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TW201629223A - 以克魯拜爾基因（ＫＲＵＰＰＥＬ ＧＥＮＥ）之親代ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制作用來控制鞘翅目害蟲之技術 - Google Patents

以克魯拜爾基因（ＫＲＵＰＰＥＬ ＧＥＮＥ）之親代ＲＮＡ干擾（ＲＮＡｉ）抑制作用來控制鞘翅目害蟲之技術 Download PDF

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TW201629223A
TW201629223A TW104142144A TW104142144A TW201629223A TW 201629223 A TW201629223 A TW 201629223A TW 104142144 A TW104142144 A TW 104142144A TW 104142144 A TW104142144 A TW 104142144A TW 201629223 A TW201629223 A TW 201629223A
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布萊爾 西格弗萊德
肯尼士Ｅ 納爾瓦
卡尼卡 阿羅拉
莎拉Ｅ 沃登
哲凡 卡哈傑拉
伊蓮 費希萊維奇
尼可拉斯Ｐ 史托爾
梅根 弗瑞
隆達 哈姆
亞納 沃茲
Original Assignee
陶氏農業科學公司
內布拉斯加大學董事會
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Abstract

此揭示係有關於核酸分子及使用其等用於控制鞘翅目害蟲的方法，其係透過RNA干擾-媒介的靶定編碼與轉錄的非編碼序列在鞘翅目害蟲中之抑制作用。本揭示亦有關於用於製造基因轉殖植物的方法，該植物表現對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子，以及由此獲得的植物細胞與植物。

Description

以克魯拜爾基因(KRUPPEL GENE)之親代RNA干擾(RNAi)抑制作用 來控制鞘翅目害蟲之技術 優先權主張
此申請案主張提申日期2014年12月16日提申，“PARENTAL RNAI SUPPRESSION OF KRUPPEL GENE TO CONTROL COLEOPTERAN PESTS”之美國專利臨時申請案第62/092,781號之利益，其係以其之全體併入於此。
發明領域
本發明一般而言係有關於由鞘翅目害蟲造成的植物損害之遺傳控制。在特定的具體例中，本揭示有關於辨識靶定的編碼與非編碼多核苷酸，以及使用重組DNA技術用於轉錄後壓制或抑制靶定的編碼與非編碼多核苷酸在鞘翅目害蟲細胞中的表現，以提供植物防護的效果。
發明背景
西方玉米根蟲(western corn rootworm)(WCR)，玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)，為北美最具破壞性的玉米根蟲物種中之一者，且在美國中西部的玉米種植區為特別重要的事。北方玉米根蟲(northern corn rootworm)(NCR)，北方玉米根蟲(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)，為一種密切相關的物種，該者與WCR共棲於許多相同的範圍。在美洲還有其他數種相關的葉甲(Diabrotica)亞種為重大的害蟲：墨西哥玉米根蟲(Mexican corn rootworm)(MCR)，墨西哥玉米根葉甲(D.virgifera zeae Krysan and Smith)；南方玉米根蟲(southern corn rootworm)(SCR)，黃瓜十一星葉甲食根亞種(D.undecimpunctata howardi Barber)；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.undecimpunctata tenella)；南美葉甲(D.speciosa Germar)；以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。美國農業部業已估計玉米根蟲每年造成10億美元歲入的損失，包括8億美元的產量損失以及2億美元的處理費用。
WCR與NCR兩者於夏季期間皆以卵沈積在土壤中。該等昆蟲在整個冬季依舊處於卵的階段。這些卵係為橢圓形、白色，且長度小於0.1mm。幼蟲在五月底或六月初孵化，卵孵化的精確時程由於溫度差異與位置而每一年有所不同。初孵化的幼蟲為長度小於3.18mm的白色蠕蟲。 一旦孵化，幼蟲開始取食玉米的根。玉米根蟲歷經3個幼蟲齡期。在取食數周之後，幼蟲蛻皮進入蛹的階段。它們在土壤中成蛹，然後在七月與八月時以成蟲從土壤中出現。成蟲根蟲長度為大約6.35mm。
玉米根蟲幼蟲在玉米與其他數種禾草物種上完成發育。在黃色狐尾草上飼養的幼蟲出現得較晚，且比起 在玉米上飼養的幼蟲，成蟲的頭殼尺寸較小。Ellsbury等人之(2005)Environ.Entomol.34：627-34。WCR成蟲取食玉米鬚(corn silk)、花粉及暴露的穗尖(ear tips)。當可以得到偏好的組織例如鬚與花粉時，成蟲將會迅速搬移到鬚與花粉。NCR成蟲亦會取食玉米植物的生殖組織。WCR雌體典型交配一次。Branson等人(1977)Ann.Entom.Soc.America 70(4)：506-8。
玉米大部分的根蟲損害係由幼蟲取食造成。剛孵化的根蟲最初取食纖細的玉米根毛並鑽入根尖內。當幼蟲長得更大時，它們取食主根並且鑽入主根之內。當玉米根蟲的量大量時，幼蟲取食常常會引致根部的削減，一直到玉米莖的基部。嚴重的根傷害干擾了根部輸送水分與養分到植物內的能力，降低植物的生長，並且引致穀粒生產降低，因而常常使整體產量大大地降低。嚴重的根傷害亦常常引致玉米植物的倒伏，這使得收割更為困難，並且使產量進一步減低。再者，成蟲在玉米生殖組織上取食可以引致在穗尖的鬚消減。假若在散粉期間此種“鬚修剪(silk clipping)”足夠嚴重，則可能會使授粉中斷。
可以透過作物輪作、化學殺蟲劑、生物農藥(例如，形成孢子的革蘭氏陽性細菌，蘇力菌(Bacillus thuringiensis))、表現Bt毒素的基因轉殖植物，或其等之組合，來嘗試控制玉米根蟲。在耕地使用上作物輪作會遭受到安置限定的缺點。再者，一些根蟲物種的產卵可能會在玉米或延長滯育以外的作物田間發生，導致在多年期間的 卵孵化，因而使玉米以及其他的作物實行輪作的有效性減輕。
實現玉米根蟲控制依賴得最嚴重的策略係化學殺蟲劑。儘管如此，化學殺蟲劑的使用為不完美的玉米根蟲控制策略；雖然使用了殺蟲劑，可是當將化學殺蟲劑的成本加入至可能發生的玉米根蟲損傷所致的產量損失之費用時，美國每年因玉米根蟲侵擾的損失可能超過10億美元。高族群的幼蟲、暴雨及殺蟲劑的不當施用全部都可能會引致玉米根蟲的控制不夠充分。再者，殺蟲劑之持續使用可能會選擇出抗殺蟲劑的根蟲品系，以及因為殺蟲劑缺乏特異性，所以提高顯著的環境關注。
RNA干擾(RNAi)係為一種利用內源性細胞途徑之方法，憑此，對一靶定基因之適當大小的全部或任何部分有特異性的干擾RNA(iRNA)分子(例如，一種雙股RNA(dsRNA)分子)，會引致由此編碼的mRNA之降解。近年來，RNAi在許多物種與實驗系統中已被使用於執行基因“減量(knockdown)”；舉例而言，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)、植物、昆蟲胚胎及組織培養中的細胞。參閱，例如，Fire等人之(1998)Nature 391：806-11；Martinez等人之(2002)Cell 110：563-74；McManus及Sharp之(2002)Nature Rev.Genetics 3：737-47。
RNAi透過內源性途徑，包括DICER蛋白複合體，來達到mRNA之降解。DICER將長的dsRNA分子切割成為大約20個核苷酸的短片段，命名為短小干擾RNA(siRNA)。 siRNA解開成兩個單股RNA：過客股(passenger strand)及引導股(guide strand)。過客股被降解，而引導股係併入RNA誘導的靜默複合體(RISC)內。微核糖核酸(Micro ribonucleic acid)(miRNA)為結構非常類似的分子，其等可從含有與雜交的過客股及引導股相連接的多核苷酸“環”之前驅體切割，且其等可以類似地併入至RISC之內。當引導股特異地結合至互補的mRNA分子且誘導藉由阿革蛋白家族(Argonaute)之切割時一阿革蛋白家族(Argonaute)為RISC複合體的催化組份一會發生轉錄後基因靜默作用。儘管初始限制的siRNA及/或miRNA濃度，但是此過程已知係系統性散布遍及一些真核生物體中，諸如植物、線蟲及一些昆蟲。
僅有互補於siRNA及/或miRNA的轉錄本被切割與降解，且因此mRNA表現的減量(knockdown)為序列特異性的。在植物中，DICER基因存在著數種的官能團。該RNAi的基因沈默效應存留數天且，在實驗條件下，可以導致該靶定轉錄本的豐度下降90%或更多，伴隨隨後在該相應蛋白質位準的降低。於昆蟲方面，有至少二種DICER基因，DICER1促進阿革蛋白家族1(Argonaute1)指引的miRNA降解。Lee等人之(2004)Cell 117(1)：69-81。DICER2促進siRNA由阿革蛋白家族2(Argonaute2)指引的降解。
美國專利第7,612,194號及美國專利公開案第2007/0050860號、第2010/0192265號與第2011/0154545號，揭露了從玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)的蛹所單離出的9112個表現序列標籤(EST)的序列庫。在美國專利第 7,612,194號及美國專利公開案第2007/0050860號中，建議可操縱地鏈接一個啟動子至一種核酸分子，該核酸分子係與該處揭露的玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)液泡型H+-ATP酶(V-ATP酶)的數個特定的部分序列之一者互補，用於在植物細胞中表現反義RNA。美國專利公開案第2010/0192265號建議可操縱地鏈接一啟動子至一種核酸分子，該核酸分子係互補於玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)未知且未揭露功能基因之特定的部分序列(該部分序列係聲明為與秀麗隱桿線蟲(C.elegans)中C56C10.3的基因產物有58%的同一性)，用於在植物細胞中表現反義RNA。美國專利公開案第2011/0154545號建議可操縱地鏈接一啟動子至一種核酸分子，該核酸分子係互補於玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)外被體β次單元基因之二個特定的部分序列，用於在植物細胞中表現反義RNA。再者，美國專利第7,943,819號揭露了從玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)之幼蟲、蛹及切開的中腸單離出的906個表現序列標籤(EST)的序列庫，以及建議可操縱地鏈接一啟動子至一種核酸分子，該核酸分子係互補於玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)帶電荷的多胞體蛋白4b基因之特定的部分序列，用於在植物細胞中表現雙股RNA。
在美國專利第7,612,194號，以及美國專利公開案第2007/0050860號、第2010/0192265號與第2011/0154545號中，除了V-ATP酶之數個特定的部分序列及未知功能之基因的特定部分序列之外，關於使用在其中列出超過9000個序 列之任何特定序列用於RNA干擾，沒有提供進一步的建議。更進一步地，美國專利第7,612,194號與美國專利公開案2007/0050860號與第2010/0192265號，以及第2011/0154545號中無一者，對於所提供超過9000個序列在玉米根蟲物種中使用做為dsRNA或siRNA時，何者將為致命的或甚至是有用的，提供任何引導。美國專利第7,943,819號除了帶電荷的多胞體蛋白4b基因之特定的部分序列之外，對於使用在其中列出超過900個序列之任何特定序列用於RNA干擾，沒有提供任何的建議。再者，美國專利第7,943,819號，對於所提供超過900個序列在玉米根蟲物種中使用做為dsRNA或siRNA時，何者將為致命的或甚至是有用的，沒有提供任何引導。美國專利公開案第2013/040173號及PCT專利公開案第WO 2013/169923號中，說明使用由玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera)Snf7基因衍生的序列用於玉蜀黍(maize)之RNA干擾。(於Bolognesi等人之(2012)PLOS ONE 7(10)：e47534.doi：10.1371/journal.pone.0047534中亦有揭示)。
於使用做為dsRNA或siRNA時，互補於玉米根蟲DNAs(例如前述)的序列中壓倒性的多數，不會提供植物防護的效果。舉例而言，Baum等人(2007)，Nature Biotechnology 25：1322-1326，描述藉由RNAi來抑制數個WCR基因的標靶的效果。這些作者記錄26個他們測試的靶定基因中，有8者在超過520ng/cm2之非常高的iRNA(例如，dsRNA)濃度時，無法提供實驗上顯著的鞘翅目害蟲死亡 率。
美國專利第7,612,194號以及美國專利公開案第2007/0050860號的作者首先報導於玉米植物中靶定西方玉米根蟲之植物界RNAi。Baum等人(2007)Nat.Biotechnol.25(11)：1322-6。這些作者描述一種高輸出量活體內飲食RNAi系統，用來篩選可能的靶定基因供開發基因轉殖的RNAi玉蜀黍(maize)。在起始的290個標靶基因池(gene pool)中，只有14者展現出幼蟲控制的潛力。最有效的雙股RNA(dsRNA)中之一者係靶定一種編碼液泡型ATP酶次單元A(V-ATP酶)，以低濃度的dsRNA導致快速抑制對應的內源性mRNA且觸發特異性RNAi反應。因而，這些作者首次用充分的證據證明植物界RNAi作為可能的害蟲管理工具之潛力，而同時證明有效的標靶不能正確地先驗(a priori)鑑定，即使是來自相對小的候選基因組。
RNAi於昆蟲控制方面另一種潛在的應用涉及親代RNAi(pRNAi)。首次描述於秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)，pRNAi之確認係藉由注入dsRNA至體腔內(或是經由攝入而應用dsRNA)，造成子代的胚胎去活化。Fire等人(1998)，如前文；Timmons and Fire(1998)Nature 395(6705)：854。相似的過程描述於模型鞘翅目，擬穀盜(Tribolium castaneum)中，藉此將相應於三種獨特的基因之dsRNA注入雌性蛹內，該等基因控制胚胎發育期間的卵割(segmentation)，引致子代的胚胎之合子胚基因的減量。Bucher等人之(2002)Curr.Biol.12(3)：R85-6。此研究中幾乎 所有的子代幼蟲於注入後一週展現出基因特異性表型。縱然注入dsRNA用於功能基因體學研究業已於各種昆蟲成功，但是必需經由口腔接觸dsRNA而從腸環境攝入dsRNA且隨後向下調控必要基因，以使RNAi成為作為有效的昆蟲管理工具。Auer and Frederick(2009)Trends Biotechnol.27(11)：644-51。
親代RNAi業已用來描述一些昆蟲物種之胚胎基因的功能，包括彈尾蟲，長角長跳(Orchesella cincta)(Konopova and Akam(2014)Evodevo 5(1)：2)；褐稻飛虱(brown plant hopper)，褐飛虱(Nilaparvata lugens)；鋸蜂(sawfly)，新疆菜葉蜂(Athalia rosae)(Yoshiyama等人之(2013)J.Insect Physiol.59(4)：400-7)；德國蟑螂(German cockroach)，德國蟑螂(Blattella germanica)(Piulachs等人之(2010)Insect Biochem.Mol.Biol.40：468-75)；以及豌豆蚜蟲(pea aphid)，苜蓿豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)(Mao等人之(2013)Arch Insect Biochem Physiol 84(4)：209-21)。於此等所有的例子中，pRNAi反應係透過將dsRNA注入至親代雌體血腔內來完成。
發明概要
本文揭露的為核酸分子(例如，靶定基因、DNAs、dsRNAs、siRNAs、shRNAs、miRNAs及hpRNAs)及其等之使用方法，用於控制鞘翅目害蟲，包括舉例而言，玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)(西方玉米根蟲，"WCR")； 北方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence)(北方玉米根蟲，"NCR")；黃瓜十一星葉甲食根亞種(D.u.howardi Barber)(南方玉米根蟲，"SCR")；墨西哥玉米根葉甲(D.v.zeae Krysan and Smith)(墨西哥玉米根蟲，"MCR")；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；南美葉甲(D.speciosa Germar)；以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。在特定例子中，揭露了示範性的核酸分子，其等可能同源於在一種鞘翅目害蟲中的一個或多個天然的核酸序列之至少一部分。於一些具體例中，鞘翅目害蟲係透過降低現存一代生產後續世代的能力來控制。在某些例子中，遞送核酸分子至鞘翅目害蟲不會導致害蟲顯著的死亡率，但是會降低鞘翅目害蟲生產的存活後代的數目。
在此些及進一步的實例中，天然的核酸可以為一種靶定基因，該靶定基因可以為下列之產物，舉例而言但不限於：涉及代謝過程；涉及生殖過程；及/或涉及胚胎及/或幼蟲發育。在一些例子中，藉由一種包含同源於其等之多核苷酸的核酸分子，予以轉譯後抑制一種靶定基因的表現，可能引致鞘翅目害蟲降低的活力、生長及/或生殖。在具體的實例中，選擇一種克魯拜爾(kruppel)基因作為用於轉錄後靜默之靶定基因。在特定實例中，一種有用於轉錄後抑制之靶定基因係新穎的基因，於此稱為葉甲克魯拜爾(Diabrotica kruppel)(序列辨識編號：1及序列辨識編號：2)。本文因而揭露一種經單離的核酸分子，其包含下列多核苷 酸：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補物；及/或前述之任何片段(例如，序列辨識編號：4)。
亦揭露了核酸分子，其包含編碼多肽之多核苷酸，該多肽係至少大約85%同一於一種靶定基因產物(舉例而言，克魯拜爾(kruppel)基因之產物)之內的胺基酸序列。舉例而言，一種核酸分子可以包含編碼一種多肽之多核苷酸，該多肽係至少85%同一於選自於以下所組成之群組之多肽：序列辨識編號：3(葉甲克魯拜爾(Diabrotica kruppel))；及/或葉甲克魯拜爾產物內的胺基酸序列。進一步揭露包含一種多核苷酸之核酸分子，其中該多核苷酸係為編碼一種多肽之多核苷酸的反向互補物，其中該多肽係至少85%同一於一種靶定基因產物內的胺基酸序列。
進一步揭露可以使用於生產iRNA(例如，dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及hpRNA)分子的cDNA多核苷酸，該iRNA係互補於一種鞘翅目害蟲靶定基因的全部或部分，舉例而言一種克魯拜爾基因。在特定具體例中，dsRNAs、siRNAs、shRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可以藉由一種基因改造生物體，諸如植物或細菌，在活體外或活體內生產。在特定實例中，揭露了cDNA分子，其等可以使用來生產互補於從葉甲克魯拜爾(Diabrotica kruppel)(序列辨識編號：1及序列辨識編號：2)轉錄的mRNA之全部或部分之iRNA分子。
額外揭露用於抑制鞘翅目害蟲中一種必要基因 表現的構件，以及用於防護植物不受鞘翅目害蟲傷害的構件。一種用於抑制鞘翅目中的一種必要基因表現的構件為一種單股或雙股RNA分子，其係由選自於下列所構成的群組之多核苷酸：序列辨識編號：69-71；及其之互補物。用於抑制鞘翅目害蟲中一種必要的基因表現的構件之功能均等物包括單股或雙股RNA分子，其實質上同源於從一種WCR基因轉錄之mRNA的全部或部分，該WCR基因含有序列辨識編號：1及序列辨識編號：2。一種用於防護植物不受鞘翅目害蟲傷害的構件係一種DNA分子，該DNA分子包含可操縱地鏈接至一啟動子之一種多核苷酸，該多核苷酸編碼用於抑制在一種鞘翅目害蟲中一種必要的基因表現的構件，其中該DNA分子係能夠整合到玉蜀黍(maize)植物之基因組中。
揭露了用於控制一種鞘翅目害蟲族群之方法，該方法包含提供一種iRNA(例如dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及hpRNA)分子至一種鞘翅目害蟲，該iRNA分子一旦被該害蟲攝取時，即起作用以抑制該害蟲內的生物功能，其中該iRNA分子包含選自於下列所組成的群組之多核苷酸的全部或部分(例如，至少15個連續核苷酸)：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補物；一種葉甲(Diabrotica)生物體(例如WCR)之天然的編碼多核苷酸，其包含序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2的全部或部分；一種葉甲生物體之天然的編碼多核苷酸之互補物，該天然編碼多核苷酸包含 序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2的全部或部分；一葉甲生物體之天然非編碼多核苷酸，該天然非編碼多核苷酸轉錄成包含序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2的全部或部分之天然RNA分子；以及一葉甲生物體之天然非編碼多核苷酸之互補物，該天然非編碼多核苷酸轉錄成包含序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2的全部或部分之天然RNA分子。
在特定例子中，揭露了用於控制一種鞘翅目害蟲族群之方法，該方法包含提供一種iRNA(例如dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及hpRNA)分子至一種鞘翅目害蟲，該iRNA分子一旦被該害蟲攝取時，即起作用以抑制該害蟲內的生物功能，其中該iRNA分子包含選自於下列所組成的群組之多核苷酸：序列辨識編號：67的全部或部分；序列辨識編號：67的全部或部分之互補物；序列辨識編號：68；序列辨識編號：68之互補物；序列辨識編號：69；序列辨識編號：69之互補物；一種與葉甲生物體(例如WCR)之天然編碼多核苷酸雜交之多核苷酸，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1及2任一者的全部或部分；以及與一種葉甲生物體(例如WCR)之天然編碼多核苷酸雜交之多核苷酸的互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1及2任一者的全部或部分。
於此亦揭露的方法係為在其中可在一種飲食為基礎的分析中，或在表現dsRNAs、siRNAs、shRNAs、miRNAs及/或hpRNAs的基因改造植物細胞中，提供dsRNAs、 siRNAs、shRNAs、miRNAs及/或hpRNAs至一種鞘翅目害蟲。在這些及進一步實例中，該dsRNAs、siRNAs、shRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可以由鞘翅目害蟲予以攝入。攝入本發明的dsRNAs、siRNAs、shRNAs、miRNAs及/或hpRNAs可能繼而引致害蟲中的RNAi，該者轉而可能引致對代謝過程；生殖過程；及/或幼蟲發育過程必要的基因之靜默作用。因此，揭露了方法，其中包含對鞘翅目害蟲親代控制有用之示範性多核苷酸(等)的核酸分子，係被提供至一種鞘翅目害蟲。在特定實例中，藉由使用本發明之核酸分子而控制的鞘翅目害蟲可以為WCR、NCR或是SCR。在一些例子中，遞送核酸分子至鞘翅目害蟲不會導致害蟲顯著的死亡率，但是會降低鞘翅目害蟲生產的活的後代數目。在一些例子中，遞送核酸分子至鞘翅目害蟲會導致害蟲顯著的死亡率，並且也會降低鞘翅目害蟲生產的活的後代數目。
從下列數個參照附圖進行的具體例之詳細說明，前述特徵及其它特徵將變得更為明顯。
圖1包括從單一轉錄模板及單一對引子(圖1A)，以及從二個轉錄模板(圖1B)，來產生dsRNA使用的策略之描述。
圖2包括黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(DME)以及玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)(WCR)克魯拜爾(KRUPPEL)蛋白質序列之領域機構(domain organization)之描述。黑腹果蠅(D.melanogaster)以及玉米根螢葉甲(D.v. virgifera)克魯拜爾蛋白質含有4個C2H2型鋅指領域；使用SMART資料庫予以註解。
圖3含括資料之摘要，其顯示特定的dsRNA對於WCR卵生產與活力的效應。描繪的是每隻成年WCR雌體產的卵數目(圖3A)，以及卵孵化的百分比(圖3B)。數據為平均值加/減SEM。有*之長條為與水對照之顯著差異(P<0.1)，以及**為與水對照之顯著差異(P<0.05)。
圖4包括切開的WCR卵來檢查不同實驗條件下胚胎的發育之代表照片。用水及GFP dsRNA處理之雌體產的卵(圖4A)顯示正常的發育。用克魯拜爾dsRNA處理之雌體產的卵(圖4B)顯示沒有不完全的胚胎發育或是畸形的幼蟲。
圖5含括資料之摘要，其顯示曝露至處理的人工飲食內的dsRNA之WCR成年雌體中，克魯拜爾相對於GFP及水對照之相對表現(圖5A)。亦顯示於曝露至處理的人工飲食內的dsRNA之成年雌體採集的卵中，克魯拜爾相對於GFP及水對照之相對表現(圖5B)，以及於曝露至處理的人工飲食內的dsRNA之幼蟲中，克魯拜爾相對於GFP及水對照之相對表現(圖5C)。誤差槓表示平均值之標準誤差。有**之長條為與水對照之顯著差異(P<0.05)。
圖6包括建模資料(modeling data)之摘要，其顯示當非避難處植物表現殺蟲蛋白質及親代活性iRNA時，從“避難處區(refuge patch)”(亦即，其不表現殺蟲iRNAs或重組蛋白質於基因轉殖作物中)出現的雌體WCR成蟲上，對於 殺蟲蛋白質(R)及RNAi(Y)之抗性的對偶基因頻率之增長率，pRNAi效應的相對效應值。
圖7包括建模資料(modeling data)之摘要，其顯示當非避難處植物表現殺蟲蛋白質以及幼蟲活性與親代活性iRNA分子二者時，從“避難處嵌塊(refuge patch)”(亦即，其不表現殺蟲iRNAs或重組蛋白質於含有玉米根蟲幼蟲活性干擾dsRNA之基因轉殖作物中，組合以玉米根蟲活性殺蟲蛋白質於基因轉殖作物中)出現的雌體WCR成蟲上，對於殺蟲蛋白質(R)及RNAi(Y)之抗性的對偶基因頻率之增長率，pRNAi效應的相對效應值。
較佳實施例之詳細說明 序列表之簡要說明
在附隨的序列表中識別出的核酸序列係使用核苷酸鹼基的標準字母縮寫來表示，如在37 C.F.R.§ 1.822中所界定者。所列的核酸及胺基酸序列係界定具有以所述方式配置的核苷酸及胺基酸單體之分子(亦即，分別為多核苷酸及多肽)。所列之核酸及胺基酸序列亦各自界定一類的多核苷酸或是多肽，其包含以所述方式配置的核苷酸及胺基酸單體。鑑於遺傳密碼的冗餘性(redundancy)，會瞭解到含括編碼序列之核苷酸序列亦描述該類的多核苷酸，其編碼如參考序列所組成的多核苷酸同樣的多肽。進一步會瞭解到一胺基酸序列係描述編碼該多肽之該類的多核苷酸ORFs。
每一核酸序列僅有顯示一股，但是會瞭解互補股係藉由參照至展現股而含括。由於初級核酸序列之互補物及反向互補物必需由該初級序列予以揭露，所以一核酸序列之互補序列與反向互補序列係藉由參照至該核酸序列而含括，除非其係另有明確聲明(或其從序列出現之上下文中係清楚的)。再者，因本技藝瞭解一RNA股之核苷酸序列係由轉錄成該RNA之DNA的序列所決定(但是尿嘧啶(U)核鹼基取代胸腺嘧啶(T))，所以一RNA序列係藉由參照編碼該RNA之DNA序列而含括。在附隨的序列表中：
序列辨識編號：1顯示一種片段重疊群(Contig)，其包含一種示範性葉甲克魯拜爾(Diabrotica kruppel)DNA：
序列辨識編號：2顯示一種片段重疊群，其包含一種另外的示範性葉甲克魯拜爾(Diabrotica kruppel)DNA：
序列辨識編號：3顯示一種葉甲克魯拜爾(Diabrotica KRUPPEL)多肽之胺基酸序列，其係由一種示範性葉甲克魯拜爾(Diabrotica kruppel)DNA所編碼：
序列辨識編號：4顯示一種示範性葉甲克魯拜爾DNA，在本文中一些地方稱為克魯拜爾區域1(Reg1)，其於一些實例中用來生產一種dsRNA：
序列辨識編號：5顯示一種T7噬菌體啟動子之核苷酸序列。
序列辨識編號：6-9顯示引子，其等使用來擴增葉甲克魯拜爾基因或是GFP基因之基因區域。
序列辨識編號：10顯示一種GFP基因之部分編碼區域。
序列辨識編號：11顯示一種示範性YFP基因之部分編碼區域。
序列辨識編號：12顯示一種膜聯蛋白(annexin)區域1之DNA序列。
序列辨識編號：13顯示一種膜聯蛋白區域2之DNA序列。
序列辨識編號：14顯示一種β紅血球膜骨架蛋白質(spectrin)2區域1之DNA序列。
序列辨識編號：15顯示一種β紅血球膜骨架蛋白質2區域2之DNA序列。
序列辨識編號：16顯示一種mtRP-L4區域1之DNA序列。
序列辨識編號：17顯示一種mtRP-L4區域2之DNA序列。
序列辨識編號：18-45顯示引子，其等使用來擴增膜聯蛋白、β紅血球膜骨架蛋白質2、mtRP-L4，以及YFP之基 因區域用於dsRNA合成。
序列辨識編號：46顯示一種示範性DNA，其包含一種ST-LS1內含子。
序列辨識編號：47顯示一種T20VN引子寡核苷酸之核苷酸序列。
序列辨識編號：48-52顯示引子及探針，其等使用於dsRNA轉錄本表現分析。
序列辨識編號：53顯示一種SpecR編碼區域的部分之核苷酸序列，其係用於二元載體主幹(binary vector backbone)偵測。
序列辨識編號：54顯示一種AAD1編碼區域之核苷酸序列，其係用於基因複本數(genomic copy number)分析。
序列辨識編號：55-66顯示DNA寡核苷酸之核苷酸序列，其等係用於基因複本數判定與二元載體主幹偵測。
序列辨識編號：67-69顯示從核酸轉錄之示範性RNAs，該等核酸包含示範性克魯拜爾多核苷酸及其等之片段。
進行本發明之模式 I.數個具體例概述
吾人發展RNA干擾(RNAi)作為昆蟲害蟲管理的工具，其係使用表現dsRNA之基因轉殖植物最可能靶定的害蟲物種中之一者，西方玉米根蟲。到現在為止，提議作為根蟲幼蟲內RNAi標靶的多數基因沒有實現其等之目的，以及該等業已辨識出之有用標靶涉及引致幼蟲階段致死性的該等。於此，吾人描述西方玉米根蟲中RNAi媒介的克魯 拜爾(kr)之減量(knockdown)，舉例而言，此在經由餵食克魯拜爾dsRNA來遞送iRNA分子至成年雌體時，顯示出中斷胚胎發育。成年雌體昆蟲當口腔投與而曝露於克魯拜爾dsRNA時，不會影響成體的壽命。然而，從曝露於克魯拜爾dsRNA的雌體採集的卵幾乎完全沒有孵化。於此之具體例中，藉由餵食而遞送克魯拜爾dsRNA至成年昆蟲的能力，賦予非常有用的pRNAi效應用於昆蟲(例如鞘翅目)害蟲管理。再者，於幼蟲及成年根蟲二者影響多重標靶序列的潛力，可以使發展出涉及RNAi技術的昆蟲害蟲管理永續性方法的機會增高。
於此揭露的為用於基因控制鞘翅目害蟲侵擾的方法與組成物。亦提供用於辨識對鞘翅目害蟲生命週期必要之一種或多種基因(等)(例如，對於正常生殖能力及/或胚胎及/或幼蟲發育必要的基因)的方法，以使用做為RNAi媒介的鞘翅目害蟲族群控制之靶定基因。可以設計編碼一種RNA分子的DNA質體載體，以箝制對生長、存活、發育及/或生殖必要的一種或多種靶定基因(等)。在一些具體例中，該RNA分子可能可以形成dsRNA分子。在一些具體例中，提供用於一種靶定基因的轉錄後表現的壓制或抑制方法，該者係經由互補於在一種鞘翅目害蟲中之靶定基因的編碼或非編碼序列之核酸分子。在這些及進一步具體例中，一種鞘翅目害蟲可能攝入一種或多種dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及/或hpRNA分子，該者係從互補於一靶定基因之編碼或非編碼序列的核酸分子之全部或部分而轉錄，從而提 供植物防護的效果。
一些具體例涉及靶定基因產物表現的序列特異性抑制，其使用互補於該(等)靶定基因之編碼及/或非編碼序列的dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA及/或hpRNA，以實現鞘翅目害蟲至少部分的控制。揭露的是一組經單離及純化的核酸分子，其包含一種多核苷酸，舉例而言，如在序列辨識編號：1及2中所陳述者，以及其等之片段。在一些具體例中，可以從此等多核苷酸、其等之片段、或包括這些多核苷酸中之一者的基因來表現一種穩定的dsRNA分子，用於一種靶定基因的轉錄後靜默或抑制。在某些具體例中，經單離及純化的核酸分子包含序列辨識編號：1；2；及4中任一者之全部或部分。
其他的具體例涉及一種重組宿主細胞(例如一植物細胞)，該者在其基因組中具有至少一個重組DNA序列，其編碼至少一個iRNA(例如dsRNA)分子者(等)。在特定的具體例中，當由一種鞘翅目害蟲攝入時，可生產該(等)dsRNA分子，以轉錄後靜默或抑制一靶定基因在該害蟲或該害蟲的後代中之表現。該重組DNA可以包含，舉例而言下列中任一者：序列辨識編號：1；2；及4中任一者，序列辨識編號：1；2；及4中任一者之片段，以及一種基因的部分序列所組成的多核苷酸，該基因包含序列辨識編號：1；2；及4，及/或其等之互補物。
任擇的具體例涉及一種重組宿主細胞，該者在其基因組中具有至少一個重組DNA，其編碼至少一個 iRNA(例如dsRNA)分子者(等)，該者包含序列辨識編號：67或序列辨識編號：68之全部或部分(例如，選自於序列辨識編號：67-69所構成的群組之至少一種多核苷酸)。當由鞘翅目害蟲攝入時，該(等)iRNA分子可靜默或抑制一種靶定克魯拜爾基因(舉例而言，一種包含一種多核苷酸之全部或部分的DNA，該多核苷酸係選自於序列辨識編號：1及序列辨識編號：2所構成的群組)在該害蟲或該害蟲的後代中的表現，並且從而引致該害蟲之生殖，及/或該害蟲的後代生長、發育及/或取食的停止。
在一些具體例中，一種重組宿主細胞可以為一種經轉形的植物細胞，該重組宿主細胞在其基因組中具有編碼至少一個RNA分子的至少一個重組DNA，該RNA分子能形成dsRNA分子。一些具體例涉及基因轉殖植物，其包含此種轉形植物細胞。除了此種基因轉殖植物，還提供任何基因轉殖植物世代的後代植株、基因轉殖種子及基因轉殖植物之產物全體，其中每一者包含重組DNA。在特定的具體例中，一種能形成dsRNA分子之RNA分子可以在一種基因轉殖植物細胞中表現。所以，在這些及其他具體例中，一種dsRNA分子可以從一基因轉殖植物細胞單離出。在特定具體例中，該基因轉殖植物為選自於玉米(玉蜀黍(Zea mays))、大豆(大豆(Glycine max))及禾本科(Poaceae)植物所組成之群組的植物。
其他的具體例涉及一種用於調控靶定基因在鞘翅目害蟲細胞中表現的方法。在這些及其他具體例中，可 提供一種核酸分子，其中該核酸分子包含一種編碼能形成dsRNA分子之RNA分子之多核苷酸。在特定的具體例中，一種編碼能形成dsRNA分子之RNA分子之多核苷酸，可以可操縱地鏈接至一啟動子，且亦可以可操縱地鏈接至一轉錄終止序列。在特定具體例中，一種用於調控靶定基因在鞘翅目害蟲細胞中表現的方法可以包含：(a)以一載體轉形一植物細胞，該載體包含一種編碼能形成dsRNA分子之RNA分子之多核苷酸；(b)在足以允許包含數個轉形植物細胞之植物細胞培養物發展的條件下，培養該經轉形植物細胞；(c)選擇已經將該載體整合至其基因組內的轉形植物細胞；及(d)確定該選擇的轉形植物細胞包含由該載體的多核苷酸所編碼之能形成dsRNA分子之RNA分子。一植物可能從一植物細胞再生，該植物細胞在其基因組中具有整合的載體且包含由該載體的多核苷酸所編碼的該dsRNA分子。
並且揭露一種基因轉殖植物，其包含整合至其基因組內之載體，該載體具有一種編碼能形成dsRNA分子之RNA分子的多核苷酸，其中該基因轉殖植物包含由該載體的多核苷酸所編碼之該dsRNA分子。在特定的具體例中，在植物中表現能形成dsRNA分子之RNA分子，係足以調控接觸該轉形植物或植物細胞(舉例而言，藉由取食該轉形的植物、該植物的一部分(例如根)或植物細胞)的鞘翅目害蟲之細胞中靶定基因的表現，或是接觸該轉形植物或植物細胞(舉例而言，藉由親代傳遞(parental transmission))的該鞘翅目害蟲後代細胞中靶定基因的表現，以使得該害蟲的生 殖被抑制。本文所揭露的基因轉殖植物可展現對鞘翅目害蟲侵擾的耐受性及/或防護性。特定的基因轉殖植物可能會展現對選自於以下所組成之群組的一種或多種鞘翅目害蟲之防護性及/或增強的防護性：WCR；NCR；SCR；MCR；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；南美葉甲(D.speciosa Germar)；以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。
本文進一步揭露的是遞送控制劑，諸如一種iRNA分子，至一種鞘翅目害蟲的方法。此種控制劑可能直接或間接地造成鞘翅目害蟲族群取食、生長、或以其它方式造成宿主損害之能力的毀損。在一些具體例中，提供一種方法，該方法包含遞送一穩定的dsRNA分子至一種鞘翅目害蟲，以在該害蟲或其後代中箝制至少一靶定基因，從而引致親代RNAi且降低或消除植物損害。在一些具體例中，一種抑制一靶定基因在鞘翅目害蟲中表現的方法可能會引致該害蟲之生殖，及/或該害蟲的後代生長、發育及/或取食的停止。在一些具體例中，該方法可以顯著地減少侵擾中的後續害蟲世代的規模(size)，但不會直接導致接觸該iRNA分子之害蟲的死亡。在一些具體例中，該方法可以顯著地減少侵擾中的後續害蟲世代的規模，同時也導致接觸該iRNA分子之害蟲的死亡。
在一些具體例中，提供組成物(例如一種局部組成物)，該者包含一種iRNA(例如dsRNA)分子，用於在植物、 動物及/或植物或動物的環境中使用，以實現鞘翅目害蟲侵擾的消除或降低。在一些具體例中，提供含括一種原核生物之組成物，該原核生物包含一種編碼iRNA分子的DNA，舉例而言一種轉形細菌細胞。在特定實例中，此一種轉形細菌細胞可以使用作為常規的殺蟲劑調配物。在特定的具體例中，該組成物可能為餵食該鞘翅目害蟲之營養組成物或資源，或食物來源。一些具體例包含製成該害蟲可用的營養組成物或食物來源。攝入包含iRNA分子之組成物可能引致該分子被該鞘翅目害蟲之一個或多個細胞攝取，該者轉而可能引致抑制至少一靶定基因在該害蟲或其後代的細胞(等)中的表現。透過在該害蟲之宿主中提供一個或多個包含iRNA分子的組成物，可以限制或消除該害蟲存在的任何宿主組織或環境中或附近，被鞘翅目害蟲侵擾的植物或植物細胞之攝入或損害。
本文揭露之組成物及方法可以與其它用於控制鞘翅目害蟲損害的方法與組成物一起組合使用。舉例而言，一種如於此所描述用於防護植物不受鞘翅目害蟲傷害的iRNA分子可能在一方法中使用，該方法包含以下的額外使用，包括：一種或多種對鞘翅目害蟲有效的化學藥劑、對此一鞘翅目害蟲有效的生物農藥、作物輪作、重組基因技術，其展示特徵不同於RNAi-媒介的方法及RNAi組成物之特徵者(例如在植物中重組製造對鞘翅目害蟲有害的蛋白質(例如Bt毒素))，及/或非親代iRNA分子之重組表現(例如，致命的iRNA分子，其導致攝入該iRNA分子之該鞘翅目害蟲 的死亡率、生長、發育及/或取食的停止)。
II.縮寫
III.術語
在下列之說明與圖表中，使用許多術語。為了提供本說明書與請求項清楚且一貫的理解，包括此等術語給定的範圍，提供下面的定義：
鞘翅目害蟲：如於此所使用，術語"鞘翅目害蟲"意指鞘翅目(order Coleoptera)的害蟲昆蟲，含括葉甲屬(genus Diabrotica)的害蟲昆蟲，該等昆蟲取食農作物及作物產品，包括玉米及其他真草。在特定實例中，一種鞘翅目害蟲係選自包含以下之名單：玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)(WCR)；北方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence)(NCR)；黃瓜十一星葉甲食根亞種(D.u.howardi)(SCR)；墨西哥玉米根葉甲(D.v.zeae)(MCR)；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；南美葉甲(D.speciosa)；以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲 (D.u.undecimpunctata Mannerheim)。
接觸(一生物體)：如於此所使用，術語"接觸"一生物體(例如一種鞘翅目害蟲)或由一生物體"攝取"，當就一核酸分子而言時，包括將該核酸分子內化(internalization)至該生物體內，舉例而言但不限於：由該生物體攝入該分子(例如藉由取食)；使該生物體與包含該核酸分子之組成物接觸；及將該生物體浸泡於包含該核酸分子之溶液。
片段重疊群(Contig)：當使用於本文中，術語"片段重疊群"意指一DNA序列其係重建於一組重疊的DNA區段，該重疊的DNA區段係衍生自一單一遺傳來源。
玉米植物：如於此所使用，術語"玉米植物"意指物種玉蜀黍(Zea mays)(玉蜀黍(maize))之植物。術語"玉米植物"與"玉蜀黍(maize)"於本文中係可交換使用。
表現：如於此所使用，一編碼多核苷酸(舉例而言，一基因或轉基因)之"表現"意指一過程，在該過程中一核酸轉錄單元(包括，例如gDNA或cDNA)的編碼資訊係被轉換成細胞的操作、非操作、或結構部分，通常包括蛋白質的合成。外部訊號可以影響基因表現；舉例而言，將細胞、組織或生物體曝露至提高或減少基因表現之一藥劑。基因表現亦可以在從DNA至RNA至蛋白質的途徑中的任意處調控。基因表現的調控發生於下列情況，舉例而言，透過在轉錄、轉譯、RNA運輸及加工、中間分子諸如mRNA之降解上的控制作用，或是透過特定蛋白質分子在它們被製造之後的活化、去活化、分室作用(compartmentalization) 或降解，或是藉由其等之組合。基因表現可以藉由本技藝已知的任何方法，在RNA位準或蛋白質位準進行測量，包括但不限於，北方墨漬法、RT-PCR、西方墨漬法，或活體外、原位或是活體內蛋白質活性分析(等)。
遺傳物質：如於此所使用，術語"遺傳物質"包括所有的基因及核酸分子，諸如DNA與RNA。
抑制：如於此所使用，當使用以描述在一編碼多核苷酸(舉例而言，一基因)上的效果時，術語"抑制"意指轉錄自該編碼多核苷酸之mRNA，及/或該編碼多核苷酸的胜肽、多肽或蛋白質產物，於細胞位準上可測量的下降。在一些實例中，一編碼多核苷酸的表現可以被抑制，藉此近似消除該表現。"特異性抑制"意指一靶定編碼多核苷酸之抑制，而不必然地影響其他編碼多核苷酸(例如基因)在該細胞中的表現，其中在該細胞中達到特異性抑制。
經單離的：一種"經單離的"的生物成分(諸如核酸或蛋白質)實質上已與生物體細胞中，該成份天然發生區域中的其他生物成分(亦即，其他染色體及染色體外的DNA及RNA，及蛋白質)分隔、分開製造或純化而離開，而同時影響該組份的化學或功能性改變(例如，一核酸可以藉由打斷連結核酸至該染色體中剩餘DNA的化學鍵而從染色體單離開)。業已"經單離的"核酸分子與蛋白質包括藉由標準純化方法來純化的核酸分子及蛋白質。該術語亦含括藉由在一宿主細胞中重組表現而製備的核酸及蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質及胜肽。
核酸分子：如於此所使用，術語"核酸分子"可以意指核苷酸的聚合物形式，該者可包括RNA之意義股與反義股兩者、cDNA、gDNA，以及上述的合成形式與混合聚合物。一種核苷酸或核鹼基可以意指一核糖核苷酸(ribonucleotide)、去氧核糖核苷酸、或任一類型核苷酸的修飾形式。一種"核酸分子"如於此所使用係同義於"核酸"及"多核苷酸"。除非另有指明，一種核酸分子的長度通常為至少10個鹼基。按照慣例，一種核酸分子的核苷酸序列係從該分子的5’端讀取到3’端。一種核酸分子的"互補物"意指一種多核苷酸具有可以與該核酸分子的核鹼基形成鹼基對(意即，A-T/U，及G-C)的核鹼基。
一些具體例包括含有一模板DNA之核酸，該模板DNA轉錄成一種RNA分子，該RNA分子為一種mRNA分子的互補物。在這些具體例中，轉錄成mRNA分子的該核酸的互補物係以5’至3’的定向呈現，藉由此RNA聚合酶(該者以5’至3’方向轉錄DNA)將從該互補物轉錄一核酸，其可以雜交至該mRNA分子。除非另有明確聲明，或從該上下文係為清楚的，術語"互補物"因而意指一種具有核鹼基的多核苷酸，從5’至3’，其可與一參考核酸之核鹼基形成鹼基對。同樣地，除非另有明確聲明(或其從上下文係為清楚的)，否則一核酸之"反向互補物"意指以反向定向之互補物。前述情況係於下列圖解中演繹：
ATGATGATG 多核苷酸
TACTACTAC 多核苷酸之“互補物”
CATCATCAT 多核苷酸之“反向互補物”
本發明之一些具體例可以包括髮夾RNA形成RNAi分子。在這些RNAi分子中，由RNA干擾靶定之核酸的互補物及反向互補物兩者，皆可能在相同的分子中發現，藉此該單股RNA分子可以"折疊(fold over)"並雜交至本身包含該互補與反向互補多核苷酸的區域上。
"核酸分子"包括所有的多核苷酸，舉例而言：單股及雙股形式的DNA；單股形式的RNA；及雙股形式的RNA(dsRNA)。術語"核苷酸序列"或"核酸序列"意指一核酸之意義股與反義股兩者，以個別單股或在雙聯體中任一。術語"核糖核酸"(RNA)係包括iRNA(抑制性RNA)、dsRNA(雙股RNA)、siRNA(短小干擾RNA)、shRNA(小髮夾RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微RNA)、hpRNA(髮夾RNA)、tRNA(轉移RNA，不論裝載或未裝載相應的醯化胺基酸)，以及cRNA(互補的RNA)。術語"去氧核糖核酸"(DNA)係包括cDNA、gDNA，及DNA-RNA雜交體。術語"多核苷酸"及"核酸"，及其"片段"，對本技藝之一般人士將理解為一術語，其包括二種gDNA；核糖體RNA；轉移RNA；信使RNA；操縱子；以及較小的遺傳工程多核苷酸，其編碼或可能適於編碼胜肽、多肽或是蛋白質者。
寡核苷酸：一種寡核苷酸為一種短的核酸聚合物。寡核苷酸可以藉由切割較長的核酸區段而形成，或是藉由聚合個別的核苷酸前驅體而形成。自動合成器允許長度高達數百個鹼基的寡核苷酸之合成。因為寡核苷酸可以結合 至一種互補的核酸，所以它們可以使用做為偵測DNA或RNA的探針。由DNA構成的寡核苷酸(寡去氧核糖核苷酸)可以使用於PCR中，PCR為用於擴增DNA之技術。在PCR方面，寡核苷酸典型地稱為一"引子"，該引子允許DNA聚合酶延展該寡核苷酸並且複製互補股。
一核酸分子可以包括天然存在及由天然發生及/或非天然發生核苷酸鏈結而鏈接在一起的修飾的核苷酸任一者或兩者。核酸分子可以予以化學或生物化學修飾，或是可以含有非天然或衍生的核苷酸鹼基，如熟習該項技藝者將容易體會的。此種修飾包括，舉例而言，標示、甲基化、以一類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾(例如不帶電荷的鏈結：舉例而言，膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯(phosphoramidates)、胺基甲酸酯等等；帶電鏈結：舉例而言，硫代磷酸酯(phosphorothioates)、二硫代磷酸酯等等；懸垂(pendent)部分：舉例而言，胜肽；插入劑(intercalator)：舉例而言，吖啶、補骨脂素(psoralen)等等；螯合劑；烷化劑(alkylators)；及修飾鏈結：舉例而言，α-變旋異構體(alpha anomeric)核酸等等)。術語"核酸分子"亦包括任何拓撲構形，包括單股、雙股、部分雙聯體(duplexed)、三聯體、髮夾形、圓形以及扣鎖式(padlocked)構形。
如於此所使用，就DNA而言，術語"編碼多核苷酸"、"結構性多核苷酸"或"結構性核酸分子"意指當置於適當的調控元素控制下時，一種多核苷酸經由轉錄最終轉譯 成一種多肽，與mRNA。就RNA而言，術語"編碼多核苷酸"意指一種多核苷酸，其轉譯成一胜肽、多肽或蛋白質。一編碼多核苷酸的邊界係由5'-末端之一轉譯起始密碼子及3'-末端之一轉譯終止密碼子來確定。編碼多核苷酸包括，但不限於：gDNA；cDNA；EST；以及重組多核苷酸。
如於此所使用，術語"轉錄的非編碼多核苷酸"意指mRNA分子的區段，例如5'UTR、3'UTR及內含子區段，其未被轉譯成一胜肽、多肽或蛋白質。再者，"轉錄的非編碼多核苷酸"意指一種核酸，其轉錄成細胞內有作用的RNA，舉例而言結構性RNAs(諸如核糖體RNA(rRNA)舉例來說5S rRNA、5.8S rRNA、16S rRNA、18S rRNA、23S rRNA及28S rRNA及類似物)；轉移RNA(tRNA)；以及核小核糖核酸(snRNA)諸如U4、U5、U6及類似物。轉錄的非編碼多核苷酸亦包括，舉例而言但不限於，小RNAs(sRNA)，該術語通常用來描述小的細菌非編碼RNAs；小核仁RNAs(snoRNA)；以及微RNA；短小干擾RNAs(siRNA)；Piwi-交互作用RNAs(piRNA)；以及長的非編碼RNA。還進一步，"轉錄的非編碼多核苷酸"意指一種多核苷酸其可能原生地存在於一核酸中做為基因內的"鏈接子"，且該者係轉錄成一RNA分子。
致命的RNA干擾：如於此所使用，術語"致命的RNA干擾"意指RNA干擾，其會導致遞送，舉例而言dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、及/或hpRNA之主體個體的死亡或活力降低。
親代RNA干擾：如於此所使用，術語"親代RNA干擾"(pRNAi)意指遞送，舉例而言dsRNA、miRNA、siRNA、shRNA、及/或hpRNA之主體(例如一種鞘翅目害蟲)的後代，可觀察到的RNA干擾的表型。在一些具體例中，pRNAi包含遞送一種dsRNA至一種鞘翅目害蟲，其中該害蟲藉此較不能生產活的子代。一種起始pRNAi之核酸可能會或可能不會增加被遞送該核酸的族群之死亡發生率。在某些例子中，該起始pRNAi之核酸不會增加被遞送該核酸的族群之死亡發生率。舉例而言，一種鞘翅目害蟲族群可能餵食一種或多種起始pRNAi之核酸，其中該害蟲存活且交配，但是生產的卵比起相同物種但沒有取食該核酸的害蟲生產的卵，較不能孵化活的後代。於一種pRNAi機制方面，遞送至雌體的親代RNAi可以使雌體子代的胚胎之合子胚基因表現減量。Bucher等人之(2002)Curr.Biol.12(3)：R85-6。
基因組：如於此所使用，術語"基因組"意指在一細胞之細胞核內發現的染色體DNA，且還意指在該細胞之次細胞組件內發現的胞器DNA。在本發明之一些具體例中，一種DNA分子可能被引入到一植物細胞內，藉由此，該DNA分子係整合至該植物細胞的基因組中。在這些及進一步具體例中，該DNA分子可能整合至該植物細胞的細胞核DNA，或是整合至該植物細胞的葉綠體或粒線體DNA。術語"基因組"，當它應用於細菌時，意指該細菌細胞之內的染色體與質體兩者。在本發明之一些具體例中，一種DNA分子可能引入至一細菌中，藉由此，該DNA分子係整合至細菌的基 因組中。在這些及進一步具體例中，該DNA分子可能不是整合至染色體，就是坐落如一穩定質體或位於一穩定的質體中。
序列同一性(Sequence identity)：術語兩個多核苷酸或多肽之"序列同一性"或"同一性"，如於此上下文中所使用，意指當跨越一特定的比較窗口針對最大對應來排列比對時，在該兩個分子的序列中相同的殘基。
如於此所使用，術語"序列同一性百分比"可能意指藉由跨越一比較窗口上比較一分子的兩個最佳排列比對序列(例如核酸序列或多肽序列)而決定的值，其中在該比較窗口中的該部分序列針對該兩序列的最佳排列比對，可能包含添加或缺失(意即，間隙)，當相較於參考序列時(參考序列不包含添加或缺失)。百分比之計算係藉由確定在該兩者序列中同一的核苷酸或胺基酸殘基發生的位置數目，以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以該比較窗口中的位置總數，並將該結果乘以100，以產生序列同一性的百分比。一序列與一參考序列在每一位置比較之下係同一的，稱為100%同一於該參考序列，反之亦然。
用於排列比對序列以比較的方法在本技藝中係眾所周知的。各種程式及比對演算法係描述於，舉例而言：Smith及Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482；Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443；Pearson及Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444；Higgins及Sharp(1988)Gene 73：237-44；Higgins及Sharp (1989)CABIOS 5：151-3；Corpet等人之(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等人之(1992)Comp.Appl.Biosci.8：155-65；Pearson等人之(1994)Methods Mol.Biol.24：307-31；Tatiana等人之(1999)FEMS Microbiol.Lett.174：247-50。序列比對方法及同源性計算之詳細的考慮因素可以於，例如，Altschul等人之(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中找到。
國家生物技術資訊中心(NCBI)基本局部比對搜尋工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可從數個來源獲得，包括國家生物技術資訊中心(Bethesda,MD)，及在網際網路上，用於與數個序列分析程式聯合使用。使用此程式如何決定序列同一性之說明可從網際網路上在BLASTTM"協助(help)"一節上獲得。對於核酸序列之比較，可以利用BLASTTM(Blastn)程式的"Blast 2序列"功能，該者使用預設的BLOSUM62模式設為預設參數。當藉由此方法評估時，對參考多核苷酸序列具更大序列同一性的核酸將顯示提高的同一性百分比。
特異性雜交/特異性互補：如於此所使用，術語"特異性雜交"以及"特異性互補"係為術語，其指出充分程度的互補度，藉由此，在核酸分子與一靶定核酸分子之間發生穩定且特異性結合。兩個核酸分子之間的雜交涉及在該兩個核酸分子之核鹼基之間形成反平行排列比對。該兩分子然後能夠與相反股上相應的鹼基形成氫鍵，以形成一種雙聯體分子，假若其足夠穩定，則該雙聯體分子可以使用 本技藝中眾所周知的方法偵測。一種多核苷酸不需要100%的互補於其特異性雜交的靶定核酸。然而，必須存在使得雜交為特異性互補度的數量為所使用的雜交條件的函數。
引致特定程度嚴格度的雜交條件將取決於所抉擇的雜交方法的本性及雜交核酸之組成與長度，而有所不同。一般而言，雖然清洗的時間亦會影響嚴格度，但雜交溫度及雜交緩衝液的離子強度(尤其是Na+及/或Mg++濃度)將決定雜交的嚴格度。考慮要求的雜交條件、用於得到特定程度嚴格度的計算，對於該技藝中之一般技藝人士係為知悉的，且係討論於，舉例而言Sambrook等人(ed.)之Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989，第9及第11章；以及Hames與Higgins(eds.)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。關於核酸雜交進一步詳細的教學與引導可能於以下找到，舉例而言Tijssen，"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部，第2章，Elsevier,NY,1993；以及Ausubel等人，Eds.,Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
如於此所使用，"嚴格條件"含括條件，在該條件下雜交將只發生於如果該雜交分子序列與該靶定核酸分子 內的同源多核苷酸之間的失配低於20%時。"嚴格條件"包括進一步特定位準的嚴格度。因此，如於此所使用，"中嚴格度"條件係為分子有超過20%的序列不會雜交的那些條件；"高嚴格度"的條件係具有超過10%的失配的序列不會雜交的那些條件；以及"非常高嚴格度"的條件係具有超過5%的失配的序列不會雜交的那些條件。
下列為代表性、非限制性雜交條件。
高嚴格度條件(偵測到共享至少90%的序列同一性之多核苷酸)：5×SSC緩衝液中於65℃下雜交16小時；以2×SSC緩衝液中於室溫下清洗兩次，每次15分鐘；及在0.5×SSC緩衝液中於65℃下清洗兩次，每次20分鐘。中嚴格度條件(偵測到共享至少80%序列同一性之多核苷酸)：5x-6x SSC緩衝液中，於65-70℃雜交16-20小時；以2×SSC緩衝液中於室溫下洗滌兩次，每次5-20分鐘；以及以1x SSC緩衝液於55-70℃下洗滌兩次，每次30分鐘。非嚴格的控制條件(共享至少50%序列同一性之多核苷酸將雜交)：以6x SSC緩衝液於室溫至55℃雜交16-20小時；以2x-3x SSC緩衝液於室溫至55℃至少洗滌兩次，每次20-30分鐘。
如於此所使用，當就一核酸而言時，術語"實質上同源的"或"實質同源性"意指多核苷酸擁有的連續核鹼基，該者在嚴格條件之下雜交到參考核酸。舉例而言，實質上同源於序列辨識編號：1、2及4中任一者之參考核酸的核酸，係為在嚴格條件下(例如，前文陳述之中嚴格度條件)雜交至序列辨識編號：1、2及4中任一者之參考核酸的該等核酸者。 實質上同源的多核苷酸可能具有至少80%的序列同一性。舉例而言，實質上同源的多核苷酸可能具有從大約80%至100%之序列同一性，諸如79%；80%；約81%；約82%；約83%；約84%；約85%；約86%；約87%；約88%；約89%；約90%；約91%；約92%；約93%；約94%；約95%；約96%；約97%；約98%；約98.5%；約99%；約99.5%；及約100%。實質同源性之性質係密切相關於特異性雜交。舉例而言，當有足夠程度的互補度，一核酸分子係特異性地雜交，以避免核酸與非靶定多核苷酸在希望特異性結合的條件下，舉例而言在嚴格的雜交條件下，進行非特異性結合。
如於此所使用，術語"異種同源物(ortholog)"意指在兩種或更多物種中，一基因已經從一共同的祖先核酸演變，並可能在該兩種或更多物種中保留相同的功能。
如於此所使用，當在5'至3'方向讀取之多核苷酸的每一核苷酸係互補於另一多核苷酸在3'至5'方向中讀取的每一核苷酸時，兩個核酸分子被認為展示出"完整的互補度"。一種互補於參考多核苷酸的多核苷酸將展示出與該參考多核苷酸的反向互補物為同一的一序列。這些術語與說明在本技藝中係定義良好的，且本技藝之一般技藝人士將很容易理解。
可操縱地鏈接：當第一多核苷酸與該第二多核苷酸係在一功能關係中時，該第一多核苷酸係與該第二多核苷酸為可操縱地鏈接。當重組製造時，可操縱地鏈接的多核苷酸一般來說是連續的，且在必要時在相同的讀取框架 中(例如在一轉譯融合ORF中)要連結兩個蛋白質編碼區域。然而，核酸不必要被連續地操縱鏈接。
術語"可操縱地鏈接"，當參照一調控遺傳元素及一編碼多核苷酸使用時，意味著該調控元素影響該鏈接的編碼多核苷酸的表現。"調控元素"或"控制元素"意指多核苷酸，其影響該關聯的編碼多核苷酸之轉錄的時間及位準/數量、RNA加工或穩定性、或轉譯。調控元素可以包括啟動子；轉譯前導子；內含子；增強子；莖環結構；抑制子結合多核苷酸；具終止序列之多核苷酸；具聚腺苷酸識別序列之多核苷酸......等等。特定的調控元素可能位於可操縱地鏈接於此之編碼多核苷酸的上游及/或下游。還有，可操縱地鏈接於一編碼多核苷酸的特定調控元素，可能位於雙股核酸分子之關聯互補股上。
啟動子：如於此所使用，術語"啟動子"意指一種DNA區域，該區域可能在轉錄起始的上游，並可能涉及識別及結合RNA聚合酶與其它蛋白質以引發轉錄。一啟動子可能可操縱地鏈接至一編碼多核苷酸用於在細胞中表現，或者一啟動子可能可操縱地鏈接到編碼一訊號胜肽的多核苷酸，其中該訊號胜肽可能可操縱地鏈接到一編碼多核苷酸，用於在一細胞中表現。一種"植物啟動子"可能為能夠在植物細胞中引發轉錄的啟動子。在發育控制下的啟動子之例子包括啟動子其優先在某些組織中引發轉錄者，諸如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或是厚壁組織。此種啟動子係稱為"組織優先的"。僅在某些組織中引發轉 錄的啟動子被稱為"組織特異性"。一種"細胞類型特異性"啟動子主要在一種或多種器官中的某些細胞類型中驅動表現，舉例而言，在根或葉中的維管束細胞。一種"誘導型"啟動子可能為在環境控制之下的一種啟動子。可藉由誘導型啟動子引發轉錄之環境條件的例子包括厭氧條件及光的存在。組織特異性、組織優先的、細胞類型特異性及誘導型啟動子構成"非持續表現"型的啟動子。一種"持續表現型"啟動子為在大多數環境條件下，或在大多數組織或細胞類型中活耀的啟動子。
本發明之一些具體例中可以使用任何誘導型啟動子。參閱Ward等人之(1993)Plant Mol.Biol.22：361-366。藉由一種可誘導的啟動子，轉錄速率對一誘導劑的回應係提高的。示範性的誘導型啟動子包括，但不限於：源自於ACEI系統對銅回應的啟動子；源自於玉米、對苯磺醯胺除草劑安全劑回應的In2基因；源自於Tn10之Tet抑制子；以及源自於類固醇激素基因的可誘導啟動子，該者之轉錄活性可以藉由一種糖皮質類固醇激素(glucocorticosteroid hormone)來誘導(Schena等人之(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：0421)。
示範性的持續表現型啟動子包括，但不限於：來自植物病毒之啟動子，諸如來自花椰菜嵌紋病毒(Cauliflower Mosaic Virus)(CaMV)的35S啟動子；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pEMU；MAS；玉蜀黍(maize)H3組織蛋白啟動子；及ALS啟動子，Xba1/NcoI 片段5'至大油菜(Brassica napus)ALS3結構基因(或是類似於Xba1/NcoI片段之一種多核苷酸)(國際PCT公開案第WO96/30530號)。
此外，在本發明之一些實施例中可以利用任何組織特異性或組織優先的啟動子。以包含可操縱地鏈接至一種組織特異性啟動子之一編碼多核苷酸的核酸分子予以轉形之植物，可在特定組織中專有地，或優先地製造該編碼多核苷酸的產物。示範性的組織特異性或組織優先性的啟動子包括，但不限於：一種子優先啟動子，諸如源自菜豆蛋白(phaseolin)基因之該者；一葉特異性及光誘導的啟動子，諸如源自cab或核酮糖雙磷酸羧化酶(rubisco)之該者；一花藥特異性啟動子，諸如源自LAT52之該者；一花粉特異性啟動子，諸如源自Zm13之該者；及一孢子優先性啟動子，諸如源自apg之該者。
大豆植物：如於此所使用，術語"大豆植物"意指一種大豆屬(Glycine)物種的植物；舉例而言大豆(G.max)。
轉形：如於此所使用，術語"轉形"或"轉導"意指一種或多種核酸分子(等)進入一細胞之轉移作用。藉由一核酸分子轉導至該細胞，無論是藉由將該核酸分子併入該細胞基因組中，或藉由游離基因體複製，而使該核酸分子變成穩定而由細胞複製時，則一細胞係"轉形"的。如於此所使用的，術語"轉形"含括可以將一核酸分子引入至此一細胞中的所有技術。例子包括但是不限於：以病毒載體轉染；以質體載體轉形；電穿孔(Fromm等人之(1986)Nature 319： 791-3)；脂質體轉染法(lipofection)(Felgner等人之(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7)；顯微注射(Mueller等人之(1978)Cell 15：579-85)；農桿菌(Agrobacterium)媒介的轉移(Fraley等人之(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)；直接DNA攝取；以及基因槍法(microprojectile bombardment)(Klein等人之(1987)Nature 327：70)。
轉基因：一種外源性核酸序列。在一些例子中，一種轉基因可以為一DNA，該者編碼能夠形成dsRNA分子之一股或兩股RNA，該者包含一多核苷酸其互補於在鞘翅目害蟲中找到的一核酸分子。在進一步的例子中，一轉基因可能為反義多核苷酸，其中該反義多核苷酸之表現會抑制一靶定核酸之表現，藉此產生親代RNAi的表型。在再進一步的例子中，一轉基因可能為一基因(例如一除草劑耐受性基因、一基因其編碼在工業上或藥學上有用的化合物、或一基因其編碼一所欲的農業性狀)。在這些及其他例子中，一轉基因可能含有調控元素其可操縱地鏈接該轉基因的編碼多核苷酸(例如一啟動子)。
載體：一種核酸分子，當其引入至一細胞時，舉例而言，會產生一轉形細胞。一種載體可能包括容許其在該宿主細胞中複製的遺傳元素，諸如複製起點。載體的例子包括，但不限於：一質體；黏質體；噬菌體；或病毒，其攜帶外源DNA進入一細胞中。一載體還可能包括一種或多種基因，包括產生反義分子者，及/或可選擇的標記基因以及在該技藝中所知悉的其他遺傳元素。一載體可能轉導、 轉形、或感染一細胞，從而造成該細胞表現由該載體所編碼的核酸分子及/或蛋白質。一載體選擇性地包括協助實現該核酸分子進入細胞的物質(例如脂質體、蛋白質塗層......等等)。
產量：大約100%或更大的穩定產量係相對於檢查品種(check variety)在相同生長位置，於相同時間及相同條件下生長。在特定具體例中，"改良產量"或"改善產量"意味相對於檢查品種的產量，具有105%或更大的穩定產量之一栽培種，該者係在相同生長位置含有顯著密度傷害該作物之鞘翅目害蟲，於相同時間且在相同條件下生長，其為本文之組成物及方法靶定的。
除非具體地指出或暗示，否則術語"一(a)"、"一(an)"及"該"表示"至少一個"，如於此所使用。
除非另有具體解釋，否則於此所使用的所有技術與科學術語具有相同的含義，如同此揭露內容所屬之技藝的一般技藝人士所普遍理解者。分子生物學常用術語的定義可見於，舉例而言，如Lewin的Genes X,Jones & Bartlett Publishers,2009(ISBN 10 0763766321)；Krebs等人(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Meyers R.A.(ed.),Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。所有的百分數皆以重量計，且所有溶劑混合物之比例皆以體積計，除非另有指出。所有的溫度均為 攝氏度。
IV.包含鞘翅目害蟲多核苷酸之核酸分子 A.概述
於此所描述係為對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子。所描述的核酸分子包括靶定的多核苷酸(例如，天然基因及非編碼多核苷酸)、dsRNAs、siRNAs、shRNA、hpRNAs及miRNAs。舉例而言，dsRNAs、siRNA、miRNA、shRNA及/或hpRNA分子係描述於一些具體例中，該等者可能特異性地互補於鞘翅目害蟲中一種或多種天然核酸之全部或部分。在這些及進一步具體例中，該(等)天然核酸可能為一種或多種靶定基因(等)，該者之產物可能為，舉例而言但不限於：涉及生殖過程或涉及幼蟲發育。於此所描述之核酸分子，當引入(舉例而言，經由親代傳遞)至包含與該核酸分子特異性地互補的至少一個天然核酸(等)之細胞時，可能引發該細胞中的RNAi，且因此降低或是消除該(等)天然核酸的表現。在一些例子中，一種靶定基因藉由特異性地互補於其等之核酸分子而降低或消除其之表現，可能會引致該鞘翅目害蟲之生殖，及/或該害蟲的後代之生長、發育及/或取食的減少或是停止。此等方法可以顯著地減少侵擾中的後續害蟲世代的規模，舉例而言，但不會直接導致接觸該iRNA分子之害蟲的死亡。
在一些具體例中，可以選擇一種鞘翅目害蟲中的至少一種靶定基因，其中該靶定基因包含一種克魯拜爾(kruppel)多核苷酸。在特定例子中，選擇一種鞘翅目害蟲 中的一種靶定基因，其中該靶定基因包含一種選自於下列之中的多核苷酸：序列辨識編號：1、2及4。
西方玉米根蟲克魯拜爾(kruppel)表示一序列1617bp(序列辨識編號：1)、1640bp(序列辨識編號：2)，以及371個胺基酸(克魯拜爾蛋白質(序列辨識編號：3))。於此序列內，預測四個H2C2型鋅指領域係位在胺基酸位置162-186、189-213、217-241，以及246-269，一致於其作為DNA結合轉錄因子之角色。參閱，例如Zuo(1991)Genes Dev 5：254-64。當使用BLASTp演算法於NCBI資料庫中搜尋時，最相似的序列為源自擬穀盜(Tribolium castaneum)，以及該序列只展現出65百分比序列同一性(NP_001034527.2)。
在一些具體例中，一靶定基因可為包含一種多核苷酸之核酸分子，該多核苷酸可以電腦模擬(in silico)反向轉譯成一種多肽，該多肽含有的連續胺基酸序列係至少約85%同一於(例如至少84%、85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%、或100%同一於)一種克魯拜爾多核苷酸的蛋白質產物之胺基酸序列。一種靶定基因可能為鞘翅目害蟲中任何的核酸，該者之轉錄後抑制對於該害蟲生產活的子代之能力有不利的效果，舉例來說以提供植物防護的益處來對抗害蟲。在特定的例子中，一種靶定基因為一種包含一多核苷酸之核酸分子，該多核苷酸可以電腦模擬(in silico)而反轉譯成一種包含連續胺基酸序列之多肽，該胺基酸序列係至少大約85%同一於、大約90%同一於、大約95%同一於、大約96%同一於、大約97%同一 於、大約98%同一於、大約99%同一於、大約100%同一於、或是100%同一於序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2(例如序列辨識編號：3)之電腦模擬(in silico)轉譯產物之胺基酸序列。
一些具體例中提供了DNA，該者的表現將引致一種包含一多核苷酸的RNA分子，該多核苷酸特異性地互補於一種鞘翅目害蟲中的一編碼多核苷酸所編碼的天然RNA分子之全部或部分。在一些具體例中，在一種鞘翅目害蟲攝入該表現的RNA分子之後，在該害蟲細胞或該害蟲的後代細胞之中可得到編碼多核苷酸的向下調控。在特定具體例中，在該鞘翅目害蟲細胞中編碼多核苷酸的向下調控可能引致該害蟲之生殖及/或繁殖，及/或該害蟲的後代之生長、發育及/或取食的減少或是停止。
在一些具體例中，靶定的多核苷酸包括轉錄的非編碼RNA序列，諸如5'UTRs；3'UTRs；剪接前導子；內含子；末端內含子(outron)(例如隨後在反式剪接中修飾的5'UTR RNA)：供體子(donatron)(例如提供供體序列用於反式剪接所要求的非編碼RNA)；及靶定鞘翅目害蟲基因的其他非編碼轉錄RNA。此種多核苷酸可能衍自於單順反子(mono-cistronic)與聚-順反子基因兩者。
因而，於此有關一些具體例亦描述iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs、shRNA及hpRNAs)，該者包含特異性互補於在鞘翅目害蟲中一靶定核酸之全部或部分的至少一種多核苷酸。在一些具體例中，一種iRNA分子 可能包含多核苷酸(等)，其等互補於數個靶定核酸之全部或部分；舉例而言，2、3、4、5、6、7、8、9、10個、或更多個靶定核酸。在特定具體例中，iRNA分子可能在活體外製造，或藉由一基因改造生物體在活體內製造，諸如一植物或一細菌。亦揭露的是cDNA，其可能使用於dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子及/或hpRNA分子之製造，該等係特異性地互補於鞘翅目害蟲中一靶定核酸的全部或部分。進一步描述的為重組DNA建構物，供實現特定宿主標靶之穩定轉形使用。經轉形的宿主標靶可能從該重組DNA建構物表現有效位準的dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及/或hpRNA分子。所以，亦描述一種植物轉形載體，該者包含可操縱地鏈接至植物細胞中有作用的異源性啟動子的至少一種多核苷酸，其中該(等)多核苷酸的表現引致一種RNA分子，該RNA分子包含一列連續的核鹼基，其特異性互補於一種鞘翅目害蟲中一靶定核酸的全部或部分。
在特定例子中，對控制鞘翅目害蟲有用的核酸分子可能包括：從葉甲屬(Diabrotica)所單離的天然核酸之全部或部分，其包含一種克魯拜爾多核苷酸(例如，序列辨識編號：1及2中任一者)；DNAs，當表現時引致一種包含一多核苷酸之RNA分子，該多核苷酸特異性互補於克魯拜爾所編碼之天然RNA分子的全部或部分；iRNA分子(例如dsRNAs、siRNAs、miRNAs、shRNA及hpRNAs)，其包含至少一多核苷酸，該者係特異性互補於克魯拜爾所編碼之RNA分子的全部或部分；cDNA序列，其可以使用於生產 dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子及/或hpRNA分子，該等分子特異性互補於克魯拜爾所編碼之RNA分子之全部或部分；以及在實現特定宿主標靶之穩定轉形所使用的重組DNA建構物，其中一經轉形宿主標靶包含一個或多個前述的核酸分子。
B.核酸分子
本發明提供，在其他事物之外，iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及hpRNA)分子，該者抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現；以及DNA分子，該者能夠在一細胞或微生物中表現為iRNA分子，以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現。
本發明之一些具體例提供一種經單離的核酸分子，該者包含選自於下列所組成的群組之至少一個(例如，一個、二個、三個、或更多個)多核苷酸：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1的互補物；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2的互補物；序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2的至少15個連續核苷酸(例如至少19個連續核苷酸)的片段(例如序列辨識編號：4)；序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2的至少15個連續核苷酸的片段之互補物；一種葉甲(Diabrotica)生物體(例如WCR)之天然的編碼多核苷酸，其包含序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2；一種葉甲生物體之天然的編碼多核苷酸之互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2；一種葉甲 生物體之天然編碼多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2；以及一種葉甲生物體之天然編碼多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2。在特定具體例中，一種鞘翅目害蟲接觸或攝取該經單離的多核苷酸抑制了該害蟲的生長、發育、生殖及/或取食。
於一些具體例中，本發明之經單離的核酸分子可以包含選自於下列所組成的群組之至少一個(例如，一個、二個、三個、或更多個)多核苷酸：序列辨識編號：67；序列辨識編號：67之互補物；序列辨識編號：68；序列辨識編號：68之互補物；序列辨識編號：69；序列辨識編號：69之互補物；序列辨識編號：67-69之任一者的至少15個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：67-69之任一者的至少15個連續核苷酸的片段之互補物；一種於葉甲生物體內從一基因轉錄之天然的多核苷酸，該天然的多核苷酸包含：序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2；一種於葉甲生物體內從一基因轉錄之天然的多核苷酸之互補物，該天然的多核苷酸包含：序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2；一種於葉甲生物體內從一基因轉錄之天然的多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段，該天然的多核苷酸包含：序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2；以及一種於葉甲生物體內從一基因轉錄之天然的多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然的多核苷酸包含：序列辨識編號： 1及/或序列辨識編號：2。在特定具體例中，一種鞘翅目害蟲接觸或攝取該經單離的多核苷酸抑制了該害蟲的生長、發育、生殖及/或取食。
在其他的具體例中，本發明的核酸分子可包含至少一(例如一、二、三或更多)DNA(等)，該者能夠在一細胞或微生物中表現為iRNA分子，以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現。此(等)DNA可能可操縱地鏈接到在包含該DNA分子之細胞中作用的啟動子，以引發或增強能夠形成dsRNA分子(等)之編碼的RNA之轉錄作用。在一個具體例中，該至少一(例如一、二、三、或更多)DNA(等)可衍生自序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之多核苷酸。序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之衍生物，包括序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之片段。在一些具體例中，此種片段可能包含，舉例而言序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之至少大約15個連續核苷酸，或其等之互補物。因此，此種片段可能包含，舉例而言：序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200或更多個連續的核苷酸，或是其等之互補物。在一些實例中，此種片段可能包含，舉例而言序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之至少19個連續核苷酸(例如19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30個連續核苷酸)，或是其等之互補物。
特定的具體例包含引入部分或完全穩定的dsRNA分子到一種鞘翅目害蟲中，以抑制一靶定基因在該鞘翅目害蟲之細胞、組織或器官中的表現。當表現為一種iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及hpRNA)，並由一種鞘翅目害蟲攝取時，含有序列辨識編號：1及2任一者的一個或多個片段及其等之互補物的多核苷酸，可能造成鞘翅目害蟲死亡、發育停止、生長抑制、性別比例變化、窩卵數(brood size)的縮小、停止感染及/或停止取食之一者或多者。在特定例子中，含有序列辨識編號：1及2任一者的一個或多個片段及其等之互補物之多核苷酸(例如包括約15個至約300個核苷酸之多核苷酸)，會造成害蟲現存一代生產後續世代害蟲的能力降低。
在某些具體例中，本發明所提供的dsRNA分子包含互補於來自一靶定基因之轉錄本之多核苷酸，該靶定基因包含序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2，及/或互補於序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2的片段之多核苷酸，該靶定基因在一種鞘翅目害蟲中的抑制作用引致對該害蟲或該害蟲後代之生長、發育、或其他生物功能必要的多肽或多核苷酸劑的降低或移除。一選擇的多核苷酸可以對下列展現出從約80%至約100%的序列同一性：序列辨識編號：1、2及/或4，序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之連續片段，或前述任一者之互補物。舉例而言，一選定的多核苷酸對下列可展現出79%；80%；約81%；約82%；約83%；約84%；約85%；約86%；約87%；約88%；約89%； 約90%；約91%；約92%；約93%；約94%；約95%；約96%；約97%；約98%；約98.5%；約99%；約99.5%；或約100%的序列同一性：序列辨識編號：1、2及/或4，序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之連續片段，或前述任一者之互補物。
在一些具體例中，一種能夠在細胞或微生物中表現如一種iRNA分子以抑制靶定基因表現的DNA分子，可能包含一單一多核苷酸，其係特異性地互補於一種或多種靶定鞘翅目害蟲物種中發現之一種天然多核苷酸的全部或部分，或是該DNA分子可以從數個這種特異性地互補的多核苷酸而建構為一種嵌合體(chimera)。
在任擇的具體例中，一核酸分子可能包含由一種"鏈接子"分隔的第一及第二多核苷酸。一鏈接子可能為一區域，其包含當所欲時在該第一及第二多核苷酸之間促進二級結構形成的任何核苷酸序列。在一具體例中，該鏈接子係為mRNA之意義或反義編碼多核苷酸的一部分。該鏈接子可能任擇地包含能夠共價鏈接至一核酸分子的核苷酸或其等之同源的任何組合。在一些具體例中，該鏈接子可以包含一內含子(例如作為ST-LS1內含子)。
舉例而言，在一些具體例中，該DNA分子可能包含一種編碼一種或多種不同的RNA分子之多核苷酸，其中該不同的RNA分子每一者包含一第一多核苷酸及一第二多核苷酸，其中該第一及第二多核苷酸係彼此互補的。該第一及第二多核苷酸可藉由一鏈接子而在一種RNA分子內連 接。該鏈接子可能構成該第一多核苷酸或該第二多核苷酸的一部分。包含該第一及第二核苷酸多核苷酸之RNA分子的表現可能導致本發明之dsRNA分子的形成，藉由該第一及第二核苷酸多核苷酸之特異性分子內鹼基配對。該第一多核苷酸或該第二多核苷酸可能為實質上同一於一種鞘翅目害蟲天然的多核苷酸(例如一靶定基因，或轉錄的非編碼多核苷酸)、其等之衍生物或互補於此的多核苷酸。
dsRNA核酸分子包含雙股的聚合核糖核苷酸，且可能包括對該磷酸糖主幹或核苷任一的修飾。可以打造RNA結構中的修飾以允許特定的抑制。在一具體例中，dsRNA分子可以透過無處不在的酶促過程修飾，以便可以生成siRNA分子。此酶促過程可能利用一種核糖核酸酶III酵素，諸如真核生物中之DICER，在活體外或活體內進行。參閱Elbashir等人之(2001)Nature 411：494-8；及Hamilton與Baulcombe(1999)Science 286(5441)：950-2。DICER或功能均等的核糖核酸酶III酵素切割較大的dsRNA股及/或hpRNA分子成為較小的寡核苷酸(例如siRNA)，其中每一者的長度係為約19-25個核苷酸。由這些酵素所產生之siRNA分子具有2至3個核苷酸之3'突出端，及5'磷酸酯末端與3'羥基末端。藉由核糖核酸酶III酵素生成之siRNA分子在細胞中解開並分開為單股RNA。然後該siRNA分子與一靶定基因轉錄的RNA進行特異性地雜交，而兩個RNA分子隨後係藉由一種固有的細胞RNA降解機制而降解。此過程可能引致該靶定基因編碼之RNA在該靶定生物體中的有效降解或 移除。結果係該靶定基因的轉錄後靜默。在一些具體例中，從異源性核酸分子透過內源性核糖核酸酶III酵素所產生的siRNA分子可以有效地媒介鞘翅目害蟲中靶定基因的向下調控。
在一些具體例中，本發明之一種核酸分子可以包括至少一非天然存在的多核苷酸，該者可以轉錄成能夠透過分子間雜交而在活體內形成dsRNA分子的一單股RNA分子。此種dsRNA典型地自組裝，且可以在一種鞘翅目害蟲營養源中提供，以實現一靶定基因的轉錄後抑制。在這些及進一步具體例中，本發明之核酸分子可以包含兩種不同的非天然存在的多核苷酸，其中每一者係特異性地互補於在一種鞘翅目害蟲中不同的靶定基因。當此一核酸分子係以一種dsRNA分子提供至一鞘翅目害蟲時，該dsRNA分子抑制害蟲中至少兩種不同的靶定基因之表現。
C.獲得核酸分子
可以使用鞘翅目害蟲中的各種多核苷酸做為用於設計本發明之核酸分子的標靶，諸如iRNAs及編碼iRNA之DNA分子。然而，天然多核苷酸之選擇係非直截了當的過程。在鞘翅目害蟲中僅有很小數目的天然多核苷酸會是有效的標靶。舉例而言，無法確實的預測一特定的天然多核苷酸是否可以藉由本發明之核酸分子有效地向下調控，或者一特定天然多核苷酸的向下調控是否將在鞘翅目害蟲之生長、活力、繁殖及/或生殖上具有不利的效果。絕大多數的天然鞘翅目害蟲多核苷酸，諸如由此分離的EST(舉例 而言，於美國專利第7,612,194號中所列出之鞘翅目害蟲多核苷酸)，在害蟲的生長、活力、繁殖及/或生殖上不具有不利的效果。該等天然多核苷酸何者可能在鞘翅目害蟲具有不利的效果，能夠在重組技術中使用用於在宿主植物中表現互補於此種天然多核苷酸的核酸分子，並且依靠取食在害蟲上提供不利的效果而不會對宿主植物造成危害，兩者皆為不可預測的。
在一些具體例中，本發明之核酸分子(例如在鞘翅目害蟲之宿主植物中提供的dsRNA分子)係被選擇以靶定cDNA，其編碼對鞘翅目害蟲生殖及/或發育必要之蛋白質或部分的蛋白質，諸如涉及代謝或分解生化途徑、細胞分裂、生殖、能量代謝、胚胎發育、幼蟲發育、轉錄調控、及之類的多肽。如於此所描述，一種靶定生物體攝入含有一個或多個dsRNA的組成物，其中該一個或多個dsRNA中至少一區段係特異性地互補於該靶定害蟲生物體細胞中製造的至少實質上同一的RNA區段，可以引致交配、產卵或是生產活的後代能力的失敗或減少。一種衍生自鞘翅目害蟲之多核苷酸，DNA或RNA任一，可以使用以建構抗害蟲侵擾的植物細胞。該鞘翅目害蟲的宿主植物(例如玉蜀黍(Z.mays))，舉例而言，可以經轉形以含有如於此所提供、衍生自鞘翅目害蟲的一個或多個多核苷酸。轉形到宿主的多核苷酸可以編碼一個或多個RNA，其在該轉形宿主之內的細胞或生物液中形成一種dsRNA結構，因此假若/當該害蟲與該基因轉殖宿主形成一種營養關係時，可獲得該dsRNA。 此可能引致該害蟲細胞中一個或多個基因表現的箝制，以及最終抑制生殖及/或發育。
因此，在一些具體例中，一種本質上涉及一種鞘翅目害蟲的生長、發育及生殖之基因係為靶定的。其他在本發明中使用的靶定基因可能包括，舉例而言，那些在鞘翅目害蟲之活力、運動、移動、遷移、生長、發育、感染性及取食部位建立中扮演重要角色者。一種靶定基因因而可能為一種管家基因(housekeeping gene)或一種轉錄因子。此外，在本發明中使用之天然鞘翅目害蟲多核苷酸亦可能衍自於一植物、病毒、細菌或昆蟲基因的同源物(例如異種同源物(ortholog))，該者之功能對熟習該項技藝者係為知悉的，且該者之多核苷酸與靶定鞘翅目害蟲之基因組中的靶定基因係特異性地雜交的。用一種已知核苷酸序列、藉由雜交來辨識基因之同源物的方法對熟習該項技藝人士係知悉的。
在一些具體例中，本發明提供用於獲得一核酸分子的方法，該核酸分子包含用於製造iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及hpRNA)分子之多核苷酸。一個這樣的具體例包含：(a)依靠dsRNA-媒介基因箝制，分析一個或多個靶定基因(等)在鞘翅目害蟲中的表現、功能及表型；(b)以一探針探測cDNA或gDNA庫，其中該探針包含源自靶定鞘翅目害蟲之多核苷酸的全部或部分或其等之同源物，該核苷酸序列的全部或部分或其等之同源物在dsRNA-媒介的箝制分析中展示改變(例如降低)的生殖或發育表型；(c) 辨識與該探針特異性雜交之DNA選殖體；(d)單離在步驟(b)中辨識之該DNA選殖體；(e)定序包含在步驟(d)中單離之該選殖體的cDNA或gDNA片段，其中該經定序的核酸分子包含全部或大部分的RNA序列或其等的同源物；及(f)化學合成一基因或siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA或dsRNA的全部或大部分。
在進一步具體例中，一種用於獲得一核酸片段的方法，該核酸片段包含用於製造大部分的iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及hpRNA)分子的多核苷酸，該方法包括：(a)合成第一及第二寡核苷酸引子，其特異性地互補於源自一種靶定鞘翅目害蟲的天然多核苷酸之一部分；以及(b)使用步驟(a)之該第一及第二寡核苷酸引子來擴增一種選殖載體中存在的cDNA或是gDNA插入子，其中該經擴增的核酸分子包含大部分的siRNA、miRNA、hpRNA、mRNA、shRNA或是dsRNA分子。
本發明之核酸可以藉由許多方法予以單離、擴增或產生。舉例而言，一種iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及hpRNA)分子可能藉由PCR擴增一種衍生自gDNA或cDNA庫的靶定多核苷酸(例如一靶定基因或一靶定轉錄的非編碼多核苷酸)，或其等之部分而獲得。DNA或RNA可能從一靶定生物體萃取，且核酸庫可能使用該技藝一般技藝人士所知悉的方法由此而製備。從一靶定生物體生成之gDNA或cDNA庫可以使用於PCR擴增及靶定基因之定序。已確認的PCR產物可以使用做為一模板，用於以最小啟動 子(minimal promoter)在活體外轉錄以生成意義及反義RNA。或者，核酸分子可能藉由許多技術的任一者予以合成(參閱，例如Ozaki等人之(1992)Nucleic Acids Research,20：5205-5214；及Agrawal等人之(1990)Nucleic Acids Research,18：5419-5423)，包括使用一種自動DNA合成儀(舉例而言，P.E.Biosystems公司(加州福斯特城)之392或394型DNA/RNA合成儀)，使用標準化學品，諸如亞磷醯胺(phosphoramidite)化學品。參閱，例如，Beaucage等人之(1992)Tetrahedron,48：2223-2311；美國專利第4,980,460號、第4,725,677號、第4,415,732號、第4,458,066號及第4,973,679號。亦可以採用引致非天然主幹基團之任擇的化學品，諸如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)及之類。
本發明之RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA或hpRNA分子可能由熟習該項技藝者透過手動或自動反應予以化學或酶促製造，或在活體內於包含一種核酸分子的細胞中製造，該核酸分子包含編碼該RNA、dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA或hpRNA分子之多核苷酸。RNA亦可以藉由部分或總有機合成予以製造；任何修飾的核糖核苷酸可以藉由活體外酶促或是有機合成來引入。一種RNA分子可以藉由一細胞RNA聚合酶或一噬菌體RNA聚合酶(例如T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶及SP6 RNA聚合酶)予以合成。對多核苷酸之選殖及表現有用的表現建構物在本技藝中係已知的。參閱，例如國際PCT公開案第WO97/32016號；以 及美國專利第5,593,874號、第5,698,425號、第5,712,135號、第5,789,214號及第5,804,693號。化學合成或藉由活體外酶促合成的RNA分子可能在引入到一細胞之前純化。舉例而言，RNA分子可以藉由以一溶劑或樹脂予以提取、沈澱、電泳法、色層分析法，或其等之一組合，而從一混合物中純化。或者，化學合成或藉由活體外酶促合成的RNA分子可能沒有純化或最小純化而使用，舉例而言，以避免因為樣本處理的損失。該RNA分子可能乾燥用於儲存，或溶解在一水溶液中。該溶液可以含有緩衝液或鹽類以促進dsRNA分子雙聯體股的黏合，及/或穩定。
在特定的具體例中，一種dsRNA分子可能由一種單一的自我互補RNA股或從兩個互補的RNA股予以形成。dsRNA分子可能在活體內或在活體外合成。一種細胞內源性RNA聚合酶可能媒介一種或兩種RNA股在活體內的轉錄，或是可使用選殖的RNA聚合酶以媒介活體內或活體外的轉錄。在一種鞘翅目害蟲中靶定基因的轉錄後抑制可能為宿主靶定的，其係藉由在該宿主之一器官、組織或細胞類型中的特異性轉錄(例如藉由使用一種組織特異性啟動子)；該宿主中環境條件的刺激(例如藉由使用對感染、壓力、溫度及/或化學誘導劑回應的一種誘導型啟動子)；及/或於該宿主之發育階段或年齡的遺傳工程轉錄(例如藉由使用發育階段特異性啟動子)。無論在活體外或活體內轉錄，形成dsRNA分子的RNA股可能或可能不能夠予以多腺苷酸化，且可能或可能不能藉由細胞的轉譯裝置予以轉譯成多肽。
D.重組載體及宿主細胞轉形
在一些具體例中，本發明亦提供一種DNA分子，用於引入至一細胞中(例如一細菌細胞、酵母細胞或植物細胞)，其中該DNA分子包含一種多核苷酸，該多核苷酸一旦表現成RNA且由鞘翅目害蟲攝入，便在該害蟲之細胞、組織或器官中實現靶定基因的箝制。因此，一些具體例提供一種重組核酸分子，其包含能夠在一植物細胞中表現為一種iRNA(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及hpRNA)分子的多核苷酸，以抑制靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現。為了引發或增強表現，此種重組的核酸分子可能包含一種或多種調控元素，該調控元素可以可操縱地鏈接到能夠表現為iRNA之多核苷酸。在植物中表現一種基因箝制分子的方法係為已知的，且可能使用來表現本發明之一種多核苷酸。參閱，例如國際PCT公開案第WO06/073727號；以及美國專利公開案第2006/0200878 A1號)。
在特定具體例中，本發明之一種重組DNA分子可以包含一種多核苷酸，其編碼可能形成一種dsRNA分子的RNA。此種重組DNA分子可以編碼會形成dsRNA分子之RNA，該者一旦攝入，能夠抑制鞘翅目害蟲細胞中內源性靶定基因(等)之表現。在許多具體例中，轉錄的RNA可以形成一種dsRNA分子，其可以穩定形式來提供；例如以一髮夾及莖環結構。
在一些具體例中，一種dsRNA分子之一股可以藉由從一種多核苷酸轉錄而形成，該多核苷酸實質上係同源 於選自於下列所組成的群組之多核苷酸所編碼的RNA：序列辨識編號：1、2及4；序列辨識編號：1、2及/或4之互補物；序列辨識編號：1，序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：4之至少15個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：1，序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：4之至少15個連續核苷酸的片段之互補物；一種葉甲生物體(例如，WCR)之天然編碼多核苷酸，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1、2及/或4；一種葉甲生物體之天然編碼多核苷酸之互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1、2及/或4；一種葉甲生物體之天然編碼多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1、2及/或4；以及一種葉甲生物體之天然編碼多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1、2及/或4。
在特定具體例中，一種編碼能形成dsRNA分子之RNA的重組DNA分子可以包含一編碼區域，其中至少二種多核苷酸係配置成為藉此，相對於至少一啟動子，一種多核苷酸係處於意義定向(sense orientation)，且另一種多核苷酸係處於在反義定向，其中該意義多核苷酸與該反義多核苷酸係藉由例如，從約五(~5)至約一千(~1000)個核苷酸的鏈接子予以鏈接或連接。該鏈接子可以在該意義及反義多核苷酸之間形成一個環。該意義多核苷酸或該反義多核苷酸可能實質上同源於一靶定基因所編碼之RNA(例如一種含有序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之克魯拜爾基 因)，或其等之片段。然而，在一些具體例中，一種重組DNA分子可以編碼一種能形成dsRNA分子之RNA但不具鏈接子。在具體例中，一意義編碼多核苷酸及一反義編碼多核苷酸的長度可能不同。
辨識為在鞘翅目害蟲上具有不利影響，或就該鞘翅目害蟲而言具有植物防護效果者之多核苷酸，可以透過在本發明的重組核酸分子中創造適當的表現卡匣(expression cassette)而輕易地併入被表現的dsRNA分子內。舉例而言，此種多核苷酸可以表現為具有莖環結構之髮夾，其係藉由取得第一區段，其係相應於一靶定基因多核苷酸所編碼之RNA(例如一種克魯拜爾基因，其含有序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2，及其等之片段(序列辨識編號：4))；將此多核苷酸鏈接至不同源或不互補於該第一區段的第二區段鏈接子區域；以及將此鏈接至第三區段，其中該第三區段的至少一部分係實質上互補於該第一區段。此一建構物藉由該第一區段與該三區段的分子內鹼基對而形成一種莖環結構，其中該環結構形成包含該第二區段。參閱，例如美國專利公開案第2002/0048814號及第2003/0018993號；以及國際PCT專利公開案第WO94/01550號及第WO98/05770號。一種dsRNA分子可能生成為，舉例而言雙股結構形式，諸如莖環結構(例如髮夾)，從而由於靶定基因的片段之共同表現於譬如額外的植物表現卡匣上，而使靶定天然鞘翅目害蟲多核苷酸的siRNA之製造提升，該者導致增強的siRNA生產，或降低甲基化，以防止該dsRNA髮夾啟 動子的轉錄基因靜默作用。
本發明之某些具體例包括引入本發明之一種重組核酸分子到一植物內(亦即轉形)，以實現一種或多種iRNA分子表現之鞘翅目害蟲防護的位準。一種重組DNA分子可以為，舉例而言，一載體，諸如一線形或一環狀閉合質體。載體系統可能為一種單一載體或質體，或二個或多個一起含有要引入宿主基因組內之總DNA的載體或質體。此外，載體可能為一表現載體。本發明之核酸可以，舉例而言，適當地插入到在一種於合適啟動子控制下的載體之內，其中該啟動子係在一種或多種宿主中作用以驅動鏈接的編碼多核苷酸或其它DNA元素的表現。許多載體可用於此目的，而適當載體之選擇主要將取決於要插入到該載體的核酸大小，及該載體要轉形的特定宿主細胞。每一載體取決其功能(例如擴增DNA或表現DNA)及其相容的特定宿主細胞，而含有各種組份。
為了傳遞鞘翅目害蟲防護性至一基因轉殖植物，一種重組DNA可以在重組植物的組織或流體內，舉例而言，轉錄成一種iRNA分子(例如會形成一種dsRNA分子的RNA分子)。一種iRNA分子可以包含一種多核苷酸，該多核苷酸實質上同源且特異性地雜交至可能會造成宿主植物物種損害之鞘翅目害蟲之內相應的轉錄多核苷酸。該鞘翅目害蟲可以舉例而言，藉由攝入包含該iRNA分子之基因轉殖宿主植物的細胞或流體，而接觸在該基因轉殖宿主植物細胞中轉錄的iRNA分子。因此，侵擾該基因轉殖宿主植物之鞘翅 目害蟲內的靶定基因表現係由iRNA分子予以箝制。在一些具體例中，靶定基因在該靶定鞘翅目害蟲中表現的箝制作用可能引致該植物能抵抗該害蟲的攻擊。
為了能夠遞送iRNA分子到與本發明重組核酸分子業已轉形之植物細胞為營養關係之一種鞘翅目害蟲，必須能在該植物細胞中表現(亦即，轉錄)iRNA分子。因此，一種重組核酸分子可能包含本發明的多核苷酸，其可操縱地鏈接到在宿主細胞內作用之一個或多個調控元素，諸如於宿主細胞諸如細菌細胞中作用的異源性啟動子元素，其中該核酸分子係予以擴增，及該核酸分子係被表現於一植物細胞中。
適合在本發明之核酸分子中使用的啟動子包括那些誘導型、病毒、合成，或持續表現型，在本技藝中全部係為眾所周知的。說明此種啟動子之非限制性例子包括美國專利第6,437,217號(玉蜀黍(maize)RS81啟動子)；第5,641,876號(水稻肌動蛋白啟動子)；第6,426,446號(玉蜀黍(maize)RS324啟動子)；第6,429,362號(玉蜀黍(maize)PR-1啟動子)；第6,232,526號(玉蜀黍(maize)A3啟動子)；第6,177,611號(持續表現型玉蜀黍(maize)啟動子)；第5,322,938號、第5,352,605號、第5,359,142號及第5,530,196號(CaMV 35S啟動子)；第6,433,252號(玉蜀黍(maize)L3油膜蛋白(oleosin)啟動子)；第6,429,357號(水稻肌動蛋白2啟動子及水稻肌動蛋白2內含子)；第6,294,714號(光誘導型啟動子)；第6,140,078號(鹽誘導型啟動子)；第6,252,138號(病原 誘導型啟動子)；第6,175,060號(缺磷誘導型啟動子)；第6,388,170號(雙向啟動子)；第6,635,806號(γ-醇溶蛋白(coixin)啟動子)；及美國專利公開案第2009/757,089號(玉蜀黍(maize)葉綠體醛醇縮酶啟動子)。額外的啟動子包括胭脂鹼(nopaline)合成酶(NOS)啟動子(Ebert等人之(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16)：5745-9)及章魚鹼合成酶(OCS)啟動子(該等係於農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)之腫瘤誘導質體上實行)；花椰菜嵌紋病毒(caulimovirus)啟動子，諸如花椰菜嵌紋病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)19S啟動子(Lawton等人之(1987)Plant Mol.Biol.9：315-24)；CaMV 35S啟動子(Odell等人之(1985)Nature 313：810-2)；玄參花嵌紋病毒(figwort mosaic virus)35S-啟動子(Walker等人之(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19)：6624-8)；蔗糖合成酶啟動子(Yang及Russell之(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4144-8)；R基因複合體啟動子(Chandler等人之(1989)Plant Cell 1：1175-83)；葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子；CaMV 35S(美國專利第5,322,938號、第5,352,605號、第5,359,142號及第5,530,196號)；FMV 35S(美國專利第6,051,753號及第5,378,619號)；PC1SV啟動子(美國專利第5,850,019號)：SCP1啟動子(美國專利第6,677,503號)；及AGRtu.nos啟動子(GenBank®登錄號V00087；Depicker等人之(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561-73；Bevan等人之(1983)Nature 304：184-7)。
在特定具體例中，本發明之核酸分子包含一種組 織特異性啟動子，諸如一種根特異性啟動子。根特異性啟動子專門或優先地驅動操縱鏈接編碼多核苷酸在根組織中表現。根特異性啟動子的例子在本技藝中為已知的。參閱，例如美國專利第5,110,732號；第5,459,252號及第5,837,848號；及Opperman等人之(1994)Science 263：221-3；及Hirel等人之(1992)Plant Mol.Biol.20：207-18。在一些具體例中，根據本發明用於鞘翅目害蟲控制之多核苷酸或片段可以選殖在兩個根特異性啟動子之間，其中該兩啟動子相對於該多核苷酸或片段係定向在相反的轉錄方向，且該多核苷酸或片段在基因轉殖植物細胞中為可操縱的並在其中表現，以在該基因轉殖植物細胞中製造RNA分子其隨後可能形成dsRNA分子，如前文所描述。在植物組織中表現之iRNA分子可能由一鞘翅目害蟲攝入，藉由此，實現靶定基因表現之箝制。
可以選擇性地操縱鏈接至一種感興趣的核酸分子之額外的調控元素包括5'UTRs，其位於一啟動子元素及一編碼多核苷酸之間、作用為一種轉譯前導子元素。該轉譯前導子元素係存在於完全加工的mRNA中，且其可能影響初級轉錄本的加工，及/或RNA的穩定性。轉譯前導子元素的例子包括玉蜀黍(maize)及矮牽牛(petunia)熱休克蛋白質前導子(美國專利第5,362,865號)、植物病毒外殼蛋白質前導子、植物核酮糖雙磷酸羧化酶前導子，以及其他。參閱，例如Turner及Foster之(1995)Molecular Biotech.3(3)：225-36。5'UTRs之非限制性例子包括GmHsp(美國專利第 5,659,122號)；PhDnaK(美國專利第5,362,865號)；AtAnt1；TEV(Carrington及Freed之(1990)J.Virol.64：1590-7)；及AGRtunos(GenBank®登錄號V00087；以及Beva等人之(1983)Nature 304：184-7)。
可能選擇性地操縱鏈接至一種感興趣的核酸分子之額外的調控序列還包括3'非轉譯元素、3'轉錄終止區域，或多腺苷酸化區域。這些係位於一種多核苷酸下游的遺傳元素，且包括多核苷酸其提供多腺苷酸化訊號，及/或其他能夠影響轉錄或mRNA加工的調控訊號。多腺苷酸化訊號在植物中作用以造成該mRNA前驅體3'端聚腺苷酸核苷酸的添加。該多腺苷酸化元素可以衍生自各種植物基因，或是衍生自T-DNA基因。3'轉錄終止區域之非限制性例子為胭脂鹼合成酶3'區域(nos 3'；Fraley等人之(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)。使用不同的3'非轉譯區域之一個例子係提供於Ingelbrecht等人之(1989)Plant Cell 1：671-80中。多腺苷酸化訊號的非限制性例子包括一者，其源自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzz等人之(1984)EMBO J.3：1671-9)以及AGRtu.nos(GenBank®登錄號E01312)。
一些具體例可以包括一種植物轉形載體，其包含經單離的及純化之DNA分子，該DNA分子包含至少一個上文描述、可操縱地鏈接到本發明之一種或多種多核苷酸的調控元素。當表現時，該一種或多種多核苷酸引致一種或多種RNA分子(等)，其包含特異性地互補於鞘翅目害蟲中的 天然RNA分子之全部或部分的多核苷酸。因此，該(等)多核苷酸可以包含一區段，其編碼存在於一靶定鞘翅目害蟲RNA轉錄本中之一多核糖核苷酸(polyribonucleotide)之全部或一部分，且可以包含一靶定害蟲轉錄本之全部或一部分的反向重複。一種植物轉形載體可能含有特異性地互補於超過一種靶定多核苷酸的多核苷酸，從而允許製造超過一種的dsRNA，用於抑制靶定鞘翅目害蟲之一種或多種族群或物種之細胞中二種或多種基因的表現。特異性地互補於存在不同基因中之多核苷酸的多核苷酸區段，可以組合成一單一複合核酸分子，用於在一基因轉殖植物中表現。此等區段可能為連續的或是由鏈接子分隔開。
在其他的具體例中，一種已經含有本發明至少一種多核苷酸(等)的本發明質體，可以藉由在相同質體中依序插入額外的多核苷酸(等)而修飾，其中該(等)額外的多核苷酸係如初始的至少一種多核苷酸(等)予以可操縱地鏈接到相同的調控元素。在一些具體例中，一核酸分子可能設計用於抑制多重靶定基因。在一些具體例中，被抑制的多重基因可以從相同的鞘翅目害蟲物種獲得，該者可能增強該核酸分子的有效性。在其他的具體例中，該基因可以衍生自不同的昆蟲(例如，鞘翅目)害蟲，該者可能擴大該(等)藥劑係為有效的害蟲之範圍。當多重基因係靶定用於箝制或表現及箝制之組合時，可以遺傳工程製造一種多順反子DNA元素。
本發明之重組核酸分子或載體可能包含一種可 選擇的標記，該者賦予轉形細胞，諸如一植物細胞，一種可選擇的表型。可選擇的標記亦可以使用以選擇包含本發明重組核酸分子的植物或植物細胞。該標記可能編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如卡那黴素(kanamycin)、Geneticin(G418)、博來黴素(bleomycin)、潮黴素(hygromycin)等等)、或除草劑耐受性(例如嘉磷塞(glyphosate)等等)。可選擇標記之例子包括，但不限於：neo基因，該者編碼卡那黴素抗性且可以使用卡那黴素、G418等等予以選擇；bar基因，該者編碼雙丙氨磷(bialaphos)抗性；一種突變的EPSP合成酶基因，該者編碼嘉磷塞(glyphosate)耐受性；一種腈合成酶(nitrilase)基因，該者賦予對溴苯腈(bromoxynil)的抗性；一種突變乙醯乳酸合成酶(ALS)基因，該者賦予咪唑啉酮(imidazolinone)或磺醯脲素耐受性；及一種抗胺甲基葉酸(methotrexate)DHFR基因。多重可選擇的標記係為可用的，該者賦予對以下之抗性：胺芐青黴素(ampicillin)、博萊黴素(bleomycin)、氯黴素、建他黴素(gentamycin)、潮黴素(hygromycin)、卡那黴素(kanamycin)、林可黴素(lincomycin)、胺甲基葉酸、草胺膦(phosphinothricin)、嘌呤黴素(puromycin)、觀黴素(spectinomycin)、利福平(rifampicin)、鏈黴素及四環黴素及之類。此種可選擇標記之例子係例示於，例如美國專利第5,550,318號；第5,633,435號；第5,780,708號以及第6,118,047號。
本發明之重組核酸分子或載體亦可包括一種可篩選標記。可篩選標記可以使用以監控表現。示範性的可 篩選標記包括β-葡萄糖醛酸苷酶或uidA基因(GUS)，該者編碼各種顯色基質係為已知的酶(Jefferson等人之(1987)Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)；R-基因座基因，該者編碼一產物其調控植物組織中花青素(anthocyanin)色素(紅色)的製造(Dellaporta等人之(1988)"Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." In 18 th Stadler Genetics Symposium,P.Gustafson and R.Appels,eds.(New York：Plenum),pp.263-82)；β-內醯胺酶基因(Sutcliffe等人之(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3737-41)；一種基因，其編碼各種顯色基質係為已知的酶(例如PADAC，一種顯色頭孢菌素(cephalosporin))；一種螢光素酶基因(Ow等人之(1986)Science 234：856-9)；一種xylE基因，其編碼可以轉換顯色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶(Zukowski等人之(1983)Gene 46(2-3)：247-55)；一種澱粉酶基因(Ikatu等人之(1990)Bio/Technol.8：241-2)；一種酪胺酸酶基因，該者編碼能夠氧化酪胺酸成為DOPA及多巴醌(dopaquinone)之酶，後者轉而縮合成黑色素(Katz等人之(1983)J.Gen.Microbiol.129：2703-14)；以及α-半乳糖苷酶。
在一些具體例中，重組核酸分子，如前文所描述，可以用於創造基因轉殖植物及在植物中表現異源性核酸的方法中使用，以製備對鞘翅目害蟲展示降低的感受性之基因轉殖植物。植物轉形載體可以，舉例而言，藉由將編碼iRNA分子的核酸分子插入到植物轉形載體內並將它們引 入到植物內來製備。
適合用於轉形宿主細胞的方法包括DNA可以被引入到一種細胞中的任何方法，諸如藉由原生質體(protoplast)的轉形(參閱，例如美國專利第5,508,184號)，藉由乾燥/抑制(desiccation/inhibition)媒介的DNA攝入(參閱，例如Potrykus等人之(1985)Mol.Gen.Genet.199：183-8)，藉由電穿孔(參閱，例如美國專利第5,384,253號)，藉由以碳化矽纖維攪拌(參閱，例如美國專利第5,302,523號及第5,464,765號)，藉由農桿菌媒介轉形(參閱，例如美國專利第5,563,055號；第5,591,616號；第5,693,512號；第5,824,877號；第5,981,840號；及第6,384,301號)以及藉由加速的DNA包覆顆粒(參閱，例如美國專利第5,015,580號；第5,550,318號；第5,538,880號；第6,160,208號；第6,399,861號；及第6,403,865號)等等。對轉形玉米特別有用的技術係描述，舉例而言，於美國專利第7,060,876號及第5,591,616號；以及國際PCT專利公開案WO95/06722。透過諸如這些技術的應用，幾乎可以穩定地轉形任何物種的細胞。在一些具體例中，轉形的DNA係整合至宿主細胞的基因組中。在多細胞物種的情況下，基因轉殖細胞可以再生成一基因轉殖生物。這些技術任一者可以使用來製造基因轉殖植物，舉例而言，其包含一種或多種編碼一種或多種iRNA分子的核酸序列在該基因轉殖植物之基因組中。
用於引入一表現載體至植物內最廣泛利用的方法係奠基於農桿菌的天然轉形系統。農桿腫瘤菌(A. tumefaciens)及農桿根毛菌(A.rhizogenes)係為植物病原土壤細菌，其等會使植物細胞基因轉形。農桿腫瘤菌(A.tumefaciens)及農桿根毛菌(A.rhizogenes)的Ti及Ri質體係分別攜帶負責植物基因轉形的基因。Ti(腫瘤誘導)-質體含有被稱為T-DNA的一大區段，該者係轉移到經轉形的植物中。Ti質體之另一區段，Vir區域，係負責T-DNA的轉移。該T-DNA區域係藉由末端重複接壤的。在修飾的雙元載體中，腫瘤誘導基因業已被刪除，而利用Vir區域之功能以轉移由T-DNA交界元素接壤的外來DNA。T-區域亦可能含有用於有效地回收基因轉殖細胞及植物之可選擇的標記，以及一個多重選殖位點用於插入轉移的多核苷酸，諸如編碼核酸的dsRNA。
因此，在一些具體例中，一種植物轉形載體係衍生自農桿腫瘤菌的Ti質體(參閱，例如美國專利第4,536,475號、第4,693,977號、第4,886,937號及第5,501,967號；及歐洲專利第EP 0 122 791號)，或衍生自農桿根毛菌的Ri質體。額外的植物轉形載體包括，舉例而言但不限於，以下所描述的那些：Herrera-Estrella等人之(1983)Nature 303：209-13；Bevan等人之(1983)Nature 304：184-7；Klee等人之(1985)Bio/Technol.3：637-42；及歐洲專利第EP 0 120 516號，及那些衍生自於前述任一者。其他與植物自然交互作用的細菌，諸如中華根瘤菌(Sinorhizobium)、根瘤菌(Rhizobium)及中慢生根瘤菌(Mesorhizobium)，可以予以修飾以媒介許多歧異植物的基因轉移。這些植物關聯的共生細菌可以藉 由取得無害的Ti質體及一種合適的雙元載體兩者而勝任基因轉移。
在提供外源DNA至接受細胞(recipient cell)之後，轉形細胞通常予以鑑定用於進一步培養及植物再生。為了改良鑑定轉形細胞的能力，可能希望採用一種可選擇或可篩選的標記基因，如先前所陳述，加上用來產生轉形體之轉形載體。在使用一種可選擇標記的情況下，轉形細胞係藉由曝露該細胞到一選擇性藥劑或藥劑等在潛在轉形細胞族群之內予以鑑定。在使用一種可篩選標記的情況下，細胞可能針對該所欲的標記基因性狀來篩選。
在暴露於選擇劑之後仍然存活的細胞，或是於篩選分析中已經評分為陽性的細胞，可以培養於支持植物的再生之培養基內。於一些具體例中，任何適合的植物組織培養基(舉例而言，MS和N6培養基)可以透過含括另外的物質而改良，例如生長調節劑。組織可以維持於帶有生長調節劑的基礎培養基上，直到可得到足夠的組織來開始植物再生工作，或是繼之重複循環的手工選擇，直到組織的形態適合再生為止(舉例而言，至少2週)，接而轉移至有助於莖(shoot)形成的培養基。週期性地轉移培養物直到足夠的莖形成已出現為止。一旦莖形成，將其等轉移至有助於根形成的培養基。一旦足夠的根形成，植物可以轉移至土壤用於進一步的生長和成熟。
為了確認再生的植物內存在一種感興趣核酸分子(舉例而言一種DNA，其編碼抑制靶定基因在鞘翅目害蟲 中表現之一種或多種iRNA分子)，可以執行各種各樣的分析。此等分析包括，舉例而言：分子生物分析，例如南方墨點和北方墨點、PCR以及核酸定序；生化分析，例如，舉例而言，透過免疫學的手段(ELISA及/或西方墨點)或是透過酵素功能來偵測蛋白質產物的存在；植物部分的分析，例如葉片或是根分析；以及全株再生植物之表型的分析。
整合品件(Integration events)可以，舉例而言，藉由PCR擴增來分析，例如使用對感興趣核酸分子特異性的寡核苷酸引子。PCR基因分型係理解為包括，但不限於，衍生自經單離的宿主植物癒傷組織的gDNA之聚合酶連鎖反應(PCR)擴增，其中該癒傷組織係預測含有整合至該基因組中之一感興趣核酸分子，繼之標準選殖及定序分析PCR擴增產物。PCR基因分型方法已清楚描述(舉例而言，Rios,G等人之(2002)Plant J.32：243-53)，且可能應用到衍生自任何植物物種(例如玉蜀黍(Z.mays))或組織類型的gDNA，包括細胞培養。
一種使用依賴農桿菌轉形方法形成的基因轉殖植物典型地含有插入到一染色體內的單一重組DNA。該單一重組DNA之多核苷酸係稱為一種"基因轉殖品件"或是"整合品件"。此種基因轉殖植物因為插入的外源性多核苷酸係為異型接合的(heterozygous)。在一些具體例中，一種就轉基因而言為同型接合之基因轉殖植物，可能藉由有性交配(自交)含有一種單一外源性基因之獨立分離體基因轉殖植物到自身而獲得的，舉例而言一種T0植物，以產生T1種 子。所產生的四分之一種T1種子就該轉基因而言將為同型接合的。發芽的T1種子引致植物，其可以用於異型合子歧異度測試者，典型地使用允許區別異型合子與同型合子之間(意即，接合子(zygosity)分析)的SNP分析或熱放大分析。
在特定具體例中，在具有一鞘翅目害蟲防護效果的植物細胞中，產生至少2、3、4、5、6、7、8、9或是10個或更多個不同的iRNA分子。該iRNA分子(例如dsRNA分子)可能從不同轉形品件中引入之多重核酸來表現，或從在一單一轉形品件中引入之單一核酸來表現的。在一些具體例中，數個iRNA分子係於一單一啟動子的控制下表現。在其他具體例中，數個iRNA分子係於多重啟動子控制下表現。可以表現包含多重多核苷酸之單一iRNA分子，該多重多核苷酸每一者係同源於一種或多種鞘翅目害蟲之內的不同基因座(舉例而言，由序列辨識編號：1、2及4所界定的基因座)，二者均於相同的鞘翅目害蟲物種中的不同族群，或是在不同物種的鞘翅目害蟲中。
除了以重組核酸分子直接轉形一種植物之外，基因轉殖植物可以藉由將具有至少一種基因轉殖品件的第一種植物與缺乏此種品件的第二種植物雜交而製備。舉例而言，一種包含編碼一種iRNA分子之多核苷酸的重組核酸分子，可能引入至第一植物品系，其順應於轉形以產生一種基因轉殖植物，該基因轉殖植物可能與第二植物品系雜交以使編碼該iRNA分子之多核苷酸基因滲入(introgress)到該第二植物品系內。
本發明亦包括含有本發明之一種或多種多核苷酸的商品產物。特定具體例包括商品產物其產自於含有本發明之一種或多種多核苷酸的重組植物或種子。含有本發明之一種或多種多核苷酸的一種商品產物係意欲包括，但不僅於，一植物之膳食、油、粉碎或全穀物或種子，或是任何食品產品，其包含一重組植物或種子的任何膳食、油或粉碎或全穀物，其中該重組植物或種子含有本發明之一個或多個多核苷酸。在於此所思量之一種或多種商品或商品產物中偵測本發明之一種或多種多核苷酸為一事實上的證據，該者表明該商品或商品產物係產自於一種設計來表現本發明一種或多種多核苷酸的基因轉殖植物，為了達到使用dsRNA媒介的基因箝制方法來控制植物害蟲的目的。
在一些態樣中，包括衍生自轉形植物細胞的基因轉殖植物所生產的種子及商品產物，其中該種子或商品產物包含可檢測數量的本發明之核酸。在一些具體例中，此種商品產物可能舉例而言，藉由獲得基因轉殖植物並從該者製備食物或飼料來製造。包含本發明之一種或多種多核苷酸之商品產物包括，舉例而言但不限於：一植物之膳食、油、粉碎或全穀物或種子，及包含一重組植物或種子的任何膳食、油或粉碎或全穀物的任何食品產物，其中該重組植物或種子含有本發明之一種或多種核酸。在一種或多種商品或商品產物中偵測本發明之一種或多種多核苷酸係為一事實上的證據，該者表明該商品或商品產物係產自於設計來表現本發明之一種或多種iRNA分子的基因轉殖植物， 為了達到控制鞘翅目害蟲的目的。
在一些具體例中，一種包含本發明之核酸分子的基因轉殖植物或種子亦可能在其基因組中包含至少一種其他的基因轉殖品件，包括但不限於：一基因轉殖品件，該者轉錄一種iRNA分子，該iRNA分子在鞘翅目害蟲中靶定的基因座不是由下列所界定之基因座：序列辨識編號：1、2及4；一基因轉殖品件，該者轉錄一種iRNA分子，該iRNA分子在非鞘翅目害蟲之生物體(例如一種植物寄生線蟲)內靶定一基因；一種編碼殺蟲蛋白質之基因(例如蘇力菌(Bacillus thuringiensis)的殺蟲蛋白質)；除草劑耐受性基因(例如一種提供對嘉磷塞(glyphosate)之耐受性的基因)；以及一基因，其促成該基因轉殖植物所欲的表型，諸如提高的產量、改變的脂肪酸代謝、或是細胞質雄性不育的修復。在特定的具體例中，本發明編碼iRNA分子的多核苷酸可能與在一植物中的其他昆蟲控制及疾病性狀組合，以實現所欲的性狀，用於增強植物疾病及昆蟲損害之控制。採用區別的作用模式之組合的昆蟲控制性狀，可以提供受防護的基因轉殖植物優越的耐久力，超越懷有一單一的控制性狀的植物，舉例而言，因為在田間發展對抗該(等)性狀之機率將會降低。
V.鞘翅目害蟲中靶定基因的箝制 A.概述
在本發明之一些具體例中，可以提供至少一個對鞘翅目害蟲控制有用的核酸分子給一鞘翅目害蟲，其中該 核酸分子在該害蟲中導致RNAi媒介的基因靜默。在特定的具體例中，可以提供一種iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及hpRNA)給害蟲。在一些具體例中，對鞘翅目害蟲控制有用之一種核酸分子可藉由使該核酸分子與一害蟲接觸而提供至該害蟲。在這些及進一步具體例中，一種對鞘翅目害蟲控制有用之核酸分子可以提供在該害蟲的飼料基質中，舉例而言，一營養組成物。在這些及進一步具體例中，一種對鞘翅目害蟲控制有用之核酸分子可能透過攝入包含該核酸分子的植物材料而提供，其中該核酸分子係由該害蟲攝入。在某些具體例中，該核酸分子係透過表現引入到該植物材料內之重組核酸而存在於該植物材料中，舉例而言，藉由以包含該重組核酸之載體予以轉形一種植物細胞，並從該轉形植物細胞再生一種植物材料或是整個植物。
B. RNAi-媒介之靶定基因箝制
在具體例中，本發明提供iRNA分子(例如dsRNA、siRNA、miRNA、shRNA及hpRNA)，其可以設計以靶定在一種鞘翅目(例如WCR或NCR)害蟲之轉錄體學(transcriptome)中必要的天然多核苷酸(例如必要基因)，舉例而言，其係藉由設計一種iRNA分子，該iRNA分子包含至少一股，該股包含特異性地互補於該靶定多核苷酸的多核苷酸。如此設計的iRNA分子序列與該靶定多核苷酸之序列可能是同一的，或者可能併入不會防礙該iRNA分子與其靶定多核苷酸之間特異性雜交的失配。
本發明之iRNA分子可能在一種鞘翅目害蟲之基因箝制之方法中使用，由此降低由該害蟲在一植物(舉例而言，包含一種iRNA分子之受防護轉形植物)上所造成之損害的位準或發病率。如於此所使用，術語“基因箝制”意指用於降低基因轉錄為mRNA及隨後該mRNA轉譯之結果所製造的蛋白質位準之任何眾所周知的方法，包括降低蛋白質從一基因或一編碼多核苷酸的表現，包括表現之轉錄後抑制及轉錄箝制。轉錄後抑制係藉由從用於箝制之靶定基因轉錄之mRNA的全部或部分，與使用於箝制的相應iRNA分子之間特異性同源而媒介。此外，轉錄後抑制意指在該細胞中可用於核糖體結合的mRNA數量之大量且可測量的降低。
在iRNA分子為一種dsRNA分子的特定具體例中，該dsRNA分子可能由酵素，DICER，切割成短的siRNA分子(長度大約20個核苷酸)。藉由DICER活性而在該dsRNA分子上生成之雙股siRNA分子可能分開成兩個單股的siRNA；"過客股"與"引導股"。過客股可能被降解，而引導股可能併入到RISC中。發生轉錄後抑制係藉由該引導股與一種mRNA分子之特異性互補多核苷酸的特異性雜交，且隨後由酵素，阿革蛋白家族(Argonaute)(RISC複合體之催化組份)予以切割。
在本發明其他的具體例中，可以使用任何形式的iRNA分子。熟習本技藝者將理解的是，較諸單股RNA分子，dsRNA分子在製備期間及在提供該iRNA分子至一細胞之 步驟期間典型係更穩定的，以及典型於細胞中係更穩定的。因此，雖然siRNA及miRNA分子，舉例而言，在一些具體例中可能同樣有效的，但是因dsRNA分子之穩定性可能會擇取dsRNA分子。
在某些具體例中，提供一種包含一多核苷酸之核酸分子，該多核苷酸可能在活體外表現以產生一種iRNA分子，該iRNA分子係實質上同源於一種鞘翅目害蟲之基因組內的多核苷酸所編碼的核酸分子。在某些具體例中，活體外轉錄的iRNA分子可能為包含一種莖環結構的穩定dsRNA分子。在一種鞘翅目害蟲接觸活體外轉錄之iRNA分子之後，可能發生靶定基因(舉例而言，一必要基因)在該害蟲中的轉錄後抑制。
在本發明之一些具體例中，一種來自核酸分子之iRNA的表現係使用於轉錄後抑制一種鞘翅目害蟲之一靶定基因的方法中，該iRNA包含一種多核苷酸之至少15個連續核苷酸(例如，至少19個連續核苷酸)，其中該多核苷酸係選自於以下所組成的群組：序列辨識編號：1；序列辨識編號：1之互補物；序列辨識編號：2；序列辨識編號：2之互補物；序列辨識編號：4；序列辨識編號：4之互補物；序列辨識編號：1之至少15個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：1之至少15個連續核苷酸的片段之互補物；序列辨識編號：2之至少15個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：2之至少15個連續核苷酸的片段之互補物；一種葉甲生物體之天然的編碼多核苷酸，其包含序列辨識編號：1：一種葉甲 生物體之天然的編碼多核苷酸之互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然的編碼多核苷酸，其包含序列辨識編號：2；一種葉甲生物體之天然的編碼多核苷酸之互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：2；一種葉甲生物體之天然編碼多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：1；一種葉甲生物體之天然編碼多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：2；以及一種葉甲生物體之天然編碼多核苷酸之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼多核苷酸包含序列辨識編號：2。在某些具體例中，一種核酸分子之表現與前述任一者有至少約80%同一性(例如79%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、約100%及100%)者可以使用。在這些及進一步具體例中，可以表現一種核酸分子，其特異性地雜交到存在於一種鞘翅目害蟲的至少一細胞中之RNA分子。
本文一些具體例之一重要特徵為，該RNAi轉錄後抑制系統能夠容忍靶定基因中的序列變化，該者歸因於基因突變、品種多型性(strain polymorphism)或是演化分歧係為可預期的。所引入的核酸分子可能不需要絕對同源於 一種靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一者，只要該引入的核酸分子係特異性地雜交至該靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一者。再者，該引入的核酸分子可能不需要為全長，相對於該靶定基因之初級轉錄產物或完全加工的mRNA任一者而言。
使用本發明之iRNA技術抑制一靶定基因係序列特異性的；亦即實質上同源於該(等)iRNA分子之多核苷酸係被靶定用於基因抑制。在一些具體例中，一種包含多核苷酸之RNA分子可以使用於抑制，該多核苷酸帶有的核苷酸序列與部分的靶定基因之核苷酸序列有同一性。在這些及進一步具體例中，可以使用一種包含一種多核苷酸之RNA分子，該多核苷酸序列相對於一靶定多核苷酸具有一個或多個插入、缺失及/或點突變。在特定具體例中，一種iRNA分子與一靶定基因之一部分可能共享，舉例而言，至少從約80%、至少從約81%、至少從約82%、至少從約83%、至少從約84%、至少從約85%、至少從約86%、至少從約87%、至少從約88%、至少從約89%、至少從約90%、至少從約91%、至少從約92%、至少從約93%、至少從約94%、至少從約95%、至少從約96%、至少從約97%、至少從約98%、至少從約99%、至少從約100%、及100%的序列同一性。任擇地，一種dsRNA分子之雙聯體區域可能與一靶定基因轉錄本的一部分特異性地雜交。在特異性雜交的分子中，一種展示出較大同源性之比全長小的多核苷酸會補償一種較長、較不同源的序列。一種與一靶定基因轉錄本的一部分有同一性之dsRNA 分子雙聯體區域的多核苷酸序列長度，可能為至少大約25、50、100、200、300、400、500、或至少大約1000個鹼基。在一些具體例中，可以使用大於20-100個核苷酸之多核苷酸；舉例而言，可以使用100-200個或300-500個核苷酸之多核苷酸。在特定具體例中，可以使用大於約200-300個核苷酸之多核苷酸。在特定具體例中，取決於該靶定基因的大小，可以使用大於約500-1000個核苷酸之多核苷酸。
在某些具體例中，一種靶定基因在鞘翅目害蟲中的表現可以在該害蟲的細胞內抑制達至少10%；至少33%；至少50%；或是至少80%，藉由此，發生顯著的抑制。顯著的抑制意指抑制超過一閾值，該閾值引致一種可偵測的表型(例如停止生殖、取食、發育等等)，或是相應於該被抑制的靶定基因，在RNA及/或基因產物方面有可偵測的下降。雖然在本發明之某些具體例中，抑制發生在實質害蟲所有細胞中，但是在其他具體例中，抑制只發生在表現該靶定基因之子集細胞內。
在一些具體例中，轉錄箝制係藉由在細胞中出現一種dsRNA分子而媒介，該dsRNA分子對一啟動子DNA或其等之互補物展示實質的序列同一性，以招致稱為"啟動子反向箝制(promoter trans suppression)"。基因箝制對可能攝入或接觸此種dsRNA分子之一種鞘翅目害蟲的靶定基因可能為有效的，舉例而言，藉由攝入或接觸含有該dsRNA分子的植物材料。在啟動子反向箝制中使用的dsRNA分子可以特異性地設計，以抑制或箝制該鞘翅目害蟲細胞中一種 或多種同源或互補的多核苷酸之表現。藉由反義或意義定向之RNA的轉錄後基因箝制以調控植物細胞中的基因表現，係揭露於美國專利第5,107,065號；第5,759,829號；第5,283,184號；以及第5,231,020號。
C.提供給鞘翅目害蟲的iRNA分子之表現
表現iRNA分子用於在一種鞘翅目害蟲中RNAi媒介的基因抑制，可以在許多活體外或活體內形式之任一者中實行。該iRNA分子繼而可以提供給一種鞘翅目害蟲，舉例而言，藉由使該iRNA分子與該害蟲接觸，或是藉由使該害蟲攝入或其他方式內化該iRNA分子。本發明之一些具體例包括鞘翅目害蟲轉形之宿主植物、經轉形植物細胞、及轉形植物的後代。轉形植物細胞及轉形植物可以遺傳工程以舉例而言，在一異源性啟動子控制下表現一種或多種iRNA分子，以提供害蟲防護效果。因此，當一種鞘翅目害蟲在取食期間消耗一基因轉殖植物或植物細胞時，該害蟲可能攝入該基因轉殖植物或細胞中表現的iRNA分子。本發明之多核苷酸亦可能引入至廣泛種類的原核及真核微生物宿主，以生產iRNA分子。術語"微生物"包括原核及真核物種，諸如細菌及真菌。
基因表現之調控可能包括此種表現的部分或完全箝制。在另一具體例中，一種用於箝制一種鞘翅目害蟲中基因表現的方法包含：在該害蟲宿主之組織中提供基因箝制數量的至少一種dsRNA分子，該dsRNA分子係在本文中所描述的多核苷酸轉錄之後形成者，且該多核苷酸的至 少一段係互補於該鞘翅目害蟲細胞內的一種mRNA。依據本發明由鞘翅目害蟲攝入的dsRNA分子，包括其修飾形式，諸如siRNA、miRNA、shRNA、或hpRNA分子，可以為至少從大約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或是約100%的同一於從一種克魯拜爾DNA分子轉錄的RNA分子，該分子舉例而言包含選自於序列辨識編號：1、2及4組成的群組之多核苷酸。因而提供經單離且實質純化的核酸分子，包括但不限於，非天然存在的多核苷酸及提供本發明之dsRNA分子之重組DNA建構物，該者當引入其中時，會箝制或抑制鞘翅目害蟲中內源性編碼多核苷酸或靶定編碼多核苷酸的表現。
特定的具體例提供一種遞送系統，供遞送iRNA分子用於轉錄後抑制一種鞘翅目害蟲中之一種或多種靶定基因(等)，並控制該植物害蟲的族群。在一些具體例中，該遞送系統包含攝入一宿主基因轉殖植物細胞或攝入該宿主細胞內含物，該內含物含有在該宿主細胞中轉錄之RNA分子。在這些及進一步具體例中，一基因轉殖植物細胞或一基因轉殖植物係被創造，該者含有提供本發明之穩定dsRNA分子的一重組DNA建構物。包含編碼一特定iRNA分子的核酸之基因轉殖植物細胞及基因轉殖植物，可以藉由採用重組DNA技術(該者之基本技術在該技藝中為眾所周知的)來產生，以建構包含一種多核苷酸的植物轉形載體，該多核苷酸編碼本發明之一種iRNA分子(例如一種穩定的 dsRNA分子)；轉形一植物細胞或植物；以及產生含有轉錄iRNA分子的基因轉殖植物細胞或基因轉殖植物。
為了傳遞鞘翅目害蟲防護性至一基因轉殖植物，一種重組DNA分子可能，舉例而言，轉錄成iRNA分子，諸如一種dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子、shRNA分子或hpRNA分子。在一些具體例中，從一種重組DNA分子轉錄的RNA分子可能在該重組植物之組織或流體內形成dsRNA分子。此一種dsRNA分子可能包含在一種多核苷酸的一部分內，該多核苷酸與一種相應的多核苷酸為同一性的，該相應的多核苷酸係從可能侵擾該宿主植物之鞘翅目害蟲類型內的DNA所轉錄的。靶定基因在該鞘翅目害蟲內的表現係由該dsRNA分子予以箝制，且該靶定基因在鞘翅目害蟲中表現之箝制引致了基因轉殖植物對該害蟲的抗性。dsRNA分子的調控效果業已顯示為適用於在害蟲中表現的各種基因，包括舉例而言，負責細胞分裂、染色體重塑以及細胞代謝或細胞轉形之內源性基因，包括管家(house-keeping)基因；轉錄因子；蛻皮相關基因；及其他編碼涉及細胞代謝或正常生長及發育的多肽之基因。
為了從活體內或是一種表現建構物之轉基因進行轉錄，在一些具體例中可以使用一調控區域(例如啟動子、增強子、靜默子及多腺苷酸化訊號)以轉錄該RNA股(或股等)。所以，在一些具體例中，如前文所陳述，一種供用於生產iRNA分子的多核苷酸可能可操縱地鏈接到一個或多個在植物宿主細胞中作用的啟動子元素。該啟動子可能為 一種內源性啟動子，通常駐留在宿主基因組中。本發明之多核苷酸，在操縱鏈接之啟動子元素的控制下，可能進一步側接額外的元素，其有利地影響其轉錄及/或所得到轉錄本之穩定性。此種元素可能位於該操縱鏈接啟動子的上游，該表現建構物3'端的下游，且可能發生於該啟動子上游與該表現建構物3'端下游兩者。
於一些具體例中，一種靶定基因(例如一種克魯拜爾基因)的箝制作用造成親代RNAi的表型；於接觸該iRNA分子之主體(例如一種鞘翅目害蟲)的後代可觀察到的表型。在一些具體例中，pRNAi表型包含該害蟲較不能生產活的子代。在pRNAi之特定例子中，一種起始pRNAi之核酸不會使遞送該核酸之族群的死亡發生率增加。在其他的pRNAi例子中，一種起始pRNAi之核酸亦會使遞送該核酸之族群的死亡發生率增加。
在其他的具體例中，一種鞘翅目害蟲族群接觸一種iRNA分子，藉此導致pRNAi，其中該害蟲存活且交配，但生產的卵比起相同物種但沒有提供該核酸的害蟲生產的卵，較不能孵化活的後代。在一些實例中，比起相同物種但沒有接觸該iRNA分子的害蟲可觀察到的狀況，此等害蟲不能產卵或是生產的卵較少。在一些實例中，比起相同物種但沒有接觸該iRNA分子的害蟲可觀察到的狀況，此等害蟲產的卵不能孵化或是孵化的速率顯著較低。在一些實例中，比起相同物種但沒有接觸該iRNA分子的害蟲可觀察到的狀況，從此等害蟲產的卵所孵化的幼蟲不能存活或是較 不能存活。
靶定昆蟲害蟲族群容易適應會生產提供對昆蟲進食防護性的物質之基因轉殖作物，此會降低昆蟲防護性物質之耐久性的益處。習慣上，延遲昆蟲害蟲適應基因轉殖作物係透過下列方式來達成：(1)種植“避難處(refuges)”(不含殺蟲(pesticidal)物質之作物，且因而使殺蟲物質感受性的昆蟲能存活)；及/或(2)組合殺蟲物質及對抗靶定害蟲之多重作用模式，以便抗一種作用模式之個體會被第二種作用模式殺死。
在一些例子中，iRNA分子(例如從宿主植物中的一轉基因表現)代表新的作用模式，其組合蘇力菌(Bacillus thuringiensis)的殺蟲蛋白質技術及/或致命的RNAi技術於害蟲抗性管治基因錐體(Insect Resistance Management gene pyramids)，以減輕對此等控制技術任一者有抗性的昆蟲族群之發育。
在一些具體例中，親代RNAi可以導致一類害蟲控制，其與致命的RNAi所獲得的控制不同，以及親代RNAi可以組合以致命的RNAi來引致協同性害蟲控制。因而，在特定具體例中，用於轉錄後抑制一種鞘翅目植物害蟲中之一種或多種靶定基因(等)，可以組合以其他的iRNA分子，以提供冗餘的RNAi靶定以及協同性RNAi效應。
造成卵死亡率或卵活力之喪失之親代RNAi(pRNAi)對使用RNAi及其他昆蟲防護機制之基因轉殖作物，有潛力能帶來進一步耐久性的益處。pRNAi防礙暴 露的昆蟲生產後代，且因而防礙攜帶賦予對殺蟲物質抗性的任一種對偶基因傳遞至下一代。pRNAi在組合以對相同昆蟲族群提供防護性的一種或多種額外的殺蟲物質時，在延長昆蟲防護性基因轉殖作物之耐久力方面是特別有用的。在一些具體例中，此等額外的殺蟲物質包括，舉例而言：dsRNA；幼蟲活性的dsRNA；成體活性的dsRNA；殺蟲蛋白質(例如衍生自蘇力菌(Bacillus thuringiensis)或其他的生物之該等)；以及其他的殺蟲物質。此益處是提升的，因為比起避難處作物，基因轉殖作物中存在更高族群比例之對殺蟲物質有抗性的昆蟲。設若傳遞至下一代之抗性對偶基因對感受性對偶基因的比率，於存在pRNAi的情況下比缺少pRNAi的情況下更低，那麼將延遲抗性的演化。
舉例而言，pRNAi可能不會使表現iRNA分子、遭受損傷之植物第一代害蟲個體的數目減少。然而，此等害蟲持續侵擾後續世代的能力可能會降低。相反地，致命的RNAi可能會殺死已經侵擾植物的害蟲。當pRNAi組合以致命的RNAi時，接觸親代iRNA分子的害蟲可能與外界尚未接觸iRNA的害蟲繁殖，然而，此交配的後代可能不能存活或是較不能存活，且因而可能無法侵擾植物。同時，接觸致命的iRNA分子的害蟲可能直接受影響。此等二種效應之組合可以是協同性的；亦即組合的pRNAi及致命的RNAi效應可以比pRNAi及致命的RNAi獨立效應的總和更大。pRNAi可以組合以致命的RNAi，舉例而言，透過提供一種表現致命的及親代iRNA分子二者之植物；透過提供表現致 命的iRNA分子之第一種植物與表現親代iRNA分子之第二種植物於同樣的位置；及/或透過使雌性及/或雄性害蟲與pRNAi分子接觸，以及隨後釋放接觸過的害蟲至植物環境內，以使得其等能與植物的害蟲非生產性地交配。
一些具體例提供用於降低由一種取食植物之鞘翅目害蟲所造成的宿主植物(例如玉米植物)損害之方法，其中該方法包含在該宿主植物中提供一種表現本發明的至少一種核酸分子之轉形植物細胞，其中該(等)核酸分子一旦由該害蟲取用，作用以抑制一靶定多核苷酸在該害蟲內的表現，此表現抑制除了引致該害蟲的死亡率及/或降低的生長以外，還引致譬如降低的生殖，從而降低該害蟲對該宿主植物造成的損害。在一些具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子。在這些及進一步具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一種多核苷酸，其特異性地雜交到鞘翅目害蟲細胞中表現之核酸分子。在一些具體例中，該(等)核酸分子係由一種多核苷酸組成，其中該多核苷酸係特異性地雜交至一種鞘翅目害蟲細胞中表現的核酸分子。
在其他的具體例中，提供一種用於提高玉米作物產量之方法，其中該方法包含引入本發明之至少一種的核酸分子到玉米植物內；以及培育該玉米植物以允許一種包含該核酸的iRNA分子表現，其中包含該核酸的iRNA分子之表現抑制鞘翅目害蟲損害及/或生長，從而降低或消除歸因於鞘翅目害蟲侵擾的產量損失。在一些具體例中，該iRNA 分子為一種dsRNA分子。在這些及進一步具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一種多核苷酸，其特異性地雜交到鞘翅目害蟲細胞中表現之核酸分子。在一些具體例中，該(等)核酸分子係由一種多核苷酸組成，其中該多核苷酸係特異性地雜交至一種鞘翅目害蟲細胞中表現的核酸分子。
在特定的具體例中，提供一種用於提高植物作物產量之方法，其中該方法包含引入本發明的至少一種核酸分子到一種雌性鞘翅目害蟲(例如，藉由注入、藉由攝入、藉由噴灑，及藉由從一種DNA表現)；以及釋放該雌性害蟲至該作物內，其中使含括不能或是較不能生產活的子代之雌性害蟲的一對害蟲交配，從而降低或消除歸因於鞘翅目害蟲侵擾的產量損失。在特定的具體例中，此一方法提供後續世代之控制。在類似的具體例中，該方法包含將本發明的核酸引入至一雄性鞘翅目害蟲內，以及釋放該雄性害蟲至該作物內(例如，其中pRNAi雄性害蟲比未處理的對照生產較少的精子)。舉例而言，鑑於WCR雌體典型只交配一次，此等pRNAi雌體及/或雄體能用於競爭交配以戰勝天然的WCR昆蟲。在一些具體例中，該核酸分子為一種DNA分子，其被表現以產生iRNA分子。在一些具體例中，該iRNA為一種dsRNA分子。在這些及進一步具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一種多核苷酸，其特異性地雜交到鞘翅目害蟲細胞中表現之核酸分子。在一些具體例中，該(等)核酸分子係由一種多 核苷酸組成，其中該多核苷酸係特異性地雜交至一種鞘翅目害蟲細胞中表現的核酸分子。
在任擇的具體例中，提供一種用於調控一靶定基因在一種鞘翅目害蟲中之表現的方法，該方法包含：以包含一種多核苷酸的一載體來轉形植物細胞，其中該多核苷酸編碼本發明至少一種iRNA分子，其中該多核苷酸係可操縱地鏈接至一啟動子及一轉錄終止元素；在足以允許包含數個轉形植物細胞之植物細胞培養物發展的條件下培養該轉形的植物細胞；選擇已經將該多核苷酸整合至其等之基因組的轉形植物細胞；篩選表現該整合多核苷酸所編碼之iRNA分子的該轉形植物細胞；選擇表現該iRNA分子之基因轉殖植物細胞；及餵食該經選擇的基因轉殖植物細胞至該鞘翅目害蟲。植物亦可能從表現該整合核酸分子所編碼之iRNA分子的轉形植物細胞予以再生。在一些具體例中，該iRNA為一種dsRNA分子。在這些及進一步具體例中，該(等)核酸分子包含dsRNA分子，其中該dsRNA分子每一者包含超過一種多核苷酸，其特異性地雜交到鞘翅目害蟲細胞中表現之核酸分子。在一些具體例中，該(等)核酸分子係由一種多核苷酸組成，其中該多核苷酸係特異性地雜交至一種鞘翅目害蟲細胞中表現的核酸分子。
本發明之iRNA分子可以併入於一種植物物種(例如玉米)之種子內，無論是做為源自併入植物細胞基因組中之一種重組基因表現的產物，或是併入至種植之前施加到種子的塗料或種子處理。一種包含重組基因之植物細胞 係視為一種基因轉殖品件。本發明具體例中亦包括用於遞送iRNA分子到鞘翅目害蟲的遞送系統。舉例而言，本發明之iRNA分子可以直接引入一種害蟲的細胞內。引入的方法可以包括將iRNA直接混合至該鞘翅目害蟲的飲食內(例如藉由與源自害蟲宿主的植物組織混合)，以及施用包含本發明iRNA分子的組成物至宿主植物組織。舉例而言，iRNA分子可以噴灑到植物表面。或者，一種iRNA分子可能由微生物表現，且該微生物可以施用到該植物表面，或藉由諸如注射之物理手段引入到根或莖中。如前文所討論，一種基因轉殖植物亦可以遺傳工程處理，以表現足以殺死已知侵擾該植物的鞘翅目害蟲或其等的子代的數量之至少一種iRNA分子。藉由化學或酶促合成所製造的iRNA分子亦可能以一致於普遍農業做法的方式予以調配，並使用做為用於控制鞘翅目害蟲造成的植物損害之噴霧產品。該調配物可能包括針對有效葉面覆蓋(foliar coverage)所需的適當佐劑(例如，展著劑(stickers)及增濕劑)，以及UV防護劑以防護iRNA分子(例如，dsRNA分子)免受紫外線損害。此種添加劑在生物殺蟲劑工業係普遍的，且對熟習該項技藝者為眾所周知的。此種應用可以與其他噴霧殺蟲劑應用(基於生物學或是其他方式)組合，以增強植物防護不受對鞘翅目害蟲傷害。
於此引用之所有的參考文獻，包括公開案、專利以及專利申請案，皆在此併入本案以作為參考資料，其內容與本揭示之明確細節並無不一致之處，因此每一單獨與 特定指出之文獻皆完整併入本案以作為參考資料。於此所討論之參考文獻僅提供本申請案申請日之前的揭示。於此揭示之內容不應該被解釋為本發明人無權憑藉先前之發明揭示本發明。
下列實施例提供某些特定特徵及/或態樣之說明。這些實施例不應解釋為將本揭示限制於所描述之特定特徵或態樣。
實施例 實施例1：材料與方法
葉甲幼蟲取食分析之樣本製備及生物分析。
許多dsRNA分子(包括相應於克魯拜爾的該等)、係使用MEGAscript® RNAi套組(LIFE TECHNOLOGIES)或是HiScribe® T7活體外轉錄套組(NEW ENGLAND BIOLABS)予以合成及純化。純化的dsRNA分子係於TE緩衝液中製備，且所有生物分析均含有由此緩衝液組成之對照處理，該者擔任WCR之死亡率或生長抑制的背景檢查。dsRNA分子在該生物分析緩衝液中之濃度係使用NANODROP® 8000分光光度計予以測量(THERMO SCIENTIFIC，Wilmington，DE)。
在生物分析中測試樣本的昆蟲活性，該生物分析係以新生的昆蟲幼蟲在人工昆蟲飲食上進行。WCR的卵係得自於CROP CHARACTERISTICS公司(Farmington，MN)。
生物分析係於特別針對昆蟲生物分析所設計的128井塑膠盤中進行(C-D INTERNATIONAL，Pitman，NJ)。 每井含有大約1.0mL針對鞘翅目昆蟲生長設計的飲食。60μL等分試樣的dsRNA樣本係藉由移液管來遞送至每一井1.5cm2的飲食表面上(40μL/cm2)。dsRNA樣本濃度係計算為該井中每平方公分表面積之dsRNA的數量(ng/cm2)。經處理的盤係維持在通風櫥中，直到該飲食表面上的液體蒸發或吸收到飲食內。
在脫蛹幾個小時之內，個別幼蟲係以沾濕的駝毛刷挑起並放置在經處理的飲食上(每井一隻或二隻幼蟲)。然後以透明塑膠黏接片來密封該128井塑膠盤之受侵擾孔，並且開孔以讓氣體交換。生物分析盤係維持在受控的環境條件下(28℃，~40%相對濕度，16：8(光：暗))達9天，在那之後，記錄曝露到每個樣本的昆蟲總數、死亡的昆蟲數、及存活昆蟲的重量。計算每一處理之死亡率百分比、平均活體重量及生長抑制。阻礙生長(Stunting)係定義為平均活體重量之減少。生長抑制(GI)係計算如下：GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]，其中TWIT係為該處理中活蟲的總重量；TNIT為該處理中昆蟲的總數；TWIBC為在背景檢查(緩衝液對照)中活蟲的總重量；及TNIBC為在背景檢查(緩衝液對照)中昆蟲的總數。
GI50係判定為GI值為50%時，飲食中樣本的濃度。LC50(50%致死濃度)係記錄為50%的測試昆蟲被殺死時，飲食中樣本的濃度。統計分析係使用JMP®軟體(SAS，Cary，NC)進行。
實施例2：來自葉甲之候選的靶定基因之鑑定
來自WCR(玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))的多發育階段昆蟲係選定用於匯集的轉錄體學分析，以提供用於藉由RNAi基因轉殖植物昆蟲防護技術控制之候選的靶定基因序列。
於一範例中，總RNA係從約0.9克整隻的一齡WCR幼蟲；(孵化後4至5天，維持在16℃)予以單離，並使用下列苯酚/TRI REAGENT®-為基礎的方法(MOLECULAR RESEARCH CENTER，Cincinnati，OH)予以純化。
幼蟲係於室溫下在15mL的均質機中以10mL之TRI REAGENT®均質化，直至獲得均勻的懸浮液為止。繼5分鐘室溫中培育之後，均質物係分配至1.5mL微量離心管中(每管1mL)，加入200μL的氯仿，並將混合物劇烈震盪15秒。在允許萃取物於室溫靜置10分鐘之後，該等相係藉由12,000x g於4℃下離心而分開。上層相(包含約0.6mL)係小心地轉移到另一個滅菌的1.5mL管子中，且加入等體積的室溫異丙醇。在室溫中培育5至10分鐘之後，混合物係於12,000x g離心8分鐘(4℃或25℃下)。
小心地移除並丟棄上清液，而RNA沈澱物係藉由以75%乙醇渦漩洗滌兩次，且在每次洗滌之後藉由7,500x g離心5分鐘(4℃或25℃)回收。小心地移除乙醇，允許沈澱物空氣乾燥歷時3至5分鐘，然後溶解於無核酸酶的滅菌水中。RNA濃度係藉由測量260nm及280nm處的吸光度(A)而確定。典型的萃取係從大約0.9克的幼蟲產出高於1毫克的總 RNA，伴隨A260/A280比值為1.9。由此萃取的RNA係儲存於-80℃，直到進一步加工。
RNA品質係藉由將等分試樣通過1%瓊脂糖凝膠展開而確定。瓊脂糖凝膠溶液係使用高壓蒸氣滅菌的10X TAE緩衝液(Tris-乙酸EDTA；1x濃度為0.04M Tris-乙酸、1mM的EDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽)，pH為8.0)、以DEPC(焦碳酸二乙酯)-處理的水在高壓蒸氣滅菌的容器中稀釋製成。使用1x TAE做為展開緩衝液。在使用之前，電泳槽及孔形成梳係以RNASEAWAY®(INVITROGEN公司，Carlsbad，CA)來清洗。2μL的RNA樣本係與8μL的TE緩衝液(10mM的Tris HCl，pH為7.0；1mM EDTA)及10μL的RNA樣本緩衝液(Novagen®目錄號70606；EMD4 Bioscience，Gibbstown，NJ)混合。該樣本係於70℃加熱3分鐘，冷卻至室溫，且每孔係加載5μL(含1μg至2μg的RNA)。市售的RNA分子量標記係同時在分隔的孔中展開，用於分子大小比較。該凝膠係以60伏特展開2小時。
一種標準化的cDNA庫係由商業服務提供商(EUROFINS MWG Operon，Huntsville，AL)而從幼蟲總RNA製備，使用隨機引動(priming)。標準化的幼蟲cDNA庫係於1/2底片尺度(plate scale)，藉由GS FLX 454 TitaniumTM系列化學於EUROFINS MWG Operon定序，該者引致超過600,000的讀取伴隨348bp之平均讀取長度。350,000讀取係組裝成超過50,000的片段重疊群。未組裝讀取及片段重疊群兩者皆使用公開可用的程式，FORMATDB(可從NCBI獲 得)轉換成BLASTable數據庫。
總RNA及標準化cDNA庫係同樣地從來自其他WCR發育階段收穫的材料來製備。一種用於靶定基因篩選的匯集轉錄體學庫係藉由組合代表各種發育階段的cDNA庫成員而建構。
使用關於特定基因在其他昆蟲中的致命效果之資訊，來選擇RNAi靶定的候選基因，諸如果蠅(Drosophila)及穀蛀蟲(Tribolium)。克魯拜爾為一種間隙基因，其突變或刪失會於身體分節(segmentation)產生間隙。舉例而言，基於果蠅(Drosophila)及穀蛀蟲(Tribolium)內整體的克魯拜爾功能守恆性而選出間隙基因克魯拜爾，一種於早期的胚胎發育期間建立前後極性必須的轉錄因子(Cerny(2005)Development 132：5353-63；Treisman(1989)Nature 341：335 7；Nibu(2003)Mol.Cell Biol.23：3990-9)。
使用候選蛋白質編碼序列的TBLASTN搜尋，係對含有未組裝的葉甲(Diabrotica)序列讀取或經組裝重疊群的BLASTable數據庫展開。對葉甲(Diabrotica)序列之顯著命中(對片段重疊群同源物界定為比e-20更好，且對未組裝的序列讀取同源物界定為比e-10更好)係使用BLASTX對NCBI非冗餘數據庫(non-redundant database)確認。此BLASTX搜尋的結果確認的是，在TBLASTN搜尋中辨識的葉甲同源物候選基因序列的確包含葉甲基因，或是為葉甲序列對非葉甲候選基因序列可獲得之最佳命中(best hit)。在大多數情況下，穀蛀蟲(Tribolium)候選基因註解為一種編碼一蛋白質、 對葉甲轉錄體學序列中的一序列或是序列等給予明白的序列同源性。在少數情況下，明顯的是，一些由於與一種非葉甲候選基因同源而選定的葉甲類片段重疊群或未組裝序列讀取係重疊的，而該片段重疊群之組裝在加入這些重疊上已經失敗了。在該等情況下，使用SEQUENCHER® v4.9(GENE CODES CORPORATION，Ann Arbor，MI)以組裝該等序列成為較長的片段重疊群。
玉米根螢葉甲(D.v.virgifera)額外的轉錄體學定序先前業已描述過。Euyn等人，(2014)PLoS One 9(4)：e94052。於另一個範例中，從卵(過濾後15,162,017 ILLUMINA®雙端的讀取)、新生的蟲(過濾後721,697,288 ILLUMINA®雙端的讀取)，以及三齡幼蟲的中腸(44,852,488 ILLUMINA®雙端的讀取及415,742 Roche 454的讀取，二者均於過濾後)製備的cDNA係使用ILLUMINA®雙端(paired-end)以及454鈦定序技術予以定序總共~7千億鹼基(~700gigabases)。三個樣本各者以及匯集資料集之重新(De novo transcriptome assembly)轉錄體學組裝係使用Trinity(Grabherr等人，(2011)Nat.Biotechnol.29(7)：644-52)來執行。匯集的總成產生163,871個片段重疊群且平均長度為914bp。源自果蠅(Drosophila)或穀蛀蟲(Tribolium)的克魯拜爾之胺基酸序列係使用作為詢問序列，來搜尋tBLASTN根蟲轉錄體及基因組資料庫(未公開的)，使用截止E值10-5。演繹的胺基酸序列係用CLUSTALXTM予以排列，以及用GENEDOCTM軟體予以編輯。
在WCR中辨識出一種候選靶定基因，其可能導致鞘翅目害蟲死亡或生長抑制、發育抑制，或生殖抑制，包括轉錄本：序列辨識編號：1及序列序列辨識編號：2，加上子序列次區域序列辨識編號：4。此等基因編碼一種克魯拜爾蛋白質或其次區域，其係涉及西方玉米根蟲之成體形態發生。轉錄因子E93觸發擬穀盜(Tribolium castaneum)及其他昆蟲之成體形態發生(Belles and Santos(2014)Insect Biochem.Mol.Biol.52：60-8)。
序列辨識編號：1及序列序列辨識編號：2的多核苷酸是新穎的。公共資料庫中沒有提供該等序列，以及WO/2011/025860；美國專利申請案第20070124836號；美國專利申請案第20090306189號；美國專利申請案第US20070050860號；美國專利申請案第20100192265號；或美國專利7,612,194中均未揭露。於GENBANK®搜尋沒有發現顯著同源的核苷酸序列。葉甲克魯拜爾胺基酸序列(序列辨識編號：3)最接近的同源物為一種擬穀盜(Tribolium castaneum)蛋白質，其具有GENBANK®登錄號NP_001034527.2(於同源區域為71%相似；60%同一的)。
含SNF2的葉甲候選克魯拜爾基因之序列的全長或部分選殖體，係用來產生PCR擴增物用於dsRNA合成。dsRNA亦從DNA選殖體予以擴增，該DNA選殖體包含黃色螢光蛋白(YFP)之編碼區域(序列辨識編號：11；Shagin等人之(2004)Mol.Biol.Evol.21(5)：841-850)。
實施例3：源自葉甲的靶定基因之擴增
引子係設計以藉由PCR來擴增每一種靶定基因之部分的編碼區域。參閱表1。如果適當的話，將一種T7噬菌體啟動子序列(TAATACGACTCACTATAGGG(序列辨識編號：5))併入擴增的意義或反義股的5'端。參閱表1。總RNA係從WCR萃取，且第一股cDNA係使用作為PCR反應的模板，該者使用相反定位引子以擴增天然靶定基因序列的全部或部分。
實施例4：RNAi建構物 藉由PCR製備模板及dsRNA合成
圖1A及圖1B中顯示使用以提供用於含SNF2的克魯拜爾dsRNA生產之特異性模板的策略。意欲在克魯拜爾Reg1 dsRNA合成中使用的模板DNA係藉由PCR、使用引 子第1對(表1)來製備，以及(做為PCR模板)第一股cDNA係從總RNA予以製備。對於克魯拜爾Reg1選定的靶定基因區域，執行兩個獨立的PCR擴增。圖1。第一個PCR擴增在擴增的意義股的5'端引入一個T7啟動子序列。第二個反應在反義股的5'端併入該T7啟動子序列。靶定基因的各個區域之兩個PCR擴增的片段繼而以大約相等的數量混合，且使用該混合物作為dsRNA生產的轉錄模板。圖1。序列辨識編號：4揭示以特定引子擴增的克魯拜爾Reg1 dsRNA模板之序列。
關於YFP陰性對照，執行一個單一的PCR擴增。圖1B。PCR擴增在擴增的意義股及反義股的5'端引入一個T7啟動子序列。靶定基因的各個區域之兩個PCR擴增的片段繼而以大約相等的數量混合，且使用該混合物作為dsRNA生產的轉錄模板。圖1B。陰性對照YFP編碼區域(序列辨識編號：11)的dsRNA係使用引子第2對(表1)以及YFP編碼區域之DNA選殖體作為模板來生產。GFP陰性對照係使用引子第3對(表1)由pIZT/V5-His表現載體(Invitrogen)予以擴增。利用MEGAscript高產率轉錄套組(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)，使用克魯拜爾及GFP之擴增PCR產物作為模板用於dsRNA活體外合成。合成的dsRNAs係使用RNEASY®迷你套組(Qiagen,Valencia,CA)或是AMBION® MEGASCRIPT® RNAi套組、實質遵照製造商規定的說明予以純化。dsRNA製備物係使用一種NANODROP® 8000分光光度計(THERMO SCIENTIFIC， Wilmington；DE)或是等效的構件來定量，並且藉由凝膠電泳予以分析以決定純度。
實施例5：葉甲幼蟲的候選靶定基因之篩選
重複的生物分析證明，攝入在實施例2中辨識的衍生自克魯拜爾Reg 1靶定基因序列之dsRNA製備物，當在以飲食為基礎的分析中投與至WCR時，會造成西方玉米根蟲幼蟲的死亡率及生長抑制。表2。
先前已有人建議，葉甲物種(Diabrotica spp.)的某些基因可以用於RNAi媒介的昆蟲控制。參閱美國專利公開案第2007/0124836號，該者揭露了906個序列，以及美國專 利第7,612,194號，該者揭露了9,112個序列。然而，確定的是，許多建議對RNAi-媒介的昆蟲控制具有用途的基因在控制葉甲方面不是有效的。亦確定的是，相較於建議對RNAi-媒介的昆蟲控制具有用途的其他基因而言，克魯拜爾Reg1提供了令人驚訝且非預期的葉甲優越控制。
舉例而言，於美國專利第7,612,194號中建議膜聯蛋白(Annexin)、β-紅血球膜骨架蛋白質2(Spectrin 2)，以及mtRP-L4每一者在RNAi媒介的昆蟲控制方面是有效的。序列辨識編號：12為膜聯蛋白區域1的DNA序列，而序列辨識編號：13為膜聯蛋白區域2的DNA序列。序列辨識編號：14為β紅血球膜骨架蛋白質2區域1的DNA序列，而序列辨識編號：15為β紅血球膜骨架蛋白質2區域2的DNA序列。序列辨識編號：16為mtRP-L4區域1的DNA序列，而序列辨識編號：17為mtRP-L4區域2的DNA序列。
前述提及的各個序列係使用經由實施例4(圖1)之雙重引子對的方法來生產dsRNA，以及dsRNAs係各自透過以上所述飲食為基礎的生物分析方法來測試。一種YFP序列(序列辨識編號：11)亦使用來生成dsRNA做為陰性對照組。表3列出使用以製造膜聯蛋白、β紅血球膜骨架蛋白質2、mtRP-L4，及YFP dsRNA分子的引子序列。表4呈現WCR幼蟲繼之9天曝露至這些dsRNA之後，飲食為基礎的取食生物分析的結果。重複的生物分析證明，這些dsRNA之攝入引致的西方玉米根蟲幼蟲死亡率或生長抑制，不超過以TE緩衝液、YFP dsRNA或水之對照樣本上看到的西方玉米根 蟲幼蟲死亡率或生長抑制。
實施例6：葉甲成蟲取食分析之樣本製備及生物分析
透過取食對應於克魯拜爾靶定基因序列區段之dsRNA至懷孕的成年雌體，來進行西方玉米根蟲之親代RNA干擾(RNAi)。成年根蟲(羽化後<48小時)係得自於CROP CHARACTERISTICS公司(Farmington，MN)。所有的生物分析中成蟲均飼養於23±1℃、相對濕度>75%，以及8hr：16hr之光：暗週期下。飼養昆蟲的飲食係改造自Branson及Jackson(1988)，J.Kansas Entomol.Soc.61：353-55。將乾的成分添加(48gm/100mL)至一種溶液，該溶液包含二次蒸餾水加上2.9%瓊脂及5.6mL的甘油。此外，將包含47%丙酸及6%磷酸溶液的0.5mL混合物添加至每100mL的飲食，以抑制微生物的生長。使瓊脂溶解於沸水中，以及添加乾的成分、甘油及丙酸/磷酸溶液，徹底混合，以及傾注 至大概2mm的深度。用1號木栓穿孔器從固化的飲食填塞物(大約直徑4mm乘上2mm高度；25.12mm3)切割飲食。六隻成年雄體及雌體(24至48小時大)供養於未經處理的人工飲食，以及允許其等於16井有通風蓋的盤子內(5.1cm長x 3.8cm寬x 2.9高)交配4天。
於第五天，將雄體從容器移除，以及用3μL克魯拜爾Reg1(序列辨識編號：4)基因特異性dsRNA處理之人工昆蟲飲食表面填塞物上餵食雌體(2μg/飲食填塞物；大概79.6ng/mm3)。懷孕的雌體曝露到用相同濃度GFP dsRNA(序列辨識編號：10)或相同體積的水處理的飲食，構成了對照處理。如上所述使用反向引子來生產GFP dsRNA，該等反向引子於其等之5'端均具有T7啟動子序列(序列辨識編號：8與9)。每隔一天提供用dsRNA處理的新鮮人工飲食持續整個實驗。於第11天，將雌體移至產卵籠(7.5cm x 5.5cm x 5.5cm)(ShowMan box,Althor Products,Wilton,CT)中，其含有被篩通過60篩孔的篩子之高壓蒸氣滅菌的粉砂黏壤土泥土(Jackson(1986)Rearing and handling of Diabrotica virgifera and Diabrotica undecimpunctata howardi.第25頁至第47頁於J.L.Krysan and T.A.Miller,eds.Methods for the study of pest Diabrotica.Springer-Verlag,New York)。允許雌體產卵4天，以及於產卵箱中的泥土內、於27℃下孵育卵歷時10天，且繼而經由清洗產卵泥土通過60篩孔的篩子而從泥土來移除卵。用甲醛(500μL甲醛配於5mL二次蒸餾水中)及甲基-(丁胺甲醯基)-2-苯并咪唑胺甲酸酯 (methyl-(butycarbamoy)-2-benzimidazole carbamate)(0.025g配於50mL二次蒸餾水中)的溶液來處理卵，以預防真菌生長。將雌體從產卵箱移除，以及將來自各處理之卵的子樣本瞬間冷凍於液態氮中供後續定量qPCR之表現分析(見實施例7)。用Dino-Lite Pro數位顯微鏡(Torrance,CA)來為培養皿(dish)拍照，以及全體的卵係使用Image J軟體之細胞計數功能(Schneider等人之(2012)Nat.Methods 9：671-5)來計數。收穫的卵裝在培養皿內、於濕濾紙上在28℃下，以及監測歷時15天來決定卵活力。於不同天進行六次重複，各次包含三隻到六隻雌體。每天記錄從各處理孵化的幼蟲數目直到不再觀察到孵化為止。
成年WCR雌體攝入克魯拜爾Reg1 dsRNA分子證明對於卵活力具有令人驚訝、戲劇性且可再現性的效應。曝露至克魯拜爾dsRNA之交配的雌體生產的卵數目，與曝露至未經處理的飲食或用GFP dsRNA處理的飲食之雌體，生產的卵數目大概相等(圖3A；表5)。然而，從曝露於克魯拜爾dsRNA之雌體採集的卵沒有存活(圖3B；表5)。曝露於克魯拜爾dsRNA之成年雌體之卵孵化<3%。
圖3A及圖3B通過圖來總結表5之資料，關於dsRNA處理對於卵生產與卵活力的效應。
將來自各處理組之未孵化的卵之胚胎切開來檢查胚胎的發育且估計親代RNAi(pRNAi)效應的表型反應。用GFP dsRNA處理之WCR雌體產的卵顯示正常的發育。圖4A。相反地，用克魯拜爾Reg1 dsRNA處理之雌體產的卵顯示卵內胚胎有一些發育，並且切開時，明顯地變短且遺失一些腹部與胸環節，然而個別的幼蟲之間反應多變。圖4B。因而本發明非預期地發現攝入克魯拜爾dsRNA對於WCR卵及幼蟲有致命或是發育的效應。進一步令人驚訝且非預期的是，成年WCR雌體攝入克魯拜爾dsRNA戲劇性地影響卵活力，但是對於成年雌體自身沒有可識別戲劇性的效應。
前述的結果清楚地證明RNAi於西方玉米根蟲的系統性本質，以及達成親代效應的潛力，其中曝露至dsRNA之雌體的卵內之胚胎發育相關的基因之減量。重要地，此為pRNAi對於西方玉米根蟲內攝入的dsRNA之反應首次的報告。基於觀察到曝露及攝入dsRNA之消化管以外的組織之減量的情況發生，顯示為一種系統性反應。因為一般而言昆蟲，以及具體而言根蟲缺少RNA依賴型RNA聚合酶， 其業已與植物及線蟲之系統性反應有關聯，吾人的結果確認dsRNA能被腸組織吸收並易位至其他的組織(例如發育中的卵巢小管)。
涉及胚胎發育之基因表現減量而使卵不孵化的能力，提供獨特的機會以實現及改良西方玉米根蟲之控制。因為成蟲容易取食地面上的生殖組織(例如，鬚與雄花序)，成年根蟲可以透過dsRNA之基因轉殖表現，而曝露到iRNA控制劑，以藉由防止卵孵化來實現後續世代之根防護(root protection)。透過dsRNA之基因轉殖表現，或是透過接觸表面施用的iRNAs而遞送dsRNA於玉米植物內，提供重要的堆疊合作夥伴(stacking partner)給其他直接靶定幼蟲的基因轉殖方法，並且提升害蟲管理策略之整體耐久力。
實施例7：即時PCR分析
總RNA係從成年雌體、處理的雌性孵化的幼蟲以及卵全身予以單離，使用RNEASY®迷你套組(Qiagen，Valencia，CA)、遵循製造商的建議進行。在轉錄反應起始之前，使用Quantitech反轉錄套組(Qiagen，Valencia，CA)、用去氧核醣核酸酶處理總RNA以移除任何gDNA。使用總RNA(500ng)來合成第一股cDNA作為即時定量PCR(qPCR)之模板。於260nm分光光度來定量RNA，以及藉由瓊脂糖凝膠電泳來評估純度。qPCR分析使用的引子係利用Beacon設計軟體(Premier Biosoft International,Palo Alto,CA)來設計。引子對的效率係利用三重複之5倍系列稀釋(1：1/5：1/25：1/125：1/625)來評估。本研究中使用的所有qPCR引子 對之擴增的效率均高於96.1%。本研究中使用的所有的引子組合，於cDNA模板的量與PCR產物的量之間顯示出線性相關。所有的相關係數均大於0.99。利用7500 Fast System SDS v2.0.6軟體(Applied Biosystems)來判定斜率、相關係數，以及效率。qPCR分析使用三個生物重複，各者有二個技術重複。qPCR係利用SYBR green套組(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)及7500 Fast System即時PCR偵測系統(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)來執行。qPCR循環參數包括40個循環，各循環由95℃歷時3秒，58℃歷時30秒組成，如同製造商的實驗協定中所述(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)。於各PCR反應終點，產生一熔化曲線來確認單一峰並排除引子-二聚物及非特異性產物形成的可能性。轉錄本之相對定量係使用2-△△CT方法來計算，以及標準化至β-肌動蛋白。
圖5(A-C)通過圖來總結表6之資料，其顯示於卵、成年雌體以及幼蟲內，克魯拜爾及GFP與水相比之相對轉錄本位準。於雌性成體以及卵之轉錄本位準出人意外的減少。從處理的雌性孵化的幼蟲之轉錄本沒有減少。
實施例8：植物轉形載體之建構
一種輸入載體(entry vector)係使用化學合成片段(DNA2.0，Menlo Park，CA)及標準分子選殖方法之組合來組裝，該輸入載體含有一種dsRNA髮夾形成之靶定基因建構物，包含下列之區段：克魯拜爾(序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2)，及/或克魯拜爾Reg1(序列辨識編號：4)。RNA初級轉錄本之分子內髮夾形成係藉由將兩個複本的靶定基因區段配置(在一單一轉錄單元內)成彼此相反之定向而促進，該兩個區段係由鏈接子序列(例如ST-LS1內含子， 序列辨識編號：46；Vancanneyt等人之(1990)Mol.Gen.Genet.220：245-250)分隔。因此，該初級mRNA轉錄本含有由該鏈接子序列分隔之兩個克魯拜爾基因區段序列，作為彼此大的反向重複。初級mRNA髮夾轉錄本之製造係藉由玉蜀黍(maize)泛素1啟動子(美國專利第5,510,474號)之複本所驅動，以及包含源自玉蜀黍(maize)過氧化酶5基因的3'非轉譯區域(ZmPer5 3'UTR v2；美國專利第6,699,984號)之一片段，係使用以終止髮夾-RNA-表現基因的轉錄。初級mRNA髮夾轉錄本之製造係藉由一種啟動子(例如玉蜀黍(maize)泛素1，美國專利第5,510,474號；來自花椰菜嵌紋病毒(Cauliflower Mosaic Virus)(CaMV)的35S；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pEMU；MAS；玉蜀黍(maize)H3組織蛋白啟動子；ALS啟動子；菜豆蛋白(phaseolin)基因啟動子；cab；核酮糖雙磷酸羧化酶(rubisco)；LAT52；Zm13；及/或apg)之複本所驅動，以及包含3'非轉譯區域之一片段，舉例而言但不限於：玉蜀黍(maize)過氧化酶5基因(ZmPer5 3'UTR v2；美國專利第6,699,984號)、AtUbi10、AtEf1，或StPinII，係使用以終止髮夾-RNA-表現基因的轉錄。
一種輸入載體係用典型的雙元目標載體，使用標準的GATEWAY®重組反應，來生產克魯拜爾髮夾RNA表現轉形載體供用於農桿菌媒介的玉蜀黍胚胎轉形。
一種陰性對照雙元載體，其包含表現YFP髮夾dsRNA的基因，係用典型的雙元目標載體及輸入載體，藉 由標準GATEWAY®重組反應來建構。該輸入載體包含YFP髮夾序列，該YFP髮夾序列係處於玉蜀黍(maize)泛素1啟動子(如上所述)及源自玉蜀黍(maize)過氧化酶5基因的3'非轉譯區域之片段(如上所述)的表現控制下。
一種雙元目標載體包含一種除草劑耐受性基因(芳亞基鏈烷酸酯雙加氧酶(aryloxyalknoate dioxygenase)；(AAD-1 v3，美國專利第7,838,733號，及Wright等人之(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107：20240-5))，在一種植物可操縱的啟動子(例如甘蔗桿狀病毒(sugarcane bacilliform badnavirus)(ScBV)啟動子(Schenk等人之(1999)Plant Mol.Biol.39：1221-30)或是ZmUbi1(美國專利第5,510,474號))的調控下。5'UTR及源自此等啟動子之內含子，係放置於該啟動子區段的3'端和AAD-1編碼區域的起始密碼子之間。一種包含源自玉蜀黍(maize)脂酶基因的3'非轉譯區域之片段(ZmLip 3'UTR；美國專利第7,179,902號)，係使用來終止AAD-1 mRNA的轉錄。
一種另外的陰性對照雙元載體，其包含表現YFP蛋白質的基因，係用典型的雙元目標載體及輸入載體，藉由標準GATEWAY®重組反應來建構。該雙元目標載體能包含一種除草劑耐受性基因(芳亞基鏈烷酸酯雙加氧酶(aryloxyalknoate dioxygenase)；AAD-1 v3)(如上所述)，其係在玉蜀黍(maize)泛素1啟動子(如上所述)及源自玉蜀黍(maize)脂酶基因的3'非轉譯區域之一片段(ZmLip 3'UTR；如上所述)的表現控制下。該輸入載體包含一種YFP編碼區 域，該YFP編碼區域係在玉蜀黍(maize)泛素1啟動子(如上所述)及源自玉蜀黍(maize)過氧化酶5基因的3'非轉譯區域之一片段(如上所述)的表現控制下。
實施例9：包含殺蟲性dsRNA之基因轉殖玉蜀黍(maize)組織
農桿菌媒介的轉形。於農桿菌媒介的轉形之後，透過穩定整合至植物基因組的嵌合基因之表現而產生出基因轉殖玉蜀黍(maize)細胞、組織及植物，該基因轉殖玉米細胞、組織及植物會生產一種或多種殺蟲性dsRNA分子(舉例而言至少一種dsRNA分子，其含括一種靶定一種基因的dsRNA分子，該基因包含下列之區段：克魯拜爾(序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2)及克魯拜爾Reg1(序列辨識編號：4)。採用超級雙元(superbinary)或雙元轉形載體之玉蜀黍轉形方法在本技藝中係為知悉的，舉例而言，如描述於美國專利第8,304,604號，其全體係在此併入以作為參考資料。轉形組織係藉由其在含合氯氟(Haloxyfop)培養基上生長的能力而選擇，且適當地針對dsRNA製造而篩選。此種轉形組織培養的一部分可能呈現給新生的玉米根蟲幼蟲用於生物分析，本質上如同在實施例1中所描述。
農桿菌培養引發。含有如上所述(實施例7)之雙元轉形載體pDAB109819或pDAB114245之農桿菌菌株DAt13192細胞(WO 2012/016222A2)的甘油保存種(stocks)係劃線於含有適當抗生素的AB基本培養基平盤上(Watson等人之(1975)J.Bacteriol.123：255-264)，並於20℃中生長達3天。繼而將培養物劃線於含相同抗生素的YEP平盤 (gm/L：酵母萃取物，10；蛋白腖，10；NaCl 5)，且該平盤係於20℃中培育1天。
農桿菌培養。在實驗當天，於實驗中製備合適建構物數量的體積之接種培養基及乙醯丁香酮(acetosyringone)的儲備溶液，以及予以移液至無菌、拋棄式250mL燒瓶內。接種培養基(Frame等人之(2011)Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos.，IN Plant Embryo Culture Methods and Protocols：Methods in Molecular Biology.T.A.Thorpe and E.C.Yeung,(Eds),Springer Science and Business Media,LLC.pp 327-341)含有：2.2gm/L MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素(Frame等人(2011))68.4gm/L蔗糖；36gm/L葡萄糖；115mg/L L-脯胺酸；以及100mg/L肌肌醇(myo-inositol)；於pH 5.4)。將配於100%二甲亞碸之1M儲備溶液的乙醯丁香酮添加至含有接種培養基的燒瓶內成為最終濃度200μM，以及充分混和該溶液。
關於各個建構物方面，將來自YEP平盤之滿滿1或2個接種環的農桿菌懸浮在無菌、拋棄式50mL離心管中的15mL接種培養基/乙醯丁香酮儲備溶液中，且用分光光度計來測量溶液於550nm處的光密度(OD550)。懸浮液繼而使用額外的接種培養基/乙醯丁香酮混合物，而稀釋至0.3至0.4的OD550。繼而將農桿菌懸浮液的管子水平地放置在一平台搖動器上、設定在室溫下大約75rpm，以及搖動歷時1至4小時同時執行胚胎剝離。
穗滅菌及胚胎單離。玉蜀黍(Maize)未成熟胚胎係從在溫室中生長、且自花或近緣授粉(sib-pollinated)以產生穗的玉蜀黍(Zea mays)植物自交品系B104(Hallauer等人之(1997)Crop Science 37：1405-1406)來獲得。在授粉後大概10至12天收穫穗。於實驗那天，去外皮的穗之表面滅菌係藉由浸漬在20%的商業性的漂白劑溶液(ULTRA CLOROX® GERMICIDAL BLEACH，6.15%次氯酸鈉；加上二滴TWEEN 20)，並震盪20至30分鐘，繼之在通風櫥中用無菌去離子水沖洗三次。未成熟合子胚(1.8至2.2mm長)係從每個穗無菌地剝離，且隨機地分配到微量離心管中，該微量離心管含有配於液體接種培養基及200μM乙醯丁香酮之2.0mL合適的農桿菌細胞懸浮液，其業已添加2μL的10% BREAK-THRU® S233界面活性劑(EVONIK INDUSTRIES；Essen，Germany)。在一套特定之實驗中，將源自匯集的穗之胚胎使用於每一轉形。
農桿菌共培養。接種後，將胚胎放置在一盪動平台上歷時5分鐘。接而將管的內含物傾注至共培養培養基的平盤上，共培養培養基含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；30gm/L蔗糖；700mg/L之L-脯氨酸；在KOH中之3.3mg/L的汰克草(Dicamba)(3,6-二氯-鄰-大茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/L之肌肌醇；100mg/L之酪蛋白酵素水解產物；15mg/L的AgNO3；在DMSO中之200μM的乙醯丁香酮；及3gm/L之GELZANTM；於pH 5.8。用無菌、拋棄式移液吸管來移動液體農桿菌懸浮液。 胚胎繼而使用無菌鑷子及顯微鏡的協助而將子葉盤(scutellum)面向上來定向。蓋上平盤，用3MTM MICROPORETM醫療膠帶來密封，以及放置於大概60μmol m-2s-1之光合有效輻射(PAR)的持續光、在25℃孵化器內。
基因轉殖品件之癒合組織篩選與再生。在共培養的期間之後，將胚芽轉移至休眠培養基，其含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；30gm/L之蔗糖；700mg/L的L-脯氨酸；在KOH中之3.3mg/L的汰克草(Dicamba)；100mg/L之肌肌醇；100mg/L之酪蛋白酵素水解產物；15mg/L的AgNO3；0.5gm/L的MES(2-(N-嗎啉)乙磺酸單水合物；PHYTOTECHNOLOGIES LABR.；Lenexa，KS)；250mg/L之卡本西林(Carbenicillin)；及2.3gm/L之GELZANTM；pH為5.8。將不超過36個胚胎移動到各個平盤。將平盤放置在一透明的塑膠箱子中，且於大概50μmol m-2s-1 PAR的持續光、在27℃下孵育歷時7至10天。癒合的組織胚胎接而轉移至選擇培養基I(<18/平盤)上，選擇培養基I係由休息培養基(上文)與100nM的R-合氯氟酸(0.0362mg/L；用於選擇含AAD-1基因之癒合組織)組成。將平盤放回透明的箱子中，且用大概50μmol m-2s-1 PAR的持續光、在27℃下孵育歷時7天。癒合的組織胚胎接而轉移至選擇培養基II(<12/平盤)上，選擇培養基II係由休息培養基(上文)與500nM的R-合氯氟酸(0.181mg/L)組成。將平盤放回透明的箱子中，且用大概50μmol m-2s-1 PAR的持續光、在27℃下孵育歷時14天。此選擇步驟允許基因轉殖癒合組織進一步增殖及分化。
增殖的胚性癒合組織係轉移至預再生培養基上(<9/平盤)。預再生培養基中含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；45gm/L之蔗糖；350mg/L的L-脯氨酸；100mg/L之肌肌醇；50mg/L之酪蛋白酵素水解產物；1.0mg/L的AgNO3；0.25gm/L的MES；在NaOH中0.5mg/L之萘乙酸；在乙醇中2.5mg/L之離層酸(abscisic acid)；1mg/L之6-芣基腺嘌呤(6-benzylaminopurine)；250mg/L之卡本西林(Carbenicillin)；2.5gm/L之GELZANTM；及0.181mg/L的合氯氟酸；pH為5.8。將平盤儲存於透明的塑膠箱子中，且於大概50μmol m-2s-1 PAR的持續光、在27℃下孵育歷時7天。再生的癒合組織繼而轉移(<6/平盤)至PHYTATRAYSTM(SIGMA-ALDRICH)之再生培養基上，並於28℃下、及每日16小時光亮/8小時黑暗(在大概160μmol m-2s-1 PAR下)予以孵育歷時14天，或是直到莖和根發育出。再生培養基含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；60gm/L之蔗糖；100mg/L之肌肌醇；125mg/L之卡本西林(Carbenicillin)；3gm/L的GELLZANTM膠；以及0.181mg/L的R-合氯氟酸；pH為5.8。具初生根之小芽繼而予以單離並且不經選擇而轉移至伸長培養基。伸長培養基含有4.33gm/L之MS鹽類；1X ISU修飾的MS維生素；30gm/L之蔗糖；以及3.5gm/L之GELRITE®：pH為5.8。
將藉由其等在含有合氯氟的培養基上生長的能力而選擇的轉形植物芽，從PHYTATRAYSTM移植至填充生長培養基(PROMIX BX；PREMIER TECH HORTICULTURE) 之小盆，覆蓋杯子或HUMI-DOMES(ARCO PLASTICS)，然後在CONVIRON®生長室中使幼苗健化(hardened-off)(白天27℃/夜間24℃，16小時光照期，50-70% RH，200μmol m-2s-1 PAR)。於一些例子中，推定的基因轉殖小苗係藉由即時定量PCR分析、使用設計以偵測整合至玉蜀黍基因組之AAD1除草劑耐受性基因的引子，針對轉基因相對複本數予以分析。再者，使用RNA qPCR分析以偵測推定的轉形體表現的dsRNAs中鏈接子序列的存在。選出的轉形小苗接而移至溫室內供進一步生長及測試。
在溫室中轉移並建立T0植物，用於生物分析及種子生產。當植物達到V3-V4階段時，將其等移植至IE CUSTOM BLEND(PROFILE/METRO MIX 160)土壤混合物並在溫室中生長以開花(光暴露類型：光或同化作用(Photo or Assimilation)；強光限制(High Light Limit)：1200 PAR；16-小時日長；白天27℃/夜間24℃)。
用於昆蟲生物分析的植物係從小花盆移植到TINUSTM 350-4 ROOTRAINERS®(SPENCER LEMAIRE INDUSTRIES，Acheson，Alberta，Canada；)(每一ROOTRAINER®一個植物一個品件)。移植到ROOTRAINERS®大約四天後，植物係用於生物分析中。
T1世代的植物係藉由用從非基因轉殖原種(elite)自交品系B104植物或其他適當的花粉供體，所收集的花粉與T0基因轉殖植物之鬚進行授粉，並種植所得到的種子而獲得。於可能時可以執行回交。
實施例10：成年葉甲取食生物分析
將表現親代RNAi標靶及GFP對照之dsRNA的基因轉殖玉米葉羣(V3-4)予以冷凍乾燥，以及用研缽及杵磨碎成細粉且通過600μM的篩子予以過篩，俾以在與人工飲食合併之前達到一致的粒度。人工飲食為如前所述親代RNAi實驗相同的飲食，除了水量加倍之外(20mL ddH2O，0.40g瓊脂，6.0g飲食混合物，700μL甘油，27.5μL黴菌抑制劑)。固化之前，以40mg/ml之飲食的速率將粉末狀的玉米葉組織與飲食合併並徹底混合。將飲食傾注至塑膠培養皿表面上至大概4mm的深度並讓其固化。從飲食填塞物切割飲食，以及使用如前所述親代RNAi實驗相同的方法來曝露於西方玉米根蟲成蟲。
pRNAi T0或T1品件在溫室中生長直到植物生玉米穗軸、雄花序與鬚。於各株植物釋放剛出現的根蟲成蟲總共25隻，以及覆蓋整株植物以防止成蟲逃脫。釋放二週之後，從各株植物回收雌性成蟲，且供養於實驗室中以採集卵。取決於親代RNAi標靶及預期的表型，記錄參數例如每隻雌體的卵數目、卵孵化的百分比及幼蟲死亡率，並與對照植物比較。
實施例11：基因轉殖玉蜀黍之葉甲幼蟲根取食生物分析
昆蟲生物分析。本主體發明在植物細胞中產生的dsRNA之生物活性係藉由生物分析方法證明。舉例而言，一者能夠藉由在受控制的取食環境中餵食各種植物組織或組織塊給靶定昆蟲來證明有效性，該植物組織或組織塊係 衍生自一種生產殺蟲性dsRNA的植物。或者，萃取物係從一種生產殺蟲性dsRNA的植物所衍生的各種植物組織來製備，及經萃取的核酸係如於此先前所描述般分配到用於生物分析的人工飲食的頂部。此種取食分析的結果係與採用源自不生產殺蟲性dsRNA的宿主植物的適當對照組織，或是與其他對照樣本以類似方式進行的生物分析的結果，作比較。
基因轉殖玉蜀黍品件之昆蟲生物分析。選擇從清洗過的卵孵出的二隻西方玉米根蟲幼蟲(1至3天大)，以及放置於生物分析盤的各個井中。繼而用"PULL N’ PEEL"標籤蓋(BIO-CV-16，BIO-SERV)來覆蓋且放置於28℃及18小時/6小時光/暗週期之孵化器內。於初始侵擾九天之後，評估幼蟲的死亡率，死亡率係計算為從各個處理的昆蟲總數裡死亡的昆蟲百分比。昆蟲樣本冷凍於-20℃歷時二天，然後匯集各個處理的昆蟲幼蟲並稱重。生長抑制百分比係計算為實驗處理的平均重量除以二個對照井處理的平均重量。數據表達為(陰性對照的)生長抑制百分比。超過對照平均重量之平均重量係標準化至零。
溫室中的昆蟲生物分析。從源自CROP CHARACTERISTICS(Farmington，MN)的土壤得到西方玉米根蟲(WCR，玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte))的卵。WCR的卵係於28℃下培養歷時10至11天。卵係從土壤洗滌出，放進0.15%之瓊脂溶液內，且濃度係調整為每0.25mL等分試樣大概75個至100個卵。一孵化平盤 係在具一等分試樣卵懸浮液的培養皿中建立，以監測孵化率。
於ROOTRAINERS®中成長的玉蜀黍植物周圍的土壤係以150至200個WCR的卵予以侵擾。允許該昆蟲取食達2週，在該時間之後，對每一植物給予"根等級(Root Rating)"。利用節點損害量表來分級，其實質上係根據Oleson等人，(2005)J.Econ.Entomol.98：1-8。通過這種生物分析的植物係移植至5加侖的花盆用於種子生產。用殺蟲劑來處理移植體以預防於溫室中進一步的根蟲損傷以及昆蟲釋放。以手工方式授粉植物用於種子生產。由這些植物生產的種子係保存用於評估T1及植物後續世代。
溫室生物分析包括二種陰性對照植物。基因轉殖陰性對照植物係藉由懷有設計用來生產黃色螢光蛋白(YFP)或YFP髮夾dsRNA(見實施例4)之基因的載體予以轉形來產生。非轉形陰性對照植物係產自於種子品系B104。生物分析係於二個不同的日期進行，且各組植物材料含括有陰性對照。
實施例12：基因轉殖玉蜀黍組織之分子分析
玉蜀黍組織之分子分析(例如，RNA qPCR)係於源自葉片和根的樣本上執行，葉片和根樣本係於評估根取食損害的同一天從溫室生長的植物採集。
使用Per5 3'UTR之RNA qPCR分析的結果來確認髮夾轉基因的表現。(在非轉形的玉蜀黍植物預期到低位準的Per5 3'UTR偵測量，因玉蜀黍組織內通常有內源性Per5 基因表現。)表現的RNAs中重複序列之間的介入序列(其對形成dsRNA髮夾分子為不可缺少的)之RNA qPCR分析結果，係用來確認髮夾轉錄本的存在。測量轉基因RNA的表現位準，相較於一內源性玉蜀黍基因之RNA位準。
偵測gDNA中AAD1編碼區域的一部分之DNA qPCR分析，係使用來估計轉基因的插入複本數。此等分析的樣本係從環境室生長的植物採集。結果係與設計用來偵測單一複本天然基因的一部分之DNA qPCR的分析結果比較，以及單純的品件(有一個或二個複本的轉基因)繼續用於進一步的溫室研究。
此外，設計用來偵測觀黴素(spectinomycin)抗性基因(SpecR；存在於T-DNA外部的雙元載體質體上)的一部分之qPCR的分析，係使用來判定基因轉殖植物是否含有外來整合的質體主幹序列。
髮夾RNA轉錄本表現位準：Per5 3'UTR qPCR。癒合細胞品件或基因轉殖植物係藉由該Per5 3'UTR序列之即時定量PCR(qPCR)來分析，以確定全長髮夾轉錄本的相對表現位準，相較於一種內部玉蜀黍基因(舉例而言，GENBANK®登錄號BT069734)的轉錄位準，後者編碼一種類TIP41蛋白質(亦即，GENBANK®登錄號AT4G34270之玉蜀黍同源物；具有74%同一性之tBLASTX分數)。RNA係使用RNAEASYTM 96套組(QIAGEN，Valencia，CA)予以單離。在沖洗之後，總RNA根據套組建議的協定而經歷去氧核醣核酸酶I處理。RNA繼而於NANODROP® 8000分光光度計 (THERMO SCIENTIFIC)上定量，以及將濃度標準化成25ng/μL。第一股cDNA係使用HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT(INVITROGEN)、實質上根據製造商推薦的實驗協定、在10μL反應體積中以5μL的變性RNA製備。該協定係稍微修改，以包括添加10μL的100μM T20VN寡核苷酸(IDT)(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN，其中V為A、C或G，以及N為A、C、G或T；序列辨識編號：47)到隨機引子存料混合物的1mL管子中，俾以製備組合的隨機引子與寡dT之工作存料。
cDNA合成之後，樣本係以無核酸酶的水予以1：3稀釋，並儲存在-20℃，直到分析。
Per5 3' UTR及類TIP41轉錄本之獨立即時PCR分析係於LIGHTCYCLER® 480(ROCHE DIAGNOSTICS，Indianapolis，IN)上，在10μL反應體積中執行。在Per5 3' UTR分析方面，反應係用引子5U76S(F)(序列辨識編號：48)及P5U76A(R)(序列辨識編號：49)，以及ROCHE UNIVERSAL PROBETM(UPL76；目錄號4889960001；用FAM標記)來進行。在類TIP41參考基因分析方面，使用引子TIPmxF(序列辨識編號：50)及TIPmxR(序列辨識編號：51)，以及用HEX(六氯螢光素)標記的探針HXTIP(序列辨識編號：52)。
所有分析均含括無模板(僅混合)的陰性對照組。對於標準曲線，一空白試樣(在源井(source well)中的水)亦包括在源盤上，以檢查樣本的交叉污染。表7中列舉引子及 探針序列。偵測各種轉錄本的反應組分配方係揭示於表8中，以及PCR反應條件係摘要於表9中。FAM(6-羧基螢光素醯胺(6-Carboxy Fluorescein Amidite))螢光部分係以465nm來激發，以及測量510nm的螢光；HEX(六氯螢光素)螢光部分對應的值為533nm及580nm。
數據係根據供應商的建議，使用LIGHTCYCLER®軟體v1.5、藉由相對定量法，該者係使用一種二階導數的最大演算法用於計算Cq值。對於表現分析，表現值係使用△△Ct方法(亦即，2-(Cq標靶-Cq REF))計算，該者依賴於兩個標靶Cq值與在對最佳化PCR反應該產物每一週期加倍之假設之下，而選定的基準值2之間差異的比 較。
髮夾轉錄本大小及完整性：北方墨漬法分析。於一些例子中，該基因轉殖植物之額外的分子表徵係藉由使用北方墨漬法(RNA墨漬法)分析而獲得，以確定在表現克魯拜爾髮夾dsRNA的基因轉殖植物中克魯拜爾髮夾RNA的分子大小。
所有的材料及設備在使用之前係以RNaseZAP(AMBION/INVITROGEN)予以處理。組織樣本(100mg至500mg)係收集於2ml SAFELOCK EPPENDORF管子中，以KLECKOTM組織粉碎機(GARCIA MANUFACTURING，Visalia，CA)藉由三個鎢珠、在1ml TRIZOL(INVITROGEN)中破壞達5分鐘，然後於室溫(RT)培育達10分鐘。選擇性地，該等樣本係於4℃下以11,000rpm予以離心歷時10分鐘，且將上清液轉移至新的2ml SAFELOCKTM EPPENDORF管子中。在添加200μL的氯仿至均質物之後，該管子係藉由反轉達2至5分鐘而混合，於RT培育達10分鐘，並於4℃以12,000x g離心歷時15分鐘。將頂部相轉移到滅菌的1.5mL EPPENDORF管子中，且添加600μL之100%異丙醇，繼之在RT下培育歷時10分鐘至2小時，然後在4℃至25℃下、以12,000x g離心歷時10分鐘。丟棄上清液，且RNA沈澱物係以1ml的70%乙醇予以洗滌兩次，伴隨洗滌之間於4℃至25℃、以7,500x g予以離心歷時10分鐘。丟棄乙醇，且將沈澱物短暫地風乾3至5分鐘然後再懸浮於50μL的無核酸酶水中。
總RNA係使用NANODROP® 8000(THERMO-FISHER)來定量，且樣本係予以標準化至5μg/10μL。然後添加10μL的乙二醛(AMBION/INVITROGEN)到每個樣本。分配5至14ng的DIG RNA標準標記混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE，Indianapolis，IN)，並且加入等體積的乙二醛。樣本及標記RNA係於50℃下變性歷時45分鐘，並且儲存在冰上，直至加載在NORTHERNMAX 10X乙二醛展開緩衝液(AMBION/INVITROGEN)中的1.25% SEAKEM GOLD瓊脂糖(LONZA，Allendale，NJ)凝膠中為止。RNAs係藉由於65伏特/30mA進行電泳歷時2小時15分鐘予以分開。
電泳之後，凝膠係於2X SSC中沖洗5分鐘並於GEL DOC工作站(BIORAD，Hercules，CA)上成像，然後RNA係於RT下過夜以被動轉移至一尼龍膜(MILLIPORE)上，使用10X SSC做為轉移緩衝液(20X SSC係由3M的氯化鈉及300mM的檸檬酸三鈉組成，pH 7.0)。繼轉移之後，該膜係於2X SSC中沖洗5分鐘，該RNA係UV交聯至該膜(AGILENT/STRATAGENE)，並且允許該膜在室溫下乾燥高達2天。
該膜係於ULTRAHYB緩衝液(AMBION/INVITROGEN)中預雜交歷時1至2小時。該探針係由含有感興趣序列的PCR擴增產物組成，其係藉助於ROCHE APPLIED SCIENCE DIG程序、以長葉毛地黃配質(digoxigenin)予以標示。在推薦的緩衝液中，於60℃的溫度 下、在一雜交管中執行雜交過夜。繼雜交之後，該墨漬係經受DIG洗滌、包裹、暴露於軟片歷時1分鐘至30分鐘，然後該軟片係予以顯影，全部均用DIG套組供應商所推薦的方法。
轉基因複本數判定。將大約等於2個葉沖孔(leaf punches)的玉蜀黍葉片碎片收集於96井收集平盤(QIAGEN)之內。用一種KLECKOTM組織粉碎機(GARCIA MANUFACTURING，Visalia，CA)加上一個不鏽鋼珠、在BIOSPRINT96 AP1溶解緩衝液(提供自BIOSPRINT96 PLANT KIT；QIAGEN)中執行組織瓦解。於組織離解之後，gDNA係使用一種BIOSPRINT96 PLANT KIT及BIOSPRINT96萃取自動儀、以高輸出量格式予以單離。將gDNA稀釋2：3 DNA：水，然後設定qPCR反應。
qPCR分析。轉基因偵測係使用一種LIGHTCYCLER®480系統、藉由即時PCR、透過水解探針分析來執行。使用LIGHTCYCLER®探針設計軟體2.0來設計水解探針分析使用的寡核苷酸，來偵測鏈接子序列(例如ST-LS1；序列辨識編號：46)，或是來偵測SpecR基因的一部分(亦即，觀黴素(spectinomycin)抗性基因，存在雙元載體質體上；序列辨識編號：53；表10中的SPC1寡核苷酸)。再者，使用PRIMER EXPRESS軟體(APPLIED BIOSYSTEMS)來設計水解探針分析所使用的寡核苷酸，來偵測AAD-1除草劑耐受性基因(序列辨識編號：54；表10中的GAAD1寡核苷酸)。表10顯示引子以及探針的序列。用內 源性玉蜀黍染色體基因多重進行分析法(轉化酶；GENBANK登錄號U16123，於此稱為IVR1)，其擔任內部參考序列以確保各分析法中gDNA的存在。在擴增方面，LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER混合物(ROCHE APPLIED SCIENCE)係製備為1X最終濃度在10μL體積多重反應中，該者含有0.4μM的每個引子以及0.2μM的每個探針(表11)。兩步驟的擴增反應係如同表12中概述者來執行。FAM-及HEX-標示的探針之螢光活化及放射係如上所述；CY5綴合物最大以650nm來激發，以及螢光最大於670nm。
Cp分數(螢光訊號與背景閾值交叉之處)係從即時PCR資料、使用配適點演算法(fit points algorithm)(LIGHTCYCLER® SOFTWARE發行1.5)及相對定量模組(根據△△Ct方法)來判定。數據係如前所述予以處理(如上；RNA qPCR)。
實施例13：包含鞘翅目害蟲序列的基因轉殖玉蜀黍(Zea mays)
10至20株基因轉殖T0玉蜀黍植物係如實施例8中所描述般生成的。獲得另外的10-20株表現RNAi建構物的髮夾dsRNA之T1玉蜀黍獨立品系，用於玉米根蟲的考驗。髮夾dsRNA可以衍生自如下列中列舉者：序列辨識編號：1，序列辨識編號：2，以及序列辨識編號：4。額外的髮夾dsRNA可以衍生自，舉例來說鞘翅目害蟲序列，諸如舉例而言，Caf1-180(美國專利公開案第2012/0174258號)、VatpaseC(美國專利公開案第2012/0174259號)、Rho1(美國專利公開案第2012/0174260號)、VatpaseH(美國專利公開案第2012/0198586號)、PPI-87B(美國專利公開案第2013/0091600號)、RPA70(美國專利公開案第2013/0091601號)、RPS6(美國專利公開案第2013/0097730號)、駝背(Hunchback)(USSN)，以及婆羅賀摩(Brahma)(USSN)。這些係透過RT-PCR或是其他分子分析方法予以證實。源自選定的獨立T1品系的總RNA製備物係選擇性地使用於RT-PCR，加上設計以結合在每一RNAi建構物中之髮夾表現卡匣的鏈接子的引子。此外，在RNAi建構物中每一靶定基因的特定引子係選擇性地使用來擴增，並確認生產植物界之siRNA所要求之加工前mRNA之生成。對每一靶定基因，所欲的電泳帶 (band)的擴增證實了髮夾RNA在每一基因轉殖玉蜀黍植物中的表現。隨後選擇性地於獨立的基因轉殖品系中使用RNA墨漬法雜交，而證實該等靶定基因之dsRNA髮夾加工成為siRNA。
再者，具有對靶定基因失配的序列及超過80%序列同一性之RNAi分子，與具有對靶定基因100%序列同一性之RNAi分子，影響玉米根蟲的方式是相似的。失配的序列與天然序列的配對而於相同的RNAi建構物中形成髮夾dsRNA，遞送了經植物加工的siRNAs，其能夠影響取食的鞘翅目害蟲之生長、發育、生殖及活力。
在植物界遞送相應於靶定基因的dsRNA、siRNA或miRNA，且隨後由鞘翅目害蟲透過取食攝取引致該靶定基因透過RNA媒介基因靜默而向下調控鞘翅目害蟲的靶定基因。當一靶定基因之功能於一個或多個發育階段為重要時，該鞘翅目害蟲的生長、發育及生殖受影響，且在WCR、NCR、SCR、MCR、巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)、黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)，及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)中至少一者的情況下，導致無法成功侵擾、取食、發育及/或生殖，或導致該鞘翅目害蟲的死亡。抉擇靶定基因並繼而成功的應用RNAi係使用來控制鞘翅目害蟲。
基因轉殖RNAi品系及未轉形玉蜀黍的表型比較。選定用於創造髮夾dsRNA的靶定鞘翅目害蟲基因或序列，對任何已知的植物基因序列不具有相似度。因此，因靶定 這些鞘翅目害蟲基因或序列的建構物而製造或活化的(系統性)RNAi，對基因轉殖植物預期是不會發生任何不利影響。然而，基因轉殖品系的發育與形態特徵係與未轉形植物進行比較，以及與那些以沒有髮夾表現基因之"空"的載體所轉形的基因轉殖品系進行比較。比較植物的根、芽、葉羣及生殖特徵。在基因轉殖及未轉形植物之根長度與生長模式中，沒有可觀察到的差異。植物的芽特徵，諸如高度、葉片數及大小，開花時間，花的大小及外觀都是類似的。一般而言，當在活體外及在溫室土壤中培養時，在基因轉殖品系及那些沒有表現靶定iRNA分子者之間沒有觀察到形態差異。
實施例14：包含鞘翅目害蟲序列及額外的RNAi建構物之基因轉殖玉蜀黍
一種在其基因組包含一異源性編碼序列之基因轉殖玉蜀黍植物，該異源性編碼序列轉錄成靶定鞘翅目害蟲以外的生物體的iRNA分子，係經由農桿菌或WHISKERSTM方法學(見Petolino and Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67)予以二次轉形，以產生一種或多種殺蟲的dsRNA分子(舉例而言，至少一種dsRNA分子，其包括靶定下列基因的一種dsRNA分子：序列辨識編號：1，序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：4)。實質上係如實施例7所描述般製備的植物轉形質體載體，係經由農桿菌或WHISKERSTM-媒介轉形方法而遞送至從一基因轉殖Hi II或B104玉蜀黍植物獲得的玉蜀黍懸浮液細胞或是未成熟的 玉蜀黍胚胎中，其中該玉蜀黍植物在其基因組包含一異源性編碼序列，該者轉錄成靶定鞘翅目害蟲以外之生物體的一種iRNA分子。
實施例15：包含RNAi建構物及額外的鞘翅目害蟲對照序列之基因轉殖玉蜀黍
一種在其基因組包含一異源性編碼序列之基因轉殖玉蜀黍植物，該異源性編碼序列轉錄成靶定鞘翅目害蟲生物體的iRNA分子(舉例而言，至少一種dsRNA分子，其包括靶定下列基因的一種dsRNA分子：序列辨識編號：1，序列辨識編號：2及/或序列辨識編號：4)，經由農桿菌或WHISKERSTM方法學予以二次轉形(見Petolino and Arnold(2009)Methods Mol.Biol.526：59-67)，以產生一種或多種殺蟲的蛋白質分子，舉例而言，Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A，以及Cyt2C殺蟲的蛋白質。實質上如實施例7所描述般製備的植物轉形質體載體，係經由農桿菌或WHISKERSTM-媒介轉形方法遞送至從一種基因轉殖B104玉蜀黍植物獲得的玉蜀黍懸浮液細胞或是未成熟的玉蜀黍胚胎中，其中該基因轉殖B104玉蜀黍植物在其基因組包含一異源性編碼序列，該者轉錄成靶定鞘翅目害蟲生物體的一種iRNA分子。獲得雙重轉形的植物，其會生產iRNA分子及殺蟲的蛋白質用於控制鞘翅目害蟲。
實施例16：pRNAi媒介的昆蟲防護
造成卵死亡率或卵活力喪失之親代RNAi帶給使用RNAi及其他昆蟲防護機制之基因轉殖作物進一步耐久性的益處。利用一種基本的二嵌塊模型來證明此用途。
一個嵌塊含有一種表現殺蟲成分的基因轉殖作物，以及第二個嵌塊含有一種不表現殺蟲成分的避難處作物。卵係依據二個模型化嵌塊之相對比例而於其中產出。於此實例中，基因轉殖嵌塊代表95%的地景，以及避難處嵌塊代表5%。基因轉殖作物表現一種對抗玉米根蟲幼蟲為活性的殺蟲蛋白質。
玉米根蟲對殺蟲蛋白質之抗性係建模為單基因的、具有二個可能的對偶基因；一者(S)賦予感受性，以及另一者(R)賦予抗性。殺蟲蛋白質係建模為引致於其上取食之同型接合的感受性(SS)玉米根蟲幼蟲97%的死亡率。同型接合的抗性對偶基因(RR)之玉米根蟲幼蟲假定為沒有死亡率。殺蟲蛋白質之抗性係假定為不完全性隱性，藉以功能性顯性(functional dominance)為0.3(於基因轉殖作物上取食之蛋白質抗性異型接合的(heterozygous)(RS)幼蟲的死亡率為67.9%)。
基因轉殖作物亦表現親代活性的dsRNA，其透過RNA干擾(pRNAi)，引致曝露至基因轉殖作物之成年雌性玉米根蟲的卵不能存活。玉米根蟲對pRNAi的抗性亦被認為是單基因的、具有二個可能的對偶基因；一者(X)賦予成年雌體對RNAi的感受性，以及另一者(Y)賦予成年雌體對RNAi的抗性。假定高位準的曝露於dsRNAs，pRNAi係建模 為引致同型接合的感受性(XX)雌體生產的卵99.9%不能存活。該模型假定pRNAi對於同型接合的抗性(YY)雌體生產的卵之存活沒有效應。dsRNA之抗性係假定為隱性的，藉以功能性顯性(functional dominance)為0.01(對於dsRNA抗性異型接合的(heterozygous)(XY)雌體生產的卵98.9%不能存活)。
於該模型中，依據其等之相對比例，有存活的成蟲跨越二個嵌塊之隨機交配及隨機產卵。活的子代之基因型頻率遵循孟德爾式遺傳之二基因座遺傳系統。
pRNAi的效應需要成年雌體於表現親代活性dsRNA的植物組織上取食。對於從避難處作物出現的成年雌體，比從基因轉殖作物出現的成年雌體，卵發育的干擾是更低的；預期成體會於其等出現繼而若蟲發育的嵌塊處更廣泛地取食。因而，從避難處嵌塊出現的雌性成體之pRNAi效應的相對值，會隨著pRNAi效應的比例而從0(對於從避難處嵌塊出現的成年雌體沒有pRNAi效應)變化至1(對於從避難處嵌塊出現的成年雌體如同對於從基因轉殖嵌塊出現的成年雌體，有相同的pRNAi效應)。
此模型可以容易地調整以展現亦可或是任擇地透過成年雌體於表現親代活性dsRNA的植物組織上取食來達成pRNAi之效應的情況。
二個抗性對偶基因的頻率係跨世代來計算。抗性對偶基因二者(R及Y)之起始頻率係假定為0.005。結果係呈現為各個抗性對偶基因的頻率達到0.05之昆蟲世代的數目。 為了要檢查pRNAi所引致的抗性延遲，對於所有其他方面都完全相同，但含括pRNAi之模擬與不含括pRNAi之模擬進行比較。圖6。
該模型亦修改為含括玉米根蟲幼蟲活性干擾dsRNA組合以玉米根蟲活性殺蟲蛋白質於基因轉殖作物中。指定該處之幼蟲RNAi同型接合的RNAi感受性玉米根蟲幼蟲(基因型XX)為97%幼蟲死亡率之效應，以及同型接合的RNAi抗性玉米根蟲幼蟲(YY)沒有效應。RNAi抗性異型接合的(XY)玉米根蟲幼蟲有67.9%的死亡率。假定相同的抗性機制適用於玉米根蟲之幼蟲活性RNAi及pRNAi二者。像之前一樣，對於從避難處嵌塊出現的成年雌體相對於從基因轉殖嵌塊出現的成年雌體，pRNAi效應係從0變化至1。像之前一樣，為了要檢查pRNAi所引致的抗性延遲，含括pRNAi之模擬及不含括pRNAi之模擬，但是所有其他方面都完全相同(包括幼蟲RNAi)，進行比較。圖7。
與從基因轉殖嵌塊出現的成體之效應的大小相比，對於從避難處嵌塊出現的雌性玉米根蟲成蟲之卵活力而言pRNAi效應值是下降的，觀察到清楚的pRNAi抗性管理效益。除了產生殺蟲蛋白質還產生親代活性dsRNA的基因轉殖作物，與只產生殺蟲蛋白質的基因轉殖作物相比，是更為持久的。同樣地，除了產生殺蟲蛋白質與幼蟲活性dsRNA二者還產生親代活性dsRNA的基因轉殖作物，與只產生殺蟲蛋白質與幼蟲活性dsRNA的基因轉殖作物相比，是更為持久的。在後者的情況中，耐久性的效益適用於殺 蟲蛋白質與殺蟲干擾dsRNA二者。
實施例17：親代RNAi對於WCR雄體之效應
從CROP CHARACTERISTICS(Farmington，MN)收得的剛出現的處子(virgin)WCR雄體曝露到用dsRNA處理的人工飲食供用於pRNAi(克魯拜爾)歷時7天，伴隨連續的dsRNA取食。存活的雄體繼而與處女雌體配對且允許交配歷時4天。將雌體隔離於產卵室且供養於未經處理的飲食上，以根據卵活力來判定交配是否成功。此外，於產卵10天之後，將雌體切開來判定精莢之存在。含括GFP dsRNA與水之對照。執行三重複，每處理每重複有10隻雄體與10隻雌體。用不同的3天剛出現的成體來完成重複實驗。每重複每處理含有10隻雄體每重複每處理，以及放置於一種分析盤的一個井中。各井包括用水或dsRNA(GFP或克魯拜爾)處理的12個飲食填塞物。各飲食填塞物係用配於3μL水之2μg dsRNA予以處理。將分析盤轉移至生長室中、溫度為23±1℃、相對濕度>80%，及L：D 16：8。於第3、5及7天將雄體轉移至各井內有12個處理的飲食填塞物之新的分析盤。於第7天，每處理每重複3隻雄體予以瞬間冷凍供qPCR分析，如實施例7中所述。於第8天，將10隻雌體與10隻經處理的雄體一起放置於一種容器中以允許交配。各容器包括22個未經處理的飲食填塞物。於第10天將昆蟲轉移至有22個未經處理的飲食填塞物之新的分析盤，並且於第12天移動雄體，以及利用螢光染色技術用來測量精子活力。將雌體轉移至新的分析盤，且每隔一天加上12個未經處理的飲食填 塞物直到第22天。於第16天，將雌體轉移至含有高壓蒸氣滅菌的泥土之卵籠(egg cage)用於產卵。於第22天，將所有的雌體從土壤籠移開，且予以冷凍來檢查精莢之存在。將土壤籠轉移至新的生長室中、溫度為27±1℃、相對濕度>80%，及24h黑暗。於第28天，使用篩子#60來清洗泥土以從各個籠子收集卵。用甲醛(500μL甲醛配於5mL二次蒸餾水中)及甲基-(丁胺甲醯基)-2-苯并咪唑胺甲酸酯(methyl-(butycarbamoy)-2-benzimidazole carbamate)(0.025g配於50mL二次蒸餾水中)的溶液來處理卵，以預防真菌污染，以及放置於含有濾紙的小培養皿中。將培養皿及卵轉移至小的生長室中、溫度為27±1℃、相對濕度>80%，及24h黑暗。從第29-42天每天監測幼蟲的孵化。
精子活力。處子(virgin)西方玉米根蟲雄體曝露到用dsRNA及親代RNAi基因克魯拜爾處理的人工飲食歷時7天。每隔一天提供處理的飲食。每重複每處理使用四隻雄體來測量試精子活力，其係以利用螢光染色技術以區別活的及死的精子，如同Collins及Donoghue(1999)所述。Live Dead Sperm Viability KitTM(Life Technologies,Carlsbad CA)含有SYBR 14，一種可透過膜的核酸染色，以及碘化丙啶(propidium iodine)，其染色死細胞。
於冰上麻醉WCR雄體，切開睪丸及儲精囊，放置於10μL緩衝液(HEPES 10mM，NaCl 150mM，BSA 10%，pH 7.4，)中，以及用高壓蒸氣滅菌的牙籤予以壓碎。立即利用Live Dead Sperm Viability KitTM來評估精子活力。添加 1μL的SYBR 14(0.1mM配於DMSO)，且於室溫培育達10分鐘，接著1μL的碘化丙啶(propidium iodine)(2.4mM)，以及再次於室溫培育達10分鐘。將10μL的精子染色溶液轉移至一種玻璃載玻片且用封套(slipcover)來覆蓋。樣本係利用一種NIKON® Eclipse 90i顯微鏡及一種NIKON® A1共焦及NIS-Elements軟體來評估。樣本係以10X及488激發予以顯現，同步地500-550nm帶通(band pass)用於活的精子(SYBR 14)以及663-738nm帶通用於死的精子(碘化丙啶(propidium iodine))。每樣本記錄五個視野之數位影像。活的(綠色)及死的(紅色)精子的數目係使用Image J軟體之細胞計數功能來評估。Schneider等人之(2012)Nat.Methods 9：671-5。
實施例18：有效的濃度
交配的雌體曝露至4個劑量的克魯拜爾dsRNA以判定有效的濃度。剛出現的(24-48小時)成年雄體及雌體係得自於CROP CHARACTERISTICS公司(Farmington，MN)。處理組為2、0.2、0.02及0.002μg克魯拜爾dsRNA。2μg之GFP及水作為對照。將10隻雄體與10隻雌體一起放置於含有20個未經處理的人工飲食小丸的井內。將分析盤轉移至生長室中，及供養於23±1℃、相對濕度>80%，及16：8 L：D光週期。將昆蟲轉移至有新鮮未經處理的人工飲食(每井11個填塞物)之新分析盤並且放回至生長室中。於第五天，將雄體從實驗移除。從第7-13天每隔一天將雌體轉移至含有具有各別dsRNA處理的11個飲食填塞物之新分析盤內。於第14天，將雌體轉移至含有高壓蒸氣滅菌的泥土之卵籠， 以及提供新鮮的處理的人工飲食(每籠11個填塞物)。將卵籠放回移至生長室中。於第16天，如上所述地提供新鮮的人工飲食。於第18天，將所有的雌體從土壤籠移開，且予以瞬間冷凍用於RT-qPCR。將土壤籠轉移至新的生長室中、溫度為27±1℃、相對濕度>80%，及24h黑暗。於第24天，使用#60篩子來清洗泥土以從各個籠子收集卵。用甲醛(500μL甲醛配於5mL二次蒸餾水中)及甲基-(丁胺甲醯基)-2-苯并咪唑胺甲酸酯(methyl-(butycarbamoy)-2-benzimidazole carbamate)(0.025g配於50mL二次蒸餾水中)的溶液來處理卵，以預防真菌污染，以及放置於含有濾紙的小培養皿中。為各培養皿拍照，使用Image J軟體之細胞計數功能(Schneider等人之(2012)Nat.Methods 9：671-5)來給卵計數。將培養皿及卵轉移至小的生長室中、溫度為27±1℃、相對濕度>80%，及24h黑暗。每天監測幼蟲的孵化歷時38天。每天從培養皿計數並移除幼蟲。
實施例19：曝露時間
雌體曝露於三個不同時間開始的2μg的克魯拜爾dsRNA，以判定產生親代RNAi效應需要的曝露時間。雌體於交配之前曝露於dsRNA6次，交配後即刻曝露6次，以及交配後6天曝露6次。各個曝露時間完成三重複，每重複有10隻雌體與10隻雄體。雌體係從CROP CHARACTERISTICS(Farmington，MN)收得。
交配之前的dsRNA取食：將10隻雌體放置於具有11個處理的人工飲食小丸(每小丸為2μg dsRNA)的井內。將 分析盤轉移至生長室中、溫度為23±1℃、相對濕度>80%，及16：8 L：D光週期。將雌體轉移至分析盤，其含有新鮮處理的飲食每隔一天歷時10天。於第12天，將雌體與10隻雄體配對，以及提供22個未處理的飲食填塞物。於4天之後移除雄體。每隔一天提供新鮮未處理的飲食歷時8天。於第22天，將雌體轉移至含有高壓蒸氣滅菌的泥土之卵籠，加上11個未處理的人工飲食填塞物。將卵籠放回至生長室中。於第24天替換飲食。於第26天，將雌體從土壤籠移開，且予以瞬間冷凍用於RT-qPCR。將土壤籠轉移至一生長室中、溫度為27±1℃、相對濕度>80%，及24h黑暗。於4天後，使用#60篩子來清洗泥土以從各個籠子收集卵。卵係如上所述地予以處理，以預防真菌污染，以及放置於含有濾紙的小培養皿中。為各培養皿拍照，使用Image J軟體之細胞計數功能(Schneider等人之(2012)Nat.Methods 9：671-5)來給卵計數。將培養皿及卵轉移至小的生長室中、溫度為27±1℃、相對濕度>80%，及24h黑暗。從第33-47天每天監測幼蟲的孵化。每天從培養皿計數並移除幼蟲。
交配後即刻的dsRNA取食：使用相似於以上所述之方法，除了本研究開始時將10隻雄體與10隻雌體一起放置於有22個未經處理的人工飲食填塞物的井內。分析盤係如上所述地轉移至生長室中。於第3天提供新鮮未處理的飲食，以及於第5天移動雄體。將雌體轉移至處理的人工飲食，以及供養於生長室中。每隔一天提供新鮮處理的飲食歷時6天。於第12天，將雌體轉移至含有高壓蒸氣滅菌的泥土之 卵籠，加上11個處理的人工飲食填塞物。將卵籠放回至生長室中。於第14天提供新鮮處理的飲食。於第16天，將所有的雌體從土壤籠移開，且予以瞬間冷凍用於RT-qPCR。於6天之後以如上所述的方式清洗土壤籠及卵。從第23天至第37天每天監測幼蟲的孵化。每天從培養皿計數並移除幼蟲。
交配後的dsRNA取食：使用相似於以上所述關於交配後即刻的dsRNA取食之方法，除了昆蟲係每隔一天接受未經處理的人工飲食直到第11天，將雌體轉移至處理的人工飲食。於第12天，將雌體轉移至含有高壓蒸氣滅菌的泥土之卵籠，加上11個處理的人工飲食填塞物。將卵籠放回至生長室中。從第12-20天每隔一天提供新鮮處理的飲食。於第22天，將所有的雌體從土壤籠移開，且予以瞬間冷凍用於RT-qPCR。於6天之後以如上所述的方式清洗土壤籠及卵。從第29-43天每天監測幼蟲的孵化。每天從培養皿計數並移除幼蟲。每隔一天記錄所有處理組的雌體死亡率持續整個研究期間。
實施例20：曝露的持續期間
處子雄體及雌體交配歷時4天期間加上未經處理的飲食，之後使交配的雌體曝露於克魯拜爾dsRNA。為了評估曝露的持續期間之效應，使昆蟲曝露於2μg克魯拜爾或是GFP dsRNA1、2、4或是6次。各個處理完成四重複，每重複有10隻雌體與10隻雄體。成年雄體及雌體係得自於CROP CHARACTERISTICS公司(Farmington，MN)。將10 隻雄體與10隻雌體一起放置於有20個未經處理的人工飲食小丸的井內。將分析盤供養於生長室中、溫度為23±1℃、相對濕度>80%，及16：8 L：D光週期。於第3天提供新的未經處理的人工飲食。於第5天移動雄體，以及將雌體轉移至新的分析盤，其含有各別處理組的dsRNA於每井之11個飲食填塞物上。於第7天，將雌體轉移至具有新的處理人工飲食之新分析盤(每井11個填塞物)並記錄死亡率。將來自1次曝露處理的雌體轉移至未經處理的飲食。於第10與12天，將雌體轉移至具有新的處理人工飲食(每井11個填塞物)之新的分析盤，並記錄死亡率。將曝露1次與2次的雌體轉移至未經處理的飲食。於第14天，將雌體轉移至含有高壓蒸氣滅菌的泥土之卵籠。提供新鮮處理的人工飲食(每籠11個填塞物)。提供未經處理的飲食給曝露1次、2次與4次的雌體。於第16天，移除舊的飲食並添加新的處理飲食(每籠11個填塞物)。提供未經處理的飲食給曝露1、2與4次的雌體。於18天之後，將所有的雌體從土壤籠移開，且予以瞬間冷凍用於RT-qPCR。將土壤籠轉移至一生長室中、溫度為27±1℃、相對濕度>80%，及24h黑暗。於第24天，使用#60篩子來清洗泥土以從各個籠子收集卵。卵係如上所述地予以處理，以預防真菌污染，以及放置於含有濾紙的小培養皿中。為各培養皿拍照，使用Image J軟體之細胞計數功能(Schneider等人之(2012)Nat.Methods 9：671-5)來給卵計數。將培養皿及卵轉移至小的生長室中、溫度為27±1℃、相對濕度>80%，及24h黑暗。從第25-38天每天監測幼蟲的孵化。 每天從各培養皿計數並移除剛出現的幼蟲。
<110> 陶氏農業科學公司內布拉斯加大學董事會
<120> 以克魯拜爾基因(KRUPPEL GENE)之親代RNA干擾(RNAi)抑制作用來控制鞘翅目害蟲之技術
<130> 2971-P12624.2US(76901-UP-NP)
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<160> 69
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1617
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera)
<400> 1
<210> 2
<211> 1640
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 2
<210> 3
<211> 371
<212> PRT
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 3
<210> 4
<211> 291
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 啟動子(promotor)寡核苷酸
<400> 5
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 6
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 7
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 8
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 9
<210> 10
<211> 370
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分編碼區域
<400> 10
<210> 11
<211> 503
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分編碼區域
<400> 11
<210> 12
<211> 218
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 12
<210> 13
<211> 424
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<220>
<221> 其他特徵
<222> (393)..(393)
<223> n為a、c、g或t
<220>
<221> 其他特徵
<222> (394)..(394)
<223> n為a、c、g或t
<220>
<221> 其他特徵
<222> (395)..(395)
<223> n為a、c、g或t
<400> 13
<210> 14
<211> 397
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 14
<210> 15
<211> 490
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 15
<210> 16
<211> 330
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 16
<210> 17
<211> 320
<212> DNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 17
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 18
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 20
<210> 21
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 21
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 24
<210> 25
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 25
<210> 26
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 26
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 27
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 28
<210> 29
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 29
<210> 30
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 30
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 31
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 32
<210> 33
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 33
<210> 34
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 34
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 35
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 36
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 37
<210> 38
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 38
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 39
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 40
<210> 41
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 41
<210> 42
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 42
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 43
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 44
<210> 45
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 45
<210> 46
<211> 222
<212> DNA
<213> 馬鈴薯
<400> 46
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<220>
<221> 其他特徵
<222> (22)..(22)
<223> n為a、c、g或t
<400> 47
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 48
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 49
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 50
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 51
<210> 52
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 52
<210> 53
<211> 151
<212> DNA
<213> 大腸桿菌
<400> 53
<210> 54
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分編碼區域
<400> 54
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 55
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 56
<210> 57
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 57
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 58
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 59
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 60
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 61
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 62
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 63
<210> 64
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 64
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子寡核苷酸
<400> 65
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探針寡核苷酸
<400> 66
<210> 67
<211> 1617
<212> RNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 67
<210> 68
<211> 1640
<212> RNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 68
<210> 69
<211> 291
<212> RNA
<213> 玉米根螢葉甲
<400> 69

Claims (57)

  1. 一種經單離的核酸，其包含選自於以下所組成的群組之至少一多核苷酸：序列辨識編號：1，序列辨識編號：1之互補物，序列辨識編號：1之至少15個連續核苷酸的片段，序列辨識編號：1之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，一葉甲(Diabrotica)生物體之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：1，一葉甲生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1，一葉甲生物體之天然非編碼序列，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：67之天然RNA分子；一葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：67之天然RNA分子；一葉甲生物體之天然編碼序列之至少15個連續核苷酸的片段，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1，一葉甲生物體之天然編碼序列之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：1，一葉甲生物體之天然非編碼序列之至少15個連續核苷酸的片段，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：67之天然RNA分子，以及一葉甲生物體之天然非編碼序列之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：67之天然RNA分子，序列辨識編號：2，序列辨識編號：2之互補物，序 列辨識編號：2之至少15個連續核苷酸的片段，序列辨識編號：2之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，一葉甲生物體之天然編碼序列，其包含序列辨識編號：2，一葉甲生物體之天然編碼序列之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：2，一葉甲生物體之天然非編碼序列，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：68之天然RNA分子；一葉甲生物體之天然非編碼序列之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：68之天然RNA分子；一葉甲生物體之天然編碼序列之至少15個連續核苷酸的片段，該天然編碼序列包含序列辨識編號：2，一葉甲生物體之天然編碼序列之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然編碼序列包含序列辨識編號：2，一葉甲生物體之天然非編碼序列之至少15個連續核苷酸的片段，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：68之天然RNA分子，以及一葉甲生物體之天然非編碼序列之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，該天然非編碼序列轉錄成包含序列辨識編號：68之天然RNA分子。
  2. 如請求項1之多核苷酸，其中該多核苷酸係選自於以下所組成的群組：序列辨識編號：1、序列辨識編號：2，以及序列辨識編號：4。
  3. 一種植物轉形載體，其包含如請求項1之多核苷酸。
  4. 如請求項1之多核苷酸，其中該生物體係選自於以下所組成的群組：玉米根螢葉甲(D.v.virgifera LeConte)；北 方玉米根蟲(D.barberi Smith and Lawrence)；黃瓜十一星葉甲食根亞種(D.u.howardi)；墨西哥玉米根葉甲(D.v.zeae)；巴西玉米根蟲(D.balteata LeConte)；黃瓜十一星葉甲球蟲(D.u.tenella)；南美葉甲(D.speciosa Germar)；以及黃瓜十一星葉甲甘薯猿葉甲蟲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。
  5. 一種核糖核酸(RNA)分子，其係從如請求項1之多核苷酸所轉錄。
  6. 一種雙股核糖核酸分子，其係產自於如請求項1之多核苷酸的表現。
  7. 如請求項6之雙股核糖核酸分子，其中使該多核苷酸序列與一鞘翅目害蟲接觸，抑制一內源性核苷酸序列的表現，該內源性核苷酸序列特異性地互補於該多核苷酸。
  8. 如請求項7之雙股核糖核酸分子，其中使該核糖核苷酸(ribonucleotide)分子與鞘翅目害蟲接觸，殺死或抑制該害蟲的生長、生殖及/或取食。
  9. 如請求項6之雙股RNA分子，其包含一第一、一第二及一第三RNA區段，其中該第一RNA區段包含該多核苷酸，其中該第三RNA區段係藉由該第二RNA區段而鏈接至該第一RNA區段，以及其中該第三RNA區段實質上為該第一RNA區段的反向互補物，藉此該第一與該第三RNA區段在轉錄成一核糖核酸時雜交而形成該雙股RNA。
  10. 如請求項5之RNA，其係選自於以下所組成的群組：長度介於約15個與約30個核苷酸之間的一雙股核糖核酸 分子及一單股核糖核酸分子。
  11. 一種植物轉形載體，其包含如請求項1之多核苷酸，其中該異源性啟動子於植物細胞中係有作用的。
  12. 一種細胞，其係以如請求項1之多核苷酸予以轉形。
  13. 如請求項12之細胞，其中該細胞為一原核細胞。
  14. 如請求項12之細胞，其中該細胞為一真核細胞。
  15. 如請求項14之細胞，其中該細胞為一植物細胞。
  16. 一種植物，其係以如請求項1之多核苷酸予以轉形。
  17. 一種如請求項16之植物的種子，其中該種子包含該多核苷酸。
  18. 一種商品產品，其產自於如請求項16之植物，其中該商品產品包含可偵測數量之該多核苷酸。
  19. 如請求項16之植物，其中該至少一多核苷酸係於該植物中表現為一雙股核糖核酸分子。
  20. 如請求項15之細胞，其中該細胞為玉蜀黍(Zea mays)細胞。
  21. 如請求項16之植物，其中該植物為玉蜀黍(Zea mays)。
  22. 如請求項16之植物，其中該至少一多核苷酸係於該植物中表現為一核糖核酸分子，以及當一鞘翅目害蟲攝入該植物的一部分時，該核糖核酸分子抑制一內源性多核苷酸的表現，該內源性多核苷酸特異性地互補於該至少一多核苷酸。
  23. 如請求項1之多核苷酸，其進一步包含至少一個額外的多核苷酸，其編碼一RNA分子，該RNA分子抑制一內源 性害蟲基因的表現。
  24. 如請求項23之多核苷酸，其中該額外的多核苷酸編碼一抑制性核糖核酸(iRNA)分子，該iRNA分子引致一親代RNA干擾(RNAi)的表型。
  25. 如請求項24之多核苷酸，其中該額外的多核苷酸編碼一iRNA分子，該iRNA分子抑制婆羅賀摩(brahma)或是駝背(hunchback)基因的表現。
  26. 如請求項23之多核苷酸，其中該額外的多核苷酸編碼一iRNA分子，該iRNA分子於一接觸該iRNA分子的鞘翅目害蟲內，引致減少的生長及/或發育及/或死亡率(致命的RNAi)。
  27. 一種植物轉形載體，其包含如請求項23之多核苷酸，其中該額外的多核苷酸係各自可操縱地鏈接至一在植物細胞中有作用的異源性啟動子。
  28. 如請求項1之多核苷酸，其中該多核苷酸係可操縱地鏈接至一異源性啟動子。
  29. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含提供包含一核糖核酸(RNA)分子的製劑，其一旦與該鞘翅目害蟲接觸，即起作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該RNA與選自於下列所組成的群組之多核苷酸特異性地雜交：序列辨識編號：67-69中任一者；序列辨識編號：67-69中任一者的互補物；序列辨識編號：67-69中任一者之至少15個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：67-69中任一者之至少15個連續核苷酸的片段 之互補物；序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本；序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本的互補物；序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本之至少15個連續核苷酸的片段；以及序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本之至少15個連續核苷酸的片段之互補物。
  30. 如請求項29之方法，其中該製劑為一雙股RNA分子。
  31. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含：將一核糖核酸(RNA)分子引入至鞘翅目害蟲內，其一旦與該鞘翅目害蟲接觸，即起作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該RNA與選自於下列中任一者所組成的群組之多核苷酸特異性地雜交：序列辨識編號：67-69，序列辨識編號：67-69中任一者的互補物，序列辨識編號：67-69中任一者之至少15個連續核苷酸的片段，序列辨識編號：67-69中任一者之至少15個連續核苷酸的片段之互補物，序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本，序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本的互補物，序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本之至少15個連續核苷酸的片段，以及序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本之至少15個連續核苷酸的片段之互補物；藉此產生一具有親代RNA干擾(pRNAi)表型之鞘翅 目害蟲。
  32. 如請求項31之方法，其中該RNA係引入至一雄性鞘翅目害蟲內。
  33. 如請求項31之方法，其中該RNA係引入至一雌性鞘翅目害蟲內，該方法進一步包含釋放具有該pRNAi表型之該雌性鞘翅目害蟲至該害蟲族群，其中具有該pRNAi表型之該雌性鞘翅目害蟲與該雄性害蟲族群之間交配，比其他雌性害蟲與該雄性害蟲族群之間交配，產生更少的活的子代。
  34. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含：提供包含一第一及一第二多核苷酸序列的製劑，其一旦與該鞘翅目害蟲接觸，即起作用以抑制該鞘翅目害蟲內的生物功能，其中該第一多核苷酸序列包含一區域，該區域與序列辨識編號：67及/或序列辨識編號：68之大約19個至大約30個連續核苷酸展現出從約90%至約100%的序列同一性，以及其中該第一多核苷酸序列與該第二多核苷酸序列係特異性地雜交。
  35. 如請求項34之方法，其中該核糖核酸分子為一雙股核糖核酸分子。
  36. 如請求項34之方法，其中相對於侵擾相同宿主植物物種、但缺乏該經轉形植物細胞之相同的害蟲物種族群，該鞘翅目害蟲族群係降低的。
  37. 一種用於控制一鞘翅目害蟲族群的方法，該方法包含：在鞘翅目害蟲之宿主植物中提供一經轉形的植物 細胞，該經轉形植物細胞包含如請求項1之多核苷酸，其中該多核苷酸被表現以生成一核糖核酸分子，其一旦與屬於該族群之鞘翅目害蟲接觸時，即起作用以抑制在該鞘翅目害蟲內一靶定序列的表現，且致使該鞘翅目害蟲或害蟲族群的生殖減少，相對於在相同宿主植物物種但不含該多核苷酸之植物上的相同害蟲物種的生殖。
  38. 如請求項37之方法，其中該核糖核酸分子為一雙股核糖核酸分子。
  39. 如請求項37之方法，其中相對於侵擾相同宿主植物物種、但缺乏該經轉形植物細胞之鞘翅目害蟲族群，該鞘翅目害蟲族群係降低的。
  40. 一種控制一植物中鞘翅目害蟲侵擾的方法，該方法包含在鞘翅目害蟲的飲食中提供一核糖核酸(RNA)，該核糖核酸與下列所組成的群組之多核苷酸特異性地雜交：序列辨識編號：67-69；序列辨識編號：67-69中任一者的互補物；序列辨識編號：67-69中任一者之至少15個連續核苷酸的片段；序列辨識編號：67-69中任一者之至少15個連續核苷酸的片段之互補物；序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本；序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本的互補物；序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本之至少15個連續核苷酸的片段；以及 序列辨識編號：1及2任一者之轉錄本之至少15個連續核苷酸的片段之互補物。
  41. 如請求項40之方法，其中該飲食包含一植物細胞，該植物細胞係經轉形以表現該多核苷酸。
  42. 如請求項40之方法，其中該特異性地雜交的RNA被包含在一雙股RNA分子內。
  43. 一種用於改良一玉米作物產量的方法，該方法包含：將如請求項1之核酸引入至玉米植物內，以產生一基因轉殖玉米植物；以及培養該玉米植物以允許該至少一多核苷酸的表現；其中該至少一多核苷酸的表現抑制鞘翅目害蟲的生殖或生長，以及因鞘翅目害蟲感染所致的產量損失。
  44. 如請求項43之方法，其中該至少一多核苷酸的表現生產一RNA分子，該RNA分子在已經接觸該玉米植物之一部份的鞘翅目害蟲中，箝制至少一第一靶定基因。
  45. 一種用於生產一基因轉殖植物細胞的方法，該方法包含：以一載體轉形一植物細胞，該載體包含如請求項1之核酸；在足以允許一包含數個經轉形植物細胞之植物細胞培養物發展的條件下，培養該經轉形植物細胞；選擇已經將該至少一多核苷酸整合至其等基因組內的經轉形植物細胞；篩選表現由該至少一多核苷酸所編碼之核糖核酸 (RNA)分子的該經轉形植物細胞；以及選擇表現該RNA之植物細胞。
  46. 如請求項45之方法，其中該RNA分子為一雙股RNA分子。
  47. 一種用於提供抗鞘翅目害蟲防護性給一基因轉殖植物的方法，該方法包含：提供由如請求項45之方法所生產的基因轉殖植物細胞；以及從該基因轉殖植物細胞再生基因轉殖植物，其中由該至少一多核苷酸所編碼之核糖核酸分子之表現，係足以調控接觸該經轉形植物的鞘翅目害蟲中一靶定基因的表現。
  48. 一種用於生產一基因轉殖植物細胞的方法，該方法包含：以一載體轉形一植物細胞，該載體包含用於防護植物免受鞘翅目害蟲傷害的構件；在足以允許一包含數個經轉形植物細胞之植物細胞培養物發展的條件下，培養該經轉形植物細胞；選擇已經將防護植物免受鞘翅目害蟲傷害的該構件整合至其等基因組內的經轉形植物細胞；篩選該經轉形植物細胞，其表現用於抑制鞘翅目害蟲中的一必要基因表現之構件；以及選擇一植物細胞，其表現用於抑制鞘翅目害蟲中的必要基因表現之該構件。
  49. 一種用於生產一鞘翅目害蟲-防護性基因轉殖植物的方法，該方法包含：提供由如請求項48之方法所生產的基因轉殖植物細胞；以及從該基因轉殖植物細胞再生基因轉殖植物，其中用於抑制鞘翅目害蟲中的一必要基因表現之該構件的表現，係足以調控接觸該經轉形植物的鞘翅目害蟲中之一靶定基因的表現。
  50. 如請求項1之核酸，其進一步包含編碼源自蘇力菌(Bacillus thuringiensis)、鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)，或假單胞菌屬物種(Pseudomonas spp.)的多肽之多核苷酸。
  51. 如請求項49之核酸，其中該源自蘇力菌(B.thuringiensis)的多肽係選自於包含下列的群組：Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A，以及Cyt2C。
  52. 如請求項15之細胞，其中該細胞包含編碼源自蘇力菌(Bacillus thuringiensis)、鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)，或假單胞菌屬物種(Pseudomonas spp.)的多肽之多核苷酸。
  53. 如請求項51之細胞，其中該源自蘇力菌的多肽係選自於包含下列的群組：Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、 Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A，以及Cyt2C。
  54. 如請求項16之植物，其中該植物包含編碼源自蘇力菌(Bacillus thuringiensis)、鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)，或假單胞菌屬物種(Pseuaomonas spp.)的多肽之多核苷酸。
  55. 如請求項54之植物，其中該源自蘇力菌的多肽係選自於包含下列的群組：Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A，以及Cyt2C。
  56. 如請求項43之方法，其中該經轉形植物細胞包含一核苷酸序列，其編碼源自蘇力菌(Bacillus thuringiensis)、鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)，或假單胞菌屬物種(Pseuaomonas spp.)的多肽。
  57. 如請求項56之方法，其中該源自蘇力菌的多肽係選自於包含下列的群組：Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A，以及Cyt2C。
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