TW201238973A - MiRNAs in joint disease - Google Patents

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201238973 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於微RNA(miRNA)，特別是mir-22，作 為組織狀態或疾病例如骨性關節炎(〇A)之指標，及作為 找出治療關節炎物質之目標分子。進一步係提供用於調 查刀析及/或治療關郎疾病，特別是QA之方法和化人 物。 〇 【先前技術】 關節炎為人類最常見的關節疾病，特徵為關節疼 痛、發炎、發紅和腫大。已知有數種不同形式的關節炎、。 類風濕性關節炎(RA)，-紐性全身發炎性疾病，主 2 =液關節a;而僵直性脊椎炎(AS)，亦為慢性發炎 Μ-Γ: ’主要是f彡響雜和骨盆關節。幼年特發性 即火(JIA)其特徵為㈣的⑽發炎及發生在年齡16 痛風其特徵為經常性發作之急性發炎性 關即火，其係因血液中升高的尿酸量所 二炎係因關節感染所造成，及乾癬性關節炎可:二： 在^乾癬之病患。骨性關節炎_其^ = 異常’例如關節軟骨和軟骨下骨退化。〜 幾械 OA為西方國家最f見的疾病之—， :美L曰本和德國有超過2千1百萬個診斷症狀0广0 t卜由於人口老化，須面對不斷增加的0A病=狀病 ，、生活品f嚴重受到影響。此外，OA帶來F Γ 經濟之直接和間接的成本負擔。目前的治療; 201238973 與〇A有關的疼痛營拽，m、 緩、停止或甚至;/1 因為長久以來雖尋求可能減 式，但仍不可r逆轉OA過程和其效應之藥理學治療方 ;广伙作《造成滑液關節之結構和功能障礙之病 和病理結果。其係發生在當關節組織的分 心二1二動態平衡被破壞時。軟骨之結構性失能可 = w·: _巾的機械應變傷害健康的軟骨’以及在生理和 、/、響下，失能的病理學上受損之軟骨退化所 k成二0Α其特徵為漸進式的軟骨退化，最後導致受傷 的關節失π S QA慢性的進展期間，軟骨被破壞，釋 放出下層骨組織，最後需要手術置換受傷關節。 除了軟骨破壞外’亦發生滑賴和㈣之病理性退 化。ΟΑ的第二效應為產生發炎。 ΟΑ中觀察到的形態變化包括軟骨侵蝕以及不同程 度的滑膜發炎。這些變化係歸因於生化因子之複雜網 絡，包括導致軟骨大分子，特別是膠原蛋白π、χ和蛋 白多糖(aggrecan)分解之蛋白質水解酵素。細胞激素例 如藉由活化的滑膜細胞、單核細胞，或藉由軟骨本身所 產生的IL-1和TNF-α，顯著地上調基質金屬蛋白酶 (MMP)和細胞激素基因表現，以及鈍化補償合成路 確切的OA病因仍無解，但某些成因係與疾病的笋 生和進程有關。最重要的因子為年齡，但週期性的超χ 荷、肥胖、關節鬆弛和先天性亦扮演重要的角色。^ 基質組份之退化一般認同係由於胞外蛋白酶，主^月 201238973 MMP之合成增加和活化，以及細胞激素擴大了退化過 程0 OA的診斷一般係以病患關節之臨床檢查出現緩起 症狀和徵兆為基準，以X-光確認診斷。經由光可觀 察到的典型變化包括關節空間窄化、關節邊緣形成骨 刺、軟骨下硬化、軟骨下囊腫形成、骨骼重塑和關節積 液。診斷OA之實驗室試驗仍尚未取得’因為習用之標 記在OA中仍為正常的。這些試驗僅可用於辨別〇A^ 其他形式的關節炎，特別是發炎類型的關節炎。因此， 僅在關節退化已惡化至足以用χ_光看出之階段時才可 能診斷出OA。就目前看來，早期發生之此疾病尚無法 偵測，防礙了可能從一開始避免關節破壞之及時治療\ 因此，能在早期階段鑑定0A之改良性工具仍為所1希望 ^ 叫、丨工征狀必炳囚性醫藥治療並不可 月匕，因為並無〇Α疾病緩解藥(DMOAD)存在。因此， 現今之疾病管理為降低翻醫藥，主要 炎__之投予，舒緩疼痛並因而 良性:缺陷，對於得以鑑定早期疾病:改 = : = =給予預防及…早期治癒性 【發明内容】 及適狀改良方法以 席夂物負和組成物。精由本發明不同 201238973 的方面’以提供在軟骨細胞之分化雜期間差異性表達 之imRNA為基礎之方法和4勿質，及培養骨 (BMCS)可得到解決。 卿、，，胞 本發明絲於發明者意外發現，在軟骨細胞中 mir-22專一性的抑制作用增加了軟骨形成標記，而軟骨 細胞中mir-22之過度表現則導致軟骨形成標記下降。 在第一方面，本發明係提供用作組織狀態或疾病指 標之mir-22，及在第二方面為mir_22作為組織狀 病指標之用途。 在第三方面，本發明係提供於個體中鑑定組織狀態 改變，或疾病（較佳地關節疾病）發生風險及/或鑑定疾病 存在及/或監控疾病進程之方法，其係包括偵測樣本中 mir-22之量。 在第四方面，本發明係提供於個體中測定用於組織 狀態改麦或預防或治療疾病，較佳地關節疾病之醫藥劑 量之方法，其包括下列步驟：（幻測定個體樣本中mir 22 之量’及(b)依照試驗樣本中mir_22之量決定醫藥劑量。 在第五方面，本發明係提供調整用於組織狀態改變 或預防或治療關節疾病之醫藥劑量之方法，其包括下列 步驟：（a)測定樣本中mir_22之量，及(b)測定一或多個參 照樣本中mir-22之量，（c)檢驗試驗樣本關於存在該樣本 中mir-22之量是否與一或多個參照樣本中mir_22之量不 同’（d)依照試驗樣本中mir-22之量是否與一或多個參照 樣本中mir-22之量不同，調整醫藥劑量。 在第六方面’本發明係提供測定一物質對組織狀態 201238973 或發生㈣疾病之制及/麵#效狀方*，盆包括 下列步驟··⑷駭試驗樣本中偷_22之量 ； 中-22之量，及⑷檢驗試驗二 存在该樣本中mir_22之量是否與—或多個參照樣本中 mir22之5_不同，其中$試驗樣本暴露於該物 係與一或多種參照樣本不同。 在第七方面’本發明係提供mir_22於第三至第六方 面任一方面之方法中的用途。 ^ 在第八方面’本發明係提供用於第三至第六方面任 一 ^面之方法中的套組，其包括—或多種偵測秦批 工具。 在第九方面，本發明係提供第八方面 至第六方面任一方面之方法中的用途。第二 在第十方面，本發明係於第三至第六方面任一方面 之方法中’提供一或多種用於偵測mir-22基因、基因產 物或其功能活性變體之核酸。 在第十一方面，本發明係於第三至第六方面任一方 面之方法中’提供用於偵測秦22基因 功能活性變體之胜肽、多肽或蛋白。 ^ j第十二方面，本發明係提供第十方面之核酸，或 第十方面之胜肽、多肽或蛋白於第三至第六方面任一 方面之方法中的用途。 、在第十二方面，本發明係提供篩選mir-22拮抗劑之 方法其中该方法包括下列步驟：⑻提供mir-22或mir-22 基因’（b)提供概化合物，及_量或制試驗化合 7 201238973 物對mir-22或mir-22基因之影響。 在第十四方面’本發明係提供用於組織狀態改變或 預防或治療關節疾病之mir-22拮抗劑。 在第十五方面，本發明係提供包括第十四方面之 mir-22拮抗劑之醫藥。 在第十六方面，本發明係提供用於組織狀態改變或 預防或治療關節疾病之方法，其中係將一治療上有效量 之第十五方面的醫藥投予處於發生或罹患關節疾病風 險之個體。 本發明詳細說明 在詳述本發明之前’應了解，本發明不限於文中所 述之特定的方法、方案及試劑，因為這些可改變。亦應 了解，文中所用的術語僅供描述特定的實施例之目的， 而不希望限制本發明之範圍，.本發明之範圍僅受限於所 附的申請專利範圍。如本發明所屬的技術之一般技術者 正常之理解，除非另有說明，否則所有文中所用的技術 和科學術語具有相同意義。 較佳地，文中所用的術語係如”A multilingual glossary of biotechnological terms ： (IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W, Nagel, B.及 Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel，Switzerland)中所述來定義。 本說明書全文引述數種文件。各文中所引述的文件 201238973 (包括：所有的專利、專利申請書、科學刊物、製造商 說明書、指南、基因銀行(GenBank)登錄號序列提交 專）’無論上文或是下文，其全文係以引用的方式併入。 在文中不應視為核准，本發明並無權藉由先前的發明提 早此揭示文。 定義 整個說明書及其後的申請專利範圍，除非文中需 要，否則「包括」一詞及其變化應了解係指包含陳述的 整體或步驟，或整體或步驟之群組，但並不排除其他的 整體或步驟，或整體或步驟之群組。 「核酸」分子應了解為由核苷酸單體所合成之聚合 或券合大分子。核苷酸單體係由核鹼基、五碳糖(例如（但 不限於)核糖或2’-去氧核糖）及一至三個磷酸基團所級 成。典型地，多核苷酸係經由個別核苷酸單體間的磷醆 二酯鍵所形成。在本發明内文中係指核酸分子包括（值 不限於)核糖核酸(RNA)、去氧核糖核酸(DNA)及其混合 物，例如RNA-DNA雜合物。術語「多核苷酸」和「核 酸」在本文中可父換使用。核酸可例如以化學合成， 如依填酸二S日法（參見’例如uhlmann, E. & Peyman A (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584) 〇 ’ 核酸可藉由核酸内切酶或核酸外切酶降解，特別β 細胞中可發現的DNΑ酶和RNΑ酶。因此，有利的係= 飾核酸，以便使其安定，對抗降解，藉此確保長期維^ 細胞中咼的核酸濃度(Beigelman等人（1995) Nucle. 201238973 WO 95/11910

Acids Res. 23:3989-94 WO 98/37240 ; WO 97/29116)。典型地，此安定化作 用可藉由導入一或多個核苷釀間磷基團或藉由導入一 或多個非磷的核苷酸間基團來達成。 適合的修飾核苦酸間基圑係匯編於Uhlmann和 Peyman (1990)，上文（亦參見 Beigdman 等人（1995)

Nucleic Acids Res. 23:3989-94 ； WO 95/11910 ； WO 98/37240，WO 97/29116)。可用於本發明用途之 一的修飾核苷酸間磷酸基及/或核酸間之非磷橋包括例 如膦酸曱酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、二硫代磷酸酯 及/或磷酸酯，而非磷的核苷酸間類似物包括，例如矽 氧烷橋；碳酸橋；羧酸曱酯、胺基乙酯橋及/或硫醚橋。 亦所欲的，此修飾應改善可用於本發明用途之一的醫藥 組成物之效期。 核酸可由下列組成之群中選出：多核苷酸探針、引 子（例如引子對）’較佳地用於聚合酶連鎖反應（pCR)、 反轉錄(RT)反應或DNA排序之引子、胜肽核酸(PNA)、 鎖核酸(LNA)、二醇核酸(〇Na)、蘇糖核酸(TNA)、微 RNA (miRNA)和小的干擾 RNA(siRNA)。 術語「探針」如文中所用係指單股寡核苷酸，其典 型地係用於偵測與探針序列互補的目標RNA及/或DNA 序列。探針與單股的核酸(DNA4RNA)雜交，因為探針 和目標序列互補，其核苷酸序列能使核苷酸配對。探針 長度係依照所欲用途以及探針所需的專一性而定。典型 地’板針為20-500 (亦即50、55、60、65、70、75、80、 201238973 85、90、95、100、110、120、130、140 ' 150、i6〇、 〇〇、180、190、200、300、400、500)個核苷酸長，較 佳地20-100個核苷酸，更佳地2〇_5〇個。對於偵測微RNA 探針係介於12至3 0個核苷酸之間。探針係用在各種實驗 設定例如（但不限於）南方墨點和北方墨點，即時pcR和 原位雜交(ISH)以及微陣列實驗。探針可為未標示、直 接標示或間接標示，例如以稍後可結合鏈黴親合素複合 物之生物素。該標示可為以光譜、光化學、生物化學、 免疫化學、化學或其他物理方法可偵測之分子。例如， 適合的標示包括32P、螢光染劑、高電子密度試劑、酵 素（例如常用於ELISA)、生物素、地高辛（dig〇xigenin) 或半抗原及其他可偵測之實體。標示可在任何位置併入 核酸，例如在3,端、5,端或之間。術語「探針」亦涵蓋 其架構組成上不同的核酸，例如（但不限於）胜肽核酸 (PNA)、鎖核酸（LNA)、二醇核酸（GNA)和蘇糖核酸 (TNA)。 術語「引子」如文中所用係指單股寡核苷酸，其典 型地係作為DNA-複製酵素之起始點。引子係與DNA模 板結合或雜交及典型地係包括本應與〇]^八序列結合的 序列相互補之序列。引子亦可包括另㈣賴，例如作 為核酸酶裂解位置(例如Bam m、Hind m等）之序列。 号丨子的長度係依照所欲的用途來選擇。例如，聚合酶連 鎖反應(PCR)中用於增幅DNA之引子典型地具有至少1〇 個核皆I ’較佳地介於1()至5()(亦即15、16、、18、 19、20、21、22、Μ^ 201238973 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50) 個核苷酸，更佳地介於15至30個核苷酸。至少5個核苷 酸之較短的引子可用於DNA模板之定序。術語「引子」 亦包括術語「簡併引子」，其為類似，但非相同引子的 混合物。引子可以光譜、光化學、生物化學、免疫化學、 化學或其他物理方法可偵測之標記分子加標籤或標示。 如文中所用’術語「微RNA」及其變化例如「miRNA」 和「miR」包括可自然生成之人類111汉1^八、成熟的單股 miRNA、前驅物miRNA(前-miR)及其變體。在某些例子 中，術語「miRNA」包括初級miRNA轉錄本和雙螺旋 miRNA。除非另有註解，否則當用本文時，特定miRNA 之名稱係指成熟的miRNA。例如，mir-22係指衍生自前 -mir-22之成熟的miRNA序列。miRNA之序列，包括人 類成熟的和前驅物序列（亦稱為莖環序列），係提報於下 列數據庫中： miRBase-微RNA數據庫，可經由下列連接： http://microrna.sanger.ac.uk or http://www.mirbase.org/ 包括miRNA序列之出版品有：Griffiths-Jones等人， Nucleic Acids Research, 2008，36，Database Issue， D154-D158; Griffiths-Jones 等人，Nucleic Acids Research， 2006, 34, Database Issue, D140-D144 ； Griffiths-Jones, Nucleic Acids Research, 2004, 32, Database Issue, D109-D111, Griffiths-Jones 等人，Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, Database Issue, D152-D157) ° 12 201238973 mir-22:之序列 智人mir 22莖環序列hsa_mir-22(登錄號： MI0000078): GGCUGAGCCGCAGUAGUUCUUCAGUGGCAAG CUUUAUGUCCUGACCCAGCUAAAGCUGCCAGUUG AAGAACUGUUGCCCUCUGCC (SEQ ID ΝΟ:1) 成熟序列： hsa-miR-22(登錄號：MIMAT0000077): AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU (SEQ ID NO:2) 子序列： hsa-miR-22*(登錄號：MIMAT0004495): AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA (SEQ ID NO:3) 此miRNA序列係以與來自小鼠驗證過的miRNA 同源性為基準所描繪「’Identification of novel genes coding for small expressed RNAs” Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T Science. 294:853-858(2001), "Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia" Michael MZ, O’ Connor SM, van Holst Pellekaan NG, Young GP, James RJ Mol Cancer Res. 1:882-891(2003)]。其表現後來於人類 中驗證「”Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus expresses an array of viral microRNAs in latently infected cells” Cai X, Lu S, Zhang Z, Gonzalez CM, Damania B, 13 201238973

Cullen BR Proc Natl Acad Sci USA. 102:5570-5575(2005)., "A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing" Landgraf P, Rusu M, Sheridan R, Sewer A, Iovino N, Aravin A, Pfeffer S, Rice A, Kamphorst AO, Landthaler M, Lin C, Socci ND, Hermida L, Fulci V, Chiaretti S, Foa R, Schliwka J, Fuchs U, Novosel A, Muller RU, Schermer B, Bissels U, Inman J, Phan Q, Chien M Cell. 129:1401-1414(2007)。 微RNAs (miRNAs)為内生性的小RNA分子，其係 涉及在在轉譯層級調節基因表現。再者，其為細胞RNA 干擾(RNAi)機制之部分。miRNA係由從DNA轉錄但非 轉譯成蛋白之基因所編碼（非-蛋白-編碼RNA)。其首先 係在秀麗隱桿線蟲中發現，並存 在於植物和動物中。許多miRNA的序列在不同的物種 間被高度保留，其顯示miRNA路徑為相當古老和重要 調節機制之部分(Grosshans 等人 J Cell Biol 156: 17-21 (2002))。已發現miRNA調節約3〇%的哺乳動物基因 (Czech, NEJM 354:1194-1195 (2006) ； Mack, Nature Biotech. 25:631-638 (2007) ； Eulalio，等人，Cell 132:9-14 (2008))。最近，已發現miRNA藉由阻斷轉譯 ^造成轉錄退化來抑制蛋白產生，藉此調控基因表現。 單二miRNA可能以25〇-5〇〇種不同的mRNA為目標， 其也明此類的RNA在廣泛的細胞功能中為極重要的介 201238973 子。許多藉由miRNA調節之基因乃致病基因。因此， 任何miRNA-調節功能性具有很大的治療潛力。 在動物中，miRNA首先係由作為RNA轉錄本稱為 初級miRNA(pri-miRNA)之基因體所表現。其係由rnA 聚合酶II轉錄，並形成髮夾結構。在核中，dsRNA-專 一性核糖核酸酶Drosha將pri-miRNA作用成更短的約 70-至100-核苦酸長，稱為pre-miRNA之莖環結構，然 後可能是以Exportin-5 (Exp5)將其輸出至細胞質。（γί， 等人 Genes Dev. 17 :3011-3016 (2003))。在細胞質中， Dicer’RNA酶III核糖核酸酶家族之成員，將前_miRNA 裂解成在二端帶有3’突出之雙股的引導/乘客 (miRNA/miRNA*)雙螺旋。miRNA雙螺旋之二股，在其 序列上因不完全互補常會有錯配，且當其分開，成熟的 miRNA ’在許多案例中，介於約19至23個核苷酸長， 被RNA-誘導沉默複合物(RISC)或類似的蛋白複合物所 束缚。RISC亦為蛋白複合物，其可招致由小的或短的 干擾RNA(siRNA)媒介的目標專一性mRNA降解。 目前，咸信其係以RISC之催化性組份argonaute 作為引導股，成熟的miRNA則被整合到RISC複合物 中，並與具有即使非完全但相當大程度互補序列的信使 RNA(mRNA)分子結合。乘客股miRNA*，可降解。然 後被miRNA-RISC複合物束縛之mRNA的轉錄受到抑 制，造成對應基因之表現減低。在某些案例中，該受束 缚的mRNA被裂解或去腺苷酸化及降解。對於特定的 miRNA，單一前驅物包含一種以上的成熟序列。在其他 5 15 201238973 的實例中’多前驅物miRNA含有相同的成熟序列。 術語「蛋白」和「多肽」在文中可交換使用且係指 任何胺基酸之胜肽連結鏈，無關長度或後轉譯修飾。可 用於本發明之蛋白（包括蛋白衍生物、蛋白變體、蛋白 斷片、蛋白片段、蛋白表位或蛋白結構域）可進一步以 化學修飾來修飾。此等方法例如化學修飾多肽係包括扣 種天然胺基酸以外的其他化學基團。此等其他化學基團 之貫例包括（不限於)醣基化胺基酸和鱗酸化胺基酸。相 較於原多肽，化學修飾之多肽可提供有利的性質，例如 一或多項增進安定性、增加生物半衰期或增加水溶解 度。適用於本發明可用變體之化學修飾包括（不限於）： PEG化、非糖基化母體多肽之糖基化或存在母體多肽中 糖基化之修飾。 如文中所用，術語「變體」應了解為一種多核苷酸 或蛋白，其相較於從其衍生之多核苷酸或蛋白，其差異 在於長度或序列上有一或多種改變。衍生蛋白或核酸變 體之多肽或多核苷酸亦稱為母體多肽或多核苷酸。術語 「變體」包括母體分子之「斷片」或「衍生物」。典型 地’「斷片」在長度或尺寸皆比母體分子小，而「衍生 物」’相較於母體分子，則在序列上具有一或多種差異。 又涵蓋的修飾分子例如包括（但不限於）後轉譯修飾白 (例如糖基化、生物素化、磷酸化、泛素化、棕櫚醯化 或蛋白質水解性裂解蛋白和修飾核酸例如曱基化 DNA。術語「變體」亦涵蓋不同分子之混合物例如（但 不限於)RNA-DNA雜合物。典型地，變體係由人工建構 16 201238973 =車乂仏地以基因工程方法，而母體多肽或多核苷酸則 二=生型蛋白或多核純。然而，應了解，天财成的 受體亦涵蓋在文中所用的術語「變體」中。另外，可用 於本發明H何衍生自母體分子之_物、直系同 源物或旁系同源物，或衍生自人工建構的變體，其限制 條件為該變體具有至少一種母體分子之生物活性，亦即 功能活性。 替代地或另外地，如文中所用「變體」可由與從其 衍生的母體多肽或母體多核苷酸之特定程度的序列一 致f生來疋性。更精確地，本發明内文中之蛋白變體與其 母體多肽具有至少8〇%序列一致性。本發明内文中之多 核苷酸變體與其母體多核苷酸具有至少8〇%序列一致 性。整個說明書中所用的術語「至少8〇%序列一致性」 係有關多肽和多核苷酸序列比較。此詞語較佳地係指與 個別的參照多肽或個別的參照多核苷酸具至少8〇%，至 少81%，至少82% ’至少83%，至少84%，至少85%，至 少86%，至少87%，至少88%，至少89%，至少90%，至 少91°/。’至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至 少96% ’至少97% ’至少98%，或至少99%序列一致性。 核苷酸和胺基酸序列之相似性，亦即序列一致性百 分比，可經由序列比對來測定。此等比對可以數種技術 中已知的演算法來進行，較佳地以Karlin和Altschul之數 學演算法(Karlin & Altschul (1993) 90 : 5873-5877)，以 hmmalign (HMMER package, http://hmmer.wustl.edu/)或以 CLUSTAL 演算法 17 201238973 (Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)可於例如 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 或 於 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html 或於 http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/N PSA/npsa_clustalw.html取得。所用較佳的參數為系統内 定參數 ， 而其係 設置在 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ 或 http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html。序歹ij 一 致性（序列配對）之等級可使用例如BLAST、BLAT或 BlastZ (或BlastX)來計算。一類似的演算法係併入 Altschul 等人（1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-410 之 BLASTN和BLASTP程式。BLAST多核苷酸搜尋係以 BLASTN程式，得分= 100，字長=12來進行，得到與編 碼mir-22之核酸同源之多核苷酸序列。BLAST蛋白搜尋 係以BLASTN程式，得分=50，字長=3來進行，得到與 mir-22同源之胺基酸序列。為了得到比較用之缺位比 對，係利用 Altschul 等人（1997) Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402 所述的 Gapped BLAST。當利用 BLAST 和 Gapped BLAST程式時，則使用個別程式之内定參數。 序列比對分析可藉由己建立的同源性定位技術如 Shuffle-LAGAN (Brudno M., Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:154-162)或Markov隨機場來補充。當本申請書中 指出序列一致性之百分比時，若無特別指出，則這些百 分比係以相對於較長序列之全長所計算。 201238973 術語「雜交」亦可用作二種核酸序列間序列一致性 或同源性之計量標準。編碼miRNA之核酸序列或其部 分，根據標準的雜交技術可用作「雜交探針」。mir_22 探針與試驗來源的DNA或RNA之雜交為試驗來源中 mir-22 DNA或RNA存在之指標。雜交條件已為熟習本項 技術者所知並可參見，例如Current Pr〇t〇c〇ls in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 6.3.1-6.3.6,

1991。「中度雜交條件」係定義為相當在於2χ氣化 鈉/獰檬酸鈉（ssc)中雜交，接著alx ssc、〇 1〇/。SDS 於50°C清洗。「高嚴格條件」係定義為相當在45〇c於6χ 氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)中雜交，接著以02XSSc、〇 1% SDS於65°C清洗。 ’ 術語「組織」如文中所用，係指一致地實行特定功 能之相同起源的細胞集群。組織之實例包括（但不限於） 骨、軟骨、結締組織、肌肉組織、神經組織和上皮組織。 多種組織共同形成一個器官用以實行特定的功能。器官 之實例包括（但不限於）關節、骨骼、肌肉、血液、腦、 心、肝、腎、胃和皮膚。例如，關節係由不同的組織所 形成，例如（但不限於）骨、軟骨、滑膜、肌肉、韌帶和 肌腱。 術語「關節」如文中所用係指讓二或多根骨頭相接 觸的位置。此術語可指可動關節或不可動關節。另外， 關節可為纖維關節，其中骨頭係以富含膠原蛋白的緻密 性結締組織連附；或軟骨關節，其中骨頭係以軟骨連 附。關節亦可為滑液關節，其中骨頭並不直接相連但具 201238973 ，她㈣㈣帶#σ肌腱連結的關節軟骨之 =囊=。細_包括(但不限於)球窩關結‘ ，關即或肩關郎1圓關節和平面關節，例如 肘部、膝蓋、騍«手指和腳趾關節 椎之關節。 胃郎，及樞軸關郎，例如寰椎與樞 術香「組織狀態」或「組織之狀態」在文中可交換 使用’其係指組織之狀況。組織狀態可以此等組織弃 定的形態來表示特徵或可藉由—或多種特定分子，例如 |仁不限於)胜肽、蛋白和核酸或其組合之表現來表示特 徵。若此組織之狀況類似無疾病或損傷並足以實行其特 定功能時，組織狀態可被視為「健康」或「正常」了若 此組織因患病或損傷而無法實行其功能時，組織狀態可 視為「退化」、「疾病」或「異常」。另外，若此組二之 形態或其分子表現模式與正常組織相比較時「改變」或 「變化」，則組織狀態可視為「退化」、「疾病」或「異 常」。因此，組織之形態或組織中特定分子之表現模式 可作為組織狀態之指標。組織狀態之指標包括(但不^ 於）組織退化，例如軟骨退化、骨退化和滑膜退化、組 織發炎例如軟骨發炎或滑膜發炎、組織重塑例如軟骨重 塑、硬化、液體堆積或增生性組織例如受傷癒合過程之 增生、囊腫形成或癌症。 術語「疾病」和「病症」在文中可交換使用，直係 指異常狀況，特別是異常的f學狀況例如患病或剔备， 其中組織、器官或個體不再能充分實行其功能。典型 20 201238973 地，但非必要，疾病係與顯示此疾病出現之特定的癥狀 或徵兆有關。因此，此癥狀或徵兆之出現可為組織、器 官或個體患有疾病之指標。這些癥狀或徵兆之改變可為 此疾病進程之指標。疾病之進程典型地其特徵為可顯示 疾病「加重」或「好轉」之此等薇狀或徵兆增加或減少。 疾病「加重」其特徵為組織、器官或個體充分實行其功 能之能力減低，而疾病「好轉」典型地其特徵為組織、 器官或個體充分實行其功能之能力增加。組織、器官或 個體處於疾病「發生之風險」係在健康的狀態下，但顯 示疾病出現之潛在性。典型地，發生疾病之風險係與此 等疾病之早期或微弱的徵兆或癥狀有關。在此情況下， 疾病之發生仍可藉由治療來預防。疾病之實例包括（但 不限於)創傷性疾病、發炎性疾病、感染性疾病、皮膚 症狀、内分泌疾病、腸疾病、神經病症、關節疾病、遺 傳性病症、自體免疫疾病及各種類型的癌症。 術語「關節疾病」如文中所用，係指關節之異常症 狀，特別是因受傷、創傷、退化、發炎、感染或自體免 疫因素。關節疾病包括類風濕性關節炎(RA)、僵直性脊 椎炎(AS)、幼年特發性關節炎(JIA)、痛風、感染性關節 炎、乾癖性關節炎和骨性關節炎（OA)、癌症例如軟骨肉 瘤、骨肉瘤、纖維肉瘤和多發性骨髓瘤、肌腱炎、滑液 囊炎、骨折和軟骨或骨骼傷害。 疾病之「癥狀」為具有此疾病之組織、器官或個體 顯見的疾病暗示，並包括(但不限於）組織、器官或個體 之疼痛、虛弱、柔軟、拉緊、剛硬和痙攣。疾病之「徵 21 201238973 兆」或化唬」包括(但不限於）變化或改變，例如特定 W如生物標記或分子標記之有、無、增加或提升、降 低或減广’或癥狀發生、出現或加重。 、a術語「指標」如文中所用，係指症狀之徵兆或信號， 或疋用於監測症狀。此「症狀」係指細胞、組織或器官 之生物狀態或指個體之健康及/或疾病狀態。指標可為 分子，包括(但不限於)胜肽、蛋白和核酸之有或無，或 可為細胞或組織、器官或個體中此分子之表現量或模式 改變。指標可為個體中疾病開始、發生或出現之徵兆， 或進一步為此疾病之進程。指標亦可為個體中發生疾病 風險之徵死。例如’於關節疾病例如〇A有關的指標包 括（但不限於）轉錄因子例如Sox-5、Sox-6、Sox-9、

Nfatl、pitxl、FoxO、HIF2A、SAF-1、RUNX-2、cytokines such as IL-Ιβ、IL-2、IL-7、IL_12、IL-18、GM-CFS、 TNF-ci、NF-kB和INF-γ，磷酸酶例如鹼性磷酸酶(ALP)， 蛋白酶例如金屬蛋白酶（例如MMP-1、MMP-2、 MMP-3、MMP-8、MIyIP-9、MMP-13、MMP-14)，蛋白 多糖酶（例如 ADAM-8、ADAM-12、ADAM-TS4、 ADAM-TS5)和半耽胺酸蛋白酶[例如組織蛋白酶 B(cathepsin B)、組織蛋白酶 K(cathepsin K)、組織蛋白 酶S(cathepsin S)、鈣蛋白酶（caipain)、凋亡蛋白酶 -3(caspases-3)、调亡蛋白酶-3(caspase-9)]、金屬蛋白酶 之組織抑制子（例如TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、 TIMP-4)，胞外基質組份例如膠原蛋白（例如膠原蛋白 II、VI、IX、X、XI)，蛋白多酷(proteoglycan)(例如硫 22 201238973 酸乙醯肝素、硫酸軟骨素、硫酸角質素）、蛋白多糖 (aggrecan)、彈力蛋白、玻尿酸、纖維糖連蛋白、基祺 黏連蛋白、CD-RAP、CDMP、軟骨調節素 (chondromodulin)和多效蛋白（piei〇tr〇phin)。典型地，在 患有關節炎，特別是OA之組織、器官或個體中，一或 多個此等指標會高於或低於未患有關節炎之組織、器官 或個體。例如，相較於未患有θΑ或未處於發生〇八風 險之組織、盗官或個體，胞外基質組份膠原蛋白Η和X 以及蛋白多糖和CD-RAP在患有ΟΑ或處於發生〇Α風 險之組織、器官或個體中會較低。另外相較於 〇A或未處於發生〇A風險之組織、器官或個體，^錄 因子S〇x9的量以及金屬蛋白酶ΤΙΜΡ-1和ΤΙΜΡ-4之組 織抑制子在患有QA或處於發生QA風險之組織、器官 或個體中會降低。相反的，相較於未患有〇A或未處於 發生OA風險之組織、器官或個體，細胞激素正-丨、il_6 矛TNF ct以及金屬蛋白酶mmP-1、MMP-2、MMP-3 和MMP_9及磷酸酶ALp之量在患有〇A或處於發生 〇A風險之組織、器官或個體中會提高。 在本發明内文中，較佳的組織狀態或疾病之指標為 miRNA ’其包括（但不限於）如卜21、⑽·22、mir l4〇、 =r-146a和mir_199a。個體中隱_22為疾病例如關節 犬，特別是OA之特佳的指標。 M，文中所用，「個體」係指任何可由本發明獲得利 =爵乳動物、；^蟲類或烏類。較佳地，個體係由下列 、且、之群中選出.實驗室動物(例如小鼠、大氣或兔）、 23 201238973 家養動物（包括例如天竺鼠、兔、馬、驢子、牛、綿 山羊、豬、雞、鴨、駱駝、貓、狗、烏龜、陸龜：： 蜥踢）或靈長類包括（黑麵、倭㈣、大麵 匕或 特佳地，該「個體」為人類。 1。 術語「樣本」或「相關樣本」可交換使用， 組織、器官或個體之部分或碎片，典型地係小於^曰 器官或個體，目的在於代表整個組織、器官或個體-、 照分析，樣本健供㈣組織狀態，或器官或 = J疾病狀態之資訊。樣本之實例包括(但不限於)液二’ 本例如血液、血清H滑液、尿液、唾液和淋巴= 或固體樣本例如組織萃取物、軟骨、骨、滑膜、軟’ =结締組織。另外的樣本實例有細胞培養或養 =(但不限於)軟骨、骨、滑膜、视細胞、軟骨?田月;養 細胞、破軟骨細胞、滑液細胞、骨細胞、破 '田 胞、成骨幹細胞及/或葉間幹細胞。 喂月、，、田 樣本之分析可以視覺或化學基礎來輯。 包括(但不限於)可作樣本之形態學評估、二： 個體的顯微鏡顯影或放射線攝影掃目苗 = (二限於)偵測有或無特定指標之存在或其量:程ί之 術語「參照樣本」如文中所用，係指 貫質上相同的方式分析之樣本彳樣本 :資料作比較。參照樣本藉此提供!標;本 本所得到的資料得以評估。 表由相關樣 參照樣本可衍生自健康或正常的組織、器官或個 24 201238973 體，藉此提供健康的組織、器官或個 常的參照樣本之狀態和相關樣本之狀熊^準。正 為疾病發生或存在或此疾病或病症進_^步3展差異可能 參照樣本可衍生自異常或羅病的組織、票。 藉此提郷病的組織m個體狀態卻準或= J疾病發生風險低或無疾病或此疾病或病4轉 參照樣本亦可衍生自和相關樣本相同 :間點所採集之組織、器官或個體。較早採集 本之狀態及相關樣本之狀態間的差異 > 樣 指標’亦即隨時間變化之疾病好轉或加重:若之 樣本和採集相關樣本間有時間落差，參照樣 二> 照 或較晚的時間點採集。此時間期可為年(例如^較^ 4'5、10、15、20、25、3〇、35、4〇、45、5〇6〇、、、 8〇、90、100 年）、月（卜2、3、4、5、6、7、8、9、1〇、 1卜12個月）、週(例如卜2、3、4、56、7、8週 日（例如卜 2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、60、70、80、9〇、1〇〇、2〇〇、3〇〇、4〇〇、5〇〇 日）、小時（1、2、3、4、5、6、7、8、9、1〇、η、12 小時）、分鐘(例如 1、2、3、4、5、1〇、15、2〇、25、 30、35、40、45、50、60 分鐘，或秒(例如！、2、3、4、 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 秒）。 術語「低」或「降低」量之指標’例如mir-22，係 指相較於參照物或參照樣本，在樣本中此指標之量減 25 201238973 少。術語「升高」或「增加」量之指 射=較於參㈣或參照樣本，在縣中

ΟΛ 5 ^^iRNA 之里同於未患有〇A之個體的滑液，則其 ’樣本(例如滑液）中升高的量係顯示〇A间存在 或易罹患性增加或發生〇Α的可能性增加。 在 參照樣本可經與相關樣本「不同處理 露」，若二種樣本除了單一因素外，係以實質二本 方式處理。此單一因素包括(但不限於)暴 ^目冋的 ::間、濃度或溫度。因此，相關樣本可暴露於 樣本不_量之敎㈣，或可暴露於與參 間間Ϊ，或可暴露於與參照樣本不同的溫度。相關 ^可暴露之不_量包括(但不限於)參照樣本所暴』 f量之2_倍、5-倍、10·倍、20-倍、30-倍、4〇_倍、+ 〇、100-倍及/或1000_倍的增加或減低劑量。相° _

:暴露之不同時間包括(但不限於)比參照樣本暴露時 更 =更長2-倍、5_倍、1〇_倍、2〇_倍、3〇_倍、4〇 J 。、100-倍及/或1000-倍的時間。相關樣本可暴^ 比參照樣本暴露溫度増二或降 --倍、5务 1〇_倍、20-倍、3〇·倍、40_倍、5〇 倍、 •倍及/或1000-倍。在非限定的實例中，相關樣^ ^露在比參照樣本增加1〇_倍的物質濃度中。然後管 質上相_方式進行二觀本之分析，測定效用 增加的此物質濃度對相關樣本之有利或有害效用。: 技術者應了解，此實例係經必要的修改應驗不同的濃 26 201238973 度範圍、不同的暴露時間及/或不同的暴露溫度。 術語「激動劑」如文中所用’係指引起組織、器官 或個體之作用，例如受體訊號傳遞、基因表現、蛋白入 成和蛋白降解之物質。典型地，激動劑係藉由與受體分 子之活性位或異位結合’觸發特定反應來作用。激動劑 之實例包括（但不限於）核酸分子，例如mRN A戈 miRNA，或蛋白例如荷爾蒙、細胞激素、生長因子、神 經傳遞質和轉錄因子。 術語「拮抗劑」如文中所用，係指阻斷激動劑作斥 之物質。典型地’拮抗劑係藉由與受體分子之活性位_ 異位結合來作用，或與非一般涉及受體活性調節之1 結合位相互作用。典型地，拮抗劑係在結構定義結入' 與激動劑競爭，或以讓激動劑不能引起一般因其 造成的作用之方式，改變激動劑的結合位。拮 性依照拮抗劑-受體複合物之交互作用备人 4之/3 逆的或不可逆的。拮抗劑之實例包括ϋ限 子，例如siRNA或miRNA，或蛋白例^酸女 激素、生長因子或神經傳遞質 拉、象、細用 術語「模擬物」如文中二 如目標分子如組織、器官或個〜日线目標分子(# :作用，例如受體訊號傳遞、基"因夺了動/或拮抗劑 白降解之物質。因此 ^表現、蛋*合成和蛋 如激動劑或拮抗劑)結構上可不7模擬之目標分子(例 特定反應，例如藉由與㈣可造成相同的 (亦即藉由運用至少其之活性位或異 種激動劑或拮抗劑之活性 201238973 典型地，模擬物係實行與個別的激動劑或拮抗劑相同之 功能，亦即為功能上同等物。例如，mir_22的模擬物為 給予至少其巾-種秦22活性、具有論_22功能及/或 模擬mir-22作用之物質。 術5吾「文體」如文中所用，係指與一或多個特定訊 =遞分子相結合之分子，例如蛋白❹核紐。訊號 4、’刀子可作為激動劑或拮抗劑，其包括（不限於)核酸 为子’例如siRNA或miRNA，或蛋白例如荷爾蒙、細 胞激素、生長因子或神經傳遞質、抗體或轉錄因子。受 體可侷限在細胞膜、細胞質内及/或胞内隔室。 如文中所用，疾病或病症之「治療」係指達成下列 一或多項：（a)降低病症之嚴重度；（b)限制或防止所治 療病症之癥狀特徵發生；（c)抑制所治療病症之癥狀特徵 加重；（d)限制或防止之前患有該病症之個體再發生此病 症；及(e)限制或防止之前具有該病症癥狀之病患再發生 癥狀。 如文中所用，疾病或病症之「防止」或「預防」係 指於病患中防止此疾病或病症。 術5吾「醫藥」、「醫藥品」和「藥物」在文中可交換 使用，其係指用於測定、預防或治療組織狀態或疾病之 物質或物質之組合物。 「醫藥上可接受」係指經聯邦或州政府管理當局核 准或列於美國藥典或其他一般用於動物（更特言之，^ 類）之已知的藥峨。 術語「活性成份」係指在醫藥組成物或調配物中具 28 201238973 生物活性，亦即提供醫藥價值之物f。t藥組成 括一或多種可聯合或各自獨立作用之活性成份。 活性成份可調配為中性或_式。醫藥上為趟 類包括與_胺基基團所形成H例如" 石粦酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽類，及^^其 團所形成之鹽例如(但不限於)衍生自納、鉀、：竣二基 =化鐵、異丙胺、三乙胺、2_乙基胺基乙醇、二酸、 普卡因及其類似物。 術語「製備物」和「組成物」希望係包括活性化合 勿與包膠物質作為制提供膠囊之調配物， 二 ^他載劑之活性組份係被載劑所包圍與其=結 術語「載劑」如文中所用，係指藥理學上 例如(但不限於)稀釋劑、賦形劑或媒劑，盆係虚 ^ 性成份—起給藥。此等醫藥_可為液體或固 =體制包括(但秘於)無菌㈣，例如食鹽水溶 f =包括，、動物、植物或合成來源，例如花生 ί 油、礦物油、芝麻油及其類似物。食鹽水溶液 糖和二醇溶液亦可用作液體載劑，特別是用 溶液為較=載Ϊ醫藥組成物係以腔内給藥時，食鹽水 劑、Γΐ形1製備物適合用於口服給藥並包括散劑、錠 固體賦形劑:亦袋劑、栓劑和可分散顆粒。 y了為或多種亦可作為稀釋劑、調味劑、結 29 201238973 著劑、防腐劑、錠劑崩解劑或包膠物質之物質。 在散劑中，賦形劑較佳地為細粉狀固體，其係混合 在細粉狀活性成份之混合物中。在錠劑中，本發明之活 性成份係與具有所需結合性質之載劑，以適合的比例混 合並壓縮成所欲的形狀和大小。散劑和錠劑較佳地係含 有從5%至80%，更佳地從20%至70%的活性化合物。 適合的醫藥「賦形劑」包括澱粉、葡萄糖、乳糖、 蔗糖、明膠、果膠、糊精、麥芽、米、趣粉、白堊土、 矽膠、碳酸鎂、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、甘油單水合物、 滑石、氣化鈉、黃耆膠、甲基纖維素、羧曱基纖維素鈉、 脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、低熔點蠟、可可 脂及其類似物。 對於製備栓劑，係將低熔點蠟，例如脂肪酸甘油酯 之混合物或可可脂，先熔解並將活性組份，如以攪拌均 勻地分散在其中。然後將熔解均勻的混合物倒入方便大 小的模型中，使其冷卻，及據此固化。適合的醫藥載劑 之實例亦描述於’’Remington丨s Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martin 中。 術語「佐劑」係指在細胞或體液層級上增加、刺激、 活化、加強或調節對組成物之活性成份的免疫反應之試 劑，例如免疫學佐劑刺激免疫系統對實際抗原之反應， 但其本身不具有免疫學效用。此等佐劑之實例包括（但 不限於），無機佐劑（例如無機金屬鹽類如磷酸鋁或氫氧 化鋁）、有機佐劑（例如皂素或鮫鯊烯）、油基佐劑（例如 費氏(Freund’s)完全佐劑和費氏不完全佐劑）、細胞激素 201238973 (例如 IL-Ιβ、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和 INF-γ)、微粒佐劑(例如免疫_刺激複合物(ISC〇MS)、微 脂體或生物可降解微球體）、病毒小體、細菌性佐劑（例 如單碟酸化脂質A或胞壁醯肽）、合成佐劑（例如非離子 ，段共聚物、胞壁醯肽類似物或合成的脂質八)或合成的 多核苷酸佐劑(例如聚精胺酸或聚絲胺酸）。 如文中所用’「給藥」包括活體内給藥 ，以及活體 外直接投予組織，例如靜脈移植。在本發明内文中，口 服、局p部、皮膚滲透及/或腔内（例如靜脈内）給藥為較佳。 曰 冶療上有效量」為足以達成所欲目的之醫藥劑的 =。給予的治療劑之有效量將隨例如試劑性質、給藥路 控▲大小和接文治療劑之動物物種以及給藥目的等因素 又各個別案例中之有效量可由熟習技術者根據本項 技術已建立的方法依經驗決定。 本發明之實施例 ^在第^方^ ’本發0㈣提供用仙織狀態或疾病η 75 mir毛明者意外的發現mir-22之有或盔影塑已 知疾病指標(例如轉錄因子、胞外基質組份和蛋白酶曰 之㈣組織㈣或疾狀有、無或進展 旦瞻-22為組織狀態或疾病之指標。秦22 有…或里改變為組織狀態或疾病之 徵兆。在本發明内文中，改二，進展的 為組織比讀地其特徵 的參22量。疾广狀二It的㈣紐織具有不同 疾病狀態較佳地其特徵為··與正常器宫 31 201238973 或個體器官比較，或與較早時間點之相同的器官或個體 比較，其具有不同的mir-22量。 立 在第二方面，本發明係關於mir_22作為組織狀態 或疾病指標之用途。由於在疾病發生及/或進展期間 mir-22的表現量不同，mir_22係用作組織狀態或疾病之 指標。 在本發明第一及/或第 —r-vx "不，八一乃囬又乃外的貫施例中， r 22之里為(a)組織狀態或疾病及/或作)發生組織狀態 改變或疾病之風險及/或（c)個體具有組織狀態改變或疾 =及/或（d)個體中組織狀態或疾病之進展或階段之指 標。mir-22之量為mir-22之表現量或mir_22的存在量。 ^匕’ mir-22之表現量或mir_22的存在量為⑷組織狀 =、或疾病及/或(b)發生組織狀態改變或疾狀風險及/ 體具有組織狀態改變或疾病及/或(d)個體中組織 =或疾狀進展或祕之指標。在—更佳的實施例 m『22之量為個體中或個體樣本中她·22之量。 改變實施财，此22纽㈣顯示組織狀態 改=病，例如組織狀態或疾病加重或好轉。 織狀態或疾病好轉。 標，更佳地二生升 之風險指標。mir_22量改變，^植祕化或疾病 為個體具有組織狀態改變或疾=tr22量升高，亦 中秦22量改變，例如之^。再者，在個體 置升南或降低，係顯示 32 201238973 組織狀態或疾病之進展或階段。較佳地，mir_22旦古 為組織狀態或疾病加重之指標。 里升1¾ 符住地，imr-u之量為組織狀態或疾病之指 中該組織係由下列組成之群中選出：骨、軟骨、纟^ ^ 織、肌肉組織、神經組織和上皮組織。較二，：：： 狀態為組織退化，例如（但不限於)軟骨退化、骨艮〆° 滑膜退化、組織發炎例如軟骨發炎或滑膜發炎二 塑例如軟骨重塑、硬化、液體堆積或增生性組織例:為 傷癒合過程之增生、囊腫形成或癌症。特佳地，此組ς 狀態係關於組織退化或組織發炎，更佳地係關於軟艮 化、滑膜退化、軟骨發炎及/或滑膜發炎。 人月以 另外較佳的，mir-22之量為疾病之指標，其中該疾 病為關節疾病，例如（但不限於）關節炎，例如類風=性 關節炎(RA)、僵直性脊椎炎(AS)、幼年特發性關^炎 (JIA)、痛風、感染性關節炎、乾癬性關節炎和骨性關節 炎(OA)、癌症例如軟骨肉瘤、骨肉瘤、纖維肉瘤和多發 性骨趙瘤、肌腱炎、滑液囊炎、骨折和軟骨或骨絡傷害。 在特佳的貫把例中，此疾病為關節炎，更佳地骨性關節 炎0 在第三方面，本發明係提供於個體中鑑定(a)組織狀 悲之改變，或疾病存在及/或(b)發生組織狀態改變或疾 病之風險及/或（c)及/或監控組織狀態或疾病之進展或 階段之方法，其包括偵測樣本中mir_22之量。較佳地， 係於RNA或DNA層級上來偵測mir_22，更佳地經由已 知的方法例如（但不限於)能與mir-22 RNA或cDNA專 33 201238973 一性結合及/或雜交之抗體、引子或核酸探針。 直較佳地’ mir-22之量為個體中或個體樣本中恤_22 之:。車父窃佳地，imr-22之量為個體中或個體樣本中他_22 之表現量或mir-22的存在量。 ^卜較佳的，該個體為哺乳動物、爬赫或鳥類。 更佳地’該健係由下顺叙群巾選出：實驗^動物 (例如小鼠、大鼠或兔）、家養動物（包括例如天竺鼠、兔、 綿羊、山羊、豬、雞、鴨，、描、 狗、烏龜、陸龜、蛇或渐場）或靈長類 娜猩、大麵和人類。特佳地，該個體為人^ 组=樣3 一 Ϊ多種固體樣本，例如(但不限於) 組織t物、軟骨、骨、滑膜、軟骨膜、囊、皮膚和社 /月聚、液、料、麵和淋巴液。在—較佳 施例中，職本係由下顺成之群巾選出：財貫 囊、血液n血清、尿液和滑液。在特佳 、 中’該樣本為軟骨、滑膜、血漿、血清及/或滑液 跡22之量係經由任何已知方法，使用用於 酸例如能與所論及之miRNA結合的專一性核酸 之已知工具來彳貞測。適合的方法包括(但不限於）聚 連鎖反應(PCR)技術’例如反轉錄酶pCR或定^ σ往 PCR’雜交技術例如北方墨點、原位雜交或晶片^ ’、 免疫組織學或免疫化學或免疫細胞化學技術，例如太 墨點、免疫螢光或ELISA、質譜(MS)，例如Lc/m 高效液相層析(HPLC)，特別是以互補股標定後之離子交 201238973 換 HPLC。 偵測存在個體或個體樣本中之mir_2 限於)該等典加於上文所提及方法中之/具^= 括（但不限於）—或多套能專一性偵測mir-22 RNA或 cDNA(例如用於定量RT pCR)、一或多種在標準條件下 能專-性與mi卜22 RNA《cDNA雜交之核酸探針(例如 用於北方墨點或晶片雜交技術中），-或多種能專一性 偵測mir-22之抗體(例如用於免疫組織學或免疫組織化 學或免疫化學技術，例如偵測組織學組織切片中之 mir-22或固定在適合載體如膜、晶片、EusA板上之 mir-22) ° 社♦贫明另外較佳的實施例中，係將該個體中或個 體樣本中之ιηΰ：·22量與-❹個參照物及/或參照樣本 相比較。較佳地，此參照物係由下列組成之群中選出： 健康個體、罹病個體或與試驗個體相同之較早或較晚時 =的個體。另外或替代地，此參照物為無組織狀態改 j疾病存在、有組織狀態改變或疾病存在，或發生組 ，狀1改變或疾病之風險增加或降低之偷.22量的代 表值。 白盘樣本較佳地射Μ自健康個體、‘_個體或來 自”相關樣本相同之個體。t參照樣本係由與相關樣本 才目同之個體所採集合’該參照樣本較佳地係在比相關樣 或更晚時間點所採集。採集參照樣本和採集相關 樣本間之時間落差，較佳地係以年(例如卜2、3、4、5、 201238973 90、100 年）、月 1 12個 W、 、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12個月）、週（例如 如 1、2、3、4、5 ln ”、4、5、6、7、8週）、曰（例 5〇、6〇、7〇、8〇 9〇 2〇、25、30、35、40、45、 小時(卜 2、3 〇、100、2〇〇、30〇、400、500 日）、 分糊如卜；、;5/,6:7、8、9、10、1…2—)、 40、4S π 4、5、10、b、20、25、30、35、 :5 20: 2; 6〇 分鐘)，或秒，^ 或替代地，此Γ、35、40、45、50、60秒)表示。另外 或無组織崎本為帶有代表健康個體，或代表有 變二= = 或代表發生組織狀態改 9加或降低之mir-22量的參照樣本。 個㈣^例中’其中參照物或參照樣本射丨生自健康 .^ ^發生組織狀態改變或疾病之風險降低或帶 有代表無組織狀態改變或疾病存在之mir-22量的個 體士’相較_參照物，相隨本巾恤_22量升高係顯 示°亥個體中(a)有組織狀態惡化或疾病之存在及/或(b)發 生組織狀態惡化或疾病之驗増加及/或(e)組織狀態惡 化或疾病之進展。在實施例中，其中該參照物係衍生自 罹病的個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險增 加或代表有組織狀態改變或疾病存在之值的個體，類似 的mir-22量係顯示該個體中（a)有組織狀態惡化或疾病 之存在及/或(b)發生組織狀態惡化或疾病之風險增加及 /或(c)組織狀態惡化或疾病之進展。 在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍生自健康 個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險降低或帶 36 201238973 有代表無組織狀態改變或疾病存在之mir_22量的個 體’相較於該參照物，相關樣本中類似的mir_22量係 顯示該個體中（a)組織狀態改變或改善或無疾病存在及/ 戍生組織狀悲惡化或疾病之風險降低及/或（〇)組織 狀態惡化或疾病之進展減緩。 在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍生自健康 個體或▼有發生組織狀態改變或疾病之風險降低或帶 有代表無組織狀態改變或疾病存在之mir_22量的個 體’相較於該參照物’相關樣本中mir_22量降低係顯 示該個體中（a)組織狀態改變或改善或無疾病存在及/或 (b)發生組織狀態惡化或疾病之風險降低及/或(c)組織狀 態惡化或疾病之進展減緩。 在實施例中，其中該參照物或參照樣本係衍生自罹 病的個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險增加 或代表有組織狀態改變或疾病存在之值的個體，類似的 mir-22量係顯示該個體中（a)有組織狀態惡化或疾病之 存在及/或（b)發生組織狀態惡化或疾病之風險增加及/ 或(c)組織狀態惡化或疾病之進展。 在實施例中，其中該參照物或參照樣本係衍生自罹 病的個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險增加 或代表有組織狀態改變或疾病存在之值的個體，升高的 mir-22量係顯示該個體中（a)有組織狀態惡化或疾病之 存在及/或（b)發生組織狀態惡化或疾病之風險增加及/ 或(c)組織狀態惡化或疾病之進展。 在實施例中，其中該參照物或參照樣本係衍生自罹 37 201238973 病的個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險增加 或代表有組織狀態改變或疾病存在之值的個體，減低的 mir-22量係顯示該個體中（a)組織狀態改變或改善或無 疾病存在及/或(b)發生組織狀態惡化或疾病之風險降低 及/或(c)組織狀態惡化或疾病之進展減緩。 在實施例中，其中§玄參照物或參照樣本係衍生自與 相關個體相同之較早時間點的個體，相關樣本中升高的 mir-22-a量係顯不9亥個體中（a)有組織狀態惡化或疾病 之存在及/或(b)發生組織狀態惡化或疾病之風險增加及 /或(c)組織狀態惡化或疾病之進展。 在實施例中，其中該參照物或參照樣本係衍生自與 相關個體相同之較早時間點的個體，相關樣本中減低的 mir-22-a量係顯示該個體中（a)組織狀態改變或改善或 無疾病存在及/或(b)發生組織狀態惡化或疾病之風險降 低及/或(c)組織狀態惡化或疾病之進展減緩。 在實施例中，其中該參照物或參照樣本係衍生自與 相關個體相同之較早時間點的個體，相關樣本中類似的 mir-22-a量係顯示該個體中（a)發生組織狀態惡化或疾 病之類似風險及/或(b)組織狀態惡化或疾病之進展停滯 及/或(c)組織狀態惡化或疾病持續。 在第四方面’本發明係提供用於測定供個體中組織 狀態改變或預防或治療疾病之醫藥劑量之方法，其包括 下列步驟(a)測定個體樣本中mir-22之量，及視需要測定 參照物或參照樣本中mir-22之量，及(b)依照相關樣本中 mir-22之量’視需要依照相關樣本和參照物和參照樣本 38 201238973 中mir-22之量的_交，決定醫藥劑量。 在本电明内文中，mi卜22之量較佳地係於 RNA或 DNA層級上來偵測’更佳地經由已知的方法例如(但不 限於)能與rmm基因、基因產物及/或其魏活性變體 專-性結合及/或雜交之抗體、引子或核酸探針。 樣本可為液體或固體，較佳地液體樣本 例如(但不限於)血液、金清、血漿、滑液、尿液、= 和淋巴液’及固體樣本為組織樣本，例如(但不限 骨、骨、賴、軟骨膜、囊、皮膚和結軌織。參照樣 本較佳地物生自健康個體、罹病個體或來自與相關 本相同之個體。當參照樣本係由與相關樣本相同之個體 所採集合時’參照樣本健地係在比相祕本較早 晚時間點所採集。替代地或另外地，參照樣本為帶 表健康個體，或代表有或無組織狀態改變或疾病存在， 之 或代表發生組織狀態改變或疾病之風險增加或， mir-22量的參照樣本。 民 在較佳的實施例中，維持或改變，亦即増加或降 醫藥劑量之必要性係依樣本中mir_22的測定量來決 定’較佳地係與參照物或參照樣本相比較。 、 设想，在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍生 自健康個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險降 低或帶有代表無組織狀態改變或疾病存在之mir_22旦 的個體:且相較於該參照物或參照樣本，須仏到相關二 本中升高㈤論-22 f： ’則決定必須轉醫_量或辦 加有利於個體中組織狀態改變或預防或治療疾病之^ 39 201238973 藥劑量。 亦設想，在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍 生自健康個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風= 降低或帶有代表無組織狀態改變或疾病存在之m i 量的個體’且相較於該參照物或參照樣本，測定到相關 樣本中減低的mir-22量，則決定必須維持醫藥劑量< 降低有利於個體中組織狀態改變或預防或治療疾 醫藥劑量。 ’、、力 亦設想’在實施例中’其中參照物或參照樣本係衍 生自健康個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風^ 降低或帶有代表無組織狀態改變或疾病存在之 量的個體，且相較於該參照物或參照樣本，測定到相關 樣本中類似的mir_22量，則決定必須維持醫藥劑量或 降低有利於個體中組織狀態改變或預防或治療疾病之 醫藥劑量。 在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍生自羅病 =個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險增加^ =有代表有組織狀態改變或疾病存在之值的個體，且二 較於該參照物或參照樣本，測定到相關樣本中類似的 rmr-22量，則決定必須維持醫藥劑量或增加有利於個體 中組·織狀態改變或預防或治療疾病之醫藥劑量。 在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍生自罹病 =個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險增加或 ▼有代表有組織狀態改變或疾病存在之值的個體，且相 較於。亥參照物或參照樣本，測定到相關樣本中降低的 201238973 、必須_㈣猶或降鱗利於個體 =文.交或預防或治療疾病之醫藥劑量。 的個ΐΓ;::生其或參照樣本係衍生自罹病 帶有代表有^狀離之風險增加或 較於該參昭物或二/或疾病存在之值的個體，且相 略22量，則決/乂:百本，測定到相關樣本中升高的 中組織狀態改^預量或增加有利於個體 右眚*或治療疾病之醫藥劑量。 相關個體二：較2:亥參照物或參照樣本係衍生自與 或參照樣本Hu間點的個體’且相較於該參照物 決定必須維持醫升高的_22量，則 改變或騎或、、里或增加有利於個體中組織狀態 戎療疾病之醫藥劑量。 相關個體相同^上中轉照物或參照樣本係衍生自與 或參照樣本，^間點_體’且相較於該參照物 決定必須維持本中降低的秦22量，則 改變或預防5feV 、里或降低有利於個體中組織狀態 在實施療疾病1藥劑量。 相關個體相同^ 一中5亥參照物或參照樣本係衍生自與 或參照樣本，、^早時間點的個體，且相較於該參照物 決定^須維持樣本中類似的Mr·22量，則 織狀態改缴洗”片里或增加或降低有利於個體中組 在第五^預防或治療疾病之醫藥劑量。 變或預防或仏面，本發明係提供用於調整供組織狀態改 3 b療關節疾病之醫藥劑量之方法，其包括下 201238973 列步驟：（a)測定樣本中mir-22之量，及(b)測定一或多個 參照物或參照樣本中mir_22之量，（c)檢驗試驗樣本關於 存在該樣本中mir_22之量是否與一或多個參照樣本中 mir-22之量不同’（d)依照試驗樣本中mir-22之量是否與 一或多個參照物或參照樣本中mir-22之量不同，調整醫 藥劑量。 mir-22之量較佳地係於RNA或DNA層級上來偵 /貝j ’更佳地經由已知的工具例如（但不限於）能與mir-22 基因、基因產物及/或其功能活性變體專一性結合及/或 雜父之抗體、引子或核酸探針。樣本可為液體或固體， 較佳地液體樣本為體液樣本例如（但不限於）血液、血 /月、血漿、滑液、尿液、唾液和淋巴液，及固體樣本為 組織樣本，例如（但不限於)軟骨、骨、滑膜、軟骨膜、 囊、皮膚和結締組織。 在較佳的實施例中，係與一或多個參照物或參照樣 本相比較，依照樣本中mir_22的測定量來維持或改變， 亦即增加或降低醫藥劑量。 设想，在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍生 自健康個體或帶有發生組織狀態&變或疾病之風險降 低或帶有代表無組織狀態改變或疾病存在之mir_22量 之個體二且相較於該參照物或參照樣本，測定到相關樣 本中升问的mir-22量，則維持或增加有利於個體中组 織狀態改變或預防或治療疾病之醫藥劑量。 v 在實施例中’其中參照物或參照樣本係射自健康 個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險降低或帶 42 201238973 有代表無組織狀態改變或疾病存在之mir-22量之個 體，且相較於該參照物或參照樣本，測定到相關樣本中 ，低的mir-22量，則維持或降低有利於個體中組織狀 態改變或預防或治療疾病之醫藥劑量。 在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍生自健康 個體或可有發生组織狀態改變或疾病之風險降低戋帶 =代表無組織狀態改變或疾病存在之mir-22量之個 肢’且相較於該參照物或參照樣本，測定到相關樣本中 =的^mn-22 i ’則維持、降低或減少有利於個體中 、’且”’0狀f改變麵防或治療疾病之醫藥劑量。 的個其中參照物或參照樣本係衍生自罹病 組織狀態改變或疾病之風險增加或 較於該^照dt改變或疾病存在之值的個體，且相 *22^ Γ則维2持本，測定到相關樣本中類似的 預防或治療疾病之醫利於個體中組織狀態改變或 的二物或參照樣本係衍生自罹病 帶有代表；疾病之風險增加或 較於該參照物或參照樣^或疾；1 存在之值的個體，且相 mir-22量，則維持或降’測疋到相關樣本中降低的 預防或，疾病之㈣體中組織狀態改變或 的個樣柄衍生自羅病 帶有代表杨^ 43 201238973 較於該^照物或參照樣本，測定到相 mir-22量，則維持或掸Λ 7本中升尚的 或預㈣治療疾病狀態改變 在實施例中’其中該參照物 相關個體相同之較早時間點的個體，相較== 持或增加有利於個體的變：== 病之醫藥劑量。 文飞頂防或治療疾 在：,例中’其中該參照物或參照樣本係 間點的個體，相較於該參照物或 參”，、樣本則疋到相關樣本中降低的mir22旦 持或降低有利於個體中組織狀態改變或預防：二广 病之醫藥劑量。 貝丨方或治療疾 在實施例其中該參照物或 相同之較早時間點的個體，相較於二= 參…、樣本”則定到相關樣本中類似的mir_2 維 持、增加或降低有利於個體中組織狀態改 療疾病之醫藥劑量。 頂I万欢Λ3 在第六方面，本發明係提供測定物質 發生疾病之有利及/或有害效應之方法，其包 驟·⑷測定相關樣本中—η之量，及(b)測定—或多^ 照樣本中mir_22之量，及⑷檢測相關樣本關 於存f °亥相關樣本中mir-22之量是否與-或多個來昭 物或ς照樣本中mir_22之量不同，其中相關樣本暴^ 該物貝之方式係與—或多種參照樣本不同。'J' 44 201238973 較佳地，mir-22之量係在RNA或dna層級上偵測， 更佳地經由已知的工具例如（但不限於）能與mir_22基 因、^因產物及/或其功能活性變體專一性結合及/或雜 父之抗脰、引子或核酸探針。樣本可為液體或固體，較 佳地液體樣本為體液樣本例如（但不限於)血液、血清、 血聚、滑液、尿液、讀和淋⑽，及固體樣本為組織 樣本，例如(但不限於)軟骨、骨、滑膜、軟骨膜、囊、 皮膚和結締纟且織。 在較佳的實施例中，物質對組織狀態或疾病發生之 有利及/或有害效應係依照樣本中mir_22的測定量來決 定’ ^佳地，健—或多個參照物或參照樣本相比較〕 設想，在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍生 自健f個體或帶有發生組織狀態改變或㈣之風險降 低或V有代表無組織狀態改變或疾病存在之量 之個體且相杈於該參照物或參照樣本，測定到相關樣 ^升高的_22量’則蚊該物質對組織狀態或疾 病發生具有有害效應。 亦設想，在實關巾’其巾參照物或參職本係衍 生自健康個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險 =低或帶有代表無組織狀態改變或疾病存在之mir_22 量之個體’且相較於該參照物或參照樣本，測定到相關 樣本中降低的量，則蚊該物f對組織狀態或 疾病發生具有有利效應。 亦設想，在實施例中，其中參照物或參照樣本係衍 生自健康個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險 45 201238973 降低或帶有代表無組織狀態改變或疾病存在之m i r- 2 2 量之個體，且相較於該參照物或參照樣本，測定到相關 樣本中類似的mir-22量，則決定該物質對組織狀態或 疾病發生不具效應或僅具有非常有限的效應。 在實施例中’其中參照物或參照樣本係衍生自罹病 =個體或帶有發生組織狀態改變或疾病之風險增加或 可有代表有組織狀態改變或疾病存在之值的個體，且相 較於°亥參照物或參照樣本，測定到相關樣本中類似的 mir 22里，則決定該物質對組織狀態或疾病發生不具效 應或僅具有非常有限的效應。 〃 在實_巾，其中細物或參難本係衍生自羅: =體或帶有發生組織狀態改變或 …物或參照樣本，測定到相關樣本中降低έ 利效 蚊該物__狀態或錢發生具有习 的個體其中參照物或參照樣本係衍生自罹a 帶有代狀風險増加s 較;^$A 心蜓或疾病存在之值的個體，且^ 本，«本中升高Ϊ 害效應^ 物狀誠“發生具有; 相關個鸿Γ Τ琢參照物或參照樣本係衍生 參照樣ϊ目同ϊ i較早時間點的個體’相較於該參辟 ’、、’，測定到相關樣本中升高的mir_22量， 46 201238973 定該物質對組織狀態或疾病發生具有有害效應。 在實施例中，其中該參照物或參照樣本係衍生自與 相關個體相同之較早日夺間點的個豸，相較於該參照物或 參照樣本，測定到相關樣本中降低的mir_22量，則決 定該物質對組織狀態或疾病發生具有有利效應。 在實施例中，其中該參照物或參照樣本係衍生自與 相關個體相同之較早時間點的個體，相較於該參照物或 參照樣本’測疋到相關樣本中類似的mir-22量，則決定 該物質對組織狀態或疾病發生不具效應或僅具有非常 有限的效應。 在第七方面，本發明係提供mir-22於任一本發明前 述方面之方法中的用途。 因此，mir-22之用途係提供於測定個體中，如上所 詳述(a)組織狀態改變或疾病存在及/或(b)發生組織狀態 改.變或疾病之風險及/或（c)監測組織狀態改變或疾病之 進展和階段之方法中，其包括彳貞測mir-22之量。mir-22 之用途亦提供於供測定個體中組織狀態改變或預防或 治療疾病之醫藥劑量的方法中，其包括下列步驟(a)測定 個體樣本中mir-22之量，及視需要測定參照物或參照樣 本中mir-22之量，及(b)依照相關樣本中mir-22之量，視 需要依照相關樣本和參照物和參照樣本中mir-22之量 的比較，決定醫藥劑量。再者’ mir-22之用途係設想用 於調整供組織狀態改變或預防或治療關節疾病之醫藥 劑量的方法中，如上所詳述’其包括下列步驟：（a)測定 樣本中mir-22之量，及(b)測定一或多個參照物或參照樣 201238973 本中mir-22之罝’（c)檢驗試驗樣本關於存在該樣本中 mir-22之量是否與一或多個參照樣本中mir-22之量不 同’（d)依照試驗樣本中mir-22之量是否與一或多個參照 物或參照樣本中mir-22之量不同，調整醫藥劑量。又 mir-22之用途係提供於測定物質對組織狀態或疾病發 生之有利及/或有害效應之方法中，如上所詳述，其包 括下列步驟.（a)測定相關樣本中mir-22之量，及(b)測定 或夕個參照物或參照樣本中mir 22之量及(c)檢測相 關樣本關於存在該相關樣本中mir 22之量是否與一或 照物或參照樣本中_22之量不同，其中相關樣 ^暴^該物質之方式係與—或多種參照樣本不同。在 任一上述所指方法中之如卜2 因產物及/或其功能活性變二 固體之較㈣實施财，相關樣本為 體樣本為體液樣本。又體樣本為_樣本而液 之群中選出：於Α χ 、，組織樣本係由下列組成 締組織’而液體i本二;:骨囊、皮膚和結 血清、血漿、滑液、】、，且成之群中選出：血液、 施例中，樣本係由下=二唾液和淋巴液。在更佳的實 囊、血液、血毁、血且成之群中選出：軟骨、滑膜、 中，樣本騎骨、:、尿液和滑液。在特佳的實施例 外地，樣本為細胞许養血:月及’或滑》夜。替代地或另 列組成之群中選出養樣本，較佳地係由下 細胞、軟骨母細胞::滑膜、骨髓細胞、軟骨 軟月細胞、滑液細胞、骨細胞、 48 201238973 破骨細胞、成骨幹細胞、幹細胞及/或葉間幹細胞。 在第八方面，本發明係提供用於本發明任何方面之 、’且一其包括一或多種偵測mir_22之工具。在較佳的套 、、且之貫％例中，—或多種偵測mir 22之工具為測定 mir 22表現里之工具，更佳地，係在基因及/或RNA層級 上：特佳的，偵測_22之__或多種工具係由下列組成 ，群中f出：核酸，較佳地DNA或RNA、胜肽和蛋白。 較佳地單株或多株抗體。較佳地，偵測πιίι··22之工具為 與rmr-22及/或其前驅物之序列互補之天然生成的核酸 例如DNA或RNA或化學修飾核酸。 在更佳的套組之實施例中，進一步包括(a)—容器， 及/或(b)數據載器。特佳的，數據載器包括例如（但不限 於)下列貢訊：（1)有關測定關節疾病之發生風險及/或測 定關節疾病存在及/或監測關節疾病之進展的方法說 明’（ii)偵測，較佳地樣本中，更佳地來自個體樣本中 mir-22之工具及/或套組之使用說明，（出）品質資訊例如 有關用於偵測mir_22之工具及/或套組批號、製造或組裝 地或到期曰或保存期限之資訊，有關套組之正確保存或 操作之負A ’（iv)有關用於偵測mir-22之緩衝劑、稀釋 劑、試劑之組成物及/或偵測mir-22之工具的資訊，（v) 當進行上述方法測定及/或監測關節疾病進展時，所得 到的資料解釋之相關資訊，（vi)當應用不適合的方法及/ 或不適合的工具時，可能的誤解或錯誤結果之相關警 告’及/或(vii)當使用不適合的試劑及/或緩衝劑時，可 能的誤解或錯誤結果之相關警告。 49 201238973 在第九方面，本發明係提供第八方面之套組於本發 明任何方法中之用途。 因此，該套組之用途係提供於測定個體中，如上所 詳述(a)組織狀態改變或疾病存在及/或(b)發生組織狀態 改變或疾病之風險及/或（c)監測組織狀態改變或疾病之 進展或階段之方法中，其包括偵測mir-22之量。該套 組之用途亦提供於測定用於個體中組織狀態改變或預 防或治療疾病之醫藥劑量的方法中，如上所詳述，其包 括下列步驟：（a)測定個體樣本中mir-22之量，及視需 要測定參照物或參照樣本中mir_22之量，用於與相關 樣本中的mir-22量作比較，及(b)依照相關樣本中mir 22 之量’視需要依照相關樣本和參照物和參照樣本中 mir-22之量的比較，決定醫藥劑量。再者，該套組之用 途係設想用於調整供組織狀態改變或預防或治療關節 疾病之醫藥劑量之方法中，如上所詳述，其包括下列步 驟：(a)測定樣本中mir-22之量，（b)測定一或多個參照 物或參照樣本中mir-22之量，（c)檢測試驗樣本關於存 在該樣本中mir_22之量是否與一或多個參照樣本中 mir-22之量不同，及(d)依照相關樣本中mir_22之量是 否與一或多個參照物或參照樣本中mir_22之量不同， 凋整醫藥劑量。該套組之用途亦提供於測定物質對組織 狀態或疾病發生之有利及/或有害效應之方法中，如上 所f述，其包括下列步驟：（幻測定相關樣本中mir_22 之量’及(b)測定一或多個參照物或參照樣本中mir_22 之量’及(c)檢驗相關樣本關於存在該相關樣本中mir_22 201238973 之量是否與一或多個參照物或參照樣本中mir_22之量 不同，其中该相關樣本暴露於該物質之方式係與一或多 種參照樣本不同。 在第十方面，本發明，如上所詳述，係於本發明任 何方面之方法中，提供一或多種供偵測mir-22基因、基 因產物或其功能活性變體之核酸。在較佳的實施例中， 該核酸為天然生成的核酸例如D N A或RN A或經化學修 飾。較佳地，該核酸係由下列組成之群中選出：核酸探 針、聚酿胺或胜肽核酸(pna)、微RNA(miRNA)、小干 擾RNA(siRNA)、鎖核酸(LNA)、聚合酶連鎖反應(PCR) 之引子、反轉錄(RT)反應之引子及DNA定序之引子。特 佳的’此核酸具有對mir-22強烈的結合性。因此，約8 個核苷酸之示例性LNA適合用於偵測mir-22，只要此序 列在整體微RNA序列中為獨一無二的。 在第十一方面，本發明，如上所詳述，係於本發明 任何方面之方法中，提供用於偵測mir-22基因、基因產 物、其功能活性變體及/或微RNA上標記之胜肽、多肽 或蛋白。在較佳的實施例中’該胜肽、多肽或蛋白為蛋 白配體，較佳地抗體、斷片或其衍生物、朵平(darpin) 或抗運載蛋白（anticalin)，或該多肽或胜肽為探針，較 佳地質譜探針。 在較佳的實施例中，蛋白配體為經重組製備的抗 體及，若適當，經修飾’例如鼓合抗體、人源化抗體、 多功能抗體、雙專一性或寡專一性抗體、單股抗體及 F(ab)或 F(ab)2 斷片（參見，例如 EP-B1-0 368 684、 51 201238973 US 4,816,567 、 US 4,816,397 、 WO 88/01649 、 WO 93/06213或WO 98/24884)。另外地或替代地，對於 抗mir-22之經典抗體蛋白骨架係用作蛋白配體，例如 以脂約蛋白（lipocalin)為主的抗運載蛋白（Beste等人 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903)。脂i弓 蛋白之天然的配體結合位，例如視黃醇結合蛋白或後膽 色素結合蛋白，可被改變，例如以「組合蛋白設計」法， 在此法中，其係與所選的不完全抗原結合，本文係與 mir-22 結合（Skerra，2000, Biochim. Biophys. Acta，1982, 337-50)。其他已知的蛋白骨架可作為分子測定之抗體的 替代物（Skerra (2000) J. Mol· Recognit.，13, 167-187)。 在第十二方面，本發明係提供本發明第十方面之核 酸，及/或本發明第十一方面之胜肽、多肽或蛋白於本 發明任何方面之方法中的用途。在較佳的實施例中，該 核酸係以裸型、轉基因載體或與微脂體或黃金粒子複合 之形式來使用。轉基因載體之實例有病毒載體，例如腺 病毒載體或反轉錄病毒載體（Lindemann等人（1997)， Mol. Med.，3, 466-76; Springer等人（1988) Mol. Cell.，2, 549-58)。帶有微脂體之複合物通常係達到非常高效的轉 染，特別是皮膚細胞(Alexander and Akhurst，1995, Hum. Mol. Genet. 4:146-a79-85)。在脂質轉染中，由陽離子脂 質組成的單層脂質體係藉由將微質體懸浮液以超音波 處理來製備。DNA係以保持總電荷正電之比例及所有的 質體DNA係被微脂體複合之方式離子性結合在微脂體 的表面。除了 Feigner，p. L.等人（1987)，Proc. Natl. Acad. 52 201238973

Sci USA，84, 7413 - 7414所用的DOTMA(l,2-二油基氧 基丙基-3-三曱基溴化銨)和DOPE(二油基磷脂醯基乙醇 胺）脂質混合物外，目前已有合成許多的脂質調配物並 就其在轉染各種細胞株之效能上進行試驗（B ehr等人 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986 ； Zhao and Huang (1991), Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203 ; Feigner 等人（1994) J. Biol. Chem·，269, 2550-2561)。脂質調配物之實例有DOTAP N-[l-(2,3-二 油基氧基）丙基]-N，N，N-三甲基甲基硫酸銨或DOGS (二-十八基酿胺基甘醯基精胺）。增加核酸轉染至細胞的辅 助物質可為’例如與DNA結合之蛋白或胜肽，或能使核 酸被轉運到細胞的細胞核中之合成的胜肽-DNA分子 (Schwartz等人（1999) Gene Therapy 6:282 ; Brand6n等 人（1999) Nature Biotech.，17, 784)。辅助物質亦包括能 讓核酸釋放至細胞的細胞質之分子(Planck等人（1994) J. Biol. Chem” 269，12918 ; Kichler 等人（1997) Bioconj. Chem，8，213) ’ 或例如微脂體（uhlmann和 Peyman (1990)，上文）。另外，特別適合的形式可藉由 將上述的核酸塗覆在黃金粒子上並將這些粒子使用所 謂的基因搶射入組織或細胞中（Wang等人（1999) J.

Invest. Dermatol. 112:775-81, Tuting 等人（1998) J. Invest. Dermatol. 111:183-8)。 在第十二方面’本發明係提供mir-22或mir-22基因 或其功能活性變體作為目標分子供找出mir-22拮抗劑 或其模擬物之用途。在較佳的實施例中，係讓mir-22或 53 201238973 接觸土:目丨ί :功能活性變體與試驗化合直接或間接 或偵測試驗化合物細-22或秦22基因 ρρ二二也試驗化合物為化學分*，例如（但不 二接& 7。:有機化合物、脂質、碳水化合物、胜肽， :25個二SI有上勺1〇至約8〇個胺基酸’特別是帶有10 接辦^ 土欠及寡核苷酸，較佳地帶有約10至約90個核 特^帶有15至纖核苷酸。特佳的為小化學分 約15^^·實驗室合成或天'然的’具有約細克’莫耳至 祛八早曰莫耳，特別是400克/莫耳至1000克/莫耳之較 佳刀子1之非聚合性有機化合物。 較佳地，試驗化合物改變了 mir—22之量，例如增加 或降低表現量或此22的存在1^在本發明内文中 低mir-22量之試驗化合物為特佳的。 在本發明第十四方面，係提供篩選mir_22拮抗劑 模擬物之方法，其包括下列步驟：⑷提供mir22 ，22基因，（b)提供試驗化合物，及(c)測量或彳貞測 试驗化合物對mir-22或mir-22基因之影響。 在本發明第十五方面，係提供用於組織狀態改變或 預防或治療關節疾病之mir-22拮抗劑或其模擬物。 在本發明内文中，mir_22拮抗劑或其模擬物可為任 何，低或抑制mir-22功能或減低mir-22表現程度或存 在里=分子或組成物。實例包括（但不限於）：1.核酸， 例如募核苷酸、寡核糖核苷酸，特別是本項技術中已知 的 dsRNA、ssRNA、siRNA、miRNA、shRNA 等，2. 抬抗胜狀或蛋白，例如失穩或抑制所指之miRNA功能 54 201238973 的蛋白、拮抗性抗體或其斷片或所指之miRNA的轉錄 拮抗劑，及/或3.帶有拮抗作用之小分子化合物。替代 地或另外地，本發明之拮抗劑可為粗製的或純的天然產 物萃取物之形式。萃取物可根據標準製程來製造，例如 水及/或醇及/或有機溶劑萃取，及/或管柱層析及/或由動 物、植物或微生物來源如蛇毒、葉子或微生物發酵液沉 澱。 本發明之另一方面為此拮抗劑或其模擬物用於治 療關節疾病’特別是退化性關節炎例如骨性關節炎之用 途。較佳的，mir-22拮抗劑或其模擬物係用於治療疼 痛’特別疋降低退化性關節疾病之關節疼痛。此外， mir-22拮抗劑係用於製造醫藥品供治療關節疾病及/或 供治療如上所示之關節疼痛。 在本發明第十六方面’係提供用於本發明或治療關 節疼痛之包括mir-22拮抗劑或其模擬物的醫藥。在較佳 的實施例中，此醫藥進一步包括醫藥上可接受載劑^及/ 或賦形劑和視需要一或多種另外的活性物質。另外的活 性物質可有效對抗相同疾病或對抗不同疾病或病症或 症狀。因此，另外的活性物質包括該等對治療關節疾病 及/或治療如上所示之關節疼痛具有有利效用之物質。 再者，亦包括適合與本發明活性成份組合、針對治療不 同疾病或病症或症狀之另外的活性物質。亦涵蓋影塑另 外的miRNA及/或其基因產物，例如個別的miRN^^激 動劑或拮抗劑之例示性另外的活性物質。另外的活性物 質亦包括被認為有利於個人飲食及/或治療關節疾病及/ 55 201238973 或治療如上所示之關節疼痛及/或任何及他疾病、病症 或症狀之食品增補劑，例如（但不限於)維生素、礦物質、 纖維、脂肪酸或胺基酸。 就醫藥之製造，本發明之mir-22拮抗劑或其模擬 物，依照給藥的種類，通常係與一或多種醫藥上可接受 添加劑或佐劑物質，例如生理緩衝溶液，例如氣化納、= 液、去離子水，安定劑例如蛋白酶或核酸酶拮抗劑，= 佳地抑肽酶（aprotinin)、ε-胺基己酸亦 = . 4仰肽素 (pepstatin)A或螯合劑例如EDTA ’凝膠調配物例如白凡 士林、低黏度石蠟及/或黃臘等一起調配。另外適人的 添加劑有’例如洗務劑例如Triton mir-22-1 〇〇戍去氧脾 酸鈉，以及多醇類，例如聚乙二醇或甘油，糖例如嚴^ 或葡萄糖’二性離子化合物例如胺基酸如甘胺酸或^牙 是牛胺酸或甜菜驗，及/或蛋白，例如牛或人血清蛋白 洗滌劑、多醇及/或二性離子化合物為較佳的。 ° 生理緩衝溶液較佳地具有約6.0-8.0之ρίΙ,特別曰 大約7.4之pH及/或大約200-400毫滲克分子/公升，= 佳地大約290-310毫滲克分子/公升之滲透壓。醫藥。= pH —般係使用適合的有機或無機緩衝劑，例如佳 地使用磷酸緩衝劑、tris緩衝劑（叁（羥基甲基）胺基 燒)、HEPES緩衝劑（[4-(2-羥乙基)哌畊]乙磺酸）或 緩衝劑(3-嗎啉-1-丙磺酸)來調整。個別的緩衝劑之選擇 一般係依照所欲的緩衝劑莫耳濃度而定。磷酸緩衝=係 適合’例如用於注射和輸注溶液。 就醫藥之製造’本發明之mir-22拮抗劑或其模擬 56 201238973 物，亦可與奈粒子、微脂體或其他脂質複合物一起調 配，或可接合一蛋白、胜肽、核酸(例如適體（aptamer)) 或凝膠，例如以玻尿酸為基底，或類似的緩釋調配物。 醫藥較佳地為單位劑型。在此形式中，製備物可細 分成含適當量活性組份之單位劑量。單位劑型可為包裝 製備物，此包裝含有離散量之製備物，例如包裝錠劑、 膠囊及小瓶或安瓶散劑。又，單位劑型本身可為膠囊、 注射安瓶、錠劑、袋劑或口含錠，或其可為適當數目之 任何此等包裝形式。 第十七方面，本發明係提供用於改變組織狀態或預 防或治療關節疾病之方法，其中係將治療上有效量之第 十六方面的醫藥投予處於發生或罹患關節疾病風險之 個體。在較佳的實施例中，此醫藥係以口服、局部、經 皮滲透或腔内給藥。腔内給藥包括（但不限於)靜脈内和 關節内給藥。 醫藥可以習用的方式，例如藉由口服劑型、例如錠 劑或膠囊，藉由黏膜，例如鼻子或口腔，以植入皮膚下 之儲藏物形式，藉由注射、輸注或含有本發明醫藥品之 凝膠來給藥。另外可能的係局部給予醫藥品，用以治療 如上所述之特定關節炎，若適當，以微脂體複合物之形 式。再者，治療可藉由經皮治療系統(TTS)來進行，該 系統能以時間控制醫藥品之釋放。TTS可從例如，ΕΡ0 944 398 A卜 EP 0 916 336 A卜 EP 0 889 723 A1 或EP 0 852 493 A1得知。若僅相當小量的溶液或懸浮液，例如 約1至約20毫升，投予身體，則一般係使用注射溶液。 57 201238973

’ή經由所謂的繞道來進行。 相η發二月任何方面之較佳的實施例中，組織狀態為 况、"貝％較佳地係由下列組成之群中選出：骨、軟骨、 二，軟骨膜、囊和結締組織之傷害，及/或其特徵為 二、’且織巾之調控分子、訊號傳遞分子及/或退化分子 的量改變》 ，本發明任何方面之另外較佳的實施例中 ’此疾病 二I# i卩疾病，較佳地係由下列組成之群中選出：骨性關 1 X '類風濕性關節炎、乾癬性關節炎、感染性關節炎、 僵直性，椎炎、滑囊炎(發炎）、皮肌炎、纖維肌痛、痛 $性關節炎、幼年特發性關節炎（史迪爾氏症）、混合的 結締組織疾病、風濕性多發性肌痛症、多發性肌炎、反 應性關節炎（萊特氏症候群）、硬皮病、肩肌腱炎、薛格 連氏症候群、全身性紅斑性狼瘡，及/或特徵為由關節 發炎或關節退化所致之關節物理性或代謝性損傷，更佳 58 201238973 地，其中該疾病為骨性關節炎。 另外，本發明之非限定方面和實施例係如下所述 診斷方法包括測量病患樣本中一或多種miRNA之 量和使用試驗、结果來診斷及/或預測對病患之最適治療 療法。本發明所述之組成物包括用作miRNA拮抗劑之 mir_22拮抗劑，其可導入病患中用以治療和降低一或多 種與關節疾病，特別是與骨性關節炎有關的症狀。 诊斷方法包括測1病患樣本中一或多種miRNA之 量和使用試驗結果來診斷及/或預測對治療病患之最適 治療療法。本發明所述之組成物包括用作 miRNAs/miRNA激動劑/拮抗劑之mir_22激動劑/mir_22 拮抗劑，其可導入病患中用以治療和降低一或多種與發 炎疾病，特別是與骨性關節炎有關的症狀。 在本發明一或多方面之内容中（例如使用miRNA# 為生物標記），偵測m i RN A可藉由任何已知的方法使用 =知用則貞測核gt，例如能與所指之麻祖結合的特 定核酸之工具來進行。本發明一方面係關於用於生物樣 本中僧柄之量，供製造帛於!靖碳水化合 物或脂質代謝魏障礙U具的料。

偵測存在生物樣本中所指m丨RN A 定狀可為任何镇測所指miRNA之工具。其 如套月b專一性債測所指miRNA或cDNA之弓丨子:你 如用於定量RT ΡΓ1? p ^ 下能與所指二Α另：的工具例如可為在標糊 酸探針，例如=、:ΓΑ或―Α專一性雜交之相 :北方墨點或晶片雜交技術。另外的工 59 201238973

本發明係關於測定關節疾病例如 听採集的樣本 OA或個體中發生關節疾病

照樣本不同。存有升高的量顯示該個體罹患《生關銘

1疾病’例如OA的風險增加之方 听採集的樣本，有關mir-22之 mir-22活性是否與一或多個參 Γ御料⑽萃取物、滑液、血清或血幻，特別是來 曰受4個體’與來自H组不具有該關節疾病，特別 疋ΟΑ之比較樣本中的miRNA量相比較時，已知的組 織或組織祕本巾miRNA之量，在特定條件下，具有 可偵測量。例如，miRNA其在患有〇A個體之滑膜中 比有。A個體之滑膜中可_到較高量者，係具有 升高量。就mir-22,病患中具升高量係顯示〇A存在或 發生OA之易罹患性增加或可能性增加。 在某些案例中，將miRNA標記之量與對照組比 較，用以測定此量是降低或增加。對照組可為外部對照 組，例如來自已知無關節疾病，特別是〇A之病患樣本 中的miRNA。在其他的情況下，此外部對照組可為來 自^知不具有可偵測量（或通常等量，不論個體之疾病 狀態）所指miRNA之組織/組織液樣本的miRNA或已知 201238973 量的合成RNA。内部對照組可為來自受試組織/組織液 樣本之miRNA。miRNA對照組之特性可與所測量之來 自病患血清或血漿miRNA之特性相同或不同。 在本發明内文中，miRNA之拮抗劑可為任何降低 或抑制所指miRNA之功能或量的分子或組成物。實例 包括（但不限於）： 1. 核酸，例如，如本項技術中所知，寡核苷酸、寡 核糖核苷酸，特別是本項技術中已知的dsRNA、

ssRNA、siRNA、miRNA、shRNA、ssDNA、ssDNA/RNA 雜交物或化學修飾核酸等。 2. 拮抗胜肽或蛋白’例如失穩或抑制所指之 功月b的蛋白、拮抗性抗體或其斷片或所指miRNA的 錄枯抗劑， 3. 帶有拮抗作用之小分子化合物， 4. 包括一或多種1-4和可能的賦形劑之組成物。 因此，本發明之一主題為拮抗劑用於治療關節疾 病，特別是退化性關節疾病，例如骨性關節炎之用途: nnRNA拮抗劑亦可用於治療關節疾疼痛，特別是減低 退化性關節赫之關節疼痛。此外，miRNA拮抗劑可 5 St::、π療關-疾病及/或供治療如上所述之關節 疾病的醫樂品。 化合:ίΓ:術語「化學分子」涵蓋非聚合性《 ini a s曰/〜妷水化合物、胜肽，較佳地胜肽帶有約 及篡枝二，基酸’特別是帶有1GJL 25個胺基酸， 人-文，父佳地帶有約10至約9〇個核苷酸，特別 61 201238973 是2有15至25個核苷酸。特佳的為小化學分子，特別 是實驗室合成或天然的，具有約200克/莫耳至約15〇〇 克f耳，特別是400克/莫耳至1〇〇〇克/莫耳之較佳分 子量的非聚合性有機化合物。 刀 替代地，本發明之拮抗劑可為粗製的或純的天然產 物萃取物之形式。萃取物可根據標準製程來製造，^如 水及/或醇及/或有機溶劑萃取，及/或管柱層析及/或由動 物、植物或微生物來源如蛇毒、葉子或微生物發酵液沉 澱。 ’ 術語「結合蛋白」或「結合胜肽」係指結合和抑制 mir-22之蛋白或胜肽種類，其包括（但不限於）多株或單 株抗體、抗體斷片和抗mir-22之蛋白骨架，例如抗 mir-22之抗運載蛋白。 製備抗體或抗體斷片之製程係依照熟習技術者熟 知之方法來進行，例如以mir-22使哺乳動物，例如兔 子產生免疫’若適當’例如在費氏(Freund’s)佐劑及/或 乳氧化銘凝膠之存在下（參見，例如Diamond，Β·Α·等人 (1981) The New England Journal of Medicine · 1344-1349)。在動物中因免疫反應所形成的多株抗體隨 後可使用熟知之方法，及例如藉由管柱層析純化從血液 中分離出。單株抗體可，例如依照已知的Winter &

Milstein 之方法來製備(winter，G. & Milstein，C. (1991) Nature, 349, 293-299) ° 根據本發明，術語抗體或抗體斷片，亦請了解，係 指抗體或其抗原結合部分，其係經重組製備，且若適 62 201238973 當，經修飾，例如嵌合抗體、人源化抗體、多功能抗 體、雙專一性或寡專一性抗體、單股抗體及F(ab)或 F(ab)2 斷片（參見，例如 EP-B1-0 368 684、 US 4,816,567 、 US 4,816,397 、 WO 88/01649 、 WO 93/06213 或 WO 98/24884)。 亦可使用抗mir-22之蛋白骨架作為經典抗體之替 代物，例如以脂約蛋白（lipocalin)為主的抗運載蛋白 (Beste 等人（1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 1898-1903)。脂鈣蛋白之天然的配體結合位，例如視黃 醇結合蛋白或後膽色素結合蛋白，可被改變，例如以 「組合蛋白設計」法，以此法其係與選擇的不完全抗原 結合，本文係與 mir-22 結合（Skerra，2000，Biochim. Biophys. Acta, 1982，337-50)。其他已知的蛋白骨架已 知可作為分子測定之抗體的替代物（Skerra (2000) J. Mol. Recognit.，13, 167-187)。 術語「抗mir-22基因或mir-22本身之核酸」係指 雙股或單股DNA或RNA，其例如，抑制或活化mir-22 基因之表現或mir-22之活性，並包括（不限於)反義核 酸、適體、siRNA (小干擾 RNA)、miRNA、shRNA(短 的髮夾RNA)和核糖酶。 核酸可，例如以化學合成，例如依照磷酸三酯法（參 見，例如 Uhlmann，E. & Peyman，A. (1990) Chemical Reviews，90, 543-584)。適體為以高親和力與多肽結合 之核酸，本文為mir-22。適體可藉由選擇法例如來自大 的不同單股RNA分子池之SELEmir-22來分離（參見， 63 201238973 例如 Jayasena (1999) Clin. Chem·，45，1628-50 ; Klug and Famulok (1994) M. Mol. Biol. Rep., 20, 97-107 ； US 5,582,981)。適體液可以其鏡像形式合成和選擇，例 如 L-核糖核苷酸(Nolte 等人（1996)Nat. Biotechnol.，14, 1116-9 ; Klussmann 等人（1996) Nat. Biotechnol.，14, 1112-5)。以此法分離出的形式享有不被天然核糖核酸酶 降解之好處，而因此具有更佳的安定性。 核酸可被核酸内切酶或核酸外切酶降解，特別是被 細胞中可發現的DNA酶和RNA酶降解。因此，有利的 係修飾核酸以使其安定，對抗降解，藉此確保長期維持 細胞中高的核酸濃度(Beigelman等人（1995) Nucleic Acids Res. 23:3989-94 ; WO 95/11910 ； WO 98/37240 ’ WO 97/29116)。典型地，此安定化作 用可藉由導入一或多個核苷酸間磷基團或藉由導入一 或多個非磷的核苷酸間基。 適合的經修飾核苷酸間基係匯編於Uhlmann和 Peyman (1990)，上文（亦參見 Beigdman 等人（1995)

Nucleic Acids Res. 23:3989-94 ； WO 95/11910 ； WO 98/37240 ; WO 97/29116”可用於本發明用途之 一的磷酸中經修飾核苷酸間磷酸基及/或非磷橋包括例 如膦酸曱酯、硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、二硫代磷酸 醋及/或填酸醋，而非碌的核苦酸間基類似物包括，例 如石夕氧院橋；碳酸橋；羧酸曱酯、胺基乙酯橋及/或硫 謎橋。亦所欲的’此修飾應改善可用於本發明用途之 一的醫藥組成物之效期。 64 201238973 適合的反義核酸係另外描述於，例如Zheng和 Kemeny (1995) Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2 ； Nellen 和 Lichtenstein (1993) Trends Biochem. Sci·，18, 419-23, Stein (1992) Leukemia，6, 697-74 或 Yacyshyn, B. R.等人 (1998) Gastroenterology，114, 1142)中。 於下調或關閉基因表現（本文為mir-22基因表現） 過程中作為RNA干擾工具之siRNA的製造和用途，係 例如描述於 Elbashir，S. M.等人（2001) Genes Dev., 15, 188或Elbashir，S.M.等人（2001)Nature，411，494 中。 核糖酶亦為抑制核酸轉譯之適合的工具，本處為 RAK基因，因為其能專一性結合及切斷mRNA。其， 例如係描述於 Amarzguioui 等人（1998) Cell. Mol. Life Sci·, 54, 1175-202 ; Vaish 等人（1998) Nucleic Acids Res.， 26, 5237-42 ； Persidis (1467) Nat. Biotechnol., 15, 921-2 或 Couture and Stinchcomb (1996) Trends Genet·，12, 510-5 中。 所述的核酸較佳地係須用作或作為mir-22之拮抗 劑。 就醫藥之製造’本發明之mir-22拮抗劑’依照給 藥的種類，通常係與一或多種醫藥上可接受添加劑或 佐劑物質，例如生理緩衝溶液，例如氣化鈉溶液、去 離子水，安定劑例如蛋白酶或核酸酶拮抗劑，較佳地抑 肽酶(aprotinin)、ε-胺基己酸或抑肽素(pepstatin)A或螯 合劑例如EDTA，凝膠調配物例如白凡士林、低黏度石 堪及/或黃臘等一起調配。 65 201238973 mir 22 lL%口二添广劑有例如洗條劑例如Trit〇n 或甘、、由，，以及多醇類，例如聚乙二醇 或甘油糖例如择糖或葡兹 清蛋白。洗膝劑一二性離子化 生理緩衝溶液較佳地具有大約6.G-8.0之PH，特別 疋大約6.8-7.8之pH，特別是大約7 *之pH，及/或大 約2〇0_4〇0毫參克分子/公升，較佳地大約携··毫參 克分子/公升之渗透壓。醫藥品之PH -般係使用適合的 有機或無機緩衝劑，例如，較佳地使_酸緩衝劑、⑽ 緩衝劑（叁（羥基曱基）胺基甲烷）、HEpES緩衝劑 (0(2-羥乙基）哌η井]乙磺酸）或M〇ps缓衝劑（3嗎啉 -1-丙磺酸）來調整》個別的緩衝劑之選擇一般係依照所 欲的緩衝劑莫耳濃度而定。.磷酸緩衝劑係適合，例如用 於注射和輸注溶液。 醫藥可以習用的方式，例如藉由口服劑型、例如 銳劑或膠囊’藉由黏膜’例如鼻子或口腔，以植入皮 膚下之儲藏物形式’藉由注射、輸注或含有本發明醫 藥品之凝膠來給藥。另外可能的係局部給予醫藥品，’ 以治療如上所述之特定關節炎，若適當，以微脂體複 合物之形式。再者，治療可藉由經皮治療系統(TTS)來 進行，該系統能以時間控制醫藥品之釋放。TTS可從 例如，EP 0 944 398 Al、EP 0 916 336 A1、 EP 0 889 723 A1 或 EP 0 852 493 A1 得知0 66 201238973 古斗若小量的溶液或懸浮液，例如約1至約20 旦的身η ’則—般係使用注射溶液。若投予較大 液’例如約—或多公升，則—般係使用 二ΐ二？二相對於輸注溶液，就注射溶液的情況， 毛.，'主射中，ΡΗ和血液或組織液之滲透 =Γ、ϊ異對其本身並不明顯或本身僅注意到不明顯 ς之％痛感覺。因此般並不需要在使用前稀釋本 發明之調配物。然而，在相當大量給藥的情況下，本發 ^之調配物應在給藥前簡單稀釋到至少大約得到等張 溶液之程度。等張溶液之實例為G9%^度的氯化納溶 液。在輸注的情況下，可進行稀釋，例如使用無菌水， 而給藥可經由所謂的繞道來進行。 上述核酸可以裸型、轉基因載體或與脂質（特別是 陽離子脂質）或黃金粒子複合之形式來使用。其可調配 為微脂體（其中核酸係如貨物被攜帶在膜脂質層例如脂 雙層内），或可以奈粒子’例如葡聚糖、胜肽或其他聚 合物為基底。 轉基因載體之實例有病毒載體，例如腺病毒載體 或反轉錄病毒載體(Lindemann等人（1997)，Mol. Med.， 3，466-76 ; Springer 等人（1988) Mol. Cell.，2, 549-58)。帶有微脂體之複合物通常達到非常高的轉染 效能，特別是皮膚細胞(Alexander and Akhurst，1995,

Hum· Mol· Genet· 4:146-a79-85)。在脂質轉染中，由陽 離子脂質組成的單層脂質體係藉由將微質體懸浮液以 超音波處理來製備。DNA係以保持總電荷正電之比例 67 201238973 及所有的質體DNA係被微脂體複合之方式離子性結合 在微脂體的表面。除了 Feigner, P.L.等人（1987)，Proc. Natl. Acad· Sci USA，84，7413 - 7414 所用的 DOTMA(l，2-二油基氧基丙基-3-三曱基溴化銨）和 DOPE(二油基磷脂醯基乙醇胺）脂質混合物外，目前已 有合成大量的脂質調配物並就其在轉染各種細胞株之 效能上進行試驗(Behr 等人（1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86，6982-6986 ; Zhao *Huang(1991),Biochim· Biophys. Acta, 1189，195-203 ; Feigner 等人（1994)】· Biol. Chem.，269，2550-2561)。脂質調配物之實例有 DOTAP N-[l-(2,3-二油基氧基）丙基]-N，N，N-三曱基曱 基硫酸敍或DOGS(二-十八基酿胺基甘酿基精胺）。 增加核酸轉染至細胞的輔助物質可為，例如與 DNA結合之蛋白或胜肽，或能使核酸被轉運到細胞的 細胞核中之合成的胜肽-DNA分子（Schwartz等人（1999) Gene Therapy 6:282 ； Brand0n 等人（1999) Nature Biotech·，17, 784)。輔助物質亦包括能讓核酸釋放至細 胞質之分子（Planck 等人（1994) J. Biol. Chem., 269, 12918 ; Kichler 等人（1997) Bioconj. Chem，8，213)， 或例如微脂體(Uhlmann和Peyman (1990)，上文）。 另外，特別適合的形式可藉由將上述的核酸塗覆 在黃金粒子上並將這些粒子使用所謂的基因搶射入組 織或細胞中（Wang 等人（1999) J· Invest. Dermatol. 112:775-81，Tuting 等人（1998) J. Invest. Dermatol. 111:183-8)。 68 201238973 本發明另一主題為mir-22或mir-22基因作為找出 mir-22拮抗劑之標的，用於治療關節疾病，特別是退化 性關節疾病，例如骨性關節炎，或關節疾病，例如類風 濕性關節炎，及/或用於治療關節疾疼痛，特別是減低 退化性關節疾病之關節疼痛的用途。較佳地，該mir-22 拮抗劑可以如上述之醫藥品形式來使用。 因此，本發明亦指篩選mir-22拮抗劑之方法，其 中該方法包括下列步驟： (a) 提供 mir-22 或 mir-22 基因， (b) 提供試驗化合物，及 (c) 測量或偵測試驗化合物對mir-22或mir-22基因 之影響。 一般而言，mir-22或mir-22基因係提供於分析系統 中並使其與試驗化合物，特別的生物學或化學試驗化合 物，例如化學化合物庫之形式，直接或間接接觸。然後 測量或彳貞測試驗化合物對mir-22或mir-22基因之影 響。之後，分析及/或分離適合的拮抗劑。就化學化合 物庫之篩選，使用熟習技術者已知或市售的高通量分析 為較佳。 根據本發明，術語「化學化合物庫」係指，從任何 多來源，包括化學合成分子和天然產物，經組合，或由 組合化學技術所產生之多數個化學化合物。 一般而言，試驗化合物對mir-22或mir-22基因之 影響係以異相或均相分析來測量或偵測。如文中所用， 異相分析為包括一或多個清洗步驟之分析，而在均相分 69 201238973 析中並不需要此等清洗步驟。僅將試劑和化合物混合並 測量。 適合的功能性分析可以mir-22之表現為基準。 特言之，本發明係關於下列各方面： 1. Mir-22用作組織狀態或疾病之指標。 2. Mir-22作為組織狀態或疾病指標之用途。 3. 根據第1方面之Mir-22或根據第2方面Mir-22之用 途，其中mir-22之量為下列之指標： (a) 組織狀態或疾病及/或 (b) 發生組織狀態改變或疾病之風險，及/或 (c) 個體具有組織狀態改變或疾病，及/或 (d) 個體中組織狀態或疾病之進展或階段。 4. 一種測定個體中 (a) 組織狀態改變或疾病存在，及/或 (b) 發生組織狀態改變或疾病之風險，及/或 (c) 監測組織狀態或疾病之進展或階段 之方法，其包括偵測mir-22之量。 5. 根據第3方面之Mir-22或Mir-22之用途或第4方面 之方法’其中mir-22之量為個體中或個體樣本中mir-22 之量。 6. 根據第5方面之Mir-22或Mir-22之用途，進一步包 括將該個體或樣本中Mir-22之量與一或多個參照物或 參照樣本中mir-22之量作比較。 201238973 7·根據第6方面之Mir-22或Mir-22之用途或方法，其 中該參照物係由下列組成之群中選出：健康個體、罹病 個體或與試驗個體相同之較早或較晚時間點的個體，或 代表無組織狀態改變或疾病存在、有組織狀態改變或疾 病存在或代表發生組織狀態改變或疾病之風險增加或 降低之mir-22量之值。 8. 根據第7方面之Mir-22或Mir-22之用途或方法，其 中該參照樣本係由下列組成之群中選出：衍生自健康個 體的參照樣本、衍生自罹病個體的參照樣本或衍生自與 相關樣本相同在較早或較晚時間點所採集之參照樣 本’或帶有代表健康個體或代表有或無組織狀態改變或 疾病存在’或代表發生組織狀態改變或疾病之風險增加 或降低之mir-22量的參照樣本。 9. 根據第7方面之Mir-22或Mir-22之用途或方法’其 中该參照物·為健康個體，或帶有發生組織狀態改變或疾 病之風險降低之個體’或代表無組織狀態改變或疾病之 mir-22量’或根據第8方面之之用途或方 法，其中該參照樣本係衍生自健康個體，或衍生自帶有 發生組織狀態改變或疾病之風險降低之個體，或包括代 表健康個體或無疾病狀態，或發生組織狀態改變或疾病 之風險降低之mir_22量，其中升高的Mir_22量係顯示個 體中： (a) 有組織狀態惡化或疾病之存在及/或 (b) 發生組織狀態惡化或疾病之風險增加及/或 (c) 組織狀態惡化或疾病之進展。 201238973 10.根據第7方面之Mir-22或Mir-22之用途或方法， 其中5亥參照物為罹病的個體’或帶有發生組織狀態改變 或疾病之風險增加之個體，或代表有組織狀態改變或疾 病之值，或根據第8方面之Mir-22或Mir-22之用途或方 法，其中該參照樣本係衍生自罹病的個體，或衍生自帶 有發生組織狀態改變或疾病之風險增加之個體，或包括 代表罹病個體或有疾病存在之狀態’或發生組織狀態改 變或疾病之風險增加之mir-22程度或量，其中類似的 Mir-22量係顯示個體中： (a) 有組織狀態惡化或疾病之存在及/或 (b) 發生組織狀態惡化或疾病之風險增加及/或 (c) 組織狀態惡化或疾病之進展。 11 ·根據第7方面之Mir-22或Mir-22之用途或方法， 其中該參照物為較早時間點之相同個體，或根據第8方 面之]VIir-22或Mir-22之用途或方法，其中該參照樣本係 衍生自與相關樣本相同在較早時間點所採集之個體，其 中 〃 (i) 相關樣本中升高的mir-22量係顯示個體+ (a) 有組織狀態惡化或疾病之存在及/或 (b) 發生組織狀態惡化或疾病之風險增加及/或 (c) 組織狀態惡化或疾病之進展， (ii) 相關樣本中降低的mir-22量係顯示 (a) 組織狀態改變或改善或無疾病存在及/或 (b) 發生組織狀態惡化或疾病之風險降低及/或 (c) 組織狀態惡化或疾病之進展減緩。 72 201238973 (iii)相關樣本中類似的mir_22量係顯示個體中 (a) 發生組織狀態惡化或疾病之類似風險及/或 (b) 組織狀態惡化或疾病之進展停滯及/或 (c) 組織狀態惡化或疾病持續。 12. —種用於測定個體中組織狀態改變或預防或治 療疾病之醫藥劑量之方法，其包括下列步驟 (a) 測定個體樣本中mir-22之量，及視需要測定參照 物或參照樣本中mir_22之量，用於與相關樣本中的 mir-22量作比較，及 (b) 依照相關樣本中mir-22之量，視需要依照相關樣 本和參照物或參照樣本中mir-22之量的比較，決定醫藥 劑量。 13. —種調整用於組織狀態改變或預防或治療關節 疾病之醫藥劑量之方法，其包括下列步驟： (a) 測定樣本中mir_22之量，及 (b) 測定一或多個參照物或參照樣本中mir-22之量， (C)檢驗試驗樣本關於存在該相關樣本中mir-22之 量是否與一或多個參照物或參照樣本中mir-22之量不 同， (d) 依照相關樣本中mir-22之量是否與一或多個參 照物或參照樣本中之量不同，調整醫藥劑量。 14 _ 一種測定物質對組織狀態或疾病發生之有利及/ 或有害效應之方法，其包括下列步驟： ⑻測定相關樣本中mir_22之量， 73 201238973 (b) 測定一或多個參照物或參照樣本中mir-22之 量，及 (c) 檢驗相關樣本關於存在該相關樣本中mir-22之 量是否與一或多個參照物或參照樣本中之量不同， 其中相關樣本暴露於該物質之方式係與一或多個 參照物或參照樣本不同。 15. 根據第5至11方面任一方面中之Mir-22或mir-22 之用途，或根據第5至14方面任一方面中之方法，其中 該相關樣本為組織及/或體液。 16. 根據第15方面之Mir-22或Mir-22之用途或方 法，其中該組織樣本係由下列組成之群中選出：組織萃 取物、滑液組織和軟骨，而體液係由下列組成之群中選 出：滑液、血清、血聚和尿液。 17. —種mir-22於根據第4至16方面任一方面之方法 中的用途。 18. —種用於根據第4至16方面任一方面之方法中 之套組，係包括一或多種偵測mir-22之工具。 19. 根據第18方面之套組，其中該一或多種偵測 mir-22之工具為測定mir-22表現量之工具，較佳地，係 在基因及/或RNA層級上。 20. 根據第18或19方面之套組，其中該一或多種偵 測mir-22之工具係由下列組成之群中選出：核酸，較佳 地DNA或RNA、二者之混合物或化學修飾核酸、胜肽和 蛋白，較佳地單株或多株抗體。 74 201238973 21. 根據第18至20方面任一方面中之套组，其中該 套組進一步包括 (a) —容器，及/或 (b) 數據載器，其中該數據載器包括例如下列資訊： Ο)有關測定關節疾病之發生風險及/或測定關節疾 病存在及/或監測關節疾病之進展的方法說明， (ii) 偵測，較佳地樣本中，更佳地來自個體樣本中 mir-22之工具及/或套組之使用說明， (iii) 品質資訊例如有關用於偵測mir-22之工具及/或 套組批號、製造或組裝地或到期日或保存期限之資訊， 有關套組之正確保存或操作之資訊， (iv) 有關用於偵測mir-22之缓衝劑、稀釋劑、試劑之 多且成物及/或彳貞測mir-22之工具的資訊， (v) 當進行上述方法測定及/或監測關節疾病進展 時，所得到的資料解釋之有關資訊， (vi) 當應用不適合的方法及/或不適合的工具時，可 能的誤解或錯誤結果之相關警告，及/或 (vii) 當使用不適合的試劑及/或緩衝劑時，可能的誤 解或錯誤結果之相關警告。 22. —種如第18至21方面任一方面之套組於第4至 16方面任一方面之方法中之用途。 23. —或多種於第4至16方面任一方面之方法中供 偵測mir-22基因、基因產物或其功能活性變體之核酸。 24. 根據第23方面之核酸，其中該核酸係由下列組 成之群中選出：鎖核酸(LNA)、核酸探針、聚醯胺或胜 75 201238973 肽核酸(PNA)、微RNA (miRNA)、小干擾rna (siRNA)、 聚合酶連鎖反應(PCR)之引子、反轉錄(RT)反應之引子 及DNA定序之引子。 25·根據第24方面之核酸’係包括至少8個核苦酸之 核苷酸序列。 26. —種於第4至16方面任一方面之方法中供债測 mir-22基因、基因產物或其功能活性變體之胜狀、多狀 或蛋白。 27·根據第25方面之胜肽、多肽或蛋

^ > 一一 ”，具中該J 白或多肽為蛋白配體，較佳地抗體、斷片或其衍生物 朵平或抗運載蛋白，或其中該多肽或胜肽為探2 地質譜探針❶ $ 28.—種根據第23至25方面任一方面中之核 g 根據第26或27方面之胜肽、多肽或蛋白，於第々至“^ 面任一.方面之方法中之用途。 ’ 29· —種mir-22或mir-22基因或其功能活性个 為目標分子供找出mir-22拮抗劑之用途。

3〇.根據第29方面之用途，其中係將叻卜” ^ m心22基因或其功能活性變體與試驗化合物直接或J 接接觸，並測量或偵測試驗化合物對mir_22 ° E 基因之影響。 虱mir-2 31. —種篩選mir-22拮抗劑之方法，其中該方法爸 括 / (a) 提供 mir-22 或 mir-22 基因， (b) 提供試驗化合物，及 76 201238973 (c)測量或债測試，驗化合物對mir-22或mir-22基因 之影響。 32. —種用於組織狀態改變或預防或治療關節疾病 之mir-22拮抗劑。 33. —種包括mir-22拮抗劑之醫藥，係用於預防或治 療關節疾病，較佳地發炎性關節疾病。 34. 如第33方面之醫藥，其進一步包括醫藥上可接 受載劑及/或賦形劑，及視需要一或多種另外的活性物 質。 35. —種改變組織狀態或預防或治療關節疾病之方 法，其中係將根據第33或34方面之治療上有效量醫藥投 予處於發生或罹患關節疾病風險中之個體。 36. 如第35方面之方法，其中該醫藥係以口服、局 部、經皮滲透或腔内，較佳地靜脈内或關節内給藥。 37. 根據第5至11方面任一方面中之Mir-22或 mir-22，或根據第5至14方面和第35至36方面任一方面 之方法，第22方面之套組之用途，第23或25方面任一方 面之核酸，第26或27方面之胜肽、多肽或蛋白，或第28 方面之核酸、胜肽、多肽或蛋白之用途，或第32方面之 Mir-22拮抗劑，其中該組織狀態為組織損傷，較佳地係 由下列組成之群中選出：骨、軟骨、滑膜、軟骨膜、囊 和結締組織之損傷，及/或其特徵為存在組織中之調控 分子、訊號傳遞分子及/或退化分子的量改變。 77 201238973 38.根據第5至11方面任一方面中之Mir-22或 mir-22，或根據第5至14方面和第35至36方面任一方面 之方法，第22方面之套組之用途，第23或25方面任一方 面之核酸，第26或27方面之胜肽、多肽或蛋白，或第28 方面之核酸、胜肽、多肽或蛋白之用途，或第32方面之 Mir-22结抗劑，其中該疾病為關節疾病，較佳地係由下 列組成之群中選出：骨性關節炎、類風濕性關節炎、乾 癬性關節炎、感染性關節炎、僵直性脊椎炎、滑囊炎(發 炎）、皮肌炎、纖維肌痛、痛風性關節炎、幼年特發性 關節炎（史迪爾氏症）、混合的結締組織疾病、風濕性多 發性肌痛症、多發性肌炎、反應性關節炎（萊特氏症候 群）、硬皮病、肩肌腱炎、薛格連氏症候群、全身性紅 斑性狼瘡，及/或特徵為由關節發炎或關節退化所致之 關節物理性或代謝性損傷，更佳地，其中該疾病為骨性 關節炎。 本發明之其他方面係如下： 1.[預測方法]一種於一受試者中測定關節炎疾病風 險增加之方法，其包括： a) 測量該對象之生物樣本中mir-22之量；及 b) 將樣本中的mir-22量與適合對照組之mir-22量作 比較，其中，相較於對照組，在樣本中測定到增加的 mir-22量，藉此測定該受試者具有關節疾病之增高的風 險。 78 201238973 2. [診斷方法]一種於受試者中診斷關節炎疾病之方 法，該方法包括： a) 測量該對象之生物樣本中mir-22之量；及 b) 將樣本中的mir-22量與適合對照組之mir-22量作 比較， 其中，相較於對照組，在樣本中測定到增加的 mir-22量，藉此測定該受試者具有關節疾病。 3. [病患分類]一種治療患有關節疾病之對象之方 法，該方法包括： a) 測量該對象之生物樣本中mir-22之量； b) 將樣本中的mir-22量與適合對照組之mir-22量作 比較；及 c) 當相較於對照組，在樣本中測定到增加的mir-22 量，則將治療關節疾病之醫藥組成物投予該病患，藉此 治療該對象。· 4. [劑量最適化]一種測定用於治療患有關節疾病之 對象的醫藥劑量之方法，該方法包括： a) 測量該對象之生物樣本中mir-22之量； b) 將樣本中的mir-22量與適合對照組之mir-22量作 比較；及 c) 當相較於對照組，在樣本中測定到增加的mir-22 量，則增加醫藥組成物之劑量；或當相較於對照組，在 樣本中測定到減少的mir-22量，則減少醫藥組成物之劑 量， 藉此決定該對象之醫藥劑量。 79 201238973 5. [篩選分析]一種測定物質或試驗化合物對關節疾 病之效應之方法，該方法包括： ”矢 a) 測量經物質或試驗化合物治療之樣本中mir_22之 重， b) 將治療樣本中的mir-22量與適合對照組之_ 量作比較；及 _

若相較於對照組，在樣本中測定到增加的^ 量，則測定該物質具有有害效應，或若相較於對照級， 在樣本中測定到減少的mir-22量’則測定該物質耳有有 利效應，藉此決定由此決定該物質或試驗化合物對關〜 疾病之效應。 BP 6. 如第1-4方面任一方面中之方法，其中係使用一气 多種核酸探針來債測mir-22之量。 7. 如第1-6方面任一方面中之方法，其中該適合的對 照組為來自健康對象之生物樣本。 8. 如第6方面之方法，其中該適合的對照組為未縫 物質治療之樣本。 、 9_如前述方面任一方面中之方法，其中該關節疾病 為骨性關節炎。 ’ 1 〇·[以mir-22拮抗劑治療之方法]一種於一對象中+ 療關節疾病之方法，其包括將mir-22拮抗劑投予|亥_ 象，藉此治療該對象之關節疾病。 11.如第10方面之方法，其中該mir-22拮抗劑係由^ 列組成之群中選出：siRNA、shRNA、反義RNA和核轉 酶。 201238973 12. 如第10方面之方法，其中該mir-22拮抗劑實質上 係與至少一部分的mir-22前驅物型（SEQ ID ΝΟ:1)相互 補。 13. 如第10方面之方法，其中該mir-22拮抗劑實質上 係與至少一部分的mir-22成熟型（SEQ ID NO:2)或 mir-22*(SEQIDNO:3)相互補。 14. 如第10方面之方法，其中miRNA-146a拮抗劑為 長度約6至約20個核苷酸之核酸分子。 15. 如第10方面之方法，其中miRNA-146a拮抗劑為 經修飾LNA或經修飾PNA之核酸分子。 16. 如第10方面之方法，其中該關節疾病為骨性關 節炎。 17. 如第10方面之方法，其中係投予miR-146拮抗 劑，使該對象軟骨細胞中的一或多種軟骨形成標記增 加。 18. 如第17方面之方法，其中該一或多種軟骨形成 標記係由下列組成之群中選出：膠原蛋白II、蛋白多糠、 Sox9、膠原蛋白 X、ALP、CD-Rap、MMP-1 和 mMP-3。 19. 如第11方面之方法，其中該哺乳動物為人類。 20. —種包含一或多種偵測mir-22之工具和適合對 照物之套組。 【實施方式】 本發明以實例和圖式更詳細描述，其不應理解為限 制本發明之範圍。 201238973 實例 實例1:在其培養期間軟骨細胞和幹細胞中mir_22之表 現特徵 於初級軟骨細胞和骨髓衍生的間葉幹細胞(BMSC) 之培養期間測定mir-22之表現，以評估於所指的時間 期間内這些細胞中mir-22表現量之正常波動。 將軟骨細胞以團狀培養於添補2mM L-麵醯胺酸 (Sigma-Aldrich)、lx 非必需胺基酸（Sigma-Aldrich)、 10nM 地赛米松（dexamethasone)(Sigma-Aldrich)、 10pg/ml胰島素、5.5pg/ml運體蛋白、5ng/ml亞硒酸鈉 (Sigma-Aldrich)、44pg/ml 抗壞血酸（Sigma-Aldrich)和 \10ng/ml TGF-βΙ (R&D Systems)之DMEM培養基中培 養0、1、4、7或14天。將BMSC以團狀培養於相同的培 養基中培養0、1、4、7、14或21天。收取軟骨細胞和BMSC 並個別處理各團塊進行RN A分離p就分泌蛋白之分析係 於整個培養期間收集上清液並集中。就RNA之萃取，係 在培養七天後收集團塊並分別以Mixermill(Retsch)均 質。在均質的細胞上進行蛋白酶K消化。從Qiagen miRNeasyPlusMicro套組溶離總RNA(包括miRNA)。根 據製造商的說明，使用反轉錄酶套組和RNA酶抑制劑 (Life Technologies)將RNA反轉錄至cDNA。根據熟習技 術者熟知的方法，經由miRNA專一性定量即時PCR，使 用Taqman探針測定軟骨細胞和BMSC中mir-22表現特 徵。使用 ABI Taqman® microRNA低密度陣列（TLDA， Applied Biosystems，Foster City, CA)定出 668 miRNA和 82 201238973 另外參照基因之特徵。此分析包括三個步驟：多重RT、 前置增幅和單重TaqMan PCR。所有的步驟皆根據製造 商之s兒明來進行。即時PCR係於AB 7900HT序列偵測系 統上進行。就表現分析，係應用比較性Ct法。 圖la係說明培養期間軟骨細胞團中mir_22之表 現’而圖2係說明培養期間BMSC中mir_22之表現。 mir-22之表現在軟骨細胞團中可偵測到約23循環㈨= 23)之循環閥值，而BMSC於整個實驗期間為23。培養 條件係選擇例如健康分化的軟骨之反射條件。如可從圖 la和圖2看出，在培養期間二種細胞類型之mir_22表 現量仍穩定，僅具有非常小的波動。此穩定的表現代表 與在相同條件於平行實驗進行之隨時間增加的 mir-199a 和 mir-140 的表現（圖 lb)相反，而 mir_199a 和 mir-140為二種已被本發明者測定出作為生理軟骨狀態 標記之微RNA ;在另一方面，本發明者已揭示與骨性 關節炎軟骨有關之mir-146a的表現’在整個培養其間顯 現與mir-22相同的表現穩定性。因此，mir_22之表現 量在生理軟骨中比分化的生理（亦即非骨性關節炎)軟骨 之標記中更低。因此，相對於分化的生理（亦即非骨性 關節炎)軟骨之標記，較低mir-22表現量係為無〇A存 在之指標。 實例2 : BMSC中mir-22之過度表現和敲減 蛋白質膠原蛋白II、蛋白多糖、Sox9、膠原蛋白X、 ALP和CD-Rap之表現已知在關節炎之關節中會改變。 83 201238973 因此其個別的表現量為有無OA存在之指標。為了研究 mir-22在〇A中的角色，係在軟骨細胞分化後於bmsC 中’於mRNA(膠原蛋白II、蛋白多糖、sox9和膠原蛋 白X)或蛋白（CD-Rap)層級上測量，分析其過度表現或 敲減對這些分子之效應。 在三個獨立的實驗(V15、V18、V20)中，以包括編 碼mir-22之DNA(本文另係指：mir-22)或MRP((本文另 係指：空載體)之泛病毒粒子轉染BMSOMir-22已選 殖至pLenti9(—種含部分HIV1 LTR序列（參見下圖）之 慢病毒載體）。泛病毒粒子係由Vectalys公司（Toulouse, France)為客戶服務所製造。BMSC之轉染係以5之感染 複數(MOI)來進行。為了增進感染，係加入8pg/ml凝聚 胺(Polybrene)並將測定盤以50〇xg於32°C離心90分 鐘。隔天，藉由離心（30〇xg，5分鐘)在96孔錐形底的測 定盤(Eppendorf)形成由2.5χ105個細胞組成的高密度團 塊。

84 201238973 團狀培養7天後，收集細胞並依照實例1所示之相 同方法分離其RNA。根據製造商的說明，使用反轉錄 酶套組和RNA酶抑制劑(Life Technologies)進行cDNA 合成。經由定量即時PCR測定四種軟骨形成標記膠原 蛋白II、蛋白多糖、Sox9和勝原蛋白X之表現量。使 用 TaqMan® Universal PCR Master Mix 和目標基因為 ACAN、COL2A1、COL10A1 和 SOX9(參見下表）之 FAMTM-標定基因專一性分析進行TaqMan反應。所有 的基因專一性分析係由FAM™染劑-標定的TaqMan® MGB探針所組成。使用ABI Prism 7900 (Life Technologies)進行 PCR。使用核醣體蛋白 L37a (RPL37a) 作為參照基因。就RPL37a係選擇下列序列：參照前置 引子：GGCACTGTGGTTCCTGCAT，參照反置引子： ACAGCGGAAGTGGTATTGTACGT。MGB 參照探針係 以 VIC 標定並具有下列.序列 ： CCGCCAGCCACTGTCT。就表現分析，係應用比較性 Ct法。 目標基因 基因符號 登錄號 基因專一性分析ID 蛋白多糖 ACAN ΝΜ—0132 27 Hs00153936_ml 膠原蛋白， 第I型，αΐ COL2A1 ΝΜ_0331 50 Hs00264051_ml 膠原蛋白， 第X型，αΐ COL10A1 ΝΜ_0004 93 Hs00166657一ml 85 201238973 SRY(性別決 SOX9 NM—0003 Hs00165814 ml 定區）-box 9 46 在一種不同各蜀立的實驗（亦即V15、V18、V20) 中，-·22過度表現對四種不同標記蛋白(亦即膠原蛋 白11、蛋白多糖、S〇x9和膠原蛋白X)表現量之效應係 如圖3所不(參見圖3 A_D)。各實驗包括四個樣本化= 4)。 於實驗V15、V18和V20(參見圖3Ε)，使用elisa， 依照熟習技術者熟知之方法，試驗標記蛋白CD RAp之 表現量。蛋白量係以團狀培養上清液，使用ELISA套 組，根據製造商的說明加以定量：CD RAp (MIA)(Roehe)。收集並集中整個三星期的培養期間於每 次培養基更換時所得來的各單一團狀培養上清液，對單 -團塊以ELISA測定蛋白之量。各團在培養期間用於 團塊之培養基量為相同的。 相較於對照組細胞所測的表現量，所試驗的全部五 種標記蛋白之表現量因mir_22過度表現皆顯著降低。 mir-22過度表現顯示下調這些蛋白之表現。因此高 mir-22量為這些標記之表現量下降之指標。因此，相較 於正常的對照組’升高的mir_22量為〇A存在之指標。 在三種不同的實驗中（V21、V22、V23)，使用

miRIDIAN 髮夾抑制劑 hsa-mir-22 (Dharmacon)於 BMSC 中敲減mir-22(本文另係指：mir-22 inh)並相較於對照 組細胞，觀察對四種標記蛋白膠原蛋白Π、蛋白多糖、 86 201238973

Sox9和膠原蛋白X表現之效應。在單層培養中以濃度 30 nM之miRIDIAN髮夾抑制劑hsa-mir-22處理 BMSC。以miRIDIAN微RNA髮夾抑制劑負對照 (Negative Control)# 1 (Dharmacon)作為負對照組。隔 天，藉由離心（30〇xg，5分鐘）在96孔錐形底測定盤 (Eppendorf)形成由2.5xl05個細胞組成的高密度團塊。 將團塊培養最多3星期。如已於mir-22過度表現中所 描述，進行所有後續之分析步驟。 在二種不同、獨立的實驗中（亦即V21、V22、V23)， mir-22敲減對五種標記蛋白（亦即膠原蛋白π、蛋白多 於細胞所測的表現量，所有四種試驗的標記蛋白

之表現（Pujol JP 糖、S〇X9、膠原蛋白Χ和CD-RAP)表現量之效應係如 Ε所示。母個貫驗係檢驗四個樣本& = 4)。相較 1IL-1抑制軟骨基質中第^和IX ujol JP 1998)及減少蛋白多醣 87 201238973 (proteoglycan)之合成。已證實其存在於〇A關節中。因 此測定分化的BMSC中IL-1處理對標記蛋白：膠原蛋 白II、蛋白多糖、Sox9和膠原蛋白X表現量之效應。 為了研究IL-1之效應，在實驗V22和V23中製備 另外的樣本，其中細胞係另外以細胞激素〗L-l處理。 如早先所述，製備BMSC團狀培養。分化7天後(如前 面所述）’將團塊另於無TGF及在〇.〇5 ng/ml IL-1 (R&D Systems)存在下下培養。從團狀培養開始後2星期，以 IL-1刺激7天後，萃取RNA。於IL-1刺激期間，收集 2星期的上清液(總培養期3星期）。 IL-1處理對mir-22敲減之效應係如圖5 A-D所示。 相較於對照組細胞所測的表現量，因IL-1處理，膠原 蛋白II、蛋白多糖、Sox9和膠原蛋白X表現量稍微增 加。然而，此增加量低於無IL-1時所增加的表現量（參 見上文實例2和圖4)，其顯示部分反向的mir-22敲減 效應。 圖6係進一步說明相較於未處理的對照組，因 mir-22過度表現或敲減，四種標記蛋白：膠原蛋白π、 蛋白多糖、Sox9和膠原蛋白X表現量變化之百分比 (A)，以及IL-1處理對mir-22敲除之效應（B)。 【圖式簡單說明】 圖la :培養期間，軟骨細胞團中mir-22表現。 圖lb :培養期間，軟骨細胞團中mir_22、mir-140、 mir-146a 和 mir-199a 之表現。 88 201238973 圖2 :培養期間，間葉幹細胞團中mir-22表現。 圖3 :於三個不同的實驗中，mir-22過度表現對三 種標記基因和1種標記蛋白之效應：膠原蛋白H (A); 蛋白多糖(Β) ; Sox9(C);膠原蛋白 x(D) ; CD-RAP (Ε)。

圖4 :於三個不同的實驗中，mir-22敲減對三種標 記基因和1種標記蛋白之表現量的效應：膠原蛋白II

(A);蛋白多糖(b) ; Sox9 (C);膠原蛋白 X(D) ; CD-RAP (E)。 圖5 :於三個不同的實驗中，在的存在下， mir-22敲減對三種標記基因和1種標記蛋白之表現量的 效應：膠原蛋白11(A);蛋白多糖(B) ; Sox9(C);膠原蛋 白 X(D)。 ' 圖6 :三種標記基因和1種標記蛋白回應mir_22過 度表現或敲減之表現量的相對變化(A)，及IL-Ιβ處理對 mir-22敲減之效應(B)。 序列表-自由文本資料 SEQ ID NO : 1智人 mir22 莖環序列 hsa-mir-22(登錄號：MI0000078) SEQ ID NO · 2 hsa-miR-22(登 錄 號 . MIMAT0000077) SEQ ID NO : 3 hsa-miR-22*(登錄號 ： MIMAT0004495) 參考文獻 1. Grosshans et al., J Cell Biol 156 · 17-21 (2〇〇2) 89 201238973 2. Czech, NEJM 354:1194-1195 (2006)； 3. Mack，Nature Biotech. 25:631-638 (2007); 4. Eulalio et al., Cell 132:9-14 (2008) 5. Yi, et al. Genes Dev. 17 · 3011-3016 (2003) 6. Leuenberger et al., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland (1995) 7. Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90, 543-584 (1990) 8. Jayasena, Clin. Chem., 45, 1628-50 (1969) 9. Klug and Famulok, Mol. Biol. Rep., 20, 97-107 (1994) 10. US 5,582,981 11. Nolte et al., Nat. Biotechnol., 14, 1116-9 (1996) 12. Klussmann et al.，Nat. Biotechnol.，14，1112-5 (1996) 13. Beigelman et al·，Nucleic Acids Res· 23:3989-94 (1995) 14. WO 95/11910 15. WO 98/37240 16. WO 97/29116 17. Beigelman et al., Nucleic Acids Res. 23:3989-94 (1995) 18. Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Research, 36, Database Issue, D154-D158 (2008) 90 201238973 19. Griffiths-Jones et al., Nucleic Acids Research, 34, Database Issue，D140-D144 (2006) 20. Griffiths-Jones, Nucleic Acids Research, 32, Database Issue, D109-D111 (2004) 21. Lagos-Quintana et al.，Science. 294:853-858 (2001) 22. Michael et al., Cancer Res. 1:882-891 (2003) 23. Cai et al., Proc Natl Acad Sci USA. 102:5570-5575 (2005) 24. Landgraf et al., Cell. 129:1401-1414(2007) 25. Karlin & Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 ： 5873-5877 (1993) 26. Thompson et al·, Nucleic Acids Res. 22, 4673-80 (1994) 27. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 ： 403-410 (1990) 28. Altschul et al.，Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402 (1997) 29. Brudno, Bioinformatics 2003b, 19 Suppl 1:154-162 30. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, (1991) 31. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences 32. EP 0 368 684 B1 33. US 4,816,567 34. US 4,816,397 91 201238973 35. WO 88/01649 36. WO 93/06213 37. WO 98/24884 38. Beste etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，96, 1898-1903 (1999) 39. Skerra，Biochim. Biophys. Acta, 1482，337-50 (2000) 40. Skerra, Mol. Recognit., 13, 167-187 (2000) 41. Lindemann et al.，Mol. Med·, 3, 466-76 (1997) 42. Springer et al·，Mol. Cell·，2, 549-58 (1988) 43. Alexander and Akhurst, Hum. Mol. Genet. 4:146-a79-85 (1995) 44. Feigner et al.，Proc. Natl. Acad. Sci USA, 84, 7413 . 7414 (1987) 45. Behr et al” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6982-6986 (1989) 46. Zhao and Huang, Biochim. Biophys. Acta, 1189, 195-203 (1994) 47. Feigner et al., J. Biol. Chem., 269, 2550-2561 (1994) 48. Schwartz et al., Gene Therapy 6:282(1999) 49. Branden et al., Nature Biotech., 17, 784 (1969) 50. Planck et al., J. Biol. Chem., 269, 12918 (1994) 51. Kichler et al., Bioconj. Chem, 8, 213 (1997) 92 201238973 52. Wang et al., J. Invest. Dermatol. 112:775-81 (1999) 53. Tuting et al., J. Invest. Dermatol. 111:183-8 (1998) 54. EP 0 944 398 A1 55. EP 0 916 336 A1 56. EP 0 889 723 A1 57. EP 0 852 493 A1 58. Diamond et al” The New England Journal of Medicine ： 1344-1349 (1981) 59. Winter and Milstein, Nature, 349, 293-299 (1991) 60. Zheng and Kemeny, Clin. Exp. Immunol., 100, 380-2(1995) 61. Nellen and Lichtenstein, Trends Biochem. Sci., 18, 419-23 (1993) 62. Stein, Leukemia, 6, 697-74 (1992) 63. Yacyshyn et al., Gastroenterology, 114, 1142 (1998) 64· Elbashir et al., Genes Dev.，15, 188 (2001) 65. Elbashir et al.，Nature, 411，494 (2001) 66. Amarzguioui et al., Cell. Mol. Life Sci., 54, 1175-202 (1998) 67. Vaish et al., Nucleic Acids Res., 26, 5237-42 (1998) 68. Persidis, Nat. Biotechnol., 15, 921-2 (1997) 93 201238973 69. Couture and Stinchcomb, Trends Genet., 12, 510-5 (1996) 94 201238973 序列表 <11 〇>賽諾菲公司 <120>關節疾病之miRNAs( —） <130> DE2010/287 <160> 3 <170> BiSSAP 1.0 <210> 1 <211> 85 <212> RNA <213>智人 <220〉 <221〉來源 <222> 1..85 <223〉/分子_類型="RNA" /生物體="智人" <400〉 1 ggcugagccg caguaguucu ucaguggcaa gcuuuauguc cugacccagc uaaagcugcc 60 aguugaagaa cuguugcccu cugcc 85 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213>智人 <220〉 <221>來源 <222〉 1..22

<223〉/分子_類型="RNA 201238973 /生物體="智人" <400〉 2 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210〉 3 <211> 22 <212> RNA <213>智人 <220〉 <221>來源 <222> 1..22 <223〉/分子_類型=" /生物體="智人” <400〉 3 aguucuucag uggcaagcuu ua 22 2

Claims (1)

1. 201238973 七、申請專利範圍： 1. 一種用作組織狀態或疾病指標之Mir_22。 2. —種Mir-22作為組織狀態或疾病指標之用途。 3. —種在個體中測定下列的方法， (a) 組織狀態改變或疾病存在，及/或 (b) 發生組織狀態改變或疾病之風險，及/或 (c) 監測組織狀態或疾病之進展或階段，其包括偵測 mir-22 之量。 4 · 一種測定用於個體中改變組織狀態或預防或治療疾 病之醫藥劑量之方法，其包括下列步驟 (a) 測定個體樣本中mir_22之量，及視需要測定參照物 或參照樣本中mir-22之量，用於與相關樣本中的 mir-22量作比較，及 (b) 依照相關樣本中mir_22之量，視需要依照相關樣本 和參照物或參照樣本中mir_22之量的比較，決定醫藥 劑量。 5. —種，整用於組織狀態改變或預防或治療關節疾病 之醫藥劑量之方法，其包括下列步驟： (a) 測定樣本中mir-22之量，及 (b) 測定—或多個參照物或參照樣本中mir-22之量， (C)檢驗試驗樣本關於存在該相關樣本中mir-22之量 201238973 是否與一或多個參照物或參照樣本中mir-22之量不 同，及 (d)依照相關樣本中mir-22之量是否與一或多個參照 物或參照樣本中之量不同，調整醫藥劑量。 6. —種測定物質對組織狀態或疾病發生之有利及/或有害 效應之方法，其包括下列步驟： (a) 測定相關樣本中mir-22之量， (b) 測定一或多個參照物或參照樣本中mir-22之量，及 (c) 檢驗相關樣本關於存在該相關樣本中mir-22之ι 是否與一或多個參照物或參照樣本中之量不同， 其中該相關樣本暴露於該物質之方式係與一或多個 參照物或參照樣本不同。 7. —種mir-22於如申請專利範圍第3至6項中任一項之方 法中的用途。 8. —種用於如申請專利範圍第3至6項中任一項之方法中 的套組，其包括一或多種偵測mir-22工具。 9. 一種如申請專利範圍第8項之套組之用途，係用於如申 請專利範圍第3至6項中任一項之方法。 201238973 10. —或多種用於偵測mir-22基因、基因產物或其功能活 性變體之核酸，係用於如申請專利範圍第3至6項中任 一項之方法。 11. 一種用於偵測mir-22基因、基因產物或其功能活性變 體之胜肽、多肽或蛋白，係用於如申請專利範圍第3 至6項中任一項之方法。 12. —種如申請專利範圍第10項之核酸或如申請專利範 圍第11項之胜肽、多肽或蛋白之用途，係用於如申請 專利範圍第3至6項中任一項之方法。 13. —種mir-22或mir-22基因或其功能活性變體作為供 找出mir-22拮抗劑之目標分子的用途。 14. 一種篩選mir-22拮抗劑之方法，其中該方法包括下 列步驟： ⑻提供mir-22或mir-22基因， (b) 提供試驗化合物，及 (c) 測量或彳貞測試，驗化合物對mir-22或mir-22基因之 影響。 15. —種用於改變組織狀態或預防或治療關節疾病之 mir-22拮抗劑。 201238973 16. —種包括mir-22拮抗劑之醫藥，係用於預防或治療 關節疾病，較佳為發炎性關節疾病。 17. —種改變組織狀態或預防或治療關節疾病之方法， 其中係將一治療上有效量之如申請專利範圍第15項 之拮抗劑，或如申請專利範圍第16項之醫藥投予處 於發生關節疾病風險之個體或罹患關節疾病之個