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TW200902064A - Methods and compositions for modulating IL-17F/IL-17A biological activity - Google Patents

Methods and compositions for modulating IL-17F/IL-17A biological activity Download PDF

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Publication number
TW200902064A
TW200902064A TW097110997A TW97110997A TW200902064A TW 200902064 A TW200902064 A TW 200902064A TW 097110997 A TW097110997 A TW 097110997A TW 97110997 A TW97110997 A TW 97110997A TW 200902064 A TW200902064 A TW 200902064A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
antagonist
signaling
cells
mil
antibody
Prior art date
Application number
TW097110997A
Other languages
English (en)
Inventor
Jill F Wright
Spencer C Liang
Frances K Bennett
Mary Collins
Beatriz M Carreno
Original Assignee
Wyeth Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wyeth Corp filed Critical Wyeth Corp
Publication of TW200902064A publication Critical patent/TW200902064A/zh

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Description

200902064 九、發明說明： 本申請案主張提申於2007年3月28日美國臨時申請案 U.S. No. 60/920,591及提申於2007年4月5日之美國臨時申 請案No. 60/922,175之權利，其兩者之全部内容皆被於此 5 併入作為參考。 I：發明所屬之技術領域3 發明領域 本發明係關於引發IL-17F/IL-17A訊息傳遞路徑會引 起發炎反應，例如呼吸道發炎的發現以及關於阻斷 10 JL-HF/IL-nA訊息傳遞路徑可預防及/或治療 IL-17F/IL-17A-相關疾病，例如，發炎，例如呼吸到發炎的 發現。因此，本發明係關於IL-17F/IL-17A訊息拮傳遞抗 劑，例如對於IL-17F/IL-17A拮抗的抗體或其片段、可溶 性受體、小分子、抑制性多核苷酸等。該抗體以及其它 15 IL_17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑在診斷、判斷預後、監控、 預防以及治療IL-17F/IL-17A-相關疾病，例如，發炎性疾病 (e.g_，自體免疫疾病（e.g.，關節炎）、呼吸道疾病（e.g.,呼吸 道發炎、COPD、囊腫纖維化、氣喘、肺部惡化e.g·,由於細 菌性發炎反應)）、發炎性腸疾（e.g.,潰瘍性大腸炎、克隆 20 氏症))以及移植排斥之方法中係有用的。 C先前技術]1 發明背景 IL-17細胞介素(cytokine)家族由六個結構相關連之蛋 白質（IL-17A，IL-17B, IL-17C, IL-17D，IL-17E,以及IL-17F) 200902064 所構成，其等之功能現今已經被闡明。此家族最被特徵化 之分子係IL-17A。IL-17A主要由Thl7細胞所表現，該細胞 係一子集之CD4+ T細胞，且IL-17A係已知透過二受體 IL-17RA (亦在先前技術中已知為aIL-17R)及IL-17RC來傳 5 遞訊息（Aggarwal et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:1910-14; Langrish et al. (2005) J. Exp. Med. 201:233-40; Veldhoen et al. (2006) Immunity 24:179-89; Bettelli et al. (2006) Nature 441:235-38; Mangan et al. (2006) Nature 441:231-34; Yao et al. (1995) Immunity 3:811-21; Toy et al. (2006) J. Immunol. 10 177:36-39)。雖然這些受體係被廣泛的表現，IL-17A被相信 主要係作用於實質細胞（parenchymal cells)上，諸如纖維 母細胞、上皮細胞以及内皮細胞。經由IL-17A之訊息傳遞 增加基質金屬蛋白酵素（matrix metalloproteinase )以及促 發炎細胞介素（proinflammatory cytokine )表現(如同Kolls 15 and Linden (2004) Immunity 21:467-76; Weaver et al. (2007) Annu. Rev. Immunol. 25:821-52 中所探討者）。IL-17A亦透過 CXC細胞激素（chemokines)及G-CSF之誘導作用以招募嗜 中性球至周圍處。IL-17A之表現被加強於數個包括嚴重氣 喘、慢性阻塞性肺臟疾病（COPD)以及囊腫纖維化之肺部疾 20 病中，於其中嗜中性球係存在的（Barczyk et al. (2003) Respir. Med. 97:726-33; Molet et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108:430-38; Wong et al. (2001) Clin. Exp. Immunol. 125:177-83; Shen et al. (2004) Zhonghua Nei Ke Za Zhi 43:888-90; McAllister et al. (2005) J. Immunol. 200902064 175:404-12)。因此，相當多的關注已經被放在IL-17A於呼 吸道疾病之致病性的角色。 投予IL-17A於呼吸道中透過加強CXCLl(KC)及 CXCL2 (MIP-2)之表現係足以引發嗜中性球相當大的增加 5 (Laan et al. (1999) J. Immunol. 162:2347-52; Ferretti et al. (2003) J. Immunol. 170:2106-12)。於LPS-驅動之呼吸發炎的 模式中，IL-17A之中和顯著地降低嗜中性球的數目（Ferretti et al. (2003) supra; Miyamoto et al.(2003) J. Immunol. 170:4665-72)。這樣的數據指出IL-17A於調控呼吸道發炎及 10 嗜中性球徵召中有重要角色。 在其餘五個IL-17家族成員中，IL-17F係與IL-17A關係 最密切的。該二個分子享有高度的同源性（約57%相似以及 52%相同），且係於相對應染色體的（syntenic )(兩者皆位 於老鼠之染色體1A4上）。如同IL-17A ，IL-17FimRNA及 15 蛋白質已於Thl7細胞中被偵測到（Langrish et al. (2005) supra', Liang et al. (2006) J. Exp. Med. 203:2271-79)° IL-17F 存在為一同塑二聚體（homodimer)，採取一透過半胱氨酸 交互作用所形成之四個半胱氨酸結，其中一半胱氨酸係負 責鏈間的結合（Hymowitz et al. (2001)五細〇 /· 20 20:5332-41)。這些半胱氨酸於IL-17A也是高度保守性的， 暗示IL-17A具有一與IL-17F相似之同型二聚體結構。 IL-17A及IL-17F也據信係共用相同的受體，暗示具有相同 功能（Toy et al· (2006) Kramer et al· (2006) 乂 /mmwnoA 176:711-15)。大部分IL-17F功能的研究以測試人 200902064 類細胞介素之功效。於試管研究中使用重組人類IL-17F已 證實IL-17F可以從初級人類上皮細胞引發G-CSF及 CXCL(McAllister et al· (2005) «supra)。使用一腺病毒載體過 量表現人類IL-17F或使用肺基因轉殖於老鼠呼吸道來過量 5 表現老鼠IL-17F引發嗜中性球之數目以及細胞激素之表現 顯著增加（Hurst et al· (2002)/. 169:443-53)。雖然 這些研究指出於呼吸道中IL-17A及IL-17F具重疊的功 能，亦很有可能係具非冗餘的特徵。與此一致，IL-17A-缺 失之老鼠具有一深度的表現型，其似乎無法藉由IL-17F表 1〇 現來被抵銷（Nakae etal. (2003)/· /wmwwo/. 171:6173-77)。 IL-17 A及IL-17F間之南度序列同源性以及其半耽氨酸 保守的位置暗示IL-17A及IL-17F之異型二聚體（異型二 聚體）可存在；經由Thl7細胞共同表現IL-17A及IL-17F進 一步支持了這個可能性。最近，人類IL-17F/IL-17A異型 15 二聚體的存在已經由使用生化及物化方法被證實了 (Wright et al. (2007) J_ Biol. Chem. 282:13447-55;亦參見 U.S.專利申請案No. 11/353,161，其全文被於此併入作為參 考）。質譜測定法由初級人類CD4+T所產生之天然的 IL_17F/IL-17A異型二聚體的質譜測定法分析已經顯示鏈間 20 雙硫鍵鍵結的胜肽的存在，包含一來自IL-17F胜肽以及一 來自IL-17A之胜肽。此暗示了 IL-17F/IL-17A異型二聚體之 存在’該二聚體可能具有新穎之功能。 除了製造IL-17A及IL-17F，Thl7細胞也製造IL-22，一 IL_l〇 豕族成員（Liang et al_ (2006) supra; Chung et al. (2006) 200902064
Cell Res. 16:902-07; Zheng et al. (2007) Nature 445:648-51;
Renauld (2003) Nat. Rev. Immunol. 3:667-76)。IL-22作用於 上皮細胞及一些纖維母細胞上’且已經被顯示於發炎反應 上扮演一角色。IL-22引起一表示急性相反應之基因表現 5 (Wolk et al. (2004) Immunity 21:241-54)。與IL-17A及IL-17F 相似，IL-22也可加強基質金屬蛋白酵素、細胞激素及細胞 介素於某些組織中的表現(Wolk et al. (2004) supra; Ikeuchi et al. (2005) Arthritis Rheum. 52:1037-46; Andoh et al. (2005) Gastroenterology 129:969-84; Boniface et al. (2005) J. 10 Immunol. 174:3695-02)。IL-22 與IL-17A及IL-17F由Thl7細 胞所共同表現暗示細胞介素可一起作用以媒介發炎反應。 然而，在本發明被揭露於此的之前，無論人類IL-17F/IL-17A 異型二聚體或老鼠IL-17F/IL-17A異型二聚體之受體皆非為 人所知且皆係不可取得用以研究IL-17F/IL-17A之生物活 15 性。 【發明内容】 發明概要 本發明提供人類IL-17F/IL-17A異型二聚體之受體，以 及人類IL-17F/IL-17A之生物活性。本發明也提供一新穎老 20 鼠蛋白質’其係一IL-17F/IL-17A異型二聚體。由鼠Thl7 細胞所表現之鼠IL-17A、鼠IL-17F/IL-17A以及鼠IL-17F的 特徵之描述、鼠IL-17A、鼠IL-17F/IL-17A以及鼠IL-17F於 試管中之功能及活性的比較以及鼠IL-ΠΑ、鼠 IL-17F/IL-17A以及鼠IL-17F在活體中於嗜中性球之招募及 10 200902064 細胞激素之製造上所扮演之角色的比較也在此被揭露。此 外’用以測試這些細胞介素於調節呼吸道發炎反應之Thl7 細胞採用的傳送模型（Th 17 cell adoptive transfer model) 被建立。在此§登明的係mlL-17F及mIL-22於呼吸道中與 5 mIL-17A或mIL-17F/IL-17A並不具有重疊的功能且證明鼠 IL-17F/IL-17A係具生物活性且可於活體中引發嗜中性球 之徵召。因此’本發明提供IL-17F/IL-17A訊息傳遞路徑作 為一用於預防及/或治療許多疾病，例如，呼吸道發炎、關 節炎、氣喘、過敏、COPD、囊腫纖維化、克隆氏症（Cr〇hn，s 10 disease)等的標的。 本發明提供多種關於IL-17F/IL-17A異型二聚體及 IL-17F/IL-17A訊息傳遞的方法以及組成物。因此於至少一 具體例中，本發明提供一種用於可拮抗IL-17F/IL-17A訊息 傳遞之化合物篩選的方法，使一含有包含以下步驟：使含 有IL-17F/IL-17A及IL-17R之試樣與多數個測試化合物中 之一者接觸；以及判定相對於於一沒有與該測試化合物接 觸之試樣中的IL-17F/IL-17A之生物活性，於試樣中之 IL-17F/IL-17A的生物活性是否係較減少的，經由此種於與 該測試化合物接觸的試樣中之IL-17F/IL-17 A生物活性的減 2〇 少確認出該化合物為一IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。於 至少另一具體例中，該方法進一步包含一識別是否該 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑係一具專一性之 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑的第一或一最終步驟。於至 少一其它具體例中，該確認之步驟進一步包含下面步驟： 200902064 使一含有IL-17 A及IL-17R之試樣與該IL-丨7F/IL_丨7A訊息傳 遞括抗劑接觸；決定於該試樣中之IL-17A的生物活性是 否相對於在一未與該IL-17F/IL-nA訊息傳遞拮抗劑接觸2 試樣中的IL-17A之生物活性係被減少的；將含有il_17f及 5 IL-17R之試樣與該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸；以 及決定於該試樣中之IL-17F的生物活性是否相對於在一未 與該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸之試樣中的丨 之生物活性係被減少的’其中由該iL_17f/il_17A訊息傳遞 拮抗劑在將IL-17F及IL-17A兩者之生物活性皆降低之失敗 10 可確δ忍遺IL-17F/IL-17A §fl息傳遞拮抗劑為一具專一性 IL-17FAL-17A訊息傳遞拮抗劑。於至少另一具體例中，本 發明提供一由這些方法中之一者所確認出的化合物。 於至少一具體例中’本發明提供一筛選能夠拮抗 IL-17FAL-17A訊息傳遞之化合物的方法，包含下面步驟： 15 使一含有1L-17F/IL- ΠA及IL-17RC之試樣與多數個測試化 合物中之一者接觸；以及決定是否於該試樣中之 IL-17FAL-17A的生物活性相對於於一未與該測試化合物接 觸之試樣中的IL-17F/IL-17A之生物活性係減少的，藉由此 一於與該測試化合物接觸之試樣中的IL-17F/IL-17A之生 20 物活性的減少確認該化合物係一 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮 抗劑。於至少另一具體例中，該方法進一步包含確認是否 該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑係一具專一性之 IL-17F/IL-17A訊息傳遞抬抗劑的第一或最後一步驟。於至 少另一具體例中，該確認之步驟進一步包含使一含有 12 200902064 IL-17A及IL-17RC之試樣與IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑 接觸；決定是否於該試樣中之IL-17A的生物活性相對於於 一未與該IL-17F/IL-17 A訊息傳遞拮抗劑接觸之試樣中的 11^-17八之生物活性係減少的；使一含有11^17?及11^1711〇 5 之試樣與該1l-pf/zl-pa訊息傳遞拮抗劑；且決定是否於 該試樣中之IL-17F的生物活性相對於於一未與該 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸之試樣中的IL_ 17F之生 物活性係減少的。 藉由IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑減少IL-17F及 10 IL-17A兩者之生物活性的失敗識別該mF/mA訊息傳 遞拮抗劑為一具專一性IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。於 至少另一具體例中，本發明提供一由這些方法中之—者所 識別之化合物。 於至少一具體例中，本發明提供一於一對象中抑制 15 IL-PF/IL-nA之生物活性的方法，該方法包含投予該對象 一IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。於至少另一具體例中， 本發明提供一於一細胞群體中抑制GRO-α分泌之方法，該 方法包含投予該細胞群體一IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗 劑。於至少另一具體例中，本發明提供一治療—有 20 IL-17F/IL-17A-相關疾病風險或被診斷有IL-l7F/IL-17A-相 關疾病之對象的方法’該方法包含投予該對象一治療有致 1之IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。於至少又一具體例 中，該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑係一專—性 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。於至少另一其他具體例 13 200902064 中’该IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑係選自於由一拮抗性 小分子及一拮抗性抗體所構成之組群。於至少另一具體例 中’该拮抗性小分子係對IL-17F/IL-17A具專一性的。於至 少另—具體例中’該拮抗性抗體係對於IL_17F/IL_17A具專 5 一性的。於至少另一具體例中，該IL-17F/IL-17A訊息傳遞 拮抗劑係一由本發明之方法所識別出之化合物。於至少另 八體例中，§亥IL-17F/IL-17A-相關疾病係一發炎疾病。於 至少另—具體例中，該IL-17F/IL-17A-相關疾病係一呼吸疾 病。於至少又一具體例中，該呼吸疾病係選自於由呼吸道 10 發炎、氣喘及COPD所構成之組群。 於至少一具體例中，本發明提供了一藥學組成物包含 一 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑以及一藥學上可接受之載 劑。於至少另一具體例中，該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗 劑係選自於由一拮抗性小分子及一拮抗性抗體所構成之組 15 群。於至少另一具體例中，該拮抗性小分子係對於 IL-17F/IL-17A具專一性。於至少另一具體例中，該拮抗性 抗體係對於IL-17F/IL-17A具專一性。於至少另一具體例 中，該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑係一由本發明之方法 所辨識之化合物。 20 於至少一具體例中，本發明提供一經分離之可專一性 地與IL-17F/IL-17A異型二聚體結合的抗體。於至少另一具 體例中，該抗體抑制IL-17F/IL-17A之訊息傳遞。於至少另 一具體例中，本發明提供一可專一性地結合il_17f/il_17a 異型二聚體之小分子。於至少另一具體例中，該小分子抑 14 200902064 制IL-17F/IL-17A之訊息傳遞。 於至少一具體例中，本發明提供一於對象中引發呼吸 道發炎之方法，包含投予該對象IL-17F/IL-17A。於至少另 一具體例中，該對象係一老鼠。 5 圖式簡單說明 第1圖顯示增加濃度（ng/ml細胞介素；x_軸）之人類 IL-17A (hIL-17A; ♦)、人類 IL-17F (hIL-17F;鲁）或人類 IL-17F/IL-17A (hIL-17F/A; p)細胞介素與IL-17R.FC受體 (第1A圖）或IL-17RC.FC受體（第1B圖）之結合(O.D. 450nm; 10 y-軸），依照經由ELISA之測定。 第2圖顯示在以增加濃度(ng/ml of細胞介素；X-軸)之 人類IL-17A (IL-17A; ♦)、人類IL-17F (IL-17F; π)或人類 IL-17F/IL-17A (IL-17F/A;〇）處理BJ細胞後來自BJ細胞之 GRO-α釋放(pg/ml GRO-α; y-軸）所代表的人類IL-17A、人類 15 IL-17F以及人類IL-17F/IL-17A功能（生物）活性。GRO-a釋 放係藉由ELISA來測定。 第3A圖及第3B圖顯示來自BJ細胞之相對的GRO-a釋 放(相對反應(Relative Response); y-軸），其係由1 ng/ml人 類 IL-17A 、50 ng/ml 人類 IL-17F 或 5 ng/ml 人類 20 IL-17F/IL-17A細胞介素於（第3A圖）可溶性受體融合蛋白 質 hIL-17R.Fc、hIL-17RC.Fc，或hIL-17R.Fc及hIL-17RC.Fc 之組合以及（第3B圖）抗-hIL-17R及抗-hIL-17RC抗體存在下 被引發。對照之抗體被包括於兩個實驗中。 第4A圖以及第4B圖顯示四個IL-17R siRNAs (R-1、 15 200902064 R-2、R-3及R-4; x-軸）以及四siRNAs (RC-l、 RC-2、RC-3 ' RC-4; x-軸）分別地於hIL-17A-及hIL-17F-所 引發之由BJ細胞而來之GRO-a釋放(相對反應；y_軸）上之 影響。”Tagman (探針），，代表在治療條件下IL_17R (第4A 5 圖）或IL-17RC (第4B圖）mRNA相對的量。“Mock”代表僅 使用培養基及轉染試劑。“NTC1”代表以非專一性對照組 siRNA轉染。於分別以hIL-17R以及hIL-17RC轉染之 HEK293細胞中siRNA轉染在hIL-17R以及hIL-17RC表現上 的衫響措由西方墨點法被顯示於第4C圖。肌動蛋白之西方 10 墨點代表蛋白質載入的對照組。 第5圖代表於經減少濃度（^軸）之人類il_17a(第5A 圖）、人類IL-17F (第5B圖）或人類IL-17F/IL-17A (第5C圖） 處理之BJ細胞中，IL-17R siRNA (R-3及 R-4)以及 IL-17RC siRNA (RC-2 及 RC-4)之處理在 GRO-α 釋放（pg/mlGROa; 15 y-axes)上的影響。NTC1代表以非專一性對照組siRNA來轉 染。
顯示於第6A圖中的係經針對几_17? (y-軸）及IL-17A (X-軸）細胞内染色之CD4+CD62L+ (na.ive) DOll T細胞的流 式細胞儀點陣圖（flow cytometric dot plots)，該細胞係經 照射脾細胞活化四天，1 pg/ml OVA323-339，且經以下列三 種細胞介素之一種處理：TGF-β、IL-6或TGF-β及IL-6 (TGF-β ’ IL-6)兩者。顯示於第6B圖中地係經經照射脾細 胞，lpg/ml OVA323-339，活化以經TGF-β及IL-6兩者之活 化 1天、2天、3天或4天後之CD4+CD62L+ (naive) DOll T 16 200902064 細胞的流式細胞儀點陣圖。其係經對於小鼠IL-17F (y-軸) 及小鼠IL-17A (X-軸)細胞内染色的。所有的圖被限制(gated) 於CD4+D011 T細胞上。數據係代表三個分開的實驗。 顯示於第7A圖中的係經純化重組小鼠 5 IL-17F/IL-17A,、小鼠 IL-17A或小鼠 IL-17F蛋白質（35 ng每 道）以（左圖⑴)抗-IL-17A抗體或（右圖（ii))抗-IL-17F抗體 分析之西方墨點。小鼠IL-17F/IL-17A之大小係由於使用於 其純化的標籤(tag) η (見實施例2·2.2)而被改質。 第7Β、7C及7D圖顯示各種濃度(ng/mi; X-轴）之經純化 10 重組小鼠IL-17A (空白的正方形）、小鼠IL-17F/IL-17A (填滿 的圓圈）或小鼠IL-17F (填滿的三角形）藉由小鼠仏-丨了八（第 7B 圖）、小鼠 IL-17F/IL-17A(第 7C 圖）或小鼠 IL-17F (第 7D 圖） 之定量ELISA的偵測結果(〇.d_; y-軸）。插入圖代表較低濃 度之放大的視圖，以虛線代表偵測的極限。 15 第7E圖顯示小鼠IL-17A (空白柱體）、小鼠 IL-17F/IL-17A (具影線柱體）或小鼠IL-17F (經填滿柱體)經 由CD4+CD62L+D011 T細胞之製造，該細胞於初級活化中 經經照射脾細胞，1 pg/ml OVA323-339以及所經指定之細 胞介素（Χ·軸）活化七天。第7F圖顯示小鼠IUl7A (空白柱 20體）、小鼠1L-17F/IL-17A (具影線柱體）或小鼠IL_17F (經填 滿柱體）藉由CD4+CD62L+ D011 T細胞之製造（ng/ml; y-轴），該細胞於初級活化中經經照射之脾細胞，丨pg/ml OVA323-339，及經被指定之細胞介素(x_軸；‘‘初次”（亦即， TGFH6及IL-1& 或咖-石、IL_6、IM/3AIL 23)) 17 200902064 活化七天、收穫、靜置整夜且為了二次活化以經照射脾細 胞、IL-2及 1 pg/mlOVA323-339 單獨（-)或添加下列IL_23、 抗-IFN-γ抗體(txIFN-γ以及抗-IL-4抗體(aIL-4)來再刺激。關 於第7E圖及第7F圖，在第四天各個活化後，條件培養基針 5 對IL-17A、IL-17F/IL-17A及IL-17F被分析，所顯示的數據 係平均土 SD且*代表<lng/ml之IL-17A。第7E圖及第7F圖 代表至少三個實驗。 第8圖顯示由鼠肺上皮(MLE-12)細胞所分離出之條件 培養基之CXCL1濃度(CXCL1 (pg/ml); y-軸）’該等細胞以小 10 鼠1L_i7A(空白的正方形）、小鼠IL-17F/IL-17A(經填滿的 圓圈）以及小鼠IL-17F (經填滿的三角形）在各種濃度（細胞 介素（ng/ml); X-軸）（第8A圖）被培養24小時；在各種濃度之 經50 pg/ml之兩種不同的抗_il-17F抗體(ctIL-17F(RK015-01) (經填滿之圓圈）或aIL-17F(RK016-17)(經填滿之三角形）） 15 或大鼠〗gG1 (空白之正方形）預培養的小鼠IL-17F (IL-17F (ng/ml);x-軸）中培養24小時（第8B圖）；或於200 ng/ml之經 8(Vg/ml之所示抗體或多數抗體（χ_轴）預培養之小鼠 IL-17F/IL-17A培養小時（第叱圖）。關於第8Α、8Β，及8C圖， 虛線代表沒有的外因之細胞介素存在的MLE-12細胞所產 20生之CXCL1的基本量。所有數據被表示為平均土SD且係代 表三個實驗。 第9圖表示：（第9A圖）於BAL流體中之小鼠 IL-17F/IL-17A (IL-17F/IL-17A (pg/ml); y-軸）以及小鼠IL-22 (IL-22 (pg/ml); y-軸）的濃度；（第阳圖）於bal流體中嗜中 18 200902064 性球、嗜酸性球、淋巴細胞及單核球（x_軸）的不同細胞量 (細胞(xl〇5);y-軸）；或（第9C圖）H&E組織學於分離自對照 組天真（naive) BALB/c動物之40X放大率之肺（“a”表 示呼吸道内腔且“v”表示血管），該Balb/c動物得到 5 2.5xl06Thl7細胞被24小時後接續地以PBS鼻内地刺激一天 一次連續不斷二天，（空白柱體（於第9A圖及9B圖）； Thl7/PBS);分離自未得到Thl7細胞且接續地以乃吨印白 蛋白（OVA)鼻内地刺激一天一次連續不斷三天的對照組天 真的BALB/c動物’或分離自得到2.5xl〇6 Thl7細胞且24小 10 時後接續地以75 pg印白蛋白（OVA)鼻内地刺激一天·一次連 續不斷三天的對照組天真的BALB/c動物（經填滿柱體； Thl7/OVA)。關於第9A及9B圖，數據係平均± SEM。關於 第9A、9B及9C圖，n = 5-6隻每群小鼠，且數據係代表至少 兩個實驗。 15 第10圖表示：（第l〇A圖）嗜中性球之數量（細胞(χΐ〇5); y-軸）’（第10B圖）小鼠之CXCL1之濃度(ng/ml; y-軸）或（第 10C圖）於BAL流體中分離自對照組動物之CXCL5的濃度 (ng/ml; y-軸），該動物沒有得到Thl7細胞χ—軸)但接續地 經卵白蛋白（OVA; +)鼻内地刺激，或該動物係得到Thl7細 20 胞（+) ’未經處理(_)或經針對小鼠IL-17A (抗IL-17A(50104) 之中和抗體(mAb)、針對小鼠比_171?(抗IL_17F (RK015-〇l)) 之中和抗體或針對小鼠IL-22 (抗IL-22 (Ab-01))之中和抗 體或適當之同型對照組抗體(IgG2a或IgG 1)處理且接續經卵 白蛋白（OVA; +)鼻内地刺激。該bal流體係在最後之卵白 19 200902064 蛋白刺激的24小時後被收集。數據係平均±SEM，^ == 8-9隻 每群小鼠且係表示二或三個實驗，依據抗體而定。 第11A - 11E圖顯示嗜中性球之數量（細胞， y-軸）(A-C) ’ CXCL1 濃度（pg/mi; y·軸）(八、b 及 D)以及 5 CXCL5濃度(pg/ml; y-軸)(A、B及E)於BAL流體，該流體係 於小鼠被投予（A)每日一鼻内劑量15吨之小鼠IL_17A或小 鼠IL-17F (X-軸），（B)鼻内劑量i.5pg之小鼠IL-17A或小鼠 IL-17F (X-轴)連續不間斷三天或(C-Ε) —鼻内劑量I.5畔之 小鼠IL-17A、小鼠IL-17F/IL-17A、小鼠IL-17F或小鼠 10 IL-22 (X-軸)後的24小時被分離。對照動物係被投予磷酸鹽 緩衝液（PBS)。數據係平均土 SEM，n=7，且係表示二個實 驗。全部的p值係相對於僅接受PBS之對照組動物來被計 算。 第12A圖及第12B圖表示使用二不同抗-IL_17F抗體作 15 為捕捉抗體之重組小鼠IL-17A (空白正方形）或小鼠 IL-17F/IL-17A (經填滿之圓形）之不同濃度細胞介素 (ng/ml); X-軸）的ELISAs測定光密度(O.D.; y-軸）的結果（A) 抗-IL-17F (RK015-01)或（B)抗-IL-17F (RK016-17)連接至 ELISA盤上，其已以山羊抗-大鼠IgGl預塗覆且使山羊抗-小 20 鼠IL-17A作為偵測試劑。第12C圖顯示CXCL1 (“CXCL-lpg/ml”； y-軸）於以200 ng/ml IL-17A經培養24小 時之MLE-12細胞中分離之培養基的濃度，該IL-17A已以 50 pg/ml之下列抗體中之一者(X-軸）預培養：IgG2a，抗-小 鼠 IL-17A (抗-mIL17A(50104))、大鼠IgGl (rlgGl)、抗-小 20 200902064 鼠 IL-17F (抗-mIL17F(RK015-01))以及抗-小鼠IL-17F (抗 mIL17F(RK016-17))。 第13圖顯示嗜中性球(細胞(χ1〇5)之數量;左圖，y-軸）以 及CXCL5 (ng/ml;右圖，y-軸)於BAL流體中之濃度，該流體 5 係分離自對照動物，該動物係沒有得到Thl7細胞（-;x-軸) 但接續地經卵白蛋白（OVA i.n.;+)鼻内地刺激或該動物係 得到Thl7細胞(+)但未經處理㈠或經針對小鼠IL-17F (抗 -IL-17F (RK016-17))之中和單株抗體(mAb)或一適當同塑 對照抗體(IgGl)處理且接續地經卵白蛋白鼻内地刺激。該 10 BAL流體係在最後之卵白蛋白刺激的24小時後被收集。數 據係平均土 SEM，η = 8-9隻每群小鼠且係表示二或三個實 驗，依據抗體而定。 L實施方式3 較佳實施例之詳細說明 15 本發明係部分地以兩個研究為基礎；一研究說明人類 (h) IL-17F/IL-17A之訊息傳遞路徑以及其他未被揭露之新 穎小鼠（m) IL-17F/IL-17A異型二聚體及其於活體中之生 物活性。這些研究被單獨或一起被拿來提供於至治療 几-17尸/11^17八相關疾病之方法中治療11^17[肌-17八訊息 2〇 傳遞路徑的基礎。
發明者證實hIL-17F/IL-17A，最近所鑑定之IL-17細胞 介素家族之一員，使用與hIL-17F及hIL-17A相同的受體複 合物。發明者研究人類IL-17R(hIL-17R)及人類IL-17RC (hIL-17RC)受體於人類 IL-17F (hIL-17F)、人類 IL-17A 21 200902064 (hIL-17A)及人類 IL-17F/IL-17A (WL-17F/IL-17A)異型二 聚體之生物活性上的角色。使用各種方法，包括Biacore及 siRNA，發明人特徵化關於人類IL-17F, hIL-17A及 hIL-17F/IL-17A結合於hIL-17R及hIL-17RC之交互作用及動 5 力學參數。使用可溶性ML-17R及hIL-17RC受體、對抗這些 受體之抗體，以及針對這些受體之受體siRNA分子，發明人 證實hIL-17R以及至一較少的程度，hIL-17RC對於三個 hIL-17細胞介素（亦即，hIL-17A、hIL-17F及hIL-17F/IL-17A) 之生物活性係必須的。再者，發明人提供了 hIL-17R於 10 hIL-17A-及hIL-17F/IL_17A-所媒介之反應中佔主要地位的 證據，而hIL-17RC對於ML-17F之生物活性似乎係較IL-17R 重要。因此，本發明係部份基於下列發現：（1) WL-17A、 hIL-17F以及hIL-17F/IL-17A具相同親和性結合至 hIL-17RC受體；（2) hIL-17A對於hIL- 17R受體具有最高的親 15 和力，接著係hIL-17F/IL-17A異型二聚體，接著係hIL-17F; (3) hIL-17A、ML-17F及hIL-17F/IL-17A引發促發炎細胞介 素（例如，GRO-α)之釋放；（4) ML-17R以及WL-17RC係 hIL-17F、hIL-17A 及 hIL-17F/IL-17A 訊息傳遞所需的。 hIL-17F/IL-17A結合至hIL-17R及hIL-17RC的發現提供此 20 訊息傳遞路徑作為治療，例如，發炎性疾病、呼吸道疾病、 自體免疫及定以及移植排斥，之方法的標的。 先前被報導的係hIL-17R對於hIL-17A及WL-17F (McAllister et al. (2005) J. Immunol. 175:404-12)之功能性 活性係必須的。又，最近已經被顯示的係WL-17R於沒有配 22 200902064 位體存在之細胞表面自我結合且受體結合於hIL-17A時由 於構造改變而被降低（Kramer et al_ (2006) J. Immunol. 176:711-15)。另一研究提出配位體結合改變hIL-17R之構造 以促進一與hIL-17RC之功能性、異型交互作用（Toy et al. 5 (2006) J. Immunol. 177:36-39)。關於本發明之研究暗示 IL-17R/IL-17RC細胞表面受體複合物於細胞介素之生物活 性中的角色。 發明人進一步發現小鼠Thl7細胞也產生小鼠 IL-17F/IL-17A(mIL-17F/IL-17A)異型二聚體蛋白質。而天 10 真CD4+ T細胞朝向Thl7分化表現高於mIL-17A (mIL-17A) 同型二聚體之量且低於小鼠IL-17F (mIL-17F)同型二聚體 之量的mIL-17F/IL-17A，經分化Thl7細胞表現相當於小鼠 同型二聚體兩者之量的mIL-17F/IL-17A。這個結果表示由 Thl7細胞所產生之IL-17A、IL-17F/IL-17A及IL-17F之相對 15 量係根據分化的階段所調控。這些於試管中的觀察暗示於 活體中在適應性免疫反應之早期分化Thl7細胞對於IL-17A 表現之限制。 最近，RORyt及STAT3轉錄因此已經被辨識出係Thl7 分化的調控子（Ivanov et al. (2006) Cell 126:1121-33; Chen 2〇 et al. (20〇6) Proc· Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:8137-42)。所
觀察到不同的量變曲線可係關於這些或其他未經辨識出之 轉錄因此於天真細胞相對於經分化Thl7之分化表現。也可 能在基因座編碼IL-17A及IL-17F之間有轉錄可達性之不 同。發明人也證實於試管中’ mIL-17F/IL-17A係較mIL-17F 23 200902064 有能力且較mIL-17A不具能力。以mIL-17A-專一性抗體而 不以mIL-17F-專一性抗體對mlL-17F/IL-17A之中和減少 mIL-17F/IL-17A大部分之活性。此暗示mIL-17A及 mIL-17F/IL-17A具有至少一保守性受體結合部位，該部位 5 係由mIL-17A-專一性抗體所阻斷。為了於活體中研究這些 細胞介素，發明人建立一Thl7細胞採用轉移模式，其特徵 為呼吸道中經增加的嗜中性球。一mIL-17A-專一性抗體完 全地避免Thl7細胞所引發之嗜中性球增多症以及CXCL5表 現，而對於mIL-17F或mIL-22具專一性之抗體不具有功效， 10 後者mIL-22係一細胞介素，亦由Thl7細胞所產生。直接投 予 mIL-ΠΑ 或 mIL-17F/IL-17A 蛋白質而非 mlL-17F 或 mIL-22於呼吸道中顯著地增加嗜中性球及細胞激素表現。 一起考量，小鼠數據證實mIL-17F及mIL-17A不具有相同功 能。此外，該小鼠數據證實一新穎mIL-17F/IL-17A異型二 15 聚體之表現及功能且顯示於活體中此細胞介素於呼吸道於 炎，例如，呼吸道嗜中性球增多症，中之角色。兮 IL_17F/IL-17A異型二聚體代表一可媒介Thl7細胞之某些功 能的新蛋白質，且加入於Thl7譜系所產生之細胞介素間的 另一方面可能功能性協同作用。 20 之多核苷酸及多肽。 除非有其他的指示且除非内文有不同要求，用技 “IL-17A”、“IL-17F”、“IL-17F/IL-17A” ； “IL-17R”（或 “IL-17RA”）及“IL-17RC”沒有指定任何人類(h)或小鼠加） 之種類，廣泛地意指人類及小鼠種以及其他哺乳類種的各 24 200902064 IL-17A、IL-17F及 IL-17F/IL-17A細胞介素以及各IL-17R (或 IL-17RA)及 IL-17RC受體。 本發明進一步提供人類11^17?/比-17八訊息傳遞路徑之 特性描述，亦即，人類IL_17R及人類IL_17RC作為人類 5 IL-17A、人類IL-17F及人類IL-17F/IL-17A之共同受體的測 定。就其本身而論，本發明係關於人類IL-17F、人類 IL-17A、人類IL-17R及人類IL-17RC之多核苷酸以及多肽。 本發明也提供一新穎小鼠IL-17F/IL-17A異型二聚體。就其 本身而論，本發明係關於小鼠IL-17F及小鼠IL-17A之多核 10 苷酸以及多肽。 IL-17A核苷酸以及胺基酸序列係習知技藝中已知的。 一編碼人類IL-17A之核苷酸序列被提出為SEQ ID NO:卜其 包括一多（A)尾部（poly(A) tail)。核酸殘基54-521代表SEQ IDNO:l之開放讀架，其包括停止密碼子。由SEQIDNO:l 15 所編碼之全長的人類IL-17A蛋白質的胺基酸序列係被提 出為SEQIDNO:2。編碼小鼠IL-17A之cDNA的核苷酸序 列係被提出為8£卩10]^0:34。由8丑(^10 1^0:34所編碼之全 長小鼠IL-17A蛋白質的胺基酸序列被提出為SEQ ID NO:35。 20 IL-17F核苷酸以及胺基酸序列係習知技藝中已知的且 被提供的。編碼人類IL-17F之cDNA的核苷酸序列被提出 為SEQ ID NO:3。由該核苷酸序列所編碼之全長人類IL-17F 蛋白質之胺基酸序列被提出為阳卩ID N0:4。成熟1L_17F 蛋白質之胺基酸序列係相對應於由約SEQ ID NO:4之胺基 25 200902064 酸31起始的蛋白質（見，例如，美國專利申請案No. 10/102,080，其全部内容被併入於此作為參考）。編碼小鼠 IL-17F之cDNA的核苷酸序列被提出為SEQIDNO:36。由 SEQ ID NO:36所編碼之全長小鼠IL-17F蛋白質之胺基酸 5 序列被提出為SEQIDNO:37。 IL -17 R核苷酸以及胺基酸序列係習知技藝中已知的且 被提供的。編碼人類IL-17R之cDNA的核苷酸序列被提出 為SEQ ID NO:5，其包括一多（A)尾部。核酸殘基134-2734 代表SEQ ID NO:5之開放讀架’其包括一停止密碼子。由 10 SEQ ID NO:5所編碼之全長人類IL-17R蛋白質之胺基酸 序列係被提出為SEQIDNO:6。一額外的關於人類IL-17R 之核酸序列由NCBI編號No. BC011624所提供，且被提出 為SEQ ID NO:28。SEQ ID NO:28編碼866個胺基酸蛋白 質，被提出為SEQ ID NO:29。 15 IL-17RC核苷酸以及胺基酸序列係習知技藝中已知的 且被提供的。數個編碼人類IL-17RC之cDNA的核苷酸序列 被提出為SEQ ID NOs:7、9、11、13以及15，其包括多（A) 尾部。核酸殘基219-2594、219-2381、219-1835、219-1022 以及219-494分別代表SEQ ID NOs:7、9、11，13及5之開放 20 讀架，其包括停止密碼子。由SEQ ID NOs:7 ' 9、11、13 及15所編碼之全長IL-17RC蛋白質的胺基酸序列被分別列 為SEQIDNOs:8、10、12、14及 16。一格外之人類 IL-17RC 之核酸序列係由NCBI編號No. AY359098所提供，且被列為 SEQ ID NO:26。SEQ ID NO:26編碼一705胺基酸蛋白質， 26 200902064 被列為SEQIDNO:27。 關於本發明之核酸可包含DNA或RNA以及可係全部或 部份合成物。所提及之如在此所列之核苷酸序列包含一具 有特定序列之DNA分子或進一步包含具有特定序列之rnA 5 或其補體，其中U係由T所取代，除非内文中有其他要求。
The isolated與本發明相關之經分離之多核苷酸可被 使用作為雜交探針及引子用以辨識或分離具有與那些編碼 經揭露之多核普酸相同或相似序列之核酸。用於辨識及分 離核酸之雜交方法包括聚合酶連鎖反應(PCR)、南方雜交 10 法（Southern hybridizations )、原位雜交（in situ hybridization)以及北方雜交法，且係熟習此藝者所廣為人 知的。 15 雅又汉應°』在不同嚴格度之條件下進行。一雜交之嚴 格度包括任何兩個核酸分子彼此相互雜交之困難性。較佳 地，各雜交多核紐與其相對應之多料酸在經降低嚴格 度之條件下雜交。嚴格度條件之例子被顯示於下列表^中： 高度嚴格條件係那些至少與，例如條件A_F，_樣嚴格的； 嚴格條件係至少與，例如條件G_L，—樣嚴格的；以及經 降低嚴格度讀件餘讀，例如，條件M_R —樣嚴格的。 20
27 200902064
M. 格度條 件 多-核苷酸雜 種 (Hybrid) 雜 種長度 (bp)l 雜交溫度以及緩衝 液2 洗滌溫 度以及緩衝 液2 lxSSC E RNA:RNA >50 70°C; lxSSC —或-50°C; lxSSC，50%甲醯胺 70°C; 0.3xSSC F RNA:RNA <50 TF*; lxSSC TF*; lxSSC G DNA:DNA >50 65°C; 4xSSC -或-42°C; 4xSSC，50%甲醯胺 65°C; lxSSC Η DNA:DNA <50 ΤΗ*; 4xSSC TH*; 4xSSC I DNA:RNA >50 67°C; 4xSSC -或-45°C; 4xSSC, 50%甲醯胺 67°C; lxSSC J DNA:RNA <50 TJ*; 4xSSC TJ*; 4xSSC Κ RNA:RNA >50 70oC;4xSSd-5〇°C; 4xSSC, 50%甲醯胺 67°C; lxSSC L RNA:RNA <50 TL*; 2xSSC TL+; 2xSSC Μ DNA:DNA >50 50°C; 4xSSC -或-4〇°C; 6xSSC, 50%甲醯胺 50°C; 2xSSC Ν DNA:DNA <50 TN*; 6xSSC TN*; 6xSSC 0 DNA:RNA >50 550C; 4xSSC -或-42°C; 6xSSC, 50% 甲醯胺 55°C; 2xSSC Ρ DNA:RNA <50 TP*; 6xSSC TP*; 6xSSC Q RNA:RNA >50 60oC; 4xSSC —或-45°C; 6xSSC, 50% 甲醯胺 60°C; 2xSSC R RNA:RNA <50 TR*; 4xSSC TR*; 4xSSC 1:該雜種長度係被預期為雜交多核苷酸之經雜交的 區域。當雜交一多核苷酸至—未知序列的目標多核苷酸， 雜種長度係被假設為雜交多核苷酸之長度。當一已知序列 之多核普酸被雜交，該雜種長度可藉由比對多核苷酸之序 5 列以及辨識最佳序列互補性之區域或多數區域。
2: SSPE (lxSSPE係0.15M Naa，10mM NaH2P04且 l_25mM EDTA，pH 7.4)可被取代為 ssc (lxSSC係〇15M
NaCl且15mM檸檬酸鈉）於雜交及洗蘇緩衝液中 :洗蘇係在 雜父反應完成後被進行15分鐘。 B TR .對於被預期為少於5〇驗基之雜種之雜交溫 度應係少於該雜之融解溫度5膏c (Tm)，其巾Tm係根據 下列方程式所决疋。對於長度少於18個鹼基之雜種，Tm(〇c) ( T驗基）+ 4(G之#+C驗基）。對於長度於18到49 28 200902064 個鹼基之間的雜種 ’ Tm(°C) = 81.5 + 16.6(loglONa+) + 0.41(%G+C) - (600/N)，其中N係於雜種中鹼基之數目，以 及Na+係鈉離子於雜交緩衝液中之濃度（Na+用於lxSSC =0.165M)。 5 對於多核苷酸雜交之嚴格度條件的額外例子被提供於
Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11, r x and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. 10 Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4，其被合併於此作為參考。 本發明相關之經分離的多核苷酸被使用作為雜交探針 及引子以辨識及分離具有編碼被揭露之多核苷酸的對偶基 因變異體。對偶基因變異體係自然發生之經揭露多核苷酸 15 的替代型態，其編碼與經揭露之多核苷酸所編碼之多肽相 # 同或顯著相似之多肽。較佳地，對偶基因變異體與所揭露 I， 之多核苷酸具有至少90%序列相同度（較佳地，至少95%相 同度，最佳地係至少99%之相同度）。可擇地，顯著的相似 性存在當核酸片段在選擇性雜交條件下(例如，高度嚴格性 20 雜交條件)與經揭露之多核苷酸雜交。 與本發明相關之經分離的多核苷酸可被使用作為雜交 探針及引子用以辨識及分離具有編碼與被揭露之多核苷酸 同源之多肽之序列的DNAs。這些同源物（homolog)係分 離自與所揭露之多肽及多核苷酸不同種或於相同種的多肽 29 200902064 及多核苷酸，但其具有顯著相似於所揭露之多核苷酸及多 肽的序列。較佳地，多核苷酸同源體與被揭露之多核苷酸 具有至少50%之序列相同性（更佳地，至少75%相同性；最 佳地至少90%之相同性），而多肽同源物與被揭露之多肽具 5 有至少30%之序列相同性（更佳地，至少45%之相同性；最 佳地，至少60%之相同性）。較佳地，經揭露之多核苷酸及 多肽的同源體係分離自哺乳類物種中。 兩個序列之間之「同源性」或「序列相同性」的計算 被進行如下。該等序列可被比對為達最佳的比較效果（例 10 如，空位可被引入第一或第二胺基酸之一者或兩者或核酸 序列中為了最佳比對且為了比較之效果非同源序列可被忽 視）。於較佳之具體例中，一用於比較目的之被比對的對照 序列之長度係至少30%，較佳地至少40%，更佳地至少 50%，又更佳地至少60%，再更佳地至少70%、80%、90%、 15 100%之該對照序列之程度。於相對應之胺基酸位置或核酸 位置上之胺基酸或核算可接著被比較。當於第一序列中之 一位置被與於第二序列中相對應位置上相同之胺基酸或核 酸佔據時，則該等分子在該位置係相同具同源性的。於兩 序列間之相同性百分比（percent identity )係由該等序列所 20 共有之相同位置之數目的函數，且將空位之數目以及空位 之長度考量進去，該空位係為了兩序列之最佳比對而被引 入0 序列之比較以及兩序列間相同性百分比之決定可使用 數學演算法被完成。於一具體例中，兩個胺基酸序列之間 30 200902064 之相同性百分比係使用倪德曼與王氏（Needleman and Wunsch algorithm )演算法被決定（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-53)，其已經被併入於GCG軟體套裝程式之GAP程 式中（可於www_gcg.com取得），使用布拉珊（Blossum) 62 5 矩陣或aPAM250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4之空位 重量（gap weight)及1、2、3, 4, 5或6之長度重量（length weight)。於另一具體例，兩核苷酸序列之間的相同性百分 比係使用於GCG軟體套裝程式中之GAP程式來決定（可於 www.gcg.com取得），使用 NWSgapdna.CMP矩陣以及40、 10 50、60、70或80之空位重量以及卜2、3、4、5或6之長度 重量。一組較佳之參數（以及若從事者不確定哪個參數應該 被使用以決定是否一分子係於本發明之序列相同性或同源 性的限制内可被使用者）係一具有為12之空位罰分、為4之 空位擴大罰分以及為5之讀框移位罰分之布拉珊（B1〇ssum) 15 62得分矩陣。兩個胺基酸或核苷酸序列之相同性百分比亦 可使用 Meyers and Millei^演算法來決定（〇989) cabi〇s 4.11-17)，其已經被併入AUGN程式中（版本2 〇)，使用 PAM120重量殘基表，12的空位長度罰分以及4之空位罰分。 本發明相關之多核苷酸也可使用作為一雜交探針及引 20子用以辨識表現與本發明相關之多狀的細胞及組織以及辨 識在何條件下它們被表現。 此外，與本發明相關之多肽的功能皆可由使用編碼該 等多肽之多核苦酸以改變相對應於與本發明相關之多核皆 酸的基因的表現（亦即，加強、減少或改質）於-細胞或 31 200902064 生物中來被直接檢測。這些「相對應的基因」係與本發明 相關之基因體DNA序列，其被轉錄以產生mRNA，本發明 相關之多核苷酸係衍生自該等mRNA。 本發明相關之基因經改變的表現可於細胞或生物中經 5 由使用各種抑制性多核苷酸可被達成，抑制性多核苷酸係 諸如反義多核苷酸以及連接及分裂來轉錄自與本發明相關 之基因的mRNA的核糖酵素（rib〇zyme)(見，例如Galderisi et al. (1999) J. Cell Physiol. 181:251-57; Sioud (2001) Curr. Mol. Med· 1:575-88)。一抑制性多核苷酸，例如，對於 10 IL-17F、IL-17A、IL-17R及/或IL-17RC，可被使用作為一 11^-17?/11^-17人拮抗劑（訊息傳遞拮抗劑），例如，用以抑制 IL-17F/IL-17A連結到其受體（例如，il-17R及/或IL-17RC)。 因此，此種抑制性多核苷酸可用於預防或治療 IL-17F/IL-17A-相關疾病。 15 本發明相關之反義多核苷酸或核糖酵素可互補於本發 明相關之基因的完整密碼鏈或互補於其部份。可擇地，反 義夕核苷酸或核糖酵素可係與本發明相關基因之密碼鏈的 非編碼區域互補。該反義多核苦酸或核糖酵素可使用化學 合成或酵素接合反應被構造，其係藉由使用已為先前技藝 2〇所廣知的步驟。經化學合成的多核普酸之核普連接可被修 飾以加強其對抗核酸酶所媒介之分解的能力，且增加其序 列的專-性。這樣的接合修飾包括，但不限於，硫代鱗酸 酉曰甲基膦酸酯、填醯胺酯、硼代磷酸酯 (b〇ranophosphate )、嗎福啉基以及肽核酸（pNA)接合 32 200902064 (Galderisi et al·，supra; Heasman (2002) Dev. Biol. 243:209-14;Micklefield (2001) Curr. Med. Chem. 8:1157-79)。可擇地，這些分子可使用一表現載體被生物地 製造，與本發明相關之多核苷酸被以反義（亦即，反轉)之定 5 向次選殖於該載體中。 本發明之抑制性多核苷酸亦包含三鏈形成寡核苷酸 (TFOs)，其以高專一性及親和性與雙鏈DNA之主要凹槽結 合(Knauert and Glazer (2001) Hum. Mol. Genet. 10:2243-51)。與本發明相關之基因的表現可藉由將與該等 10 基因之調控區域（亦即，啟動子以及/或加強序列）互補的 TFO定標以形成三股螺旋結構來抑制，該三股螺旋結構可 防止該等基因之轉錄。 於本發明之一具體例中，本發明之抑制性多核苷酸係 短干擾RNA (siRNA)分子。這些siRNA分子係短的（較佳地 15 係9-25個核苷酸；最佳地係19或21個核苷酸）雙股RNA分 子’其造成序列-專一性之標的mRNA的分解。此分解係已 知為 RNA 干擾（RNAi)(例如，Bass (2001) Nature 411:428-29)。起初係於較低等生物中被發現，RNAi已有 效地應用於哺乳類細胞且最近已被顯示於經以Fas mRNA 2〇 為標的之siRNA分子處理之小鼠用以預防暴發性肝炎 (Song et al. (2003) Nat. Med· 9:347-51)。此外，經腦脊髓膜 内運送的siRNA最近已經被報導於兩個大鼠模式（激動劑引 發的疼痛模式以及神經係疼痛模式）中用以阻斷疼痛反應 (Dorn et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(5):e49)。 33 200902064 本發明之siRNA分子可藉由退火二在一起的互補單股 RNA分子（其中之一者與標的mRNA之一部分相配）（Fire et al·，U.S.專利案No. 6,506,559)被產生或透過使用一單股u 型RNA分子來產生’該股分子折疊回其本身以產 5 生不可缺少的雙股部份(Yu et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci· USA 99:6047-52)。該siRNA分子可被化學地合成 (Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-98)或藉由於試管中 使用單股DNA模板轉錄來製造(Yu et al.，supra)。可擇地， siRNA分子可使用一含有有意義或反義siRNA序列之表現 10 載體被生物地暫時地(Yu et al” supra; Sui et al. (2002) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 99:5515-20)或穩定地(Paddison et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1443-48)製造。最近， 標的mRNA於初代人類細胞中之水準以有效及序列_專一性 之方式的下降已經由使用表現U型RNA之腺病毒載體被證 15 明，該RNA進一步被加工為 siRNAs (Arts et al. (2003) Genome Res. 13:2325-32)。 為與本發明相關之多核苷酸之標的的siRNA可根據先 前技術廣為人知的準則來被設計（e.g·, Elbashir et al. (2001) EMBO J. 20:6877-88)。例如，該標的城财之標的片段較 20 佳地應以AA (最佳地）、TA、GA或CA起始；siRNA分子之 GC比例較佳地應為45-55%;該siRNA分子較佳地不應含有 三個相同的核苷酸於一列中；該siRNA分子較佳地不應包含 七個混合的G/Cs於一列中；且該標的片段較佳地應於該標 的mRNA之ORF區域且較佳地應於起始ATg之後的至少75 34 200902064 b且於停止密碼之前的至少75 bp。根據這些準則或其它已 知之準則（例如，Reynolds et al. (2004) Nat. Biotechnol. 22:326-30)，與本發明相關以與本發明相關之mRNA多核苷 酸為標的之siRNA分子可由一熟習此藝者所設計。 5 表2列出基於與本發明相關之siRNA分子的例示性多 核苷酸序列以及一替代的序列名稱，SEQ ID NO，以及其 f 10 各標的。如表2所示，列為SEQ ID NOs: 17-20之序列代表基 於hIL-17R之多核苷酸序列且SEQ ID NOs:21-24代表基於 用於hIL-17RC的多核苷酸序列。根據列為SEQID NOs:17-20 之序列之siRNA成功地被使用來將hIL-17R之表現作為標 的，且根據列為SEQ ID NOs: 17-20之序列之siRNA成功地被使用來將hIL_17RC之表現作為標的（見實施例126)。 表2.例示性siRNA分子
15
標的Il-ur IL-17R IL-17R D—7R— IL-17RC IL-17RC IL-17RC IL-17RC
SEQ ID NO 序列Λ代的 SEQ ID NO:17 SEQ ID NO:18 SEQ ID NO:19 SEQ ID NO：20 SEQ ID NO：2l SEQ ID NO：22 SEQ ID NO：23 SEQ ID NO:24
多核苷酸序列
CAG CGG TCT GGT TAT CGT CTA
CGG CAC CTA CGT AGT CTG CTA
CAG GAA GGT CTG GAT CAT CTA
CAG GTT TGA GTT TCT GTC CAA
ACC GCA GAT CAT TAC CTT GAA
CAG GTA CGA GAA GGA ACT CAA
CGG GAC TTA AAT AAA GGC AG A
CCG CGC GGC TCT GCT CCT CTA 關於IL-17F之抑制性多核苷酸 ，例如siRNA、反義多核 35 200902064 苷酸、核糖酵素、TFO等，可以IL-17F及/或IL-17F/IL-17A 之表現為標輕。相似地，關於IL-17A之抑制性多核普酸可 以IL-17A及/或IL-17F/IL-17A之表現為標乾。再者，以針 對IL-17F及IL-17A之一或兩者的抑制性多核苦酸處理一細 5 胞可以IL-17F/IL-17A異型二聚體之表現為標乾。因此，針 對IL-17F及IL-17A之一或兩者的抑制性多核苷酸亦可被認 為係IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。 於一生物中與本發明相關之基因的表現被改變亦可經 由非人類轉殖動物之創造而達成’於該等轉殖動物之基因 1〇中，與本發明相關之基因體多核苷酸被導入。這樣的轉殖 動物包括具有多份本發明的基因（亦即，轉殖基因）。一 組織專-性的調控序列可被可操作地連接至一轉殖基因以 指揮本發明相關之多肽於特定細胞或—特定發育階段之表 現。用於經由胚胎操作以及為注射產生轉殖動物，特別係 Μ諸如小氣之動物，的方法已經變成習見且於該技術領域中 廣為人知的（例如。B〇ckamp et al (2〇〇2) physi〇i
Genomics 11:115-32)。 本發明相關基因於生物中之被改變的表現可經由動物 之產生而被達成，該等動物之相對應於本發明相關之基因 20的内生性基因已經經由外來多核脊酸序列之插入而被中斷 (亦即，基因齡動物）。勒錄_ _碼區域可被中 斷藉此產生一非功此性的蛋白質。可擇地，該内生性基 因的上游調控區域可被中斷或以不同的調控元件替代，造 成該仍具功能之蛋白質的表現改變。用於產生基因剔除動 36 200902064 物之方法包括同源性重組且係該技術領域中廣為人知的 (例如，Wolfer et al. (2002) Trends Neurosci. 25:336-40)。 本發明經分離之多核苷酸也可被可操作地連接至一表 現控制序列及或被接合至一用於本發明相關之多肽（包括 5 活性片段及/或其融合多肽)之重組製造的表現載體中。一般 表現重組蛋白質之方法係該技術領域中廣為人知的。 一表現載體，當被於此使用，係欲意指一可運送另一 核酸的一核酸分子，該另一核酸與該核酸分子相連接。一 、 類型之載體係質體（plasmid)，其屬於一環狀雙股DNA環， 10 額外之DNA片段可被接合於其中。另一類型之載體係病毒 性載體，其中額外之DNA片段可被接合於病毒的基因體 中。某些載體係可自發地於該等載體被引入的寄主細胞中 複製（例如，具有一細菌複製起點的細菌性載體及附加性 (episomal)哺乳類載體）。其他載體（例如，非附加性哺 15 乳類載體）可當被導入該宿主細胞時被結合於一宿主細胞 之基因體，且藉此隨著該宿主基因體一起被複製。再者， $ % 某些載體可指揮被可操作地連接至該載體的基因之表現。 — 這樣的載體在此係亦指重組表現載體（或簡單地，表現載 — 體）。一般地，於重組DNA技術中使用的表現載體常為質體 20 之形式。於本發明說明書物中，質體及載體可被互相交換 地使用因為該質體係最普遍地被使用的載體形式。然而， 本發明係意圖包括其他形式之表現載體，諸如病毒性載體 (，例如，複製缺陷的反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒） 其提供相同的功能。 37 200902064 於一具體例中，本發明相關之多核苷酸被使用以產生 一重組IL-17F/IL-17A訊息傳遞激動劑，例如那些可根據至 少一 IL-17F/IL-17A”受體結合區域（receptor binding motif )’’ 被辨識者。當使用於此，「受體結合區域」一詞包括胺基酸 5 序列或殘基，其對於細胞介素對其必須受體的結合係重要 的。例如，一 IL-17F/IL-17A激動劑（訊息傳遞激動劑）包括 IL-17F/IL-17A及/或其片段，例如，IL-17R或IL-17RC結合 片段。於另一具體例中，該等與本發明相關之多核苷酸被 使用以產生IL-17F, IL-17A及/或IL-17F/IL-17A訊息傳遞結 10 抗劑(例如，IL-17F、IL-17A、IL-17R及/或IL-17抑制性多核 苷酸；可溶性IL-17R及/或IL-17RC多肽（包括片段（例如， IL-17F、IL-17A及/或IL-17F/IL-17A結合片段）及/或其融合 蛋白質）；抑制性抗 _IL-17F、抗-IL-17A、抗-IL-17F/IL-17A、 抗-IL-17R，及/或IL-17RC抗體；拮抗性小分子等）。 15 產生融合多肽，亦即一與一第二多肽區域連接之第一 多肽區域，之方法係該技術領域中廣為人知的。例如，一 與本發明相關之多肽(例如，IL-17A同型二聚體、IL_17F同
型二聚體、IL-17F/IL-17A異型二聚體、IL-17R、iL-nRC 及其片段)可被融合至一第二多肽區域，例如，一免疫球蛋 ° 白或其片段(例如’其Fc結合片段）。於一些具體例中，該第 —多肽區域包括本發明相關之全長的多肽。可擇地，該第 —多肽可包含少於該全長的多肽。此外，一本發明相關之 可溶性形式的多肽可係一被融合至一免疫球蛋白之&蛋白 質（見，例如，實施例1_1_2)，其具有或不具有一連接本案 38 200902064 相關之多肽及該免疫球蛋白之Fc蛋白質的，，連接，，序列。其 他融合蛋白質，諸如那些具有麩胺基硫轉移酶（GST)、 Lex-A、硫氧還蛋白（thi〇rec[oxin ) (TRX)、生物素或麥芽 糖-結合蛋白（MBP)，亦可被使用。 5 該第二多肽區域較佳地係可溶的，於一些具體例中， 該第二多肽區域提高了經連接多肽之半衰期（例如，血清半 衰期）。於一些具體例中，該第二多肽區域包括一序列，其 促進融合多肽與另一IL-ΠΑ、IL-17F、IL-17RC或IL-17R多 肽之結合’或IL-17A與IL-17F之結合以形成一異型二聚 10 體。於一些具體例中，該第二多肽包括一免疫球蛋白多肽 之至少一區域。免疫球蛋白融合多肽係於該技術領域中已 知的且被敘述於，例如美國專利案N〇s 5,516,964、 5,225,538、5,428,130、5,514,582 ; 5,714,147以及5,455,165， 其等之全部内容在此被併入本案作為參考。該融合蛋白質 15 可額外地包括一連接序列’該連接序列將，例如，IL-17F、 IL-17A、IL-17F/IL-17A、IL-17R或IL-17RC，包括其片段之 第一多肽區域結合至第二區域。這樣的連接序列之使用係 該技術領域中已廣為人知的。例如，該融合蛋白質可包括 一胜肽連接劑，例如’一約2至20個胺基酸長度的胜肽連接 20 物’較佳係少於10個胺基酸。於一具體例中，該胜肽連接 物可係2個胺基酸長。 於另一具體例，該重組蛋白質包括異源性訊息序列 (亦即’多肽序列不存在於由IL-17F、IL-17A、IL-17R或 IL-17RC核酸所編碼之多肽中）於其N-端。例如，一來自另 39 200902064 -蛋白質之訊息序列可與一本發明相關之多肽融合，包括 片段及/或其融合蛋白質。—某些宿主細胞中（例如鳴乳類 宿主細胞）’重組蛋白質之表現及/或分泌透過_異源性訊息 序列之使用可被增加。例如，可被包括於、該融合蛋白質 5中的訊息胜肽係一蜂毒蛋白（melittin )訊息胜肽 mkflvnvalvfmvvyisyiya (SEq m N〇:25)。 一本發明相關之融合蛋白質可藉由標準重組DNA技術 來被製造。例如，編碼不同多肽序列之DNA片段被同一讀 框地接合一起’其係根據習見技術藉由使用，例如鈍尾或 10 交錯尾端來接合、限制性酶切以提供至適當的尾端，當適 當時填滿黏著性尾端，鹼性磷酸酶處理以避免非所欲接合 且酵素的接合。於另一具體例中，該融合基因可藉由習見 技術被合成，該技術包括DNA自動合成儀。可擇地，基因 片段的PCR擴增技術可使用錨定引子被進行，該引子在二 15 個連續不斷之基因片段間引起互補的伸出物，該伸出物可 接續地被退火及再擴增以產生嵌合體基因序列（見，例如， Ausubel et al. (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992)。又，許多編碼一融合部份(例如， 免疫球蛋白重鏈之Fc區域）之表現載體係商業上可取得 20 的。例如，一IL-17F-、IL-17A-、IL-17R-及/或IL-17RC-編 碼核酸可被複製於一表現載體中以使得該融合部份被讀框 地與該免疫球蛋白連接。於一些具體例中，IL-17F、 IL-17A、IL-17R及/或IL-17RC融合多肽存在為一寡聚物， 諸如二聚物、三聚物或四聚物。於一具體例中，IL-17F及 40 200902064 IL-17A融合多肽存在為一異型二聚體。 本發明之重組體表現載體可帶有額外的序列，諸如調 控該載體於宿主細胞中之複製的序列（例如，複製起點）及可 選擇性的標示基因。該標示基因促進於宿主細胞中該載體 5 被導入之該宿主細胞的選擇。例如，典型地該可選擇性的 標示基因給予對於藥物的抗藥性，諸如G418、潮黴素或滅 殺除癌錠（methotrexate)於該載體被導入之宿主細胞上。 較佳的可選擇性標示基因包括二氫葉酸還原酶（〇111?11)基 因（用於dhfr-宿主細胞伴隨滅殺除癌錠選擇/擴增）以及狀〇 10 基因（用於G418選擇）。 適合的載體可被選擇或構造，包含適當的調控序列， 其包括啟動子序列、結束子序列、多聚腺苷酸化序列、加 強序列、標示基因以及其它序列，例如調控該載體於宿主 細胞中複製的序列（例如，複製起點）當適當時。載體可係 15 一質體或病毒的，例如噬菌體，或嗟質體（phagemid)，依 適當性。關於進一步之細節，請見，例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd ed., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。許多已知之用於操縱核酸的 技術及規則，例如，核酸構造的製備、突變形成、定序、 20 DNA導入細胞之技術以及基因表現，以及蛋白質之分析， 已經被詳細敘述於Current Protocols in Molecular Biology, 2nd ed·, Ausubel et al. eds·，John Wiley & Sons, 1992 中。 因此，本發明之另一方面提供一包含一如在此所揭露 之核酸的宿主細胞。又另一方面係提供一方法’其包含將 200902064 這樣的核酸導入一宿主細胞。該導入可使用任合可取得之 技術。用於真核細胞，適合的技術可包括磷酸鈣轉染、 DEAE-類糊精、電穿孔、脂質體_所媒介之轉染，以及使用 反轉錄病毒或其他病毒，例如牛痘或用於昆蟲細胞桿狀病 5毒，之轉導。用於細菌細胞，適合的技術可包括氯化鈣轉 化、電穿孔及使用細菌噬菌體之轉染。該導入可由造成或 使付從3亥核酸之表現來接續，例如，經由在用於該基因表 現之條件下培養宿主細胞。多種細胞株可作為適合用於與 本發明相關之多肽的重組體表現的適合宿主細胞。哺乳類 10 宿主細胞株包括，例如，COS細胞、CHO細胞、293細胞(例 如，HEK293細胞）、A431細胞、3T3細胞、CV-1細胞、HeLa 細胞、L細胞、BHK21細胞、HL-60細胞、U937細胞、HaK 細胞、Jurkat細胞’以及由初代組織及初代外植片體於試 管中培養衍生的細胞株。於本發明之具體例中， 15 il_17F/IL-17A異型二聚體可被製造藉由同時以含il_17F- 載體及含IL-17A-之載體兩者轉染一細胞或以一含有il_17F 及IL-17A兩者之載體轉染一細胞且在適合il-ΠΑ及IL-17F 兩者之重組體表現的條件下培養該細胞，以使得該異型二 聚體被表現。 20 可擇地，重組地於諸如酵母菌之低等真核生物中或原 核生物中產生與本發明相關之多肽係可能的。可能適合的 酵母菌株包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、粟酒 裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe )、克魯維酵母 (Kluyveromyces )株及假絲酵母（Candida )株。可能適 42 200902064 合的細菌菌株包括大腸桿菌（Escherichia coli)、枯草桿菌 (Bacillus subtilis )以及沙 Π 氏鼠傷寒桿菌（Salmonella typhimurium)。若本發明相關之多肽被於酵母菌或細菌中被 製造’可能必須藉由例如適當位置之磷酸化或醣化去改質 5 這些多肽以獲得功能性。這樣的共價的接附可使用廣為人 知之化學或酵素方法來被達成。 於細菌中表現可能造成與該重組蛋白質混合之包涵體 的形成。因此，為了產生具活性或更具活性之物質，再折 疊重組蛋白質可能係必須的。數個用於由細菌包涵體中獲 10 得正確地經折疊的異源性蛋白質的方法係該技術領域中已 知的。這些方法通常涉及使來自包涵體之蛋白質溶解、接 著使用一促溶劑（chaotropicagen)完全變性該蛋白質。當 半胱胺酸存在於該蛋白質之初級胺基酸序列中，時常必須 於一允許雙硫鍵正確形成的環境中（氧化還原系統）完成再 15 折疊。一般再折疊之方法被揭露於Kohno (1990) Meth. Enzymol. 185:187-95 中。歐洲專利 EP 0433225 及 U.S.專利案 No. 5,399,677敘述其他適合之方法。 本發明相關之多肽也可連接一被重組地製造，藉由於 一或多個昆蟲表現載體，諸如桿狀病毒載體，可操作地連 20 接本發明該經分離之多核苷酸至一適合的控制序列並使用 一昆蟲細胞表現系統。用於桿狀病毒/sf9表現系統之材料及 方法係商業上可以套組之形式取得的（例如，the MaxBac® kit, Invitrogen, Carlsbad, CA)。 接續著於適當宿主細胞中重組物表現，本發明該重組 43 200902064 多肽可接著從培養基或細胞萃取物中使用已知的純化方法 被純化，諸如凝膠過濾及離子交換層析術。例如，諸如 IL-17F、IL-17A、IL-17F/IL_17A、IL_17R、IL_nRC蛋白質 (包括片段及/或其如融合蛋白質）、其拮抗劑及其激動劑之 5本發明相關多肽的溶解形式可從條件培養基中被純化。本 發明相關之連接膜形式之多肽可藉由從該表現細胞製備— 全部膜碎片以及以諸如Triton X-100的非離子性清潔劑萃 取來被純化。本發明相關之多肽可使用—商業上可取得之 例如Amicon or MilliP〇re Pellicon超濾單元的濃縮過濾器來 10 被濃縮。接續著濃縮的步驟，該濃縮物可被施用於—諸如 凝膠過濾基的一純化基質上。可擇地，一陰離子交換樹脂 可被使用’例如一具有懸垂的二乙胺乙基(DEAE)或聚乙亞 胺(PEI)基團之基質或基材。該基質可係丙稀酿胺、瓊脂精、 類糊精、纖維素或於蛋白質純化中普遍使用的其他種類。 15 可擇地，一陽離子交換步驟可被使用。適合的陽離子交換 劑包括各種包含磺丙基或羧甲基基團之非可溶性基質。@ 丙基基團係較佳的（例如，S-SEPHAROSE®管柱）。來自土立 養上清液之重組蛋白質之純化亦可包含於這樣親和性樹月旨 上之一或多個管柱步驟，該樹脂係諸如伴刀豆球蛋白八_壤 20 脂精、肝素-TOYOPEARL® (Toyo Soda Manufacturing Co.， Ltd.，Japan)或 Cibacron blue 3GA SEPHAROSE® ;或藉由 使用樹脂之疏水性反應層析法，此種樹腊係諸如二苯醚、 丁基醚或丙基鍵；或藉由免疫親和性層析法。最後，一或 多個反相高效液相色層分析法(RP-HPLC)步驟可被運用以 44 200902064 進一步純化該重組蛋白質，該反相高效液相色層分析法步 驟使用例如具有懸垂甲基或其他脂肪族基團的矽膠之疏水 性RP-HPLC媒體。包含針對重組蛋白質之抗體(例如，在此 被敘述使用該等方法的那些）的親和性管柱可根據已知的 5 方法於純化步驟中被使用。一些或所有前述的純化步驟， 以各種組合或與其它之方法一起，亦可被使用以提供實質 上經純化之經分離重組蛋白質。較佳地，經分離之重組蛋 白質被純化以使得其實質上不具有其它哺乳類之蛋白質。 此外’這些純化方法也可被使用以從其他包括天然來源之 10 來源純化本發明之多肽。例如，本發明相關之多肽，其被 表現作為一轉殖動物之產物可依如上所述被純化，該產物 係例如轉殖牛、山羊、猪或羊之奶。 可擇地，該等多肽可被以促進純化之形式重組地被表 現。例如’該等多肽可被表現為一融合的蛋白質，諸如麥 15 芽糖-結合蛋白（MBP)、麩胺基硫轉移酶(GST)，或硫氧還蛋 白（TRX)。用於這樣融合蛋白質之表現以及純化的套組係商 業上取得的，其分別來自New England BioLabs (Beverly， ΜΑ)、Pharmacia (Piscataway，NJ)及Invitrogen。重組蛋白質 也可被以小的抗原決定區（epitope )來被添加標藏且接續 20 著使用對於該抗原決定區具專一性之抗體來辨識及純化該 重組蛋白質。一較佳的抗原決定區係一FLAG抗原決定區， 其係攸Eastman Kodak (New Haven, CT)商業上可取得的。 可擇地，重組IL-17F及IL-17A融合蛋白可以不同之抗 原決定區添加標籤以允許IL_丨7F/IL_ 17A異型二聚體之純 45 200902064 化。不同標籤於IL-17F及il-ΠΛ上的存在使得 IL-17F/IL-17A異型二聚體之分離可進行，該異型二聚體係 實質上不具有IL-17A及IL-17F同型二聚體兩者。例如， IL-17A可被添加一抗原決定區之標籤（例如，FLAG、爪外 5等）而1L_17F同時被添加另一抗原決定區之標籤（例如， His、GST等）且兩個蛋白質同時表現於一細胞中。來自該重 組宿主細胞之萃取物或該等宿主細胞被培養於其中的培養 基可被獲得且在非還原條件下經過二步驟親和性層析法純 化。第一親和性管柱會與兩個不同標籤之一者結合，例如 10被融合至1L—17A (或IL-17A之片段）之flag抗原決定區， 且因此來自該第一管柱之洗滌液含有（主要地）IL17F同 型一聚體且來自該第一管柱之洗提液會含有IL_i 7F/IL_ i 7 異型二聚體以及IL-17A同型二聚體兩者。來自第一管柱之 洗七液接著會被置於一第二親和性管柱，其特定地與該兩 15 個不同_示臧的另一者結合，例如，被融合至IL-17F的之His ‘戴。因此，來自該第二管柱之洗滌液會含有化_ 17a同型 一聚體且來自該第二管柱之洗提液會實質上不具有il_17a 及IL-17F同型一聚體兩者（亦即，僅含有IL-17F/IL-17A異 型二聚體）。來自重組物宿主細胞或宿主細胞培養基之萃取 20 物可在非還原條件下被獲得以使得蛋白質-蛋白質交互作 用不會被打斷，或可於還原條件下被獲得且接著經處理以 使於其中所包含之IL-17F及IL-17A單體可適當的再折疊及 交互作用。沾S此藝者將會各易地認知到一宿主細胞不需 要表現IL-17F及IL-17A融合蛋白兩者；細胞或培養基萃取 46 200902064 物非來自單一的轉染細胞’例如一表現IL-17A或IL-17F融 合蛋白之宿主細胞'被獲仵且在允許IL-17 A及IL-17F單 體形成二聚物之條件下被結合。1L-17F/IL_17A異型二聚體 純化之詳細的方法被敘述於U_S•專利申請案No. 5 ιι/353，161，其全部内容於此被併入作為參考。 本發明相關之多肽亦可接由已知習見之化學合成法而 被製造。用於化學合成這樣的多肽之方法係熟習此藝者已 熟知的。這樣化學合成的多肽可具有與天然純化的多肽共 同的生物性質且因此玎被使用作為生物活性物質或天然多 10 肽的免疫取代物。 本發明相關之多肽’包括1L_17F、IL_17A以及 IL-17F/IL-17A訊息傳遞激動劑及拮抗劑，也包含與所揭露 之多肽結構上不同（例如’具有些微改變的序列）但實質上具 有與所揭露多肽的相同生物性質（例如僅有功能上非必要 15 的胺基酸殘基被改變）的分子。這些分子包括自然地發生對 偶變異物且故意的經設計的變異物，包含經修改、取代、 替代、插入或刪除。用於這些修改、取代、替代、插入或 刪除的技術係熟習此藝者已熟知的。於一些具體例中，多 肽部份係被提供作為於天然發生之序列（例如，野生型）中具 20 有突變之變異體多肽，其造成一序列造成對於蛋白分解更 有抵抗力（相對於無突變之序列）。 根據本發明之多肽亦可包括模擬胜肽（peptide mimetics)。模擬胜肽係含有胜肽之分子，其模擬蛋白質二 級結構之單元。見，例如，Johnson et al. “Peptide Turn 47 200902064
Mimetics” in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al·，Eds” Chapman and Hall, New York (1993)(其 全部内容在此併入作為參考資料）。在使用模擬胜肽背後之 潛在的理由係蛋白質之胜肽骨架主要存在以將胺基酸側鏈 5 以促進分子交互作用之方式定向，諸如那些抗體及抗原。 一模擬胜肽被預期可允許類似於天然分子的分子交互作 用。這些規則可被使用以設計具有許多被揭露之目標胜肽 或多肽之天然性質但具有經改變且甚至改善特性的第二代 分子。 10 本發明相關之多肽可被使用為篩選劑（例如，其它 IL-17F、IL-17A及IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑，例如抗 -IL-17F、抗-IL-17A及抗-IL-17F/IL-17A 抗體），其可結合 IL-17F/IL-17A及/或抑制IL- 17F/IL-17A生物活性。使用一所 欲之被固定或未經固定的結合蛋白質之結合檢驗係該技術 15 領域廣為人知的且可與本發明相關之多肽被用於此一目 的。經純化之以細胞為基礎或以蛋白質為基礎（不具有細胞) 的篩選試驗可被使用以辨識這樣的藥劑。例如， IL-17F/IL-17蛋白質可以一經純化之形式被固定於載體上 且可能之配位子與經純化之IL-17F/IL-17A的結合可被檢 20 測。 抗體 於一些具體例中，本發明提供具有專一性之抗 -IL-17F/IL-17A抗體，亦即，完整的抗體或其抗原結合片 段，其只結合至IL-17F/IL-17A異型二聚體。於另一具體例， 48 200902064 本發明提供選擇性的抗_IL_17F/IL-17A抗體，其結合 IL-17F/IL-17A兩者及IL-17F或IL-17A之一者由於該選擇性 抗體辨識一對於IL-17F/IL-17A異型二聚體不具專一性之抗 原決定區但辨識對於IL-17F或IL-ΠΑ具專一性的抗原決定 5 區。於一具體例中，該等抗體係訊息傳遞拮抗劑（包括對 於IL-17F/IL-17A訊息傳遞具專一性及選擇性拮抗劑）’亦 即’它們抑制至少一IL-17F/IL-17A之生物活性(例如，異型 二聚體對於受體之結合、異型二聚體_所媒介之訊息分子的 活化、異型二聚體-所媒介之細胞介素製造的引發（例如’ 10 GR〇-°〇、異型二聚體對於呼吸道發炎的引發等）。本發明之 拮抗劑抗體也可被使用來診斷、判斷預後、監控及/或治療 IL-17F/IL-17A-相關疾病。一熟習此藝者將可認知到選擇性 及拮抗性IL-17F/IL-17A抗體可抑制至少一IL-17F/IL-17A 兩者及IL-17F或IL-17A中之一者的生物活性。於另一具體 15 例，該等抗體（包括具專一性及選擇性抗體)係偵測抗體，其 特定地結合但不抑制IL-17F/IL-17 A訊息傳遞且可被使用以 偵測IL-17F/IL-17A的存在，例如作為用於診斷、判斷預後 及/或監控一 IL-HF/IL-HA訊息傳遞相關之疾病的套組之 —部分。於一具體例，該抗體係一單株抗體。該等抗體也 20 可係人類的、人類化、嵌合體或試管中所製造的對抗人類 IL-17A、IL-17F及/或IL-17F/IL-17A之抗體。於一較佳的具 體例’本發明之抗體，例如拮抗劑抗體或偵測抗體，係關 於哺乳類，例如人類IL-17F/IL-17A。 一熟習此藝者將會認知到，當被使用於此，「抗體」一 49 200902064 詞意指一蛋白質包含至少一，且較佳地為二個重(Η)鏈變異 區域(在此縮寫為VH) ’以及至少一且較佳地為二個輕(l)鏈 變異區域(在此縮寫為VL)。該VH及VL區域可被進一步再 細分為高變異性（hypervariability )區域，被稱為r互補性 5 決定區」（“CDRs”），散佈於較保守性之被稱為「骨架區」 (“FR”)之區域間。FRs及CDR之範圍已經被明確地界定（見， Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological
Interest，Fifth Edition，U.S. Department of Health and 人類
Services, NIH Publication No. 91-3242; and Chothia et al. 10 (1987) J· Mo1· BloL丨96:901.1? ’其全部内容被於此併入作 為參考）。各VH及VL係包含三個CDRs及四個FRs，以下列 順序從胺基端被排列至羧基端：FRh CDR卜FR2、CDR2、 FR3、CDR3、FR4。該抗體可進一步包括一重鏈及輕鏈固 定區域以藉Λ分別形成-重及輕免疫#蛋白鍵。於一具體 15例，該抗體係-二重免疫球蛋白鏈及二輕免疫球蛋白鍵之 四聚物’其中该重及輕免疫球蛋白鍵係互相連接，例如藉 由雙石瓜鍵。邊重鏈固定區域係包含區間，ch1ch2&ch3。 該輕鏈固定區域包括-區間，CL。該重鍵及輕鍵之變異區 域含有-結合區間，其與一抗原作用。該等抗體之固定區 域典型地媒介該抗體對於宿主_或因子的結合，該宿主 組織或因子包括各種免疫系統之細胞（例如，效應細胞 (effector cell))以及每典補體系統之第一組份(叫卜 免疫球蛋白思指-由一或多個實質上由免疫球蛋白基 因所編馬的夕肽所組成的蛋白質。被辨識的人類免疫球蛋 50 200902064 白基因包括/c、凡、a (IgAl及IgA2)、7 (IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4)、5、£及#固定區域基因，以及大量的免疫 球蛋白變異區域基因。全長的免疫球蛋白「輕鏈」（約25 Kd 或214個胺基酸)係由一於NH2_端之變異區域基因（約〗1〇個 5 胺基酸）以及—於COOH-端之/c或λ固定區域基因所編 碼。全長的免疫球蛋白「重鏈」（約50 Kd或446個胺基酸) 係相似地由一變異區域基因（約U6個胺基酸)及其天前面所 提及之固定區域中之一者，例如^ (編碼約330個胺基酸)所 編碼。該免疫球蛋白重鏈固定區域編碼用於抗體分類，亦 10 即，同型（例如’ IgM或IgGl)。一抗體之抗原結合片段（或 僅係「抗體之部份」或「片段」），被使用於此，意指一全 長之抗體的一或多個片段，其保有特定地結合一抗原（例如 CD3)的能力。被包含於一抗體之「抗原結合片段」一詞中 之結合片段的例子包括⑴一Fab片段、一由VL、VH、CL及 15 CH1區間所組成之單鍵片段；（ϋ)一F(ab’)2片段，一含有兩 個由一於鉸鏈區之雙硫橋所連接的Fab之雙鍵片段；（iii)一 由VH及CH1構成的Fd片段；（iv) —由一抗體之單一臂之 VL及VH區間所構成的Fv片段；（v) — dAb片段(Ward et al. (1989) Nature 341:544-46)，其由VH區間構成；以及(vi)>-20 經分離之互補決定區域(CDR)或一組CDRs，例如二或三個 CDRs。再者，雖然Fv片段、VL及VH之兩個區間係由分開 的基因所編碼，它們可，使用重組技術藉由一合成連接物 被接合，該連接物可使其被形成一單一蛋白質鏈，其中VL 及VH區域配對以形成單鍵分子（已知為單一鏈Fv (scFv); 51 200902064 見，例如，Bird etal. (1988) Science 242:423-26; and Huston et al· (1988) Proc. Natl· Acad· Sci. USA 85:5879-83)。 這樣單一鏈抗體係意圖被包含於一抗體之「抗體結合 片端」一詞當中。這些抗體結合片段使用習見熟習此藝者 5 已知之技術而被獲得且該等片段被篩選來用於與完整抗體 相同之應用。 於一些具體例，本發明提供單一區間抗體。單一區間 抗體可包括該等抗體，其CDRs為一單一區間多肽之一部 分。例子包括，但不限於’重鏈抗體、天生缺乏輕鏈之抗 10 體、衍生自習見四-鏈抗體之單一區間抗體、經設計構造之 抗體以及除了衍生自抗體之外的單一區間台架。單一區間 抗體可係任何習見已知者或任何未來之單一區間抗體。單 一區間抗體可係衍生自任何物種，包括但不限於小鼠、人 類、駱駝、美洲駝、山苹、兔子、牛。根據本發明之—方 15 面，一於此被使用的單一區間抗體係一自然發生的單—區 間抗體，其已知為一缺乏輕鏈之重鏈。這樣的單一區間抗 體被揭露於，例如W0 94/04678。此衍生自一自然缺乏輕鍵 之重鏈的變異區間係在此已知為一VHH或奈米體 (nanobody)，用以區隔來自四鏈免疫球蛋白之習見¥111^。 20 這樣一VHH可係衍生自絡乾科物種，例如，駱轮、美洲路、 單峰駱駝、羊駝及原駝’所產生之抗體。除了那些於路轮 家族之外的其它物種可產自然缺乏輕鏈之重鏈抗體；這樣 的VHH分子係於本發明之範圍之内。針對本發明之多肽的 抗體分子可經由熟習此藝者以熟知之方法來製造。例如， 52 200902064 單株抗體可經由根據已知之方法產生融合瘤而被製造。以 此方式所形成之融合瘤接著使用諸如酵素連結免疫吸附法 (ELISA)之標準方法被篩選，以辨識一或多個融合瘤，該等 融合瘤產生特定地與本發明之多肽結合的抗體。例如， 5 IL-17F/IL-17A可被使用以引起動物免疫反應以獲得與 IL-17F/IL-17A異型二聚體特定地（亦即，不與IL-17F或 IL-17A結合）或選擇性地（亦即，與IL-17F/IL-17A及IL-17F 或IL-17A(或兩者）兩者)結合的多株及單株抗體。相似地， IL-17R或IL-17RC蛋白可被使用以獲得多株或單株抗體，該 10 等抗體分別與IL-17R或IL-17RC反應且可抑制這些受體僅 與 IL-17F/IL-17 A 或與 IL-17F/IL-17 A及 IL-17F 或 IL-17 A之一 的兩者結合。IL-17R或IL-17RC蛋白亦可被使用以獲得多株 及單株抗體，該等抗體特定地分別與IL-17R或IL-17RC反 應，或其可抑制這些受體與L-17A、IL-17F以及/或 15 m-PWIL-HA細胞介素之中任一者結合。該胜肽抗原可額 外地含有一半胱胺酸於羧基端，且可與一諸如血氰蛋白 (K L Η)之半抗原結合。額外的胜肽抗原藉由以硫酸化酪胺酸 殘基取代酪胺酸殘基而被製造。用於合成這樣的胜肽之方 法於§亥技術領域中係廣為人知的，例如，如同於Merrifield 20 (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54; Krstenansky et al. (1987) FEBS Lett. 211:10-16中。本發明之全長的多肽可被 使用作為抗原，或可擇地，該等多肽之抗原胜肽片段可被 使用。本發明之多肽的抗原胜肽包含至少七個連續的胺基 酸殘基以及包含一抗原決定區以使得一所產生的對抗該胜 53 200902064 肽的抗體與該胜肽形成一具專一性的免疫複合物。較佳 地，該抗原胜肽包含至少ίο個胺基酸殘基，更佳地係至少 15個胺基酸殘基，再更佳地係至少20個胺基酸殘基且最佳 地係至少30個胺基酸殘基。 5 單株抗體可由其它熟習此藝者已知之重組DNA技術之 方法來被產生。作為一製備單株抗體-分泌融合瘤一選擇， 一本發明之多肽的單株抗體可被辨識及分離，其藉由篩選 一重組之組合的免疫球蛋白庫（例如，抗體噬菌體展示基 因庫）及與本發明相關之多肽，藉此分離與本發明相關之 10 多肽結合之免疫球蛋白庫中的成員。用於產生及篩選噬菌 體展示基因庫的技術以及商業上可取得的套組係熟習此藝 者所熟知的。此外，特別適用於產生及篩選噬菌體展示基 因庫的方法及試劑可於文獻中找到。例如，”組合的抗體展 示”方法係廣為人知的且係被發展以辨識及分離具有特定 15 抗原專一性之抗體片段，且可被使用以產生單株抗體 (針對組合的抗體展示之敘述，見，例如，Sastryetal. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728; Huse et al. (1989) Science 246:1275; Orlandi et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833)。在如上所述以_抗原引起一動物之免疫反 2〇應後，所得到之B細胞庫的抗體庫被複製。用於得到免疫球 蛋白分子之多變化群體之可變異匪序列之方法係通常被 知道係藉由使用寡聚物引子之混合物及pCR。例如，經泥 口的相對應於5’引導序列（訊息胜肽）及或骨架1 (FR1)序 歹J的募合皆酸引子以及針對保守3,固定區域之引子可被 54 200902064 使用於來自許多小鼠抗體之重鏈及輕鏈變異區域之PCR擴 增術(Larricketal. (1991) Biotechniques 11:152-56)。一相似 之策略亦可被使用於擴增來自人類抗體之人類重鏈及輕鏈 可變異區域(Larrick etal. (1991) Methods: Companion to 5 Methods in Enzymology 2:106-10) 〇 多株血清及抗體可經由以本發明相關之多肽引起一適 合對象之免疫反應來被製造。於經引起免疫反應之對象中 抗體滴定量可經由標準技術隨時間被監測，諸如使用以 ELISA使用經固定的蛋白質。若所欲，對抗本發明之多肽 10 的抗體可從該對象或培養基中被分離且藉由諸如之蛋白質 A層析法之廣為人知之技術被純化以獲得IgG部份。 本發明之多肽的抗體片段可藉由依據該領域廣為人知 之方法分裂该專抗體來被製造。例如，具免疫活性之Fab及 F(ab )2片段可藉由以諸如胃蛋白酶之酵素處理該等抗體而 15 被產生。 此外，針對本發明之多肽的嵌合、人類化及單鏈抗體 包含有人類及非人類部份兩者，可使用標準的重組DNa技 術及/或一重組組合免疫球蛋白庫來被製造。人類化抗體亦 可使用轉殖小鼠來製造，該轉殖小鼠係不能表現外來的免 2〇 疫球蛋白重鏈及輕鏈基因但可表現人類之重鏈及輕鏈基 因。例如，對抗例如IL-17F/IL-17A之人類單株抗體(mAbs) 可使用帶有人類免疫球蛋白基因而非小鼠免疫球蛋白基因 之轉殖老鼠來被製造。來自這些轉殖老鼠之經所關注之抗 原引起免疫反應的脾細胞可接著被使用以產生分泌具有對 55 200902064 於來自人類蛋白質之抗原決定區有專一性之人類mAbs的 融合瘤（參見，例如Wood et al_，WO 91/00906 ; Kucherlapati et al., WO 91/10741 ； Lonberg et al. WO 92/03918; Kay et al., WO 92/03917; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856-59; 5 Green et al. (1994) Nat. Genet. 7:13-21; Morrison et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-55; Bruggeman (1993) Year Immunol. 7:33-40; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-24; Bruggeman et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21:1323-26)。 10 嵌合抗體，包括嵌合免疫球蛋白鏈，可藉由該技術領 域已知之重組DNA技術來被製造。例如，一編碼小鼠（或其 它物種）單株抗體分子之F c固定區域之基因被以限制酶消 化以移除編碼小鼠Fc之區域且一編碼人類Fc固定區域之 基因的相同部份被取代（見Robinson et al., International 15 Patent Publication PCT/US86/02269; Akira et al., European Patent Application EP 184,187; Taniguchi，歐洲專利申請案 EP 171,496; Morrison et al., European Patent Application EP 173,494; Neuberger et al., WO 86/01533; Cabilly et al., U.S. Patent No· 4,816,567; Cabilly et al·，歐洲專利申請案 20 EP 125,023; Better et al. (1988) Science 240:1041-43; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-43; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-26; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-18; Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-49;以 56 200902064 及Shaw et al_ (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-59)。 一抗體或一免疫球蛋白鏈可經由該領域中已知的方法 被人類化。人類化抗體，包括人類化免疫球蛋白鏈，可經 由取代Fv可變異區域之序列來產生，該可變異區域係不直 5 接涉及與來自人類Fv可變異區域相同之序列之抗原結 合。一般用於產生人類化抗體之方法係由Morrison (1985) Science 229:1202-07; 〇i et al. (1986) BioTechniques 4:214;
Queen et al·，U.S.專利案 Nos.5,585,089; 5,693,761; % 5,693,762所提供，其等全部之所有内容在此被併入作為參 10 考。這些方法包括分離、操作以及表現編碼所有或部份來 自一重鏈或輕鏈之一者的核酸序列。這樣的核酸序列之來 源係熟習此藝者已知的且例如，可從產生一對抗一預先決 定之標的的融合瘤來獲得。編碼經人類化抗體或其片段之 重組DNA可接著被複製於一適當的表現載體中。 15 人類化或CDR-經轉接抗體分子或免疫球蛋白可藉由 CDR轉接或CDR來被製得，其中免疫球蛋白鏈之一、二個 或全部的CDRs可被取代。見，例如，U.S.專利案No. 5,225,539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-25; Verhoeyan - et al. (1988) Science 239:1534; Beidler et al. (1988) J. 20 Immunol. 141:4053-60; Winter，U.S.專利案No. 5,225,539， 其等全部之内容於此被併入本案作為參考。Winter敘述一 CDR-轉接方法，其可被使用以製備本發明之人類化抗體（專 利申請案 GB 2188638A; Winter, U.S·專利案 No. 5,225,539)，其等之全部内容在此被併入本案作為參考。一 57 200902064 特定人類〜之全部的⑶以可被—非人類咖之至少一 部分所取代，或僅-些該等隱可被—非人類CDR之一部 分所取代。絲代料人祕抗紅減_之抗原之結 合所需的CDRs係唯一必須的。 5 15 20 已經被例如刪除、添加或取代抗體之例如固定區域的 其它部份所改質之單株4合以及人類化抗體也係於本發 明之範圍中。作為-非限制性的例子，—抗體可被改質， 藉由刪除践區域、藉“例如__意欲增加抗體半生期、 穩定性或親和性m域，或從另—物種或抗體種類而 來之固定區域之另一固定區域取代其固定區域，或藉由改 質固定區域中之一或多個胺基酸以改變，例如醣化位置、 效應細胞功能、Fc受體(FCR)結合、補體結合等 用於改變一抗體固定區域之方法係該技術領域中已廣 為人知的。具有經改變功能之抗體，例如經改變之用於一 效應配位體，諸如於一細胞上之FcR，或補體之以組份， 可藉由以一不同的殘基取代於抗體之固定區域株中之至少 一胺基酸殘基來產生（見，例如EP 388151A1, U.S. 5,624,821 及U.S. 5,648,260 ’其等之全部内容在此被併入本案中作為 參考資料）。對於小鼠（或其它物種)之免疫球蛋白相似類型 之變更可被施用以減少或消除其功能，這樣的變更係該技 術領域中已知的。 例如，去改變一抗體（例如’一IgG，諸如一人類igG) 之一Fc區域對於FcR (例如，FcyRl)的親和性係可能的， 或對於C1 q之結合藉由以一於側鏈上具有適當功能性之殘 58 200902064 基取代特定殘基或藉由引入一諸如麩氨酸或天冬胺酸之帶 電官能基團或一諸如苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸或丙胺酸 之芳香族非極性殘基（見，例如U.S. 5 624,821)。 本發明之抗體可使用來分離、純化及/或偵測於上清 5 液、細胞溶解產物中或於細胞表面上的本發明之多肽。於 一具體例中，一抗_IL-17F/IL-nA抗體係被使用以分離、純
化及/或偵測IL-17F/IL-17A。於另一具體例中，抗-IL-17A 及抗-IL-17F抗體只可分別分離、純化及/或偵测比-丨了八及 IL-17F。於又另-具體例中，抗-IL-17A及抗-IL-17F抗體也 10 可分離、純化及/或偵測IL-17F/IL-17A異型二聚體。揭露於 本發明之抗體也可被使用以診斷地監測，例如 IL-17F/IL-17A蛋白質之水準，作為臨床測試程序之—邹 分，或臨床地以使一治療調節劑將一含有該抗體之抗原的 細胞或組織作為目標。例如，一諸如一小分子之治療物戈 15 本發明之其它治療物可被結合至本發明之抗體以使該治療 物以表現本發明之多肽的細胞或組織為標的。與IL_17F、 IL-17A、IL-17F/IL-17A、IL-17R或IL-17RC蛋白質結合之拮 抗性抗體（較佳地係單株抗體）亦可被使用於 IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關疾病之治療。因此，本發明進 20 一步提供一包含具特定拮抗性IL-17F/IL-17A抗體之組成 物’亦即一專一性地與IL_17F/IL_17A結合且減少、限制、 阻斷或用其它方式降低IL-17F/IL-17A之訊息傳遞的抗體。 本發明也提供一含有訊息傳遞拮抗劑之組成物，其減少 IL-17F、IL-17a及IL_丨7F/IL_丨7a之任一者的訊息傳遞且因 59 200902064 此降低所有三個細胞介素之訊息傳遞下游。相似地，抗 -IL-17F、抗-IL-17A、抗-IL17F/IL-17A、抗-IL-17R 或抗 -IL-17RC抗體可被使用於分離、純化、偵測及/或診斷監測 IL-17F、IL-17A、IL-17F/IL-17A、IL-17R或IL-17RC，分別 5 地，及/或臨床地使一治療調節劑分別以一包含IL-17F、 IL-17A、IL-17F/IL-17A、IL-17R或 IL-17RC之細胞或組織 為標把。抗-IL-17F及抗-IL-17A抗體亦可使用於分離、純 化、偵測及/或診斷監測IL-17F/IL-17A，或臨床地使一治療 調節劑以包含IL-17F/IL-17A之細胞或組織為標粗。 10 除了於本發明中使用之抗體，其它分子也可被使用以 調節IL-17F同型二聚體、IL-17A同型二聚體及/或 IL-17F/IL-17A異型二聚體之活性。這樣的分子包括小模組 免疫藥學（small modular immunopharmaceutical) (SMIPTM) 藥物(Trubion Pharmaceuticals, Seattle, WA)。SMIPs係單鏈 15 多肽包含一用於諸如抗原之同族結構的結合區間、一制衡 受體或其類似物、一具有一個或無半胱胺酸殘基之垂旋區 域以及免疫球蛋白CH2及CH3區間（亦參見 www.trubion.com)。SMIPs及其用途和應用被揭露於，例如 U.S公開專利申請案Nos_ 2003/0118592、2003/0133939、 20 2004/0058445 、 2005/0136049 、 2005/0175614 、 2005/0180970 、 2005/0186216 、 2005/0202012 、 2005/0202023'2005/0202028、2005/0202534 及 2005/0238646 以及其相關之專利案家族成員，其全部内容在此特別被併 入本案中作為參考。 60 200902064 β争選試驗 本發明相關之多核苷酸及多肽可被使用於筛選試驗中 以辨識藥學藥劑或用於藥劑之主要化合物，其可調節於細 胞或生物中IL-17F/IL-17A之生物活性且因此係可能的發炎 5 反應之調控劑。例如，含有至少IL-17F/IL-17A之試樣可被 與多數試驗化合物（生物試劑或小有機分子）之一者接觸且 於各經處理試樣中的IL-17F/IL-17A之生物活性（例如， IL-17F/IL-17Α與IL-17R及IL-17RC之一者或兩者的結合， IL-17F/IL-17A-相關呼吸道發炎反應（例如，嗜中性球招 10 募、細胞介素製造等))可與未經處理之試樣或接觸不同測試 化合物之試樣中的IL-17F/IL-17A之生物活性比較。這樣的 比較將決定是否該等測試化合物之任一者造成：1)一實質 上經減少之IL-17F/IL-17A的表現水準或生物活性，藉此表 示為一 IL-17F/IL-17A拮抗劑或2) —實質上增加之 15 IL-17F/IL-17A的表現水準及生物或活性，藉此表示一 IL-17F/IL-17A激動劑。於一具體例，IL-17F/IL-17A分子(例 如，可調節IL-17F/IL-17A活性之分子）之辨識，係使用高通 量篩選試驗，諸如BIACORE® (Biacore International ΑΒ， Uppsala, Sweden)、BRET (生物發光共振能量轉移 20 ( bioluminescence resonance energy transfer))及FRET (螢 光共振能量轉移（luorescence resonance energy transfer)) 試驗。 熟習此藝者將認知到可調節IL-17F/IL-17A之生物活性 的藥學試劑或主要化合物亦可調節IL-17F及/或IL-17A之生 61 200902064 物活性。因此，本發明也提供—辨識是否一IL17F/IL17A 調節劑（例如，一 IL-17F/IL-17A訊息傳遞激動劑或一 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑）係—對IL_丨7wIL_丨7a具專 一性之調節劑（亦即，其僅調節IL-17F/IL-17A之生物活性） 5或一選擇性1L_17F/IL_17A調節劑（亦即，其調節 IL-17F/IL-17A 及IL-17A 及IL-17兩者或il-17A 及IL-17之 一者的生物活性）的方法。例如，可調節IL_17F/IL_17A之 生物活性的化合物，例如一化合物可調節11^_171?/11^17八與 IL-17R及IL-17RC之一者或兩者的交互作用、一可調節 10 IL-17F/IL-17A相關呼吸道發炎（例如，嗜中性球凹招募、 細胞介素產生等）之化合物等，可與含有至少IL_17A之試樣 接觸，且IL-17A之生物活性，例如IL_17A至IL_17R及/或 IL-17RC之結合或IL-17A-相關呼吸道發炎反應（例如，嗜中 性球凹招募、細胞介素產生等）等，於經處理之試樣中可與 15 未經處理之試樣中的IL-17A生物活性做比較。該化合物也 會與含有至少IL-17F之一試樣接觸，且於一經處理之試樣 中該IL-17F之生物活性’例如，iL_17F至IL_17R及/或 IL-17RC之結合，或IL-17F-相關呼吸道發炎反應（例如，嗜 中性球凹招募、細胞介素產生等）等可與於未經處理之試樣 2〇 中的IL-17F之生物活性比較。IL-17A及/或IL-17F之生物活 性的調節（亦即，生物活性增加或減少）將表示該 IL-17F/IL-17A調節劑不係一對於IL-17F/IL-17A具專一性 的調節劑，但可係一選擇性IL-17F/IL-17A調節劑。另一方 面，該化合物調節IL-17A及IL-17F兩者之生物活性的失敗 62 200902064 將表示該IL-17F/IL-17A係一對IL-17F/IL-17A具專一性之 IL-17F/IL-17A調節齊卜-$習此藝者將認知到該辨識是否 一測試化合物係一 IL-17A調節劑之步驟[例如，使一含有 IL-17A之試樣與IL_17R及IL_17RC之—者或兩者接觸且決 5定於該試樣中之1L_17A的生物活性相對於於一位與測試化 合物接觸之試樣中之IL-17A的生物活性是否被調節（例如 經增加或減少）之步驟]及辨識是否一測試化合物係一 IL-17F έ周節劑之步驟[例如，使一含有IL_ 17F之試樣與 IL-17R及IL-17RC之一者或兩者接觸且決定於該試樣中之 10 IL-17F的生物活性相對於於一位與測試化合物接觸之試樣 中之IL-17F的生物活性是否被調節（例如經增加或減少） 之步驟可以接續地任何順序或同時地被進行，且可被進行 於辨識是否該測試化合物可調節IL-17F/IL-17A之生物活性 的方法被進行[例如，包含使含有IL-17F/IL-17A與IL-17R及 15 IL-17RC之一者或兩者的試樣與一測試化合物接觸且決定 是否於該試樣中IL-17F/IL-17A之生物活性相對於未與該測 試化合物接觸之試樣中的IL-17F/IL-17 A之生物活性係經增 加或減少之步驟，藉由這樣於與該測試化合物接觸之試樣 中IL-17F/IL-17 A生物活性之增加或減少辨識該化合物為一 20 1[17?/江17人調節劑（例如，一比-17?/11^-17入訊息傳遞激動 劑或一IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑）]。 於另一具體例，IL-17F/IL-17A調節劑之辨識，包括具 專一性之IL-17F/IL-17A調節劑（例如，專一性IL-17FML-17A 拮抗劑）’係使用一呼吸道發炎反應的小鼠模式，例如，如 63 200902064 實施例2.1.6及2_2.4.所述，被進行。例如，一遭受呼吸道發 炎之實驗對象(例如，一小鼠，其中卵白蛋白-反應性Thl7 細胞已經被採用地轉一且其已經卵白蛋白刺激、一經接受 一劑量之IL-17F/IL-17A、IL-17A或IL-17F(例如，鼻内地) 5 的小鼠)可經多數個測試化合物(例如，生物試劑或小有機分 子）中之一者處理，且於各經處理之對象中呼吸道發炎反應 的水準（例如，嗜中性球招募、發炎反應細胞介素之濃度) 可與未經處理之對象中或與不同測試化合物接觸之對象中 的呼吸道發炎反應之水準比較。這樣的比較將決定是否該 10 等測試化合物中任一者會造成：1)呼吸道發炎反應的水準 實質上被減少，藉此指示一IL-17F/IL-17A拮抗劑，或2)呼 吸道發炎反應的水準實質上被增加，藉此指示一 IL-17F/IL-17A激動劑。一熟習此藝者將會認知到的係一試 驗化合物，其（1)調節IL-17F/IL-17A-相關呼吸道發炎反應 15 (例如，於一遭受一劑量之IL_17F/IL-17A的小鼠中），（2)不 調節IL-17A-相關之呼吸道發炎反應(例如，於一遭受一劑量 之IL-17A的小鼠中），以及(3)不調節IL-17F-相關呼吸道發炎 反應（例如，於一遭受一劑量之IL-17F的小鼠中）係一具專一 性 IL-17F/IL-17A調節劑。 20 小分子 於一受IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關之疾病所苦（或有 此風險之生物（或對象））中，或於一來自涉及這樣疾病之 這樣生物（或對象）的細胞中，經減少之IL-17A、IL-17F 及/或IL-17F/IL-17A生物活性亦可經過小分子（通常係有機 64 200902064 小分子）之使用被達成，該小分子拮抗IL_17F/IL_17A，亦 即抑制IL-17F/IL-17A.之活性。新穎拮抗性小分子可經由被 敛述於此之篩選方法被辨識且可被使用於本發明以下所敘 述之治療方法中。 5 相反地，於一受例如免疫缺乏，例如嗜中性球減少症， 所苦（或有此風險之生物（或對象乃中，或於一來自涉及 這樣疾病之這樣生物（或對象）的細胞中，經增加之 IL-17A、IL-17F及/或IL-17F/IL-17 A生物活性亦可經過小分 子（通常係有機小分子）之使用被達成，該小分子激動 10 IL-17F/IL-17A’亦即促進IL-17F/IL-17A.之活性。新穎激動 性小分子可經由被敘述於此之筛選方法被辨識且可被使用 於本發明以下所敘述之治療免疫缺乏之方法中，例如，如 被敘述於U.S.專利案Nos. 5,707,829 ; 6,043,344 ; 6,074,849 及U.S.專利申請案No. 10/102,080,，其等所有之全部内容皆 15 於此被併入本案作為參考。 於本發明之一些具體例中，一拮抗性或激動性小分子 可係對於IL-17F/IL-17A異型二聚體具專一性的（亦即，一 小分子僅結合且調節異型二聚體之生物活性y)。熟習此藝 者會認知到專一性IL-17F/IL-17A拮抗性或激動性小分子 20 將可分別用於僅減少或增加IL-17F/IL-17A之活性，且因此
將可被用於IL-17F/IL-17A相關疾病之治療（亦即，相較於 正常之對象中之IL-17F/IL-17A生物活性，在這樣疾病中之 對象具有經改變之IL-17F/IL-17A生物活性）。於本發明其 它具體例中，一拮抗性或激動性小分子對於IL-17F/IL-17A 65 200902064 異型二聚體係具選擇性的（亦即，一小分子，其同時結合至 /調節IL-17F/IL-17A以及IL-17A或IL-17F之一者（或兩者） 的生物活性）。熟習此藝者會認知到選擇性IL-17F/IL-17A拮 抗性或激動性小分子將可用於減少或增加IL-17F/IL-17A之 5 活性，以及例如IL-17F或IL-17A之一者的活性，且因此將 可被使用於IL-17F/IL-17A-、IL-17A-及/或IL-17F-相關疾 病/病症之治療（見，U.S專利申請案11/353,161，其被與此併 入本案作為參考）。 小分子一詞意指不係巨分子之化合物（見，例如，Karp 10 (2000) Bioinformatics Ontology 16:269-85; Verkman (2004) AJP-Cell Physiol. 286:465-74)。因此，小分子常係被認為那 些，例如，小於一千道爾頓，之化合物（例如，Voet and Voet， Biochemistry, 2nd ed., ed. N. Rose, Wiley and Sons, New York, 14 (1995))。例如，Davis et al. (2005) Proc. Natl. Acad. 15 Sci. USA 102:5981-86，使用小分子一詞去表示葉酸鹽、滅 殺除癌鍵（methotrexate )及神經胜肽，而 Halpin and Harbury (2004) PLos Biology 2:1022-30使用該詞表示小分子基因產 物，例如DNAs、RNAs及胜肽。天然之小分子的例子包括， 但不限於，膽固醇、神經傳導物及siRNAs ;被合成之小分 20 子包括，但不限於，各式表列於許多商業上可取得之小分 子資料庫之各式化學物質，該資料庫係例如FCD (Fine Chemicals Database) ' SMID (Small Molecule Interaction Database)、ChEBI (Chemical Entities of Biological Interest) 及CSD (Cambridge Structural Database)(見，例如，Alfarano 66 200902064 et al. (2005) Nuc. Acids Res. Database Issue 33:D416-24) ° 用於診斷、判斷預後及監控與IL-17F/IL-17A訊息傳遞 相關之疾病進展之方法 本發明提供一種用於於一對象中藉由偵測 5 IL-17F/IL-17A活性之上升調控（UpregUlation)，例如偵測 IL-17F/IL-17A上升調控’來診斷、判斷預後及監控與 IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關之疾病（例如，那些直接或間接 涉及IL-17F/IL-17A生物活性增加之疾病）進展之方法，其包 括但不限於於人類對象中所使用之方法。一熟習此藝者將 10 認知的係與IL-17F/IL-17A相關之疾病亦可係與il-ΠΑ及/ 或IL-17F生物活性相關的。因此，這些方法可藉由使用例 如出售以前先包裝之診斷套組來被執行，該套組包含有至 少一包含一或多個IL-17F、IL-17A、IL-17F/IL-17A、IL-17R 或IL-17RC多肽或其片斷、一或多個JL-17F、IL-17A、 15 IL-17F/IL-17A、IL-17R或IL-17RC多肽或其片斷（包括其 融合蛋白）、一或多個針對IL-17F、IL-17A、IL-17F/IL-17A、 IL-17R或IL-17RC多肽或其衍生物，或一或多個如在此所
敘述之IL-17F、IL-17A、IL-17F/IL-17A、IL-17R或IL-17RC 多核苷酸及/或多肽之調節劑之群組，其可係便於使用的， 20 例如於一臨床環境中。此外，一熟習此藝者會認知到，例 如’ IL-17F/IL-17A之上升調節亦可藉由間接之方法被偵 測’諸如計數例如嗜中性球之免疫細胞的數目。 δ乡斷的（Diagnostic)」或「診斷（diagnosing)」意 指辨識一病理病症存在或不存在。診斷方法包括偵測 67 200902064 IL-17F/IL-17A訊息傳遞之上升調節，其係藉由決定一來自 一對象之生物試樣中的IL-17F、IL-l7A及/或IL-17F/IL-17A 之IL-17F/IL-17A基因產物（例如，mRNA、cDNA及/或多 肽’包括其片斷）之一測試量並比較該測試量與一正常量 5 或範圍（亦即，來自一已知沒有受IL-17F/IL-17A訊息傳遞 相關疾病所苦之個體之量或範圍）。雖然一特定診斷方法可 能不提供一IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關疾病之最可靠的診 斷’其係足狗的若該方法提供幫助診斷之陽性指示。 本發明也提供一判斷這樣疾病預後之方法，其係藉由 10 偵測IL-17F/IL-17A活性之上升調節，例如藉由偵測 IL-17F/IL-17A之上升調節。「預後的（pr0gn0Stic)」或「判 斷預後（prognosing)」意指預測一病理病症可能的發轉及/ 或嚴重性。判斷預後之方法包括決定來自對象之生物試樣 中之IL-17F/IL-17A之基因產物的測試量且針對該 15 IL_17F/IL-17A基因產物比較該測試量與一預後之量或範圍 (亦即’來自具有IL-17F/IL-17A相關疾病之不同嚴重性之 個體的量或範圍）。於一測試式樣中該IL-17F/IL-17A基因 產物之許多量與對於IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關疾病之某 些判斷預後結果係一致的。於一特定預後水準上 20 IL_17F/IL_17A基因產物量之偵測提供對象一對預後之判 斷。 本發明也提供一監控IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關之這 樣疾病之進展或進程之方法，其係藉由偵測IL-17F/IL-17A 生物細胞介素活性之上升調節’例如藉由偵測 68 200902064
10 15
20 IL-17F/IL-17A基因產物之上升調節。監控方法包括決定於 一取自對象之多個生物試樣*IL_17F/IL_17A之基因產物 之測試量，例如於第一及第二次，且比較該等量。於該第 一及第二次間一 IL-17F/IL-17A基因產物之量的變化表示 IL-17F/IL-17A相關疾病之進程的變化，量之減少表示這樣 疾病的換解且量之增加表示這樣疾病之發展。這樣監控試 驗一可用於在一欲被治療之病患中，例如，自體免疫疾病， 評估一特定治療手段之功效。 於上面概述之方法中經增加2IL-17F/IL-17A訊息傳遞 可於’各式生物式樣中被偵測，包括體液（例如，全血、 血漿及尿）、細胞（例如’全細胞、細胞片段及細胞萃取物） 以及其它組織。生物試樣一包括組織之切片，諸如用於組 織學目的之取自活組織切片及冷凍切片。較佳之生物試樣 包括血液、血漿 '淋巴液、組織切片、尿液、CSF (腦脊髓 液）、滑液及BAL (肺泡沖洗術(bronchoalveolar lavage))。 將會被了解的係一生物試樣之分析不必然需要要求從該對 象移除細胞或組織。例如，適當之經標記之與IL-17F/IL-17A 訊息傳遞基因產物(例如’抗體、核酸)結合之藥劑可被投予 至一對象且使用標準成像科技（例如’ CAT、NMR (MRI) 及PET)而被顯現 於本發明之診斷及判斷預後之試驗中，該 IL-17F/IL-17A基因產物係被偵測並定量以產生—測試量。 該測試量接著被與一正常量或範圍比較。一顯然高於正常 量或範圍之量於IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關之疾病的診斷 69 200902064 中係一陽性的表示。IL-17F/IL-17A基因產物之摘測以及定 量的特定方法被敘述於下。 任何特定式樣種類及族群之IL-17F/IL-17A基因產物之 正常量或基線水準可被決定。通常，IL_17F/IL_17A基因產 5 物之基線（正常）水準係由測定於一來自正常（例如，健 康）對象之生物試樣種類iIL_17F/IL-i7A基因產物的個別 之量來被決定。可擇地，IL-17F/IL-17A基因產物之正常值 可藉由測定取自與染病（或可能染病）測試細胞或組織所 取自之相同對象的健康細胞或組織中之量被決定。以單位 10 細胞、總蛋白或單位體積為基礎的IL-17F/IL-17A基因產物 之量（正常量或測試量）可被決定或表現。為決定一試樣 之細胞量，可測量構成地倍表現之基因產物或該種細胞中 表現水準已知之其他基因產物，從該種細胞種生物試樣被 取出。將被了解地係本發明之該試驗方法不一定要求測量 15 IL-17F/IL-17A基因產物之絕對數值因為相對數值對於這些 方法的許多應用系足夠的。將會被了解的係除了 IL-17F/IL-17A基因產物之量或豐富度外’變異體或不正常 IL-17F/IL-17A基因產物或其表現方式（例如’經突變之轉錄 體，經截斷之多肽)可接由與正常基因產物或表現方式比較 20 來被辨識。 一特定基因於二試樣中之表現是否係顯著相似或顯著 不同，例如，顯著高於顯著低於一特定水準，係依據該基 因本身且，尤其係其於不同個體或不同式樣間的表現變異 性。決定表現水準是否係顯著相似或不同係於習知技藝的 200902064 範圍内。諸如基因變異等因子於例如多數個體、物種、器 官、組織或細胞間的IL_17F/IL_17A表現水準中可被納入考 量（虽時或所在處需要）當決定是否，例如IL_17F/IL_17A， 之表現水準於兩個試樣間係顯著相似或顯著不同，例如顯 5著高於一特定水準。由於於多數個體、物種、器官、組織 或細胞間基因表現中的自然異質性，諸如「顯著地相似」 或「顯著地高於」或相似之用語被界定為—精確百分比或 數值，但當實施本發明時可由熟習此藝者所斷定。本發明 之診斷、判斷預後即監控試驗涉及偵測及定量生物式樣中 10 IL-17F/IL-17A基因產物。IL_17F/IL_17A基因產物包括 mRNAs、cDNAs (例如，IL-17A及IL-17F她财及/或山财) 及/或多肽（例如，IL-17F/IL-17A、IL-17F、il-ΠΑ多肽）且 S可使用熟習此藝已知之方法來測定。例如，a可使 用雜交為基礎之試驗，諸如北方雜交法、原位雜交法、墨 15 點法及养核4酸试驗來被直接偵測及定量。雜交為基礎之
試驗意指其中一探針核酸係被與一標的核酸雜交之試驗。 於一些形式中，該標的、探針或兩者係被固定的。該經固 定之核酸可係DNA、RNA或另一寡核苷酸或多核苷酸，且 可包含天然的或非天然發生之核苷酸'核苷酸類似物或主 20 鍵。選擇用於本發明之核酸探針序列之方法係基於il_i7F 及/或IL-17A之核酸序列，且係習知技藝中已熟知的。 可擇地，在偵測及訂量前mRNA可被擴増。這樣擴增 為基礎之試驗係習知技藝已熟知的且包括聚合酶連鎖反廣、 (PCR)、反-轉錄-PCR (RT-PCR)、PCR-酵素連結免疫吸附法 71 200902064 (PCR-ELISA)以及連接酶連鎖反應(LCR)。用於製造及偵測 經擴增IL-17A及/或比_1717基因產物（例如，1111^八或 cDNA)的引子及探針可分別根據IL_17A及IL_17F之核酸序 列被容易地設計及製造而不需要藉由熟習此藝者之過度實 5 驗。作為一非限制性的實施例，經擴增之IL-17A及/或 IL-17F基因產物可被直接地分析，例如，藉由凝膠電泳； 藉由雜交至一探針核酸；藉由序列定序；皆由螢光、燐光 或賴射訊號之偵測或藉由任何各式已為人熟知之方法。此 外’藉由標的核酸序列之擴增來產生增加的訊號係熟習此 10 藝者已知之方法。一熟習此藝者將會認知到無論哪種擴增 方法被使用’許多習知的定量方法（例如，定量PCR)可 被使用若基因產物之定量係所欲的。 IL-17F/IL-17A多肽（或其片斷）可使用各種習知已熟知 的免疫試驗利用抗-IL-17A、抗-IL-17F及/或抗 15 -IL-17F/IL-17A抗體來被偵測，該等抗體可被產生如同在此 所敘述的。免疫試驗意指使用一特定結合至例如 IL-17F/IL-17A多肽（或其片斷）之抗體(例如，多株抗體、 單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、scFv及/或其片斷)之試 驗。這樣已被熟知之適合用於實施本發明之免疫試驗包括 20 ELISA、放射性免疫測定法(RIA)、免疫沉澱法、免疫螢光 法、螢光活化細胞分選法(FACS)及西方點墨法。 一 IL-17F/IL-17A 多肽亦可使用抗-IL-17A及抗 _IL-17F 抗體之組合而利用例如一三明治ELISA來被偵測。此外’ IL-17F/IL-17A多肽可使用一經標記之IL-17R及/成 72 200902064 IL-17RC多肽被偵測。相反地，IL-17R或IL-17RC可使用經 標記之IL-17F/IL-17A多肽被偵測。 一熟習此藝者將會了解到上面所提及之方法可被應用 於IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關疾病上。 5 IL-17F/IL-17A相關之分子於治療中之用途 美國專利申請案No. 11/353,161，其全部内容被於此併 入本案作為參考，證明hIL-17F及hIL-17A兩者透過與 hIL-17R及/或ML-17RC受體結合來引起相似之反應。本 發明人首次證明hIL-17F/IL-17A異型二聚體亦與相同 10 hIL-17R及hIL-17RC受體結合且因起相似於hIL-17A及 hIL-17F同型二聚體之反應。再者，發明人提供了一新穎小 鼠IL-17F/IL-17A異型二聚體，證明該異型二聚體於活體中 係具生物活性的且證明該異型二聚體之阻礙物可被使用於 活體以治療及/或預防IL-17F/IL-17A-相關疾病，例如呼吸 15 道發炎。因此，熟習此藝者可認到IL-17F/IL-17A-相關疾病 亦可包括IL-17A-及IL-17F-相關疾病，且因此可被以 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑治療。 調節IL-17F/IL-17A訊息傳遞之被揭露於此的分子，包 括使用上面所敘述之方法所辨識出之調節劑，可被使用於 20試管中、試管外或被併入藥學組成物中且於活體中投予至 對象或個體來治療，例如，IL_17F/IL_17A訊息傳遞相關之 疾病，其藉由IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑之投予（例如， IL-17A及/或IL-17F抑制性多核皆酸；可溶性IL_17R及/ 或IL-17RC多肽（包括其片斷及/或榮核蛋白抑制性抗 73 200902064 mF、抗^从、抗-IL_i7F/il-17A、抗-IL_17R 或抗 -IL_17RC抗體；拮抗性小分子等）。數個被考慮以決定是否 投予調節IL-17F/IL-17A訊息傳遞之分子的藥學基因方法係 熟習此藝者已熟知的且包括全基因體相關、候選基因方法 5 以及基因表現特徵判斷。本發明之一藥學組成物係被配製 以與其投藥之所欲路徑（例如’ 口服組成物通常包括一惰性 稀釋劑或一可食用之載劑)相容。其它投藥之路徑的非限制 性例子包括非經口的（例如，靜脈内的）、皮膚内的、經口的 (例如，吸入）、經皮膚的（局部的）、通過黏膜的以及直腸 10 投藥。可與各個所欲路徑相容之藥學組成物亦係習知已熟 知的。 IL-17F/IL-17A訊息傳遞激動劑或il- 17F/IL-17A訊息 傳遞拮抗劑可被使用為一藥學組成物當與一藥學上可接受 之載劑結合時。這樣的一組成物除了一調節几—丨开/丨^丨了八 15 (例如’ mF/IL-PA訊息傳遞激動劑或IL-17F/IL-17訊 息傳遞拮抗劑）之分子及載劑外，可包含各種稀釋劑、填充 劑、鹽類、緩衝劑、安定劑、助溶劑以及其它習知已熟知 的物質。「藥學上可接受」一辭表示一無毒物質，其不會干 擾活性成分之生物活性的功效。載劑之特性將會依據投藥 20 之路徑。本發明之藥學組成物亦可包含細胞介素、淋巴介 質或其他造血因子’諸如M-CSF、GM-CSF、IL-1、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、 IL-12、IL-14、IL-15、G-CSF、幹細胞因子以及紅血球生成 素。該藥學組成物亦可包含抗_細胞介素，如同下所詳細敘 74 200902064 述。該藥學組成物可包含溶解血拴或抗血栓因子，諸如胞 漿素原（plasminogen)活化因子VIII。該藥學組成物可進一部 包含其他抗發炎劑如下面所詳細敘述者。這樣額外之因子 及/或藥劑也可被包含於該藥學組成物中以與 5 IL_ 17F/IL_17A訊息傳遞激動劑或IL-17F/IL-17A訊息傳遞 拮抗劑產生協同作用或以最小化由IL-17F/IL-17A訊息傳遞 拮抗劑或IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑所造成之副作用。 相反地’ IL-17F/IL-17A訊息傳遞激動劑或IL_丨7F/IL_丨7a訊 息傳遞枯抗劑可被包括於該特定細胞介素、淋巴介質、立 10他造血因子、溶解血栓或抗血栓因子或抗發炎劑之調配物 中以最小化細胞介素、淋巴介質、其他造血因子、溶解血 栓或抗血栓因子或抗發炎劑之副作用。本發明之藥學組成 物可係於一脂質體之形式中，其中除了其他藥學上可接受 之載劑外，IL-17F/IL-17A訊息傳遞激動劑或 15 IL_17F/IL_17A訊息傳遞拮抗劑被與兩親媒性劑結合，該兩 親媒性劑諸如脂質，其存在以聚集形式，如為於水狀溶液 中之微胞、不可溶單層、脂質結晶或薄層狀層。適合用於 微胞調配物之脂質包括但不限於單甘油酯、二酸甘油酿、 聽硫脂、脫脂酸卵碟脂、填脂、皂素、膽酸等。 2〇 當被使用於此，「治療有效量」一詞意指藥學組成物或 方法之各活性成分之總量，其足以去顯示有意義的對病患 之盈處，例如症狀之改善、治癒或增加這樣病症之治癒率。 當適用於一單一活性成分，單獨被投予，該用與意指單獨 之/舌性成分。g適用於組合物，該詞意指造成治療效果 75 200902064 之該活性成分之經結合的量，不論係被組合式、連續或同 時投予》 於實施本發明之治療方法或用途中，一治療有效量之 IL-17F/IL-17A訊息傳遞調節劑（例如，IL-17F/IL-17A訊 5 息傳遞激動劑或IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑）係被投予 至一對象，例如一哺乳類（例如，一人類）。一IL-17F/IL-17A 訊息傳遞調節劑可單獨根據本發明之方法或與其它療法結 合而被投予，該等其它療法諸如使用細胞介素、淋巴介質 或其他造血因子或抗發炎劑治療。當與一或多個藥劑被共 10 同投予時’，^-HF/IL-nA激動劑或拮抗劑可被與該第二藥 劑同時或接續地投予。若被接續地投予，主治的内科醫生 將決定，例如一特定抗-_IL_17F/IL_17A拮抗性抗體與其它 藥劑組合’之投藥的適當的順序。 當—治療有效量之IL-17F/IL-17A調節劑被經口的投 15予，黏合劑將為一錠劑、膠囊、粉末、溶液或酏劑型式。 田以錠劑型式被投予，本發明之藥學組成物可額外地包 含一固體栽劑，諸如白明膠或佐劑。錠劑、膠囊及粉末含 有從、·々5至95%之黏合劑且較佳地係從約25至9〇%之黏合 劑。當以一液體形式投予，—液體宰體諸如水、石油、動 或諸如彳匕生油、礦物油、黃立油或芝麻油之植物來源 油或s成油可被添加。該液體形式之藥學組成物可進一 P 3有生理鹽類溶液、葡萄糖或其他_類溶液，或諸如 乙一醇、丙二醇或聚乙二醇之二醇。當以溶液形式投予， °玄藥學組成物含有以重量計從約0.5至9 0 %之黏合劑且較佳 76 200902064 地以重量計係從約1至50%之黏合劑。 當一治療有效量之一 IL-17F/IL-17A調節劑鞛由靜脈 内、皮膚或皮下注射被投予，該IL-17F/IL-17A調節劑將以 一無熱原、非經口可接受液體溶液之形式。這樣非經口可 5 接受之具有適合PH、等滲性、穩定性等的蛋白質溶液的製 備係於習知技藝之中。一較佳之用於靜脈内、皮膚戋皮下 注射之藥學組成物除了該IL-17F/IL-17A調節劑應包含一等 滲透媒液，諸如氣化鈉注射液、林格爾注射液（Ringer，s injection)、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸 10 林格爾注射液或其他習知已知的媒液。本發明之藥學組成 物也可含有安定劑、防腐劑、緩衝劑、抗氧化劑或其他熟 習此藝者已知之添加物。 於本發明藥學組成物中IL-17F/IL-17A調節劑之量將係 依據所欲治療病症之本質及嚴重性以及依據治療前病患所 15經歷之性質。最後，主治的内科醫生將決定治療各病患所 用之IL-17F/IL-17A調節劑的量。最初，主治的内科醫生將 投予低劑量之IL-17F/IL-17A調節劑並觀察病患之反應。較 大劑量之IL-17F/IL-17A調節劑可被投予直到對於病患最佳 之治療效果被達到且在那一點該劑量通常不會再進一部被 20增加。被預期的係許多被用於實施本發明之方法的藥學組 成物應含有約0.1吨至約1〇〇 mg2IL17F/IL17A調節 劑，例如具專一性的抑制性抗_il_17F/il_17a抗體，每公斤 體重。 使用本發明之藥學組成物的靜脈内（i v.)療法之持續 77 200902064 期間將變化，依據欲被治療之疾病的嚴重性以及各個病患 之症狀及可能的特殊反應。被預期的係IL-17F/IL-17A調節 劑之各個應用的持續時間可於多於一小時之投藥的範圍 中，例如約12至約24小時連續i.v.投藥。也被預期的係使用 5 本發明之藥學組成物的皮下（s.c.)治療法。這樣的治療法可 被每天一次、每週一次或較佳地每二週一次或每個月一次 投藥。亦被預期的係該IL-17F/IL-17A調節劑係一小分子(例 如，用於經口輸送），該等治療法可被每天一次、一天二次、 一天三次等投藥。最後，主治的内科醫生將決定使用本發 10 明之藥學組成物之i.v.或S.C治療法或以一小分子的治療法 的適當持續時間以及該治療的投藥時機。 本發明之多核苷酸以及蛋白質係被預期呈現一或多個 下列所發現的用途或生物活性（包括那些與在這裡引用之 試驗相關的）。針對本發明之蛋白質所敘述之用途或活性可 15 藉由投予或使用這樣的蛋白質或藉由投予獲使用編碼這樣 蛋白質之多核苷酸(諸如，例如，於基因治療中或適合用於 引入DNA的載體）來被提供。 IL-17F/IL-17 A訊息傳遞拮抗劑用以治療免疫疾病之用 途 20 IL-17F/IL-17 A訊息傳遞拮抗劑亦可被投予至一對象 中，對於該對象來說抑制IL-17F/IL-17A係所欲的。這些病 症包括，但不限於，發炎性疾病，例如自體免疫疾病（例如， 關節炎（包括風濕性關節炎）、牛皮癣、全身性紅斑性狼瘡、 多發性硬化症）、呼吸道疾病（例如，呼吸道發炎、COPD、 78 200902064 囊腫纖維化、氣喘、過敏）、移植排斥反應（包括固體器官移 植排斥反應）以及發炎性腸疾（例如，潰瘍性大腸炎、克隆氏 症（Crohn’s disease )。 這些方法係部份基於以下發現，該發現係以本發明相 5 關之WL-17F、hIL-17A及/或 hIL-17F/IL-17A拮抗劑（例如， hIL-17R.Fc、hIL-17RC.Fc、抗-hIL-17R 抗體、抗-hIL-17RC 抗體）處理細胞會抑制hIL-17A-、hIL-17F-、及/或 hIL-17F/IL-17A-所引發細胞介素之釋放，例如GRO-α細胞 介素釋放，例如從人類包皮纖維母細胞細胞s(實施例 10 12.4-1.2.5)。此外，這些方法係部份基於以下發現，該發
現係以本發明相關之抑制性多核苷酸(例如，IL_丨siRNA 及IL-17RC siRNA)處理細胞會抑制 hiL-l7A-、hIL-17F-及 hIL-17F/IL-17A-所引起之細胞介素的釋放（實施例12.6)。 又，發明人證明IL-17F/IL-17A在活體中呼吸道發炎反應上 15扮演一角色且該細胞介素之阻斷物預防及/或減少這樣的 呼吸道發炎反應（實施例2.2.3-2.2.5)。據此，几-17?/11^-17八 拮抗劑（例如’ IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑），亦即，抑 制IL-17F/IL-17A生物活性之分子，可被使用於活體中減少 發炎反應，例如用於治療或預kIL_17f/il_17a_相關疾病， 20例如與IL_ 17F/IL_17 A訊息傳遞相關之疾病。 使用IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑之方法也可被使 用於免疫疾病中來抑飢應L_17A生物活性且因此可被 使用以治療或預防多種免疫疾病。可被治療或預防之該等 疾病的非限制性例子包括但不限於移植的排斥反應、自體 79 200902064 免疫疾病（包括，例如糖尿病）、關節炎（包括風濕性關節 炎、幼年性風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬關節炎、反 應性關節炎）、多發性硬化症、腦脊髓炎、重症肌無力、全 身性紅斑性狼瘡(SLE)、自體免疫曱狀腺炎、皮炎（包括異 5 位性皮膚炎以及濕療性皮炎）、萊特氏症候群（Reiter’s syndrome)、牛皮癬、薛格連氏症候群(sj0gren，s syndr〇me)、 克隆氏症、口腔潰瘍、虹膜炎、結膜炎、角膜結膜炎、潰 瘍性大腸炎、脊椎關節病變、，關節黏連性脊椎炎、内因 性氣喘、過敏性氣喘、皮膚紅斑性狼瘡、硬皮病、陰道炎、 10 直腸炎、藥物性紅疹、麻瘋逆向反應、痲瘋結節性紅斑、 自體免疫性眼色素層炎、過敏性腦脊髓炎、急性壞死出血 性腦脊髓炎、自發性兩側進行性感覺神經型聽力喪失、再 生不全性貧血、純粹性紅血球再生不良、自發性血小板減 少症、多軟骨炎、韋格納肉芽腫（Wegener’s 15 granulomatosis)、慢性活動性肝炎、帝文生氏-強生症候群 (Stevens-Johnson syndrome)、自發性腹瀉、扁平苔癖、葛瑞 夫茲病（Graves’ disease)、類肉瘤病、原發性膽汁鬱積性肝 硬化、後段葡萄膜炎以及間質肺纖維化）、移植物對抗宿主 疾病、肺發作期（pulmonary exacerbation)(例如，由細菌感 20 染所引）以及過敏，諸如局部過敏。使用含有投予干擾 IL-17A、IL-17F及/或IL-17F/IL-17A異型二聚體訊息傳遞 的IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑（例如，針對IL-17A、 IL-17F及/或IL-17F/IL-17A之拮抗性抗體或其片斷； <滲 性受體；小分子；抑制性多核苷酸等.)之方法可被治療I軾 80 200902064 佳的疾病包純不限於發錄疾病，例如，自體免疫 (例如’關節炎（包括風濕性關節炎）、牛皮癖、全身性红斑 性狼瘡、多發性硬化症）、吟吸道疾病（例如，呼吸道發炎 ⑽D、囊腫纖維化、氣端、過敏）、移植排斥反應， 5
10 固體器官移植排斥反應），以及以性腸病(例如，潰癌 腸炎、克隆氏症）。 使用IL-17F/IL_17A訊息傳遞抬抗劑（例如心从 L17F、IL-17R及/或IL_17RC抑制性多核苦酸；可溶性 IL-nR及/或IL-mc多肽（其包括片段及/或融合蛋白 智性抗_IL-17F、抗孔-ΠΑ、抗_α·17Μί_ΐ7Α、抗-^孜 或IL-HRC抗體;及/缝抗性小分子等），以純方式來調節 免疫反應(例如，下調)係可能的。下調（D_regulation) 可係以抑制或阻斷-已經進行的發炎反應之方式或係涉及 預防一發炎反應的引發。 15 於一具體例中’ IL-™IL-17A訊息傳遞拮抗劑，包括 其藥學組成物，係被投與於一組合式治療法中，亦即以其 它藥劑結合，例如可用於治療諸如免疫疾病及發炎疾病之 病理病症或疾病的治療劑。「組合」—詞於此文#意指該等 藥劑係實質上同時地，同時或接續地被給予。若接續被給 20予’例如’在第二化合物被投藥開始時，二化合物中之第 -化合物係較佳地在治療處係仍具一可侧的有效濃度。 例如，組合式治療法可包括一或多個IL-17F/IL-17A訊 息傳遞拮抗劑(例如，IL-17A、IL_ i 7F、IL_! 7R及/或i脱 抑制性多核苦酸；可溶性IL_17R及/或IL_17RC多狀（包括 81 200902064 其片段及/或融合蛋白）;抑制性抗_IL_17F、抗_IL_17A、抗 -IL17F/IL-17A、抗-IL-17R或IL-17RC抗體；拮抗性小分子 等.)與一或多個額外之治療劑共同調配及/或共同投予。該 等額外之治療劑係例如一或多個細胞介素及生長因子抑制 5 劑、免疫抑制劑、抗發炎劑、代謝抑制劑、酵素抑制劑及/ 或細胞毒素或細胞生長抑制劑，如同在此更詳細之敘述。 此外’一或多個被敘述於此之IL _17F/IL_17A訊息傳遞拮抗 劑可被與一或多個被敘述於此之治療劑組合使用。這樣的 組合式可有益地使用較低劑量之被投予治療劑，因此避免 10可能的與許多單一藥物療法相關之毒性或併發症。又，被 揭露於此之該等治療劑做用於不同於IL_17F/IL_17A受體 訊息傳遞路徑之路徑上，且因此被預期會加強及/或與 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑協同作用。 被用於與IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑組合之較佳 15治療劑係那些在發炎反應中之不同階段發生干擾的治療 劑。於一具體例中，被敘述於此的一或多個IL-17F/IL-17A 訊息傳遞拮抗劑可與一或多個額外之藥劑共同被調配或投 予’該等額外藥劑係諸如其它細胞介素或生長因子拮抗劑 例如，可溶性受體、胜肽抑制劑、小分子、配位體融合體）； 20或抗體或其結合至其它標的的抗原結合片段(例如，結合至 細胞介素或生長因子、其之受體或其它細胞表面分子之抗 體），以及抗-發炎細胞介素或其激動劑。可與敘述於此之 IL-17F/IL-17 A訊息傳遞拮抗劑組合使用之該等藥劑的例子 包括’但不限於’一或多個介白素(ILs)或它們之受體之拮 82 200902064 抗劑，例如IL-l、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、 IL-15、IL-16、IL-18、IL-21及IL-22之拮抗劑；細胞介素或 生長因子或它們之受體的拮抗劑，諸如腫瘤壞死因子 (TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF 以及 PDGF。 5 IL-17F/IL-17A §fl息傳遞抬抗劑也可與細胞表面分子或其配 位體之例如抗體的抑制劑結合，該細胞表面分子係諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD20 (例如，CD20抑制劑利妥昔 單抗（rituximab) (RITUXAN®))、CD25、CD28、CD30、 CD40、CD45、CD69、CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2)、CD90， 10 該配位體包括 CD154 (gp39或CD40L)或LFA-1/ICAM-1 及 VLA-4/VCAM-1 (Yusuf-Makagiansar et al. (2002) Med. Res. Rev. 22:146-67)。可與被敘述於此之IL_17F/IL_17Mfl息傳遞 拮抗劑組合使用之較佳的拮抗劑包括IL-l、IL-12、TNFa、 IL-15、IL-18及 IL-22。 15 這些藥劑之例子包括IL-12拮抗劑，諸如嵌合的、 經人類化、人類的、試管中產生之結合至扎_12(較佳地係人 類IL-12)的抗體（或其抗原結合片段），例如揭露於 WO 00/56772中之抗體；il-12受體抑制劑，例如人類IL_12 受體之抗體；以及IL-12受體之可溶性片段，例如人類IL-12 20 受體。〗L_15拮抗劑之例子包括對抗IL-15或其受體之抗體 (或其抗原結合片段），例如散合的、經人類化、人類的、 試管中產生之對於人類IL-15或其受體、該IL-15受體之可溶 性片段以及IL-15-結合蛋白之抗體。[-18拮抗劑之例子包 括抗體’例如針封的人類IL-18、IL-18受體可溶性之片段以 83 200902064 及IL-18結合蛋白（IL-18BP)的嵌合、經人類化、人類的、試 管中產生之抗體（或其抗原結合片段）。IL-1拮抗劑之例子 包括介白素-1-轉變酵素(ICE)抑制係，諸如Vx740，IL-1拮 抗劑，例如IL-1RA (anakinra，KINERET™，Amgen)、sILlRII 5 (Immunex)以及抗-IL-1受體抗體（或其抗體結合片段）。 TNF拮抗劑之例子包括嵌合的、經人類化的、人類的 及於試管中產生的對抗TNF (例如，人類TNFa)之抗體（或 其抗原結合片段），諸如（HUMIRA™, D2E7,人類TNFa抗 體）、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人類化抗-TNFa抗體； 10 Celltech/Pharmacia)、cA2 (嵌合抗-TNFa抗體；REMICADE®,
Centocor);抗-TNF抗體片段(例如，CPD870);TNF受體之 可溶性片段，例如，p55或!)75人類TNF受體或其衍生物， 例如 75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF 受體-IgG 融合蛋白， ENBREL™; Immunex)、p55 kd TNFR-IgG (55 kD TNF受體 15 -IgG融合蛋白（LENERCEPT®));酵素拮抗劑，例如TNFa 轉變酵素(TACE)抑制劑（例如，a-磺醯羥胺酸衍生物，以 及N-羥甲醯胺TACE抑制劑GW 3333，-005,或-022);以及 TNF-bp/s-TNFR (可溶性TNF結合蛋白）。較佳的TNF拮抗劑 係TNF受體之可溶性片段，例如p55或p75人類TNF受體或其 20 衍生物，例如，75 kd TNFR-IgG及TNFa轉變酵素(TACE) 抑制劑。 於其它具體例中，被敘述於此之IL-17F/IL-17A訊息傳 遞拮抗劑可與下列中一或多個被組合投予：IL-13拮抗劑， 例如，可溶性IL-13受體（sIL-13)及/或對抗IL-13之抗體；IL-2 84 200902064 拮抗劑，例如，DAB 486-IL-2及/或DAB 389-IL-2 (IL-2融合 蛋白，Seragen)及/或對於IL-2R之抗體，例如，抗-Tac (人類 化抗-IL-2R，Protein Design Labs)。另一組合包括 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑與非耗盡性（nondepleting) 5 抗-CD4抑制劑（IDEC-CE9.1/SB 210396;非耗盡性靈長動 物化抗-CD4抗體；IDEC/SmithKline)組合。又其它較佳之 組合包括共激（costimulatory)路徑CD80 (B7.1)或CD86 (B7.2)之拮抗劑，包括抗體、可溶性受體或拮抗劑配位體； 以及p-選凝素醣蛋白配位體(PSGL)、抗發炎細胞介素，例 10 如 ’ IL_4 (DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000;重組IL-10 DNAX/Schering); IL-13及TGF-β，及其激動劑（例如，激動 劑抗體）。 於具它具體例中 15 20 ^ ^ ΊΙέ| li--l /r/lL·-! /A a.u 抗劑可與一或多個抗發炎藥物、免疫抑制劑或代謝或酵素 抑制劑共投調配或投藥。可被使用於與敘述於此之 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑的組合中之該等藥物或抑 制劑的非限制性例子包括’但不限於，一或多個：：非類固 醇抗發炎藥物(NSAIDs) ’例如，伊布洛芬(ibupr〇㈣、替尼 達普（tenidap)、奈普生（napr()xen)、美洛昔康（me-—、 °比羅昔康（Pir°Xi叫、雙氯芬酸(didofenac)以及美洒辛 (indo_hacin);柳M如定(sulfasalazine);皮質類固醇， 諸如去氫皮質醇；細胞介素抑制性抗發炎藥物(⑽财核 苦酸生物合成抑制劑，例如，嘴吟生物合成之抑制劑，葉 酸鹽抬抗咖如’統除錢）师_[[(2,4_二勝6顧 85 200902064 基）甲基]甲胺基]苯甲醯基]-L-谷氨酸）;以及鳴咬生物合成 抑制劑，例如，二氫乳酸脫氫酶(DHODH)抑制劑。較佳之 用於與IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑之組合的治療劑包 括NSAIDs、CSAIDs、（DHODH)抑制劑（例如，來氟米特 5 (leflunomide))以及葉酸鹽拮抗劑（例如，滅殺除癌錠）。 額外之抑制劑的例子包括一或多個：皮質類固醇皮質 類固醇(經口、吸入及局部注射）;免疫抑制劑，例如，環孢 素、他克莫司（tacrolimus) (FK-506);mTOR抑制劑，例如， 西羅莫司（sirolimus )(雷帕黴素（rapamycin) -ίο Rapamune™或雷帕黴素衍生物，例如，可溶性雷帕黴素 衍生物(例如，酯雷帕黴素衍生物，例如，CCI-779);藉由促 發炎細胞介素諸如TNFa或IL-1 (例如，irak、NIK、IKK、 p3 8或MAP激酶抑制劑）干擾訊息傳遞的藥劑；c〇X2抑制 劑，例如，塞來昔布(celecoxib)、羅夫考克斯（r〇fec〇xib) 15以及其變異體，麟酸一酿_抑制劑，例如，R973401 (碟酸 二醋酶第IV型抑制劑)；磷脂酶抑制劑，例如，細胞質填脂 水解酵素2 (細胞磷脂酶2) (cPLA2)之抑制劑（例如，三氟 甲基丙酮類似物);血管内皮細胞生長因子或生長因子受體 之抑制劑，例如，VEGF抑制劑及/或VEGF_R抑制劑；以及 20血管生長抑制劑。較佳之用於使用於與IL-17F/IL-17A訊_ 傳遞拮抗劑組合的治療劑係免疫抑制劑，例如，環抱素 uycl〇sp〇rin)、他克莫司（tacrolimus)(FK5〇6); mT〇R 抑制 劑，例如，西羅莫司（雷帕黴素)或雷帕徽素衍生物，例如， 可溶性雷帕黴素魅物（例如，㈣帕黴素衍生物，例如 200902064 CCI_779); COX2抑制劑，例如，塞來昔布及其變異體；以 及磷脂酶抑制劑’例如細胞磷脂酶2 (cPLA2)之抑制劑， 例如三氟甲基丙鲖類似物。可被與一 IL_丨7F/IL_丨7A訊息傳 遞拮抗劑結合之額外治療劑的例子包括下列之一或多個： 5 6-硫醇σ票吟(6-MP);硫峻嗓。令（azathioprine)、柳氛石黃 0比口定（sulphasalazine);美沙拉秦(mesalazine);奥沙拉秦 (olsalazine );氣化奎寧（chloroquine ) / 經氣啥 (hydroxychloroquine ) (PLAQUENIL®);青黴胺 (penicillamine );奥絡西那雷（aurothiornalate )(肌肉内 10 及經口的）；硫唑嘌呤（azathioprine);秋水仙素（colchicine); /5 -2腎上腺素受體激動劑（沙丁胺醇(saibutamol)、特布他林 (terbutaline)、沙美特羅（salmeterol));黃嘌呤(xanthines)(茶 驗（theophylline)、氨茶驗（aminophylline));色甘酸納 (cromoglycate );奈多羅米（nedocromil );酮替芬 15 (ketotifen);異丙托（ipratropium)以及氧托銨（oxitr〇pium); 黴酚酸酯（mycophenolate mofetil);腺核苷激動劑；抗血 栓劑；補體抑制劑；以及腎上腺素劑。 被揭露於此之IL-17F/IL-17 A訊息傳遞拮抗劑與其它治 療劑組合以治療或預防IL-17F/IL-17A訊息傳遞相關之特定 20 疾病的用途被進一步詳盡討論於下。 非限制性的用於治療或預防關節疾病（例如，風濕性關 節炎、發炎性關節炎、風濕性關節炎、幼年性風濕性關節 炎、骨關節炎以及牛皮癬關節炎)之可被與IL_17F/IL_nA訊 息傳遞拮抗劑結合使用的藥劑包括下列之—或多個：如在 87 200902064 此敘述之IL-12拮抗劑；NSAIDs; CSAIDs; TNFs，例如，如 在此所敘述之TNFa拮抗劑；如在此所敘述之非耗盡抗_CD4 抗體；如在此所敘述之IL-2拮抗劑；抗發炎細胞介素，例 如，IL-4、IL-10、IL- 13以及TGFa，或其激動劑；如在此 5 所敘述之IL-1或IL-1受體拮抗劑；如在此所敘述之鱗酸二 酯酶抑制劑；如在此所敘述之Cox-2抑制劑；伊洛前列素 (iloprost);滅殺除癌錠；沙利竇邁（thalidomide)及沙利 竇邁相關藥物(例如’ Celgen);來氟米特；胞漿素原活化抑 制劑，例如，氨曱環酸;細胞介素抑制劑，例如，Τ_614·前 10 列腺素Ε1;硫唑嘌呤；白介素-1轉變酵素（ICE)之抑制劑； zap-70及/或lck抑制劑（酪氨酸激酶zap_70或lck之抑制劑 如在此所敘述之血管内皮細胞生長因子或血管内皮細胞生 長因子受體之抑制劑；皮質類固醇抗發炎藥物（例如， SB203580); TNF-轉化酶抑制劑；IL-11; IL-13; IL-17抑制劑； 15 金；青黴胺；氣化奎寧（chloroquine);經氣喹；氣芥笨丁酸 (chlorambucil);環磷醯胺;環孢素；全淋巴照射；抗胸腺細 胞球蛋白；CD5-毒素；經口被投予之胜肽及膠原；氯苯扎 利二鈉（lobenzarit disodium );細胞介素調控劑（CRAs) HP228 及HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1 20 反義硫代璃酸寡脫氧核_酸（phosphorothioate oligodeoxynucleotides) (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.);可溶解補體受體i (ΤΡΙΟ; T Cell Sciences, Inc.);普賴 松（prednisone);奥古蛋白（org0tein);多磷發葡糖胺聚 膽（glycosaminoglycan polysulphate );美諾四環素 200902064 (minocycline) (MINOCIN®);抗-IL2R抗體；海洋及植物 脂質（魚及植物種子脂肪酸)；金諾芬（auranofin) ; 丁二苯 口比唾二酮（phenylbutazone );甲氯芬那酸（meclofenamic acid);氟芬那酸（flufenamicacid);靜脈内免疫球蛋白；齊 5 留通（zileuton);黴酚酸（mycophenolic acid) (RS-61443); 他克莫司（FK-506);西羅莫司（雷帕黴素）；氨普立糖 (amiprilose)(鹽酸氨普立糖（therafectin));克拉曲濱 (cladribine ) (2-chlorodeoxyadenosine);以及阿扎立平 (azaribine)。較佳之組合包括一或多個IL-17F/IL-17A訊 10 息傳遞拮抗劑與滅殺除癌錠或來氟米特之組合，且於中等 或嚴重的風濕性關節炎個案中與環孢素之組合。
較佳之使用於與IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑組合以 治療關節炎疾病之抑制劑的例子包括TNF拮抗劑（例如，嵌 合的、經人類化的、人類或試管中所產生之抗體，或其抗 15 原結合片段，其結合至TNF; TNF受體的可溶性片段，例 如p55或p75人類TNF受體或衍生物，例如，75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF 受體-IgG融合蛋白，ENBREL™)，p55 kD TNF 受體-IgG融合蛋白；TNF酵素拮抗劑，例如，TNFa轉變酵素 (TACE)抑制劑）；IL-12、IL-15、IL-18、IL-22之拮抗劑；T 細 2〇 胞以及B細胞-耗盡劑（例如，抗-CD4或抗-CD22抗體）;小分
子抑制劑，例如，滅殺除癌錠及來氟米特；西羅莫司（雷帕 黴素）及其類似物，例如，CCI-779; COX-2及CPLA2抑制劑； NSAIDs; p38抑制劑，TPL-2, Mk-2 以及NFkB抑制劑;RAGE 或可溶性RAGE; P-選凝素（selectin)或PSGL-1抑制劑（例 200902064 如，小分子抑制劑，對其之抗體，例如，針對p-選凝素之 抗體);動情素受體召（ERB)激動劑或erb_NFkB拮抗劑。最 佳之可被與一或多個IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑共同調 配或共同投予之額外治療劑包括一或多個：TNF受體之可 5溶性片段，諸如，p55或p75人類TNF受體或其衍生物，例 如 ’ 75 kd TNFR-IgG (75 kD TNF 受體-IgG融合蛋白， enbrel™);滅殺除癌錠、來氟米特或西羅莫司（雷帕黴素） 或其類似物，例如CCI-779。 IL-17F/IL-17 A訊息傳遞拮抗劑可與之結合用於治療或 10 預防多發硬化症之藥劑的非限制性例子包括下列： 干擾素’例如干擾素-a la (例如，Αν〇ΝΕχτΜ; Bi〇gen) 以及干擾素-lb (BETASERONtm chiron/Berlex);共聚物 1 (Cop-1; COPAXONE™ Teva Pharmaceutical Industries, Inc·); 高比例氧氣；靜脈内免疫球蛋白；克拉曲濱；如在此所敘 15述之TNF拮抗劑；皮質類固醇;去氫皮質醇；甲基去氳皮質醇； 硫唑嘌呤;環磷醯胺;環孢素;環孢素A，滅殺除癌錠；4-胺基 0比0定；以及替扎尼定（tizanidine )。可被使用於與 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑組合的額外之拮抗劑包括其 它人類細胞介素或生長因子之抗體或拮抗劑，例如，TNF、 20 LT ' JL-l、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-16、 IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF及PDGF。如在此所敘述 之IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑可與細胞表面之分子或其 配位體的抗體組合，該細胞表面分子係諸如CD2、CD3、 CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、 90 200902064 CD80、CD86、CD9G。The IL-m/IL-HA訊息傳遞拮抗劑 亦可被與藥劑’諸如滅殺除癌錠、環孢素、FK、雷帕徽 素、黴酚酸酯、來氟米特、NSAIDs，例如，伊布洛芬，皮 質類固醇，諸如去氫皮質醇，磷酸二酯酶抑制劑、腺核苷 5 酸激動劑、抗血栓劑 '補體抑制劑、腎上腺素性劑、如在 此所敘述之藉由促發炎反應細胞介素干擾訊息傳遞之藥 劑、IL-Ib轉變酵素抑制劑（e_g·, Vx74〇)、抗_p7s、pSGL、 TACE抑制劑、T-細胞訊息傳遞抑制劑，諸如激酶抑制劑、 金屬蛋白酶（metalloproteinase)抑制劑、柳氮磺吡啶、阿 10 沙絡平（azathloprine)、6-硫醇嘌呤、血管加壓素轉變酵 素抑制劑、可溶性細胞介素受體及其衍生物，如在此所敘 述以及抗發炎細胞介素（e.g· IL-4、IL- 10、IL-13及TGF)。 用於多發性硬化症之IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑可 與之結合的治療劑之較佳實施例包括干擾素_β，例如 15 IFNP-la 及ΙΡΝβ-lb;可舒鬆（Copaxone)、皮質類固醇、IL-I 抑制劑、TNF抑制劑、CD40及CD80,配位體之抗體，IL_12 拮抗劑。 非限制性的用於治療或預防發炎性腸病（例如，克隆氏 症、潰瘍性大腸炎）之IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑可與 20 之組合的藥劑包括下列：布地奈德（budenoside);表面生 長因子；皮質類固醇；環孢素；柳氮磺吡啶；胺柳酸醋 (aminosalicylates) ; 6-硫醇嘌呤；硫唑嘌呤（azathi〇prine); 甲硝吐（metronidazole );脂肪加氧酶抑制劑；美沙拉嗪 (mesalamine);奥沙拉秦；巴柳氮balsalazide);抗氧化劑； 91 200902064
凝血脂素抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗^]^；!抗體；抗_几_6抗 體；抗-IL-22抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；n比啶基_ 味峻化合物；如在此所敘述之7^17拮抗劑；il_4、il_1〇、 IL-13及/或TGF0細胞介素或其激動劑（e.g·，激動劑抗體)； 5 IL_n，去氫皮質醇之葡萄膽搭酸（glucuronide)-或聚葡萄 糖-綴合如驅藥、地塞米松（dexamethasone )或布地奈德 (budesonide) ;ICAM-1反義硫代磷酸寡脫氧核苷酸(ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals，Inc.);可溶性補體受體1 (ΤΡΙΟ; T Cell Sciences, lnc_);緩慢釋放之馬沙拉秦（sl〇w_rdease 10 mesalazine);滅殺除癌錠；血小板活化因子之拮抗劑（paf); 環丙沙星（ciprofloxacin);以及利多卡因（iignocaine)。 非限制性的用於治療或預防皮膚之發炎性疾病或病症 (包括但不限於牛皮癬）之IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑 可與之組合的藥劑包括下列：IL-12、IL-15、IL-18以及 15 IL-22。 於一具體例中，一 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑可 與一或多個針對涉及例如移植排斥反應之調節免疫反應 的其它目標之抗體被組合使用。用於治療或或預防免疫反 應之可與IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑結合使用的藥劑 2〇 之非限制性例子包括下列：對抗其它細胞表面分子之抗 體，該細胞表面分子包括但不限於CD25 (介白素-2受 體-a)、CDlla (LFA-1)、CD54 (ICAM-1)、CD4、CD45、 CD28/CTLA4 (CD80 (B7.1)，e.g.，CTLA4 Ig -阿巴西普 (abatacept ) (ORENCIA®))、ic〇SL、ICOS 及 / 或 92 200902064 c〇86(B7.2)。於另一具體例中，一 IL-17F/IL-17A訊息傳 遞括抗劑係被與一或多個諸如環抱素A或FK506的一般 免疫抑制劑結合使用。 於本發明之另一具體例，一IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮 5 抗劑係與下調抗原表面細胞融合之方法及/或用於控制免 疫抑制作用之療法結合使用：1)下調抗原表面細胞融合之 方法以及2)用於控制免疫抑制作用之組合療法係先前技術 所熟知的（見，e.g.，Xiao et al. (2003) BioDrugs 17:103-11; f ' Kuwana (2002) Hum. Immunol. 63:1156-63; Lu et al. (2002) 10 Transplantation 73:S 19-22; Rifle et al. (2002) Transplantation 73:S1-S2; Mancini et al. (2004) Crit. Care. Nurs. Q. 27:61-64)。 於其它具體例中，IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑被使 用作為一對抗自體免疫疾病、發炎性疾病等知疫苗佐劑。 15 用於治療這些類型疾病之佐劑的組合係適合使用於一具有 來自涉及自體免疫之標靶自我抗原，亦即自體抗原，的廣 V 泛變化之抗原，例如’髓鞘鹼性蛋白；發炎性自體抗原， ' 例如類澱粉胜肽抗原，或移植抗原，例如異體抗原。 - 該抗原可包括衍生自蛋白質之胜肽或多肽，以及任何 20 下列之片段：醣類、蛋白質、多核苷酸或寡核苷酸、自體 抗原、類澱粉胜肽抗原移植抗原、過敏原化其它巨分子化 合物。於一些例子中，多餘一個抗原被包含於該抗原組成 物中。 例如，所欲之於一脊椎動物宿主中用於調節對於過敏 93 200902064 原之反應的含本發明之佐劑組合物 之疫苗係包括含有一過 敏原或其片段的那些疫苗。這些過敏原 之例子被敘述於u.s.
) -脊椎動物宿主中預防或治療由類㈣歧所特徵化之疾 病的含本發明佐劑組合物之疫苗包括那些含類殿粉胜狀蛋 10自（APP)之部份。此疾病係亦指各種各樣地阿茲雜症、搬 粉樣變性病或澱粉樣血管病。因此，本發明之疫苗包括， 例如’本發明之佐劑組合物加上Αβ胜肽，以及Αβ胜肽之片 段及Αβ胜肽之抗體或其片段。 據此’本發明之另一方面係關於用於進行 15 IL-17F/IL-17Α sfl息傳遞拮抗劑與其它治療化合物之投藥的 套組。於一具體例中，該套組包括一或多個調配於藥學載 劑中之黏合劑以及當適當時具至少一例如治療劑之藥劑於 一或多個分開的藥學製備物中。 此申請暗中被引用的所有參考資料、專利及專利申請 20 的全部内容特此被併入本案作為參考。 實施例 下列實施例提供本發明之作例證的具體例且不以任何 方式限制本發明。熟習此藝者將會認知到許多其它被包含 於本發明之範圍中的具體例。 94 200902064 該等實施例不包括習見方法詳盡的敘述，這樣的方法 被使用於載體之建構、將編碼多肽之基因插入這樣的載體 或質體、將這樣栽體及質體導入宿主細胞，從這樣的載體 及質體於宿主細胞中表現多肽。這樣的方法係熟習此藝者 5 已熟知的。 實施例1:新穎之異型二聚體的人類細胞介素 IL-17F/IL-17就其功能性活性而言係需要人類之異型二聚 體複合物IL-17R及IL-17RC 實施例1.1:材料及方法 10 實施例1.1_1:試劑 人類 IL-17R.FC 及 hIL-17RC.Fc 從 R&D Systems (Minneapolis, MN)被購入。人類 IL-17F、hIL-17A 及 hIL-17F/IL-17A根據從前所敘述之方法（U.S.專利申請案 No. 11/353,161; Wright et al. (2007) J. Biol. Chem. 15 282:13447-55，兩者之全部内容在此被併入作為參考）被純 化。hIL-17F、hIL-17A 及 hIL-17F/IL-17A 被生物素化 (biotinylated )使用 ® Mini-biotin-XX Protein Labeling Kit 根據製造商之實驗規程（Cat. # F-6347, Molecular Probes, 格蘭德艾蘭（Grand Island) , NY)。 2〇 實施例1·1.2:人類IL-17受體融合蛋白之複製。 全長的人類IL-17R及hIL-17RC被從未經刺激之MG63 細胞所製造之cDNA以PCR擴增。序列定序確認人類 IL-17RC之核酸序列與NCBI編號No. AY359098 (SEQ ID NO:26，其編碼705個胺基酸的蛋白質，如SEQ ID NO:27所 95 200902064 列）符合以及一人類IL-17R之核酸序列與NCBI編號No. BC011624 (SEQ ID NO:28，其編碼一具866個胺基酸之蛋白 質，如SEQIDNO:29所列）符合。該全長的複製株被次選殖 於一反轉錄病毒構造體中且亦被使用作為用於製造可溶性 5 融合蛋白質的模板。人類IL-17R之細胞外部份（SEQ ID NO:29之殘基 1-317)與一連接肽(GSGSGSG，SEQ ID NO:30) 以及人類IgGl Fc (如SEQ ID N0:31所列之核酸序列，如 SEQ ID NO:32所列之胺基酸序列nucl)被以讀框方式（in frame)融合。人類IL-17RC之細胞外部份（SEQ ID NO:27之 10 殘跡 1-452)與一連接序列(AGSGSGSG，SEQ ID NO:33)及人 類IgGl Fc被以讀框方式(in frame)融合。 實施例1.1.3: Expression of人類IL-1受體融合蛋白的 表現 蛋白質藉由HEK293細胞之暫時性轉染被表現 15 (TransIT-LTl, Mirus，麥迪森，WI)。在轉染二十四小時後， 含有DNA/脂質體混合物之培養基被移除且取代以沒有血 清之培養基。該條件培養基48小時後被採收且蛋白質產量 由西方點墨分析來評估。 實施例1.1.4:人類IL-17受體融合蛋白質之純化 20 含有人類IL-17R.FC或hIL-17RC.Fc之培養基被流通過 一蛋白質A管柱上(Amersham，Piscataway，NJ)。該管柱被 以PBS洗滌且該融合蛋白質被以20 mM檸檬酸，200 mM NaCl，pH 3，洗提。IL-17R.FC聚集物藉由使該蛋白質通過 一使用PBS pH 7.2流出緩衝液的尺寸排阻管柱（size 96 200902064 exclusion column)。該蛋白質被對PBS pH 7.2進行透析且由 SDS-PAGE、西方點墨分析以及分析式尺寸排阻管柱層析 法所特徵化。 實施例 1.1_5:人類IL-17A、IL-17F或IL-17F/IL-17A 結 5 合至人類IL-17R.FC及人類IL-17RC.FC之ELISAs。
Binding of 人類 IL-17F、hIL-17A 或 1111^17戸/11>-17八與 人類IL-17R.Fc (hIL-17R.Fc)及IL-17RC.Fc (hIL-17RC.Fc) 之結合藉由間接的三明治ELISA來測定。ELISA盤(Costar, Cambridge ΜΑ)被塗覆以10 pg/ml山羊抗-人類IgG-Fc 10 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)整夜。人類IL，17R.Fc 或hIL17-RC.Fc接著被裝入而分別為6 ng/ml及30 ng/ml歷時 3小時，接著由經生物素化的IL-17A、IL-17F或 L-17F/IL-17A連續的稀釋2小時。該盤以聚-HR鏈黴親和素 (Streptavidin) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)及TMB 15 受質(KPL Labs, Gaithersburg, MD)顯影。 實施例1.1.6: BJ包皮纖維母細胞之細胞培養 BJ人類包皮纖維母細胞（ATCC™ Cat. # CRL-2522, Bethesda, MD)被維持於DME + 10% FCS，2 mM麵酸胺酸，1 mM丙晒酸納（sodium pyruvate)，0.1 mM MEM非必要胺基 20 酸，100 U/ml配尼西林以及100 pg/ml鏈黴素。. 實施例1.1.7:用於測量IL-17F/IL-17A生物活性之細 胞為基礎的分析
使用胰蛋白酶/ EDTA使B J細胞從培養長頸瓶釋出且被 種5xl03細胞/孔於96-孔微定量盤中，其中hIL-17A、hIL-17F 97 200902064 或hIL-17F/IL-17A已經被以預稀釋於具有或不具有可溶性 受體培養培養基中。於細胞表面受體之抗體被使用的治療 中，細胞被種於在細胞介素被加入前含有抗體之孔中。 細胞被培養於37°C歷時16-24小時，且接著上清液被移 5 除以及藉由ELISA對於GRO-α分析（相配的抗體對 (MAB275 用於捕捉，BAF275 用於偵測），R&D Systems, Minneapolis, MN)。 實施例1.1_8:人類IL.17R.Fc及人類IL-17RC.FC過量 表現於HEK293細胞 10 HEK293細胞被轉導以過量表現人類il-17R.Fc (hIL-17R_Fc)或人類 IL-17RC.Fc (hIL-17RC.Fc)，其係使用產 生自暫時轉染之293 VSV-G細胞的反轉錄病毒的上清液。簡 言之’平覆於10 mm培養盤之293 VSV-G細胞經6 pg之含有 反轉錄質體質體使用 9 μΐ FUGENE® 6(Roche, Indianapolis, 15 別)根據製造商之指示進行轉染。在37°C培養24小時後，轉 染培養基被移除且以6 ml無藥物培養基取代並將培養盤 培養於32°C中。病毒上清液在48小時被收集且接著間隔 14-24小時歷時3天。在收集後上清液於_8〇<^中被立即冷 凍。被轉導前ΗΕΚ293細胞被平覆於6孔培養盤中一天。該 20 培養培養基被抽吸且以2 ml最近融解的含ό pg/ml凝聚胺 (polybrene)反轉錄病毒上清液取代。該盤被以73〇xg， 32°C離心1小時且接著回到37°C培養器中。6小時後，3 ml 之培養培養基被加入各孔中之病毒上清液中。經轉導細胞 接下來之日被擴充於較大的培養盤中。 98 200902064 實施例1·1.9: siRNA轉染 BJ纖維母細胞在轉導一天前以104細胞/孔被種於96_ 孔盤中之培養培養基中。BJ細胞被以DHARMAFECT®#1 轉染試劑根據製造商之指示（Cat. # T-2001-03, Dharmacon， 5 Lafayette, CO)進行轉染。經 ορτί-ΜΕΜ® 稀釋為 10 μΐ (Invitrogen，Carlsbad, CA)且於室溫中被預培養的20 ηΜ siRNA 混合物被與 0.3 μΐ DHARMAFECT® #1 加入 9.7μ1 ΟΡΤΙ-ΜΕΜ®之混合物合併，混合均勻且於室溫培養2〇 min; 20 μΐ之轉染混合物接著被加至每孔含有80 μΐ之培養 10 培養基之細胞。24小時後，該轉染培養基被移除且以含有 各種濃度之hIL-17F、hIL-17Α或hIL-17F/IL-17Α的培養培養 基取代。上清液在16個小時時被收集且該等細胞被以PBS 洗滌一次並且經由ELISA (相配之抗體對，R&D Systems) 針對GRO-α分析。 15 實施例1.1.10: siRNA-所媒介之標的mRNA的分解之定 量 TURBOCAPTURE® mRNA kit (Qiagen)根據製造者之 指示被使用來分離來自BJ纖維母細胞之mRNA---步驟 的Eurogentec RTqPCR masterMix Plus, TAQMAN® 實驗規 20 程被使用其中每個試樣10 μΐ之mRNA被使用於25 μΐ TAQMAN® PCR反應中，該反應於ABI Prism 7700 DNA Sequence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA)上 進行。用於TAQMAN® PCR之條件係如下：於48°C 30分 鐘，於95°C 10分鐘，接著40個為各95°C 15秒且60°C 1分 99 200902064 鐘的循環’於MicroAmp Optical 96-孔盤上，覆蓋以 MicroAmp Optical之蓋子。各個盤針對各反應混合物含有三 份試驗cDNA模板以及無模板之對照組。各小鼠基因之表 現被標準化成人類々2-微球蛋白基因表現。用於IL-17R 5 (Hs00234888—ml)及 IL-17RC (Hs00262062_ml)之 TAQMAN®基因表現分析探針-引子組從Applied Biosystems 被取得。
實施例1.1.11: siRNA轉染效率之西方點墨分析 用於西方點墨分析，1 ·2χ104 HEK293細胞且被種於 10 96-孔盤中係使用實施例1_1·9·中所述之方法而被以IL-17R 或IL-17RC質體轉染。轉染48小時後，細胞被以PBS洗滌一 次且於冰上使用M-PER哺乳類蛋白質萃取試劑（Cat# 78501，Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL)被溶解。在 萃取後，蛋白質被裝於SDS-PAGE膠體上且轉移至尼龍膜 15 上。該等膜被以含0.1% Tween20之5%於PBS之脫脂牛奶封 阻(blocked) 30分鐘。IL-17R或IL-17RC抗體以 1:4000被加至 該膜用以培養整夜(抗-人類IL-17R抗體，Cat. # AF177，抗-人類 IL-17RC 抗體，Cat. # AF2269, R&D Systems, Minneapolis, MN)。該等膜被以具0.1 % Tween 20之PBS 洗 20 滌10分鐘三次。以1:2000之驢抗-山羊IgG-HRP (Cat. # SC-2020, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA)培養1 小時後，使用 WESTERN LIGHTING® Western Blot Chemiluminescence Reagent Plus (Cat. #NEL103001EA，Perkin-Elmer，Wellesley, MA)使該蛋 100 200902064 白質顯現。 實施例 1.1.12: IL-17F、IL-17A 或 IL-17F/IL-17A 與 IL-17R或IL-17RC受體結合之結合動力學
Biacore 2000儀器（Biacore，Piscataway, NJ)被使用於動 5 力學的測量。含有經純化hIL-17R.Fc或hIL-17RC.Fc之感應 晶片表面（Wyeth, Cambridge, MA)根據製造者之建議 (Biacore)使用胺偶合作用被製備。簡言之，該感應晶片表 面藉由注射一N-乙基-N-(2-二甲胺丙）碳二醯亞胺鹽酸鹽及 N-經基丁二醯亞胺（NHS-EDC) (Biacore)之混合物於各流 10 量槽（flow cell)上而被首次活化。5 pg/ml之hIL-17R.Fc或 hIL-17RC.Fc於10 mM醋酸鈉以pH 4.5被注射於分開之流量 槽上，具有所欲之1000至2000 RU的標的水準。剩餘活性位 置藉由1 Μ乙醇胺HC1被封阻。一參照表面以注射NHS-EDC 並接著藉由1 Μ乙醇胺HC1而被製備。全部實驗於22°C被 15 進行且數據收集率係10 Hz。人類IL-17F、hIL-17A或 WL-17F/IL-17A異型二聚體被各稀釋於HBST緩衝劑（10 mM Hepes具有 0.15 M NaC卜 3.4 mM EDTA、以及0.005% 表 面活性劑P20)以400 nM之初始濃度且於相同緩衝劑中連續 地被稀釋為 100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、 20 3.12 nM及1.56 nM。試樣以50 μί/分鐘被注射三份於各感 測器表面以允許3-分鐘結合接續以10-分鐘分離。該表面於 各分離結束被再生，其係以30-秒注射1.83 M MgC12, 0.46 M KSCN，0.92 Μ尿素以及1.83 Μ胍-HC1之30%溶液且接 續著連續不斷的15-秒HBST注射。試樣被測試至少二次以 101 200902064 從多於一經固定的感測器表面獲得結果。數據被雙重參照 如同 Myszka ((1999) J. Mol. Recognit. 12:249-84)中所述以 使用 Scrubber2 software (BioLogic Software v2.0a，Campbell， Australia)改善數據品質。所得到之動力學數據係符合使用 5 Biacore evaluation software version 3·2.的 1:1 結合模式。 實施例1.2:結果
實施例1·2·1:人類IL-17F/IL-17A結合至人類IL-17R.FC
及人類IL-17RC.FC hIL-17F、ML-17A 或 WL-17F/IL-17A與 hIL-17R.Fc及 / 10 或hIL-17RC.Fc之結合可藉由間接之三明治ELISA而被估 算。全部三個細胞介素結合至hIL-17RC.Fc以大約相同 18-25 ng/ml的EC50 (第1B圖）。然而，三細胞介素之EC50對 於結合至hIL-17R.Fc係不同的。最緊固的結合發生於具有25 ng/ml之EC50的hIL-17A及hIL-17R.Fc間。人類IL-17F微弱地 15 結合至 hIL-17R.Fc 而具大於 2000ng/ml 之 EC50。 111[-17?/11^-17入異型二聚體具有一個3〇〇1^/1111之£(：50，其 係較hIL-17A之結合弱1〇倍但係較hlL-17F之結合緊固約1〇 倍（第1A圖）。 實施例1.2.2:人類IL-17F/IL-17A與人類IL-17R.Fc及人 20 類IL-17RC.FC之結合動力學 人類IL-17F、ML-17A及hIL-17F/IL-17A與hIL-17R.Fc 及hIL-17RC.Fc受體兩者之結合動力學係被比較。結合及分 離率系數藉由即時表面電黎_子共振使用Biacore被直接測 量’如同實施例1.1.12.所述。經計算之分離常數被顯示於 102 200902064 表3中。人類IL-17A呈現與hIL-17R.Fc最緊固的結合，其具 有約2 nM之KD。相反地，hIL-17F相對地微弱地與 hIL-17R.Fc結合，其具有約174 nM之KD。有趣地， hIL-17F/IL-17A異塑二聚體具有對於hIL-17R.Fc為約26 nM 5 之KD數值，亦即，介於對於hIL-17A及hIL-17F之中間。這 些配位體，hIL-17F、hIL-17A及hIL-17F/IL-17A，各結合至 hIL-17RC.Fc具有相似之斷斷續續的比率且因此亦具有約 11-20 nM之KD數值。 f 表3·人類IL-17A、人類IL-17F或人類IL-17F/IL-17A 結 10 合至IL-17RA.FC及人類IL-17RC.FC的動力學分離常數 經注射 之分析物 經固定 之配位體 Kon (1/M s) Koff (1/s) KD (M) IL-17A IL-17RC.FC 8.92 ± 0.39 χ 104 1.79 ± 0.08 χ Hr3 2.01 ± 0.18 χ 10·8 IL-17F [L-17RC.FC 1.28 ± 0.07 x 105 2.12 ± 0.20 χ 10-3 1.66 士 0.06 χ HT8 [L-17F/A [L-17RC.Fc 1.44 ± 0.15 χ 105 1.51 ± 0.16 χ ΗΓ3 1.06 ± 0.22 χ ΙΟ·8 IL-17A IL-17R.FC 1.39 ± 0_15 χ 105 2.94 ± 0.70 χ 10·4 2.15 士 0.73 χ 1〇.9 IL-17F IL-17R.FC 9.43 ± 0.38 χ 103 1.64 ± 0.10 χ ΚΓ3 1.74 ± 0.07 χ 10—7 IL-17F/A IL-17R.FC 4.28 ± 1.46 χ 104 1.03 ± 0.01 χ 1〇_3 2.55 ± 0.83 χ HT8 實施例1.2.3:人類11^-17?/11^-17八之生物活性 hIL-17F/IL-17A之生物活性使用一細胞為基礎之分析 被估算。來自以hIL-17F、hIL-17A或hIL-17FML-17A異型二 聚體所培養之BJ細胞的條件培養基之ELISA分析顯示全部 三個細胞介素於BJ細胞中誘導GRO-α分泌以及hIL-17F相 較於WL-17A較無功效。hIL-17F/IL-17A異型二聚體被發現 相較於hIL-17F但不是hIL-17A係較有功效之使BJ細胞製造 GRO-a的誘導物（第2圖）。當不是BJ細胞之其他細胞株被 103 200902064 使用時，相似的結果被獲得（數據沒有展示）。 實施例1.2.4:人類IL-17R.FC及人類IL-17RC.Fc在人類 IL-17F/IL-17A生物活性上的功效 為了評估是否所觀察到之hIL-17F、hIL-17A及 5 hIL-17F/IL-17A之生物活性係由於與兩個提議之受體中之 一者或兩者的交互作用，細胞介素之活性在可溶性受體, hIL-17R.Fc及hIL-17RC_Fc存在或不存在下被測量。 •如第3A圖所顯示，hIL-17A之活性在hIL-17R.Fc存在 時降低至幾乎背景值，而於此實驗中當hIL-17R.Fc受體存在 10 下在IL-17A活性上沒有顯著之功效被觀察到。以il-17R.Fc 及IL-17RC.Fc兩者一起處理不會比IL-17R_Fc單獨增加處理 IL-17A活性之抑制作用。hIL-17F之活性被阻斷當存在有 IL-17RC.FC受體，但於IL-17R_Fc受體存在下沒有被阻斷， 而IL-17R.Fc及IL-17RC.Fc兩者之添加不會增加il-17RC.Fc 15 單獨存在時之IL-17F活性的抑制性。相反地，雖然il_ 17R.pe 及IL-17RC.Fc —些對於IL-17F/IL-17 A異型二聚體之活性皆 具有抑制功效，該二可溶性受體之組合具有一加成性功 效，顯著地阻斷該異型二聚體之活性。 非專一性之人類IgG對於該三個細胞介素之任—者的 20 活性都不具功效。這些數據指出儘管可溶性IL-17R可抑制 IL-17A之活性且可溶性IL-17RC可抑制IL-17F之活性，該二 可溶性受體之組合對於在IL-17F/IL-17A異型二聚體之活性 上的顯著影響戲必須的。 實施例1.2.5:抗-IL-17R及抗-IL-17RC抗體對於人類 104 200902064 IL-17FAL-17 A之生物活性的功效 hIL-17F、hIL-17A及hIL-17F/IL-17A之活性使用以或未 以抗人類IL-17R或抗-人類IL-17R抗體預培養之BJ細胞來 被估算。如第3B所示，hIL-17細胞介素之活性被顯著地降 5 低當BJ細胞經抗-人類IL-17R抗體處理。然而，抗_人類 IL-17RC抗體對於hIL-17F之活性相較於對於hIL_ i 7 A及 hIL-17F/IL-17A之活性具有一較深切的功效。該等抗體中和 這些分子活性的能力係與使用該等可溶性受體所觀察到的 正好相反的。 10 實施例1·2·6:人類IL-17R及人類IL-17RC於人類 IL-17F/IL-17Α之生物活性上的功效 WL-17R 及 hIL-17RC 於 hIL-17F 、hIL-17A 或 1111^-17?/11^-17八訊息傳遞中之角色被進一步評估。田細胞經 以不同hIL-17R或hIL-17RC siRNAs轉染且接著被添加 15 hIL-17F或hIL-17A，且相對反應藉由ELISA被決定（第4 圖）。來自用以各受體之評估之對於hIL-17R (R-3及R-4)或 ί I hIL-17RC (RC-2以及RC-4)二個最佳之siRNA寡元體被選擇 ' 係基於TAQMAN®結果（第4A圖及第4B圖）且用以降低 - HEK293細胞中蛋白質之水準的能力（第4C圖）。 20 人類 IL-17F、hIL-17A及 hIL-17F/IL-17A在三個不同濃 度被加入經hIL-17R或hIL-17RC之siRNAs轉染的BJ細胞 (第 5圖）。IL-17R及IL-17RC siRNAs減少 GRO-α分泌之量 因為在三個不同濃度之ML-17F、hIL-17A及 hIL-17F/IL-17A。相較於IL-17RC siRNAs，IL-17R siRNAs 105 200902064 對於細胞介素活性具有較大之功效。此結果暗示全部三個 hIL-Π細胞介素之活性係取決hIL_17R及hIL_17RC。 實施例2:小鼠IL-17F/IL-17A異型二聚體蛋白質由小 鼠Thl7細胞所製造且誘導呼吸道嗜中性球招集 5 實施例2.1:材料及方法 實施例2.1.1:抗體及試劑 抗-小鼠 IL-17A 抗體（Cat. # 50101，50104)從 R&D Systems 被獲得。抗-小鼠 IL-17F 抗體（RK015-01， RK016-17)、抗-小鼠IL-22抗體(Ab-ΟΙ)及相關之同型對照 10 組抗體使用先前所敘述之方法(Liang et al. (2006) supra)被 製造。小鼠IL-6、mIL-lβ、mTNF-(x及mIL-23從R&DSystems 被取得。mTGF-β及卵白蛋白（OVA)從Sigma (St. Louis, MO) 被取得。OVA323-339從New England Peptide (Gardner, ΜΑ) 被獲得。抗-IFN-Y(Cat. #XMG1.2)以及抗-IL-4 15 (Cat. # BVD4-1D11)從 BD Pharmingen (Franklin Lakes, NJ) 被取得。 實施例2.1.2: mIL-17A、mIL-17F/IL-17A及mIL-17F之 產生及純化 重組蛋白質之序列如先前被敘述之使用習見方法（Li 20 et al· (2004) Int· Immunopharmacol. 4:693-708)被建造於表 現載體中。產生於CHO細胞中的His-標記mIL-17A或His-標記 mIL-17F於Nickel NTA Superflow 管柱（Qiagen)上被純 化。該蛋白質被以250 mM咪唑洗提且進一步經凝膠過遽 (Superdex200，Amersham)純化以移除任何高分子重量之蛋 106 200902064 白質。經純化之細胞介素被以腸激酶於室溫中分解4小時。 該經分解之蛋白質被再度施用於Nickel NTA以移除腸激酶 -His-標記， 小鼠IL-17F/IL-17A異型二聚體由經相同量之編碼 5 Flag-標記mIL-17A或HPC (蛋白質C之重鏈）His-標記 mIL-17F (Lichty et al. (2005) Protein Expr. Purif. 41:98-105) 之質體暫時共轉染的HEK293細胞所製造。條件培養基72小 時後被採收且批式結合至一抗-Flag M2親和性樹脂 (Sigma)。該被結合之蛋白質（mIL-17A及mIL-17F/IL-17A) 10 被以200 pg/ml之Flag胜肽（Sigma)洗提。小鼠 IL-17F/IL-17A接著藉由批式結合至抗-蛋白質C親和性基質 (Roche)從mIL-17A被純化。小鼠IL-17F/IL-17經5 mM EDTA 洗提，經？68〇117.2)透析且接著經由308-?八0丑膠、西方 點墨分析 '質譜測定法、分析型尺寸排阻層析法特徵化。 15 所得到之mIL-17F/IL-17A異型二聚體系大於99°/。純的，如 同銀染所分析。所有重組蛋白質之内毒素水準係少於 3 EU/mg。 用於西方點墨分析，35 ng之IL-17A、IL-17F/IL-17A， 或IL-17F被載入。小鼠IL-17A經由以山羊抗-小鼠IL-17A 20 (AF421NA，1:2000稀釋，R&D Systems)並接以驢抗-山羊 HRP (Jackson Immunoresearch，West Grove, PA)來探查而被 偵測。 IL-17F經由使用來自大鼠血清（1:2000稀釋)被偵測，事 先以對於IL-17F反應抗體之測試係陽性之小鼠IL-17F引發 107 200902064 免疫，接著以山羊抗大鼠-HRP(Pierce Biotechnology)偵測。 實施例2.1.3:於試管中之T細胞活化 CD4+CD62L+天真DOll T細胞從D011.1 0小鼠之脾臟 藉由使用如先前所敘述的MACs正向及負向篩選（positive 5 and negative selection) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)被純 化。2xl05 DOll T細胞被經照射之4xl06脾細胞以及lpg/ml OVA323-339活化。細胞介素在下列濃度下被添加：1 ng/ml mTGF-β、20 ng/ml mIL-6、10 ng/ml mIL-1、10 ng/ml mTNF-α及10 ng/ml mIL-23。用於再刺激，細胞於初次活化 10 之第7天被採收，靜置過夜且以經照射脾細胞、lpg/ml OVA323-339，5 ng/ml mIL-2且於一些例子中以 10 ng/ml mIL-23、10 pg/m之抗-IFN-γ以及 10 pg/ml 抗-IL-4再刺激。 條件培養基於初次或第二次刺激的第4天被採收。細胞内細 胞介素染色被進行藉由以50 ng/ml PMA(Sigma)、1 μδ/ηι1 15 離子黴素（ionomycin ) (Sigma)以及 GOLGIPLUG®(BD Pharmingen)歷時5小時。細胞被表面染色且根據製造者之指 示（BD Pharmingen)使用 CYTOFIX/CYTOPERM® 使細胞被 穿透。 細胞内細胞介素染色被進行藉由使用抗-IL-17A PE 20 (TCll-18H10)及抗-IL-17FAlexa 647 (RK015-01)。所有淋 巴細胞被培養於補充以10% FBS，2 mM L-鞑醯胺酸、5 mM HEPES、100U/ml Pen-Strep 以及 2·5μΜβ-硫醇乙醇之 RPMI1640 。 實施例 2.1.4: ELISAs 108 200902064 為定量mIL-17A同型二聚體，培養盤被塗覆以2pg/ml 之1-11^-17八（€&1#50101)整夜。在該等盤以1%於？68中之 BSA封阻後，試樣在室溫於該等盤中被培養2小時。相同抗 -IL-17A抗體之經生物素化變體接著以lpg/ml被使用用以專 5 —性地偵測與盤連接之mIL-17A。為了定量IL-17F同型二聚 體，ELISAs被進行，其係採用一相似的流程使用抗-IL-17F (RK016-17)作為捕捉(2pg/ml)及偵測試劑（lpg/ml)兩者。該 mIL-17A&mIL-17F ELISAs的 <貞測極限分別係 1 ng/ml及4 ng/ml。mIL-17F/IL-17A異型二聚體ELISA被進行，其係使 10 用抗-IL-17A (Cat. # 50101，2pg/ml)作為捕捉抗體以及經生 物素化山羊抗-IL17F多株抗體(Cat. #BAF2057，200 ng/ml， R&D Systems)作為偵測試劑。該mIL-17F/IL-17A異型二聚 體ELISA之偵測極限係40 pg/ml。為了定量於T細胞條件培 養基中這些分子之表現，適用以決定mIL-17F/IL-17A異型 15 二聚體量之適當的稀釋係被首先進行因為此ELISA係靈敏 度最高的。使用適當ELISA之mIL-17A及mIL-17F接著被定 量。 為了要校正mIL-17F/IL-17A於各同型二聚體ELISA上 可能的貢獻，從ELISA所獲得之各個試樣的miL-17F/IL-17A 2〇 異型二聚體之量被使用以根據重組mIL-17F/IL-17A於同型 二聚體ELIS As上之滴法定來回算由mlL-17F/IL-17 A所貢 獻之0_D_之量。此來自各式樣在同型二聚體ELISAs上所獲 得之實際O.D.值之IL-17F/IL-17A O.D.貢獻被減去在計算 同型二聚體存在量之前。IL-22 ELISA被進行如先前所描述 109 200902064 (Liang et al. (2006) J. Exp. Med. 203:2271-79)。CXCL1 及 CXCL5使用DuoSet ELISAs依據製造者之指示（R&D Systems)被定量。 實施例2.1.5: MLE-12細胞之處理 5 2.5xl04個MLE-12細胞（ATCC Cat. # CRL-2110)於一96 孔盤中經細胞介素處理或以細胞介素及抗體兩者之組合物 預培養24小時。經合併之培養基在24小時被採收。MLE細 胞被培育於HITES、2% FBS及2 mML-麩醯胺酸中。 實施例2.1.6:動物實驗 10 BALB/cByJ 及 C.Cg-Tg(D011.10)10Dlo/J (D011)小鼠 從 Jackson Laboratories (Bar Harbor，ME)被取得。來自 DO 11 小鼠之CD4+CD62L+T細胞於TGF-yS、IL-6、IL-1 召、TNF-α 及IL-23存在下5天被分化成如實施例2.1.3中所述之1^17細 胞。為了建立Thl7-所媒介發炎反應，2.5xl06 Thl7細胞被 15 靜脈内地轉移至天真BALB/c接受小鼠（第0天）中。小鼠 被靜放24小時接著經75pg之OVA鼻内地每日挑戰 (challenged)連續3日（第卜2及3天）。對照主小鼠接受Thl7 細胞及鼻内PBS或僅鼻内OVA及沒有細胞。為了研究抗體， 300吨之抗體在第1天首次〇VA挑戰之前1小時被注射i.p.。 20 於以〇VA在第1、2及3天各鼻内挑戰前1小時，抗體（10(Vg) 亦被鼻内地投予。在最後之挑戰的24小時後，該小鼠被犧 牲且該支氣管肺泡灌洗術(BAL)被進行，其係使用以PBS三 次0.7 ml洗滌。該三次灌洗中之第一次被保留來用於細胞激 素分析’在細胞藉由離心法被恢復之後。為了決定總細胞 110 200902064 數量，來自全部三次灌洗的細胞被合併且使用CellDyn血液 分析儀(Abbott Diagnostic，Abbott Park, IL)被計數。分化細 胞分析藉由計數經Hema-3染色劑染色之微量玻片。每個玻 片有200個細胞被計數。沒有經過BAL之來自小鼠的肺被固 5 定於10%天然經緩衝的福馬林中供組織學分析。用於鼻内 研究，BALB/cByJ小鼠被以1.5pg之重組小鼠IL-17A、 mIL-17F、mlL-HF^/IL-n或 mIL-22於75μ1中鼻内地挑戰一 次或每天一次連續三天。挑戰後24小時，BAL液被採用且 如上所述被分析。全部小鼠係藉於8-12週大當被使用且嚴 10 格的根據Wyeth Research IACUC規則被養。 實施例2.1.7:數據分析 全部統計上有意義數值由一單方史都華檢定法 (unpaired Student’s T-test)所決定。 實施例2.2:結果 15 實施例2.2.1:小鼠扎-17入及小鼠化-17戸由小鼠1'1117細 胞共同表現 來自天真T細胞之Thl7分化作用主要地由TGF-β及IL-6 之組合所起始，雖然其他促發炎細胞介素，諸如TNF-α及 L-Ιβ，可進一步升高該反應(Veldhoen et al. (2006) supra; 20 Bettelli et al. (2006) supra; Mangan et al. (2006) supra)。雖然 這些研究已經確切地顯示IL-17A蛋白質之表現以此方式被 調控，但還沒有被報告的係是否IL-17F蛋白質之表現係相 似地被調控。為了檢測IL-17F表現之調控，由DO11.10 (DO 11)小鼠所純化之天真（CD4+CD62L+) T細胞被活化經 111 200902064 由經照射脾細胞，OVA323-339，且許多用於IL-17F之細胞 介素及細胞内細胞介素染色被進行。與IL-17A相似，大量 的IL-17F表現被彳貞測隨著TGF-β及IL-6兩者之添加（第6A 圖）。mIL-17A及mIL-17F於Thl7分化期間的相對表現在活 5 化後數個時間點被分析。大體上，mIL-17F之表現一貫地多 於mIL-17A，隨著二細胞介素之表現在第3天後降低（第6B 圖）。IL-17A+IL-17F+細胞代表一大部分之TM7細胞，其在 第2天具有mIL-17A與mIL-17F高度共同表現（88%之 IL-17A+細胞亦表現mIL-17F)。於第3天（65%)及第4天減少 10 之共同表現可能與mIL-17A及mIL-17F表現整體降低有 關。這些數據證明IL-17F蛋白質由TGF-β及IL-6之組合所誘 導。再者’ IL-17A+IL-17F+細胞代表Thl7細胞相當大的族 群。 實施例2.2.2:小鼠11117細胞製造由小鼠11^17八及 15 小鼠IL-17F所組成之異型二聚體蛋白質 人類IL-17F以及據推測hIL-17A存在為一由一保守性 半胱胺酸雙硫鍵所抓在一起的同型二聚體(Hymowitz et al. (2001) supra; Wright et al. (2007) supra)。這些半胱胺酸於 mIL-17F及mIL-17A中之保守性位置以及由小鼠Th 17細胞 20 共同表現之mIL-ΠΑ及mIL-17F暗示mIL-17A及mIL-17F亦 可形成一異型二聚體。為了探測這個可能性，重組鼠 mIL-17F/IL-17A異型二聚體由於HEK293細胞中過量表現 具鑑別性之經標記之mIL-17A及mIL-17F變體來被產生。推 測地mIL-17F/IL-17A蛋白質之純化係經由使用蛋白質標籤 112 200902064 之一連串的純化來被達成。於非還原凝膠上之西方點墨分 析顯示此經純化之雙標記蛋白質含有mlL-17A及mIL-17F 兩者之抗原決定區於相同的條紋中（第7A圖）。該等有區別 的條紋代表具鑑別性之經醣化的種類(數據沒有被呈現）。這 5 些數據證明mIL-17F/IL-17A異型二聚體之形成當該等 mIL-ΠΑ及mIL-17F基因於試管中被過量表現。 為了測試是否mIL-17F/IL-17A異型二聚體係由小鼠T 細胞所製造，用以定量mIL-17A、mIL-17F及mIL-17F/IL-17A 之ELISAs首先被建立。為了特定地定量同型二聚體，相同 10 單株抗體於一三明治E LIS A中被使用作為補抓及偵測試劑 兩者。此形式使得成功的三明治僅因同型二聚體或更高的 多聚體而被形成。為了定量mIL-17F/IL-17A異型二聚體， 一使用mIL-ΠΑ專一性抗體作為補抓試劑以及與一 mIL-17F專一性抗體作為偵測試劑之組合的三明治ELIS A 15 被進行。這些ELISAs之專一性使用經純化之重組 mIL-17A、mIL-17F/IL-17A及mIL-17F蛋白質而被證實（第 7B-7D圖）。 自然的mIL-17A、mIL-17F及mIL-17F/IL-17A 由在不同 條件下被活化之Thl7細胞所產生之量被定量。 20 天真DOll T細胞被以mTGF-β及mIL-6活化且於一些例 子中進一步被補充以mTNF-α、mIL-Ιβ、mIL-23或全部三個 細胞介素。在所有這些情況下，mIL-17F被產生最大的量， 而mIL-17F/IL-17A異型二聚體具有中度表現且mIL-17 A被 表現最低之量（第7E圖）。於經mTGF-β及mIL-6之組合活化 113 200902064 之細胞中或當這些條件被進一步補充mTNF-α或mIL-23 時，小鼠IL-17A係低於偵測之極限（1 ng/ml)(第7E圖）。 mIL-Ιβ之添加使miL-17A表現增加成9倍，mIL-17F/IL-17A 增加成5倍且mIL-17F增加成3倍。IL-23使mIL-17F/IL-17A 5 之生產提高成1.8倍且使IL-17F之生產提高成2倍。相反地， mTNF-α或IL-23添加微小地提高mIL-17F/IL-17A及 mIL-17F之表現，如果真的有的話（見，例如，第7E圖）。這 些數據證明在多種Thl7分化條件下被分化的天真τ細胞製 造不同的Thl7蛋白質，IL-17F表現最高的量，接著係 10 tL-nF/IL-nA且再來係IL-17A。為了檢測由經分化Thl7 細胞之這些蛋白質的表現，天真DOll T細胞首先於初次活 化作用經指示細胞介素中被活化7天（第7F圖）。在靜置它們 整夜後，這些細胞在mIL-2及OVA323-339存在下或以 mIL-2、OVA323-339、mIL-23以及IFN-γ及IL-4之抗體被再 15 刺激。相反於天真細胞的表現曲線，mIL-17A ' mIL-17F/IL-17A及 mIL-17F 由經 OVA323-339再刺激之經分 化Thl7細胞被製造一相當的量（第7F圖）。小鼠IL-23，連同 針對IFN-γ及IL-4之抗體提高相當多全部三個蛋白質之表 現’而mIL-17F/IL-17A被產生之量一貫地高KmiL-17A或 20 mIL_17F。這個數據證明IL-17A之表現於被分化之Thl7細胞 中被提南當相較於新被活化的天真細胞。再者， IL-17F/IL-17A異型二聚體由經IL-17-引起之條件刺激的天 真T細胞及由經分化之Thl7細胞所表現。 實施例2.2.3: IL· 17F/IL-17A異型二聚體係一具生物活 114 200902064 性的蛋白質 IL-17A及IL-17F已知係經由上皮細胞及纖維母細胞提 高細胞激素之表現，雖然使用小鼠細胞介素之直接比較還 沒有被報告。為 了檢測 mIL-17A、mIL-17F/IL-17A及 mIL-17F 5 之活性，小鼠肺上皮細胞線，MLE-12，被經這些細胞介素 處理且嗜中性球化學誘引劑，CXCL1 (KC)，之表現被檢 ' 測。小鼠IL-17A及mIL-17F兩者皆提高CXCL1之表現，雖然 mIL-17F之活性係少於mIL-17A 100-1000倍（第8A圖）。
/ mIL-17F/IL-17A異型二聚體亦提高CXCL1且係較mIL-17 A 10 具有較少能力但較mIL-17F具有較高的能力（第8A圖）。這 些數據證明mIL-17F/IL-17A係具生物活性的蛋白質。 為 了探究mIL-17A及mIL-17F於mIL-17F/IL-17A 活性 上相對的貢獻度，對於IL-17F的中和抗體被製造。兩個抗 體被辨識出，其於MLE-12細胞上以50pg/ml之抗體完全地 15 中和至多200ng/ml mIL-17F之活性（第8B圖）。這些抗 -IL-17F抗體沒有結合或中和mIL-17A且可結合至 I mIL-17F/IL-17A異型二聚體（見第12A圖及第12B圖）。 * mIL-17A-專一性抗體（50104)亦測試且判定可中和11111^17八
. 之功效（第12C圖）’且於MLE-12細胞上不可中和mIL-17F 20 (數據沒有被呈現）這些抗體在中和mIL-17F/IL-17A異型 二聚體上之功效被測定。MLE-12細胞經200 ng/ml之 mIL-17F/IL-17A異型二聚體與單株抗體之組合處理，該單 株抗體被使用以80pg/ml (超過〜100-倍莫耳）。miL-17A-單 一性抗體降低mIL-17F/IL-17A〜85%之功效當與其同型之 115 200902064 對照組(kGh)比較時（第8C圖）。相反地，mIL-17F/IL-17A 使用抗-IL-17F (RK015-01或RK016-17)之中和作用沒有或 僅稱微影響（於一些實驗中最多達2 0 %)當與其同型之對照 組(IgGl)比較時。當一IL_17F_專一性抗體被與IL_17A專一 5 性抗體組合使用時，mIL-17F/IL-17A之活性幾乎完全被中 和(〜95%)。這些數據證明雖然IL-17A-專一性抗體及IL-17F-專一性抗體之組合係完全中和IL-17F/IL-17A所需，此細胞 介素大部分中活性僅使用IL-17A-專一性抗體就可被中和。 呈現於此之數據的解釋係依據是否mIL-17F-專一性抗 10 體成功地阻斷mIL-17F/IL-17A及其受體間的交互作用。若 mIL-17F-專一性抗體係結合至mIL-17F/IL-17A，但沒有阻 斷其與受體間的交互作用，此暗示了至少一受體結合位置 在mIL-17F/IL-17A及mIL-17F間是不具保守性的。此可能係 由於在mIL-17F/IL-17A及mIL-17F之受體-結合位置中之結 15 構差異，或於mIL-17F/mIL-17A上有不同的位置存在，該位 置與一交互受體交互作用。這些可能使得受體交互作用即 使當mIL-17F-專一性抗體被結合。於此模式中，使用抗體 之組合的數據則會暗示mIL-17A-專一性抗體與 mIL-17F/IL-17A之結合會改變mIL-17F/mIL-17A受體-結合 20 位置以使得mIL-17F-專一性抗體可立即產生中性化作用。 可擇地，若mIL-17F-專一性抗體單獨可成功地阻斷 mIL-17F/mIL-17A與其受體的交互作用，則該數據表示此交 互作用不係必須的且暗示於mIL-17F/mIL-17A上之其他受 體位置的結合對於訊息傳遞係足夠的。發明人觀察到 116 200902064 mIL-17F-專一性抗體可進一步與mlL-17 A-專一性抗體組合 以進行中和。此暗示了由一mIL-17F-專一性抗體所阻斷之 受體-結合位置傳送一訊息，其相較於由mIL-17A-專一性抗 體所中合之訊息係較少能力的。 5 實施例2.2.4: Thl7細胞於呼吸到中引起嗜中性球增多
症，其係依賴IL-17A 試管中之數據證明重組mIL-17A相較於mIL-17F係較 具生物活性，而mIL-17F/IL-17A相較於mIL-17A較少活性且 相較於mIL-17F係較多活性的。為了於活體中檢測含 10 IL-17A-及IL-17F-蛋白質之相對的貢獻度，Thl7-依賴性呼 吸道發炎反應模式被建立。 來自DOll小鼠之CD4+CD62L+ T細胞經mTGFyS、 mIL-6、mIL-Ι冷、mTNF-α及mIL-23分化5天，之後細胞被 採用地轉移於一天真BALB/c宿主中。為了引發呼吸道發 15 炎，小鼠被連續地每曰經鼻内OVA挑戰連續3天。對照組小 鼠接受Th 17細胞或鼻内PBS或沒有細胞及鼻内〇VA。於 BAL流體中小鼠IL-17A及mIL-17F係低於於同型二聚體-專 一性ELISAs (數據沒有被呈現）中偵測之極限（分別係1 ng/ml及4 ng/ml)°mIL-17F/IL-17A異型二聚體之表現被偵測 20 高於偵測之水準（40 pg/ml)，且相較於對照組小鼠，於經 TM7細胞轉移以及被暴露於OVA之小鼠中的IL-17F/IL-17A 異型二聚體顯著增加6倍係被觀察到的（第9圖）。miL-22 顯著增加六倍亦被偵測到，其係最近被敘述係為由Thl7細 胞所表現的一細胞介素(Liang et al. (2006) supra; Chung et 117 200902064 al (2006) Cell Res. 16:902-07; Zheng et al. (2007) Nature 445:648-51)(第 9A圖）。mIL-17F/IL-17A及mIL-22之表現證 明Thl7細胞於呼吸道中存在且被活化。細胞性發炎反應於 此模式中接著被試驗。得到Thl7細胞及OVA之小鼠相較於 5 任一對照組小鼠之群體已顯著地於B A L流體中增加嗜中性 球及淋巴細胞之數目（第9B圖）。單核球及嗜酸性球於得到 Thl7細胞及鼻内OVA之小鼠中沒有被增加（第9B圖）。肺組 織之組織學分析亦顯示了，當相較於對照組，於經Thl7細 胞轉移及暴露於OVA之小鼠中支氣管周圍及血管周圍之發 10 炎反應係被加強的（第9C圖）。嗜中性球係該發炎反應之 重要的組成，相似於在BAL流體中所觀察到之結果。將這 些數據一起看，這些數據證明TM7細胞可引起具有招募嗜 中性球之特徵的呼吸道發炎反應。雖然Thl7細胞可引起呼 吸道嗜中性球增多症，該細胞介素特定地係這些結果的原 15 因係未知的。為了檢測這個問題，mIL-17A、mIL-17F及 mIL-22之中和抗體被投予。相較於使用相同形體(IgG2a)， 使用mIL-17A-專一性抗體(Cat. # 50104)之處理顯著地降低 嗜中性球之數目為類似於對照組小鼠的水準（第10A圖）。相 反地，mIL-17F (RK015-01 或RK016-17)或mIL-22 (Ab-01) 20 之中和抗體不會影響嗜中性球之數目（第10A圖，第13圖）。 於經對於mIL-17A、mIL-17F或mIL-22具專一性之抗體 處理的小鼠中，在淋巴細胞、嗜酸性球或單核球之數目上 沒有顯著影響的被觀察到（數據沒有被呈現）。雖然於任何處 理組中CXCL1之濃度沒有被顯著地調節（第1〇b圖）， 118 200902064 CXCL5 (LIX)，另—有能力嗜中性球化學誘引劑(Wuyts et al (1996) J. Immunol. 157:1736-43; Chandrasekar et al. (2001) Circulation 103:2296-02)被 IL-17 A-專一性抗體顯著地降低 至相似於對照組小鼠的濃度（第10C圖）。對於„111^171?或 5 mIL-22具專一性之抗體不會改變CXCL5 (第i〇c圖）。這些 數據證明IL-17A-專一性抗體單獨的投藥係足以預防Thl7 細胞所引發之嗜中性球增多症。 實施例2.2.5:小鼠IL-17F/IL-17A於試管中招募嗜中 性球 10 於在此所揭露之Thl7-依賴的呼吸道發炎反應模式 中，mIL-17A或mIL-17F於BAL流體中之表面係低於偵測 的極限。因此，mIL-ΠΑ或mIL-17F被表現於呼吸道係不會 被顯示。然而，由經分化Th 17細胞的所表現之可比較 mIL-17A、mIL-17F/IL-17A及mIL-17F暗示該異型二聚體蛋 15 白質存喽但低於偵測極限。為了直接檢測mlL-17A及 mIL-17F之功效，1.5pg之重組蛋白質被投與至呼吸道中一 次（第11A圖）或每天一次連續三天（第11B圖）。在投藥之24 小時後，於BAL流體中嗜中性球之招募以及細胞激素之製 造被檢測。人類IL-17A顯著地增加嗜中性球、CXCL1以 20 及CXCL5，當被給予一次（第11A圖）或三次（第iiB圖）。相 反地，mIL-17F沒有顯著地提高嗜中性球之數目或CXCL1 (第11八圖及第118圖）。€乂(：1^5小且顯著之增加被觀察到僅 當mIL-17F被給予三次（第11B圖）。相對於以1 5pg所觀察到 的結果，增加mIL-17F之劑量達10倍（15pg)不會提高嗜中性 119 200902064 球、cxcu或CXCL5 ’當給予—次或三次（數據沒有被呈 現）。重組mIL-22沒有造成任何可觀察之嗜中性球或細胞激 素之增加當給予一次時（第11C- 11E圖）。G-CSF、CXCL2、 MCP-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ之表現於任一這些試樣中沒 5 有被偵測到（數據沒有被呈現）。mIL-17F/IL-17A異型二聚 體與mIL-17A和mIL-17F之活性於呼吸道中被比較。一劑量 1.5pg之mIL-17F/IL-17A引發唁中性球、CXCL1&CXCLk 增加（第11C - 11E圖）。雖然嗜中性球之引發作用在miL-ΠΑ 及 mIL-17F/IL-17A (ρ=0·76)之間係相似的，CXCL1 及 10 CXCL5之表現於經mIL-17F/IL-17A處理之小鼠中係少於經 mIL-17A處理者2-3倍。這樣的發現顯示mIL-17F/IL-17A異 型二聚體係一於試管中具生物活性之分子且可以引起嗜中 性球之招募。
【圖式簡單說明J 15 第1圖顯示增加濃度（ng/ml細胞介素；X-軸）之人類 IL-17A (hIL-17A; ♦)、人類 IL-17F (WL-17F; ·)或人類 IL-17F/IL-17A (ML-17F/A; p)細胞介素與IL-17R.FC受體 (第1A圖）或IL-17RC‘Fc受體（第1B圖）之結合（O.D. 450nm; y-軸），依照經由ELISA之測定。 2〇 第2圖顯示在以增加濃度(ng/ml of細胞介素；X-軸)之 人類IL-17A (IL-17A; ♦)、人類IL-17F (IL-17F; π)或人類 IL-17F/IL-17A (IL-17F/A;〇）處理BJ細胞後來自BJ細胞之 GRO-α釋放(pg/mi GRO-α; y-軸）所代表的人類IL-17A、人類 IL-17F以及人類IL-17F/IL-17A功能（生物）活性。GRO-a釋放 120 200902064 係藉由ELISA來測定。 第3A圖及第3B圖顯示來自BJ細胞之相對的GRO-cx釋 放(相對反應(Relative Response); y-轴），其係由1 ng/ml人 類 IL-17A 、50 ng/ml 人類 IL-17F 或 5 ng/ml 人類 5 IL-17F/IL-17A細胞介素於（第3A圖）可溶性受體融合蛋白 質 hIL-17R.Fc、hIL-17RC.Fc ,或hIL-17R.Fc及hIL-17RC,Fc 之組合以及（第3B圖）抗-hIL-17R及抗-hIL-17RC抗體存在下 被引發。對照之抗體被包括於兩個實驗中。 第4A圖以及第4B圖顯示四個IL-17R siRNAs (R-1、 10 R-2、R-3及R-4; X-軸）以及四個IL-17RC siRNAs (RC-1、 RC-2、RC-3、RC-4; X-軸）分別地於hIL-17A-及ML-17F-所 引發之由BJ細胞而來之GRO-α釋放（相對反應；y-軸）上之 影響。”Tagman (探針）”代表在治療條件下iL_17R (第4A 圖）或IL-17RC (第4B圖）mRNA相對的量。“Mock”代表僅 15 使用培養基及轉染試劑。“ NTC1”代表以非專一性對照組 siRNA轉染。於分別以hIL-17R以及hIL-17RC轉染之 HEK293細胞中siRNA轉染在hIL-17R以及hIL-17RC表現 上的影響藉由西方墨點法被顯示於第4C圖。肌動蛋白之西 方墨點代表蛋白質載入的對照組。
20 第5圖代表於經減少濃度(X-軸）之人類IL-17A(第5A 圖）、人類IL-17F (第5B圖）或人類il-17F/IL-17A (第5C圖） 處理之BJ細胞中，IL-17R siRNA (R-3及R-4)以及IL-17RC siRNA (RC-2 及 RC-4)之處理在 GR〇_a 釋放（pg/mlGR〇a; y-aXeS)上的影響。NTC丨代表以非專一性對照組siRNA來轉 121 200902064 染。 顯示於第6A圖中的係經針對IL-17F (y-軸）及IL-17A (X-軸）細胞内染色之CD4+CD62L+ (na_ive) DOll T細胞的流 式細胞儀點陣圖（flow cytometric dot plots)，該細胞係經 5 照射脾細胞活化四天，1 pg/ml OVA323-339，且經以下列三 種細胞介素之一種處理：TGF-β、IL-6或TGF-β及IL-6 (TGF-β，IL-6)兩者。顯示於第6B圖中地係經經照射脾細 胞，lpg/ml OVA323-339，活化以經TGF-β及IL-6兩者之活 化1天、2天、3天或4天後之CD4+CD62L+ (naive) DOll T 10 細胞的流式細胞儀點陣圖。其係經對於小鼠IL-17F (y-轴） 及小鼠IL-17 A (X-軸）細胞内染色的。所有的圖被限制（gated) 於CD4+DOll T細胞上。數據係代表三個分開的實驗。 顯示於第7A圖中的係經純化重組小鼠 IL-17F/IL-17A，、小鼠IL-17A或小鼠IL-17F蛋白質（35 ng每 15 道）以（左圖⑴)抗-IL-17A抗體或（右圖⑼）抗_il-17F抗體 分析之西方墨點。小鼠IL-17F/IL-17A之大小係由於使用於 其純化的標籤(tag) η (見實施例2.2.2)而被改質。 第7Β、7C及7D圖顯示各種濃度(ng/mi; \_軸）之經純化 重組小鼠IL-17A (空白的正方形）、小鼠IL_17F/IL_17A (填滿 20 的圓圈）或小鼠IL-17F (填滿的三角形）藉由小鼠IL-17A (第 7B 圖）、小鼠 IL-17F/IL-17A (第 7C 圖）或小鼠IL-17F (第 7D圖） 之定量ELISA的偵測結果(〇·;〇·;严軸）。插入圖代表較低濃 度之放大的視圖’以虛線代表偵測的極限。 第7E圖顯示小鼠il-ΠΑ (空白柱體）、小鼠 122 200902064 IL-17F/IL-17A (具影線柱體）或小鼠IL_17F (經填滿柱體）經 由CD4+CD62L+D011 T細胞之製造，該細胞於初級活化中 經經照射脾細胞，1 pg/ml OVA323-339以及所經指定之細 胞介素(X-軸）活化七天。第7F圖顯示小鼠ΐ]_ι7Α (空白柱 5 體）、小鼠1L-PF/m-PA (具影線柱體)或小良IL_17F (經填 滿柱體）藉由CD4+CD62L+ DOl 1 T細胞之製造（ng/ml; y-軸），該細胞於初級活化中經經照射之脾細胞，1 pg/ml OVA323-339 ’及經被指定之細胞介素(χ>轴；“初次，，（亦即， TGF-/?、IL-6及IL-1 万；或 TGF-冷、IL-6、IL-1 石及IL-23)) 1〇 活化七天、收穫、靜置整夜且為了二次活化以經照射脾細 胞、IL-2及 1 pg/mlOVA323-339 單獨（-)或添加下列il-23、 抗-IFN-γ抗體(aIFN-γ以及抗-IL-4抗體(aIL-4)來再刺激。關 於第7E圖及第7F圖，在第四天各個活化後，條件培養基針 對IL-17A、IL-17F/IL-17A及IL-17F被分析，所顯示的數據 15 係平均土 SD且*代表<1 ng/ml之IL-17A。第7E圖及第7F圖 代表至少三個實驗。
第8圖顯示由鼠肺上皮(MLE-12)細胞所分離出之條件 培養基之CXCL1濃度(CXCL1 (pg/ml); y-軸），該等細胞以小 鼠IL-17A (空白的正方形）、小鼠IL-17F/IL-17A (經填滿的 20 圓圈）以及小鼠IL-17F (經填滿的三角形)在各種濃度（細胞 介素（ng/ml); X-軸）（第8A圖）被培養24小時；在各種濃度之 經50 pg/ml之兩種不同的抗-IL-17F抗體(aIL-17F(RK015-0l) (經填滿之圓圈）或aIL-17F(RK016-17)(經填滿之三角形）） 或大鼠IgGl (空白之正方形）預培養的小鼠IL-17F (IL-17F 123 200902064 (ng/ml);x-軸）中培養24小時（第犯圖）；或於2〇〇ng/ml之經 8(^g/ml之所不抗體或多數抗體（χ_轴）預培養之小鼠 IL-17F/IL-17A培養小時（第8(：圖）。關於第8A、8B,&8C圖， 虛線代表沒有的外因之細胞介素存在的]^1^_12細胞所產 5生之CXCL1的基本量。所有數據被表示為平均± SD且係代 表三個實驗。 第9圖表示：（第9A圖）於bal流體中之小鼠 IL-17F/IL-17A (IL-17F/IL-17A (pg/ml); y_轴）以及小鼠il-22 (IL-22 (pg/ml); y-軸）的濃度；（第9B圖）於bal流體中嗜中 10 性球、嗜酸性球、淋巴細胞及單核球（X-軸）的不同細胞量 (細胞(xl05);y-軸）；或（第9C圖）H&E組織學於分離自對照 組天真（naiive) BALB/c動物之4〇χ放大率之肺（“a”表 示呼吸道内腔且“V”表示血管），該BALB/c動物得到 2.5xl06 Thl7細胞被24小時後接續地以PBS鼻内地刺激一天 15 一次連續不斷三天，（空白柱體（於第9A圖及9B圖）; Thl7/PBS);分離自未得到Thl7細胞且接續地以75 pg印白 蛋白（OVA)鼻内地刺激一天一次連續不斷三天的對照組天 真的BALB/c動物，或分離自得到2.5xl06 Thl7細胞且24小 時後接續地以75 pg卵白蛋白（OVA)鼻内地刺激一天一次連 20 續不斷三天的對照組天真的BALB/c動物（經填滿柱體；
Thl7/OVA)。關於第9A及9B圖，數據係平均± SEM。關於 第9A、9B及9C圖，η = 5-6隻每群小鼠，且數據係代表至少 兩個實驗。 第10圖表示：（第10Α圖）嗜中性球之數量（細胞（χ105); 124 200902064 y-轴），（第10B圖）小鼠iCXCL1之濃度(ng/ml;尸轴）或（第 10C圖）於BAL流體中分離自對照組動物之CXCL5的濃度 (ng/ml; y-軸）’該動物沒有得到Thl7細胞\_軸)但接續地 經卵白蛋白（OVA; +)鼻内地刺激，或該動物係得到Thl7細 5 胞（+)’未經處理㈠或經針對小鼠IL-17A (抗IL-17A(50104) 之中和抗體(mAb)、針對小鼠IL_17F (抗IL_17F (rk〇15_01)) 之中和抗體或針對小鼠IL-22 (抗IL-22 (Ab-01))之中和抗 體或適當之同型對照組抗體(IgG2a或IgG 1)處理且接續經卵 白蛋白（OVA; +)鼻内地刺激。該baL流體係在最後之卵白 10 蛋白刺激的24小時後被收集。數據係平均士SEM，η = 8-9隻 每群小鼠且係表示二或三個實驗，依據抗體而定。 第11Α - 11Ε圖顯示嗜中性球之數量（細胞； y-軸）(A-C)，CXCL1 濃度（Pg/mi; y_ 軸）(α、Β 及 D)以及 CXCL5濃度(pg/ml; y-軸)(Α、Β及Ε)於BAL流體，該流體係 15 於小鼠被投予（Α)每日一鼻内劑量1.5pg之小鼠IL-17A或小 鼠IL-17F (X-軸），（B)鼻内劑量l_5pg之小鼠IL-17A或小鼠 IL-17F (X-軸）連續不間斷三天或（C-E) —鼻内劑量1.5 pg之 小鼠IL-17A、小鼠IL-17F/IL-17A、小鼠IL-17F或小鼠 IL-22 (X-軸)後的24小時被分離。對照動物係被投予磷酸鹽 20 缓衝液（PBS)。數據係平均土 SEM，n=7，且係表示二個實 驗。全部的p值係相對於僅接受PBS之對照組動物來被計 算。 第12A圖及第12B圖表示使用二不同抗-IL-17F抗體作 為捕捉抗體之重組小鼠IL-17A (空白正方形）或小鼠 125 200902064 IL-17F/IL-17A (經填滿之圓形）之不同濃度細胞介素 (ng/ml); X-軸）的ELISAs測定光密度(O.D.; y-軸）的結果（A) 抗-IL-17F (RK015-01)或（B)抗-IL-17F (RK016-17)連接至 ELISA盤上，其已以山羊抗-大鼠IgGl預塗覆且使山羊抗-小 5 鼠IL-17A作為偵測試劑。第12C圖顯示CXCL1 (“CXCL-lpg/ml，，； y-轴）於以200 ng/ml IL-17A經培養24小 時之MLE-12細胞中分離之培養基的濃度，該IL-17A已以 50 pg/ml之下列抗體中之一者(X-轴）預培養：IgG2a，抗-小 鼠 IL-17A (抗-mIL17A(50104))、大鼠IgGl (rlgGl)、抗-小 10 鼠 IL-17F (抗-mIL17F(RK015_01))以及抗-小鼠 IL-17F (抗 -mIL17F(RK016-17))。 第13圖顯示嗜中性球(細胞(xl〇5)之數量;左圖，y-軸）以 及CXCL5 (ng/ml;右圖，y-轴)於BAL流體中之濃度，該流體 係分離自對照動物，該動物係沒有得到Thl7細胞（-;\_軸) 15 但接續地經卵白蛋白（OVA i.η.;+)鼻内地刺激或該動物係 得到Thl7細胞（+)但未經處理㈠或經針對小鼠IL-17F (抗 -IL-17F (RK016-17))之中和單株抗體(mAb)或一適當同型 對照抗體(IgGl)處理且接續地經卵白蛋白鼻内地刺激。該 BAL流體係在最後之卵白蛋白刺激的24小時後被收集。數 20 據係平均土 SEM，η = 8-9隻每群小鼠且係表示二或三個實 驗，依據抗體而定。 【主要元件符號說明】 (無） 126

Claims (1)

  1. 200902064 十、申請專利範圍： 1. 一種篩選可拮抗IL-17F/IL-17A訊息傳遞之化合物的方法，其 包含下列步驟： (a) 使一含有IL-17F/IL-17A及IL-17R之試樣與多數 5 個測試化合物中之一者接觸；以及 (b) 判定是否於該試樣中之IL-17F/IL-17A的生物活 性相對於於一沒有與該測試化合物接觸之試樣中的 IL-17F/IL-17A之生物活性係減少的， 藉由這樣於與該測試化合物接觸之試樣中 10 IL-17F/IL-17A之生物活性的降低辨識一化合物為 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包含辨識是否 該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑係一專一性 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑的第一或最後一步驟。 15 3.如申請專利範圍第2項之方法，其中該辨識之步驟包含 下列步驟： (a) 使一含有IL-17A及IL-17R之試樣與該 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸； (b) 判定是否於該試樣中之IL-17A的生物活性相對 20 於於一沒有與該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸之 試樣中的IL-17A之生物活性係減少的； (c) 使一含有IL-17F及IL-17R之試樣與該 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸；以及 200902064 (d)判定是否於該試樣中之IL-17F的生物活性相對 於於一沒有與該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸之 试樣中的IL-17F之生物活性係減少的； 藉由IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑降低IL-PF及 IL-17A兩者之生物活性的失敗辨識該IL-17F/IL-17A訊 息傳遞拮抗劑為一專一性IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗 劑。 4. 一種篩選可拮抗il_17f/il_17A訊息傳遞之化合物的方 法，其包含下列步驟： ⑻使一含有IL-17F/IL-17A及IL-HRC之試樣與多數 個測試化合物之一者接觸；以及 (b)判定是否於該試樣中之il-17F/IL-17A的生物活 性相對於於一沒有與該測試化合物接觸之試樣中的 IL-17F/IL-17A之生物活性係減少的， 藉由這樣於與該測試化合物接觸之試樣中 IL-17F/IL-17A之生物活性的降低辨識—化合物為 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。 5. 如申請專利範圍第4項之方法，其進—步包含辨識是否 該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑係專—性 IL-17F/IL_ 17A 息傳遞枯抗劑的一第—或—最後井'驟 6. 如申請專利範_ 5項之方法，其中該辨識包含;列步 驟： ⑷使一含有IL-17A及IL-17RC夕〜α 之试樣與該 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸； 2 200902064 (b) 判定是否於該試樣中之IL-17A的生物活性相對 於於一沒有與該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸之試 樣中的IL-17A之生物活性係減少的； (c) 使一含有IL-17F及IL-17RC之試樣與該 5 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸；以及 (d) 判定是否於該試樣中之IL-17F的生物活性相對於 於一沒有與該IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑接觸之試樣 中的IL-17F之生物活性係減少的， 藉由IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑降低iL_17f及 10 IL-17A兩者之生物活性的失敗辨識該IL-17F/IL-17A訊息 傳遞拮抗劑為一專一性IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。 7. —種化合物，其係由如申請專利範圍第丨_6項中任一項 之方法所辨識。 8. —種IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑供製造一藥物之用 15 途，忒藥物係用於在一對象中抑制IL-17F/IL-17A之生物 活性。 9. 如申明專利範圍第8項之用途，其中該IL-17F/IL-17A之 生物活性係GR〇-a分泌。 1〇·如申°月專利範圍第8項之用途’其中該IL-17F/IL-17A 20訊息傳遞拮抗劑係選自於由-拮抗性小分子、拮抗性抗 體、IL-17R融合多肽以及IL_17RC：融合多肽所構成之組 群。 200902064 U.如申5奮專利範圍第8項之用途，其中該IL-17F/IL-17A 訊息傳遞拮抗劑係一專一性IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮 抗劑。 12·如中請專利範圍第8項之用途，其中該IL-17F/IL-17A 訊息傳遞拮抗劑係如申請專利範圍第7項之化合物。 13.—種IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑供製造一藥物之用 途’該藥物係用於治療一有IL-17F/IL-17Α-相關疾病之風 險或被診斷有IL-17F/IL-17A-相關疾病的對象。 10 15 14·如申睛專利範圍第13項之用途，其中該IL-17F/IL-17A §fl息傳遞拮抗劑係選自於由括抗性小分子、抬抗性抗 體、1L-17R融合多肽以及il_17R(：融合多肽所構成之組 群。 15·如申°月專利辜已圍第13項之用途，其中該IL-17F/IL-17A 汛心傳遞拮抗劑係一專一性訊息傳遞拮 抗劑。 6.如申明專利範圍第13項之用途，其中該IL-17F/IL-17A 訊息傳魅抗劑係如㈣專·圍第7項之化合物。 訊息傳遞拮 Π. -種樂學組成物，其包含_ il•腫Li 抗劑以及-藥學上可接受之栽劑 18.如申請專利範圍第 $ 17項之組成物，其中該 IL-17F/IL-17A 旬自值、路 融合多肽以及IL-17RC融合 °遞拮抗劑係選自於由拮抗性小分 子、拮抗性抗體、il_17r 多肽所構成之組群。 20 200902064 19. 如申請專利範圍第17項之組成物，其中該 IL-17F/IL-17A 訊息傳遞拮抗劑係一專一性 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑。 20. 如申請專利範圍第17項之組成物，其中該 5 IL-17F/IL-17A訊息傳遞拮抗劑係如申請專利範圍第7項 之化合物。 21. —種經分離之抗體，其可專一性地結合至IL-17F/IL-17A 異型二聚體。 22. 如申請專利範圍第21項之抗體，其中該抗體抑制 10 IL-17F/IL-17A 之訊息傳遞。 23. —種小分子，其可專一性地結合至IL-17F/IL-17A異型 二聚體。 24. 如申請專利範圍第23項之小分子，其中該小分子抑制 IL-17F/IL-17A之訊息傳遞。 15 25.如申請專利範圍第13項之用途，其中該IL-17F/IL-17A- 相關疾病係一發炎性疾病。 26. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該IL-17F/IL-17A- 相關疾病係呼吸道疾病。 27. 如申請專利範圍第26項之用途，其中該呼吸道疾病係 20 選自於呼吸道發炎、氣喘以及COPD所構成之組群。 28. —種IL-17F/IL-17A供製造一藥劑之用途，該藥劑係用 於於一對象中引發呼吸道發炎。 29. 如申請專利範圍第28之用途，其中該對象係一小鼠。 5
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