TW201207110A - Accumulation of ω -7 fatty acids in plant seeds - Google Patents

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201207110 六、發明說明： 【智^明戶斤屬技^奸々員域^】 優先權主張 此申清案以201 〇年6月24號提申之美國臨時專利申請 案第61/358,318，號“]^-7脂肪酸在植物種子中之聚積，，主張 優先權。 發明領域 在特別的實施例中，本發明係關於一新穎的突變蓖麻 屬-18 ’ 0-ACP去飽和酶，稱呼為Com25，該者作 用為一Δ9-16 : 0-ACP去飽和酶。另一實施例關於代謝工程 方法以操控在植物中的代謝分支點，舉例而言，將碳再指 向至ω-7脂肪酸。在某些實施例中，本發明係關於以代謝工 程策略之一部分表現Com25之方法，藉由此，碳在植物種 子中係再指向至ω-7脂肪酸。 【lltT ^ 發明背景 據估計’在天然界可能有1000種以上的脂肪酸結構。

Millar等人之“Trends Plant Sci 5(3) : 95-101(2000)”。這些 脂肪酸許多係藉由一批原型去飽和酶之變體由脂肪酸等 之衍生化而合成的。這些最初被單離出的去飽和酶變體係 為源自蓖麻胚乳之蓖麻屬油酸酯羥化酶，該者負責蓖麻油 酸(ricinoleic acid)的合成。Van de Loo等人之“proc· Natl. Acad. Sci. USA 92(15) : 6743-6747(1995)”。繼之此後的係 為該斑鳩菊屬亞麻油酸酯環氧酶與該還陽蔘屬 201207110 (Oep&)油酸酯乙炔酶（actylenase)之基因編碼。Lee等人之 “Science 280(5365) : 915-18(1998)”。這些基因的單離導致 了它們在油作物(oil crop)植物中之異源表現能促進該等相 應稀少脂肪酸之聚積的想法。Broun等人之“Plant Journal 13 : 201-10(1997)”。然而，由此產生的稀少脂肪酸之聚積 總是低於在該基因所單離自的天然來源植物中所發現 者。Napier，J.A.之“Annu. Rev. Plant Biol. 58 ： 295-319(2007)”。 已從組織單離、聚積稀少脂肪酸的變體去飽和酶酵素 之特異活性量變曲線與產生該相應稀少脂肪酸的角色係為 一致的。然而，相較於至今報導的所有硬酯醯基_ACP去飽 和酶’它們展現非常貧乏的特異活性，且當異源表現時在 產生修改的脂肪酸表型上已證明無效果的。Cahoon等人之 “Prog. Lipid Res· 33 : 155-63(1994)”。譬如，在一強大的種 子特異性啟動子控制下於該模式植物擬南芥中之蓖麻羥化 酶的種子特異性表現僅導致約17%的蓖麻酸聚積，遠遠短 於在蓖麻種子中所發現的約90%。Broun及Somerville之 “Plant Physiol· 113 : 933-42(1997)”。針對環氧脂肪酸與 乙炔脂肪酸，同樣令人失望的結果已被報導的，該者取 決於在擬南芥中環氧化酶（epOXygenase)與乙炔酶 (acetylenase)之異源表現已被報導分別聚積至1 $與25%。 Lee等人之“Science 280(5365) : 915-18 (1998)”。除了顯 示貧乏的活性’變體去飽和酶純化時趨向於形成不溶性 的聚合體。低安定性與貧乏的催化速率是許多起源於基 201207110 因複製事件其中安定性及/或週轉之選擇係被免除之新發 展酵素的共同性質，而突變聚積最終導致功能之修改》 Govindarajan與 Goldstein之 “Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 : 5545-49 (1998)” ； Goldstein 之 ”（2001) Protein Folding, Evolution and Design” 卷CXLIV，I.O.S.出版， Broglia、R. A.、Shakhnovich、E. I.與Tiana，G.校訂，阿姆 斯特丹。 對於目標脂肪酸低水平之聚積，許多可能的解釋已提 出了 。Napier，J.A.之“Annu. Rev. Plant Biol. 58 ： 295-319(2007)”。證據支持特定的酵素在該稀少脂肪酸併入 成甘油三酯中可能扮演一關鍵角色。譬如，月桂酸在轉基 因大油菜(办cm/ca «叩⑽)種子之聚積取決於一椰子溶血磷 脂酸（lysophosphatidic acid)酰基轉移酶與加州月桂樹 (California bay)長鏈硫酯酶之共表現由5〇%提高至6〇0/〇。

Knutzon等人之“Plant Physiol· 12〇(3) : 739-46(1999)”。近 來，蓖麻類型-2醯基-辅酶A :二酰基甘油酰基轉移酶 (RcDGAT2)與該蓖麻羥化酶之共表現將蓖麻油酸之聚積從 約 17% 提高至約 30%。Burgal 等人之“Plant Bi〇techn〇 丨 j 6(8) : 819-31(2008)”。 在轉基因植物中，其聚積相當於在天然發生物種中所 發現的高水平稀少脂肪酸者尚未被報導的。由於稀少脂肪 酸在各種X·業及應用中係高度想望的，對於轉基因植物其 針對稀少脂肪酸之生產設計—較佳表現者係、為有需要的。 【^^明内 5 201207110 發明概要 於此所揭露的係為編碼一新穎去飽和酶變體之核苷酸 序列，稱呼為Com25，及其之胺基酸序列。 亦為揭露的是在植物細胞中表現Com25之方法，以利 用該Com25酵素增強的去飽和酶活性，相對於該WT蓖麻 △9-18 : 0去飽和酶，藉由此，該等稀少脂肪酸在植物種子 中之百分比組成係提高的。在有些實施例中，該方法包括 在擬南芥中表現Com25。在某些實施例中，在植物種子中 提高之該等稀少脂肪酸係為ω-7脂肪酸。在這些實施例中， 該ω-7脂肪酸可能為16 : 1Δ19及/或18 : 1Δ11。 用於在一植物細胞中表現Com25之方法亦為提供的， 其中，該植物細胞在質體中及質體外的脂肪酸延長係受損 的，藉由此，該等稀少脂肪酸在植物種子中的百分比組成 係提高的。在一些實施例中，該方法包括在擬南芥中表現 Com25。在某些實施例中，在植物種子中提高之該等稀少 脂肪酸係為ω-7脂肪酸。在這些實施例中，該等ω-7脂肪酸 可能為 16 : 1Α19及/或 18 : 1Δ11。 用於在一植物細胞中表現Com25之進一步方法亦為提 供的，其中在該植物細胞中KASII係受到抑制的，藉由此， 該等稀少脂肪酸在植物種子中的百分比組成係提高的。在 一些實施例中，該方法包括在擬南芥中表現Com25。在某 些實施例中，在植物種子中提高之該等稀少脂肪酸係為ω-7 脂肪酸。在這些實施例中，該等ω-7脂肪酸可能為16 : 1Δ19 及/或 18 : 1Δ11。 201207110 用於在-植物細胞中表現com25之方法亦為提供的， 其十在該植物細胞中KASII與質體及質體外脂肪酸延長係 受到抑制的，藉由此，該等稀少脂肪酸在植物種子中 分比組成係提向的。在一些實施例中，該方法包括在擬南 芥中表現Com25。在某些實施例中，在植物種子中提高 該等稀少脂肪酸係為ω - 7脂肪酸。在這些實施例中，該等① 脂肪酸可能為16 : 1Δ19及/或ι8 : ιΔπ。 從下面幾個實施例的詳細說明，前述特徵與其他特徵 將更為明顯的，該者係參照該等伴隨圖表而展開。 * 圖式簡單說明 第1圖描繪在擬南芥之質體與内質網中脂肪酸之合成 與修飾的示意圖。由16 : 0去飽和酶媒介之反應係指出為1 : △ -16 . 0-ACP去飽和酶；2 :質體外：Δ9_16 : 〇 ACp去飽和 酶。CO-7FA，即16: 1Δ9與18: 1Δι丨係為方塊的。 第2圖顯不FAMEs之之一代表性氣相色層分離，其取決 Com25在擬南务之各種背景中的表現。分圖a與b，wT ; C 與D ; E與F，/aZW//ae7。分圖 A、(：與£，未轉形；B、 D與F，以Phas:Com25轉形。FAME波峰係指出為：16: 0 〇)、 16 : 1Δ9 (2)、16 : 2 (3)、18 : 0 (4)、18 : 1 厶9 (5)、is : ιδ1 丨 ⑹、18 : 2 (7)、20 : 0 (8)、20 : 1厶"⑹、is : 2 ⑺、20 : 0 (8)、20 : 1Δ11 (9)、18 : 3+20 : 1△丨3 (1〇)、及 22 : 1 (11)。 第3圖顯示在宿主種子中16 : 〇與ω_7聚積之間的關係 (以莫耳百分比）。 第4圖顯示FAMEs之之一代表性氣相色層分離，其取決 7 201207110

Com25在擬南芬或各種背景中的表現。分圖a:最佳的

Phas:Com25, jPa67-HPAS，AnA9DS，LnA9DS轉形 品系；分圖B :榮花屬種子。波峰命名係如第2 圖中所說明。 第5圖係為本發明之一特別構築實施例中dnA元素之 一示意比對。 t實施方式3 較佳實施例之詳細說明 用於施行本發明之模式（等） I-數個實施例之概述 於此揭露的係為核苷酸分子其編碼一Δ9去飽和酶酵素 者，該者包含一核苷酸序列其至少有60%相同於SEQ ID NO: 1。該核酸分子可能進一步包含一基因調控元素。在 一些實施例中，該基因調控元素可能為一菜豆蛋白 (phaseolin)啟動子。 亦揭露的是Δ9去飽和酶酵素其包含至少80%相同於 SEQ ID NO : 2之一胺基酸序列者。本發明其中該胺基酸序 列係至少80%相同於SEQ ID NO : 2之Δ9去飽和酶酵素可能 進一步在類似於SEQ ID NO : 2中位置114之位置包含一絲 胺酸；在類似於SEQ ID NO : 2中位置117之位置包含一精 胺酸；在類似於SEQ ID NO : 2中位置118之位置包含一半 胱胺酸；在類似於SEQ ID NO : 2中位置179之位置包含一 白胺酸；及/或在類似於SEQ ID NO : 2中位置188之位置包 含一蘇胺酸。 201207110 本發明之核酸分子與△9去飽和酶酵素可以在植物材 料細胞、組織或整個植物中表現，以提高稀少脂肪酸在 該植物材料、細胞、組織或整個植物中的數量，相對於在 同一物種野生型植物巾觀察到之數量。本發明之替代實施 例匕括用於提同稀少脂肪酸在該植物材料、細胞、組織或 整個植物中之數量的方法，該等者包含以seqidn〇:^ 西艾刀子齡的植物材料、細胞、組織或整個植物，藉由此， 稀V月日肪k在該植物材料 '細胞、組織或整個植物中的數 量係提高的。 在較佳實施例中，藉由該揭露方法轉形的植物材料、 細胞、_或整個植物進-步包含—或多種手段用於提高 16: 0 - A C P在該植物材料、細胞、組織或整個植物中之水平。 在某些實施例中，用於提高16:G_ACp在該植物材料、細胞、 組織或整個植物中水平之手段可能為：__f體外去飽和酶 之表現；KASII之抑制’舉例而言，藉由在該灿堪因中引 入一突變；及/或減少該16 : 〇脂肪酸之延長，舉例而言， 藉由在該为办7基因中引入一突變。 於此揭露方法可能，舉例而言，在擬南芥屬之植物上 或植物材料其衍自於擬南芥屬之植物上執行。一特別之實 施例係描寫用於創造或再生一遺傳工程植物之方法，該者 在包含以S E Q ID Ν Ο : 1核酸分子轉形之植物材料的該植物 中包含提高數量之稀少脂肪酸，相較於同一物種之野生型 植物；及培養該轉形植物材料以獲得一植物。藉由前述方 法獲得之植物、植物材料、植物細胞及種子亦為揭露的。 201207110 II.縮寫 X ： yAz 脂肪酸其含有x碳且在從羧化端數來z 位k含着y雙&者 ACP 醯基載體蛋白 COA 輔酶A KASII β-酮基醯基-ACP合成酶Π FA 脂肪酸 FAS 脂肪酸合成 FAME 脂肪酸甲基酯 WT 野生型 III.術語 脂肪酸：如於此所使用，該術語『脂肪酸』意指不同 鏈長之長鏈脂肪酸(烷酸），約從C12至C22，儘管較長與較 短鍵長之脂肪酸兩者都係知悉的。脂肪酸之結構係由該標 示法所表示，X : W，其中“x”係為在該特別脂肪酸中碳y) 原子之總數目，而“y”係為從該脂肪酸之幾化端數來在該碳 鏈中於該位置“z”中之雙鍵數目。 目的’稀少脂肪酸係 變體去飽和酶酵素修 稀少脂肪酸：為了達成本發明之 為那些在天然系統中其合成係藉由— 飾FAS之一中間物而引起的。 的-系列化學反應，由酵素催化^在-細胞内發生 成，或另-代謝賴之引發。—代2〜代謝產物之形 許多步驟，且可能與不同代謝能涉及數個或 同樣地…代謝途徑之產物可纟A的反應受質。 代謝工程：為了達成本發明:目的=謝途徑之受質。 策略之合理設計以修改在一細胞中之〜代謝工程』意指 或多個代謝途徑，藉 10 201207110 由此’逐步修飾一起始物質成為具有確切所欲化學結構之產 物係在該細胞内運行之總代謝途徑的整體方案中實現的。 去飽和酶：如於此所使用，該術語『去飽和酶』意指 一種多肽其能在一或多個脂肪酸中去飽和（即引入一雙鍵) 父產生所關注之脂肪酸或前驅物。植物可溶性脂肪酸去飽 2轉酵素將一雙鍵部位特定地引入至-飽和醯基-ACP受 貝。該反應涉及藉由一兩電子還原的二鐵中心活化分子 氧，形成該去飽和酶構造核心之該二鐵中心係由四螺旋束 配位的。於此特別關注的係為Δ9去飽和酶。 ，違Δ9-18 : O^ACP去飽和酶是所有植物維持細胞膜流動 斤要求的。雖然此酵素主要去飽和硬酯醯基，其對 棕櫚醯基-ACP亦具有較小程度之活性。 a變體去飽和酶：如於此所使用，該術語『變體去飽和 3括那些去飽和酶其展示特定的活性量變曲線一致於 製造稀少脂肪酸中之-角色。-變體㈣和酶可能從生物 體中單離，或經由-定向演化計晝建造的。 後代植物.為了達成本發明之目的，『後代植物』意指 由此獲得之任何植物或植物材料，該等者可能藉由植物育 種方法，传。植物育種方法在該技藝中係廣為知悉的，包 括天…、月種、人J1育種、涉及聰分子標記分析的選擇育 種、基因轉殖及商業育種。 植物材料：如於此所使用，該術語『植物材料』意指 從植物獲得之任何細胞或組織。 核西夂刀子.一種聚合性形式的核普酸，其可以包括正 201207110 義與反義股RNA、cDNA、基因組DNA、及以上之合成形式 與混合聚合物。—核苷酸意指一核糖核苷酸、去氧核苷酸 或兩種核苷酸類塑任一種的修飾形式。一『核酸分子』如 於此所使用係與『核酸』及『聚核苷酸』同義的。該術語 包括單股及雙股形式的DNA。一個核酸分子可以包括天然 發生核苷酸與修飾核苷酸兩者任一或兩者，該等者係藉由 天然發生及/或非天然發生的核苷酸連結而連結在一起。 核酸分子可以化學或生物化學修飾地，或可以含有非 天然的或衍生的核苷酸鹼基，該者將為一般技藝人士所輕 易體會的。此種修飾包括，舉例而言，標誌；曱基化；以 一類似物取代該一或多個天然發生的核苷酸；核苷酸間修 飾’諸如不帶電的連結（舉例而言，甲基膦、磷酸三酯 (phosphotriesters)、胺基填酸酯（phosphoramidates)、胺基碳 酸鹽......等等）、帶電連結（舉例而言，硫代磷酸酯 (phosphorothioates) 、 二 硫 代 碟 酸 g 旨 (phosphorodithioates)......等等）、下垂主體(pendent moieties) (舉例而言，肽）、嵌入劑（舉例而言，吖啶、補骨脂 (psoralen)......等等）、螯合劑、烧化劑及修飾連結（舉例而 言’阿法變旋異構核酸……等等）。該術語『核酸分子』亦 包括任何拓撲構形，包括單股、雙股、部分雙鏈、三鏈、 之字形、圓形及掛鎖構形。 操縱連結：當一第一核酸序列與一第二核酸序列係在 一功能關係中時，該第一核酸序列係與該第二核酸序列係 操縱連結的。譬如，一啟動子係操縱連結至一編碼序列假 12 201207110 各该啟動子影響S亥編瑪序 ± , 之轉錄或表現時。當重組製造 時，操縱連結核酸序列一般 „ L 杈係連續的，且必須接合兩蛋白 然而，核酸不需要被連 質編碼區域在相同的閱讀框架中 續地操縱連結。 —调控几素：如於此所使用，該術語『調控元素』意指 核酸好其具有基_控活性；也就是說，具有影響操 I連結可轉錄核酸分子之轉錄或轉譯能力之-者1控元 ^ 』等序列（leaders)、内含子與轉錄終止區 係為非編補酸分子其具有基因馳活㈣，該者在活細 胞之㈣基因表現中扮演不可缺少之-部分。在植物中作 用之單離的調控①素對經由分子卫程技術修飾植物表型因 〜係為有用的。6周控①素』係預期為―系列之核賴其決 定特定基因疋否、何時以及什麼程度的表現。該調控Ο· 序列與調控蛋白質或其他蛋白質特異地交互作用。 如於此所使用’該術語『基因調控活性』意指一核酸 刀子其^響-操縱連結核酸分子之轉錄或轉譯。一個具 有基因調控雜之單離的核酸分子可能提供㈣縱連結核 U子時@或㈣之表現’或調控其表現的程度與速率。 個具有基因調控活性之單離的核酸分子可能包含一啟動 子、内含子、前導序列或3,轉錄終止區。 啟動子：如於此所使用，該術語『啟動子』意指一核 酸分子其涉及了 RNA聚合酶II或諸如轉錄因子（反式作用蛋 白質因子其調控轉錄者）之其他蛋白質的識別及鍵結以引 發一操縱連結基因之轉錄。啟動子本身可能含有子元素， 13 201207110 諸如影響操縱連結基g轉錄之順式元素或增強域。一『植 物啟動子』係為-種在植物細胞巾作㈣原生或非原生啟 動子。一『植物啟動子』可以作為5,調控元素用於調控一操 縱連、”。基s之表現。植物啟動子可能藉由其等之時間、空 間或發育表現模式而界定。於此所描述之該核酸分子可能 包含核酸序列其包含啟動子者 序列同一性：兩個核酸序列之間或兩個胺基酸序列之 間的相似性係於該等序列之間共享的序列同一性程度術語 中表現。序列同一性典型地於同一性百分比術語中表現； 百分比越高’該兩個序列越相似。用於比對序列以比較的 方法係於下文詳細說明。 在一胺基酸序列令類似的位置：核酸及胺基酸序列可 以藉由在下列^又洛中描ϊ述之該等方法而比對。當比對時， 在一個序列中之一位置係與該比對序列之一位置在一類似 位置中，假若該等位置在該共識序列之中係為同一的。 用於比對序列進行比較之方法在該技藝中係廣為知悉 的。各種程式與比對演算法係描述於：Smith與Waterman之 “Adv. Appl. math. 2 : 482，1981” ； Needleman與Wunsch之“J. Mol. Biol. 48 : 443，1970” ； Pearson與Lipmani“Proc.Natl. Acad· Sci. USA 85 : 2444,1988” ； Higgins與 Sharp之“Gene 73 : 237-44,1988” ； Higgins 與 Shai*p 之 “CABIOS 5 ： 151-3，1989” ； Corpet等人之“Nucleic Acids Research 16 : 10881-10890,1988” ； Huang等人之“Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65, 1992”； Pearson等人之“Methods in 14 201207110

Molecular Biology 24 : 307-31，1994” ； Tatiana等人之“FEMS Microbiol. Lett·，174:247-50, 1990”；Altschul等人之“J. Mol. Biol. 215 :403-10, 1990”（序列-比對方法與同源性計算之詳 細考量）。 國家生物技術資訊中心(NCBI)基本局部比對搜尋引擎 (BLAST)可在網際網路上獲得的（於blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) ’該者與序列分析程式結合使用，舉例而言，blastp 與blastn。使用此程式如何決定序列同一性之一說明係可經 由 NCBI 於 blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=

Web&PAGE_TYPE=BlastDocs從網際網路上獲得的。 為了比較胺基酸序列，該BLAST程式之『Blast 2序列』 (bl2seq)功能係使用該預設參數而採用的。特異性參數可以 在一般技藝人士之自由裁量中調整的，舉例而言，對不匹 配提供一懲罰或匹配提供獎勵。 轉形：如於此所使用，該術語『轉形』意指已引入了 諸如一構築之外來核酸分子的一細胞、組織、器官或生物。 該引入的核酸分子可能被併入至該受體細胞、組織、器官 或生物之基因組DNA中，藉由此，該引入的聚核苷酸分子 係由隨後的後代繼承。一『轉基因』或『轉形』細胞或生 物體亦包括該細胞或生物體之後代，及來自採用此一轉基 因植物作為親代之育種計劃所產生之後代，舉例而言，起 源於一外來核酸分子存在之雜交並展示一變化的表型。 IV.系統性代謝工程方法以在宿主細胞、組織或生物體中聚 積稀少脂肪酸 15 201207110 A.概述 本發明之一實施例包括—系統化方法以代謝工程ω_7 月曰肪酸(FA)之聚積’該者’舉例而言，在植物種子中係由 棕櫚油酸(16: Μ)與反u_十八稀酸(v_nie add)(18: ιδ11) 組成。為了舉例說明在質體中用於截取新合成脂肪酸流之 方法Com25’ 一 16.0-ACP去飽和酶其起源於一直接演化 十—X増強。亥藥麻. 〇_去飽和酶之16 : 去飽和酶活 性，該者係於種子特異性菜豆蛋白啟動子控制下表現。任 何種子特異性啟動子可以在於此揭露之該實施例中使用。 此方法提高了 Co-7 FA之聚積，從在野生型（wt)中小於2〇/〇， 至在Com25轉形中約14%。 在進一步之示範方法中，在該雙突變中，該 者在質體與質體外之脂肪酸延長係為損害的，C〇m25之表 現分別造成ω-7 FA聚積提高至約50%。再者，在LTP170啟 動子控制下引入一額外的Com25提高ω-7 FA聚積至約 58% ’暗示可能源自低周轉率的去飽和酶活性限制已被克 服。該菜豆蛋白：Com25構築係於一系列KASII缺乏之背景 中表現，且ω-7 FA含量提高係正比於高達約30%之16 : 0含 量，高達約55%之總co-7FA聚積係觀察到的。有趣的是，轉 基因聚積了 56%之ω-7 FA仍然含有約19%之16 : 0，超過WT 植物者之兩倍。質體外16: 0去飽和酶表現以在16 : 0流至 三醯基甘油途中截流係調查的。在雙突變背景 中，質體與質體外去飽和酶之共同表現伴隨著KASII抑制造 成ω-7 FA提高的聚積從WT中約2%到在最佳工程品系中約 16 201207110 71%，相當於在榮花屬種子所發現者。 ω-7 FAs係被選作為目標，因為如同其他那些稀少FA — 樣’其在自然系統中的合成係錯由一變體去飽和酶酵素修 飾FAS之中間物而起始的。Cahoon等人之“Plant Mol. Biol. 33 : 1105-10 (1997)” ；及 Cahoon 等人之“Plant Physiol. 117(2) : 593-8 (1998)”。此外’ co-7FA做為聚合物原料具有 潛在的商業應用而同時具有類似於天然不飽和脂肪酸之物 理性質。 代謝工程研究係藉由將一先前未報導過的Δ9_16 : 〇_醯 基載體蛋白質(ACP)去飽和酶’ Com25，在一種子特異性啟 動子控制下引入至該模式植物擬南芥中而起始的。藉由突 變背景其含有上升水平之16 : 0的選擇，且藉由構築其係設 計透過影響受質競爭將該碳流轉向至目標脂肪酸的共表 現，將碳流轉向至ω-7 FA之方法係探討的。質體外去飽和 酶酵素係表現以在從該質體輸出後去飽和殘餘的16 : 〇。 質體及質體外去飽和酶之共表現伴隨KASII在該 背景中之抑制導致ω-7 FA從野生型中少於2%至高 達約71%之提高的聚積，高於在馬利筋屬中所發 現者且相當於在#在屬種子中發現者。 ω-7脂肪酸之前驅物，16 : 〇_Acp，係於脂肪酸生合成· 之该第一分枝點，該者係由FatB硫酯酶與尺八§11延長酶所競 爭；且一 I6: 0-ACP去飽和酶之引入使此成為一三向競爭。 KASII與FATB之抑制係為降低對受質之競爭並提高fa 聚積的有效方式。在職主品系巾’ ω_7 FA聚積之提高係 17 201207110 於約30%時飽和的，因為在此水平之上該去飽和酶係限制 的。藉由在一種子·特異性啟動子控制下表現一第二複製提 高了 Com25之劑量，進一步提高ω-7脂肪酸之聚積。然而， 高CO-7FA聚積之種子亦含有範圍約20%水平之16 : 0 ’代表 去飽和質體外16 : 〇之一機會。兩個質體外去飽和酶之表現 提高了該ω-7 FA之聚積，造成16 : 0在成熟種子中大約50% 之減少。 如下文詳細說明，系統性代謝工程可以成為一個成功 的策略以操縱稀少脂肪酸聚積程度媲美於在天然來源中所 觀察到者，因為該最佳的/M7//ae//Cow25/LnA9D與ΑηΔ9ϋ 品系聚積71%之ω-7 FA，本質上高於在馬利筋屬中之水平並 相當於在榮花屬種子發現之水平。 B.核酸 當與SEQ ID NO : 1比對時，在本發明之一些實施例中 的核酸序列顯示提高的同一性百分比。在這些與其他實施 例之中的特異性核酸序列可能包含序列其與SEQ ID NO : 2 ’舉例而言，具有至少有65%、70%、75%、80%、81%、 82%、83% ' 84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100% 之同一性。對一般技藝人士而言，係為不言而明的是該核 酸分子可能在本質上未改變一編碼多肽之胺基酸序列下而 修飾的’舉例而言，根據允許的核苷酸替換其係根據密碼 子簡併者。 在一些實施例中，本發明之核酸分子包含啟動子。啟 18 201207110 動子可能以該載體構築將被插入之細胞類型為基礎而選擇 的。在該項技藝巾，在細®、酵母菌與植物巾作用之啟動 子係廣為知悉的。該等啟動子亦可能以其等之可調控特徵 為基礎選擇的。此種特徵之例子包括：轉錄活性、誘導性、 組織特異性與發育階段特異性之增強。在植物中，啟動子 其係病毒或合成起源之可誘導者、持續活化者、時間調控 者、及空間調控者已被描述的（舉例而言，見p〇szk〇wski等 人之“EMBO J.3 : 2719(1989)” ； Odell等人之“Nature 313 : 810(1985)”，Chau等人之“Science 244 : 17481(1989)”）。 常常使用的持續性啟動子包括，舉例而言，CaMV 35S 啟動子增強的CaMV 35S啟動子、玄參嵌紋病毒(FigWort Mosaic Virus)啟動子、甘露胺酸(mann〇pine)合成酶啟動 子胭知驗(opaline)合成轉啟動子及章魚肉驗(oct〇pine)合 成酶啟動子。 有用的可誘導啟動子包括，舉例而言，啟動子其由水 杨酸或聚丙稀酸誘導者’該者係藉由安全劑(取代苯績醜胺 除草劑)之應用而誘導；熱休克啟動子；硝酸鹽誘導啟動子 其衍自於菠菜硝酸還原酶可轉錄核酸分子序列；激素誘導 啟動子；及光誘導啟動子其與ruBP羧化酶之小的次單元及 LHCP族聯合者。 組織特異性、發育調控啟動子之有用例子等包括該β_ 黄豆伴清蛋白（P_c〇nglycinin)7S啟動子及該等種子特異性 啟動子。在種子質體中較佳表現之有用的植物作用啟動子 包括那些源自在油種子中涉及脂肪酸生合成之蛋白質者， 19 •5- 201207110 及源自植物儲存蛋白質者。此種啟動子之例子等包括源自 如菜豆蛋白、油菜子蛋白（napin)、醇溶蛋白（zein)、大豆胰 蛋白酶抑製劑、ACP、硬脂酰ACP去飽和酶與油體膜蛋白 (oleosin)此種可轉錄核酸分子序列之5,調控區。另一示範性 的組織特異性啟動子係為該凝集素啟動子，該者係針對種 子特異的。 其他有用的啟動子包括胭脂驗合成酶、甘露胺酸合成 酶與章魚肉鹼合成酶啟動子，該等者係運載於農桿腫瘤菌 (Agrobacterium tumefaciens)之腫瘤誘導質體上；玄蔘嵌故 病毒(CaMV)19S與35S啟動子；增強的CaMV 35S啟動子； 玄參嵌J文病毒之35S啟動子；源自核鋼糖_1，5_二碟酸竣化酶 小次單元（ssRUBISCO)的光誘導啟動子；源自煙草之 EIF-4A 啟動子（Mandel 等人之 “piam Mol. Biol. 29 : 995-1004(1995)”）；玉米蔗糖合成酶；玉米乙醇脫氫酶1;玉 米捕光複合體(light harvesting compolex);玉米熱休克蛋白 質；源自擬南芥的幾丁質酶啟動子；LTP(脂質轉移蛋白質） 啟動子；矮牵牛查爾酮(ehalcone)異構酶；綠豆富含甘氨酸 之蛋白質1;馬铃薯塊k儲藏蛋白（patatin);泛蛋白（ubiqUitin) 啟動子；及肌動蛋白啟動子。有用的啟動子較佳地係為種 子選擇性、組織選擇性或可誘導的。種子特異性調控係於， 舉例而言，EP 0255378中討論的。 C.胺基酸序列 當與SEQ ID NO _ 2比對時，根據本發明一些實施例之 胺基酸序列顯示提高的同一性百分比。在這些與其他實施 20 201207110 例之中的特異性胺基酸序列可能包含序列其與SEQ ID NO : 2，舉例而言，具有至少有70%、75%、80%、81%、 82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 100% 之同一性。對一般技藝人士而言，係為不言而明的是該核 酸分子可能在本質上未改變一編碼多肽之胺基酸序列下而 修飾的，舉例而言，根據允許的核苷酸替換其係根據密碼 子簡併者。在許多實施例中，當與SEQ ID NO : 2比對時具 有前述提及序列同一性之該胺基酸序列編碼一多肽其具有 酵素性Δ9-18 : 0-ACP去飽和酶活性。D. Com25之變更：5 突變 本發明之觀點係關注衍自於一親代蓖麻去飽和酶的新 穎遺傳工程去飽和酶。在特定實施例中，該遺傳工程去飽 和酶係為Com25。Com25在下列5個胺基酸位置不同於其親 代蓖麻去飽和酶：]^1148、丁11711、1^118(：、？1791^與0188丁(編 號係根據成熟蓖麻去飽和酶PDB entry 1AFR)。在進一步之 實施例中，該遺傳工程去飽和酶可能包含Com25中這5突變 中之一或多個。舉例而言，一個遺傳工程去飽和酶，可能 在下列該等位置中不同於親代的蓖麻去飽和酶：M114S ; T117R ; L118C ; P179L ; G188T ; M114S與T117R ; M114S 與 L118C ; M114S 與 P179L ; M114S 與 G188T ; T117R 與 L118C ; T117R與P179L ; T117R與G188T ; L118C與P179L ; L118C與G188T ; P179L與G188T; M114S、T117R與L118C ; M114S、T117R#P179L;M114S、T1117RJ%G188T;M114S、 21 201207110 L118C與P179L ; M114S、L118C與G188T ; M114S、P179L 與G188T; T117R、L118C與P179L; T117R、L118C與G188T ; T117R、P179L與G188T ;或L118C、P179L與G188T. E.含有提高水平之16 : 0脂肪酸的宿主 在較佳實施例中，以Com25轉形之宿主細胞或材料可 旎展現提咼的16 : 0脂肪酸水平。宿主細胞可能會出現提高 水平的16 : 〇脂肪酸，舉例而言，藉由降低16 : 〇_ACp在這 些佰主細胞中之代謝。其他·提高16 : 〇脂肪酸在宿主細胞中 水平的方法可以使用的，且這種方法可能會由熟習該項技 藝者透過判斷力行使而選擇。提高16: 〇脂肪酸在宿主細胞 中水平之方法的例子包括但不限於：丨）在宿主細胞中一表 現一質體外去飽和酶；2)抑制宿主細胞中的KASn，舉例而 言，藉由在該ybw基因中引入一突變；及3)減少16 : 〇脂肪 酸之延長’舉例而言’藉由在該加7基因中引入一突變。 F•用於基因轉形植物材料之方法 -本發明亦針對產生_細胞之方法，該轉形細胞包含 或夕個核酸分子其包含至少6〇%相同於SEQ ID N〇 :丄之 —核酸序列。此種核酸分子亦可能包含，舉例而言，非編 馬的調控70素’諸如啟動子等。其他序列亦可能隨著該非 蝙碼之調控元素與可轉錄的核酸分子序列引入至細胞。這 些其他序列可能包括3,轉錄終止子、3，聚腺普酸訊號、其他 非轉錄序列、轉運相轉向序列、選擇標記、增強子及 操作子。 該轉形方法一般包含選擇一合it的宿主細胞、以一重 22 201207110 組載體轉形該宿主細胞、並獲得該轉形的宿主細胞。 用於引入DNA進入細胞之技術對熟習該項技術者係廣 為知悉的。這些方法一般可以分為五類：（1)化學方法 (Graham與Van der Eb之“Virology 54(2) : 536-9(1973)” ； Zatloukal 等人之 “Ann· Ν·Υ· Acad. Sci. 660 : 136-53 (1992)”）；（2)物理方法，諸如顯微注射（Capechi之“Cell 22(2): 479-88(1980)”)、電穿孔(Wong與Neumann之“Biochim. Biophys. Res. Commun. (1982) 107(2) : 584-7” ； Fromm等人 之“Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(17) : 5824-8(1985)” ；美國 專利第5,384,：253號），及粒子加速器（particle acceleration)(Johnston 與 Tang 之 “Methods of Cell Biol. 43(A) : 353-65(1994)” ； Fynan等人之“Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24) : 11478-82(1993)” ；（3)病毒載體(Clapp之“Clin. Perinatol. 20(1) : 155-68(1993)” ； Lu等人之“J. Exp. Med. 178(6): 2089-96(1993)” ； Eglitis與 Anderson之“Biotechniques 6(7): 608-14(1988)”）；（4)受體-媒介機制（Curiel等人之” Hum. Gen. Ther. 3(2): 147-54(1992)” ； Wagner等人之“Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(13) : 6099-103(1992)，’）；及（5)細菌-媒介 機制，諸如藉由農桿菌。或者，藉由直接注入至植物的生 殖器官，核酸可以直接引入到花粉(Zhou等人之“Methods in Enzymology 101 : 433(1983)” ； Hess之“Intern. Rev. Cytol. 107’： 367(1987)” ； Luo等人之“Plant Mol· Biol. Reporter 6 : 165(1988)” ； Pena等人之“Nature 325 : 274(1987)，，）。其他轉 形方法包括，舉例而言，如美國專利第5,508，184號中所例 S- 23 201207110 示之原生質體轉形。該核酸分子亦可能被注入到未成熟之 胚胎（Neuhaus等人之“Theor.Appl· Genet. 75 : 30(1987)，，）。 最常使用的植物細胞轉形方法係為：農桿菌-媒介DNA 轉移法（Fraley 等人之 “Proc. natl. Acad. Sci. USA 80 : 4803(1983)’’)(如例示於美國專利第5,824,877號中；美國專 利第5,591，616號；美國專利第5,981,840號；與美國專利第 6,384,3〇1號），及砲擊(1^〇1丨81^8)或粒子轟擊(111丨0"0口1*0』6(^16 bombardment)媒介法（即基因搶）(諸如描述於美國專利第 5,550,318號中；美國專利第5,538,880號；美國專利第 6,160,208號；美國專利第6,399,861號；與美國專利第 6,403,865號）。典型地，細胞核轉形係為所欲的，但在特異 性轉形諸如葉綠體或澱粉體質體係為所欲時，植物質體轉 形可能會利用粒子轟擊媒介交付所欲的核酸分子至某些植 物品種’如擬南芥、煙草、馬龄薯與芸苔屬物種。 農桿菌媒介轉形係透過使用一種屬於農桿菌屬之遺傳 工程土壤細菌而實現。數種農桿菌物種媒介被稱為 『T-DNA』的特異性DNA之轉移，該者可以遺傳工程將任 何所欲的DNA片段攜帶到許多植物物種中。標記T-DNA媒 介致病機轉方法的主要事件係為：致病力基因之誘導及 T-DNA之加工與轉移。此方法係為許多評論之主題(Ream之 “Ann. Rev. Phytopathol. 27 : 583-618(1989)” ； Howard與 Citovsky之“Bioassays 12 : 103-8(1990)” ； Kadoi“Crit.Rev· Plant Sci. 10 : 1-32(1991)” ； Zambryski之“Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol· Biol. 43 : 465-90(1992)” ； Gelvin之 24 201207110 “Transgenic Plants” Kung與Wu編輯之，Academic出版，聖 地牙哥，頁 49-87(1993) ; Binns與Howitz之“In Bacterical Pathogeneis of Plants and Animals” Dang編輯，柏林： Springer Verlag，頁 119-38(1994) ; Hooykaas與Beijersbergen 之“Ann. Rev. Phytopathol· 32: 157-79(1994)，，； Lessl與Lanka 之“Cell 77: 321-4(1994)” ；Zupan與Zambryski之“Annual Rev. Phytopathol. 27 : 583-618(1995)”）。 不管轉形方法學’為了選擇或標示轉形的植物細胞， 引入細胞之該DNA可能含有一基因其在再生植物組織中作 用以產生一種化合物，該者賦予植物組織對一否則有毒性 之化合物之抗性。使用做為一可選擇 '可篩選或可標示標 §己的感興趣基因包括但不限於，GUS、螢光蛋白質（GFP)、 螢光素酶及抗生素或除草劑耐受性基因。抗生素抗藥性基 因之例子包括基因其賦找藥性針躲#齡、康黴素(及 新黴素、G418、博萊黴素（ble〇mydn));甲氨蝶呤 (methotrexate)(及甲氧苄氨嘧啶(trimeth〇prim));氣黴素；及 四環黴素。舉例而言’草甘膦抗藥性可能藉由—除草劑抗 藥性基因而賦予的。Della_CiGppa等人之“BiG/Teehn〇1〇gy 5 · 579-84(1987)。其他亦可以履行之選擇元件包括但不限 於’對草胺膦⑽叫心她如十雜草⑼柳㈣之财受 性、及正向選擇機制，J〇ersbr〇等人之“m〇i B⑽d 4 : 111-7(1998)” ’且係、視為在本發明之發明範圍之内。 藉由選擇與筛選而鑑定並在支持再生之—適當介質中 培養的該轉形細胞然後可能容許其成熟成植物。 25 g. 201207110 本揭露方法可能使用任何可轉形之植物細胞或組織。 該等可轉形之細胞與組織，如於此所使用，包括但不限於 那些能夠進-步繁衍以產生一植物之細胞或組織。熟習該 項技藝者認識-些植物細胞或組織中其在插人外源DNA後 係為可轉㈣’且在適當的培養條件下該植物細胞或組織 可以形成一個分化的植物。適合這些目的之組織可以包括 但不限於，成熟的胚胎、胚盤（scutellar)組織、懸浮細胞培 養、未成熟花序'莖分生組織、節點外植體、癒合組織、 胚軸組織、子葉、根與葉。 從轉形植物原生質體或外植體再生、發育並培養植物 在該項技藝中係為知悉的^ Weissbach與Weissbach之 "Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.) Academic

Press，Inc.，San Diego, CA(1988)，，； Horsch等人之“Science 227 : 1229-31(1985)”。此再生與生長過程典型地包括選擇 轉形細胞，及培養這些細胞經過正常的胚胎發育階段、經 過該紮根小植株階段之該等步驟。轉基因胚胎及種子係類 似地再生。在此方法令，轉形物一般係於一選擇性培養基 存在下培養的，該者選擇成功轉形之細胞並誘導植物芽之 再生。Fraley 等人之“Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 : 4803(1993)”。這些芽等典型地係於二至四個月之内獲得 的。該所得到的轉基因發根小芽此後係種植在一適當的植 物生長培養基中’諸如土壤。細胞其從一選擇劑之曝露中 存活者’或細胞其已在一篩選分析中標示陽性者可以在支 持植物再生之一培養基中培養。該等芽然後可以轉移至— 26 201207110 適當的根料培養基巾，該培養基含有該選擇劑及—抗生素 、防止、”®g生長。该等芽中許多會發育根。這些然後係移植 至土壞或其他介質，以料該等根系之持續發育。該方法， 如上所练述，一般將依據所採用的特定植物株而變異，且該 特殊之方法學因此係於―般技藝人士之判斷力之中。 該專再生的轉基因植物可能為自花授粉以提供同源的 轉基因植物。或者’從該等再生轉基因植物獲得之花粉可 能與非轉基因植物雜交，較佳的，重要農藝品種之自交品 系。相反地，源自非轉基因植物之花粉可能使用以授粉該 等再生的轉基因植物。 該等轉基因植物可能將該轉形核酸序列傳遞給其後 代。針對該轉形的核酸序列，較佳地，該等轉基因植物係 為同源的，且根據有性生殖之結果傳送那個序列給其所有 的後代。後代可能從由該轉基因植物產生之種子生長的。 這些額外的植物然後可能自花授粉以生成一真正的植物育 種品系。 源自這些植物之該等後代除了別的之外可能就基因表 現進行評估的。該基因表現可能藉由數種常見的方法偵 測，諸如西方墨點法、北方墨點法、免疫沈澱及EUSA(酵 素結合免疫吸附分析法）。該等轉形植物亦可能針對該引入 之DNA之存在與表現水平及/或由本發明之該核酸分子及 胺基酸分子賦予的脂肪酸量變曲線分析的。熟習該項技藝 者知道許多可用於分析轉形植物之方法。舉例而言，用於 植物分析之方法包括但不限於，南方墨點法或北方墨點 27 201207110 法、PCR為基礎的方法、生化分析、表型篩選方法、田野 評估及免疫診斷分析法。 用於特異地轉形雙子葉植物之方法對熟習該項技藝者 係廣為知悉的。使用這些方法轉形並再生植物已於一些作 物中描述的，包括但不限於，擬南芥屬之植物成員、棉花 ⑽扣衍）、大豆（Glycine max)、花生 及芸苔屬之成員。用於轉形雙子葉植物，主要藉 由使用農桿腫瘤菌，並獲得轉基因植物之方法已針對棉花 發表的（美國專利第5,004,863號；美國專利第5，159,135號； 美國專利第5,518,908號）；大豆（美國專利第5,569,834號； 美國專利第 5,416,011 號；McCabe 等人之” Biotechnology 6 : 923(1988)” ； Christou 等人之，，Plant Physiol. 87 : 671_4(1988)”；芸苔屬（美國專利第5,463，174號）；花生(Cheng 等人之”Plant Cell Rep. 15 : 653-7(1996)” ； McKently等人之” Plant Cell Rep· 14 : 699-703(1995)，，）；木瓜；及豌豆（Grant 等人之” Plant Cell Rep. 15 : 254-8(1995)，，）。 用於轉形單子葉植物之方法在該項技藝中亦是廣為知 悉的。使用這些方法轉形並再生植物已於一些作物中描述 的’包括但不限於’大麥;玉米（Zea ’ 热麥(Jve⑽扣"·^);果園草⑷； 稻米（0_)ί/να，包括秈稻與粳稻品種）；高粱（心rg/mm bicolor),甘庶 sp)；高羊茅（FeWwca ’ 卓坪卓品種（例如、尸⑽ pratensis ' Stenotaphrum secundatum) Ϊ 小麥（7W"_cwm 28 201207110 沉扣’vwm);及苜蓿（她必⑶奴扣以似）。對熟習該項技藝者而 言，為了使任何有興趣之目標作物產生穩定的轉基因植 物’係為明顯的是許多轉形方法可以使用並修改的。 任何植物可能被選擇使用在本揭露方法中。根據本發 明，用於修飾之較佳植物包括擬南芥（々以/心少也 '琉璃复（琉璃苣屬物種(丑Spp.))、芥花籽油 (Canola)、兔麻commwm\s)、可可豆（TTieoiromfl cacao)、玉米（Zect 、棉花（Goiiypz’w/w spp)、海邊芥蘭 屬物種spp.)、克非亞草屬物種spp.)、亞麻 (亞麻屬物種(Lhwm spp.))、雷斯克勒屬（ze叫邮re/k)物種與 澤花屬物種、亞麻籽(Linola)、金蓮花（金蓮花 屬物種（7Vopaeo/Mm spp·))、月見草屬物種（〇em^era spp.)、 撖欖（木犀屬物種(〇/⑽Spp.))、棕櫚（油椰子屬物種(五 SPP.))、花生（落花生屬物種spp.))、油菜軒、紅花（紅 花屬物種(Cari/m/wi/ί spp.))、大豆（大豆亞屬（G^cz.we)與黃豆 亞屬〇So»物種）、向曰葵(向曰葵屬物種认WJ spp ))、 煙萆(煙萆屬物種(Nicoiiana spp.))、斑鳴菊屬物種(yernonia SPP·)、小麥(小麥屬物種(7Wi/cww spp.))、大麥(大麥屬物種 spp_))、稻米（水稻屬物種(ΟγΩ spp.))、燕麥(燕 麥屬物種(如^⑽Spp.))、高粱（高粱屬物種($org/2_ spp ))、 黑麥(黑麥屬物種(Seca/espp.))，或其他禾本科成員。 對熟習該項技藝者而言，為了自任何有興趣之目標作 物產生穩定的轉基因植物，係為明顯的是許多轉形方法可 以使用並修改的。 29 S, 201207110 G.轉基因種子 在本發明之一些實施例中，一轉基因種子其包含一多 肽’該多肽包含一胺基酸序列其至少有9〇%相同於SEQ N〇: 2。在這些與其他實施例中，該轉基因種子包含一核 酸序列其至少有60%相同於SEQ ID NO : 1。在某些實施例 中，本發明之該種子展現提高的稀少脂肪酸水平，舉例而 言，ω·7脂肪酸，諸如16 : 1△丨9及/或18 :丨△丨丨。該種子可以 從可繁殖的轉基因植物收穫的並被使用以生長此發明之轉 形植物的後代子代，包括雜種植物品系其包含根據本發明 之一核酸序列及另一有興趣之基因或核酸構築。 下列之該等例子係提供以例示某些特定的特徵及/或 實施例。這些例子不應該解釋為限制本發明於該等描述之 特定特徵及/或實施例。 實施例 實施例I :材料與方法 植物生長及轉形 擬南芥屬植物係於Ε7/2ΤΜ控制的環境生長室（c〇nvir〇n) 中連續暴露於300微愛因斯坦光線（1微愛因斯坦=1摩爾光） 下生長在土壤中。該等植物係根據Ci〇Ugh與Bent之方法轉 形的，Clough與Bent之“Plant J. 16(6) : 735-43(1998)”，該 者係使用農桿腫瘤菌菌株GV3101。我們藉由螢光發射鑑定 了攜帶該轉基因之個別Tl種子，Stuitje等人之“plant Biotechnol. J· 1(4广301-9(2003)”，該者係取決於源自連結 一 25A紅色相機濾鏡之X5 LEDtm手電筒（In〇va)之綠光照 30 201207110 明。Pidkowich等人之“Proc. Natl. Acad. Sci· USA 104(11): 4742-7(2007)，，。配備Olympus U-LH100HGTM之一WILD™ M3Z解剖顯微鏡照明系統係藉由FITC 535與FITC 515濾鏡 分別之使用以區分種子其攜帶Zs-綠色與Ds-紅色標記者。 種子-特異性表現係藉由放置一種子-儲存蛋白質啟動子或 LTP170啟動子控制之構築而實現。Slightom等人之“Proc. Natl. Acad. Sci· USA 80(7) : 1897-1901(1983)” ；及van der Geest與Hall之“Plant Mol Biol. 33(3) : 553-7(1997)”。

Co/w25之來源

Com25係為蓖麻之Δ9-18 : 0-ACP去飽和酶之一變體， 其係起源於一重組飽和突變誘發/選擇計晝，該者係設計以 鑑定變體其具有朝向醯基鏈長度小於18C之改良活性者。 Whittle 與 Shanklin 之 “J. Biol. Chem. 276(24): 21500-5(2001)”。Com25在以下5個胺基酸位置不同於其親 代蓖麻去飽和酶：；\41148、丁11711、1^118(：、？1791^與0188丁(編 號係根據該成熟蓖麻去飽和酶P D B登錄1A F R者）。 質體構築

Phas: Com25。蓖麻變體Com25之整個開放閱讀框架， 該者係建造以含有有效的轉運肽(transit peptide)且由5’PacI 與3 ’Xhol限制位包夾，係選殖到質體pDs-Red-Phas的相應位 置，Pidkowich等人之“Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11): 4742-7(2007)”，（具有Ds-Red標記）以創造Phas : Com乃（第 5 圖）。

Phas : CowZ5, LTP170 : Com乃。該LTP170啟動子係使 31 201207110

用引子 P17-5’BamHI(GGGATCCCCGGGTTGACATTTTTA CCTTTTT ； SEQ ID NO : 3)與 P17-3，PacI (GGTTAATTAAGTCTTCAAACTCTAGGA ； SEQ ID NO ： 4) 從擬南芥基因組DNA放大的，在單離該BamHI-PacI片段前 次選殖至一 Pgemt-Easy ’該BamHI-PacI片段係選殖至 pDs-Red-Phas : Com25 (在上文描述的）相對應位置以創造 pDs-Red-LTP170 : Com25。含有Com25與菜豆蛋白終止子 之一片段係使用BamHI與EcoRV切除並選殖至在 pDs-Red-LTP170-Com25 載體之内的該 BamHI 與 Smal 限制 位中以創造Phas : Com25/LTPl70 : Cow乃（第 5圖）。

Phas : 。此構築係於兩步驟中創造的，首先係 為該Phas :仏诏-那之構築，及事後該化诏基因之反義部分之 插入以取代隔開包含該之字形(hairpin)之尸如5基因的正義和反 義部分之該内含子。為了實現此一點，150 bp的擬南芥 /^5 3’UTR係從基因組DNA放大正義(使用引子FatB-hps-5，PstI GGGCTGCAGAAACAAGTTTCGGCCACCAACC C ； SEQ ID NO ： 5 與FatB-hps-3’XhoI CCCCTCGAGACATCAGAATTCGTAATGAT ; SEQ ID NO : 6)，及放大反義（使用引子FatB-hpa-5’NheI GGGGCTAGCAAGTTTCGGCCACCAAC CC ; SEQ ID NO : 7與 FatB-hpa-3’PacI CCCTTAATTAAACATCAGAATTCGTAATGAT ; SEQ ID NO: 8)兩者方向。這些片段係以Pstl/Xhol與Nhel/PacI 限制且使用以在其相等位置替代pGEM-T-Easy-HTM3中該 FaW之5’UTR正義與反義部分，Pidkowich等人之“Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11) : 4742-7(2007)”，以創造該中間物 32 201207110 質體pGEM-T-Easy-HTM4。為了創造一30(^?的尸&18編碼區 域之反義部分，一片段係以引子FatB-Exon-5’Sp-Bam (CCACTAGTGGATCCACCTCTGCTACGTCGTCATT； SEQ ID NO : 9) 與 FatB-Exon-3’Bg-Sal (GGAGATCTGTCGACGTAGTTATAGCAGCAAGA AG ； SEQ ID NO: 10)放大的，且以BamHI與Sail限制之該片段在 以Bglll與Spel限制之後係使用以替代部分的該内含 子，以創造pGEM-T-Easy-HTM5 0 該組合之HPAS片段係藉由使用PacI與Xhol切除並選 殖至pZs-Green-Phas : CowM (質體pDs-Red-Phas : ， 如上文所描述，在其中該螢光標記pCVMV : Ds-Red已由一 綠色螢光蛋白質標記pCVMV : Zs-Green™ (Clonetech)替代) 之相等位置中以創造質體Phas : FatB-HPAS(第5圖）。

Phas : AnD9d，Phas : LnD9D。兩個真菌酿基-輔酶A D9 去飽和酶係結合於質體pDAB7318中，伴隨兩基因皆由源自 菜豆(外似⑼/⑽vM/gani)之種子特異性Phas啟動子驅動。在 該構築中之第一基因係為源自小巢狀麴菌 之一酿基-辅酶ΑΔ9-去飽和酶，該者係針對在植物 中最理想的表現而重新設計與合成（美國專利申請案 2〇080260933Α1)，並融合至源自菜豆之菜豆蛋白基因的3’ 非轉譯區域與3’MAR。在此一構築中之該第二去飽和酶基 西係為係為源、自小參辕枯病病盡(^Lsptosphaey'ici nodof'uift') 之一酿基輔酶A A9-去飽和酶，該者係針對植物表現重新設 計與合成，並融合至該農桿腫瘤菌ORF23之.3'非轉譯區《此 33 201207110 去飽和酶係由哈佛與MIT布洛德研究所^ "www.broad.mit.ediO之該小麥潁枯病病菌定序計晝所釋放 出的S. nodorwm基因序列的同源性搜尋所鑑定的。藉由啤酒 酵母菌cereWi/ae)之o/ei突變互補，該者顯 示對棕櫚酸酯之去飽和具有一偏愛。Phas : AW-HPAS-Phas : Com25。為了簡化基因疊加實驗，質體 Phas : Fa67/HPAS-Phas : Cow25係構築以結合Com25之表現 與KASII之抑制。為了實現這一目標，該菜豆蛋白終止子係 從Phas : Com25單離並選殖到該中間物載體pBL，伴隨含有 菜豆蛋白啟動子驅動之Com25的該EcoRV-EcoRV片段，以創 造PBLPHAS : Com25PhasTer。此Com25表現匣係使用包夾 的EcoRI-EcoRI限制位切除並選殖到Phas : / -ΗΡΑ中之相 應位置以創造Phas : i^W-HPAS-Phas-Cow25。見第5圖。 脂肪酸分析 為了分析單一種子之脂肪酸，脂肪酸曱基酯（FAMEs) 係藉由在甲醇中以0.2M之三甲基氫氧化鎚培養而製備。 Butte等人之“Anal. Lett· 15(10) : 841-50(1982)”。為 了類似 地分析散裝bulk種子，FAMEs係藉由在在0.5 mL BC13中於 80°C下培養該種子1 h而製備，以1 mL正己烷提取，且然後 在N2之下乾燥。FAMEs係以配有60-m X 250-M SP2390毛細 管柱(Supelco公司）之HP6890™氣相色譜儀火焰離子化檢測 器（安捷倫科技)或HP5890™氣相色譜質譜儀（惠普）分析。在 分析期間該烤箱溫度係以15 °C /min從100T：上升至240°C， 伴隨1 · 1 mL/min之一流速。質譜係以一 HP5973TM質譜檢測 34 201207110 器（惠普）執行。藉由二甲基硫醚衍生化，我們確定了單不飽 和FAMEs雙鍵的位置。Yamamoto等人之”Chem· and Phys. Lipids 60(1) : 39-50(1991)”。 實施例II :在WT擬南芥中之表現 數種植物已被報導在其等之種子中聚積ω-7 FA，包括 馬利筋屬 ’ Hopkins與Chisholm之“Can. J. Biochem. Physiol. 39 : 829-35(1961)” ；及#花屬，Chisholm與Hopkins之，，J. Am_ Oil Chem. Soc. 42 : 49-50(1965)”。基因其編碼負責合成棕 櫚油酸酯之該去飽和酶酵素者已被單離出。該相應的重組 去飽和酶酵素之活性，Cahoon等人之“植物Mol. Biol. 33 : 1105-10(1997)” ； Cahoon 等人之“Plant Physiol. 117(2): 593-8(1998)” ’如許多變體去飽和酶者，低於那些被報導之 原型硬脂酰-ACP去飽和酶。whittle與Shanklini“J.Biol. Chem· 276(24): 21500-5(2001)”。我們比較了馬利筋與榮花 屬去飽和酶及數種蓖麻去飽和酶變體之表現效果，包括源 自蓖麻品種5.2及源於定向演化實驗其提升該蓖麻Δ9_18: 〇_ 去飽和酶在擬南芥中之16 : 〇去飽和酶活性的匚00125， Whittle 與 Shanklin 之 “j. Bi〇1 chem. 276(24): 21500-5(2001)”，Bondaruk 等人之“Plant Breeding 126 : 18694(2〇07)’’，提高了 16 : 1Δ9之聚積與其延長產物，18: 1Δ11 ’在WT擬南芥中從未轉形植物勉強可偵測程度分別至 約2%與約12% ’在C〇m25轉形物中產生了總共約Μ。/。之 ω-7。第2Α圖；第2Β圖。 表1顯不’對於I6 : 〇_ACp受質，雖然c〇m25超過蓖麻 35 201207110 WT(2.8 min·1)具有一個改良許多的kcat (11.1 min·1)，其變得 不及於ϋ麻變體5·2所報導者（25·3 min-1)。Whittle與 Shanklin之“J. Biol· Chem. 276(24) : 21500-5(2001)”。然而， 對於16:0-八0?’0〇11125之〖111(0，12]^)係4.6倍低於蓖麻變體 5.2(0_55)者且42倍低於葱麻'\^丁(5.0)者。對於(；〇11125，該所 得到之16 : 0-ACP受質的特異性因子91 ΜΓ1 . min-1係大約為 蓖麻變體5.2之兩倍及蓖麻WT之163倍。事實上，C〇m25之 與16 : 0-ACP特異性因子係相當於蓖麻WT與天然的18 : 0-ACP受質者(92 M·1 . min·1)。對於 16 : 0-ACP，Com25相 對於蓖麻變體5.2之改良暗示了其與FatB及KASII對受質之 競爭更有效率地’該者提供了一個解釋，為何其表現促進 了高於蓖麻變體5.2的ω-7 FA聚積，儘管其較低的Kcat。 蓖麻去飽和酶及其變體與不同受質之動力學參數。 特異性因子 酵素 受質 kcat Km ^cat/Km Min'lb μΜ μΜ'ηΰη·1 c〇m25 16 ： 0-ACP 11.1 (0.6) 0-12(0.03) 91 5.2 16 ： 0-ACP 25.3 (1.1) 0.55 (.06) 46 WT 16 ： 0-ACP 2.8 (0.1) 5.0 (0.5) 0.56 WT 18 ： 0-ACP 42.3 (1.6) 0.46 (0.05) 92 表1 實施例IV :在含有提高的16 : 0水平之宿主中表現Cow25 在WT擬南芥中，脂肪酸係透過ACP支線至16 : 0-ACP 水平之一第一分支點重新合成。第1圖。假若由FATB作用， 该掠櫚醯基硫酯酶，16 : 〇自由脂肪酸係從質體釋放到其酯 化成辅酶A的細胞質中，且隨後轉酯化到内膜系統的磷脂 36 201207110 上。或者’ β-酮基醯基-ACP合成酶n(KASII)將大部分16 : 0-ACP延長至18 : 0-ACP，據此，其由Δ9-硬酯醯基-ACP去 飽和酶去飽和以產生油醯_ACP。FATA，該油醯-ACP硫酯 酶釋放油酸’該者離開該質體且，如棕櫚酸酯，變成激活 的輔酶A-硫酯’並轉移到該填脂。在ER中，油酸酯可以透 過該脂肪酸延長酶（FAE)I延長至10 : 1Δ11，或由FAD2與 FAD3之作用連續地去飽和以分別地產生亞麻酸或亞麻酸。 16 : 0-ACP係為FA合成途徑中較早的代謝物，藉由其 去飽和為16 : 1A9-ACP，該者可以提交至ω-7的生產。為了 實現這一目標，在一種子特異性啟動子控制下表現一質體 Δ9-16 : 0-ACP-特異性去飽和酶之可行性係探討的（見第1圖 (反應1))。 如上所述，β-酮基醯-ACP合成酶n(KAS II)將16 : 0-ACP延長為18 : 0-ACP。所以，具有降低KASII活性之品 系係尋找的’該者將含有提高水平的16 : 0受質。第2圖顯 示種子FA甲基酯之代表性GC線。儘管許多突變誘發係掃 瞄，只有/aW—個突變已被報導，james與D〇〇ner之“Theor, Apple Genet. 80: 241-45(1990)，，，該者在葉子與種子中展示 提高的16:0水平，其相較於WT中約10%，含有約21%的16 : 0，如第2c圖所顯示；及表2。生化證據顯示，該ybw損害係 於KASII中，因為在該突變中其活性係降低的。carlsson等 人之“植物J. 29(6) : 761-70(2002)”。在/αό7 中表現Com25提 高16 : 1Δ9與18 : 1Δ11之聚積分別至約23%與約16%，產生 了總共約39%之ω-7 FA。第2D圖與表2。取決於Com25在該 37 201207110 /M7-i背景中之表現，此ω_7 FA之大大提高與成熟種子中 16 : 0之總聚積有關聯’並可能起源於與KASIW16 : 〇_Acp 受質競爭減少的結果。 我們亦將該突變與結合了，由於其在質體外 C18至C20脂肪酸延長之缺陷，進一步提高16 : 〇脂肪酸的 數量，並簡化了分析。該未轉形之雙突變含有約9%的ω-7 脂肪酸，大概是反映提高的16 : 0-ACP去飽和，該者係在提 高16 : 0-ACP的受質水平下藉由Δ9_18 : 〇_acp去飽和酶。 第2E圖；及表2。CowM在f之表現造成16 : 1Δ9 與18 : 1Δ11分別提高至約26%、約23%，產生ω-7 FA約50% 之一提高。第2F圖；及表2。 從上面的結果，16 : 1在/與種子中提高的 聚積與提高16 : 0有關，且所以我們尋找表現Com25之品系 在其中16 : 0水平係高於該/aW/ybei雙突變者。兩種這樣的 突變最近係報導的，在其中痛被抑制的，一個由髮夾 (HP)RNAi，Pidkowich等人之“Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11) : 4742-7 (2007)”，另一者由一新穎的抑制方法， 稱之為髮夾的反義（HPAS)RNAi，Nguyen與Shanklin之” Journal of the American Oil Chemists Society 86 : 41-9(2009)”。這些品系分別含有強烈上升的種子16 : 0聚積 水平為42%與46%。第3圖。以Com25轉形在兩者事例中進 一步產生約5% ω-7 FA之提高。表2。因此’在低水平16 : 0 中提高16 : 0聚積係為C〇m25去飽和作用提高之前兆’該者 係由ω-7 FA中正比之提高而證明的，但此種反應在超過30% 38 201207110 一點點時顯然是飽和的，因為在宿主其聚積42%或46% 16: 0者其在co-7FA聚積表現上之間係沒有差別的。第3圖。 非意欲受任何特定學說之約束，係為可能的是除了受質之 外的因子，換言之去飽和酶的數量及/或還原劑的可獲得性 成為這些轉基因的限制。 近來’一T-DNA剔除對偶基因，/aW-2係被描述其在該 異型合子具有提高的16: 0水平；然而，該同源合子係顯示 為胚胎致死的。Pidkowich等人之“Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(11) : 4742-7(2007)”。我們假設該致死的表型是不 飽和脂肪酸降低的結果’並推論說，在此品系中表現C〇m25 可賦予活力。相反的’該雙突變在同源合子狀態 下係為可活的，且在生長及發育階段係無法與WT區分的。 所以’我們使用該fabl/fael雙突變作為後續實驗之一實驗 主體。 實施例V :提高Com25基因劑量導致提高的ω-7聚積 原型乾麻Δ9-18 : 0-ACP去飽和酶具有42 min-1之一 kcat ’ Whittle 與 Shanklin 之 “J. Biol. Chem. 276(24): 21500-5(2001)” ；該者係高於Δ9-16 : 0-ACP去飽和酶所報導 之那些數倍。Cahoon 等人之 “Plant Mol. Biol. 33 : 1105-10(1997)” ；及Cahoon等人之“Plant Physiol. 117(2): 593-8(1998)”。雖然此週轉係相當於類似的鐵依賴氧化反 應，諸如細胞色素P450，這些速率係低於許多代謝酵素(在 許多事例級數等級之強度）。該去飽和酶之低週轉率迫 使高程度的蛋白質表現以為了負責儲存在種子中之大部分 39 201207110 之礙的去飽和作用，提高了去飽和酶酵素之數量可能抑制 ω-7聚積之該可能性。為了驗證此假說，C〇m25係建造於— 種子特異性LTT】70啟動子（該者控制一種子貯藏蛋白質之 表現)控制之下，並與上文描述之該菜豆蛋白驅動C〇mZ5構 築一起共表現的。在該/«67//從7背景中於菜豆蛋白及 LTP170啟動子控制下之Com25的共表現造成c〇-7FA聚積從 約50%至58%之一提高；在該16 : 1Δ9中之提高（約6%)係大 於18 : 1A11者（約2%)。在c〇-7FA聚積之此提高係為中度 moderate的，暗示在表現兩種構築之種子中Com25可 能不受限的。 旨肪酸 植物^\ 16:0 16:1Δ9 16:2 18:0 18:1Δ9 18:1Δ11 18:2 18:3 20:0 20:1 總ω7 Δ WT 10.4±0.4 0.1±0.06 0 3.7±0.4 14.5±2.2 1.7士 0.2 26.6±0.9 20.2±1.1 2.1±0.3 20.7±0.6 1.8±0.2 fabl 20.8±1.6 1.5±0.5 0 3.7±0.4 18.4土 1.3 2.8±0.9 14.8±2.7 19·1 土 1_3 3.1±0.8 15.8±1.0 4.3 土 1.3 2 fabl, fael 26.8±1.9 1.9±0.3 0 3.6±0.5 15.&tl.5 6.8±0.8 25.3i2.5 19.7±1.5 0.2±0.1 0 8·7±1.1 4 WT, Com25 9.2±1.5 1.6±0.4 0 3.7±〇.3 5.7±1.6 12.8±1.2 26.6±1.6 29.6±2.2 2.1±0.4 8.7±2.1 14.4±ϊ.5 12 fabl， Com25 18.6±2.1 23.5±3.7 1.6±0.5 l.ftt〇.3 2.9±2.2 15.6±3.3 9.6±1.7 17.1 士 1·8 1.α±Ό.4 8.2±3.4 39.1 土 1·9 35 fabl, fael Com25 22±2.6 26.2±2.9 2.0±0.4 1 8±0.4 3.7±1.1 23.4±2.3 8.6±0.7 12.4士 1.8 0 0 49.6±1.1 41 fabl, fael Com25 Fabl-HPAS 20.7±2.1 30.3±1.6 2.2±0.2 〇.9±0.6 4.7士 1.4 24.5±1.8 6.6±0.9 1Q±1.6 0 0 54.8±1.5 5 fabl, fael Com25, com25 20.8ii).8 32.5±1.7 2.5±0.4 〇.5±0.2 1.9±0.7 25.5±1.2 5.7士 1.7 11 士 1.3 0 0 58±1.3 8 fabl, fael Fatb-HPAS 23.1±1_5 4.2±0.6 0 2.9±0.8 36.1±3.9 5·1土1.7 14.8±1.5 13.9±2.3 0 0 9.3±2.0 1 fabl, fael Fatb-HPAS Com25 19.1±1.3 26.7±2.1 0 4.8±1.1 28.9±2.3 7.8±1.6 10.&42.4 0 0 55.6±1.8 6 趾1，fael AnA9D,LnA9D 12.7±2.1 17.9±1.8 〇.8±〇.l 〇.2±0.1 17.7±0.9 5.8±0.7 24.1 士 1.2 20.8±0.9 0 0 23.7土 L9 15 fabl, fael Fabl-HPAS Com25 AnA9D,LnA9D 11.2±1.3 43.4±3.3 〇.7±0.5 〇.ftt〇.2 4.6±1.5 23.2±1.1 8.4±1.2 7.6±1.6 0 0 66.6±3.9 12 榮花屬 18.0±0.5 54.6±1.7 2.4±0.5 2.0±O.l 1.8±0.2 17.3 土 1.5 3.9±0.7 0 0 0 71.9tl.3 n/a 表2 實施例VI :質體外Δ916 : 0去飽和酶之表現提高ω7 FA的聚積 如先前所討論，使用背景擬南芥其聚積高水平16 : 0者 40 201207110 取決於一 16 : Ο-ACP去飽和酶之表現與ω-7 FA之形成有關 聯’但該16 : 0許多還是離開該質體且聚積在種子油中。見 表2。所以，兩種降低16: 〇在種子中聚積的方法係考量的。 一種策略係為降低從16 : Ο-ACP分開成16 : 0之該棕櫚酸硫 酯酶FATB的活性（第1圖）。透過HPAS-RNAi抑制FATB降低 了約3%之16 : 0聚積，約提高了6% ω_7 FA。見表2。在從 該質體運出後去飽和該16 : 〇以進一步降低種子16 : 〇聚積 超越藉由FATB抑制所觀察者的可行性係探討的。 從質體釋放出的自由脂肪酸在以三醯基甘油聚積的途 中藉由醯基輔酶A合成酶變成酯化為c〇_A。Sh〇ckey等人 之，’Plant Physiol. m(2): 1065_76(2〇〇3)”。這些細胞質脂肪 醯基Co-A及磷脂連結之FAR表用於質體外去飽和酶之可 能可獲得的受質庫。質體外真菌小巢狀麴菌以")與小麥潁 枯病病菌(/^)去飽和酶之表現，單獨或結合，係就擬南芥中 降低16 : 0水平之觀點評估的。在該菜豆蛋白啟動子控制下 來自加與兩個去飽和酶之共表現在WT擬南芥中降低 16 · 0上產生可喜的結果。所以，在一KASn HpAS RNAi 抑制品系中該與構築之表現與一單一^^讲乃複製之表 現係測試H祕D細祕去飽和酶之表現導致近乎一半 的16: 0轉換為16: 1Δ9’導致16: 〇在種子中聚積從約19% 至約11%之-減少（接近SWT種子+所看到者），伴隨16 : W從約27%至約43%之—相應提高。在該宿主 /C⑽25品系巾，18 : 1Δη之水平依舊相同的，且 以偏ΡΖ)與去飽和酶轉形（分別約㈣與約η。/。)之此 41 %, 201207110 品系’該者顯示該fael突變’在16 ·· Μ延長活性中係幾乎 完全沒有的。質體與㈣外去飽和酶共表現之此策略產生 約67% ω_7 FA之-平均聚積’伴隨個別植物其顯示大於 71% 者。 【圖式簡單說明】 第1圖描繪在擬南芬之質體與内質網中脂肪酸之合成 與修飾的4圖。_:〇去飽和酶媒介之反應係指出為1: △9-16 : 0-ACP去飽和酶；2 :質體外：δ9_16 : 〇 Acp去飽和 酶。⑻从’即16:1Δ9與HIM係為方塊的。 第2圖顯示FAMEs之之一代表性氣相色層分離，其取決 Com25在擬南芥之各種背景中的表現。分圖a與B，wt ; c 與D’/Mi ; E與F’/aW//aeh 分圖 A、(：與£，未轉形；B、 D與F’以Phas:Com25轉形。FAME波峰係指出為：16: 〇 (1)、 16 : 1Δ9 (2)、16 : 2 (3)、18 : 〇 (4)、18 : ! Δ9 (5)、18 : 1Δη (6)、18 . 2 (7)、20 . 0 (8)、20 : 1Δ11 ⑹、18 : 2 (7)、20 : 0 (8)、20 : 1Δ11 (9)、18 : 3+20 : 1Δ13 (1〇)、及 22 : 1 (11)。 第3圖顯示在宿主種子中16 : 〇與ω_7聚積之間的關係 (以莫耳百分比）。 第4圖顯示FAMEs之之一代表性氣相色層分離，其取決 Com25在擬南芬或各種背景中的表現。分圖a :最佳的 /^^//從7, Phas:Cow25, FaW-HPAS, AnA9DS，LnA9DS轉形 品系；分圖B :榮花屬種子。波峰命名係如第2 圖中所說明。 第5圖係為本發明之一特別構築實施例中DNA元素之 42 201207110 一示意比對。 【主要元件符號說明】 (無）

43 201207110 序列表 <11〇>陶氏農業生技

Shanklin, John Nguyen, Huu Tam Walsh, Terence A. <120〉 植物種子中ω-7脂肪酸的聚積技術 <130> 2971.01-9666. lTff <160> 10 <170> 專利3. 4版 <210〉 1 <211〉 1092 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉從蓖麻Δ9-18:0-去飽和酶建造之Com25 <400〉 1 gcctctaccc tcaagtctgg ttctaaggaa gttgagaatc tcaagaagcc tttcatgcct 60 cctcgggagg tacatgttca ggttacccat tctatgccac cccaaaagat tgagatcttt 120 aaatccctag acaattgggc tgaggagaac attctggttc atctgaagcc agttgagaaa 180 tgttggcaac cgcaggattt tttgccagat cccgcctctg atggatttga tgagcaagtc 240 agggaactca gggagagagc aaaggagatt cctgatgatt attttgttgt tttggttgga 300 gacatgataa cggaagaagc ccttcccact tatcaaacaa gtctgaatcg ttgtgatgga 360 gttcgggatg aaacaggtgc aagtccgacg tcttgggcaa tttggacaag ggcatggact 420 gcggaagaga atagacatgg tgacctcctc aataagtatc tctacctatc tggacgagtg 480 gacatgaggc aaattgagaa gacaattcaa tatttgattg gttcaggaat ggatttgcgg 540 acagaaaaca gtccatacct tacgttcatc tatacatcat tccaggaaag ggcaaccttc 600 atttctcatg ggaacactgc ccgacaagcc aaagagcatg gagacataaa gttggctcaa 660 atatgtggta caattgctgc agatgagaag cgccatgaga cagcctacac aaagatagtg 720 gaaaaactct ttgagattga tcctgatggt accgttttgg cttttgctga tatgatgaga 780 aagaaaattt ctatgcctgc acacttgatg tatgatggcc gagatgataa tctttttgac 840 cacttttcag ctgttgcgca gcgtcttgga gtctacacag caaaggatta tgcagatata 900 ttggagttct tggtgggcag atggaaggtg gataaactaa cgggcctttc agctgaggga 960 caaaaggctc aggactatgt ttgtcggtta cctccaagaa ttagaaggct ggaagagaga 1020 gctcaaggaa gggcaaagga agcacccacc atgcctttca gctggatttt cgataggcaa 1080 gtgaagctgt ag 1092 <210> 2 <211〉 363 <212> PRT <213〉 人工的 <220〉 <223〉從蓖麻 Δ9_18:0_ 去餘和酶建造之Com25 <400> 2 Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ser Lys Glu Val 1 5 10 Glu Asn Leu Lys Lys 15 201207110

Pro Phe Met Pro Pro Arg Glu Val His Val Gin Val Thr His Ser Met 20 25 30 Pro Pro Gin Lys lie Glu lie Phe Lys Ser Leu Asp Asn Trp Ala Glu 35 40 45 Glu Asn lie Leu Val His Leu Lys Pro Val Glu Lys Cys Trp Gin Pro 50 55 60 Gin 65 Asp Phe Leu Pro Asp Pro Ala Ser Asp Gly Phe Asp Glu Gin Val 70 75 80 Arg Glu Leu Arg Glu Arg Ala Lys Glu lie Pro Asp Asp Tyr Phe Val 85 90 95 Val Leu Val Gly Asp Met lie Thr Glu Glu Ala Leu Pro Thr Tyr Gin 100 105 110 Thr Ser Leu Asn Arg Cys Asp Gly Val Arg Asp Glu Thr Gly Ala Ser 115 120 125 Pro Thr Ser Trp Ala lie Trp Thr Arg Ala Trp Thr Ala Glu Glu Asn 130 135 140 Arg 145 His Gly Asp Leu Leu Asn Lys Tyr Leu Tyr Leu Ser Gly Arg Val 150 155 160 Asp Met Arg Gin lie Glu Lys Thr lie Gin Tyr Leu lie Gly Ser Gly 165 170 175 Met Asp Leu Arg Thr Glu Asn Ser Pro Tyr Leu Thr Phe lie Tyr Thr 180 185 190 Ser Phe Gin Glu Arg Ala Thr Phe lie Ser His Gly Asn Thr Ala Arg 195 200 205 Gin Ala Lys Glu His Gly Asp lie Lys Leu Ala Gin lie Cys Gly Thr 210 215 220 lie 225 Ala Ala Asp Glu Lys Arg His Glu Thr Ala Tyr Thr Lys lie Val 230 235 240 Glu Lys Leu Phe Glu lie Asp Pro Asp Gly Thr Val Leu Ala Phe Ala 245 250 255 Asp Met Met Arg Lys Lys lie Ser Met Pro Ala His Leu Met Tyr Asp 260 265 270

Gly Arg Asp Asp Asn Leu Phe Asp His Phe Ser Ala Val Ala Gin Arg 275 280 285

Leu Gly Val Tyr Thr Ala Lys Asp Tyr Ala Asp lie Leu Glu Phe Leu 290 295 300

Val Gly Arg Trp Lys Val Asp Lys Leu Thr Gly Leu Ser Ala Glu Gly 201207110 305 310 315 320

Gin Lys Ala Gin Asp Tyr Val Cys Arg Leu Pro Pro Arg lie Arg Arg 325 330 335

Leu Glu Glu Arg Ala Gin Gly Arg Ala Lys Glu Ala Pro Thr Met Pro 340 345 350 P5 r 5 T 3 r e s e h p lie Phe Asp Arg Gin Val Lys Leu 360 <210〉 3 <211〉 31 <212〉 DNA <213〉 人工的<220〉 〈223〉 P17-5’ BamHI 引子 <400〉 3 gggatccccg ggttgacatt tttacctttt t <210〉 <211〉 <212〉 <213〉 的A工 <220〉 <223〉 P17-3’ PacI 引子 <400〉 4 ggttaattaa gtcttcaaac tctagga 27 <210〉 5 <211〉 32 <212> DNA <213〉 人工的 <220〉 <223〉 FatB-hps-5’PstI 引子 <400〉 5 gggctgcaga aacaagtttc ggccaccaac cc 32 <210> 6 <211〉 29 <212〉 DNA 〈213> 人工的<220> <223〉 FatB-hps-3’ Xhol 引子 <400> 6 cccctcgaga catcagaatt cgtaatgat <210> 7 <211> 28 <212〉 DNA <213〉 人工的<220〉 <223〉 FatB-hpa-5’NheI 引子 <400〉 7 ggggctagca agtttcggcc accaaccc 28 3 31201207110 <210〉 <211〉 <212〉 <213〉<220〉 <223〉 8 31 DNA 人工的

FatB-hpa-3’ PacI 引子 <400> 8 cccttaatta aacatcagaa ttcgtaatga t <210〉 <211〉<212> <213><220〉 <223〉 9 34 DNA 人工的

FatB_Exon-5’ Sp-Bam 弓丨子 <400> 9 ccactagtgg atccacctct gctacgtcgt catt 34 的 A工 0 4 N、 1 3 D / > > > > 0 12 3 1± 1x 11 1x 2 2 2 2 < < < < <220〉 <223〉 FatB-Exon—3’Bg-Sal 引子 <400> 10 ggagatctgt cgacgtagtt atagcagcaa gaag 34 4

Claims (1)

1. 201207110 七、申請專利範圍： 1. 一種核苷酸酸分子，其編碼一Δ9去飽和酶酵素，該者包 含至少60%相同於SEQ ID NO : 1之一核苷酸序列。 2. 如申請專利範圍第1項之該核酸分子，其進一步包含一 基因調控元素。 3. 如申請專利範圍第2項之該核酸分子，其中該基因調控 元素係為菜豆蛋白啟動子或LTP170啟動子。 4. 一種Δ9去飽和酶酵素，其包含至少80%相同於SEQ ID NO : 2之一胺基酸序列。 5·如申請專利範圍第4項之該Δ9去飽和酶酵素，其中至少 80%相同於SEQ ID NO : 2之該胺基酸在類似於SEq ID NO，2位置114之位置包含一絲胺酸；在類似於seq ID NO : 2位置117之位置包含一精胺酸；在類似於seq ID NO · 2位置118之位置包含一半胱胺酸；在類似於id NO. 2位置179之位置包含一白胺酸；或在類似於id NO : 2位置188之位置包含一蘇胺酸。 6. 如申請專利範圍第4項之該Δ9去飽和酶酵素，其中至少 80%相同於SEQ ID NO : 2之該胺基酸在類似AseQ ID NO . 2位置114之位置包含一絲胺酸；在類似於seq id NO : 2位置117之位置包含一精胺酸；在類似mSEQ仍 NO : 2位置118之位置包含一半胱胺酸；在類似於seq id NO :2位置179之位置包含一白胺酸；及在類似於SEQ m NO : 2位置188之位置包含一蘇胺酸。 7. —種用於提高植物材料中稀少脂肪酸數量之方法，該方 1 201207110 法包含： 以申請專利範圍第丨項之該核酸分子轉形植物材 料，使得該等稀少脂肪酸於該植物材料中之數量係提 高。 8. 如申請專利範圍第7項之該方法，其進一步包含以額外 的申請專利範圍第1項之核酸分子轉形植物材料。 9. 如申請專利範圍第7項之該方法，其中該植物材料包含 用於提高該植物材料中16 : 〇_ACp水平之一手段。 10. 如申請專利範圍第9項之該方法，其中用於提高該植物 材料中16 : 0-ACP水平之該手段係為一質體外去飽和酶 之表現。 11. 如申請專利範圍第9項之該方法，其中用於提高該植物 材料中16 : 0-ACP水平之該手段係為KASII之抑制。 12. 如申請專利範圍第11項之該方法，其中KASII之抑制係 藉由在該/aW基因中引入一突變而完成。 13. 如申請專利範圍第9項之該方法，其中用於提高該植物 材料中16 : 〇_ACP水平之該手段係為減少16 : 0脂肪酸 在該植物材料中之延長。 4·如申請專利範圍第13項之該方法，其中減少16 : 0脂肪 酸在該植物材料中之延長係藉由在該/aei基因中引入一 突變而完成。 15·如申請專利範圍第7項之該方法，其中該植物材料係從 選自於一屬之一植物獲得，該屬係選自包含下述之群 '且·擬南芬屬〇4^3似〇户也）、琉璃苣屬（5i?rago)、芬花 2 201207110 籽油（Canola)、蓖麻屬（及iWww*?)、可可屬（77/ei?0roma)、 玉米屬（Ζβί2)、棉花屬（GOSJ少/7Z‘WW)、海邊芬蘭屬 (0<3»iZ)e)、克非亞草屬（Cwp/zea)、亞麻屬（L/m/m)、雷斯 先勒屬（Lesquerella)與澤在屣、亞麻軒 (Linola)、金蓮花屬（7>opaeo/讀）、月見草屬 (Oe«oi/zera)、木犀屬（〇/ea)、油椰子屬、落花生 屬（Arachis)、油茱籽、紅花屣（Carthamus)、大i臣屣 (Glycine)與黃立生屬（Soj’a)、向曰凑屬（ffelianthus)、煙 草屬（Nicotiana)、斑鳩葡屬（ι/^ηοηία)、小麥屬 (Thizcww)、大麥屬（//orjeww)、水稻屬（〇7Ζβ)、燕麥屬 〇4ve«a)、高粱屬、黑麥屬，或其他禾 本科成員。 16, 17. 18. 19. 如申請專利範圍第7項之該方法，其中該植物材料包含 兩種用於提高該植物材料中16 : 〇 ACp水平之手段。 如申明專利範圍第16項之該方法，其中用於提高該植物 材料中16 : 0-ACP水平之該第一手段係為KAsn之抑 制且其中用於提高該植物材料中16 : 0-ACP水平之該 第二手段係為減少16 : 〇脂肪酸在該植物材料中之延 長。 如申請專利範圍第7項之該方法，其中該植物材料包含 二種用於提高雜歸财Μ : G_ACp水平之手段。 如申請專利制第18項之該方法，其中用於提高該植物 才料中16 . G.ACP7JC平之該第—手段係為以犯之抑 制，其中用於提高該植物材料中！6 : 0-ACP水平之該第 201207110 二手段係為減少16: 〇脂肪酸在該植物材料中之延長， 且其中用於提高該植物材料中16: 0_Acp水平之該第三 手段係為一質體外去飽和酶之表現。 20·如申請專利範圍第贼19項之該方法，其中該質體外 去飽和酶係為一 或^去飽和酶。 21‘一種用於創造—遺傳工程植物之方法，該者相較於野生 型植物在魄物巾包含提高數量之稀少脂麟，該方法 包含： / 以申請專利範圍第1項之核酸分子轉形植物材料； 且培養该經轉形之植物材料以獲得一植物。 申月專利|〖圍第21項之該方法，其中該植物係選自於 一屬j屬係選自包含下述之群組：擬南芥屬、琉瑪宣 屬二芬花籽油、蓖麻屬、可可屬、玉米屬、棉花屬、海 邊介蘭屬、克非亞草屬、亞麻屬、雷斯克勒屬與澤花屬、 魏軒、金蓮花屬、月見草屬、木犀屬、油椰子屬、落 化生屬、/由菜籽、紅花屬、大豆亞屬（G(yc/«e)與黃豆亞 屬(獅）' 向曰葵屬、煙草屬、斑鳩菊屬、小麥屬、大 麥屬、水稻屬、燕麥屬、高粱屬、黑麥屬，或其他禾 科成員。 23.種植物其藉由如中請專利範圍第η項之該方法獲得者。 认/曰^植物材料其從如巾請專利範圍第23項之該植物獲 25.如申⑼專利範圍第24項之該植物材料，其中該植物 係為種子D 4