TW201200162A - Lactobacillus salivarius for improving oral bacterial groups and health care compositions thereof - Google Patents

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201200162 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於寄存編號為BCRC910454之唾液乳酸桿菌 SG-M6 SG-M6)及其製得之發酵產物於 口腔保健之應用。 【先前技術】 正常人口腔内存在著許多細菌、黴菌、甚至病毒，而其中又 以細菌的數量為最大：每毫升唾液中有1億個細菌，整個口腔中 的細菌種類超過600種，然而這些細菌並非全都是致病菌，其中 也包括部份的益生菌。正常狀況下這些細菌彼此維持菌落的相對 平衡而不會致病，但如果身體免疫力或抵抗力變差、口腔環境改 變、服用藥物或有全身性疾病等情況下，就會使致病菌過度生長 而造成口腔疾病，輕則導致口臭、滋生牙菌斑、牙齦發炎等，重 則引發銷齒、牙周病’甚至是細菌侵入血管内大量繁殖而造成菌 血症0 根據牙醫師公會全國聯合會全年度健保資料統計，台灣地區 成年人罹患牙周病比例高達9成，由此可見牙齒保健之重要性。 牙周病一般可分為兩種，亦即牙齦炎（又作齒齦炎，gingivitis) 和牙周炎（periodontitis)。牙齦炎主要徵兆是牙齦出血、腫脹、發 紅等。牙周炎則是指支撐牙銀組織和牙齒的齒槽骨（alve〇larb〇ne) 遭到破壞的狀態。 罹患牙·周病’牙埤和耷銀間的溝槽會變深，形成「牙周韋袋」 (periodontal pocket )〇通常牙齒健康者的牙周囊袋深度約在lmm 201200162 到.2 mm之間，輕度牙周炎患者的牙周囊袋深度約是3〜4 mm，中 私0 4〜6 mm，重度患者的牙周囊袋深度則超過6 mm以上。 度患奢疋 牙周囊袋的加深，牙齦本身會變短。當牙齒外觀看起來變長， 或者斤截開始晃動，都可能是重度牙周病的警訊。 斤銀炎及牙周炎都是「牙周細菌」（periodontal bacteria )感染 - 代表性細菌有牙齦卟琳菌（尸以叹卜以’·5)。 咬液中的醣蛋白（glycoprotein)會在牙齒表面形成薄膜，使 在此附著，細菌吸取了食物中的糖分後，薄膜會變大、增

' 而形成牙菌斑。再者，如果牙周囊袋中形成牙菌斑的話， 厚> ίΕ 細菌便會在該牙菌斑中大量繁殖。由於牙周細菌具厭氧性， #氣難以到達的牙周囊袋是它最適合滋生的環境。牙菌斑也 是變 口腔 形键球菌（Sirepiococcws mwiaws)的溫床，90%以上的成年人 中都攜帶這種細菌’而此菌亦是造成銷齒的主要細菌。當變 球菌分解糖分產生的酸性物質侵触牙齒的斑瑯質（enamel ) 和象开質（dentin)後，就會造成齲齒。 f尤斤周病而言，當牙周細菌侵入牙齦時，就會引起免疫反應< 牙肩細菌會分泌酵素溶解牙齦細胞進而入侵到牙齦内部。在牙周 細菌數量尚少時，還能阻止它的入侵，一旦大量繁瘦，就會無法 抑制。 目前有一些方式可以預防齲齒或牙周病的產生，例如施用避 免細菌附著至牙齒表面的抗附著劑’以減少牙菌斑的形成避免細 菌侵蝕牙質（中華民國專利申請號094144377);使用抗菌劑以抑 制細菌孳生（美國專利第5,368,845號；WO 92/14475);或是目 前所廣泛使用的氟化物’利用其能降低琺瑯質對酸性物質的溶解 201200162 度以預防鶴齒。 【發明内容】 爰此，本發明之目的在提供一種新的唾液乳酸桿菌SG-M6 (Iacio0acz7/WlS 扣/z’varz’M·? SG-M6) ’ 其寄存編號為 BCRC910454， 更進一步揭示該唾液乳酸桿菌SG-M6,其包含編碼如SEQ ID ΝΟ:1 所示之核苷酸序列。本發明之另一目的在揭露以唾液乳酸桿菌 SG-M6於培養基發酵後製得之發酵產物。 本發明之又一目的是提供一種改善口腔内細菌群之保健組合 物’將前述唾液乳酸桿菌SG-M6或其發酵產物應用於口腔保健， 可有效抑制個體口内之牙周細菌生長。 本發明唾液乳酸桿菌SG-M6所包含SEQ ID NO : 1係和已知 的唾液乳酸桿菌之遺傳物質有明顯差異（詳見圖1 )。此外，乳酸 菌鑑疋係使用API 50 CHL套組（法國API BioMerieux Research laboratory, La Balme Les Grottes, Montalien, Jeraeh, France) > API 50 CHL比對顯示出本發明之唾液乳酸桿菌SG-M6與歐洲專利號 1312667所揭露之菌株WB21 (寄存號FERM P-17991 )、美國專利 公開第2007 / 0071737所揭露之菌株TI2711 (寄存號FERM BP-7974)、歐洲專利第0154549號所揭露之菌株AD0001 (寄存號 FERM P-7537)有明顯差異，如表一所示。 表一、本發明之唾液乳酸桿菌SG-M6與歐洲專利號1312667

I 所揭露之菌株W]B21 (寄存號FERM P-17991 )、美國專利公

開第2007 / 0071737所揭露之菌株TI2711 (寄存號FERM 201200162 BP-7974)、歐洲專利第0154549號所揭露之菌株AD0001 (寄 存號 FERM P-7537 )之 API 50 CHL 比對

API 50 CHL 醣 本發明之唾 液乳酸桿菌 (SG-M6) EP1312667 (WB21) (FERM P-17991) US2007 / 0071737 (TI2711) (FERM BP-7974) ΕΡ0154549 (AD0001) (FERM P-7537) 0 控制組 一 1 甘油（Glycerol) — 2 赤韓糖醇（Erythritol) — 3 D—阿拉伯糖 (D-Arabinose ) 一 —— — 4 L一阿拉伯糖 (L-Arabinose ) —— 5 D-核糖（D-Ribose) + 一 — 6 D-木糖（D-Xylose) — — 一 — 7 L-木糖（L-Xylose) — 8 核糖醇（Adonitol) + 9 β_曱基_木糖苷 (pMethyl-xyloside ) — 10 半乳糖（Galactose) + + + + 11 D-葡萄糖（D-Glucose) + + + + 12 D-果糖（D-Fructose) + + + 13 D-甘露糖（D-Mannose) + + + + 14 L-山梨糖（L-Sorbose) 一 15 鼠李糖（Rhamnose) + + + 16 衛矛醇（Dulcitol) — 17 肌醇（Inositol) — 18 甘露糖醇（Mannitol) + + + + 19 山梨糖醇（Sorbitol) + + + + 20 α甲基-D-甘露糖苷 (aMethyl-D-mannoside ) 一 21 α甲基-D-葡萄糖苷 (aMethyl-D-glucoside ) — 22 N-乙醯葡萄糖胺， (N Acetyl glucosamine ) + 1 23 苦杏仁苷（Amygdaline) — — ' 一 — 24 熊果苷（Arbutine) 一 201200162 25 七葉皆（Esculine) + 一 26 水楊發（Salicine) + 27 纖維二糖（Cellobiose) 一 28 麥芽糖（Maltose) + 29 乳糖（Lactose) + 30 木蜜二糖（Melibiose) + + + 31 蔬糖（Saccharose) + + 32 海藻糖（Trehalose) + + + 33 菊糖（Inuline) 一 34 落葉松糖（Melezitose) — — — 35 D-棉子糖（D-Raffinose) + + + 36 殿粉（Amidon) — —- -^^_ ............ ^^ 37 肝糖（Glycogen) — 38 木糖醇（Xylitol) — 39 β·龍膽二糖 (β-Gentiobiose ) — 40 D-松二糖（D-Turanose) — 41 D-來蘇糖（D-Lyxose) — 42 D-塔格糖（D-Tagatose) — 43 D-炭藻糖（D-Fucose) — 44 L-炭藻糖（L-Fucose) — 45 D-阿拉伯膠酵 (D-Arabitol) — 46 L-阿拉伯膠醇 (L-Arabitol) 47 ’ 葡萄糖酸（Gluconate ) — 48 2 keto-gluconate (2-酮-葡萄糖酸） 一 ---- ^^^ 49 5 keto-gluconate (5-酮-葡萄糖酸） — 本發明之發酵產物係指經能培養出唾液乳酸桿菌SG-M6成分之培養 基發酵後的產物，該培養基之主要成分為葡萄糖、蛋白酶、肉類萃 取物、酵母菌萃取物、鹽類等物質。唾液乳酸桿菌SG-M6之發酵 產物即使經過透析膜純化後，例如使用Spectra/Por®Dialysis Membrane.; MWCO:35〇〇 ife行透析，亦不影響其抑菌效力。 丨 牙周細菌皆會受到該保健組合物之影響而停止生長甚至死 201200162 亡。藉此能夠抑制口内常見的牙周病菌諸如變形鏈球菌 (Streptococcus mutans ) ' ^ ( Streptococcus sanguis ) ' -¾1 銀口卜你菌及黏放線菌（JciZ’TiOWyea Wscosw·?)等滋生的特性，吾人係可將該組合物應用於預防或治療 口腔細菌性疾病： 1. 與牙銀0卜琳菌相關之疾病：牙周疾病（Periodontal disease)、骨 質疏鬆症、海綿靜脈竇血栓性靜脈炎（Cavernous sinus thrombophlebitis )、牙周病（Periodontitis )、心血管疾病、感染性 心内膜炎（infective endocarditis )、糖尿病、呼吸系統疾病、動脈 硬化、冠狀心臟病、中風、類風濕性關節炎。 2. 與血鏈球菌相關之疾病：蛀牙、感染性心内膜炎、急感染性關節 炎（Acute septic arthritis)、心血管疾病。 3. 與變形鏈球菌相關之疾病：蛀牙、感染性心内膜炎。 4. 與黏放線菌相關之疾病：牙周病。 本發明所揭露的保健組合物，其唾液乳酸桿菌SG_M6活菌及 # 發酵產物具有抑制細菌滋生的能力，因此能以唾液乳酸桿菌 SG-M6 g株及發酵產物直接塗抹於口腔的方式使用，或是在不破 壞菌株及發酵絲活性而祕能於口㈣復原的前提下，將菌株 及發酵產物加以冷洗或乾燥化，進而製成旋劑或喷劑、溶於液體、 以食品、醫藥品添加劑、或口腔清潔劑方式加以製造並使用。惟， 任何方式只要不破壞保健組合物抑制細g之能力㈣本發明之可 能適用方式。 另，本發明所述之個體為哺乳動物，較佳备人。， 201200162 【實施方式】 下述之實施例提供本發明更進-步細節之說明，這些實_ 為本發明最佳之實施例’其用以說明此發明’然非限制本發明之 範圍。下述之實施例提供本發明更進_步細節之說明，這些實施 例為本發明最佳之實施例’其用以朗此發明，然非限制本發明 之範圍。本實施例中揭露-種用於預防或治療口腔細菌性疾病的 保健組合物，其中有效成分為唾液乳酸桿菌SG M6(Zaci〇^c沿似 扣加…/⑽）之發酵產物，在此以體外（ζ>2νζ>〇)或活體（kWv〇) 實驗加以驗證該菌體之發酵產物對於牙周病之療效。 試驗方法 1·趙外實驗（iwviVrostudy) 以唾液乳酸桿菌SG-M6在液態培養基，本實施例採用mrs 培養基於30〜37°C培養15〜24小時後，將發酵菌液濃縮成3〇倍， 並使用透析膜（Spectra/Por®Dialysis Membrane ; MWCO:3500, Spectrum Laboratories Inc，CA)將其透析48小時，再依實驗需求稀 釋成不同濃度。分別與變形鍵球菌ATCC 25175 )、血鍵球菌（汾，€^〇£；〇((7«1515<3叹1^，八丁(^ 49295)、牙齦卟 琳菌（戶0/7?/2>^〇»70«似 gz’wg/να^，ATCC 33277 )及黏放線菌 ATCC 15987 )進行紙鍵璦脂擴散試驗 (Disc agar diffusion test)、肉湯稀釋法（broth dilution method)、試驗 樣品與病原菌共同培養試驗，瞭解抑制病原菌生長狀況。以上四 / 株病原菌菌株購自財.團法人食品工業發展研究所生物資源保存及 研究中心或ATCC。 201200162 (1) 紙錠瓊脂擴散試驗 將培養至濁度相當於0.5比濁度的變形鏈球菌、血鏈球菌、牙 齦卟啉菌及黏放線菌菌液，以無菌棉棒沾菌液3秒鐘，在三個方 向平均塗抹於瓊脂表面’使接種原平均分佈。將唾液乳酸桿菌 SG-M6濃縮液透析後’調整成濃縮15倍①卯丨^、濃縮1〇倍 (LSP10)、濃縮 5 倍(LSP5)、濃縮 4 倍(LSP4)、濃縮 2 倍(LSP2)及 1倍(LSP1)(未濃縮的發酵菌液）β將直徑6mm消毒滅菌之紙錠浸 φ 入不同濃度的唾液乳酸桿菌SG-Μό發酵產物或活菌液(簡稱LSB) 中二秒鐘後’取出鱗平貼於璦脂表面’置於3rc厭氧培養箱中 培養24小時後，測量其抑制圈大小。 (2) 肉⑦稀釋法（Br〇th dilution method) 將唾液乳酸桿菌SG-M6之30倍發酵產物透析後’將其濃度 連續稀釋成15倍、1〇倍、5倍、4倍、2倍及1倍，另將變形鏈 球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉菌及黏放線菌在無菌標準液態培養基 (BHIbroth)培養至濁度相當於〇 5比濁度的菌液，各加入5〇μΙ^ ♦菌液於管中，置於37〇c厭氧培養箱中培養48小時後，以平板計數 法，計算菌落數，推算樣品抑菌濃度。 (3) 試驗樣品與病原菌共同培養試驗 將唾液乳酸桿菌SG-M6活菌或發酵產物，分別與不同病原菌 (變形鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉菌）共同放置於試管中，37。(：共 同培養。分別於不同時間點取樣，以平板計數法，計算菌落數， 瞭解樣品抑制病原菌生長狀況。 , , 、· 動物法趙實驗（//I VI_V<? study ) 11 201200162 分設實驗組及對照組。唾液乳酸桿菌SG_M6之實驗組分成6 組（透析後之唾液乳酸桿菌SG-M6之發酵產物濃縮菌液6組，濃 度分別為濃縮15倍、濃縮10倍、濃縮5倍、濃縮4倍、濃縮2 倍及1倍（未濃縮發酵菌液））’與對照組2組（四環黴素 (tetracycline ) 0.267 mg/mL 及蒸餾水（distiUed water ))。 (1)動物牙周病預防效果之評估 選用八週齡之雌性Balb/c小鼠每組12隻（表二），每日投與 不同濃度之唾液乳酸桿菌發酵產物、四環黴素0.267 mg/mL或蒸 餾水各1毫升’並於其下顎前牙紮上齒列矯正用鋼線（ligature wire)，並於牙周組織接種牙周病致病菌變形鏈球菌，即為以人工 方式引發牙周組織病變之病態動物模式。此操作至全部動物犧牲 為止，並觀察記錄其病理表徵。於由牙科主治醫師診斷直至對照 組（假食 distilled water，mock-treated group )開始牙銀出現紅腫 及牙菌斑出現後解除鋼線束缚，並停止接種牙周病致病菌。於解 除鋼線束缚後第4、8、12、及16日，檢測老鼠牙周囊袋深度（pocket depth)，各組犧牲3隻採血，並取檢體進行組織學觀察》 表二、動物實驗預防組之分組（註：人類使用的四環黴素劑量為每曰 1000 mg每75 kg體重，由此推估小鼠每曰使用之劑量大約為〇.267 mg 每20g體重） 施用劑量(每毫升） 組數 pLSPl 唾液乳酸桿菌SG-M6之發 酵產物 IX 8 pLSP2 2 X濃縮 ♦12 201200162 pLSP4 唾液乳酸桿菌SG-M6之發 酵產物 4 X濃縮 pLSP5 5 X濃縮 pLSPIO 10X濃縮 pLSP15 15X濃縮 pTC 四環黴素 0.267 mg pMT 蒸傭水(mock-treated ) (2 )動物牙周病治療效果之評估 選用八週齡之雌性Balb/c小鼠每組12隻（表三），於其下顎前 牙紮上齒列矯正用鋼線，並於牙周組織接種牙周病致病菌變形鏈 球菌，直至對照組牙齦出現紅腫及牙斑出現為止，即為以人工方 式引發牙周組織病變之病態動物模式。分別由牙科主治醫師診斷 於組織病變後每日投與不同濃度之乳酸桿菌發酵產物或乳酸桿 菌活菌、四環黴素0.267 mg/mL或蒸餾水各1毫升，並觀察記錄 其病理表徵。於開始治療日解除鋼線束缚，並停止接種牙周病致 病菌。於解除鋼線束缚後第4、8、12、及16日，檢測老鼠牙周 囊袋深度，各組犧牲3隻採血，並取檢體進行組織學觀察。 表三、動物實驗治療組之分組 施用劑量(每毫升） 組數 tLSPl 唾液乳酸桿菌SG-M6之發 酵產物 IX 8 tLSP2 2 X濃縮 tLSP4 4X濃縮 tLSP5 5 X濃縮 tLSPIO 10X濃縮 13 201200162 tLSP15 15 X濃縮 tTC 四環黴素 0.267 mg tMT 蒸傲水(mock-treated) (3)牙周囊袋深度(periodontal pocket depth)改善百分比 以對照組為標準，使用Mann-Whitney test與各組中每個個體 做檢測，有顯著差異的個體稱為改善個體。（改善個體個數/全組個 體數)xl〇〇%=牙周囊袋深度改善百分比。 (4)臨床病理及生化檢驗 將未死亡動物犧牲，頸動脈取血在3000 r.p.m.，4°C的條件下 離心10分鐘後，取上層血清，用自動生化分析儀來檢測其ALT、 AST、Creatinine、BUN生化指標。並取其重要標的臟器（肝、腎） 以10%福馬林液固定，石蠟包埋組織切片後做H.E. stain染色以 進行病理學觀察。 3.统計分析 實驗數值以平均值士標準誤差（mean ± S.D.)表示。小鼠牙周 囊袋狀況之實驗組與對照組間統計差異，在縱向（longitudinal) 研究是採One-Way ANOVA與Dunnett多重事後比較法（Dunnett multiple post hoc comparison)檢測，而橫斷（cross-secti〇nal)研 究是以One-Way ANOVA與LSD多重事後比較法（LSD multiple post hoc comparison)檢利。另外採用 Mann-Whitney test 檢測牙，周 k 囊袋改善的個.體數。Statistical significance level 之 p.值為 0.05。 201200162 結果 1.趙外實驗（ιΤι v/i/v? study ) (1)紙錠瓊脂擴散試驗 表四、紙贿脂擴散試驗之抑菌效果。無菌紙旋直徑為^，若抑菌 圈>6mm表村_效果，反之則無_效果。培養溫度及時間為 37°C，24小時，對照組為含四環黴素之紙旋，抑制圈之數值錢咖sd 表示（n=3 )。 黏放線菌 Actinomyces viscosus 牙齦卟琳菌 Porphyromonas gingivalis 變形鏈球菌 Streptococcus mutans 血鍵球菌 Streptococcus sanguis LSP1 _ LSP2 10±1.0 12 土 1.0 9±1.0 9±1.0 LSP4 13±1.0 14 士 1.0 13±1.0 16±1.0 LSP5 15±1.0 16±1.0 15±1.0 18±1.0 LSP10 23 _2 士 1.2 23±1.0 21±1.2 22±1.0 LSP15 31.1 士 1.1 32 土 1.1 29±1.0 28 士 1.4 LSB 14 士 1.0 9±0.5 14±1.0 14±1.0 Tetracycline 48.2±2.4 33.4±2.2 29.7±2.0 25.9±1.2 由表四可以見得唾液乳酸桿菌SG-M6濃縮2倍以上的發酵產 物(LSP)及活菌(LSB)對於黏放線菌、牙齦卟啉菌、變形鏈球菌及血 鏈球菌這四種病原菌皆有抑制圈產生，且發酵產物的濃縮倍數愈 高，抑制圈愈大，呈現劑量依賴現象。

1 I (2)肉湯稀釋法 ‘ * 15 , 201200162 表五、最低抑菌濃度及抑菌百分比（100% - (Test group + control) x 100%) 黏放線g Actinomy viscosus ces 牙齦卟啉菌 P orphyromonas gingivalis 變形鏈球菌 Streptococcus mutans 血鏈球菌 Streptococcus saneuis CFU/mL Inhibitory CFU/mL Inhibitory CFU/mL Inhibitory CFU/mL Inhibitory LSP15 4.78xl09 76.9% 5.79xl08 93.4% 8.64x109 75.1% 2.43xl010 65.9% LSP10 5.63xl09 72.8% 9.79x10s 88.9% 1.09xl010 68.5% 3.47xl010 51.2% LSP5 8.29xl09 60.0% 2.03x109 77.0% 2.09x10'° 39.5% 3.95xl010 44.5% LSP4 1.15xl010 44.5% 2.41x10® 72.7% 2.39x10'° 30.9% 4.11xl〇10 42.2% LSP2 1.43xl010 30.9% 3.07xl09 65.2% 3.07x10'° 11.3% 4.32x1010 39.3% LSP1 2.09x10'° 0% 7.76xl09 11.9% 3.10x10'° 10.4% 5.50xl〇10 22.6% Control 2.07x10'° --一- _ 8.81xl〇9 - 3.46xl010 - 7_llxl〇10 - 表五顯示唾液乳酸桿菌SG_M6的發酵產物對於牙周致病菌48 小時處理後有不同的抑制效果，廣泛而言，唾液乳酸桿菌SG_M6 產物之尚濃度有較好的抑制效果。針對牙周致病菌而言，唾液乳 馱桿菌SG-M6的發酵產物對於牙齦卟啉菌的抑制效果最明顯，呈 現劑量依賴現象，其次為變形键球菌。唾液乳酸桿菌的2倍以上 濃縮產物對於這4株病原菌皆有抑制作用。 (3)唾液乳酸桿菌SG-M6的發酵產物或活菌與病原菌共同培 養試驗 表六、唾液乳酸桿菌SG-M6發酵產物（簡稱LS)與變形鏈球菌共同 培養’抑制病巧复生長情形。________ 變形健緣镦 StrePtococdmutans 201200162 培養時間(hr) LS(濃縮2倍) LS(濃縮2.5倍) Control 0 5.0X107 5.〇xl〇7 Γ~5.〇χ107 1 1.5xl〇7 1.5xl〇7 6.〇xl〇7 2 5.4x10^~ 3.1xl〇6 l.OxlO8 3 3.1xl06 l.lxlO4 1.5χ1〇8 4 4.4xl〇5 0 6.〇χ108 6 l.OxlO3 1 0 l.OxlO9 8 0 0 1.5xl09 表六顯示唾液乳酸桿菌SG-M6發酵產物2倍濃縮液於共同培 養8小時，已無變形鏈球菌病原菌存在，2 5倍濃縮液於共同培養 • 時間4小時已無變形鏈球菌病原菌存在，可見低濃度唾液乳酸桿 菌發酵產物在短時間就有报好的抑制效果。 表七、唾液乳酸桿菌SG-M6發酵產物（簡稱⑻與血鍵球菌共同培 養，抑制病原菌生長情形。 血鍵球菌办印物咖⑽ 培養時間(hr) LS(濃縮2倍) LS(濃縮2.5倍) Control 0 5·〇χ1〇7 5.〇χ1〇7 5.〇xl〇7 1 4.9x10s 8.0χ] ο3 4.〇x1〇7 2 6.9xl03 5.4χΐ〇2 5.7xl〇7 3 L2xl03 l.OxlO2 6.4xl〇7 8.1xl〇7 4 3.4χ102 ------ ______〇_ 6 0 A_ 9.2xl〇7 0 _ l.OxlO5- 表七顯示唾液乳酸桿g犯摘發酵產物2倍濃縮液於共同培 養6小時’已無血鏈球g病㈣存在，25倍濃縮液於共同培養時 間4小時已無血鏈球菌病原菌存在’可見低濃度唾液乳酸桿菌 SG-M6發酵產物在短時間就有报好的抑制效果。 、 / ·*· 表八、唾液乳轉g SG-M6發酵產物（_LS)與牙齦〇卜琳菌共同 17 201200162 培養，抑制病原菌生長情形。 牙齦叶琳菌尸 培養時間(hr) LS(濃縮2倍) LS(濃縮2.5倍) Control 0 5.〇xl07 5.0xl07 5.〇xl〇7 1 3.1xl07 2.9xl06 5.3xl〇7 2 2.4χ106 8.5xl04 6.3xl〇7 3 8.4χ104 4.9xl03 8.3xl〇7 4 1.5xl03 6.4X101 1.3xl〇8 6 0 0 2.2xl〇8 8 0 0 4.1xl〇8 表八顯示唾液乳酸桿菌SG-M6發酵產物2倍或2.5倍濃縮液 於共同培養6小時，已無牙齦卟琳菌病原菌存在，可見低濃度唾 液乳酸桿菌SG-M6發酵產物在短時間就有很好的抑制效果。 表九、唾液乳酸桿菌SG-M6活菌（簡稱LSB)與變形鏈球菌共同培 養，抑制病原菌生長情形。 雙形绫珠議 Streptococcus mutans 培養時間(hr) LSB(107) LSB(108) 對照組 0 5.〇xl07 5.〇xl〇’ 5.2xl07 4 7.4xl06 7.8xlOb 4.9xl08 8 5.9xl05 6.1x10' 1.5xl09 24 26 17 1.7xl〇9 32 0 0 2.5xl07 表九顯示唾液乳酸桿菌SG-M6活菌與變形鏈球菌共同培養，不管 是低菌數組（7次方）、中菌數組（8次方），於共同培養32小時内皆無變 形鏈球菌病原菌存在，可見其皆有抑制變形鏈球菌生長之效果。

I *·- ·. 2.動物活想實驗（iViviVostudy)

I 201200162 (1)動物牙周病預防效果之評估 表十、唾液乳酸桿菌SG-M6預防組（PLS)之小鼠其牙周囊袋深度 (mm)(One-Way ANOVA with Dunnett multiple post hoc comparison)在不 _同時間點，各組與對照組(pMT)之比較。(*ρ<0.05;ί|ί*ρ<0.01) 第4天 第8天 第12天 第16天 pLSPl 1.33±0.58 U7±0.76 0.67 士 0.29** 0.75±0.35** PLSP2 0.50±0.〇0** 0.83±0.29** 1.67±1.15 1.50±0.71 PLSP4 1.23±1.54 0.63±0.75** 0.40±0.17** 0.35±0.21** PLSP5 0.90±0.52** 0.59±0.26** 0.50±0.00** 0.20±0.00** PLSPIO 0.96±0.50** 0.83 士 0.50** 0.40 士 0.15** 0.30±0.17** PLSPl5 0.73±0.30** 0·47±0.10** 0.40±0.15** 0.40±0.17** PTC 〇.84±0.50** 0.70±0.34** 〇.56±0.26** 0.49 士 0.25** PMT 2.22±l.〇7 2.16 土 1.25 2.75 士 1.32 2.21±0.64 評估預防組唾液乳酸桿菌SG-M6發酵產物，各組餵食不同濃 • 度對於牙周囊袋深度的影響，不同時間點各組間都有顯著差異。 在每個時間點與餵食蒸餾水的對照組（pMT)比較，從時間點第4 天至第16天’ 15倍高濃度（pLSP15)組、1〇倍（pLSPIO)及5 倍（PLSP5)濃度對於牙周囊袋的深度減少皆有顯著差異。而4倍 (PLSP4)濃度組除第4天無顯著改善之外，其餘時間點皆有顯著 差異° 1倍（pLSPl)濃度組在12天及16天牙周囊袋的改善有顯 著差異。餵食四環黴素的預防對照組（pTC)在所有的時間點皆有 顯著差異。 丨 , 201200162 表十一、唾液乳酸桿菌SG-M6預防組（pLS)之小鼠之牙周囊袋深度 (mmXOne-'Way ANOVA with LSD multiple post hoe comparison)，各濃度 組另j在不同時間點與第4 *mav4)比較。(*p<0.05; **p<0.01) 〇 pLSPl PLSP2 pLSP4 pLSP5 pLSPIO pLSP15 pTC pMT 第4天 1.33±0.58 〇·5〇±〇.〇〇 1.23±0.54 0.90±0.52 0.96±0.50 0.60±0.26 0.84±0.50 2.22±l.〇7 第8天 1.17±0.76 〇-83±〇.29 〇.63±0.75 0.59±0.26 0.83±0.50 0.91±0.51* 〇.70±0.34 2.16±1.25 第12天 0.67±0.29 1·67±1.15 〇.4〇±〇.17 0.50±0.00 0.40±0.15* 0.40±0.15** 0.65±0.26* 2.75±1.32 第16天 0.75 士 0.35 1_50±0·71 0.35±0.21 0.20±0.00 0.30±0.17* 0.40±0.17* 0.49±0.25* 2.21±0.64 唾液乳酸桿菌SG-M6發酵產物的各濃度組別，在不同時間點 之組内比較，10倍（pLSPIO)及四環黴素組（pTC)對於牙周囊 袋的深度減少在第12天及第16天有顯著差異，而15倍高濃度 (pLSP15)組第8天、第12天及第16天有顯著差異。 (2)動物牙周病治療效果之評估 表十二、唾液乳酸桿菌SG-M6治療組（tLS)之小鼠其牙周囊袋深度 (mm)(One way ANOVA with Dunnett multiple post hoc comparison)在不 同時間點，各組與對照組(tMT)之比較。(*p<0.05; **p<0.01) 第4天 第8天 第12天 第16天 tLSPl 1.83±1.04 U6±1.15 1.50±1.32 1.00±0.00 tLSP2 3.33±1.53 1.50±1.32 1.17±1.15 0.83±0.29 tLSP4 3.33±1.53 1.25 土 1.06 0.65±0.21** 0.35±0.21** tLSP5 0.96±0.47** 0.75±0.27** 0.58±0.40** 0.20±0.00** tLSPIO 1.21±〇.72*f 0.78±0.26** 0.61 土 0.32** 0.25士0.23** , tLSPl 5 1.18 土 0.72** 0.88±0.50** 0.38±0.16** 〇.2〇±0.〇〇** 201200162 tTC 1.05±0.64** 0.89±0.44** 0.63±0.37** 0.48±0.33** tMT 2.10±0.63 1.91±〇.89 2.10±0.97 2.00±0.92 評估治療組唾液乳酸桿菌SG-M6發酵產物，各組餵食不同濃 度發酵產物對於牙周囊袋深度的影響，不同時間點各組間都有顯 著差異°在每個時間點與對照組（tMT)比較，從時間點第4天至 第12天’ 5倍、1〇倍及15倍濃度組（tLSP5、tLSPIO及tLSPl5) 對於牙周囊袋的深度減少皆有顯著差異（p<〇 〇5)。而4倍濃度組 (tLSP4)在第12天與第16天有顯著改善(p<0 05)。餵食四環黴 素的治療對照組（tTC)在所有的時間點皆有顯著差異。 表十三、唾液乳酸桿菌SG-M6治療組（tLS)之小鼠其牙周囊袋 冰度(mm) (One way ANOVA with LSD multiple post hoc comparison)各 ^度組別在不同時間點與第4天(〇&7 4)比較〇|^<0.05;8|^<0.01)。 tLSPl tLSP2 tLSP4 tLSP5 tLSPIO ILSP15 tTC tMT 第4天 1.83±0.58 3·33±1·53 3.33土 1.53 0.96士 0.47 1.21± 0.72 1.18士 0.72 1.05土 0.64 2.10± 0.63 第8天 1.16±1.15 1.50±1.32 1.25 士 1.06 0.75士 0.27 0.78± 0.26 0.88士 0.50 0.89土 0.44 1.91士 0.89 第12天 1.50±1.32 1.17±1.15 0.65± 0.21 0.58土 0.40 0.61± 0.32** 0.38士 0.16* 0.63土 0.37** 2.10± 0.97 第16天 1.00±0.00 0·83±0·29 〇·35± 0.21 0.20± 0.00 0.25士 0.23** 0.20± 0.00* 0.61土 0.34** 2.00土 0.92 治療組餵食唾液乳酸桿菌SG-M6發酵產物的各濃度組別，在 不同時間點之組内比較（與第4天比較），各組隨著時間牙周囊袋 的改善情況。10倍、U倍濃度組及四環黴素組（tLSP10、tL,SP15 »

V 及tTC)在第12天與第16天對於牙周囊袋的深度诚少皆肴顯著差 21 201200162 異（p<0.05)。 (3)牙周囊袋深度(periodontal pocket depth)改善百分比 表十四、唾液乳酸桿菌SG-M6預防組（pLS)牙周囊袋改善百分比（與 預防組中無處理的對照組）（pMT )比較有顯著差異(Mann-Whitney test P<0.05)改善的個體百分比）。 ’ 第4天 第8天 第12天 第16天 pLSPl 0 33% 67% 100% pLSP2 100% 33% 0 0 pLSP4 67% 67% 33% 100% pLSP5 60% 29% 100% 100% pLSPIO 42% 44% 50% 100% pLSP15 75% 33% 50% 100% pTC 62% 50% 71% 100% pMT - 唾液乳酸桿菌SG-M6預防組牙周囊袋深度改善百分比在第16 天’除了 2倍濃度組外，各組皆達到1〇〇%。 表十五、唾液乳酸桿菌SG-M6治療組（tLS)牙周囊袋改善百分比（與 無治療對照組（似丁）比較有顯著差異(^^1111-篇紅1记)^31;，0<〇.〇5)改善 的個體百分比）。 第4天 第8天 第12天 第16天 tLSPl 0 . 0 33% 0 , tLSP2 0 33% 67% 33% 22 201200162 tLSP4 0 50% 50% 50% tLSP5 36% 38% 40% 50% tLSPIO 25% 22% 50% 33% tLSP15 45% 38% 60% 50% tTC 30% 20% 47% 33% tMT - - - - 唾液乳酸桿菌SG-M6治療組牙周囊袋深度改善百分比在第16 天，除了 1倍濃度組外，各組皆在第16天至少達到33%。

(4)臨床病理檢驗 餵食發酵產物的各組在第16天的肝、腎組織切片（圖2、圖 3與圖8、圖9)，顯示各組肝及腎組織細胞無顯著毒性傷害之表 徵，無發炎細胞浸潤，與無治療對照組（tMT或pMT)(圖4〜圖7 與圖10〜圖13)相較之下無明顯差異。 結論 在體外實驗的紙錠瓊脂擴散試驗可以知道，其中唾液乳酸桿 菌SG-M6濃縮2倍以上的發酵產物及活菌對於黏放線菌、變形鏈 球菌、牙齦卟啉菌、血鏈球菌這四種病原菌皆有抑制圈產生，且 濃縮倍數愈高，抑制圈愈大，呈現劑量依賴現象。在肉湯稀釋法 試驗中，顯示唾液乳酸桿菌SG-M6的發酵產物濃度對於牙周致病 菌有不同程度的抑制硃果。廣泛而言，唾液乳酸桿菌SG-M6,發酵 產物之高濃度有較好的抑制效果。共同培養呈現的數據顯示，唾 23 201200162 j β G Μό發酵產物對牙銀卟啉菌、變形鏈球菌、血鍵球 ，種牙周致病菌短時間都有抑制的作用，且濃度愈高、抑制 =次唾方=桿菌—菌對於變形鏈球_抑制效果， 在32小時内將變形鏈球菌完全殺死。 牙周病動物模型活體實驗顯示唾液乳酸桿菌sg铺 物對改善，預防的效果優於治療的效果。就預 果而° ’唾液孔酸桿菌SG_M6發酵產物濃縮I5倍、1〇伴/ 及4倍、2倍、丨位姐_ i υ借、5倍 。子於牙周囊袋的深度改善皆有顯著 效果部分，在唾液免 圭吳治療 液乳酸柃菌SG-M6發酵產物濃縮15件 倍及4倍有顯著差異。 。1〇倍、5 餵食唾液乳酸桿菌犯摘發酵產物的各組在第^天動 牲時^肝K織進行病理切片’顯示各㈣及腎臟組織細胞， 無顯著毒性傷t之錄，衫安全雜冑。 、，’。口體外實驗及動物活體實驗，顯示唾液乳酸桿菌犯挪 發酵產物能預防牙周炎的產生並改善牙周發炎的狀況。 之 惟須注意前述實施例僅代表本發明之各種態樣與特徵， 細說明及例示，以使熟習此技術者能施行並加以利用， ^ 為任何替 代、變更或修改均應在不脫離本發明之精神與範圍⑽行。熟知 此領域之人可從本發明得到本文所述之結果及優點；動物…0 以僅為示肺之較佳實施例代表，並非欲限制本發明之範圍方法 知此項技術者會對本發明做修正、變更及其他 & 熟 迷唯运些修正 與變更均應包含在本發明之精神内，並應當在本發明所附:專， 請求項所定義之範圍g。 利 *. » 1 24 201200162 【圖式簡單說明】 圖1.顯示本發明之SEQ ID NO : 1與已知的唾液乳酸桿菌（美國 專利公開號US 2002/0094328中之菌株ATCC11741)之核苷酸序 列比對圖（使用NCBIblast程式）。Query為ATCC11741之序列， Sbjct為本發明SEQ ID NO : 1之序列。 圖2.唾液乳酸桿菌SG_m6治療組（tLSP15)肝臟組織切片（ 200X) 圖3.唾液乳酸桿菌SG-M6治療組（tLSP15)腎臟組織切片（ 200X) 圖4.對照組之四環黴素治療組（tTC)肝臟組織切片（200X) 圖5.對照組之四環黴素治療組（tTC：)腎臟組織切片（200X) 圖6.對照組之無治療（distilled water)組（tMT)肝臟組織切片 (200X) 圖7.對照組之無治療（distilled water)組（tMT)腎臟組織切片 (200X) 圖8.唾液乳酸桿菌SG-M6預防組（pLSP15)肝臟組織切片（200X) 圖9.唾液乳酸桿菌SG-M6預防組（pLSP15)腎臟組織切片（200X) 籲 圖10·對照組之四環黴素預防組（pTC)肝臟組織切片（2〇〇X) 圖Η.對照組之四環黴素預防組（pTC)腎臟組織切片（200X) 圖12·對照組之無預防（distiiied water)組（pMT)肝臟組織切片 (200X) 圖13.對照組之無預防（distilled water)組（pMT)腎臟組織切片 ( 200X) 【主要元件符號說明j 無0 25 201200162 序列表 <110>生展生物科技股份有限公司 <120>改善口腔內細菌群的唾液乳酸桿菌口腔保健組合物 <130> 1153-SG-TW <160> 1

<170> Patent In version 3.4

<210> 1 <211> 1573 <212> DNA <213> Lactobaci Ilus salivarius

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1573) <400> 1 tgggcgagtc gcatgctccg gccgccatgg cggccgcggg aattcgatta cggttacctt 60 gttacgactt caccccaatc atctgtccca ccttagacgg ctggctcctt gcggttaccc 120

I I caccggcttt gggtgttaca aactctcatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg 180 26 201200162 aacgtattca ccgcgacatg ctgattcgcg attactagcg attccaactt catgtaggcg agttgcagcc tacaatccga actgagaacg gctttaagag attagctaaa cctcgcggtc tcgcgactcg ttgtaccgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgacttgacg tcgtccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtctcgc cagagtgccc aacttaatgc tggcaactga caacaagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc

tcacgacacg agctgacgac agccatgcac cacctgtcac tttgtccccg aagggaaaac ctaatctctt aggtggtcaa aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gctgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg gaatgcttat tgcgttagct gcggcactga agggcggaaa

ccctccaaca cctagcattc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctacccac gctttcgaac ctcagcgtca gttacagacc agagagccgc tttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcatttcac cgctacacat ggagttccac tctcctcttc tgcactcaag tcttccagtt tccaatgcac tactccggtt aagccgaagg ctttcacatc agacttaaaa gaccgcctgc gttcccttta cgcccaataa atccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtga cttgctggtt agataccgtc 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 27 201200162 atcgaatgaa cagttactct cactcgtgtt cttctctaac aacagagttt tacgatccga agaccttctt cactcacgcg gcgttgctcc atcagacttg cgtccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtttgggcc gtgtctcagt cccaatgtgg ccgatcaacc tctcagttcg gctacgtatc atcaccttgg taggccgtta ccccaccaac tagttaatac gccgcgggtc catctaaaag cgatagcaga accatctttc atctaagaat catgcgatcc 1140 1200 1260 1320 1380

ttagagatat acggtattag cacctgtttc caagtgttat ccccttcttt taggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccactc aacttcttac ggtgaatgca agcattcggt gtaagaaagt ttcgttcgac ttgcatgtat taggcacgcc gccagcgttc gtcctgagcc aggatcaaac tct 1440 1500 1560 1573

28

Claims (1)

1. 201200162 七、申請專利範圍： 1. 一種唾液乳酸桿菌 SG-M6 SG-M6)，其 寄存編號為BCRC910454。 2. 如申請專利範圍第1項之唾液乳酸桿菌SG-M6,包含編碼如SEQ ID N〇:l所示之核苷酸序列。 3.—種唾液乳酸桿菌SG_M6之發酵產物，其係以申請專利範圍第 1項之唾液乳酸桿菌SG M6於培養基發酵後製得。 籲4.如申請專利範圍第3項之唾液乳酸桿菌SG_M6之發酵產物，發 酵產物係指經能培養出唾液乳酸桿菌SG-M6成分之培養基發酵 後的產物。 X 5. -種改善口腔内細菌群之保健組合物，其係包含如中請專利範圍 第項所述之唾液乳酸桿菌SG_M6或申請專利範圍第 酵產物。 6.如申請專利範圍第5 牙周細菌生長。 項之保健組合物，其係用以抑制個體口内之

   項之保健組合物’其中該牙周細菌包含變形 牙銀卟琳菌或黏放線菌。 7 ·如申晴專利範圍第6 鍵球菌、血鍵球菌、 8. 如申請專利範圍第6 頊又保健組口物其中該個體係哺澍#Λ榀 9. 如申請專利範圍铯Λ = 腥你再礼動物。 項之保健組合物，其中該個體係人。 10. 如申請專利範圚笛 < 祖你人 第6項之保健組合物，係呈錄劍地μ 食品、醫藥品禾“ 你呈錠劑、喷劑、溶液、 ，、+加劑或口腔清潔用品添加劑之任—樣態。