TW201627322A

TW201627322A - 抗-ｄｒ５抗體和包括其ｄｒ５-結合結構域的分子

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Publication number: TW201627322A
Application number: TW104117565A
Authority: TW
Inventors: 保羅摩爾; 強納森李; 萊斯利強生; 坎帕納尚
Original assignee: 宏觀基因股份有限公司
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2016-08-01
Also published as: AR100680A1; WO2016122701A1

Abstract

本發明涉及DR5 mAb 1和DR5 mAb 2之抗-DR5抗體，並涉及此抗體的人源化和嵌合形式。本發明另外涉及DR5-結合分子，其包括此分子的片段，並且另外涉及雙特異性分子，其包括雙抗體、BiTE、杵/臼雙特異性抗體等，其包括：(i)DR5-結合片段和(ii)能夠結合存在於效應細胞表面上的分子的表位元的結構域。

Description

抗-DR5抗體和包括其DR5-結合結構域的分子

本發明涉及DR5 mAb 1和DR5 mAb 2之抗-DR5抗體，並且涉及此抗體的人源化形式和嵌合形式。本發明另外涉及DR5-結合分子，其包括此分子的片段，並且另外涉及雙特異性分子——包括雙抗體、BiTEs、杵/臼（knobs/holes）雙特異性抗體等，其包括(i)DR5-結合片段和(ii)能夠結合存在於效應細胞表面上的分子的表位元的結構域。

I. 死亡受體 5 (“DR5”)

健康動物保持對腫瘤細胞的連續免疫監督。通過各種生長因數、細胞因數和激素的相互作用，此動物可介導遇到的受損細胞的程式化死亡(凋亡 )。獲得對這種細胞死亡過程的抗性的受損細胞和獲得以不受控制的方式進行複製的能力的受損細胞可變成腫瘤細胞並導致癌症(參見Abdulghani, J.等(2010) “TRAIL Receptor Signaling and Therapeutics ,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108；Andera, L. (2009) “Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family ,” Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180；Carlo-Stella, C.等(2007) “Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy ,” Clin, Cancer 13(8):2313-2317；和Chaudhari, B.R.等(2006) “Following the TRAIL to apoptosis ,” Immunologic Res. 35(3):249-262)。

能夠選擇性靶向細胞死亡途徑以便對正常細胞不發揮作用同時提高殺死癌症細胞的這種途徑效率的方法在癌症治療中特別令人感興趣。腫瘤壞死因數(TNF )超家族的成員——包括Fas配體、TNF和TNF-相關的凋亡誘導配體(TRAIL )——已經被鑒別為癌症生物療法的靶標(參見Walczak, H. (2013) “Death Receptor–Ligand Systems in Cancer, Cell Death,and Inflammation ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013;5:a008698; 1-19頁；Falschlehner, C.等(2007) “TRAIL Signalling: Decisions Between Life and Death ,” Intl. J. Biochem. Cell Biol. 39:1462-1475；和Abdulghani, J.等(2010) “TRAIL Receptor Signaling and Therapeutics ,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108)。TRAIL是由效應淋巴細胞表達的細胞因數。回應細胞因數，尤其是在TRAIL基因啟動子中具有應答元件的干擾素-γ，TRAIL表達於免疫效應細胞諸如天然殺傷細胞、巨噬細胞、樹突細胞和細胞毒性T細胞的表面上(參見Allen, J.E.等(2012) “Regulation Of The Human TRAIL Gene ,” Cancer Biol. Ther. 13(12):1143-1151)。其表達水準在新分離的淋巴細胞中極其低，並且僅小部分的天然殺傷(NK )細胞表達可檢測的TRAIL。據信，TRAIL在調節涉及干擾素的固有免疫應答、增強針對腫瘤細胞的宿主應答和改變微環境以增強抗原呈遞和促進NK細胞和其它免疫系統細胞的組織滲入中發揮作用。

TRAIL-誘導的凋亡和由常規化療和放療誘導的凋亡之間的一個重要區別是後者很大程度上依賴於例如p53腫瘤抑制蛋白的細胞損傷識別 (參見Dimberg, L.Y.等(2013) “On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting and Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics ,” Oncogene 32:1341-1350)。依賴於p53來引起凋亡應答造成了癌症治療中的問題，因為由於失活突變在一半以上的所有癌症細胞中發生p53的丟失(參見Hollstein, M.等(1994) “Database Of p53 Gene Somatic Mutations In Human Tumors And Cell Lines ,” Nucleic Acids Res. 22:3551-3555)。

TRAIL是II型蛋白質，具有281個氨基酸殘基，並且與TNF-α和FasL (CD95L )具有同源性(參見Chaudhari, B.R.等(2006) “Following the TRAIL to Apoptosis ,” Immunologic Res. 35(3):249-262)。TRAIL由細胞外TNF-樣結構域、細胞外柄、跨膜螺旋和胞質結構域組成。TRAIL結合兩種不同類型的受體：觸發TRAIL-誘導的凋亡的死亡受體(DR )和抑制此途徑的誘殺型受體。至今，已經識別對TRAIL特異的兩種人死亡受體：TRAIL-R1 (也稱為DR4 )和TRAIL-R2 (也稱為DR5 )。另外，已經鑒別三種公認的誘殺型受體：TRAIL-R3 (DcR1 )、TRAIL-R4 (DcR2 )和護骨蛋白(參見Chaudhari, B.R.等(2006) “Following the TRAIL to Apoptosis ,” Immunologic Res. 35(3):249-262；Carlo-Stella, C.等(2007) “Targeting TRAIL Agonistic Receptor for Cancer Therapy ,” Clin, Cancer 13(8):2313-2317；和Allen, J.E.等(2012) “Regulation Of The Human TRAIL Gene,” Cancer Biol. Ther. 13(12):1143-1151)。TRAIL-R1 (DR4)以非常低的水準表達於大部分人組織中，包括脾、胸腺、肝、外周血白細胞、啟動的T細胞、小腸和一些腫瘤細胞系。相比之下，TRAIL-R2 (DR5)普遍分佈於正常和腫瘤細胞系中，但是在脾、外周血白細胞、啟動的淋巴細胞和肝細胞中更豐富(參見Abdulghani, J.等(2010) “TRAIL Receptor Signaling and Therapeutics ,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108)。

DR4和DR5是一次跨膜(single-pass) I型膜蛋白，並且由位於染色體8p上的兩個基因編碼。DR4和DR5各包含胞外區——其包括富含半胱氨酸的結構域(CRDs )、跨膜結構域和位於受體胞質部分內的死亡結構域。已經鑒別了DR5的兩個剪接變異體——長DR5(DR5(L) )和短DR5 (DR5(S) )。這些變異體在定位於受體的CRD和其跨膜結構域之間的29個氨基酸的一段序列中有差異。在TRAIL結合之後，DR4和DR5能夠轉導凋亡信號(參見van Roosmalen, I.A.M.等(2014) “Two Death-Inducing Human TRAIL Receptor To Target In Cancer: Similar Or Distinct Regulation And Function? ,” Biochem. Pharamcol. 91:447-456)。

當TRAIL結合於DR4或DR5時，受體同源三聚化(homotrimerize)，使得受體的死亡結構域能夠徵募銜接蛋白Fas-有關的死亡結構域和胱天蛋白酶8 (胱天蛋白酶原 8 )的失活的、未切割形式或胱天蛋白酶10 (胱天蛋白酶原 10 ) 的未切割形式。受體、具有死亡結構域的Fas-有關的蛋白質和胱天蛋白酶原8或胱天蛋白酶原10一起形成死亡誘導信號複合物(DISC )。在DISC處，在依賴二聚化和切割的過程中，胱天蛋白酶原8被啟動。然後，啟動的胱天蛋白酶8切割下游底物，最終導致效應胱天蛋白酶3的切割和啟動。胱天蛋白酶3的啟動引發分子啟動事件的級聯，最終導致死亡底物的產生(參見Schneider-Brachert, W.等(2013) “Membrane Trafficking of Death Receptors: Implications on Signalling ,” Int. J. Mol. Sci. 14:14475-14503；Falschlehner, C.等(2009) “TRAIL and Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics ,” 在以下: THERAPEUTIC TARGETS OF THE TNF SUPERFAMILY (Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, NY；195-206頁；Falschlehner, C.等(2007) “TRAIL Signalling: Decisions Between Life And Death ,” Intl. J. Biochem. Cell Biol. 39:1462-1475；Guicciardi, M.E.等(2009) “Life And Death By Death Receptors ,” FASEB J. 23:1625-1637；Kischkel, F.C.等(2000) “Apo2L/TRAIL-Dependent Recruitment of Endogenous FADD and Caspase-8 to Death Receptors 4 and 5 ,” Immunity 12:611-620；Dimberg, L.Y.等(2013) “On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting and Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics ,” Oncogene 32:1341-1350；Buchsbaum, D.J.等(2007) “TRAIL-Receptor-Antibodies as a Potential Cancer Treatment ,” Future Oncol. 3(4):405-409；Buchsbaum, D.J.等(2006) “TRAIL Receptor-Targeted Therapy ,” Future Oncol. 2(4):493-508；Andera, L. (2009) “Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family ,” Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180；和Chan, F.K.-M. (2007) “Three is Better Than One: Pre-Ligand Receptor Assembly in the Regulation of TNF Receptor Signaling ,” Cytokine 37(2):101-107)。三種誘殺型受體或者充當誘餌或者轉導抗凋亡信號(參見Carlo-Stella, C.等(2007) “Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy ,” Clin, Cancer 13(8):2313-2317；Mahmood, Z.等(2010) “Death Receptors: Targets For Cancer Therapy ,” Exper. Cell. Res. 316:887-899；和Oikonomou, E.等(2013) “The TRAIL Of Oncogenes To Apoptosis ,” Intl. J Union Biochem. Molec. Biol. 39(4):343-354)。

除了此“外在 ”途徑之外，TRAIL還可通過“內在 ”途徑介導細胞死亡(參見Carlo-Stella, C.等(2007) “Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy, ” Clin, Cancer 13(8):2313-2317；Buchsbaum, D.J.等(2006) “TRAIL Receptor-Targeted Therapy ,” Future Oncol. 2(4):493-508；和Buchsbaum, D.J.等(2007) “TRAIL-Receptor-Antibodies as a Potential Cancer Treatment ,” Future Oncol. 3(4):405-409)。內在途徑由促細胞凋亡蛋白質Bid 的切割啟動而介導，所述Bid 然後結合其他促細胞凋亡蛋白質，以形成介導細胞色素c從線粒體釋放的複合物。此釋放觸發了胱天蛋白酶釋放和導致細胞死亡的啟動的級聯(參見Kandasamy, K.等(2003) “Involvement Of Proapoptotic Molecules Bax And Bak In Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand (TRAIL)- Induced Mitochondrial Disruption And Apoptosis: Differential Regulation Of Cytochrome C And Smac/DIABLO Release ,” Cancer Res. 63:1712-1721；Rudner, J.等(2005) “Type I And Type II Reactions In TRAIL-Induced Apoptosis – Results From Dose-Response Studies ,” Oncogene 24:130-140)。

然而，分子途徑是複雜的。根據細胞類型，配體信號的相對強度和持續時間，以及向TRAIL受體下游發信號的細胞內蛋白的存在、不存在或啟動狀態，用TRAIL進行治療可刺激凋亡，或者在極少數情況下刺激細胞增殖(參見Abdulghani, J.等(2010) “TRAIL Receptor Signaling and Therapeutics ,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108；Andera, L. (2009) “Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family ,” Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180)。而且，對於誘導凋亡，某些癌症具有DR偏愛(即，DR4或DR5)，然而其他腫瘤類型並不(van Roosmalen, I.A.M.等(2014) “Two Death-Inducing Human TRAIL Receptors To Target In Cancer: Similar Or Distinct Regulation And Function? ,” Biochem. Pharamcol. 91:447-456)。

II. TRAIL 蛋白和抗 -DR 抗體的治療用途

由於TRAIL在其識別和殺傷受損細胞的能力方面是高度選擇性的，同時對正常細胞不起作用，所以可溶性重組TRAIL已經被聲明在癌症(例如，結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤；肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直腸癌)治療中具有潛在的效用(參見Micheau, O.等 (2013) “Death Receptors As Targets In Cancer ,” Br. J. Pharmacol. 169:1723-1744)；Falschlehner, C.等 (2009) “TRAIL And Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics ,” 在以下中: THERAPEUTIC TARGETS OF THE TNF SUPERFAMILY (Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, NY；195-206頁；Buchsbaum, D.J.等 (2006) “TRAIL Receptor-Targeted Therapy ,” Future Oncol. 2(4):493-508；Wajant, H.等 (2013) “Engineering Death Receptor Ligands For Cancer Therapy ,” Canc. Lett. 332:163-174；Buchsbaum, D.J.等 (2007) “TRAIL-Receptor-Antibodies as a Potential Cancer Treatment ,” Future Oncol. 3(4):405-409；Abdulghani, J.等 (2010) (“TRAIL Receptor Signaling and Therapeutics ,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108；Finnberg, N.等 (2008) “TRAIL Death Receptors As Tumor Suppressors and Drug Targets ,” Cell Cycle 7(11):1525-1528；Hellwig, C.T.等 (2012) “TRAIL Signaling and Synergy Mechanisms Used in TRAIL-Based Combination Therapies ,” Molec. Cancer Ther. 11(1):3-13；Henson, E.S.等 (2008) “The Role Of TRAIL Death Receptors In The Treatment Of Hematological Malignancies ,” Leukemia & Lymphoma 49(1):27-35；Huang, Y.等 (2007) “TRAIL Death Receptors and Cancer Therapeutics ,” Toxicol. Appl. Pharmacol. 224:284-289；Humphreys, R.C.等 (2008) “Trail Receptors: Targets for Cancer Therapy ,” 在以下中: PROGRAMMED CELL DEATH IN CANCER PROGRESSION AND THERAPY Khosravi-Far, R.和White, E. (Eds.) Springer, NY；127-158頁；Koschny, R.等 (2007) “The Promise Of TRAIL – Potential And Risks Of A Novel Anticancer Therapy ,” J. Molec. Med. 85:923-935；Kruyt, F.A.E. (2008) “TRAIL and Cancer Therapy ,” Cancer Lett. 263:14-25；Kuijlen, J.M.A.等 (2010) “Review: On TRAIL For Malignant Glioma Therapy ?,” Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36:168-182；Mellier, G.等 (2010) (“TRAILing Death in Cancer ,” Molec. Aspects Med. 31:93-112；Rahman, M.等 (2009) “The TRAIL To Targeted Therapy Of Breast Cancer ,” Adv. Cancer Res. 103:43-73；和Voelkel-Johnson, C.(2011) “TRAIL-Mediated Signaling In Prostate, Bladder And Renal Cancer ,” Nat. Rev. Urol. 8:417-427)。

由於提供更大的選擇性，已經提議了可能能夠模仿TRAIL的信號傳導的抗-DR4和抗-DR5單克隆抗體(參見Buchsbaum, D.J.等 (2006) “TRAIL Receptor-Targeted Therapy ,” Future Oncol. 2:493-508；Kelley, S.K.等 (2004) “Targeting Death Receptors In Cancer With Apo2L/TRAIL ,” Curr. Opin. Pharmacol. 4:333-339；Papenfuss, K.等 (2008) “Death Receptors As Targets For Anti-Cancer Therapy ,” J. Cell. Mol. Med. 12:2566-2585；de Bruyn, M.等 (2013) “Antibody-Based Fusion Proteins To Target Death Receptors In Cancer ,” Cancer Lett. 332:175-183)。

已經報導了馬帕木單抗(mapatumumab) ——一種抗-DR4激動劑抗體(人類基因組科學公司(Human Genome Sciences))——的三個II期臨床研究在患有非霍奇金淋巴瘤(NHL )、結直腸癌(CRC )和非小細胞肺癌(NSCLC )的患者中顯示治療作用(參見Greco, F.A.等 (2008) “Phase 2 Study Of Mapatumumab, A Fully Human Agonistic Monoclonal Antibody Which Targets And Activates The TRAIL Receptor-1, In Patients With Advanced Non-Small Cell Lung Cancer ,” Lung Cancer 61:82-90；Trarbach, T.等 (2010) “Phase II Trial Of Mapatumumab, A Fully Human Agonistic Monoclonal Antibody That Targets And Activates The Tumour Necrosis Factor Apoptosis-Inducing Ligand Receptor-1 (TRAIL-R1), In Patients With Refractory Colorectal Cancer ,” Br. J. Cancer 102:506-512；和Falschlehner, C.等 (2009) “TRAIL and Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics ,” 在以下中: THERAPEUTIC TARGETS OF THE TNF SUPERFAMILY (Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, NY；195-206頁)。TRA-8/CS-1008 ——一種人源化抗-DR5抗體(Daiichi Sankyo (東京，日本))——被報導在體外針對星形細胞瘤和白血病細胞和在體內針對移植的乳腺癌細胞已經顯示高的抗腫瘤活性(參見Buchsbaum, D.J.等 (2003) “Antitumor Efficacy Of TRA-8 Anti-DR5 Monoclonal Antibody Alone Or In Combination With Chemotherapy And/Or Radiation Therapy In A Human Breast Cancer Model ,” Clin. Cancer Res. 9:3731-3741；和Ichikawa, K. 等 (2001) “Tumoricidal Activity Of A Novel Anti-Human DR5 Monoclonal Antibody Without Hepatocyte Cytotoxicity ,” Nat. Med. 7:954-960；Saleh, M.N. 等(2008) “A Phase I Study Of CS-1008 (Humanized Monoclonal Antibody Targeting Death Receptor 5 Or DR5), Administered Weekly To Patients With Advanced Solid Tumors Or Lymphomas ,” 2008 ASCO Annual Meeting Proceedings, J. Clin. Oncol. 26(20S):摘要3537)。mDRA-6(IgG1-k) ——一種鼠科抗-人抗-DR5單克隆抗體(河南大學(Henan University))——已經被報導能夠經TRAIL外在途徑誘導Jurkat細胞的凋亡(參見Du, Y.-W.等 (2011) “A Novel Agonistic Anti-Human Death Receptor 5 Monoclonal Antibody With Tumoricidal Activity Induces Caspase- And Mitochondrial-Dependent Apoptosis In Human Leukemia Jurkat Cells ,” Cancer Biother. Radiopharmaceut. 26(2):143-152)。嵌合DR-5-靶向抗體LBY135 (Novartis)已被報導已經以10 nM或更少的IC50在一組40個人克隆癌細胞系的50%中誘導了凋亡，並已經在小鼠中的人結直腸癌異種移植模型中驗證了體內抗腫瘤活性(參見Li, J.等 (2008) “LBY135, A Novel Anti-DR5 Agonistic Antibody Induces Tumor Cell-Specific Cytotoxic Activity In Human Colon Tumor Cell LinesAnd Xenografts ,” Drug Dev. Res. 69:69-82；和Sharma, S.等 (2008) “Phase I Trial Of LBY135, A Monoclonal Antibody Agonist To DR5, Alone And In Combination With Capecitabine In Advanced Solid Tumors ,” 2008 ASCO Annual Meeting Proceedings. J. Clin. Oncol. 26(15S):3538)。處於臨床開發中的另外的抗-DR抗體包括：阿泊單抗(ApomAb) (參見Camidge, D.等 (2007) “A phase I safety and pharmacokinetic study of apomab, a human DR5 agonist antibody, in patients with advanced cancer,” 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition), J. Clin. Oncol. 25(18S):3582；Johnstone, R.W.等 (2008) “The TRAIL apoptotic pathway in cancer onset, progression and therapy,” Nat. Rev. Cancer 8:782-798)；AMG655 (LoRusso, P.等 (2007) “First-in-human study of AMG 655, a pro-apoptotic TRAIL receptor-2 agonist, in adult patients with advanced solid tumors. 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. J. Clin. Oncol. 25(18S):3534)；可那木單抗（conatumumab ） (Bajaj, M.等 (2011) “Conatumumab: A Novel Monoclonal Antibody Against Death Receptor 5 For The Treatment Of Advanced Malignancies In Adults ,” Expert Opin. Biol. Ther. 11(11):1519-1524)；來沙木單抗(lexatumumab )——一種抗-DR5激動劑抗體(人類基因組科學公司(Human Genome Sciences)) (Plummer, R.等 (2007) “Phase 1 and Pharmacokinetic Study Of LEXATUMUMAB In Patients With Advanced Cancers ,” Clin. Cancer Res. 13:6187-6194)；曲茲妥單抗(drozitumab) (Kang, Z.等 (2011) “Drozitumab, A Human Antibody To Death Receptor 5, Has Potent Antitumor Activity Against Rhabdomyosarcoma With The Expression Of Caspase-8 Predictive Of Response ,” Clin. Cancer Res. 17(10):3181-3192；Zinonos, I.等 (2014) “Doxorubicin Overcomes Resistance to Drozitumab by Antagonizing Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAPs) ,” Anticancer Res. 34(12):7007-7020；Xiang, H.等 (2013) “Death Receptor 5 Agonistic Antibody PRO95780: Preclinical Pharmacokinetics And Concentration-Effect Relationship Support Clinical Dose And Regimen Selection ,” Cancer Chemother. Pharmacol. 72(2):405-415；Stern, H.M.等 (2010) “Development Of Immunohistochemistry Assays To Assess GALNT14 and FUT3/6 In Clinical Trials Of Dulanermin And Drozitumab ,” Clin. Cancer Res. 16(5):1587-1596)和KMTR2 (Nagane, M.等 (2010) “Predominant Antitumor Effects By Fully Human Anti-TRAIL-Receptor 2 (DR5) Monoclonal Antibodies In Human Glioma Cells In Vitro And In Vivo ,” Neuro. Oncol. 12(7):687-700；和Motoki, K.等 (2005) “Enhanced Apoptosis And Tumor Regression Induced By A Direct Agonist Antibody To Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptor 2 ,” Clin. Cancer Res. 11(8):3126-3135)。

抗-DR抗體的用途在以下文獻中有評論：Falschlehner, C.等 (2009) (“TRAIL and Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics ,” 在以下中: THERAPEUTIC TARGETS of THE TNF SUPERFAMILY (Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience and Springer Science+Business Media, NY；195-206頁)；Hellwig, C.T.等 (2012) (“TRAIL Signaling and Synergy Mechanisms Used in TRAIL-Based Combination Therapies ,” Molec. Cancer Ther. 11(1):3-13)；Huang, Y.等 (2007) (“TRAIL Death Receptors And Cancer Therapeutics ,” Toxicol. Appl. Pharmacol. 224:284-289)；Humphreys, R.C.等 (2008) (“Trail Receptors: Targets for Cancer Therapy ,” 在以下中: PROGRAMMED CELL DEATH IN CANCER PROGRESSION AND THERAPY Khosravi-Far, R. and White, E. (Eds.) Springer, NY；127-158頁)；Kruyt, F.A.E. (2008) (“TRAIL and Cancer Therapy ,” Cancer Lett. 263:14-25)；Mellier, G.等 (2010) (“TRAILing Death in Cancer ,” Molec. Aspects Med. 31:93-112)；Oldenhuis, C.N.A.M.等 (2008) (“Targeting TRAIL Death Receptors ,” Curr. Opin. Pharmacol. 8:433-439)；Papenfuss, K.等 (2008) (“Death Receptors As Targets For Anti-Cancer Therapy ,” J. Cell. Mol. Med. 12(6B):2566-2585)；Micheau, O.等 (2013) (“Death Receptors As Targets In Cancer ,” Br. J. Pharmacol. 169:1723-1744；和van Roosmalen, I.A.M.等 (2014) (“Two Death-Inducing Human TRAIL Receptors To Target In Cancer: Similar Or Distinct Regulation and Function? ,” Biochem. Pharamcol. 91:447-456)。

當前的資料表明，此藥劑耐受良好，並且，血漿半衰期小於12 天，然而，這種療法的潛在應用受限於此實事：一些原發性癌細胞抵抗TRAIL凋亡，甚至在與化學療法聯合治療之後(參見Buchsbaum, D.J.等 (2007) “TRAIL-Receptor-Antibodies as a Potential Cancer Treatment ,” Future Oncol. 3(4):405-409；還參見Dimberg, L.Y.等 (2013) “On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics ,” Oncogene 32:1341-1350；Falschlehner, C.等 (2009) “TRAIL And Other TRAIL Receptor Agonists as Novel Cancer Therapeutics ,” 在以下中: THERAPEUTIC TARGETS OF THE TNF SUPERFAMILY (Grewal, I.S., Ed.) Landes Bioscience And Springer Science+Business Media, NY；195-206頁；Maksimovic-Ivanic, D.等 (2012) “Resistance To TRAIL And How To Surmount It ,” Immunol. Res. 52:157-168)。

儘管此抗體療法的前景，但研究已經顯示，一些抗-DR單克隆抗體對於臨床應用還未顯示足夠的選擇性。這可反映此實事：在九個報導的變異體中，TRAIL的僅一種特異性同種型顯示此選擇性(參見Allen, J.E.等 (2012) “Regulation Of The Human TRAIL Gene ,” Cancer Biol. Ther. 13(12):1143-1151)。已經在體外觀察到通過一些rTRAIL和抗-DR單克隆抗體在正常人細胞諸如肝細胞或角質形成細胞中誘發凋亡(參見Jo, M.等 (2000) “Apoptosis Induced In Normal Human Hepatocytes By Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand ,” Nat. Med. 6:564-567；Lawrence, D,等 (2001) “Differential Hepatocyte Toxicity Of Recombinant Apo2L/TRAIL Versions ,” Nat. Med. 7:383-385； Mori, E.等 (2004) “Human Normal Hepatocytes Are Susceptible To Apoptosis Signal Mediated By Both TRAIL-R1 And TRAIL-R2 ,” Cell. Death Differ. 11:203-207；和Qin, J.等 (2001) “Avoiding Premature Apoptosis Of Normal Epidermal Cells ,” Nat. Med. 7:385-386)。當用較高劑量(20 mg/kg)的來自人類基因組科學公司(Human Genome Sciences)的來沙木單抗(lexatumummab )抗-DR5激動劑抗體時，在少數患者中報導了隨著增加的血清丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶和膽紅素的肝毒性(參見Plummer, R.等 (2007) “Phase 1 And Pharmacokinetic Study Of LEXATUMUMAB In Patients With Advanced Cancers ,” Clin. Cancer Res. 13:6187-6194)。

抗-DR抗體公開在美國專利號8,790,663、8,715,668、8,703,712、8,461,311、8,409,570、8,372,396、8,329,180、8,173,128、8,097,704、8,067,001、8,030,023、8,029,783、7,981,421、7,897,730、7,893,216、7704502和7,476,383中；公開在美國專利公開號2014/0370019、2014/0308288、2014/0105898、2014/0004120、2014/0010812、2013/0324433、2013/0280282、2013/0243780、2013/0064838、2012/0184718、2012/0087922、2012/0070432、2011/0070248、2010/0080806、2009/0317384、2009/0317396、2009/0208483、2009/0175854和2009/0136503中；公開在歐洲專利公開號EP 2021370、EP 1790663、EP 2059533、EP 1506285、EP 1576179、EP 2636736、EP 2684896、EP 2636736、EP 2569336、EP 2046836、EP 2480230、EP 2368910、EP 2350641、EP 2292794、EP 2287285、EP 2292794和EP 2021370中；和公開在WIPO專利公開號WO 2014/159562、WO 2014/161845、WO 2014/050779、WO 2014/035474、WO 2014/009358、WO 2013/163229和WO 2013/148877中。

也已經報導了雙特異性抗體分子，其具有能夠結合腫瘤抗原的scFv結構域和能夠結合於死亡受體或結合於Fas的可溶性TRAIL (sTRAIL )或Fas (CD95)配體(FasL )結構域(參見Wajant, H.等 (2013) “Engineering Death Receptor Ligands For Cancer Therapy ,” Canc. Lett. 332:163-174)。腫瘤選擇性抗體片段與sTRAIL和sFasL的這種遺傳融合產生了高度選擇性的抗癌療法，其具有有利的抗癌特徵。然而，應用的融合蛋白的大小是非靶向可溶性配體的兩倍。因此，此途徑似乎受限於融合蛋白擴散通過多細胞以進入到實體腫瘤中的相對困難(參見de Bruyn, M.等 (2013) “Antibody-Based Fusion Proteins To Target Death Receptors In Cancer ,” Cancer Lett. 332:175-183)。能夠結合於DR5的雙特異性抗體分子公開在美國專利公開號2014/0370019、2014/0308288、2013/0243780、2012/0184718和2009/0175854；公開在歐洲專利公開號EP 1790663、EP 2059533、EP 2684896和EP 2350641中；和公開在WIPO公開號WO 2014/159562、WO 2014/161845、WO 2014/050779、WO 2014/009358和WO 2013/148877中。

除了其在癌症治療中的潛力之外，TRAIL也已經被提議作為潛在的療法用於治療細菌病原體(參見Benedict, C.A.等 (2012) “TRAIL: Not Just For Tumors Anymore ?,” J. Exp. Med. 209(11):1903-1906)。TRAIL在哮喘氣道的結構變化中也可發揮作用，因為其由各種炎性細胞，包括嗜伊紅粒細胞，表達(參見Chaudhari, B.R.等 (2006) “Following the TRAIL to Apoptosis ,” Immunologic Res. 35(3):249-262)。可溶性TRAIL製劑的應用的一個缺點是其相對短的體內半衰期(大約30分鐘)(參見Walczak, H.等 (1999) “Tumoricidal Activity Of Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand In Vivo ,” Nat. Med. 5:157-163)。另外，可溶性重組TRAIL能夠結合於TRAIL受體(從而促進癌症治療)和結合於TRAIL誘殺型受體(從而推定不提供治療益處)。TRAIL在心血管疾病中也可發揮作用(參見Martin-Ventura, J.L.等 (2007) “TRAIL and Vascular Injury,” Frontiers in Bioscience 12:3656-3667)和在炎症中發揮作用(參見Walczak, H. (2013) “Death Receptor – Ligand Systems in Cancer, Cell Death, and Inflammation ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013;5:a008698；1-19頁)。

而利用TRAIL療法的臨床試驗已經在患者中顯示低毒性，當TRAIL激動劑被用作單一療法時已觀察到令人沮喪的小的治療效果(參見Dimberg, L.Y.等 (2013) “On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics ,” Oncogene 32:1341-1350)。此結論反映此觀察：發現已經進化成腫瘤細胞的相當部分的受損細胞是抵抗TRAIL的。此經歷已經得出了此結論：TRAIL療法可非常有益，但僅針對小部分患者(參見Dimberg, L.Y.等 (2013) “On The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics ,” Oncogene 32:1341-1350)。

TRAIL抗性的多種機制已經被鑒別(參見Maksimovic-Ivanic, D.等 (2012) “Resistance To TRAIL And How To Surmount It ,” Immunol. Res. 52:157-168；Dimberg, L.Y.等 (2013) “N The TRAIL To Successful Cancer Therapy? Predicting And Counteracting Resistance Against TRAIL-Based Therapeutics ,” Oncogene 32:1341-1350；Thorburn, A.等 (2008) “TRAIL Receptor-Targeted Therapeutics: Resistance Mechanisms And Strategies To Avoid Them ,” Drug Resist. Updat. 11(1-2):17-24；和Whiteside, T.L. (2007) “The Role of Death Receptor Ligands in Shaping Tumor Microenvironment ,” Immunol. Investig. 36:25-46)。在假定的解釋中是某些胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶8)通過TRAIL-抗性腫瘤細胞的表達降低的可能性，或者胱天蛋白酶抑制劑(例如，XIAP、cIAP)通過此細胞的表達增加的可能性，或者凋亡抑制劑(例如，Bcl-2、Mcl-1等)通過此細胞的表達增加的可能性(參見Abdulghani, J.等 (2010) “TRAIL Receptor Signaling and Therapeutics ,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108；和Buchsbaum, D.J.等 (2006) “TRAIL Receptor-Targeted Therapy ,” Future Oncol. 2(4):493-508)。可選地，TRAIL抗性可反映腫瘤細胞的TRAIL受體中的缺陷的存在，或者針對死亡受體諸如FLIP或誘殺型受體TRAIL-R3和TRAIL-R4非常具有選擇性的抑制劑的表達增加。參見Abdulghani, J.等 (2010) “TRAIL Receptor Signaling and Therapeutics ,” Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108。鑒於此抗性，基於TRAIL的療法通常被建議僅用作被提供來與其他化學治療劑協作的藥劑(參見Buchsbaum, D.J.等 (2006) “TRAIL Receptor-Targeted Therapy ,” Future Oncol. 2(4):493-508)。

因此，儘管所有的現有進步，但是仍需要能夠為患有癌症或其他疾病和病況的患者提供改進的治療價值的抗-DR5抗體。

本發明涉及DR5 mAb 1和DR5 mAb 2之.抗-DR5抗體，並且涉及此抗體的人源化形式和嵌合形式。本發明另外涉及DR-結合分子，其包括此分子的片段，並且本發明另外涉及雙特異性分子——包括雙抗體、BiTEs、杵/臼雙特異性抗體等，其包括(i)此DR5-結合片段和(ii)能夠結合存在於效應細胞表面上的分子的表位元的結構域。

在一實施方式中，一種抗-人DR5-結合分子，其包括可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。其中，可變輕鏈結構域包括CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域和CDR_L 3結構域，和可變重鏈結構域包括CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域。其中，(A) (1) CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域和CDR_L 3結構域是DR5 mAb 1的輕鏈CDR，並且，分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:4 、 SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6 ；和(2) CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域是DR5 mAb 1的重鏈CDR，並且，分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:9 、 SEQ ID NO:10 和SEQ ID NO:11 。或者(B) (1) CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域和CDR_L 3結構域是DR5 mAb 2的輕鏈CDR，並且，分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:14 、 SEQ ID NO:15 和SEQ ID NO:16 ；和(2) CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域是DR5 mAb 2的重鏈CDR，並且，分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:19 、 SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:21 。

在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子中，(1) CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域和CDR_L 3結構域是DR5 mAb 1的輕鏈CDR，並且分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:4 、 SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6 ；和(2) CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域是DR5 mAb 1的重鏈CDR，並且分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:9 、 SEQ ID NO:10 和SEQ ID NO:11 。

在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子中，可變輕鏈結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:3 。

在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子中，可變重鏈結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:8 。

在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子中， (1) CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域和CDR_L 3結構域是DR5 mAb 2的輕鏈CDR，並且分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:14 、 SEQ ID NO:15 和SEQ ID NO:16 ；和(2) CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域是DR5 mAb 2的重鏈CDR，並且分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:19 、 SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:21 。

在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子中，可變輕鏈結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:13 。

在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子的實施方式，其中重鏈可變結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:18 。

在一些實施方式中，此分子是抗體，並且尤其地，此分子是嵌合抗體或人源化抗體。

在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子中，抗體、嵌合抗體或人源化抗體包括變異Fc區。此變異Fc區可包括一個或多個氨基酸修飾，並且此些氨基酸修飾改變變異Fc區對FcγR的親和力。尤其地，其此些氨基酸修飾降低變異Fc區對FcγRIIB的親和力。在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子中，此些氨基酸修飾包括選自以下的至少一個氨基酸取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中的編號是採用Kabat中的EU索引的編號。尤其地，在一些實施方式中，在此抗-人DR5-結合分子中，此些氨基酸修飾包括：(A) 選自以下的至少一個取代：F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；(B)選自以下的至少兩個取代：(1) F243L和P396L；(2) F243L和R292P；和(3) R292P和V305I；(C) 選自以下的至少三個取代：(1) F243L、R292P和Y300L；(2) F243L、R292P和V305I；(3) F243L、R292P和P396L；和(4) R292P、V305I和P396L；(D) 選自以下的至少四個取代：(1) F243L、R292P、Y300L和P396L；和(2) F243L、R292P、V305I和P396L；或者(E) 選自以下的至少五個取代：(1) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和(2) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。

在一些實施方式中，此抗-人DR5-結合分子是雙特異性結合分子，其能夠同時結合於人DR5和第二表位。在一些實施方式中，此第二表位元可是存在於效應細胞表面上的分子的表位(尤其地，第二表位可是CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32、CD64、TCR、 BCR或NKG2D的表位，特別是其中第二表位是CD3的表位)。

在一些實施方式中，此抗-人DR5-結合分子中，此分子是雙抗體，並且此雙抗體是共價結合的複合物，其包括兩條多肽鏈，或者，包括三條多肽鏈。在一些實施方式中，此分子包括Fc區。在一些實施方式中，此分子包括白蛋白-結合結構域，尤其是去免疫化的(deimmunized)白蛋白-結合結構域。在一些實施方式中，此分子結合人DR5和人CD3。在一些實施方式中，此抗-人DR5-結合分子中，(A) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:140 和第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:142 ；(B) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:144 和第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:146 ；(C) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:148 和第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:150 ；(D) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:152 和第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:154 ；(E) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:156 和第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:158 ；(F) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:160 和第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:162 ；(G) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:164 和第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:165 ；或者(H) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:166 和第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:167 。

在一些實施方式中，此抗-人DR5-結合分子結合人DR5和人CD3，並且另外包括Fc區。並且，在一些實施方式中，DR5-結合分子包括三條多肽鏈，其中(A) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:168 ；第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:169 ；和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:170 ；(B) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:171 ；第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:172 ；和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:173 ；(C) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:174 ；第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:175 ；和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:176 ；(D) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:177 ；第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:178 ；和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:179 ；或者(E) 第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:180 ；第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:181 ；和第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:182 。

在一些實施方式中，此分子是嵌合抗原受體，其包括可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域以及細胞內結構域，其中細胞內結構域選自：41BB-CD3ζ、b2c-CD3ζ、CD28、CD28-4-1BB-CD3ζ、CD28-CD3ζ、CD28-FcεRIγ、CD28mut-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD3ζ、CD4-CD3ζ、CD4-FcεRIγ、CD8-CD3ζ、FceRIγ、FcεRIγCAIX、調蛋白-CD3ζ、IL-13-CD3ζ或Ly49H-CD3ζ。

在一些實施方式中，此分子包括Fc區。並且此Fc區可是變異Fc區。其中，變異Fc區可包括一個或多個氨基酸修飾，並且此些氨基酸修飾改變變異Fc區對FcγR的親和力。更具體而言，此些氨基酸修飾可包括選自以下的至少一個氨基酸取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中的編號是採用Kabat中的EU索引的編號。在一些實施方式中，此些氨基酸修飾包括：(A) 選自以下的至少一個取代：F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；(B) 選自以下的至少兩個取代：(1) F243L和P396L；(2) F243L和R292P；和(3) R292P和V305I；(C) 選自以下的至少三個取代：(1) F243L、R292P和Y300L；(2) F243L、R292P和V305I；(3) F243L、R292P和P396L；和(4) R292P、V305I和P396L；(D) 選自以下的至少四個取代：(1) F243L、R292P、Y300L和P396L；和(2) F243L、R292P、V305I和P396L；或者(E) 選自以下的至少五個取代：(1) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和(2) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。

在一些實施方式中，任意上述之抗-人DR5-結合分子被用於治療癌症。

在一些實施方式中，任意上述之抗-人DR5-結合分子被可檢測地標記，並且被用於癌症的診斷或預後。

在一實施方式中，一種在癌症的治療或診斷或預後中的用途，其中癌症通過癌細胞的存在來表徵，並且所述癌細胞選自如下的細胞：腎上腺腫瘤、AIDS-有關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞腫瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦腫瘤、乳腺癌、頸動脈體腫瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症(pediatric cancer)、末梢神經鞘腫瘤、嗜鉻細胞瘤（phaeochromocytoma）、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層(posterious uveal)黑素瘤、罕見的血液疾病、腎轉移性癌、杆狀(rhabdoid)腫瘤、橫紋肌肉瘤(rhabdomysarcoma)、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。

在一些實施方式中，此癌症可是結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤；肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌或直腸癌。

在一些實施方式中，此癌症可是急性髓樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣(blastic plasmacytoid)樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)——包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生病或伯基特淋巴瘤。

本申請要求美國專利申請號62/107,786 (2015年1月26日提交；未決)的優先權，此申請通過引用以其整體併入本文。

本發明涉及DR5 mAb 1(monoclonal antibody 1)和DR5 mAb 2之抗-DR5抗體，並且涉及此抗體的人源化形式和嵌合形式。本發明另外涉及DR5-結合分子，其包括此分子的片段，並且另外涉及雙特異性分子——包括雙抗體、BiTEs、杵/臼雙特異性抗體等，其包括：(i)此DR5-結合片段和(ii)能夠結合存在於效應細胞表面上的分子的表位元的結構域。

I. 抗體及其結合結構域

根據本發明任一實施方式的抗體是免疫球蛋白分子，其能夠通過位於免疫球蛋白分子的可變結構域內的至少一個抗原識別位點特異性結合於靶標，諸如碳水化合物、多核苷酸、脂類、多肽等。如本文中使用的，術語“抗體 ”指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝化抗體、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的雙特異性Fvs (sdFv)、內抗體和任意以上的表位-結合片段。具體地，抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，所述免疫球蛋白分子即含有抗原結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以具有任意類型(例如， IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如，IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 、IgG₄ 、IgA₁ 和IgA₂ )或亞類。除了他們在診斷中的已知用途之外，已經顯示抗體可用作治療劑。過去幾十年間已經見證了對抗體治療潛力的興趣的復興，並且，抗體已經變成生物技術類藥物的主流類別中的一類(參見Chan, C.E.等 (2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。接近200種基於抗體的藥物已經被批准應用或進行開發。

術語“單克隆抗體 ”指同源抗體群，其中單克隆抗體包括在選擇性結合抗原中涉及的氨基酸(天然產生的和非天然產生的)。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅包括完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且還包括其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')₂ Fv)、單鏈(scFv)、其變異體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括需要的結合抗原的特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任意其他修飾的構型。對於抗體的來源或其被製造的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)，不意圖是限制性的。在“抗體”的定義下，術語包括全部免疫球蛋白以及上述片段等。製造單克隆抗體的方法在本領域中是已知的。可以被應用的一種方法是以下方法：Kohler, G.等 (1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497或其改進。通常，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用免疫原性量的含有期望表位的細胞、細胞提取物或蛋白製劑免疫動物產生抗體。免疫原可以是但不限於初級細胞、培養的細胞系、癌細胞、蛋白、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)，然後他們被用作免疫原。細胞本身或與非變性佐劑諸如Ribi組合可被用作免疫原(參見Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,” ILAR J. 37(3):119-125)。通常，當被用作免疫原時，細胞應此保持完整，並優選能存活。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫動物更好地檢測。使用變性或烈性(harsh)佐劑例如弗氏佐劑可破壞細胞，因此，其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以維持在動物中的生存力此方式被施用(例如，在組織重組體中)。可選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等價抗體可被測序並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，此抗體被測序，並且，多核苷酸序列然後被克隆到載體中，用於表達或繁殖。編碼感興趣的抗體的序列可以在宿主細胞中被維持在載體中，並且，宿主細胞然後可被擴張和冷凍，用於將來應用。此抗體的多核苷酸序列可被用於遺傳操作，以產生根據本發明任一實施方式的雙特異性分子以及嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化(canonized)抗體，以提高抗體的親和力或其他特點。人源化抗體的一般原則涉及保持抗體的抗原結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。

天然抗體(諸如IgG抗體)由與兩條重鏈複合的兩條輕鏈組成。各輕鏈含有可變結構域(VL )和固定結構域(CL )。各重鏈含有可變結構域(VH )、三個固定結構域(CH1 、CH2 和CH3 )和位於CH1 和CH2 結構域之間的鉸鏈結構域。因此，天然產生的免疫球蛋白(例如，IgG)的基本結構單元於是具有兩條輕鏈和兩條重鏈的四聚體，通常被表示為約150,000 Da的糖蛋白。各鏈的氨基-末端(“N”)部分包括最初與抗原識別有關的約100至110或更多氨基酸的可變結構域。各鏈的羧基-末端(“C”)部分限定了固定區，其中輕鏈具有單一固定結構域和重鏈通常具有三個固定結構域和鉸鏈區。因此，IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c和IgG 重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中H是鉸鏈區和n和c分別代表多肽的N-末端和C-末端)。IgG分子的可變結構域由互補決定區(CDR )組成，其包含與表位和非CDR區段接觸的殘基，所述非CDR區段被稱為框架區段(FR )，一般維持CDR環的結構和決定CDR環的位置，以便允許此接觸(儘管某些框架殘基也可接觸抗原)。因此，V_L 和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。作為(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分別被命名CDR_L 1 結構域 、CDR_L 2 結構域 和CDR_L 3 結構域 。類似地，作為(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分別被命名CDR_H 1 結構域 、CDR_H 2 結構域 和CDR_H 3 結構域 。因此，術語CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域、CDR_L 3結構域、CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域針對此多肽：其在併入到蛋白質中時導致此蛋白質能夠結合於特異性表位，無論此蛋白質是否是具有輕鏈和重鏈的抗體或雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)或是另一種類型的蛋白質。

根據本發明任一實施方式之抗-DR5-結合分子包括根據本發明任一實施方式的抗-DR5抗體的單鏈可變結構域片段(“scFv ”)。通過利用短連接肽連結輕鏈和/或重鏈可變結構域製備單鏈可變結構域片段。Bird等 (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)描述了在一個可變結構域的羧基末端和另一個可變結構域的氨基末端之間橋接大約3.5 nm的連接肽的實例。已經設計和使用了其它序列的接頭(參見Bird等 (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)。接頭進而可被修飾用於另外的功能，諸如連接藥物或連接至固體支援物。可經重組或經合成產生單鏈變異體。對於合成產生scFv，可使用自動合成儀。對於重組產生scFv，可將含有編碼scFv的多核苷酸的合適質粒引入到合適的宿主細胞——真核細胞諸如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞或原核細胞諸如大腸埃希氏菌(E. coli)中。編碼感興趣的scFv的多核苷酸可通過常規操作諸如多核苷酸的連接而製備。產生的scFv可利用本領域中已知的標準蛋白純化技術分離。

根據本發明任一實施方式之抗-DR5-結合分子包括根據本發明任一實施方式的抗體的人源化變異體。術語“人源化 ”抗體指此嵌合分子，其通常利用重組技術而製備，具有衍生自非人物種的免疫球蛋白的抗原結合位點並保留基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的分子的免疫球蛋白結構。因此，根據本發明任一實施方式的抗-人DR5抗體包括DR5 mAb 1或DR5 mAb 2的人源化、嵌合的或犬源化(caninized)衍生物。此抗體的可變結構域的多核苷酸序列可被用於遺傳操作，以產生此衍生物和提高此抗體的親和力或其他特性。人源化抗體的一般原則涉及保留抗體的抗原結合部分的基本序列，同時用人抗體序列替換抗體的非人剩餘部分。人源化單克隆抗體有四個一般步驟。它們是：(1)測定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體，即，決定在人源化過程中使用哪個抗體框架區；(3)實際的人源化方法/技術；和(4)人源化抗體的轉染和表達。參見美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692；和6,331,415。

抗原結合位點可包括融合到固定結構域上的完整的可變結構域或僅包括移植到可變結構域中適當的框架區上的互補決定區(CDR)。抗原結合位點可以是野生型的或通過一個或多個氨基酸取代被修飾。這排除了固定區在人個體中作為免疫原，但仍存在針對外源可變結構域的免疫應答的可能性(參見LoBuglio, A.F.等 (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一方法不僅致力於提供人衍生的固定區，而且也致力於修飾可變結構域，以便將他們盡可能接近地重塑成人形式。已知重鏈和輕鏈的可變結構域均含有針對所討論的抗原可以變化並決定結合能力的三個互補決定區(CDR)，側翼為在給定物種中相對保守並推定為CDR提供支架材料(scaffolding)的四個框架區(FR)。當針對特定抗原製備非人抗體時，通過將衍生自非人抗體的CDR移植到存在於待被修飾的人抗體中的FR上，可變結構域可被“重塑”或“人源化”。已經由以下文獻報導了此方法在各種抗體中的應用：Sato, K.等 (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L.等 (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等 (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等 (1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等 (1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等 (1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等 (1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等 (1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等 (1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等 (1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154。在一些實施方式中，人源化抗體保存所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗體，其含有來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其他實施方式中，人源化抗體具有一個或多個CDR (一、二、三、四、五或六個)，其相對於原始的抗體在序列上不同。

一些包含衍生自非人免疫球蛋白的抗原結合位點的“人源化”抗體分子已被述及，此抗體分子包括嵌合抗體，其具有齧齒動物或修飾的齧齒動物V區及其融合至人固定結構域的相關的互補決定區(CDR) (參見Winter等 (1991) “Man-made Antibodies ,” Nature 349:293-299；Lobuglio等 (1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw等 (1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen ,” J. Immunol. 138:4534-4538；和Brown等 (1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其它參考文獻描述在與適當的人抗體固定結構域融合之前移植到人支撐框架區(FR)中的齧齒動物CDR (參見 Riechmann, L.等 (1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等 (1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；和Jones等 (1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另外的參考文獻描述由重組修飾的(veneered)齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR。參見歐洲專利公開號519,596。這些“人源化”分子被設計，以最小化對齧齒動物抗-人抗體分子的不期望的免疫應答，其限制那些部分在人接受者中的治療應用的持續時間和效應。其它還可利用的人源化抗體的方法由以下文獻公開：Daugherty等 (1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377；6,054,297；5,997,867；和5,866,692。

II. Fcγ 受體 (FcγRs)

兩條重鏈的CH2結構域和CH3結構域相互作用以形成Fc 區，其是被細胞Fc 受體 (FcγRs) 識別的結構域。如本文中使用的，術語“Fc區”被用於限定IgG重鏈的C-末端區域。示例性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1 )：

示例性人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:197 )：

示例性人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:198 )：

示例性人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:199 )：

遍及本說明書，IgG重鏈中的殘基的編號是如Kabat等之Sequences of Proteins of Immunological Interest（免疫學關注的蛋白質的序列）,第五版，Public Health Service, NH1, MD (1991)中的EU索引的編號，其通過參考明確併入本文。“Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗體的編號。來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸通過氨基酸在鏈中的位置被命名。Kabat描述了很多抗體的氨基酸序列、鑒別了各亞組的氨基酸一致性序列並分配殘基號給各氨基酸。通過參考保守的氨基酸比對所討論的抗體與Kabat中的一致性序列中的一條，Kabat的編號方案可延伸到不包括在他的綱要中的抗體。用於分配殘基號的這種方法已經成為領域中的標準，並容易鑒別在不同抗體中處於相等位置的氨基酸，所述抗體包括嵌合或人源化變異體。例如，在人抗體輕鏈的位置50的氨基酸佔據了與小鼠抗體輕鏈的位置50處的氨基酸相等的位置。

已經在抗體固定區中的一些不同位置處(例如，Fc位置，包括但不限於位置270、272、312、315、356和358，如通過Kabat中列出的EU索引所編號的)觀察到了多態性，因此在示出的序列和現有技術中的序列之間可以存在一些輕微的差別。人免疫球蛋白的多態形式已經被很好地表徵了。目前，18種Gm異型是已知的：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5)(參見Lefranc、等、“The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation .” Pergamon、Oxford、43-78頁(1990)；Lefranc, G.等, 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211)。具體考慮根據本發明任一實施方式的抗體可以被併入任意免疫球蛋白基因的任意異型、同種異型或單元型，並且不限於本文提供的序列的異型、同種異型或單元型。此外，在一些表達系統中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上面粗體的)可以被翻譯後去除。因此，CH3結構域的C-末端殘基在根據本發明任一實施方式的LAG-3-結合分子中是任選的氨基酸殘基。在根據本發明一些實施方式中，此DR5-結合分子，其缺少CH3結構域的C-末端殘基。而且，在根據本發明一些實施方式中，此分子包括CH3結構域的C-末端殘基。

在Fc受體(FcγRs)與Fc區連接之後，啟動和抑制信號通過Fc受體(FcγRs)轉導。這些正好相反的功能是由於不同的受體同種型之間的結構差異造成的。受體的胞質信號傳導結構域中的兩個不同的結構域——稱為基於免疫受體酪氨酸的啟動基序(ITAMs)或基於免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIMS)——是造成不同應答的原因。募集不同胞質酶到這些結構中控制了FcγR-介導的細胞應答的結果。含有ITAM的FcγR複合物包括FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA，然而，含ITIM的複合物僅包括FcγRIIB。人嗜中性粒細胞表達FcγRIIA基因。通過免疫複合物或特異性抗體交聯FcγRIIA聚類用於使ITAM與促進ITAM磷酸化的受體相關的激酶聚集。ITAM磷酸化充當Syk激酶的停泊位點，Syk激酶的啟動導致下游底物(例如，PI₃ K)的啟動。細胞啟動導致促炎性介質的釋放。FcγRIIB基因在B淋巴細胞上表達；其細胞外結構域與FcγRIIA是96%一致的，並且以不能區分的方式結合IgG複合物。ITIM在FcγRIIB的胞質結構域中的存在限定了FcγR的這種抑制性亞類。最近，確定了這種抑制的分子基礎。當與啟動FcγR共連接時，FcγRIIB中的ITIM被磷酸化的，並且吸引肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)的SH2結構域，肌醇聚磷酸鹽5’-磷酸酶(SHIP)水解由於含ITAM的FcγR介導的酪氨酸激酶啟動而釋放的磷酸肌醇信使，從而防止細胞內Ca⁺⁺ 的流入。因此FcγRIIB的交聯抑制對FcγR連接的啟動應答並抑制細胞應答。B-細胞啟動、B-細胞增殖和抗體分泌因此被中止。

III. 雙特異性抗體、多特異性雙抗體和 DART® 雙抗體

抗體結合抗原的表位的能力取決於抗體的VL結構域和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體輕鏈和抗體重鏈的相互作用，尤其地，其VL結構域和VH結構域的相互作用形成天然抗體的兩個表位結合位點之一。天然抗體能夠結合於僅一種表位種類(即，他們是單特異性的)，儘管他們可以結合此種類的多個拷貝(即，顯示雙效價或多效價)。

根據本發明任一實施方式的結合結構域以“免疫特異性 ”方式結合於表位元。如本文中使用的，抗體、雙抗體或其他表位結合分子被認為“免疫特異性地 ”結合另一分子的區域(即，表位元)——如果相對於可選的表位，它以更大的持續時間和/或以更大的親和力與此表位更頻繁、更快速地反應或締合（associate）。例如，免疫特異性地結合於病毒表位元的抗體是以比其免疫特異性地結合其他病毒表位元或非病毒表位元更大的親和力、抗體親抗原性、更快速地和/或以更大的持續時間結合此病毒表位元的抗體。通過閱讀此定義還應該理解，例如，免疫特異性地結合第一靶標的抗體(或部分或表位元)可以或可以不特異性或優先結合第二靶標。因此，“特異性結合”不一定要求(儘管其可以包括)排他性結合。一般而言，但不一定，結合是表示“特異性”結合。兩個分子被認為能夠以“物理特異性 ”方式彼此結合——如果此結合顯示受體結合於其各自的配體的特異性。

通過產生能同時結合兩種分開且不同的抗原(或相同抗原的不同表位)的基於多特異性抗體的分子和/或通過產生針對相同表位和/或抗原具有較高效價(即，兩個以上結合位點)的基於抗體的分子，可增強抗體的功能性。

為了提供比天然抗體具有更大能力的分子，已經開發了各種重組雙特異性抗體形式(參見PCT公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分利用接頭肽融合進一步結合的蛋白質(例如，scFv、VL、VH等)至抗體(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)核心或至抗體核心內，或者融合多個抗體結合部分(例如，兩個Fab片段或scFvs)。可選的形式利用接頭肽融合結合蛋白(例如，scFv、VL、VH等)至二聚化結構域諸如CH2-CH3結構域或可選的多肽(參見WO 2005/070966、WO 2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。通常，此方法涉及妥協和權衡。例如，PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了接頭的使用可在治療情形中引起問題並教導三特異性抗體，其中CL和CH1結構域由其各自的天然位置被交換並且VL和VH結構域已經被多樣化(WO 2008/027236；WO 2010/108127)，以允許他們結合一個以上抗原。因此，這些文件中公開的分子犧牲結合特異性以獲取結合另外的抗原種類的能力。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域以含有融合蛋白加合物，其包括結合結構域。文件中指出，CH2結構域在介導效應物功能中可能發揮最小的作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc區已經被另外的VL和VH結構域取代，以便形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單獨的鏈含有scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其作為單一多肽鏈被合成，然後經歷蛋白酶解，以產生異源二聚結構。因此，這些文件中公開的分子犧牲所有或一些介導效應物功能的能力以獲取結合另外的抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了添加另外的結合結構域或功能集團至抗體或抗體部分(例如，添加雙抗體至抗體的輕鏈或添加另外的VL和VH結構域至抗體的輕鏈和重鏈或添加異源融合蛋白或彼此連結多個Fab結構域)。因此，這些文件中公開的分子犧牲天然抗體結構以獲取結合另外的抗原種類的能力。

現有技術已經另外注意到產生在能夠結合兩個或多個不同表位種類(即，除了雙效價或多效價之外顯示雙特異性或多特異性)方面不同於此天然抗體的雙抗體 的能力(參見Holliger等 (1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等)；US 2004/0220388 (Mertens等)；Alt等 (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等 (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等)；Olafsen, T.等 (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng. Des. Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等 (2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange ,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等 (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” 摘要3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；和Baeuerle, P.A.等 (2009) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。

雙抗體的設計是基於被稱為單鏈可變結構域片段(scFv )的抗體衍生物。此分子通過利用短連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變結構域而製備。Bird等 (1988) (“Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)描述了連接肽的實例，其在一個可變結構域的羧基末端和另一個可變結構域的氨基末端之間橋接大約3.5 nm。已經設計和使用了其它序列的接頭(參見Bird等 (1988) “Single-Chain Antigen-Binding Proteins ,” Science 242:423-426)。接頭進而可被修飾用於另外的功能，諸如連接藥物或連接至固體支援物。可經重組或經合成產生單鏈變異體。對於合成產生scFv，可使用自動合成儀。對於重組產生scFv，可將含有編碼scFv的多核苷酸的合適質粒引入到合適的宿主細胞——真核細胞諸如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞或原核細胞諸如大腸埃希氏菌中。編碼感興趣的scFv的多核苷酸可通過常規操作諸如多核苷酸的連接而製備。產生的scFv可利用本領域中已知的標準蛋白純化技術分離。

提供非單特異性雙抗體 提供了相對於抗體的顯著優勢：包括但不限於共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。因此，雙特異性雙抗體具有廣泛的應用，包括療法和免疫診斷。在各種應用中，雙特異性在設計和工程化雙抗體方面具有大的靈活性，提供對多聚抗原的增強的抗體親抗原性、不同抗原的交聯和對特定細胞類型的直接靶向，這取決於靶標抗原兩者的存在。由於其增加的效價、低離解速率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體，為~50 kDa或以下)，本領域中已知的雙抗體分子在腫瘤成像領域還顯示特別的用途(參見Fitzgerald等 (1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221)。尤其重要的是共連接不同的細胞，例如，交聯細胞毒性T細胞與腫瘤細胞(參見Staerz等 (1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631和Holliger等 (1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；和Marvin等 (2005) “Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies ,” Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658)。可選地或另外，雙特異性雙抗體可用於共連接不同細胞或單一細胞表面上的受體。不同細胞和/或受體的共連接可用於調節效應物功能和/或免疫細胞信號傳導。

雙抗體表位元-結合結構域也可以針對B細胞的表面決定簇，諸如CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD40和CD74 (參見Moore, P.A.等 (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Cheson, B.D.等 (2008) “MonoclonalAntibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma ,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626；和Castillo, J.等 (2008) “Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies,” Exp. Hematol. 36(7):755-768。在許多研究中，還發現結合於效應細胞決定簇例如Fcγ受體(FcγR)的雙抗體啟動效應細胞(參見Holliger等 (1996)“Specific KillingOf Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Holliger等 (1999)“Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” 癌 Res. 59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；和WO 2012/162068)。正常地，通過結合抗原的抗體經Fc-FcγR相互作用與效應細胞結合觸發效應細胞啟動；因此，在這方面，雙抗體分子可顯示Ig樣功能，這與他們是否包括Fc區無關(例如，如在本領域中已知的任何效應功能測定中所分析的或在本文示例的效應功能測定(例如，ADCC測定)中所分析的)。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅能使效應細胞在腫瘤細胞附近，而且導致有效腫瘤殺傷(參見Cao等 (2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197)。

然而，上述優勢是以顯著的成本獲得的。此非單特異性雙抗體的形成要求成功組裝兩個或多個有區別的和不同的多肽(即，此形成要求雙抗體通過不同多肽鏈種類的異源二聚化而形成)。此事實與單特異性雙抗體不同，其通過一致的多肽鏈的同源二聚化而形成。由於至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)必須被提供以形成非單特異性雙抗體並且由於此多肽的同源二聚化導致失活分子(參見Takemura, S.等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)，此多肽的產生必須以防止相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(即，以便防止同源二聚化) (參見Takemura, S.等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)。因此，本領域已經教導了此多肽的非共價締合(參見Olafsen等 (2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等 (2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” 摘要3P-683, J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等 (2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；和Lu, D.等( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。

然而，本領域已經認識到由非共價締合的多肽組成的雙特異性雙抗體是不穩定的，並易於解離成非功能單體(參見Lu, D.等 (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。

面對此挑戰，本領域已經成功地開發了穩定的、共價結合的異源二聚非單特異性雙抗體，其稱之為DART® ( D ualA ffinityR e-T argeting Reagents ( 雙親和力再靶向劑 ) )雙抗體；參見美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109和EP 2158221；PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687和WO 2010/080538；Moore, P.A.等 (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Veri, M.C.等 (2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；和Johnson, S.等 (2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion ,” J. Mol. Biol. 399(3):436-449)。此雙抗體包括兩個或多個共價複合的多肽並涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化到每個應用的多肽種類中，其允許形成二硫鍵，從而共價結合兩條多肽鏈。例如，將半胱氨酸殘基添加至此構建體的c-末端已經被證明允許多肽鏈之間的二硫鍵合，穩定了產生的異源二聚體，而不干擾二價分子的結合特性。

最簡單的雙特異性DART® 雙抗體的兩個多肽中的每一個包括三個結構域。第一多肽包括 (在N-末端至C-末端方向)：(i)第一結構域，其包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL1)的結合區；(ii)第二結構域，其包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH2)的結合區；和(iii)第三結構域，其含有半胱氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)和異源二聚體促進結構域，其用於促進與雙抗體的第二多肽的異源二聚化和彼此共價結合雙抗體的第一和第二多肽。第二多肽含有(在N-末端至C-末端方向)：(i)第一結構域，其包括第二免疫球蛋白的輕鏈可變結構域(VL2)的結合區；(ii)第二結構域，其包括第一免疫球蛋白的重鏈可變結構域(VH1)的結合區；和(iii)第三結構域，其含有半胱氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)和互補性異源二聚化促進結構域，其與第一多肽鏈的異源二聚化促進結構域複合，以促進與第一多肽鏈的異源二聚化。第二多肽鏈的第三結構域的半胱氨酸殘基(或含半胱氨酸的結構域)用於促進雙抗體的第二多肽鏈與第一多肽鏈的共價結合。此分子是穩定的、有潛力的，並且具有同時結合兩個或多個抗原的能力。在一個實施方式中，第一和第二多肽的第三結構域各含半胱氨酸殘基，其用於經二硫鍵將多肽結合在一起。圖 1 提供此雙抗體的示意圖，其利用E-螺旋/K-螺旋異源二聚化結構域和含半胱氨酸的接頭用於共價結合。如提供在圖 2-4 中的，多肽中的一個或兩個可另外具有CH2-CH3結構域的序列，以便兩個雙抗體多肽之間的複合形成Fc區，其能夠結合細胞(諸如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體。如以下詳述，此多肽鏈的CH2和/或CH3結構域不需要在序列上等同的，並且有利地被修飾，以促進兩條多肽鏈之間的複合。

此分子的許多變化已被提出(參見，例如美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號 EP 2714079、EP 2601216；EP 2376109和EP 2158221；和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687和WO 2010/080538)。這些含Fc區的DART®雙抗體可包括三條多肽鏈。此抗體的第一多肽含有三個結構域：(i)含VL1的結構域；(ii)含VH2的結構域；和(iii)含CH2-CH3序列的結構域。此DART®雙抗體的第二多肽含有：(i)含VL2的結構域；(ii)含VH1的結構域；和(iii)促進異源二聚化和與雙抗體的第一多肽鏈共價結合的結構域。此DART®雙抗體的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，此DART®雙抗體的第一和第二多肽鏈結合在一起，以形成能夠結合表位的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點。第一和第二多肽經二硫鍵彼此結合，在其各自的第三結構域中包括半胱氨酸殘基。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合以形成Fc區，其經二硫鍵被穩定。

可選的構建體在本領域中是已知的，用於此應用，其中期望四價分子而不需要Fc，包括但不限於四價串聯抗體，也稱為“TandAbs ” (參見美國專利公開號2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667和2013-0189263；歐洲專利公開號EP 1078004、EP 2371866、EP 2361936和EP 1293514；PCT公開號WO 1999/057150、WO 2003/025018和WO 2013/013700)，其通過同源二聚化兩個各具有VH1、VL2、VH2和VL2結構域的等同的鏈而形成。

IV. 根據本發明任一實施方式的抗 - 人 DR5- 結合分子

在一些實施方式中，DR5-結合分子包括抗體、雙抗體、BiTE等，其能夠結合人DR5的連續或不連續(例如，構象的)部分(表位元 )。在一些實施方式中，DR5-結合分子還可表現出結合一個或多個非人物種（尤其是鼠科動物、齧齒動物、犬科動物和靈長類物種）的DR5分子的能力。人DR5前體的氨基酸序列(NCBI序列 NP_003833.4) (SEQ ID NO:2 )是：

在DR5的440個氨基酸殘基(SEQ ID NO:2 )中，殘基 1-55是信號序列，殘基 57-94是第一富含半胱氨酸的結構域(CRD )，殘基 97-137是第二富含半胱氨酸的結構域(CRD )，殘基138-178是第三富含半胱氨酸的結構域(CRD )，殘基211-231是跨膜結構域和殘基232-440是胞質結構域(含有受體的死亡結構域)。

在一些實施方式中，抗-人DR5-結合分子具有鼠科抗-人DR5單克隆抗體（“DR5 mAb 1 ” 和/或“DR5 mAb 2 ” ）的VL和/或VH結構域，更優選地，具有此抗-人DR5單克隆抗體的VL結構域的CDR_L 中的1、2或所有3個和/或VH結構域的CDR_H 中的1、2或所有3個。具體抗-DR5結合分子和編碼其的多核苷酸的氨基酸序列在下文提供。在一些實施方式中，還考慮這些序列的較小變化，包括例如被引入以促進亞克隆的C-末端和/或N-末端氨基酸殘基的氨基酸替換。優選的抗-人DR5-結合分子包括具有變異Fc區的抗體、雙特異性(或多特異性)抗體、嵌合或人源化抗體、BiTe、雙抗體、嵌合抗原受體(CAR)等。

A. 抗 - 人 DR5 抗體 DR5 mAb 1

DR5 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 1的CDR_L 1 (SEQ ID NO:4 ):RASKSVSSSGYSYMH ；DR5 mAb 1的CDR_L 2 (SEQ ID NO:5 ):LSSNLDS ；且DR5 mAb 1的CDR_L 3 (SEQ ID NO:6 ):QHSRDLPPT 。

DR5 mAb 1的VL結構域優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO:7 )編碼(編碼CDR_L 的多核苷酸以底線顯示):

DR5 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:8 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)。C-末端氨基酸可以被丙氨酸替換，以促進此VH結構域的亞克隆。

其中，DR5 mAb 1的CDR_H 1(SEQ ID NO:9 ):GFDFSRYWMS ；DR5 mAb 1的CDR_H 2 (SEQ ID NO:10 ):EINPDSNTINYTPSLKD ；且DR5 mAb 1的CDR_H 3 (SEQ ID NO:11 ):RAYYGNPAWFAY 。

DR5 mAb 1的VH結構域優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸 (SEQ ID NO:12 )編碼(編碼CDR_H 的多核苷酸以底線顯示)：

B. 抗 - 人 DR5 抗體 DR5 mAb 2

1. 鼠科抗 - 人抗體 DR5 mAb 2

DR5 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:13 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 2的CDR_L 1 (SEQ ID NO:14 )：KASQDVNTAVA ；DR5 mAb 2的CDR_L 2 (SEQ ID NO:15 )：WASTRHT ；且DR5 mAb 2的CDR_L 3 (SEQ ID NO:16 )：QQHYITPWT 。

DR5 mAb 2的VL結構域優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸 (SEQ ID NO:17 )編碼(編碼CDR_L 的多核苷酸以底線顯示)：

DR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:18 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 2的CDR_H 1 (SEQ ID NO:19 )：GYTFTEYILH ；DR5 mAb 2的CDR_H 2 (SEQ ID NO:20 )：WFYPGNNNIKYNEKFKD ；且DR5 mAb 2的CDR_H 3 (SEQ ID NO:21 )：HEQGPGYFDY 。

DR5 mAb 2的VH結構域優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸 (SEQ ID NO:22 )編碼(編碼CDR_H 的多核苷酸以底線顯示)：

2. 人源化抗 - 人 DR5 抗體 DR5 mAb 2 以形成 “hDR5 mAb 2”

上述鼠科抗-人DR5抗體（DR5 mAb 2）被人源化，以顯示人源化抗-人DR5抗體以便在施用至人接受者時降低其抗原性的能力。人源化產生四個人源化VL結構域，在本文中命名為“hDR5 mAb 2 VL-2 ”、“hDR5 mAb 2 VL-3 ” 、“hDR5 mAb 2 VL-4 ”和“hDR5 mAb 2 VL-5 ”以及一個人源化VH結構域，在本文中命名為“hDR5 mAb 2 VH-2 ”。任意人源化VL結構域均可以與人源化VH結構域配對。因此，包括與人源化VH結構域配對的人源化VL結構域中的一個的任意抗體一般被稱為“hDR5 mAb 2 ”，並且具體人源化VL/VH結構域的組合是指參考VL結構域。

hDR5 mAb 2 VL-2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

[0098] hDR5 mAb 2 VL-2 優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO:24 )編碼：

hDR5 mAb 2 VL-3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:25 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

hDR5 mAb 2 VL-3 優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO:26 )編碼：

hDR5 mAb 2 VL-4 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:27 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

hDR5 mAb 2 VL-4 優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO:28 )編碼：

hDR5 mAb 2 VL-5 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:29 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

hDR5 mAb 2 VL-5 優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸 (SEQ ID NO:30 )編碼：

hDR5 mAb 2 VH-2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

hDR5 mAb 2 VH-2 優選通過具有如下顯示的序列的多核苷酸(SEQ ID NO:32 )編碼：

hDR5 mAb 2 VL-3、hDR5 mAb 2 VL-4和hDR5 mAb VL-5的VL結構域的CDR_L 1具有氨基酸序列：RASQDVNTAVA (SEQ ID NO:196 )。

C. 抗 - 人 DR5 抗體 DR mAb 1 或 DR5 mAb 2 及其具有工程化 Fc 區的衍生物

在傳統免疫功能中，抗體-抗原複合物與免疫系統的細胞的相互作用導致各種應答，範圍從效應物功能諸如抗體依賴性細胞毒性、肥大細胞脫粒和吞噬至免疫調節信號諸如調節淋巴細胞增殖和抗體分泌。所有這些相互作用均通過抗體或免疫複合物的Fc區與造血細胞上的具體細胞表面受體的結合發起。通過抗體和免疫複合物觸發的各種細胞應答由三個Fc受體：FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)和FcγRIII (CD16)的結構異質性造成。FcγRI (CD64)、FcγRIIA (CD32A)和FcγRIII (CD16)是啟動(即，免疫系統增強)受體；FcγRIIB (CD32B)是抑制(即，免疫系統抑制)受體。示例性IgG1 Fc區的氨基酸序列(SEQ ID NO:1 )在上面示出。

Fc區的修飾通常導致改變的表型，例如改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的易感性或改變的效應物功能。就效應物功能而言可期望修飾根據本發明任一實施方式的抗體，以便增強例如抗體在治療癌中的有效性。在某些情況下，期望降低或消除效應物功能，例如在抗體的作用機制涉及阻斷或對抗但不是殺傷攜帶靶標抗原的細胞的情況下。當針對不期望的細胞諸如腫瘤和外源細胞時，提高的效應物功能通常是期望的，其中FcγR以低水準表達，例如具有低水準FcγRIIB的腫瘤-特異性B細胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)。在所述實施方式中，具有賦予的或改變的效應物功能活性的根據本發明任一實施方式的分子用於治療和/或預防疾病、病症或感染，其中增強的效應物功能活性的功效是期望的。

在某些實施方式中，DR5-結合分子可包括Fc區，其對野生型Fc區的氨基酸序列(SEQ ID NO:1 )具有一個或多個修飾(例如，替換、缺失或插入)，這降低Fc區的親和力和抗體親抗原性，因此，此分子對一個或多個FcγR受體親和力和抗體親抗原性。在其他實施方式中，此分子可包括Fc區，其對野生型Fc區的氨基酸具有一個或多個修飾，這提高Fc區的親和力和抗體親抗原性，因此，提高此分子對一個或多個FcγR受體的親和力和抗體親抗原性。在其他實施方式中，此分子包括可變異Fc區，其中相對於不包括Fc區的分子或包括野生型Fc區的分子，且此變異體賦予或介導提高的ADCC活性和/或對FcγRIIA提高的結合。在可選實施方式中，此分子可包括變異Fc區，其中相對於不包括Fc區的分子或包括野生型Fc區的分子，且此變異體賦予或介導降低的ADCC活性(或其它效應物功能)和/或對FcγRIIB提高的結合。在一些實施方式中， DR5-結合分子，其包括變異Fc區，且此變異Fc區相對於包括野生型Fc區的可比較的分子不顯示對任何FcγR的可檢測的結合。在其他實施方式中，DR5-結合分子，其包括變異Fc區，且此變異Fc區僅結合單一FcγR，優選FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIIA之一。任意此提高的親和力和/或抗體親抗原性均優選通過在細胞中體外測量對FcγR可檢測的結合程度或FcγR相關活性而評估，其中此細胞在親本分子(沒有修飾的Fc區)的結合活性不能在細胞中被檢測到時表達低水準FcγR，或者所述細胞以以下濃度表達非FcγR受體靶抗原：30,000至20,000個分子/細胞、20,000至10,000個分子/細胞、10,000至5,000個分子/細胞、5,000至1,000個分子/細胞、1,000至200個分子/細胞或200個分子/細胞或更少(但是至少10、50、100或150個分子/細胞)。

在一些實施方式中，DR5-結合分子可包括對啟動和/或抑制性Fcγ受體改變的親和性。在一個實施方式中，DR5-結合分子包括變異Fc區，其相對於具有野生型Fc區的可比較的分子，對FcγRIIB具有提高的親和力和對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和力。在另一實施方式中，DR5-結合分子包括變異Fc區，其相對於具有野生型Fc區的可比較的分子，對FcγRIIB具有降低的親和力和對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有提高的親和力。在另外的實施方式中，DR5-結合分子包括變異Fc區，其相對於具有野生型Fc區的可比較的分子，對FcγRIIB具有降低的親和力和對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的親和力。在另外的實施方式中， DR5-結合分子包括變異Fc區，其相對於具有野生型Fc區的可比較的分子，對FcγRIIB具有不改變的親和力和對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的(或提高的)親和力。

在某些實施方式中，DR5-結合分子包括變異Fc區，其對FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有改變的親和力，以便免疫球蛋白具有增強的效應物功能，例如，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。效應細胞功能的非限制性實例包括抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性吞噬、吞噬、調理、調理吞噬、細胞結合、蓮座(rosetting)、C1q結合和互補依賴性細胞介導的細胞毒性。

在優選的實施方式中，相對於包括野生型Fc區的可比較的分子，親和力或效應物功能的改變為至少2-倍、優選至少4-倍、至少5-倍、至少6-倍、至少7-倍、至少8-倍、至少9-倍、至少10-倍、至少50-倍或至少100-倍。在其他實施方式中，相對於包括野生型Fc區的分子，變異Fc區以至少65%、優選至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、225%或250%更大親和力免疫特異性地結合一個或多個FcR。此測量可以是體內或體外測定，並且在優選的實施方式中是體外測定諸如ELISA或表面等離子共振測定。

在不同實施方式中，DR5-結合分子包括變異Fc區，其中所述變異體激動(agonize)FcγR受體的至少一種活性或對抗FcγR受體的至少一種活性。在優選的實施方式中，分子包括此變異體：其對抗FcγRIIB的一種或多種活性，例如，B細胞受體-介導的信號傳導、B細胞的啟動、B細胞增殖、抗體產生、B細胞的細胞內鈣流入、細胞週期進程、FcγRIIB-介導的對FcεRI信號傳導的抑制、FcγRIIB的磷酸化、SHIP募集、SHIP磷酸化和與Shc的締合或一個或多個下游分子(例如，MAP激酶、JNK、p38或Akt)在FcγRIIB信號轉導途徑中的活性。在另一實施方式中，DR5-結合分子包括變異體，其激動FcεRI的一種或多種活性，例如，肥大細胞啟動、鈣動員、脫粒、細胞因數產生或5-羥色胺釋放。

在某些實施方式中，分子包括Fc區，其包括來自兩個或多個IgG同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的區域。由於其鉸鏈和/或Fc區的氨基酸序列的差異，各種IgG同種型顯示不同的物理和功能性質，包括血清半衰期、補體結合、FcγR結合親和性和效應物功能活性 (例如，ADCC、CDC等)，例如如在以下文獻中描述的：Flesch和Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156；Chappel等 (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131；Chappel等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040；或Brüggemann等 (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361。這種類型的變異Fc區可以單獨使用或與氨基酸修飾組合使用，以影響Fc-介導的效應物功能和/或結合活性。在組合中，相對包括野生型Fc區的分子，氨基酸修飾和IgG鉸鏈/Fc區可展示類似的功能(例如，對FcγRIIA提高的親和力)並可另外或更優選協同作用，以修飾分子中的效應物功能。在其他實施方式中，相對於不包括Fc區或包括相同同種型的野生型Fc區的分子，氨基酸修飾和IgG Fc區可展示相反的功能(例如，分別對FcγRIIA提高的和降低的親和力)並可發揮作用，以選擇性緩和或降低分子的特異性功能。

在一些實施方式中，DR5-結合分子包括變異Fc區，其中相對於野生型Fc區，所述變異Fc區包括至少一個氨基酸修飾，以便所述分子對FcR具有改變的親和力，條件是基於Fc-FcR相互作用的晶體學和結構分析所述變異Fc區在直接接觸FcγR的位置不具有取代，所述分析諸如由Sondermann等 (2000) Nature 406:267-73公開的。Fc區中直接接觸FcγR的位置的實例是氨基酸殘基234-239 (鉸鏈區)、氨基酸殘基265-269 (B/C 環)、氨基酸殘基297-299 (C’/E環)和氨基酸殘基327-332 (F/G環)。在一些實施方式中，分子包括變異Fc區，其包括至少一個殘基的修飾，且此殘基基於結構和晶體學分析不直接接觸FcγR，例如不在Fc-FcγR 結合位點內。

變異Fc區在本領域中是悉知的，並且，任意已知Fc變異體均可以用於根據本發明任一實施方式的分子以賦予或修飾由包括Fc區(或其部分)的分子所表現的效應物功能，如在功能上測定的，例如在NK依賴性或巨噬細胞依賴性測定。例如，被鑒別為改變效應物功能的Fc區變異體公開在抗體工程技術工藝（Antibody Engineering Technology Art）中，並且，其中公開的任何變異體均可用於根據本發明任一實施方式的分子。

[00118] 在某些實施方式中，DR5-結合分子包括變異Fc區，其在一個或多個區域內具有一個或多個氨基酸修飾，相對於抑制性FcγR (諸如FcγRIIB)，所述修飾(一個或多個)改變(相對於野生型Fc區)變異Fc區與啟動FcγR (諸如FcγRIIA或FcγRIIIA)的親和性比 ：

在一些實施方式中，DR5-結合分子具有變異Fc區 (相對於野生型Fc區)，其中Fc變異體的親和性比大於1。此分子在提供疾病、病症或感染的療法或預防療法或其症狀的改善方面具有特別的用途，其中期望由FcγR介導的效應細胞功能(例如，ADCC)的增強的功效，例如癌或感染性疾病。相比之下，親和性比小於1的Fc變異體介導效應細胞功能的降低的功效。根據其親和性比是否大於或小於1，表 1 列出了示例性單、雙、三、四和五倍突變。

表 1 根據親和性比列出的示例性單一和多突變

在具體實施方式中，在變異Fc區中，任意氨基酸修飾(例如，取代)在位置235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328或330中的任意位置，並優選在一個或多個以下殘基處：A240、I240、L241、L243、H244、N298、I328或V330。在不同的具體實施方式中，在變異Fc區中，任意氨基酸修飾(例如，取代)在位置268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439的任意位置，並優選一個或多個以下殘基：H280、Q280、Y280、G290、S290、T290、Y290、N294、K295、P296、D298、N298、P298、V298、I300或L300。

在一些實施方式中，在以改變的親和力結合FcγR的變異Fc區中，任意氨基酸修飾(例如，取代)在位置255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439的任意位置。優選，變異Fc區具有任意以下殘基：A256、N268、Q272、D286、Q286、S286、A290、S290、A298、M301、A312、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、N326、S326、K330、T339、A333、A334、E334、H334、L334、M334、Q334、V334、K335、Q335、A359、A360或A430。

在不同實施方式中，在以降低的親和力結合FcγR (通過其Fc區)的變異Fc區中，任意氨基酸修飾(例如，替換)在位置252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439的任意位置處。

在不同實施方式中，在以增強的親和力結合FcγR (通過其Fc區)的變異Fc區中，任意氨基酸修飾(例如，取代)在位置280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398或430的任意位置處。在不同實施方式中，在以增強的親和力結合FcγRIIA的變異Fc區中，任意以下殘基：A255、A256、A258、A267、A268、N268、A272、Q272、A276、A280、A283、A285、A286、D286、Q286、S286、A290、S290、M301、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、S326、K330、A331、Q335、A337或A430。

在一些實施方式中，變異體包括一個或多個氨基酸修飾，並且此一個或多個氨基酸修飾位在位置：228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332中的任意位置處。

在一些實施方式中，變異體包括選自組A-AI的一個或多個氨基酸修飾：

在一些實施方式中，變異體包括選自組1-105的一個或多個氨基酸修飾：

在一個實施方式中，根多價DR5結合分子可包括變異Fc區，並且其具有至少一個氨基酸修飾在Fc區。在某些實施方式中，變異Fc區包括選自以下的至少一個氨基酸取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中的編號是Kabat中的EU索引的編號。

在具體實施方式中，變異Fc區包括：(A) 選自以下的至少一個氨基酸取代：F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；(B) 選自以下的至少兩個氨基酸取代：(1) F243L和P396L、(2) F243L和R292P、和(3) R292P和V305I；(C) 選自以下的至少三個氨基酸取代：(1) F243L、R292P和Y300L、(2) F243L、R292P和V305I、(3) F243L、R292P和P396L、和(4) R292P、V305I和P396L；(D) 選自以下的至少四個氨基酸取代：(1) F243L、R292P、Y300L和P396L、和(2) F243L、R292P、V305I和P396L；或者(E) 選自以下的至少五個氨基酸取代：(1) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L、和(2) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。

在另一實施方式中，變異Fc區包括如下氨基酸取代：(A) F243L、R292P和Y300L；(B) L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或者(C) F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。

在其他實施方式中，任意Fc變異體的用途，諸如在以下文獻中公開的那些：Jefferis, B.J.等 (2002) “Interaction Sites On Human IgG- FcFor FcgammaR: Current Models ,” Immunol. Lett. 82:57-65；Presta, L.G.等 (2002) “Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function ,” Biochem. Soc. Trans. 30:487-90；Idusogie, E.E.等 (2001) “Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement ,” J. Immunol. 166:2571-75；Shields, R.L.等 (2001) “High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R ,” J. Biol. Chem. 276:6591-6604；Idusogie, E.E.等 (2000) “Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc ,” J. Immunol. 164:4178-84；Reddy, M.P.等 (2000) “Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4 ,” J. Immunol. 164:1925-1933；Xu, D.等 (2000) “In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies ,” Cell. Immunol. 200:16-26；Armour, K.L.等 (1999) “Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities ,” Eur. J. Immunol. 29:2613-24；Jefferis, R.等 (1996) “Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions ,” Immunol. Lett. 54:101-04；Lund, J.等 (1996) “Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains ,” J. Immunol. 157:4963-4969；Hutchins等 (1995) “Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84；Jefferis, R.等 (1995) “Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation ,” Immunol. Lett. 44:111-17；Lund, J.等 (1995) “Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors ,” FASEB J. 9:115-19；Alegre, M.L.等 (1994) “A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo ,” Transplantation 57:1537-1543；Lund等 (1992) “Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11 ,” Mol. Immunol. 29:53-59；Lund等 (1991) “Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG ,” J. Immunol. 147:2657-2662；Duncan, A.R.等 (1988) “Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG ,” Nature 332:563-564；美國專利號5,624,821；5,885,573；6,194,551；7,276,586；和7,317,091；和PCT公開出版物WO 00/42072和PCT WO 99/58572。

在一些實施方式中，根據本發明任一實施方式的分子進一步包括一個或多個糖基化位點，以便一個或多個碳水化合物部分共價連接於分子。優選，與親本抗體相比，在Fc區具有一個或多個糖基化位點和/或一個或多個氨基酸修飾的根據本發明任一實施方式的分子賦予或具有增強的抗體介導的效應物功能，例如增強的ADCC活性。在一些實施方式中，此分子包括一個或多個氨基酸修飾，已知所述氨基酸直接或間接與抗體的碳水化合物部分相互作用，包括但不限於位置241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301處的氨基酸。直接或間接與抗體的碳水化合物部分相互作用的氨基酸在本領域中是已知的，參見Jefferis等, 1995Immunology Letters , 44: 111-7，其通過引用以其整體併入本文。

在另一實施方式中，此分子已經通過將一個或多個糖基化位點引入到分子的一個或多個位點而被修飾，優選不改變分子的功能，例如與靶抗原或Fc R的結合活性。糖基化位點可以被引入到根據本發明任一實施方式分子的可變區和/或固定區。如本文中使用的，“糖基化位點”包括抗體中的任意特異性氨基酸序列，低聚糖(即，碳水化合物，其含有兩個或多個連接在一起的單糖)將與所述氨基酸序列特異性和共價連接。低聚糖側鏈通常經N-或O-鍵連接至抗體的骨架。N-連接的糖基化指將低聚糖部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。O-連接的糖基化指將低聚糖部分連接至羥基氨基酸，例如絲氨酸、蘇氨酸。在一些實施方式中，此分子可包括一個或多個糖基化位點，包括N-連接的和O-連接的糖基化位點。本領域中已知的對於N-連接的或O-連接的糖基化的任意糖基化位元點均可依照本發明任一實施方式的方法而使用。其中，示例性N-連接的糖基化位點可為氨基酸序列：Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任意氨基酸，和Thr/Ser表示蘇氨酸或絲氨酸。利用本發明所屬領域中已知的方法，將此種位點或多個位點引入到根據本發明任一實施方式的分子中(參見IN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson等,W.H. Freeman and Company, New York, 1983, 第8章， 106-116頁，其通過引用以其整體併入本文)。用於將糖基化位點引入根據本發明任一實施方式分子的示例性方法可包括：修飾或突變分子的氨基酸序列，以便獲得期望的Asn-X-Thr/Ser序列。

在一些實施方式中，本發明亦涉及一種通過添加或刪除糖基化位點改變前述任一實施例之分子的碳水化合物含量的方法。改變抗體(以及包括抗體結構域的分子)的碳水化合物含量的方法是本領域中悉知的，並包括在根據本發明任一實施方式中，參見美國專利號6,218,149；EP 0 359 096 B1；美國公開號US 2002/0028486；WO 03/035835；美國公開號2003/0115614；美國專利號6,218,149；美國專利號6,472,511；其均通過引用以其整體併入本文。在其他實施方式中，本發明更涉及一種通過刪除分子的一個或多個內源碳水化合物部分改變前述任一實施例之分子的碳水化合物含量的方法。在具體實施方式中，可通過修飾臨近297的位置改變抗體的Fc區的糖基化位點。在具體實施方式中，透過修飾位置296，以便位置296而不是位置297被糖基化。

也可通過技術諸如通過將一個或多個半胱氨酸殘基引入到Fc區中修飾效應物功能，從而允許在此區域中發生鏈間二硫鍵形成，從而產生同源二聚抗體，其可具有改進的內在化能力和/或提高的補體-介導的細胞殺傷和ADCC (Caron, P.C.等 (1992) “Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies ,” J. Exp. Med. 176:1191-1195；Shopes, B. (1992) “A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity ,” J. Immunol. 148(9): 2918-2922。具有增強的抗腫瘤活性的同源二聚抗體還可利用異源雙功能交聯劑被製備，如以下文獻中描述的：Wolff, E.A.等 (1993) “Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice ,” Cancer Research 53:2560-2565。可選地，抗體可被工程化，其具有雙Fc區，並且，從而可具有增強的補體分解和ADCC能力(Stevenson, G.T.等 (1989) “A Chimeric Antibody With Dual Fc Regions (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge ,” Anti-Cancer Drug Design 3:219-230)。

D. 抗 - 人 DR5 雙抗體

1. 單特異性雙抗體

在一些實施方式中，DR5-結合分子可以是單特異性單鏈雙抗體諸如scFv 或嵌合抗原受體(CAR )。如上面所討論的，通過利用短連接肽連接輕鏈和/或重鏈可變結構域製備scFv。第一代CAR通常具有來自CD3 ζ鏈的細胞內結構域，其是來自內源TCR的信號的主要遞質。第二代CAR支配來自各種共刺激蛋白受體(例如，CD28、41BB、ICOS等)的另外的細胞內信號傳導結構域至CAR的胞質尾區，以提供另外的信號給T細胞。第三代CAR結合多信號傳導結構域諸如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以進一步增大效力(參見Tettamanti, S.等 (2013) ““Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric AntigenReceptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等 (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells ,” Blood 123(15): 2343-2354；Mardiros, A.等 (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia ,” Blood 122:3138-3148；和Pizzitola, I.等 (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo ,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。

[00136] 根據本發明任一實施方式的嵌合抗原受體包括融合到受體的細胞內結構域的scFv。scFv的可變輕鏈和可變重鏈結構域選自本文公開的任意抗-人DR5抗體。受體的細胞內結構域選自任意以下的細胞內結構域：41BB-CD3ζ、b2c-CD3ζ、CD28、CD28-4-1BB-CD3ζ、CD28-CD3ζ、CD28-FcεRIγ、CD28mut-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD3ζ、CD4-CD3ζ、CD4-FcεRIγ、CD8-CD3ζ、FceRIγ、FcεRIγCAIX、調蛋白-CD3ζ、IL-13-CD3ζ或Ly49H-CD3ζ (Tettamanti, S.等 (2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric AntigenReceptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401；Gill, S.等 (2014) “Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells ,” Blood 123(15)： 2343-2354；Mardiros, A.等 (2013) “T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia ,” Blood 122:3138-3148；Pizzitola, I.等 (2014) “Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo ,” Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62)。

2. 缺少 Fc 區的雙特異性雙抗體

在一些實施方式中，雙特異性單價雙抗體能夠結合於“第一表位 ”和“第二表位 ”，其中第一表位是人DR5的表位和第二表位是存在於效應細胞諸如T淋巴細胞、天然殺傷(NK)細胞或其他單核細胞表面上的分子(例如，CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32、CD64、T細胞受體(TCR)、B細胞受體(BCR)、NKG2D等)的表位。第二表位不是DR5的表位。優選地，此雙抗體包括第一多肽鏈和第二多肽鏈，而且，最優選地，由第一多肽鏈和第二多肽鏈組成，所述第一多肽鏈和第二多肽鏈的序列允許多肽鏈彼此共價結合，以形成共價締合的複合物，其能夠同時結合於DR5和第二表位。

在一些實施方式中，雙特異性單價雙抗體的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括N-末端、能夠結合於第一或第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_DR5 或VL_表位 ₂ )、第一間插間隔肽(接頭1)、能夠結合於第二表位(如果此第一多肽鏈含有VL_DR5 )或第一表位(如果此第一多肽鏈含有VL_表位 ₂ )的單克隆抗體的VH結構域、含半胱氨酸的第二間插間隔肽(接頭2)、異源二聚體促進結構域和C-末端(圖 1 )。注釋“VL1 ”和“VH1 ”分別表示結合“第一”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。類似的，注釋“VL2 ”和“VH2 ”分別表示結合“第二”表位元的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域。

在一些實施方式中，雙特異性單價雙抗體的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括N-末端、能夠結合於DR5或第二表位的單克隆抗體的VL結構域(即，VL_DR5 或VL_表位 ₂ 並且是不被選擇包括在雙抗體的第一多肽鏈中的VL結構域)、間插連接肽(接頭1)、能夠結合於第二表位(如果此第二多肽鏈含有VL_DR5 )或結合於DR5(如果此第二多肽鏈含有VL_表位 ₂ )的單克隆抗體的VH結構域、任選地含有半胱氨酸殘基的間隔肽(接頭2) 、異源二聚體促進結構域和C-末端(圖 1 )。

在一些實施方式中，第一多肽鏈的VL結構域與第二多肽鏈的VH結構域相互作用，以形成第一功能抗原結合位點，其對第一抗原(即，DR5或含有第二表位的抗原)是特異性的。同樣的，第二多肽鏈的VL結構域與第一多肽鏈的VH結構域相互作用，以形成第二功能抗原結合位點，其對第二抗原(即，含有第二表位的抗原或DR5)是特異性的。因此，對第一和第二多肽鏈的VL結構域和VH結構域的選擇是協同的，以便雙抗體的兩條多肽鏈總體地包括能夠同時結合於DR5的表位和結合於第二表位元的VL結構域和VH結構域(即，他們包括 VL_DR5 /VH_DR5 和VL_表位 ₂ /VH_表位 ₂ )。

在一些實施方式中，間插連接肽(接頭1，其分開此VL和VH結構域)的長度被選擇，以基本上或完全防止多肽鏈的VL和VH結構域彼此結合。因此，第一多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。同樣的，第二多肽鏈的VL和VH結構域基本上或完全不能彼此結合。優選的間插間隔肽(接頭1)具有序列(SEQ ID NO:33 )：GGGSGGGG。

在一些實施方式中，含半胱氨酸的第二間插間隔肽(接頭2)將含有1、2、3或更多個半胱氨酸。優選的含半胱氨酸的間隔肽(接頭2)具有序列SEQ ID NO:34 : GGCGGG。可選地，接頭2不包括半胱氨酸，並且如下所述的含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域被使用。任選地，含半胱氨酸的接頭2和含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域均被使用。

在一些實施方式中，異源二聚體促進結構域可以是一條多肽鏈上的GVEPKSC (SEQ ID NO:35 )、VEPKSC (SEQ ID NO:36 )或AEPKSC (SEQ ID NO:200 )和另一條多肽鏈上的GFNRGEC (SEQ ID NO:37 )或FNRGEC (SEQ ID NO:38 ) (US2007/0004909)。

然而，在一些實施方式中，此雙抗體的異源二聚體促進結構域由一個、兩個、三個或四個具有相反電荷的串聯重複的螺旋結構域形成，所述螺旋結構域包括具有至少六個、至少七個或至少八個帶電的氨基酸殘基序列(參見Apostolovic, B.等 (2008) “pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil ,” Biomacromolecules 9:3173–3180；Arndt, K.M.等 (2001) “Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain ,” J. Molec. Biol. 312:221-228；Arndt, K.M.等 (2002) ““Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils ,” Structure 10:1235-1248；Boucher, C.等 (2010) “Protein Detection By Western Blot Via Coiled–Coil Interactions ,” Analytical Biochemistry 399:138-140； Cachia, P.J.等 (2004) “Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy ,” J. Mol. Recognit. 17:540-557； De Crescenzo, G.D.等 (2003) “Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding ,” Biochemistry 42:1754-1763；Fernandez-Rodriquez, J.等 (2012) “Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag ,” Protein Science 21:511-519；Ghosh, T.S.等 (2009) “End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures ,” Acta crystallographica D65:1032-1041；Grigoryan, G.等 (2008) “Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions ,” Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483；Litowski, J.R.等 (2002) “Designing Heterodimeric Two-Stranded α-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And α-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity ,” J. Biol. Chem. 277:37272-37279；Steinkruger, J.D.等 (2012) “The d′--d--d′ Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′--a--a′ Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif ,” J. Amer. Chem. Soc. 134(5)：2626–2633；Straussman, R.等 (2007) “Kinking the Coiled Coil – Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface ,” J. Molec. Biol. 366:1232-1242；Tripet, B.等 (2002) “Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance ,” J. Molec. Biol. 323:345–362；Woolfson, D.N. (2005) “The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies ,” Adv. Prot. Chem. 70:79-112；和Zeng, Y.等 (2008) “A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism ,” J. Gene Med. 10:355-367)。

此重複的螺旋結構域可以是準確的重複或可具有取代。例如，第一多肽鏈的異源二聚體促進結構域可包括具有八個帶負電的氨基酸殘基的序列和第二多肽鏈的異源二聚體促進結構域可包括具有八個帶負電的氨基酸殘基的序列。哪個螺旋被提供給第一或第二多肽鏈是不重要的，條件是具有相反電荷的螺旋被用於另一條多肽鏈。帶正電的氨基酸可以是賴氨酸、精氨酸、組氨酸等和/或帶負電的氨基酸可以是谷氨酸、天冬氨酸等。帶正電的氨基酸優選是賴氨酸和/或帶負電的氨基酸優選是谷氨酸。然而，僅單一異源二聚體促進結構域被應用是可能的(因為此結構域將抑制同源二聚化，從而促進異源二聚化)，優選地，此雙抗體的第一和第二多肽鏈均含有異源二聚體促進結構域。

在優選的實施方式中，異源二聚體促進結構域中的一個將包括四個串聯“E-螺旋”螺旋結構域 (SEQ ID NO:39 : E VAAL E K-VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸鹽殘基將在pH 7形成負電荷，而異源二聚體促進結構域中的另一個將包括四個串聯“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:40 : K VAAL K E- K VAAL K E- VAAL K E-VAAL K E)，其賴氨酸殘基將在pH 7下形成正電荷。此帶電結構域的存在促進第一和第二多肽之間的締合，因此促進異源二聚體形成。尤其優選的是此異源二聚體促進結構域，其中SEQ ID NO:39 的四個串聯“E-螺旋”螺旋結構域中的一個已經被修飾成含有半胱氨酸殘基： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:41 )。同樣的，尤其優選的是此異源二聚體促進結構域，其中SEQ ID NO:40 的四個串聯“K-螺旋”螺旋結構域中的一個已經被修飾成含有半胱氨酸殘基： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E-VAAL K E (SEQ ID NO:42 )。

如WO 2012/018687中所述，為了提高雙抗體的體內藥代動力學性質，雙抗體可以被修飾成在雙抗體的一個或多個端處含有血清-結合蛋白的多肽部分。最優選地，此血清-結合蛋白的多肽部分將被安裝在雙抗體的C-末端。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白，並且，其在人體中的半衰期為19天。白蛋白具有若干小分子結合位點，其允許白蛋白非共價地結合於其他蛋白，從而延長其血清半衰期。鏈球菌屬菌株G148的蛋白G的白蛋白-結合結構域3 (ABD3)由形成穩定的三-螺旋束的46個氨基酸殘基組成，並具有廣泛的白蛋白-結合特異性(參見Johansson, M.U.等 (2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Module s,” J. Biol. Chem. 277(10): 8114-8120。因此，對於提高雙抗體的體內藥代動力學性質，尤其優選的血清-結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白G的白蛋白-結合結構域(ABD )，更優選地，鏈球菌屬菌株G148的蛋白G的白蛋白-結合結構域3 (ABD3) (SEQ ID NO:43 )：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。

如WO 2012/162068 (通過引用併入本文)中所述，SEQ ID NO:43 的“去免疫化的 ”變異體具有減弱或消除MHC II類結合的能力。基於組合突變結果，對於形成此種去免疫化的白蛋白-結合結構域，如下取代的組合被認為是優選的取代：66S/70S +71A；66S/70S +79A；64A/65A/71A+66S；64A/65A/71A+66D；64A/65A/71A+66E；64A/65A/79A+66S；64A/65A/79A+66D；64A/65A/79A+66E。變異體ABD，具有修飾L64A、I65A和D79A或修飾N66S、T70S和D79A。變異體去免疫化的ABD，具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 44 )：或者具有氨基酸序列(SEQ ID NO: 45) ：

尤其優選的，因為此去免疫化的白蛋白-結合結構域顯示基本上野生型結合同時提供減弱的MHC II類結合。因此，此具有白蛋白-結合結構域的雙抗體的第一多肽鏈含有第三接頭(接頭3)，其優選佈置於此多肽鏈的E-螺旋(或K-螺旋)結構域的C-末端，以便間插在E-螺旋(或K-螺旋)結構域和白蛋白-結合結構域(其優選是去免疫化的白蛋白-結合結構域) 之間。此接頭3的優選的序列是SEQ ID NO:46 : GGGS。

3. 含 Fc 區的雙特異性雙抗體

在一些實施方式中，包括Fc區的雙特異性雙抗體能夠同時結合於DR5和第二表位(例如，CD3)。將IgG CH2-CH3結構域添加至雙抗體多肽鏈中的一條或兩條中，以便雙抗體鏈的複合導致形成Fc區，這增加了雙抗體的生物半衰期和/或改變雙抗體的效價。將IgG CH2-CH3結構域併入到雙抗體多肽的兩個上將允許形成含Fc區的雙鏈雙特異性雙抗體(圖 2 )。

可選地，將IgG CH2-CH3結構域併入到雙抗體多肽中的僅一個上將允許形成含雙特異性Fc區的四鏈雙抗體(圖 3A-3B )，因此導致相對於兩個表位中的每一個為二價的雙特異性分子，其中一個是DR5的表位和另一個是存在於效應細胞表面上的分子的表位。圖 3A 顯示雙抗體，其具有固定輕鏈(CL)結構域和固定重鏈CH1結構域，然而，可選地，此結構域以及其它多肽的片段可被用作異源二聚體促進結構域(見，例如圖 3B ，美國專利公開號2013-0295121；2010-0174053和2009-0060910；歐洲專利公開號 EP 2714079；EP 2601216；EP 2376109；EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068；WO 2012/018687；WO 2010/080538)。因此，例如，可應用此肽替代CH1結構域，所述肽具有氨基酸序列GVEPKSC (SEQ ID NO:35 )或VEPKSC (SEQ ID NO:36 )，衍生自人IgG的鉸鏈結構域，並且，可應用人κ輕鏈的C-末端6個氨基酸——GFNRGEC (SEQ ID NO:37 )或FNRGEC (SEQ ID NO:38 )——替代CL結構域。

可用於根據本發明任一實施方式的含Fc區的雙抗體分子的另外的或可選的接頭包括：ASTKG (SEQ ID NO:47 )、DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48 )、LEPKSS (SEQ ID NO:49 )和APSSSPME (SEQ ID NO:50 )、GGC和GGG。SEQ ID NO:49 可用於替代GGG或GGC以易於克隆。另外，SEQ ID NO:47 可以緊隨SEQ ID NO:49 後面，以形成可選接頭(LEPKSSDKTHTCPPCP；SEQ ID NO:51) 。含有四鏈雙抗體的代表性肽示於圖 3A 。可選地，或者另外，可應用包含具有相反電荷的串聯螺旋結構域諸如上述E-螺旋或K-螺旋結構域的肽。含有四鏈雙抗體的代表性螺旋結構域示於圖 3B 。

在進一步的實施方式中，含Fc區的雙抗體可包括三條多肽鏈。此雙抗體的第一多肽包含三個結構域：(i)含VL1的結構域、(ii)含VH2的結構域和(iii)含有CH2-CH3序列的結構域。此雙抗體的第二多肽包含：(i)含VL2的結構域、(ii)含VH1的結構域和(iii)促進異源二聚化和與雙抗體的第一多肽鏈共價結合的結構域。此雙抗體的第三多肽包括CH2-CH3序列。因此，此雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起，以形成能夠結合於第一表位的VL1/VH1結合位點，以及能夠結合於第二表位的VL2/VH2結合位點。第一和第二多肽通過涉及在其各自的第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成經二硫鍵而被穩定化的Fc區。此雙抗體具有增強的效力。圖 4A 和 4B 圖示此雙抗體的結構。此含Fc區的DART®雙抗體可具有兩個取向中的任意一個(表 2 )：

表 2

在一些實施方式中，含Fc區的雙抗體的Fc區可以是完整的Fc區(例如，完整的IgG Fc區)或僅是完整的Fc區的片段。任選地，含Fc區的雙抗體的Fc區缺乏C-末端氨基酸殘基。儘管根據本發明任一實施方式的雙特異性單價Fc雙抗體的Fc區可具有結合於一個或多個Fc受體(例如，FcγR(一個或多個))的能力，但更優選地此Fc區將引起對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)的改變的結合(相對於由野生型Fc區顯示的結合)或將基本上消除此Fc區結合於抑制性受體(一個或多個)的能力。因此，含Fc區的雙抗體的Fc區可包括完整的Fc區的CH2結構域中的一些或全部和/或CH3結構域中的一些或全部，或可包括變異體CH2和/或變異體CH3序列(相對於完整的Fc區的CH2或CH3結構域，其可包括，例如，一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。此Fc區可包括非Fc多肽部分或可包括非天然的完整的Fc區的部分，或可包括非天然產生的取向的CH2和/或CH3結構域(諸如例如，兩個CH2結構域、或兩個CH3結構域、或在N-末端至C-末端方向，連接至CH2結構域的CH3結構域等)。

被鑒別為改變效應功能的Fc區修飾在本領域中是已知的，包括提高與啟動受體(例如，FcγRIIA (CD16A)的結合和降低與抑制性受體(例如，FcγRIIB (CD32B)的結合的修飾(見例如Stavenhagen, J.B.等 (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors ,” Cancer Res. 57(18)：8882-8890)。具有與CD32B降低的結合和/或與CD16A增強的結合的人IgG1 Fc區的示例性變異體包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。這些氨基酸取代可以任意組合存在於人IgG1 Fc區。在一個實施方式中，人IgG1 Fc區變異體包含F243L、R929P和Y300L取代。在另一個實施方式中，人IgG1 Fc區變異體包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。

尤其地，在一些實施方式中，含Fc區的雙抗體的多肽鏈的CH2-CH3結構域優選地顯示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有)結合(相對於通過野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1 )顯示的結合)。Fc變異體和能夠介導這種改變的結合的變異體形式如上所述。在具體實施方式中，含Fc區的雙抗體的多肽鏈的CH2-CH3結構域包括IgG Fc區，其顯示降低的ADCC效應物功能。在優選的實施方式中，此雙抗體的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括任意1、2或3個如下取代：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G。在另一個實施方式中，人IgG1 Fc區變異體包含N297Q取代、N297G取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因為這些突變消除FcR結合。可選地，利用此CH2-CH3結構域，其內在地顯示對FcγRIIIA (CD16a)降低的(或基本上沒有)結合和/或降低的效應物功能(相對於通過野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:1 )顯示的結合)。在具體實施方式中，含Fc區的雙抗體包括IgG2 Fc區或IgG4 Fc區。在使用IgG4 Fc區的情況下，還包括引入穩定化突變，諸如S228P，如通過Kabat中列出的EU索引所編號的(參見Lu等, (2008) “The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation ,” J Pharmaceutical Sciences 97:960-969)，以降低鏈交換的發生。本領域中已知的其他穩定化突變可以被引入到IgG4 Fc區中(參見Peters, P等, (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability ,” J. Biol. Chem., 287:24525-24533；PCT專利公開號：WO 2008/145142)。由於N297G、N297Q、L234A、L235A和D265A取代消除效應物功能，所以，在期望效應物功能的情況下，這些取代優選不被應用。

此多肽鏈的CH2和/或CH3結構域在序列上不需要是一致的，並且有利地被修飾以促進兩條多肽鏈之間的複合。例如，氨基酸取代(優選以包括形成“杵”的大側基的氨基酸例如色氨酸取代)可被引入CH2或CH3結構域，以便空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用並將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域——即“臼”(例如，用甘氨酸取代)——配對。此突變組可被工程化到任意對的包括形成Fc區的CH2-CH3結構域的多肽中。蛋白質工程化以相對於同源二聚化利於異源二聚化的方法在本領域中是悉知的，尤其是關於工程化免疫球蛋白樣分子，這些都包括在本文中(參見Ridgway等 (1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621, Atwell等 (1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35；和Xie等 (2005)A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；其均通過引用以其整體併入本文)。優選“杵”被工程化到第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中和“臼”被工程化到包括三條多肽鏈的雙抗體的第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此，“杵”將有助於防止第一多肽鏈經其CH2和/或CH3結構域而同源二聚化。由於第三多肽鏈優選包含“臼”取代，其將與第一多肽鏈異源二聚化以及自身同源二聚化。類似的策略可用於包括四條鏈的雙抗體，其中“杵”被工程化到第二多肽鏈的CH2-CH3結構域中和“臼”被工程化到第四多肽鏈的CH2-CH3結構域中。

通過修飾天然IgG Fc區以包含修飾T366W產生優選的杵。通過修飾天然IgG Fc區以包含修飾T366S、L368A和Y407V而產生優選的臼。為了幫助從包括第一、第二和第三多肽鏈的最終雙特異性單價Fc雙抗體純化第三多肽鏈同源二聚體，第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白質A結合位點優選通過在位置435 (H435R)的氨基酸取代而被突變。因此，第三多肽鏈同源二聚體將不結合蛋白質A，然而，雙特異性單價Fc雙抗體將保持其經第一多肽鏈上的蛋白質A結合位點結合蛋白質A的能力。

在一些實施方式中，含Fc區的雙抗體的第一多肽鏈的CH2和CH3結構域的優選的序列可具有“攜帶杵 ”的序列(SEQ ID NO:52 )：

在一些實施方式中，具有兩條多肽鏈的含Fc區的雙抗體的第二多肽鏈(或具有三條多肽鏈的含Fc區的雙抗體的第三多肽鏈)的CH2和CH3結構域的優選序列將具有“攜帶臼 ”的序列(SEQ ID NO:53 )：

如將注意到的，SEQ ID NO:52 和SEQ ID NO:53 的CH2-CH3結構域包括在位置234用丙氨酸進行的取代和在位置235用丙氨酸進行的取代，因此形成Fc區，其顯示對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)降低的(或基本上沒有)結合(相對於通過野生型Fc區(SEQ ID NO:1 )顯示的結合)。

優選的第一多肽鏈可具有“攜帶杵”的CH2-CH3序列諸如SEQ ID NO:52 的序列 。然而，如將被認識到的，“攜帶臼”的CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:53 )可被應用於第一多肽鏈中，在這種情況下，“攜帶杵”的CH2-CH3結構域(例如，SEQ ID NO:52 )會被應用於具有兩條多肽鏈的根據本發明任一實施方式的含Fc區的雙抗體的第二多肽鏈(或具有三個或四個多肽鏈的含Fc區的雙抗體的第三多肽鏈)中。

V. 參考抗體

A. 參考抗 - 人 DR5 抗體

為了評估和表徵根據本發明任一實施方式的新的抗-人DR5-結合分子，應用以下參考抗體：曲茲妥單抗 (在本文中命名為“DR5 mAb 3 ”)、可那木單抗(在本文中命名為“DR5 mAb 4 ”)、芬妥木單抗（tigatumumab ） (在本文中命名為“DR5 mAb 5 ”)、LBY135-1 (在本文中命名為“DR5 mAb 6 ”)、LBY135-2 (在本文中命名為“DR5mAb 7 ”)和KMTR2 (在本文中命名為“DR5 mAb 8 ”)。

1. 曲茲妥單抗 (“DR5 mAb 3”)

曲茲妥單抗 (“DR5 mAb 3 ”)的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:54 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 3的CDR_L 1 (SEQ ID NO:55 )：SGDSLRSYYAS ；DR5 mAb 3的CDR_L 2 (SEQ ID NO:56 )：GANNRPS ；且DR5 mAb 3的CDR_L 3 (SEQ ID NO:57 )：NSADSSGNHVV 。

曲茲妥單抗 (“DR5 mAb 3 ”)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:58 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 3的CDR_H 1 (SEQ ID NO:59 )：GFTFDDYAMS ；DR5 mAb 3的CDR_H 2 (SEQ ID NO:60 )：INWQGGSTGYADSVKG ；且DR5 mAb 3的CDR_H 3 (SEQ ID NO:61 )：ILGAGRGWYFDY 。

2. 可那木單抗 (“DR5 mAb 4”)

可那木單抗 (“DR5 mAb 4 ”)的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:62 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 4的CDR_L 1 (SEQ ID NO:63 )：RASQGISRSYLA ；DR5 mAb 4的CDR_L 2 (SEQ ID NO:64 )：GASSRAT ；且DR5 mAb 4的CDR_L 3 (SEQ ID NO:65 )：QQFGSSPWT 。

可那木單抗 (“DR5 mAb 4 ”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:66 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 4的CDR_H 1 (SEQ ID NO:67 )：GGSISSGDYFWS ；DR5 mAb 4的CDR_H 2 (SEQ ID NO:68 )：HIHNSGTTYYNPSLKS ；且DR5 mAb 4的CDR_H 3 (SEQ ID NO:69 )：DRGGDYYYGMDV 。

3. 芬妥木單抗 (“DR5 mAb 5”)

芬妥木單抗 (“DR5 mAb 5 ”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:70 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 5的CDR_L 1(SEQ ID NO:71 )：KASQDVGTAVA ；DR5 mAb 5的CDR_L 2 (SEQ ID NO:72 )：WASTRHT ；且DR5 mAb 5的CDR_L 3 (SEQ ID NO:73 )：QQYSSYRT 。

芬妥木單抗(“DR5 mAb5 ”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:74 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 5的CDR_H 1 (SEQ ID NO:75 )：GFTFSSYVMS ；DR5 mAb 5的CDR_H 2 (SEQ ID NO:76 )：TISSGGSYTYYPDSVKG ；且DR5 mAb 5的CDR_H 3 (SEQ ID NO:77 )：RGDSMITTDY 。

4. LBY135-1 (“DR5 mAb 6”)

LBY135-1 (“DR5 mAb 6 ”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:78 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 6的CDR_L 1 (SEQ ID NO:79 )：QDVNTAIA ；DR5 mAb 6的CDR_L 2 (SEQ ID NO:80 )：WASTRHT ；且DR5 mAb 6的CDR_L 3 (SEQ ID NO:81 )：QQWSSNPLT 。

LBY135-1 (“DR5 mAb 6 ”) 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:82 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 6的CDR_H 1 (SEQ ID NO:83 )：GYTFTDYTIH ；DR5 mAb 6的CDR_H 2 (SEQ ID NO:84 )：WFYPGGGYIKYNEKFKD ；且DR5 mAb 6的CDR_H 3 (SEQ ID NO:85 )：HEEGIYFDY 。

5. LBY135-2 (“DR5 mAb 7”)

LBY135-2 (“DR5 mAb 7 ”) 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:86 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 7的CDR_L 1 (SEQ ID NO:87 )：KASQDVNTAIA ；DR5 mAb 7的CDR_L 2 (SEQ ID NO:88 )：WASTRHT ；且DR5 mAb 7的CDR_L 3 (SEQ ID NO:89 )：QQHYTTPFT 。

LBY135-2 (“DR5 mAb 7 ”)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:90 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 7的CDR_H 1 (SEQ ID NO:91 )：GYTFTDYTIH ；DR5 mAb 7的CDR_H 2 (SEQ ID NO:92 )：WFYPGGGYIKYNEKFKD ；且DR5 mAb 7的CDR_H 3 (SEQ ID NO:93 )：HEEGIYFDY 。

6. KMTR2 (“DR5 mAb 8”)

KMTR2 (“DR5 mAb 8 ”)的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:94 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 8的CDR_L 1 (SEQ ID NO:95 )：RASQSVSSYLA ；DR5 mAb 8的CDR_L 2 (SEQ ID NO:96 )：DASNRAT ；且DR5 mAb 8的CDR_L 3 (SEQ ID NO:97 )：QQRSNWPLT 。

KMTR2 (“DR5 mAb 8 ”)的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:98 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

其中，DR5 mAb 8的CDR_H 1 (SEQ ID NO:99 )：GYTFTNYKIN ；DR5 mAb 8的CDR_H 2 (SEQ ID NO:100 )：WMNPDTDSTGYPQKFQG ；且DR5 mAb 8的CDR_H 3 (SEQ ID NO:101 )：SYGSGSYYRDYYYGMDV 。

B. 參考抗 -CD2 抗體

CD2是T細胞和天然殺傷(NK)細胞表面上發現的細胞黏附分子。CD2增強NK細胞的細胞毒性，有可能作為NK細胞納米管形成的促進劑(promoter)(參見Mace, E.M.等 (2014) “Cell Biological Steps And Checkpoints In Accessing NK Cell Cytotoxicity ,” Immunol. Cell. Biol. 92(3)：245-255；和Comerci, C.J.等 (2012) “CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation ,” PLoS One 7(10)：e47664:1-12)。抗-CD2抗體Lo-CD2a被用作參考抗體。抗-CD2抗體(Lo-CD2a；ATCC登陸號：11423)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:102 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

抗-CD2抗體(Lo-CD2a；ATCC登陸號：11423)的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:103 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

C. 參考抗 -CD3 抗體

在一些實施方式中，DR5-結合分子結合的第二表位可為是CD3的表位。CD3是T細胞共受體，由四條不同的鏈組成(參見Wucherpfennig, K.W.等 (2010) “Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling ,” Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4)：a005140；pages 1-14)。在哺乳動物中，複合物包含CD3γ鏈、CD3δ鏈和兩條CD3ε鏈。這些鏈與被稱為T細胞受體(TCR)的分子締合，以在T淋巴細胞中產生啟動信號。在不存在CD3的情況下，TCR不適當地組裝，並被降解(參見Thomas, S.等 (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2)：170–177)。發現CD3結合於所有成熟T細胞而幾乎沒有其它細胞類型的膜(見，Janeway, C.A.等 (2005) 在以下中: IMMUNOBIOLOGY: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE,” 6th ed. Garland Science Publishing, NY, 214-216頁；Sun, Z. J.等 (2001) “Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer ,” Cell 105(7)：913-923；Kuhns, M.S.等 (2006) “Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex ,” Immunity. 2006 Feb;24(2)：133-139)。

如下所述，為了闡釋本發明，產生了雙特異性抗-人CD3 x 抗-人DR5-結合分子。用於此構建體的抗-人CD3抗體在本文中命名為“CD3 mAb 2 ”。CD3 mAb 2 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

其中，CD3 mAb 2的CDR_L 1 (SEQ ID NO:105 )：RSSTGAVTTSNYAN ；CD3 mAb 2的CDR_L 2 (SEQ ID NO:106 )：GTNKRAP ；且CD3 mAb 2的CDR_L 3 (SEQ ID NO:107 )：ALWYSNLWV 。

CD3 mAb 2 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:108 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

其中，CD3 mAb 2的CDR_H 1 (SEQ ID NO:109 )：TYAMN ；CD3 mAb 2的CDR_H 2 (SEQ ID NO:110 )：RIRSKYNNYATYYADSVKD ；且CD3 mAb 2的CDR_H 3 (SEQ ID NO:111 )：HGNFGNSYVSWFAY 。

在一些CD3構建體中，變異體VH結構域被用於CD3 mAb 2 。變異體VH結構域具有D65G取代，因此，其具有如下顯示的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

氨基酸取代導致CDR_H 2具有氨基酸序列(SEQ ID NO:113 ) RIRSKYNNYATYYADSVKG 。取代的位置(D65G)以雙底線顯示。

本文中使用的第二抗-CD3抗體是抗體莫羅單抗(Muromonab)-CD3 “OKT3 ” (參見Xu等 (2000)“In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies,” Cell. Immunol. 200:16-26)；Norman, D.J. (1995) “Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3 ,” Ther. Drug Monit. 17(6)：615-620；Canafax, D.M.等 (1987) “Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection ,” Pharmacotherapy 7(4)：121-124；和Swinnen, L.J.等 (1993) “OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Transplantation ,” Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4)：670-678)。OKT3 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:114 )顯示如下(CDR_L 殘基以底線顯示)：

OKT3 的VH結構域的氨基酸序列 (SEQ ID NO:115 )顯示如下(CDR_H 殘基以底線顯示)：

D. 參考抗 -CD16 抗體

CD16是FcγRIIIA受體。CD16由嗜中性粒細胞、嗜伊紅粒細胞、天然殺傷(NK)細胞和結合聚集的而不是單體人IgG的組織巨噬細胞表達(參見Peltz, G.A.等 (1989) “Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3)：1013-1017；Bachanova, V.等 (2014) “NK Cells In Therapy Of Cancer ,” Crit. Rev. Oncog. 19(1-2)：133-141；Miller, J.S. (2013) “Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic ,” Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253；Youinou, P.等 (2002) “Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases ,” Autoimmun Rev. 1(1-2)：13-19；和Peipp, M.等 (2002) “Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells ,” Biochem. Soc. Trans. 30(4)：507-511)。

抗-CD16抗體3G8的可變輕鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:116 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

抗-CD16抗體3G8的可變重鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:117 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

抗-CD16抗體A9的可變輕鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:118 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

抗-CD16抗體A9的可變重鏈結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:119 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

E. 參考抗 -CD19 抗體

CD19抗原是I型跨膜糖蛋白，屬於免疫球蛋白Ig超家族。CD19表達於濾泡樹突細胞和B細胞上。其被認為是全(pan) B細胞標記物，在B細胞的整個發育過程中被表達，但是，與不成熟B細胞相比，在成熟細胞中具有三倍高的表達(參見Raufi A.等 (2013) “Targeting CD19 In B-Cell Lymphoma: Emerging Role Of SAR3419 ,” Cancer Manag. Res. 5:225-233)。許多CD19抗體已經被描述(例如，MD1342、MEDI-551等) (參見Mei, H.E.等 (2012) “Rationale Of Anti-CD19 Immunotherapy: An Option To Target Autoreactive Plasma Cells In Autoimmunity ,” Arthritis Res. Ther. 14(Suppl 5)：S1:1-16)。抗-CD19 結合分子 “蘭妥莫單抗(blinatumomab)”公開於EP 2186527中。

抗-CD19抗體(HD37)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:120 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

抗-CD19抗體HD37的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:121 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

F. 參考抗 -CD20 抗體

CD20是B細胞特異性分化抗原，其表達於成熟B細胞上，並且在大部分B細胞非霍奇金淋巴瘤中表達，但不在早期B細胞祖細胞(progenitor)或較晚的成熟漿細胞上表達(參見Maloney, D.G. (2012) “Anti-CD20 Antibody Therapy for B-Cell Lymphomas ,” N. Engl. J. Med. 366:2008-2016)。利妥昔單抗(Rituximab)是示例性抗-人CD20抗體。抗-CD20抗體(利妥昔單抗)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQID NO:122 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

抗-CD20抗體(利妥昔單抗)的VH結構域的氨基酸序列是(SEQID NO:123 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

G. 參考抗 -CD22 抗體

CD22是結合糖的跨膜蛋白，其發現於成熟B細胞表面上，並且，在較小程度上，發現於一些不成熟B細胞上(參見WO 2011/032633；Poe, J.C.等 (2012) “CD22 And Siglec-G In B Cell Function And Tolerance ,” Trends Immunol. 33(8)：413-420；Chen, W.C.等 (2012) “Targeting B Lymphoma With Nanoparticles Bearing Glycan Ligands Of CD22 ,” Leuk. Lymphoma 53(2)：208-210；Walker, J.A. (2008) “CD22: An Inhibitory Enigma ,” Immunology 123(3)：314-325；和Coleman, M.等 (2003) “Epratuzumab: Targeting B-Cell Malignancies Through CD22 ,” Clin. Cancer Res. 9(10 Pt 2)：3991S-3994S)。

抗-CD22抗體(依帕珠單抗，epratuzumab)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQID NO:124 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

抗-CD22抗體(依帕珠單抗)的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:125 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

H. 參考抗 -CD32B 抗體

CD32B是FcγRIIB受體。CD32B廣泛表達和存在於所有造血細胞——包括單核細胞、巨噬細胞、B細胞、NK細胞、嗜中性粒細胞、肥大細胞和血小板——上。結合於人CD32B的抗體的VL結構域的優選序列是(SEQ ID NO:126 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

結合於人CD32B的抗體的VH結構域的優選序列是(SEQ ID NO:127 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

I. 參考抗 -CD64 抗體

CD64是FcγRI受體，並表達於單核細胞/巨噬細胞、樹突細胞和啟動的粒細胞上。並且，此表達可通過IFN-γ刺激而被上調。CD64結合IgG免疫複合物。CD64在抗原捕獲、IgG/抗原複合物的吞噬和抗體依賴性細胞毒性中發揮作用(參見WO 2006/002438)。

結合於人CD64的抗體的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:128 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

結合於人CD64的抗體的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:129 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

J. 參考抗 -BCR/CD79 抗體

BCR由膜免疫球蛋白組成，其與CD79的非共價締合的α和β亞基(分別為“CD79a”和“CD79b”)一起形成BCR複合物。CD79a和CD79b是信號轉導亞基，其包含信號轉導所需要的保守的免疫受體酪氨酸基活化基序(“ITAM”) (參見Dylke, J.等 (2007) “Role Of The Extracellular And Transmembrane Domain Of Ig-Alpha/Beta In Assembly Of The B Cell Antigen Receptor (BCR) ,” Immunol. Lett. 112(1)：47-57；Cambier, J.C. (1995) “New Nomenclature For Reth Motif (or ARH1/TAM/ARAM/YXXL) ,” Immunol. Today 16:110)。BCR複合物通過多價抗原的聚集發起了CD79a和CD79b ITAM的磷酸根轉移，和與受體有關的激酶的活化(參見DeFranco, A.L. (1997) “The Complexity Of Signaling Pathways Activated By The BCR ,” Curr. Opin. Immunol. 9:296-308；和Kurosaki, T. (1997) “Molecular Mechanisms In B Cell Antigen Receptor Signaling ,” Curr. Opin. Immunol. 9:309-318；Kim, K.M.等 (1993) “Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors ,” Immun. Rev. 132:125-146)。磷酸化的ITAM徵募另外的效應物諸如PI₃ K、PLC-γ和Ras/MAPK途徑的成員。這些信號傳導事件是造成B細胞增殖和使B細胞準備與T-輔助(“T_h ”)細胞隨後相互作用所需要的活化標記物(諸如MHCII和CD86)表達增加的原因。

結合於人B細胞受體的抗體(CD79)的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:130 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

結合於人B細胞受體的抗體(CD79)的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:131 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

K. 參考抗 -T 細胞受體抗體

在可選實施方式中，通過DR5-結合分子結合的第二表位可是T細胞受體(TCR)的表位。T細胞受體由CD4+或CD8+ T細胞天然表達，並允許這些細胞識別由抗原呈遞細胞的I類或II類MHC蛋白質結合或呈遞的抗原肽。通過TCR識別pMHC(肽–MHC)複合物發起了導致細胞因數產生和抗原呈遞細胞分解的細胞免疫應答的傳播(參見Armstrong, K.M.等 (2008) “Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide–MHC Complexes ,” Biochem. J. 415(Pt 2)：183–196；Willemsen, R. (2008) “Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy ,” Cytometry A. 73(11)：1093-1099；Beier, K.C.等 (2007) “Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation ,” Eur. Respir. J. 29:804-812；Mallone, R.等 (2005) “Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes ,” Am. J. Ther. 12(6)：534–550)。CD3是受體，其結合於TCR (Thomas, S.等 (2010) “Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer ,” Immunology 129(2)：170-177；Guy, C.S.等 (2009) “Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex ,” Immunol. Rev. 232(1)：7-21；St. Clair, E.W. (Epub 2009 Oct 12) “Novel Targeted Therapies For Autoimmunity ,” Curr. Opin. Immunol. 21(6)：648-657；Baeuerle, P.A.等 (Epub 2009 Jun 9) “Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12)：4941-4944；Smith-Garvin, J.E.等 (2009) “T Cell Activation ,” Annu. Rev. Immunol. 27:591-619；和Renders, L.等 (2003) “Engineered CD3 Antibody For Immunosuppression ,” Clin. Exp. Immunol. 133(3)：307-309)。

特異性結合T細胞受體的抗體包括抗-TCR抗體BMA 031 (參見EP 0403156；Kurrle, R.等 (1989) “BMA 031 – A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application ,” Transplant Proc. 21(1 Pt 1)：1017-1019；Nashan, B.等 (1987) “Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex,” Transplant Proc. 19(5)：4270-4272；Shearman, C.W.等 (1991) “Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell,” J. Immunol. 146(3)：928-935；和Shearman, C.W.等 (1991) “Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor ,” J. Immunol. 147(12)：4366-4373)。

抗-TCR抗體BMA 031的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:132 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

[00208] 抗-TCR抗體BMA 031的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:133 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

L. 參考抗 -NKG2D 受體抗體

在可選實施方式中，通過DR5-結合分子結合的第二表位可是NKG2D受體的表位。NKG2D受體表達於所有人(和其他哺乳動物)天然殺傷細胞上(參見Bauer, S.等 (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA ,” Science 285(5428)：727-729；Jamieson, A.M.等 (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1)：19-29)以及所有CD8⁺ T細胞上(Groh, V.等 (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells ,” Nat. Immunol. 2(3)：255-260；和Jamieson, A.M.等 (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1)：19-29)。此結合配體，尤其是未在正常細胞上表達的那些結合配體，包括組織相容性60 (H60)分子、視黃酸早期誘導基因-1 (RAE-1)的產物和鼠科UL16結合類蛋白(proteinlike)轉錄物1 (MULT1) (參見Raulet D.H. (2003) “Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands ,” Nature Rev. Immunol. 3:781-790；和Coudert, J.D.等 (2005) “Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells ,” Blood 106:1711-1717)。特異性結合NKG2D受體的抗體包括KYK-2.0 (參見Kwong, KY等 (2008) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity ,” J. Mol. Biol. 384:1143-1156；和PCT/US09/54911)。

抗-NKG2D抗體KYK-1.0的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:134 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

抗-NKG2D抗體KYK-1.0的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:135 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

抗-NKG2D抗體KYK-2.0的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:136 ) (CDR_L 殘基以底線顯示)：

抗-NKG2D抗體KYK-2.0的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:137 ) (CDR_H 殘基以底線顯示)：

M. 參考抗 - 螢光素抗體

抗-螢光素抗體4-4-20 (參見Gruber, M.等 (1994) “Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity ,” J. Immunol. 152(11)：5368-5374；Bedzyk, W.D.等 (1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family ,” J. Biol. Chem. 264(3)： 1565-1569)被用於對照雙抗體中。抗-螢光素抗體4-4-20的可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域的氨基酸序列如下：

抗-螢光素抗體4-4-20的可變輕鏈結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:138 ) (CDR_L 殘基被加以底線)：

抗-螢光素抗體4-4-20的可變重鏈結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:139 ) (CDR_H 殘基被加以底線)：

VI. 示例性抗 - 人 DR5 雙特異性雙抗體

A. DR5 x CD3 雙特異性雙抗體

1. DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 雙抗體

由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體被構建成具有抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。雙抗體被命名為“DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:140 )：

在SEQ ID NO:140 中，氨基酸殘基1-111對應於DR5 mAb 1的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:3 )，殘基112-119對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基120-244對應於具有D65G 取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基245-249對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基250-277對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO:41 )。編碼SEQ ID NO:140 的多核苷酸是SEQ ID NO:141 ：

DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:142 )：

在SEQ ID NO:142 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-239對應於DR5 mAb 1的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:8 )，除了SEQ ID NO:8 的C-末端絲氨酸殘基已經被丙氨酸殘基取代之外，殘基240-244對應於ASTKG 接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基245-272對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO:42 )。編碼SEQ ID NO:142 的多核苷酸是SEQ ID NO:143 ：

2. DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 雙抗體

由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體被構建成具有抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL結構域和VH結構域和CD3 mAb 2的VL結構域和VH結構域。雙抗體被命名為“DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:144 )：

在SEQ ID NO:144 中，氨基酸殘基1-107對應於DR5 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:13 )，殘基108-115對應於間插間隔肽(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO:41 )。編碼SEQ ID NO:144 的多核苷酸是SEQ ID NO:145 ：

DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:146 )：

在SEQ ID NO:146 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於DR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:18 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO:42 )。編碼SEQ ID NO:146 的多核苷酸是SEQ ID NO:147 ：

3. hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 雙抗體

由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。hDR5 mAb 2 VL-2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:23 )被應用。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:148 )：

在SEQ ID NO:148 中，氨基酸殘基1-107對應於hDR5 mAb 2 VL-2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23 )，殘基108-115對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域 (SEQ ID NO:41 )。編碼SEQ ID NO:148 的多核苷酸是SEQ ID NO:149 ：

hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:150 )：

在SEQ ID NO:150 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域 (SEQ ID NO:42 )。編碼SEQ ID NO:150 的多核苷酸是SEQ ID NO:151 ：

4. hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2 雙抗體

由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL結構域和VH結構域和CD3 mAb 2的VL結構域和VH結構域。hDR5 mAb 2 VL-3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:25 )被應用。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:152 )：

在SEQ ID NO:152 中，氨基酸殘基1-107對應於hDR5 mAb 2 VL-3的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:25 )，殘基108-115對應於間插間隔肽(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋(SEQ ID NO:41 )。編碼SEQ ID NO:152 的多核苷酸是SEQ ID NO:153 ：

hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:154 )：

在SEQ ID NO:154 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO:42 )。編碼SEQ ID NO:154 的多核苷酸是SEQ ID NO:155 ：

5. hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2 雙抗體

由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL結構域和VH結構域和CD3 mAb 2的VL結構域和VH結構域。hDR5 mAb 2 VL-4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:27 )被應用。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:156 )：

在SEQ ID NO:156 中，氨基酸殘基1-107對應於hDR5 mAb 2 VL-4的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:27 )，殘基108-115對應於間插間隔肽(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO:41 )。編碼SEQ ID NO:156 的多核苷酸是SEQ ID NO:157 ：

hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:158 )：

在SEQ ID NO:158 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO:42 )。編碼SEQ ID NO:158 的多核苷酸是SEQ ID NO:159 ：

6. hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2 雙抗體

由兩條多肽鏈組成的示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。hDR5 mAb 2 VL-5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:29 )被應用。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:160 )：

在SEQ ID NO:160 中，氨基酸殘基1-107對應於hDR5 mAb 2 VL-5的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:29 )，殘基108-115對應於間插間隔肽(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO:41 )。編碼SEQ ID NO:160 的多核苷酸是SEQ ID NO:161 ：

hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:162 )：

在SEQ ID NO:162 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO:42 )。編碼SEQ ID NO:162 的多核苷酸是SEQ ID NO:163 ：

7. DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2 雙抗體

為進一步示例根據本發明任一實施方式的雙特異性抗-DR5 x 抗-CD3雙抗體，利用DR5 mAb 3和CD3 mAb 2的VL和VH結構域構建由兩條多肽鏈組成的雙抗體。雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:164 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:164 中，氨基酸殘基1-108對應於DR5 mAb 3的VL結構域(SEQ ID NO:54 )，殘基109-116對應於間插間隔肽GGGSGGGG(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基117-241對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基242-246對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基247-275對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO:42 )。

雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:165 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:165 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-239對應於DR5 mAb 3的VH結構域的氨基酸序列 (SEQ ID NO:58 )，殘基240-244對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基245-272對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域 (SEQ ID NO:42 )。

8. DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2 雙抗體

為進一步示例根據本發明任一實施方式的雙特異性抗-DR5 x 抗-CD3雙抗體，利用DR5 mAb 4和CD3 mAb 2的VL和VH結構域構建由兩條多肽鏈組成的雙抗體。雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:166 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:166 中，氨基酸殘基1-108對應於DR5 mAb 4的VL結構域(SEQ ID NO:62 )，殘基109-116對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基117-241對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:96 )，殘基242-246對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基247-275對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域 (SEQ ID NO:41 )。

雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:167 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:167 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-240對應於DR5 mAb 4的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:66 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基246-273對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域 (SEQ ID NO:42 )。

9. 含 Fc 區的 hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 雙抗體

a. hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 1 雙抗體

由三條多肽鏈組成的含Fc區的示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域並應用hDR5 mAb 2 VL-2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:23 )。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 1 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:168 )：

在SEQ ID NO:168 中，氨基酸殘基1-107對應於hDR5 mAb 2 VL-2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23 )，殘基108-115對應於間插間隔肽(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )，殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO:41 )，殘基274-276對應於接頭GGG，殘基277-286對應於接頭(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG 鉸鏈結構域，和殘基287-503對應於“攜帶杵”的 CH2-CH3序列(SEQ ID NO:52 )。

hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 w/Fc雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:169 )：

在SEQ ID NO:169 中，殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域 (SEQ ID NO:42 )。

[00253] hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 w/Fc雙抗體的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:170 )：

在SEQ ID NO:170 中，氨基酸殘基1-10對應於接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG 鉸鏈結構域，和殘基11-227對應於“攜帶臼”的 CH2-CH3序列(SEQ ID NO:53 )。

b. hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 2 雙抗體

由三條多肽鏈組成的含Fc區的第二示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。hDR5 mAb 2 VL-2多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:23 )被用於此構建體。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 2 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:171 )：

在SEQ ID NO:171 中，氨基酸殘基1-10對應於接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG 鉸鏈結構域，殘基11-227對應於“攜帶杵”的 CH2-CH3序列(SEQ ID NO:52 )，殘基228-235 (APSSSPME；SEQ ID NO:50 )是接頭，殘基236-342對應於hDR5 mAb 2 VL-2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:23 )，殘基343-350對應於間插間隔肽(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基351-475對應於CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:108 )，殘基476-481是含有半胱氨酸的間隔肽GGCGGG (接頭2) (SEQ ID NO:34 )和殘基482-510對應於K-螺旋(SEQ ID NO:40 )。

hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 w/Fc形式2雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:172 )：

在SEQ ID NO:172 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO:42 )。

hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2 w/Fc形式2雙抗體的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:173 )：

在SEQ ID NO:173 中，氨基酸殘基1-10對應於接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG 鉸鏈結構域，和殘基11-227對應於“攜帶臼”的CH2-CH3序列(SEQ ID NO:53 )。

c. hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 1 雙抗體

由三條多肽鏈組成的含Fc區的第三示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。hDR5 mAb 2 VL-3多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:25 )被用於此構建體。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 1 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:174 )：

在SEQ ID NO:174 中，氨基酸殘基1-107對應於hDR5 mAb 2 VL-3的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:25 )，殘基108-115對應於間插間隔肽(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )，殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO:41 )，殘基274-276對應於接頭GGG，殘基277-286對應於接頭(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG 鉸鏈結構域，和殘基287-503對應於“攜帶杵”的CH2-CH3序列(SEQ ID NO:52 )。

hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2 w/Fc雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:175 )：

在SEQ ID NO:175 中，殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域 (SEQ ID NO:42 )。

hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2 w/Fc雙抗體的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:176 )：

在SEQ ID NO:176 中，氨基酸殘基1-10對應於接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG 鉸鏈結構域，和殘基11-227對應於“攜帶臼”的CH2-CH3序列(SEQ ID NO:53 )。

d. hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 1 雙抗體

由三條多肽鏈組成的含Fc區的第四示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。hDR5 mAb 2 VL-4多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:27 )被用於此構建體。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 1 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:177 )：

在SEQ ID NO:177 中，氨基酸殘基1-107對應於hDR5 mAb 2 VL-4的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:27 )，殘基108-115對應於間插間隔肽GGGSGGGG(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )，殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域 (SEQ ID NO:41 )，殘基274-276對應於接頭GGG，殘基277-286對應於接頭(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG 鉸鏈結構域，和殘基287-503對應於“攜帶杵”的CH2-CH3序列(SEQ ID NO:52 )。

hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2 w/Fc雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:178 )：

在SEQ ID NO:178 中，殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域(SEQ ID NO:42 )。

hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2 w/Fc雙抗體的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:179 )：

在SEQ ID NO:179 中，氨基酸殘基1-10對應於接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG 鉸鏈結構域，和殘基11-227對應於“攜帶臼”的CH2-CH3序列(SEQ ID NO:53 )。

e. hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 1 雙抗體

由三條多肽鏈組成的含Fc區的第五示例性雙特異性雙抗體被構建成具有人源化抗-人DR5抗體hDR5 mAb 2的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域。hDR5 mAb 2 VL-5多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:29 )被用於此構建體。雙抗體被命名為“hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2 w/Fc 形式 1 雙抗體 ”。此雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:180 )：

在SEQ ID NO:180 中，氨基酸殘基1-107對應於hDR5 mAb 2 VL-5的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:29 )，殘基108-115對應於間插間隔肽GGGSGGGG(接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基116-240對應於具有D65G取代的CD3 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:112 )，殘基241-245對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )，殘基246-273對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域(SEQ ID NO:41 )，殘基274-276對應於接頭GGG，殘基277-286對應於接頭(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG鉸鏈結構域，和殘基287-503對應於“攜帶杵”的CH2-CH3序列(SEQ ID NO:52 )：

hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2 w/Fc雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:181 )：

在SEQ ID NO:181 中，殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-237對應於hDR5 mAb 2的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:31 )，殘基238-242對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基243-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域 (SEQ ID NO:42 )。

hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2 w/Fc雙抗體的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:182 )：

在SEQ ID NO:182 中，氨基酸殘基1-10對應於接頭DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:48 )，其來源於IgG鉸鏈結構域，和殘基11-227對應於“攜帶臼”的CH2-CH3序列(SEQ ID NO:53 )。

10. 抗 -DR5 x 抗 -CD3 BiTe 雙抗體

BiTes (Bispecific T cell Engagers，雙特異性T細胞銜接物)是一種形式的雙抗體，其中，單一多肽鏈分子被設計成具有兩個抗原-結合結構域，其中一個結合於T細胞抗原和第二個結合於存在於靶標表面上的抗原(參見WO 05/061547；Baeuerle, P等 (2008) “BiTE®: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells ,” Drugs of the Future 33: 137-147；Bargou,等 2008) “Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody ,” Science 321: 974-977)。以下顯示四種示例性抗-DR5 x 抗-CD3 BiTe分子的序列。

a. DR5 mAb 5 x OKT3 BiTE (DR5 VHVL- OKT3 VHVL)

可利用DR5 mAb 5的VL和VH結構域和OKT3的VL和VH結構域，以VH-VL取向構建第一抗-DR5 x 抗-CD3 BiTe分子。BiTe可具有DR5 VHVL – OKT3 VHVL的取向。BiTe的氨基酸序列顯示如下(SEQ ID NO:183 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQID NO:183 中，氨基酸殘基1-119對應於DR5 mAb 5的VH結構域(SEQ ID NO:74 )，氨基酸殘基120-134是接頭GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:184 )，殘基135-240對應於DR5 mAb 5的VL結構域(SEQ ID NO:70 )，殘基241-246是接頭SGGGGS (SEQ ID NO:185 )，殘基247-438對應於OKT3的VH結構域(SEQ ID NO:115 )，殘基439-453是接頭GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:184 )和殘基454-560對應於OKT3的VL結構域(SEQ ID NO:114 )。

b. DR5 mAb 5 x OKT3 BiTE (DR5 VLVH- OKT3 VLVH)

可利用DR5 mAb 5的VL和VH結構域和OKT3的VL和VH結構域，以VL-VH取向構建第二抗-DR5 x 抗-CD3 BiTe分子。BiTe可以具有DR5 VLVH – OKT3 VLVH的取向。BiTe的氨基酸序列顯示如下(SEQ ID NO:186 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:186 中，氨基酸殘基1-106對應於DR5 mAb 5的VL結構域(SEQ ID NO:70 )，殘基107-121是接頭GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:184 )，殘基122-240對應於DR5 mAb 5的VH結構域(SEQ ID NO:74 )，殘基241-245是接頭GGGGS (SEQ ID NO:187 )，殘基246-352對應於OKT3的VL結構域(SEQ ID NO:114 )，殘基 353-367是接頭GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:184 )和殘基368-560對應於OKT3的VH結構域(SEQ ID NO:115 )。

c. OKT3 x DR5 mAb 5 BiTE (OKT3 VHVL – DR5 VHVL)

可利用DR5 mAb 5的VL和VH結構域和OKT3的VL和VH結構域，以VH-VL取向構建第三抗-DR5 x 抗-CD3 BiTe分子。BiTe可以具有OKT3 VHVL – DR5 VHVL的取向。BiTe的氨基酸序列顯示如下(SEQ ID NO:188 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:188 中，氨基酸殘基1-192對應於OKT3的VH結構域(SEQ ID NO:115 )，殘基193-207是接頭GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:184 )，殘基208-314對應於OKT3的VL結構域EQ ID NO:114 )，殘基315-320是接頭SGGGGS (SEQ ID NO:185 )，殘基321-439對應於DR5 mAb 5的VH結構域(SEQ ID NO:73 )，殘基440-454是接頭GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:184 )和殘基455-560對應於DR5 mAb 5的VL結構域(SEQ ID NO:64 )。

d. OKT3 x DR5 mAb 5 BiTE (OKT3 VLVH- DR5 VLVH)

可利用DR5 mAb 5的VL和VH結構域和OKT3的VL和VH結構域，以VL-VH取向構建第四抗-DR5 x 抗-CD3 BiTe分子。BiTe可以具有OKT3 VLVH – DR5 VLVH的取向。BiTe的氨基酸序列顯示如下(SEQ ID NO:189 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:189 中，氨基酸殘基1-107對應於OKT3的VL結構域(SEQ ID NO:114 )，殘基108-122是接頭GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:184 )，殘基123-314對應於OKT3的VH結構域(SEQ ID NO:115 )，殘基315-319是接頭GGGGS (SEQ ID NO:187 )，殘基320-425對應於DR5 mAb 5的VL結構域(SEQ ID NO:70 )，殘基426-440是接頭GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:184 )，殘基441-560對應於DR5 mAb 5的VH結構域(SEQ ID NO:74 )。

B. DR5 x CD16 雙特異性雙抗體

為進一步示例根據本發明任一實施方式的雙特異性抗-DR5結合分子，可利用DR5 mAb 6和抗-CD16抗體的V結構域L和VH結構域構建由兩條多肽鏈組成的雙抗體。

雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:190 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:190 中，氨基酸殘基1-109對應於DR5 mAb 6的VL結構域(SEQ ID NO:78 )，殘基110-117對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基118-235對應於CD16抗體的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:117 )。

雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:191 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:191 中，氨基酸殘基1-111對應於CD16抗體的VL結構域(SEQ ID NO:116 )，殘基112-119對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基120-237對應於DR5 mAb 6的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:82 )。

C. DR5 x NKG2D 雙特異性雙抗體

為進一步示例根據本發明任一實施方式的雙特異性抗-DR5結合分子，可利用DR5 mAb 7和抗-NKG2D抗體的結構域VL和VH結構域構建由兩條多肽鏈組成的雙抗體。抗-NKG2D抗體結合天然殺傷組(Group) 2D (NKG2D)受體。NKG2D受體表達於所有人(和其他哺乳動物)天然殺傷細胞上(參見Bauer, S.等 (1999) “Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA ,” Science 285(5428)：727-729；Jamieson, A.M.等 (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1)：19-29)以及所有CD8⁺ T細胞上(Groh, V.等 (2001) “Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells ,” Nat. Immunol. 2(3)：255-260；和Jamieson, A.M.等 (2002) “The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing ,” Immunity 17(1)：19-29)。此雙抗體具有將NK細胞定位(通過使此NK細胞結合於雙抗體的NKG2D結合部分)於癌症細胞的位置(通過使此癌症細胞結合於雙抗體的DR5結合部分)的能力。然後，定位的NK細胞可在本文中稱為“重導向(redirected)”殺傷的過程仲介導癌症細胞的殺傷。替代利用雙抗體的NKG2D結合部分，可提供TCR (T細胞受體)結合部分，以便將T細胞定位(通過使此T細胞結合於雙抗體的TCR結合部分)於表達DR5的癌症細胞的位置和完成對癌症細胞的重導向殺傷。

雙抗體的第一多肽鏈的氨基酸序列可是(SEQ ID NO:192 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:192 中，氨基酸殘基1-104對應於DR5 mAb 7的VL結構域(SEQ ID NO:86 )，殘基105-112對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基113-233對應於抗-NKG2D抗體的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:137 )，殘基234-238對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基239-266對應於含有半胱氨酸的E-螺旋結構域 (SEQ ID NO:41 )。

雙抗體的第二多肽鏈的氨基酸序列可是(SEQ ID NO:193 ) (CDR_L 和CDR_H 殘基以底線顯示)：

在SEQ ID NO:193 中，氨基酸殘基1-110對應於抗-NKG2D抗體的VL結構域(SEQ ID NO:136 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-236對應於DR5 mAb 7的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:90 )，殘基237-241對應於ASTKG接頭(SEQ ID NO:47 )和殘基242-270對應於含有半胱氨酸的K-螺旋結構域 (SEQ ID NO:42 )。

儘管上述示例性的DR5-結合分子對於各結合結構域包括三個輕鏈(VL) CDR和三個重鏈(VH) CDR，但應此認識到在一些實施方式中，DR5-結合分子可具有：(1) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL結構域的CDR_L 中的至少一個；(2) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL結構域的CDR_L 中的至少兩個；(3) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL結構域的三個CDR_L ；(4) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VH結構域的CDR_H 中的至少一個；(5) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VH結構域的CDR_H 中的至少兩個；(6) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VH結構域的三個CDR_H ；(7) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL結構域的CDR_L 中的至少一個和抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VH結構域的CDR_H 中的至少一個；(8) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL結構域的CDR_L 中的至少兩個和抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VH結構域的CDR_H 中的至少兩個；(9) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL結構域的三個CDR_L 和抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VH結構域的三個CDR_H ；(10) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL結構域；(11) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VH結構域；(12)抗-人DR5抗體DR5 mAb 1的VL和VH結構域；(13) 或可與抗-人DR5抗體DR5 mAb 1競爭結合人DR5；或者(14) 與(1)-(13)中的任意競爭結合人DR5。

類似地，還將認識到，災一些實施方式中，DR5結合分子可具有：(15) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL結構域的CDR_L 中的至少一個；(16) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL結構域的CDR_L 中的至少兩個；(17) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL結構域的三個CDR_L ；(18) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VH結構域的CDR_H 中的至少一個；(19) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VH結構域的CDR_H 中的至少兩個；(20) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VH結構域的三個CDR_H ；(21) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL結構域的CDR_L 中的至少一個和抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VH結構域的CDR_H 中的至少一個；(22) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL結構域的CDR_L 中的至少兩個和抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VH結構域的CDR_H 中的至少兩個；(23) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL結構域的三個CDR_L 和抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VH結構域的三個CDR_H ；(24) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL結構域；(25) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VH結構域；(26) 抗-人DR5抗體DR5 mAb 2的VL和VH結構域；(27) 可與抗-人DR5抗體DR5 mAb 2競爭結合人DR5；或者(28) 可與(15)-(27)中的任意競爭結合人DR5。

VII. 生產方法

抗-DR5多肽和其他DR5激動劑、拮抗劑和調諧劑可由多核苷酸和/或DR5 mAb 1或DR5 mAb 2抗體的序列通過本領域中已知的方法產生，所述方法例如，合成或重組。產生此肽激動劑、拮抗劑和調諧劑的一種方法涉及化學合成多肽，然後在適於獲得天然構象的氧化條件下處理，也就是說，矯正二硫鍵鍵合。這可利用本領域技術人員悉知的方法完成(參見Kelley, R. F.等 (1990) 在以下中: GENETIC ENGINEERING PRINCIPLES AND METHODS, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19；Stewart, J.M等 (1984) SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, Pierce Chemical Co., Rockford, IL；和美國專利號4,105,603、3,972,859、3,842,067和3,862,925)。

根據本發明任一實施方式的多肽可以利用固相肽合成被常規製備(參見Merrifield, B. (1986) “Solid Phase Synthesis ,” Science 232(4748)：341-347；Houghten, R.A. (1985) “General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15)：5131-5135；和Ganesan, A. (2006) “Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century ,” Mini Rev. Med. Chem. 6(1)：3-10)。

仍然可選的，具有DR5 mAb 1或DR5 mAb 2的一個或多個CDR的完全人抗體或其與DR5 mAb 1或DR5 mAb 2競爭結合人DR5或其可溶性形式可以通過使用已經被工程化成表達特異性人免疫球蛋白的商售小鼠來獲得。被設計以產生更多期望的(例如，完全人抗體)或更強大的免疫應答的轉基因動物還可被用於產生人源化或人抗體。此技術的實例是XENOMOUSE™ (參見Abgenix, Inc., Fremont, CA)和HUMAB-MOUSE®和TC小鼠™ (兩者均來自Medarex, Inc., Princeton, NJ)。

可選地，抗體可以重組製備，並利用本領域中已知的任意方法表達。抗體可以如下重組製備：首先分離從宿主動物制得的抗體、獲得基因序列和利用基因序列在宿主細胞(例如，CHO細胞)中重組表達抗體。可以應用的另外的方法是在植物{(例如，煙草)或轉基因奶中表達抗體序列。用於在植物或奶中重組表達抗體的合適方法已經被公開(參見 Peeters等 (2001) “Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants ,” Vaccine 19:2756；Lonberg, N.等 (1995) “Human Antibodies From Transgenic Mice ,” Int. Rev. Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999) “Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies ,” J. Immunol方法s 231:147-157)。用於製備抗體衍生物例如人源化抗體、單鏈抗體等的合適方法在本領域中是已知的。可選地，抗體可以通過噬菌體展示技術被重組製備(參見美國專利號5,565,332、5,580,717、5,733,743和6,265,150；和Winter, G.等 (1994) “Making Antibodies By Phage Display Technology ,” Annu. Rev. Immunol. 12.433-455)。

感興趣的抗體或蛋白質可以通過Edman降解法進行測序，這是本領域技術人員熟知的。由質譜或Edman降解法產生的肽資訊可用於設計探針或引物，其被用於克隆感興趣的蛋白質。

[ 克隆感興趣的蛋白質的可選方法是通過利用純化的DR5或其部分“淘選”細胞，並且此細胞表達具有DR5 mAb 1或DR5 mAb 2的一個或多個CDR的或與DR5 mAb 1或DR5 mAb 2競爭結合人DR5的抗體或感興趣的蛋白質。“淘選”程式可以如下進行：從表達DR5的組織或細胞獲得cDNA庫、在第二細胞類型中過表達cDNA和在DR5 mAb 1或DR5 mAb 2存在或不存在時，篩選第二細胞類型的轉染的細胞用於特異性結合於DR5。用於通過“淘選”克隆編碼細胞表面蛋白的哺乳動物基因的方法的詳細描述可見於本領域(參見Aruffo, A.等 (1987) “Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577；和Stephan, J.等 (1999) “Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation ,” Endocrinol. 140:5841-5854)。

含有感興趣的多核苷酸的載體可通過一些適當手段中的任意手段被引入到宿主細胞中，所述適當手段包括電穿孔；氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質進行轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂轉染；和感染(例如，在載體是感染劑諸如痘苗病毒的情況下)。引入載體或多核苷酸的選擇將常常取決於宿主細胞的特徵。

能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞均可被使用，用於分離編碼抗體、多肽或感興趣的蛋白質的基因的目的。合適的哺乳動物宿主細胞的非的限制性實例包括但不限於COS、HeLa和CHO細胞。優選地，相比於宿主細胞中相應內源抗體或感興趣的蛋白質（如果存在），宿主細胞以約高5-倍，更優選高10-倍，甚至更優選高20-倍的水準表達cDNA。針對特異性結合於DR5篩選宿主細胞通過免疫分析或FACS完成。過表達抗體或感興趣的蛋白質的細胞可以被鑒別。

在一些實施方式中，本發明更涉及含有前述任一實施方式的抗體的氨基酸序列的多肽。此多肽可通過本領域中已知的方法製備。通過上述重組方法(即，單一或融合多肽)或通過化學合成，可經蛋白水解或抗體的其他降解產生多肽。抗體的多肽，尤其地，上至約50個氨基酸的較短的多肽，通過化學合成常規製備。化學合成方法在本領域中是已知的，並且是商業上可得到的。例如，抗-DR5多肽可通過應用固相法的自動多肽合成儀產生。

在一些實施方式中，本發明更涉及對如下分子的修飾：DR5 mAb 1或DR5 mAb 2抗體和結合DR5和此分子的激動劑、拮抗劑和調諧劑的其多肽片段，包括功能上等同的抗體和不明顯影響此分子的性質的融合多肽以及具有增強的或降低的活性的變異體。多肽的修飾在本領域中是常規操作，因而不需要在本文詳細描述。修飾的多肽的實例包括此多肽，其具有氨基酸殘基的保守取代、未明顯有害改變功能活性的氨基酸的一個或多個缺失或添加或使用化學類似物。可彼此保守取代的氨基酸殘基包括但不限於：甘氨酸/丙氨酸；絲氨酸/蘇氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬醯胺/穀氨醯胺；天冬氨酸/谷氨酸；賴氨酸/精氨酸；和苯基丙氨酸/酪氨酸。這些多肽還包括糖基化和非糖基化多肽以及具有其它翻譯後修飾的多肽，所述其它翻譯後修飾，諸如例如，用不同糖進行糖基化、乙醯化和磷酸化。優選地，氨基酸取代應該是保守的，即，取代的氨基酸會具有與原始氨基酸類似的化學性質。此保守取代在本領域中是已知的，並且已經在上文提供實例。氨基酸修飾範圍可從改變或修飾一個或多個氨基酸到區域諸如可變結構域的完全重新設計（redesign）。可變結構域中的變化可改變結合親和力和/或特異性。修飾的其它方法包括利用本領域中已知的偶合技術，包括,但不限於酶促手段、氧化取代和螯合。修飾可用於例如，連接免疫分析標記物諸如連接放射性部分用於放射免疫分析。修飾的多肽利用本領域中確定的方法製備，並且可利用本領域中已知的標準測定來篩選。

在一些實施方式中，一種融合蛋白，其包括一個或多個多肽或前述任一實施方式的DR5 mAb 1或DR5 mAb 2抗體。在一個實施方式中，融合多肽被提供，其包括輕鏈、重鏈、或輕鏈和重二者鏈。在另一個實施方式中，融合多肽包含異源免疫球蛋白固定區。在另一個實施方式中，融合多肽包含由公開保藏的雜交瘤產生的抗體的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。於此，抗體融合蛋白包含特異性結合DR5的一個或多個多肽結構域和另外的氨基酸序列，其在天然分子中不與此氨基酸序列連接，所述氨基酸序列例如，來自另外的區域的異源序列或同源序列。

VIII. DR5- 結合分子的用途

在一些實施方式中，一種組合物——包括藥物組合物，其包括前述任一實施方式的DR5-結合分子(例如，雙抗體，其包括來自抗-DR5抗體諸如DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的抗原-結合結構域或其人源化衍生物)、衍生自此分子的多肽、包括編碼此分子或多肽的序列的多核苷酸和本文描述的其他試劑。

如上面所討論的，通過TRAIL細胞因數啟動DR5導致腫瘤細胞的高度選擇性的識別和殺傷。根據本發明任一實施方式的DR5-結合分子具有充當激動劑的能力，模仿TRAIL，因此導致DR5的啟動。因此，單特異性抗體DR5 mAb 1和DR5 mAb 2、其人源化衍生物及其DR5-結合片段可以被用作TRAIL的替代物，以便促進表達DR5的腫瘤細胞死亡。由於DR5普遍分佈於腫瘤細胞系中，因此，根據本發明任一實施方式的單特異性DR5結合分子提供對癌症的一般療法。可以由此分子治療的癌包括由選自以下的細胞的癌症細胞的存在表徵的癌：腎上腺腫瘤、AIDS-有關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞腫瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦腫瘤、乳腺癌、頸動脈體腫瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、末梢神經鞘腫瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤、罕見的血液疾病、腎轉移性癌、杆狀腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。

尤其地，在一些實施方式中，單特異性DR5結合分子可用於治療結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤；肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌和直腸癌。

在一些實施方式中，雙特異性DR5結合分子增強通過DR5促進重導向殺傷表達此分子(例如，CD3、CD16、CD19、NKG2D等)的第二特異性的腫瘤細胞提供的癌療法。此結合DR5的分子尤其可用於治療急性髓樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)——包括CML的胚危象和與CML有關的艾貝爾遜癌基因(Bcr-ABL易位)、骨髓增生異常綜合征(MDS)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)——包括Richter綜合征或CLL的Richter轉化、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)——包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生病和伯基特淋巴瘤。

除了他們在療法中的有用性以外，根據本發明任一實施方式的結合DR5的分子可以被可檢測地標記，並用於診斷癌症或用於腫瘤和腫瘤細胞成像。

IX. 藥學組合物

在一些實施方式中，一種組合物包括原料藥組合物(bulk drug composition)，其可用於製備藥學組合物(例如，不純或非無菌組合物)和可用於製備單位劑型的藥學組合物(即，適於施用給受試者或患者的組合物)。此組合物包括預防有效量的或治療有效量的前述任一實施方式的DR5結合-分子或此藥劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，在一些實施方式中，此組合物包括預防有效量的或治療有效量的前述任一實施方式的DR5-結合分子和藥學上可接受的載體。在一些實施方式中，藥學組合物中的DR5結合分子是： DR5 mAb 1、DR5 mAb 2抗體、人源化DR5 mAb 1、人源化DR5 mAb 2抗體或任意這樣的抗體的DR5-結合片段或雙特異性DR5雙抗體(尤其地，DR5 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)。尤其地，在一些實施方式中，此DR5結合分子包括3個CDR_L 和DR5 mAb 1的3個CDR_H 或DR5 mAb 2的3個CDR_L 和3個CDR_H 。

在一些實施方式中，藥學組合物另外包括對特定癌抗原是特異性的第二治療抗體(例如，腫瘤特異性單克隆抗體)和藥學上可接受的載體。

在具體實施方式中，術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他通常獲得認可的藥典中，供用於動物，特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥學載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當靜脈內施用藥學組合物時，水是優選的載體。鹽水溶液和含水右旋糖以及甘油溶液也可以用作液體載體，特別是對於可注射溶液而言。合適的藥用賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉(dried skim milk)、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，組合物也可以含有小量濕潤劑或乳化劑或pH緩衝劑。這些組合物可以採用溶液、懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉劑、緩釋製劑等形式。

通常，根據本發明任一實施方式的組合物的成分被單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如作為標明活性劑的量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述密封容器如安瓿或小袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥學級水或鹽水的輸注瓶分配。如果通過注射施用所述組合物，則可以提供安瓿注射用無菌水或鹽水，以便可以在施用前混合所述成分。

在一些實施方式中，可以將前述的組合物配製為中性或鹽形式。藥學上可接受的鹽包括但不限於用陰離子形成的鹽以及用陽離子形成的鹽，所述陰離子例如來源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子，並且所述陽離子例如來自氫氧化納、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。

在一些實施方式中，一種藥學包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充以前述任一實施方式的DR5-結合分子(更優選地，DR5 mAb 1或DR5 mAb 2抗體、人源化DR5 mAb 1或人源化DR5 mAb 2抗體、(或任意這樣的抗體的DR5-結合片段)或其中DR5結合分子是雙特異性DR5雙抗體(尤其是DR5 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)。尤其地，包括的是此分子，單獨的或與藥學上可接受的載體一起，所述分子包括DR5 mAb 1的3個CDR_L 和3個CDR_H 或DR5 mAb 2的3個CDR_L 和3個CDR_H 。另外，用於治療疾病的一種或多種其他預防劑或治療劑也可以包括於所述藥學包裝或試劑盒中。在一些實施方式中，藥學包裝或試劑盒，其包含一個或多個容器，所述容器填充以前述任一實施方式的藥學組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器(一個或多個)關聯的可以是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的佈告(notice)，所述佈告反映了管理機構許可用於人類施用的製造、使用或銷售。

在一些實施方式中，可用於上述方法的試劑盒，其可包括根據本發明任一實施方式的DR5-結合分子。試劑盒可在一個或多個容器中進一步包括用於治療癌症的一種或多種其他預防劑和/或治療劑；和/或試劑盒可進一步包括結合與癌症相關的一個或多個癌抗原的一個或多個細胞毒性抗體。在某些實施方式中，其他預防劑或治療劑是化療劑。在其他實施方式中，預防劑或治療劑是生物或激素治療劑。

X. 施用方法

通過向受試者施用有效量的根據本發明任一實施方式的融合蛋白或綴合分子或包括根據本發明任一實施方式的融合蛋白或綴合分子的藥學組合物，可以提供根據本發明任一實施方式的組合物用來治療、預防和改善與疾病、病症或感染相關的一種或多種症狀。在優選的方面，這類組合物基本上是純的(即，基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子，如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。

各種遞送系統是已知的，並且可以用於施用根據本發明任一實施方式的組合物，例如封裝於脂質體、微粒、微膠囊、重組細胞中，重組細胞能表達抗體或融合蛋白、受體介導的內吞作用(參見Wu等(1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System ”J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。

施用根據本發明任一實施方式的分子的方法包括、但不限於腸胃外施用(例如皮內、肌肉、腹腔內、靜脈內以及皮下)、硬膜外以及粘膜(例如鼻內和口腔途徑)。在具體實施方式中，根據本發明任一實施方式的DR5-結合分子經肌肉、靜脈內或皮下施用。組合物可以通過任何方便途徑施用，例如通過輸注或彈丸注射、通過上皮或黏膜皮膚被覆(lining) (例如口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。給藥可以是全身的或局部的。另外，也可以應用肺給藥，例如通過使用吸入器或噴霧器，並且與霧化劑一起配製。參見美國專利號6,019,968、5,985, 320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913和5,290,540；和4,880,078；和PCT公開號WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其各自通過引用以其整體併入本文。

可使得根據本發明任一實施方式的DR5結合分子被包裝在密封容器中，比如指示分子的量的安瓿或小袋中。在一個實施方式中，此分子作為凍幹無菌粉或無水濃縮物提供於密封容器中，並且可以用例如水或鹽水重構至適當濃度用於施用於受試者。在一些實施方式中，DR5結合分子可作為凍幹無菌粉提供於密封容器中，其單位劑量為至少5 μg、更優選地至少10 μg、至少15 μg、至少25 μg、至少50 μg、至少100 μg、或至少200 μg。

在一些實施方式中，凍幹的DR5-結合分子應在它們的原容器中儲存在2和8℃之間，並且分子應在重構之後的12小時，優選地6小時，5小時，3小時，或1小時內施用。在可選的實施方式中，此分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密封容器中。優選地，當以液體形式提供時，此DR5-結合分子提供在密封容器中，其中分子存在的濃度為至少1 μg/ml，更優選地至少2.5 μg/ml，至少5 μg/ml，至少10 μg/ml，至少50 μg/ml，或至少100 μg/ml。

可通過標準臨床技術測定根據本發明任一實施方式的組合物有效治療、預防或改善與病症相關的一個或多個症狀的量。製劑中採用的精確劑量還將取決於施用的路徑和病況的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。

對於根據本發明任一實施方式包括的雙特異性單價DR5-結合雙抗體，其施用給患者的劑量優選通過接受受試者的體重(kg)確定。施用的劑量通常為至少約0.3 ng/kg/天至約0.9 ng/kg/天、至少約1 ng/kg/天至約3 ng/kg/天、至少約3 ng/kg/天至約9 ng/kg/天、至少約10 ng/kg/天至約30 ng/kg/天、至少約30 ng/kg/天至約90 ng/kg/天、至少約100 ng/kg/天至約300 ng/kg/天、至少約200 ng/kg/天至約600 ng/kg/天、至少約300 ng/kg/天至約900 ng/kg/天、至少約400 ng/kg/天至約800 ng/kg/天、至少約500 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天、至少約600 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天、至少約700 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天、至少約800 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天、至少約900 ng/kg/天至約1000 ng/kg/天或至少約1,000 ng/kg/天。計算的劑量將基於患者在基線處的體重施用。體重從基線或確定的穩定狀態( plateau)重量的顯著(≥ 10%)改變將提示重新計算劑量。

在另一個實施方式中，患者被施用此治療方案，其包括一個或多個劑量的這類預防有效量或治療有效量的前述任一實施方式的DR5-結合分子，其中治療方案在2天、3天、4天、5天、6天或7天內施用。在某些實施方式中，治療方案包括間歇施用預防有效量或治療有效量的前述任一實施方式的DR5-結合分子的劑量(例如，在給定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用劑量和不施用預防有效量或治療有效量的DR5-結合分子(尤其地，DR5 mAb 1、DR5 mAb 2抗體、人源化DR5 mAb 1、人源化DR5 mAb 2抗體或任意這樣的抗體的DR5-結合片段或雙特異性DR5雙抗體(尤其是DR5 x CD3雙特異性單價Fc雙抗體)。尤其包括 (在相同周的第5天、第6天和第7天)施用此分子，其包括DR5 mAb 1的3個CDR_L 和3個CDR_H 或DR5 mAb 2的3個CDR_L 和3個CDR_H )，在相同周的第5天、第6天和第7天)。通常，有1、2、3、4、5或更多個療程。各療程可以是相同的方案或不同方案。

在另一個實施方式中，施用的劑量在方案（一個或多個）的前四分之一、前一半、或前三分之二或四分之三內上升(例如，在四療程的第一、第二或協力廠商案內)，直到達到日預防有效量或治療有效量的DR5-結合分子。表 3 提供針對典型療程的上述不同給藥方案的5個實例。

表 3

在一些實施方式中，DR5-結合分子的施用劑量和頻率可通過更改比如，例如脂質化而增強分子的吸收和組織滲透來降低或改變。

在一些實施方式中，可計算施用至患者的DR5-結合分子的劑量，以用作單劑療法。可選地，分子可用於結合其他治療性組合物使用，並且施用至患者的劑量小於當所述分子作為單試劑療法使用時的劑量。

在一些實施方式中，藥學組合物可局部施用至需要治療的區域；這可通過例如，但不限於下述方式實現：局部注入、通過注射、或通過植入物的手段，所述植入物是多孔的、非多孔的或膠狀材料，包括膜，比如矽橡膠膜或纖維。優選地，當施用前述任一實施方式的分子時，必須注意使用不吸收此分子的材料。

在一些實施方式中，組合物可在泡狀體(vesicle)，尤其是脂質體中遞送(參見Langer (1990)“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)；Treat等, 在以下中：LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein和Fidler (eds.), Liss, New York, 353-365頁(1989)；Lopez-Berestein, ibid., 3 17-327頁)。

在一些實施方式中，可以在控釋或緩釋系統遞送前述任一實施方式的組合物。可以使用本領域技術人員已知的任何技術產生包括一個或多個根據本發明任一實施方式的DR5-結合分子(一種或多種)的緩釋製劑。參見美國專利號4,526,938；PCT公開物WO 91/05548；PCT公開物WO 96/20698；Ning等 (1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained ‑ Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179‑189, Song等 (1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long ‑ Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等 (1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等 (1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759‑760，其各通過引用以其整體併入本文。在一個實施方式中，泵可用於控釋系統(參見Langer，上文；Sefton, (1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240；Buchwald等 (1980)“Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,” Surgery 88:507-516；和Saudek等 (1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med. 321:574-579)。在另一個實施方式中，聚合材料可用於實現分子的控釋(參見MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer和Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen和Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Levy等 (1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science 228:190-192；During等 (1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356；Howard等 (1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg. 7(1)：105-112)；美國專利號5,679,377；美國專利號5,916,597；美國專利號5,912,015；美國專利號5,989,463；美國專利號5,128,326；PCT公開號WO 99/15154；和PCT公開號WO 99/20253)。緩釋製劑所用的聚合物的實例包括但不限於聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、丙交酯-乙交酯共聚物(PLGA)以及聚原酸酯(polyorthoeste)。控釋系統可接近治療靶標(例如，肺)佈置，因此僅僅需要全身劑量的一部分(參見Goodson, 在MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE中，上文，卷2, 115-138頁(1984))。根據Dunn等 (見U.S. 5,945,155)，使用可用作控釋移植物的聚合物組合物。此特定方法基於聚合物系統中生物活性材料原位控釋的治療效果。移植可通常發生於患者身體內需要治療的任何地方。可使用非聚合物持續遞送系統，由此受試者身體內的非聚合物移植物被用作藥物遞送系統。一旦移植到身體中，移植物的有機溶劑會從組合物中消散、分散或滲漏到周圍組織液中，並且非聚合物材料會逐漸凝結或沉澱，形成固體微孔基質(見U.S. 5,888,533)。

控釋系統在Langer (1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533)的綜述中有論述。可以使用本領域技術人員已知的任何技術來生產包含根據本發明任一實施方式的一種或多種治療劑的緩釋製劑。參見美國專利號4,526,938；國際公開號WO 91/05548和WO 96/20698；Ning等 (1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained ‑ Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179‑189, Song等 (1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long ‑ Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372‑397；Cleek等 (1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853‑854；和Lam等 (1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760，其各通過引用以其整體併入本文。

在組合物是編碼前述任一實施方式的DR5-結合分子的核酸的情況下，核酸可體內施用，以通過如下方式促進其編碼的DR5-結合分子的表達：通過將其構建為適當的核酸表達載體的一部分並且施用它從而其成為細胞內的，例如，通過使用逆轉錄病毒載體(參見美國專利號4,980,286)，或通過直接注射，或通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；生物彈道技術(Biolistic)，Dupont)，或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑塗覆，或通過與已知進入核的同源框樣肽一起施用(參見例如Joliot等 (1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868) 等。可選地，可以將核酸引入細胞內並通過同源重組整合到宿主細胞DNA中，以進行表達。

在一些實施方式中，用治療或預防有效量的DR5-結合分子治療受試者可包括單一治療或，優選地，可包括一系列治療。在優選的實施例中，用此雙抗體每週治療受試者一次持續約1至10周，優選地2至8周，更優選地約3至7周，和甚至更優選地約4、5或6周。在一些實施方式中，藥學組合物可一天施用一次、一天兩次或一天三次。可選地，藥學組合物可一周施用一次、一周兩次、每兩週一次、一個月一次、每六週一次、每兩個月一次、一年兩次或每年一次。應當認識到，用於治療的分子的有效劑量可以隨著具體療程增加或降低。

實施例：

已經一般性描述了根據本發明任一實施方式，通過參考下述實施例將更容易理解本發明，所述實施例通過示例的方式被提供而不旨在限制本發明，除非指出的。針對材料和方法二者的許多更改可以被實踐而不背離本公開的範圍，這對於本領域技術人員來說是明顯的。

A. 實施例 1 ：抗-人DR5單克隆抗體DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的表徵

兩個單克隆抗體由於能夠免疫特異性結合於人DR5而被分離，並被授予命名“DR5 mAb 1”和“DR5 mAb 2”。如上面所討論的，發現這些抗體的CDR不同。為了確定抗體是否結合至不同DR5表位，製備了人DR5-Fc融合蛋白，並將其塗覆至固定的表面。將DR5 mAb 1 (1 μg/mL)生物素化，並用對照IgG或用DR5 mAb 2 (10 μg/mL)孵育，並且，通過測量固定的生物素化抗體的量評估IgG或DR5 mAb 2抗體與DR5 mAb 1競爭結合(至人DR5-Fc融合蛋白)的能力。另外，評估IgG或DR5 mAb 1抗體與生物素化DR5 mAb 2競爭結合的能力。此實驗的結果顯示於表 4 中。

表 4

此實驗的結果表明，生物素化抗體能夠結合DR5蛋白質，即使在存在過量非生物素化抗體的情況下。因此，結果顯示DR5 mAb 1和DR5 mAb 2 結合於DR5的不同表位。

為了進一步表徵DR5 mAb 1和DR mAb 2抗體，評估其阻礙DR5和TRAIL配體之間結合的能力。因此，生物素化DR5 mAb 1、生物素化DR5 mAb 2或生物素化DR5-Fc融合物(各為2 μg/mL)分別用固定的DR5-Fc融合物(1 μg/mL)在緩衝液或組氨酸標記的TRAIL (20 μg/mL)存在下孵育。評估固定的生物素化抗體的量。此實驗的結果顯示於表 5 。

表 5

結果顯示，結合至固定的DR5-Fc的DR5 mAb 1或DR5 mAb 2的量不受到組氨酸標記的TRAIL的存在的影響，因此表明DR5 mAb 1和DR5 mAb 2均不阻礙DR5的TRAIL配體結合位點。另外，兩個抗體都不能結合組氨酸標記的TRAIL配體。

B. 實施例 2 ：抗 - 人 DR5 單克隆抗體 DR5 mAb 1 和 DR5 mAb 2 的物種特異性

為了評估抗-人DR5單克隆抗體DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的物種特異性，比較抗體結合人DR5的能力與其結合食蟹猴 (Macaca fascicularis ) DR5的能力。此實驗的結果顯示於圖 5 。結果顯示，兩種抗體都能夠結合食蟹猴DR5，但是，他們各顯示對人DR5較高的結合親和力。

利用Biacore分析研究結合動力學，如示於圖 6 。雙特異性DR5 x CD3雙抗體用His-標記的DR5孵育，並且通過Biacore分析測量結合動力學。應用的雙抗體為DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2 (圖 6 ，版圖 A 和 E )、DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 (圖 6 ，版圖 B 和 F )、DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2 (圖 6 ，版圖 C 和 G )和DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2 (圖 6 ，版圖 D 和 H )。圖 6 ，版圖 A-D 顯示人DR5的結果。圖 6 ，版圖 E-H 顯示食蟹猴DR5的結果。計算的ka、kd和KD示於表 6 。

表 6

結果顯示相對於參考抗體DR5 mAb 3和DR5 mAb 4，DR5 mAb 1和DR5 mAb 2顯示改變的結合動力學。

C. 實施例 3 ：抗 - 人 DR5 單克隆抗體 DR5 mAb 1 和 DR5 mAb 2 的腫瘤細胞特異性

研究抗-人DR5單克隆抗體DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的腫瘤細胞特異性。使正常組織與DR5 mAb 1或與同種型對照(5 μg/mL)接觸，並將染色的程度視覺化。如示於圖 7A ，版圖 A-L ，DR5 mAb 1和同種型對照均不能標記正常組織的細胞。相比之下，發現DR5 mAb 1強烈地標記結腸癌組織(圖 7B ，版圖 A )和肺癌組織(圖 7B ，版圖 B )的細胞。相比之下，同種型對照不能標記任一組織(圖 7B ，版圖 C-D) 。因此，示於圖 7A-7B 的結果表明DR5 mAb 1能夠特異性結合癌症細胞。

類似地，使正常組織接觸DR5 mAb 2 (5 μg/mL)，並將染色的程度視覺化。如示於圖 8A ，版圖 A-F ，DR5 mAb 2不能標記正常組織的細胞。相比之下，發現DR5 mAb 2強烈標記結腸癌組織(圖 8B ，版圖 A )和肺癌組織(圖 8B ，版圖 C )的細胞。相比之下，同種型對照不能標記任一組織(圖 8B ，版圖 B 和 D) 。因此，示於圖 8A-8B 的結果表明DR5 mAb 2能夠特異性結合癌症細胞。

D. 實施例 4 ： DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2 雙抗體的腫瘤細胞細胞毒性

通過在靶腫瘤細胞和外周血單核細胞(PBMC )存在下以效應物與靶細胞比為30:1或20:1孵育雙特異性DR5 x CD3雙抗體或對照雙抗體24小時，評估根據本發明任一實施方式的DR5-結合分子介導細胞毒性的能力。通過測量乳酸脫氫酶(LDH)通過受損細胞向介質的釋放，測量細胞毒性百分比。

對於此研究，雙抗體：DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2被用作雙特異性DR5 x CD3雙抗體。應用的對照雙抗體含有抗-螢光素抗體4-4-20的VL和VH結構域 (分別為SEQ ID NOs:138 和 139 )和CD3 mAb 2的VL和VH結構域(分別為SEQ ID NOs:102 和 108 )，並被命名為抗-螢光素x抗-CD3對照雙抗體“4-4-20 x CD3 mAb 2 ”。雙抗體由兩條多肽鏈組成。雙抗體的第一多肽鏈具有如下氨基酸序列(SEQ ID NO:194 ) (CDR以底線顯示)：

在SEQ ID NO:194 中，氨基酸殘基1-112對應於抗-螢光素抗體4-4-20的VL結構域 (SEQ ID NO:138 )，殘基113-120對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基121-245對應於CD3 mAb 2的VH結構域 (SEQ ID NO:108 )，殘基246-251是含有半胱氨酸的間隔肽(GGCGGG) (SEQ ID NO:34 )和殘基252-280對應於E-螺旋結構域 (SEQ ID NO:39 )。

雙抗體的第二多肽鏈具有如下氨基酸序列(SEQ ID NO:195 ) (CDR以底線顯示)：

在SEQ ID NO:195 中，氨基酸殘基1-110對應於CD3 mAb 2的VL結構域(SEQ ID NO:102 )，殘基111-118對應於間插間隔肽GGGSGGGG (接頭1) (SEQ ID NO:33 )，殘基119-236對應於抗-螢光素抗體4-4-20 的VH結構域(SEQ ID NO:139 )，殘基237-242是含有半胱氨酸的間隔肽(GGCGGG) (SEQ ID NO:34 )和殘基243-270對應於K-螺旋結構域 (SEQ ID NO:40 )。

此研究的結果顯示於圖 9A-9K 。應用的靶腫瘤細胞是：786O腎細胞腺癌細胞(圖 9A )、A498腎癌細胞(圖 9B )、AsPC1胰腺癌細胞(圖 9C )、LNCap雄激素敏感性人前列腺腺癌細胞(圖 9D )、SW48結直腸癌腺癌細胞(圖 9E )、A549腺癌人肺泡基底上皮細胞(圖 9F )、SKMES人肺癌症細胞(圖 9G )、DU145人前列腺癌症細胞(圖 9H )、A375人惡性黑素瘤細胞(圖 9I )、SKBR3人HER2-過表達乳腺癌細胞(圖 9J )和JIMT人乳腺癌細胞(圖 9K )。結果表明DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2雙抗體能夠介導對癌症細胞有效的細胞毒性攻擊。

E. 實施例 5 ： DR5 mAb 1 和 DR5 mAb 2 的預想不到的優勢

將根據本發明一實施方式的DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的DR5-結合分子介導細胞毒性的能力與參考抗-DR5抗體：DR5 mAb 3和DR5 mAb 4介導細胞毒性的能力進行比較。為了進行此比較，製備含有這些抗體的VL和VH結構域和CD3 mAb 2的VL和VH結構域的雙特異性DR5 x CD3雙抗體。製備的雙抗體為：DR5 mAb 1 x CD3 mAb 2；DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2；DR5 mAb 3 x CD3 mAb 2；和DR5 mAb 4 x CD3 mAb 2。

用這些雙抗體之一或用對照雙抗體(4-4-20 x CD3 mAb 2)在外周血單核細胞(PBMC )和靶腫瘤細胞存在下以效應物與靶細胞比為20:1孵育靶腫瘤細胞24小時。通過測量乳酸脫氫酶(LDH)通過受損細胞向介質的釋放測量細胞毒性百分比。

此研究的結果顯示於圖 10A-10F 。應用的靶腫瘤細胞為：A549腺癌人肺泡基底上皮細胞(圖 10A )、SKMES 人肺癌症細胞 (圖 10B )、DU145 人前列腺癌症細胞(圖 10C )、A375人惡性黑素瘤細胞(圖 10D )、SKBR人HER2-過表達乳腺癌細胞(圖 10E )和JIMT人乳腺癌細胞(圖 10F )。結果表明DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的VL和VH結構域在誘發細胞毒性方面比參考DR5 mAb顯著地和預想不到地更有效力。

F. 實施例 6 ： DR5 mAb 1 和 DR5 mAb 2 的雙重和同時結合

為了顯示根據本發明任一實施方式的DR5 x CD3雙抗體同時結合DR5和結合CD3的能力，將可溶性人DR5 (以組氨酸標記)塗覆至支撐物表面。然後用DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2雙抗體或其以下人源化衍生物中的一種孵育支撐物：hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2、hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2、hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2或hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2。然後，提供綴合生物素的CD3，並測量固定至支撐物的CD3的量。

此實驗的結果顯示於圖 11 。發現所有的雙抗體均能夠同時結合DR5和CD3。

G. 實施例 7 ： DR5 mAb 2 的人源化衍生物的細胞毒性

為了顯示根據本發明任一實施方式的人源化DR5 mAb 2 x CD3雙抗體介導細胞毒性的能力，用全T細胞和已經被工程化成表達螢光素酶(luc)報告基因的靶Colo206結直腸癌細胞(Colo205-Luc細胞)孵育DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2雙抗體或其以下人源化衍生物中的一種：hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2, hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2、hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2或hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2 (效應物與靶的比為10:1)。通過螢光素酶在細胞分解時的釋放所引起的發光的增加測量細胞毒性。

此研究的結果顯示於圖 12 。發現DR5 mAb 2 x CD3雙抗體均能夠介導結直腸癌細胞的細胞毒性。

本說明書提到的所有出版物和專利通過參考併入本文，如同好像具體和單獨指出每個單個出版物或專利申請通過參考以其整體併入的程度。儘管已經結合其具體實施方式描述了本發明，但是應當理解，其能夠被進一步更改並且本申請旨在覆蓋大體上根據本發明原理的本發明的任何變型、用途或改變，並且包括與本公開的偏離，只要在本發明所屬領域的已知或習慣實踐內並且如可應用至本文之前所闡釋的本質特徵。

VL‧‧‧結構域
VH‧‧‧結構域
CH1‧‧‧結構域
CH2‧‧‧結構域
CH3‧‧‧結構域
CH‧‧‧結構域
CL‧‧‧結構域
VL1‧‧‧結構域
VL2‧‧‧結構域
VH1‧‧‧結構域
VH2‧‧‧結構域
MFI‧‧‧平均螢光值
PBMC‧‧‧外周血單核細胞
LDH‧‧‧乳酸脫氫酶

[圖 1 ]提供由兩條多肽鏈組成的共價結合的雙抗體的示意圖，每條多肽鏈各具有異源二聚體促進結構域。利用相同的陰影顯示識別相同表位元的VL結構域和VH結構域。 [圖 2 ]提供由兩條多肽鏈組成的共價結合的雙抗體的示意圖，每條多肽鏈各具有CH2結構域和CH3結構域，以便相連的鏈形成包括天然產生的Fc區的所有或部分的Fc區。利用相同的陰影顯示識別相同表位元的VL結構域和VH結構域。 [圖 3A-3B ]提供示意圖，其顯示由兩對多肽鏈組成的四價雙抗體。所述對是不同的，因而產生雙特異性分子，其相對於兩個表位中的每一個是二價的，其中，一個是DR5的表位和另一個是存在於效應細胞表面上的分子的表位。各對中的一條多肽具有CH2結構域和CH3結構域，以便相連的鏈形成包括天然產生的Fc區的所有或部分的Fc區。利用相同的陰影顯示識別相同表位元的VL結構域和VH結構域。僅一對表位元(以相同陰影顯示)能夠結合於DR5。圖 3A ，顯示Ig雙抗體，其包含抗體CH結構域和CL結構域。圖 3B ，顯示Fc雙抗體，其包含E-螺旋(coil)和K-螺旋異源二聚體促進結構域。 [圖 4A 和 4B ]提供由三條多肽鏈組成的共價結合的雙抗體的示意圖。多肽鏈中的兩條具有CH2結構域和CH3結構域，以便相連的鏈形成包括Fc區的所有或部分的Fc區。利用相同的陰影顯示識別相同表位元的VL結構域和VH結構域。 [圖 5] 顯示抗-人DR5單克隆抗體DR5 mAb 1(monoclonal antibody 1)和DR5 mAb 2結合人DR5和結合食蟹猴(cynomolgus monkey)的DR5的能力。 [圖 6] 顯示通過Biacore分析測量結合動力學的結果，其中版圖 A-H 顯示mAb 1 (版圖 A 和 E )、DR5 mAb 2 (版圖 B 和 F )、DR5 mAb 3 (版圖 C 和 G )和DR5 mAb 4 (版圖 D 和 H )對人DR 5 (版圖 A-D )和對食蟹猴DR5 (版圖 E-H )的結合動力學。 [圖 7A-7B ]顯示DR5 mAb 1差別地結合於腫瘤細胞的能力。圖 7A 顯示正常結腸(版圖 A 和 G )、肝(版圖 B 和 H )、肺(版圖 C 和 I )、胰(版圖 D 和 J )、腎(版圖 E 和 K )和心(版圖 F 和 L )組織的組織學染色。圖 7A 、版圖 A-F 顯示用標記的DR5 mAb 1 (5 μg/mL) 孵育的組織的結果。圖 7A 、版圖 G-L 顯示用標記的同種型對照mAb (5 μg/mL)孵育的組織的結果。圖 7B 顯示腫瘤性結腸(版圖 A 和 C )和腫瘤性肺(版圖 B 和 D )的組織學染色。圖 7B 、版圖 A-B 顯示用標記的DR5 mAb 1 (5 μg/mL)孵育的組織的結果。圖 7B 、版圖 C-D 顯示用標記的同種型對照mAb (5 μg/mL)孵育的組織的結果。 [圖 8A-8B ]顯示DR5 mAb 2差別地結合於腫瘤細胞的能力。圖 8A 顯示用標記的DR5 mAb 2 (5 μg/mL)孵育的正常結腸(版圖 A )、腎(版圖 B )、肺(版圖 C )、心(版圖 D )、肝(版圖 E )和胰(版圖 F )組織的組織學染色。圖 8B 顯示腫瘤性結腸(版圖 A 和 B )和腫瘤性肺(版圖 C 和 D ) 的組織學染色。圖 8B 、版圖 A 和 C 顯示用標記的DR5 mAb 2 (5 μg/mL)孵育的組織的結果。圖 8B 、版圖 B 和 D 顯示用標記的同種型對照mAb (5 μg/mL)孵育的組織的結果。 [圖 9A-9K ]顯示DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2雙抗體介導786O腎細胞腺癌細胞(圖 9A )、A498腎癌細胞(圖 9B )、AsPC1胰腺癌細胞(圖 9C )、LNCap雄激素敏感性人前列腺腺癌細胞(圖 9D )、SW48結直腸癌腺癌細胞(圖 9E )、A549腺癌人肺泡基底上皮細胞(圖 9F )、SKMES人肺癌細胞(圖 9G )、DU145人前列腺癌細胞(圖 9H )、A375人惡性黑素瘤細胞(圖 9I )、SKBR3人HER2-過表達乳腺癌細胞(圖 9J )和JIMT人乳腺癌細胞(圖 9K ) 的細胞毒性的能力。此靶細胞以效應物與靶細胞比為20:1或30:1在外周血單核細胞(PBMC )的存在下被孵育24小時。靶細胞的細胞毒性百分比通過測量乳酸脫氫酶(LDH)通過受損細胞向介質的釋放來測定。 [圖 10A-10F ]顯示DR5 mAb 1和DR5 mAb 2的預想不到的優勢。優勢通過比較具有DR5 mAb 1、DR5 mAb 2、DR5 mAb 3或DR5 mAb 4的VL結構域和VH結構域的DR5 x CD3雙抗體介導腫瘤細胞的細胞毒性的能力來評估。應用的靶腫瘤細胞為：A549腺癌人肺泡基底上皮細胞(圖 10A )、SKMES 人肺癌細胞(圖 10B )、DU145人前列腺癌細胞(圖 10C )、A375人惡性黑素瘤細胞(圖 10D )和SKBR3人HER2-過表達乳腺癌細胞(圖 10E )和JIMT人乳腺癌細胞(圖 10F )。 [圖 11 ]顯示DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2雙抗體及其人源化衍生物：hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2、hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2、hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2或hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2同時結合於DR5和CD3的能力。 [圖 12 ]顯示DR5 mAb 2 x CD3 mAb 2雙抗體及其人源化衍生物：hDR5 mAb 2 (2.2) x CD3 mAb 2、hDR5 mAb 2 (2.3) x CD3 mAb 2、hDR5 mAb 2 (2.4) x CD3 mAb 2或hDR5 mAb 2 (2.5) x CD3 mAb 2介導Colo205結直腸癌細胞的細胞毒性的能力。

VL‧‧‧結構域

VH‧‧‧結構域

Claims

一種抗-人DR5-結合分子，包括：可變輕鏈結構域和可變重鏈結構域；其中，該可變輕鏈結構域包括CDR_L 1結構域、CDR_L 2結構域和CDR_L 3結構域，和該可變重鏈結構域包括CDR_H 1結構域、CDR_H 2結構域和CDR_H 3結構域；以及其中： (A) (1) 該CDR_L 1結構域、該CDR_L 2結構域和該CDR_L 3結構域是DR5 mAb 1的輕鏈CDR，並且分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:4 、 SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6 ；和 (2) 該CDR_H 1結構域、該CDR_H 2結構域和該CDR_H 3結構域是該DR5 mAb 1的重鏈CDR，並且分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:9 、 SEQ ID NO:10 和SEQ ID NO:11; 或 (B) (1) 該CDR_L 1結構域、該CDR_L 2結構域和該CDR_L 3結構域是DR5 mAb 2的輕鏈CDR，並且分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:14 、 SEQ ID NO:15 和SEQ ID NO:16 ；和 (2) 該CDR_H 1結構域、該CDR_H 2結構域和該CDR_H 3結構域是該DR5 mAb 2的重鏈CDR，並且分別具有氨基酸序列：SEQ ID NO:19 、 SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:21 。
如請求項1所述的抗-人DR5-結合分子，其中： (1) 該CDR_L 1結構域、該CDR_L 2結構域和該CDR_L 3結構域是該DR5 mAb 1的該輕鏈CDR，並且分別具有該些氨基酸序列：SEQ ID NO:4 、 SEQ ID NO:5 和SEQ ID NO:6 ；和 (2) 該CDR_H 1結構域、該CDR_H 2結構域和該CDR_H 3結構域是該DR5 mAb 1的該重鏈CDR，並且分別具有該些氨基酸序列：SEQ ID NO:9 、 SEQ ID NO:10 和SEQ ID NO:11 。
如請求項2所述的抗-人DR5-結合分子，其中該可變輕鏈結構域具有該氨基酸序列SEQ ID NO:3 。
如請求項2或3所述的抗-人DR5-結合分子，其中該可變重鏈結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:8 。
如請求項1所述的抗-人DR5-結合分子，其中： (1) 該CDR_L 1結構域、該CDR_L 2結構域和該CDR_L 3結構域是該DR5 mAb 2的該輕鏈CDR，並且分別具有該些氨基酸序列：SEQ ID NO:14 、 SEQ ID NO:15 和SEQ ID NO:16 ；和 (2) 該CDR_H 1結構域、該CDR_H 2結構域和該CDR_H 3結構域是該DR5 mAb 2的該重鏈CDR，並且，分別具有該些氨基酸序列：SEQ ID NO:19 、 SEQ ID NO:20 和SEQ ID NO:21 。
如請求項5所述的抗-人DR5-結合分子，其中該可變輕鏈結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:13 。
如請求項5或6所述的抗-人DR5-結合分子，其中該可變重鏈結構域具有氨基酸序列SEQ ID NO:18 。
如請求項1-7中之任一項所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子是抗體。
如請求項8所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子是嵌合抗體或人源化抗體。
如請求項8或9所述的抗-人DR5-結合分子，其中該抗體、該嵌合抗體或該人源化抗體包括變異Fc區，其包括一個或多個氨基酸修飾，該一個或多個氨基酸修飾改變該變異Fc區對FcγR的親和力。
如請求項10所述的抗-人DR5-結合分子，其中該一個或多個氨基酸修飾降低該變異Fc區對FcγRIIB的親和力。
如請求項10或11所述的抗-人DR5-結合分子，其中該一個或多個氨基酸修飾包括選自以下的至少一個氨基酸取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中的編號是Kabat中的EU索引的編號。
如請求項12所述的抗-人DR5-結合分子，其中該一個或多個氨基酸修飾包括： (A) 選自以下的至少一個取代：該F243L、該R292P、該Y300L、該V305I和該P396L； (B) 選自以下的至少兩個取代： (1) 該F243L和該P396L； (2) 該 F243L和該R292P；和 (3) 該 R292P和該V305I； (C) 選自以下的至少三個取代： (1) 該 F243L、該R292P和該Y300L； (2) 該F243L、該R292P和該V305I； (3) 該F243L、該R292P和該P396L；和 (4) 該R292P、該V305I和該P396L； (D) 選自以下的至少四個取代： (1) 該F243L、該R292P、該Y300L和該P396L；和 (2) 該F243L、該R292P、該V305I和該P396L；或 (E) 選自以下的至少五個取代： (1) 該F243L、該R292P、該Y300L、該V305I和該P396L；和 (2) 該L235V、該F243L、該R292P、該Y300L和該P396L。
一種抗-人DR5-結合分子，其是雙特異性結合分子，能夠同時結合人DR5和第二表位。
如請求項14所述的抗-人DR5-結合分子，其中該第二表位是存在於效應細胞表面上的分子的表位。
如請求項14所述的抗-人DR5-結合分子，其中該第二表位是CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32、CD64、TCR、BCR和NKG2D其中的一表位。
如請求項16所述的抗-人DR5-結合分子，其中該第二表位是該CD3的表位。
如請求項14-17中之任一項所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子是雙抗體，該雙抗體是包括兩條多肽鏈的共價結合的複合物。
如請求項18所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子是包括三條多肽鏈的共價結合的複合物。
如請求項16-18中之任一項所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子包括Fc區。
如請求項18-19中之任一項所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子包括白蛋白-結合結構域。
如請求項21所述的抗-人DR5-結合分子，其中該白蛋白-結合結構域是去免疫化的白蛋白-結合結構域。
如請求項18所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子結合該人DR5和人CD3。
如請求項23所述的抗-人DR5-結合分子，其中： (A) 該兩條多肽鏈中的第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:140 和該兩條多肽鏈中的第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:142 ； (B) 該兩條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:144 和該兩條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:146 ； (C) 該兩條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:148 和該兩條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:150 ； (D) 該兩條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:152 和該兩條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:154 ； (E) 該兩條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:156 和該兩條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:158 ； (F) 該兩條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:160 和該兩條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:162 ； (G) 該兩條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:164 和該兩條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:165 ；或 (H) 該兩條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:166 和該兩條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:167 。
如請求項19所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子結合該人DR5和人CD3，並且另外包括Fc區。
如請求項25所述的抗-人DR5-結合分子，其中： (A) 該三條多肽鏈中的第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:168 ；該三條多肽鏈中的第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:169 ；和該三條多肽鏈中的第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:170 ； (B) 該三條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:171 ；該三條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:172 ；和該三條多肽鏈中的該第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:173 ； (C) 該三條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:174 ；該三條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:175 ；和該三條多肽鏈中的該第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:176 ； (D) 該三條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:177 ；該三條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:178 ；和該三條多肽鏈中的該第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:179 ；或 (E) 該三條多肽鏈中的該第一多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:180 ；該三條多肽鏈中的該第二多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:181 ；和該三條多肽鏈中的該第三多肽鏈具有氨基酸序列SEQ ID NO:182 。
如請求項1-7中之任一項所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子是嵌合抗原受體，其包括該可變輕鏈結構域和該可變重鏈結構域和選自以下的細胞內結構域：41BB-CD3ζ、b2c-CD3ζ、CD28、CD28-4-1BB-CD3ζ、CD28-CD3ζ、CD28-FcεRIγ、CD28mut-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD28-OX40-CD3ζ、CD3ζ、CD4-CD3ζ、CD4-FcεRIγ、CD8-CD3ζ、FceRIγ、FcεRIγCAIX、調蛋白-CD3ζ、IL-13-CD3ζ或Ly49H-CD3ζ。
如請求項20或25所述的抗-人DR5-結合分子，其中該Fc區是變異Fc區，其包括一個或多個氨基酸修飾，該一個或多個氨基酸修飾改變該變異Fc區對FcγR的親和力。
如請求項20或25所述的抗-人DR5-結合分子，其中該一個或多個氨基酸修飾包括選自以下的至少一個氨基酸取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中的編號是Kabat中的EU索引的編號。
如請求項12所述的抗-人DR5-結合分子，其中該一個或多個氨基酸修飾包括： (A) 選自以下的至少一個取代：該F243L、該R292P、該Y300L、該V305I和該P396L； (B) 選自以下的至少兩個取代： (1) 該F243L和該P396L； (2) 該F243L和該R292P；和 (3) 該R292P和該V305I； (C) 選自以下的至少三個取代： (1) 該F243L、該R292P和該Y300L； (2) 該F243L、該R292P和該V305I； (3) 該F243L、該R292P和該P396L；和 (4) 該R292P、該V305I和該P396L； (D) 選自以下的至少四個取代： (1) 該F243L、該R292P、該Y300L和該P396L；和 (2) 該F243L、該R292P、該V305I和該P396L；或 (E) 選自以下的至少五個取代： (1) 該F243L、該R292P、該Y300L、該V305I和該P396L；和 (2) 該L235V、該F243L、該R292P、該Y300L和該P396L。
如請求項1-30中之任一項所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子被用於治療癌症。
如請求項1-30中之任一項所述的抗-人DR5-結合分子，其中該分子被可檢測地標記，並且被用於癌症的診斷或預後。
如請求項31或32所述的抗-人DR5-結合分子，其中該癌症通過癌症細胞的存在被表徵，該癌症細胞選自以下的細胞：腎上腺腫瘤、AIDS-有關的癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞腫瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦腫瘤、乳腺癌、頸動脈體腫瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、成纖維細胞性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、尤文氏腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、不完全性骨纖維生成、骨纖維發育不良、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養層疾病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、肝細胞癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤形成、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、末梢神經鞘腫瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤、罕見的血液疾病、腎轉移性癌、杆狀腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌和子宮癌。
如請求項31或32所述的抗-人DR5-結合分子，其中該癌症是結直腸癌、肝細胞癌、神經膠質瘤、腎癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤、膀胱癌、成神經細胞瘤；肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌或直腸癌。
如請求項31或32所述的抗-人DR5-結合分子，其中該癌症是急性髓樣白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性B成淋巴細胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅生物(BPDCN)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)——包括套細胞白血病(MCL)和小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、霍奇金淋巴瘤、系統性肥大細胞增生病或伯基特淋巴瘤。