TR201907085A2 - Parazi̇tleri̇n ve parazi̇tlerden elde edi̇len ekstraselüler vezi̇külleri̇n kanser tedavi̇si̇nde kullanimi - Google Patents

Abstract

Buluş kanser tedavisi amacıyla parazitleri ve parazitlerden izole edilen ekstraselüler veziküllerin kullanımı ile ilgilidir. Buluş, parazitlerin ve parazit eksozomlarının kanser tedavisinde kullanımını ve eksozomların ilaç yükleme kapasitesinden yararlanılarak eksozomlara etkin madde yüklenmesini; böylece sağlıklı hücrelere yan etki göstermeksizin doğrudan hedef kanser hücrelerine spesifik ilaç taşıması yapılarak ilacın biyoyararlanımının artırılması ile tümöre spesifik hedef bölgede istenilen etkinin alınmasını amaçlamaktadır. Buluş kapsamında, ekstraselüler veziküller için kaynak olarak özellikle Leishmania infantum paraziti kullanılmaktadır

Description

TARIFNAME PARAZITLERIN VE PARAZITLERDEN ELDE EDILEN EKSTRASELÜLER VEZIKÜLLERIN KANSER TEDAVISINDE KULLANIMI Teknik Alan Bu bulus kanser tedavisi ainaciyla parazitleri ve parazitlerden izole edilen ekstraselüler veziküllerin kullanimi ile ilgilidir. Önceki Teknik Kanser günümüzün en tehlikeli ve sik rastlanan hastaliklarindan biridir. 2012 yilinda dünyada ortalama 14.1 milyon yeni kanser vakasi oldugu düsünülmektedir gelistirilen tedavi yöntemleri etkinliklerinin düsük ve yan etkilerinin yüksek olmasi dolayisiyla yetersiz kalmaktadir. Örnegin, kemoterapi gögüs kanseri gibi birçok kanser türünde en sik basvurulan tedavi yöntemi olsa da vücutta kemik iligi, saç ve sindirim sistemi gibi birçok saglikli dokuya ciddi zararlar verir [2].

Tedavi metotlarinin yetersizligi, bilim insanlarini kanser alaninda yeni metotlarin denemeye itmistir. Bu denemeler arasinda, eksozoinlar etkili sonuçlar vaat etmektedir.

Basvuru kapsaminda kullanilan “neoplastik hastaliklar” ifadesi, habis (malign) tümörlere veya kontrolsüz hücre büyümesi ile karakterize olan bir fizyolojik duruma, ömegin kanser hastaligina isaret etmektedir, Bu kapsamda, “neoplastik hastalik” ve “kanser” terimleri birbiri ile degisebilir sekilde kullanilabilir. Kanser örnekleri karsinoma, lenfoma, blastoma sarkoma ve löseiniyi içermekte olup bunlarla sinirli degildir. o Karsinoma, burada kullanildigi sekliyle, epitel hücrelerden olusan bir kanser türünü ifade etmektedir. 0 Lenfoma, burada kullanildigi sekliyle, lenfositlerden gelisen bir kanser türünü anlatmaktadir. o Blastoma, burada kullanildigi sekliyle, blast hücre adiyla da bilinen öncü hücrelerden gelisen bir kanser türünü anlatmaktadir. o Sarkoma, burada kullanildigi sekliyle, mezenkimal kökenli degismis hücrelerden kaynaklanan kanser türünü anlatmaktadir. i Lösemi, burada kullanildigi sekliyle, kemik iliginde baslayan ve yüksek sayida anormal akyuvar hücresi olusumuna neden olan kanser türünü ifade etmektedir.

Kanser türlerine ait daha özel örnekler meme kanseri, prostat kanseri, kolorektal kanser, deri kanseri, küçük hücreli akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri, mezotelyom, gastrointestinal kanser, pankreas kanseri, gliyoblastom, vulva kanseri, rahim agzi kanseri, endometriyal karsinom, yumurtalik kanseri, karaciger kanseri, hepatom, mesane kanseri, böbrek kanseri, tükürük bezi karsinomu, tiroid kanseri ve çesitli bas ve boyun kanserlerini içerir.

Kanserin tedavisi adina siklikla, cerrahi operasyon ve/veya kemoterapi kullanilmaktadir. Cerrahi operasyon, bazi vakalarda, tani ve etkili bir sonuç dogururken; genellikle, hayatta kalan ve uzun zamanda kanser olusumunu tetikleyecek olan kanserli hücreler ihtimaline karsi, ameliyat sonrasi kemoterapötik ilaç uygulanmasi söz konusudur. Çogunlukla kemoterapi, kanserli hücrenin yani sira saglikli hücrelere de zarar vererek bir takim yan etkilere neden olur. Vücutta çogalma hizi yüksek olan hücreler kemoterapiden en çok etkilenen hücrelerdir ki bunlar da saç, kemik iliginde üretilen kan hücreleri ve sindirim sistemi hücreleridir.

Kemoterapi sonrasi siklikla gözlemlenen yan etkiler; 0 Halsi'zli'k.' Çogunlukla kan hücrelerinin etkilenmesinden dolayi olusan anemi sebebi ile olsa da kaynagi psikolojik de olabilir. o Bulanti ve Kusma: Ilaçlara olan duyarliliktan dolayi olabilecegi gibi psikolojik sebepler ile de olabilir. 0 Saç Dökülmesi.' Hizli büyümelerinden dolayi kemoterapiden özellikle olumsuz olarak etkilenen saçin dökülmesi, hastalarin psikolojilerinin bozulmasindaki en büyük nedenlerden birisidir. 0 Kan Degerlerinin Düsmesi: Kemik iliginin kemoterapiden etkilenmesi, kan hücrelerinde kayda deger bir düsüs olmasi ile sonuçlanir. Bu düsüsün sonucu olarak da dokulara yeterli oksijen gidememesinden, bagisikligin zayiflamasina kadar kan pihtilasmasindaki zorluklara kadar birçok olumsuzluk gözlemlenebilir. o Agiz yaralari: Kemoterapi ilaçlari bazen agiz içerisinde iltihapli yaralara neden olabilir. Bu süreçte hastalarin, asiri sicak veya soguk içeceklerden kaçinmalari ve agiz hijyenlerine azami dikkat göstermeleri gerekmektedir. 0 Ishal veya Kabizlik.' Sindirim sistemi hücrelerinin farkli kemoterapik ajanlara karsi gösterdikleri tepki sonucu ishal veya kabizlik gözlemlenebilir. Çogunlukla diyet ile etkileri azaltilabilen bu durum, kimi vakalarda damar yolundan sivi alinmasinin gerektigi kadar siddetli ishale de dönüsebilir. 0 Cilt ve Tirnak Degisiklikleri.' Kemoterapötik ilaçlar cilt renginde koyulasina, ciltte soyulma, kizariklik veya kuruluk yan etkilere sahiptir.

Tirnaklarin kolay kirilmasi veya renklerinin koyulasmasi da gözlemlenebilir. Özellikle ciltteki soyulmalara, bagisikligi zayiflamis olan hastalarda açik yara olusturacagindan dolayi, çok dikkat edilmesi gerekir. 0 Uyku Problemleri.' Genellikle psikolojik sebeplerle ortaya çiksa da vücudun özellikle kemoterapi sirasinda dinlenememesi durumu hem kemoterapinin etkisini azaltan hem de hastanin ruh sagligini daha da bozan bir durumdur.

Tedavi basarisinin artmasi için kemoterapinin gerek cerrahi operasyonla gerekse diger yöntemlerle birlikte kullanilmasi gerekliligi ile birlikte, yan etkilerinin çoklugu ve hastadan hastaya degismesinden dolayi tahmin edilemezligi, bilim insanlarini yeni tedavi yöntemleri aramaya itmistir.

Nauts ve ark. (1953) mikroorganizmalarin antitümör yanit olusturabilecegini göstermislerdir. Zayiflatilmis ya da genetik olarak modifiye edilmis, patojenik olmayan organizmalarin antitümör ajan olarak kullanilabilecegi fikri üzerinde çalismislardir [3]. T oxoplasma gondii and Acanthamoeba castellam'i'nin antitumor aktivite gösterdigini bulmuslardir. Bu gelismelerin isiginda, mikroorganizmalarla onkolojide yeni bir tedavi alani olusmus, ilk kez 1931 yilinda kullanilan ”Biyoterapi" adi altinda arastirma ve gelisme çalismalari yapilmistir [4, 5, 6, 7, 8].

Baird ve ark. (2013), zayiflatilmis T oxoplasma gondii' parazitini Bl6F10 murin melanom tedavisinde kullanmislar, Toxoplasma gondii verilen farelerde, güçlü bir CD8+ T hücre-kaynakli antitümör yanitin olustugunu gösterrnislerdir [9].

Bose ve ark. (2016) yaptigi çalismada, isi ile zayiflatilmis Leishmania donovani'nin HepG2 karaciger kanser hücrelerinde reaktif oksijen türleri (ROS) kaynakli p53'ye bagli mitokondrial yolaginda apoptozun indüklendigi sonucuna varmislardir [10].

Yang ve ark. (2017), Plasmodium ile enfekte edilmis farelerden izole edilen eksozomlari Lewis akciger kanser modelinde denemisler ve tumor anjiyogenezini inhibe ettigini gözlemlemislerdir [11].

Mevcut tedavi yöntemlerini gelistirmek ve yan etkileri azaltabilmek adina baslatilan çalismalarda eksozomlar elde edildikleri hücrenin spesifik kargo içeriklerini tasimalari ile hedeflemede kullanilabilirligi dolayisiyla ön plana çikmistir.

Ekstraselüler veziküller; hücreler arasinda maddelerin tasinmasinda görev alan ve sitoplazma sivisindan en az bir çift tabakali lipit katmanli küçük keseciklerdir.

Ekstraselüler veziküllerden biri olan eksozomlar ise, yüksek ökaryotlara, bitkilere kadar birçok organizma tarafindan salgilanan, farkli boyutlarda bulunabilen çift tabakali lipit zar tasiyan veziküllerdir. Bu veziküllerin önemi, hücresel fonksiyonu etkilemek amaciyla diger hücrelere bilgi aktarma kapasitesi altinda yatar.

Eksozomlar ile sinyal aktarimi, proteinler, lipidlera nükleik asitler ve sekerlerden olusan birçok farkli kategorideki biyomoleküller araciligi ile gerçeklestirilir [12]. Üretildikleri hücrenin yüzey proteinlerini tasidiklari için, eksozomlar in Viva sistemlerde verildikleri hücre türüne güdümlüdürler. Bu özellikleri, eksozomlari, ilaç, biyoaktif madde ve gen terapisi için nükleik asitleri tasimakta elverisli kilar.

Eksozomlarin bir diger ayirt edici yani, tasidiklari sinyallerin ve kargolarin üretildikleri hücreye ve hücrenin o anda bulundugu fizyolojik durumlara has olmalaridir. Farkli canlilarin eksozomlari, ayni canlinin farkli türdeki hücrelerinin eksozomlari ve ayni hücrenin ayri kosullardaki eksozomlari farkli özellikler gösterir.

Her hücre kendi amaçlarina yönelik eksozomlar üretir. Kanser hücrelerinin ürettikleri eksozomlar ile vücutta kendileri için elverisli bir ortam yarattiklari [13], bagisiklik sisteminden kaçtiklari [14, 15] ve metastasis için eksozomlardan faydalandiklari [16] kesfedilmistir. Vücudun kansere karsi cevabinda ise kök hücre eksozomlarinin [17] ve özellikle bagisiklik sistemi hücreleri olan dendritik hücrelerin eksozomlarinin [18, 19] birçok çalismasi bulunmaktadir. Basarili sonuçlar gösteren bir baska eksozom kaynagi bitkilerdir. Limondan elde edilen eksozomlar kronik iniyeloid lösemi modeli üzerinde tedavi amaciyla basarili bir sekilde kullanilmistir [20].

Bütün ökaryotik hücreler kendi eksozomlarini üretirler, buna ökaryotik parazitler de dahildir. Leishmaniasis, Leishmam'a protozoan parazitlerinin enfeksiyon kapmis disi tatarcik (sandfly) sineklerinin isirmasi ile insana tasinan, vektörel kaynakli bir grup hastaliga verilen ortak addir. Dünya Saglik Örgütü verilerine göre Leishmaniasis, Türkiye ve ülke cografyasi da dahil olmak üzere özellikle Güney Avrupa, Orta Dogu ve Kuzey Afrika ülkeleri dahil dünya çapinda 60'dan fazla ülkede yaygin görülmektedir.

Teknikte bilinen uygulamalardan EP1687025 sayili Avrupa patent basvurusunda, interlökin 18 ve saponin destekleyici sistemi içeren bir asi kompozisyonundan bahsedilmektedir. Bulus kapsaminda açiklanan kombinasyon terapisinin, bulasici hastaliklar, kanserlerj otoimmün hastaliklar ve iliskili kosullarin tedavisinde ve korunmasinda kullanisli oldugu belirlenmistir.

Teknikte bilinen uygulamalardan CN102988417 sayili Çin patent basvurusu dokümaninda, hastaliklarin önlenmesi ve kontrolü için helmintik parazit biyolojik ajanlarinin kullanimindan bahsedilmektedir. Bu parazit preparatlari, bir düzenleyici T hücresi fonksiyonunu etkilemektedir. Parazit preparatinin uygulanmasiyla düzenleyici T hücre aktivitesi degistirilerek bir hastaligin tedavisi gerçeklestirilmektedir. Bu yöntem ile tedavi edilen hastaliklardan olarak Thl veya Th2 iliskili kanser gösterilmektedir.

Bulusun Kisa Açiklamasi Bulusun amaci, parazit ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin kanser tedavisinde kullanimidir. Parazit eksozomlarinin saglikli hücrelere yan etki göstermeksizin dogrudan kanser hücrelerinde yanit olusturmaktadir. Ayrica, eksozomlarin ilaç yükleme kapasitesinden yararlanilarak eksozomlara etkin madde yüklenebilmekte; böylece hedef hücreye spesifik ilaç tasimasi yapilarak ilacin biyoyararlaniminin artirilmasi ile tümöre spesifik hedef bölgede istenilen etkinin alinmasi gerçeklestirmektir. Bulus kapsaminda, ekstraselüler veziküller (eksozomlar) için kaynak olarak özellikle Let`s/'imama infantum paraziti kullanilmaktadir.

Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen “Parazitlerin ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin kanser tedavisinde kullanimi” ekli sekillerde gösterilmis olup; bu sekillerden: Sekil 1 - Leishmania infantum parazitlerinin U87 hücreleri ile birlikte 2 farkli dozda inkübasyonunun hücreler üzerindeki apoptotik etkisinin degerlendirilmesinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 2 - Kültür ortamindaki U87 hücrelerinin parazit ile inkübasyonundan 8 saat sonraki parazit enfeksiyonunu gösteren isik mikroskobu fotografinin gösterimidir Sekil 3 - Leishmariia iri/anlam parazitlerinden elde edilen eksozomlarin 8 farkli dozda 24, 48 ve 72 saatlik uygulamada U87 hücrelerinin hücre canliligina etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil4- Leishmania iii/anlam parazitlerinden elde edilen eksozoinlarin 8 farkli dozda 24, 48 ve 72 saatlik uygulamada A172 hücrelerinin hücre canliligina etkisinin grafiksel gösterimidir.

SekilS- Leishmania iigfânrum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin 8 farkli dozda 24, 48 ve 72 saatlik uygulamada SHSYSY hücrelerinin hücre canliligina etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekilö- Leishmania infantum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin 8 farkli dozda 24, 48 ve 72 saatlik uygulamada SH4 hücrelerinin hücre canliligina etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil7- Leishmania infanrum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin 8 farkli dozda 24, 48 ve 72 saatlik uygulainada 22RV hücrelerinin hücre canliligina etkisinin grafiksel gösterimidir.

SekilS- Leishmania irsfantum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin 8 farkli dozda 24, 48 ve 72 saatlik uygulamada hDF hücrelerinin hücre canliligina etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 9 - Leishmania infanmm parazitlerinden elde edilen eksozomlarin 8 farkli dozda 24, 48 ve 72 saatlik uygulamada Haeat hücrelerinin hücre canliligina etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 10 -Leishmartia infantum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin 8 farkli dozda 24, 48 ve 72 saatlik uygulamada Astrosit hücrelerinin hücre canliligina etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 11 -Leishmania infantum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 48 saatlik uygulamada, SHSYSY nöroblastoma hücrelerinde Bax gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 12 -Lei'shmania infanrum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 48 saatlik uygulamada SHSYSY nöroblastoma hücrelerinde Bel-2 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 13 -Leishmania irýântum parazitlcrindcn elde edilen eksozomlarin tek dozda 48 saatlik uygulamada SHSYSY nöroblastoma hücrelerinde Caspase 3 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 14 -Leishmania infânrum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 48 saatlik uygulamada SHSYSY nöroblastoma hücrelerinde p53 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 15 -Lei'shmania infantum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 3 saatlik uygulamada SHSYSY nöroblastoma hücrelerinde p21 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 16 -Leishmam'a infântum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 3 saatlik uygulamada Astrosit hücrelerinde p21 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 17 -Leishmania infantum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 3 saatlik uygulamada SHSYSY nöroblastoma hücrelerinde p53 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 18 -Leishmania infanrum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 3 saatlik uygulamada Astrosit hücrelerinde p53 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 19 -Leishmania infânmm parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 3 saatlik uygulamada SHSYSY nöroblastoma hücrelerinde Caspase3 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Sekil 20 -Leishmania infânrum parazitlerinden elde edilen eksozomlarin tek dozda 3 saatlik uygulamada Astrosit hücrelerinde Caspase3 gen ifadesine etkisinin grafiksel gösterimidir.

Bulus, parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin, neoplastik hastaliklarin tedavisi için kullanilmasidir. Bu “neoplastik hastaliklar” ifadesi habis (malign) tümörlere veya kontrolsüz hücre büyümesi ile karakterize olan bir fizyolojik durum olup, kanser hastaligina isaret eder. Bulus kapsaminda kullanilabilir. Neoplastik hastalik olarak; meme kanseri, prostat kanseri, kolorektal kanser, deri kanseri, küçük hücreli akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri, mezotelyom, gastrointestinal kanser, pankreas kanseri, sarkoma, blastoma, lenfoma, gliyoblastom, nöroblastom, vulva kanseri, rahim agzi kanseri, endometriyal karsinom, yumurtalik kanseri, karaciger kanseri, hepatom, lösemi, mesane kanseri, böbrek kanseri, tükürük bezi karsinomu, tiroid kanseri ve çesitli bas ve boyun kanserlerinden olusan bir gruptan seçilen en az bir kanser hastaligi için olabilmektedir. Bulus kapsaminda, glioblastoma hücre hatti olan U87 kanser hücrelerinin ve A172 kanser hücrelerinin, nöroblastoma hücre hatti olan SHSY-SY kanser hücrelerinin, melanoma hücre hatti olan SH4 kanser hücrelerinin, prostat hücre hatti olan 22RV kanser hücrelerinin öldürülmesi seklinde kanscr tedavisi gcrçcklcstirilmcktcdir.

Bulus konusu, Leishmania parazitlerin ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin seçici olarak kanser hücrelerini öldürmesi sebebiyle kanser tedavisinde kullanilmalarini ele almaktadir. Bulusun gelistirilmesi kapsaminda, parazitlerin ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin kanser üzerinde yüksek derecelerde ölümcül olduklarini, fakat saglikli hücreler üzerinde neredeyse hiçbir yan etki göstermedigi gözlemlenmistir.

Bulus kapsaminda, parazit eksozomlarinin ilaç yükleme kapasitesinden yararlanilarak eksozomlara etkin inadde yüklenebilecek; hedef hücreye spesifik ilaç tasimasi yapilabilecek, böylece ilacin biyoyararlanimi artirilarak hedef bölgede istenilen etkinin alinmasi saglanabilecektir.

Bulusun farkliligi, kanser tedavisinde Leishmania parazitinden izole edilen eksozomlarin kullanmasidir. Önceki teknik basligi altinda bahsedilen çalismalarda direkt parazitlerin kullanilmasi, parazitlerin hastalik olusturmasi nedeniyle tedavide kullanilmalari önünde Ciddi bir engeldir. Bulus konusunda ise, parazitlerden elde edilen eksozomlar kullanilarak, direkt parazitlerin kullanimindaki olasi hastalik riskinin önüne geçilmektedir.

Bulusta aralarinda Leishmania infantum parazitinin de yer aldigi çesitli parazitler ve parazitlerden elde edilen eksozomlar kanser tedavisinde kullanilmaktadir.

Bulus kapsaminda, burada kullanilan “parazitler” Acanthamoeba sp.

(Acanrhamoeba castellam'i'), Echinoeococcus spp., E. histolytica spp., Ancylosroma brazilense, A. caninum, A. ceylanicum, and Uncinaria stenocephala., Angiostmngylus cantonensi's, Ascaris, Giardi'a, Leishmania spp.

(L. Arabi'ca, L. archibaldi, L. aristedesi, L. brazili'ensi's, L. Chagasi, L. colombiensis, L. Deanei, L. donovam', L. enrieîii, L. equatorensis, L. forattinii, L. garnhami, L. gerbil, L. guyanensis, L. herreri, L. hertigi', L. infantum, L. killi'cki', L. lainsoni, L. major, L. Mexicana, L. naijfi, L. panamensis, L. peruviana, L. pifimoi, L. shawi, L. tarentolae, L. Iropi'ca, L. turanica, L. venezuelensis), Plasmadfum spp. (P. falcipamm, P. w'vax, P. ovale), Schistosoma spp., Toxoplasma spp.

(Toxoplasma gondii), Trypanosoma brucei ssp. türlerini içermektedir. Bulus kapsaminda yukarida siralanan bu parazitlerden biri kullanilabildigi gibi, bunlardan en az bir parazit kaynakli olan bir parazit veya parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller kullanilmaktadir.

Bulus kapsaminda, parazit olarak Leishmam'a infantum seçilmekte olup, parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin karakterize edilmesinde parazit olarak Leishmania infantum seçilmektedir. Kanser tedavisinde kullanimi parazitlerin kültür medyasi olabilmektedir.

Bulus kapsaminda parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerinin, parazit antijenlerinin (isi ile inaktive edilmis veya direkt antijenin kendisi), genetik materyalinin (mRNA, small RNA, mitoehondrial DNA, DNA fragments), gen transferi ve transfekte olmus parazitlerin (plazmid aktarimi, lentiviral, SV40 antijeni ile elektroporasyon), CRISPR (nükleodit düzenleme içeren yöntemler) kanser tedavisi için kullanilmaktadir. Bunlar, kanser tedavisinde nano tasiyici sistemler içerisine enkapsüle edilerek kullanilmaktadir.

Parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin izolasyonu, bulus kapsaminda, çift fazli sivi sistemleri ile izolasyon (ATPS), dereceli santrifüj, ultrasantrifüj, sukroz gradient ultrasantrifüj, polimerik çöktürme, ultrafiltrasyon, kromatografik yöntemler ile izolasyon (affinite kromatografi (antikor and peptit affinite), boyut ayrimi kromatografisi (boyut dislama kromatografisi)), mikro boncuklar ile izolasyondan iyon yüküne göre çöktürme (elektriksel yük bazli çöktürme), salting tuzla çöktürme yöntemlerinden en az bir izolasyon yöntemi kullanilmaktadir. Bulus kapsaminda tercih edilen çift fazli sivi izolasyon yöntemi: - Ekstaselüler veziküllerin izole edilecegi parazitin kültür medyasinin toplanmasi, - kültür medyasinin hücre artiklari ve parazitler gibi istenmeyenlerden hizda santrifüj edilmesi, - santrifüj sonrasinda filtreleme ile 220 nm ve üstü boyuttaki parçaciklarin uzaklastirilmasi, - santrifüj islemi ile elde edilen vezikül-protein karisiminin ayristirilmasi amaciyla PEG fazi ve DEX fazi içeren çift fazli sivi sistemi içerisine alinmasi, - PEG fazinin proteinlere, DEX fazinin ise fosfolipid yapili membranlara olan kimyasal egiliminden yararlanilarak veziküllerin; vezikül disi proteinlerden, hücresel yaglardan ve diger kirliliklerden arindirilmasi, - izole edilmis veziküllerin elde edilmesi adimlardan olusmaktadir.

Bulus kapsaminda gelistirilen ve parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler vezikülleri içeren bir formülasyon; veziküller, emülsiyon sistemleri, biyolojik ve kimyasal yapili nanopartiküller (polimerik nanopartiküller, kati lipid nanopartiküller), inorganik yapili nanopartiküller (metalik nanopartiküller), lipid yapili veziküler sistemler (lipozomlar, niozomlar ve etozomlar), dendrimerler, polimer ilaç- koiijugatlari miseller, karbon nanotüplerden olusan bir gruptan seçilen nano tasiyici sistemler içermektedir. Bu foriiiülasyon; diger etken madde antiparazitik, antibakteriyel, antiviral, antineoplastik ve/Veya sitotoksik ve/veya antimetastatik etki gösteren bilinen aktif bilesikler ve bunlarin ikili ve üçlü kombinasyonlarindan olusan bir gruptan seçilen en az bir aktif bilesik içermektedir. Bu formülasyon antibakteriyel etki gösteren aktif bilesik olarak; amikasina gentamisin, kanamisin, neomisin, netilmisin, tobramisin, paromisin, streptomisin, spektinomisin, geldanamisin, herbimisin, rifaksimin, lorakarbef, ertapenem, doripenem, imipenem, meropenem, sefadroksil, sefazolin, sefalotin, sefaleksin, sefaklor, sefamandol, sefoksitin, sefprozil, sefuroksim, sefiksim, sefdinir, sefditoren, sefoperazon, sefotaksim, sefpodoksim, seftazidim, seftibüten, seftizoksim, sefepim, seftarolin fosamil, seftobiprol, teikoplaiiin, vankomisin, televansin, dalbavansin, oritavansin, clindamisin, linkomisin, daptomisin, azitromisin, klaritromisin, diritromisin, eritromisin, roksitromisin, troleandomisin, telitromisin, spiramisin, aztreonam, furazolidon, nitrofurantoin, linezolid, posizolid, radezolid, torezolid, amoksisilin, ampisilin, azlosilin, karbenisilin, kloksasilin, dikloksasilin, Ilukloksasilin, mezlosilin, metisilin, nafsilin, okzasilinj penisilin G, penisilin V, piperasilin, temosilin, tikarsilin, klavulanat, sulbaktam, tazobaktam, basitrasin, kolistin, polimiksin B, siproiloksasin, enoksasin, gatitloksasin, gemifloksasin, levotloksasin, lomefloksasin, moksitloksasin, nalidinik asit, norfloksasin, ofloksasin, trovafloksasin, grepafloksasiri, spariloksasin, temafloksasin, mafenid, sulfasetamid, sulfadiazin, sülfadimetoksin, sülfametizol, sülfametoksazol, sulfanilimid, sülfasalazin, sülfîsoksazol, trometoprim, demeklosiklin, doksisiklin, minosiklin, oksitetrasiklin, tetrasiklin, klofazimin, dapson, kapreomisin, sikloserin, etambutol, isoniyazid, pyrazinamid, rifampisin, rifabutin, rifapentin, streptomisin, arsfenamin, kloramfenikol, fosfomisin, fusidik asit, metronidazol, mupirosin, platensimisin, kinupristin, dalfopristin, tiamfenikol, tigesiklin, tinidazol, trimetoprimî ve bunlarin ikili veya üçlü kombinasyonlari ve/veya enkapsülasyonlarindan olusan bir grubun içerisinden seçilen en az bir ajan içermektedir. Bu formülasyon antiviral etki gösteren aktif bilesik olarak; abakavir, asiklovir, adefovir, amantadin, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, balavir, sidofovir, kombivir, dolutegravir, darunavir, delavirdin, didanosin, dokosanol, eduksudin, efavirenz, emtrisitabin, enfuvirtid, entekavir, ekoliver, famsiklovir, fomivirsen, fosamprenavir, foskarnet, fosfonet, gansiklovir, ibasitabin, imunOVir, idoksuridin, imikuimod, indinavir, inosin, interferon tip I, interferon tip II, interferon tip lll, interferon, lamivudin, lopinavir, lovirid, maravirok, moroksidin, metisazon, nelfinavir, nevirapin, neksavir, nitazoksanid, novir, oseltamivir, peginterferon alfa-Za, pensiklovir, peramivir, plekonaril, podofilotoksin, proteaz inhibitörü, nükleosit analoglari, ralgetavir, ribavirin, rimantadin, ritonavir, piramidin, saquinavir, sofosbuvir, stavudin, telaprevir, tenofovir, tipranavir, trifliridine, trizivir, tromantadin, trovada, valasiklovir, valgansiklovir, Vidarabin, viramidin, zalsitabin, zanamivir, zidovudin`i ve bunlarin ikili veya üçlü kombinasyonlari ve/veya enkapsülasyonlarindan olusan bir grubun içerisinden seçilen en az bir ajan içermektedir. Bu formülasyon antiparazitik etki gösteren aktif bilesikler olarak; nitazoksanit, melarsoprol, eIlornitin, metronidazol, tinidazol, miltefosin, mebendazol, pirantel pamoat, tiyabendazol, dietilkarbamazin, ivermektin, niklosamid, prazikuantel, albendazol, rifampin, amfoterisin B, fumagillin, furazolidon, nifursemizon, nitaksozanid, ornidazol, paramomisin sülfat, pentamidin, pirimetamine, tinidazol, albendazol, mebendazol, tiyabendazol, fenbendazol, triklabendazol, flubendazol, abamektin, dietilkarbamazin, ivermektin, suramin, pirantel pamoat, levamisol, niklosamid, nitasokzanid, oksiklonazd, monepantel, derquantel, amfoterisin B, üre stibamin, sodyum stiboglukonat, meglumin antimoniat, paromomisin, miltefosin, flukonazol, pentamidin”den ve bunlarin ikili veya üçlü kombinasyonlari ve/veya enkapsülasyonlarindan olusan bir grubun içerisinden seçilen en az bir ajan içermektedir. Bu formülasyon ekstraselüler veziküller ve/Veya nanotasiyici sistemlerle kombine olarak antineoplastik etki gösteren aktif bilesikler olarak; siklofosfamid, ifosfamid, temozolomid, kapesitabin, 5-f10ro urasil, metotreksat, gemsitabin, pemetrekset, mitomisin, bleomisin, epirubisin, doksorubisin, etoposit, paklitaksel, irinotekan, dosetaksel, vinkristin, karboplatin, cisplatin, okzaliplatin, bevacizumab, setuksimab, gefitinibg imatinib, trastuzumab, denosumab, rituksimab, sunitinib, zoledronat, abirateron, anastrozol, bikalutamid, eksemestan, goserelin, medroksiprogesteron, oktreotid, tamoksifen, bendamustin, karmustin, klorambusil, lomustin, melfalan, prokarbazin, streptozosin, fludarabin, raltitrexed, aktinomisin D, daktinomisin, doksorubisin, mitoksantron, eribulin, topotekan, vinblastin, vinorelbin, afatinib, atlibersept, krizotinib, dabrafenib, interferon, ipilimumab, lapatinib, nivolumab, panitumumab, pembrolizumab, pertuzumab, sorafenib, trastuzumab emtansin, temsorilimus, vemurafenib, ibandronik asit, pamidronat, bexarotan, buserelin, siproteron, degareliks, folinik asit, fulvestrant, lanreotid, lenalidomid, letrozole, leuprorelin, megestrol, mesna, talidomid, vinkristin'den ve bunlarin ikili veya üçlü kombinasyonlari ve/veya enkapsülasyonlarindan olusan bir grubun içerisinden seçilen en az bir ajan içennektedir. Ayrica bu forrnülasyon en az bir etkin madde içermektedir. Etkin madde, yukarida tanimlanmis ve siralanmis olan maddeleri kapsamaktadir.

Yukarida açiklanan bu farmasötik bilesimin tedavide uygulama yöntemi; parenteral, intravenöz, intradermal, subkutan, intraperitonal, topikal, intratekal, intranasal, intraserebroventriküler, Oküler, vajinal, üretral, transdermal, sublingual, subaraknoid, rektal, periodontal, perinöral, peridural, periartiküler, oral, intratimpanik, intratumor, intrapulmoner, intrasinovial, intramuskuler, intraovarian, intrameningeal, intracorporus kavemosum, intrakoroner, intraserebral, epidural, kütanöz, bukkal, dentallden olusan bir gruptan seçilen en az bir uygulama yöntemidir.

Bulus kapsaminda ekstraselüler veziküller, adjuvan olarak kanser tedavisi için kullanilmaktadir. Bulus kapsaininda açiklanan farmasötik bilesim; parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin, 3D-MPL, kolesterol, CG oligonukleotid içeren alüminyum hidroksit, alüminyum fosfat, tokoferol, emülsiyon sistemlerinden en az birinin veya bunlarin ikili veya daha fazla kombinasyonu içerisinde bulunmasi ile olusturulabilmektedir.

Bulusun amaci dogrultusunda kanser tedavisinde kullanilabilecek parazitlerin ve parazit ekstraselüler veziküllerinin üretilmesi, asagidaki adimlari içermektedir: 1. Parazitlerin kültürü Leishmam'a infêmtum (MHOM/MA/67/ITMA-P263) promastigotlari 27 OC”de RPM] mcdiumunda (isica inaktivc cttirilmis %10 fetal bovin serum, 2mM L- glutamine, 20 mM HEPES, 100 U/ml penicillin, 100 tig/ml streptomisin esliginde) inkübe edilir. Logaritmik faza ulasan parazitler (lOG/ml) enfektif hale getirilir. 2. Kültüre edilmis parazitlerin glioblastoma kanseri ile muamele edilip Annexin V denevi ile apoptoz miktarlarinin ölçümü Kültür ortamindaki glioblastoma U87 hücrelerinin üzerine hazirlanmis olan parazitler eklenir. 2 farkli doz olmak üzere (U87 hücrelerinin 50 ve 100 kati) verilen parazitler 8 saat inkübe edildikten sonra U87 hücrelerinin üstündeki parazitler uzaklastirilir. Ertesi gün Annevin V solüsyonu eklenerek ölüm orani akis sitometrisi eihazinda ölçülür. 3. Parazit medyasinin toplanmasi Bulusun kapsaminda parazit ekstraselüler vezikülleri, çift fazli sivi sistem ile izolasyon, dereceli santrifüj, ultraiiltrasyon, kromotografik yöntemler, polimer bazli izolasyon. mikro boncuklar ile izolasyondan olusan bir gruptan seçilen bir izolasyon yöntemiyle izole edilmektedir. Aralarindan en saf bir sekilde ekstraselüler vezikül izolasyonu çift fazli sivi sistem ile izolasyon ile saglanmaktadir ve bu sebeple basvuru kapsaminda bu izolasyon yöntemi tercih edilmektedir.

Bulus kapsaminda kullanilan parazit ekstraselüler veziküllerinin izolasyonu için kullanilan çift fazli sivi sistem ile izolasyon yöntemi, o Ekstraselüler veziküllerin izole edilecegi parazitin kültür medyasinin toplanmasi 0 Kültür medyasinin hücre artiklari ve parazitler gibi istenmeyenlerden hizda santrifüj edilmesi, . Santrifüj sonrasinda filtreleme ile 220 nm ve üstü boyuttaki parçaciklarin uzaklastirilmasi . Santrifüj islemi ile elde edilen vezikül-protein karisiminin ayristirilmasi amaciyla PEG fazi ve DEX fazi içeren çift fazli sivi sistemi içerisine alinmasi, 0 PEG fazinin proteinlere, DEX fazinin ise fosfolipid yapili membranlara olan kimyasal egiliminden yararlanilarak veziküllerin; vezikül disi proteinlerden, hücresel yaglardan ve diger kirliliklerden arindirilmasi, - Izole edilmis veziküllerin elde edilmesi adimlarindan olusmaktadir.

Hücreler kültür ortaminda %10 fetal bovin serum (Invitrogen) ve %1 PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) içeren Dulbecco,s modified Eagleis medium (DMEM) içerisinde 96 kuyucuklu kültür kaplarina (Coming Glasswork, Coming, NY) 5.000 hücre/kuyucuk olacak sekilde ekildikten sonra 1., 2. ve 3. günlerde hücrelerin canlilik düzeyleri ölçülmüstür. Hücre canliligi 3-(435-di-metil- tiazol-2-il)-5-(3-carboksi-methoksi-fenil)-2-(4-sulfo-fenil)-2H-tetrazolyum (MTS)-metodu (CellTiter96 Aqueous One Solution; Promega, Southampton, UK) kullanilarak ölçüldü. 100ul büyüme besiyeri içerisinde olan hücrelerin üzerine 10111 MTS solüsyonu eklenmis ve 2 saat karanlikta inkübe edilmistir. Inkübasyon sürecinden sonra 490nm dalga boyunda ELISA plaka okuyucu (Biotek, Winooski, VT) cihazi ile abzorbans ölçümü yapilarak canlilik analizi gözlemlenmistir.

. Kantitatif gerçek zamanli polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) Hücreler kültür ortaminda %10 fetal bovin serum (Invitrogen) ve %1 PSA (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) içeren Dulbecco,s modified Eagle”s medium (DMEM) içerisinde 96 kuyucuklu kültür kaplarina (Coming Glasswork, Coming, NY) 150.000 hücre/kuyucuk olacak sekilde ekildikten sonraki gün, hücreler çesitli dozlarda (10-40 ug/ml) parazit eksozomu ile inkübe edilmis, inkübasyondan 3. ve 48. saat sonra hücrelerdeki p2l, p53, caspase 3, Bel-2 ve Bax gen ifadelerine bakilmistir. Özetle, hücrelerden Trizol® ile RNA izolasyonu yapilmis, NanoDrop spektrofotornetresi ile total RNA konsantrasyonlari ölçülmüs ve sonrasinda cDNA kiti (Roche) kullanilarak cDNA sentezi yapilmistir. RT- PCR, SYBR Green Kit (Thermofisher scientific) kullanilarak 95 °C for 15 dk, 39 Housekeeping gen olarak GAPDH kullanilmistir.

Bulus konusunun teknigin bilinen durumu karsisinda farkliliklarindan biri, parazit ve parazit kültür ortamindan izole edilen eksozomlarin kullanilmasidir ve hem izole edildigi canli türü bakimindan hem de parazitlerin eksozomunun kullanilmasi bakimindan belirgin bir farklilik yaratmaktadir. Bu eksozomlar hücrelerin disariya salgiladiklari kimyasallarin sadece bir parçasidir. Bulus kapsaminda parazitlerin ve eksozomlarinin hem kanser hem de saglikli hücre hatlari üzerine olan etkisi gösterilmektedir. Parazitler glioblastoma hücre hatti olan U87 hücrelerinin üzerine hem 50 hat hemde 100 kat olacak sekilde verilip kanser hücrelerinin apoptoz yani ölüm oranlari degerlendirilmekte ve 8 saat inkübasyonunun Sonucunda iki dozda da yüzde 30'lara varan ölüm gözlemlenmektedir (Sekil 1). Ayni zamanda apoptoza yani ölüme giden hücrelerin Leishmam'a infüntum parazitleri ile enfeksiyonunu yaklasik yüzde 68 oraninda olmaktadir (Sekil 2). Sadece parazitlerin degil; ayni zamanda bu parazitlerin salgiladigi ve besi ortamindan izole edilen eksozoinlar belirli kanser ve saglikli hücreler üzerine belirli konsantrasyonlarda (0.78-50 tig/ml) verilip 3 gün boyunca hücre canliligina bakildiginda U87 glioblastoma hücresinde (%40 ve üzeri), SHSYSY nöroblastoma hücresinde (%90 ve üzeri), A172 glioblastomada (%45 ve üzeri), SH4 melanoma hücresinde (%90 ve üzeri), 22RV prostat hücresinde (%90 ve üzeri) hücre canliliginda azalma, ölüm görülürken; saglikli hücre hatlari olan HACAT, hDF ve Astrosit hücrelerinde canliliga herhangi bir etkisi bulunmamaktadir (Sekil 3-10).

SHSY-SY Nöroblastoma hücrelerinde, 10 ug/ml dozda eksozom verilip 48 saat inkübasyondan sonra p53, caspase 3, Bel-2 ve Bax gen ifadesi Kantitatif gerçek zamanli polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile tayin edilmis, sonucunda SHSY-SY Nöroblastoma hücrelerinde p53, caspasc 3 ve Bax genindc anlamli bir artis ve Bel-2 gen ifadesinde azalma görülmüstür (Sekil 11-14). SHSY-SY Nöroblastoma ve Astrosit (NHA) hücrelerinde, 40 ug/ml dozda eksozom verilip 3 saat inkübasyondan sonra p2l, p53 ve caspase 3 gen ifadesindeki degisiklikler degerlendirilmis; SHSY-SY nöroblastoma hücrelerinde p2l ve caspase 3 gen ifadelerinde anlamli bir artis görülmüs, Astrosit (NHA) hücrelerinde ise p2l, 1353 ve caspase 3 gen ifadelerinin azaldigi sonucuna varilmistir (Sekil 15-20). Yapilan deneyler isiginda elde edilen sonuç, bulus konusunun, yüksek miktarlarda kanser hücrelerinde ölüme (apoptosis) sebep olurken saglikli hücrelerin üzerinde sitotoksik bir etki birakmayan bir formülasyonun gelistirilmesine uygunlugunu göstermektedir.

Bulus konusunun avantajlari asagidaki gibi ifade edilebilir: . Bulus farkli kanser türleri üzerinde 24 saat içinde neredeyse tamamen etki göstermekte ve saglikli hücreler üzerinde yan etki göstermemektedir, o Parazitlera özellikle Leishmania türleri genetik modifikasyonlara son derece açik olduklari için parazitler ve parazitlerin ekstraselüler vezikülleri ihtiyaca göre genetik müdahale ile modifiye edilebilirler, kanser üzerindeki etkinlikleri? parazitlerden elde edile üretim hacmi gibi alanlarda iyilestirmelere açiklardir, - Eksozomlarin ilaç yükleme kapasitesinden yararlanilarak eksozomlara etkin madde yüklenebilmekte; böylece hedef hücreye spesifik ilaç tasimasi yapilarak ilacin biyoyararlaniminin artirilmasi ile tümöre spesifik hedef bölgede istenilen etkinin alinmasi saglanabilmektedir, o Bulusta kullanilan ekstraselüler veziküller yüksek hacimlerde uygun fiyatlarla üretilebilen ürünlerdir.

Claims (26)

ISTEMLER

1. Habis (malign) tümörlere veya kontrolsüz hücre büyümesi seklinde açiklanan fizyolojik durumlarin ifadesi olan neoplastik hastaliklarin tedavisi için kullanilan parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller.

2. Acanthamoeba sp. (Acanthamoeba castellanii), Echinocococcus spp., E. histoly'tica spp., Ancylostoma brazilense, A. caninum.A. ceylanicum, and Uncinaria Stenocephala., Angiostrongylus canlonensis, Ascaris, Giardi'a, Leishmania spp. (L. Arabica, L. archibaldi, L. aristedesi, L. braziliensis, L. chagasi', L. colombiensis,L. Deanei, L. donovani, L. enrietii, L. equatorensis, L. fomüinii, L. gamhami, L. gerbil, L. guyanensis, L. herreri', L. hertigi, L. infantum, L. killicki', L. lainsoni, L. major, L. Mexicana, L. naißî, L. panamensis, L. peruviana, L. pzfanoi, L. shawi, L. rarentolae, L. tropica, L. turam'ca, L. venezuelensis), Plasmadium spp. (P. _fâlcz'parum P. vivax, P. ovale), Schistosoma spp., Toxoplasrna spp. (Toxoplasma gondii), Trypanosoma brucei ssp. türlerinden olusan bir gruptan seçilen en az bir parazit olan istem 1”deki gibi parazitler.

3. Acanthamoeba sp. (Acanthamoeba castellanü), Echinocoeoecus spp., E. histolytica spp., Ancylosroma brazilense, A. carzinum,A. ceylanicum, and Uncinaria stenocephala., Angiostrongylus cantonensis, Ascaris, Giardia, Leishmania spp. (L. Arabica, L. arc/zibaldi, L. aristedesi, L. braziliensis, L. chagasi', L. colombiensis,L. Deanei, L. donovani, L. enrietii, L. equatorensis, L. fomttinii, L. garnhami', L. gerbil, L. guyanensis, L. herreri, L. hertigi, L. infantum, L. killicki, L. lainsoni, L. major, L. Mexicana, L. naiffi, L. panamensfs, L. peruviana, L. pz'ßmoz', L. shawi, L. tarantolae, L. tropz'ca, L. turanica, L. venezuelensis), Plasmadium spp. (P. jâlciparum, P. vivax, P. ovale), Schistosoma spp., Toxoplasma spp. (T oxoplasma gondii), Trypanosoma brucei ssp. türlerinden olusan bir gruptan seçilen en az bir parazit kaynakli olan Istem 1 veya 2°deki gibi parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller.

4. Parazit antijenlerinin (isi ile inaktive edilmis veya direkt antijenin kendisi), genetik materyalinin (mRNA, small RNA, mitochondrial DNA, DNA fragments), gen transferi ve transfekte olmus parazitlerin (plazmid aktarimi, lentiviral, SV4O antijeni ile elektroporasyon), CRISPR (nükleodit düzenleme içeren yöntemler) kanser tedavisi için kullanilan istem l”deki gibi bir parazit ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller.

5. Parazit antijenlerinin (isi ile inaktive edilmis veya direkt antijenin kendisi), genetik materyalinin (mRNA, small RNA, mitochondrial DNA, DNA fragments), gen transferi ve transfekte olmus parazitlerin (plazmid aktarimi, lentiviral, SV40 antijeni ile elektroporasyon), CRISPR (nükleodit düzenleme içeren yöntemler) kanser tedavisinde nano tasiyici sistemler içerisine enkapsüle edilerek kullanilan Istem l”deki gibi parazitler.

6. Kültür medyasi olan Istem l”deki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller.

7. Parazit olarak Leishmam'a infantum seçildigi Istem 25deki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller.

8. Parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin karakterize edilmesinde parazit olarak Leishmania infanrum Istem 3”teki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller.

9. Neoplastik hastalik olarak; meme kanseri, prostat kanseri, kolorektal kanser, deri kanseri, küçük hücreli akciger kanseri, küçük hücreli olmayan akciger kanseri, mezotelyom, gastrointestinal kanser, pankreas kanseri, sarkoma, blastoma, lenfoma, gliyoblastom, nöroblastom, vulva kanseri, rahim agzi kanseri, endometriyal karsinom, yumurtalik kanseri, karaciger kanseri, hepatom, lösemi, mesane kanseri, böbrek kanseri, tükürük bezi karsinomu, tiroid kanseri ve çesitli bas ve boyun kanserlerinden olusan bir gruptan seçilen en az bir kanser hastaligi için kullanilan Istem 1'deki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller.

10. Glioblastoma hücre hatti olan U87 kanser hücrelerinin öldürülmesi seklinde kanser tedavisi için kullanilan Istem 9,daki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler vezikülleri.

11. Glioblastoma hücre hatti olan A172 kanser hücrelerinin öldürülmesi seklinde kanser tedavisi için kullanilan Istem 9”daki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler vezikülleri.

12. Nöroblastoma hücre hatti olan SHSY-SY kanser hücrelerinin öldürülmesi seklinde kanser tedavisi için kullanilan Istem 9Sdaki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler vezikülleri.

13. Melanoma hücre hatti olan SH4 kanser hücrelerinin öldürülmesi seklinde kanser tedavisi için kullanilan Istem 97daki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler vezikülleri.

14. Prostat hücre hatti olan 22RV kanser hücrelerinin Öldürülmesi seklinde kanser tedavisi için kullanilan Istem 9”daki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler vezikülleri.

15. Çift fazli sivi sistemleri ile izolasyon (ATPS), dereceli santrifüj, ultrasantrifüj, sukroz gradient ultrasantrifîij, polimerik çöktürme, ultratîltrasyon, kromatografik yöntemler ile izolasyon (affinite kromatografi (antikor and peptit afiinite), boyut ayrimi kromatografisi (boyut dislama kromatogratisi)), mikro boncuklar ile izolasyondan iyon yüküne göre çöktürme (elektriksel yük bazli çöktürme), salting tuzla çöktürrne yöntemlerinden en az biri ile izole edilen yukaridaki istemlerden herhangi birindeki gibi parazitler ve parazitlerden elde eilen ekstraselüler veziküller.

16. Ekstaselüler veziküllerin izole edilecegi parazitin kültür medyasinin toplanmasi, - kültür medyasinin hücre artiklari ve parazitler gibi istenmeyenlerden hizda santriû'ij edilmesi, - santrifüj sonrasinda filtreleme ile 220 nm ve üstü boyuttaki parçaciklann uzaklastirilmasi, - santrifüj islemi ile elde edilen vezikül-protein karisiminin ayristirilmasi amaciyla PEG fazi ve DEX fazi içeren çift fazli sivi sistemi içerisine alinmasi, - PEG fazinin proteinlere, DEX fazinin ise fosfolipid yapili membranlara olan kimyasal egiliminden yararlanilarak veziküllerin; vezikül disi proteinlerden, hücresel yaglardan ve diger kirliliklerden arindirilmasi, - izole edilmis veziküllerin elde edilmesi adimlarindan olusan bir çift fazli sivi sistem ile izolasyon yöntemiyle izole edilen Istem 15”deki gibi parazit ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküller.

17. Yukaridaki istemlerden herhangi birindeki gibi parazitler ve parazitlerden elde edilen ekstraselüler vezikülleri içeren ve içerisinde ekstraselüler veziküller, emülsiyon sistemleri, biyolojik ve kimyasal yapili nanopartiküller (polimerik nanopartiküller, kati lipid nanopartiküller), inorganik yapili nanopartiküller (metalik nanopartiküller), lipid yapili veziküler sistemler (lipozomlar, niozomlar ve etozomlar), dendrimerler, polimer ilaç- konjugatlari miseller, karbon nanotüplerden olusan bir gruptan seçilen nano tasiyici sistemler bulunan bir farmasötik bilesim.

18. Istem l7'ye göre farmasötik bilesim olup diger etken madde antiparazitik, antibakteriyel, antiviral, antineoplastik ve/Veya sitotoksik ve/Veya antimetastatik etki gösteren bilinen aktif bilesikler ve bunlarin ikili ve üçlü koinbinasyonlarindan olusan bir gruptan seçilen en az bir aktif bilesik içermektedir.

19. Istem 18*e göre farmasötik bilesim olup antibakteriyel etki gösteren aktif bilesik olarak; amikasin, gentarnisin, kanamisin, neomisin, netilmisinj tobramisin, paroinisinj streptomisin, spektinomisin, geldanamisin, herbimisin, rifaksiinin, lorakarbef, ertapenem, doripenem, imipenem, meropenem, sefadroksil, sefazolin, sefalotin, sefaleksin, sefaklor, sefamandol, sefoksitin, sefprozil, sefuroksim, sefiksim, sefdinir, sefditoren, sefoperazon, sefotaksiin, sefpodoksim, seftazidim, seftibüten, seftizoksim, sefepim, seftarolin fosamil, seftobiprol, teikoplanin, vankomisin, televansin, dalbavansin, oritavansin, clindamisin, linkomisin, daptomisin, azitromisin, klaritromisin, diritromisin, eritromisin, roksitromisin, troleandomisin, telitrornisin, spiramisin, aztreonarn, furazolidon, nitrofurantoin, linezolid, posizolid, radezolid, torezolid, amoksisilin, ampisilin, azlosilin, karbenisilin, kloksasilin, dikloksasilin, Ilukloksasilin, mezlosilinn metisilin, nafsilin, okzasilin, penisilin G, penisilin V, piperasilin, temosilin, tikarsilin, klavulanat, sulbaktam, tazobaktam, basitrasin, kolistin, polimiksin B, siprofloksasin, enoksasin, gatifloksasin, gemifloksasin, levofloksasin, lomeiloksasin, moksifloksasin, nalidinik asit, norfloksasin, ofloksasin, tr0vaf10ksasin, grepafloksasin, sparfloksasin, teinafloksasin, mafenid, sulfasetamid, sulfadiazin, sülfadimetoksin, sülfametizol, sülfametoksazol, sulfanilimid, sülfasalazin, sülfisoksazol, trometopriin, demeklosiklin, doksisiklin, minosiklin, oksitetrasiklin, tetrasiklin, klofazimina dapson, kapreomisin, sikloserin, etambutola isoniyazid, pyrazinamid, rifampisin, 1'ifabutina rifapentin, streptomisin, arsfenamin, kloramfenikol, fosfomisin, fusidik asit, metronidazol, mupirosin, platensiinisin, kinupristin, dalfopristin, tiainfenikol, tigesiklin, tinidazol, trimetoprim'i ve bunlarin ikili veya üçlü kombinasyonlari ve/veya enkapsülasyonlarindan olusan bir grubun içerisinden seçilen en az bir ajan içennektedir.

20. Istem 18”e göre bir farmasötik bilesim olup antiviral etki gösteren aktif bilesik olarak; abakavir, asiklovir, adefovir, amantadin, amprenavir, ampligen, arbidol, atazanavir, atripla, balavir, sidofovir, kombivir, dolutegravir, darunavir, delavirdin, didanosin, dokosanol, eduksudin, efavirenz, emtrisitabin, enfuvirtid, entekavir, ekoliver, famsiklovir, fomivirsen, fosamprenavir, foskarnet, fosfonet, gansiklovir, ibasitabin, imunovir, idoksuridin, imikuimod, indinavir, inosin, interferon tip I, interferon tip II, interferon tip HI, interferon, lamivudin, lopinavir, 10Virid, maravirok, moroksidin, metisazon, nelfinavir, nevirapin, neksavir, nitazoksanid, nOVir, oseltamivir, peginterferon alfa-Za, pensiklovir, peramivir, plekonaril, podofilotoksin, proteaz inhibitörü, nükleosit analoglari, ralgetavir, ribavirin, rimantadin, ritonavir, piramidin, saquinavir, sofosbuvir, stavudin, telaprevir, tenofovir, tipranavir, trifliridine, trizivir, tromantadin, trovada, valasiklovir, valgansiklovir, vidarabin, viramidin, zalsitabin, zanamivir, Zidovudin'i ve bunlarin ikili veya üçlü kombinasyonlari ve/veya enkapsülasyonlarindan olusan bir grubun içerisinden seçilen en az bir ajan içermektedir.

21. Istem l8*e göre bir farmasötik bilesim olup antiparazitik etki gösteren aktif bilesikler olarak; nitazoksanit, melarsoprol, eflornitin, metronidazol, tinidazol, miltefosin, mebendazol, pirantel pamoat, tiyabendazol, dietilkarbamazin, ivermektin, niklosamid, prazikuantel, albendazol, rifampin, amfoterisin B, fumagillin, furazolidon, nifursemizon, nitaksozanid, ornidazol, paramomisin sülfat, pentamidin, pirimetamine, tinidazol, albendazol, mebendazol, tiyabendazol, fenbendazol, triklabendazol, flubendazol, abamektin, dietilkarbamazin, ivermektin, suramin, pirantel pamoat, levamisol, niklosamid, nitasokzanid, oksiklonazd, monepantel, derquantel, amfoterisin B, üre stibamin, sodyum stiboglukonat, meglumin antimoniat, paromomisin, miltefosin, flukonazol, pentamidinSden ve bunlarin ikili veya üçlü kombinasyonlari ve/veya enkapsülasyonlarmdan olusan bir grubun içerisinden seçilen en az bir ajan içermektedir.

22. Istem 18'e göre bir farmasötik bilesim olup ekstraselüler veziküller ve/veya nanotasiyici sistemlerle kombine olarak antineoplastik etki gösteren aktif bilesikler olarak; siklofosfamid, ifosfamid, temozolomid, kapesitabin, 5-floro urasil, metotreksat, gemsitabin, pemetrekset, mitomisin, bleomisin, epirubisin, doksorubisin, etoposit, paklitaksel, irinotekan, dosetaksel, vinkristin, karboplatin, Cisplatin, okzaliplatin, bevacizumab, setuksimab, gefitinib, imatinib, trastuzumab, denosumab, rituksimab, sunitinib, zoledronat, abirateron, anastrozol, bikalutamid, eksemestan, goserelin, medroksiprogesteron, oktreotid, tamoksifen, bendamustin, karmustin, klorambusil, lomustin, melfalan, prokarbazin, streptozosin, fludarabin, raltitrexed, aktinomisin D, daktinomisin, doksorubisin, mitoksantron, eribulin, topotekan, vinblastin, Vinorelbin, afatinib, aflibersept, krizotinib, dabrafenib, interferon, ipilimumab, lapatinib, nivolumab, panitumumab, pembrolizumaba pertuzumab, sorafenib, trastuzumab emtansin, temsorilimus, vemurafenib, ibandronik asit, pamidronat, bexarotan, buserelin, siproteron, degareliks, folinik asit, fulvestrant, lanreotid, lenalidomid, letrozole, leuprorelin, megestrol, mesna, talidoinid, vinkristin”den ve bunlarin ikili veya üçlü kombinasyonlari ve/veya enkapsülasyonlarindan olusan bir grubun içerisinden seçilen en az bir ajan içermektedir.

23. Istem 18-22,den herhangi birine göre bir farmasötik bilesim olup en az bir etkin madde içerir.

24. Istem 18-23”den herhangi birine göre bir farmasötik bilesim olup, tedavide uygulama yönteminin; parenteral, intravenöz, intradermal, subkutan, intraperitonal, topikal, intratekal, intranasal, intraserebroventriküler, oküler, vajinal, üretral, transdermal, sublingual, subaraknoid, rektal, periodontal, perinöral, peridural, periartiküler, oral, intratimpanik, intratumor, intrapulmoner, intrasinovial, intramuskuler, intraovarian, intrameningeal, intracorporus kavernosum, intrakoroner, intraserebral, epidural, kütanöz, bukkal, dental°den olusan bir gruptan seçilen en az bir uygulama yöntemi olmasidir.

25. Adjuvan olarak kanser tedavisi için kullanilan Istem l'e göre ektrasellüler veziküller.

26. Istem 18-24”den herhangi birine göre bir farmasötik bilesim olup, parazitlerden elde edilen ekstraselüler veziküllerin, 3D-MPL, kolesterol, CG oligonukleotid içeren alüminyum hidroksit, alüminyum fosfat, tokoferol, emülsiyon sistemlerinden en az birinin veya bunlarin Ikili veya daha fazla kombinasyonu içerisinde bulunmasi ile olusturulmaktadir.