[go: up one dir, main page]

TW201620932A - 抗－ｂ型流感病毒血球凝集素抗體及其使用方法 - Google Patents

抗－ｂ型流感病毒血球凝集素抗體及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201620932A
TW201620932A TW104109843A TW104109843A TW201620932A TW 201620932 A TW201620932 A TW 201620932A TW 104109843 A TW104109843 A TW 104109843A TW 104109843 A TW104109843 A TW 104109843A TW 201620932 A TW201620932 A TW 201620932A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
amino acid
antibody
acid sequence
hvr
seq
Prior art date
Application number
TW104109843A
Other languages
English (en)
Inventor
李 史旺
許民
馬西地 巴拉茲
柴寧
南西 江
亨利 邱
宗華 林
傑芮Ｒ 娜卡慕拉
朴玄朱
Original Assignee
建南德克公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 建南德克公司 filed Critical 建南德克公司
Publication of TW201620932A publication Critical patent/TW201620932A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39583—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials not provided for elsewhere, e.g. haptens, coenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本發明提供抗-B型流感病毒血球凝集素抗體、包含抗-B型流感病毒血球凝集素抗體之組合物及其使用方法。

Description

抗-B型流感病毒血球凝集素抗體及其使用方法 相關申請案
本申請案主張於2014年3月27日提出申請之美國臨時申請案第61/971,123號之權益，其全部內容以引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有以ASCII格式電子提交之序列表且其全部內容以引用方式併入本文中。該ASCII拷貝在2014年3月18日創建，命名為P05794R1-WO_SL.txt且大小為96,612個位元組。
本發明提供抗-B型流感病毒血球凝集素抗體、包含抗-B型流感病毒血球凝集素抗體之組合物及其使用方法。
流感病毒感染每年在世界範圍內引起介於300萬例與500萬例之間之嚴重疾病及介於250,000與500,000之間之死亡。僅在美國，每年5%至20%之群體受流感病毒感染，其中大多數該等感染係由A型流感病毒引起。(例如，參見Dushoff等人，(2006)Am J Epidemiology 163：181-187；Thompson等人，(2004)JAMA 292：1333-1340；Thompson等人，(2003)JAMA 289：179-186)。然而，僅在美國，B型流感病毒感染每年佔約10,000-100,000個住院流感病例，此展示高的年與年之間可變性(所有住院流感病毒病例之1%-40%係B型流感病毒 感染，平均值為17%)。(參見Zhou等人(2012)Clin Inf Dis 54：1427-1436)。與流感病毒感染相關之對健康照護成本及喪失生產力之負荷係廣泛的。住院及死亡主要發生於高風險群組，例如老年人、兒童及臨床患病者。
神經胺酸酶抑制劑批准用於門診患者治療及預防A型及B型流感病毒感染。奧塞米韋(oseltamivir)(Tamiflu®)係A型及B型流感病毒感染之廣泛使用之預防性及早期治療性治療選項。(例如，參見Kandel及Hartshorn(2001)BioDrugs：Clinical Immunotherapy,Biopharmaceuticals and Gene Therapy 15：303-323；Nicholson等人，(2000)Lancet 355：1845-1850；Treanor等人，(2000)JAMA 283：1016-1024；及Welliver等人，(2001)JAMA 285：748-754)。然而，奧塞米韋治療必須在症狀發作之48小時內開始以提供顯著臨床益處。(例如，參見Aoki等人(2003)J Antimicrobial Chemotherapy 51：123-129)。此不便性損害奧塞米韋治療嚴重疾病患者之能力，該等患者在尋求治療時通常超出最佳48小時治療窗。另外，奧塞米韋在治療B型流感病毒感染時與治療A型流感病毒感染相比較不有效，此可能部分係由於其對B型流感神經胺酸酶之IC50值係對A型流感神經胺酸酶之IC50值之10倍。因此，最近特別關注鑑別B型流感病毒治療劑以治療住院B型流感病毒感染患者。
在1988-1989年期間，自祖先B型流感病毒譜系出現B型流感病毒之兩種高度不同之抗原性變體。該等病毒與B型流感病毒B/維多利亞(Victoria)/2/87或B/山形(Yamagata)/16/88在抗原上有關。(例如，參見Rota等人(1990)Virology 175：59-68)。因此，期望研發B型流感病毒感染之療法，其有效抵抗B型流感病毒之祖先、維多利亞及山形譜系。
最近報導已闡述結合血球凝集素並中和B型流感病毒之單株抗體 (mAb)。(參見Kubota-Koketsu等人(2009)Biochem Biophys Res Comm 387：180-185；Yasugi等人(2013)PLOS Pathogens 9：e1003150,1-12；Dreyfus等人(2012)Science Express 337：1343-1348；國際申請公開案第WO 2013/007770號、第WO 2013/132007號、第WO 2013/114885號、第WO 2010/073647號及美國申請公開案第US 2009/0092620號、第US 2011/0319600號及第US 2011/0319660號)。
儘管該等報導，但業內仍需要有效抵抗寬範圍之B型流感病毒菌株之新穎B型流感病毒療法，包括有效治療或預防祖先、山形及維多利亞譜系之B型流感病毒感染之B型流感病毒療法。本發明滿足此需要且提供治療及預防B型流感病毒感染之其他益處。
本發明提供抗-B型流感病毒血球凝集素抗體(即，抗血球凝集素抗體、抗-B型流感病毒抗體)、包含抗-B型流感病毒血球凝集素抗體之組合物及其使用方法。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)及三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：64及65組成之群之胺基酸序列；(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：75；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個、三個、四個、五個及/或六個超變區(HVR)序 列，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：64及65組成之群之胺基酸序列；(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：75；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及LVR-L3)，其中：(a)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(b)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(c)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：64及65組成之群之胺基酸序列；且(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：75。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個及/或三個輕鏈超變區(HVR)序列，其中：(a)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(b)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(c)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個及/或三個重鏈超變區(HVR)序列，其中： (a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：64及65組成之群之胺基酸序列；且(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：75。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：79及83組成之群之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：78、82及86組成之群之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含選自由SEQ ID NO：78、82及86組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含選自由SEQ ID NO：79及83組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含選自由SEQ ID NO：81、85及88組成之群之胺基酸序列，且輕鏈包含選自由SEQ ID NO：80、84及87組成之群之胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含選自由SEQ ID NO：80、84及87組成之群之胺基酸序列的輕鏈。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含選自由SEQ ID NO：81、85及88組成之群之胺基酸序列的重鏈。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)及三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：62；(b)HVR-H2包含胺基酸序列SEQ ID NO：66； (c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：76；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個、三個、四個、五個及/或六個超變區(HVR)序列，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：62；(b)HVR-H2包含胺基酸序列SEQ ID NO：66；(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：76；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及LVR-L3)，其中：(a)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(b)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(c)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：62；(b)HVR-H2包含胺基酸序列SEQ ID NO：66；且(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：76。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個及/或三個輕鏈超變區(HVR)序列，其中：(a)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55； (b)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(c)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個及/或三個重鏈超變區(HVR)序列，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：62；(b)HVR-H2包含胺基酸序列SEQ ID NO：66；且(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：76。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO：89，且輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO：78。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：78之輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：89之重鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：90且輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：80。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：80之輕鏈。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：90之重鏈。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)及三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、 73及74組成之群之胺基酸序列；(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個、三個、四個、五個及/或六個超變區(HVR)序列，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73及74組成之群之胺基酸序列；(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及LVR-L3)，其中：(a)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(b)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；且(c)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73及74組成之群之胺基酸序列；且(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個及/或三個輕鏈超變區(HVR)序列，其中：(a)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(b)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；且(c)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一些實施例中，本發明提供經分離之抗血球凝集素抗體，其包含：至少一個、兩個及/或三個重鏈超變區(HVR)序列，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73及74組成之群之胺基酸序列；且(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：92、95、97、99、101、103、105及107組成之群之胺基酸序列，且輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO：91。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含選自由SEQ ID NO：92、95、97、99、101、103、105及107組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含重鏈及輕鏈，其中重鏈包含選自由SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、106及108組成之群之胺基酸序列，且輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：93。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體包含包含選自由SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、106及108組成之群之胺基酸序列的重鏈。
在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體係單株抗體。在一些實施例中，本發明之經分離之抗血球凝集素抗體特異性結合B型流感病毒血球凝集素。在一些實施例中，經分離之抗血球凝集素抗體係特異性結合B型流感病毒血球凝集素之經分離之抗血球凝集素單株抗體。
本發明亦提供編碼本發明之抗血球凝集素抗體之經分離之核酸。本發明亦提供包含編碼本發明之抗血球凝集素抗體之核酸的載體。本發明亦提供包含本發明之核酸或載體之宿主細胞。載體可具有任何類型，例如，重組載體，例如表現載體。可使用多種宿主細胞中之任一者。在一個實施例中，宿主細胞係原核細胞，例如大腸桿菌(E.coli)。在另一實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如，哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
本發明進一步提供產生本發明之抗血球凝集素抗體之方法。舉例而言，本發明提供製備抗血球凝集素抗體(如本文中所定義，其包括全長抗體及其片段)之方法，該方法包含使編碼抗血球凝集素抗體或其片段之本發明之重組載體在適宜宿主細胞中表現，以使產生抗體或其片段。在一些實施例中，該方法包含培養包含編碼本發明之抗血球凝集素抗體(或其片段)之核酸的宿主細胞，以使核酸表現。該方法可進一步包含自宿主細胞培養物或宿主細胞培養基回收抗血球凝集素抗體或其片段。
本發明亦提供包含本發明之抗血球凝集素抗體及醫藥上可接受之載劑之醫藥調配物。醫藥調配物可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋(zanamivir)；另一抗 體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
本發明亦提供包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物。組合物可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋；另一抗體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
本發明亦提供包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物，其用於預防B型流感病毒感染。在一些實施例中，本發明提供包含本發明之抗血球凝集素抗體之醫藥組合物，其用於預防B型流感病毒感染。本發明進一步提供包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物，其用於治療B型流感病毒感染。在一些實施例中，本發明提供包含本發明之抗血球凝集素抗體之醫藥組合物，其用於治療B型流感病毒感染。本發明進一步提供包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物，其用於抑制B型流感病毒感染。在一些實施例中，本發明提供包含本發明之抗血球凝集素抗體之醫藥組合物，其用於抑制B型流感病毒感染。
包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物亦可用於製造藥劑。該藥劑可用於抑制、治療或預防B型流感病毒感染。在某些實施例中，該藥劑可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋；另一抗體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
本發明亦提供抑制B型流感病毒感染之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物，藉此抑制B型流感病毒感染。本發明亦提供治療B型流感病毒感染之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物，藉此治療B型流感病毒感染。本發明亦提供預防B型流感病毒感染之方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物，藉此預防B型流感病毒感 染。
本發明亦提供抑制、治療或預防B型流感病毒感染之方法，該方法包含向有需要之患者投與有效量之包含本發明之抗血球凝集素抗體之組合物，及向該患者投與有效量之額外治療劑，藉此抑制、治療或預防B型流感病毒感染。在一些實施例中，額外治療劑係神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋。在其他實施例中，額外治療劑係另一抗血球凝集素抗體。在其他實施例中，額外治療劑係抗M2抗體。在該等組合治療之各個態樣中，治療劑係大約同時投與，一起投與，或依序或連續投與。在特定實施例中，抗神經胺酸酶抑制劑係在投與本發明之抗血球凝集素抗體之前投與。在一些實施例中，本發明之抗-B型流感病毒血球凝集素抗體有效中和、抑制、治療或預防不同譜系(包括祖先、山形及維多利亞譜系)之B型流感病毒菌株之B型流感病毒感染。
在另一態樣中，本發明提供本發明之抗-血球凝集素抗體在製造藥劑中之用途。該藥劑可用於抑制、治療或預防B型流感病毒感染。在某些實施例中，該藥劑可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋；另一抗體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
在另一態樣中，本發明提供本發明之核酸在製造藥劑中之用途。該藥劑可用於抑制、治療或預防B型流感病毒感染。在某些實施例中，該藥劑可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋；另一抗體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
在另一態樣中，本發明提供本發明之表現載體在製造藥劑中之用途。該藥劑可用於抑制、治療或預防B型流感病毒感染。在某些實施例中，該藥劑可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制 劑，例如奧塞米韋或紮那米韋；另一抗體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
在另一態樣中，本發明提供本發明之宿主細胞在製造藥劑中之用途。該藥劑可用於抑制、治療或預防B型流感病毒感染。在某些實施例中，該藥劑可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋；另一抗體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
在另一態樣中，本發明提供本發明之製品在製造藥劑中之用途。該藥劑可用於抑制、治療或預防B型流感病毒感染。在某些實施例中，該藥劑可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋；另一抗體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
在另一態樣中，本發明提供本發明之套組在製造藥劑中之用途。該藥劑可用於抑制、治療或預防B型流感病毒感染。在某些實施例中，該藥劑可進一步包含額外治療劑(例如，神經胺酸酶抑制劑，例如奧塞米韋或紮那米韋；另一抗體，例如另一抗血球凝集素抗體或抗M2抗體；等)。
在各個態樣中，本發明之抗血球凝集素抗體結合B型流感病毒之血球凝集素。在其他態樣中，本發明之抗血球凝集素抗體結合血球凝集素並中和B型流感病毒。在一些實施例中，本發明之抗血球凝集素抗體在活體外、活體內或活體外及活體內中和B型流感病毒。
圖1A及1B分別闡述顯示各種B型流感病毒分離物由單株抗體34B5A及單株抗體33F8活體外中和之數據。
圖2闡述顯示各種B型流感病毒分離物由單株抗體46B8A活體外中和之數據。
圖3闡述顯示單株抗體34B5C及單株抗體46B8C對血球凝集抑制之效應的數據。
圖4闡述顯示藉由活體外血小板抑制分析之各種B型流感病毒分離物由單株抗體46B8C中和的數據。
圖5闡述顯示單株抗體34B5C及單株抗體46B8C對血球凝集素介導之細胞-細胞融合之效應的數據。
圖6A及6B闡述顯示感染B型流感病毒B/維多利亞/2000並投與不同量之單株抗體34B5A之小鼠(圖6A)與投與奧塞米韋(Tamiflu)之小鼠(圖6B)之存活%相比的數據。
圖7A及7B分別闡述顯示感染B型流感病毒B/威斯康辛(Wisconsin)/2000並在感染後48小時或感染後72小時投與不同量之單株抗體34B5C之小鼠之存活%的數據。
圖8A、8B、8C及8D分別闡述顯示感染B型流感病毒B/威斯康辛/2010、B/維多利亞/2000、B/俄國(Russia)/1969及B/馬薩諸塞(Massachusetts)/1966並在感染後24小時、48小時或72小時投與單株抗體46B8C製小鼠之存活%的數據。
圖9A及9B闡述顯示分別感染B型流感病毒B/威斯康辛/2010及B/維多利亞/2000並在感染後72小時投與不同量之單株抗體46B8C之小鼠之存活%的數據。
圖10A及10B闡述顯示感染B型流感病毒B/維多利亞/2000並投與單株抗體46B8C或奧塞米韋(Tamiflu)之小鼠之分別存活%及體重(BW)變化%的數據。
圖11A及11B分別闡述顯示在小鼠中僅投與單株抗體46B8C及奧塞米韋(Tamiflu)或組合對存活%及病毒肺效價之效應的數據。
圖12A及12B闡述顯示共投與單株抗體46B8C及奧塞米韋(Tamiflu)之效應的數據。
圖13闡述本發明之抗-B型流感病毒抗體之輕鏈及重鏈超變區的胺基酸序列。
圖14闡述mAb 34B5A之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖15闡述mAb 34B5B之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖16闡述mAb 34B5C之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖17闡述mAb 33F8之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖18闡述mAb 46B8A之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖19闡述mAb 46B8B之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖20闡述mAb 46B8C之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖21闡述mAb 46B8D之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖22闡述mAb 46B8E之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖23闡述mAb 46B8F之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖24闡述mAb 46B8G之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖25闡述mAb 46B8H之輕鏈可變區、重鏈可變區、輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
圖26A及26B分別闡述顯示感染B型流感病毒B/布里斯班(Brisbane)/2008並投與單株抗體46B8C之小鼠之存活%及體重(BW)變化%的數據。
I. 定義
出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)之間之非共價相互作用之總強度。除非另有說明，否則本文所用「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對之成員(例如，抗體及抗原)之間之1：1相互作用。分子X對於其配偶體Y之親和力通常可表示為解離常數(Kd)。可藉由業內已知之常用方法(包括彼等本文所述者)來量測親和力。用於量測結合親和力之具體說明性及實例性實施例闡述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指相較於不具有改變之親代抗體在一或多個超變區(HVR)中具有一或多個改變的抗體，此等改變使得可改良抗體對抗原之親和力。
術語「抗血球凝集素抗體」及「結合之血球凝集素之抗體」係指以足夠親和力結合血球凝集素之抗體，使得抗體可作為診斷劑及/或治療劑用於靶向血球凝集素，包括靶向流感病毒之血球凝集素。在 一個實施例中，抗血球凝集素抗體與無關非血球凝集素蛋白結合之程度低於該抗體與血球凝集素結合之約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合血球凝集素之抗體之解離常數(Kd)係1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如，10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗血球凝集素抗體結合至B型流感病毒之血球凝集素之表位，該表位在來自B型流感病毒之不同菌株、亞型及分離物之血球凝集素(例如祖先、維多利亞或山形譜系之B型流感病毒之血球凝集素)間保守。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展示期望抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段亦係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結合血球凝集素並中和A型流感病毒之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、雙價抗體、直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)及自抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合至相同表位之抗體」(作為參考抗體)係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高的抗體，且反之，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高。實例性競爭分析提供於本文中。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同源或物種的抗體。
抗體之「種類」係指重鏈所擁有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之 若干種可進一步分成子類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於免疫球蛋白之不同種類之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文所用術語「細胞毒性劑」係指抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲蝶呤(methotrexate)、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如來自細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應子功能」係指彼等可歸因於抗體之Fc區之生物學活性者，其可隨抗體同種型而有所變化。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如，醫藥調配物)之「有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C-末端區。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非在本文中另外指出，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根 據亦稱為EU索引之EU編號系統，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有實質上與原始抗體結構類似之結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「經轉化細胞」，其包括原代經轉化細胞及源自其之子代(與傳代次數無關)。子代之核酸含量可與親代細胞並不完全相同，而是可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於原始經轉化細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。
「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列的抗體：其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共有框架」係表示在選擇人類免疫球蛋白VL或VH框架序列中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列係來自可變結構域序列之亞組。通常，序列之亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在一個實施例中，對於VL而言，亞組係如Kabat等人所述之亞組κ I(見上文)。在 一個實施例中，對於VH而言，該亞組係如Kabat等人所述之III亞組(見上文)。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDR)對應於非人類抗體之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。「人類化形式」之抗體(例如，非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。
本文所用術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域中序列(「互補決定區」或「CDR」)超變及/或形成結構明確之環(「超變環」)及/或含有抗原接觸殘基(「抗原觸點」)之區中的每一者。通常，抗體包含6個HVR；3個在VH中(H1、H2、H3)，且3個在VL中(L1、L2、L3)。本文中之實例性HVR包括： (a)出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處之超變環(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))； (b)出現於胺基酸殘基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)處之CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))； (c)出現於胺基酸殘基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)及93-101(H3)處之抗原觸點(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；及 (d)(a)、(b)及/或(c)之組合，包括HVR胺基酸殘基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49- 65(H2)、93-102(H3)及94-102(H3)。
除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據Kabat等人所述編號(見上文)。
「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。
「個體」(individual或subject)係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴子)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體(individual或subject)係人類。
「經分離」抗體係已與其天然環境中之組份分離者。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。關於評定抗體純度之方法之綜述，例如，參見Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「經分離」核酸係指已與其天然環境中之組份分離之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置。
「編碼抗血球凝集素抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括單一載體或單獨載體中之該(等)核酸分子及存在於宿主細胞中一或多個位置處之該(等)核酸分子。
本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群體獲得之抗體，亦即，包含該群體之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，此等變體通常以較小量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位) 之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵在於得自實質上同源之抗體群體，且不應視為需要藉由任一特定方法產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法及利用含有所有或部分之人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。
「裸抗體」係指不與異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記偶聯之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異四聚體糖蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N末端至C末端，每一重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重結構域或重鏈可變結構域，隨後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，每一輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕結構域或輕鏈可變結構域，隨後為恆定輕(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈分配為兩種類型中之一者，稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。
術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於該治療產品之使用之警告的資訊。
就參考多肽序列而言，「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達到最大序列一致性百分比後候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來 達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何算法。然而，出於本文目的，使用序列對比電腦程式ALIGN-2來生成胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列對比電腦程式係由Genentech公司設計，且源代碼與使用者文件已一起編入美國版權局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.,20559中，其中其以美國版權註冊號TXU510087註冊。ALIGN-2程式可自Genentech公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自源代碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)中。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不改變。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下：
100×分數X/Y
其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係根據前面緊接段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其所呈現形式允許其中所含活性成份之生物活性有效，且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受毒性的額外組份。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個 體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
除非另外指示，否則本文所用術語「血球凝集素」係指來自任何流感病毒來源之任何天然血球凝集素。該術語涵蓋「全長」未處理血球凝集素以及自處理流感病毒或流感病毒感染細胞產生之任何形式之血球凝集素。該術語亦涵蓋血球凝集素之天然變體，例如，剪接變體或對偶基因變體。來自各種B型流感病毒菌株或譜系之實例性血球凝集素蛋白之胺基酸序列可在業內易於獲得。
如本文所用「治療」(及其語法變體，例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程之臨床介入，且可實施用於預防或在臨床病程期間實施。治療之期望效應包括(但不限於)防止疾病發生或復發(例如，防止B型流感病毒感染發生或復發)、減輕(reduction)(例如，減輕(reducing))或緩和症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理學後果、降低疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，使用本發明抗體來延遲疾病發生或減緩疾病進展。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與使抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有相似結構，其中各結構域包含4個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。(例如，參見Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分離以分別篩選互補VL或VH結構域文庫。例如，參見Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
本文所用術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核 酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體，以及納入引入其之宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠引導與其可操作連接之核酸的表現。此等載體在本文中稱作「表現載體」。
II. 組合物及方法
在一個態樣中，本發明部分係基於抗血球凝集素抗體及其用途。在某些實施例中，提供結合血球凝集素之抗體。本發明抗體可(例如)用於診斷、治療或預防A型流感病毒感染。
A. 實例性抗血球凝集素抗體
在一個態樣中，本發明提供結合血球凝集素之經分離抗體。在某些實施例中，本發明之抗血球凝集素抗體結合血球凝集素，結合來自B型流感病毒之血球凝集素，結合來自B型流感病毒之山形譜系之血球凝集素，結合來自B型流感病毒之維多利亞譜系之血球凝集素，結合來自B型流感病毒之祖先譜系之血球凝集素，或結合來自B型流感病毒之山形譜系、維多利亞譜系及祖先譜系之血球凝集素。在其他實施例中，本發明之抗血球凝集素抗體在活體外中和B型流感病毒。在其他實施例中，本發明之抗血球凝集素抗體在活體內中和B型流感病毒。在其他實施例中，本發明之抗血球凝集素抗體減輕B型流感病毒感染，預防B型流感病毒感染，抑制B型流感病毒感染，或治療B型流感病毒感染。在一些實施例中，本發明之抗血球凝集素抗體預防、抑制或降低流感病毒膜與感染細胞內體膜之間之血球凝集素介導之融合(由此預防、抑制或降低病毒RNA進入感染細胞細胞質中，由此預防、抑制或降低流感病毒感染進一步傳播)。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：64；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：75；(d) HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：65；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：75；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：64；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：75。
在另一態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：65；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：75。
在另一態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：64；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：75；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2，其包含胺基酸 序列SEQ ID NO：57；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：65；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：75；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：79及83組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：78、82及86組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：79及83組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區及包含選自由SEQ ID NO：78、82及86組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：79之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：78之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：83之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：82之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：83之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：86之輕鏈可變區的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：81、85及88組成之群之胺基酸序列之重鏈的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：80、84及87組成之群之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：81、85及88組成之群之胺基酸序列之重鏈及包含選自由SEQ ID NO：80、84及87組成之群之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：81之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：80之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：85之重鏈及包含選自由SEQ ID NO：84組成之群之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：88之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：87之輕鏈的抗體。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：62；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：66；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：76；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在另一態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：62；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：66；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：76。
在另一態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；及 (c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：62；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：66；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：76；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
在另一態樣中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：89之重鏈可變區的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：78之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：89之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：78之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：90之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：80之輕鏈的抗體。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73及74組成之群之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：67；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：68；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：69；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：70；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1 個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：71；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：72；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：73；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體，其包含至少1個、2個、3個、4個、5個或6個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：74；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：67；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：68；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：69；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：70；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：71；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三 個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：73；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在一個態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：74；及(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
在另一態樣中，本發明提供包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之抗體：(a)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(b)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(c)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：67；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：68；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：69；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR- L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：70；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：71；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：72；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：73；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77。
(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：60之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：74；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；及(f)HVR-L3，其包含選自SEQ ID NO：60之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：92、95、97、99、101、103、105及107組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：92、95、97、99、101、103、105及107組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：92之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：95之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：97之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：99之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的 抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：101之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：103之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：105之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：107之重鏈可變區及包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、106及108組成之群之胺基酸序列之重鏈的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在另一態樣中，本發明提供包含包含選自由SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、106及108組成之群之胺基酸序列之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：94之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：96之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：98之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：100之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：102之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：104之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：106之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在一個實施例中，本發明提供包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：108之重鏈及包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈的抗體。
在上述實施例中之任一者中，本發明之抗血球凝集素抗體經人類化。在一個實施例中，抗血球凝集素抗體包含如上述實施例中之任一者中之HVR，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。
在另一態樣中，本發明之抗血球凝集素抗體包含與選自由SEQ ID NO：79、83、89、92、95、97、99、101、103、105及107組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性的重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性之VH序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗血球凝集素抗體保持結合血球凝集素之能力。在某些實施例中，總共1至10個胺基酸在SEQ ID NO：79、83、89、92、95、97、99、101、103、105或107中發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生於HVR外側之區中(亦即，在FR中)。視情況，抗血球凝集素抗體 包含SEQ ID NO：79、83、89、92、95、97、99、101、103、105或107中之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，提供抗血球凝集素抗體，其中該抗體包含與選自由SEQ ID NO：78、82、86及91組成之群之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之序列一致性的輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之一致性之VL序列相對於參考序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗血球凝集素抗體保持結合血球凝集素之能力。在某些實施例中，總共1至10個胺基酸在SEQ ID NO：78、82、86或91中發生取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生於HVR外側之區中(亦即，在FR中)。視情況，抗血球凝集素抗體包括SEQ ID NO：78、82、86或91中之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。
在另一態樣中，提供抗血球凝集素抗體，其中該抗體包含如上文所提供任一實施例中之VH及如上文所提供任一實施例中之VL。在一個實施例中，抗體包含分別SEQ ID NO：79、83、89、92、95、97、99、101、103、105或107及SEQ ID NO：78、82、86或91中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在又一態樣中，本發明提供與本文所提供抗血球凝集素抗體結合至相同表位之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與抗血球凝集素抗體結合至相同表位之抗體，其包含SEQ ID NO：79之VH序列及SEQ ID NO：78之VL序列；SEQ ID NO：83之VH序列及SEQ ID NO：82之VL序列；SEQ ID NO：83之VH序列及SEQ ID NO：86之VL序列；SEQ ID NO：89之VH序列及SEQ ID NO：78之VL序列；SEQ ID NO：92之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：95之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列：SEQ ID NO：97之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：99之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：101之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：103之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：105之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：107之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列。
在本發明之又一態樣中，上文任一實施例之抗血球凝集素抗體係單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一個實施例中，抗血球凝集素抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙價抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，抗體係全長抗體，例如完整(例如)IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同種型。
在又一態樣中，上文任一實施例之抗血球凝集素抗體可單獨或組合納入任一特徵，如下文部分1-7中所述：
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供抗體具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如，10-8M或更小、例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)之解離常數(Kd)。
在一個實施例中，Kd係藉由放射性標記之抗原結合分析(RIA)來量測。在一個實施例中，RIA係利用所關注抗體之Fab形式及其抗原實施。舉例而言，Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由以下來量測：在滴定系列之未標記抗原之存在下，利用最低濃度之(125I)標記抗原平衡Fab，隨後利用抗Fab抗體塗佈板捕獲所結合抗原(例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立該分析之條件，將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml於50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之捕獲用抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈過夜，且隨後在室溫 (約23℃)下用於PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2小時至5小時。在非吸收性板(Nunc編號269620)中，將100pM或26pM[125I]抗原與連續稀釋之所關注Fab混合(例如，與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體(Fab-12)之評定一致)。隨後將所關注Fab培育過夜；然而，可繼續培育較長時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。隨後，將混合物轉移至捕獲板中以在室溫下進行培育(例如，1小時)。隨後去除溶液且用PBS中之0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)將板洗滌8次。在板已乾燥時，添加150μl/孔之閃爍體(MICROSCINT-20 TM；Packard)，且在TOPCOUNT TM γ計數器(Packard)上經10分鐘對該等板進行計數。選擇得到小於或等於20%之最大結合之每一Fab的濃度用於競爭性結合分析。
根據另一實施例，Kd係使用BIACORE®表面電漿共振分析來量測。舉例而言，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway,NJ)之分析係在25℃下用固定抗原CM5晶片以約10個反應單位(RU)實施。在一個實施例中，根據供應商說明書用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE公司)。用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後以5μl/分鐘之流速注射以達成約10個反應單位(RU)之偶聯蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以約25μl/min之流速注射Fab於含有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑之PBS(PBST)中之兩倍連續稀釋物(0.78nM至500nM)。締合速率(kon)及解離速率(koff)係使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE ®評估軟體3.2版)藉由同時擬合締合及解離感測圖來計算。以比率koff/kon之形式來計算平衡解離常數(Kd).例如，參見Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上述表 面電漿共振分析測得之締合速率超過106M-1 S-1，則締合速率可藉由使用螢光淬滅技術進行測定，該技術在25℃下於增加濃度之抗原存在下量測於PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度的增加或降低(激發波長=295nm；發射波長=340nm，16nm帶通)，如於分光光度計(例如帶有攪拌比色杯之停流裝備之分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本文所提供抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，例如，參見Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙價抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三價抗體及四價抗體亦闡述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單一結構域抗體係包含抗體中重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。
可藉由各種技術來製備抗體片段，該等技術包括但不限於溶蛋白性消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)來產生，如本文所述。
3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984)中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴子)之可變區)及人類恆定區。在又一實例中，嵌合抗體係種類或子類已自親代抗體發生變化之「種類轉換」抗體。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，而保持親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR(例如，CDR)(或其部分)係源自非人類抗體，且FR(或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦可包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如)Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(闡述特異性決定區(SDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(闡述「表面重塑」)； Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(闡述FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(例如，參見，Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(例如，參見，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(經體突變)框架區或人類種系框架區(例如，參見，Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及衍生自篩選FR文庫之框架區(例如，參見，Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4. 人類抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。人類抗體可使用業內已知之各種技術或使用本文所述之技術產生。人類抗體通常闡述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生完整人類抗體或具有因應抗原性攻擊之人類可變區的完整抗體。此等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座代替內源免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此等轉基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座通常已不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。例如，亦參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870 號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區組合來修飾由此等動物產生之完整抗體的人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於雜交瘤之方法來製備。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。)經由人類B細胞雜交瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。額外方法包括彼等闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述來自雜交瘤細胞系之單株人類IgM抗體之產生)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(闡述人類-人類雜交瘤)中者。人類雜交瘤技術(三源雜交瘤(Trioma)技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來生成。隨後，此等可變結構域序列可與期望之人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
5. 文庫衍生之抗體
可藉由自組合文庫篩選具有一或多種期望活性之抗體來分離本發明抗體。舉例而言，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自此等文庫篩選具有期望結合特性之抗體的各種方法。此等方法可參見(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等 人，編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)，且進一步闡述於(例如)以下中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)來單獨選殖VH及VL基因之譜且將其隨機重組於噬菌體文庫中，隨後可篩選結合抗原之噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。來自免疫化源之文庫可向免疫原提供高親和力抗體而無需構築雜交瘤。或者，可選殖幼稚譜(例如，自人類)以向各種無任何免疫之非自體抗原亦及自體抗原提供單一抗體源，如由Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最後，亦可藉由以下方式以合成方式製得幼稚文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因片段，且使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高度可變CDR3區並在活體外達成重排，如由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
本文中將自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段視為人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係關於血球凝集素且另一者係關於任一其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至血球凝集素之兩個不同表位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑局域化至表現血球凝集素之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製得。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造用於製備抗體Fc-異源二聚分子之靜電牽引效應(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(例如，參見美國專利第4,676,980號及Brennan等人，Science 229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊產生雙特異性抗體(例如，參見Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用用於製備雙特異性抗體片段之「雙價抗體」技術(例如，參見Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(scFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994))；及製備三特異性抗體(例如，如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述)。
本文亦包括經改造具有三個或更多個功能抗原結合位點之抗體(包括「章魚抗體」)(例如，參見US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括包含結合至血球凝集素以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙重作用之FAb」或「DAF」(例如，參見US 2008/0069820)。
7. 抗體變體
在某些實施例中，涵蓋本文提供抗體之胺基酸序列變體。舉例而言，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成來製備。此等修飾包括(例如)抗體胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以獲得最終構築體，前提為最終構築體具有期望特性，例如抗原結合性。
a)取代、插入及缺失變體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR及FR。保守取代示於表1中之「較佳取代」標題下。更多實質性變化提供於表1之「實例性取代」標題下，且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步所述。可將胺基酸取代引入所關注抗體及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係(例如)經保持/改良抗原結合、經降低免疫原性或經改良ADCC或CDC。
可根據常見側鏈性質將胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代使得需要將該等種類之一種之成員與另一種類交換。
一種取代變體類型涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體在某些生物學性質(例如，增加之親和力、降低之免疫原性)中具有修飾(例如，改良)及/或實質上保持親代抗體之某些生物學性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地(例如)使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如彼等本文所述者)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗體展示於噬菌體上並篩選特定生 物學活性(例如結合親和力)。
可對HVR作出變化(例如，取代)以(例如)改良抗體親和力。該等變化可在HVR「熱點」(亦即，由在體細胞成熟過程期間發生高頻率突變之密碼子編碼的殘基)(例如，參見Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或接觸抗原之殘基中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由構築二級文庫及自該等文庫重新選擇來達成親和力成熟已闡述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之誘變)中之任一者將多樣性引入所選用於成熟之可變基因中。隨後建立二級文庫。隨後篩選文庫以鑑別具有期望親和力之任一抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導方法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可特定鑑別(例如，使用丙胺酸掃描誘變或建模)參與抗原結合之HVR殘基。具體而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要此等變化不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可對HVR作出不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，本文所提供之保守取代)。此等變化可(例如)在HVR中之抗原接觸殘基外部。在上文所提供變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑別抗體上可靶向用於誘變之殘基或區的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085中所述。在此方法中，已鑑別殘基或目標殘基組(例如，帶電殘基，例如arg、asp、his、lys及glu)，並由中性或帶負電之胺基酸(例如，丙胺酸或多丙胺酸)代替以確定是否影響抗體與抗原之相互作 用。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原間之接觸點。可靶向此等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其排除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。
胺基酸序列插入包括胺基-及/或羧基末端融合物(長度在一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲二磺醯殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體之N末端或C末端與酶(例如，用於ADEPT)或可延長抗體血清半衰期之多肽之融合物。
b)糖基化變體
在某些實施例中，改變本文提供之抗體以增加或降低抗體經糖基化之程度。抗體糖基化位點之添加或缺失可藉由改變胺基酸序列以產生或移除一或多個糖基化位點來便捷地完成。
若抗體包含Fc區，則其所附接之碳水化合物可有所改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈、二分枝寡糖，其通常藉由N-連接附接至Fc區之CH2結構域的Asn297。例如，參見Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。該寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接至二分枝寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具有某些改良性質之抗體變體。
在一個實施例中，提供具有缺乏附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗體變體。舉例而言，此抗體中岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。藉由計算相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複合物、雜合體及高甘露糖結構)之總量Asn297處糖鏈內岩藻糖之平均量來測定岩藻糖的量，如藉由MALDI-TOF質譜所量測，如(例如)WO 2008/077546中所述。Asn297 係指位於Fc區中大約297位處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，因抗體中具有微小序列變化，故Asn297亦可位於297位上游或下游之大約±3個胺基酸處，亦即，介於294位與300位之間。此等岩藻糖基化變體可具有經改良ADCC功能。例如，參見美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。與「去岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖」抗體變體相關之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺少蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因剔除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供二等分寡糖之抗體變體，例如，其中附接至抗體Fc區之二分枝寡糖由GlcNAc二等分。此等抗體變體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。此等抗體變體之實例闡述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)中。亦提供在附接至Fc區之寡糖 中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此等抗體變體可具有經改良CDC功能。此等抗體變體闡述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)、WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，藉此產生Fc區變體。Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些(但非全部)效應子功能之抗體變體，此使其成為許多應用之合意的候選物，在該等應用中抗體之活體內半衰期較為重要，但某些效應子功能(例如補體及ADCC)係不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏Fc γ R結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。介導ADCC之原代細胞(NK細胞)僅表現Fc γ RIII，而單核球表現Fc γ RI、Fc γ RII及Fc γ RIII。FcR於造血細胞中之表現匯總於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-492(1991)之第464頁表3中。評定所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可採用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。可用於該等分析之效應細胞包括末梢血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細 胞。或者或另外，可在活體內(例如，在諸如揭示於Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中之動物模型等動物模型中)評定所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析來確認抗體不能與C1q結合且因此缺少CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評定補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括在殘基265及297處經丙胺酸取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有改良或降低之與FcR之結合的某些抗體變體。(例如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如，在Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號)。
在一些實施例中，Fc區有所改變，從而改變(亦即，改良或減小)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
具有延長之半衰期及改良之與新生兒Fc受體(FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒中，Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之結合之抗體闡述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。此等Fc變體包括彼等在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及與Fc區變體有關之其他實例之WO 94/29351。
d)半胱胺酸改造之抗體變體
在某些實施例中，可能期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基於抗體之可及位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團藉此位於抗體之可及位點處且可用於使抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫偶聯物，如本文進一步所述。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)、重鏈之A118(EU編號)及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供抗體以含有業內已知且易於獲得之額外非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於) 聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，衍生化所用聚合物之數量及/或類型可基於包括(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：欲改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於界定條件下之療法等。
在另一實施例中，提供抗體及非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一個實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長：其不會危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至可將毗鄰抗體-非蛋白質性部分之細胞殺滅的溫度。
B.重組方法及組合物
可使用重組方法及組合物來產生抗體，例如，如美國專利第4,816,567號中所述。在一個實施例中，提供本文所述之編碼抗血球凝集素抗體之分離核酸。此核酸可編碼抗體中包含VL之胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在又一實施例中，提供一或多個包含此核酸之載體(例如，表現載體)。在又一實施例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在一個此實施例中，宿主細胞包含以下物質(例如，已經該等物質轉化)：(1)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸的載體，或(2) 包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一實施例中，宿主細胞係真核細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製備抗血球凝集素抗體之方法，其中該方法包含在適於表現抗體之條件下培養包括編碼如上文所提供抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
對於抗血球凝集素抗體之重組產生，分離(例如)如上文所述之編碼抗體之核酸並將其插入一或多個載體中以供進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此核酸可使用習用程序容易地分離並測序(例如，藉由使用能與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)。
用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包括本文所述原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，具體而言在無需糖基化及Fc效應子功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，例如，參見美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。表現後，可以可溶部分自細菌細胞膏糊分離抗體且可將其進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母菌)亦係用於編碼抗體之載體之適宜選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已「人類化」從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞生物體(無脊 椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞聯合使用，具體而言用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述產生轉基因植物中之抗體之PLANIBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用之哺乳動物宿主細胞系之其他實例係藉由SV40轉化之猴腎CV1系(COS-7)；人類胚腎系(293或293細胞，如(例如)Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠支持細胞(TM4細胞，如(例如)Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如)Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用之哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，例如，參見Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
C. 分析
可藉由業內已知之各種分析來鑑別本文所提供之抗血球凝集素抗體、篩選或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。
1. 結合分析及其他分析
在一個態樣中，例如，藉由已知方法(例如ELISA、西方墨點(Western blot)等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析以鑑別競爭血球凝集素與本文所述任何抗血球凝集素抗體結合的抗體。在某些實施例中，該競爭抗體結合至由本文所述抗血球凝集素抗體(例如，包含以下序列之抗血球凝集素抗體：SEQ ID NO：79之VH序列及SEQ ID NO：78之VL序列；SEQ ID NO：83之VH序列及SEQ ID NO：82之VL序列；SEQ ID NO：83之VH序列及SEQ ID NO：86之VL序列；SEQ ID NO：89之VH序列及SEQ ID NO：78之VL序列；SEQ ID NO：92之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：95之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：97之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：99之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：101之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：103之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：105之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列；SEQ ID NO：107之VH序列及SEQ ID NO：91之VL序列)結合之相同表位(例如，線性或構象表位)。定位抗體結合之表位之詳細實例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols,」Methods in Molecular Riology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在實例性競爭分析中，在溶液中培育固定血球凝集素，該溶液包含結合至血球凝集素之第一經標記抗體及正在測試與第一抗體競爭結合至血球凝集素之能力之第二未標記抗體。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體而非第二未經標記抗體之溶液中培育固定血球凝集素。在允許第一抗體與血球凝集素結合之條件下培育後，去除過量未結合抗體，並量測與固定血球凝集素結合之標記的量。若與固定血球凝集素結合之標記之量在測試試樣中相 對於對照試樣實質上有所減小，則此表明第二抗體與第一抗體競爭結合至血球凝集素。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2. 活性分析
在一個態樣中，提供分析以鑑別具有生物活性之抗血球凝集素抗體及其片段。生物活性可包括(例如)特異性結合至B型流感病毒血球凝集素、中和B型流感病毒等。亦提供包含具有該活體內及/或活體外生物活性之抗體或其片段的抗體及組合物。
在某些實施例中，測試本發明抗體之此生物活性。關於該等分析之實例性說明，參見實例3-16。
D. 免疫偶聯物
本發明亦提供包含偶聯至一或多種細胞毒性劑之本文抗血球凝集素抗體的免疫偶聯物，該等細胞毒性劑係(例如)化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌之酶促活性毒素、真菌、植物或動物來源或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，免疫偶聯物係抗體-藥物偶聯物(ADC)，其中抗體偶聯至一或多種藥物，該等藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧裡斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裡斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928 (1998))；蒽環抗生素，例如道諾黴素或多柔比星(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；胺甲蝶呤；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，例如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉羅他塞(larotaxel)、特西他塞(tesetaxel)及歐他紫杉烷(ortataxel)；單端孢黴烯(trichothecene)；及CC1065。
在另一實施例中，免疫偶聯物包含與酶促活性毒素或其片段偶聯之本文所述抗體，該酶促活性毒素或其片段包括但不限於白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲裂吉菌素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及單端孢黴烯族毒素(tricothecene)。
在另一實施例中，免疫偶聯物包含偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物的本文所述抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當偶聯物用於檢測時，其可包含用於閃爍法研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，例如碘-123(再 次)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得，例如3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺基酯之雙功能衍生物(例如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-重氮苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰酸根合苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於放射性核苷酸與抗體偶聯的實例性螯合劑。參見WO94/11026。連接體可為促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接體」。舉例而言，可使用酸不穩定性連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定性連接體、二甲基連接體或含有二硫化物之連接體(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫偶聯物或ADC明確地涵蓋(但不限於)此等使用以下交聯劑試劑製備之偶聯物：包括但不限於BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC及sulfo-SMPB、以及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑可自市面購得(例如，購自Pierce Biotechnology公司，Rockford,IL.,U.S.A)。
E. 用於診斷及檢測之方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供抗血球凝集素抗體中之任一者皆可用於檢測生物試樣中血球凝集素或B型流感病毒之存在。本文所用 術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物試樣包含細胞或組織(例如，肺、上呼吸道、鼻淚管、血液、痰)，或包含藉由鼻或咽喉拭子獲得之生物試樣。
在一個實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗血球凝集素抗體。在又一態樣中，提供檢測生物試樣中血球凝集素或B型流感病毒之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含使生物試樣與本文所述抗血球凝集素抗體在允許抗血球凝集素抗體與血球凝集素結合之條件下接觸，並檢測在抗血球凝集素抗體與血球凝集素之間是否形成複合物。此方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用抗血球凝集素抗體來選擇適用於使用抗血球凝集素抗體之療法的個體，例如，其中血球凝集素係用於選擇患者之生物標記。
可使用本發明抗體診斷之實例性病症包括A型流感病毒感染，包括兒童、嬰兒、成人及老年人之B型流感病毒感染。
在某些實施例中，提供經標記之抗血球凝集素抗體。標記包括(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光素及其衍生物)、玫瑰紅(rhodamine)及其衍生物、丹磺醯、繖形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利第4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶聯)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。
F. 醫藥調配物
如本文所述抗血球凝集素抗體之醫藥調配物係藉由混合具有期望純度之該抗體與一或多種醫藥上可接受之可選載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))以凍乾之調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒，且包括但不限於：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯化苄二甲烴銨、氯化本索寧；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性玻尿酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International公司)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，將sHASEGP與一或多種額外糖胺聚糖酶(例如軟骨素酶)組合。
實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中者，後一些調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性成份，較佳為彼等具有相互間不會產生不利影響之補充活性者。舉例而言，可期望進一步提供神經胺酸酶抑制劑、抗血球凝集素抗體、抗M2抗體等。該等活性成份以有效用於預期目的之量適宜地組合存在。
活性成份亦可分別裝入藉由(例如)凝聚技術或藉由介面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
亦可製備持續釋放製劑。緩釋製劑之適宜實例包括含有抗體之固態疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物件形式，例如薄膜或微膠囊。
欲用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可藉由(例如)經由無菌過濾膜進行過濾來容易地達成。
G. 治療方法及組合物
本文所提供抗血球凝集素抗體中之任一者皆可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供用作藥劑之抗血球凝集素抗體。在其他態樣中，提供用於治療、預防或抑制B型流感病毒感染之抗血球凝集素抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法中之抗血球凝集素抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有B型流感病毒感染之個體之方法中之抗血球凝集素抗體，該方法包含向該個體投與有效量之抗血球凝集素抗體。在一個此實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如，如下文所述。在其他實施例 中，本發明提供用於預防、抑制或降低B型流感病毒病毒膜與感染細胞內體膜之間血球凝集素介導之融合、由此預防病毒RNA進入感染細胞細胞質並預防感染進一步傳播的抗血球凝集素抗體。在某些實施例中，本發明提供用於預防、抑制或治療個體B型流感病毒感染之方法中之抗血球凝集素抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗血球凝集素抗體以預防、抑制或治療B型流感病毒感染。上述實施例中之任一者之「個體」較佳係人類。
在又一態樣中，本發明提供抗血球凝集素抗體在製造或製備藥劑中之用途。在一個實施例中，藥劑用於治療B型流感病毒感染。在又一實施例中，該藥劑用於治療B型流感病毒感染之方法中，該方法包含向患有B型流感病毒感染之個體投與有效量之藥劑。在一個此實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如，如下文所述。在又一實施例中，該藥劑用於預防、抑制或降低B型流感病毒病毒膜與感染細胞內體膜之間血球凝集素介導之融合、由此預防病毒RNA進入感染細胞細胞質並預防感染進一步傳播。在又一實施例中，該藥劑用於預防、抑制或治療個體B型流感病毒感染之方法中，該方法包含向個體投與有效量之該藥劑以預防、抑制或治療B型流感病毒感染。上文實施例中之任一者之「個體」可為人類。
在又一態樣中，本發明提供治療B型流感病毒感染治方法。在一個實施例中，該方法包含向患有該B型流感病毒感染之個體投與有效量之抗血球凝集素抗體。在一個此實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，如本文所述。上文實施例中之任一者之「個體」可為人類。
本發明提供有效抑制、預防或治療個體(individual，例如，個體(subject)或患者)之B型流感病毒感染的抗血球凝集素抗體。在一些態 樣中，本發明之抗血球凝集素抗體有效預防性治療個體以預防個體之B型流感病毒感染。
在一些態樣中，適於經本發明之抗血球凝集素抗體治療之個體係患有或懷疑患有B型流感病毒感染之個體。在一些實施例中，該等個體包括嬰兒、兒童、成人及老年人。在一些實施例中，個體因B型流感病毒感染住院。在其他實施例中，患有B型流感病毒感染之個體具有一或多種共病，例如，免疫缺陷、懷孕、肺疾病、心臟病、腎病或共感染(例如，細菌感染或病毒感染，例如細菌或病毒肺炎)。
在一些態樣中，用本發明之抗血球凝集素抗體治療個體可降低B型流感病毒感染嚴重程度、減少B型流感病毒感染之時長或降低B型流感病毒之感染性。在其他態樣中，用本發明之抗血球凝集素抗體治療B型流感病毒感染提供額外益處，包括減少住院時長、降低或防止需要加護病房(ICU)使用、降低或防止需要輔助或機械通風、降低或防止需要補充氧使用及降低死亡率。在一些態樣中，住院時長減少1天、2天、3天、4天、5天或長於5天。在一些態樣中，需要加護病房使用減少1天、2天、3天、4天、5天或長於5天。在一些態樣中，需要輔助或機械通風減少1天、2天、3天、4天、5天或長於5天。在一些態樣中，需要補充氧減少1天、2天、3天、4天、5天或長於5天。在一些態樣中，用本發明之抗血球凝集素抗體治療個體可減輕B型流感病毒感染疾病症狀，例如，發熱、鼻炎、冷硬、咽喉痛、肌肉疼痛、身體痛、頭痛、咳嗽、鼻充血、虛弱或疲勞、經刺激或溢淚眼及全身不適。
在一些態樣中，用本發明之抗血球凝集素抗體治療個體可減少達到呼吸功能正規化之時間，例如減少達到呼吸率正規化之時間或減少大大氧飽和正規化之時間。在一些態樣中，用本發明之抗血球凝集素抗體治療個體可減少恢復至正常氧飽和(例如約92%或更大之氧飽 和)之時間，如經24小時時段無補充氧投與所量測。在其他態樣中，用本發明之抗血球凝集素抗體治療個體可減少達到生命徵象(例如心率、血壓、呼吸率及溫度)正規化之時間。
在一些態樣中，用本發明之抗血球凝集素抗體治療個體可改良病毒終點，例如流感病毒效價。病毒效價可藉由彼等熟習此項技術者已知之各種方式量測，例如，病毒曲線下面積(AUC)，如藉由(例如)qPCR或組織培養感染劑量(TCID50)所量測。在一些態樣中，治療引起病毒AUC降低大於或等於50%，如藉由qPCR或TCID50所量測。
在本發明之各個態樣中，在症狀發作(例如，疾病發作)後約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時、約84小時及約96小時投與時，本文所提供抗血球凝集素抗體有效治療B型流感病毒感染。在其他態樣中，在症狀發作後介於約24小時與48小時之間(例如，個體已有症狀介於24小時與48小時之間)投與時，在症狀發作後介於約48小時與72小時之間投與時，或在症狀發作後介於約72小時與96小時之間投與時，本文所提供抗血球凝集素抗體有效治療B型流感病毒感染。在本發明之某些實施例中，本發明之抗血球凝集素抗體有效治療或減輕B型流感病毒感染且延長當前護理標準(例如，奧塞米韋)之治療窗超過症狀發作後48小時。
在又一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包含本文所提供抗血球凝集素抗體中之任一者以(例如)用於上述治療方法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供抗血球凝集素抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供抗血球凝集素抗體中之任一者及至少一種額外治療劑，例如，如下文所述。
本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，可共投與本發明抗體與至少一種額外治療劑。在某些實施例中，額外 治療劑係神經胺酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、磷酸奧塞米韋、金剛烷胺(amantadine)、金剛烷乙胺(rimantadine))、抗M2抗體、抗血球凝集素抗體等。在一些態樣中，與用單一藥劑治療相比，用與神經胺酸酶抑制劑共投與之本發明之抗血球凝集素抗體治療患有B型流感病毒感染之個體可提供協同治療效應。
上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或分開調配物中)及分開投與(在此情形中，可在投與一或多種額外治療劑之前、同時及/或之後投與本發明抗體)。在一個實施例中，投與抗血球凝集素抗體及投與額外治療劑彼此可在約1個月內、或在約1週、2週或3週內、在約1天、2天、3天、4天、5天或6天內、或在約1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、10小時、12小時、16小時、20小時或24小時內發生。
本發明抗體(及任一額外治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內、以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑、例如藉由注射、例如靜脈內或皮下注射投藥，此部分取決於投與係短期投與或長期投與。本文涵蓋各種投藥方案，包括(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
本發明抗體應以符合良好醫療實踐之方式調配、投用及投與。在此上下文中需考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床病況、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間安排及從業醫師所知之其他因素。抗體不需要(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。此等其他藥劑之有效量端視調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型及上文所討論之其他因素而定。該等藥劑通常以相同劑量及如本文所述之投與途徑來使用，或以本文所述劑量之約1%至99%來使用，或以憑經 驗/臨床確定適當之任一劑量及任一途徑來使用。
對疾病之預防或治療而言，本發明抗體之適當劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)應端視欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。抗體係以適宜方式一次性或經一系列治療投與患者。端視疾病之類型及嚴重度，不論(例如)藉由一或多次分開投與或藉由連續輸注來投與，約1μg/kg至約45mg/kg(例如，約1.0mg/kg至約15mg/kg)抗體可係投與患者之初始候選劑量。端視上文所提及因素而定，一種典型日劑量可介於約1μg/kg至100mg/kg之範圍內或更高。對於經若干天或更長時間重複投與，端視病況而定，治療通常持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體之實例性劑量可在約1.0mg/kg至約45mg/kg、約1.0mg/kg至約30mg/kg、約1.0mg/kg至約15mg/kg、約1.0mg/kg至約10mg/kg或約1.0mg/kg至約5mg/kg範圍內。因此，可向患者投與約1.0mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、30mg/kg或45mg/kg(或其任何組合)之一或多個劑量。該等劑量可間歇(例如每天、每2天、每3天等)投與。可在開始時投與較高載荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。亦可以固定劑量(例如，200mg、400mg、600mg、800mg、1000mg、1200mg、1400mg、1500mg、1600mg、1800mg、2000mg、2200mg、2400mg、2500mg、2600mg、2800mg、3000mg、3200mg、3400mg、3600mg等)投用。此療法之進展可容易地藉由習用技術及分析來監測。
應理解，可使用本發明之免疫偶聯物代替抗血球凝集素抗體或與抗血球凝集素抗體一起來實施任一上述調配物或治療方法。
H. 製品
在本發明之另一態樣中，提供含有用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器相連之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合時可有效治療、預防及/或診斷病況之組合物，且可具有無菌存取通道(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該組合物中至少一種活性劑係本發明抗體。標記或包裝插頁指示該組合物用於治療選定病況。此外，該製品可包含(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或治療劑。本發明此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病況之包裝插頁。另一選擇為或另外，該製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度來看期望之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾膜、針及注射器。
應理解，代替抗血球凝集素抗體或除抗血球凝集素抗體以外，上文任一製品可包括本發明免疫偶聯物。
III.實例
以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，鑒於上文所提供之一般說明可實踐各種其他實施例。
實例1. 漿母細胞富集及擴增
為發現並鑑別針對B型流感病毒血球凝集素之稀有抗體，研發以下漿母細胞富集及擴增技術。(參見於2013年11月12日提出申請之共同待決專利申請案美國專利申請案第14/077,414號及國際專利申請案第PCT/US2013/69567號，及Nakamura等人(2013)Cell Host & Microbe,14：93-103，其全文各自以引用方式併入本文中)。
自Blood Centers of the Pacific(San Francisco,CA)獲得在捐血之前7天接受季節性流感Fluvirin®疫苗(Novartis批號111796P1)之正常人類供體之白血球。使用標準方法自該等白血球分離末梢血單核細胞(PBMC)。自Charles River Laboratories(Hollister,CA)購得六至八週齡之雌性SCID/米色小鼠並根據American Association of Laboratory Animal Care guidelines將其維持於Genentech。所有實驗研究皆係在Institutional Animal Care and Use Committees of Genentech Lab Animal Research批准下在AAALACi認可之設施中根據Guide for the Care and Use of Laboratory Animals及適用法律及法規實施。健康人類供體之白血球或血液係在提供書面知情同意書且自Western Institutional Review Board授權倫理批准後獲得。
如下使用PBMC之脾移植實施活體內抗原取代驅動之漿母細胞富集及擴增。將經分離之PBMC用血球凝集素抗原(見下文)(對於每一100萬B細胞，0.1-2μg抗原)再懸浮並於37℃下培育30分鐘(PBMC/抗原預混物)。在此培育後，洗滌PBMC以去除未結合抗原。為富集產生對B型流感病毒具有特異性之交叉反應性血球凝集素抗體的漿母細胞，特定選擇用於PBMC/抗原預混物及單一細胞分選之血球凝集素抗原變體以與流感Fluvirin®疫苗內所含之血球凝集素抗原變體區分。因此，此研究中所用之血球凝集素抗原包括以下B型流感病毒分離物之血球凝集素：B/香港(HongKong)/1973(用於抗原-預混物及FACS中)；B/馬里蘭(Maryland)/1/1959及B/威斯康辛/2010(用於ELISA篩選中)；及B/布里斯班/2008(疫苗中及用於ELISA篩選中)。血球凝集素抗原係使用標準分子生物技術於Genentech處產生。
使用銫-137源用350 rad以亞致死方式輻照6-8週齡雌性SCID/米色小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)。在輻照後向飲用水中 添加多黏菌素B(polymyxin B)(110mg/L)及新黴素(1.1g/L)達7天。輻照後4小時，將每一小鼠之左側腹剃毛並利用Betadine®(Purdue Pharma,Stamford,CT)及70%酒精進行術前準備。在麻醉下使用無菌手術程序實施手術程序。在每一小鼠之肋骨邊緣正下方切出1-cm皮膚切口，之後對腹壁及腹膜切口。小心暴露每一小鼠之脾並注射50×106個再懸浮於30μL PBS中之人類PBMC。在肌肉層及皮膚中分別使用5-O Vicryl®縫合線(Ethicon,Somerville,NJ)及手術U形釘閉合切口。對於抗原特異性細胞分選實驗，在移植後8天處死小鼠並收穫其脾。
將自小鼠獲得之脾細胞之單一細胞懸浮液用抗人類單株抗體CD38 PECy7(BD Biosciences,San Jose,CA)及IgG Dylight(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司，West Grove,PA)之混合劑染色，此將人類IgG+漿母細胞定義為CD38高/IgG+表現。為鑑別經分離脾細胞之懸浮液內之B型流感病毒血球凝集素交叉反應性漿母細胞，使用Lightning-Link®標記套組(Innova Biosciences,Cambridge,UK)將細胞用先前分別與FITC或PE偶聯之B型流感病毒菌株B/香港/1973之血球凝集素染色。
在使用上述方法鑑別之約2,018個抗原特異性漿母細胞中，7種mAb針對至少一種B型流感病毒菌株顯示病毒中和，且3種mAb針對測試之所有B型流感病毒菌株(包括山形及維多利亞譜系之B型流感病毒菌株)展示病毒中和。
實例2. 自單一漿母細胞之IgG選殖
對B型流感病毒血球凝集素交叉反應性人類漿母細胞(上文所述)進行單一細胞分選，從而產生約2,018個抗原特異性漿母細胞。將單一漿母細胞直接分選至有50μl含5%低IgG胎牛血清之RPMI的U形底96孔微量滴定板中。將板以600×g離心5分鐘(Beckman Coulter,Brea,CA)並藉由抽吸小心去除培養基。遵循相同程序將細胞再懸浮並在90 μl PBS中洗滌兩次。
為生成編碼可變重鏈及輕鏈之cDNA，將每一細胞再懸浮於6μl逆轉錄酶(RT)反應混合物中，該反應混合物含有2單位RNaseout(Invitrogen,Grand Island,NY)、0.5mM 4dNTP(Perkin Elmer,Waltham,MA)、1.5mM MgCl2、37.5mM KCl、10mM DTT(二硫蘇糖醇)、0.25% Nonidet P40(US Biological,Marblehead,MA)、0.1mg/ml牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)、25mM Tris pH 8.3、0.25pmol IgG1-4恆定、κ鏈恆定及λ鏈恆定區特異性寡核苷酸(下文所示)及40U Superscript III(Invitrogen,Grand Island,NY)。
IgG1-4恆定：(SEQ ID NO：1)
κ恆定：(SEQ ID NO：2)
λ恆定：(SEQ ID NO：3)
將反應物於45℃、50℃及55℃下各自培育3×30分鐘。在培育後，將反應混合物用TE緩衝液(10mm Tris HCl、1mM EDTA)稀釋至15μl。遵循由製造商提供之方案使用來自上述及Advantage-GC 2聚合酶混合物(Clontech,Mountain View,CA)之2μl經稀釋RT混合劑實施初始聚合酶鏈式反應(PCR)以擴增IgG重鏈、κ鏈及λ鏈。使用基於下文所示可變重鏈及輕鏈種系及恆定區序列之簡併寡核苷酸實施PCR擴增。
IGVH1a(SEQ ID NO：4)
IGVH1b(SEQ ID NO：5)
IGVH2(SEQ ID NO：6)
IGVH3(SEQ ID NO：7)
IGVH4(SEQ ID NO：8)
IGVH5(SEQ ID NO：9)
IGVH6(SEQ ID NO：10)
IGVH7(SEQ ID NO：11)
IGKV1(SEQ ID NO：12)
IGKV2(SEQ ID NO：13)
IGKV3(SEQ ID NO：14.)
IGKV4(SEQ ID NO：15)
IGKV5(SEQ ID NO：16)
IGKV6(SEQ ID NO：17)
IGLV1(SEQ ID NO：18)
IGLV2(SEQ ID NO：19)
IGLV3(SEQ ID NO：20)
IGLV4(SEQ ID NO：21)
IGLV5(SEQ ID NO：22)
IGLV6(SEQ ID NO：23)
IGLV7(SEQ ID NO：24)
IGLV8(SEQ ID NO：25)
IGLV9(SEQ ID NO：26)
HC301.5恆定(SEQ ID NO：27)
κ102恆定(SEQ ID NO：28)
λ 202恆定(SEQ ID NO：29)
將重鏈及輕鏈PCR擴增反應各自分成如下兩個反應：重鏈家族VH.1、2、3(引子IGVH1a、IGVH1b、IGVH2、IGVH3)及VH.4、5、6、7(引子IGVH4、IGVH5、IGVH6及IGVH7)；κ鏈家族VK.1、2、3(引子IGKV1、IGKV2及IGKV3)及VK.4、5、6(引子IGVK4、IGVK5及IGVK6)；及λ鏈家族VL.1、2、3、4、5(IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4及IGLV5)及VL.6、7、8、9(引子IGLV6、IGLV7、IGLV8及IGLV9)。使用觸地PCR擴增方案進行溫度循環。
在反應後，將PCR擴增產物用外核酸酶1(Exo)及蝦鹼性磷酸酶(SAP)處理以自每一PCR擴增反應去除過量核苷酸及引子(U.S.Biologicals,Marblehead,MA)。使用Sanger測序直接測序初始PCR擴增產物以測定重鏈及輕鏈二者之可變序列。使用種系匹配重鏈及輕鏈可變寡核苷酸實施第二巢式PCR擴增以使用以下寡核苷酸引子插入哺乳動物信號及恆定區選殖序列。
sVH1a： (SEQ ID NO：30)
sVH2： (SEQ ID NO：31)
sVH3vv： (SEQ ID NO：32)
sVH3g1： (SEQ ID NO：33)
sVH4： (SEQ ID NO：34)
sVH5：
(SEQ ID NO：35)
sVH6： (SEQ ID NO：36)
sVH7： (SEQ ID NO：37)
sVK1： (SEQ ID NO：38)
sVK2： (SEQ ID NO：39)
sVK3： (SEQ ID NO：40)
sVK4： (SEQ ID NO：41)
sVK5： (SEQ ID NO：42)
sVK6： (SEQ ID NO：43)
sVL1： (SEQ ID NO：44)
sVL2： (SEQ ID NO：45)
sVL3： (SEQ ID NO：46)
sVL4： (SEQ ID NO：47)
sVL5： (SEQ ID NO：48)
sVL6： (SEQ ID NO：49)
sVL7： (SEQ ID NO：50)
sVL8： (SEQ ID NO：51)
wVL9： (SEQ ID NO：52)
重恆定：(SEQ ID NO：53)
κ恆定： (SEQ ID NO：54)
λ恆定：(SEQ ID NO：29)
根據製造商之推薦使用具有GC之PrimeStar HS DNA聚合酶(Takara Bio,Shiga,Japan)設定PCR擴增反應。在PCR擴增反應後，如上文所述將擴增產物用Exo/SAP處理。使用無限制內核酸酶之程序將編碼PCR擴增產物之可變重鏈及可變輕鏈插入哺乳動物表現載體中。使用Kunkel誘變方案將20μl PCR擴增產物退火至IgG1、κ及λ鏈之單鏈DNA人類模板上。(參見Kunkel(1985)PNAS 82：488-492)。藉由DNA測序確認正確插入之構築體。使用Fugene轉染試劑(Roche Diagnostic,Indianapolis,IN)將含有編碼重鏈及輕鏈之核酸之質體共轉染至293T人類胚腎細胞中用於瞬時表現，且如下文所述分析表現及結合。
實例3. 血球凝集素ELISA篩選分析
如下藉由ELISA檢查如上文所述獲得之每一單株抗血球凝集素抗體(即，抗-B型流感病毒抗體)結合不同B型流感病毒分離物之各種血球凝集素亞型的能力。將各種血球凝集素表現質體轉染至293T細胞中；該等血球凝集素包括B型流感病毒菌株B/馬里蘭/1/1959、B/維多 利亞/2000及B/布里斯班/2008之血球凝集素。兩天後，使細胞在50mM Tris(pH 8)、5mM EDTA、150mM NaCl、1% Triton X-100加蛋白酶抑制劑混合劑(Roche)中裂解。藉由離心清除核並將所得裂解物儲存於-80℃下。
對於ELISA篩選，用5μg/ml PBS中之普通雪花蓮(Galanthus nivalis)凝集素(Sigma)塗佈384孔板(Nunc MaxiSorp)。將板洗滌且隨後用含有各種表現血球凝集素之細胞裂解物之稀釋物塗佈。將板洗滌並與抗血球凝集素抗體之各種稀釋物及隨後與山羊-抗人類-HRP二級抗體(Jackson)一起培育。將板洗滌並處理用於TMB(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)受質檢測。
自實例2中之上述單一細胞分選獲得約2,018個漿母細胞。其中，在293T細胞中瞬時表現且藉由ELISA篩選之98種單株抗體展示結合至B型流感病毒菌株B/馬里蘭/1/1959、B/維多利亞/2000及B/布里斯班/2008之血球凝集素。
實例4. 活體外B型流感病毒中和
如下檢查本發明之抗-B型流感病毒血球凝集素抗體引發一組B型流感病毒分離物在活體外寬血球凝集素亞型結合及中和的能力。使MDCK細胞在具有透明底部成像板(Costar 3904)之96孔黑壁中補充有10% FBS作為25%融合單層之DMEM培養基中生長。將每一B型流感病毒亞型在流感培養基(DMEM、Gibco目錄編號15260之0.2%BSA、10mM HEPES、Gibco目錄編號10378之青黴素/鏈黴素/Glutamin、2ug/mL來自Sigma目錄編號T1426之TPCK處理之胰蛋白酶)中稀釋至1之MOI並於37℃下與介於0.02nM至1,600nM範圍內之不同濃度之mAb 34B5A及mAb 33F8一起培育1小時。隨後在用冷100%乙醇固定細胞之前於37℃下在5% CO2培育箱中使每一抗體/流感病毒混合劑感染MDCK細胞達16小時。隨後將固定細胞用Hoechst 33342(Invitrogen目 錄編號H3570)染色以可視化細胞核並測定總細胞數。亦將細胞依序用對B型流感病毒核蛋白(NP)具有特異性之廣泛反應性單株抗體(Millipore目錄編號MAB8258)及Alexa Fluor 488偶聯山羊抗小鼠二級抗體(Invitrogen目錄編號A11029)染色以測定感染細胞之數目。使用Image Express Micro儀器(Molecular Devices)使細胞成像且使用MetaXpress 3.1軟體分析數據影像。
測定感染細胞%並在Y軸上對X軸上之抗體濃度(Log10)繪圖。一式三份地完成所有中和分析且數據報導為IC50值(以nM表示)與95%信賴區間(95% CI)。將數據與非線性消退劑量反應曲線擬合以生成IC50及95% CI。
使用本文所述各種濃度之針對多種B型流感病毒菌株之單株抗體生成活體外中和劑量-反應曲線。圖1A及1B顯示mAb 34B5A及mAb 33F8分別針對一組B型流感病毒菌株之中和曲線。如圖1A及1B中所示，mAb 34B5A及mAb 33F8在活體外有效中和多種B型流感病毒菌株，包括針對祖先B型流感病毒譜系、以及山形及維多利亞譜系之B型流感病毒之活體外中和活性。
下表2顯示針對mAb 34B5A之上述實驗之活體外中和活性。
圖2顯示mAb 46B8A針對一組B型流感病毒菌株之活體外中和曲線。另外，如圖2中所示，mAb 46B8A在活體外有效中和多種B型流感病毒菌株，包括針對祖先B型流感病毒譜系、以及山形及維多利亞譜系之B型流感病毒之活體外中和活性。
該等結果顯示，本發明單株抗體能夠以劑量依賴性方式在活體外中和各種B型流感病毒分離物/菌株。另外，該等結果顯示，本發明單株抗體能夠中和祖先B型流感病毒分離物以及山形及維多利亞譜系分化後B型流感病毒分離物，包括中和B型流感病毒菌株威斯康辛/2010、布里斯班/2008、孟加拉國/2007、馬來西亞/2004、維多利亞/2000、俄國/1969、麻薩諸塞族/1966、馬里蘭/1959及李/1940。
該等結果指示，本發明單株抗體有效治療及預防B型流感病毒感染及祖先、山形及維多利亞譜系之B型流感病毒菌株。
實例5. B型流感病毒血球凝集抑制分析
為檢查由mAb 46B8C及mAb 34B5C之中和機制，使用兩種B型流感病毒：B/維多利亞/504/2000及B/威斯康辛/1/2010實施血球凝集抑制(HI)分析。對於每一B型流感病毒，在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以1：5開始一式兩份地製備8種5倍步長之連續稀釋物。將50μl每一稀釋物轉移至V底96孔板(Costar 3894)中。將火雞紅血球(TRBC，來自Lampire Biological Laboratories，目錄編號7249408)在PBS中稀釋至0.5%並向含有病毒之每一孔中添加50μl。將板於室溫下培育1小時。藉由直接可視化測定防止TRBC聚集之最終病毒稀釋物(對應於最低病毒濃度)且其用於血球凝集抑制(HI)分析。
利用mAb 46B8C及mAb 34B5C(即具有寬B型流感病毒血球凝集素亞型結合之兩種人類單株抗體(huMab))及對照huMab gD5237(其對 單純皰疹病毒(HSV)之糖蛋白D具有特異性)實施HI分析。將介於0.0032-250μg/ml範圍內之5倍步長之每一抗體之8種連續稀釋物(一式三份)與預定量之B/維多利亞/504/2000或B/威斯康辛/1/2010病毒在PBS中混合並於37℃下培育1小時，如上文所述。將50μl病毒-抗體混合物轉移至V底96孔板中。將TRBC在PBS中稀釋至0.5%並向含有50μl病毒-抗體混合物之每一孔中添加50μl。將每一板於室溫下培育1小時並藉由直接可視化測定每一抗體之HI效價(即，有效抑制血球凝集之最低抗體濃度)。
如圖3中所示，mAb 34B5C有效抑制火雞紅血球(TRBC)由B/維多利亞/504/2000及B/威斯康辛/1/2010 B型流感病毒之血球凝集。相比之下，mAb 46B8C及對照gD5237抗體即使於測試之最高抗體濃度下亦皆不顯示由B型流感病毒抑制血球凝集。該等結果表明，mAb 34B5C結合至B型流感病毒血球凝集素之首基中之受體結合結構域且因此防止病毒結合至TRBC上之唾液酸受體。該等結果亦表明，mAb 46B8C結合至B型流感病毒血球凝集素上之區域，其在受體結合結構域外部(例如，柄(或主幹)區)。
實例6. 藉由血小板抑制分析之活體外B型流感病毒中和
如下進一步分析本發明之抗-B型流感病毒血球凝集素抗體中和各種B型流感病毒分離物之能力。如下藉由噬菌斑分析測定B型流感病毒效價。使MDCK細胞在6孔組織培養板(Costar 3516)中補充有10% FBS作為融合單層之DMEM培養基中生長。該等研究中所用之所有B型流感病毒菌株皆係自ViraPur(Dan Diego,CA)購得。對於病毒效價測定，在流感培養基(DMEM、Gibco目錄編號15260之0.2%BSA、10mM HEPES、Gibco目錄編號10378之青黴素/鏈黴素/Glutamin、2ug/mL來自Sigma目錄編號T1426之TPCK處理之胰蛋白酶)中稀釋每一病毒儲存液。針對每一病毒自1：102至1：107製備6種10倍步長之連續稀 釋物並在6孔板中使用各自1ml以感染MDCK細胞。感染後2小時，去除病毒並用2ml 2×流感培養基：2%瓊脂糖之1：1混合物覆蓋細胞。將板於室溫下保持30分鐘且隨後於37℃下在5% CO2培育箱中培育。三天後，藉由在不透明光下直接可視化對噬菌斑進行計數，且以噬菌斑形成單位(PFU)/ml測定每一病毒之效價。
隨後如下檢查藉由血小板抑制分析之本發明單株抗體對B型流感病毒中和之效應。使MDCK細胞在6孔組織培養板(Costar 3516)中補充有10% FBS作為融合單層之DMEM培養基中生長。對於每一B型流感病毒，在血小板抑制分析中使用在6孔板中每孔產生20至200個噬菌斑之病毒之量(如上文所述測定)。將介於0.16nM至38.4nM範圍內之3倍步長之mAb 46B8C之6種連續稀釋物與每一病毒在流感培養基中混合並於37℃下培育1小時。使用1ml病毒-抗體混合物以感染6孔板中之MDCK細胞，且在3個一式三份板中實施每一感染。在2×流感培養基中製備mAb 46B8C之相同連續稀釋物並以1：1與2%瓊脂糖混合。感染後2小時，去除病毒-抗體混合物並用2ml抗體-瓊脂糖混合物覆蓋細胞。將板於室溫下保持30分鐘且隨後於37℃下在5% CO2培育箱中培育。5至6天後，藉由在不透明光下直接觀察對噬菌斑進行計數。藉由正規化至最高噬菌斑數目(於最低抗體濃度下)測定感染%並在Y軸上對X軸上之Log 10抗體濃度繪圖。將數據與非線性消退劑量反應曲線擬合以生成IC50(產生50%抑制之濃度)值與95%信賴區間(95% CI)。
如圖4中所示，mAb 46B8C針對以劑量依賴性方式測試之所有B型流感病毒菌株在活體外阻斷噬菌斑形成。下表3中顯示自利用上述mAb 46B8C之噬菌斑形成分析生成之數據計算之IC50值。如表3中所見，mAb 46B8C以極低濃度阻斷噬菌斑形成，從而展現小於1nM之IC50值。
表3
總之，該等數據指示，本發明單株抗體有效抑制並中和使用噬菌斑中和分析之B型流感病毒活體外噬菌斑形成，包括祖先、山形及維多利亞譜系之B型流感病毒分離物。另外，該等結果顯示，本發明單株抗體以低於1nM之IC50值抑制B型流感病毒活體外噬菌斑形成。
實例7. B型流感病毒血球凝集素融合抑制分析
為進一步探索由mAb 46B8C及mAb 34B5C之中和機制，如下檢查在病毒進入期間繞過初始受體結合步驟之血球凝集素介導之細胞-細胞融合分析中該等抗體之抑制效應。使HeLa細胞在6孔組織培養板(Costar 3516)中在DMEM+10% FBS中生長至約40%鋪滿。將每一孔中之細胞用10mg表現B/威斯康辛/1/2010血球凝集素之質體轉染。17小時後，自細胞去除轉染混合物並向細胞中添加含有10mM丁酸鈉之新鮮培養基。6小時後再次更換培養基並使細胞生長過夜至約80%鋪滿，其後實施融合抑制分析。
將細胞在PBS中洗滌並於37℃下用PBS中之5mg/ml TPCK胰蛋白酶(Sigma目錄編號T1426)處理7分鐘。去除胰蛋白酶，添加含有50mg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑(CalBiochem目錄編號65035)之培養基並將細胞於37℃下培育10分鐘。隨後將細胞於37℃下在含有20mg/ml或 200mg/ml mAb 46B8C、mAb 34B5C或對照人類mAb gD5237(其對單純皰疹病毒(HSV)之糖蛋白D具有特異性)之培養基中培育。1小時後，去除抗體並將細胞於37℃下在流感培養基(pH 4.85)中培育5分鐘。去除低pH培養基並將細胞於37℃下在生長培養基中培育過夜以完全形成合胞體。在10×物鏡下利用Nikon Eclipse TE2000-E顯微鏡及NIS-Elements AR3.2軟體獲取細胞之相位影像。
將表現B型流感病毒B/威斯康辛/1/2010血球凝集素之HeLa細胞與20μg/ml或200μg/ml mAb 46B8C、mAb 34B5C或對照mAb gD5237一起培育，之後暴露於低pH培養基。合胞體在pH下降之幾小時內出現且在過夜培養後完全發育。mAb 46B8C於20μg/ml及200μg/ml下抑制合胞體形成；相比之下，mAb 34B5C及對照mAb gD5237於檢查濃度下皆不阻斷細胞-細胞融合。(參見圖5)。
與實例5中上述血球凝集抑制(HI)分析中獲得之結果一致，該等結果表明，mAb 46B8C係血球凝集素柄-結合抗體且因此能夠阻斷B型流感病毒膜融合所需之血球凝集素柄之pH誘導之構象變化。該等結果亦表明，mAb 34B5C可能結合至血球凝集素之首基且藉由阻斷初始受體結合步驟(即在本文所述細胞-細胞融合分析中繞過之步驟)中和B型流感病毒。
實例8. mAb 46B8C對各種B型流感病毒血球凝集素之親和力
如下測定mAb46B8對各種B型流感病毒血球凝集素之親和力。
將結合緩衝液(DMEM，具有2% FBS、50mM HEPES pH 7.2及0.1%疊氮化鈉)中之50μL含有固定濃度之碘化抗-B型流感病毒抗體(mAb 46B8C)及連續稀釋濃度之未經標記之抗-B型流感病毒抗體(mAb 46B8C)之競爭反應混合物放置於96孔板中。以50,000個細胞/0.2ml結合緩衝液之密度向競爭反應混合物中添加瞬時表現各種菌株之B型流感病毒之293細胞。將具有細胞之競爭反應物於室溫下培育2小時。2 小時培育後，將競爭反應物轉移至Millipore Multiscreen過濾板並用結合緩衝液洗滌四次以分離游離抗體與結合碘化抗體。利用Wallac Wizard 1470 γ計數器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences；Wellesley,MA)對過濾器進行計數。使用New Ligand軟體(Genentech)評估結合數據，該軟體使用Munson及Rodbard之擬合算法以測定結合親和力(Munson及Rodbard(1980)Anal Biochem7：2239)。
下表X顯示mAb 46B8C與在293T細胞表面上重組表現之各種B型流感病毒之血球凝集素三聚物之Scatchard結合分析。如下表4中所示，mAb 46B8C展示對各種B型流感病毒血球凝集素之低nM親和力。
實例9. 小鼠中mAb 34B5A針對B/維多利亞/2000及B/威斯康辛/2010之活體內效能
如下實施小鼠中mAb 34B5A對B型流感病毒感染之活體內效能。將DBA/2J小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME)用50μl稀釋於流感培養基(DMEM，0.2% BSA、2μg/mL TPCK處理之胰蛋白酶)中之B型流感病毒菌株B/維多利亞/2000以最小LD100劑量(1×104病毒/小鼠)鼻內感染。使流感病毒感染進行72小時(對於B/維多利亞/2000感染)，之後靜脈內投與mAb 34B5A。
B型流感病毒B/維多利亞/2000感染後72小時後，以15mg/kg、3mg/kg、0.6mg/kg及0.12mg/kg之劑量於200μl PBS中向小鼠靜脈內投 與不同量之mAb 34B5A。向對照處理之動物以mAb 34B5A之最高測試當量劑量(即，約15mg/kg)投與mAb gD5237。每日監測小鼠之身體調節及存活，且亦每日稱重直至感染後21天。
圖6A顯示在感染B型流感病毒B/維多利亞/2000後72小時投與不同量之mAb 34B5A之小鼠的存活%(隨時間，以天表示)。如圖6A中所示，在投與對照抗體之感染小鼠中直至第10天觀察到100%死亡率。然而，投與本發明單株抗體之感染小鼠顯示存活增加。具體而言，在mAb 34B5A之15mg/kg之處理劑量下，在感染B型流感病毒B/維多利亞/2000之小鼠中觀察到100%存活。
實施平行實驗以比較mAb 34B5A與Tamiflu(奧塞米韋)之效能。在病毒感染後72小時開始投與10mg/kg、30mg/kg或100mg/kg BID之Tamiflu。儘管與媒劑對照處理之動物相比，Tamiflu為感染B型流感病毒B/維多利亞/2000之小鼠提供一定保護，但即使於最高投與劑量下亦在第11天觀察到100%死亡率。(參見圖6B)。
該等結果顯示，本發明單株抗體有效治療活體內B型流感病毒感染。另外，該等數據顯示，在B型流感病毒感染後直至至少72小時投與時，本發明單株抗體有效治療活體內B型流感病毒感染。總之，該等結果另外顯示，在病毒感染後72小時投與時，本發明單株抗體展示與Tamiflu相比更好小鼠中活體內效能。
實例10. 小鼠中mAb 34B5C針對B型流感病毒B/威斯康辛/2010之活體內效能
如下實施小鼠中mAb 34B5C對B型流感病毒感染之活體內效能。將DBA/2J小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME)用50μl稀釋於流感培養基(DMEM，0.2% BSA、2μg/mL TPCK處理之胰蛋白酶)中之B型流感病毒菌株B/威斯康辛/2010以最小LD100劑量(1×106病毒/小鼠)鼻內感染。使流感病毒感染進行48小時或72小時，之後靜脈內投與mAb 34B5C。
B型流感病毒B/威斯康辛/2010感染後48小時或72小時，以15mg/kg、5mg/kg及1.7mg/kg之劑量於200μl PBS中向小鼠靜脈內投與不同量之mAb 34B5C。向對照處理之動物以mAb 34B5C之最高測試當量劑量(即，約15mg/kg)投與mAb gD5237。每日監測小鼠之身體調節及存活，且亦每日稱重直至感染後21天。
圖7A及7B分別顯示在感染B型流感病毒B/威斯康辛/2010後48或72小時投與不同量之mAb 34B5C之小鼠的存活%(隨時間，以天表示)。如圖7A及7B中所示，在投與對照抗體之感染小鼠中直至第9天或第10天觀察到100%死亡率。然而，投與mAb 34B5C之感染小鼠顯示存活增加。(參見圖7A及7B)。
該等結果顯示，本發明單株抗體有效治療各種B型流感病毒感染。另外，該等數據指示，在B型流感病毒感染後直至至少72小時投與時，本發明單株抗體有效治療B型流感病毒感染。
實例11. 小鼠中mAb 46B8C針對B型流感病毒B/威斯康辛/2010之活體內效能
為測試小鼠中mAb 46B8C之活體內效能，向感染四種不同B型流感病毒菌株(B/威斯康辛/2010、B/維多利亞/2000、B/俄國/1969及B/麻薩(Mass)/1966)之小鼠i.v.投與抗體。將DBA/2J小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME)用50μl稀釋至流感培養基(DMEM，0.2% BSA、2ug/mL TPCK處理之胰蛋白酶)中之不同B型流感病毒菌株以1×LD100劑量鼻內感染。
在一組實驗中，使用以下B型流感病毒分離物：B/威斯康辛/2010、B/維多利亞/2000、B/俄國/1969及B/麻薩/1966。在感染後24小時、48小時或72小時，以約15mg/kg在200μl PBS中靜脈內投與抗血球凝集素mAb 46B8C。給予對照處理之動物mAb gD5237(15 mg/kg)。監測小鼠之身體調節及存活，且稱重直至感染後21天。
如圖8A及8B中所示，直至第10天及第9天在分別投與B型流感病毒菌株B/威斯康辛/2010及B/維多利亞/2000之小鼠中在對照處理組中觀察到100%死亡率。在感染B/維多利亞/2000或B/麻薩/1966後24小時、48小時或72小時投與15mg/kg之mAb 46B8C之單一劑量產生小鼠之100%存活。(參見圖8B及8D)。在感染B/威斯康辛/2010或B/俄國/1969(以及B/維多利亞/2000或B/麻薩/1966)後24小時或48小時投與15mg/kg之mAb 46B8C之單一劑量產生小鼠之100%存活。(參見圖8A、8B、8C及8D)。
該等結果顯示，mAb 46B8C有效治療活體內B型流感病毒之各種菌株之感染。具體而言，該等結果顯示，在感染後24小時、48小時或72小時投與時，mAb 46B8C有效治療B型流感病毒感染及改良存活。總之，該等結果顯示，即使在感染後直至至少72小時投與時，本發明單株抗體亦有效治療祖先、山形及維多利亞譜系之B型流感病毒分離物。
實例12. 在B型流感病毒感染後72小時投與時小鼠中mAb 46B8C之活體內效能
如下實施小鼠中各種劑量之mAb 46B8C對B型流感病毒感染之活體內效能。將DBA/2J小鼠(Jackson Lab,Bar Harbor,ME)用50μl稀釋於流感培養基(DMEM，0.2% BSA、2μg/mL TPCK處理之胰蛋白酶)中之B型流感病毒菌株B/威斯康辛/2010或B/維多利亞/2000以最小LD100劑量鼻內感染。使流感病毒感染進行72小時，之後靜脈內投與各種劑量之mAb 46B8C。
在B型流感病毒感染後72小時，以45mg/kg、15mg/kg或5mg/kg之劑量在200μl PBS中向小鼠靜脈內投與不同量之mAb 46B8C。向對照處理之動物以約45mg/kg之最高測試當量劑量投與mAb gD5237。 每日監測小鼠之身體調節及存活，且亦每日稱重直至感染後21天。
如圖9A及9B中所示，在B型流感病毒感染後72小時投與45mg/kg或15mg/kg之mAb 46B8C產生分別感染B/威斯康辛/2010或B/維多利亞/2000之小鼠之100%存活。與對照處理之動物相比，即使於5mg/kg之劑量下，mAb 46B8C之投與顯示針對B型流感病毒B/威斯康辛/2010及B/維多利亞/2000之治療性治療效能，如藉由小鼠之存活%所量測。此數據指示，在B型流感病毒感染後至少直至72小時投與時，mAb 46B8C有效治療B型流感病毒感染。
實例13. 小鼠中嚴重B型流感病毒感染中mAb 46B8C及奧塞米韋之活體內效能的比較
為比較小鼠中本發明之抗-B型流感病毒血球凝集素抗體與磷酸奧塞米韋(Tamiflu®)之效能，實施以下研究。將6週齡之Balb/c小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)用50μl B型流感病毒菌株B/維多利亞/2000以4×LD100鼻內感染。感染後48小時，靜脈內投與45mg/kg之單一劑量之抗血球凝集素抗體mAb 46B8C或200μl PBS中之對照IgG。在該等實驗中，將由2mg每日兩次(BID)投與5天組成之奧塞米韋投藥方案與約15mg/kg之單一i.v.劑量之mAb 46B8C進行比較。(奧塞米韋(即，本文所述實例中之任一者中所述之Tamiflu®)係自Toronto Research Chemicals，目錄編號0701000)。
如圖10A中所示，在對照-IgG(mAb gD5237)處理之動物中直至第9天觀察到100%死亡率，且在Tamiflu處理之動物中直至第11天觀察到100%死亡率。然而，單一15mg/kg劑量之mAb 46B8C保護約75%感染動物免受致死B型流感病毒攻擊。另外，經mAb 46B8C處理之動物顯示表示為體重變化%之恢復。(參見圖10B)。
實例14. mAb 46B8C與Tamiflu組合係安全的且降低肺效價
為進一步檢查小鼠中本發明之抗-B型流感病毒血球凝集素抗體 與磷酸奧塞米韋(Tamiflu®)之用途及效能，實施以下研究。將6週齡之Balb/c小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)用50μl B型流感病毒菌株B/維多利亞/2000以1×LD100鼻內感染。感染後48小時，靜脈內投與15mg/kg之單一劑量之抗血球凝集素抗體mAb 46B8C或200μl PBS中之對照IgG。在該等實驗中，將由2mg每日兩次(BID)投與5天組成之奧塞米韋投藥方案(100mg/kg)與約15mg/kg之單一i.v.劑量之mAb 46B8C進行比較。亦實施組合治療。
如圖11A中所示，直至第11天在對照-IgG(mAb gD5237)處理之動物中觀察到100%死亡率。然而，單一15mg/kg劑量之mAb 46B8C在單獨或與Tamiflu組合投與時產生小鼠之100%存活。另外，用mAb 46B8C與Tamiflu之組合治療動物在此活體內B型流感病毒感染模型中係安全且有效的。
如圖11B中所示，單獨或與Tamiflu組合投與mAb 46B8C顯示與對照處理動物或僅經Tamiflu處理之動物中觀察者相比，B型流感病毒肺效價降低。
該等結果指示，本發明單株抗體在與神經胺酸酶抑制劑(例如，奧塞米韋)組合使用時係安全且有效的。
實例15. 小鼠中嚴重B型流感病毒感染模型中mAb 46B8C與奧塞米韋之協同作用
為進一步檢查小鼠中共投與本發明之抗-B型流感病毒血球凝集素抗體與磷酸奧塞米韋(Tamiflu®)之效能，實施以下研究。將6週齡之Balb/c小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)用50μl B型流感病毒菌株B/維多利亞/2000以4×LD100鼻內感染。感染後48小時，靜脈內投與15mg/kg或5mg/kg之單一劑量之抗血球凝集素抗體mAb 46B8C或200μl PBS中之對照IgG。在該等實驗中，將由2mg每日兩次(BID)投與5天組成之奧塞米韋投藥方案與約15mg/kg之單一i.v.劑量之 mAb 46B8C進行比較。在該等實驗中，奧塞米韋投藥方案由2mg每日兩次(BID)投與5天組成(100mg/kg)。將動物用對照抗體、單獨mAb 46B8C、單獨奧塞米韋或mAb 46B8C與奧塞米韋之組合治療。
如圖12A及12B中所示，投與對照抗體或僅Tamiflu之動物直至第9或10天顯示100%死亡率。另外，在此嚴重B型流感病毒感染模型中，投與5mg/kg之mAb 46B8C之動物直至第9天顯示100%死亡率。然而，5mg/kg或15mg/kg之劑量下之mAb 46B8C與Tamiflu之組合治療顯示存活增加。
該等結果指示，一起使用本發明抗體與奧塞米韋之組合治療與單一治療相比在治療結果中提供一定程度之協同作用。
實例16. 競爭ELISA
使用血球凝集素B型流感病毒(例如，B/維多利亞/2000、B/威斯康辛/2010等)研發競爭ELISA分析。使血球凝集素塗佈之ELISA板以不同濃度(X軸)結合測試抗體，之後添加飽和濃度之生物素標記之本發明單株抗體(例如，mAb 48B8C等)。若測試抗體競爭本發明單株抗體之B型流感病毒血球凝集素表位，則生物素ELISA信號(Y軸)隨增加測試抗體濃度之變化而減少。將結合數據與非線性劑量反應曲線擬合以測定以nM給出之EC50值。
根據製造商之推薦方案(Sulfo-NHS-LC-LC,Pierce,Rockford,IL)經由胺偶合生物素化本發明單株抗體。生物素化mAb之最終儲存液濃度係(例如)13.2mM。為測定最佳使用濃度，針對B型流感病毒之固定血球凝集素連續滴定生物素化mAb。將重組血球凝集素蛋白在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中稀釋至2μg/ml並分配(100μl)至96孔Nunc Maxisorp板(Nunc,Rochester,NY)上。將板於4℃下塗佈過夜，在PBS中沖洗，且隨後於室溫下用含有1%牛血清白蛋白之PBS阻斷1小時(BSA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。
隨後每一板接受100μl連續稀釋之生物素化mAb，該連續稀釋之生物素化mAb以88nM之初始濃度開始且在含有1.0% BSA及0.05%聚山梨醇酯20之PBS(Sigma-Aldrich)中1/3稀釋。1小時培育後，將板洗滌且隨後與100μl鏈黴抗生物素蛋白偶聯辣根過氧化酶(Caltag Laboratories,Carlsbad,CA)之1：5000稀釋物於室溫下一起培育30分鐘。培育後，將板洗滌且用100μl TMB受質(Kirkegaard and Perry Laboratories公司，Gaithersburg,MD)顯影。利用SpectraMax板讀數器(Molecular Devices,Sunnyvale,CA.)於O.D.450nM下讀數。生物素化mAb之最佳濃度經測定為(例如)1nM。
實例17. 小鼠中mAb 46B8C針對B型流感病毒B/布里斯班/2008之活體內效能
為測試小鼠中mAb 46B8C針對B型流感病毒B/布里斯班/2008(一種維多利亞譜系之B型流感病毒)(Viapur,LLC,San Diego,CA)之活體內效能，實施以下研究。將DBA/2J小鼠用最小1×LD100劑量(1×104 PFU/小鼠)之B型流感病毒B/布里斯班/2008鼻內感染。在感染後24小時、48小時及72小時，在0.1mL PBS中以15mg/kg向8隻雌性小鼠/組靜脈內投與mAb 46B8C。監測小鼠之存活，且稱重直至感染後21天。作為對照，感染後72小時，將一組經感染小鼠用15mg/kg之人類IgG1抗體抗gD處理(小鼠中無已知靶標)。
如圖26A中所示，在投與B型流感病毒B/布里斯班/2008之小鼠中直至第11天在對照處理組中觀察到100%死亡率。在感染B型流感病毒B/布里斯班/2008後24小時、48小時或72小時投與15mg/kg之單一劑量之mAb 46B8C產生小鼠之100%存活。(參見圖26A)。圖26B顯示在上述各種條件及處理下小鼠之體重變化。
該等結果顯示，mAb 46B8C有效治療維多利亞譜系之B型流感病毒B/布里斯班/2008感染。
統計學分析
使用JMP 9.0.2版軟體(SAS Institute)計算統計學。使用對數秩測試比較存活實驗。P值<0.05認為顯著。使用Graphpad Prism 5.0版軟體繪示並計算IC50曲線及值。
儘管已出於理解清楚之目的藉由闡釋及實例相當詳細地對上述發明進行闡述，但說明及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容皆全文以引用方式明確併入本文中。
<110> 美商建南德克公司等人
<120> 抗-B型流感病毒血球凝集素抗體及其使用方法
<130> P05794R1-WO
<140>
<141>
<150> 61/971,123
<151> 2014-03-27
<160> 108
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 1
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 2
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 3
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 4
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 5
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 6
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 7
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 8
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 9
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 10
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 11
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 12
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 13
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 14
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 15
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 16
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 17
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 18
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 19
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 20
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 21
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 23
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 24
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 25
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 26
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 27
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成寡核苷酸」
<400> 28
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 29
<210> 30
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 30
<210> 31
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 31
<210> 32
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 32
<210> 33
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 33
<210> 34
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 34
<210> 35
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多核苷酸」
<400> 35
<210> 36
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 36
<210> 37
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 37
<210> 38
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 38
<210> 39
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 39
<210> 40
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多核苷酸」
<400> 40
<210> 41
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多核苷酸」
<400> 41
<210> 42
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 42
<210> 43
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 43
<210> 44
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 44
<210> 45
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 45
<210> 46
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 46
<210> 47
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 47
<210> 48
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 48
<210> 49
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 49
<210> 50
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 50
<210> 51
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 51
<210> 52
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 52
<210> 53
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 53
<210> 54
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成引子」
<400> 54
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 55
<210> 56
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 56
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 57
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 58
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 60
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 61
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 62
<210> 63
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 63
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 65
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 66
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 67
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 68
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 69
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 71
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 72
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 73
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 74
<210> 75
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 75
<210> 76
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 76
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成肽」
<400> 77
<210> 78
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 78
<210> 79
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 79
<210> 80
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 80
<210> 81
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 81
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 82
<210> 83
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 83
<210> 84
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 84
<210> 85
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 85
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 86
<210> 87
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 87
<210> 88
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 88
<210> 89
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 89
<210> 90
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 90
<210> 91
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 91
<210> 92
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 92
<210> 93
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 93
<210> 94
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 94
<210> 95
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 95
<210> 96
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 96
<210> 97
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 97
<210> 98
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 98
<210> 99
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 99
<210> 100
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 100
<210> 101
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 101
<210> 102
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 102
<210> 103
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 103
<210> 104
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 104
<210> 105
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 105
<210> 106
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 106
<210> 107
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 107
<210> 108
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> source
<223> /註=「人工序列之說明：合成多肽」
<400> 108

Claims (30)

  1. 一種經分離之特異性結合B型流感病毒血球凝集素之抗血球凝集素單株抗體，其包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)及三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：63；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：67、68、69、70、71、72、73及74組成之群之胺基酸序列；(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：77；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：56；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：58；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：60。
  2. 如請求項1之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：91之輕鏈可變區。
  3. 如請求項1之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含選自由SEQ ID NO：92、95、97、99、101、103、105及107組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區。
  4. 如請求項1之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO：91，且該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：92、95、97、99、101、103、105及107組成之群之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：93之輕鏈。
  6. 如請求項1之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含選自由SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、106及108組成之群之胺基酸序列的重鏈。
  7. 如請求項1之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：93，且該重鏈包含選自由SEQ ID NO：94、96、98、100、102、104、106及108組成之群之胺基酸序列。
  8. 一種經分離之特異性結合B型流感病毒血球凝集素之抗血球凝集素單株抗體，其包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)及三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：61；(b)HVR-H2包含選自由SEQ ID NO：64及65組成之群之胺基酸序列；(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：75；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
  9. 如請求項8之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含選自由SEQ ID NO：78、82及86組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  10. 如請求項8之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含選自由SEQ ID NO：79及83組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區。
  11. 如請求項8之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：78、82及86組成之群之胺基酸序列，且該重鏈可變區包含選自由SEQ ID NO：79及83組成之群之胺基酸序列。
  12. 如請求項8之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含選自由SEQ ID NO：80、84及87組成之群之胺基酸序列的輕 鏈。
  13. 如請求項8之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含選自由SEQ ID NO：81、85及88組成之群之胺基酸序列的重鏈。
  14. 如請求項8之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含選自由SEQ ID NO：80、84及87組成之群之胺基酸序列，且該重鏈包含選自由SEQ ID NO：81、85及88組成之群之胺基酸序列。
  15. 一種經分離之特異性結合B型流感病毒血球凝集素之抗血球凝集素單株抗體，其包含三個重鏈超變區(HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3)及三個輕鏈超變區(HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3)，其中：(a)HVR-H1包含胺基酸序列SEQ ID NO：62；(b)HVR-H2包含胺基酸序列SEQ ID NO：66；(c)HVR-H3包含胺基酸序列SEQ ID NO：76；(d)HVR-L1包含胺基酸序列SEQ ID NO：55；(e)HVR-L2包含胺基酸序列SEQ ID NO：57；且(f)HVR-L3包含胺基酸序列SEQ ID NO：59。
  16. 如請求項15之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：78之輕鏈可變區。
  17. 如請求項15之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：89之重鏈可變區。
  18. 如請求項15之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO：78，且該重鏈可變區包含胺基酸序列SEQ ID NO：89。
  19. 如請求項15之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包 含包含胺基酸序列SEQ ID NO：80之輕鏈。
  20. 如請求項15之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含包含胺基酸序列SEQ ID NO：90之重鏈。
  21. 如請求項15之經分離之抗血球凝集素單株抗體，其中該抗體包含輕鏈及重鏈，其中該輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：80，且該重鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：90。
  22. 一種如請求項1至21中任一項之抗體之用途，其用於製造藥劑。
  23. 如請求項22之用途，其中該藥劑用於治療、抑制或預防B型流感病毒感染。
  24. 如請求項22之用途，其中該藥劑進一步包含額外治療劑或欲與該額外治療劑一起投與。
  25. 如請求項24之用途，其中該額外治療劑係神經胺酸酶抑制劑、抗血球凝集素抗體或抗M2抗體。
  26. 一種組合物，其包含如請求項1至21中任一項之抗體。
  27. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至21中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
  28. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至21中任一項之抗體。
  29. 一種宿主細胞，其包含如請求項28之核酸。
  30. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項29之宿主細胞，使得產生該抗體。
TW104109843A 2014-03-27 2015-03-26 抗－ｂ型流感病毒血球凝集素抗體及其使用方法 TW201620932A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461971123P 2014-03-27 2014-03-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201620932A true TW201620932A (zh) 2016-06-16

Family

ID=52829396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104109843A TW201620932A (zh) 2014-03-27 2015-03-26 抗－ｂ型流感病毒血球凝集素抗體及其使用方法

Country Status (20)

Country Link
US (2) US9745365B2 (zh)
EP (1) EP3122771A1 (zh)
JP (1) JP2017512471A (zh)
KR (1) KR20160135830A (zh)
CN (1) CN106132987A (zh)
AR (1) AR099855A1 (zh)
AU (1) AU2015235983A1 (zh)
BR (1) BR112016022113A2 (zh)
CA (1) CA2942820A1 (zh)
CL (2) CL2016002413A1 (zh)
CR (1) CR20160502A (zh)
EA (1) EA201691945A1 (zh)
IL (1) IL247870A0 (zh)
MA (1) MA39803A (zh)
MX (1) MX2016012530A (zh)
PE (1) PE20161376A1 (zh)
PH (1) PH12016501873A1 (zh)
SG (1) SG11201607945UA (zh)
TW (1) TW201620932A (zh)
WO (1) WO2015148806A1 (zh)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL314040A (en) 2016-05-10 2024-09-01 Genentech Inc Methods of decreasing trisulfide bonds during recombinant production of polypeptides
KR102699853B1 (ko) 2017-12-22 2024-08-30 제넨테크, 인크. 핵산의 표적화된 통합
SG11202006379UA (en) 2018-01-26 2020-07-29 Regeneron Pharma Human antibodies to influenza hemagglutinin
EP3775184A1 (en) 2018-03-29 2021-02-17 F. Hoffmann-La Roche AG Modulating lactogenic activity in mammalian cells
EP3980544A1 (en) 2018-12-21 2022-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Targeted integration of nucleic acids
RU2714246C1 (ru) * 2018-12-28 2020-02-13 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт гриппа имени А.А. Смородинцева" Министерства здравоохранения Российской Федерации Моноклональные антитела, специфичные к различным штаммам вируса гриппа в
WO2021086899A1 (en) * 2019-10-28 2021-05-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use thereof
BR112022014278A2 (pt) * 2020-01-24 2022-09-20 Regeneron Pharma Conjugados de composto proteico-antiviral
JP2023518841A (ja) 2020-03-26 2023-05-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド 宿主細胞タンパク質が減少した修飾哺乳動物細胞
US20210403943A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Genentech, Inc. Targeted integration of nucleic acids
US20220041672A1 (en) 2020-06-24 2022-02-10 Genentech, Inc. Apoptosis resistant cell lines
KR20230056766A (ko) 2020-08-28 2023-04-27 제넨테크, 인크. 숙주 세포 단백질의 CRISPR/Cas9 다중 녹아웃
CN114316032B (zh) * 2020-09-27 2022-12-27 东莞市朋志生物科技有限公司 抗乙型流感病毒的抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒
TW202305122A (zh) 2021-04-19 2023-02-01 美商建南德克公司 經修飾之哺乳動物細胞
WO2022246259A1 (en) 2021-05-21 2022-11-24 Genentech, Inc. Modified cells for the production of a recombinant product of interest
CN120202213A (zh) 2022-11-14 2025-06-24 扬森疫苗与预防有限公司 乙型流感病毒疫苗及其用途
KR20250107893A (ko) 2022-11-15 2025-07-14 제넨테크, 인크. 숙주 세포로의 트랜스포존 매개 통합 및 핵산의 표적 통합의 조합
US20240240175A1 (en) 2023-01-12 2024-07-18 Genentech, Inc. Combinatorial vector cloning and transfection strategies for targeted integration of nucleic acids
US12319747B2 (en) 2023-07-03 2025-06-03 Medicovestor, Inc. Methods of using anti-SP17 immunotherapeutics
US20250011420A1 (en) * 2023-07-03 2025-01-09 Medicovestor, Inc. Proteins that bind sp17 including fully-human anti-sp17 antibodies
US12364777B2 (en) 2023-10-20 2025-07-22 Medicovestor, Inc. Homodimeric antibodies for use in treating cancers and methods of use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2921928B1 (fr) 2007-10-08 2011-03-04 Sanofi Pasteur Anticorps monoclonaux specifiques de l'hemagglutinine du virus grippal
BE1018561A3 (fr) 2008-12-24 2011-03-01 Galactic Sa Procede de purification de l'acide lactique par cristallisation.
CN102264896B (zh) 2008-12-25 2014-02-26 国立大学法人大阪大学 抗人流感病毒人型抗体
BR112014000263B1 (pt) 2011-07-14 2022-01-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Anticorpo isolado capaz de se ligar especificamente à proteína hemaglutinina (ha) dos subtipos de vírus influenza b, e, composição farmacêutica que o compreende
EP2814841A4 (en) * 2012-01-31 2015-06-17 Univ Osaka HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES FOR WIDE PROTECTION AGAINST INFLUENZA B VIRUS AND METHOD OF USE THEREOF
EP2822968B1 (en) 2012-03-08 2018-01-10 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Human binding molecules capable of binding to and neutralizing influenza b viruses and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
PH12016501873A1 (en) 2017-01-09
CL2016002413A1 (es) 2017-06-23
KR20160135830A (ko) 2016-11-28
EA201691945A1 (ru) 2017-02-28
US20150274812A1 (en) 2015-10-01
MX2016012530A (es) 2017-01-05
AR099855A1 (es) 2016-08-24
AU2015235983A1 (en) 2016-10-06
IL247870A0 (en) 2016-11-30
CL2018002874A1 (es) 2018-12-14
CR20160502A (es) 2017-02-03
EP3122771A1 (en) 2017-02-01
JP2017512471A (ja) 2017-05-25
US20170320937A1 (en) 2017-11-09
BR112016022113A2 (pt) 2017-10-31
MA39803A (fr) 2017-02-01
PE20161376A1 (es) 2016-12-26
CN106132987A (zh) 2016-11-16
US9745365B2 (en) 2017-08-29
SG11201607945UA (en) 2016-10-28
CA2942820A1 (en) 2015-10-01
WO2015148806A1 (en) 2015-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9745365B2 (en) Anti-influenza B virus hemagglutinin antibodies and methods of use
CN104968367B (zh) 抗血凝素抗体和使用方法
US9879066B2 (en) Influenza A H7N9 virus therapies
HK1250723A1 (zh) 人源化抗埃博拉病毒糖蛋白抗體和使用方法
HK1231087A1 (zh) 抗乙型流感病毒血凝素抗體和使用方法
HK1228424A1 (zh) 抗h7病毒抗体治疗h7n9流感
HK1215856B (zh) 抗血凝素抗体和使用方法