示體，則證實該產品是真的。

第2圖係呈現一即時PCR結果圖，顯示以與本發明一實施例相關的方法檢測一扣帶的DNA標示體的結果。第2圖顯示經扭矩封膠(torque seal)處理之樣本的即時PCR結果，該樣本係經由如下方法萃取。將所有樣本A、B、C、D、以及E乾燥20天並接著將之磨碎。樣本D與E進一步以水煮沸處理。將DNA標誌正控制組300、複製的負控制組310、與該些經扭矩封膠處理之樣本共同置於即時PCR的條件下。該正控制組300顯示一Cp值為29，而該負控制組310僅表現一背景值。僅由磨碎處理的兩個經扭矩封膠處理之樣本：樣本A(320)與樣本B(330)，分別具有Cp值為37與33。同時經磨碎與煮沸處理的樣本：樣本D(340)與樣本E(350)則均具有一Cp值為34。該結果顯示，經過暴露20天後，可從經扭矩封膠處理之物質所取得的樣本檢測到該DNA標誌。磨碎與煮沸兩種方法提供質化的結果，而磨碎接著煮沸法則提供半量化的結果。

第3圖顯示經扭矩封膠處理之樣本的即時PCR結果，該樣本係經由如下方法萃取。將所有樣本乾燥20天並磨碎後溶解於水，進一步使用一QIAgen PCR純化套組純化以去除可干擾PCR儀器光學檢測之微粒物質。該純化步驟包括離心以將存在於該經扭矩封膠處理之樣本的DNA結合至一濾膜上，接者將任何雜質洗法，再接著以水洗滌該DNA。該流程快速且簡單，執行時間僅需不多於15分鐘。洗滌之後，以樣本A與樣本B執行即時PCR，樣本A可為2μL或4μL的該純化的經扭矩封膠處理之DNA，而樣本B可為2μL或4μL的該純化的經扭矩封膠處理之DNA。本發明亦以2μL正控制組DNA(9543-2)來抑制樣本A與樣本B以測試該PCR反應的抑制效果。

樣本A與樣本B經過PCR反應之放大曲線如第3圖所示。2μL的樣本A與2μL的樣本B之曲線分別為曲線360與曲線370，且均具有相近的Cp值為32。4μL的樣本A與4μL的樣本B之曲線分別為曲線380與曲線390，且均具有相當程度可再現性的Cp值約30。該放大的正控制組400如預期具有一Cp值為29，而該複製的負控制組410則未表現任何高於背景值的訊號。經扭矩封膠處理之樣本A與樣本B係分別由正控制組420與430抑制，以確保該純化套組並不影響該目標DNA的放大反應。經抑制的樣本A與經抑制的樣本B分別具有Cp值為27與29。經該純化套組處理的樣本所產生之螢光訊號係平滑且具有即時PCR典型的曲線。本實驗顯示可從乾燥之經扭矩封膠處理的物質檢測所得到的特定DNA標誌。該結果亦顯示該分析方法可為半量化的。

第4圖係根據本發明一實施例之流程圖。將具有一DNA標誌的物品樣本化，將該樣本傳送至一樣本容器，該樣本容器係操作性地與一分析裝置連結。對特定樣本而言，該樣本較佳可以一DNA萃取流程步驟處理，以進行檢測與驗證步驟。原始數據係與一數據處理單元溝通。該處理單元的數據可接著中繼傳送至一本地或遠端處理器或資料庫以進行進一步地分析、展現、儲存、或合併為一報告，例如：一“合格/不合格”讀出格式。在三角形區域內所示的流程、矩形區域內所示的分析與讀出係隱蔽、安全的流程。

第5圖係根據本發明之一實施例所示之現場檢測儀器。樣本110係從一有興趣的物品取得。將該樣本110傳輸至該現場檢測儀器。該現場檢測儀器包括一整合的微系統，其具有樣本進-結果出之分析能力以檢測該區別性標誌之存在。該現場檢測儀器可提供一直接的結果輸出，例如一顯示器或印出資料上的讀出。替代或額外地，該現場檢測儀器可與一伺服器溝通以比較該現場檢測儀器所產生之數據與儲存於該伺服器之數掾。該伺服器可為獨立的伺服器或者該伺服器可位於雲端，而該雲端伺服器可反過來連接至獨立的伺服器。

實施例1：快速現場檢測一區別性標誌之整合微系統與方法

根據本發明之一實施例，係辨別有興趣物品中包括一或多個核酸序列之一區別性標誌的位置。取得包括該核酸序列之區別性標誌的樣本，並將該樣本傳輸至包括客製化陣列晶片的陣列管。該樣本係選擇性地螢光標記，並由微陣列分析以判定該一或多個核酸序列的存在。

可運用具有客製化探針陣列的陣列管於一微反應瓶。該陣列管可為例如：具有客製化探針微陣列(例如：生物晶片)的Alere Technologies GmbH ArrayTube並結合至微反應瓶的陣列管，該陣列管係市面上可購得(Alere Technologies,Jena,Germany)。該客製化陣列包括對於該有興趣物品是獨特的且與組成該區別性標誌之核酸序列互補的寡核苷酸。該客製化陣列晶片包括一客製化的互補寡核苷酸序列選擇並以點的形式置於該陣列晶片。該寡核苷酸探針與互補的目標核酸序列雜交以檢測樣本中的目標核酸分子。

該探針微陣列係以寡核苷酸、聚核苷酸、或蛋白質/胜肽探針分子因應各別應用而客製化。各陣列管晶片具有3mm x 3mm的尺寸且可提供多達14 x 14種特徵，包括反應控制與參考標誌點。

根據各別的分析，可製造以核酸與蛋白質以及胜肽為基礎的陣列。各陣列管例以一獨特的數據基質碼(一二進位條碼)標記以識別陣列與相關的分析。陣列管之測試係與沉澱染色方法組合執行，係適合作為血清學與以核酸為基礎的分析。催化引起的沉澱反應直接地與結合至該陣列的目標分子的數量相關。沉澱結果圖案的分析係由簡易傳輸測量來完成，導致輸入光學器材之訊號有效地降低。傳輸測量可由一ATR 03儀器執行，其係市面上可購得(Alere Technologies,Jena,Germany)、或是可由一ARRAYMATE儀器執行，其亦可於市面上購得(Alere Technologies,Jena,Germany)。

數據係從該含有客製化陣列晶片的陣列管自動化地記錄並直接地分析，而結果係電子化地傳輸至一電腦伺服器或儲存於一本地硬碟。由該自動化微陣列取得的數據可自動化地處理並與一已知核酸序列資料庫進行比較以執行驗證。

實施例2：快速現場檢測一區別性標誌之整合微系統與方法

提供一有興趣DNA標誌之樣本並將其傳輸至該整合的微系統裝置以進行分析。該樣本包括一或多個寡核苷酸序列。該寡核苷酸序列可包括一或多個該區別性標誌的目標寡核苷酸序列以及一或多個作為偽裝或誘餌的非目標寡核苷酸序列。

該樣本包括若干寡核苷酸序列。藉由清洗該樣本通過一固定於一系列微通道中的磁珠床可從該樣本純化目標寡核苷酸(例如：去除無關或偽裝的寡核苷酸序列)。各磁珠具有一或多個附著於其上的寡核苷酸探針，該寡核苷酸探針係與對於該有興趣物品為特殊的目標寡核苷酸互補的。目標寡核苷酸係結合至該磁珠的寡核苷酸探針，形成一DNA-探針偶聯物。此序列專一性DNA純化法藉由去除背景寡核苷酸序列以促進下游放大反應的效率(例如：純化該目標寡核苷酸)。該樣本利用一微幫浦在抓取通道中移動。

該磁珠作為一基質以攜帶該目標寡核苷酸至一恆溫放大單元以進行放大增幅。包括DNA-探針偶聯物的磁珠被推動至該恆溫放大單元中而該目標寡核苷酸係由恆溫放大反應增幅。

該放大的產物係被推動至一適合作為放大反應之後注入一毛細管電泳管柱的抓取膠體。該放大產物集結於該抓取膠體以形成一樣本塞(sample plug)而可被推動至一毛細管電泳管柱以進行分離與檢測。釋放該樣本塞(例如：以溫度釋放)並將其注入至一毛細管電泳管柱以進行目標寡核苷酸分離與各目標寡核苷酸序列是否存在的檢測。寡核苷酸分離係由一根據本領域中習知標準毛細管電泳技術的電場來執行，並運用一雷射與一光學檢測器系統以檢測包括於該樣本塞中之該目標寡核苷酸的存在。毛細管電泳與DNA檢測技術係如Schwartz與Guttman於“Separation of DNA by capillary electrophoresis.Beckman,1995”中所述。

根據所檢測該樣本中的目標寡核苷酸，產生一目標序列分布。該目標序列分布僅包括該被檢測到的目標寡核苷酸序列，並排除該非目標(偽裝)寡核苷酸序列。將分布數據傳輸至一遠端伺服器或儲存於一本地硬碟，以供與一資料庫中已知序列分布進行比較，來判斷該樣本是否係從一非假冒的物品所提供而得。

實施例3：快速現場檢測一區別性標誌之整合微系統與方法

提供一有興趣DNA標誌之樣本並將其傳輸至整合的微系統裝置以進行分析。該樣本包括一或多個寡核苷酸序列。該寡核苷酸序列可包括一或多個該區別性標誌的目標寡核苷酸序列以及一或多個作為偽裝或誘餌的非目標寡核苷酸序列。

該整合的微系統裝置包括一反應腔室、一廢液腔室、一反應腔室活塞、一溫度控制模組、一光學檢測模組、以及一數據分析模組。該整合的微系統裝置利用一力學螢光背景移除技術，其運用以下的原則。將一固定寡核苷酸抓取探針的陣列設置於該反應腔室，並亦提供包含與該固定寡核苷酸抓取探針互補之螢光標記報導寡核苷酸探針的溶液於該反應腔室中。在該反應腔室中所產生之與該報導寡核苷酸探針互補的擴增子係與該抓取探針競爭，用於與該報導寡核苷酸探針結合。即，該報導探針亦各自與一特定目標寡核苷酸序列互補。因此，隨著一特定擴增子(例如：目標核苷酸序列)數目的增加，所檢測到相應固定核苷酸抓取探針的螢光訊號會下降，因為較少的報導核苷酸探針結合至相應的抓取探針。如此可同步地進行包括該核苷酸序列之目標核酸序列樣本質化與量化的檢測。

根據本實施例，在加入該樣本至該反應腔室之前，該報導探針可自由地與抓取探針結合而可獲得一基準線螢光訊號。藉由啟動該反應腔室活塞(plunger)以將該抓取探針陣列壓至一該反應腔室的壁來獲得一螢光訊號。當該反應腔室活塞未啟動時，該抓取探針陣列不會被壓至該反應腔室的壁，因此該光學檢測模組不會檢測到螢光訊號。啟動該反應腔室活塞亦可去除含有未結合報導探針的反應混合物，而使得僅結合(與該抓取探針結合)的報導探針會被檢測到。

將所提供之樣本加入至該反應腔室並藉由PCR放大該目標核苷酸序列。為了依時間檢測一螢光訊號樣式，該系統係設置為連續地在各PCR放大循環之後取得螢光訊號圖像。該溫度控制模組被配設置以為了PCR放大反應自動化地加熱與冷卻該反應腔室，而該反應腔室活塞係在各PCR放大循環完成時啟動以取得螢光訊號。然而，該反應混合物可能發射一背景螢光訊號而中斷從該抓取探針陣列取得之螢光訊號。因此，當該反應腔室活塞啟動時，其壓縮該反應腔室因而去除該反應混合物至一廢液腔室，故，將該反應混合物從該反應腔室去除並實質上排除背景螢光訊號。在從該抓取探針陣列取得螢光訊號後，該反應腔室因未被該反應腔室活塞壓縮，使得該反應混合物從該廢液腔室回流至該反應腔室。此流程於各PCR放大反應循環的過程中重複。

該數據分析模組被配置以從該光學檢測模組收集光學數據以質化地判定樣本中一或多個目標寡核苷酸序列的存在及/或量化地判定一或多個目標寡核苷酸序列PCR放大反應的速度(例如：擴增子產生的數量)。從該數據分析模組產生一目標序列分布而該數據係傳輸至一遠端伺服器或儲存於一本地硬碟，用於與一已知序列分布資料庫進行比較以判斷所提供之樣本是否來自於一非假冒的物品。

實施例4：快速現場檢測一區別性標誌之整合微系統與方法

實施例3所述之整合的微系統可運用恆溫放大反應進行改裝以排除溫度循環。因此，該溫度控制模組可忽略，而取得圖像的速率可提升以適應該恆溫放大反應之較快速的循環時間。

本發明之方法與系統亦可用於識別附於任何可被偽造或偷竊之物品的安全性標誌DNA。該些物品包括但不限於印刷品、銀行紙幣、金融儀器、硬幣、標籤、徽標圖示、識別證、布料、紡織品、或其他商品、微晶片以及其他電子用品如：桌上型電腦、筆記型電腦、平板電腦、以及智慧型手機，並非僅以此些為例。

本發明說明書中所揭露之各參考文獻、專利、以及公開的專利申請皆以其完整內容作為本文之一部分。

雖然已經藉由圖示描述了本發明之一個或多個實施方式，但本領域中具有通常知識者將能理解，在不偏離如所附申請專利範圍請求限定的本發明之精神和範圍的情況下，其中可作出各種形式和細節上的改變。