TW201512221A

TW201512221A - 抗體

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Publication number: TW201512221A
Application number: TW103126815A
Authority: TW
Inventors: Graham Craggs; Karine Jeannine Madeleine Herve; Diane Marshall
Original assignee: Ucb Biopharma Sprl
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2015-04-01
Also published as: ES2733735T3; US20160200821A1; EP3549599B1; AU2014314304A1; KR102303130B1; TR201909478T4; DK3549599T5; HUE045672T2; IL244043A0; SMT202300409T1; HRP20231264T1; RS59019B1; CN112321711A; US9908939B2; SI3038643T1; AR097464A1; EP4282881A2; CY1121964T1; PE20201067A1; EP4282881A3

Abstract

本發明係關於抗-CSF-1R抗體及其結合片段、編碼其之DNA、包含該DNA之宿主細胞及於宿主細胞中表現該抗體或結合片段之方法。本發明亦關於包含該抗體或其結合片段之醫藥組合物及一種以該抗體、結合片段及包含其之組合物於治療中之用途。

Description

抗體

本發明係關於一種抗-CSF-1R抗體及其結合片段、編碼其之DNA、包含該DNA之宿主細胞及於宿主細胞中表現該抗體或結合片段之方法。本發明亦關於包含該抗體或其結合片段之醫藥組合物及一種該抗體、結合片段及包含其之組合物於治療之用途。

群落刺激因子1(CSF-1)(亦稱為巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF))為由多種細胞(包括巨噬細胞、內皮細胞及纖維母細胞)產生之細胞激素。CSF-1係由形成生物活性二聚CSF-1蛋白之兩個「單體」多肽所構成。CSF-1係呈因替代性RNA剪接而存在至少三種成熟形式(參見Cerretti等人，1988，Molecular Immunology，25：761)。這三種CSF-1形式係轉譯自不同mRNA前驅物，該等mRNA前驅物編碼在胺基端具有32個胺基酸信號序列及在羧基端附近具有約23個胺基酸之推想跨膜區之256至554個胺基酸的多肽單體。該等前驅肽於隨後藉由胺基末端及羧基末端解蛋白裂解處理以釋放成熟CSF-1。CSF-1之所有三種成熟形式之殘基1-149係相同且據信包含達成CSF-1生物活性所需之序列。在活體內，CSF-1單體經糖基化並經由二硫鍵二聚化。CSF-1係屬於促使產生血液細胞之生物促效劑群組。明確言之，其作為單核吞噬細胞系之骨髓祖細胞之生長及分化因子。此外，CSF-1經由於反應細胞上之特異性受體來刺激巨噬細胞之存活、增生及功能。

CSF-1受體(CSF-1R)亦稱為c-fms基因產物或CD115。CSF-1R為屬於III型受體酪胺酸激酶家族之165kDa 1型TM糖蛋白。除了CSF-1之外，亦顯示結構上類似但序列不相關聯之分子IL-34為CSF-1R之配體(Lin等人，2008，Science 320：807-811)。CSF-1R之表現受限於單核細胞-巨噬細胞系(循環及常駐組織群體)細胞及破骨細胞。此外，其於女性生殖系統之許多種細胞(包括卵母細胞、蛻膜細胞及滋養細胞)中得以表現。

配體CSF-1與CSF-1受體結合會導致該受體之一或多個酪胺酸殘基之磷酸化(藉由酪胺酸激酶域作用)。可能會偵測到該磷酸化，此乃因抗體僅可於磷酸化之後用於與受體結合(例如，磷酸-M-CSF-受體(Tyr546)抗體#3083，來自Cell Signaling Technology)。

CSF-1及CSF-1R之表現與許多癌症類型中之腫瘤進展及不良診斷相關聯。與腫瘤相關聯之巨噬細胞(TAM)可為腫瘤基質之主要組分及CSF-1及CSF-1R之高水平與許多腫瘤類型中之高TAM浸潤及不良預後相關聯。

相關技藝中已知針對於CSF-1R之抗體。Sherr,C.J.等人，1989，Blood 73：1786-1793描述抑制CSF-1活性之抗CSF-1R抗體(Sherr,C.J.等人，1989，Blood 73：1786-1793)。WO2009/026303揭示與人類CSF-1R結合之抗-CSF-1R抗體及使用抗鼠科CSF-1R抗體之活體內小鼠腫瘤模型。WO2011/123381揭示使CSF-1R內化且具有ADCC活性之抗-CSF-1R抗體。WO2011/123381亦揭示使用抗鼠科CSF-1R抗體之活體內小鼠腫瘤模型。WO2011/140249揭示阻斷CSF-1與CSF-1R結合且經陳述適用於治療癌症之抗-CSF-1R抗體。WO2009/112245揭示抑制CSF-1與CSF-1R結合且經陳述適用於治療癌症、發炎性腸病及類風濕關節炎之抗-CSF-1R IgG1抗體。WO2011/131407揭示抑制CSF-1與CSF-1R結合且經陳述適用於治療骨損失及癌症之抗-CSF-1R抗體。WO2011/107553揭示抑制CSF-1與CSF-1R結合之抗-CSF-1R抗體，其被認為適用於治療骨損失及癌症。WO2011/070024揭示與人類CSF-1R片段delD4結合之抗-CSF-1R抗體。

於本技藝中需要提供適用於治療應用之新穎抗-CSF-1R抗體。雖然先前已描述抗-CSF-1R抗體於治療特定癌症之治療應用，但仍舊需要提供基於該等抗體之新穎治療應用。

術語「纖維變性疾病」係指過量纖維結締組織形成於器官或組織中之異常傷口癒合反應。過量細胞外基質組分(諸如膠原及纖維結合素)之沉積及累積致使組織硬化及組織瘢痕而最終會導致器官衰竭。

纖維變性疾病之實例包括肺纖維化(諸如特發性肺纖維化及囊性纖維化)、腎纖維化、肝纖維化、肝硬化、原發性硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化、心內膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維變性、腹膜後腔纖維化、進行性大塊纖維化、腎因性全身纖維化、克羅恩氏病、瘢痕疙瘩、心肌梗塞、全身性硬化症、硬皮病及關節纖維化。

傷口隨著臨時細胞外基質(ECM)之發展導致立刻凝固及凝結反應。血小板之聚集及活化有助於促進特徵為血管擴張及血管通透性增強而容許各種免疫細胞(包括嗜中性粒細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞及淋巴細胞)募集之發炎反應。嗜中性粒細胞及巨噬細胞會清除傷口，因而降低感染之風險並與經活化淋巴細胞一起分泌多種可用來進一步增強發炎反應之生長因子及細胞激素。諸如TGFβ、PDGF、IL-13之分子激活巨噬細胞並導致纖維母細胞在傷口部位募集、增生及活化。經活化之纖維母細胞或肌纖維母細胞係以α-平滑肌肌動蛋白之表現為特徵並分泌膠原及其他ECM組分。經活化之纖維母細胞使膠原晶格收縮而將傷口邊緣牽拉至中心。上皮及內皮細胞增殖並遷移於暫時性基質上以使受損傷組織再生而完成傷口修補。

持續性組織損害或損傷或修補路徑之功能失調會導致不適傷口反應。膠原及ECM之過量沉積及高交聯之發生導致瘢痕組織替代正常組織結構過度形成及硬化。

纖維變性疾病之病因可係取決於所涉及之器官或組織及在諸如特發性肺纖維化(IPF)之一些疾病中尚屬未知。肝纖維化並最終肝硬化係由持續暴露於多種因素(包括環境及膳食因素或感染因子)之慢性肝損傷所導致。長期性肝炎B及C感染會導致肝纖維化。持續過度攝取酒精或高脂/糖飲食亦會導致肝硬化。類似地，糖尿病會損傷腎臟及使腎臟結疤而導致功能之損失。

IPF為病因尚屬未知的七種間質肺部疾病之一。諸如輻射暴露或粒子之環境因素可能發揮一定作用。吸煙的個體亦具有較高風險罹患該疾病。於診斷後，患者之壽命極短，平均存活率為2至5年。

纖維變性疾病之治療通常包括抗發炎劑及免疫抑制劑，但該等藥物對患者益處很小。一般而言，此等治療之藥效缺乏導致重新視IPF及纖維變性疾病為對傷口癒合之異常反應而非發炎性病症。哌非尼酮(Pirfenidone)為已於2008年在日本及於2011年在歐洲核准用於治療IPF之小分子藥物，其極有可能係藉由多種作用機制起作用。迄今，尚無標靶療法及抗體療法核准用於纖維變性適應症。

因此，目前尚有對纖維變性疾病之改良治療之醫療需求。例如，就IPF而言，3年存活率為50%及5年存活率僅為20%及在約20%的病例中需要移植。

於一個態樣中，提供一種包含重鏈之抗-CSF-1R抗體或其結合片段，其中該重鏈之可變域包含具有針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4表示之序列之CDR、具有針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5表示之序列之CDR及具有針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之序列之CDR中至少一者，例如，其中CDR-H1為SEQ ID NO：4，CDR-H2為SEQ ID NO：5及CDR-H3為SEQ ID NO：6。

於一個態樣中，根據本發明之抗體或結合片段包含輕鏈，其中該輕鏈之可變域包含具有針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列之CDR、具有針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之序列之CDR及具有針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列之CDR中至少一者，例如，其中CDR-L1為SEQ ID NO：1，CDR-L2為SEQ ID NO：2及CDR-L3為SEQ ID NO：3。

本發明之抗體對CSF-1R具有高親和力、可阻斷配體對CSF-1R之結合、對CSF-1R不具活性及不會致使CSF-1R內化。

本發明亦關於可編碼如本文所述抗體或片段之多核苷酸(諸如DNA)。

亦提供一種包含該多核苷酸之宿主細胞。

本文亦提供表現抗體或其結合片段之方法。

本發明亦關於包含該等抗體或其結合片段之醫藥組合物。

於一個實施例中，提供一種治療方法，該方法包括投與治療有效量之如本文所述抗體、片段或組合物。

本發明亦關於將本發明之抗體、結合片段或組合物用於治療，特定言之係用於治療癌症及/或纖維變性疾病。

於一個實施例中，由本發明提供之抗體可阻斷配體與CSF-1R結合。如本文中所用，阻斷係指物理阻斷，諸如封閉受體，但亦包括抗體或片段與抗原決定基結合導致(例如)構形改變，此意味著天然配體無法再與受體結合(於本文中稱為異位阻斷或異位抑制)。於一個實施例中，本發明之抗體可與CSF-1R之所有同型物結合，例如，於ECD域中具有改變之其等，諸如V23G、A245S、H247P、V279M及兩種、三種或四種該等變化之組合。

本文實例描述適用於確定抗體阻斷CSF-1R之能力之分析法。 CSF-1及IL-34為CSF-1R的兩種配體及本發明之抗體較佳抑制CSF-1及IL-34二者在功能性細胞篩選中之活性。本發明之抗體亦較佳不導致CSF-1R活化及/或CSF-1R內化。本發明之抗體亦較佳選擇性耗乏活體內非典型單核細胞群體。

非典型單核細胞一般係指具有低CD14表現及高CD16表現之單核細胞。此單核細胞群體被認為是與腫瘤相關聯之巨噬細胞之前驅物。

本發明之抗體分子適宜地具有高結合親和力。如本文實例中所述，可利用相關技藝中已知的任何適宜方法(包括諸如表面電漿子共振(例如BIAcore)之技術)，使用單離的天然或重組CSF-1R或適宜融合蛋白質/多肽來測量親和力。於一個實例中，如本文實例中所述，使用重組人類CSF-1R胞外域來測量親和力。於一個實例中，使用的重組人類CSF-1R胞外域為單體。適宜地，本發明之抗體分子針對於單離的人類CSF-1R具有約1nM或小於1nM之結合親和力。於一個實施例中，本發明之抗體分子具有約500pM或更小之結合親和力。於一個實施例中，本發明之抗體分子具有約250pM或更小之結合親和力。於一個實施例中，本發明之抗體分子具有約200pM或更小之結合親和力。於一個實施例中，本發明提供一種具有約100pM或更小結合親和力之抗-CSF-1R抗體。於一個實施例中，本發明提供一種具有約100pM或更小(較佳約10pM或更小，更佳約5pM或更小)結合親和力之人源化抗-CSF-1R抗體。於另一個實施例中，本發明提供一種具有約100pM或更小(較佳約10pM或更小，更佳約5pM或更小)結合親和力之人源化抗-CSF-1R抗體。

親和力之數字數值越小，抗體或片段對抗原之親和力越大。

如本文中使用，人類CSF-1R係指人類蛋白質名稱CSF-1R或其生物活性片段，例如，如以SEQ ID NO：39所表示或於UniProt中以編號P07333所表示。當然，經表現之成熟蛋白質不包含信號序列，此乃因信號序列於轉譯後裂解。

本發明者已提供新穎抗-CSF-1R抗體，包括人源化抗體。自大鼠纖維母細胞經表現CSF-1R胞外域之載體轉染之大鼠之免疫作用來產生該等抗體。上清液之基於人類CSF-1R與抗體結合之初級篩選鑑別出約1000個包含具有抗-CSF-1R活性之抗體之孔。基於抗體可防止人類CSF-1與人類CSF-1R結合之次級篩選鑑別出88個陽性孔。基於抗體可防止初代人類單核細胞之CSF-1相關存活率之三次篩選鑑別出18個陽性孔。該等18個陽性孔之可變區經過選殖，此會導致成功地選殖14種抗體，及接續之表現可提供9種足夠程度地表現且可抑制CSF-1結合的嵌合抗-CSF-1R抗體。該等9種抗體係經定序且發現均具有獨特序列及係用於進一步研究。

評定該等9種抗-CSF-1R嵌合抗體之配體阻斷活性及抑制CSF-1及IL-34介導之單核細胞存活率之能力。其中四種抗體先用於進一步研究，此乃因其證實CSF-1結合之完全抑制及高程度之單核細胞存活之抑制。於諸多活體外分析法中測試該等4種抗-CSF-1R嵌合抗體之活性以評定親和力、CSF-1結合之抑制、與恆河猴(rhesus monkey)、馬來猴及犬科CSF-1R之交叉反應性、CSF-1R內化及CSF-1R活化。該等四種抗-CSF-1R抗體亦經過人源化及測量該等人源化移植物之親和力。兩種該等抗-CSF-1R抗體之人源化產生具有與親本嵌合抗體相當的親和力(K_D)及指示抗體具有適宜熱穩定性之Tm之完全人源化抗體(不存在大鼠供者殘基)。相對地，其他兩種人源化抗-CSF-1R抗體相對嵌合抗體而言具有對CSF-1R之低親和力，且Tm更小。基於此等原因，只有兩種該等抗體之保留親和力之完全人源化移植物以較大規模地表現來達成進一步的分析。

進行該等兩種抗體之完全人源化移植物之進一步分析及MCP-1抑制分析，其中藉由可阻斷CSF-1結合之抗體抑制CSF-1R信號傳導致使MCP-1分泌量減少。該種分析驚人地顯示完全人源化移植物展現相較嵌合抗體減低之活性。進行基於一種較佳抗體(稱之為Ab969)之一系列實驗以顯示完全人源化移植物為何會展現該種減低之活性。獲得Ab969之許多種中間人源化移植物及於MCP-1抑制分析中進行測試。咸發現包含可變輕鏈供者殘基Y71之移植物在MCP-1抑制分析中大致上顯示與嵌合Ab969相當的活性。假設MCP-1抑制分析中各種抗體移植物之該種活性差異係歸因於抗體結合速率(低K_a)相較於嵌合Ab969改變所致。

Ab969與其他抗-CSF-1R抗體(例如抗-CSF-1R抗體Ab970)之間之熱穩定性分析比較顯示Ab969可能更為穩定。

Ab969之人源化移植物之進一步的生物物理分析顯示部分移植物於濃縮抗體時沉澱。證實輕鏈中位置38處之離胺酸殘基之代換(例如麩醯胺酸)會導致經改良之物理穩定性。

因此，選擇Ab969之一種抗體移植物Ab969.g2(亦稱為Ab969)以進行進一步的活體外表徵研究。除了有利的高CSF-1R結合親和力、高熱穩定性及高物理穩定性之外，該抗體亦展現IL-34相關單核細胞活化之良好抑制及亦發現可與CSF-1R之SNP變體結合。Ab969.g2亦用於馬來猴中之藥效動力學標記分析，其中顯示Ab969.g2可與CSF-1R結合、可阻斷CSF-1結合及選擇性地耗乏為腫瘤相關巨噬細胞之前驅細胞之活體內非典型馬來猴單核細胞群體。

因此，於一個實施例中，本發明提供一種包含重鏈及/或輕鏈之抗體，其中該重鏈及/或輕鏈包含至少一個衍生自抗-CSF-1R抗體969.2之CDR。

Ab969.2為全長人源化IgG4分子；該輕鏈包含人類κ鏈恆定區 (Km3異型)及該重鏈包含具有絞鏈穩定突變S241P(Angal等人，1993)之人類γ-4重鏈恆定區。可能的DG異構化基序存在於該輕鏈可變區中的CDR-L2與架構接面處。Ab969.2完全抗體重鏈及輕鏈之序列以SEQ ID NO：27及19表示。

於抗體可變域中之殘基習知係依照Kabat等人，1987所設計的系統編號。該種系統述於Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，美國衛生與人類服務部(US Department of Health and Human Services)，NIH，美國(後文中「Kabat等人(如前述)」)中。除非另作指明，否則本說明書中使用該種編號系統。

Kabat殘基表示法並不始終直接與胺基酸殘基之線性編號相對應。實際線性胺基酸序列可包含相較在嚴格Kabat編號中更少或增加的胺基酸，此對應於基礎可變域結構之結構組分(不論架構或互補決定區域(CDR))之縮短或插入。可針對特定抗體藉由抗體序列中具同源性之殘基與「標準」經Kabat編號的序列之間之比對來確定正確的殘基Kabat編號。

根據Kabat編號系統，重鏈可變域之CDR位於殘基31-35(CDR-H1)、殘基50-65(CDR-H2)及殘基95-102(CDR-H3)之處。然而，根據Chothia(Chothia,C.與Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901-917(1987))，與CDR-H1相當的環路自殘基26延伸至殘基32。因此，除非另作指明，否則「CDR-H1」如本文中使用意指殘基26至35，如藉由Kabat編號系統及Chothia拓撲環路定義之組合所述。

根據Kabat編號系統，輕鏈可變域之CDR位於殘基24-34(CDR-L1)、殘基50-56(CDR-L2)及殘基89-97(CDR-L3)之處。

用於本發明中之抗體可使用相關技藝中已知的任何適宜方法來獲得。CSF-1R多肽/蛋白質(包括融合蛋白質)、(重組或自然)表現該多肽之細胞可用於產生特異性識別CSF-1R之抗體。該多肽可為「成熟」多肽或其生物活性片段或衍生物。人類蛋白質在UniProt中以編號P07333表示。

用於使宿主免疫之多肽可由相關技藝中熟知的方法自包括表現系統之經基因改造的宿主細胞製得，或其等可自天然生物來源回收獲得。於本申請案中，術語「多肽」包括肽、多肽及蛋白質。該等術語可互換使用，除非另作指明。於一些實例中CSF-1R多肽可為諸如(例如)融合至親和標籤或類似之融合蛋白質之較大蛋白質之一部分。

所產生的抗CSF-1R多肽之抗體可使用所熟知且例行的方案(參見(例如)Handbook of Experimental Immunology，D.M.Weir(編輯)，第4卷，Blackwell Scientific Publishers，英國牛津市，1986)在需要使動物免疫的情況下藉由對動物(較佳係非人類之動物)投與該等多肽來獲得。可使諸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、駱駝或豬之諸多溫血動物免疫。然而，小鼠、兔、豬及大鼠一般係最適宜的。

單株抗體可由相關技藝中已知的任何方法諸如融合瘤技術(Kohler & Milstein，1975，Nature，256：495-497)、三體雜交瘤(trioma)技術、人類B-細胞融合瘤技術(Kozbor等人，1983，Immunology Today，4：72)及EBV-融合瘤技術(Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，第77至96頁，Alan R Liss,Inc.)來製造。

抗體亦可使用單淋巴細胞抗體方法藉由選殖及表現自藉由(例如)Babcook,J.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848；WO92/02551；WO04/051268及國際專利申請案第WO04/106377號所述方法製造特異性抗體所選的單淋巴細胞產生之免疫球蛋白可變區cDNA來製造。

可利用測量與人類CSF-1R結合之試驗及/或測量可阻斷配體與受體結合之能力之試驗來進行抗體之篩選。適宜試驗之實例述於本文實例中。

如本文中使用，特異性意指抗體僅識別對其具特異性之抗原或抗體對其具特異性之抗原比對其不具特異性之抗原之結合具有明顯更高結合親和力，例如至少5、6、7、8、9、10倍的更高結合親和力。

本發明之特定抗體之胺基酸序列及多核苷酸序列提供於圖1及2中。

於本發明之一個態樣中，抗體為包含重鏈之抗-CSF-1R抗體或其結合片段，其中該重鏈之可變域包含具有針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4表示之序列之CDR、CDR具有針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5表示之序列及具有針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之序列之CDR中至少一者。較佳地，該重鏈之可變域包含針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4表示之序列、針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5表示之序列及針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之序列。

於本發明之第二態樣中，抗體為包含輕鏈之抗-CSF-1R抗體或其結合片段，其中該輕鏈之可變域包含具有針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列之CDR、具有針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之序列之CDR及具有針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列之CDR中至少一者。較佳地，該輕鏈之可變域包含針對於CDR-H1以SEQ ID NO：1表示之序列、針對於CDR-H2以SEQ ID NO：2表示之序列及針對於CDR-H3以SEQ ID NO：3表示之序列。

於一個實施例中，本發明之抗體為包含如上所定義重鏈且另外包含輕鏈之抗-CSF-1R抗體或其結合片段，其中該輕鏈之可變域包含具有針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列之CDR、具有針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之序列之CDR及具有針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列之CDR中至少一者。該輕鏈之可變域較佳包含針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列、針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之序列及針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列。

於一個實施例中，至少一個胺基酸在一或多種獨立選自由以下組成之群之CDR中以守恆代換地置換：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3中任何一者；組合CDR-H1與H2、CDR-H1與H3、CDR-H1與L1、CDR-H1與L2、CDR-H1與L3、CDR-H2與H3、CDR-H2與L1、CDR-H2與L2、CDR-H2與L3、CDR-H3與L1、CDR-H3與L2、CDR-H3與L3、CDR-L1與L2、CDR-L1與L3、CDR-L2與L3中任何一者；CDR-H1、H2及H3、CDR-H1、H2及L1、CDR-H1、H2及L2、CDR-H1、H2及L3、CDR-H2、H3及L1、CDR-H2、H3及L2、CDR-H2、H3及L3、CDR-H3、L1及L2、CDR-H3、L1及L3、CDR-L1、L2、L3；組合CDR-H1、H2、H3及L1、CDR-H1、H2、H3及L2、CDR-H1、H2、H3及L3、CDR-H2、H3、L1及L2、CDR-H2、H3、L2及L3、CDR-H3、L1、L2及L3、CDR-L1、L2、L3及H1、CDR-L1、L2、L3及H2、CDR-L1、L2、L3及H3、CDR-L2、L3、H1及H2中任何一者；CDR-H1、H2、H3、L1及L2、CDR-H1、H2、H3、L1及L3、CDR-H1、H2、H3、L2及L3、CDR-L1、L2、L3、H1及H2、CDR-L1、L2、L3、H1及H3、CDR-L1、L2、L3、H2及H3；及組合CDR-H1、H2、H3、L1、L2及L3。

於一個實施例中，揭示於本文中之重鏈之域包含具有1、2、3或4處守恆胺基酸代換之序列，例如，其中該等代換係在架構中。

於一個實施例中，該重鏈可變區之架構包含1、2、3、或4個已經過插入、缺失、代換或其組合之胺基酸。於一個實施例中，經代換之胺基酸為衍生自供者抗體之對應胺基酸。

於一個實施例中，揭示於本文中之輕可變區包含具有1、2、3或4處守恆胺基酸代換之序列，例如，其中該等代換係在架構中。

於一個實施例中，輕鏈可變區之架構包含1、2、3或4個已經過插入、缺失、代換或其組合之胺基酸。於一個實施例中，經代換之胺基為衍生自供者抗體之對應胺基酸。

於本發明之一個態樣中，提供一種抗-CSF-1R抗體或其結合片段，其中該重鏈之可變域包含三種CDR及該CDR-H1之序列具有相對以SEQ ID NO：4表示之序列至少60%、70%、80%、90%或95%一致性或相似性，該CDR-H2之序列具有相對以SEQ ID NO：5表示之序列至少60%、70%、80%、90%或95%一致性或相似性及該CDR-H-3之序列具有相對以SEQ ID NO：6表示之序列至少60%、70%、80%、90%或95%一致性或相似性。較佳地，該抗-CSF-1R抗體或其結合片段另外包含輕鏈，其中該輕鏈之可變域包含三種CDR及該CDR-L1之序列具有相對以SEQ ID NO：1表示之序列至少60%、70%、80%、90%或95%一致性或相似性，該CDR-L2之序列具有相對以SEQ ID NO：2表示之序列至少60%、70%、80%、90%或95%一致性或相似性及該CDR-L3之序列具有相對以SEQ ID NO：3表示之序列至少60%一致性或相似性。

於一個實施例中，所提供的可變區具有相對揭示於本文中之可變區序列至少60%、70%、80%、90%或95%一致性或相似性。於另一個實施例中，提供一種與本發明之抗體或片段競爭結合至CSF-1R受體(較佳係CSF-1R受體之胞外域)、更特定言之結合至具有SEQ ID NO：35、36、37、38及/或39或UniProt資料庫鍵入P07333之序列之CSF-1R受體、特定言之結合至具有SEQ ID NO：36之CSF-1R受體胞外域或於UniProt資料庫鍵入P07333中揭示之胞外域之498個胺基酸(P07333之胺基酸20至517)之抗-CSF-1R抗體。

於一個實施例中，提供一種交叉阻斷包含針對於CDR-L1以序列SEQ ID NO：1、針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2、針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3、針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4、針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5及針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之6種CDR之抗體之(例如)具有100pM或更小之親和力結合之抗-CSF-1R抗體，特定言之，其中該交叉阻斷係異位。

於另一個實施例中，提供一種抗-CSF-1R-抗體或其結合片段，其係抑制CSF-1及/或IL-34與CSF-1R受體之胞外域結合或與CSF-1及/或IL-34與CSF-1R受體之胞外域之結合重疊。

於一個實施例中，提供一種交叉阻斷包含針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1、針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2、針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3、針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4、針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5及針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之6種CDR之抗體之(例如)具有100pM或更小親和力結合之抗-CSF-1R抗體，特定言之，其中該抗體係藉由結合與其阻斷的抗體相同的抗原決定基來交叉阻斷該結合。

於一個實施例中，提供抗體或其結合片段，其中該抗體序列之C-端殘基係經裂解，例如，重鏈序列之C-端殘基，例如，末端離胺酸。於一個實施例中，胺基酸係自揭示於本文中之序列裂解。一般而言，裂解係由經表現之抗體或結合片段之轉譯後修飾所導致。

於另一個實施例中，提供任何上述或下述實施例之抗-CSF-1R抗體，其中以SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：29表示之重鏈序列之C-端離胺酸係缺少或缺失。缺少或缺失的C-端離胺酸(例如，SEQ ID NO：27之位置453或SEQ ID NO：30之位置472)可例如藉由在表現系統中於不編碼末端離胺酸下表現抗-CSF-1R抗體來達成。或者，C-端殘基(諸如離胺酸)之缺失可為轉譯後修飾引起。

於一個實施例中，本發明之抗體或結合片段係經人源化。

如本文所用，術語「人源化」抗體係指其中之重鏈及/或輕鏈包含一或多種來自供者抗體(例如，鼠科單株抗體)之CDR(若需要則包含一或多種經修飾之CDR)接枝至受體抗體(例如，人類抗體)(參見：例如，US 5,585,089；WO91/09967)之重鏈及/或輕鏈可變區架構中之抗體或抗體分子。關於評論，參見Vaughan等人，Nature Biotechnology，16,535-539，1998。於一個實施例中，僅一或多個來自任何一種上述CDR之特異性決定殘基傳送至人類抗體架構，而非整個CDR傳送(參見(例如)Kashmiri等人，2005，Methods，36：25-34)。

於一個實施例中，僅來自一或多個上述CDR之特異性決定殘基傳送至人類抗體架構。於另一個實施例中，僅來自上述CDR各者之特異性決定殘基傳送至人類抗體架構。在CDR或特異性決定殘基係經接枝之情況下，可根據衍生該等CDR之供者抗體之類別/類型使用任何適宜受體可變區架構序列，包括小鼠、靈長類動物及人類架構區。

適宜地，本發明之人源化抗體具有包含人類受體架構區及一或多種本文所明確提供之CDR之可變域。因此，於一個實施例中提供一種與人類CSF-1R結合之人源化抗體，其中該可變域包含人類受體架構區及非人類供者CDR。

可用於本發明中之人類架構之實例為KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY及POM(Kabat等人，如前述)。例如，KOL及NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈及EU、LAY及POM可用於重鏈及輕鏈二者。或者，可使用人類生殖株序列；其等可在：http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/取得。

於本發明之人源化抗體中，受體重鏈及輕鏈並不一定需要衍生自相同抗體及若需要則可包含具有衍生自不同鏈之架構區之複合鏈。

於一個實施例中，人類架構包含1、2、3、或4處胺基酸代換、新增或缺失，例如，1、2、3或4處供者殘基守恆代換或代換。

於一個實施例中，用作人類架構之序列係與本文所揭示序列80%、85%、90%、95%或更大相似或相同。

用於本發明人源化抗體之重鏈之一個該適宜架構區係衍生自人類子群組VH2序列3-12-70加上JH3 J-區(SEQ ID NO：33)。

因此，於一個實例中，提供一種包含針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4表示之序列、針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5表示之序列及針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之序列之人源化抗體，其中該重鏈架構區係衍生自人類子群組VH3序列1-3 3-07加上JH4。

於一個實例中，抗體之重鏈可變域包含以SEQ ID NO：23表示之序列。

用於本發明人源化抗體之輕鏈之適宜架構區係衍生自人類生殖株子群組VK1 2-1-(1)O12加上JK4 J-區(SEQ ID NO：31)。

因此，於一個實例中，提供一種包含針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列、針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之序列及針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列之人源化抗體，其中該輕鏈架構域係衍生自人類子群組VK1 2-1-(1)O12加上JK4 J-區。

於一個實例中，抗體之輕鏈可變域包含以SEQ ID NO：15表示之序列。

於本發明之人源化抗體中，該等架構區不需要具有完全與受體抗體之其等架構區相同的序列。例如，非尋常殘基可基於該受體鏈類別或類型改變為更頻繁生成之殘基。或者，受體架構區中之選定殘基可經改變以使其對應於在供者抗體中相同位置之處發現之殘基(參見Reichmann等人，1998，Nature，332：323-324)。該等改變應維持為恢復供者抗體之親和力時所最低必需。用於選擇受體架構區中可能需要改變之殘基之方案述於WO91/09967中。

因此，於一個實例中，提供一種人源化抗體，其中至少重鏈可變域之位置78處殘基(Kabat編號)為供者殘基。於一個實施例中，重鏈可變域之殘基78係經丙胺酸置換。

供者殘基如本文中使用係指來自可提供CDR之非人類抗體(例如，鼠科抗體)之殘基。

於一個實施例中，提供一種人源化抗體，其中該重鏈可變域不包含任何供者殘基。

因此，於一個實例中，提供一種人源化抗體，其中輕鏈可變域之位置38、71及87處殘基(Kabat編號)中之至少一個為供者殘基。於一個實施例中，該等選自輕鏈可變域之位置38、71及87處殘基(Kabat編號)之殘基中之一個為供者殘基。於一個實施例中，該等選自輕鏈可變域之位置38、71及87(例如38及71；或38及87；或71及87)處殘基(Kabat編號)之殘基中之兩個為供者殘基。於一個實施例中，輕鏈可變域之位置38、71及87處之三個殘基(Kabat編號)為供者殘基。

於一個實施例中，輕鏈可變域之殘基38係經離胺酸置換。於一個替代實施例中，輕鏈可變域之殘基38係經麩醯胺酸置換。

於一個實施例中，輕鏈可變域之殘基71係經酪胺酸置換。

於一個實施例中，輕鏈可變域之殘基87係經苯丙胺酸置換。

於一個實施例中，提供一種人源化抗體，其中輕鏈可變區中僅殘基71為供者殘基，較佳係酪胺酸。

於一個特定的實施例中，本發明提供一種抗-CSF-1R抗體或其結合片段，其具有包含以SEQ ID NO：23表示之重鏈可變域序列之重鏈及包含以SEQ ID NO：15表示之輕鏈可變域序列之輕鏈。

於本發明之另一個態樣中，提供一種抗-CSF-1R抗體或其結合片段，其係與CSF-1R(較佳CSF-1R之胞外域，更佳人類CSF-1R之胞外域)結合，其中該抗體或結合片段包含SEQ ID NO：15之輕鏈可變域及 SEQ ID NO：23之重鏈可變域，較佳地，其中該抗體或其結合片段為單株抗體，為IgG1-、IgG2-、IgG4類型之抗體，為Fab、經修飾之Fab、Fab’、經修飾之Fab’、F(ab’)₂、Fv、單域抗體(例如，VH或VL或VHH)、scFv、二、三或四價抗體、雙-scFv、雙價抗體、三價抗體或四價抗體。

於一個實施例中，本發明提供一種與本文所揭示序列80%相似或相同(例如相對部分或整個相關序列85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相似或相同)之抗體序列。於一個實施例中，相關序列為SEQ ID NO：15。於一個實施例中，相關序列為SEQ ID NO：23。

如本文所用，「一致性」指示在經比對序列之任何特定位置之處，序列之間之胺基酸殘基相同。如本文所用，「相似性」指示在經比對序列之任何特定位置之處，序列之間之胺基酸殘基為相似類型。例如，白胺酸可經代換成異白胺酸或纈胺酸。可經常彼此間相互代換之其他胺基酸包括(但不限於)：-苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸(具有芳族側鏈之胺基酸)；-離胺酸、精胺酸及組胺酸(具有鹼性側鏈之胺基酸)；-天冬胺酸及麩胺酸(具有酸性側鏈之胺基酸)；-天冬醯胺酸及麩醯胺酸(具有醯胺側鏈之胺基酸)；及-半胱胺酸及甲硫胺酸(具有含硫側鏈之胺基酸)。可輕易地計算得一致性及相似性程度(Computational Molecular Biology，Lesk,A.M.編輯，牛津大學出版社(Oxford University Press)，紐約，1988；Biocomputing.Informatics and Genome Projects，Smith,D.W.編輯，學術出版社(Academic Press)，紐約，1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part 1，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編輯，胡馬納出版社(Humana Press)，新澤西州，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje,G.，學術出版社，1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov,M.及Devereux,J.編輯，M Stockton出版社，紐約，1991，可從NCBI購得之BLAST^TM軟體(Altschul,S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.及States,D.J.1993，Nature Genet.3：266-272.Madden,T.L.等人，1996，Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.及Madden,T.L.1997，Genome Res.7：649-656)。

本發明之抗體分子可包括具有全長重鏈及輕鏈之完全抗體分子或其結合片段及可為(但不限於)Fab、經修飾之Fab、Fab’、經修飾之Fab’、F(ab’)₂、Fv、單域抗體(例如VH或VL或VHH)、scFv、二、三或四價抗體、雙-scFv、雙價抗體、三價抗體、四價抗體及上述任一者之抗原決定基結合片段(參見(例如)Holliger及Hudson，2005，Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair及Lawson，2005，Drug Design Reviews-Online 2(3),209-217)。相關技藝中熟知產生及製造該等抗體片段之方法(參見(例如)Verma等人，1998，Journal of Immunological Methods，216：165-181)。用於本發明中之其他抗體片段包括述於國際專利申請案WO05/003169、WO05/003170及WO05/003171中之Fab及Fab’片段。多價抗體可包含多特異性(例如，雙特異性)或可為單特異性(參見(例如)WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562及WO2010/035012)。

用於本文中之抗體之結合片段係指可以將片段表徵為對抗原具特異性之親和力與抗原結合之片段。

於一個實施例中，本發明之抗體係呈包含免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab’片段)及一或兩個直接或間接鍵聯至其之單域抗體(dAb)之CSF-1R結合抗體融合蛋白質提供，例如如均以引用方式併入本文中之WO2009/040562、WO2010/035012、WO2011/030107、 WO2011/061492及WO2011/086091中所述。

於一個實施例中，該融合蛋白質包括例如呈可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)配對之視情況經二硫鍵鍵鏈之兩個域抗體。

於一個實施例中，該融合蛋白質之Fab或Fab’成員對該或該等單域抗體具有相同或類似的特異性。於一個實施例中，該Fab或Fab’對該或該等單域抗體具有不同的特異性，換言之，該融合蛋白質為多價。於一個實施例中，本發明之多價融合蛋白質具有白蛋白結合位點，例如，其中之VH/VL對提供白蛋白結合位點。

可基於提出的抗體分子功能、及特定言之可能為必需的效應子功能來選擇(若存在)本發明抗體分子之守恆區結構域。例如，該等守恆區結構域可為人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結構域。特定言之，在抗體分子意欲用於治療用途及抗體效應子功能為必需之情況下，可使用尤其IgG1及IgG3同型之人IgG守恆區結構域。或者，在抗體分子意欲用於治療目的及不需要抗體效應子功能之情況下，可使用IgG2及IgG4同型。

於一個特定的實施例中，本發明之抗體為IgG2或IgG4抗體。

應瞭解亦可使用該等守恆區結構域之序列變體。例如，可使用如Angal等人，1993，Molecular Immunology，1993，30：105-108中所述於位置241之處之絲胺酸已改為脯胺酸之IgG4分子。因此，於抗體為IgG4抗體之實施例中，抗體可包括突變S241P。

熟習此項技藝者亦應明瞭抗體可經過多種轉譯後修飾。該等修飾之類型及程度通常係取決於用於表現抗體之宿主細胞系及培養條件。該等修飾可包括糖基化、甲硫胺酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬胺酸異構化及天冬醯胺酸脫醯胺改變。頻繁的修飾由於羧基肽酶之作用而致羧基端鹼性殘基(諸如離胺酸或精胺酸)之損失(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705：129-134，1995中所述)。因此，可能不存在抗體重鏈之C-端離胺酸。

於一個實施例中，該抗體重鏈包含CH1域及該抗體輕鏈包含CL域(κ或λ)。

於一個實施例中，該抗體重鏈包含CH1域、CH2域及CH3域及該抗體輕鏈包含CL域(κ或λ)。

本發明提供之抗體具有包含以SEQ ID NO：27表示之序列之重鏈及包含以SEQ ID NO：19表示之序列之輕鏈。亦提供一種抗-CSF-1R抗體或其結合片段，其中該等重鏈及輕鏈與包含以SEQ ID NO：27表示之序列之重鏈及包含以SEQ ID NO：19表示之序列之輕鏈至少80%(較佳85%、90%、95%或98%)相同或相似。於一個實施例中，該輕鏈具有以SEQ ID NO：19表示之序列或由其組成及該重鏈具有以SEQ ID NO：27表示之序列或由其組成。於另一個實施例中，該輕鏈具有SEQ ID NO：19之序列或由其組成及該重鏈具有SEQ ID NO：27之序列或由其組成，其中於SEQ ID NO：27之位置453之處之胺基酸離胺酸係缺少或缺失。

本發明亦提供人類CSF-1R之為本發明提供之抗體(特定言之包含重鏈序列gH2(SEQ ID NO：27)及/或輕鏈序列gL7(SEQ ID NO：19)之抗體969.g2)所結合的特異性區域或抗原決定基。

人類CSF-1R多肽之該特異性區域或抗原決定基可藉由相關技藝中已知的任何適宜抗原決定圖譜分析方法結合任何一種本發明所提供抗體來識別。該等方法之實例包括基於以可特異性結合至本發明抗體之包含由該抗體識別的抗原決定基之序列之最小片段(例如，該區域中約5至20個，較佳約7個胺基酸長度之肽)結合至本發明抗體來篩選衍生自CSF-1R之各種長度之肽。CSF-1R肽可以合成或藉由CSF-1R多肽之蛋白質分解消化製得。與該抗體結合之肽可藉由(例如)質譜分析來識別。於另一個實例中，可使用NMR光譜或X-射線結晶學以識別為本發明抗體所結合的抗原決定基。一旦識別出，與本發明抗體結合之抗原決定性片段(若需要)可用作為抗原體，以獲得其他的與相同抗原決定基結合之抗體。

諸如抗體或片段之生物分子包含酸性及/或鹼性官能基，藉此提供分子正或負淨電荷。總體「所觀察到」電荷的量將取決於實體之絕對胺基酸序列、帶電荷基團在3D結構中的局部環境及分子之環境條件。等電點(pI)為特定分子或其溶劑可及表面不帶有淨電荷之pH。於一個實例中，本發明之CSF-1R抗體及片段可經改造以具有適宜等電點。此可獲得具有較穩健性質、特定言之適宜溶解性及/或穩定性及/或經改良之純化特性之抗體及/或片段。

因此，於一個態樣中，本發明提供一種經改造以具有與初始識別之抗體之等電點不同的等電點之人源化CSF-1R抗體。抗體可(例如)藉由置換胺基酸殘基諸如藉由一或多個鹼性胺基酸殘基置換酸性胺基酸殘基來改造。或者，可引入鹼性胺基酸殘基或可移去酸性胺基酸殘基。或者，若分子具有不可接受的高pI值，則視需要可引入酸性殘基以減低pI。重點是，在操縱pI時，必須小心處理以維持抗體或片段之期望活性。因此，於一個實施例中，經改造之抗體或片段具有與「未經修飾之」抗體或片段相同或實質上相同的活性。

諸如** ExPASY http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html及http：//www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html之程式可用於預測抗體或片段之等電點。

應瞭解可使用相關技藝中已知的任何適宜方法來改變本發明所提供抗體之親和力。本發明因此亦關於本發明抗體分子之具有針對CSF-1R之經改良親和力之變體。該等變體可藉由多種親和力突變方案來獲得，包括使CDR突變(Yang等人，1995，J.Mol.Biol.，254：392-403)、鏈改組(Marks等人，1992，Bio/Technology，10：779- 783)、大腸桿菌(E.coli)之突變株之使用(Low等人，1996，J.Mol.Biol.，250：359-368)、DNA改組(Patten等人，1997，Curr.Opin.Biotechnol.，8：724-733)、噬菌體呈現(Thompson等人，J.Mol.Biol.，256，77-88，1996)及有性PCR(Crameri等人，1998，Nature，391：288-291)。Vaughan等人(如前述)闡述該等親和力成熟方法。

若需要則可將用於本發明中之抗體與一或多個效應子分子共軛。應瞭解效應子分子可包含單效應子分子或經鍵鏈以形成可與本發明抗體連接之單個部分之兩個或更多個該等分子。在需要效應子分子來獲得鍵聯至效應子分子之抗體片段之情況下，可藉由其中使該抗體片段直接或透過偶聯劑鍵聯至該效應子分子之標準化學或重組DNA程序製得該鍵聯至效應子分子之抗體片段。將該等效應子分子與抗體共軛之技術係相關技藝中熟知(參見，Hellstrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人編輯，1987，第623-53頁；Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.，62：119-58及Dubowchik等人，1999，Pharmacology and Therapeutics，83,67-123)。特定的化學程序包括(例如)彼等描述於WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476及WO03/031581中者。或者，在效應子分子為蛋白質或多肽之情況下，鍵聯可使用例如如WO86/01533及EP0392745中所述之重組DNA程序來達成。

術語效應子分子如本文中使用包括(例如)抗贅瘤藥劑、藥物、毒素、生物活性蛋白質(例如酵素)、其他抗體或抗體片段、合成或天然聚合物、核酸及其片段(例如，DNA、RNA及其片段)、放射性核素(特定言之係放射性碘)、放射性同位素、螯合金屬、奈米粒子及諸如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜偵測之化合物之報導子群組。

效應子分子之實例可包括細胞毒素或細胞毒性劑(包括會傷害(例如殺死)細胞之任何藥劑)。實例包括康布瑞汀(combrestatin)、多拉斯他汀(dolastatin)、埃博黴素(epothilone)、星孢菌素(staurosporin)、類美登素(maytansinoid)、海綿毒素(spongistatin)、根黴素(rhizoxin)、軟海綿素(halichondrin)、桿孢菌素(roridin)、哈米特林(hemiasterlin)、紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D(gramicidin D)、溴化乙錠(ethidium bromide)、吐根鹼(emetine)、絲裂黴素、依託泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼、長春花鹼、秋水仙鹼、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝黴素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycin D)、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、及嘌呤黴素(puromycin)及其類似物或同源物。

效應子分子亦包括(但不限於)抗代謝物(例如甲胺喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷基化試劑(例如氮芥、硫噴妥苯丁酸氮芥、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)及洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素C、及順式-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環黴素(例如柔紅黴素(原名道諾黴素(daunomycin))及多柔比星)、抗生素(例如放線菌素D(dactinomycin)(原名放線菌素)、博來黴素、光輝黴素、安曲黴素(anthramycin)(AMC)、卡奇黴素(calicheamicin)或多卡米星(duocarmycin))、及抗有絲分裂試劑(例如長春新鹼及長春花鹼)。

其他效應子分子可包括螯合放射性核素，諸如¹¹¹In及⁹⁰Y、Lu¹⁷⁷、鉍²¹³、鉲²⁵²、銥¹⁹²及鎢¹⁸⁸/錸¹⁸⁸；或藥物，諸如(但不限於)烷基磷酸膽鹼、拓撲異構酶I抑制劑、類紫杉醇(taxoid)及蘇拉明(suramin)。

其他效應子分子包括蛋白質、肽及酵素。所述酵素包括(但不限於)蛋白質分解酵素、水解酶、裂解酶、異構酶、轉移酶。所述蛋白質、多肽及肽包括(但不限於)免疫球蛋白、毒素(諸如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素A(ricin A)、綠膿桿菌外黴素(pseudomonas exotoxin)、或白喉毒素)、蛋白質(諸如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子或組織纖維蛋白溶酶原活化因子)、血栓藥劑或抗血管生成劑(例如血管抑制素或內皮抑制素)、或生物反應調節劑(諸如淋巴細胞活素、介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、神經生長因子(NGF)或其他生長因子及免疫球蛋白)。

其他效應子分子可包括適用於例如診斷中之可偵測物質。可偵測物質之實例包括各種酵素、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料、放射性核素、正子發射金屬(用於正子發射斷層掃描)、及非放射性順磁性金屬離子。關於可與用作診斷使用之抗體共軛之金屬離子，可大致參見美國專利案第4,741,900號。適宜之酵素包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙醯膽鹼酯酶；適宜之輔基包括鏈黴親和素、抗生物素蛋白及生物素；適宜之螢光材料包括繖形銅(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、玫瑰紅、二氯三嗪胺螢光素、丹磺醯氯及藻紅素；適宜之發光材料包括魯米諾(luminol)；適宜之生物發光材料包括螢光素酶、蟲螢光素、及水母素(aequorin)；及適宜之放射性核種包括¹²⁵I、¹³¹I、¹¹¹In及⁹⁹Tc。

於另一個實例中，效應子分子可延長抗體活體內半衰期，及/或減低抗體之免疫原性及/或增進抗體跨上皮障壁輸送至免疫系統。此類型之適宜效應子分子之實例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結合蛋白或諸如述於WO05/117984中之其等之白蛋白結合化合物。

於一個實施例中，藉由效應子分子提供的獨立於CSF-1R的半衰期為有利。

在效應子分子為聚合物之情況下，一般而言，其可為合成或天然聚合物，例如，視情況經取代之直鏈或分支鏈聚伸烷基、聚伸烯基或聚環氧烷聚合物或分支鏈或無分支鏈多醣(例如，均-或雜多醣)。

可存於上述合成聚合物上之特定可選取代基包括一或多個羥基、甲基或甲氧基。

合成聚合物之特定實例包括視情況經取代之直鏈或分支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其係視情況經取代之聚(乙二醇)，諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

特定的天然聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、聚葡萄糖、肝醣或其衍生物。

於一個實施例中，該聚合物為白蛋白或其片段，諸如人類血清白蛋白或其片段。

「衍生物」如本文所用意欲包括反應性衍生物，例如，硫醇選擇性反應性基團，諸如馬來醯亞胺及類似物。反應性基團可直接或經連接子片段鍵聯至聚合物。於一些實例中應瞭解，該種基團之殘基將呈抗體片段與聚合物之間之鍵聯基團的形式形成產物之一部分。

聚合物之尺寸可依需要改變，但一般將在自500Da至50000Da、例如自5000至40000Da、諸如自20000至40000Da之平均分子量範圍內。聚合物尺寸特定言之可基於產物之預定用途，例如，定位至諸如腫瘤之特定組織或延長循環半衰期之能力來選擇(其相關概論請參見Chapman，2002，Advanced Drug Delivery Reviews，54，531-545)。因此，例如，若希望產物可離開循環繼而穿透組織，例如：用於治療腫瘤時，可能宜使用例如具有約5000Da分子量之小分子量聚合物。若用在希望產物留在循環中之應用時，則可能宜使用例如具有介於20000Da至40000Da範圍內之分子量之較高分子量聚合物。

適宜之聚合物包括聚伸烷基聚合物，諸如聚(乙二醇)或特定言之甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其係具有介於約15000Da至約 40000Da範圍內之分子量。

於一個實例中，用於本發明中之抗體係連接至聚(乙二醇)(PEG)部分。於一個特定的實例中，抗體為抗體片段，及PEG分子可透過位於抗體片段中之任何可利用之胺基酸側鏈或末端胺基酸官能基(例如任何游離胺基、亞胺基、硫醇基、羥基或羧基)連接。該等胺基酸可天然存在於抗體片段中或可利用重組DNA方法(參見(例如)US 5,219,996；US 5,667,425；WO98/25971；WO2008/038024)改造至片段中。於一個實例中，本發明之抗體分子為經修飾之Fab片段，其中該修飾係在其重鏈之C-末端新增一或多個胺基酸以容許效應子分子之連接。適宜地，增加的胺基酸形成包含一或多個可連接效應子分子的半胱胺酸殘基之經修飾之絞鏈區。多個位點可用於連接兩個或更多個PEG分子。

適宜地，PEG分子係透過至少一個位於抗體片段中之半胱胺酸殘基之硫醇基共價鍵聯。連接至經修飾之抗體片段之各聚合物分子可共價鍵聯至位於該片段中之半胱胺酸殘基之硫原子。該共價鍵聯一般將為二硫鍵或特定言之硫-碳鍵。在將硫醇基用作連接點之情況下，可使用經適宜活化之效應子分子，例如，硫醇基選擇性衍生物，諸如馬來醯亞胺及半胱胺酸衍生物。可使用經活化之聚合物作為製備如上所述的經聚合物修飾之抗體片段中之起始物質。經活化之聚合物可為包含硫醇反應性基團(諸如α-鹵代羧酸或酯(例如，碘乙醯胺)、醯亞胺(例如馬來醯亞胺)、乙烯基碸或二硫化物)之任何聚合物。該等起始物質可自商業上(例如，從Nektar，原名Shearwater Polymers Inc.，美國阿拉巴馬州亨斯維爾)獲得或可自市售起始物質使用習知化學程序製得。特定的PEG分子包括20K甲氧基-PEG-胺(可從Nektar，原名Shearwater；Rapp Polymere；及SunBio獲得)及M-PEG-SPA(可從Nektar(原名Shearwater)獲得)。

於一個實施例中，該抗體為經修飾之Fab片段、Fab’片段或二Fab，其係經聚乙二醇化，換言之，具有與其共價連接的PEG(聚(乙二醇))，例如，係依照揭示於EP 0948544或EP1090037中之方法[亦可參見「Poly(ethyleneglycol)Chemistry,Biotechnical and Biomedical Applications」，1992，J.Milton Harris(編輯)，Plenum出版社，紐約，「Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications」，1997，J.Milton Harris及S.Zalipsky(編輯)，American Chemical Society，華盛頓及「Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences」，1998，M.Aslam及A.Dent，葛洛夫出版社(Grove Publishers)，紐約；Chapman,A.2002，Advanced Drug Delivery Reviews 2002，54：531-545]。於一個實例中，PEG係連接至絞鏈區中之半胱胺酸。於一個實例中，經PEG修飾之Fab片段具有與經修飾之絞鏈區中之單硫醇基共價鍵聯之馬來醯亞胺基。離胺酸殘基可共價鍵聯至馬來醯亞胺基及於離胺酸殘基上之各胺基團可連接至具有約20,000Da分子量之甲氧基聚(乙二醇)聚合物。因此，連接至Fab片段之PEG的總分子量可為約40,000Da。

特定的PEG分子包括經N,N’-雙(甲氧基聚(乙二醇)MW 20,000)修飾之離胺酸之2-[3-(N-馬來醯亞胺基)丙醯胺基]乙醯胺，亦稱為PEG2MAL40K(可自Nektar(原名Shearwater)獲得)。

PEG連接子之替代來源包括供應GL2-400MA3(其中以下結構式中之m為5)及GL2-400MA(其中m為2)且n為約450之NOF：

換言之，各PEG為約20,000Da。

因此，於一個實施例中，PEG為2,3-雙(甲基聚氧伸乙基-氧基)-1-{[3-(6-馬來醯亞胺基-1-側氧基己基)胺基]丙氧基}己烷(2臂分支鏈PEG、-CH₂)₃NHCO(CH₂)₅-MAL，Mw 40,000，稱為SUNBRIGHT GL2-400MA3。

其他替代PEG效應子分子為以下類型：

於一個實施例中，提供一種抗體，諸如，全長抗體，其係經聚乙二醇化(例如，係藉由述於本文中之PEG)，透過鏈中胺基酸226(例如重鏈之胺基酸226(依定序編號))上或其附近之半胱胺酸胺基酸殘基進行連接。

於一個實施例中，本發明提供包含一或多種PEG聚合物，例如1或2種聚合物，諸如一或多種40kDa聚合物之Fab’PEG分子。

本發明之Fab-PEG分子可能因為其具有與Fc片段無關之半衰期而尤其有利。

於一個實施例中，提供一種與諸如PEG分子、澱粉分子或白蛋白分子之聚合物共軛之scFv。

於一個實施例中，該抗體或片段係共軛至澱粉分子，例如，以延長半衰期。實施共軛方法以偶聯至蛋白質，如以引用方式併入本文中之US 8,017,739中所述。

報導分子如本文中使用為可被偵測之分子，例如，螢光染料、放射性標記或其他可偵測實體。

本發明亦提供一種編碼本發明抗體分子之重鏈及/或輕鏈之單離的DNA序列。適宜地，該DNA序列編碼本發明之抗體分子之重或輕鏈。本發明之DNA序列可包含例如藉由化學處理製得之合成DNA、cDNA、基因組DNA或其任何組合。

編碼本發明之抗體分子之DNA序列可由熟習此項技藝者熟知的方法來獲得。例如，編碼抗體重鏈及輕鏈之部分或全部之DNA序列可如期望自已確定的DNA序列或基於對應胺基酸序列來合成。

編碼受體架構序列之DNA可廣泛地由熟習此項技藝者來取得且可基於其已知的胺基酸序列輕易地合成。

分子生物學標準技術可用於製造編碼本發明之抗體分子之DNA序列。所欲DNA序列可完全或部分地利用寡核苷酸合成技術合成。可適宜地採用定點突變及聚合酶鏈反應(PCR)技術。

適宜DNA序列之實例提供於圖1中。

本發明亦關於一種包含一或多種本發明DNA序列之選殖或表現載體。因此，提供一種包含一或多種編碼本發明抗體之DNA序列之選殖或表現載體。於一個實施例中，該載體包含以SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：20表示之序列。適宜地，該選殖或表現載體包含兩種編碼本發明抗體分子之輕鏈及重鏈之DNA序列(較佳分別係SEQ ID NO：28及SEQ ID NO：20)及適宜之信號序列。於一個實例中，該載體包含介於重鏈及輕鏈之間之基因間隔序列(參見WO03/048208)。

熟習此項技藝者熟知可建構載體之一般方法、轉染方法及培養方法。關於此方面係引用「Current Protocols in Molecular Biology」，1999，F.M.Ausubel(編輯)，Wiley Interscience，紐約及由冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Publishing)出版之Maniatis Manual。

亦提供包含一或多種包含一或多種編碼本發明抗體之DNA序列之選殖或表現載體的宿主細胞。任何適宜之宿主細胞/載體系統可用於編碼本發明之抗體分子之DNA序列之表現。可使用細菌(例如大腸桿菌)及其他微生物系統或亦可使用真核(例如哺乳動物)宿主細胞表現系統。適宜之哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。

本發明亦提供一種製造本發明之抗體分子之方法，該方法包括在適於達成自編碼本發明抗體分子之DNA表現蛋白質之條件下培養包含本發明載體之宿主細胞，及單離抗體分子。

抗體分子可僅包含重或輕鏈多肽，於該種情況中，僅需將重鏈或輕鏈多肽編碼序列用於轉染宿主細胞。就製造同時包含重鏈及輕鏈之產物而言，可藉由兩種載體(編碼輕鏈多肽之第一載體及編碼重鏈多肽之第二載體)轉染細胞系。或者，可使用單一載體，該載體包括編碼重鏈及輕鏈多肽之序列。

本發明之抗體及片段係自宿主細胞以良好程度表現。因此，該等抗體及/或結合片段之性質適用於商業規模化表現。

因此，提供一種培養宿主細胞並表現抗體或其片段，單離抗體或其片段及視需要將其純化以提供單離的抗體或片段之方法。於一個實施例中，該方法進一步包括將效應子分子共軛至單離的抗體或片段，例如，共軛至特定言之如本文所述PEG聚合物之步驟。

於一個實施例中，提供一種純化抗體(特定言之本發明之抗體或片段)之方法，該方法包括以非結合模式進行陰離子交換層析致使雜質滯留於管柱上而溶出抗體。

於一個實施例中，該純化係於CSF-1R管柱上利用親和力捕捉。

於一個實施例中，該純化係使用汽巴藍(cibacron blue)或類似物來達成白蛋白融合或共軛物分子之純化。

用於該方法中之適宜離子交換樹脂包括Q.FF樹脂(由GE-Healthcare供應)。該步驟可例如於約8 pH下進行。

該方法可進一步包括使用陽離子交換層析之例如於約4至5(諸如4.5)pH下進行之初始捕捉步驟。該陽離子交換層析可例如使用諸如CaptoS樹脂或SP瓊脂糖凝膠FF(由GE-Healthcare供應)之樹脂。可接著使用例如於200mM濃度下之離子鹽溶液(諸如氯化鈉)自該樹脂溶出該抗體或片段。

因此，該(等)層析步驟可適宜地包括一或多個洗滌步驟。

該純化方法亦可包括一或多個過濾步驟，諸如，濾洗步驟。

因此在一個實施例中提供一種經純化之抗-CSF-1R抗體或片段，例如，人源化抗體或片段，特別是本發明之抗體或片段，其呈實質上純化形式，特定言之係不含或實質上不含內毒素及/或宿主細胞蛋白質或DNA。

經純化之形式如前述使用意指至少90%純度，諸如，91、92、93、94、95、96、97、98、99% w/w或更高純度。

實質上不含內毒素一般意指每mg抗體產物具有1 EU或更小(諸如每mg產物具有0.5或0.1 EU)之內毒素含量。

實質上不含宿主細胞蛋白質或DNA一般意指適宜地每mg抗體產物具有400μg或更小(諸如每mg具有100μg或更小，特定言之每mg具有20μg)之宿主細胞蛋白質及/或DNA含量。

本發明亦提供一種本發明之適用為藥物之抗-CSF-1R抗體(或包含其之醫藥組合物)。

本發明亦提供一種本發明之用於治療癌症之抗-CSF-1R抗體(或包含其之醫藥組合物)。

本發明亦提供一種本發明之抗-CSF-1R抗體(或包含其之醫藥組合物)於製造用於治療或預防癌症之藥物之用途。

本發明亦提供一種治療罹患癌症或處在癌症風險之人類個體的方法，該方法包括投與該個體有效量之本發明之抗-CSF-1R抗體。

本發明之抗體可用於治療選自由以下組成之群之癌症：乳癌、前列腺癌、骨癌、骨髓瘤、結腸直腸癌、白血病、淋巴瘤、皮膚癌(諸如黑素瘤)、食道癌、胃癌、星形細胞癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌、頭頸癌、胰癌及卵巢癌。

於一個實施例中，該癌症為自任何以上所列原發性癌症之轉移性癌症，特定言之骨癌。

令人意外地，吾人已可證實抑制CSF-1R活性之抗-CSF-1R抗體在治療纖維變性疾病中具活性。明確言之，吾人已可證實抗-CSF-1R抗體在活體內動物肺纖維化模型中具活性。

本發明亦提供一種本發明之用於治療纖維變性疾病之抗-CSF-1R抗體(或包含其之醫藥組合物)。

本發明亦提供一種本發明之抗-CSF-1R抗體(或包含其之醫藥組合物)於製造用於治療或預防纖維變性疾病之藥物之用途。

本發明亦提供一種治療罹患纖維變性疾病或處在纖維變性疾病風險之人類個體的方法，該方法包括對該個體投與治療有效量之本發明之抗-CSF-1R抗體。

於本發明中，術語「纖維變性疾病」包括以對傷口癒合之異常反應為特徵之疾病，其中過量的纖維結締組織形成於器官或組織中。說明性纖維變性疾病包括(但不限於)諸如特發性肺纖維化及囊性纖維化之肺纖維化、包括腎小管萎縮及間質纖維化之腎纖維化、肝纖維化、肝硬化、原發性硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化、心內膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維變性、腹膜後腔纖維化、進行性大塊纖維化、腎因性全身纖維化、克羅恩氏病、瘢痕疙瘩、心肌梗塞、硬皮病、全身性硬化症及關節纖維化。

於一個實施例中，本發明之抗體或片段係用於治療或預防癌症或纖維變性疾病。

本發明之抗體可用於治療發炎性疾病，諸如(例如)發炎性關節炎、動脈粥樣硬化、多發性硬化症、發炎性腸病、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、類風濕脊椎炎、僵直性脊椎炎、關節炎、銀屑病關節炎、類風濕關節炎、骨關節炎、濕疹、接觸性皮膚炎、銀屑病、毒性休克症候群、敗血症、敗血性休克、內毒素性休克、哮喘、慢性肺發炎性疾病、矽肺病、肺類肉瘤病、骨質疏鬆症、再狹窄症、心臟及腎臟再灌注損傷、血栓症、腎小球腎炎、糖尿病、移植物抗宿主反應、同種異體移植排斥、多發性硬化症、肌肉退化、肌肉萎縮、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)及中風。

本發明之抗體及片段可用於治療或預防。

本發明之抗體分子亦可用於診斷，例如，用於與CSF-1R相關之疾病狀況之活體內診斷及成像。

因本發明之抗體適用於治療及/或預防病理病況，故本發明亦提供一種包含本發明之抗體分子及醫藥可接受賦形劑、稀釋劑或載劑中一或多者之醫藥或診斷組合物。因此，提供一種本發明之抗體於製造藥物之用途。該組合物通常將經過提供作為通常將包含醫藥可接受載劑之滅菌醫藥組合物之一部分。本發明之醫藥組合物可另外包含醫藥可接受佐劑。

本發明亦提供一種製備醫藥或診斷組合物之方法，該方法包括添加並混合本發明之抗體分子及醫藥可接受賦形劑、稀釋劑或載劑中之一或多者。

該抗體分子可為該醫藥或診斷組合物中之唯一活性組分。或者，該抗體可組合一或多種其他治療活性組分例如同時、依序或分開投與。據此，於該醫藥或診斷組合物中之抗體分子可藉由其他活性組分伴隨，該等其他活性組分包括其他抗體組分，例如，表皮生長因子受體家族(EGFR、HER-2)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、血小板源生長因子受體(PDGFR)抗體，或非抗體組分，諸如伊馬替尼(imatinib)、達沙替尼(dasatinib)、尼羅替尼(nioltinib)、巴蘇替尼(basutinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、西羅莫司脂化物(temsirolimus)、凡德他尼(vandetanib)、維拉非尼(vemurafenib)、克裡唑蒂尼(crizotinib)、伏立諾他(vorinostat)、羅咪酯肽(romidepsin)、硼替佐米(bortezomib)、索拉非尼(sorafenib)、蘇尼替尼(sunitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格菲尼(regorafenib)、卡博替尼(cabozantinib)、吡非尼酮(Perfenidone)、類固醇或其他藥物分子(特別是其半衰期與CSF-1R結合無關之藥物分子)。

活性組分如本文中使用係指於相關劑量下具有藥理學效應(諸如治療效應)之組分。

醫藥組合物適宜包含治療有效量之本發明之抗體。術語「治療有效量」如本文中使用係指治療劑之可治療、改善或預防標靶疾病或病況、或展現可偵測治療、藥理或預防效應所需的量。就任何抗體而言，該治療有效量可先在細胞培養分析或動物模型通常在齲齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物中進行估計。該動物模型亦可用於確定適宜之濃度範圍及投藥途徑。該資訊可接著用於確定於人類中之有用劑量及投藥途徑。

用於人類個體之精確治療有效量將取決於疾病狀況之嚴重度、個體一般健康狀況、個體的年齡、體重及性別、膳食、投藥時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對治療之耐受性/反應。該量可藉由例行試驗來確定及係屬於醫師判斷範圍。一般而言，治療有效量將為0.01mg/kg至500mg/kg，例如，0.1mg/kg至200mg/kg，諸如100mg/Kg。

醫藥組合物可方便地以每劑量包含預定量之本發明活性劑之單位劑型呈現。

本發明之抗體之治療劑量未顯示表觀或有限活體內毒理學效應。

組合物可個別地投與患者或可以與其他藥劑、藥物或激素組合(例如，同時、依序或分開)投與。

於一個實施例中，本發明之抗體或結合片段係併與一或多種其他癌症治療選項(諸如(例如)化學療法、放射治療或手術)使用。若併與化學治療劑投與，則可在化學治療劑之前或之後或同時投與抗體。可併與所提供的抗原結合蛋白組合使用之化學療法治療包括(但不限於)烷基化/DNA破壞劑(例如卡鉑(carboplatin)、順鉑)、抗代謝物(例如卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)、5-氟尿嘧啶)、有絲分裂抑制劑(例如太平洋紫衫醇、長春新鹼)。

欲用於治療各種發炎性疾病之抗體可單獨或與各種其他抗發炎藥劑組合使用。

欲用於治療各種纖維變性疾病之抗體可單獨或與各種其他抗纖維變性劑組合使用。該藥劑之一個實例為普菲酮(Perfedidone)。

本發明抗體分子之投與劑量係取決於待治療之病況之性質、所呈現病況之嚴重度及取決於抗體分子係用於預防還是用於治療原有的病況。

給藥頻率將取決於抗體分子之半衰期及其效應之持續時間。若抗體分子具有短的半衰期(例如2至10小時)，則可必要地每天給藥一或多次。或者，若抗體分子具有長的半衰期(例如2至15天)及/或持久藥效動力學(PD)性質，則其可能僅需要每天給藥一次、每週一次或甚至每1或2個月一次。

半衰期如本文中使用意指該分子於循環例如血清/血漿中之持續時間。

藥效動力學如本文中使用係指根據本發明之分子之生物作用之分佈及特定言之持續時間。

醫藥可接受載劑本身應不誘導產生對接受該組合物之個體有害的抗體且不應具有毒性。適宜之載劑可為大緩慢代謝大分子，諸如蛋白質、多肽、脂質體、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物及無活性病毒顆粒。

可使用醫藥可接受鹽，例如，礦物酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽及硫酸鹽，或有機酸之鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽及苯甲酸鹽。

於治療性組合物中之醫藥可接受載劑可另外包含諸如水、鹽水、甘油及乙醇之液體。另外，諸如潤濕或乳化劑之輔助物質或pH緩衝物質可存在於該等組合物中。該等載劑可使醫藥組合物調配成錠劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液及懸浮液以供患者攝取。

用於投與之適宜形式包括適用於非經腸投與(例如，藉由注射或輸注，例如藉由快速注射或連續輸注)之形式。在產品係用於注射或輸注之情況下，其可採用在油性或水性載劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式及其可包含調配劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩定劑及/或分散劑。或者，就於與適宜滅菌液體併用之前之複水而言，該抗體分子可呈乾燥形式。

於完成調配後，本發明之組合物可直接投與至個體。欲治療之個體可為動物。然而，於一或多個實施例中，該等組合物適於投與人類個體。

適宜地，於本發明之調配物中，最終調配物之pH並非係與抗體或片段之等電點之值相似，例如，若該調配物之pH為7，則8至9或更大之pI可能係適宜。同時，在不希望受理論約束下，認為此可最終提供具有經改良穩定性之最終調配物，例如，該抗體或片段殘留於溶液中。

於一個實例中，在4.0至7.0範圍之pH下之醫藥調配物包含：1至200mg/mL之本發明之抗體、1至100mM之緩衝劑、0.001至1%之表面活性劑，a)10至500mM穩定劑、b)10至500mM穩定劑及5至500mM滲透劑、或c)5至500mM滲透劑。

本發明之醫藥組合物可以任何數目之途徑投與，包括(但不限於)口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、骨髓內、鞘內、室內、穿皮、經皮(例如，參見WO98/20734)、皮下、腹膜內、鼻內、腸內、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。亦可使用皮下注射器(Hypospray)以投與本發明之醫藥組合物。通常，治療組合物可製備成液體溶液或懸浮液中任一種形式之注射液。亦可製造在注射之前適用於在液體載劑中之溶液或懸浮液之固體形式。

該等組合物之直接輸送一般將藉由注射、經皮下、經腹膜內、經靜脈內或經肌肉內、或輸送至組織間質空間來達成。該等組合物亦可投與至病灶中。給藥治療可為單劑量時程或多劑量時程。

應瞭解於組合物中之活性組分將為抗體分子。因此，其將容易在胃腸道中降解。因此，若該組合物意欲以利用胃腸道之途徑投與，則該組合物將必需包含可保護抗體免遭降解但在其已被吸收後自胃腸道釋放抗體之試劑。

醫藥可接受載劑之詳盡論述可於Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)中獲得。

於一個實施例中，該調配物係呈用於包括吸入之局部投與之調配物形式提供。

適宜之可吸入製劑包括可吸入粉末、包含推進劑氣體之計量噴霧劑或不含推進劑氣體之可吸入溶液。本發明之包含活性物質之可吸入粉末可單獨由上述活性物質組成或由上述活性物質與生理可接受賦形劑之混合物組成。

該等可吸入粉末可包括單醣(例如葡萄糖或阿拉伯糖)、二醣(例如乳糖、蔗糖、麥芽糖)、寡-及多醣(例如聚葡萄糖)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇)、鹽(例如氯化鈉、碳酸鈣)或其等彼此之間之混合物。適宜地使用單-或二醣，使用乳糖或葡萄糖，特定言之但非獨一地呈其水合物形式。

適於沉積於肺中之顆粒需要具有小於10微米(諸如1至9微米，例如0.1至5μm，特定言之1至5μm之粒度。活性組分(諸如抗體或片段)之粒度具主要重要意義。

相關技藝中已知可用於製備可吸入噴霧劑之推進劑氣體。適宜之推進劑氣體係選自諸如正丙烷、正丁烷或異丁烷之烴及諸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、環丙烷或環丁烷之氯化及/或氟化衍生物之鹵代烴。上述推進劑氣體可自身或以其混合物形式使用。

特別適宜之推進劑氣體為選自TG 11、TG 12、TG 134a及TG227之鹵化烷烴衍生物。於上述鹵化烴中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)及TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物尤其適宜。

含推進劑氣體之可吸入噴霧劑亦可包含其他組分，諸如共溶劑、穩定劑、表面活性試劑(表面活性劑)、抗氧化劑、潤滑劑及用於調整pH之裝置。相關技藝中已知所有該等組分。

本發明之含推進劑氣體之可吸入噴霧劑可包含至高5重量%活性物質。本發明之噴霧劑包含(例如)0.002至5重量%、0.01至3重量%、0.015至2重量%、0.1至2重量%、0.5至2重量%或0.5至1重量%活性組分。

或者，投與肺之局部投與亦可藉由例如使用諸如噴霧器(例如，連接至壓縮機之噴霧器(例如，連接至由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.製造的Pari Master(R)壓縮機之Pari LC-Jet Plus(R)噴霧器))之裝置投與液體溶液或懸浮液調配物。

本發明之抗體可分散於溶劑中，例如，呈溶液或懸浮液形式輸送。可使其懸浮於適宜之生理溶液(例如，鹽水)或其他藥理可接受溶劑或經緩衝之溶液中。相關技藝中已知的經緩衝之溶液可係每1ml水包含0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二鈉、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg無水檸檬酸、及0.45mg至0.55mg檸檬酸鈉以達成約4.0至5.0之pH。懸浮液可使用(例如)凍乾抗體。

治療性懸浮液或溶液調配物亦可包含一或多種賦形劑。該等賦形劑為相關技藝熟知及包括緩衝液(例如檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液、乙酸鹽緩衝液及碳酸氫鹽緩衝液)、胺基酸、尿素、醇、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(例如，血清白蛋白)、EDTA、氯化鈉、脂質體、甘露醇、山梨糖醇、及甘油。溶液或懸浮液可囊封於脂質體或生物可降解微球體中。該調配物一般將利用滅菌製造製程以實質上滅菌形式提供。

此可包括藉由以下步驟之製造及滅菌：過濾用於調配物之經緩衝之溶劑/溶液、使抗體無菌懸浮於該滅菌經緩衝之溶劑溶液中、及依熟習此項技藝者悉知的方法將該調配物施配至滅菌容槽中。

本發明之可噴射調配物可例如呈封裝於箔封裝袋中之單劑量單位(例如，封口型塑料容器或小瓶)提供。各小瓶裝納單位劑量(以體積計，例如2mL)溶劑/溶液緩衝液。

揭示於本文中之抗體可適於藉由噴射輸送。

亦設想本發明之抗體可藉由使用基因療法來投與。為達成此投與，將適宜DNA組分控制下編碼該抗體分子之重鏈及輕鏈之DNA序列引入患者中使得該等抗體鏈自該等DNA序列表現並原位組裝。

於一個實施例中，本發明包括一種抗體或其片段作為例如共軛至報導分子之藥劑或診斷之用途。因此提供本發明之經標記之抗體或片段。於一個態樣中，提供一種包含本發明之抗體或片段之管柱。

因此，提供一種用作用於諸如以下之用途之試劑的抗-CSF-1R抗體或片段：

1)純化CSF-1R蛋白質(或其結合片段)-其係與基質共軛及用作親和性管柱，或(呈抗-CSF-1R之經修飾形式)用作沉澱劑(例如，呈經藉由另一可經修飾之分子識別的結構域修飾之形式)，其可視需要藉由抗-Fc劑沉澱

2)偵測及/或定量於活的或經固定之細胞(在活體外或在組織或細胞切片中之細胞)上或中之CSF-1R。就此而言之用途可包括作為生物標誌定量CSF-1R，以發揮抗-CSF-1R治療之效應。基於該等目的，候選可呈經修飾之形式使用(例如，藉由添加另一部分，呈基因融合蛋白或化學共軛物，諸如添加報導分子，例如，用於偵測目的之螢光標籤)。

3)純化或分選藉由結合至經依(1)及(2)中所列舉方法修飾之候選所標記之帶有CSF-1R之細胞。

本說明書上下文中之包含意指包括。

在技術上適宜之情況下，可將本發明之實施例組合。

實施例在本文中描述作包括特定特徵/要件。本發明亦關於由該等特徵/要件組成或基本上由其組成之個別實施例。

諸如專利案及申請案之技術參考文獻係以引用方式併入本文中。

特定且明確地列舉於本文中之任何實施例可單獨或以與一或多種其他實施例組合方式構成棄權聲明書之基礎。

進一步於隨後的實例中僅以列示方式描述本發明，該等實例提及以下圖式：圖1A至1F顯示特定胺基酸及多核苷酸序列。

圖2A至2B顯示特定序列之比對。

圖3顯示經用於轉染細胞且於該細胞表面上表現蛋白質之多核苷酸編碼之人類CSF-1R胞外域之序列。該等細胞接著係用於使宿主動物免疫。

圖4顯示藉由抗體Ab969抑制CSF-1與THP-1細胞結合。

圖5a顯示藉由抗體Ab969抑制初代人類單核細胞之CSF-1驅動之存活及增殖。

圖5b顯示藉由抗體Ab969抑制初代人類單核細胞之IL-34驅動之存活及增殖。

圖6顯示藉由抗體Ab535抑制初代鼠科單核細胞之CSF-1驅動之存活及增殖。

圖7顯示經Ab969、人類CSF-1及同型對照物培養之THP-1細胞上細胞表面CSF-1R的含量。

圖8顯示相較於同型對照物而言經Ab969處理之THP-1細胞上細胞表面CSF-1R的相對含量。

圖9顯示經Ab535、CSF-1及同型對照物培養之RAW264.7細胞上細胞表面CSF-1R的含量。

圖10顯示相較於同型對照物而言經Ab535處理之RAW264.7細胞上細胞表面CSF-1R的相對含量。

圖11顯示於藉由CSF-1刺激或藉由Ab969處理後經CSF-1R轉染之HEK293F細胞上CSF-1R磷酸化之程度。

圖12顯示初代人類單核細胞在經Ab969及經CSF-1培養情況下之MCP-1分泌量。

圖13顯示相較於嵌合Ab969.g0藉由人源化抗體969.g5抑制CSF-1介導之單核細胞存活之效應。

圖14顯示藉由Ab969之多種人源化抗體移植物抑制CSF-1介導之單核細胞存活之效應。

圖15a顯示從經單一靜脈內劑量7mg/kg Ab969.g2處理之馬來猴(cynomolgus monkey)採集的血清樣本中CSF-1之濃度。

圖15b顯示從經單一靜脈內劑量1.5mg/kg Ab969.g2處理之馬來猴採集的血清樣本中CSF-1之濃度。

圖15c顯示以7mg/kg及1.5mg/kg劑量對馬來猴投與抗體Ab969.g2於不同時間點對循環非典型單核細胞之效應。

圖16顯示具有人乳癌異種移植物MCF-7之皮下移植物的免疫缺陷裸小鼠中抗體Ab535相對於抗體對照組(陽性對照組)及媒劑對照組之抗腫瘤效應。

圖17顯示原位前列腺癌模型PC-3中抗體Ab535相對於抗體對照組(陽性對照組)及媒劑對照組之抗腫瘤療效。

圖18a顯示基於BALF膠原濃度之Ab535相較於同型對照物對博來黴素(bleomycin)誘發性肺纖維化之治療效應。

圖18b顯示基於Ashcroft得分所測得肺樣本纖維變性病理之Ab535相較於同型對照物對博來黴素誘發性肺纖維化之治療效應。

圖18c顯示基於血清中白蛋白濃度之Ab535相較於同型對照物對博來黴素誘發性肺纖維化之治療效應。

圖18d為博來黴素誘發性肺纖維化研究之小鼠BAL流體中之巨噬細胞數且顯示藉由Ab535治療博來黴素誘發性肺纖維化相較於經同型對照物治療之動物使得BAL流體中之巨噬細胞數減少。數據以平均值±平均標準偏差形式表示；*表示顯著不同於鹽水同型；#表示顯著不同於以同型對照抗體給藥之經博來黴素處理之小鼠(p0.05)

圖19表示取自經鹽水對照、博來黴素加上同型對照物及博來黴素加上Ab535處理之動物之肺之組織病理分析之代表性影像。

圖20a顯示基於BALF膠原濃度之Ab535相較於同型對照物之治療而言對罹患誘發性肺纖維化之ADA缺陷小鼠之治療效應。

圖20b顯示基於依Ashcroft得分所測得肺樣本纖維變性病理之Ab535相較於同型對照物之治療而言對罹患誘發性肺纖維化之ADA缺陷小鼠之治療效應。

圖20c顯示基於血清中白蛋白濃度之Ab535相較於同型對照物之治療而言對罹患誘發性肺纖維化之ADA缺陷小鼠之治療效應。

圖20d顯示肺纖維化ADA缺陷模型小鼠之BAL流體中之巨噬細胞數且顯示以Ab535治療罹患誘發性肺纖維化之ADA缺陷小鼠使得BAL流體中之巨噬細胞數減少。

圖21顯示均經同型對照物或Ab535處理之正常小鼠(ADA+)及罹患誘發性肺纖維化(ADA-)之ADA缺陷小鼠之肺之組織病理分析的代表性影像。

實例

實例1-抗-CSF-1R抗體之生成

免疫化：藉由已經過鍵聯至糖基化磷脂醯-肌醇(GPI)錨蛋白之表現人類CSF-1R胞外域之載體瞬時轉染之同基因RFL6大鼠纖維母細胞使雌性斯潑累格多雷大鼠(Sprague Dawley rat)免疫。圖3顯示SEQ ID NO：39，其為用於大鼠之免疫中之人類CSF-1R胞外域序列。

大鼠以三週時間間隔接受每隻動物3至9×10⁶個經轉染細胞之五次皮下免疫。在與第一次細胞免疫相鄰的部位注射弗氏完全佐劑(Freund’s Complete Adjuvant)(50%含於PBS中)。最後一次免疫後兩週，收穫周邊血液單核細胞(PBMC)及脾臟。

抗體上清液之初級篩選

抗體上清液首先係基於其可與表現於經轉染HEK293細胞上之人類CSF-1R結合之能力藉由螢光微量檢測技術(FMAT)來篩選。

在600×96-孔盤之初級FMAT篩選中識別出約1000個具有抗-CSF-1R反應性之孔。藉由FMAT針對CSF-1R結合抗體之產生篩選出總計約3×10⁸個B細胞(大鼠脾細胞)。

抗體上清液之次級篩選

已設計出中等通量檢測以識別包含中和抗-CSF-1R活性(即，具有防止人類CSF-1與人類CSF-1R受體結合之能力之抗體)之FMAT-陽性孔。在利用人類CSF-1培養之前將抗體上清液與表現CSF-1R之THP-1細胞培養。與THP-1細胞結合之CSF-1含量藉由流式細胞計數法使用抗-CSF-1多株抗體來測得。使用無關抗體上清液作為陰性對照。

對取自779個抗體孔之上清液施行次級篩選及該等孔中有88個孔展現可偵測CSF-1阻斷活性。

抗體上清液之三級篩選

對已在次級篩選中顯示中和活性之抗體上清液測試其妨礙初代人類單核細胞之CSF-1相關性存活之能力。從人體血液純化單核細胞及在20ng/ml人類CSF-1的存在下用各抗體上清液培養1×10⁴個細胞。於72小時的培養之後，依CellTiter Glo分析法測量有活力單核細胞個數。

對取自在二級篩選中識別出之該等抗體孔中的59個抗體孔之上清液施行三級篩選及18個孔展現減低CSF-1-介導之單核細胞存活之能力。

抗體可變區之選殖及阻斷活性之再分析

自該等18個抗體孔嘗試可變區(V-區)選殖從而證實CSF-1-中和活性。重及輕免疫球蛋白V-區係藉由RT-PCR使用對大鼠抗體恆定區具特異性之引子及鏈合至編碼大鼠免疫球蛋白前導肽之序列之冗餘引子組來擴增。從14種抗體回收V-區基因並選殖至重-及輕鏈人IgG4表現載體中。

抗體載體對係經瞬時轉染至HEK293F細胞中及針對THP-1細胞之CSF-1-中和活性測試經處理之培養基(如上所述)。該等抗體中有九種抗體相較於經處理之培養基對照具有部分或完全抑制CSF-1結合之能力。

九種中和抗-CSF-1R抗體之序列分析

九種中和抗體係經定序以評估序列多樣性。所有這九種抗體為獨特的。該等抗體係經選殖並表現，以達成進一步概況研究。

實例2-抗人CSF-1R嵌合Ab969及抗鼠科CSF-1R Ab535之活體外性質

i)嵌合Ab969之表現

於實例1中識別之九種中和抗體之可變區係經選殖至個別重-及輕鏈表現載體中且經表現為全長人類IgG4抗體。

VH基因係經選殖至包含編碼天然前導序列及具有絞鏈穩定突變S241P之人類γ-4重鏈恆定域之DNA的載體pVhg4FL(V19H)中。該等VL基因(κ)係經選殖至包含編碼天然前導序列及人類κ鏈恆定區(Km3同種異型)之DNA之載體pKH10.1(V4L)中。

抗體藉由將重-及輕鏈載體對匹配至CHO-K1細胞中之瞬時共轉染來表現。進行抗體於PBS pH 7.4中之純化，使得最終製劑中聚集物之濃度小於1%。

這九種抗體之組包含命名為抗體969之抗體。包含大鼠可變區及人類γ-4重鏈恆定區及人類κ鏈恆定區之嵌合抗體於以下實例中稱為抗體969或抗體969cHcL或抗體969.g0。

ii)配體阻斷檢測

由流式細胞計數法來評估該等九種抗體之各者抑制CSF-1與THP-1細胞結合之活性。將THP-1細胞與0.5、0.125、0.031、0.0078及0.00195μg/ml下之各抗體一起培養30分鐘。無關IgG4抗體充當同型對照物。於洗滌之後，將該等細胞與0.5μg/ml人CSF-1一起培養30分鐘。於進一步洗滌之後，藉由與生物素化之抗-CSF-1抗體及與Alexa488共軛之鏈黴親和素之連續培養來偵測結合的CSF-1。藉由流式細胞計數法來測量與受體結合之配體並繪製中位螢光強度(MFI)。

此檢測識別四種較所測試的剩餘抗體優異之抗體(包括Ab969)，證實可於濃度31.3ng/ml下完全抑制CSF-1結合。關於Ab969之結果顯示於圖4中。

iii)CSF-1-與IL-34-介導之單核細胞存活之抑制

抗-人類CSF-1R：對經純化之抗-人類CSF-1R抗體測試其抑制初代人類單核細胞之受CSF-1及IL-34驅動之存活及增殖之能力。於各檢測中，絲裂原(CSF-1或IL-34)係以可提供單核細胞之最大刺激的濃度使用。

基於發克梯度(Ficoll gradient)自新鮮人全血製造人PBMC及藉由陰性篩選來純化單核細胞。該等單核細胞與0.25μg/ml抗體及20ng/ml CSF-1一起培養72小時及利用CellTiter Glo分析來確定有活力細胞的相對數量。發光讀取值係與有活力細胞的數量相關聯。結果顯示於圖5a中。

基於發克梯度自新鮮人全血製造人PBMC及藉由陰性篩選來純化單核細胞。該等單核細胞與0.25μg/ml抗體及20ng/ml IL-34一起培養72小時及利用CellTiter Glo分析來確定有活力細胞的相對數量。發光讀取值係與有活力細胞的數量相關聯。結果顯示於圖5b中。

四種該等抗體(包括Ab969)證實就CSF-1(圖5a)及IL-34(圖5b)刺激二者而言可較剩餘抗體優異地抑制單核細胞存活，與其配體阻斷活性一致。

抗-鼠科CSF-1R：從小鼠脾臟純化初代鼠科CD11b⁺單核細胞。該等單核細胞接著在鼠科CSF-1(mCSF-1)之滴定下培養24小時。藉由ELISA測得MCP-1釋放至細胞培養基中及證實mCSF-1劑量相依地釋放MCP-1。於本研究的一個個別組中，伴隨mCSF-1之滴定添加10μg/ml抗-鼠科CSF-1R Ab535。可藉由Ab535於所測試的CSF-1的所有濃度下完全地抑制MCP-1之釋放(圖6)。

使用初代鼠科單核細胞以100ng/ml之恆定CSF-1濃度及Ab535之滴定來進行MCP-1釋放檢測。證實MCP-1釋放之劑量相依抑制及計算得IC₅₀。兩個獨立實驗之Ab535的IC₅₀平均值係經測量為8.08ng/ml。

結論：藉由CSF-1處理鼠科單核細胞導致MCP-1之劑量相依釋放，該釋放可藉以10μg/ml Ab535處理完全抑制。Ab535以劑量相依方式抑制自鼠科單核細胞之CSF-1-驅動之MCP-1釋放，IC₅₀平均值為8.08ng/ml(n=2)。該IC₅₀值與藉由抗-人類CSF-1R抗體展現之IC₅₀值相似。

iv)親和力

於BIAcore檢測中藉由對經純化之重組CSF-1R/Fc融合蛋白質之結合動力學之測量來測試抗體之結合CSF-1R之能力。

檢測形式為藉由經固定的抗-人IgG,F(ab’)₂捕捉抗-CSF-1R抗體，接著將hCSF-1R/Fc滴定於捕捉的表面之上。使用BIAcore 3000(GE Healthcare Bio-Sciences AB)進行BIA(雙分子相互作用分析)。所有實驗均在25℃下進行。透過胺偶聯化學法將親和純化F(ab’)₂片段山羊專一性抗人IgG,F(ab’)₂片段(Jackson ImmunoResearch)固定於CM5感測晶片(GE Healthcare Bio-Sciences AB)上達成~5000個響應單位(RU)的水平。使用HBS-EP緩衝液(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%表面活性劑P20，GE Healthcare Bio-Sciences AB)作為操作緩衝液且流速為10μl/min。進行抗-CSF-1R抗體之注射，可提供於經固定的抗人IgG,F(ab)₂上約100 RU之捕捉濃度。

重組人類CSF-1R/Fc(R&D Systems)於5nM下以30μl/min流速輸入於捕捉的抗-CSF-1R抗體上維持5min接著在解離階段使該流速增加至100μl/min維持30min。於5nM下之注射連同對應緩衝液對照進行兩次。該等感應圖用於生成解離速率。自2.5nM以30μl/min流速將重組人類CSF-1R/Fc滴定於捕捉的抗-CSF-1R抗體上維持5min接著是10min的解離階段。該等感應圖用於生成解離速率。可藉由40mM HCl之10μl注射液接著10mM NaOH之5μl注射以10μl/min流速使該表面再生。使用BIA評估軟體(4.1版)遵循標準程式來分析雙重參照經減去背景之結合曲線。藉由擬合演算法來確定動力學參數。

四種所測試抗體中有三種展現小於10pM之親和力(K_D)。有利地將此與抗鼠科CSF-1R類似試劑Ab535比較。針對於Ab969及Ab553之結果顯示於表1中。

亦依基於細胞之分析法使用THP-1細胞來測量抗體之親和力。藉由Alexa-488螢光染料直接標記該等抗體及藉由定量流式細胞計數法來測量親和力。另一BIAcore分析證實抗體之螢光共軛並不改變對重組CSF-1R蛋白質之親和力。結果顯示於表2中。

由這兩種方法衍生之絕對親和力值係不同的，且該差異通常在比較該等兩種系統時觀測到。然而，該基於細胞之方法證實抗體以高親和力與CSF-1R結合。

v)CSF-1結合之抑制(IC₅₀)

四種抗體係藉由測量其抑制CSF-1結合至THP-1細胞之相對效力來分析。所有四種抗體於該種檢測形式中均展現CSF-1結合之有效抑制，且IC₅₀值為小於5ng/ml(~30pM)。

vi)抗體交叉反應性

測試四種抗體與恆河猴、馬來猴及犬科全長CSF-1R之交叉反應性。除了人CSF-1R之外，所有四種抗體均與恆河猴及馬來猴CSF-1R結合，此證實明顯高於同型對照物程度之完全結合。

vii)CSF-1R內化

Ab969：將THP-1細胞與Ab969一起培養0、0.5、2、4、24及48小時。亦藉由分別充當陽性及陰性對照之人類CSF-1及同型對照物處理細胞。在各時間點，藉由流式細胞計數法來測量細胞表面CSF-1R含量(圖7)。計算得經Ab969處理之細胞上細胞表面CSF-1R相對同型對照物之相對含量並顯示於圖8中。

藉由重組CSF-1處理THP-1細胞導致細胞表面CSF-1R含量快速且持續地減低；天然配體與其同源受體結合並驅動配體-受體複合物之內化。

經Ab969處理之THP-1細胞在整個48小時時程中比未經處理及經同型對照物處理之THP-1細胞展現更高細胞表面CSF-1R表現程度。該數據強力地顯示藉由Ab969處理THP-1細胞在長達處理後48小時並不致使細胞表面表現之hCSF-1R內化。

隨著時間之發展，除了經CSF-1處理之細胞之外，於未經處理及經處理之THP-1細胞上之細胞表面表現之CSF-1R顯著增加。此可能係歸因於在實驗48小時時間期內於細胞生長期間表現改變及可潛在性為應激反應。

為了提供Ab969不增強受體內化之進一步的證據，及亦排除THP-1細胞系為非生理相關之可能性，亦在內化檢測中使用初代人類單核細胞。衍生自該檢測之數據亦證實Ab969並不致使健康初代人類單核細胞上細胞表面CSF-1R快速內化。

Ab535：小鼠白血病單核細胞/巨噬細胞細胞系RAW264.7表現高程度之鼠科CSF-1R(mCSF-1R)，且代表可用於測試抗-鼠科CSF-1R抗體Ab535是否可引起受體內化之適宜的基於細胞之系統。

將RAW264.7細胞與Ab535一起培養0、0.5、2、4、24及48小時。亦藉由分別作為陽性及陰性對照之人類CSF-1及同型對照物處理該等細胞。於各時間點，藉由流式細胞計數法來測量細胞表面CSF-1R含量(圖9)。計算細胞表面CSF-1R相對於同型對照物之相對含量，並顯示於圖10中。

數據顯示，藉由重組CSF-1處理THP-1細胞會導致細胞表面CSF-1R含量快速且持續地減低。

在經人類CSF-1處理2小時之RAW264.7細胞上觀測到細胞表面mCSF-1R含量比未經處理及經同型對照物處理之細胞明顯減低。這種減低維持於整個48小時的研究。此證實人類CSF-1會引起mCSF-1R內化，並驗證該實驗系統可用於監測受體內化。

與未經處理及經同型對照物處理之細胞相比，經Ab535處理之RAW264.7細胞在整個48小時時程中展現相似含量的細胞表面mCSF-1R。因預期抗體介導之受體內化在該時間範圍內發生，故該數據強力地顯示Ab535不會觸發mCSF-1R內化。

為提供Ab535不會增強受體內化之進一步的證據，在內化檢測中使用初代鼠科CD11b⁺單核細胞-巨噬細胞。該等結果亦證實藉由Ab535處理小鼠單核細胞-巨噬細胞在處理後長達24小時仍未導致細胞表面所表現mCSF-1R之內化。

viii)CSF1-R活化

CSF-1與CSF-1R結合，導致形成受體二聚物，此藉由使激酶域親密接近在一起而觸發快速受體磷酸化。此結果隨後導致受體內化及若干已知其詳細特徵之信號傳導路徑(包括Ras-MAPK路徑)之活化。可能係由抗-CSF-1R抗體引起受體叢集並觸發下游信號級聯。此可能為該應抑制受體信號傳導之抗體所不期望之性質，因此，使用兩種獨立活體外檢測形式來測試藉由Ab969之受體促效作用。

於第一檢測形式中，將抗體與經人全長CSF-1R轉染之細胞一起培養及藉由西方墨點法(Western blotting)來監測受體及下游信號傳導分子之磷酸化。

THP-1細胞系代表監測CSF-1R之活化狀態之起始點。然而，該細胞系中CSF-1R之表現水平相當低而難以進行生物化學分析。因此，實驗系統係經設計成可穩健地偵測CSF-1R磷酸化程度。可在兩個酪胺酸殘基Y723及Y809之處偵測到CSF-1R之磷酸化。此外，p44/42 MAPK(Erk1/2)於T202及Y204之處之磷酸化係經測量為CSF-1R活性之獨立讀取。於所有實驗中，包括藉由CSF-1刺激作為陽性對照。

藉由表現全長CSF-1R之質體載體轉染HEK293F細胞。於無血清條件下培養24小時之後，藉由100μg/ml至0.001μg/ml滴定Ab969.g0來刺激細胞達5分鐘。亦藉由500ng/ml重組CSF-1處理該等細胞以提供陽性對照。包括未經處理之細胞作為陰性對照。衍生自經處理及未經處理之細胞之蛋白質裂解物係藉由SDS-聚丙烯醯胺電泳分離並點漬至硝基纖維素上。使用抗體對磷酸化-Y723 CSF-1R(Cell Signaling Technology #3151)、磷酸化-Y809(Cell Signaling Technology #3154)、全CSF-1R(Cell Signaling Technology #3152)及磷酸化-ERK1/2(p44/42 MAPK)(Cell Signaling Technology #5301)進行西方細胞免疫墨點法。

未受刺激之經CSF-1R轉染之HEK293F細胞展現低基礎程度之CSF-1R磷酸化。藉由CSF-1刺激細胞導致殘基Y723及Y809之處CSF-1R磷酸化之程度可由西方墨點分析法輕易地觀測到(圖11)。亦於CSF-1處理後明顯地刺激ERK1/2之磷酸化。藉由抗體Ab969.g0處理經轉染之HEK293F細胞並不刺激CSF-1R之磷酸化或增強ERK1/2活化。

於第二檢測中，將抗體Ab969(單體及交聯)與初代人類單核細胞一起培養及使用MCP-1分泌作為CSF-1R活化之標記。人類單核細胞之CSF-1處理致使其釋放單核細胞化學引誘蛋白-1(MCP-1)。若抗-CSF-1R抗體具有在單核細胞上活化CSF-1R受體之能力，則預期將發生MCP-1之釋放。

先前已述的生物化學檢測僅使用單體抗-CSF-1R抗體。然而，可能係，交聯IgG1將具有增強之使CSF-1R分子親密接近並觸發酪胺酸磷酸化及下游信號傳導之能力。為評估此點，亦使用已藉由抗-人-Fc抗體交聯化之Ab969.g0來進行MCP-1檢測。

可如下自人全血製造人類單核細胞：採集60至100ml人全血於BD Vacutainer 10ml肝素鋰171 IU管中。將血液分配至3至4個Leucosep Ficoll管(Greiner Bio-One)中並用PBS加滿。該等管於1000g、20℃下無中斷地離心10分鐘，及收集PBMC層。將該等細胞粒化，且接著使用陽性篩選人CD14珠粒(Miltenyi Biotec 130-050-201)依照製造商協定單離單核細胞。藉由添加山羊抗人IgG Fc抗體(R&D Systems G-102-C)以2：1之Ab969.g0：Fc比使抗體Ab969.g0交聯。於存在抗體Ab969.g0或交聯Ab969.g0之劑量滴定(半對數連續稀釋，包括16種濃度，最大濃度為10μg/ml)下，將單核細胞以20,000個細胞/孔接種在培養基中。於存在及不存在100ng/ml CSF-1、及於存在及不存在抗人Fc抗體(於與以抗體Ab969.g0之頂濃度(5μg/ml)呈現相同的濃度)下，對照孔不包含抗體。將該等細胞培養24小時，該等盤係經離心至集結粒細胞，及收集上清液。藉由MSD(K151AYB-2)依照製造商協定測量分泌的MCP-1。

衍生自實驗之結果顯示於圖12中。不論在單體或交聯形式中，就任何Ab969.g0處理而言，未偵測到MCP-1含量之增加；經處理之細胞之培養基中MCP-1之濃度與未經處理之細胞相等。如所期，經CSF-1處理之細胞使得MCP-1含量顯著且重複性地增加。

實例3-抗體969之人源化及人源化移植物之篩選

四種抗-CSF-1R抗體係基於其在實例2中測得之親和力及性質而經選擇用於人源化。

i)人源化移植物之製造

抗體969及970係藉由將來自大鼠抗體V區的CDR接枝至人類生殖株抗體V區架構上而人源化。

除了使用組合Chothia/Kabat定義之CDR-H1(參見Adair等人，1991 Humanised antibodies.WO91/09967)以外，自供者接枝至受體序列之CDR係如Kabat(Kabat等人，1987)定義。

人類V區VK1 2-1-(1)O12加上JK4 J-區(V BASE，http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)係經選擇為用於輕鏈CDR之受體。人類V區VH2 3-1 2-70加上JH3 J區(V BASE，http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)係經選擇為用於重鏈CDR之受體。

衍生自大鼠V區之許多架構殘基保留於人源化序列中，如表1中所顯示。

編碼初始人源化輕及重鏈V區序列之基因(分別命名為gL1及gH1)係經設計並由自動化合成方法來建構。輕及重鏈V區之其他變體係藉由以寡核苷酸定點突變修飾gL1及gH1基因來創建。

VK基因(gL1至gL9)係經選殖至包含編碼人類κ鏈恆定區(Km3同種異型)之DNA之人類輕鏈表現載體pKH10.1中。VH基因(gH1及gH2)係經選殖至包含編碼具有絞鏈穩定突變S241P之人類γ-4重鏈恆定區之DNA之人類γ-4重鏈表現載體pVhγ4P FL中(Angal等人，1993,Mol Immunol.30：105-8)。編碼變體輕及重鏈之質體之不同組合係經共轉染至HEK293F中，導致人源化重組969抗體表現。

其他三種抗-CSF-1R抗體亦藉由提供在重鏈及輕鏈中包含預測具重要意義之許多個供者殘基之守恆移植物及不包含供者殘基之完全人源化移植物而人源化。

ii)人源化抗體之親和力

評估各人源化移植物之相對親本嵌合抗體而言之(i)藉由BIAcore測得之與人CSF-1R之結合親和力及(ii)藉由ThermoFluor分析測得之熔化溫度(Tm)。據信熔化溫度可提供抗體分子穩定性之早期指示，且不穩定抗體通常展現小於75.0℃之Tm。

顯示Ab969人源化之階段之移植物顯示於表5中。表5亦顯示Ab696之嵌合抗體(969cHcL)。守恆移植物(969gH1gL1)展現2.4pM之親和力常數(K_D)，因此，相較於嵌合大鼠抗體(969cHcL)，親和力並未顯著損失。969gH1gL1守恆移植物之Tm為78.8℃及因此高於75.0℃之臨限值。於重鏈中由A78供者殘基代換V78以產生969gH2gL1不會減低抗體親和力(K_D=2.3pM)。於由K38、Y71及F87供者殘基分別逐步代換Q38、F71及Y87後，未觀察到親和力改變。不包含供者殘基之最終人源化移植物969gH2gL8展現與親本嵌合抗體(4.1 pM)相似的親和力。

Ab969在CDR-L2及架構之接面之處具有有潛力的DG異構化基序。969gH2gL7及969gH2gL8移植物中之該DG位點天冬胺酸殘基係經突變為絲胺酸以提供惰性SG序列。藉由BIAcore測量對CSF-1R之親和力及未偵測到親和力顯著損失(表6)。此外，最終969H2gL7(SG)及969gH2gL8(SG)移植物分別保留80.5℃及79.9℃之高Tm。

Ab969及一種其他抗-CSF-1R抗體Ab970之人源化產生具有與親本嵌合抗體相當的親和力(K_D)及可提供分子穩定性之初始預測值之Tm之完全人源化抗體(不存在大鼠供者殘基)。Ab969之完全人源化變型(969gH2gL8 SG))再命名為Ab969.g5。因此，Ab969之嵌合變型將稱為Ab969.g0。

再次利用BIAcore分析法來測量Ab969抗體之經純化之嵌合及人源化移植物對重組CSF-1R之親和力。以往的在人源化製程期間進行之BIAcore實驗改用粗製細胞上清液替代經純化之抗體來進行。偵測到親和力略微減低，K_D值從約4pM增加至5pM。

iii)藉由Ab969.g0及Ab969.g5抑制CSF-1介導之單核細胞存活

CSF-1為培養中單核細胞之活化及存活所需要的；若移除CSF-1，則單核細胞快速地經歷細胞凋亡。設計一種檢測法，使用MCP-1(單核細胞趨化蛋白-1；亦稱為CCL2(趨化因子C-C基序配體2))作為讀取。於CSF-1刺激後，人類單核細胞分泌MCP-1，MCP-1可通常在刺激後第24小時於細胞上清液中由ELISA偵測到。藉由阻斷CSF-1-結合之抗體抑制CSF-1R信號傳導會導致MCP-1分泌之減少。

基於發克梯度自新鮮人全血製造人PBMC及藉由陽性篩選來純化CD14⁺單核細胞。總計2×10⁴個單核細胞與10μg/ml至0.35pg/ml抗體之半對數系列稀釋在100ng/ml人類CSF-1的存在下培養24小時。包含包括「無抗體，無CSF-1」及「無抗體，含有CSF-1」之對照以提供最小及最大MCP-1釋放值。於24小時的培養之後，藉由離心粒化該等細胞及收集上清液。使用人CCL2/MCP-1 DuoSet ELISA(R&D Systems DY279)遵循製造商使用說明來測量MCP-1之濃度。

於此後，該檢測稱為「MCP-1抑制檢測」。

MCP-1抑制檢測用於比較人源化969.g5與嵌合Ab969.g0之間之活性。使用單核細胞之四種不同供者來進行五種獨立檢測。於所有檢測中，Ab969.g5人源化移植物展現意想不到地明顯比親本嵌合抗體969.g0低的活性。單個代表性實驗顯示於圖13中。相較於969.g5之333.0ng/ml，單核細胞檢測中969.g0之IC₅₀平均值為24.6ng/ml。此指示在使用該檢測形式來比較兩種抗體時抗體效力減低13.5倍。

使用Ab969進行一系列實驗以顯示人源化抗體於MCP-1抑制檢測中展現低活性之原因。數據顯示在MCP-1抑制檢測中所觀測到Ab969.g5活性之損失係歸因於將抗體及配體添加至標靶細胞之順序。Ab969.g0及Ab969.g5二者之活性在施用競爭性檢測形式之情況下減低，但更重要地，偵測到其阻斷活性間較大的差異。為分析人源化Ab969之較低「結合」是否造成效力之減低，進行BIAcore分析。該等數據已鑑定，在Ab969.g0及Ab969.g5之K_D相似時，相對於969.g0之2.16×10⁶M^-1s^-1，Ab969.g5之Ka更低，為1.57×10⁶M^-1s^-1(參見表5)。於一種競爭性檢測中，在CSF-1及抗-CSF-1R抗體競爭與相同受體結合之情況下，若配體之結合速率亦高且配體以高濃度存在，則較慢的抗體結合速率會導致低阻斷活性。已知人類CSF-1具有與抗體相類似的特別高的結合速率2.19×10⁶M^-1s^-1，，且該檢測以高CSF-1濃度(250ng/ml)進行。

為進一步證實969.g5之阻斷活性之減低係歸因於抗體之先天性質，已開發出可測量CSF-1與CSF-1R結合之ELISA。該方法自此處開始稱為「ELISA配體-阻斷檢測」。利用競爭性結合來進行此檢測，其中CSF-1及抗體係在施用至盤結合CSF-1R之前預混合。亦進行該檢測以評估CSF-1濃度對抗體活性之影響。

在配體阻斷ELISA中使用1ng/ml之CSF-1濃度來測量969.g0及969.g5之IC₅₀時，兩種抗體看來分別具有12.83ng/ml對19.65ng/ml之IC₅₀之相似活性。在該檢測中使用10ng/ml CSF-1之濃度時，Ab969.g0及Ab969.g5二者之IC₅₀增加，但更重要地，兩者之間之差值分別進一步增加至79.29ng/ml對268.10ng/ml。可在檢測中使用100ng/ml CSF-1持續該種趨勢，其中Ab969.g0及Ab969.g5可提供分別為828.70ng/ml及3947.00ng/ml之IC₅₀值。競爭性檢測證實Ab969.g5在阻斷CSF-1與CSF-1R結合方面其活性比Ab969.g0小。效力之這種減低隨著CSF-1濃度之增加變的更為顯著。

iv)在MCP-1抑制檢測中鑑別Ab 969之具有與嵌合Ab 969相當的活性之人源化移植物

藉由瞬時表現製造Ab969人源化中間移植物組以致可在活體外活性之間作比較(表8)。對應之嵌合抗體(Ab969.g0)及完全人源化移植物(Ab969.g5)亦包含於瞬時表現中以致可於相同批次中進行抗體特徵之直接比較。

於MCP-1抑制檢測中測試各抗體之活體外活性。選擇利用藉由一種抗體濃度之CSF-1滴定之檢測形式，此乃因該種形式可實現大抗體組之快速篩選並突顯任何差異化CSF-1R阻斷活性。於該檢測中，偵測到MCP-1自初代人類單核細胞之劑量相依釋放及各抗體阻斷CSF-1R活性之相對能力係藉由釋放MCP-1之CSF-1濃度測得。於存在重組人類CSF-1(2倍系列稀釋，包括18種濃度，最大濃度為500ng/ml)之滴定下，將單核細胞以20,000個細胞/孔接種在培養基中。添加1μg/ml單一劑量之抗體。將該等細胞培養24h及收集上清液。藉由ELISA測量分泌的MCP-1。MCP-1抑制檢測顯示抗體Ab969.g2及Ab969.g7保有高CSF-1R阻斷活性，且這兩種實體可在CSF-1以大於100ng/ml之濃度添加至單核細胞時完全抑制MCP-1分泌(圖14)。於該檢測中，對於Ab969.g5而言偵測到活性顯著損失，此僅可在至多10ng/ml之CSF-1濃度時抑制MCP-1分泌。類似地，抗體Ab969.g9相較Ab969.g2及Ab969.g7展現低CSF-1R阻斷活性。

於MCP-1檢測中測量選定的Ab969人源化移植物之IC₅₀以更為徹底地評估其抑制CSF-1介導之單核細胞活化之相對能力。使用若干種不同供者於不混合來生自混合來源之單核細胞聚集下評估抗體活性被視為具重要性。表9顯示來自使用6種不同供者對Ab969進行之檢測之累積抗體之IC₅₀值。

Ab969.g2及Ab969.g7人源化移植物均顯示與嵌合Ab969.g0抗體可相比擬的相對IC₅₀。明顯對比地，Ab969.g5於該檢測中展現小得多的效力(平均嵌合/移植物IC₅₀比值為19.6)。

v)人源化Ab696抗體組之親和力

藉由BIAcore測量各Ab969人源化抗體移植物及親本嵌合抗體之親和力(表10)，其中進行三個獨立實驗及計算得平均值。數據顯示在自嵌合分子(Ab969.g0)至「完全人源化」抗體Ab969.g5之人源化製程期間親和力(K_D)似乎並沒有改變。然而，抗體「結合速率」在人源化進行超過Ab969.g2移植物時減小；Ab969.g4及Ab969.g5均具有比前述移植物更低的K_a值。另外，就Ab969.g5而言之K_a低於Ab969.g4，潛在性地表明DG異構化位點突變為SG又進一步地使抗體結合速率減小。

結論：於若干檢測中對Ab969人源化移植物組之測試顯示於輕鏈中位置71之處之酪胺酸殘基(例如Y71)可改良抗體之活性。由Y71代換例如苯丙胺酸導致抗體結合速率相對親本嵌合分子減小(低K_a)。於監測CSF-1R在初代人類單核細胞中之活性之檢測(MCP-1抑制檢測)中顯示，此導致抗體阻斷CSF-1與CSF-1R結合之能力減低。

實例4-人源化Ab696組之分子穩定性

i)熱穩定性

由兩種獨立方法來確定熱穩定性(測得為熔化溫度，Tm)；一種方法係藉由使螢光染料結合至暴露之疏水性表面來監測去折疊(Thermofluor方法)，另一種方法係藉由示差掃描熱量分析儀(DSC)，為正交技術。

藉由Thermofluor針對抗體969(含於PBS pH7.4中)之各種移植物測得之T_m概述於表11中。

總言之，如藉由Thermofluor測得之Fab’T_m顯示大多數969移植物相較於IgG4對照更具熱穩定性。

ii)樣本濃度對聚集傾向之效應

關於儲存期間樣本穩定性之預測，研究抗體濃度對在PBS pH 7.4中之穩定性之效應。

實驗1：將該等抗體濃縮至>10mg/ml及於室溫下培養5天。於濃縮(T₀)後不久，969.g7顯示渾濁及969.g8顯示略為乳白。相對地，根據目測檢查判斷969.g5樣本為清透。於室溫下培養5天之後，965.g5樣本保持清透，而969.g7及969.g8之聚集已進一步發展，各顯示重沉澱。

從本研究可將該等樣本按照在該等條件下之抗聚集性順序分級為如下：969.g5>969.g8>969g7。

實驗2：於濃縮之前，除了顯示乳白之969.g6(4.68mg/ml)以外，根據目測檢查觀察到所有這三種抗體樣本為清透。於濃縮至16mg/ml後，於室溫及4℃下儲存24小時後均觀察到969.g6之沉澱。然而，969.g1及969.g4二者保持目測清透。於5天的進一步培養之後，樣本969.g1在室溫及4℃下均觀察到明顯的大顆粒。如根據目測檢查判斷，於室溫或4℃咸未觀察到樣本969.g4聚集。

由本研究可證實969.g6在以低濃度(4.68mg/ml)儲存於PBS pH 7.4中時具有部分聚集不穩定性。另外，藉由進一步的抗體濃縮來促進該沉澱。經濃縮之969.g1顯示較緩慢之聚集速率，而經濃縮之969.g4於任一種儲存溫度下均維持穩定長達5天。具穩定性至聚集之順序因此為：969.g4>969.g1>969.g6。

實驗3：抗體969.g2、969.g5、969.g7及969.g9

於濃縮(T₀)後不久、於過夜培養之後及於濃縮後5天時，對樣本進行分析。在濃縮之前根據目測檢查觀察到所有樣本為清透及不存在顆粒形成之證據。於濃縮至23.07mg/ml後不久，如已先前在實驗1中所觀察到，969.g7樣本顯示沉澱。就969.g9而言觀察到存在輕微乳白，此在室溫或4℃下儲存24小時之後變的更為顯著。其他所有969移植物於濃縮後不久根據目測檢查觀察到顯示清透。

於21天的培養之後，相較於室溫下過夜培養之後所觀察無顯著改變；969.g7及969.g9移植物二者由於樣本之濃縮而聚集，然而，其他樣本未出現明顯可見聚集。

總言之，969.g2樣本因濃度增加而顯示最小聚集傾向。此亦與如藉由Thermofluor測得之最高T_m相關聯。

結論：於人源化Ab969組之表現及純化期間，明瞭提高抗體濃度高於10mg/ml會導致部分人源化抗體移植物快速沉澱。明確言之，Ab969.g1、Ab969.g6及Ab969.g7形成沉澱，而Ab969.g2、Ab969.g4及Ab969.g5未形成沉澱。該數據顯示由輕鏈中位置38之處之離胺酸殘基(K38)代換麩醯胺酸可在經濃縮高於10mg/ml之情況下改良抗體穩定性。

實例5 Ab969.g2之活體外分析

i)Ab969.g2之序列

Ab969.g2包含gL7輕鏈移植物及gH2重鏈移植物。大鼠抗體(供者)V區序列與人類生殖株(受體)V區序列之間之比對及用於輕鏈移植物gL7及重鏈移植物gH2之最終人源化序列顯示於圖2A及2B中。

於移植物gH2中之重鏈架構殘基均衍生自人類生殖株基因。由在人類重鏈架構之位置1之處之麩醯胺酸殘基改為麩胺酸(E1)以例如藉由在抗體及抗體片段之N-端將麩醯胺酸轉化為焦麩胺酸提高均質產物之表現及純化。

除了殘基71(Kabat編號)以外，移植物gL7中之輕鏈架構殘基均衍生自人類生殖株基因，其中供者殘基酪胺酸保留。該殘基之保留提供改良之人源化抗體效力，如實例3中所顯示。

ii)IL-34相依人類單核細胞活化之抑制

在IL-34-相依人類單核細胞檢測中評估Ab969.g2相較於969.g0之活性。使用兩種獨立單核細胞供者來進行該實驗及計算得IL-34介導之單核細胞刺激之抑制之平均IC₅₀(表12)。Ab969.g2與Ab969.g0之間之IC₅₀無顯著差異。

於存在100ng/ml重組人類IL-34及劑量滴定抗-CSF-1R抗體(半對數系列稀釋，包括16種濃度，最大濃度為10μg/ml)下，將初代人類單核細胞以20,000個細胞/孔接種。將該等細胞培養24小時及收集上清液。藉由ELISA(R&D systems DY279)測量分泌的MCP-1。該圖顯示MCP-1生成相對僅含CSF-1之對照之百分比抑制。

iii)Ab969.g2與人類CSF-1R之SNP之結合

已報告在人類群體中存在位於人類CSF-1R基因之配體結合域中之四種非同義單核苷酸多態(SNP)。該等SNP為V32G、A245S、H247P及V279M(圖1F)。人類CSF-1R之各SNP變體產生並穩定表現於細胞系中。藉由流式細胞計數法來證實Ab969.g2與各SNP之結合。

實例6 於馬來猴中之藥效動力學標記分析

進行針對人源化單株抗-CSF-1R抗體969.g2之藥物動力學/藥效動力學(PK/PD)研究以證實該抗體於非人類靈長類動物(馬來猴)中之藥理學活性。對三隻馬來猴之群組靜脈內投藥7mg/kg(組別1)或1.5mg/kg(組別2)單一劑量的969.g2抗體。抗體具良好耐受性，且無不良臨床徵兆。在25天研究期間之多個時間點採集血清樣本。

藉由ELISA測量969.g2的血清濃度及進行藥物動力學分析(表13)。利用WinNonlin軟體計算得PK參數。

t_1/2為抗體於血清中之半衰期。

C_最大為抗體於血清中之峰值濃度。

AUC為曲線下方面積(濃度-時間曲線之積分)及提供藥物總暴露量之指示。

清除率為每單位時間清除藥物之血漿之體積。

Vol.Dist.為分佈體積，為藥物分佈之表觀體積。

在觀察值及預測值之間存在良好關聯性(動物2除外且視為離群點)。C_最大與劑量成比例；AUC大於劑量比例，指明於較高劑量下清除較慢。在血清中偵測到大部分969.g2。

用於清除CSF-1之主要路徑係透過結合至其同源受體CSF-1R。預期CSF-1與CSF-1R結合之阻斷係藉由防止受體介導之清除來增加CSF-1之血清濃度；為一種已於鼠科模型中觀察到的現象。因此，血清CSF-1濃度之增加為CSF-1R結合及抑制之藥效動力學標記。

969.g2之兩種劑量均促使血清CSF-1快速且顯著地累積。該效應係與劑量相關，且7mg/kg劑量可提供比1.5mg/kg劑量高約10倍之峰值CSF-1濃度。藉由CSF-1含量之標準化觀測到藥物動力學/藥效動力學關係遵循抗體清除率。就兩個治療組而言，CSF-1含量在研究結束時返回至基線。結果顯示於圖15a及15b中。

圖15a顯示從經單一靜脈內劑量之7mg/kg Ab969.g2處理之馬來猴採集的血清樣本中CSF-1之濃度。於兩個獨立檢測中測定CSF-1之血清濃度。該圖顯示組1(7mg/kg)中三隻動物之CSF-1之平均濃度與標準誤差(正方形)。亦顯示Ab969.g2之平均血清濃度(圓形)。

圖15b顯示從經單一靜脈內劑量之1.5mg/kg Ab969.g2處理之馬來猴採集的血清樣本中CSF-1之濃度。於兩個獨立檢測中測量CSF-1之血清濃度。該圖顯示組2(1.5mg/kg)中三隻動物之CSF-1之平均濃度與標準誤差(正方形)。亦顯示Ab969.g2之平均血清濃度(圓形)。

循環人類及馬來猴單核細胞有兩個主要群組；(i)CD14+ CD16-「典型」單核細胞及(ii)CD14+ CD16+「非典型」或「常駐」單核細胞。鼠科模型已證實常駐組織巨噬細胞(包括TAM)係衍生自非典型單核細胞群組。另外，非典型單核細胞係衍生自典型單核細胞群組之進一步的分化。藉由全血之四色流式細胞計數監測於以969.g2給藥之馬來猴中之循環單核細胞群組。使用抗馬來猴-CD45-PerCP、抗人類-HLA-DR-APC、抗人類-CD14-FITC(My4純系)及抗人類-CD16-PE(3G8純系)抗體進行流式細胞計數。就各抗體而言使用適宜之同型對照物來設置閘。典型單核細胞係定義為CD45⁺ HLA-DR⁺ CD14⁺ CD16^-。非典型單核細胞係定義為CD45⁺ HLA-DR⁺ CD14⁺ CD16⁺。

969.g2之兩種劑量均促使非典型CD14⁺ CD16⁺單核細胞在研究第一週期間逐漸耗乏。非典型單核細胞之幾乎總體耗乏係由7mg/kg劑量引起。藉由7mg/kg及1.5mg/kg兩種劑量之非典型單核細胞之減少似乎在第4天時間點達到峰值，且到第11天數量恢復為正常。結果顯示於圖15c中。條形圖顯示循環非典型CD14⁺ CD16⁺單核細胞於整個研究中該等時間點(第0、第1、第4、第18及第25天(D))之平均數量與標準誤差。亦繪製血清CSF-1之平均濃度與標準誤差。

該實例證實(i)於馬來猴中抗體969.g2可結合CSF-1R及阻斷CSF-1結合，(ii)證實抗體969.g2於非人類靈長類動物模型中之藥理學活性，(iii)證實抗體969.g2在活體內選擇性耗乏馬來猴單核細胞非典型群組-據信該單核細胞群組是腫瘤相關巨噬細胞之前驅物，及(iv)血清CSF-1濃度適宜作為用於測量969.g2活性之生物標誌。

實例7：抑制MCF-7乳癌異種移植物之生長

抗體969.g2係不可以與鼠科CSF-1R結合。因此，使用抗鼠科CSF-1R抗體Ab535進行活體內鼠科研究以顯示Ab969.g2可治療癌症及纖維化之效用。已在許多活體外實驗中證實Ab535具有與Ab969.g2可相比擬的性質及活性。

已在實例2 iii)中證實Ab535可抑制CSF-1介導之單核細胞存活，在實例2 iv)中具有可相比擬的親和力及在實例2 vii)中不觸發CSF-1R內化。

就對Ab535之活體內研究而言，可如下進行活體內MCF-7乳癌異種移植物模型：該研究係測量具有人類乳癌異種移植物MCF-7之皮下移植物之免疫缺乏裸小鼠中經皮下投與(s.c.)之抗體Ab535相對對照抗體(陽性對照)及載劑對照之治療療效。腫瘤生長抑制係用作治療參數。人類乳癌MCF-7係用作用於免疫缺乏雌性NMRI：nu/nu小鼠中之皮下異種移植模型。從國家癌症研究所(National Cancer Institute)(USA)腫瘤庫獲得MCF-7細胞系。就實驗用途而言，將該等細胞活體外培養於RPMI 1640培養基+10% FCS中。從次匯合培養基收集細胞及經皮下接種至小鼠中。在達成可摸到的腫瘤尺寸(4至10mm)時，開始治療。每週三次提供(皮下投與)測試化合物及載劑對照。在第24天、第33天及第40天每天一次靜脈內投與陽性對照。於注射時相對體重個別地調整注射體積。每週三次用測徑規測量腫瘤直徑。依照V=(長度×(寬度)2)/2計算得腫瘤體積。就計算相對腫瘤體積(RTV)而言，各測量日的體積係與第一治療日相關聯。於各測量日，計算得每組的中位及平均腫瘤體積及中位經處理組對對照組(T/C)之值，單位為百分比。

結果顯示於圖16中。Ab535顯示劑量相依抗腫瘤效應。對照小鼠IgG抗體之兩種劑量均不引起腫瘤生長抑制。相對腫瘤體積係與載劑對照及引起腫瘤生長抑制之陽性對照可相比擬。

結論：測試抗體Ab535在人類乳癌異種移植物MCF-7中於最高劑量(30mg/kg/天)下引起統計學顯著抗腫瘤效應。

實例8：抑制PC-3原位性前列腺癌之生長

亦使用活體內原位性前列腺癌模型PC-3測試抗體Ab535之抗腫瘤及抗轉移效力。PC-3細胞系係在基因上經改變以持續地表現螢光素酶從而容許活體內生物發光成像分析，此容許監測腫瘤活體內生長及在所選器官中進行活體外轉移分析。

該研究係由隨機分組後各包含11隻(組5)或12隻(其他所有組)雄性NMRI裸小鼠之6個實驗組組成。在第0天，將PC-3細胞原位植入至所有參與雄性NMRI裸小鼠之前列腺中。在第3天，經由活體內生物發光成像驗證腫瘤開始生長。在第8天，進行第二活體內生物發光成像及根據成像結果將罹患腫瘤之動物隨機分為六組，以致平均生物發光強度及因而各組中之腫瘤尺寸相似。於後一天(第9天)，啟動治療。組2及3之動物分別接受30及10mg/kg之對照抗體，每週皮下投與3次，直至第42天。治療組4及5之動物分別接受30及10mg/kg抗體Ab535，每週皮下投與3次，直至第42天。組1之動物代表載劑對照且接受載劑(PBS)，每週皮下投與3次，直到第42天。組6之動物代表陽性對照且接受360mg/kg對照，每週靜脈內投藥一次，持續四週(在第10天、第17天、第24天及第31天)。於研究過程中，在第3天、第8天(隨機化)、第15天、第22天、第29天、第36天及第43天使用生物發光成像來活體內監測經原位植入之PC-3腫瘤之生長。

於研究結束時進行屍體剖檢。測定初始腫瘤重量及體積。收集所選器官(肝、脾臟及肺)，取各者之一部分固定於福馬林中及利用活體外螢光素酶檢測經由生物發光成像分析其餘部分之轉移模式。另外，收集來自一隻腿之腿骨及腰椎之相同部分，利用活體外螢光素酶檢測分析骨骼中之轉移模式。

活體內生物發光信號係由原發性腫瘤及轉移灶(全身成像)二者組成。基於該等數據，可針對所有組計算得腫瘤生長曲線(圖17)。腫瘤發展於所有研究組中均勻，直到隨機分組及開始治療。於下述中，載劑對照組1及兩個對照抗體RTE11組2及3顯示規律腫瘤生長。就陽性對照(組6)而言，可觀察到在第43天於活體內測得之腫瘤生長之極顯著減慢。在利用活體內生物發光成像監測時，分別以30或10mg/kg投與之抗體Ab535(組4及5)導致腫瘤生長顯著減慢。

在第44天的屍體剖檢期間確定初始腫瘤體積及濕重量。陽性對照(組6)導致初始腫瘤體積及重量均極顯著地減小。抗體Ab535以30mg/kg投與(組4)，可觀察到初始腫瘤體積及重量均顯著減小。當Ab535以10mg/kg(組5)投與時，腫瘤體積之減小顯著但小於組4所顯示。就對照抗體而言，未觀察到顯著抗腫瘤效力。

利用生物發光成像技術，於屍體剖檢後測量初始腫瘤螢光素酶活性。獲得的結果與屍體剖檢發現及活體內生長曲線之結果可相比擬。陽性對照(組6)導致初始腫瘤螢光素酶活性極顯著地減低。以30mg/kg投與之抗體Ab535(組4)導致初始腫瘤螢光素酶活性顯著減低，而當Ab535以10mg/kg投與(組5)時減低量較小。就對照抗體而言，未觀察到螢光素酶活性顯著減低。

利用活體外生物發光成像技術來分析若干種其他器官(肝、脾臟、肺、腿骨及腰椎之一部分)。就陽性對照而言，腿骨及腰椎可能顯示螢光素酶活性之顯著減低，而就肝及脾臟而言，信號減低剛好低於顯著性。就以30mg/kg投與之抗體Ab535(組4)而言，肝之螢光素酶活性之減低顯著及就其他所有器官而言係顯著的。對照抗體(組2及3)並不導致所測試的所有器官中螢光素酶活性之任何減低。

總言之，可證實抗體Ab535於該腫瘤模型中之顯著抗腫瘤效力、及顯著抗轉移效力。

實例9：抗-CSF-1R抗體於博來黴素誘導肺纖維化之活體內模型中之效應

博來黴素為最先從輪生鏈黴菌(Streptomyces verticillatus)單離且已用作用於多種癌症之化學治療劑的抗生素。肺纖維化之博來黴素模型為完整確立的模型且基本上如Madtes,DK等人，1999，Am J Respir Cell Mol Biol，20,924-34中所述使用。詳細方案可參見以下參考文獻Morschl, E.、Molina, J. G.、Volmer, J.、Mohsenin, A.、Pero, R. S.、Hong, J. S.、Kheradmand, F.、Lee, J. J.及Blackburn, M. R.(2008)，A3 adenosine receptor signaling influences pulmonary inflammation and fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.39: 697-705。

使用的所有小鼠為自Harlan Labs購得之野生型C57Blk6雌小鼠(20g)。使用氣管內(IT)切斷滴注，其中利用阿佛丁(avertin)使該等小鼠麻醉及進行氣管造口以灌輸3.5個單位劑量之在50μl鹽水中之博來黴素或僅灌輸50μl鹽水作為對照。以此方式治療會導致在博來黴素暴露後第7天時達到峰值之發炎期及在暴露後第21時為最大之纖維變性期。研究抗體Ab535之效應，其中該抗體僅在該模型之纖維變性期投藥及從第9至第21天每週三次以30mg/kg皮下投與。在第21天將該等動物殺死及讀取包括肺部之組織病理分析、BAL(支氣管肺泡灌洗)流體細胞性及BAL流體中可溶性膠原蛋白之測量。進行組織病理分析，使用改良的Ashcroft評分系統以對肺損傷評分來確定肺纖維化之嚴重度(Hubner RH等人，2008，Biotechniques 44：507-17)。利用10%福馬林使切開的肺膨脹至25cm壓力及藉由一系列醇及二甲苯處理，嵌入石蠟中及在處理及藉由梅生三色法(Masson’s Trichrome)染色之前對組織切片去石蠟化。

使用市售Sircol檢測套組遵循製造商使用說明來評估BAL流體中可溶性膠原蛋白的量。

使用細胞離心製劑確定對BAL流體中巨噬細胞群體之效應。BAL細胞之等分試樣旋塗至顯微鏡載玻片上，藉由Diff-Quick染色及對巨噬細胞計數。

發現藉由抗-CSF-1R抗體Ab535以在第9天開始給藥之治療性處理導致博來黴素誘發性肺纖維化大大地減少。纖維化的嚴重度及程度均明顯減低。經處理之小鼠具有減低之膠原蛋白生成、改善之纖維變性病理及改善之肺障壁保護。

圖18a顯示以Ab535治療博來黴素誘發性肺纖維化相較於藉由同型對照物治療使得BALF膠原蛋白濃度減低。

圖18b顯示以Ab535治療博來黴素誘發性肺纖維化相較於藉由同型對照物治療使得樣本之阿西克夫(Ashcroft)得分值減低，此因而顯示經Ab535治療之小鼠具有改善之纖維變性病理。

圖18c顯示以Ab535治療博來黴素誘發性肺纖維化相較於藉由同型對照物治療使得血清中白蛋白之濃度減小，此因而顯示經Ab535處理之小鼠血管通透性改良。

圖19顯示來自經鹽水對照、博來黴素加上同型對照物及博來黴素加上Ab535處理之動物之肺之組織病理分析之代表性影像。經Ab535處理之動物相較於同型對照物經博來黴素處理之動物具有大大減低之肺纖維變性。

實例10.抗-CSF-1R抗體在肺纖維化之腺苷去胺酶缺乏小鼠模型中之效應

腺苷為強效信號傳導核苷，其含量在細胞遭受應激或受到損傷時增加及在腺苷與其特異性G蛋白質結合受體接合時產生多種反應。腺苷去胺酶(ADA)為可將腺苷轉化為肌苷之嘌呤分解代謝酵素。已獲得ADA基因剔除小鼠且證實在血清及諸如腎臟、肝及肺之組織中具有增加之腺苷含量(Blackburn,MR等人，1998，J Biol Chem,273(9)：5093-5100)。該等小鼠展現慢性肺病之與肺中增加之腺苷含量相關聯之特徵(諸如肺泡破壞、氣道發炎及過度黏液產生)(Blackburn MR等人，2000，J Exp Med，192：159-70)。該等效應為使得小鼠到三週大時因呼吸窘迫而死亡之效應。使用低劑量療法投與外源ADA可減低腺苷含量及延長該等小鼠之壽命，容許發展出肺纖維化模型(Chunn JL等人，2005，J Immunol 175：1937-46，Pedrosa M等人，2011，PLoS One,6(7)：e22667)。於該模型中，腺苷含量之長期性提高係與前纖維變性介體(包括肺中之TGF-_1)之增加、肺組織中之高膠原蛋白沉積及增加之纖維變性肺病理相關聯。為研究具有抗纖維變性潛力之分子之效應，ADA缺乏小鼠維持低劑量外源ADA療法數週，接著停止ADA治療及投與有潛力的抗纖維變性藥劑。

在肺纖維化之ADA基因剔除小鼠模型中研究抗-CSF-1R抗體Ab535之效應。於該模型中，酵素缺乏小鼠從出生後第1至第21天維持ADA酵素治療。製備ADA-聚乙二醇(PEG)共軛物(Young HW等人，2004，J Immunol 173：1380-89)及在出生後第1天、第5天、第9天、第13天及第17天(分別為0.625、1.25、2.5、2.5及2.5個單位)投與肌肉內注射液，接著在第21天經腹膜內注射5個單位。於第21天後，不進一步投與酵素。從第25天(出生後)三次/週皮下投與100μl體積30mg/kg的Ab535直到在第42天將該等動物殺死。

在第42天將該等動物殺死及讀取包括肺之組織病理分析、BAL流體細胞性及BAL流體中可溶性膠原蛋白之定量。進行組織病理分析，使用改良的Ashcroft評分系統對肺損傷評分以確定肺纖維化之嚴重度(Hubner等人，2008，Biotechniques 44：507-17)。利用10%福馬林使切開的肺膨脹至25cm壓力及藉由一系列醇及二甲苯處理，嵌入石蠟中及在處理及藉由梅生三色法染色之前對組織切片去石蠟化。

亦使用市售Sircol檢測套組遵循製造商使用說明來評估BAL流體中可溶性膠原蛋白的量。

使用細胞離心製劑來確定對BAL流體中巨噬細胞群體之效應。將BAL細胞之等分試樣旋塗至顯微鏡載玻片上，藉由Diff-Quick染色及對巨噬細胞計數。

發現藉由抗-CSF-1R抗體Ab535治療性療法明顯地減低ADA缺乏小鼠中之肺纖維化。經處理之小鼠具有減低之膠原蛋白生成、改善之纖維變性病理及改善之肺障壁功能及保護。

圖20a顯示藉由Ab535治療罹患誘發性肺纖維化之ADA缺乏小鼠相較於藉由同型對照物治療使得BALF膠原蛋白濃度減小。

圖20b顯示藉由Ab535治療罹患誘發性肺纖維化之ADA缺乏小鼠相較於藉由同型對照物治療使得樣本之阿西克夫得分值減小，此因而證實經Ab535治療之小鼠具有改善之纖維變性病理。

圖20c顯示藉由Ab535治療罹患誘發性肺纖維化之ADA缺乏小鼠相較於藉由同型對照物治療使得血清中白蛋白之濃度減小，此因而證實經Ab535治療之小鼠之血管通透性改良。

圖20d顯示罹患誘發性肺纖維化之ADA缺乏小鼠接受Ab535之治療使得BAL流體中巨噬細胞的數量減少。

圖21顯示來自均經同型對照物或Ab535治療之正常小鼠(ADA+)及罹患誘發性肺纖維化之ADA缺乏小鼠(ADA-)之肺之組織病理分析之代表性影像。於ADA-小鼠中，經Ab535治療之動物具有相較於同型對照物大大減低之肺纖維化。

因此，已顯示藉由抗-CSF-1R抗體治療之肺纖維化之兩種小鼠模型可有效治療纖維變性疾病。

<110> 比利時商UCB生物製藥公司

<120> 抗體

<130> G0181-PCT

<150> GB1315487.7

<151> 2013-08-30

<160> 39

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA019_969 Ab序列CDR-L1

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA019_969 Ab序列CDRL2

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA019_969 Ab序列CDR-L3

<400> 3

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA019_969 Ab序列CDR-H1

<400> 4

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA019_969 Ab序列CDR-H2

<400> 5

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CA019_969 Ab序列CDR-H3

<400> 6

<210> 7

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠Ab 969 VL區

<400> 7

<210> 8

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠Ab 969 VL區

<400> 8

<210> 9

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之大鼠Ab 969 VL區

<400> 9

<210> 10

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之大鼠Ab 969 VL區

<400> 10

<210> 11

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠Ab 969 VH區

<400> 11

<210> 12

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 大鼠Ab 969 VH區

<400> 12

<210> 13

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之大鼠Ab 969 VH區

<400> 13

<210> 14

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之大鼠Ab 969 VH區

<400> 14

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 969 gL7 V區

<400> 15

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 969 gL7 V區

<400> 16

<210> 17

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之969 gL7 V區

<400> 17

<210> 18

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之969 gL7 V區

<400> 18

<210> 19

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 969 gL7輕鏈(V+恆定區)

<400> 19

<210> 20

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 969 gL7輕鏈(V+恆定區)

<400> 20

<210> 21

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之969 gL7輕鏈(V+恆定區)

<400> 21

<210> 22

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之969 gL7輕鏈(V+恆定區)

<400> 22

<210> 23

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 969 gH2 V區

<400> 23

<210> 24

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 969 gH2 V區

<400> 24

<210> 25

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之969 gH2 V區

<400> 25

<210> 26

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之969 gH2 V區

<400> 26

<210> 27

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 969 gH2重鏈(V+恆定區-hu IgG4P)

<400> 27

<210> 28

<211> 1966

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 969 gH2重鏈(V+恆定區-hu IgG4P，加下劃線之外顯子)

<400> 28

<210> 29

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之969 gH2重鏈(V+恆定區-hu IgG4P)

<400> 29

<210> 30

<211> 2023

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 具有加下劃線且斜體之信號序列之969 gH2重鏈(V+恆定區-hu IgG4P，加下劃線之外顯子)

<400> 30

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類VK1 2-1-(1)O12 JK4受體架構

<400> 31

<210> 32

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類VK1 2-1-(1)O12 JK4受體架構

<400> 32

<210> 33

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類VH2 3-1 2-70 JH3受體架構

<400> 33

<210> 34

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類VH2 3-1 2-70 JH3受體架構

<400> 34

<210> 35

<211> 972

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CSF-1R之胺基酸序列

<400> 35

<210> 36

<211> 277

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CSF-1R之胺基酸序列

<400> 36

<210> 37

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CSF-1R之胺基酸序列

<400> 37

<210> 38

<211> 493

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CSF-1R(SNP V32G、A245S、H247P、V279M、加下劃線之位置)之胺基酸序列

<400> 38

<210> 39

<211> 512

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類CSF-1R胞外域之序列

<400> 39

Claims

一種抗-CSF-1R抗體，其包含重鏈，其中該重鏈之可變域包含以下至少一者：具有針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4表示之序列之CDR、具有針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5表示之序列之CDR及具有針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之序列之CDR。
如請求項1之抗-CSF-1R抗體，其中該重鏈之可變域包含針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4表示之序列、針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5表示之序列及針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之序列。
一種抗-CSF-IR抗體，其包含輕鏈，其中該輕鏈之可變域包含以下至少一者：具有針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列之CDR、具有針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之CDR及具有針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列之CDR。
如請求項1或2之抗-CSF-1R抗體，其另外包輕鏈，其中該輕鏈之可變域包含以下至少一者：具有針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列之CDR、具有針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之序列之CDR及具有針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列之CDR。
如請求項4之抗-CSF-1R抗體，其中該輕鏈之可變域包含針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列、針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之序列及針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列。
一種抗-CSF-1R抗體，其中該重鏈之可變域包含三種CDR，且該CDR-H1之序列與以SEQ ID NO：4表示之序列具有至少60%一致性或相似性，該CDR-H2之序列與以SEQ ID NO：5表示之序列具有至少60%一致性或相似性，及該CDR-H3之序列與以SEQ ID NO：6表示之序列具有至少60%一致性或相似性。
如請求項6之抗-CSF-1R抗體，其另外包含輕鏈，其中該輕鏈之可變域包含三種CDR，且該CDR-L1之序列與以SEQ ID NO：1表示之序列具有至少60%一致性或相似性，該CDR-L2之序列與以SEQ ID NO：2表示之序列具有至少60%一致性或相似性，及該CDR-L3之序列與以SEQ ID NO：3表示之序列具有至少60%一致性或相似性。
如請求項1或2之抗-CSF-1R抗體，其中該重鏈包含以SEQ ID NO：23表示之序列。
如請求項1或2之抗-CSF-1R抗體，其中該輕鏈包含以SEQ ID NO：15表示之序列。
如請求項1或2之抗-CSF-1R抗體，其中該抗體分子係選自由具有全長重鏈及輕鏈之完整抗體分子或其片段組成之群，例如，選自包含Fab、經修飾之Fab’、Fab’、F(ab’)₂、Fv、VH、VL及scFv片段之群組。
一種抗-CSF-1R抗體，其具有包含以SEQ ID NO：23表示之序列之重鏈及包含以SEQ ID NO：15表示之序列之輕鏈。
一種抗-CSF-1R抗體，其中該輕鏈之可變域包含與如請求項11之抗體之輕鏈可變域具有至少80%一致性或相似性之序列且其中該重鏈之可變域包含與如請求項11之抗體之重鏈可變域具有至少80%一致性或相似性之序列。
一種抗-CSF-1R抗體，其具有包含以SEQ ID NO：27表示之序列之重鏈及包含以SEQ ID NO：19表示之序列之輕鏈。
一種抗-CSF-1R抗體，其中該重鏈及輕鏈係與如請求項13之抗體之對應重鏈及輕鏈具至少80%一致性或相似性。
如請求項1或2之抗-CSF-1R抗體，其具有與其連接的效應子或報導分子。
如請求項1或2之抗-CSF-1R抗體，其針對人類CSF-1R之結合親和力為10pM或小於10pM。
一種抗-CSF-1R抗體，其係交叉阻斷包含以下6種CDR的抗體之結合性：針對於CDR-L1以SEQ ID NO：1表示之序列、針對於CDR-L2以SEQ ID NO：2表示之序列、針對於CDR-L3以SEQ ID NO：3表示之序列、針對於CDR-H1以SEQ ID NO：4表示之序列、針對於CDR-H2以SEQ ID NO：5表示之序列及針對於CDR-H3以SEQ ID NO：6表示之序列，(例如)具有100pM或更小之親和力。
如請求項17之抗-CSF-1R抗體，其中該抗體係藉由與其所阻斷抗體的相同抗原決定基結合來交叉阻斷該結合。
一種單離的DNA序列，其編碼如請求項1至18中任一項之抗體的重鏈及/或輕鏈。
一種選殖或表現載體，其包含一或多種如請求項19之DNA序列。
如請求項20之載體，其中該載體包含以SEQ ID NO：28及/或SEQ ID NO：20表示之序列。
一種宿主細胞，其包含一或多種如請求項21之選殖或表現載體。
一種製造如請求項1至18中任一項之抗體之方法，該方法包括培養如請求項22之宿主細胞及單離該抗體。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至18中任一項之抗體與醫藥可接受賦形劑、稀釋劑或載劑中一或多者之組合。
如請求項24之醫藥組合物，其另外包含其他活性組分。
如請求項1至3、6、7、11至14、17及18中任一項之抗體，其係用作藥物。
如請求項1至3、6、7、11至14、17及18中任一項之抗體，其係用於治療癌症。
如請求項1至3、6、7、11至14、17及18中任一項之抗體，其係用於治療纖維變性疾病。
一種以如請求項1至18中任一項之抗體或如請求項24或25之組合物於製造用於治療或預防癌症之藥物之用途。
一種以如請求項1至18中任一項之抗體或如請求項24或25之組合物於製造用於治療或預防纖維變性疾病之藥物之用途。
一種用於治療罹患癌症或處在癌症風險之人類個體之方法，該方法包括對該個體投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗-CSF-1R抗體或如請求項24或25之組合物。
一種用於治療罹患纖維變性疾病或處在纖維變性疾病風險之人類個體之方法，該方法包括對該個體投與有效量之如請求項1至18中任一項之抗-CSF-1R抗體或如請求項24或25之組合物。
如請求項27之抗體，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、前列腺癌、骨癌、結腸直腸癌、白血病、淋巴瘤、皮膚癌、食道癌、胃癌、星形細胞癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌、頭頸癌、胰癌及卵巢癌。
如請求項28之抗體，其中該纖維變性疾病係選自由以下組成之群：諸如特發性肺纖維化及囊性纖維化之肺纖維化、腎纖維化、肝硬化、心內膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維變性、腹膜後腔纖維化、進行性大塊纖維化、腎因性全身纖維化、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、瘢痕疙瘩(keloid)、心肌梗塞、硬皮病及關節纖維化。
如請求項24或25之組合物，其係用作藥物。
如請求項24或25之組合物，其係用於治療癌症。
如請求項24或25之組合物，其係用於治療纖維變性疾病。
如請求項29之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、前列腺癌、骨癌、結腸直腸癌、白血病、淋巴瘤、皮膚癌、食道癌、胃癌、星形細胞癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌、頭頸癌、胰癌及卵巢癌。
如請求項31之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：乳癌、前列腺癌、骨癌、結腸直腸癌、白血病、淋巴瘤、皮膚癌、食道癌、胃癌、星形細胞癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、肺癌、肝癌、甲狀腺癌、頭頸癌、胰癌及卵巢癌。
如請求項30之用途，其中該纖維變性疾病係選自由以下組成之群：諸如特發性肺纖維化及囊性纖維化之肺纖維化、腎纖維化、肝硬化、心內膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維變性、腹膜後腔纖維化、進行性大塊纖維化、腎因性全身纖維化、克羅恩氏病、瘢痕疙瘩、心肌梗塞、硬皮病及關節纖維化。
如請求項32之方法，其中該纖維變性疾病係選自由以下組成之群：諸如特發性肺纖維化及囊性纖維化之肺纖維化、腎纖維化、肝硬化、心內膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維變性、腹膜後腔纖維化、進行性大塊纖維化、腎因性全身纖維化、克羅恩氏病、瘢痕疙瘩、心肌梗塞、硬皮病及關節纖維化。