TW201433572A

TW201433572A - 人類上皮細胞增生因子之製造方法

Info

Publication number: TW201433572A
Application number: TW102139254A
Authority: TW
Inventors: Seiya Sato; Shouichirou Okawa; Kyouji Yoshinaka
Original assignee: Unibio Corp
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2014-09-01
Also published as: TWI638826B; JP6302415B2; WO2014097733A1; JPWO2014097733A1

Abstract

本發明揭示一種可依較習知技術更低成本並效率佳地製造上皮增生因子(EGF)的新穎手段。本案發明者等人以開發出使用植物之人類EGF之生產技術為目標而潛心研究，結果成功發現了可利用短暫性表現系統而依高效率生產EGF之經變更的EGF編碼序列及訊息肽編碼序列。藉由利用此等序列，即使在使用了由病毒載體所進行短暫性表現系統，仍可效率佳地生產EGF。

Description

人類上皮細胞增生因子之製造方法

本發明係關於人類上皮細胞增生因子之製造方法、及適合用於該方法之核酸建構物。

上皮增生因子(EGF)係最初由Cohen等人從小鼠之頜下腺所發現而精製(非專利文獻1)。其後，從人類尿液被精製作為具有胃酸分泌抑制作用的物質(非專利文獻2)。人類EGF係於生物體內，合成為由1207個胺基酸所形成的前驅蛋白質，其後藉由經處理之由53個胺基酸所形成的分子量約6kDa之胜肽，於分子內具有3處之雙硫鍵(非專利文獻3)。作為EGF之生理活性，已知有細胞增生作用、胃酸分泌抑制作用、抗潰瘍作用、消化器黏膜保護作用、DNA合成促進作用、角膜修護作用、創傷治癒促進作用、抗炎症作用、鎮痛作用等。亦開始嘗試將EGF應用至由此種作用所得之創傷治癒藥、抗潰瘍劑等，現在被利用作為醫藥品及化妝品等之成分之一。

如此嘗試著EGF之應用研究的同時，另一方面，關於EGF之有效率地生產方法亦已著手研究中。已報告有各種由基因重組所進行之EGF生產方法。作為此等報告之一例，有如大腸菌所進行之生產(非專利文獻4)、由酵母所進行之生產(非專利文獻5~7)、由植物所進行之生產(專利文獻1、非專利文獻8)等。

於使用細菌的情況，必須精密監視細微之培養條件，而導入用於控制之昂貴系統。又，亦有來自細菌之發熱物質混入等的潛在性風險的可能性，而亦被指摘存在有問題。再者，EGF被認為係分子內具有之6個半胱胺酸，藉此等形成3個雙硫鍵而作成一定之立體構造，而發揮生物學活性。以屬於原核細胞之大腸菌作為宿主並藉重組DNA技術所生產之真核細胞的蛋白質，已知並無法構成蛋白質原有之立體構造，於菌體內依不溶性顆粒的形式存在。因此，在藉大腸菌生產來自真核細胞之具有生物學活性的蛋白質時，大多情況下必須進行轉換為天然型蛋白質之操作，步驟變得複雜。

相較於此，屬於真核生物之植物係於細胞內存在有製作雙硫鍵之酵素及伴隨蛋白(chaperone)等之形成具有生物學活性之立體構造的機能。專利文獻1記載有於大麥之細胞基因中穩定地重組EGF之基因，使大麥生產的方法。然而，此方法在基因重組植物的管理方面存在問題。另一方面，非專利文獻8記載有於菸草植物體之基因組(genome)中穩定地重組EGF基因而使其生產EGF的方法，此外，記載有使用病毒載體之方法，亦即，製作重組了人類EGF基因之具有感染性的病毒，將此病毒感染至菸草，藉由使人類EGF短暫性表現以生產EGF的方法。然而，非專利文獻8記載之使用病毒載體的方法，在產量上有問題，無法稱得上是實用方法。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] WO/2011/083500

[非專利文獻]

[非專利文獻1] S. Cohen, J. Biol. Chem., 237, 1555(1962)

[非專利文獻2] H. Gregory, Nature, 257, 325(1975)

[非專利文獻3] G. I. Bell, et al., Nucleic Acids Research 14(21), 8427(1986)

[非專利文獻4] F. kishimoto et al., Gene, 45, 311(1986)

[非專利文獻5] M. S. Urdea, et al. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 80 7461(1983)

[非專利文獻6] J. M. Clements, et al., Gene 106, 267(1991)

[非專利文獻7] Z. Hambali, Journal of International Studies, 10, 36(2009)

[非專利文獻8] Sonin Wirth, et al., Molecular Breeding 13：23-35, 2004

本發明之目的在於提供一種可依較習知技術更低成本且效率佳地製造EGF的新穎手段。

本發明者等人以開發出使用植物之人類EGF之生產技術為目標而潛心研究，結果成功發現了可利用短暫性表現系統而依高效率生產EGF之經變更的EGF編碼序列及訊息肽編碼序列，並發現藉由利用此等序列，即使在使用了由病毒載體所得之短暫性表現系統，仍可效率佳地生產EGF，遂完成本案發明。

亦即，本發明提供一種核酸建構物，係含有編碼出成熟型人類EGF之鹼基序列、用於在植物細胞內表現成熟型人類EGF者，編碼出成熟型人類EGF之上述鹼基序列係具有與序列編號1所示鹼基序列呈90%以上相同性之鹼基序列。再者，本發明提供一種含有上述本發明之核酸建構物的表現載體。再者，本發明提供一種含有上述本發明之核酸建構物的重組病毒。再者，本發明提供一種人類EGF之製造方法，係包括使上述本發明之重組病毒感染至植物體，病毒增生後，回收由該病毒所生產之成熟型人類EGF蛋白質分子。再者，本發明提供一種人類EGF之製造方法，係包括使由上述本發明之表現載體所調製之重組病毒感染至植物體，病毒增生後，回收由該病毒所生產之成熟型人類EGF蛋白質分子。再者，本發明提供一種多核苷酸，係編碼出成熟型人類EGF者，該多核苷酸之鹼基序列係具有與序列編號1所示鹼基序列呈90%以上相同性之鹼基序列。再者，本發明提供一種多核苷酸，係編碼出成熟型人類EGF者，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號1所示鹼基序列、或於序列編號1中置換了1~15個鹼基的鹼基序列。再者，本發明提供一種多核苷酸，係編碼出菸草伸展蛋白訊息肽者，該多核苷酸之鹼基序列係具有與序列編號4所示鹼基序列呈90%以上相同性。再者，本發明提供一種編碼出菸草伸展蛋白訊息肽者，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號4所示鹼基序列、或於序列編號4中置換了1~數個鹼基的鹼基序列。再者，本發明提供一種多核苷酸，係編碼出內質網滯留訊息者，該多核苷酸之鹼基序列係具有與序列編號7所示鹼基序列呈80%以上相同性。再者，本發明提供一種多核苷酸，係編碼出內質網滯留訊息者，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號7所示鹼基序列、或於序列編號7中置換了1~2個鹼基之鹼基序列。再者，本發明提供一種含有上述本發明之多核苷酸的重組病毒。

根據本發明，提供一種可利用短暫性表現系統效率佳地生產EGF之新穎手段。植物係與人類相同屬於真核生物，兩者之細胞具有非常相似之蛋白質表現機構。又，植物係根據光合成的獨立營養生物，具有能量效率極佳之蛋白質合成系統。於在細菌內生產EGF的習知技術中，為了精密監視並控制細微之培養條件而必須導入昂貴系統；相較於此種技術，本發明之方法係由生產成本、設備投資、生產擴張性之觀點而言較有利。根據本發明，由於可較習知更廉價地提供EGF，故有助於利用EGF之醫藥品或化妝品等之製品的低價格化。過去雖已知有在植物體內生產EGF的技術，但習知技術中為了達成一定之生產效率，必須於植物體之基因組中穩定地重組EGF基因。根據本發明之方法，由於不需改變植物基因即可完成，故相較於使用植物之習知技術，在植物體之管理方面亦較有利。

圖1為編碼出成熟型人類EGF之天然之人類基因序列(NM_001963)、與本發明所使用之序列編號1所示改變型基因序列(altered)的對比圖。

圖2為編碼出伸展蛋白訊息肽之天然之菸草(N.plumbaginifolia)基因序列(M34371)、與本發明所使用之序列編號4所示改變型基因序列(altered)的對比圖。

圖3為製造導入了EGF基因之重組TMV時所使用的基因建構物的構造一例的概略圖。

圖4為實施例所使用之TMV表現載體UB001的構造圖。

圖5為表示將由重組TMV感染菸草葉所萃取精製之EGF於 SDS-PAGE後進行了銀染色的結果圖。帶1：分子標誌，帶2：標準品，帶3：C端內質網訊息KDEL(5倍濃縮)，帶4：無C端內質網訊息(5倍濃縮)，帶5：C端內質網訊息，帶6：無C端內質網訊息，帶7：分子標誌。

圖6為對由重組TMV感染菸草葉所萃取精製之EGF進行生物活性測定的結果。A.使用EGF濃度相異之試料，測定人類纖維母細胞PDL3之增生促進作用的結果。B.將A所示結果以EGF濃度予以表示的圖表。

圖7為對由重組TMV感染菸草葉所萃取精製之EGF進行生物活性(增生促進作用)測定的結果。A.人類纖維母細胞PDL3。B.來自小鼠胚胎之細胞BALB/3T3。

圖8為對市售之人類EGF蛋白質標準品進行生物活性(增生促進作用)測定的結果。A.人類纖維母細胞PDL3。B.來自小鼠胚胎之細胞BALB/3T3。

序列編號1所示鹼基序列係依可使用短暫性表現系統於植物細胞內效率佳地表現由53殘基所形成之成熟型人類EGF的方式，實施了密碼子之最佳化，編碼出胺基酸序列與天然之成熟型人類EGF(序列編號3)相同之EGF蛋白質分子的序列。人類EGF基因係於NCBI資料庫Gene依1950之Gene ID所登錄，其序列係例如於GenBank依accession No.NM_001963所登錄。序列編號2係表示天然之人類EGF基因中、編碼出成熟型EGF之區域的鹼基序列。若比對此天然之鹼基序列、與序列編號1所示之經最佳化的改變型序列，則如圖1所示，序列編號1之鹼基序列中包含有未伴隨胺基酸變化的複數之鹼基置換。

序列編號4所示鹼基序列由於使用短暫性表現系統於植物細胞內效率佳地表現成熟型人類EGF，故可適合使用，其為編碼出用於細胞內輸送之訊息肽的序列。於序列編號4所示鹼基序列中，係編碼著由與菸草N.plumbaginifolia所具有之伸展蛋白訊息肽(序列編號6)相同之胺基酸序列所構成的訊息肽，為了使用短暫性表現系統之EGF生產而使密碼子經最佳化。N.plumbaginifolia之伸展蛋白基因序列，係於GenBank依accession No.M34371所登錄，此登錄序列中所見之訊息肽編碼區域係如序列編號5所示。若比對此天然之鹼基序列、與序列編號4所示之經最佳化之改變型序列，則如圖2所示般，於序列編號4之鹼基序列中包含有未伴隨胺基酸變化的複數之鹼基置換。

序列編號7所示鹼基序列由於使用短暫性表現系統於植物細胞內效率佳地表現成熟型人類EGF，故可適合使用，其為編碼出用於細胞內局部存在之訊息肽的序列。具體而言，於序列編號7所示鹼基序列中，係編碼著內質網滯留訊息KDEL(序列編號8)。序列編號7所示鹼基序列亦為了適合與上述成熟型人類EGF之最佳化改變序列一起使用，而使密碼子經最佳化。

已知Met及Trp以外之18種胺基酸係編碼為2~6種同義密碼子，但視生物種類，同義密碼子的使用頻率相異(Grantham,R.(1980)Trends Biochem.Sci.5,327-331.；Grantham,R.,Gautier,C.and Gouy,M.(t980)Nucl.Acids Res.8,1893-1912.；Grantham,R.,Gautier,C.,Gouy,M.,Mercier,R.and Pave,A.(1980)Nucl.Acids Res.8,r49-r62.；Grantham,R.,Gautier,C.,Gouyt,M.,Jacobzone,M.and Mercier,R.(1981)Nucd.Acids Res.9,r43-r74.；Aota,S.-I.,Gojobori,T.,Ishibashi,F., Maruvama,T.and Ikemura,T.(1988)Nucl.Acids Res.16,r315-r402.)。Murray等人針對植物中之密碼子使用頻率亦有報告(Murray et al.(1989)Nucl.Acids Res.17,477-498)，參考該報告，可依提高編碼出導入至植物細胞中之所需胺基酸序列之鹼基序列之密碼子在植物細胞內的表現效率的方式予以改變。

18種胺基酸之同義密碼子中，作為在植物(尤其是雙子葉植物)中使用頻率高的密碼子的具體例，可舉例如表1所示者。此等密碼子係可較佳使用於植物的密碼子。

本發明之核酸建構物係適合使用於在植物細胞內短暫性表現成熟型人類EGF的核酸建構物，其含有編碼出成熟型人類EGF 之胺基酸序列的鹼基序列。然而，該核酸建構物即使在藉古典之農桿菌法重組至植物基因組中而使其表現的情況下，仍可於植物體內生產EGF，故本發明之核酸建構物的用途並不僅限定於短暫性表現。

上述序列編號1所示鹼基序列，係作為編碼出成熟型人類EGF之胺基酸序列的鹼基序列，於本發明中為最適合使用的鹼基序列。

另外，並不僅是與序列編號1完全相同之鹼基序列，若為少數鹼基相異之程度的序列，尤其是多數利用了如上述表1所例示之植物中使用頻率高之密碼子的序列，則可與序列編號1之鹼基序列同樣適合使用。於此所謂「少數鹼基相異」，可為例如鹼基1個~15個、1個~12個、1個~數個、1個~5個、1個~3個、1~2個、或1個之置換。在依與序列編號1之序列相同性(%)表現的情況，可與序列編號1同樣使用之改變鹼基序列，係與序列編號1之相同性為90%以上、92%以上、95%以上、或98%以上。

於此，所謂序列編號之「相同性」，係依使欲比較之2個鹼基序列之鹼基儘可能多數一致的方式使兩序列對列，以總鹼基數除以一致之鹼基數所得值依百分比所表示者。上述對列時，視需要可於所比較之2個序列之一者或兩者中適當插入間隙。此種序列之對列化可使用例如BLAST、FASTA、CLUSTAL W等周知程序而進行。在插入間隙的情況，上述總鹼基數係以1個間隙作為1個鹼基而計算。如此計算之總鹼基數，在所比較之2個序列間為相異的情況，相同性(%)係以較長者序列之總鹼基數除以一致之鹼基數而計算。其中，在欲比較之序列呈現與其他任意序列連結之狀態的情況下(例如重組至表現載體的狀態等)，係僅取出對應之區域而比對序列，算出相同性。例如，在比較編碼出成熟型人類EGF之鹼基序列時，係僅將對應於編碼出該成熟型人類EGF之區域的區域取出而比對序列。

於本發明之核酸建構物中，亦可進一步含有編碼出可用於在植物體細胞內所生產之EGF蛋白質分子的細胞內輸送或局部存在化等之訊息肽的鹼基序列。訊息肽通常為由胺基酸數3至60個左右所形成的胜肽，為指示在細胞質內所合成之蛋白質的輸送及局部存在化的構造。

作為可利用於細胞內輸送之訊息肽，可舉例如伸展蛋白之訊息肽。編碼出伸展蛋白訊息肽之鹼基序列，若被含於編碼出EGF之鹼基序列的上游側即可。

上述序列編號4所示鹼基序列，係作為編碼出伸展蛋白訊息肽之鹼基序列，為本發明中最適合使用的鹼基序列。

另外，並不僅是與序列編號4完全相同之序列，若為少數鹼基相異(例如1個~數個、1個~5個、1個~3個、1~2個、或1個鹼基經置換)的序列，尤其是多數利用了如上述表1所例示之植物中使用頻率高之密碼子的序列，則可與序列編號4之鹼基序列同樣適合使用。在依序列相同性(%)表現的情況，可與序列編號4同樣使用之改變鹼基序列，係與序列編號4之相同性為90%以上、92%以上、95%以上、或98%以上。

作為可利用於局部存在化之訊息肽，可舉例如由KDEL(序列編號8)之序列所形成的內質網滯留訊息。內質網滯留訊息KDEL由於係加成至EGF蛋白質之C端側而使用，故編碼出內質網滯留訊息之鹼基序列，若被含於編碼出EGF之鹼基序列的下游側即可。

上述序列編號7所示鹼基序列，係作為編碼出內質網滯留訊息之鹼基序列，為本發明中最適合使用的鹼基序列。

另外，並不僅是與序列編號7完全相同之序列，若為少數鹼基相異(例如1~2個、或1個鹼基經置換)的序列，尤其是多數利用了如上述表1所例示之植物中使用頻率高之密碼子的序列，則可與序列編號7之鹼基序列同樣適合使用。在依序列相同性(%)表現的情況，可與序列編號7同樣使用之改變鹼基序列，係與序列編號7之相同性為80%以上、或90%以上。

序列編號11所示鹼基序列，係分別於編碼出成熟型EGF序列之密碼子經最佳化之鹼基序列(序列編號1)的上游側，連接了編碼出伸展蛋白訊息肽序列之密碼子經最佳化的鹼基序列(序列編號4)，於下游側連接了編碼出內質網滯留訊息KDEL之密碼子經最佳化的鹼基序列(序列編號7)者。該鹼基序列係作為本發明之核酸建構物所含之鹼基序列屬特佳一例。融合了伸展蛋白訊息肽及內質網滯留訊息的外來蛋白質，若於植物細胞內表現，則可認為將累積於該細胞之細胞質內、尤其是內質網。

不僅是與序列編號11完全相同之序列，若為例如1~25個、1~20個、1~12個、1~數個、1個~5個、1個~3個、1~2個、或1個鹼基相異的序列，尤其是多數利用了如上述表1所例示之植物中使用頻率高之密碼子的序列，則可與序列編號11之鹼基序列同樣適合使用。在依序列相同性(%)表現的情況，可與序列編號11同樣使用之改變鹼基序列，係與序列編號11之相同性為90%以上、92%以上、95%以上或98%以上。

核酸建構物可為DNA或RNA，或可為PNA(胜肽核酸)或LNA(Locked Nucleic Acid)等之核酸衍生物，但典型為DNA或 RNA。用於建構病毒表現載體的核酸建構物，通常為DNA建構物。又，在所謂「含有核酸建構物之重組病毒」的情況，由於為基因組中含有該核酸建構物的病毒，故通常若病毒為RNA病毒，則該核酸建構物為RNA，若病毒為DNA病毒，則該核酸建構物為DNA。

含有上述經改變之鹼基序列的核酸建構物，可藉常法之化學合成進行合成。或藉由周知之基因工程手法，合成具有天然存在之序列的cDNA後，以此cDNA作為模板，使用適當引子適當導入突變則亦可進行合成。或者，將欲合成之核酸建構物分為數個短區域並化學合成複數之DNA片段，藉公知之融合PCR法使各片段連接而可合成DNA建構物。RNA建構物可藉由從DNA建構物的轉錄(transcription)反應而調製。

所謂「短暫性表現」，係指外來基因依未重組至宿主組胞之基因組中的狀態、於宿主細胞內進行表現。此種短暫性表現，可使用病毒載體而實施。用於在植物體細胞內使所需之外來基因表現的植物病毒載體，已知有各種物(例如參照「蛋白質核酸酵素」，vol.45,p.607-613等)，市售物亦存在各種物。植物病毒載體中，最被活躍研究並廣為利用者為菸草鑲嵌病毒(TMV)載體，本發明中亦可適合使用TMV載體。

使用病毒載體使本發明之核酸建構物於植物體內短暫性表現時，含有編碼出人類EGF之區域的本發明的核酸建構物，係在藉轉錄反應合成重組病毒RNA時，與需要之適當的RNA合成酶啟動子(例如T7啟動子等之噬菌體合成酶啟動子)、病毒之複製酶cDNA、移動蛋白質cDNA及外殼蛋白質cDNA連接，依重組至質體DNA之形態利用作為病毒表現載體。若為使用TMV等之菸草鑲嵌病毒屬載體的情況，則依[RNA合成酶啟動子]-[複製酶cDNA]-[移動蛋白質cDNA]-[本發明之核酸建構物]-[外殼蛋白質cDNA]的順序將核酸建構物與病毒因子cDNA連接即可(圖3)。以含有此種構造之TMV表現載體為模板，進行轉錄反應，藉此可調製使編碼出成熟型人類EGF蛋白質之核酸建構物重組之重組TMV RNA。

若列舉本發明可適合使用之根據TMV的短暫性表現系統的具體例，有如日本專利第4750285號記載之BSG1037及BSG1057，或市售物之Kentucky BioProcessing公司之GENEWARE(註冊商標)等。此等質體係可表現全身感染性之重組TMV的質體，含有RNA合成酶啟動子、TMV之複製酶(RNA依存性RNA合成酶)cDNA、移動蛋白質cDNA及外殼蛋白質cDNA。將所需之外來基因插入至移動蛋白質cDNA與外殼蛋白質cDNA之間，以此作為模板而合成於5'端具有端帽的RNA，藉此可得到可於植物細胞內表現所需外來基因之全身感染性之TMV病毒RNA。經端帽加成的RNA的合成，可使用市售套組(例如Life Technologies公司之mMESSAGE mMACHINE(註冊商標)套組等)而輕易進行。

尚且，本發明中，所謂「複製酶cDNA」、「移動蛋白質」、「外殼蛋白質」的情況，係除了具有與天然之植物病毒所具有之此等因子相同之序列者之外，尚包括為了短暫性表現而經最佳化、具有包括人為改變之序列者。例如，於日本專利第4750285號記載之TMV表現載體BSG1057中，於複製酶cDNA及移動蛋白質cDNA加入改變，產生出序列與天然TMV稍微相異之複製酶與移動蛋白質，而此種序列改變者亦涵括於本發明範圍中。

重組了編碼出成熟型人類EGF蛋白質之核酸的全身感染性的重組TMV RNA，可直接依裸病毒基因組之狀態接種至植物，或可與精製之外殼蛋白質混合而形成殼體，作成病毒粒子之狀態後再接種至植物。所謂「重組病毒」一詞，係包括裸病毒基因組、與形成殼體而得之病毒粒子之兩者。病毒的接種係如常法，對植物葉片使用碳粉末或矽藻土等之微粒子機械性地負傷並使其與接種原接觸而進行。

在感染了重組病毒的植物體內，病毒增生，於植物細胞內產生大量之EGF。於病毒接種後栽培10~15日左右後，收穫葉片並萃取回收EGF蛋白質分子即可。由感染了重組病毒之植物組織所進行的EGF蛋白質分子的萃取及精製，基本上可使用一般之蛋白質精製方法(C.D.Mount et al.,Archives of Biochemistry and Biophysics,240 33(1985),U.H.Gregory and I.R.Willshire,Hoppe-Sayler's Z.Physiol.Chem.,356 1765(1975))進行。具體而言可如以下般進行。

於含有蛋白質分解酵素抑制劑之緩衝液中加入經感染的植物組織，藉混合器使其均勻化並萃取蛋白質。將此液離心後，回收上清液，藉超微過濾去除上清液中之不純的蛋白質，視需要再藉超微過膜進行濃縮，得到粗製物。超微過濾係可例如藉Miracloth(CALBIOCHEM公司)或玻璃纖維濾紙等之過濾器進行過濾後，將濾液藉區分分子量10~30kDa左右的膜進行交叉流動過濾而實施。

所得之粗製物，係使用疏水性相互作用層析載體進一步進行精製1次以上。載體並無特別限定，可為凝膠或樹脂等一般用於疏水性相互作用層析的公知載體。作為疏水性互相作用層析載體，適合使用具有苯基作為官能基者、例如苯基瓊脂糖凝膠(Sepharose)載體。於粗製物添加終濃度1~3M之硫酸銨等而提高鹽濃度後，使其與疏水性相互作用層析載體接觸，使目標蛋白質吸附於載體。接著，藉數mM左右濃度之磷酸鈉等之緩衝液(pH係使用中性附近者)使所吸附之蛋白質溶出。

進一步視需要，將洗提液藉強陰離子交換層析載體使蛋白質吸附，以調整為鹼性(pH9~11左右)之含有氯化鈉的甘胺酸緩衝液使其溶出，藉此可回收、精製於植物體內表現的EGF蛋白質。所得之EGF蛋白質亦可進行脫鹽處理等視需要而進一步進行的處理。

經精製之EGF可藉質量分析般之周知化學分析方法鑑定其化學特性。再者，亦可藉由周知方法、例如HPLC之分析(L.M.Matrisian et al.,Analytical Biochemistry,125,339(1982))測定EGF純度。再者，亦可藉周知方法實施如屬於EGF重要生理活性之一的細胞增生促進能力的測定(G.Carpenter and J.Zendegui,Analytical Biochemistry,153,279(1985))、及對EGF受體之結合能力的測定(R.L.Ladda,et al,Analytical Biochemistry,93,286(1979))。

藉本發明之方法所生產的人類EGF，係具有良好的生理活性，與習知物同樣地可利用於創傷治癒藥、抗潰瘍劑、化妝品等。

本發明並提供一種使在植物細胞內之表現效率提升、編碼出成熟型人類EGF之多核苷酸。該多核苷酸係具有與序列編號1所示鹼基序列呈90%以上、較佳92%以上、更佳95%以上、再更佳98%以上序列相同性。或者，該多核苷酸之鹼基序列可為序列編號1所示鹼基序列，或可為於序列編號1中1個~15個、較佳1個~12個、更佳1個~數個、再更佳1個~5個、又更佳1個~3個、特佳1~2個、再更佳1個鹼基經置換的鹼基序列。最佳係該多核苷酸之鹼基序列為序列編號1所示鹼基序列。

本發明並提供一種使在植物細胞內之表現效率提升、編碼出菸草伸展蛋白訊息肽之多核苷酸。該多核苷酸係具有與序列編號4所示鹼基序列呈90%以上、較佳92%以上、更佳95%以上、再更佳98%以上序列相同性。或者，該多核苷酸之鹼基序列可為序列編號4所示鹼基序列，或可為於序列編號4中1個~數個、更佳1個~5個、又更佳1個~3個、特佳1~2個、再更佳1個鹼基經置換的鹼基序列。最佳係該多核苷酸之鹼基序列為序列編號4所示鹼基序列。

本發明並提供一種使在植物細胞內之表現效率提升、編碼出內質網滯留訊息之多核苷酸。該多核苷酸係具有與序列編號7所示鹼基序列呈80%以上、較佳90%以上序列相同性。或者，該多核苷酸之鹼基序列可為序列編號7所示鹼基序列，或可為於序列編號7中1~2個、更佳1個鹼基經置換的鹼基序列。最佳係該多核苷酸之鹼基序列為序列編號7所示鹼基序列。

上述使在植物細胞內之表現效率提升的多核苷酸，任一者可為DNA或RNA，或可為PNA(胜肽核酸)或LNA(Locked Nucleic Acid)等之核酸衍生物。並無特別限定，但典型為DNA。

重組了上述編碼出成熟型人類EGF之多核苷酸等的病毒，係如上述，可藉常法調製。重組病毒較佳為植物病毒，例如可為重組菸草鑲嵌病毒。含有編碼出成熟型人類EGF之多核苷酸的病毒，係如上述般，較佳係進一步含有編碼出菸草伸展蛋白訊息肽之上述多核苷酸及編碼出內質網滯留訊息的上述多核苷酸。

(實施例)

以下根據實施例更具體說明本發明。但本發明並不限定於下述實施例。

1.重組TMV表現載體的調製

含有編碼出連接了菸草伸展蛋白訊息肽、53殘基之成熟型人類EGF、與內質網滯留訊息KDEL之多胜肽(序列編號10)、且由經改變之鹼基序列所形成之DNA的嵌入DNA(序列編號9)，係委託GeneArt公司(現Life Technologies公司)，藉化學合成所製作。

另一方面，將改變可表現重組菸草鑲嵌病毒之公知質體BSG1057(日本專利第4750285號)所製作的質體UB001(圖4)，藉PacI及XhoI切開並連接，藉瓊脂膠電泳後由瓊脂膠進行萃取、精製。

將上述嵌入DNA與線狀化UB001藉T4 DNA連接酶(Invitrogen)進行連接(37℃、20分鐘)。將所得質體DNA藉熱休克導入至大腸菌NEB5-α(New England BioLabs)，藉含安比西林之培養基進行篩選使單菌落增生，由此大腸菌細胞使用mini prep套組(Qiagen)將質體DNA進行萃取、精製，藉此得到於UB001之菸草鑲嵌病毒MP區域與CP區域之間插入了嵌入DNA的重組TMV表現質體。藉PacI與XhoI切開質體以確認嵌入尺寸。

2.重組TMV粒子的調製

以上述所得之重組TMV表現質體DNA作為模板，使用Ambion mMessage mMachine kit(Life Technologies)進行轉錄反應。反應液組成係設為如以下。

將反應液於37℃培養1~3小時，調製成可表現於成熟型人類EGF融合了伸展蛋白訊息肽與內質網滯留訊息之蛋白質的重組TMV RNA。將反應液中0.5μL藉1%瓊脂膠進行電泳，確認轉錄產物。

將反應液19.5μL，與1.58mL之無核酸酶水、0.2mL之1M磷酸鈉pH7.0、及0.2mL之精製TMV外殼蛋白質(10mg/mL，由TMV感染菸草葉所萃取精製者)混合，於室溫培養2小時~一晚，藉此進行殼體形成反應。藉此，得到能表現於成熟型人類EGF融合了伸展蛋白訊息肽與內質網滯留訊息之蛋白質(序列編號10)的重組TMV粒子。

3.接種原之調製

使用殼體形成反應後之反應液調製接種原。用於調製接種原之緩衝液(GENEWARE(註冊商標)Inoculation Buffer(GIB))係如以下般調製。

於燒杯中裝入250mL之18.2MΩ水、2.25g之甘胺酸、3.14g之K₂HPO₄、3.00g之Na₄P₂O₇．10H₂O，以攪拌子攪拌15分鐘以上。將溶解後之溶液移至500mL容量的量筒中，以18.2MΩ水調整為300mL。將其轉移至可進行高壓釜處理的容器中，加入3.00g之皂土與3.00g之矽藻土，進行旋轉攪拌使皂土與矽藻土充分濕潤後，進行高壓釜處理(121℃、20分鐘)。冷卻後以4℃保存(於4℃安定1年)。

將殼體形成反應液之原液或適當以無核酸酶水所稀釋的液，與等量的GIB混合，使用作為接種原。對菸草(Nicotiana benthamiana)每1個體中各2片的本葉片，於每一葉片滴下30μL之接種原，以戴了手套之手指輕擦使葉片負傷，藉此使重組TMV感染至菸草。

4.由菸草葉之EGF回收(1)

接種後經裁培12日後，收穫菸草葉片。所收穫之500g之葉片係於至萃取之前，置於冰上約45分鐘。萃取用緩衝液(50mM Tris緩衝液(pH8.5)、10mM EDTA、1mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride，作為蛋白酶抑制劑)、0.1% Triton X-100)係在萃取作業之前冷藏保存於4℃。於500g葉片中加入500mL之萃取用緩衝液，藉榨汁機進行破碎萃取，裝入玻璃瓶中並保存於冰液。將此液依10,000g離心10分鐘，作為其後之過濾材料。將離心後之上清液藉Miracloth及30kDa PES Kvick flow UF匣(0.1m²)進行過濾，藉此去除濾液中大部分的蛋白質而濃縮EGF(30KDa濾液)。又，將此30KDa濾液以2KDa Hydrosart Sartorius匣(0.1m²)進一步濃縮為90mL(2KDa濾液)。進一步將各濾液殘渣以7倍量之萃取用緩衝液(計1,600mL)洗淨，回收洗淨液(30KDa殘渣、及2KDa殘渣)。

針對菸草葉片破碎液、離心上清液、30KDa濾液、30KDa殘渣、2KDa濾液及2KDa殘渣的各試料，藉西方點墨法進行EGF檢測。其結果，除了破碎液、離心上清液之外，於30kDa濾液試料與2kDa過濾殘渣試料中檢測到約5.5kDa的EGF。在菸草葉細胞內由重組TMV所產生的EGF，係依加成了訊息肽的狀態被轉譯，但由於其後藉植物細胞內之酵素反應而訊息肽脫離，故檢測出的結果係得到上述尺寸。

5.由菸草葉之EGF回收(2)

接種後經裁培12日後，收穫菸草葉片。所收穫之1500g之葉片係於至萃取之前，置於冰上約45分鐘。萃取用緩衝液(50mM Tris緩衝液(pH8.5)、10mM EDTA、1mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl fluoride，作為蛋白酶抑制劑)、0.1% Triton X-100)係在萃取作業之前冷藏保存於4℃。於1500g葉片中加入1500mL之萃取用緩衝液，藉榨汁機進行破碎萃取，裝入玻璃瓶中並保存於冰液。將此液依10,000g離心10分鐘，作為其後之過濾材料。將離心後之上清液藉Miracloth及30kDa PES Kvick flow UF匣(0.1m²)進行過濾，藉此去除濾液中大部分的蛋白質而濃縮EGF。於此30KDa濾液中加入硫酸銨成為1.5M使其吸附於Phenyl Sepharose FF管柱後，藉5mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)進行洗提。進一步於此30KDa濾液中加入硫酸銨成為2.5M使其吸附於Phenyl Sepharose FF管柱後，藉5mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)進行洗提。將此液通過NuviaQ管柱使EGF吸附，藉加入了500mM氯化鈉的甘胺酸緩衝液(pH10.0)進行洗提。以此作為試料，實施SDS-PAGE．銀染色的純度測定及生物活性測定。

生物活性之測定係如以下般進行。於96孔微量盤之各孔中依5000個之方式置入人類纖維母細胞PDL3。將上述試料由20pg/mL至2000pg/mL依11階段進行稀釋，將各稀釋試料0.5mL分別加入至盤之各一列(6孔)、共計11列的孔中。準備分別加入了PDL3培養用的培養液0.5mL之一列孔作為負控制組。將此微量盤以碳酸氣體細胞培養器培養4日。培養後，去除培養液，加入四唑鎓系生細胞染色液1mL進行染色3小時，使用微量盤分析儀測定490nm的吸光度。

另外，除了PDL3之外，使用來自BALB/c小鼠胚胎之細胞BALB/3T3同樣地測定生物活性。作為參考數據，係取代上述重組蛋白質試料，使用市售之人類EGF蛋白質標準品(Promega公司)同樣地測定生物活性。

將銀染色結果示於圖5。確認到藉上述方法可依高純度回收精製菸草葉內之EGF。

將EGF之生物活性測定結果示於圖6及圖7。不論PDL3細胞(圖6、圖7A)及BALB/3T3細胞(圖7B)，均配合由菸草葉所回收精製之EGF之添加濃度而促進細胞增生，顯示並不遜色於市售人類EGF蛋白質(圖8A、B)的結果。藉此，確認到依上述方法由菸草葉所回收精製之EGF具有生物活性。

<110> 優你生物股份有限公司

<120> 人類EGF之製造方法

<130> PF495-PCT

<160> 11

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經變更之成熟型人類EGF序列

<400> 1

<210> 2

<211> 159

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 53

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經變更之菸草伸展蛋白訊息肽序列

<400> 4

<210> 5

<211> 78

<212> DNA

<213> 菸草(Nicotiana plumbaginifolia)

<400> 5

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> 菸草(Nicotiana plumbaginifolia)

<400> 6

<210> 7

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經變更之內質網滯留訊息序列

<400> 7

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 菸草(Nicotiana benthamiana)

<400> 8

<210> 9

<211> 275

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 插入序列，SP-EGF-KDEL

<220>

<221> CDS

<222> (10)..(258)

<223>

<400> 9

<210> 10

<211> 83

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 插入序列，SP-EGF-KDEL

<400> 10

<210> 11

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 經變更之SP-EGF-KDEL鹼基序列

<400> 11

Claims

一種核酸建構物，係含有編碼出成熟型人類EGF之鹼基序列、用於在植物細胞內表現成熟型人類EGF者，編碼出成熟型人類EGF之上述鹼基序列係具有與序列編號1所示鹼基序列呈90%以上相同性之鹼基序列。
如申請專利範圍第1項之核酸建構物，其中，編碼出成熟型人類EGF之上述鹼基序列係具有與序列編號1所示鹼基序列呈95%以上相同性之鹼基序列。
如申請專利範圍第1項之核酸建構物，其中，編碼出成熟型人類EGF之上述鹼基序列係序列編號1所示鹼基序列、或於序列編號1中置換了1~15個鹼基的鹼基序列。
如申請專利範圍第1項之核酸建構物，其中，編碼出成熟型人類EGF之上述鹼基序列係序列編號1所示鹼基序列。
如申請專利範圍第1至4項中任一項核酸建構物，其中，於編碼出成熟型人類EGF之上述鹼基序列的上游，進一步含有編碼出用於細胞內輸送之訊息肽的鹼基序列。
如申請專利範圍第5項之核酸建構物，其中，編碼出訊息肽的鹼基序列係具有與序列編號4所示鹼基序列呈90%以上相同性之鹼基序列。
如申請專利範圍第5項之核酸建構物，其中，編碼出訊息肽的鹼基序列係具有與序列編號4所示鹼基序列呈95%以上相同性之鹼基序列。
如申請專利範圍第5項之核酸建構物，其中，編碼出訊息肽的鹼基序列係序列編號4所示鹼基序列、或於序列編號4中置換了1個~ 數個鹼基的鹼基序列。
如申請專利範圍第5項之核酸建構物，其中，編碼出訊息肽的鹼基序列係序列編號4所示鹼基序列。
如申請專利範圍第1至9項中任一項之核酸建構物，其中，進一步含有編碼出內質網滯留訊息的鹼基序列。
如申請專利範圍第10項之核酸建構物，其中，編碼出內質網滯留訊息的鹼基序列係具有與序列編號7所示鹼基序列呈80%以上相同性之鹼基序列。
如申請專利範圍第10項之核酸建構物，其中，編碼出內質網滯留訊息的鹼基序列係序列編號7所示鹼基序列、或於序列編號7中置換了1個~2個鹼基的鹼基序列。
如申請專利範圍第10項之核酸建構物，其中，編碼出內質網滯留訊息的鹼基序列係序列編號7所示鹼基序列。
如申請專利範圍第1至13項中任一項之核酸建構物，其為DNA建構物。
如申請專利範圍第14項之核酸建構物，其係與RNA合成酶啟動子、病毒複製酶cDNA、病毒移動蛋白質cDNA及病毒外殼蛋白質cDNA連接的形態。
如申請專利範圍第15項之核酸建構物，其中，上述病毒複製酶、移動蛋白質及外殼蛋白質係來自菸草鑲嵌病毒。
一種表現載體，係含有申請專利範圍第1至16項中任一項之核酸建構物。
如申請專利範圍第17項之表現載體，其係病毒表現載體。
一種重組病毒，係含有申請專利範圍第1至13項中任一項之核酸建構物。
如申請專利範圍第19項之重組病毒，其係由申請專利範圍第18項之表現載體所調製之重組病毒。
一種人類EGF之製造方法，係包括使申請專利範圍第19或20項之重組病毒感染至植物體，病毒增生後，回收由該病毒所生產之成熟型人類EGF蛋白質分子。
一種人類EGF之製造方法，係包括使由申請專利範圍第18項之表現載體所調製之重組病毒感染至植物體，病毒增生後，回收由該病毒所生產之成熟型人類EGF蛋白質分子。
如申請專利範圍第21或22之方法，其係使用菸草作為植物體。
一種多核苷酸，係編碼出成熟型人類EGF者，該多核苷酸之鹼基序列係具有與序列編號1所示鹼基序列呈90%以上相同性。
如申請專利範圍第24項之多核苷酸，其中，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號1所示鹼基序列。
一種多核苷酸，其中，係編碼出成熟型人類EGF者，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號1所示鹼基序列、或於序列編號1中置換了1~15個鹼基的鹼基序列。
一種多核苷酸，係編碼出菸草伸展蛋白訊息肽者，該多核苷酸之鹼基序列係具有與序列編號4所示鹼基序列呈90%以上相同性。
如申請專利範圍第27項之多核苷酸，其中，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號4所示鹼基序列。
一種多核苷酸，其中，係編碼出菸草伸展蛋白訊息肽者，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號4所示鹼基序列、或於序列編號4中置換了1個~數個鹼基的鹼基序列。
一種多核苷酸，係編碼出內質網滯留訊息者，該多核苷酸之鹼基序列係具有與序列編號7所示鹼基序列呈80%以上相同性。
如申請專利範圍第30項之多核苷酸，其中，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號7所示鹼基序列。
一種多核苷酸，其中，係編碼出內質網滯留訊息者，該多核苷酸之鹼基序列係序列編號7所示鹼基序列、或於序列編號7中置換了1個~2個鹼基的鹼基序列。
一種重組病毒，係含有申請專利範圍第24至26項中任一項之多核苷酸。
如申請專利範圍第33項之重組病毒，其為植物病毒。
如申請專利範圍第33或34項之重組病毒，其進一步含有申請專利範圍第27至29項中任一項之多核苷酸、及申請專利範圍第30至32項中任一項之多核苷酸。