TR201901782T4 - İnsanlaştirilmiş bi̇r si̇nyal düzenleyi̇ci̇ protei̇n geni̇ne sahi̇p olan i̇nsan dişi hayvanlar. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, insan hematopoetik kök hücrelerinin daha gelişmiş bir biçimde melezleşmesine olanak tanımak için insan dışı hayvanların tasarlanmasının arzu edilebilir olduğunun kabul edilmesine dayanmaktadır. Mevcut buluş ayrıca, insanlaştırılmış bir SIRP&#945#& genine sahip olan ve/veya aksi takdirde bir insan ya da insanlaştırılmış SIRP&#945#& proteinini ekspres eden, ihtiva eden ya da üreten insan dışı hayvanların örneğin, insan hematopoetik kök hücrelerinin aşılanmasında kullanım için arzu edilir olduğu tanımına da dayanmaktadır.

Description

TARIFNAME INSANLASTIRILMIS BIR SINYAL DÜZENLEYICI PROTEIN GENINE SAHIP OLAN INSAN DISI HAYVANLAR Bu basvuru, 23 Eylül 2013lte basvurusu yapilan ABD Geçici Patent Basvurusu 61/881 ,261 'e dayanarak rüçhan talebinde bulunmaktadir. ARKA PLAN Bagisiklik sistemi, çok yüksek oranda regüle edilmis çoklu proseslerde yer alan ve birlikte yabanci proteinleri elimine etmede etkili olan bagisiklik yanitlari üreten birkaç farkli hücre tipinden olusmaktadir. Ayrica, yine ayni bagisiklik hücrelerinin, digerlerinin yani sira, hücreden hücreye etkilesimleri düzenleyen düzenleyici membran proteinleri sayesinde bir öz-farkindalik özelligine sahip oldugu bulunmustur. Bu gibi bir iletisim bu gibi organizmalarin hayatta kalmasi için kritik öneme sahiptir, çünkü bu proteinlerin nakil engraftrasyonunun önemli bir belirleyicisi oldugu iddia edilmektedir. Bununla birlikte, insan bagisiklik hücresi-hücre etkilesimlerinin moleküler yönlerini ve bunun düzenlenmesini belirlemek için hiçbir in vivo sistem mevcut degildir. Bu gibi bir sistem in vivo insan hematopoetik ve bagisiklik sistemi ile ilgili fonksiyonlara yönelik deneyler ve yeni tedavilerin ve asilarin tanimlanmasi için bir kaynak saglamaktadir. BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus, insan hematopoetik kök hücrelerinin daha gelismis bir biçimde melezlesmesine olanak tanimak için insan disi hayvanlarin tasarlanmasinin arzu edilebilir oldugunun kabul edilmesine dayanmaktadir. Mevcut bulus ayrica, insanlastirilmis bir SIRPoi genine sahip olan ve/veya aksi takdirde bir insan ya da insanlastirilmis SIRPoi proteinini ekspres edeni ihtiva eden ya da üreten insan disi hayvanlarin örnegin, insan hematopoetik kök hücrelerinin asilanmasinda kullanim için arzu edilir oldugu tanimina da dayanmaktadir. Bulus genomu bir insanlastirilmis SIRPoi genini olusturmak üzere bir insan SlRPoi geninin ekzonlari 2, 3 ve 4 ile bir endojen kemirgen SIRPoi lokusundaki bir kemirgen SIRPoi geninin 2, 3 ve 4 ekzonlarinin bir ikamesini içeren bir kemirgen saglamaktadir. burada adi geçen insanlastirilmis SlRPoi geni söz konusu endojen kemirgen SIRPci lokusundaki bir kemirgen SIRPoi promotörüne islevsel olarak baglanmaktadir ve bahsedilen kemirgende, bahsedilen insan SlRPoi geni tarafindan kodlanan insanlastirilmis SlRPoi proteininin hücre disi bir kismini ve bahsedilen kemirgen SIRPoi geni tarafindan kodlanan kemirgen SlRPoi proteininin hücre içi bir kismini içeren insanlastirilmis bir SlRPoi proteinini ekspres etmektedir. Bulus ayrica genomu bir insanlastirilmis SIRPoi genini olusturmak üzere bir insan SIRPo geninin ekzonlari 2, 3 ve 4 ile bir endojen kemirgen SIRPo Iokusundaki bir kemirgen SIRPa geninin 2, 3 ve 4 ekzonlarinin bir ikamesini içeren izole edilmis bir kemirgen hücresi ve dokusu saglamaktadir, burada adi geçen insanlastirilmis SIRPo geni söz konusu endojen kemirgen SlRPoi Iokusundaki bir kemirgen SlRPoi promotörüne islevsel olarak baglanmaktadir ve bahsedilen insan SIRPd geni tarafindan kodlanan insanlastirilmis SlRPoi proteininin hücre disi bir kismini ve bahsedilen kemirgen SIRPoi geni tarafindan kodlanan kemirgen SIRPoi proteininin hücre içi bir kismini içeren insanlastirilmis bir SIRPoi proteinini kodlamaktadir. Bulus bunlara ilaveten asagidakileri içeren bir kemirgen üretme yöntemi saglamaktadir: (a) bir insanlastirilmis SIRPoi genini olusturmak üzere bir insan SIRPoi geninin ekzonlari 2, 3 ve 4 ile bir kemirgen ES hücresindeki bir endojen kemirgen SIRPd Iokusunda bir kemirgen SlRPoi geninin ekzonlari 2, 3 ve 4'ünün degistirilmesi, burada sözü edilen insanlastirilmis SlRPd geni. sözü edilen endojen kemirgen SlRPd lokusundaki bir kemirgen SIRPd promotörüne islevsel bir sekilde baglanmaktadir ve söz konusu insan SIRPoi geni tarafindan kodlanan insan SIRPoi proteininin hücre disi bir kismini ve söz konusu kemirgen SIRPoi geni tarafindan kodlanan kemirgen SlRPoi proteininin hücre içi bir kismini içeren bir hümanize SIRPoi proteinini kodlamaktadir ve böylece sözü edilen insanlastirilmis SlRPa genini içeren modifiye bir kemirgen ES hücresi elde edilmektedir; ve (b) (a)'da elde edilen modifiye ES hücresini kullanarak bir kemirgenin üretilmesi. Bulus ayrica, insan hücrelerini hedef alan bir ilacin terapötik etkinligini degerlendirmek için bir yöntem saglamakta olup asagidakileri içermektedir: (a) bir ya da daha fazla insan hücresinin nakledildigi istem 1-6'dan herhangi birine göre bir kemirgenin saglanmasi; (b) bir ilaç adayinin sözü edilen kemirgene uygulanmasi; ve (c) ilaç adayinin terapötik etkinligini belirlemek için kemirgendeki insan hücrelerinin izlenmesi. Burada bir insan SlRPd proteininin hücre disi bir kismini ve birfare SlRPd proteininin hücre içi kismini içeren bir SIRPd polipeptidini ekspres eden bir insan disi bir hayvan tarif edilmektedir. Bir insan SIRPd proteininin hücre disi bir kismi DIZI ID NO: 4ite görünen bir insan SIRPoi proteininin 28-362. kalintilarina karsilik gelen amino asitler içerebilir. Bir insan SIRPa proteininin hücre disi bir kismi Tablo 3'te de görünen bir insan SIRPd proteininin karsilik gelen bir hücre disi kismi ile en az % 50, en az % 55, en az % 60, en az % 65, en az % 70, en az % 75, en az % 80, en az % 85, en az % 90, en az % 95 ya da en az % 98 oraninda bir % kimlik benzerligi paylasabilir. Bir insan SIRPd proteininin hücre disi bir kismi Tablo 3'te de görünen bir insan SIRPoi proteininin karsilik gelen bir hücre disi kismi ile % 100 oraninda bir kimlik benzerligi (ya da özdeslik) paylasabilir. Ayrica burada endojen bir insan disi SIRPd proteini de ifade etmeyen insan disi bir hayvan tarif edilmektedir. Insan olmayan hayvan, endojen bir kemirgen SIRPd proteinini de ekspres etmeyen bir kemirgen olabilir. Insan olmayan hayvan, Tablo 3'te görünen bir diziye sahip olan endojen bir fare SIRPoi proteinini de ekspres etmeyen bir fare olabilir. Ayrica burada insan disi bir SlRPd promotörüne islevsel olarak baglanmis bir insan SIRPd geninin 2, 3 ve 4. ekzonlarini içeren bir SlRPd geni içeren insan disi bir hayvandir. Burada tarif edilen insan disi bir hayvanin bir SlRPd geni, bir endojenöz insan disi SIRPoi geninin 1, 5, 6, 7 ve 8. ekzonlarini içerebilir. Burada tarif edilmekte olan insan disi hayvan bir kemirgen olabilir. Kemirgen bir siçan ya da bir fare arasindan seçilebilir. Buna ilaveten, burada tarif edildigi gibi insan disi bir hayvanin geni tarafindan kodlanmis bir SIRPG polipeptidi de tarif edilmektedir. Ayrica burada tarif edildigi gibi insan disi bir hayvandan izole edilmis olan bir hücre ya da doku da tarif edilmektedir. Bir hücre bir lenfosit (örnegin bir B ya da T hücresi), bir miyeloid hücre (örnegin, bir makrofaj, bir nötrofil, bir granülosit, bir miyeloid dendritik hücre ve bir mast hücre) ve bir nöron arasindan seçilebilir. Bir doku yag, mesane, beyin, meme, kemik iligi, göz, kalp, bagirsak, böbrek, karaciger, akciger, lenf bezi, kas, pankreas, plazma, serum, cilt, dalak, mide, timus, testis, yumurta ve/veya bunlarin bir kombinasyonu arasindan seçilebilir. Bunlara ilave olarak, genomu, bir fare SlRPoi proteininin hücre içi bölümüne bagli olan bir insan SIRPoi proteininin hücre disi kismini kodlayan bir SIRPoi geni içeren izole edilmis bir fare hücresi ya da dokusu tarif edilmektedir. Burada tarif edilmis olan SIRPd geni bir fare SIRPoi promotörüne islevsel bir biçimde baglanmis olabilir. Burada tarif edilmis olan bir SlRPoi geni, bir insan SIRPd geninin 2, 3 ve 4. ekzonunu içerebilir. Buna ilaveten burada, genomu burada tarif edildigi gibi bir SlRPoi geni Içeren insan disi bir embriyonik kök (ES) hücre tarif edilmektedir. ES hücresi insan disi bir SIRPoi promotörüne islevsel olarak baglanmis bir insan SlRPoi geninin 2, 3 ve 4. ekzonlarini içerebilir. ES hücresi bir kemirgen ES hücresi olabilir. Burada tarif edilmis olan insan disi embriyonik kök hücre bir fare ya da siçan embriyonik kök hücre olabilir. Burada ayrica, burada tarif edildigi gibi bir SlRPd geni içeren bir insan disi embriyonik kök hücre içeren, bir SIRPd geni içeren bir insan disi embriyonik kök hücreden yapilan, bir SIRPd geni içeren bir insan disi embriyonik kök hücreden elde edilen ya da bir SlRPoi geni içeren bir insan disi embriyonik kök hücreden üretilen bir insan disi embriyo tarif edilmektedir. Insan disi embriyo bir kemirgen embriyosu olabilir. Burada tarif edilmis oldugu gibi kemirgen embriyosu bir fare ya da siçan embriyosu olabilir. Burada ayrica endojen bir SIRPd lokusundan bir SIRPd proteinini ekspres eden insan disi bir hayvanin yapilmasi, ki buradaki SlRPoi proteini, bir insan dizisini içermektedir (yöntem bir insan SIRPoi proteinini tamamen ya da kismen sifreleyen bir nükleotit dizisi içeren bir genomik parça ile insan disi bir ES hücresinde endojen bir SIRPa lokusunun hedeflenmesini içermektedir): bahsedilen insan dizisini içeren endojen bir SlRPor lokusu içeren degistirilmis bir insan disi ES hücresi elde edilmesi; ve söz konusu degistirilmis ES hücresini kullanarak insan disi bir hayvanin yaratilmasina yönelik bir yöntem tarif edilmektedir. Burada tarif edildigi gibi. sözü edilen nükleotit dizisi bir insan SlRPd geninin 2, 3 ve 4. ekzonlarini içerebilir. Sözü edilen nükleotit dizisi, Tablo 3'te görünen bir insan SIRPoi genine en az % 50, en az % 55, en az % 60, en az % 65, en az % 70, en az % 75, en az % 80, en az % 85, en az °/o 90, en az % 95, ya da en az % 98 oraninda özdes bir diziye sahip olan bir insan SlRPci geninin 2, 3 ve 4. ekzonlarini içerebilir. Sözü edilen nükleotit dizisi, bir insan SlRPoi proteininin 28-362. amino asit kalintilarini kodlayabilir. Sözü edilen nükleotit dizisi, Tablo 3'te görünen bir insan SIRPa proteini ile en az % 50, en az % 55, en az % 60, en az % 65, en az % 70, en az % 75, en az % 80, en az % 85, en az % 90, en az % 95 ya da en az % 98 oraninda özdes bir diziye sahip olan bir insan SIRPd proteininin 28-362 amino asit kalintilarini kodlayabilir. Burada ayrica genomu bir fare SlRPor proteininin hücre içi kismina bagli bir insan SIRPci proteininin hücre disi kismini kodlayan bir SIRPci geni içeren bir farenin saglanmasina yönelik bir yöntem tarif edilmekte olup söz konusu yöntem bir farenin genomunun, bir fare SIRPci proteininin hücre içi kismina bagli bir insan SlRPoi proteininin hücre disi kismini kodlayan bir SlRPoi geni içerecek sekilde modifiye edilmesi ve bu sekilde de sözü edilen farenin saglanmasini içermektedir. The SIRPd geni burada tarif edildigi gibi bir SlRPoi geni olabilir. SlRPoi geni, bir insan SIRPoi geninin 2, 3 ve 4 ekzonunu içerebilir. Burada ayrica insan hücrelerini bir fareye asilamak için bir yöntem de tarif edilmektedir ve söz konusu yöntem genomu, bir fare SIRPci proteininin hücre içi bölümüne bagli bir insan SIRPoi proteininin hücre disi kismini kodlayan bir SIRPd geni içeren bir farenin saglanmasi ve bir ya da daha fazla insan hücresinin fareye nakledilmesi adimlarini içermektedir. Yöntem ayrica, bir ya da daha fazla insan hücresinin fare içine asilanmasini analiz edilmesini bir adim olarak içerebilir. Analiz etme adimi, bir ya da birden fazla insan hücresinin asilamasinin bir ya da birden fazla vahsi tip farenin asilamasi ile karsilastirmayi içerebilir. Analiz etme adimi, bir ya da birden fazla insan hücresinin asilamasinin genomu, bir fare SIRPoi proteininin hücre içi kismina bagli bir insan SlRPoi proteininin hücre disi kismini kodlayan bir SIRPa geni içermeyen bir ya da birden fazla farenin asilamasi ile karsilastirmayi içerebilir. Insan hücreleri hematopoetik kök hücreler olabilir. Insan hücreleri intravenöz bir biçimde asilanmis olabilir. Insan hücreleri intraperitonal bir biçimde asilanmis olabilir. Insan hücreleri subkütanöz olarak transplante edilebilir. Burada ayrica genomu bir fare SlRPoi proteininin hücre içi kismina bagli bir insan SIRPa proteininin hücre disi kismini kodlayan bir SIRPoi geni içeren bir ya da birden fazla hücrenin saglanmasi, bir ya da daha fazla hücrenin etiketli bir substrat ile inkübe edilmesi ve etiketli substratin fagositozunun bir ya da daha fazla hücre tarafindan ölçülmesi adimlarini içeren bir yöntem de tarif edilmektedir. Hücreler, fare hücreleri olabilir. Substrat floresan etiketli olabilir. Substrat bir antikor ile etiketlenebilir. Substrat bir ya da birden fazla kirmizi kan hücresi olabilir. Substrat bir ya da birden fazla bakteriyal hücre olabilir. Yukaridakilere ilaveten burada genomu bir fare SIRPoi proteininin hücre içi kismina bagli bir insan SIRPoi proteininin hücre disi kismini kodlayan bir SlRPoi geni içeren bir farenin saglanmasi, farenin bir antijene maruz birakilmasi ve antijenin fagositozunun farenin bir ya da daha fazla hücresi tarafindan ölçülmesi adimlarini içeren bir yöntem de tarif edilmektedir. Maruz birakma adimi, fareyi flüoresan olarak etiketlenmis bir antijene maruz birakmayi içerebilir. Maruz birakma adimi, fareyi antijeni içeren bir ya da birden fazla hücreye maruz birakmayi içerebilir. Maruz birakma adimi, fareyi antijeni içeren bir ya da birden fazla insan hücresine maruz birakmayi içerebilir. Maruz birakma adimi, fareyi antijeni içeren bir ya da birden fazla bakteri hücresine maruz birakmayi içerebilir. Burada tarif edilmis olan bir SlRPoi geni, bir insan SIRPoi geninin 2, 3 ve 4. ekzonunu içermektedir. Burada tarif edilen bir insan SlRPoi proteininin hücre disi bir kismi Tablo 3'te görünen bir insan SlRPoi proteininin 28-362. kalintilarina karsilik gelen amino asitler içerebilir. Burada tarif edilmis olan bir SlRPo geni bir fare SIRPCI promotörüne islevsel bir biçimde baglanmis olabilir. Burada ayrica, burada tarif edilenler gibi yöntemlerle elde edilebilen insan disi bir hayvan da tarif edilmektedir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar endojen bir SIRPa proteinin hücre disi bir kismini tespit edilebilir bir biçimde ekspres edemeyebilir. Burada ayrica bir ilacin ya da asinin tanimlanmasi ya da validasyonu için yöntemler de tarif edilmektedir ki söz konusu yöntemler burada tarif edildigi gibi insan disi bir hayvana bir ilaç ya da asinin verilmesi ve ilaca ya da asiya bagisiklik tepkisi, ilacin ya da asinin güvenlik profili ya da bir hastalik ya da durum üzerindeki etkisinden bir ya da birden fazlasinin izlenmesini içermektedir. Güvenlik profilinin izlenmesi, insan disi hayvanin, ilacin ya da asinin verilmesi sonucunda bir yan etki ya da ters reaksiyon gösterip göstermedigini belirlemeyi içerebilir. Bir yan etki ya da ters reaksiyon, morbidite, mortalite, vücut agirligindaki degisiklik, bir ya da daha fazla enzimin seviyesinin degistirilmesi (örnegin, karaciger), bir ya da daha fazla organin agirligindaki degisiklik, fonksiyon kaybi (örnegin duyusal, motor, organ, vb.), bir ya da daha fazla hastaliga karsi duyarlilik artisi, insan disi hayvanin genomunda degisiklikler, yiyecek tüketiminde artis ya da azalma ve bir ya da daha fazla hastaligin komplikasyonlari arasindan seçilebilir. Bunlara ilave olarak, bu bulusun insan disi bir hayvaninin, bir ilaç olarak kullanim gibi tipta kullanilmak üzere bir ilacin ya da asinin gelistirilmesinde kullanimi tarif edilmektedir. Burada ayrica, insan hücrelerini hedefleyen terapötik bir ilacin etkililigini degerlendirmek için burada tarif edilmis olan insan disi bir hayvanin kullanimi da tarif edilmektedir. Burada tarif edilen insan disi bir hayvan insan hücreleri ile transplante edilmis olabilir ve bu gibi insan hücrelerin, hedef alan bir ilaç adayi hayvana uygulanabilir. Ilacin etkililigi, ilacin uygulanmasindan sonra insan disi hayvandaki insan hücrelerinin izlenmesiyle belirlenmektedir. Burada tarif edilmekte olan insan disi hayvanlar tercih edilen sekliyle bir fare ya da bir siçan olabilirler. Bu basvuruda kullanildigi haliyle, "yaklasik" ve "takriben" terimleri esdegerler olarak kullanilmaktadir. Basvuruda yaklasik/takriben ifadeleri ile ya da onlarsiz kullanilan herhangi bir sayi, teknik alanda uzman bir kisinin de kabul edebilecegi herhangi bir normal dalgalanmayi kapsamaktadir. Mevcut bulusun diger özellikleri, amaçlari ve avantajlari asagidaki detayli tarifnamede belirgin bir biçimde anlatilmaktadir. Bununla birlikte, mevcut bulusun düzenlemelerini gösterirken ayrintili tarifin, sinirlama amaciyla degil, sadece açiklama amaciyla verildigi anlasilmalidir. Bulusun kapsamindaki çesitli degisiklikler ve modifikasyonlar, söz konusu ayrintili tarifnameden sonra teknik alanda uzman kisiler için asikar hale gelecektir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Tarifnameye dahil edilmis olan çizim bulusu sinirlandirmak degil, resmetmek amaciyla dahil edilmistir. Sekil 1, numaralandirilmis her bir ekzon ile endojen bir murin SIRPoi geninin (üstte) ölçeklenemeyen bir diyagramini göstermektedir. Bir insan SlRPo geninin 2-4 ekzonlari ve bölgeye özgü rekombinaz tanima bölgeleri (örnegin onP) ile çevrili bir neomisin seçim kaseti (Ub-Neo) içeren insanlastirilmis bir endojen SlRPd geni (altta) gösterilmektedir. Insan SIRPCI geninin 2-4 ekzonlarinin hedefli olarak yerlestirilmesi bir insan SIRPci proteinine karsilik gelen hücre disi bir bölgeye sahip olan insanlastirilmis bir SIRPci genini ekspres eden endojen bir gen ile sonuçlanmaktadir. Sekil 2, insanlastirilmis bir SIRPd geni için vahsi tipte ve farelerde heterozigoz SIRPd ekspresyonu bindirmesini göstermektedir. Sekil 3. insan CD34 + hücreleri ile asilanmis farkli fare suslarinda CD45+ hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. Sekil 4, insan CD34+ hücreleri ile asilanmis farkli fare suslarinda CD45+CD3+ hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. Sekil 5, insan CD34+ hücreleri ile asilanmis farkli fare suslarinda CD45+CD19+ hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. Sekil 6, Ab1'in, hCD34+ asilanmis SIRPci BRG farelerinde doza bagli bir sekilde Raji tümörlerinin büyümesini baskiladigini göstermektedir. Raji tümör hacmi, tümör implantasyonundan sonraki 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 ve 34. günlerde ölçülmüstür. Ayri ayri hayvanlar için veriler (Paneller A-D) sunulmustur. hCD34 + ile asilanmis SIRPoi BRG farelerine, 0. Günde subkütanöz olarak 2x106 Raji tümör hücresi uygulanmistir. Kontrol gruplari hiç bir antikor almamistir (tasiyici kontrol) (Panel A). Deney gruplari için 0. günde fareler 0.4 mg/kg'da (Panel B) baglanmayan kontrol Ab'nin (kontrol Ab 5) bir IP dozu ya da 0.4 mg/kg'da Ab 1 (Panel C) ya da 0.04 mg/kg (Panel D), ile tedavi edilmis ve bunu da çalismanin uzunlugu boyunca haftada iki doz takip etmistir. Tüm bireysel test gruplari için bilesik veriler Sekil 7'de gösterilmektedir. Sekil 7, Ab1'in, hCD34+ asilanmis SlRPci BRG farelerinde Raji tümörlerinin büyümesini önemli derecede baskiladigini göstermektedir. Veriler, Sekil 6'da gösterildigi gibi grup basina n=4-5 fareden gelen bilesik verileri temsil etmektedir. Veriler ortalama (SEM) olarak ifade edilmis ve önemli etkileri arastirmak için varyans analizi (ANOVA) ve post hoc testleri kullanilarak analiz edilmistir (iki yönlü ANOVA için Tukey). Verileri iki yönlü ANOVA ile analiz etmek için tasiyici kontrol grubu, Kontrol Ab 5 grubu ve Ab 1 0.4mg/kg grubunda bir fare erken ölüm nedeniyle bu bilesik grafikten çikarilmistir. Sekil 8 hCD34+ asilanmis SlRPoi BRG farelerinde Ab 1'in vücut agirligini etkilemedigini göstermektedir. Vücut agirliklari, tümör implantasyonundan sonraki 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 ve 34. günlerde ölçülmüstür. Ayri ayri hayvanlar için veriler (Paneller A-D) ölçülmüstür. hCD34 + ile asilanmis SlRPd BRG farelerine, 0. Günde subkütanöz olarak 2x106 Raji tümör hücresi uygulanmistir. Kontrol gruplari hiç bir antikor almamistir (tasiyici kontrol) (Panel A). Deney gruplari için 0. günde fareler 0.4 mg/kg'da (Panel B) IgG1 baglanmayan kontrol Ab 5iin bir IP dozu ya da 0.4 mg/kg'da Ab 1 (Panel C) ya da 0.04 mg/kg (Panel D), ile tedavi edilmis ve bunu da çalismanin uzunlugu boyunca haftada iki doz takip etmistir. TANIMLAMALAR Bu bulus belirli yöntemler ve tarif edilen deneysel kosullarla sinirli degildir; bu gibi yöntemler ve kosullar degisebilir. Ayrica, burada kullanilan terminolojinin, sadece belirli düzenlemeleri tarif etmek amaciyla oldugu ve bu bulusun kapsami istemlerle tanimlandigi için sinirlama amaci tasimadigi anlasilmalidir. Aksi belirtilmedigi sürece, burada kullanilan tüm terimler ve Ifadeler, aksi açikça belirtilmedigi sürece ya da terimin kullanildigi baglamdan açikça anlasilmadigi sürece, terimlerin ve cümlelerin teknik alanda kazanmis oldugu anlamlari içermektedir. Burada tarif edilenlere benzer ya da esdeger herhangi bir yöntem ve materyal, mevcut bulusun uygulamasinda ya da test edilmesinde kullanilabiliyor olsa da simdi belirli yöntemler ve materyaller tarif edilmektedir. Burada bir ya da daha fazla ilgilenilen degere uygulandiginda "yaklasik" terimi, belirtilen referans degerine benzer bir degeri ifade etmektedir. Belirli düzenlemelerde, "yaklasik" ya da "takriben" terimleri, aksi belirtilmedigi ya da içerikte açikça belirtilmedigi sürece belirtilen referans degerinin her iki yönünde (büyük ya da küçük) % 25,% 20, % 19, % 18, % 17, % 16, % 15, % 14, % 13, % 12, °/o 11, % 10, % 9, % 8, % 7, % 6, % 5, % 4, % 3, % 2, % 1 (ya da daha az) orani içerisine giren bir deger araligini ifade etmektedir (bu sayinin muhtemel bir degerin % 100'ünü geçecegi durumlar hariç). Burada kullanildigi sekliyle, "biyolojik olarak aktif" terimi, biyolojik bir sistemde, in vitro ya da in vivo (örnegin bir organizmada) aktivitesi olan herhangi bir maddenin bir özelligini ifade etmektedir. Örnegin, bir organizmada bulundugunda, bu organizmada biyolojik bir etkiye sahip olan bir maddenin biyolojik olarak aktif oldugu kabul edilmektedir. Bir protein ya da polipeptidin biyolojik olarak aktif oldugu özel uygulamalarda, protein ya da polipeptidin en az bir biyolojik aktivitesini paylasan o proteinin ya da polipeptidin bir kismi tipik olarak "biyolojik olarak aktif" bir kisim olarak adlandirilmaktadir. Burada kullanildigi sekliyle "karsilastirilabilir" terimi, birbirleriyle ayni olmayabilecek ancak aralarinda karsilastirmaya izin vermek için yeterince benzerlik olan, ve bu sayede de gözlenen farkliliklara ya da benzerliklere dayanarak makul sonuçlarin çikarilabilecegi iki ya da daha fazla etken, varlik, durum, kosul kümeleri vb. anlamina gelmektedir. Teknik alanda siradan uzmanliga sahip kisiler, baglam içerisinde, karsilastirilabilir olarak nitelendirilebilecek bu iki ya da daha fazla ajan, varlik, durum, sart kümesi vb. için herhangi bir kosulda ne tür bir kimligin gerekli oldugunu anlayacaktir. Burada konservatif bir amino asit substitüsyonunu tarif etmek için kullanilan "konservatif" terimi bir amino asit tortusunun, benzer kimyasal özelliklere sahip (örnegin, yük ya da hidrofobiklik) bir yan zincir R grubuna sahip olan bir baska amino asit tortusu ile ikame edilmesi anlamina gelmektedir. Genel olarak konservatif bir amino asit substitüsyonu bir proteinin, örnegin bir reseptörün bir Iiganda baglanma yetenegini ilgilendiren islevsel özelliklerini büyük ölçüde degistirmez. Benzer kimyasal özelliklere sahip yan zincirlere sahip olan amino asit gruplarinin örnekleri arasinda glisin, alanin, valin, lösin ve izolösin gibi alifatik yan zincirler; serin ve treonin gibi alifatik-hidroksil yan zincirleri; asparagin ve glutamin gibi amid içeren yan zincirler; fenilalanin, tirozin ve triptofan gibi aromatik yan zincirler; lisin, arginin ve histidin gibi bazik yan zincirler; aspartik asit ve glutamik asit gibi asidik yan zincirler; ve sistein ve metiyonin gibi kükürt içeren yan zincirler yer almaktadir. Konservatif amino asit ikame gruplari örnegin valin/Iösin/izolösin, fenilalanin/tirozin, Iisin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat ve asparagin/glutamini içermektedir. Bazi düzenlemelerde, konservatif bir amino asit ikamesi, örnegin bir alanin tarama mutajenezinde kullanildigi gibi bir protein içindeki herhangi bir dogal kalintinin alanin ile ikame edilmesi olabilir. Bazi düzenlemelerde, konservatif bir substitüsyon gerçeklestirilmistir ve bu substitüsyon Gonnet ve ark.'da açiklanan PAM250 Iog- likelihood matrisinde pozitif bir degere sahiptir. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. Bazi düzenlemelerde, ikame, orta derecede konservatif bir ikamedir, ki burada ikame PAM250 Iog-olabilirlik matrisinde negatif olmayan bir degere sahiptir. Burada kullanildigi sekliyle "bozulma" terimi, bir DNA molekülü ile (örnegin, bir gen ya da gen lokusu gibi endojen bir homolog dizi ile) bir homolog rekombinasyon olayinin sonucunu belirtmektedir. Bazi düzenlemelerde, bir bozulma, bir DNA dizisinin/dizilerinin bir eklemesini, Silinmesini, ikame edilmesini, yerine koyulmasini, yanlis mutasyonunu ya da Çerçeve kaymasini ya da bunlarin bir kombinasyonunu gerçeklestirebilir ya da temsil edebilir. Eklemeler, genlerin tamaminin ya da gen parçalarinin (örnegin endojen diziden baska bir kökeni olabilecek ekzonlar) yerlestirilmesini içerebilir. Bazi düzenlemelerde, meydana gelen bir bozulma bir gen ya da gen ürününün ekspresyonunu ve/veya aktivitesini arttirabilir (örnegin bir gen tarafindan kodlanan bir proteinin). Bazi düzenlemelerde, meydana gelen bir bozulma bir gen ya da gen ürününün ekspresyonunu ve/veya aktivitesini düsürebilir. Bazi düzenlemelerde, meydana gelebilecek bir bozulma bir genin dizilimini ya da kodlanmis olan gen ürününü (örnegin kodlanmis bir protein) degistirebilir. Bazi düzenlemelerde, meydana gelebilecek bir bozulma bir geni ya da kodlanmis olan gen ürününü (örnegin kodlanmis bir protein) kesebilir ya da parçalara ayirabilir. Bazi düzenlemelerde, bir bozulma bir geni ya da kodlanmis bir gen ürününü uzatabilir; bu gibi bazi düzenlemelerde bir bozulma, bir füzyon proteininin toplanmasini saglayabilir. Bazi düzenlemelerde, bir bozulma seviyeyi etkileyebilir fakat bir gen ya da gen ürününün aktivitesini etkilemez. Bazi düzenlemelerde, bir bozulma aktiviteyi etkileyebilir fakat bir gen ya da gen ürününün seviyesini etkilemez. Bazi düzenlemelerde, meydana gelen bir bozulma bir gen ya da bir gen ürününün seviyesi üzerinde önemli bir etkiye sahip degildir. Bazi düzenlemelerde, meydana gelen bir bozulma bir gen ya da bir gen ürününün aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip degildir. Bazi düzenlemelerde, meydana gelen bir bozulma bir gen ya da bir gen ürününün seviyesi ya da aktivitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip degildir. Burada kullanildigi sekliyle "endojen lokus" ya da "endojen gen" ifadesi burada tarif edildigi gibi bir bozulma, silme, degistirme ya da modifikasyonun uygulanmasindan önce bir ana ya da referans organizmada bulunan bir genetik lokusu belirtmektedir. Bazi düzenlemelerde, endojen lokus dogada bulunan bir diziye sahiptir. Bazi düzenlemelerde, endojen Iokus vahsi tiptir. Bazi düzenlemelerde, referans organizma vahsi tipte bir organizmadir. Bazi düzenlemelerde, referans organizma tasarlanmis bir organizmadir. Bazi düzenlemelerde, referans organizma laboratuvarda üretilmis bir organizmadir (ister vahsi tip ister tasarlanmis olsun). "Endojen promotör" ifadesi, dogal olarak, örnegin vahsi tip bir organizmada endojen bir gen ile dogal olarak iliskili bir promotörü belirtmektedir. Burada kullanildigi sekliyle "heterolog" terimi farkli bir kaynaktan bir ajani ya da varligi ifade etmektedir. Örnegin, bir polipeptit, gen ya da gen ürününe referans olarak kullanildiginda ya da belirli bir hücre ya da organizmada mevcut oldugunda terim, ilgili polipeptit, gen ya da gen ürününün 1) insanin eliyle tasarlandiginin; 2) insan eliyle (örnegin genetik mühendisligi yoluyla) hücreye ya da organizmaya (ya da bunun bir öncüsüne) sokuldugunu; ve/veya 3) ilgili hücre ya da organizma (örnegin ilgili hücre tipi ya da organizma türü) tarafindan dogal olarak üretilemez oldugunu ya da içinde mevcut olmadigini açikliga kavusturmaktadir. Burada kullanildigi sekliyle "konak hücre" terimi, içine bir heterolog (örnegin eksojen) nükleik asit ya da proteinin sokuldugu bir hücreyi belirtmektedir. Bu açiklamanin okunmasi üzerine teknik alanda tecrübeli kisiler bu terimlerin sadece belirli bir konuya yönelik degil ayni zamanda böyle bir hücrenin soyuna atifta bulunmak için kullanildigini anlayacaktir. Bazi modifikasyonlar mutasyon ya da çevresel etkiler nedeniyle birbirini takip eden nesiller boyunca meydana gelebilecegi için, bu tür soylar aslinda ana hücre ile ayni olmayabilir, ancak yine de burada kullanildigi gibi "konak hücre" terimi kapsamindadirlar. Bulusun bazi düzenlemelerinde bir konak hücre bir prokaryotik ya da ökaryotik hücredir ya da prokaryotik ya da ökaryotik hücre içermektedir. Genel olarak, bir konak hücre, hücrenin atandigi canli alemine bakilmaksizin. bir heterolog nükleik asit ya da proteini almak ve/veya üretmek için uygun olan herhangi bir hücredir. Örnek hücreler arasinda prokaryotlar ve ökaryotlar (tek hücreli ya da çok hücreli), bakteri hücreleri (örn., E. coli suslari, Bacillus spp., Streptomyces spp., vb.), mikobakteri hücreleri, mantar hücreleri, maya hücreleri (örn., S. cerevisiae , S. pombe, P. pastoris, P. metanolica, vb.), Bitki hücreleri, böcek hücreleri (örnegin, SF-9, SF-21, bakulovirüs ile enfekte edilmis böcek hücreleri, Trichoplusia ni, vb.), insan disi hayvan hücreler, insan hücreleri ya da örnegin hibridomlar ya da kuadromlar gibi hücre füzyonlari yer almaktadir. Bazi düzenlemelerde hücre bir insan, maymun, insansi maymun, hamster, siçan ya da bir fare hücresidir. Bazi düzenlemelerde, söz konusu hücre ökaryotiktir ve asagidaki hücreler arasindan seçilmektedir: CHO (örnegin, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie- CHO), COS (örnegin, CCS-7), retinal hücre, Vero, CV1, böbrek (örnegin, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepGZ, WI38, MRC 5, Co|0205, HB 8065, HL-60, (örnegin, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, L hücresi, C127 hücresi, SP2/0, NS-O, MMT 060562, Sertoli hücresi, BRL 3A hücresi, HT108O hücresi, miyelom hücresi, tümör hücresi ve yukarida bahsedilen bir hücreden türetilmis bir hücre soyu. Bazi düzenlemelerde, hücre bir ya da birden fazla viral gen içermektedir, örnegin bir viral geni ekspres eden bir retinal hücre (örnegin bir PER.06TM hücresi). Bulusun bazi düzenlemelerinde bir konak hücre izole edilmis bir hücredir ya da izole edilmis bir hücre içermektedir. Bulusun bazi düzenlemelerinde konak hücre bir dokunun parçasidir. Bulusun bazi düzenlemelerinde bir konak hücre bir organizmanin parçasidir. Burada teknik alanda anlasilan anlamina uygun olarak kullanilan "insanlastirilmis" terimi, yapilari (yani, nükleotit ya da amino asit dizileri) dogada insan disi bir hayvanda bulunan belirli bir genin ya da proteinin yapilari ile büyük ölçüde ya da tamamen özdes olan kisimlari ve ayrica ilgili spesifik insan disi gen ya da protein içinde bulunandan farkli olan ve bunun yerine karsilik gelen bir insan geninde ya da proteininde bulunan benzer yapilara daha yakin karsilik gelen kisimlari içeren nükleik asitleri ya da proteinleri ifade etmektedir. Bir "insanlastirilmis" gen, esasen bir insan polipeptidininki gibi amino asit dizisine sahip olan bir polipeptidi kodlayan bir gen olabilir (örnegin, bir insan proteini ya da bunun bir kismi - örnegin karakteristik kismi). Örnegin bir membran reseptörü söz konusu oldugunda, "insanlastirilmis" bir gen, insan hücre disi bölümününki gibi bir amino asit dizisine ve geri kalan dizi de insan disi (örnegin, fare) polipeptidindeki gibi olan hücre disi bir kisma sahip bir polipeptidi kodlayabilmektedir. Insanlastirilmis bir gen bir insan geninin tüm bir DNA dizisinin en az bir kismini içerebilir. Insanlastirilmis bir gen bir insan geninin tüm bir DNA dizilimini içerebilir. Insanlastirilmis bir protein bir insan proteininde görülen bir parçaya sahip olan bir dizi içerebilir. Insanlastirilmis bir protein, bir insan proteininin bütün bir dizisini içerebilir ve insan geninin homolog ya da ortologuna karsilik gelen insan disi bir hayvanin bir endojen Iokusundan ekspres edilmektedir. Dizilerin karsilastirilmasi ile baglantili olarak burada kullanildigi sekliyle "özdeslik" terimi, teknik alanda bilinen ve nükleotit ve/veya amino asit dizisi özdesligini ölçmek için kullanilabilecek birkaç farkli algoritma tarafindan tespit edilen özdesligi ifade etmektedir. Bazi düzenlemelerde, burada tarif edildigi gibi varliklar 10.0'Iuk bir açik bosluk cezasi, 0,1'lik bir uzatma araligi cezasi kullanan bir ClustalW v. 1.83 (yavas) hizalamasi ve bir Gonnet benzerlik matrisi kullanarak (MACVECTORTM 10.0.2, MacVector Inc., 2008) belirlenmektedir. Burada kullanildigi sekliyle "izole edilmis" terimi (1) baslangiçta üretildiginde (dogada ve/veya deneysel bir ortamda olsun) ilk olarak üretildigi zaman iliskili oldugu bilesenlerin birinden ayrilmis ve/veya (2) insan eliyle tasarlanmis, hazirlanmis ve/veya üretilmis bir madde ve/veya varligi ifade etmektedir. izole edilmis maddeler ve/veya varliklar, baslangiçta iliskili olduklari diger bilesenlerin yaklasik % 10, yaklasik % 20, yaklasik % 30, yaklasik % 40, yaklasik % 50, yaklasik % 60, yaklasik % 70, yaklasik % 80, yaklasik % 90, yaklasik % 91, yaklasik % 92, yaklasik % 93, yaklasik 94 %, yaklasik % 95, yaklasik % 96, yaklasik % 97, yaklasik % 98, yaklasik % 99 ya da yaklasik % 99'undan fazlasindan ayrilmis olabilirler. Bazi düzenlemelerde, izole edilmis ajanlar yaklasik% 80, yaklasik% 85, yaklasik % 90, yaklasik % 91, yaklasik % 92, yaklasik % 93, yaklasik % 94, yaklasik % 95, yaklasik % 96, yaklasik % 97, yaklasik % 98, yaklasik % 99 ya da yaklasik % 99'dan büyük bir oranda saftir. Burada kullanildigi sekliyle bir madde, hemen hemen hiç bir baska bilesen içermiyorsa, "saftir". Bazi düzenlemelerde, teknik alanda uzman kisilerce kolayca anlasilabilecegi üzere, bir madde, örnegin bir ya da daha fazla tasiyici ya da yardimci madde (Örnegin tampon, solvent, su, vb.) gibi bazi diger bilesenlerle birlestirildikten sonra bile "izole edilmis" ya da hatta "saf" olarak kabul edilebilir; bu tür düzenlemelerde, maddenin yüzde izolasyonu ya da safligi, bu gibi tasiyicilar ya da yardimci maddeler dahil edilmeden hesaplanmaktadir. Bir örnek vermek gerekirse, bazi düzenlemelerde, dogada olusan bir polipeptit ya da polinükleotit gibi bir biyolojik polimer, a) mensei ya da türetme kaynagi, dogada kendi dogal haliyle ona eslik eden bilesenlerin bazilari ya da tümü ile iliskili degilse; b) esas olarak ayni türün, onu dogada üreten türlerden diger polipeptitlerden ya da nükleik asitlerden arinmis olmasi; 0) bir hücreden ya da dogada onu üreten türlerden olmayan bir ekspresyon sisteminden gelen bilesenlerle ifade edildigi ya da bununla bir arada oldugu zaman "izole edilmis" sayilmaktadir. Dolayisiyla, örnegin bazi düzenlemelerde, kimyasal olarak sentezlenen ya da dogada onu üreten hücreden farkli bir hücresel sistemde sentezlenen bir polipeptit, "izole edilmis" bir polipeptit olarak kabul edilmektedir. Alternatif olarak ya da ilaveten, bazi düzenlemelerde, bir ya da daha fazla saflastirma teknigine tabi tutulmus bir polipeptit a) dogada iliski içerisinde oldugu; ve/veya b) iI üretildiginde iliski oldugu diger bilesenlerden ayrilabildigi ölçüde "izole edilmis" bir polipeptid olarak düsünülebilir. Burada kullanilan "insan disi hayvan" ifadesi, insan disi herhangi bir omurgali organizmaya karsilik gelmektedir. Bazi düzenlemelerde insan disi bir hayvan bir asiklostom, kemikli bir balik, kikirdakli bir balik (örnegin köpekbaligi ya da vatoz), bir amfibi, bir sürüngen, bir memeli ve bir kustur. Bazi düzenlemelerde, insan insan disi bir memeli primat, keçi, koyun, domuz, köpek, inek ya da kemirgendir. Bazi düzenlemelerde, insan disi hayvan bir siçan ya da bir fare gibi bir kemirgendir. Bu tarifnamede kullanildigi haliyle, "nükleik asit" ifadesi, en genis anlamiyla, bir oligonükleotid zincirine dahil edilen ya da dahil edilebilen herhangi bir bilesigi ve/veya maddeyi ifade etmektedir. Bazi düzenlemelerde bir nükleik asit bir fosfodiester bagi vasitasiyla bir oligonükleotid zincirine dahil edilen ya da dahil edilebilen bir bilesigi ve/veya maddeyi ifade etmektedir. Baglamdan da açik bir biçimde anlasilabilecegi gibi, bazi düzenlemelerde, "nükleik asit" terimi ayri ayri nükleik asit kalintilarini (örnegin nükleotitler ve/veya nükleositler) ifade etmektedir; bazi düzenlemelerde, "nükleik asit" ayri ayri nükleik asit kalintilari içeren bir oligonükleotid zinciri ifade etmektedir. Bazi düzenlemelerde, bir "nükleik asit" RNAidir ya da RNA içermektedir; bazi düzenlemelerde, bir "nükleik asit" DNA'dir ya da DNA içermektedir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit bir ya da birden fazla nükleik asit kalintisi içermekte ya da bir ya da birden fazla nükleik asit kalintisindan olusmaktadir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit bir ya da birden fazla nükleik asit analogu içermekte ya da bir ya da birden fazla nükleik asit analogundan olusmaktadir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit analogu, bir fosfodiester omurga kullanmamasi ile bir nükleik asitten ayrilmaktadir. Örnegin, bazi düzenlemelerde, teknik alanda bilinen ve omurgada fosfodiester baglari yerine peptid baglarina sahip bir ya da daha fazla "peptid nükleik asidi" içeren ya da bunlardan olusan bir nükleik asit mevcut bulus kapsaminda degerlendirilmektedir. Alternatif olarak ya da ilaveten, bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit fosfodiester baglari yerine bir ya da birden fazla fosforotiyoat ve/veya 5,-N-fosforamidit baglantisina sahip olabilir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit bir ya da birden fazla dogal nükleosit içermekte ya da bir ya da birden fazla nükleositten olusmaktadir (örnegin, adenosin, timidin, guanozin, sitidin, üridin, deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksiguanozin ve deoksisitidin). Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit bir ya da birden fazla nükleosid analogu içermekte ya da bir ya da birden fazla nükleosid analogundan olusmaktadir (örnegin, 2-aminoadenosin, 2-tiy0timidin, inosin, pirrolo-pirimidin, 3-metil adenosin, 5- metilsitidin, C-5-propiniI-sitidin, C-5-propiniI-üridin, 2-aminoadenosin, C5-bromouridin, CS-floroüridin, C5-iyod0üridin, C5-propinil-üridin, C5-pr0piniI-sitidin, C5-metilsitidin, 2- aminoadenosin, 7-deazaadenosin, 7-deazaguanosin, 8-oksoadenosin, 8- oksoguanosin, O (6) -metilguanin, 2-tiyositidin, metillenmis bazlar, ardalanmis bazlar ve bunlarin kombinasyonlari). Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit dogal nükleik asitlerde bulunanlarla karsilastirildiginda, bir ya da daha fazla modifiye seker (örnegin, 2'-flor0riboz, riboz, 2'-deoksiriboz, arabinoz ve heksoz) içermektedir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit bir RNA ya da bir protein gibi bir fonksiyonel gen ürününü kodlayan bir nükleotit dizisine sahiptir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit bir ya da birden fazla intron içermektedir. Bazi düzenlemelerde, nükleik asitler dogal bir kaynaktan bir ya da daha fazla izolasyonla, tamamlayici bir sablona (in vivo ya da in vitro) dayali bir polimerizasyonla enzimatik sentezleme, rekombinant bir hücre ya da sistemde üreme ve kimyasal sentez yoluyla hazirlanmaktadir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit en az 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ya da daha fazla kalinti uzunlugundadir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit tek sarmalli bir nükleik asittir; bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit çift sarmalli bir nükleik asittir. Bazi düzenlemelerde bir nükleik asit bir polipeptidi kodlayan en az bir elemani içeren bir nükleotit dizisine sahiptir ya da bir polipeptidi kodlayan bir dizinin tamamlayicisidir. Bazi düzenlemelerde, bir nükleik asit enzimatik aktiviteye sahiptir. Burada kullanildigi sekliyle "islevsel olarak bagli" ifadesi, burada tarif edilen bilesenlerin amaçlanan sekilde çalismalarina izin veren bir iliski içinde olduklari bir yan yana koyma anlamina gelmektedir. Bir kodlama dizisine "islevsel olarak bagli" bir kontrol dizisi, kodlama dizisinin ekspresyonunun kontrol dizileriyle uyumlu kosullar altinda elde edilebilecegi sekilde baglanmaktadir. "islevsel olarak baglanmis" diziler hem ilgi konusu genlerle bitisik olan ekspresyon kontrol dizilerini ve hem de ilgili geni kontrol etmek için trans ya da bir mesafede hareket eden ekspresyon kontrol dizilerini içermektedir. Burada kullanildigi sekliyle "ifade kontrol dizisi" terimi, baglandiklari kodlama dizilerinin ekspresyonunu ve prosesini etkilemek için gerekli olan polinükleotid dizilerini ifade etmektedir. Ekspresyon kontrol dizileri uygun transkripsiyon baslatma, sonlandirma, destekleme ve arttirma dizilerini; ekleme ve poliadenilasyon sinyalleri gibi verimli RNA islem sinyallerini; sitoplazmik mRNA'yi stabilize eden dizileri; translasyon verimliligini artiran dizileri (yani Kozak konsensüs dizisi); protein stabilitesini artiran dizileri; ve istendiginde, protein salgisini artiran dizileri kapsamaktadir. Bu gibi kontrol dizilerinin dogasi konak organizmaya bagli olarak degisiklik göstermektedir. Örnegin prokaryotlarda bu gibi kontrol dizileri genel olarak promotörü, ribozomal baglanma alanini ve transkripsiyon sonlandirma dizisini içerirken ökaryotlarda tipik olarak bu gibi kontrol dizileri, promotörleri ve transkripsiyon sonlandirma dizisini içermektedir. "Kontrol dizileri" terimi, varligi ekspresyon ve proses için vazgeçilmez olan bilesenleri içermeyi amaçlamaktadir ve ayrica örnegin lider diziler ve füzyon ortagi diziler gibi varligi avantajli olan ilave bilesenleri de içerebilir. Burada kullanildigi sekliyle "polipeptid" terimi amino asitlerin herhangi bir polimerik zincirini ifade etmektedir. Bazi düzenlemelerde, bir polipeptid dogada bulunan bir amino asit dizisine sahiptir. Bazi düzenlemelerde, bir polipeptid dogada var olmayan bir amino asit dizisine sahiptir. Bazi düzenlemelerde, bir polipeptid insanlar tarafindan tasarlanmis ve/veya insan müdahalesi yoluyla üretilmis bir amino asit dizisine sahiptir. Burada kullanildigi sekliyle "rekombinant" terimi, bir konak hücreye transfekte edilmis bir rekombinant ekspresyon vektörü kullanilarak ekspres edilen polipeptitler, rekombinant, kombinatoryal insan polipeptid kütüphanesinden izole edilen polipeptitler (Hoogenboom H. R., (1997) TlB Tech. 15:62-70;Azzazy H., and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) lmmunology Today 21:371-378), insan immünoglobulin genleri için transjenik olan bir hayvandan (örnegin bir fareden) izole edilmis antikorlar (bkz. örn., Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) lmmunology Today 21:364-370) ya da seçilen dizilim elemanlarini uçlarindan birbirine birlestirmeyi içeren baska herhangi bir yolla hazirlanan, ekspres edilen, olusturulan ya da izole edilen polipeptitler gibi rekombinant araçlar tarafindan tasarlanmis, gerçeklestirilmis, hazirlanmis, ekspres edilmis, yaratilmis ya da izole edilmis polipeptidleri ( örnegin burada tarif edilen sinyal düzenleyici proteinler) ifade etmektedir. Bazi düzenlemelerde, seçilen bu gibi dizi elemanlarindan biri ya da birkaçi dogada bulunmaktadir. Bazi düzenlemelerde, seçilen bu gibi dizi elemanlarindan biri ya da birkaçi silicoda dizayn edilmistir. Bazi düzenlemelerde, bu gibi seçilmis dizi elemanlarindan bir ya da birden fazlasi bilinen bir dizi elemaninin, örnegin dogal ya da sentetik bir kaynaktan mutagenezi (örnegin in vivo ya da in vitro) ile elde edilmektedir. Örnegin bazi düzenlemelerde, bir rekombinant polipeptid ilgi konusu bir kaynak organizmanin (örnegin insan, fare v.b.) genomunda bulunan dizilerden olusmaktadir. Bazi düzenlemelerde, bir rekombinant polipeptit, mutajenezden (örnegin in vitro ya da in vivo, örnegin insan disi bir hayvanda) kaynaklanan bir amino asit dizisine sahiptir, ki bu nedenle amino asit dizileri rekombinant polipeptitler, polipeptit dizilerinden köken alirken ve bunlarla iliskiliyken, iri vivo olarak insan disi bir hayvanin genomunda dogal olarak bulunmayan dizilerdir. Burada kullanildigi sekliyle "replasman" terimi bir konak lokusta bulunan (örnegin bir genomda) bulunan "degistirilmis" bir nükleik asit dizisinin (örnegin bir gen) o lokustan çikarildigi ve yerine farkli bir "replasman" nükleik asidin yerlestirildigi bir prosesi ifade etmektedir. Bazi düzenlemelerde, ikame edilmis nükleik asit dizisi ve replasman nükleik asit dizileri birbirleriyle karsilastirilabilirdir, söyle ki, örnegin bunlar birbirine homologtur ve/veya karsilik gelen elementleri (örnegin, protein kodlayan elementler, düzenleyici elementler, vb.) içermektedirler. Bazi düzenlemelerde, degistirilmis bir nükleik asit dizisi bir ya da birden fazla promotör, bir arttirici, bir ek donör bölgesi, bir ek alici bölge, bir intron, bir ekzon, çevrilmemis bir bölge (UTR) içermektedir; bazi düzenlemelerde, bir replasman nükleik asit dizisi bir ya da daha fazla kodlama dizisi içermektedir. Bazi düzenlemelerde, bir replasman nükleik asit dizisi yeri degistirilen nükleik asit dizisinin bir homologudur. Bazi düzenlemelerde, bir replasman nükleik asit dizisi yeri degistirilen dizinin bir ortologudur. Bazi düzenlemelerde, bir replasman nükleik asit dizisi bir insan nükleik asit dizisidir ya da bir insan nükleik asit dizisi içermektedir. Replasman nükleik asit dizisinin bir insan nükleik asit dizisi oldugu ya da bir insan nükleik asit dizisi içerdigi bazi düzenlemelerde, yer degistirilen nükleik asit dizisi bir kemirgen dizisidir ya da bir kemirgen dizisi içermektedir (örnegin bir fare dizisi). Böyle yerlestirilen nükleik asit dizisi, yerlestirilen diziyi elde etmek için kullanilan kaynak nükleik asit dizisinin bir parçasi olan bir ya da daha fazla düzenleyici diziyi içerebilir (örnegin, promotörler, arttiricilar, 5' ya da 3'-çevrilmemis bölgeler, vb.). Örnegin çesitli düzenlemelerde, yer degistirme, bir gen ürününün bu sekilde yerlestirilen nükleik asit dizisinden üretilmesiyle sonuçlanan bir heterolog dizilim ile bir endojen dizinin bir ikame edilmesidir (heterolog diziyi içerir), fakat endojen bir dizinin ekspresyonu degildir; yer degistirme, endojen dizi tarafindan kodlanan bir protein ile benzer bir isleve sahip olan bir proteini kodlayan bir nükleik asit dizisine sahip bir endojen genomik dizilimdir (örnegin, endojen genomik dizi bir SIRPd proteinini kodlar ve DNA parçasi bir ya da daha fazla kodlar) insan SIRPd proteinleri). Çesitli düzenlemelerde, bir endojen gen ya da onun bir parçasi karsilik gelen bir insan geni ya da parçasi ile degistirilmektedir. Karsilik gelen bir insan geni ya da bunun bir fragmani, ortolog olan ya da büyük ölçüde benzer olan ya da bunun yapisi ve/veya fonksiyonunda, endojen gen ya da bunun fragmani olarak degistirilen bir insan geni ya da fragmanidir. Burada kullanildigi sekliyle "sinyal düzenleyici protein" ya da "SIRP" ifadesi, bir sinyal düzenleyici protein reseptörüne, örnegin bir SIRPoi reseptörüne karsilik gelmektedir. SIRP genleri, bir hücre yüzeyinde ekspres edilen ve Iökositlerin üzerindeki membran yüzey proteinleri arasindaki etkilesimlerde yer alan düzenleyici bir protein görevi gören bir plazma membran reseptörü içermektedir. SlRP genleri arasindaki polimorfik varyasyonlar insan denekler içinde tarif edilmistir. Örnekleme yoluyla, bir insan ve fare SlRP geninin nükleotit ve amino asit dizileri Tablo 1'de saglanmaktadir. Teknik alanda beceri ve bilgi sahibi kisiler bu tarifnameyi okuduklarinda bir genomda (ya da hepsinde) bir ya da daha fazla endojen SIRP reseptörü geninin, bir ya da daha fazla heterolog SIRP geniyle degistirilebilecegini anlayacaktir (örnegin polimorfik varyantlar, alt tipler ya da mutantlar, baska türlerden genler, insanlastirilmis formlar, vb.). Burada kullanildigi sekliyle bir "SlRP ekspres eden hücre", bir sinyal düzenleyici protein reseptörünü ekspres eden bir hücreye karsilik gelmektedir. Bazi düzenlemelerde, SlRP ekspres eden bir hücre, yüzeyinde bir sinyal düzenleyici protein reseptörü ekspres etmektedir. Bazi düzenlemelerde SIRP proteini yoluyla hücre-hücre etkilesimlerine aracilik etmek için yeterli bir miktarda hücre yüzeyinde ekspres edilen bir SlRP proteini, hücre yüzeyinde ekspres edilmektedir. Örnek SlRP ekspres eden hücreler, nöronlari, lenfositleri, miyeloid hücreleri, makrofajlari, nötrofilleri ve dogal öldürücü (NK) hücreleri içermektedir. SIRP ekspres eden hücreler, çesitli yabanci antijenlere ya da patojenlere bagisiklik tepkisini düzenlemek için bagisiklik hücrelerinin etkilesimini düzenlemektedir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar, insan disi hayvanlarin bir ya da birden fazla hücresinin yüzeyinde ekspres edilen insanlastirilmis SIRP reseptörleri vasitasiyla bir bagisiklik hücresi regülasyonu sergileyebilirler. Bu tarifnamede kullanildigi sekliyle, "esasen" terimi, ilgilenilen bir özelligin ya da nemanin toplam ya da toplama yakin sinirini ya da derecesini sergilemenin nitel durumunu ifade etmektedir. Biyolojik tekniklerde standart bilgiye sahip bir kisinin de anlayacagi üzere, biyolojik ve kimyasal olaylar nadiren tam sonuçlanir ve/veya bir sonuca dogru ilerler ya da mutlak bir sonuca ulasir ya da bundan kaçinir. Bu nedenle, "esasen" terimi, birçok biyolojik ve kimyasal fenomenin dogasinda var olan eksiksizligin potansiyel eksikligini yakalamak için burada kullanilmaktadir. Burada kullanildigi sekliyle "önemli derecede homoloji" ifadesi, amino asit ya da nükleik asit dizileri arasindaki bir karsilastirmayi ifade etmektedir. Teknik alanda siradan uzmanliga sahip kisilerce de takdir edilecegi gibi, iki dizi karsilik gelen pozisyonlarda homolog kalintilar içermeleri durumunda genellikle "büyük ölçüde homolog" olarak kabul edilmektedir. Homolog kalintilar özdes kalintilar olabilir. Alternatif olarak, homolog kalintilar, uygun sekilde benzer yapisal ve/veya fonksiyonel özelliklere sahip özdes olmayan kalintilar olabilir. Örnegin, teknik alanda siradan uzmanliga sahip kisilerce iyi bilindigi üzere belirli amino asitler tipik olarak "hidrofobik" ya da "hidrofilik" amino asitler olarak siniflandirilmakta ve/veya "polar" ya da "polar olmayan" yan zincirlere sahip olarak siniflandirilmaktadir. Bir amino asidin ayni tipte bir baskasi Için ikame edilmesi genellikle "homolog" bir ikame olarak kabul edilebilir. Tipik amino asit kategorizasyonlari Tablo 1 ve 2'de özetlenmistir. Alanin Arjinin Asparagin Aspartik asit Sistein Glutamik asit Glutamin Glisin Histidin Isolösin Lösin Lisin Metionin Fenilalanin Proline Serin Treonin Ala Arg Asn Asp Cys Glu Gln Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr TABLO 1 A nonpolar R polar N polar D polar C nonpolar E polar Q polar G nonpolar H polar I nonpolar L nonpolar K polar M nonpolar F nonpolar P nonpolar S polar T polar nötr pozitif nötr negatif nötr negatif nötr nötr pozitif nötr nötr pozitif nötr nötr nötr nötr nötr Triptofan Trp W nonpolar nötr -O.9 Tirozin Tyr Y polar nötr -1.3 Valin Val V nonpolar nötr 4.2 TABLO 2 Belirsiz Amino Asitler 3 -Harf 1 -Harf Asparagin ya da aspartik asit Asx B Glutamin ya da glutamik asit Glx Z Lösin ya da izolösin Xle J Belirtilmemis ya da bilinmeyen amino asit Xaa X Bu teknik alanda da iyi bilindigi üzere, amino asit ya da nükleik asit dizileri, nükleotit dizileri için BLASTN ve BLASTP, bosluklu BLAST ve amino asit dizileri için PSI- BLAST gibi ticari bilgisayar programlarinda mevcut olanlar dahil olmak üzere çesitli algoritmalarin herhangi biri kullanilarak karsilastiriIabilmektedir. Bu gibi programlara örnekler Altschul, ve ark., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, ve ark., Methods in Enzymology; Altschul ve ark., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis ve ark., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, ve ark., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999 ek olarak, yukarida belirtilen programlar tipik olarak homologlugun bir derecesini de göstermektedir. Bazi düzenlemelerde, iki dizi, karsilik gelen kalintilarinin en az % 50, % 55, % 60, % 65, % 70, % 75, % 80, % 85, % 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97, % 98, % 99 ya da daha fazlasi ilgili bir kalinti uzamasi üzerinde homolog ise büyük oranda homolog kabul edilmektedir. Bazi düzenlemelerde, ilgili uzama tam bir dizidir. Bazi düzenlemelerde, ilgili uzama en az 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ya da daha fazla kalintidir. Bazi düzenlemelerde, ilgili uzama tam bir dizi boyunca kesintisiz kalintilar içermektedir. Bazi düzenlemelerde, ilgili uzama tam bir dizi boyunca kesintili kalintilar içermektedir. Bazi düzenlemelerde, ilgili uzama en az 10, , 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ya da daha fazla kalintidir. Burada kullanildigi sekliyle "önemli derecede özdeslik" ifadesi, amino asit ya da nükleik asit dizileri arasindaki bir karsilastirmayi ifade etmektedir. Teknik alanda siradan uzmanliga sahip kisilerce de takdir edilecegi gibi, iki dizi karsilik gelen pozisyonlarda ayni kalintilari içermeleri durumunda genellikle "büyük ölçüde özdes" olarak kabul edilmektedir. Bu teknik alanda da iyi bilindigi üzere, amino asit ya da nükleik asit dizileri, nükleotit dizileri için BLASTN ve BLASTP, bosluklu BLAST ve amino asit dizileri için PSI-BLAST gibi ticari bilgisayar programlarinda mevcut olanlar dahil olmak üzere çesitli algoritmalarin herhangi biri kullanilarak karsilastirilabilmektedir. Bu gibi programlara örnekler Altschul, ve ark., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, ve ark., Methods iri EnzymoIOQY; Altschul ve ark., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis ve ark., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, ve ark., (eda), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999 Özdes dizileri tanimlamaya ek olarak, yukarida belirtilen programlar tipik olarak özdesligin bir derecesini de göstermektedir. Bazi düzenlemelerde, iki dizi, karsilik gelen kalintilarinin en az % 50, % 55, % 60, % 65, % 70, % 75, % 80, % 85, % 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97, % 98, % 99 ya da daha fazlasi kalintilarin ilgili bir uzamasi boyunca özdes olmasi halinde büyük oranda özdes kabul edilmektedir. Bazi düzenlemelerde, ilgili uzama tam bir dizidir. Bazi düzenlemelerde, ilgili uzama en az 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ya da daha fazla kalintidir. Burada kullanildigi sekliyle "hedefleme vektörü" ya da "hedefleme yapisi" ifadesi, bir hedefleme bölgesi içeren bir polinükleotit molekülünü belirtmektedir. Bir hedefleyici bölge bir hedef hücre, doku ya da hayvandaki bir dizilim ile ayni ya da büyük ölçüde özdes bir diziyi içermektedir ve hedefleyici yapinin homolog rekombinasyon yoluyla hücre, doku ya da hayvanin genomu içindeki bir pozisyona entegrasyonunu saglamaktadir. Bölgeye özgü rekombinaz tanima bölgelerini (örnegin, loxP ya da Frt bölgeleri) kullanarak hedefleme yapan bölgelerin hedeflemesi de dahil edilmistir. Bazi düzenlemelerde, bu bulusun bir hedefleyici yapisi ayrica özel ilgi duyulan bir nükleik asit dizisi ya da geni, seçilebilir bir isaretleyiciyi, kontrol ve ya da düzenleyici dizileri, ve bu gibi dizileri içeren rekombinasyona yardimci olan ya da bunu kolaylastiran proteinlerin ekzojen ilavesiyle aracilik edilen rekombinasyona izin veren diger nükleik asit dizilerini içermektedir. Bazi düzenlemelerde, mevcut bulusun bir hedefleyici yapisi ayrica tamamen ya da kismen bir ilgi konusu geni içermektedir; burada ilgilenilen gen, bir endojen dizinin kodladigi bir protein ile tamamen ya da kismen bir proteini sifreleyen bir proteini tamamen ya da kismen kodlayan bir heterolog gendir. Burada kullanildigi sekliyle "varyant" terimi, referans varlik ile büyük oranda özdes olan ancak referans varlik ile karsilastirildiginda, bir ya da birden fazla kimyasal kismin varliginda ya da seviyesinde referans varliktan yapisal olarak farklilik gösteren bir varligi ifade etmektedir. Bir çok düzenlemede, bir varyant ayrica islevsel olarak da referans varligindan farklidir. Genel olarak, belirli bir varligin uygun sekilde bir referans varligin "degiskeni" olarak kabul edilip edilmedigi, referans varlik ile yapisal özdesliginin derecesine dayanmaktadir. Teknik alanda uzman kimselerin de takdir edecegi gibi herhangi bir biyolojik ya da kimyasal referans varlik belirli karakteristik yapisal elemanlara sahiptir. Bir varyant, tanimi geregi, bir ya da daha fazla bu karakteristik yapisal elemani paylasan ayri bir kimyasal varliktir. Birkaç örnek vermek gerekirse, küçük bir molekül, karakteristik bir çekirdek yapisal elemana (örnegin, bir makrosiklik çekirdek) ve/veya bir ya da daha fazla karakteristik sarkik kisma sahip olabilir böylece küçük molekülün bir çesidi, çekirdek yapisal elemani ve karakteristik sarkan kisimlari paylasan, ancak diger sarkan kisimlarda ve/veya çekirdek içinde mevcut bulunan bag tiplerinde (tekli ya da ikili, E ve Z, vb.) farklilik gösteren bir degiskendir, bir polipeptit, dogrusal ya da üç boyutlu uzayda birbirlerine göre belirlenmis pozisyonlara sahip ve/veya belirli bir biyolojik fonksiyona katkida bulunan çok sayida amino asitten olusan bir karakteristik dizi elemanina sahip olabilir, bir nükleik asit, dogrusal ya da üç boyutlu uzayda bir baskasina göre belirlenmis pozisyonlara sahip çok sayida nükleotit kalintisindan olusan bir karakteristik dizi elemanina sahip olabilir. Örnegin bir varyant polipeptit amino asit dizisindeki bir ya da daha fazla farkin ve/veya polipeptit omurgasina kovalent olarak baglanmis kimyasal kisimlardaki (örnegin karbonhidratlar, Iipitler, vb.) bir ya da daha fazla farkin bir sonucu olarak bir referans polipeptitten farkli olabilir. Bazi düzenlemelerde, bir varyant polipeptit, bir referans polipeptid ile en % 85, % 86, % 87, % 88, % 89, °/o 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97 ya da % 99 oraninda benzer bir bütün dizilim özdesligi sergilemektedir. Alternatif olarak ya da ilaveten bazi düzenlemelerde, bir varyant polipeptid, bir referans polipeptidle en az bir karakteristik dizi elemanini paylasmamaktadir. Bazi düzenlemelerde, referans polipeptid bir ya da birden fazla biyolojik aktiviteye sahiptir. Bazi düzenlemelerde, bir varyant polipeptid, referans polipeptidin biyolojik aktivitelerinden bir ya da birden fazlasini paylasmaktadir. Bazi düzenlemelerde, bir varyant polipeptid, referans polipeptidin biyolojik aktivitelerinden bir ya da birden fazlasina sahip degildir. Bazi düzenlemelerde, bir varyant polipeptit, referans polipeptit ile karsilastirildiginda bir ya da daha fazla azaltilmis biyolojik aktivite seviyesi sergilemektedir. Birçok düzenlemede, ilgilenilen bir polipeptidin, ebeveyninkiyle ayni olan ancak belirli pozisyonlardaki az sayida dizi degisikligi için bir amino asit dizisine sahip olmasi durumunda bir ebeveyn ya da referans polipeptidinin bir "varyanti" oldugu kabul edilmektedir. Ebeveynle mukayese edildiginde, tipik olarak varyanttaki kalintilarin % , % 15, % 10, % 9, % 8, % 7, % 6, % 5, % 4, % 3, % 2"den azi ikame edilmistir. Bazi düzenlemelerde, bir varyant, bir ebeveyne kiyasla 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ya da 1 ikame edilmis tortuya sahiptir. Genellikle, bir varyant çok az sayida (örnegin, 5, 4, 3, 2 ya da 1'den az) ikame edilmis fonksiyonel kalintilara (örnegin belirli bir biyolojik aktiviteye katilan kalintilar) sahiptir. Ayrica, bir varyant tipik olarak en fazla 5, 4, 3, 2 ya da 1 ilave ya da silmeye sahiptir ve çogu zaman ebeveyne kiyasla herhangi bir ilaveye ya da silmeye sahip degildir. Bundan baska, herhangi bir ekleme ya da silme islemi tipik olarak yaklasik 25, yaklasik 20, yaklasik 19, yaklasik 18, yaklasik 17, yaklasik 16, yaklasik 15, yaklasik 14, yaklasik 13, yaklasik 10, yaklasik 9, yaklasik 8, yaklasik 7, yaklasik 6 kalintidan azdir ve genel olarak yaklasik 5, yaklasik 4, yaklasik 3 ya da yaklasik 2 kalintidan azdir. Bazi düzenlemelerde, ebeveyn ya da referans polipeptidi dogada bulunan türde bir polipeptittir. Teknik alanda siradan uzmanliga sahip kisilerce de anlasilacagi üzere, ilgilenilen belirli bir polipeptidin çok sayida varyanti, özellikle ilgilenilen polipeptit, bulasici bir ajan polipeptidi oldugunda dogada yaygin olarak bulunabilir. Burada kullanildigi sekliyle "vektör" terimi iliskili oldugu baska bir nükleik asidi nakledebilen bir nükleik asit molekülünü ifade etmektedir. Bazi düzenlemelerde, vektörler ökaryotik ve/veya prokaryotik hücre gibi bir konakçi hücrede baglandiklari nükleik asitlerin ekstra kromozomal replikasyonu ve/veya ekspresyonunu gerçeklestirebilme yetisine sahiptirler. Operasyonel olarak bagli genlerin ekspresyonunu yönlendirebilen vektörler burada "ekspresyon vektörleri" olarak adlandirilmaktadir. Burada kullanildigi sekliyle "vahsi-tip" terimi ilgili teknik alanda, dogada oldugu gibi normal bir durum ya da baglamda (mutant, düzeltilmis, degistirilmis v.b.'nin tam tersi) bir yapiya ve/veya aktiviteye sahip olan anlaminda kullanilmaktadir. Teknik alanda standart bir uzmanliga sahip kisiler vahsi tip genlerin ve polipeptidlerin genellikle çok sayida farkli formda mevcut olabilecegini takdir edecektir (örnegin aleller). AYRINTILI TARIFNAME Diger seylerin yanisira burada transplant asilamasi, fagositoz aktivasyonu ve sinyal iletimindeki analizler için sinyal düzenleyici bir proteini (örn., SlRP'Ier) kodlayan hümanize genetik materyale sahip olan ve/veya tasarlanan insan disi hayvanlar tarif edilmektedir. Bu gibi insan disi hayvanlarin, insan hücrelerinin transplant asilamasinda bir gelisme sagladigi tasarlanmaktadir. Bu nedenle, mevcut tarifname insan disi hayvanlarda insan hematopoetik hücrelerinin korunmasi açisindan özellikle faydalidir. Özellikle mevcut tarifname insan disi bir hayvanin hücrelerinin plazma zari yüzeyi üzerinde insanlastirilmis bir proteinin ekspresyonuna yol açan bir kemirgen SlRPd geninin insanlastirilmasini kapsamaktadir. Bu gibi insanlastirilmis proteinler, asilanmis insan hücrelerinin yüzeyinde mevcut olan insanlastirilmis SIRPd proteinlerinin ve ligandlarinin birlesmesi yoluyla asilanmis insan hücrelerini tanima kapasitesine sahiptir. Burada, nakledilen insan hematopoetik hücrelerini alabilen insan disi hayvanlar tarif edilmektedir; bu tür insan disi memeliler, insan hücrelerini içeren bir bagisiklik sistemi gelistirebilir ve/veya sahip olabilir. insanlastirilmis SIRPd proteinleri, bir insan SIRPo proteininin 28-362. amino asit kalintilarina karsilik gelen dizilere sahip olabilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar, insan disi hayvan ve bir heterolog türden (örnegin bir insan) genetik materyal içeren bir endojen SlRPoi geni içerebilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar bir insanlastirilmis SIRPC( geni içerebilir, ki burada insanlastirilmis SIRPoi geni, bir insan SIRPC( geninin 2, 3 ve 4. ekzonlarini içermektedir. Bulusun çesitli yönleri asagidaki bölümlerde detayli bir biçimde anlatilmaktadir. Bölümlerin kullanimi, bulusu sinirlama amacinda degildir. Her bölüm, bulusun herhangi bir yönüne uygulanabilir. Bu basvuruda, aksi belirtilmedigi sürece, "ya da" ifadesi "ve/veya" anlamina gelmektedir. Sinyal Düzenleyici Protein (SIRP) Gen Ailesi Sinyal düzenleyici proteinler (SlRP'Ier), Ienfositler, miyeloid hücreler (makrofajlar, nötrofiller, granülositler, miyeloid dendritik hücreler ve mast hücreleri dahil) ve nöronlar üzerinde ekspres edilen bir hücre yüzeyi glikoprotein ailesini olusturmaktadir (örnegin, bakiniz Barclay and Brown, 2006, Nat Rev Immunol 6, 457-464). Bildirilen birkaç SIRP geni mevcuttur ve söz konusu bu genler kendi karsilik gelen ligandlari ve dahil olduklari sinyal türleri ile kategorize edilebilir. SIRPd (ayrica CD172A, SHPSl, PS4, MYD-1, BIT ve PTPNS1 olarak da bilinmektedir), miyeloid neslinin immün hücreleri üzerinde ekspres edilmekte ve bir immünoreseptör tirozin bazli inhibitör motifi (lTIM) yoluyla inhibitör reseptör olarak islev görmektedir. SIRPoi ekspresyonu ayrica nöronlarda da gözlenmistir. SIRPa için bildirilen Iigandlar, en önemli olarak CD47'yi içermekle birlikte ayrica yüzey aktif madde proteinleri A ve D'yi de içermektedir. SIRPB (ayrica CDi72b olarak da bilinmektedir) makrofajlar ve nötrofiller üzerinde ekspres edilmektedir, ancak bilinen hiçbir ligand bildirilmemistir. SIRPß, SIRPa'ya kiyasla kisa bir sitoplazmik bölge içermektedir ve DNAX aktivasyon proteini 12 (DAP12) olarak bilinen bir sinyallesme bileseni ile iliskili oldugu bilinmektedir. Bu nedenle de, SIRPß'nin aktive edici bir reseptör oldugu düsünülmektedir. SIRPV (ayrica CD1729 ve SIRPß2 olarak da bilinmektedir) Ienfositlerde ve dogal öldürücü hücrelerde ekspres edilmektedir ve ayrica CD47'ye baglanmaktadir, ancak sitoplazmik kuyruk sadece dört amino asit içerdiginden ve DAP12 ile birlesmeyi kolaylastiracak bir diziden de yoksun oldugundan hiçbir sinyal islevi rapor edilmemistir. Bir diger üye, SlRPö daha önce tarif edilmistir ve çözünebilir bir reseptör seklinde mevcuttur. Özellikle SlRPd'nin rolü, konak hücrelerin fagositozunda makrofajlar tarafindan inhibe edici rolü açisindan arastirilmistir. Örnegin, makrofajlarda SlRPoi'ya baglanan CD47, fagositozu negatif olarak düzenleyen inhibitör sinyallerini tetiklemektedir. Alternatif olarak, SIRPO( baglanmasinin aracilik ettigi pozitif sinyallesme etkileri de bildirilmistir (Shultz ve ark., 1995, J Immunol 154, 180-91). SIRPa Dizileri Insan ve fareler için örnek SlRPoi dizileri Tablo 3'te verilmektedir. cDNA dizileri için ardisik ekzonlar, birbirini takip eden alti çizili metinlerle ayrilmaktadir. Protein dizileri için sinyal peptitlerinin alti çizilidir ve transmembran ve sitoplazmik diziler itaIik yazilmistir. Fare SIRPoi cDNA NM_OO7547.3 TABLO 3 Fare SIRP Proteini NP_031573.2 Insan SIRP DNA NM 0010400221 GAGGGAGAAAGGAACAAGGCAAGGGAAGATGTGTAGCTTTG GCTTTAACCAGGCAGC`CTGGGGGCTCCCAAGCCTATGGAACC CTGGTACAAAGAAGAGAACAGAAGCGCCCTGTGAGGAGTGG GATTTGTTTTTCTGTAGACCAGATGAGAAGGA AACAGGCC CT GTTTTGTACATAGTTGCAACTTAAAATTTTTGGCTTGCAAAAT ATTTTTGTAATAAAGATTTCTGGGTAACAATAAAAAAAAAAA AAAAAA (SEQ ID No:1) MEPAGPAPGRLGPLLLCLLLSASCFCTGATGKELKVTQPEKSVSV AAGDSTVLNCTLTSLLPVGPIRVVYRGVGPSRLLIYSFAGEYVPRI RNVSDTTKRNNMDFSIRISNVTPADAGIYYCVKFQKGSSEPDTEI QSGGGTEVY V LAKPSPPEVSGPADRGI PDQKVN FTCKSHGFSPRN [TLKWFKDGQELHPLETTVNPSGKNVSYNISSTVRVVLNSMDVN SKVICEVAHITLDRSPLRGIANLSNFIRVSPTVKVTQQSPTSMNQV NLTCRAERFYPEDLQ LIWLENGNVSRNDTPKNLTKNTDGTYNYT SLFLVNSSAHREDVVFTCQVKHDQQPAITRNHTVLGFAHSSDQG SMQTF PDNNA T HN WNVF 1 G VG VA CA LL VVLLAIAAL YLLRIKQKKAK GS TSS T RLH EPEK NA RE] T QI QD TNDINDI TYA DLNLPKEKKPAPRAP EPNNHTE YASIETGKVPRPEDTL TYA DLD/WVHLSRA QPA PKPEPSF S EYASVQVQRK (SEQ ID NO: 2) Insan SIRPa Proteini NP_ 0010351 1 1.1 Insanlastirilmis SIRPa Proteini MEPAGPAPGRLGPLLCLLLAASCAWSGVAGEEELQVIQPDKSVL VAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPR VTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEF KSGAGTE LS VRA KPSA PV VSGPAA RATPQHTVS FIC ESHGFSPRD ITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVVLTREDVHS QVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIRVPPTLEVTQQPVRAENQV NVTCQVRKFYPQRLQLTWI_ENGNVSRTETASTVTENKDGTYNW MSWLLVNVSAHRDDVK LTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVSAHPK EQGSNTAAENTGSNERNI 2'1 WG VVCTLL l-'ALLMAAL YL I'RJRQKKA QGS TSS TRL HEPEKNA REITQDTNDITYA DLNLPKGKKR4 PQAAEPN NHTE YA SIQ TSPQPA SED TL TYA DL DMVHL NR TPKQPA PKPEPSFSEY Asz-'QVPRK (SEQ ID NO: 4) MEPAGPAPGRLGPLLLCLLLSASCFCTGVAGEEELQVIQPDKSVL VAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYN QKEGHFPR VTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEF KSGAGTELSVRAKPSAPVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRD ITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSYSIHSTAKVV LTREDVHS QVIC EVAHVT LQGDPLRGTAN LSETIRVPPTLEVTQQPVRA ENQV NVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGN VSRTETASTVTEN KDGTYN W M SWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHD LK VSAH PK EQGSNTAADNNA THNWNVFIG VC VA CALL I'VLLi'l/IAAL YLLRIKQKK AK GS TSS TRLHEPEKNAREI T QI QD TNDINDI T YADLNLPKEKKPA PR APEPNNHTE YASIETGK VPRPEDTLTYADLDMVHLSRA QPA PKPEPS FSEYASVQVQRK (SEQ ID NO: 5) Insanlastirilmis SlRPa Insan disi Hayvanlar Bir SIRPoi proteinini kodlayan insan disi hayvanin bir endojen Iokusunun genetik bir modifikasyonu sonucu ortaya çikan insan disi hayvanlarin bagisiklik hücrelerinin (örnegin miyeloid hücreleri) yüzeyinde insanlastirilmis SIRPoi proteinlerini ekspres eden insan disi hayvanlar tarif edilmektedir. Burada tarif edilmis olan uygun örnekler kemirgenleri, özellikle de fareleri içermektedir. Burada tarif edilen bir insanlastirilmis SlRPoi geni, heterolog bir türden (örn., Insanlar) genetik materyal içerebilir ki burada insanlastirilmis SIRPoi geni, bu genetik materyalin kodlanmis kismini heterolog türlerden olusturan bir SlRPoi proteinini kodlamaktadir. Burada tarif edilmekte olan insanlastirilmis bir SIRPoi geni, bir hücrenin plazma zari üzerinde ekspres edilen bir SIRPoi proteininin hücre disi kismina karsilik gelen heterolog bir türün genomik DNA'sini içerebilir. Insan disi hayvanlar, embriyolar, hücreler ve insan disi hayvanlar, insan disi embriyolar ve bahsedilen insanlastirilmis SIRPoi genini içeren hücreler yapmak için hedefleyici yapilar da tarif edilmistir. Bir endojen SlRPd geni silinebilir. Bir endojen SIRPa geni degistirilebilir, ki burada endojen SIRPoi geninin bir parçasi bir heterolog diziyle degistirilmektedir (örnegin bir bütün ya da parça halinde bir insan SIRPoi dizisi). Endojen bir SIRPoi geninin tamami ya da büyük ölçüde tamami, heterolog bir gen (örnegin bir insan SIRPoi geni) ile yer degistirebilir. Heterolog bir SIRPoi geninin bir kismi, endojen bir SIRPoi lokusunda endojen insan disi bir SIRPoi genine yerlestirilebilir. Heterolog gen, bir insan geni olabilir. Modifikasyon ya da insanlastirma endojen SIRPoi geninin iki kopyasindan birine yapilabilir ve bu sekilde insanlastirilmis SIRPoi genine göre heterozigot olan insan disi bir hayvan elde edilmektedir. Insan disi bir hayvan insanlastirilmis bir SIRPoi geni için homozigot olarak tarif edilmektedir. Burada tarif edilen insan disi bir hayvan, tamamen ya da kismen endojen bir insan disi SIRPoi lokusunda bir insan SlRPa geni içermektedir. Bu nedenle, bu gibi insan disi hayvanlar bir heterolog SIRP genine sahip olarak tarif edilebilirler. Endojen SIRPci lokusunda degistirilmis, yerlestirilmis ya da modifiye edilmis SIRPci geni örnegin PCR, Western blot, Southern blot, kisitlama fragman uzunlugu polimorfizmi (RFLP) ya da allel analizinde kazanç - kayip yöntemlerini kapsayan çesitli yöntemler kullanilarak tespit edilebilir. insan disi hayvan insanlastirilmis SlRPoi genine göre heterozigot olabilir. Burada tarif edilen insanlastirilmis bir SlRPoi geni Tablo 3'teki bir insan SIRPoi geninde görünen, ikinci, üçüncü ve dördüncü ekzon ile en az % 50 (örnegin, % 50, % 55, % 60, % 65, % 70, % 75, % 80, % 85, % 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97 , % 98, % 99 ya da daha fazla) özdes dizilime sahip ikinci, üçüncü ve dördüncü ekzon içeren bir SlRPci genini içermektedir. Burada tarif edilen insanlastirilmis bir SIRPoi geni, Tablo 3'teki bir insan SIRPoi cDNA dizisinde bulunan nükleotit 352 - 1114 ile en az % 50 (örnegin, % 50, % 55, % 60, % 65, % 70, % 75, % 80, % 85, % 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97, % 98, % 99 ya da daha fazla) oraninda özdes bir nükleotid kodlama dizisine (örnegin bir cDNA dizisine) sahip olan bir SlRPoi geni içermektedir. Burada açiklanan insan disi bir hayvan tarafindan üretilen insanlastirilmis bir SlRPoi proteini Tablo 3'te görünen insan SIRPO( proteininin hücre disi bir kismi ile en az % 50 (örnegin, % 50, % 55, % 60, % 65, % 70, % 75, % 80, % 85, % 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97, % 98, % 99 ya da daha fazla) oraninda özdes bir dizilime sahip hücre disi bir kisma sahip olabilir. Burada tarif edilen insan disi bir hayvan tarafindan Üretilen insanlastirilmis bir SIRPoi proteini Tablo 3'teki bir insan SIRPoi proteininde görünen 28-362 amino asit kalintilari ile az % 50 (örnegin, % 50, % 55, °/o 60, % 65, % 70, % 75, % 80, % 85, % 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97, % 98, % 99 ya da daha fazla) oraninda özdes bir dizilime sahip hücre disi bir kisma sahip olabilir. Burada açiklanan insan disi bir hayvan tarafindan üretilen insanlastirilmis bir SlRPo proteini Tablo 3'te görünen insanlastirilmis bir SIRPoi proteininin bir amino asit dizisi ile en az % 50 (örnegin, % 50, % 55, % 60, % 65, % 70, % 75, % 80, % 85, % 90, % 91, % 92, % 93, % 94, % 95, % 96, % 97, % 98, % 99 ya da daha fazla) oraninda özdes bir dizilime sahip bir amino asit dizisine sahip olabilir. Spesifik polimorfik formlar ya da alel varyantlari (örnegin, tekli amino asit farkliliklari dahil) dahil olmak üzere insanlastirilmis bir SIRPoi proteinini ekspres eden insan disi hayvanlari yapmak için kompozisyonlar ve yöntemler, bir insan promotöründen ve bir Insan düzenleyici diziden bu tür proteinleri ekspres eden insan disi hayvanlari yapmak için kompozisyonlar ve yöntemler de dahil olmak üzere tarif edilmistir. Bir endojen promotör ve bir endojen regülatör dizisinden bu tür proteinleri ekspres eden insan disi hayvanlarin üretilmesi için kompozisyonlar ve yöntemler de ayrica tarif edilmektedir. Yöntemler bir insan SIRPa proteinini kodlayan genetik materyalin, tamamen ya da kismen, endojen bir SIRPoi genine karsilik gelen insan disi bir hayvan genomunda belirli bir yere sokulmasini ve böylece, tamamen ya da kismen insan olan bir SIRPo proteinini ekspres eden bir insanlastirilmis SIRPoi geninin yaratilmasini içermektedir. Yöntemler insan SlRPoi geninin 2 - 4 ekzonlarina karsilik gelen genomik DNA'nin insan disi hayvanin endojen SlRPd genine eklenmesini ve bu sayede eklenen ekzonlar tarafindan kodlanan amino asitleri içeren bir insan kismi içeren bir SlRPoi proteinini kodlayan insanlastirilmis bir genin yaratilmasini içerebilirler. Insanlastirilmis bir SlRPoi gen yaklasimi endojen genin nispeten minimal bir modifikasyonunu kullanmaktadir ve insan disi hayvanlarda dogal SlRPoi aracili sinyal iletimi ile sonuçlanabilir, çünkü SIRPoi dizilerinin genomik dizisi, tek bir fragman halinde modifiye edilir ve bu nedenle, gerekli düzenleyici dizileri dahil ederek normal islevselligi korur. Dolayisiyla, SlRPoi gen modifikasyonu, diger çevre genleri ya da diger endojen SIRP genlerini etkilemeyebilir. Buna ilaveten, modifikasyon, fonksiyonel bir reseptörün plazmada birlestirilmesini etkilemeyebilir ve modifikasyondan etkilenmeyen reseptörün sitoplazmik kismi boyunca baglanma ve ardindan sinyal iletimi yoluyla normal efektörfonksiyonlarini korur. Endojen bir murin SlRPoi geninin ve insanlastirilmis bir SIRPoi geninin sematik bir gösterimi (ölçeklendirilmemistir), Sekil 1'de verilmistir. Resmedilmis oldugu gibi, bir insan SlRPa geninin 2 - 4. ekzonlarini içeren bir genomik DNA bir hedefleme yapisi ile endojen bir murin SIRPd gen Iokusu içine yerlestirilmektedir. Bu genomik DNA, Iigand baglanmasindan sorumlu bir insan SIRPa proteininin bir hücre disi kismini (örnegin amino asit kalintilari 28 - 362) kodlayan genin bir parçasinin içermektedir. Endojen SIRPa lokusunda insanlastirilmis bir SIRPo genine sahip olan insan disi bir hayvan (örnegin bir fare) teknik alanda bilinen herhangi bir yöntemle yapilabilir. Örnegin, tamamen ya da kismen seçilebilir bir isaretleyici gen ile bir insan SlRPoi genini içeri sokan bir hedefleme vektörü yapilabilir. Sekil 1 bir insan SIRPd'sinin 2 - 4. ekzonlarinin bir insersiyonunu içeren bir fare genomunu resmetmektedir. Resmedildigi gibi bir hedefleyici yapi bir endojen murin SlRPoi geninin ekzon 2'sinin yukarisinda akis dizisini içeren bir 5' homoloji kolu, ardindan bir insan SlRPoi geninin 2 ila 4 ekzonlarini içeren bir genomik DNA fragmani, bir ilaç seçme kaseti (örnegin, her iki tarafa da loxP dizileri ile çevrili bir neomisin direnç geni) ve bir endojen murin SIRPoi geninin ekzonlarinin 4 asagi akis dizisini içeren bir 3' homoloii kolunu içermektedir. Homolog rekombinasyondan sonra, endojen murin SIRPoi geninin 2 - 4. ekzonlari, hedefleme vektöründe bulunan diziyle degistirilmektedir. insanlastirilmis bir SIRPoi geninin olusturulmasi, bir insan SIRPo geninin 2-4. ekzonlari tarafindan kodlanan amino asitleri içeren bir insanlastirilmis SIRPoi proteinini ekspres eden bir hücre ya da insan disi hayvanla sonuçlanmaktadir. Ilaç seçme kaseti istege bagli olarak müteakiben bir rekombinazin eklenmesi ile çikarilabilir (örnegin Cre islemiyle). Burada tarif edildigi gibi insanlastirilmis SIRPoi genlerine sahip olan farelere ilaveten ayrica insanlastirilmis SIRPoi genlerini içeren diger genetik olarak modifiye edilmis insan disi hayvanlar da tarif edilmektedir. Bu gibi insan disi hayvanlar, endojen bir SIRPoi promoterine islevsel olarak baglanmis bir insanlastirilmis SIRPoi geni içerebilir. Bu gibi insan disi hayvanlar bir endojen lokustan insanlastirilmis bir SlRPoi proteinini ekspres edebilir ki burada insanlastirilmis SlRPo proteini, bir insan SlRPoi proteininin 28 - 362. amino asit kalintilarini içermektedir. Bu tür insan disi hayvanlar fare, siçan, tavsan, domuz, sigir (ör. inek, boga, bufalo), geyik, koyun, keçi, tavuk, kedi, köpek, yaban gelincigi ve bir primattan (ör., marmoset, al yanakli maymun) olusan gruptan seçilebilir. Uygun genetik olarak degistirilebilen ES hücrelerinin hazirda olmadigi insan disi hayvanlar için, burada tarif edildigi gibi genetik modifikasyonlari içeren insan disi bir hayvanin yapilmasi için baska yöntemler kullanilmaktadir. Bu tür yöntemler arasinda örnegin ES olmayan bir hücre genomunun (örnegin, bir fibroblast ya da indüklenmis bir pluripotent hücrenin) modifiye edilmesi ve modifiye edilmis genomun uygun bir hücreye, örnegin bir oosite aktarilmasi için nükleer transfer kullanilmasi ve modifiye edilmis hücrenin (örnegin, modifiye oosit) insan disi bir hayvanda bir embriyo olusturmak için uygun kosullar gebe birakilmasi yer almaktadir. Burada tarif edilmekte olan insan disi hayvan bir memeli olabilir. Burada tarif edilmekte olan insan disi bir hayvan, örnegin Dipodoidea ya da Muroidea süper ailelerinden küçük bir memeli olabilir. Burada tarif edilmekte olan genetik olarak modifiye edilmis hayvan bir kemirgen olabilir. Burada tarif edilmekte olan kemirgen bir fare, bir siçan ve bir hamster arasindan seçilebilir. Kemirgen bir Muroidea süper ailesinden seçilebilir. Burada tarif edilen genetigi degistirilmis bir hayvan, Calomyscidae (örnegin, fare benzeri hamsterler), Cricetidae (örnegin, hamster, Yeni Dünya siçanlari ve fareleri, tarla fareleri), Muridae (gerçek fareler ve siçanlar, gerbiller, dikenli fareler, tepeli siçanlar), Nesomyidae (tirmanici fareler, kaya fareleri, kuyruklu siçanlar, Madagaskar siçanlari ve fareleri), Platacanthomyidae (örnegin, dikenli yedi uyurlar) ve Spalacidae (örnegin köstebek faresi, bambu siçanlari ve zokerler) arasindan seçilen bir hayvan olabilir. Burada tarif edilmis olan genetik olarak modifiye edilmis bir kemirgen gerçek bir fare ya da siçan (Muridae familyasi), bir gerbil, dikenli bir fare ve tepeli bir siçan arasindan seçilebilir. Burada tarif edilmis olan genetik olarak modifiye edilmis bir fare Muridae ailesinin bir üyesi olabilir. Burada tarif edilmekte olan insan disi hayvan bir kemirgen olabilir. Burada tarif edilmekte olan kemirgen bir siçan ve bir fare arasindan seçilebilir. Bazi düzenlemelerde, burada tarif edilmekte olan insan disi hayvan bir fare olabilir. Bazi düzenlemelerde, mevcut bulusun bir faresi CSYBL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/SJ, C57BL/GByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10808n, C578L/10Cr ve CSTBL/Ola arasindan seçilen bir C57BL susudur. Bazi belirli düzenlemelerde mevcut bulusa ait bir fare, 129P1, 129P2, 129P3,129X1, 12981 (örn., 12981/8V, 12981/8vlm), 12982, 12984, 12985, 12989/8vEvH, 129/SvJae, 12986 (129/SvEvTac), 12987, 12988, 129T1, 129T2 suslarindan olusan gruptan seçilen bir 129 susudur (bakiniz, örnegin Festing ve ark., 1999, Mammalian Genome 101836; Auerbach ve ark., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032). Bazi belirli düzenlemelerde, mevcut bulusun genetik olarak modifiye edilmis bir faresi daha önce söz edilmis olan 129 susu ve daha önce söz edilmis olan C57BL/6 susunun bir karisimidir. Bazi belirli düzenlemelerde, mevcut bulusun bir faresi daha önce söz edilmis olan 129 suslarinin bir karisimi ya da daha önce söz edilmis olan BL/6 suslarinin bir karisimidir. Bazi belirli düzenlemelerde, burada tarif edildigi gibi karisimin bir 129 susu bir 12986 (129/8vEvTac) susudur. Bazi düzenlemelerde, mevcut bulusa ait bir fare bir BALB susudur, örnegin BALB/c susu. Bazi düzenlemelerde, mevcut bulusun bir faresi BALB susu ve yukarida söz edilmis olan bir diger susun bir karisimidir. Burada tarif edilmekte olan insan disi hayvan bir siçan olabilir. Bazi belirli düzenlemelerde, mevcut bulusun bir siçani bir Wistar siçani, bir LEA susu, Sprague Dawley susu, bir Fischer susu, F344, F6 ve Dark Agouti arasindan seçilmektedir. Bazi belirli düzenlemelerde, burada tarif edildigi gibi bir siçan susu Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 ve Dark Agouti"den olusan gruptan seçilen iki ya da daha fazla susun bir karisimidir. Insanlastirilmis SIRPci Genlerine Sahip Insan Disi Hayvanlari Kullanan Yön tem/er SIRPci mutanti ve transgenik insan disi hayvanlar (örnegin fareler) rapor edilmistir (Inagaki ve ark., 2000, EMBO Journal 19(24):6721-6731; Strowig ve ark.., 2011, Proc. Nat. Acad. Sci. 108(32):13218-13223). Bu gibi hayvanlar SIRPci ekspresyonunun, fonksiyonunun ve regülasyonunun moleküler yönlerini belirlemek üzere bir dizi analizde kullanilmistir. Ancak, bunlarin da sinirlandirmalari mevcuttur. Örnegin, SIRPci mutant farelerin kullanimi, SlRPoi'nin mutant formunu içeren hücrelerin sinyal verememesinden kaynaklanan zararli saglik kosullari nedeniyle sinirlandirilmistir. Buna ilaveten, SlRPoi için bir Iigand olan CD47, SlRPoi'nin mutant formu ile ayni hücrede mevcut olabildigi ve her iki protein de hücre içi sinyaller saglayabilme kapasitesine sahip oldugu için, bu sonuçlarin SIRPci sinyalinin eksikliginden mi yoksa CD47'ye baglanmadan mi kaynaklandigini ayirt etmek mümkün degildir. Insan SIRPci transgenik farenin durumunda, fare SIRPoi*si bir bütün halinde ve fonksiyoneldir. Bu nedenle de, çesitli biyolojik proseslerdeki SIRPoi- bagimli fonksiyonlar (örnegin asilama) hem insan hem de fare SIRPci reseptörleri mevcut ve islevsel oldugundan, bu farelerde tek basina insan SIRPci ya da fare SIRPci fonksiyonuna açikça atfedilemez. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar çesitli analizler için faydali olan insan SIRPoi'sini ekspres eden gelismis bir in vivo sistem ve biyolojik materyal kaynagi (örn. hücreler) saglamaktadir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar SIRPa'yi hedefleyen ve/veya SlRPd-CD47 sinyallesmesini modüle eden terapötiklerin gelistirilmesinde kullanilabilirler. Çesitli düzenlemelerde mevcut bulusun fareleri aday terapötiklerin (örnegin insan SIRch'sina baglanan antikorlar) taranmasi ve gelistirilmesi için kullanilmaktadir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar, burada tarif edildigi gibi insan disi bir hayvanin bir hücresinin yüzeyinde insanlastirilmis bir SIRPci antagonistinin ve/veya agonistinin baglanma profilini belirlemek üzere kullanilabilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar SIRPci sinyal transdüksiyonunu bloke etme ya da modüle etmenin terapötik etkisini (örn., fosforilasyon) ve hücresel degisikliklerin bir sonucu olarak gen ekspresyonu üzerindeki etkisini ölçmek üzere kullanilabilirler. Burada tarif edilen insan disi bir hayvan ya da bundan izole edilen hücreler insan disi bir hayvanin hücresinin yüzeyindeki bir insan SIRPd'sina baglanan bir terapötik adaya maruz birakilabilir ve takip eden bir süreden sonra, SIRPoi'ya bagli prosesler, örnegin B ve/veya T hücresi proliferasyonu, trombositlerin temizlenmesi ve sitokin ekspresyonunun indüklenmesi üzerindeki etkiler açisindan analiz edilmektedir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar insanlastirilmis SIRPoi proteinini ekspres etmektedir, dolayisiyla baglanma ve fonksiyonel deneylerde kullanim için, insanlastirilmis bir SlRPa kaynagi olarak hizmet etmek üzere üretilebilirler, örnegin bir SIRPoi antagonistinin ya da agonistinin baglanmasini ya da islevini tahlil etmek için, ki burada antagonist ya da agonist, bir insan SlRPoi dizisi ya da epitopu için spesifiktir. Burada tarif edildigi gibi insan disi bir hayvan tarafindan ekspres edilen insanlastirilmis bir SlRPoi proteini bir varyant amino asit dizisi içermektedir. Ligand baglama kalintilari ile baglantili varyasyonlara sahip varyant insan SIRPa proteinleri bildirilmistir. Burada tarif edilmekte olan insan disi hayvanlar insanlastirilmis bir SIRPa proteini varyantini ekspres edebilir. Varyant, Iigand baglanmasi ile baglantili bir amino asit pozisyonunda polimorfik olabilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar. insan SlRPoi'sinin bir polimorfik varyanti ile etkilesime girerek Iigand baglanmasinin etkisini belirlemek için kullanilabilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlardan elde edilen hücreler izole edilebilir ve geçici olarak kullanilabilir ya da birçok kusak boyunca kültürde muhafaza edilebilir. Burada tarif edilen insan disi bir hayvandan alinan hücreler ölümsüz hale getirilebilir ve süresiz olarak kültürde tutulabilir (örnegin seri kültürlerde). Burada tarif edilen insan disi hayvanlarin hücreleri, insan SlRPa'sini modüle eden aday terapötiklerin taranmasi ve gelistirilmesi için bir hücre göçünde ya da yayilma analizinde kullanilabilir. Bu tür prosesler, yara iyilesmesi, farklilasma, çogalma ve hayatta kalma da dahil olmak üzere birçok hücresel süreç için gereklidir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlarin hücreleri, insan SlRPoi'sini hedef alan aday terapötiklerin farmako-toksikolojik yönlerini test etmek için megakaryositik koloni olusturan hücrelerin kIonaI analizlerinde kullanilabilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlarin hücreleri, fagositozun SIRPci'ya bagli regülasyonunu modüle etmek için bilesiklerin ya da biyolojik ajanlarin terapötik potansiyelini belirlemek amaciyla fagositoz analizlerinde kullanilabilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar, bir ilaç ya da asinin analizi ve test edilmesi için bir in vivo sistem saglamaktadir. Bir aday ilaç ya da asi, burada tarif edilen bir ya da daha fazla insan disi hayvana verilebilir ve ardindan ilaca ya da asiya bagisiklik tepkisi, ilacin ya da asinin güvenlik profili ya da bir hastalik ya da durum üzerindeki etkisinden bir ya da daha fazlasinin belirlenmesi için insan disi hayvanlarin izlenmesi gelir. Bu gibi ilaçlar ya da asilar, bu gibi insan disi hayvanlarda düzeltilebilir ve/veya gelistirilebilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar adoptif aktarim yoluyla insandaki hücreden hücreye etkilesimin mekanizmalarini açikliga kavusturan gelismis in vivo sistem saglamaktadir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar bir tümör asisi ile implante edilebilir, bunun hemen ardindan kati tümörlerin ya da diger malignitelerin yok edilmesindeki etkililigi belirlemek için insan disi hayvanlara adoptif transfer ile tümör infiltre Ienfositlerinin ikinci implantasyonu gerçeklestirilebilir. Bu gibi deneyler, insan disi hayvanin endojen SIRPa'si ile rekabet etmeden insan SIRPd'sinin özel mevcudiyeti nedeniyle insan hücreleri ile gerçeklestirilebilmektedir. Buna ilaveten, ksenotransplantasyonda kullanima yönelik terapiler ve farmasötikler bu gibi insan disi hayvanlarda düzeltilebilir ve/veya gelistirilebilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar asilama yoluyla insan hematopoetik kök hücrelerinin bakimi ve gelisimi için gelistirilmis bir in vivo sistem saglamaktadir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar insan disi hayvanlarin içinde yer alan insan kök hücrelerinin iyilestirilmis bir gelisimini ve bakimini saglayabilirler. Farklilasmis insan B ve T hücrelerinin artan popülasyonlari insan disi hayvanin kaninda, kemik iliginde, dalakta ve timusta gözlenebilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar, hem fare hem de insan SIRPdsmi ekspres eden insan disi hayvanlara kiyasla insan hücrelerinin asilanma seviyesinde bir artis saglayabilir. Burada tarif edilen insan disi hayvanlar insan hücrelerini hedefleyen terapötik ilaçlarin etkililigini degerlendirmek üzere kullanilabilir. Burada tarif edilen insan disi bir hayvan insan hücreleri ile transplante edilmis olabilir ve bu gibi insan hücrelerini hedef alan bir ilaç adayi bu gibi bir hayvana uygulanmaktadir. Ilacin terapötik etkinligi, ilacin uygulanmasindan sonra insan disi hayvandaki insan hücrelerinin izlenmesiyle belirlenmektedir. Insan disi hayvanlarda test edilebilen ilaçlar arasinda hem küçük moleküllü bilesikler, yani 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD ya da 800 daltondan daha düsük moleküler agirliga sahip bilesikler ve hem de insan hücrelerini hedef alarak (örnegin baglanma ve/veya bunlara etki etme yoluyla) insan hastaliklarinin ve kosullarinin tedavisi için terapötik etkileri olan büyük moleküllü bilesikler (örnegin proteinler, örnegin antikorlar) yer almaktadir. Ilaç bir anti-kanser ilaci olabilir ve insan hücreleri de bir primer kanser türünün hücreleri olabilir ya da bir primer kanserden elde edilen hücre dizilerinin hücreleri olabilir. Bu baglamda, burada tarif edilen insan disi bir hayvan, insan kanser hücreleri ile nakledilmektedir ve insan disi hayvana bir anti-kanser ilaci verilmektedir. Ilacin etkililigi, insan disi hayvandaki insan kanser hücrelerinin büyümesinin ya da metastazinin, ilacin uygulanmasinin bir sonucu olarak inhibe edilip edilmedigi degerlendirilerek belirlenebilir. Anti-kanser ilaci, insan kanser hücrelerinin üzerinde bulunan bir antijene baglanan bir antikor molekülü olabilir. Anti kanser ilaci insan kanser hücreleri üzerindeki bir antijene baglanan ve diger insan hücreleri üzerindeki bir antijene, örnegin B hücreleri ve T hücreleri gibi insan bagisiklik sistemi ("ya da insan bagisiklik hücreleri'l) hücreleri üzerindeki bir antijene baglanan bispesifik bir antikor olabilir. Burada tarif edilen insan disi bir hayvan, insan bagisiklik hücreleri ya da insan bagisiklik hücrelerine farklilasan hücreler ile asilanabilir. Bu gibi insan bagisiklik hücreleri asilanmis insan disi hayvanlara insan kanser hücreleri transplante edilmekte ve insan kanser hücreleri üzerindeki bir antijene ve insan bagisiklik hücreleri üzerindeki bir antijene (örnegin T hücreleri) baglanan bispesifik bir antikor gibi bir anti-kanser ilaci uygulanmaktadir. Bispesifik antikorun terapötik etkinligi, insan disi hayvandaki insan kanser hücrelerinin büyümesini ya da metastazini inhibe etme becerisine bagli olarak degerlendirilebilir. Burada tarif edilen insan disi hayvan, insan bagisiklik hücrelerine (digerlerinin yanisira, T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri dahil) neden olan insan CD34+ hematopoetik progenitör hücreler ile asilanabilir. Insan B hücresi Ienfoma hücreleri (örn., Raji hücreleri), asilanmis insan bagisiklik hücrelerine sahip insan disi bir hayvana nakledilmekte, daha sonra bispesifik antikorun insan disi hayvanlarda tümör büyümesini inhibe etme kabiliyetini test etmek için CD20'ye ve T hücresi reseptörünün CDS alt ünitesine baglanan bispesifik bir antikorla (normal B hücrelerinde bir antijen ve bazi B hücresi maligniteleri) uygulanmaktadir. ÖRNEKLER Asagidaki örnekler, teknik alanda siradan uzmanliga sahip kisilere, burada tarif edilen yöntem ve kompozisyonlarin nasil hazirlanacagini ve kullanilacagini tarif edecek sekilde saglanmistir ve bulus sahiplerinin buluslari olarak gördükleri seylerin kapsamini sinirlandirma amaci tasimamaktadir. Aksi belirtilmedigi sürece sicakliklar Celcius cinsinden belirtilmektedir ve basinç ise atmosferik ya da ona yakin bir basinçtir. Örnek 1. Bir endojen sinyal düzenleyici protein (SIRP) geninin insanlastirilmasi. Bu örnek bir kemirgen gibi (örnegin bir fare) insan disi bir hayvanda sinyal düzenleyici protein alfayi (SIRPoi) kodlayan bir endojen genin insanlastirilmasi için örnek niteligindeki yöntemleri resmetmektedir. Insan SIRPd'sinin en az 10 alelik formda mevcut oldugu bilinmektedir. Bu örnekte tarif edilen yöntemler herhangi bir insan aIeIi ya da istendigi taktirde insan aIeIIerinin bir kombinasyonu (ya da alel parçalari) kullanilarak insan disi bir hayvanin bir endojen SIRPd genini insanlastirmak için kullanilabilir. Bu örnekte insan SlRPd varyant 1ii, bir farenin bir endojen SIRPoi genini insanlastirmak için kullanilmaktadir. Bir SIRP (örn., SIRPoi) geninin hücre disi bir bölgesinin insanlastirilmasi için bir hedefleme vektörü, VELOCIGENE® teknolojisi kullanilarak yapilmistir (bakiniz, örnegin,ABD Pat. No. 6,586,251 ve Valenzuela ve ark. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21 (6):652-659). Kisaca, fare bakteriyel yapay kromozomu (BAC) klonu bMQ-261H14 bir endojen SIRPd geninin 2 ila 4 ekzonlarini içeren diziyi silmek ve bir insan SIRPoi geninin 2 ila 4 ekzonlarini eklemek için, insan BAC klonu CTD-3035H21 kullanilarak modifiye edilmistir. Bir endojen SIRPoi geninin 2 ila 4 ekzonuna karsilik gelen genomik DNA (~8555 bp) BAC klonu bMQ-261H14'te BAC klonu CTD-3035H21'den bir insan SIRPoi geninin 2 ila 4 ekzonunu içeren bir ~8581 bp DNA parçasi ile degistirilmistir. BAC klonu CTD-3035H21'de bulunan insan SIRPa alelinin dizi analizi, allelin insan varyanti 1'e karsilik geldigini ortaya çikarmistir. Insan SIRPd geninin 2 ila 4 ekzonunu içeren ~8581 bp insan DNA fragmaninin sonuna onP bölgeleriyle çevrili bir neomisin kaseti eklenmistir (Sekil 1). Akis yukari ve akis asagi homoloji kollari, sirasiyla ekzon 2 ve 4'ün 5' ve 3' pozisyonlarinda fare BAC DNA'sindan elde edilmis ve endojen bir SlRPd geninin insanlastirilmasi için nihai hedefleme vektörünü olusturmak üzere ~8581 bp insan fragmani-neomisin kasetine eklenmistir, bu kaset Endojen SlRPd geninin 2 ekzonundan 19 kb fare DNA'si 5', bir insan SIRPd geninin 2 ila 4 ekzonlarini içeren bir ~8581 bp DNA fragmani, onP bölgeleri ile çevrili bir neomisin kaseti ve bir endojen SlRPd geninin ekzon 4'ünden 21 kb fare DNA'si 3' içeren bir 3' homoloji kolu içeren 5'den 3'e kadar bir 5 'homoloji kolu Içermektedir. Hedefleme vektörünün hedeflenmis bir biçimde yerlestirilmesi, neomisin kasetini ekzonlar 4 ve 5 arasindaki bir fare SIRPd geninin besinci intronuna konumlandirmistir. Hedefleme vektörü, Swal ile sindirilerek dogrusallastirilmistir ve daha sonra, bir insan SIRPd geninin 2 ila 4. ekzonlari ile bir fare SIRPO( geninde 2 ila 4. ekzonlarin hedeflenmis bir replasmanini gerçeklestirmek için bakteriyal hücrelerde homolog rekombinasyonda kullanilmistir. Hedeflenen BAC DNA'si (yukarida tarif edilmistir), bir insan SlRPoi geninin 2 ila 4 ekzonlarini içeren bir genomik fragman ile bir endojen fare SlRPd geninde 2 ila 4 ekzon degistirmesini içeren modifiye ES hücrelerini olusturmak üzere fare ES hücrelerini elektroporatlamak için kullanilmistir. Bir insan SIRPd geninin 2 ila 4 ekzonlarini içeren bir genomik parça içeren pozitif ES hücreleri, TAQMANTM problari kullanilarak kantitatif PCR ile tanimlanmistir (Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9243-48). Yukari akis ekleme noktasi boyunca nükleotit dizisi asagidakileri içermekte olup bu durum yerlestirme noktasinda mevcut olan bir insan SIRPa genomik dizisine bitisik olarak baglanmis yerlestirme noktasinin yukarisindaki endojen fare dizisini (asagidaki parantez içinde yer almaktadir) göstermektedir: (AGCTCTCCTA CCACTAGACT GCTGAGACCC GCTGCTCTGC TCAGGACTCG ATTTCCAGTA CACAATCTCC CTCTTTGAAA AGTACCACAC ATCCTGGGGT) GCTCTTGCAT TTGTGTGACA CTTTGCTAGC CAGGCTCAGT CCTGGGTTCC AGGTGGGGAC TCAAACACAC TGGCACGAGT CTACATTGGA TATTCTTGGT (DIZI ID NO: 6). Neomisin kasetinin 5 'ucundaki asagi akis yerlestirme noktasi boyunca nükleotit dizisi asagidakileri içermekte olup bu durum ekleme noktasinin asagisindaki kaset dizisine bitisik insan SIRPd genomik dizisini göstermektedir (italik hale getirilmis onPsequence ile asagida parantez içinde yer almaktadir): GCTCCCCATT CCTCACTGGC CCAGCCCCTC TTCCCTACTC TTTCTAGCCC CTGCCTCATC TCCCTGGCTG CCATTGGGAG CCTGCCCCAC TGGAAGCCAG (TCGAG ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG GTTTTGGCGC CTCCCGCGGG CGCCCCCCTC CTCACGGCGA) (DIZI ID NO: 7). Neomisin kasetinin 3' ucundaki asagi akis yerlestirme noktasindaki nükleotit dizisi, asagidakileri içermekte olup bu durum bir endojen SIRPo geninin (asagidaki parantez içinde yer almaktadir) 4 ekzonunun fare genomik dizisi 3' ile bitisik kaset dizisini göstermektedir: CATTCTCAGT ATTGTTTTGC CAAGTTCTAA TTCCATCAGA CCTCGACCTG CAGCCCCTAG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTATGCTAGC (TGTCTCATAG AGGCTGGCGA TCTGGCTCAG GGACAGCCAG TACTGCAAAG AGTATCCTTG TTCATACCTT CTCCTAGTGG CCATCTCCCT GGGACAGTCA) (DIZI ID NO: 8). Pozitif ES hücre klonlari daha sonra bir insan SIRPa geninin 2 ila 4 ekzonunun bir farenin bir endojen SIRPa genine sokulmasi içeren bir yavru sürüsü üretmek için VELOCIMOUSE® yöntemini kullanarak disi fareleri implante etmek için kullanilmaktadir (bkz. örnegin, U.S. Pat. No. 7,294,754 ve Poueymirou et al. 2007, FO generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). Yukarida tarif edilen hedeflenmis ES hücreleri, donör ES hücreleri olarak kullanilmis ve VELOClMOUSE® yöntemi (supra) ile 8 hücre asamasindaki bir fare embriyosuna yerlestirilmistir. Bir endojen SIRPoi geninin 2 ila 4 ekzonlarinin insanlastirilmasiyla iliskili fareler, insan SIRPoi gen dizilerinin varligini tespit eden bir alel analizi modifikasyonu (Valenzuela ve ark., yukarida) kullanilarak genotipleme ile tanimlanmistir. Insanlastirilmis bir SIRPoi gen yapisina sahip olan fareler (yani, bir fare SIRPa geninde insan SIRPoi 2 ila 4 ekzonlarini içeren), örnegin ES hücre asamasinda ya da embriyoda çikarilmayan hedefleme vektörü tarafindan sokulan herhangi bir oned neomisin kasetini çikarmak için bir Cre yok edici fare susuna (bakiniz, örnegin, Uluslararasi Patent Basvurusu Yayin No. WO 2009/114400) baglanabilir. Istege bagli olarak, neomisin kaseti farelerde tutulmaktadir. Yavrular genotiplendirilmekte ve insanlastirilmis SlRPoi gen yapisi için yavru bir heterozigoz karakterizasyon için seçilmektedir. Örnek 2. Insan disi hayvanlarda insanlastirilmis SlRPoi*nin ekspresyonu Bu örnek bir endojen SIRPoi Iokusunda Örnek 1'de tarif edildigi gibi bir insanlastirilmis SIRPd geni yapisini içermek üzere tasarlanmis insan disi hayvanlardan gelen hücrelerin yüzeyinde SIRPoi proteininin karakteristik ekspresyonunu resmetmektedir. Kisacasi dalaklar, insanlastirilmis bir SlRPoi geni için vahsi tipte (WT) ve farelerde heterozigozdan izole edilmistir. Daha sonra dalaklar Kollajenaz D (Roche Bioscience) ile perfüze edilmis ve eritrositler üreticinin spesifikasyonlarina göre ACK Iizis tamponu ile eritilmistir. Fare ve insan SIRPoi'sinin hücre yüzeyi ekspresyonu, florokrom-konjüge edilmis anti-CD3 (17A2), anti-CD19 (1D3), anti-CD11b (Mi/70), anti-insan SlRPoi (SE5A5) ve anti-fare SlRPoi (P84) kullanilarak FACS ile analiz edilmistir. Akis sitometrisi BD LSRFORTESSATM kullanilarak gerçeklestirilmistir. CD11b+ monositlerinin yüzeyinde saptanan insan ve fare SIRPa'sinin örnek ekspresyonu, Sekil 2'de gösterilmektedir. Sekil 2ide gösterildigi gibi, hem fare hem de insanlastirilmis SIRPoi'nin ekspresyonu, heterozigot farelerden CD11b+ monositlerinin yüzeyinde açikça tespit edilebilir durumdadir. Örnek 3. insanlastirilmis SIRP insan disi hayvanlarda insan hücresi asilamasi. Bu örnek insanlastirilmis bir SIRPd genine sahip olan insan disi hayvanlarda insan hematopoetik kök hücresinin iyilestirilmis bir asilamasini resmetmektedir. Kisaca, insanlastirilmis bir SlRPoi genine sahip olan ya da olmayan RagZ KO IL2Rynu" fareleri patojen içermeyen kosullar altinda yetistirilmistir. Yenidogan fareler (2 ila 5 günlük) 240 cGy ile isinlanmis ve intra-hepatik olarak 11x105 CD34+ insan hematopoetik kök hücreleri ile enjekte edilmistir. Farelerden asilamadan 10 ila 12 hafta sonra kan alinmis ve alinan kan florokrom-konjuge anti-insan CD45 (HI30), anti-insan CD3 (SKY), anti-insan CD19 (Hl819) ve anti-fare CD45 (30-F11) kullanilarak insan bagisiklik sisteminin yeniden yapilandirilmasini kontrol etmek üzere analiz edilmistir. Farelerin genetik geçmisi BALB/CTa x 129/SvJae'dir. Vahsi tipte insan CD34+ hücreleri, insanlastirilmis SIRPoi için heterozigoz fareler, insanlastirilmis SIRPoi ve BALB-RagZ"'IL2RVC'/'(DKO) fareleri için homozigot farelerin örnek yüzdeleri Sekiller 3-5'te gösterilmektedir. Bu örnekte gösterildigi gibi, Insanlastirilmis bir SIRPoi geni Için homozigot bir fare, test edilen diger suslara kiyasla çevrede (örnegin kan) insan CD34+ hücrelerinin en yüksek yüzdesini saglayarak, insan CD34+ hücrelerinin iyilestirilmis bir asilamasini sergilemektedir. Birlikte alindiginda bu veriler bize göstermektedir ki burada tarif edildigi gibi insanlastirilmis SlRPoi fare içindeki hücrelerin yüzeyinde ekspresyon yoluyla islevseldir ve insan CD34+ hematopoetik kök hücrelerin asilanmasini destekleme kapasitesine sahip olmaya baslamaktadir. Örnek 4. Ab 1'in BRG Farelerindeki Raji Lenfoma Tümör Büyümesi Üzerindeki Etkililiginin Degerlendirilmesi. ÖZET Ab1, T hücresi reseptörü (TCR) kompleksi ile baglantili bir T hücresi antijeni olan CD3'e ve normal B hücreleri ve birkaç B hücresi soyu malignitelerinde bulunan bir B hücresi yüzey antijeni olan CD20'ye baglanan bispesifik bir antikordur (bsAb). Ab1, CD20'yi ekspres eden hücrelerin, TCR'nin CD3 alt ünitesine baglanarak sitotoksik T hücreleri ile köprülenmesi, CD20'ye yönelik poliklonal T hücresi öldürülmesiyle sonuçlanacak sekilde tasarlanmistir. CD20, immünoterapi için klinik olarak onaylanmis bir hedeftir; kimerik antikor rituksimab, Hodgkin Disi Lenfoma (NHL) ve Kronik Lenfositik Löseminin (CLL) tedavisi için onaylanmistir. Her ne kadar hastalar rituksimabaya dirençli olabilse de, tipik olarak CD20 ekspresyonunun kaybi gözlenmemistir. Bu nedenle de CD20-pozitif tümör hücrelerini sitotoksik T hücreleri ile köprüleyen bispesifik bir antikor, potansiyel bir anti-tümör stratejisini temsil etmektedir. Bu çalismada CD20XCD3 bsAb Ab 1 ile tedavinin insan B hücreli Ienfoma (Raji) tümörünün büyümesi üzerindeki etkisi bir fare tümörü modelinde incelenmistir. Model, SIRPoi için insanlastirilmis hCD34 + asilanmis BALB/c-Raanull lL2rynulI (BRG) farelerini kullanmistir. Insan T, B ve NK hücrelerinin yanisira granülositlere, monositlere ve dendritik hücrelere (DCtler) sahip olan bu fareler haftada iki kez Ab 1 ile tedavi edilmis ve bunun sonucunda da, tasiyici kontrol ve baglanmayan kontrol mAb, kontrol Ab 5 ile kiyaslandiginda Raji tümörünün büyümesini önemli derecede bastirmistir. Ab 1 tedavisi, tedavi süresince araç kontrol grubundan daha büyük bir öneme sahip olarak hem 0.4 mg / kg hem de 0.04 mg / kg tümör büyümesini bastirmistir (p <0.0001). Herhangi bir tedavi grubunda anlamli bir kilo kaybi gözlenmemistir. Bu sonuçlar Ab 1,in insan bagisiklik hücrelerine sahip olan farelerde Raji tümörlerini hedefledigini ve bunun bir sonucu olarak da önemli derecede tümör supresyonunun gerçeklestigini göstermektedir. MATERYAL VE YÖNTEMLER Materyaller Test Bilesigi ve Kontrol Antikoru Test bilesigi: Ab 1. Kontrol antikoru: Kontrol Ab 5. Reaktifler Tablo 4: Reaktif Listesi Reaktif Kaynak Tanimlama .. Regeneron Raji hucreleri _ , Raji P 1-4-10 Geçis #4 çekirdek tesis Insan fetal karacigerlerinden izole Advanced edilmis olan insan CD34 + Biosciences hematopoetik kök hücreler (HSC) Resource, Inc. Katalog #0500-300, Parti hPBMC'Ier Reachbio #130322 Katalog #181164-1OOG, L-Histidin Amresco Parti #3363E344 Katalog #BI0640-07, Sukroz Biosolutions Parti #0816012 RPMl Irvine Scientific Katalog #9160, parti Reaktif FBS Penisilin/Streptomyci Glutamin 2-Merkaptoetanol Anti-insan CD45 Anti-insan NKp46 Anti-insan CD19 Anti-insan CD3 Anti-insan CD14 Anti-insan CD45 BD Fortessa n/L- 49 Kaynak Tissue Culture Biologicals Gibco Gibco Invitrogen BD Biosciences BD Biosciences Invitrogen BD Biosciences BD Biosciences BD Biosciences Tanimlama #9160100803 Katalog Parti #107062 #101, Katalog #10376-016, Parti #1411480 Katalog #21985-023, Parti #762405 Katalog #MHCD4518, Klon H130 Katalog #558051, 9E2 Klon Katalog #555412, Klon HlB19 Katalog #M HCD0328, Klon 84.1 Katalog #557742, Klon M5E2 Katalog #557659, Klon -F11 Özel Siparis Enstrümani Test Sistemleri Bu raporda sunulan tümör çalismalari sinyal düzenleyici protein alfa (SIRPoi) geni için insanlastirilmis 24-32 haftalik erkek ve disi BALB / c-RaanuII lL2rynuII (BRG) bagisiklik yetmezlikli farelerde kullanilmistir. Bunlar Regeneron'da embriyonik kök (ES) hücre hedeflemesi ile üretilmistir (Strowig ve ark., Proc Natl Acad Sci U S A, 108(32): 13218-13223 (2011)). CD47inin belirlenmesinden sonra SIRPo makrofajlar ile CD47 pozitif hücrelerin klirensini inhibe etmektedir. Önceki çalismalar, insan SIRPoi transgenini ekspres eden BRG farelerinin, insan HSC'sinin asilanmasini arttirdigini göstermistir (Strowig ve ark., Proc Natl Acad Sci U S A, 108(32): 13218- 13223 (2011)). Yenidogan SIRPoi BRG yavrulari radyasyona maruz birakilmis ve fetal karacigerden elde edilen hCD34+ hematopoetik progenitör hücreler ile asilanmistir (Traggiai, ve ark., Science, 304(5667): 104-107 (2004)). Bu insan HSC'Ieri insan T, B ve NK hücrelerine ve yani sira granülositler, monositler ve dendritik hücrelere (DC'ler) yol açmaktadir. Dolasimdaki düsük insan B hücresi seviyeleri nedeniyle, düsük dolasimdaki insan lgG seviyeleri vardir. Buna ilaveten, bu fareler germinal merkezler gelistirmemekte, lenf dügümleri içermemekte ve bu hücreler tükenirse sinirli T ve B hücre takviyesine sahip olmaktadirlar. Murin monositleri, DC'Ieri ve granülositleri de olmaya devam etmektedir. Bagisiklik hücresi kompozisyonu kanin akis sitometrisi ile dogrulanmis ve fareler tümör çalismalarinda kullanilmadan önce % insan CD45 asilamasi ile randomize edilmistir. Farelere, 0. Günde Raji tümör hücreleri nakledilmis ve Ab 1'in 4 hafta boyunca tümör büyümesini bloke etme kabiliyeti test edilmistir. Vücut agirliklari ve tümör hacimleri 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 ve 34. günlerde ve implantasyonun ardindan kaydedilmistir. Deneysel Tasarim SIRPor BRG Faresinde Insan Bagisiklik Sisteminin Yeniden Olusturulmasi Bagisiklik yetmezlikli BALB/c Rag2/-yc-/- (BRG) insan SIRP alfa (SIRPo BRG) fareleri, Regeneron hayvan tesisinde mikropsuz izolatörlerde yetistirilmistir. Yenidogan fareler, insan fetal karacigerlerinden izole edilmis insan CD34+ hematopoetik kök hücrelerin (HSC) enjeksiyonundan 8-24 saat önce bir doz 3000Grey ile radyasyona maruz birakilmistir. Asilamanin 12-16 hafta boyunca gelismesine izin verilmis ve asilanmis hücrelerin sayisi akis sitometrisi ile periyodik olarak degerlendirilmistir. Deney sürecinin tamami boyunca hayvanlar Regeneron hayvan tesislerinde, standart kosullar altinda, 12 saat gündüz ve 12 saat gecelik bir gece gündüz ritminde ve tüketebildikleri kadar su ve yiyecekle beslenerek barindirilmistir. Kafes basina düsen hayvan sayisi maksimum 5 ile sinirlandirilmistir. Fare kani, çalismanin baslatilmasindan önce yüzde cinsinden melezlesme miktarinin belirlenmesi amaciyla analiz edilmistir. Tam kan 50 uL %2 EDTA içeren iki kapiler tüp içerisinde toplanmistir (etilendiamintetraasetik asit; 15 mg/mL). Kirmizi kan hücreleri, 3 dakika boyunca ACK Iizis tamponu kullanilarak parçalanmis ve tampon, PBS ile nötrlestirilmistir (kalsiyum ya da magnezyum yok). Hücreler Fc Block ile 4°C'de 5 dakika boyunca bloke edilmis ve daha sonra insan CD45, NKp46, CD19, CD3 ve CD14 ile 4 °C'de 30 dakika boyunca boyanmistir. Numuneler 5 lazerli akis sitometrisi (BD Fortessa) ile analiz edilmistir. Asilama yüzdesi, insan CD45+ hücrelerinin toplam hücre sayisina orani seklinde belirlenmektedir. SIRPor BRG Farelerinde Raji Tümör Çalismasi Prosedürü 0. günde, 5 SIRPa BRG fare grubuna subkutan olarak 2x106 Raji tümör hücreleri uygulanmistir. Yine ayni gün içerisinde fareler Ab1'in (0.4 ya da 0.04 mg / kg) bir intraperitonal (IP) dozu, baglanmayan kontrol mAb Kontrol Ab 5 (insan CD20 ya da CD3'üne çapraz reaktivitesi olmayan bir kedi antijenini baglar) ile 0,4 mg / kg dozunda ya da tek basina bir araç ile tedavi edilmistir. Fareler bunun hemen ardindan 4 hafta boyunca haftada iki doz antikor almistir. Tümörün büyümesi 3, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30 ve 34. günlerde pergeller ölçülmüstür. Çalisma Gruplari Tablo 'te özetlenmistir. Tablo 5: SIRPoi BRG Farelerinde Tedavi Gruplarinin Özeti Gruplar Tümör Antikor Doz (mg/kg) Yol Takvim #Fare Antikor yok Raji 0 IP 2x/hafta 5 Kontrol (yalniz Araç) Gruplari Raji Kontrol Ab5 0.4 IP 2x/hafta 5 Deneysel Raji Ab 1 0.4 IP 2X/hafta 5 Gruplar Tümör Antikor Doz (mg/kg) Yol Takvim # Fare Gruplar Raji Ab1 0.04 IP 2x/hafta 5 Spesifik Prosedürler Reaktiflerin Hazirlanisi Ab 1 ve Kontrol Ab5'in her biri, tasiyicida arzu edilen konsantrasyona kadar seyreltilmistir (10 mM histidin,% 5 sukroz, pH 5.8). Raji hücreleri, Regeneron çekirdek tesisinden (pasaj 4) elde edilmis ve kültür ortaminda saklanmistir: RPMl 1640 + % 10 FBS + Pen Strep-L-Glu + Merkaptoetanol. Raji hücreleri ortam içerisinde istenen konsantrasyonda seyreltilmistir. Istatistiksel Analizler Istatistiksel analizler GraphPad yazilimi Prism 5.0 (Maclntosh Version) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Istatistiksel anlamlilik iki yönlü ANOVA ile Tukey'in çoklu karsilastirma sonrasi testi ile belirlenmistir. Her bir okumadan elde edilen veriler tedavi gruplari arasinda karsilastirilmistir. * Ile belirtildigi üzere, p <0,05 esigi istatistiksel olarak anlamli kabul edilmektedir. Çalismanin bitiminden önce ölen fareler, iki yönlü ANOVA ile analiz edilmek üzere belirtildigi gibi birlestirilmis tümör büyüme egrisi (ancak tek tek fare büyüme egrisinden degil) grafiklerinden ve istatistiksel analizden çikarilmistir. SONU LAR Ab 1, hCD34 + Asili SIRPd BRG Farelerinde Raji Tümör Hücre Büyümesini Bastirmaktadir Ab 1, hCD34 + ile asilanmis SIRPd BRG farelerinde tasiyici kontrolü ve baglayici olmayan kontrol ile karsilastirildiginda Raji tümör büyümesini bastirmistir (Sekil 6). Yenidogan SlRPd BRG yavrulari radyasyona maruz birakilmis ve hematopoetik progenitör hücreler olarak hCD34+ fetal karaciger hücreleri ile asilanmistir (Traggiai, ve ark., Science, 304(5667): 104-107 (2004)) ve bu da insan T, B ve NK hücrelerine ve yanisira granülositlere, monositlere ve DC'lere yol açmistir. 0. günde, hCD34+ ile asilanmis SIRPa BRG farelerine subkutan olarak 2x106 Raji tümör hücreleri uygulanmistir. Ayni günde fareler Ab 1 (0,4 ya da 0,04 mg / kg) ya da baglayici olmayan kontrol mAb Kontrol Ab 5 ya da tasiyici kontrolün intraperitonal (lP) bir dozu ile tedavi edilmis ve bunu da çalisma boyunca haftada iki kerelik dozlar takip etmistir. Tasiyici kontrol gruplari ve baglayici olmayan kontrol gruplari ile karsilastirildiginda, tümör implantasyonu sonrasi 34. günde, 0.04 mg/kg (p <0.0001) ya da 0.4 mg/kg (p <0.0001) dozlarinda uygulanan Ab 1 Raji tümörü büyümesini önemli ölçüde bastirmistir (Sekil 7). Buna ilaveten, Ab1 tedavisinin etkileri doza bagimli olmustur ve 0.4 mg/kg Ab 1 çalisma boyunca büyümeyi tamamen baskilarken, 0,04 mg/kg Ab 1, . günde tümör büyümesini tamamen baskilamistir. Ne Ab1 ne de baglanmayan kontrol mAb, çalisma boyunca fare vücut agirligi üzerinde önemli bir etkiye sahip olmamistir (Sekil 8). SONUç Bir CD20xCD3 bsAb olan Ab1 ile tedavinin Raji tümör büyümesi üzerindeki etkisi, bir fare modeli üzerinde incelenmistir. Ab 1, hCD34+ ile asilanmis SIRPd BRG farelerinde (insan T, B ve NK hücrelerinin yani sira granülositler, monositler ve DC'lerle) tümör büyümesinin baskilanmasinda etkili olmustur. Ab 1 ile haftada iki kez tedavi, araç kontrollü ve baglanmayan kontrol ile tedaviyle karsilastirildiginda, Raji insan B hücreli lenfoma tümör büyümesinin, anlamli ve doza bagimli bir sekilde baskilanmasiyla sonuçlanmistir. Herhangi bir tedavi grubunda anlamli bir kilo kaybi gözlenmemistir. Bu sonuçlar Ab 1,in insan bagisiklik hücrelerine sahip olan farelerde Raji tümörlerini hedefledigini ve bunun bir sonucu olarak da önemli derecede tümör büyümesi supresyonunun gerçeklestigini göstermektedir. Esdegerler Bu sekilde mevcut bulusun en az bir düzenlemesinin birkaç yönünü tarif ettikten sonra, teknik alanda uzman kisiler, teknikte uzman kisilerce çesitli degisikliklerin, modifikasyonlarin ve gelistirmelerin kolayca gerçeklestirilebilecegini takdir edecektir. Bu gibi degisiklikler, modifikasyonlar ve gelistirmelerin bu tarifnamenin bir parçasi olmasi amaçlanmistir. Buna göre, yukarida verilen tarifname ve çizim sadece örnek amaçlidir. Istemin bir ögesini degistirmek için istemlerde "birinci , ikinci , uçüncü" gibi siradan terimlerin kullanilmasi tek basina bir istem ögesinin digerine göre herhangi bir önceligini, üstünlügünü ya da sirasini ya da bir yöntemin eylemlerinin yerine getirildigi zamansal sirayi ifade etmemekte, ancak istem elemanlarini ayirt etmek için sadece belirli bir ada sahip bir istem ögesini ayni ada sahip baska bir elemandan (ancak siradan bir terimin kullanimi için) ayirt etmek için sadece etiketler olarak kullanilmaktadir. Burada tarifnamede ve istemlerde kullanildigi sekliyle "bir" teriminin, aksi açikça belirtilmedigi sürece çogul referanslari içerdigi anlasilmalidir. Bir grubun bir ya da daha fazla üyesi arasinda "ya da" ifadesi bulunan istemler ya da açiklamalar, eger grup üyelerinden biri, birden fazlasi ya da tümü, aksi belirtilmedikçe ya da baglamdan açikça anlasilmadigi sürece, belirli bir ürün ya da proseste mevcut ise, kullanildiysa ya da bunlarla ilgiliyse, yerine getirilmis kabul edilmektedir. Bulus, grubun tam olarak bir üyesinin içinde bulundugu, kullanildigi ya da belirli bir ürün ya da islemle ilgili oldugu sekilde yapilan düzenlemeleri içermektedir. Bulus ayrica grup elemanlarindan birden fazlasinin ya da tamaminin belirli bir ürün ya da islem içerisinde mevcut oldugu, kullanildigi ya da aksi halde iliskili oldugu düzenlemeleri de içermektedir. Buna ilaveten, anlasilmasi gereken, aksi belirtilmedigi sürece ya da teknik alanda siradan uzmanliga sahip birine, bir çeliski ya da tutarsizligin ortaya çikacagi açik olmadigi sürece, bulusun listelenen istemlerin bir ya da daha fazlasindan bir ya da daha fazla sinirlamanin, ögenin, maddenin, tanimlayici terimin, vb., ayni baz istemine (ya da ilgili olarak, herhangi bir diger isteme) bagli olarak baska bir talebe dahil edildigi tüm varyasyonlari, kombinasyonlari ve permütasyonlari kapsayacagidir. Elemanlarin listeler halinde sunulmasi durumunda (örnegin, Markush grubu içerisinde ya da benzer bir formatta) elemanlarin her bir alt grubunun da açiklandigi ve herhangi bir elemanin gruptan çikarilabilecegi anlasilmalidir. Genel olarak anlasilmalidir ki, bulusun ya da bulusun belirli yönleri, belirli elemanlari, özellikleri v.b. içerecek sekilde ifade edildiginde bulusun bazi düzenlemeleri ya da bulusun yönleri bu unsurlar, özellikler vb.'den olusmakta ya da büyük oranda bunlardan olusmaktadir. Basitlik amaciyla, bu düzenlemeler, her durumda, ayrintili bir biçimde spesifik olarak ortaya konmamaktadir. Ayrica anlasilmalidir ki, bulusun herhangi bir düzenlemesi ya da yönü, spesifik bir çikarmanin spesifikasyonda belirtilip belirtilmedigine bakilmaksizin açikça istemlerden çikarilabilir. Teknik alanda uzman kisiler, analizlerde ya da burada tarif edilen diger islemlerde elde edilen degerlere atfedilebilen tipik sapma ya da hata standartlarini takdir edeceklerdir. Burada referans verilen yayinlar, web siteleri ve diger referans materyalleri, bulusun arka planini tarif etmekte ve uygulamasina yönelik ilave ayrintilar saglamaktadir. TR TR TR TR

Claims (15)

ISTEMLER

1. Genomu bir insanlastirilmis SIRPoi genini olusturmak üzere bir insan SIRPd geninin 2, 3 ve 4 ekzonlari ile bir endojen kemirgen SIRPoi lokusundaki bir kemirgen SIRPoi geninin 2, 3 ve 4 ekzonlarinin bir ikamesini içeren bir kemirgen olup, özelligi; burada, sözü edilen insanlastirilmis SIRPoi geninin söz konusu endojen kemirgen SIRPoi lokusundaki bir kemirgen SlRPoi promotörüne islevsel olarak baglanmasi ve bahsedilen kemirgende, bahsedilen insan SIRPoi geni tarafindan kodlanan insan SIRPoi proteininin hücre disi bir kismini ve bahsedilen kemirgen SIRPoi geni tarafindan kodlanan kemirgen SIRPd proteininin hücre içi bir kismini içeren insanlastirilmis bir SIRPoi proteinini ekspres etmesidir.

2. Istem 1'e göre kemirgen olup, özelligi; insanlastirilmis SIRPoi geninin, sözü edilen kemirgen SIRPoi geninin 1, 5, 6, 7 ve 8. ekzonlarini içermesidir.

3. Istem 1 ya da 2'ye göre kemirgen olup, özelligi; burada sözü edilen insan SIRPoi proteininin DIZI ID NO: 4'te belirtilen amino asit dizisini içermesidir.

4. Istem Sie göre kemirgen olup, özelligi; sözü edilen insanlastirilmis SIRPoi proteininin DIZI ID NO: 4'e ait amino asit kalintilari 28-362'yi içermesidir.

5. Istemler 1-4iten herhangi birine göre bir kemirgen olup, özelligi; kemirgenin bir kemirgen SIRPoi proteinini ekspres etmemesidir.

6. Genomu bir insanlastirilmis SIRPoi genini olusturmak üzere bir insan SIRPci geninin 2, 3 ve 4 ekzonlari ile bir endojen kemirgen SIRPoi lokusundaki bir kemirgen SIRPoi geninin 2, 3 ve 4 ekzonlarinin bir ikamesini içeren izole edilmis bir kemirgen hücresi veya dokusu olup, özelligi; burada adi geçen insanlastirilmis SIRPoi geninin söz konusu endojen kemirgen SIRPoi lokusundaki bir kemirgen SIRPoi promotörüne islevsel olarak baglanmasi ve bahsedilen insanlastirilmis SlRPd geni tarafindan kodlanan insan SIRPoi proteininin hücre disi bir kismini ve bahsedilen kemirgen SIRPoi geni tarafindan kodlanan kemirgen SIRPoi proteininin hücre içi bir kismini içeren insanlastirilmis bir SIRPoi proteinini kodlamasidir.

7. Istem &ya göre izole edilmis hücre ya da doku olup, özelligi; insanlastirilmis SIRPoi geninin, sözü edilen kemirgen SIRPd geninin 1, 5, 6, 7 ve 8. ekzonlarini içermesidir.

8. istem 6 ya da ?ye göre izole edilmis hücre ya da doku olup, özelligi; hücre ya da dokunun bir kemirgen SlRPoi proteinini ekspres etmemesidir.

9. Istem 6-8iden herhangi birine göre izole edilmis kemirgen hücresi olup, özelligi; kemirgen hücresinin bir kemirgen embriyonik kök hücresi olmasidir.

10. Bir kemirgen üretmek için yöntem olup, özelligi; sunlari içermesidir: (a) bir insanlastirilmis SIRPo genini olusturmak üzere bir insan SIRPoi geninin 2, 3 ve 4 ekzonlari ile bir kemirgen ES hücresindeki bir endojen kemirgen SIRPoi lokusunda bir kemirgen SIRPoi geninin 2, 3 ve 4 ekzonlarinin degistirilmesi, burada sözü edilen insanlastirilmis SIRPoi geninin, sözü edilen endojen kemirgen SlRPoi Iokusundaki bir kemirgen SIRPoi promotörüne islevsel bir sekilde baglanmasi ve söz konusu insan SIRPoi geni tarafindan kodlanan insan SIRPoi proteininin hücre disi bir kismini ve söz konusu kemirgen SlRPoi geni tarafindan kodlanan kemirgen SlRPoi proteininin hücre içi bir kismini içeren bir insanlastirilmis SIRPd proteinini kodlamasi; ve böylece sözü edilen insanlastirilmis SlRPd genini içeren modifiye bir kemirgen ES hücresi elde edilmesi; ve (b) (a)'da elde edilen modifiye edilmis ES hücresini kullanarak bir kemirgenin olusturulmasi.

11. istem 10'a göre yöntem olup, özelligi; insanlastirilmis SlRPd geninin, sözü edilen kemirgen SIRPor geninin 1, 5, 6, 7 ve 8. ekzonlarini içermesidir.

12. istem 10 ya da 11'e göre yöntem olup, özelligi; burada sözü edilen insan SIRPoi proteininin DIZI ID NO: 4'te belirtilen amino asit dizisini içermesidir.

13. istem 12*ye göre kemirgen olup, özelligi; sözü edilen insanlastirilmis SIRPoi proteininin DIZI ID NO: 4'e ait amino asit kalintilari 28-362'yi içermesidir.

14. Insan hücrelerini hedef alan bir ilacin terapötik etkinligini degerlendirmek için bir yöntem olup, özelligi; sunlari içermesidir: (a) bir ya da daha fazla insan hücresinin nakledildigi istem 1-6'dan herhangi birine göre bir kemirgenin saglanmasi; (b) bir ilaç adayinin sözü edilen kemirgene uygulanmasi; ve (C) ilaç adayinin terapötik etkinligini belirlemek için kemirgendeki insan hücrelerinin izlenmesi.

15. istemler 1-5'ten herhangi birine g'ore kemirgen, istemler 6-9rdan herhangi birine göre izole edilmis kemirgen hücresi ya da dokusu ya da istemler 10-14'ten herhangi birine göre yöntem olup, özelligi; kemirgenin bir siçan olmasidir.