TW201442719A

TW201442719A - 魚針草萃取物及其純化物抗流感病毒之用途

Info

Publication number: TW201442719A
Application number: TW102117106A
Authority: TW
Inventors: Chi-Chiang Yang; Yew-Min Tzeng
Original assignee: Jenisa Biotechnology Corp Ltd
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-11-16
Also published as: TWI453026B

Abstract

本發明係揭露一種魚針草萃取物及其純化物之用途，其係用於製備抗流行性感冒病毒之藥物。

Description

魚針草萃取物及其純化物抗流感病毒之用途

本發明是有關於一種魚針草萃取物及其純化物之用途，特別是有關於自魚針草天然植物中提萃出可抗流行性感冒病毒之萃取物及其純化物，以用於製備抗流行性感病毒之藥物。

流行性感冒，簡稱流感，是一種經由流感病毒(Influenza virus, IFV)所引起之疾病。流感病毒係屬於一種造成人類及動物罹患流行性感冒之RNA病毒。在分類學上，流感病毒屬於正黏液病毒科，會造成急性上呼吸道感染，並藉由空氣迅速的傳播，在世界各地常會有週期性的大流行。流行性感冒病毒在免疫力較弱的老人或小孩及一些免疫失調的病人會引起較嚴重的症狀，如肺炎或是心肺衰竭等。

一般而言，根據流感病毒感染的對象，可以將病毒分為人類流感病毒、豬流感病毒、馬流感病毒以及禽流感病毒等類群，而正黏液病毒科根據其病毒蛋白的抗原性分為三類：A型流感病毒(Influenza A virus)、B型流感病毒(Influenza B virus)和C型流感病毒(Influenza C virus)。在蛋白抗原性的基礎上，A型流感病毒進一步係根據血凝素(hemagglutinin, H1至H16)及神經氨酸酶(neuraminidase, N1至N9)的抗原性分為不同的亞型。人類感染A型及B型流感病毒皆會引起季節性流行，而A型流感病毒又較為盛行，死亡率也較高。

目前，防治流感病毒一方面要加強流感病毒變異的檢測，以便進行有針對性的疫苗接種；另一方面是切斷流感病毒在人群中的傳播，因流感病毒依靠飛沫傳染，儘早發現流感患者、對公共場所使用化學消毒劑熏蒸等手段可以有效抑制流感病毒的傳播。此外，更重要地，對於流感患者，可使用流感抗病毒藥劑，其係為一種可以預防或治療流感病毒感染的藥品。流感抗病毒藥劑主要分為二類，其一為M2蛋白抑制劑(M2 protein inhibitor)，另一則為神經胺酸酶抑制劑。近年來，克流感及瑞樂沙^TM等流感抗病毒藥劑，均為新成分之神經胺酸酶抑制劑，其可有效地抑制流感病毒的複製，並可同時治療A型及B型流行性感冒。

此外，魚針草Anisomeles indica (L.) Kuntze，係分類於唇形花科，且屬於一種一年生或越年生之草本植物，其又可別名為假紫蘇、臭蘇、金劍草、本藿香、土牛膝、虱母頭、白紫蘇等。自古代以來，魚針草之藥用療效具有解熱、袪風濕、健胃、解毒、止痛之療效，一般民間常用於治療風寒發熱、腹痛、嘔吐、風濕骨痛、濕疹、腫毒、瘡瘍、痔瘡、毒蛇咬傷等症狀。

針對魚針草萃取物之生化特性分析而言，近年來醫學研究發現，自魚針草中所萃取純化出的化學成份，例如：β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素(apigenin)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)等，皆具有有許多的藥理作用，包括抗發炎、抗病毒、抗癌、及降血壓等功用，是以，魚針草應相當具有成為醫藥相關用途之藥物的開發潛力。

然而，雖然習知抗流感藥物能夠有效地抑制流感病毒的複製，但早期作為抗病毒藥劑之M2蛋白抑制劑，其主要在抑制A型流感病毒的複製，不過對於B型流感病毒並不具療效，且有神經及精神之副作用，並容易產生抗藥性的問題。再者，現今雖已有克流感及瑞樂沙^TM等之新流感抗病毒藥劑可用於同時治療A型及B型流行性感冒，但仍然會有輕微的副作用產生，包括噁心、嘔吐等，且亦有抗藥性之問題。而魚針草雖具有成為醫藥相關用途之藥物開發潛力，但至今仍未有任何文獻記載魚針草萃取物可用於製備成抗流行性感冒病毒藥物之應用。因此，有鑑於習知技術之問題，本發明人便自魚針草中提萃出可抗流感病毒之萃取物，以提出魚針草萃取物，應用於製備抗流感病毒之藥物的用途。

有鑑於上述習知技藝之問題，本發明提出一種魚針草萃取物之用途，其係用於製備抗流行性感冒病毒之藥物。

較佳地，魚針草萃取物包含β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素(apigenin)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、麥角甾苷(Acteoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)及α-D-葡萄糖(α-D-glucose)。

較佳地，β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素(apigenin)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、麥角甾苷(Acteoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)及α-D-葡萄糖(α-D-glucose)在魚針草萃取物之含量分別可為600 ppm～1000 ppm、20 ppm～60 ppm、20 ppm～40 ppm、10 ppm～30 ppm、100 ppm～140 ppm、100 ppm～140 ppm、100 ppm～120 ppm及180 ppm～220 ppm。

有鑑於上述習知技藝之問題，本發明再提出一種魚針草純化物之用途，其係用於製備抗流行性感冒病毒之藥物。

較佳地，魚針草純化物可為β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)或α-D-葡萄糖(α-D-glucose)。

承上所述，依本發明之魚針草萃取物之用途，其係自魚針草天然植物中提萃出可對抗流感病毒之萃取物，藉此用於製備抗流感病毒之藥物，進而解決服用非天然抗流感藥劑所產生之抗藥性問題。

無。

第1圖係為本發明自魚針草萃取物中純化分離之純化物之化學結構圖。
第2圖係為本發明經A型及B型流行性感冒病毒感染之A549人類肺泡基底上皮腺癌細胞以魚針草萃取物處理後進行免疫螢光試驗之實驗圖。
第3A圖係為本發明經流行性感冒病毒感染之A549細胞以魚針草萃取物中之AI-7處理後進行病毒蛋白質表現分析之西方墨點圖。
第3B圖係為本發明經流行性感冒病毒感染之A549細胞以魚針草萃取物中之AI-7處理後進行病毒蛋白質表現分析之蛋白質定量圖。
第4A圖係為本發明經流行性感冒病毒感染之A549細胞以魚針草萃取物中之AI-7處理後進行病毒蛋白質表現分析之西方墨點圖。
第4B圖係為本發明經流行性感冒病毒感染之A549細胞以魚針草萃取物中之AI-7處理後進行病毒蛋白質表現分析之蛋白質定量圖。

為利　鈞審瞭解本發明之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下。

本發明所使用之「魚針草萃取物」，可包括自魚針草的根、莖、葉、花、或全植株萃取而得之萃取物。而本發明所使用之「魚針草純化物」，係將魚針草萃取物進一步純化而得。首先，先進行魚針草萃取物之提萃，其係將魚針草Anisomeles indica (L.) Kuntze利用有機溶劑進行萃取，以萃取出一初萃取液。其中，所述之有機溶劑係為極性溶劑，其包括C₁-C₁₂醇類、C₂-C₅乙酸酯類、C₅-C₆烷類或其組合，例如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、2-丁醇、第三丁醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、戊醇、異戊醇、2,3-戊二醇、2,4-戊二醇、環戊醇、己醇、環己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸戊酯、正戊烷、環戊烷、正己烷、環己烷、或此等組合，但不以此述而有所限制。而本發明用以萃取魚針草萃取物之有機溶劑係選用甲醇，其濃度可為50%～95%。此外，萃取溫度及時間可視使用的溶劑性質等條件決定，沒有特別限制，較佳地萃取溫度可為50～80℃，或為70～80℃，較佳地萃取時間可為2～4小時，但不限於此。

接著，將該萃取液與氯仿或丁醇進行混合，使該初萃取液中之個別成分可產生分層，並利用矽膠膠體管柱層析(silica gel column chromatography)、薄層層析法(thin layer chromatography, TLC)及再結晶法(recrystallization)來純化分離及辨別自魚針草所提取分離出之純化物。值得一提的是，可藉由重複萃取步驟及純化步驟以獲得純度較高的魚針草萃取物。其中，所萃取之魚針草萃取物至少包含β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素(apigenin)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、麥角甾苷(Acteoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)及α-D-葡萄糖(α-D-glucose)。其中，所純化之魚針草純化物可為β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)或α-D-葡萄糖(α-D-glucose)。

上述中，所述β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素(apigenin)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、麥角甾苷(Acteoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)及α-D-葡萄糖(α-D-glucose)在魚針草萃取物之含量分別可為600 ppm～1000 ppm、20 ppm～60 ppm、20 ppm～40 ppm、10 ppm～30 ppm、100 ppm～140 ppm、100 ppm～140 ppm、100 ppm～120 ppm及180 ppm～220 ppm。

更進一步地，本發明為了證明所述之魚針草萃取物及其純化物確實具備有抗流行性感冒病毒之用途，以於日後可用於製備抗流行性感冒病毒之藥物，其係將所萃取之魚針草萃取物及進一步純化出之純化物進行各種抗流行性感冒病毒實驗分析。

上述中，本發明所使用之主要實驗材料可包含：

i. 流行性感冒病毒：A型及B型流行性感冒病毒

ii. 細胞株：人肺泡基底上皮腺癌細胞(human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cells, A549)

iii. 抗流性感冒藥劑：克流感(磷酸奧司他韋, oseltamivir phosphate, Tamiflu)

上述中，流行性感冒病毒之種類可參考下表一所示：

表一

魚針草萃取物之細胞毒性測試分析結果，如下表二所示。首先，本發明係將A549細胞以1.5 x 10⁵cells/well，植入於96孔盤中，並置於35℃培養箱中培養24小時。接著，分別加入A型及B型流行性感冒病毒(1:1)混合液，使A549細胞感染流行性感冒病毒。再分別加入20 μl純化萃取出之魚針草萃取物，如AI-3(β-谷甾醇，β-sitosterol)、AI-4(魚針草內酯，ovatodiolide)、AI-5(芹菜素，apigenin)、AI-6(芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷，Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、AI-7(β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷，β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、AI-8(麥角甾苷，acteodise)、AI-10(毛蕊花糖苷 II，Campneoside II)、AI-11(α-D-葡萄糖，α-D-glucose)，並將該已加入魚針草萃取物之96孔盤置於35℃培養箱中培養3天。其中，係以克流感(磷酸奧司他韋, oseltamivir phosphate, Tamiflu)作為控制組。並利用四氮唑氫氧化鹽比色分析法(tetrazolium hydroxide salt, XTT)，藉由活細胞線粒體脫氫酶將四氮唑氫氧化鹽還原成水溶性的棕色甲膁產物，以檢驗其甲膁產物的含量，甲膁的生成量與細胞的增殖程度呈正相關，可藉此得知細胞增殖或活性程度。

表二

由上述結果可得知，本發明自魚針草天然植物中所萃取出之萃取物及其中所包含之純化物(編號AI-3至AI-8、AI-10至AI-11)，其中AI-3、AI-4、AI-6、AI-7、AI-10及AI-11皆可有效地抑制流行感冒病毒，以保護細胞不被感染而死亡，此實驗測試係以克流感(奧司他韋, oseltamivir)作為控制組，其係為一種作用於神經氨酸酶的特異性抑制劑，能抑制神經氨酸酶之作用，以抑制組裝後的子代流感病毒脫離宿主細胞而成熟，從而抑制流感病毒在細胞內的感染，故可增加細胞存活率。而利用本發明所萃取出之萃取物及上述純化物，經實驗檢測證明皆可有效地抑制流行感冒病毒，且特別是以AI-7不只能有效地抑制流行感冒病毒，其較高的選擇性指數(Selective Index)更顯示其具有比控制組克流感更高的安全劑量範圍。如此一來，將本發明所述之魚針草萃取物應用於對抗流感病毒，可藉此有效地抑制抗流感病毒，增加細胞存活率。

更進一步地，將上述經由流行性感冒病毒所感染且個別添加有魚針草純化物之A549細胞進行病毒蛋白質分析。請參閱第2圖，其係為本發明經流行性感冒病毒感染之A549細胞以魚針草純化物處理後進行免疫螢光試驗之實驗圖。此試驗結果顯示，添加AI-3至AI-7及AI-11魚針草純化物後，可明顯抑制了A549宿主細胞中之流行性感冒病毒，因此於A549細胞宿主中的病毒蛋白質表現大幅減少。

此外，係將經A型流行性感冒病毒所感染且添加有不同劑量的魚針草純化物AI-7之A549細胞進一步進行病毒蛋白質分析試驗，其係以Western Blot蛋白質表現分析法分析A549細胞中之A型流行性感冒病毒的NP、M1、M2、HA蛋白質表現。由此實驗結果可得知，魚針草純化物AI-7抑制A型流行性感冒病毒之NP、M1、M2、HA蛋白質表現的效果隨著劑量的增加而增加。當魚針草純化物AI-7之添加量達300 μg/ml時，其抑制A型流行性感冒病毒之NP、M1、M2、HA蛋白質表現相較於作為控制組之0.1 μM克流感(奧司他韋, oseltamivir, OSE)之抑制效果來的佳，如第3A圖及第3B圖(1)至(4)所示。其中，此圖中所示之M代表未感染組；V代表流行性感冒病毒感染組。然而，利用本發明所述之半數抑制劑量(IC50)150 μg/ml魚針草純化物AI-7持續作用16小時內，皆具有抑制A549細胞宿主中之A型流行性感冒病毒之NP、M1、M2、HA蛋白質表現之效果，如第4A圖及第4B圖(1)至(4)所示。

據上所述，本發明所述之魚針草萃取物及其純化物確實具備可對抗A型或B型流行性感冒病毒之用途，可將其應用於製備成抗流行性感冒病毒之藥物，且魚針草萃取物及其純化物對抗流行性感冒病毒之途徑係經由抑制病毒蛋白表達及病毒複製機制所達成。

綜合上述，本發明所述之魚針草萃取物之用途，其係自魚針草天然植物中提萃出可對抗流感病毒之萃取物，並將此萃取物及其中之純化物應用以製備出可對抗流行性感冒病毒之藥物。且藉由本發明所述之魚針草萃取物及其純化物所製備出之藥物，可有效解決服用非天然抗流感藥劑所產生之抗藥性問題。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims

一種魚針草萃取物之用途，其係用於製備抗流行性感冒病毒之藥物。
如申請專利範圍第1項所述之魚針草萃取物之用途，其中該魚針草萃取物包含β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素(apigenin)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、麥角甾苷(Acteoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)及α-D-葡萄糖(α-D-glucose)。
如申請專利範圍第2項所述之魚針草萃取物之用途，其中β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素(apigenin)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、麥角甾苷(Acteoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)及α-D-葡萄糖(α-D-glucose)在該魚針草萃取物之含量分別係為600 ppm～1000 ppm、20 ppm～60 ppm、20 ppm～40 ppm、10 ppm～30 ppm、100 ppm～140 ppm、100 ppm～140 ppm、100 ppm～120 ppm及180 ppm～220 ppm 。
一種魚針草純化物之用途，其係用於製備抗流行性感冒病毒之藥物。
如申請專利範圍第4項所述之魚針草純化物之用途，其中該魚針草純化物係為β-谷甾醇(β-sitosterol)、魚針草內酯(ovatodiolide)、芹菜素7-O-β-D-葡萄糖苷(Apigenin 7-O-β-D-glucuronopyranoside)、β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷(β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside)、毛蕊花糖苷 II(Campneoside II)或α-D-葡萄糖(α-D-glucose)。