[go: up one dir, main page]

TR201821294T4 - Böbrek Hastalığının Teşhisi Ve Tedavisine Yönelik Slit-robo Sinyal İletimi - Google Patents

Böbrek Hastalığının Teşhisi Ve Tedavisine Yönelik Slit-robo Sinyal İletimi Download PDF

Info

Publication number
TR201821294T4
TR201821294T4 TR2018/21294T TR201821294T TR201821294T4 TR 201821294 T4 TR201821294 T4 TR 201821294T4 TR 2018/21294 T TR2018/21294 T TR 2018/21294T TR 201821294 T TR201821294 T TR 201821294T TR 201821294 T4 TR201821294 T4 TR 201821294T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
roboz
robo2
protein
rob02
nephrin
Prior art date
Application number
TR2018/21294T
Other languages
English (en)
Inventor
Lu Weining
Fan Xueping
J Salant David
Original Assignee
Boston Medical Ct Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boston Medical Ct Corp filed Critical Boston Medical Ct Corp
Publication of TR201821294T4 publication Critical patent/TR201821294T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H20/00—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance
    • G16H20/10—ICT specially adapted for therapies or health-improving plans, e.g. for handling prescriptions, for steering therapy or for monitoring patient compliance relating to drugs or medications, e.g. for ensuring correct administration to patients
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16H—HEALTHCARE INFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR THE HANDLING OR PROCESSING OF MEDICAL OR HEALTHCARE DATA
    • G16H50/00—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics
    • G16H50/30—ICT specially adapted for medical diagnosis, medical simulation or medical data mining; ICT specially adapted for detecting, monitoring or modelling epidemics or pandemics for calculating health indices; for individual health risk assessment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)

Abstract

Buluş, ROBO2 biyolojik aktivitesini inhibe eden bir ROBO2 inhibitörünü içeren bir farmasötik bileşim ile ilgilidir, burada bahsedilen ROBO2 inhibitörü, intraselüler ROBO2 domeni bulunmayan ROBO2'nin hem Ig1 hem de Ig2 SLIT bağlayıcı domenlerini içeren bir füzyon polipeptidini ihtiva eden bir çözünür ROBO2 proteini olmaktadır.

Description

TARIFNAME BOBREK HASTALIGININ TESHISI VE TEDAVISINE Y'ONELIK SLIT-ROBO SINYAL BULUS SAHASI Mevcut bulusun sahasi, kronik böbrek hastaligi ve proteinüri tedavisine ve kronik böbrek hastaligi teshisine ve tedavinin, kronik böbrek hastaliginin ve proteinürinin ilerlemesi üzerindeki etkilerinin izlenmesine yönelik metotlar ile ilgilidir. Lu, W. ve ark. (Am. J. Hum. Genet. Cilt 80, No 4, Nisan 2007), ROBO2'nin bozulmasinin idrar yolu anomalileri ile iliskili oldugu ve vezikoüreteral reflü riski kazandirdigini bildirir. ROBO2 genini bozan ve birinci ROBOZ ekstraselüler immünoglobulin (lg) domenini içeren füzyon bulunan bir hasta kaydedilmistir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, ROBO2 biyolojik aktivitesini inhibe eden bir ROBOZ inhibitörünü içeren bir farmasötik bilesim saglamakta olup burada bahsedilen ROBOZ inhibitörü, intraselüler ROBOZ domeni bulunmayan ROBO2'nin hem Ig1 hem de I92 SLIT baglayici domenlerini içeren bir füzyon polipeptidini ihtiva eden bir çözünür ROBOZ proteini olmaktadir. Mevcut bulus, bir kronik böbrek hastaligi veya proteinürisi olan veya bu bakimdan riski bulunan bir bireyin tedavisinde kullanilmaya yönelik olarak, bahsedilen farmasötik bilesimi saglamaktadir. Burada, mevcut bulus sahiplerinin, podosit F-aktin hücre iskeleti ve böbrekteki ayaksi çikinti yapilarin düzenlenmesinde SLIT-ROBO sinyal iletim yolaginin rolüne yönelik yeni ve beklenmedik bir rolünün kesfi esasinda, kronik böbrek hastaligi ve proteinüri tedavisine ve kronik böbrek hastaliginin tanilanmasina ve tedavinin, kronik böbrek hastaliginin ve Buna göre, bazi yönlerine göre burada, ihtiyaç halindeki bir bireyde kronik böbrek hastaliginin tedavisine yönelik metotlar saglamakta olup bu metotlar, bir kronik böbrek hastaligi olan veya bu bakimdan riski bulunan bir bireye, bir ROBOZ inhibitörü içeren bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini ihtiva etmektedir. Gene burada, bazi yönlerine göre, ihtiyaç halindeki bir bireyde proteinüriyi azaltmaya yönelik olarak, proteinürisi olan veya bu bakimdan riski bulunan bir bireye, bir ROBO2 inhibitörü içeren bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini içeren metot saglanmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü; ROBOZ için spesifik olan bir bloke edici antikor veya bu antikorun bir antijen baglayici fragmani, ROBO2 için spesifik olan bir antisens molekülü, ROBO2 için spesifik olan bir kisa enterferans RNA (siRNA), ROBOZ'nin bir küçük moleküllü inhibitörü, bir ROBOZ inhibitör polipeptidi, ya da bir ROBOZ yapisal analogu olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü, ROBOZ'nin SLIT'e, ch'ye veya her ikisine baglanmasini bloke etmekte veya azaltmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü; Ig1 SLIT baglayici domen için, Ig1 ve lgZ SLIT baglayici domenler için, ch intraselüler baglanma domen için, ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonu için spesifik olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 inhibitör polipeptidi; bir dominant negatif ROBO2 füzyon proteini, intraselüler domen olmaksizin bir ROBOZ ekstraselüler domeni içeren bir polipeptit, ya da ekstraselüler domen olmaksizin bir ROBO2 intraselüler domeni içeren bir polipeptit olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre bir kronik böbrek hastaligi olan veya bu bakimdan riski bulunan bireyde, diyabetik nefropati veya yüksek kan basinci bulunmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre metot, ayrica bireye bir ilave terapötik ajan uygulanmasini ihtiva etmektedir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ilave terapötik ajan, bir anjiyotensin dönüstürücü enzim (ACE) inhibitörü veya bir anjiyotensin ll reseptör blokeri (ARB) olmaktadir. Gene burada, bazi yönlerine göre, asagidaki hususlari içeren metotlar saglanmaktadir: a. ROBO2 polipeptidinin veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan bir RNA'nin bir ekspresyon seviyesini belirlemek üzere bir bireyden alinan bir biyolojik test örneginin test edilmesi; b. biyolojik test örneginde, ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesinin veya ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinin, bir referans esik düzeyin üzerinde olup olmadiginin belirlenmesi; ve c. bireyin, kronik böbrek hastaligi tedavisine veya teshisine ihtiyaci oldugunun tanilanmasi. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesinin test edilmesi, ROBO2 polipeptidi için spesifik bir antikor veya bunun bir antijen baglayici fragmani kullanilarak gerçeklestirilir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre bir ROBO2 polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinin test edilmesi, PCR veya bir hibridizasyon testi kullanilarak gerçeklestirilir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre biyolojik test örnegi; bir böbrek biyopsisi, idrar, kan, serum örnegi, ya da bir idrar örneginden peletlenmis hücreler olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 polipeptidinin ekspresyon seviyesi veya bir ROBO2 polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesi, referans esik düzeyinin en az %20 üzerinde olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 polipeptidinin ekspresyon seviyesi veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesi, referans esik düzeyinin en az iki standart sapma kadar üzerinde olmaktadir. Gene burada, bazi yönlerine göre, asagidaki hususlari içeren testler saglanmaktadir: a. bir bireyden izole edilen bir biyolojik test örneginin, ROBOZ polipeptidini veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan bir RNA'yi saptayan bir reaktif ile temas ettirilmesi; ve b. ROBOZ polipeptidinin, ya da bir ROBOZ polipeptidini kodlayan bir RNA'nin düzeyinin ölçülmesi burada bahsedilen ROBOZ polipeptidinin veya bir ROBO2 polipeptidini kodlayan bahsedilen RNA'nin, bir normal biyolojik örnege göreli artmis bir seviyesi, bir bireyi, kronik böbrek hastaligina sahip oldugu ve / veya kronik böbrek hastaligi veya proteinüri hastaliginin ilerledigi yönünde tanilamaktadir. Bu testlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip testlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesinin saptanmasi, ROBO2 polipeptidi için spesifik bir antikor veya bunun bir antijen baglayici fragmani kullanilarak gerçeklestirilir. Bu testlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip testlerin bazi yapilanmalarina göre bir ROBO2 polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinin saptanmasi, PCR veya bir hibridizasyon testi kullanilarak gerçeklestirilir. Bu testlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip testlerin bazi yapilanmalarina göre biyolojik test örnegi; bir böbrek biyopsisi, idrar, kan, serum örnegi, ya da bir idrar örneginden peletlenmis hücreler olmaktadir. Bu testlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip testlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesi veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesi, referans esik düzeyinin en az %20 üzerinde olmaktadir. Bu testlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip testlerin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 polipeptidinin ekspresyon seviyesi veya bir ROBO2 polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesi, referans esik düzeyinin en az iki standart sapma kadar üzerinde olmaktadir. Bu testlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip testlerin bazi yapilanmalarina göre birey, diyabet veya yüksek kan basinci ile tanilanmis olmaktadir. Bazi yönlerine göre burada, bir bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan risk altinda olup olmadiginin, ya da kronik böbrek hastaligi bulunup bulunmadiginin belirlenmesine yönelik olarak, asagida sayilanlari içeren sistemler saglanmaktadir: a. bir bireyden elde edilen bir biyolojik örnekte, ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesini veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesini belirleyecek sekilde düzenlenen bir ölçüm modülü; b. ölçüm modülü tarafindan belirlendigi üzere, ROBO2 polipeptidinin bahsedilen ekspresyon seviyesini veya bir ROBO2 polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinini alacagi ve ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesinin veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinin, önceden belirlenmis bir referans seviyenin veya oranin üzerinde olup olmadigini belirleyecegi ve bir inceleme sonucu saglayacagi sekilde düzenlenen bir karsilastirma modülü; ve c. bahsedilen karsilastirma modülünden gelen veri çikisi esasinda bir içerigi ekranda göstermek üzere bir ekran modülü, burada bahsedilen içerik, ROBOZ polipeptidinin veya RNA'nin ekspresyon seviyesinin veya oraninin, önceden belirlenmis referans seviyesi veya oranindan daha büyük oldugunu gösteren bir sinyali, ya da ROBOZ seviyesinin veya ekspresyon oraninin, referans seviyesi veya önceden belirlenmis orandan daha büyük olmadigini gösteren bir sinyali içermektedir. Bu sistemlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ekran modülü üzerinde gösterilen içerik, ayrica, bireyin belirli bir tedavi rejimi almasini öneren bir sinyali içermektedir. Bazi yönlerine göre burada, bir bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan risk altinda olup olmadiginin, ya da kronik böbrek hastaligi bulunup bulunmadiginin belirlenmesine yönelik olarak, asagida sayilanlari içeren sistemler saglanmaktadir: a. bir bireyden elde edilen en az bir test örnegini alacagi ve asagidaki durumlardan herhangi birinin varligini veya yoklugunu belirlemek üzere bahsedilen en az bir test örnegi üzerinde en az bir analiz gerçeklestirecegi sekilde düzenlenen bir tayin modülü: i. ROBO2'nin, önceden belirlenmis bir orandan daha büyük bir ekspresyon orani, ii. ROBOZ'nin, önceden belirlenmis bir seviyeden daha büyük bir ekspresyon b. bahsedilen tayin modülünden gelen veri çikisini saklayacagi sekilde düzenlenen bir depolama aygiti; ve o. bir içerigin, bahsedilen tayin modülünden gelen veri çikisi esasinda görüntülenmesine yönelik bir ekran modülü, burada bahsedilen içerik, ROBOZ'nin ekspresyon oraninin önceden belirlenmis orandan veya önceden belirlenmis seviyeden daha büyük oldugunu gösteren bir sinyali, ya da ROBOZ ekspresyon oraninin, önceden belirlenmis orandan daha büyük olmadigini veya önceden belirlenmis seviyeden daha büyük olmadigini gösteren bir sinyali içermektedir. Bu sistemlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ekran modülü üzerinde gösterilen içerik, ayrica, bireyin belirli bir tedavi rejimi almasini öneren bir sinyali içermektedir. Gene burada, bazi yönlerine göre, kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riski tasiyan bir insan bireyin tedavi edilmesine yönelik olarak, bir referans esik seviyenin üzerinde bir ROBO2 protein seviyesi oldugu belirlenen bir insan bireye, kronik böbrek hastaligi veya proteinüri olusunu önlemek üzere bir tedavi veya terapi uygulanmasini içeren metotlar saglanmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ proteini seviyesi, referans seviyenin en az %20 üzerinde olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ proteini seviyesi, referans seviyenin en az iki standart sapma üzerinde olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre kronik böbrek hastaligi veya proteinüri olusunu önlemeye yönelik tedavi veya terapi, bir ROBOZ inhibitörünü ihtiva etmektedir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü; R0802 için spesifik olan bir bloke edici antikor veya bu antikorun bir antijen baglayici fragmani, ROBOZ için spesifik olan bir antisens molekülü, ROBO2 için Spesifik olan bir kisa enterferans RNA (siRNA), ROBOZ'nin bir küçük moleküllü inhibitörü, bir R0802 inhibitör polipeptidi, ya da bir ROBOZ yapisal analogu olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü, ROBO2'nin SLIT'e, ch'ye veya her ikisine baglanmasini bloke etmekte veya azaltmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 inhibitör'u; Ig1 SLIT baglayici domen için, Ig1 ve lgZ SLIT baglayici domenler için, ch intraselüler baglanma domen için, ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonu için spesifik olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitör polipeptidi; bir dominant negatif ROBO2 füzyon proteini, intraselüler domen olmaksizin bir ROBOZ ekstraselüler domeni içeren bir polipeptit, ya da ekstraselüler domen olmaksizin bir ROBOZ intraselüler domeni içeren bir polipeptit olmaktadir. Gene burada, bazi yönlerine göre, bir kronik böbrek hastaligi tedavisinde kullanilmaya yönelik ROBOZ inhibitörleri ve proteinüri tedavisinde kullanilmaya yönelik ROBOZ inhibitörü saglanmaktadir. Bu kullanimlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip kullanimlarin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 inhibitörü; ROBO2 icin spesifik olan bir bloke edici antikor veya bu antikorun bir antijen baglayici fragmani, ROBOZ için spesifik olan bir antisens molekülü, ROBOZ için spesifik olan bir kisa enterferans RNA (siRNA), ROBOZ'nin bir küçük moleküllü inhibitörü, bir ROBOZ inhibitör polipeptidi, ya da bir ROBOZ yapisal analogu olmaktadir. Bu kullanimlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip kullanimlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü, ROBOZ'nin SLIT'e, ch'ye veya her ikisine baglanmasini bloke etmekte veya azaltmaktadir. Bu kullanimlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip kullanimlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü; lg1 SLIT baglayici domen için, !91 ve IgZ SLIT baglayici domenler için, ch intraselüler baglanma domen için, ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonu için spesifik olmaktadir. Bu kullanimlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip kullanimlarin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 inhibitör polipeptidi; bir dominant negatif ROBOZ füzyon proteini, intraselüler domen olmaksizin bir ROBOZ ekstraselüler domeni içeren bir polipeptit, ya da ekstraselüler domen olmaksizin bir ROBOZ intraselüler domeni içeren bir polipeptit olmaktadir. Bu kullanimlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip kullanimlarin bazi yapilanmalarina göre göre kronik böbrek hastaligi veya proteinürinin sebebi, diyabetik nefropati veya yüksek kan basinci olmaktadir. Bu yönlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip yönlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ, SEQ kökenli ROBO2 anlamina gelmektedir. Bu yönlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip yönlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ, SEO ID NO: 4'nin mRNA dizisi tarafindan kodlanan SEQ Tanimlar Uygunluk saglamak bakimindan burada bu sartnamede, örneklerde ve ekli istemlerde kullanilan belirli terimler burada toparlanmistir. Aksi belirtilmedigi veya baglamdan dolayli olarak çikarilmadigi sürece asagidaki terimler ve ifadeler, asagida verilen anlamlari içerir. Aksi açikça belirtilmedigi sürece (veya baglamdan asikar olmadikça) asagidaki terimler ve ifadeler, terimin veya ifadenin ait oldugu teknikte kazanmis oldugu anlamini hariç tutmamaktadir. Bu tarifler, belirli yapilanmalari tarif etmeye yardimci olmak için saglanir ve koruma talep edilen bulusu sinirlandirmasi amaçlanmamaktadir, çünkü mevcut bulusun kapsami sadece istemler ile sinirlidir. Mevcut dokümanda kullanilan tüm bilimsel ve teknik terimler, aksi belirtilmedigi sürece mevcut bulusun dahil oldugu teknik alanin uzmanlarinca yaygin sekilde anlasilan anlamlara sahiptir. Burada kullanildigi haliyle "içeren" veya "içerir" terimi, bulus için zaruri olan, ancak zaruri olsun ya da olmasin belirtilmeyen unsurlarin dahil edilmesine gene de açik olan bilesimlere, metotlara ve bunlarin kendi bilesenine / bilesenlerine yönelik olarak kullanilir. Burada kullanildigi haliyle "büyük ölçüde olusur" terimi, belirli bir yapilanma için gerekli olan unsurlari ifade eder. Bu terim, mevcut bulusun o yapilanmasinin temel ve yeni veya fonksiyonel karakteristigini / karakteristiklerini maddi olarak etkilemeyen ilave elemanlarin varligina imkan verir. unsurundan ayri olan bilesimlere, metotlara ve bunlarin kendi bilesenlerine isarete eder. Bu tarifname boyunca ve ekli istemler bölümünde kullanilan "bir" gibi tekil ifadeler, içerikte aksi açikça belirtilmedigi sürece çogul durumlari da kapsar. Dolayisiyla, örnegin "metot" için yapilan bir atif, burada tarif edilen ve burada açiklananlari Okumalari üzerine ilgili teknikte uzman kisilerce anlasilacak olan tipteki bir veya daha fazla metodu ve I veya adimlari da kapsar. Çalisma örneklerinden baska, ya da aksi belirtilen yerlerde, burada kullanilan bilesenlerin miktarlarini veya reaksiyon sartlarini ifade eden tüm sayilar, her durumda "yaklasik olarak" terimi ile degistirilmis olarak anlasilmalidir. Yüzdeler ile baglantili olarak kullanildiginda Aksi belirtilmedikçe burada mevcut basvuru ile baglantili olarak kullanilan bilimsel ve teknik terimler, burada açiklananlarin sahasindaki teknigin uzmanlarinca yaygin olarak anlasildiklari anlamlari tasiyacaklardir. Bu bulusun, burada tarif edilen belirli metodoloji, protokoller ve reaktifler ile sinirli olmadigi ve dolayisiyla degiskenlik gösterebilecegi anlasilmalidir. Burada kullanilan terminoloji, sadece Özel yapilanmalari tarif etme amacina yöneliktir ve mevcut bulusun sadece istemlerde tanimlanan kapsamini sinirlandirmasi amaçlanmamaktadir. Immünoloji ve moleküler biyolojinin yayin terimlerinin tanimlari için bkz. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18. Baski, yayinlayan Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0- 911910-18-2); Robert S. Porter ve ark. (ed), The EncycIOpedia of Molecular Biology, yayinlayan Blackwell Science Ltd., , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, yayinlayan VCH Publishers, Inc., ; Immunology by Werner Luttmann, yayinlayan Elsevier, 2006. Moleküler biyolojinin yaygin terimlerinin tanimlari için bkz. Benjamin Lewin, Genes IX, yayinlayan Jones & Bartlett Publishing, : Kendrew ve ark. (ed), The Encyclopedia of Molecular Biology, yayinlayan Blackwell Science Ltd., , Maniatis ve ark., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., ABD (1982); Sambrook ve ark., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. baski), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., ABD (1989); Davis ve ark., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, ABD (1986); veya Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Cilt152, S. L. Berger ve A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, ABD (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel ve ark., ed., John Wiley and Sons, Inc.). Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, ve ark., ed., John Wiley and Sons, Inc.) ve Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ve ark., ed. John Wiley and Sons, Inc.). SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKILLER 1A-1R Robo2'nin podositlerin bazal hücre yüzeyinde ifade edildigi ve lokalize oldugunu gösterir. Sekiller 1A-1Q kapsamindaki tüm immün boyama çalismalari, farelerde gün E16.5'te 600X büyütme ile gerçeklestirilir (eriskin fare glomerüllerinde immün boyama çalismalari için bkz. Sekiller 5A-5M). Sekiller 1A-1C: R0b02, podosit yarikli diyafram proteini nefrin ile birlikte lokalize olur. Sekiller 1D-1F: R0b02, podosit yarikli diyafram proteini podosin ile birlikte lokalize olur. Sekiller 1G-1 I: R0b02, adaptör proteini ch ile glomerüllerde birlikte lokalize olur. Sekiller 1J-1L: R0b02, glomerüler bazal membran proteini nidojen ile bitisik olan bazal podosit yüzeyi üzerinde ifade edilir. Sekiller 1M-10: R0b02, glomerüler endotelyal hücre protein belirteci Pecam1 ile birlikte lokalize olmaz. Sekil IP: Sekil 1L içerisindeki büyütülmüs bölgesel kutu, Rob02'nin glomerüler bazal membran belirteci nidojen ile bitisik olan podositlerin (p) bazal hücre yüzeyi üzerinde dominant olarak ifade edildigini gösterir. Rob02, podositlerin apikal ve lateral hücre yüzeylerinde (ok baslari) zayif sekilde ifade edilir. Sekil 1Q: Rob02, podositlerin (p) bazal hücre yüzeyi (oklar) üzerinde dominant olarak ifade edilir ve apikal veya lateral hücre yüzeyleri (ok baslari) üzerinde zayif sekilde ifade edilir. Sekil 1R: immün-altin elektron mikroskobu, 3 haftalik bir farenin bir podositinde ayaksi çikintida (fp, foot process) Rob02 antikoru ile konjüge altin kisimlarinin (oklar) Iokalizasyonunu gösterir. GBM, glomerüler bazal membran. Büyütme: 50,000X. Ayrica bkz. Sekiller 5A-5M. Sekiller 2A-2J, Rob02'nin adaptör protein ch ile etkilesime girdigini ve nefrin ile bir kompleks olusturdugunu gösterir. Sekil 2A: Maya iki hibritli testleri, Rob02 intraselüler domeni (Rob02-ICD) ve chl arasinda pozitif bir etkilesim gösterir. LacZ raportör (X- gal): +++, maya koyulasti; ++, açik; -, 24 saat esnasinda. Lözin raportör (-Leu): +, maya büyüdü; -, maya büyümedi. CC, sitoplazmik konzerve bölge. Buradaki rakamlar, tam uzunluktaki proteinde rezidü pozisyonlarini gösterir. Sekil 28: Maya iki hibritli testleri, Rob02-lCD ile etkilesimi için, chl'nin ilk iki SH3 domeninin gerekli oldugunu gösterir. Sekil 2C: Maya iki hibritli testleri, Rob02 ve chI etkilesimine aracilik eden potansiyel baglayici domenleri gösterir. Buradaki dizi, Rob02'de chl'ye yönelik potansiyel baglayici bölgedir. Prolin yönünden zengin bölgeler, vurgulanir. Sekil 2D: Rob02 ve ch'nin birlikte presipitasyonu. Serit 5'teki hücre Iizatlari, His-myc-R0b02 ile transfekte hücrelerden toplanir (seritler 1 ve 2'de kullanilir); serit 6'daki hücre Iizatlari, His-myc- R0bo2-ANBD ile transfekte hücrelerden toplanir (seritler 3 ve 4'te kullanilir). Sekil 2E: Rob02, ch ve nefrinin birlikte presipitasyonu. Sekil 2F: Sekil 2E'deki ile benzer bir ortak presipitasyon, ancak His-myc-Rob02 yerine His-myc-nefrin asagi çekilir. Sekil 2G: Böbrek endojen Rob02, ch ve nefrinin birlikte immün presipitasyonu. Sekil 2H, Sekil 2G'deki ile benzer bir testtir, ancak fare anti-nefrin antikoru kullanilarak çökeltiler hazirlanir. (I) Slit2, Rob02-ch-nefrin kompleks olusumunu artirir. His-myc-Rob02, nefrin ve Fyn; Slit2 ile sartlandirilmis ortam (seritler 1, 3) veya kontrol ile sartlandirilmis ortam (serit 2, 4) ile uyarilan HEK hücrelerinde ifade edilir. Sekil 2J: Yeginlik kantifikasyonu (Sekil 2I). Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, n=7, *p < 0.05, **p < 0.01 (kontrol ile karsilastirmali olarak, bagimli örneklem ttesti). Ayrica bkz. Sekiller 6A- Sekiller 3A-3G. SIit2-Robo2 sinyal iletiminin, nefrin araciliginda gerçeklesen aktin polimerizasyonunu inhibe ettigini gösterir. Sekil 3A: CD16/7-NCD, Slit2 ile sartlandirilan ortam (Slit) veya kontrol ile sartlandirilan ortam (CTL) varliginda, anti-CD16 antikoru ve rodamin-konjüge anti-IgG antikoru ile muamele edilen HEK hücrelerinde Rob02 ile birlikte ifade edilir. Hücreler daha sonra fikse edilir ve F-aktini açiga çikarmak üzere FlTC-konjüge falloidin ile boyanir. Olçek sütunu, 5 um. NCD: nefrin sitoplazmik domeni. Sekil SB: Sekil 3A kapsamindaki test ile benzerdir, ancak CD16/7-NCD, CD16/7-HA ile ikame edilir ve bir kontrol testi olarak kullanilir. Sekil BC: F-aktin kuyruklari olan hücrelerin, toplam hücrelere yüzdesi; her bir gruptaki CD16/7 kümeleri kantifiye edilir. Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, *p < 0.01, n=5. Sekil 3D: Slit2 ile sartlandirilan ortam stimülasyonu (seritler 1 ve 3) veya kontrol ile sartlandirilan ortam stimülasyonundan (seritler 2 ve 4) sonra, Sekil 3A kapsamindaki CD16/7-NCD. anti- CD 16 antikoru ile immün presipitasyona tabi tutulur. Serit 1'de F-aktin düsüsüne dikkat edilmelidir. CD16/7-HA, bir negatif kontrol olarak kullanilir. Sekil 3E: Sekil 3D'nin yeginlik kantifikasyonu. Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, n=4, *p < 0.05 (kontrol ile karsilastirmali olarak, bagimli örneklem t testi). Sekil 3F: Nefrinin, anti-nefrin antikoru kullanilarak Rob02'si nakavt edilen homozigot (Rob02-H, heterozigot (Rob02+/-) ve yabanil tipteki (Rob02+/+) fare böbreklerinden immün presipitasyonu. Serit 3'te F-aktin artisina dikkat edilmelidir. Sekil 3G: Sekil 3F'nin yeginlik kantifikasyonu. Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, n=4, *p < 005 (yabanil tip ve heterozigot ile karsilastirmali olarak, ANOVA analizi). Ayrica bkz. Sekiller 7A-7C. Sekiller 4A-4W, Rob02 homozigot null, Rob02 podosit spesifik nakavt ve Rob02 ile Nphs1 bakimindan ikili nakavt farelerde podosit yapisal fenotiplerini gösterir. Sekiller 4A ve 48: Yeni dogan böbreklerinin temsili görselleri, yabanil tip (Sekil 4A) ve Rob02 homozigot null farelerde (Sekil 48) podosit cisimcikleri (ok baslari) ve Bowman kapsülünü (oklar) gösterir. Sekiller 4C ve 4D: Sekiller 4A ve 4B'nin yüksek büyütme seviyesindeki görüntüleri, yeni dogan böbreginde podosit ayaksi çikintilari gösterir. Olçek sütunu, 1 um. Sekiller 4E ve 4F: Düsük büyütme seviyesinde 3 haftalik böbreklerin temsili görselleri, yas eslesmeli bir kontrol ile karsilastirmali olarak (Sekil 4E), bir Rob02 homozigot null farede podosit hücre cisimcigini gösterir (Sekil 4F). Sekiller 4G ve 4H: Sekiller 4E ve 4F'nin yüksek büyütme seviyesindeki görüntüleri, 3 haftalik bir Rob02 homozigot null farede (Sekil 4H), yasa göre eslestirmeli kontrolde görülen (Sekil 4G) düzenli fermuar seklindeki ayaksi çikintilar ile karsilastirildiginda, düzensiz ve daha kisa kivrimli ayaksi çikintilar (ok) gösterir. Olçek çubugu: 2 um. Sekiller 4I ve 4J: Temsili transmisyon elektron mikroskopi görüntüleri (büyütme 5000x), bir aylik Rob02 podosit-spesifik nakavt bir faredeki fokal kismi podosit ayaksi çikinti efasmanini (Sekil 4J'deki ok) ve kontroldeki normal fenotipi (Sekil 4I) gösterir. Kisaltmalar: gc: glomerüler kapiler; us: uriner bosluk. Sekiller 4K ve 4L: Yüksek büyütme seviyesindeki transmisyon elektron mikroskopi görüntüleri (40000x), iki aylik bir Rob02 podosit-spesifik mutant farede, kontrol ile karsilastirmali olarak (Sekil 4K) daha genis podosit ayaksi çikintilar (Sekil 4L'deki ok) gösterir. Kisaltmalar: fp, podosit ayaksi çikinti; GBM, glomerüler bazal membran. Sekil 4M: Bir aylik Rob02de'5/f'OX;TgNphsz'Cre* podosit spesifik nakavt farede ve yabanil tip "littermate" kontrollerde (WT) podosit ayaksi çikintinin kantifikasyonu. Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, n=333, *p < 0.01. Sekil 4N: Spot idrar ELlSa testi, yabanil tip kontrol (WT) ile karsilastirildiginda, Rob02de'5/"°x; Nphs2-Cre+ (KO) eriskin farelerde artmis bir albümin/kreatinin orani gösterir. Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, n=20, *p < 0.01. Sekil 40: Western blot analizi, idrardaki albümin varligini gösterir; her bir göze 1 pl idrar konulmus ve 0.2 ug albümin bir pozitif kontrol olarak kullanilmistir. WT, üç adet yabanil tip es batin yavrusu; Rob02 KO, üç adet Rob02deI5/flox;Nphs2-Cre+ faresi. Sekiller 4P ve 4Q: Temsili taramali elektron mikroskop görüntüleri, Nphs1-I- tek homozigot yeni dogan fare böbreginde düzensiz hücresel çikintilara (oklar) benzer, bozuk, birbirine geçmis podosit ayaksi çikintilari gösterir. Olçek çubugu: 1 um. Sekiller 4R ve 48: Nphs1-I-Rob02-I- ikili homozigot yeni dogan farelerin glomerülleri, toparlanmis, birbirine geçen ayaksi çikintilar (oklar) göstererek, Rob02'nin nakavt edilmesi ile nefrin null fenotipin azalmasini ortaya koyar. Sekiller 4T ve 4U: Rob02-I- tekli homozigot yeni dogan farelerin glomerülleri, düzensiz ve daha genis ayaksi çikintilar, ancak kapsamli, birbirine geçen bir desen olusumu (oklar) sergiler. Sekiller 4V ve 4W: Normal, düzenli, birbirine geçen bir ayaksi çikinti örüntüsü (oklar) ile yeni dogan yabanil tip farelerin glomerülleri. Ayrica bkz. Sekiller 8A-82 ve Tablolar 1-4. Sekiller 5A-5M, Rob02'nin gelisen ve eriskin glomerüllerinde ifade edildigini gösterir. Sekiller 5A ve 5B: In situ hibridizasyon analizi, Rob02 transkriptlerinin E16.5'te gelisen glomerüllerde (oklar) ifade edildigi gösterir. Büyütme: 60X Sekil 5A ve 200X Sekil SB. noktasina gelisen glomerüller esnasinda ifade edildigini gösterir. Büyütme: 600X. Sekil 5G: IHC çalismalari, Rob02'nin, 5 haftalik eriskin fare glomerüllerinde spesifik olarak ifade edildigini gösterir. DAPI, böbrekteki hücre çekirdeklerini ifade eder. Büyütme: 400X. Sekil 5H: 5 haftalik böbrekteki IHC ko-Iokalizasyon boyamalari, Rob02'nin glomerülde podosit belirteci Wt1 ile birlikte ifade edildigini gösterir. Büyütme: 600X. Sekiller 5I-5K: Rob02 ve WT1, fare glomerülünde E165 noktasinda birlikte ifade edilir. Büyütme: 600X. Sekiller 5L ve 5M: 5 haftalik böbrekte yapilan IHC ko-Iokalizasyon boyama çalismasi, glomerülde mezangial hücre belirteci Pdgfrb (Sekil 5L) ve endotel hücre belirteci Pecam1 (Sekil 5M) ile birlikte ifade edilir. Büyütme: 600X. Sekiller 6A-6F', Rob02'nin ch ile etkilesime girdigini ve nefrin ile, Slit2 stimülasyonu ile artirilan bir kompleks olusturdugunu gösterir. Sekil 6A: Rob02'nin endojen ch'li nefrin ile ko-IP çalismasi. Rob02, nefrin ve Fyn; HEK hücrelerinde ifade edilir ve Slit2 ile uyarilir. Endojen ch, bir anti-ch antikoru ile immün presipitasyondan geçirilir. Fare ekspresyonu ile artar. Sekiller GB ve 6C: Slit2, yeni dogan fare glomerüllerinde immün peroksidaz boyamasi (Sekil 68) ile ifade edilir ve glomerülde podosit belirteci Synaptopodin ile birlikte ifade edilir (Sekil GC). Büyütme: 600X. Sekiller 6D ve 6D': CD16/7-NCD, HEK hücrelerinde, anti-CD16 antikoru ve rodamin-konjüge anti-IgG antikoru ile muamele edilen Slit2 varliginda Rob02 ile birlikte ifade edilir, daha sonra fikse edilir ve anti-R0b02 antikoru ile boyanir. CD16/7-NCD kümeleri, Rob02 ile birlikte lokalize olur (Sekil 6D), ancak kontrol CD16/7-HA kümelerinde ko-Iokalizasyon gözlenmez (Sekil 6D'). Olçek çubugu: 5 um. NCD: nefrin sitoplazmik domeni. Sekiller 6E ve 6E': R silinmesi, Slit2 varliginda CD16/7- NCD ile birlikte lokalize olmasini bozar. CD16/7-NCD kümeleri, Rob02 ile birlikte lokalize olur (Sekil 6E), ancak RoboZ-ANBD kümelerinde ko-Iokalizasyon gözlenmez (Sekil GE'). Olçek çubugu: 5 um. Sekiller 6F ve 6F': Slit2 stimülasyonu, HEK hücrelerinde CD16/7-NCD ve R0b02 ko-Iokalizasyonunu artirir. CD16/7-NCD kümeleri, Slit2 varliginda R0b02 ile birlikte lokalize olur (Sekil GF), ancak kontrol ile sartlandirilan ortam ile olmaz (Sekil 6F'). Olçek çubugu: 5 um. Sekiller 7A-7C, R0b02'de ch baglayici domenin silinmesinin, nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonu üzerinde Slit2-Rob02 inhibisyonunu tehlikeye soktugunu gösterir. Sekil 7A: CD veya kontrol ile sartlandirilan ortam (CTL) varliginda, anti-CD16 antikoru ve rodamin-konjüge anti-IgG antikoru ile kümelenen HEK hücrelerinde birlikte ifade edilmistir. Hücreler daha sonra fikse edilmis ve F-aktin liflerini açiga çikarmak üzere FlTC-konjüge falloidin ile boyanmistir. CD16/7-NCD ve F-aktin liflerinin kümeleri, konfokal mikroskopi ile incelenmistir. Olçek çubugu, 5 pm. NCD, nefrin sitoplazmik domeni. Sekil 78: CD16/7- NCD ve R0b02-ANBD, HEK hücrelerinde birlikte ifade edilmistir. Olçek çubugu, 5 um. NBD, ch baglayici domen. Sekil 70: Her bir grupta, F-aktin kuyruklari olan hücrelerin, CD16/7-NCD içeren toplam hücrelere yüzdesi kantifiye edilmistir. Veriler; ortalama ± ikili nakavt farelerde glomerüler fenotipi ve Rob02-Nefrin sinyal iletiminin `önerilen bir modelini gösterir. Sekiller 8A-8F: Yeni dogan (NB) R0b02de'5/de'5 mutant farelerin böbreklerinde yapilan transmisyon elektron mikroskopi analizi. Sekiller 8A, 80, 8E: dereceli büyütme ile yeni dogan heterozigot bir R0b02 kontrol faresinin glomerüler ultra yapisi. Sekiller 85, 8D, 8F: Düsük (Sekil 85), orta (Sekil 8D) ve yüksek (Sekil 8F) dereceli büyütme ile yeni dogan homozigot bir R0b02 (-/-) (R0b02deVde'5) mutant farenin glomerüler ultra yapisi. Oklar, fokal ayaksi çikinti efasmanini gösterir. Kisaltmalar: go: glomerüler kapiler; us: uriner bosluk; GBM: glomerüler bazal membran. Sekiller SG-8N: R0b02 podosit-spesifik nakavt farelerde anormal podosit ayaksi çikinti örüntüleri. Sekiller 8G-8J: Bir aylik R0b02de'5'"°x; Nphs2-Cre+ podosit-spesifik nakavt fareler ve yasa göre eslemeli R0b02"l+ kontrol farelerine ait glomerüllerin temsili taramali elektron mikroskop görüntüleri. Bir aylik bir R0b02 podosit-spesifik nakavt farede birbirine geçen podosit ayaksi çikintilarinda hafif düzensizlikler bulunmustur (Sekiller 8K ve 8N). Yedi aylik oldugunda R0b02 podosit-spesifik nakavt fareler, belirgin düzensiz ayaksi çikintilar gelistirmistir (Sekiller 8L ve 8N). Olçek çubugu: 10 um büyütme ile). Sekiller 80-8T: R0b02 podosit-spesifik nakavt farelerde glomerüler morfoloji. Sekiller boyama çalismasinda, yasa göre eslemeli kontroller ile karsilastirildiginda (Sekiller 80, BG), 2 aylik ve 6 aylik R0b02 podosit-spesifik nakavt farelerinde (Sekiller 8P, 8R) mezangial matriks genislemesi görülmüstür. Sekil 88: Glomerüllerin kantitatif analizi, yasa göre eslemeli yabanil tip (WT) kontrolleri ile karsilastirildiginda, 12 aylik R0b02 podosit-spesifik nakavt farelerinde (MU) mezangial matriks genislemesi gösterir. Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, n=5, *p < 0.01. (T) R0b02 podosit spesifik nakavt, podosit sayisini etkilemez. Podosit hücreleri, WT-1 boyamasi kullanilarak belirlenmistir. Birim glomerüler kesitteki podosit sayisi, dört adet yasa göre eslemeli yabanil tip fareler (WT) ile karsilastirildiginda, dört adet bir yasindaki Robo2de'5'f'0X; TgNPhSz'cre+ podosit spesifik nakavt farelerinde (MU) sayilmistir. Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, p = 0.645, Nphsi ikili nakavt farelerde glomerüler fenotip. Sekil 8U: H&E boyamasi, bir Nphsi* tekli homozigot yeni dogan farede Bowman boslugunun karakteristik dilatasyonlarina sahip glomerülleri gösterir (400X). Sekil 8V: Bir Robo2+ tekli homozigot yeni dogan farenin glomerülleri, Bowman boslugu dilatasyonlari olmadigini gösterir (400X). Sekil 8W: Anlamli Bowman boslugu dilatasyonlari (oklar) bulunmayan, normal görünen glomerüller bir R0b02'l'; Nphs1'/` ikili homozigot yeni dogan farede gösterilerek, Nphs'l' tip yeni dogan fare kontrolüne ait normal böbrek ve glomerüllerin H&E boyamasi; 400X. Sekil 8Y: Yeni dogan farelerde genislemis Bowman boslugu bulunan glomerüllerin kantifikasyonu, Nphs1"'" tekli homozigot (R0b02"";Nphsi'/') ile karsilastirmali olarak Robo2'l';Nphs1'/' ikili homozigot durumunda Bowman boslugunun karakteristik genislemis fenotipini gösterir. Veriler; ortalama ± SEM olarak sunulur, *p < 0.01. Sekil 82: Nefrin üzerinde Slit2-R0b02 sinyal iletiminin inhibitör etkilerinin, podosit ayaksi çikinti yapisini etkileme modeli: Fizyolojik sartlar altinda (örnegin ayaksi çikinti gelisimi esnasinda), nefrin intraselüler fosforillenmis tirozin domenleri (YDxV-p), SH2 domeni ile etkilesimi sebebiyle ch rekrutmani saglar. ch ise, aktin polimerizasyonunu desteklemek üzere kendi SH3 domenleri yoluyla hücre iskeleti regülatörlerini toplar. SIit2, ch'nin SH3 domenleri ile Rob02 intraselüler domen etkilesimini artirmak üzere R0b02'ye baglanir ve bu durum, ch'nin sitoskeletal regülatörlere baglanmasini önleyebilecek ve nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonunun bir inhibisyonu ile sonuçlanabilecektir. Dengeli aktin polimerizasyonu, bir normal ayaksi çikinti yapisi için podosit gelisimi esnasinda muhafaza edilir. SIit2-R0b02 sinyal iletimi olmadiginda (örnegin Rob02, nakavt oldugunda), Rob02'nin nefrin ile uyarilan polimerizasyon üzerindeki etkisi kaybolur. ch'nin SH3 domenleri, aktin polimerizasyonunu artirmak üzere akis asagi sitoskeletal regülatöri ile etkilesime girebilir ve bu durum, Rob02 mutant farelerinde degismis podosit ayaksi çikinti yapisini izah edebilir. Kisaltmalar: lg: Immünoglobulin domeni; FN3: Fibronektin tip 3 domeni; SH2: Src homolog 2 domeni; SH3: Src homolog 3 domeni; CCO, CC1, CC2, CCS: Sitoplazmik Konzerve bölge O, 1, 2, 3. DETAYLI AÇIKLAMA Rob02'nin, itici kilavuz isareti Slit için bir hücre yüzeyi reseptörü oldugu ve sinir sisteminde akson kilavuzlugu ve nöronal migrasyona müdahil oldugu daha önce gösterilmistir. Nefrin, böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinde islev gösteren bir podosit slit-diyafram proteini olmaktadir. Biz, Rob02'nin, örnegin fare podositleri gibi podositlerin bazal yüzeyinde ifade edildigini ve nefrin ile birlikte lokalize oldugunu burada göstermekteyiz. Biyokimyasal çalismalar, R0b02'nin adaptör protein ch ile böbrekte nefrin ile bir kompleks olusturdugunu gösterir. Nefrinin, aktin polimerizasyonunu destekleyen rolünün zitti olarak, SIit2-Rob02 sinyal iletiminin, nefrinle uyarilan aktin polimerizasyonunu inhibe ettigini burada göstermekteyiz. Ornegin nefrin ile birlesik F-aktin miktari, degismis bir podosit ayaksi çikinti yapisi ve mikroalbuminüri gelistiren Rob02 nakavt farelerinde artmaktadir. Genetik etkilesim çalismalari ayrica Rob02 kaybinin, nefrin null farelerinde, anormal podosit fenotipini azalttigini ortaya koymaktadir. Burada saglanan sonuçlar, Rob02 sinyal iletiminin, podosit ayaksi çikinti mimarisini etkilemek üzere nefrin üzerinde bir negatif regülatör olarak etki ettigini gösterir. Dahasi, vezikoüreteral reflüsü (VUR) olan bir hastanin, ROBOZ genini bozan ve SLIT2- ROBOZ sinyal iletim yolagini ortadan kaldiran dominant negatif ROBOZ füzyon proteinleri üreten bir kromozom translokasyonu sergiledigi de gösterilmistir. Normal olarak VUR, idrarin mesaneden üreterlere ve böbrege retrograd akisi ile karakterize bir hastaliktir ve VUR hastalari, siddetli proteinüri ile ortaya çikan bir durum olarak reflü nefropatisi gösterebilir. Bir VUR hastasi tarafindan üretilen dominant negatif ROBOZ füzyon proteinlerinin, SLIT2-ROBOZ sinyal iletim yolagini bloke ettigi ve hastayi, reflü nefropatisinden ve proteinüriden korudugu gösterilmistir ve bu durum, bulus sahiplerinin, hayvan modellerinde kronik böbrek hastaligi tedavisi amaciyla SLIT2-ROBOZ sinyal iletim yolagini hedeflemedeki terapötik degeri dogrulamakta ve ayrica desteklemektedir. Normal böbrege göre, fenestre endotel hücrelerinden, bazal membran ve podositlerden olusan trilaminer glomerüler kapiler duvar, plazma proteinlerine geçirgenligi sinirlandirmaktadir. Podositler, glomerüler bazal membranin dis yüzeyini kaplamak üzere primer ve sekonder çikintilari uzatan uzmanlasmis epitel hücrelerdir. Komsu podositlerden gelen aktin zengini, birbirine geçen sekonder çikintilari, yani ayaksi çikintilar, protein geçirgenligine son bariyeri olusturan bir yari gözenekli yarik- diyafram ile köprülenen filtreleme yariklari olusturur. Ornegin nefrin ve baskalari gibi podosit slit-diyafram proteinlerinin genetik mutasyonlari, proteinürik böbrek hastaliginin kalitsal formlari ile iliskili olmakla birlikte (Tryggvason ve ark., 2006), slit- diyaframi olusturan ve bu diyaframla birlesen proteinlerin, bir basit yapisal bariyerden daha fazlasi oldugu asikar hale gelmistir. Bu proteinler, podosit ayaksi çikinti yapisini etkileyebilen ve F-aktin hücre iskeleti ile etkilesim yoluyla islev gösterebilen dengeli bir sinyal iletim agidir Roundabout (Robo) ailesi proteinleri olarak, Robot, Rob02, Rob03 ve Rob04, salinan ligant Slit için hücre yüzeyi reseptörleridir (Dickson ve Gilestro, 2006). Slit1, Slit2 ve Slit3, ilk olarak, sinir sisteminin gelisimi esnasinda akson yol bulucu (pathfinding) ve göç edici nöronlara yönelik itici kilavuz isaretleri olarak bulunmustur (Guan ve Rao, 2003). Transmembran proteini Robo, ekstraselüler domeninde bes adet lg motifi ve üç adet fibronektin tip III (FNIII) tekrari ihtiva eder (Dickson ve Gilestro, 2006). Her iki immünoglobulin (lg) motifi (1 ve 2) Slit ile etkilesime girerken, Robo'nun birinci Igi motifi, Slit'e yönelik primer baglanma pozisyonudur (Dickson ve Gilestro, 2006). Robo'nun intraselüler domeni; CCO, CC1, CC2 ve CC3 olarak adlandirilan dört adet sitoplazmik konzerve (CC) diziye sahiptir (Bashaw ve ark., 2000; Kidd ve CC3, prolin zengini uzantilardir. Slit-Robo sinyal iletiminin itici aktivitesi, aktin polimerizasyonunu inhibe eder (Guan ve Rao, 2003) veya F-aktin depolimerizasyona sebep olur (Piper ve ark., 2006). SIit-Robo sinyali, erken böbrek indüksiyonu ve üreterik tomurcuk asiri büyümesi esnasinda kritik rol oynar. Slit2 veya Rob02 içermeyen fare mutantlari; dubleks böbrekler, anormal üreterovezikal bileskeler ve hidronefroz gibi genis spektrumda idrar kanali fenotiplerine yol açan, ihtiyaç fazlasi üreterik tomurcuklar gelistirir (Grieshammer ve ark., 2004; Lu ve ark., 2007). Insanlarda ROBOZ'nin bozulmasi, böbreklerde ve idrar yollarinda konjenital anomalilere (CAKUT) sebep olur ve ROBOZ'nin nokta mutasyonlari, vezikoüreteral reflüsü (VUR) olan hastalarda saptanmistir (Lu ve ark., 2007). Yakin tarihli çalismamiz, Rob02'nin, normal bir üreteral orifisin olusumu ve etkili bir anti-reflü mekanizmasinin korunmasi için kritik öneme sahip oldugunu gösterir (Wang ve ark., 2011). Burada, R0b02'nin, böbrekte glomerüler podositlerin bazal yüzeyinde ifade edilen ve nefrin ve podosin ile birlikte lokalize olan yeni bir podosit proteini oldugunu göstermekteyiz. R0b02, adaptör protein ch SH3 domenleri ile direkt olarak etkilesime girer ve nefrin ile bir kompleks olusturur. R0b02 nakavt fareleri, degismis podosit ayaksi çikintilar gelistirirken, R0b02 kaybi, nefrin null farelerinde görülen ayaksi çikinti yapisal anomalilerini hafifletir. Burada tarif edilen sonuçlar, R0b02 sinyal iletiminin, podosit ayaksi çikinti mimarisini etkilemek üzere nefrin üzerinde bir negatif regülatör olarak etki ettigini gösterir. Gene burada gösterildigi üzere, bir hasta tarafindan üretilen dominant negatif ROBOZ füzyon proteinlerinin, SLIT2-ROBOZ sinyal iletim yolagini bloke ettigi ve hastayi, reflü nefropatisinden ve proteinüriden korudugu kesfedilmistir ve bu durum, burada tarif edildigi üzere, hayvan modellerinde kronik böbrek hastaligi tedavisi amaciyla SLIT2-ROBO2 sinyal iletim yolagini hedeflemenin terapötik degerini dogrulamakta ve ayrica desteklemektedir. Buna göre, bazi yönlerine göre burada, ihtiyaç halindeki bir bireyde kronik böbrek hastaliginin tedavisine yönelik metotlar saglamakta olup bu tip metotlar, bir kronik böbrek hastaligi olan veya bu bakimdan riski bulunan bir bireye, bir SLIT2-ROBO2 inhibitörü içeren bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini ihtiva etmektedir. Gene burada, bazi yönlerine göre, ihtiyaç halindeki bir bireyde proteinüriyi azaltmaya yönelik olarak, proteinürisi olan veya bu bakimdan riski bulunan bir bireye, bir SLIT2-ROBO2 inhibitörü içeren bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini içeren metotlar saglanmaktadir. Baska yönlerine göre burada, ihtiyaç halindeki bir bireyde böbrek hastaliklarini önlemeye veya böbrek hastaliklarinin profilaksisini desteklemeye yönelik metotlar saglanmakta olup bu metotlar, bireydeki böbrek hastaligini önleyecek veya profilaksisini destekleyecek sekilde, bir SLIT2-ROBO2 sinyal iletim yolagi inhibitörünü içeren bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin ilgili bireye uygulanmasini içermektedir. Gene burada, bazi yönlerine göre, ihtiyaç halindeki bir bireyde böbrek hastaliginin etkilerini hafifletmeye, böbrek hastaliginin siddetini azaltmaya, böbrek hastaligi gelistirme ihtimalini azaltmaya ve / veya böbrek hastaliginin ilerlemesini yavaslamaya yönelik metotlar saglanmaktadir. Burada kullanildigi haliyle "ROBOZ", dogal olarak meydana gelen her allelik, splays varyantlari MARRHERVTRRMWTWAPGLLMMTVVFWGHQGNGQGQGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIV SKGEPTTLNCKAEGRPTPTIEWYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKP DEGSYVCVARNYLGEAVSRNASLEVALLRDDFRQNPTDWVAAGEPAILECQPPRGHPEPT FLRRPINQVVLEEEAVEFRCQVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTD EGTYMCIAENRVGKMEASATLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFW QKEGSQNLLFPNQPQQPNSRCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVT DVLTDRPPPIILQGPANQTLAVDGTALLKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGT LQIKNLRISDTGTYTCVATSSSGETSWSAVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVT KNSVTLSWQPGTPGTLPASAYIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVR AINPQGLSDPSPMSDPVRTQDISPPAQGVDHRQVQKELGDVLVRLHNPVVLTPTTVQVTWT VDRQPQFIQGYRVMYRQTSGLQATSSWQNLDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNE FQGMDSESKTVRTTEEAPSAPPQSVTVLTVGSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIIQEYKIWCL GNETRFHINKTVDAAIRSVIIGGLFPGIQYRVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEWITENN NSITEQITDWKQPAFIAGlGGACWVILMGFSIWLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSN GSRPGLLNAGDPSYPWLADSWPATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTAT MLSDGAIYSSIDFTTKTSYNSSSQITQATPYATTQILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDL MGFGYSLPDQNKGNNGGKGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEH YAVEQQENGYDSDSWCPPLPVQTYLHQGLEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQS TATLTPSPREEMQPMLQAHLDELTRAYQFDIAKQTWHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALIS DLETDVADDDADDEEEALEIPRPLRALDQTPGSSMDNLDSSVTGKAFTSSQRPRPTSPFST DSNTSAALSQSQRPRPTKKHKGGRMDQQPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHS SSGTASSKGSTGPRKTEVLRAGHQRNAS DLLDIGYMGSNSQGQFTGEL (Homo sapiens roundabout homolog 2 izoformu ROBOZa; SEQ ID NO: 1) amino asit dizisine sahip polipeptide isaret eder; veya örnegin NP_ tarafindan kodlanan: MSLLMFTQLLLCGFLYVRVDGSRLRQEDFPPRIVEHPSDVIVSKGEPTTLNCKAEGRPTPTIE WYKDGERVETDKDDPRSHRMLLPSGSLFFLRIVHGRRSKPDEGSYVCVARNYLGEAVSRN ASLEVALLRDDFRQNPTDWVAAGEPAILECQPPRGHPEPTIYWKKDKVRIDDKEERISIRG GKLMISNTRKSDAGMYTCVGTNMVGERDSDPAELTVFERPTFLRRPINQVVLEEEAVEFRC QVQGDPQPTVRWKKDDADLPRGRYDIKDDYTLRIKKTMSTDEGTYMCIAENRVGKMEASA TLTVRAPPQFVVRPRDQIVAQGRTVTFPCETKGNPQPAVFWQKEGSQNLLFPNQPQQPNS RCSVSPTGDLTITNIQRSDAGYYICQALTVAGSILAKAQLEVTDVLTDRPPPIILQGPANQTLA VDGTALLKCKATGDPLPVISWLKEGFTFPGRDPRATIQEQGTLQIKNLRISDTGTYTCVATSS SGETSWSAVLDVTESGATISKNYDLSDLPGPPSKPQVTDVTKNSVTLSWQPGTPGTLPASA YIIEAFSQSVSNSWQTVANHVKTTLYTVRGLRPNTIYLFMVRAINPQGLSDPSPMSDPVRTQ DISPPAQGVDHRQVQKELGDVLVRLHNPWLTPTTVQVTWTVDRQPQFIQGYRVMYRQTS GLQATSSWQNLDAKVPTERSAVLVNLKKGVTYEIKVRPYFNEFQGMDSESKTVRTTEEAPS APPQSVTVLTVGSYNSTSISVSWDPPPPDHQNGIlQEYKIWCLGNETRFHINKTVDAAIRSVII GGLFPGIQYRVEVAASTSAGVGVKSEPQPIIIGRRNEVVITENNNSITEQITDVVKQPAFIAGIG GACWVILMGFSIWLYWRRKKRKGLSNYAVTFQRGDGGLMSNGSRPGLLNAGDPSYPWLA DSWPATSLPVNNSNSGPNEIGNFGRGDVLPPVPGQGDKTATMLSDGAIYSSIDFTTKTSYN SSSQITQATPYATTQILHSNSIHELAVDLPDPQWKSSIQQKTDLMGFGYSLPDQNKGNNGG KGGKKKKNKNSSKPQKNNGSTWANVPLPPPPVQPLPGTELEHYAVEQQENGYDSDSWCP PLPVQTYLHQGLEDELEEDDDRVPTPPVRGVASSPAISFGQQSTATLTPSPREEMQPMLQA HLDELTRAYQFDIAKQTWHIQSNNQPPQPPVPPLGYVSGALISDLETDVADDDADDEEEALE HKGGRMDQQPALPHRREGMTDEEALVPYSKPSFPSPGGHSSSGTASSKGSTGPRKTEVL RAGHQRNASDLLDIGYMGSNSQGQFTG EL (Homo sapiens roundabout homolog 2 izoformu ROBOZb; SEQ ID NO: 3) amino asit dizisine sahip polipeptide isaret eder. Tipik oldugu üzere ROBOZ, insan kökenli ROBOZ anlamina gelir. ROBOZ geni; sempanze, Rhesus maymunu, köpek, büyükbas, fare, siçan, tavuk, zebra baligi, meyve sinegi, sivrisinek ve C.elegansta korunmus durumda bulunur. ROBOZ'nin spesifik rezidülerine, örnegin "ROBOZ(30)" denilebilir. ROBO2'nin spesifik domenleri, bu isimlendirme ile de anilabilir. Bes adet immünoglobulin motifi ve üç adet fibronektin tip III (FNIII) tekrari içeren N-terminal veya "ROBO2 ekstraselüler domeni", SEQ ID NO: 1 - ROBOZ( olarak anilabilir. Slit2 ile etkilesime giren immünoglobulin (lg) motifleri 1 ve 2, ya da "lg SLIT baglayici domen", sirasiyla SEQ ID NO: 1 - ROBO ve sirasiyla SEQ ID NO: 3 - ROBO seklinde belirtilir. Benzer olarak, burada tarif edilen dört adet intraselüler prolin zengini motifler içeren "ch intraselüler baglayici domene" sahip "intraselüler domen", SEQ ID NO: 3 - ROBOZ(881-1378) olarak anilabilir. Burada kullanildigi haliyle "ROBOZ inhibitörü", "ROBOZ antagonisti", "ROBOZ inhibitör ajani" ve "ROBO2 antagonisti ajani" terimleri, örnegin ROBO2 sinyal iletiminin aracilik ettigi akis asagi yolaklarin aktivitesi, mesela ROBOZ'nin adaptör protein ch ile etkilesimi ve I veya nefrin ile kompleks olusturmasi, nefrin aracili aktin polimerizasyonunun SLIT2-ROBO-2 aracili inhibisyonu ve / veya ROBOZ'ye bir hücresel yanitin uyarilmasi gibi, ROBOZ'nin (memeli, örnegin insan kökenli ROBOZ) biyolojik aktivitesini in vitro, in situ ve / veya in vivo olarak anlamli ölçüde bloke eden, inhibe eden, azaltan, ya da engelleyen bir molekülü veya ajani ifade eder. Bir ROBOZ inhibitörüne atfen kullanildigi haliyle "ajan" terimi, bunlarla sinirli olmamak üzere bir küçük molekül, nükleik asit, polipeptit, peptit, ilaç, iyon vs. gibi her bilesik veya maddeyi ifade eder. Bir "ajan", bunlarla sinirli olmaksizin sentetik veya dogal olarak meydana gelen proteinli ve proteinli olmayan varliklar da dahil olmak üzere her kimyasal varlik veya grup olabilir Burada tarif edilen yönlerin bazi yapilanmalarina göre bir ajan; bir nükleik asit, bir nükleik asit analogu, bir protein, bir antikor, bir peptit, bir aptamer, nükleik asitlerin bir oligomeri, bir amino asit, ya da bir karbonhidrat olmaktadir ve bunlarla sinirli olmamak üzere proteinler, oligonükleotitler, ribozimler, DNAzimIer, glikoproteinler, antisens RNA'Iar, siRNAlar, tarif edilen terapötik bilesimlerde ve metotlarda kullanilmaya yönelik bilesiklerin, arzu edilen bir aktiviteye ve I veya özelligi sahip olduklari, ya da ilgili teknikte uzman kisilerce bilinen tarama metotlari kullanilarak çesitli bilesiklerin bir kitapligindan seçilebildigi bilinmektedir. Burada tarif edilen çesitli yönlerde ve yapilanmalarda kullanilmak üzere öngörülen temsili ROBO2 inhibitörleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, ROBOZ'ye spesifik olarak baglanan anti- ROBOZ antikorlari veya bunlarin antijen baglayici fragmanlarini; ROBO2'yi kodlayan bir nükleik aside (örnegin ROB02a veya ROB02b veya her ikisi) hedeflenen anti-sens molekülleri; ROBOZ'yi kodlayan bir nükleik asidi (örnegin ROBOZa veya ROBOZb veya her ikisi) hedefleyen kisa enterferans RNA ("siRNA") molekülleri; ROBOZ'ye baglanan ve ROBO2 aracili sinyal iletimini inhibe eden / azaltan / bloke eden RNA veya DNA aptamerleri; ROB02 yapisal analoglari; ve çözünür ROBOZ proteinleri, inhibitör polipeptitleri, mesela dominant negatif polipeptitler, ya da bunlarin füzyon polipeptitlerini içerir. Bu yönlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip yönlerin bazi yapilanmalarina göre bir ROBO2 inhibitörü (örnegin bir antikor veya bu antikorun bir antijen baglayici fragmani), ROBOZ'ye (fiziksel olarak etkilesime girerek) baglanir, akis asagi ROB02 sinyal iletimini hedefler ve I veya ROB02 sentezini, üretimini veya salimini inhibe eder (azaltir). Bu yönlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip yönlerin bazi yapilanmalarina göre bir ROBO2 inhibitörü, bunu baglar ve örnegin SLIT2 gibi bir SLIT protein yapilanmalarina göre bir ROB02 inhibitörü, bir ya da daha fazla ROBOZ izoformunun ekspresyonunu (yani transkripsiyon veya translasyon) spesifik olarak azaltir veya elimine eder. Burada kullanildigi haliyle bir ROB02 inhibitörü veya antagonisti, ROBOZ'nin bir hücredeki (örnek olarak podositler) aktivitesini ve / veya ekspresyonunu, ROB02 inhibitörünün olmadigi durumdaki aktivite veya ekspresyon seviyesine göreli olarak, en az %5, en az %10, en az %15, en az %98, en az %99, ya da daha fazla azaltma becerisine sahiptir. Buna göre, burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü, ROB02 aracili sinyal iletimini inhibe etmektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü; ROBO2'nin adaptör protein ch ile etkilesimini ve / veya nefrin ile kompleks olusturmasini, nefrin araciliginda gerçeklesen aktin polimerizasyonunun SLIT2-ROBO-2 aracili inhibisyonunu ve / veya ROBOZ'ye hücresel yanit uyarilmasini hedeflemektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre, bir antikor veya antikorun antijen baglayici fragmani gibi ROBOZ inhibitörlerinin baglanma pozisyonlari, bir SLIT2 Iigant etkilesim pozisyonu gibi bir ROBO2 Iigant etkilesim pozisyonuna yönlendirilmektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre, bir antikor veya antikorun antijen baglayici fragmani gibi ROBOZ inhibitörlerinin baglanma pozisyonlari, örnegin bir ch etkilesim pozisyonu gibi bir ROBO2 adaptör etkilesim pozisyonuna veya ROBOZ'nin dört adet intraseli'iler prolin zengini motifini içeren NCK intrasel'uler baglayici domene yönlendirilmektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörlerinin baglanma pozisyonlari, reseptörün (örnegin ROBO2) kendi Iigandi (örnegin SLIT2) ile etkilesimine sterik engelleme saglamak amaciyla, ligant etkilesim pozisyonunun yakininda bulunan bir hedef 'üzerindeki bir pozisyona yönlendirilmektedir. Burada tarif edilen bir ROBOZ inhibitörü, bir ROBOZ Iigant etkilesim pozisyonuna baglanmak yoluyla, ROBO2 aktivitesini veya ekspresyonunu ve takip eden ROBOZ sinyal iletimi sonuçlarini (örnek olarak ROBOZ'nin adaptör protein ch ile etkilesimi ve / veya nefrin ile kompleks olusturmasi, nefrin aracili aktin polimerizasyonunun SLIT2- ROBOZ aracili inhibisyonu ve / veya ROBO2'ye bir hücresel yanitin uyarilmasi) azaltabilir veya inhibe edebilir. Ornegin burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörlerinin baglanma pozisyonlari, ROBOZ `üzerinde, en azindan Ig1'i ve tercih edildigi haliyle hem lg1 hem de I92 pozisyonlarini (yani SEQ ID NO: 1'e ait ROBOZ(46-145) ve ROBOZ( bloke eder veya hedef alir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 inhibitörlerinin baglayici pozisyonlari, ch intrasel'uler baglayici domeni, yani SEQ lD NO: 3'e ait ROBOZ(881-1378) içeren ROBOZ intraseli'iler domeni bloke eder veya hedefler. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörlerinin baglayici pozisyonlari, ROBOZ'nin dört intraselüler prolin zengini motifini içeren ROBO2 ch intrasel'i'iler baglayici domeni bloke eder veya hedefler. Bu süreç, örnegin antikorlar ve bunlarin antijen baglayici fragmanlari, inhibitör RNA'lar vs. gibi ilgili teknikte layikiyla bilinen ve burada tarif edilen çesitli vasitalar ile gerçeklestirilebilir. Buna göre, burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitör'ü, ROBOZ ile selektif sekilde baglanan veya fiziksel olarak etkilesime giren bir antikor veya bunun bir antijen baglayici fragmani olmaktadir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü, ROBOZ'ye baglanan ve ch ile etkilesimi ve / veya nefrin ile kompleks olusumunu inhibe eden ve / veya bloke eden ve/ veya önleyen bir antikor veya bir antijen baglayici fragmani anlamina gelir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre antikor veya bu antikorun antijen baglayici fragmani, ROBOZ'nin lg SLIT baglayici domenine baglanir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre antikor veya antikorun antijen baglayici fragmani, ROBO2'nin lg1SLIT baglayici domenine, ya da ROBO2'nin hem lgl hem de lgZ SLIT baglayici domenlerine (yani SEQ ID NO: 1'e ait ROBOZ( ve SEO ID NO: 3'e ait ROBOZ( baglanir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre antikor veya antikorun antijen baglayici fragmani, bloke edilir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre antikor veya antikorun antijen baglayici fragmani, ROBO2'nin dört adet intraselüler prolin zengini motifini içeren ch intraselüler baglayici domene baglanir veya bloke eder. Burada tarif edilen bilesimlerde kullanilmak üzere ve burada tarif edilen metotlari gerçeklestirmek üzere uygun olan, ROBOZ'ye spesifik veya ROBOZ'yi spesifik olarak baglayan antikorlar tercihen monoklonaldir ve bunlarla sinirli olmamak üzere, tek zincirli antikorlar, Fab fragmanlari, F(ab') fragmanlari, bir Fab ekspresyon kütüphanesi ile üretilen fragmanlar ve / veya bunlarin herhangi birinin baglayici fragmanlari da dahil olmak üzere insan, hümanize veya kimerik antikorlari içerir. Antikorlar, immünoglobulin moleküllerine ve immünoglobulin moleküllerinin immünolojik olarak aktif kisimlarina, yani antijen veya hedef baglayici pozisyonlar veya "antijen baglayici fragmanlar" içeren moleküllere de isaret eder. Burada tarif edilen immünoglobulin molekülleri, ilgili teknigin uzman kisisi tarafindan anlasildigi haliyle, immünoglobulin molekülünün herhangi bir tipi (Örnek olarak IgG, IgE, lgM, lgD, lgA ve lgY), sinifi (mesela lgG1, lgG2, IgGS, IgG4, lgA1 ve lgA2) veya alt sinifi olabilir. Buna göre burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre burada tarif edilen bir ROBOZ inhibitörü, bir monoklonal anti-ROBOZ antikoru veya bir antijen baglayici fragmani olmaktadir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre burada tarif edilen bir ROBOZ inhibitörü, bir ROBOZ antikor fragmani veya antijen baglayici fragmani olmaktadir. Burada kullanildigi haliyle "antikor fragmani", "antijen baglayici fragman" ve "antikor türevi" terimleri, bir intakt antikorun, genellikle bir antijen baglama pozisyonunu içeren ve böylece antijen baglama becerisini koruyan sadece bir kismini içeren bir protein fragmani anlamina gelir. Antikor fragmani veya antijen baglayici fragmani ile kapsanan antikor fragmanlarinin Örnekleri, asagida sayilanlari içerir: (i) VL, CL, VH de CH1 domenlerine sahip Fab fragmani; (ii) CH1 domeninin C-terminusunda bir veya daha fazla sistein rezidüsüne sahip bir Fab fragmani olan Fab' fragmani; (iii) VH ve CH1 domenlerine sahip Fd fragmani; (iv) VH ve CH1 domenlerine sahip olan ve CH1 domeninin C-terminusunda bir veya daha fazla sistein rezidüsü içeren Fd' fragmani; (v) bir antikorun tek bir koluna ait VL ve VH domenlerine sahip olan Fv fragmani; (vi) bir VH domeninden veya bir VL domeninden olusan bir dAb fragmani (Ward ve ark., Nature 2 fragmanlari olarak, mentese bölgesinde bir disülfid köprüsü ile bagli iki Fab' fragmani içeren çift degerlikli bir fragman; (ix) tek zincirli antikor molekülleri (örnegin tek zincirli Fv; scFv) (Bird ve ark., Science 242z423-426 ( ayni polipeptit zincirinde bir hafif zincir degisken domenine (VL) bagli bir agir zincir degisken domeni (VH) içeren, iki antijen polipeptitleri ile birlikte, antijen baglayici bölgelerin bir çiftini meydana getiren bir çift tandem Fd kismi (VH-CH1-VH-CH1) içeren "lineer antikorlar" (Zapata ve ark., Protein Eng. 8(10):1057- polialkilen glikolün (mesela polietilen glikol, polipropilen glikol, polibütilen glikol) veya baska uygun bir polimerin kovalent olarak baglanmasi ile degismis) versiyonlari. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bir ROBOZ inhibitörü veya antagonisti, bir ROBOZ antagonist antikorunun veya bunun antijen baglayici fragmaninin bir kimerik antikor türevi olmaktadir. Burada tarif edilen ROBO2 inhibitörü veya antagonist antikorlari ve bunlarin antijen baglayici fragmanlari bazi yapilanmalara göre bir hümanize antikor türevi de olabilir. Bazi yapilanmalara göre burada tarif edilen ROBOZ inhibitörü veya antagonist antikorlari ve bunlarin antijen baglayici fragmanlari, böylesi bir kovalent baglanmanin antikorun örnegin ROBOZ gibi bir hedef antijene baglanmasini engellemedigi sürece, herhangi tipteki bir molekülün antikora kovalent olarak baglanmasi yoluyla modifiye olan türevleri içerir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre, insan hastalarin terapötik tedavisi için özellikle arzu edilen, tamamen insan kökenli antikorlar kullanilir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü, örnegin SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 4 ya da her ikisi, ya da bunlarin ilgili domenleri gibi, ROBOZ'yi kodlayan nükleik asitleri hedefleyerek belirli bir fonksiyonel ROBO2'nin ekspresyonunu bloke edebilen veya azaltabilen en az bir adet antisens molekül içerir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bahsedilen en az bir adet antisens molekül, ROBOZ'nin lg SLlT baglayici domenini kodlayan nükleik asitleri hedeflemektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bahsedilen en az bir adet antisens molekül, ROBOZ'nin Ig1 SLIT baglayici domenini veya ROBOZ'nin hem Ig1 hem de IgZ SLIT baglayici domenlerini kodlayan nükleik asitleri hedeflemektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bahsedilen en az bir adet antisens molekül, ROBO2 intraselüler domenini kodlayan nükleik asitleri hedeflemektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bahsedilen en az bir antisens molekül, ROBOZ'nin dört adet intraselüler prolin zengini motifini içeren ch intraselüler baglayici domeni kodlayan nükleik asitleri hedeflemektedir. Baska polinükleotitler ile Çapraz reaksiyona girmeden ROBOZ mRNA'sini spesifik olarak baglayacak olan antisens oligonükleotit moleküllerinin hazirlanmasina yönelik metotlar ilgili teknikte uzman kisilerce bilinmektedir. Temsili hedef pozisyonlari, bunlarla sinirli olmamak üzere baslatma kodonu, promotörler veya hizlandiricilar da dahil olmak üzere 5' regülatör bölgeleri, herhangi bir konzerve konsensüs bölgesi de dahil olmak üzere kodlayici dizi ve 3' çevrilmemis bölgeyi içerir. Bu yönlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip yönlerin bazi yapilanmalarina göre antisens oligonükleotitleri, yaklasik olarak 10 ila yaklasik 100 nükleotit uzunlugunda, yaklasik 15 ila yaklasik 50 nükleotit uzunlugunda, yaklasik 18 ila yaklasik 25 nükleotit uzunlugunda veya daha uzun olmaktadir. Belirli yapilanmalara göre antisens oligonükleotitleri, örnegin ilgili teknikte uzman kisilerce bilinen fosforotioat baglantilari ve 2-0- sekeri modifikasyonlari gibi nükleaz direncini artirmak üzere vs. kimyasal modifikasyonlar da Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 inhibitörü, örnegin SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 4, ya da bunlarin ilgili domenleri gibi, ROBOZ'nin her iki izoformunu kodlayan nükleik asitleri hedefleyerek fonksiyonel ROBOZ'nin ekspresyonunu bloke edebilen veya azaltabilen en az bir adet kisa interferans RNA (siRNA) molekülü de içerir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bahsedilen en az bir adet siRNA molekülü, ROBOZ'nin lg SLIT baglayici domenini kodlayan nükleik asitleri hedeflemektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bahsedilen en az bir adet siRNA molekülü, ROBOZ'nin I91 SLIT baglayici domenini veya ROBOZ'nin hem Ig1 hem de Ig2 SLIT baglayici domenlerini kodlayan nükleik asitleri hedeflemektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bahsedilen en az bir adet siRNA molekülü, ROBOZ intraselüler domenini kodlayan nükleik asitleri hedeflemektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bahsedilen en az bir siRNA molekülü, ROBO2'nin dört adet intraselüler prolin zengini motifini içeren ch intraselüler baglayici domeni kodlayan nükleik asitleri hedeflemektedir. Baska polinükleotitler ile Çapraz reaksiyon vermeden, ROBOZ mRNA'yi spesifik olarak hedefleyecek olan siRNA moleküllerinin hazirlanmasi, rutin bir islemdir. Burada tarif edilen bilesimlerde ve metotlarda kullanilmaya yönelik siRNA molekülleri, örnegin tipik bir kati faz oligonükleotit sentezi gibi ilgili teknikte bilinen metotlar ile üretilebilir ve siklikla, siRNA ajaninin yari ömrünü ve / veya etkinligini artirmak üzere ve / veya daha stabil bir uygulama formülasyonuna imkan vermek üzere kimyasal modifikasyonlar içerecektir. Alternatif olarak siRNA molekülleri, siRNA'nin intraselülertranskripsiyonu için bir ekspresyon kasetini kodlayan bir vektör kullanilarak uygulanir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü, ROBO2'nin bir veya daha fazla izoformuna baglanan bir RNA veya DNA aptameri olmaktadir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bir ROBO2 inhibitörü veya antagonisti, ROBOZ ile baglanan veya fiziksel olarak etkilesime giren ve örnegin SLIT2 veya ch olmak üzere, ROBOZ ve bir Iigant veya bir adaptör molekül arasindaki etkilesimleri bloke eden bir RNA veya DNA aptameri olmaktadir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bir ROBO-2 inhibitörü veya antagonisti, ROBO2 ile baglanan veya fiziksel olarak etkilesime giren ve nefrin aracili aktin polimerizasyonunun SLIT2- ROBO-2 aracili inhibisyonu ve / veya ROBO2'ye bir hücresel yanitin uyarilmasi gibi akis asagi ROBOZ sinyal iletimini azaltan, engelleyen veya bloke eden bir RNA veya DNA aptameri olmaktadir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre RNA veya DNA aptameri, ROBOZ'nin lg SLIT baglayici domenine baglanmakta veya fiziksel olarak etkilesime girmektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre RNA veya DNA aptameri, ROBOZ'nin lg1SLIT baglayici domenine, ya da ROBOZ'nin hem Ig1 hem de Ig2 SLIT baglayici domenlerine (yani SEQ ID NO: 1'e ait ROBOZ(46-145) ve ROBOZ( baglanmakta veya fiziksel olarak etkilesime girmektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre RNA veya DNA aptameri, ROBOZ intraselüler domenine, yani SEQ ID NO: 3'e ait ROBOZ(881-1378)'e baglanmakta veya fiziksel olarak etkilesime girmektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre RNA veya DNA aptameri, ROBOZ'nin dört adet intraselüler prolin zengini motifini içeren ch intraselüler baglayici domene baglanmakta veya fiziksel olarak etkilesime girmektedir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü, bunlarla sinirli olmamak üzere küçük peptitler veya peptit benzeri moleküller, çözünür peptitler ve sentetik, peptidil olmayan organik veya inorganik bilesikler de dahil olmak üzere, ROBOZ'yi hedefleyen veya baglanan bir küçük moleküllü bilesik veya ajan olmaktadir. Burada kullanildigi haliyle "küçük molekül" terimi, bunlarla sinirli olmamak üzere bir peptit, bir peptidomimetik, bir amino asit, bir amino asit analogu, bir polinükleotit, bir polinükleotit analogu, bir aptamer, bir nükleotit, bir nükleotit analogu, birim molde yaklasik 10,000 gramdan daha düsük molekül agirligina sahip bir organik veya inorganik bilesik (yani heterorganik ve / veya organometalik bilesikler de dahil), birim molde yaklasik 5,000 gramdan daha düsük molekül agirligina sahip organik veya inorganik bilesikler, birim molde yaklasik 1,000 gramdan daha düsük molekül agirligina sahip organik veya inorganik bilesikler, birim molde yaklasik 500 gramdan daha düsük molekül agirligina sahip organik veya inorganik bilesikler ve bu tip bilesiklerin tuzlari, esterleri ve farmasötik olarak kabul edilebilir diger formlarini içerir. Küçük molekül baglanmasinin temsili pozisyonlari, bunlarla sinirli olmamak üzere ROBZ'nin, SLIT2'ye veya adaptör ch'ye baglanan kismini, yani ROBOZ'nin lg1SLIT baglayici domenini, ya da ROBO2'nin hem Ig1 hem de lgZ SLIT baglayici domenlerini, ROBOZ intraselüler domenini veya ROBOZ'nin dört adet intraselüler prolin zengini motifini içeren ch intraselüler baglayici domenini içerir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bir ROBO2 inhibitörü veya antagonisti, ROBO2'ye baglanan ve ROBOZ'nin biyolojik aktivitesini inhibe eden bir küçük molekül ihtiva eder. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü veya antagonisti, örnegin bir dominant negatif ROBOZ polipeptidi gibi en az bir adet ROBO2 yapisal analogu ihtiva eder. Burada kullanildigi haliyle ROBO2 yapisal analoglari, ROBO2'ninkinin bir parçasi olarak benzer üç boyutlu bir yapiya sahip olan ve SLIT2'ye ve / veya ch'ye in vitro veya in vivo olarak fizyolojik sartlar altinda baglanan bilesikler anlamina gelir ve burada bahsedilen baglanma, örnegin nefrin aracili aktin polimerizasyonunun SLIT2-ROBOZ aracili inhibisyonu ve / veya ROBOZ'ye bir hücresel yanitin uyarilmasi gibi bir ROBOZ biyolojik aktivitesini en azindan kismi olarak inhibe eder. Uygun ROBOZ yapisal analoglari, örnegin ROBO2-SLIT2 baglanmasinin moleküler modellenmesi yoluyla dizayn edilebilir ve sentezlenebilir. ROBOZ yapisal analoglari, Iyilesmis afiniteler ve biyolojik etkiler elde etmek amaciyla ayni veya farkli yapilardaki istenen her kombinasyonda bulunan monomerler, dimerler veya daha yüksek dereceden multimerler olabilir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre bir ROBO2 inhibitörü veya antagonisti, en az bir çözünür ROBO2 reseptörü veya bunun bir füzyon polipeptidini, mesela bir ROBO2 inhibitör polipeptidi ihtiva eder. Bu tip bazi yapilanmalara göre ROBOZ inhibitörü polipeptit, bir dominant negatif ROBOZ füzyon proteini olmaktadir. Burada tarif edilen bilesimlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ inhibitörü polipeptit, ROBOZ ekstraselüler domeni, örnegin ROBO2`nin lgtSLlT baglayici domenini veya intraselüler ROBOZ domenleri olmaksizin ROBO2'nin hem lg1 hem de IgZ SLIT baglayici domenlerini ihtiva eder. Burada tarif edilen bilesimlerde ve metotlarda kullanilmaya yönelik ROBO2 inhibitörleri veya antagonistleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, mesela Ornekler içerisinde tarif edildigi gibi protein-protein baglanma testleri, biyokimyasal tarama testleri, immün testleri ve hücre tabanli testler gibi ilgili teknikte bilinen metotlar kullanilarak belirlenebilir veya karakterize edilebilir. Ornegin ROBOZ ve kendi Iigandi (mesela SLIT2) arasindaki etkilesimi inhibe eden bir molekülü belirlemek üzere baglanma testleri kullanilabilir. Ornegin ROBO2 veya SLIT, bir mikrotitre plak üzerinde, kovalent veya kovalent olmayan baglanma ile sabitlenir. Bu test, saptanabilir bir isaret ile isaretlenebilen, sabitlenmemis bir bilesen (ligant veya reseptör), sabitlenmis bilesene, bir test ajanin varliginda veya yoklugunda eklenerek gerçeklestirilir. Reaksiyon tamamlandiginda, reaksiyona girmeyen bilesenler uzaklastirilir ve baglayici kompleksler saptanir. Eger ki baglayici komplekslerinin olusumu, test ajaninin varligi ile inhibe olur ise, test ajani, örnegin ROBOZ ve SLIT2 arasinda baglanmayi inhibe eden bir aday antagonist olarak kabul edilebilir. Hücre tabanli veya membran tabanli testler de ROBOZ inhibitörlerini belirlemek için kullanilabilir. Baska yapilanmalara göre ROBO2 gen ekspresyonunun düzeyleri saptanarak ve / veya ölçülerek, ROBO2 gen ekspresyonunu inhibe eden ROBOZ inhibitör molekülleri test edilebilir. ROBOZ gen ekspresyonu, örnegin gerçek zamanli RT-PCR, enzime bagli immünosorban testi ("ELISA"), Northern blot, ya da akim sitometri gibi ve teknigin uzmanlarinca bilinen çesitli metotlar ile saptanabilir ve / veya ölçülebilir. Bu tip saptanmis ROBOZ inhibitörleri, örnegin glomeri'iler ve interstisyel yaralanma modelleri gibi kronik böbrek hastaliginin in vivo hayvan modelleri (örnegin NZB fareleri (NZB x NZW) F1 hibrit (NZB/W olarak adlandirilir) da dahil olmak üzere lupus nefrit hayvan modelleri ve bunlarin konjenik t'urevleri, MRL/Ipr ve BXSB suslari), yaslanmanin hayvan modelleri (örnegin yasli Sprague Dawley siçanlari ve yasli C57BL/6 fareleri); spontan hipertansif siçanlar (SHR): insan idiopatik nefrotik sendromun bir modeli olarak Buffalo/mna siçanlari; eriskinlikte hipertansiyon ve tuz hassasiyetinin gelismesine yatkin olarak, nefron sayisindaki bir konjenital kusur ile iliskili bir genetik model olan Munich Wistar Frömter (MWF) fareleri; primer podosit-spesifik genetik FSGS modelleri; HIV ile baglantili nefropati (HIVAN) transgenik fare modelleri; tip IV kolajenin 03, 04, ya da 05 zincirlerinin mutasyonlarini (COL içeren Alport sendromunun hayvan modelleri; bagisikligin indüklendigi modeller, örnegin mezanjiyoproliferatif glomeri'ilonefritn (MsPGN) bir deneysel siçan modeli olan Thy-1 nefrit modeli, anti-glomerüler bazal membran (GBM) modelleri; ve bagisikligin indüklenmedigi modeller kullanilarak ayrica test edilebilir. Burada kullanildigi haliyle ROBOZ inhibitör'u ile ilgili "selektif olarak baglanir" veya "spesifik olarak baglanir" veya "spesifiktir" terimi, burada tarif edilen bir ROBOZ inhibitörünün, örnek olmasi bakimindan bir ROBOZ antagonist antikoru veya bunun ROBOZ antijeni baglayici fragmaninin, bir hedefe (yani ROBOZ), 10'5 M ( veya daha az, örnegin 106 M veya az, 10'11 M veya daha az, ya da 10'12 M veya daha az bir KD degeri ile baglanmasi anlamina gelir. Ornegin burada tarif edildigi haliyle bir ROBOZ inhibitörü / antagonisti, örnegin baska ROBO ailesi üyeleri gibi ilgili bir moleküle degil de ROBO2'ye 10'5 M veya altinda bir KD degeri ile baglanir ise, bu ajanin ROBOZ'ye spesifik olarak baglandigi söylenir. Spesifik baglanma, örnegin ROBOZ inhibitöri'i /antagonist antikorunun, ya da bunun antijen baglayici fragmaninin afinitesi ve aviditesi ve polipeptit ajaninin konsantrasyonu ile etkilenebilir. Ilgili teknikte uzman kisi, burada tarif edilen polipeptit ajanlarinin, uygun bir hücre baglanma testinde bir polipeptit ajanin titrasyonu gibi uygun olan her metot kullanilarak hedeflere selektif olarak baglandigi ROBO2 aktivitesinin inhibe edilmesi yoluyla kronik böbrek hastaligini tedavi etme metotlari ile ilgili olarak "kronik böbrek hastaligi veya KBH terimi, ilerleyen nefron kaybi ve sonucunda böbrek fonksiyonu kaybi sebebiyle zaman içerisinde yavas ve kademeli olarak kötülesen böbrek hastaliklarini ifade eder. Erken evrelerde semptom bulunmayabilir. Fonksiyon kaybinin meydana gelmesi genellikle aylar veya yillar alir. Böbrek fonksiyonu, normalin onda birinden az olana dek semptomlarin görülemeyecegi kadar yavas olabilir. Kronik böbrek hastaliginin son asamasina, son evre böbrek hastaligi (ESRD) denilir. Bu asamada böbrekler, artik yeteri kadar atik ve sivi fazlasini bedenden temizleyemez. Hastanin diyaliz veya böbrek nakli ihtiyaci söz konusu olur. Diyabetik nefropatiye ve yüksek kan basincina sebep olan diyabet, kronik böbrek hastaliginin en yaygin iki sebebidir ve çogu vakadan sorumludur. Böbreklere zarar verebilen ve kronik böbrek hastaligina yol açabilen baska hastaliklar ve durumlarin arasinda otoimmün bozukluklar (örnek olarak sistemik Iupus eritematozus ve skleroderma); böbreklerdeki dogum kusurlari (örnegin polikistik böbrek hastaligi); belirli toksik kimyasallar; glomerülonefrit; yaralanma veya travma; böbrek taslari ve enfeksiyonu; böbreklere veya içerisine giden arterler ile ilgili problemler; bazi agri kesici ilaçlar ve baska ilaçlar (mesela kanser ilaçlari); refl'u nefropati (böbrekler bu durumda idrarin böbreklere geri akisindan zarar görür) vs. bulunur. Burada kullanildigi haliyle "proteinüri" terimi, idrarda asiri miktarda serum proteini bulunmasini ifade eder. Protein'uri, bazi yapilanmalara göre, böbrek hastaliginin göstergesi olabilir, ancak tek basina karar verici degildir. Buna göre bu yönlerin ve burada tarif edilen tüm bu tip yönlerin bazi yapilanmalarina göre bir kronik böbrek hastaligi olan veya bu bakimdan riski bulunan bireyde, diyabetik nefropati bulunmaktadir. Burada tarif edilen kronik böbrek hastaligi ve protein'uri tedavisi metotlari bakimindan parametresi veya semptomu bakimindan tercihen %20 veya 'üzerinde, %30 veya üzerinde, tercih edildigi haliyle %75 veya 'üzerinde, %80 veya 'üzerinde, %85 veya üzerinde, %90 veya örnegin tedavi edilen bozuklugun semptomlari, örnegin yüksek kan basinci, idrardaki protein vs. ile ilgili olabilir. Yüksek kan basinci, kronik böbrek hastaliginin tüm evrelerinde neredeyse daima bulunur. Bir sinir sistemi muayenesi, sinir hasarinin isaretlerini ortaya çikarabilir. Saglik uzmani, bir stetoskop ile dinlerken anormal kalp veya akciger sesleri duyabilir. Kronik böbrek hastaliginin erken belirtileri, baska hastaliklarin da belirtileridir. Bu semptomlar, durum daha ilerlemis hale gelene kadar, böbrek hastaliklarinin tek isareti olabilir. Kronik böbrek hastaliginin semptomlari arasinda istah kaybi; genel hastalik hissi ve yorgunluk; bas agrilari; kasinti (pruritus) ve kuru cilt; mide bulantisi; kilo vermeye çalismaksizin kilo kaybi vb. bulunur. Ozellikle böbrek fonksiyonu daha da kötüye gittiginde gelisebilen baska semptomlarin arasinda, anormal koyu veya açik ciltler; kemik agrisi; beyin ve sinir sistemi semptomlari; uyku hali ve kafa karisikligi; konsantre olma veya düsünme problemleri; ellerde, ayaklarda veya baska alanlarda hissizlik; kas segirmesi veya kramplar; nefes kokusu; kolay morarma, kanama veya diskida kan; asiri susama; sik hiçkirma; cinsel ilgi düzeyinde düsüklük ve iktidarsizlik; adet dönemlerinin durmasi (amenore); nefes darligi; uyku bozukluklari, örnegin uykusuzluk, huzursuz bacak sendromu ve obstruktif uyku apnesi; ayaklarin ve ellerin sismesi (ödem); tipik olarak sabahlari kusma bulunur. Buna göre burada tarif edilen metotlarin bazi yapilanmalarina göre, burada tarif edilen bir ROBO2 inhibitörünü içeren bir bilesimin bir etkili miktari, kronik böbrek hastaliginin bir semptomunu hafifletmek amaciyla bir bireye uygulanir. Burada kullanildigi haliyle, "kronik böbrek hastaligina ait bir semptomun hafifletilmesi", kronik böbrek hastaligi ile iliskili herhangi bir durumun veya semptomun iyilestirilmesidir. Alternatif olarak, bir kronik böbrek hastaliginin bir semptomunun hafifletilmesi, kronik böbrek hastaligindan mustarip durumdaki tedavi görmemis bir kontrole göreli olarak, ya da ayni bireyin tedavi öncesindeki durumuna göreli olarak, bireydeki kronik böbrek hastaligina ait bir veya daha fazla semptomun azaltilmasina yer verebilir. ROBOZ inhibitörü ile tedavi edilmemis olan bir esdeger kontrol ile veya bireyin ROBOZ inhibitörü ile tedaviden önceki durumu ile karsilastirildiginda bu tip bir düsüs veya önleme derecesi, bir standart teknik ile ölçüldügü üzere en az %5, en az %10, en az %15, en da daha fazla olur. Arzu edildigi haliyle kronik böbrek hastaligi, ilgili teknikte bilinen herhangi standart bir metot ile saptandigi üzere anlamli ölçüde azalir veya saptanamaz, ki bu durumda kronik böbrek hastaligi tedavi edilmis kabul edilir. Bir kronik böbrek hastaligi için tedavi edilmekte olan bir hasta, bir pratisyen hekimin böyle bir duruma sahip oldugunu saptadigi kisidir. Teshis, ilgili teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen uygun her vasita ile gerçeklestirilebilir. Teshis ve izlem, örnegin idrar, kan veya serum örneginde spesifik proteinlere veya moleküllere ait düzeylerin, örnegin albümin, kalsiyum, kolesterol, tam kan sayimi (CBC), elektrolitler, magnezyum, fosfor, potasyum, sodyum, ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonuna ait düzeylerin saptanmasi; örnegin kreatinin klirensi, kreatinin düzeyleri, BUN (kan üre azot) tayinine yönelik tahliller; abdominal CT taramasi, abdominal MR, abdominal ultrason, böbrek biyopsisi, böbrek taramasi, böbrek ultrasonu; eritropoietin, PTH testlerinin sonuçlarindaki degisimlerin saptanmasi; kemik yogunlugu, ya da D vitamini testi; veya bu tip deteksiyon metotlarinin ve testlerin herhangi bir kombinasyonunu içerebilir. Burada tarif edilen metotlarin herhangi biri ile ilgili olarak kullanildigi haliyle "birey" ve "hasta" terimleri, burada birbirlerinin yerine kullanilabilir ve burada tarif edilen ROBOZ inhibitörlerinin alicisi olan bir hayvani, örnegin bir insani ifade eder. Örnegin bir insan birey gibi spesifik bir hayvana spesifik olan hastalik durumlarinin tedavisi için "birey" terimi, o spesifik hayvana isaret eder. "Insan harici hayvanlar" ve "insan harici memeliler" terimleri, burada birbirlerinin yerine kullanilabilir ve siçanlar, fareler, tavsanlar, koyunlar, kediler, köpekler, sigirlar, domuzlar ve insan harici primatlar gibi memelileri kapsar. "Hasta" terimi, bunlarla sinirli olmamak üzere memeliler, Sürüngenler, amfibiler ve baliklar da dahil olmak üzere her omurgaliyi kapsar. Ancak avantajli oldugu üzere hasta, bir insan gibi bir memeli, ya da mesela köpek, kedi, at ve benzeri bir evcillestirilmis memeli olmaktadir. Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre metot, bireye, ROBO2 inhibitörüne ilave olarak ayrica bir ilave terapötik ajan uygulanmasini ihtiva etmektedir. Böylesi bir ilave terapötik ajan, ROBOZ inhibitörü ile birlikte uygulanabilir. Burada kullanildigi haliyle "birlikte uygulama / verme" terimi, burada tarif edilen bir ROBOZ inhibitörünün ve bir baska bilesigin, mesela bir terapötik ajanin, bir kalifiye saglik personeli tarafindan belirlendigi üzere bir zaman periyodu boyunca ayri ayri, es zamanli ve /veya sirali olarak uygulanmasini ifade eder. Bazi yapilanmalara göre ilave terapötik ajan; bir anjiyotensin dönüstürücü enzim (ACE) inhibitörü, bir anjiyotensin II reseptör blokeri (ARB), ya da bir mineralokortikoit reseptör (MR) antagonisti olmaktadir. Burada tarif edilen ROBO2 inhibitörleri ile kullanilmaya yönelik ACE inhibitörleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, benazepril (ABD'de LOTENSINTM olarak pazarlanir), kaptopril (ABD'de CAPOTENTM olarak pazarlanir), enalapril / enalaprilat (ABD'de oral ve enjektabl VASOTECTM olarak pazarlanir), fosinopril (ABD'de MONOPRILT'VI olarak pazarlanir), Iisinopril (ABD'de ZESTRILTM ve PRINIVILTM olarak pazarlanir), moeksipril (ABD'de UNIVASCTM olarak pazarlanir), perindopril (ABD'de ACEON TM olarak pazarlanir), kinapril (ABD'de ACCUPRILTM olarak pazarlanir), ramipril (ABD'de ALTACETM olarak pazarlanir) ve trandolapril (ABD'de MAVIKTM olarak pazarlanir) içerir. Burada tarif edilen ROBO2 inhibitörleri ile kullanilmaya yönelik ARB'Ier; kandesartan (ABD'de ATACANDTM olarak pazarlanir), irbesartan (ABD'de AVAPROTM olarak pazarlanir), olmesartan (ABD'de BENICARTM olarak pazarlanir), losartan (ABD'de COZAART'V' olarak pazarlanir), valsartan (ABD'de olarak DIOVANTM olarak pazarlanir), telmisartan (ABD'de MICARDISTM olarak pazarlanir) ve eprosartan (ABD'de TEVETENTM olarak pazarlanir). Bu metotlarin ve burada tarif edilen tüm bu tip metotlarin bazi yapilanmalarina göre metot, bireye, ROBOZ inhibitör'une ilave olarak ayrica bir di'üretigin etkili bir miktarinin uygulanmasini ihtiva etmektedir. Di'üretikler, bunlar ile sinirli olmamak üzere, torsemid (ABD'de DEMADEXTM olarak pazarlanir), furosemid (ABD'de LASIXTM olarak pazarlanir), bumetanid (ABD'de BUMEXTM olarak pazarlanir), etakrinik asit (ABD'de EDECRINTM olarak pazarlanir), torsemid (ABD'de DEMADEXTM olarak pazarlanir), amilorid (ABD'de MIDAMORTM olarak pazarlanir), asetazolamid (ABD'de DIAMOXTM olarak pazarlanir), pamabrom (ABD'de AQUA-BANTM olarak pazarlanir), mannitol (ABD'de ARIDOLTM veya OSMITROLTM olarak pazarlanir), traimteren (ABD'de DYRENIUMTM olarak satilir), spironolakton (ABD'de ALDACTONETM olarak pazarlanir), amilorid (ABD'de MlDATORTM olarak pazarlanir), indapamid (ABD'de LOZOLT'VI olarak pazarlanir), hidroklorotiazid (ABD'de HYDRODIURILTM olarak pazarlanir), metolazon (ABD'de ZAROXOLYNTM veya MYKROXTM olarak pazarlanir), metilklotiazid (ABD'de AQUATENSENTM veya ENDURONTM olarak pazarlanir), hidrokolortiazid (ABD'de AQUAZIDE HT'V' veya ESIDRlXTM veya MICROZIDETM olarak pazarlanir), klorotiazid (ABD'de DIURILTM olarak pazarlanir), bendroflumetiazid (ABD'de NATURETINTM olarak pazarlanir), politiazid (ABD'de RENESETM olarak pazarlanir), hidroflumetiazid (ABD'de SALURONTM olarak pazarlanir) ve klortalidon (ABD'de THALITONETM olarak pazarlanir) içerir. Eksiksiz bir liste için ayrica bkz. örnegin Physician's Desk Reference, . Burada kullanildigi haliyle, burada tarif edilen ROBO-2 inhibitörleri veya bunlarin kombinasyon tedavilerini içeren bilesimlerin ve metotlarin herhangi biri itibariyla "tedavi", "tedavi etme" veya siddetini tersine çevirmek, azaltmak, iyilestirmek, inhibe etmek, yavaslamak veya durdurmak oldugu terapötik tedavileri ifade eder. "Tedavi etme" terimi, bunlarla sinirli olmamak üzere diyabetik nefropati gibi bir kronik böbrek hastaligi ile iliskili bir durumun, hastaligin veya bozuklugun en az bir advers etkisinin veya semptomunun azaltilmasini veya yatistirilmasini ihtiva eder. Tedavi, genellikle bir veya daha fazla semptom veya klinik belirteç azaldiginda, durdurulmasi durumunda "etkili" kabul edilir. Yani "tedavi", sadece semptomlarin veya belirteçlerin iyilesmesini degil, ayrica tedavi olmadiginda beklenecek oldugu 'üzere, semptomlarin ilerlemesinin veya kötülesmesinin durdurulmasi veya en azindan yavaslatilmasini da kapsar. Faydali veya arzu edilen klinik sonuçlarin arasinda, bunlar ile sinirli olmamak 'üzere ve saptanabilir olsun veya olmasin, bir veya daha fazla semptomun yatismasi, hastalik derecesinin azalmasi, hastalik durumunun stabillesmesi (yani kötülesmemesi), hastaligin ilerlemesinin gecikmesi veya yavaslamasi, hastalik durumunun iyilesmesi veya palyasyonu ve remisyon (kismi veya total) bulunur. Bir hastaligin "tedavisi" terimi, hastaligin semptomlarindan veya yari etkilerinden rahatlama saglanmasini da içerir (palyatif tedavi de dahil). Burada kullanildigi haliyle "etkili miktar" ifadesi, burada tarif edilen bir ROBO-2 inhibitörünün, tedavi edilen hastalik veya bozuklugun en az bir veya daha fazla semptomunu yatistirmak için gerekli olan miktarini ifade eder ve istenen etkiyi saglamak üzere yeterli bir farmakolojik bilesim miktari ile ilgilidir. Dolayisiyla "terapötik olarak etkili miktar" ifadesi, burada açiklanan metotlar kullanilarak, burada tarif edilen ROBO-2 inhibitörünün, tipik bir bireye verildiginde özel bir etki saglamak için yeterli olan bir miktarini ifade eder. Burada kullanildigi haliyle etkili bir miktar, hastaligin bir semptomunun gelismesini geciktirmede, bir semptom hastaliginin seyrini degistirmede (bunlarla sinirli olmamak üzere örnegin hastaligin bir semptomunun ilerlemesini yavaslatmada), ya da hastaligin bir semptomunu tersine çevirmede yeterli bir miktari da içerebilecektir. Dolayisiyla tam "etkili miktari" belirtmek mümkün degildir. Ancak herhangi bir vaka bakimindan uygun bir "etkili miktar", ilgili teknikte uzman kisiler tarafindan sadece rutin deneyler kullanilarak belirlenebilir. Etkili miktarlar, toksisite ve terapötik etkinlik, örnegin LD50 (popülasyonun %50'sine ölümcül olan doz) ve EDSO (popülasyonun %50'sinde terapötik olarak etkili olan doz) degerlerinin belirlenmesi gibi, hücre kültürlerinde veya deney hayvanlarinda standart farmasötik prosedürlere göre belirlenebilir, Dozaj, kullanilan dozajin sekline ve kullanilan uygulama yoluna bagli olarak degisiklik gösterebilir. Toksik ve terapötik etkiler arasindaki doz orani, terapötik indeks anlamina gelir ve LD50 I EDSO orani olarak ifade edilebilir. Büyük terapötik indeksler sergileyen bilesimler ve metotlar tercih edilir. Terapötik olarak etkili bir doz, baslangiçta hücre kültürü testlerinden tahmin edilebilir. Dahasi bir doz, hücre kültüründe veya uygun bir hayvan modelinde belirlendigi üzere, lCSO degerini (yani burada tarif edilen ve ölçülen fonksiyon veya aktivitenin yari maksimal inhibisyonunu saglayan ROBO-2 inhibitörü konsantrasyonunu) içeren bir dolasimsal plazma konsantrasyonu elde etmek üzere hayvan modellerinde formüle edilebilir. Plazmadaki düzeyler, mesela yüksek performansli likit kromatografi yoluyla ölçülebilir. Belirli bir dozajin etkileri, uygun bir biyo-test ile izlenebilir. Dozaj, bir hekim tarafindan belirlenebilir ve gerektigi sekilde tedavinin gözlemlenen etkilerini karsilayacak sekilde ayarlanir. Kronik böbrek hastaliginin tipine ve siddetine bagli olarak, burada tarif edilen bir ROBOZ inhibitörünün yaklasik olarak 1 tig/kg ila 100 mg/kg (örnegin 0.1- mg/kg) seviyesindeki bir miktari, gerek bir veya daha fazla ayri uygulama, gerekse sürekli infüzyon yoluyla olsun, bireye verilmesi için bir baslangiç aday dozaj araligina karsilik gelir. Ilaç Verme (Uygulama) Modlari Burada tarif edilen ROBOZ inhibitörleri veya bunlarin kombinasyon tedavileri, ihtiyaç halindeki bir bireye, bireyin etkin bir tedavisiyle sonuçlanan uygun her yoldan uygulanabilir. Burada kullanildigi haliyle "uygulama / verme" ve "yerlestirme" terimleri, birbirlerinin yerine kullanilabilir ve bir ROBO-2 inhibitörünün, bir hastaya, bu tip ajanlarin istenen bir yerde, istenen bir etki / etkilerin üretilecegi sekilde en azindan kismi olarak Iokalizasyonu ile sonuçlanan bir metot veya yolla yerlestirilmesini ifade eder. Bazi yapilanmalara göre ROBOZ inhibitörü, ile kronik böbrek hastaligi olan bir bireye, ajani sistemik olarak veya istenen bir yüzey veya hedefe ulastiran herhangi bir uygulama yoluyla verilir ve bunlarla sinirli olmamak üzere enjeksiyon, infüzyon, instilasyon ve inhalasyon uygulamalarini içerebilir. Polipeptit ajanlarinin bagirsakta etkisizlesmesine karsi korunabildigi ölçüde oral uygulama sekilleri de öngörülür. "Enjeksiyon", bunlarla sinirli olmaksizin intravenöz, intramusküler, intraarteriyel, intratekal, intraventriküler, intrakapsüler, intraorbital, intrakardiyak, intradermal, intraperitoneal, transtrakeal, subkütanöz, subkütikiler, intraartiküler, sub kapsüler, subaraknoid, intraspinal, intraserebro spinal ve intrasternal enjeksiyon ve infüzyon uygulamalarini içerir. Bazi yapilanmalara göre burada tarif edilen metotlarda kullanilmaya yönelik ROBO-2 inhibitörleri intravenöz infüzyon veya enjeksiyon yoluyla uygulanir. Burada kullanildigi haliyle "parenteral uygulama" ve "parenteral olarak uygulanir" ifadeleri, genellikle enjeksiyon yoluyla, enteral ve topikal uygulama haricindeki uygulama sekillerine karsilik gelir. Burada kullanildigi haliyle "sistemik uygulama, sistemik olarak uygulanir", tümörün bulundugu bir yer gibi bir hedef bölge, doku veya organa direkt olmayan ve bireyin dolasim sistemine girecegi ve dolayisiyla metabolizmaya ve benzer baska süreçlere tabi tutulacagi sekilde uygulanmasini ifade eder. Burada tarif edilen metotlarin klinik kullanimi bakimindan burada tarif edilen ROBO-2 inhibitörlerinin uygulanmasi; örnegin intravenöz gibi parenteral; örnegin intranazal gibi mukozal; oküler veya bir baska uygulama sekli için farmasötik bilesimler veya farmasötik formülasyonlar halindeki formülasyonlari içerebilir. Bazi yapilanmalara göre burada tarif edilen ROBO-2 inhibitörleri, bireyin etkili bir tedavisiyle sonuçlanan, farmasötik olarak kabul edilebilir her tasiyici bilesik, materyal, ya da bilesim ile birlikte verilebilir. Dolayisiyla burada tarif edilen metotlarda kullanilmaya yönelik bir farmasötik formülasyon, burada tarif edilen bir ROBO-2 inhibitörünü, farmasötik olarak kabul edilebilir bir veya daha fazla bilesen ile birlikte ihtiva edebilir. insanlar ve hayvanlarin dokulari ile temas halinde asiri toksisite, iritasyon, alerjik yanit ve diger problem veya komplikasyonlara yol açmaksizin kullanilmaya elverisli olan ve makul bir fayda/risk orani sergileyen bilesikler, materyaller, bilesimler ve / veya dozaj formlaridir. Burada kullanildigi haliyle "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici" ifadesi, bir ROBO-2 inhibitörünün stabilitesi, çözünürlügü, ya da aktivitesinin muhafaza edilmesine katki saglayan farmasötik olarak kabul edilebilir bir materyal, bilesim veya araç, örnegin bir sivi veya kati dolgu, seyreltici, eksipiyan, solvent, ortam, kapsülleyici materyal, üretim yardimcisi (örnek olarak Iubrikant, talk magnezyum, kalsiyum veya çinko stearat, ya da sterik asit), ya da solvent kapsülleyici materyal anlamina gelir. Her bir tasiyici, formülasyondaki diger bilesenler ile uyumlu olmali ve hastaya zarar vermemesi bakimindan "kabul edilebilir" olmalidir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar olarak islev gösterebilen materyallerin bazi örnekleri, asagida sayilanlari ihtiva eder: (1) sekerler, mesela Iaktoz, glukoz ve sakaroz; (2) nisastalar, mesela misir nisastasi ve patates nisastasi; (3) selüloz ve türevleri, mesela sodyum karboksimetil selüloz, metilselüloz, etil selüloz, mikrokristalin selüloz ve selüloz asetat; (4) toz kitre; (5) malt; (6) jelatin; (7) eksipiyanlar, mesela kakao yagi ve fitil mumlar; (8) yaglar, mesela yer fistigi yagi, pamuk tohumu yagi, aspir yagi, susam yagi, zeytinyagi, misir yagi ve soya yagi; (9) glikoller, mesela propilen glikol; (10) poliol, örnegin gliserin, sorbitol, mannitol ve polietilen glikol (PEG); (11) esterler, mesela etil oleat ve etil Iaurat; (12) agar; (13) tamponlayici ajanlar, mesela magnezyum hidroksit ve alüminyum hidroksit; (14) aljinik asit; (15) pirojensiz su; (16) izotonik salin; (17) Ringer çözeltisi; (19) pH tamponlu çözeltiler; (20) poliesterler, polikarbonatlar ve / veya polianhidrürler; (21) hacim artirici ajanlar, mesela polipeptitler ve amino asitler (22) serum bilesenleri, örnegin serum albümin, HDL ve LDL; (23) 02-012 alkolleri, mesela etanol; ve (24) farmasötik formülasyonlarda kullanilan toksik olmayan baska tip baska maddeler. Salim maddeleri, kaplama maddeleri, koruyucu maddeler ve antioksidanlar da formülasyonda bulunabilir. "Eksipiyan", "tasiyici" ve "farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar" gibi terimler, burada birbirlerinin yerine kullanilabilir. Burada tarif edilen ROBO-2 inhibitörleri, asagida belirtilenler için adapte edilenler de dahil olmak üzere bilesigin bir bireye kati, sivi veya jel formunda uygulanmasi için özel olarak formüle edilebilir: (1) parenteral uygulama, örnegin subkütanöz, intramusküler, intravenöz veya epidural enjeksiyon, örnegin bir steril çözelti veya süspansiyon, ya da sürekli salinan bir formülasyon olarak; (2) topikal uygulama, mesela bir krem, merhem, ya da cilde uygulanan ve kontrollü salim saglayan bir yama veya sprey; (3) intravajinal olarak veya intrarektal olarak, mesela bir peser, krem veya köpük formunda; (4) oküler olarak; (5) transdermal olarak; (6) transmukozal olarak; ya da (79) nazal olarak. ilaveten bir ROBO-2 inhibitörü, bir hastaya implante edilebilir veya bir ilaç uygulama sistemi kullanilarak enjekte edilebilir. Bkz. örnegin Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981); U.S. Pat. No. Burada tarif edilen metotlarda kullanilabilen, burada tarif edilen ROBO-2 inhibitörlerini içeren bilesimlerin form'L'ilasyonlari ve uygulama sekilleri ile ilgili baska yapilanmalari, asagida tarif Parenteral Dozai Formlari. ROBO-2 inhibitörlerinin parenteral dozaj formlari, kronik böbrek durumu olan bir bireye de, bunlarla sinirli olmamak 'üzere subk'ütan'oz, intravenöz (bolus enjeksiyonu da dahil) intramusk'uler ve intraarteriyel yollar da dahil olmak üzere çesitli yollar ile uygulanabilir. Parenteral dozaj formlarinin uygulanmasi tipik olarak hastanin yabanci / kirletici maddelere karsi dogal savunmasini baypas ettiginden, parenteral dozaj formlari tercihen sterildir veya hastaya verilmeden önce sterilize edilebilmektedir. Parenteral dozaj formlarinin örnekleri, bunlar ile sinirli olmamak üzere enjeksiyona hazir çözeltiler, enjeksiyon için farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içinde çözülmeye veya süspansiyon haline getirilmeye hazir kuru `ürünler, enjeksiyon için hazir süspansiyonlar, kontrollü salirn saglayan parenteral dozaj formlari ve emülsiyonlari ihtiva eder. Burada açiklanan parenteral dozaj formlarini saglamak 'üzere kullanilabilen uygun araçlar, ilgili teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinir. Bunlarin 'Örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere steril su; enjeksiyonluk su USP; salin çözeltisi; glukoz çözeltisi; sulu araçlar, bunlar ile sinirli olmamak 'üzere `Örnegin sodyum klor`ür enjeksiyonu, Ringer enjeksiyonu, dekstroz enjeksiyon, dekstroz ve sodyum klor`ur enjeksiyonu ve Iaktatli Ringer enjeksiyonu; suyla karisabilen araçlar, bunlarla sinirli olmamak üzere örnegin etil alkol, polietilen glikol ve propilen glikol; ve suyla karismayan araçlar, bunlarla sinirli olmamak üzere örnegin misir yagi, pamuk tohumu yagi, yer fistigi yagi, susam yagi, etil oleat, izopropil miristat ve benzil benzoat bulunur. Bazi yapilanmalara göre bir ROBOZ inhibitör'i'inün etkili bir miktarini içeren bilesimler, Örnegin ayrik dozaj formlari gibi, bunlarla sinirli olmamak 'üzere 'örnegin tabletler (bunlarla sinirli olmaksizin skorlu veya kapli tabletler de dahil), haplar, kapletler, kapsüller, çigneme tabletleri, toz paketleri, kaseler, haplar, gofretler, aerosol spreyler, ya da sivilar, bunlarla sinirli olmaksizin `Örnegin sulu bir sivi, susuz bir sivi, bir su içinde yag emülsiyonu, ya da bir yag içinde su em'ülsiyonu içindeki suruplar, iksirler, çözeltiler veya süspansiyonlar gibi oral uygulama için uygun olacak sekilde formüle edilir. Bu tip bilesimler, burada açiklanan bilesiklerin farmasötik olarak kabul edilebilir tuzunun 'önceden belirlenmis bir miktarini içerir ve ilgili teknikte uzman kisilerce iyi bilinen bir eczacilik metodu ile hazirlanabilir. Bkz. genel olarak Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Baski, Mack Publishing, Easton, Pa. (1990). Kolay sekilde uygulanabilir olmalari sebebiyle tabletler ve kapsüller, en avantajli oral birim dozaj formunu temsil eder ve bu durumda kati eksipiyanlar kullanilir. Arzu edildigi takdirde tabletler, standart sulu veya susuz teknikler ile kaplanabilir. Bu dozaj formlari, bilinen eczacilik metotlari ile hazirlanabilir. Söz konusu farmas'otik bilesimler ve dozaj formlari, genel olarak etkin madde(ler)in sivi tasiyicilar, ince sekilde bölünmüs kati tasiyicilar veya her ikisi ile birlikte homojen ve siki bir sekilde karistirilmasi, akabinde ve gerektigi takdirde `ürüne istenen sunum seklinin verilmesi yoluyla hazirlanir. Bazi yapilanmalara göre oral dozaj formlari, antibiyotik ajan için kullanilmamaktadir. Bir ROBOZ inhibitörünün etkili bir miktarini içeren bilesimlerin tipik oral dozaj formlari, ROBOZ inhibitbrünün farmas'otik olarak kabul edilebilir tuzunun, konvansiyonel farmas'otik hazirlama tekniklerine göre en az bir eksipiyan ile bir sivi karisim halinde birlestirilmesi yoluyla hazirlanir. Eksipiyanlar, uygulama için istenen bilesimin formuna bagli olarak çok çesitli biçimlerde olabilir. Örnegin oral likit veya aerosol formlarda kullanilmak üzere uygun olan eksipiyanlar, bunlar ile sinirli olmamak üzere su, glikollar, yaglar, alkoller, aroma katici maddeler, koruyucu maddeler ve renklendirici maddeleri içerir. Kati oral dozaj formlarinda kullanilmaya uygun eksipiyan Örnekleri (mesela tozlar, tabletler, kapsüller ve kapletler), bunlar ile sinirli olmamak üzere nisastalar, sekerler, mikrokristalin selüloz, seyrelticiler, taneleyici ajanlar, Iubrikantlar, baglayici ajanlar ve dagitici ajanlari içerir. Burada tarif edilen farmasbtik formülasyonlarda kullanilmaya elverisli baglayicilar, bunlarla sinirli olmamak üzere misir nisastasi, patates nisastasi ya da diger nisastalar, jelatin, dogal ve sentetik zamklar, mesela akasya, sodyum aljinat, aljinik asit, diger aljinatlar, toz haline getirilmis kitre, guar zamki, selüloz ve türevleri (örnegin etil selüloz, selüloz asetat, karboksimetil selüloz kalsiyum, sodyum karboksimetil selüloz), polivinil pirrolidon, metil selüloz, mikrokristalin selüloz ve bunlarin karisimlarini içerir. Burada tarif edilen farmasötik formülasyonlarda kullanilmaya elverisli dolgu maddelerinin örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, talk, kalsiyum karbonat (örnegin granüller veya toz), mikrokristalin selüloz, toz haline getirilmis selüloz, dekstratlar, kaolin, mannitol, silisik asit, sorbitol, nisasta, önceden jelatinlesmis nisasta ve bunlarin karisimlarini içerir. Baglayici veya dolgu, burada tarif edilen farmasotik bilesimlerde tipik olarak farmasötik bilesimin yaklasik %50 Dagitici maddeler, burada tarif edilen oral farmasötik formülasyonlarda, bir sulu ortama maruz kaldiklarinda dagilan tabletler saglamak üzere kullanilir. Burada tarif edilen ROBO2 inhibitörlerinin kati oral dozaj formlarini olusturmak üzere, etkin maddenin / maddelerin salimini zararli sekilde degistirmeden ne çok az, ne de çok fazla olan yeterli miktarda dagitici kullanilmalidir. Kullanilan dagitici miktari, formülasyonun tipine göre degisir ve ilgili teknigin uzmanlarinca kolaylikla tespit edilebilir. Oral farmasötik formülasyonlar olusturmak üzere kullanilabilen dagitici maddeler, bunlarla sinirli olmamak üzere agar, aljinik asit, kalsiyum karbonat, mikrokristalin selüloz, kroskarmeloz sodyum, krospovidon, polakrilin potasyum, sodyum nisasta glikolat, patates veya tapioka nisastasi, baska nisastalar, jelatinlesmis nisasta, killer, baska aljinler, baska selülozlar, zamklar ve bunlarin karisimlarini içerir. Burada tarif edilen ROBOZ inhibitörlerinin oral farmasötik formülasyonlarini olusturmak üzere kullanilabilen Iubrikantlar, bunlarla sinirli olmamak üzere kalsiyum stearat, magnezyum stearat, mineral yag, hafif mineral yag, gliserin, sorbitol, mannitol, polietilen glikol, baska glikoller, stearik asit, sodyum Iauril sülfat, talk, hidrojene bitkisel yag (örnegin yer fistigi yagi, pamuk tohumu yagi, ayçiçegi yagi, susam yagi, zeytinyagi, misir yagi ve soya yagi), çinko stearat, etil oleat, etil laurat, agar ve bunlarin karisimlarini içerir. Ilave Iubrikantlar, örnegin bir siloid silika jel (AEROSIL® 200, üreten W. R. Grace Co.: Baltimore, MD), bir koagüle sentetik silika aerosolü (pazarlayan Degussa C0.; Piano, TX), CAB-O-SIL® (bir pirojenik silikon dioksit ürünü, satan Cabot Co.; Boston, MA) ve bunlarin karisimlarini içerir. Eger ki kullaniliyor ise agirlikça yaklasik yüzde 1 miktarlarinda kullanilir. Baska yapilanmalara göre, laktoz içermeyen farmasötik formülasyonlar ve dozaj formlari saglanmakta olup bu tip bilesimler tercihen varsa bile az miktarda laktoz veya baska mono- veya di-sakkaridler içermektedir. Burada kullanildigi haliyle "laktoz içermeyen" ifadesi, varsa bile mevcut laktoz miktarinin, bir etkin maddenin bozulma hizini esasli sekilde yükseltmekte yetersiz oldugu anlamina gelir. Burada açiklanan laktoz içermeyen bilesimler, ilgili teknikte layikiyla bilinen ve USP (XXI) l NF (XVI) içerisinde listelenen eksipiyanlari ihtiva edebilir. ROBOZ inhibitörlerinin oral formülasyonlari, bazi yapilanmalara göre burada etkin maddeler olarak tarif edilen ROBOZ inhibitörlerini içeren susuz farmasötik bilesimler ve dozaj formlarini kapsar, çünkü su, bazi bilesiklerin yikimini kolaylastirabilir. Örnegin su (mesela %5 oraninda) katilmasi, farmasötik tekniginde, formülasyonlarin zamana göre raf ömrü veya stabilitesi gibi karakteristiklerini belirlemek amaciyla uzun dönemli saklamayi simüle etmenin bir araci olarak yaygin sekilde kabul edilir. Bkz. örnegin Jens T. Carstensen, Drug Stabilitszrinciples & farmasötik bilesimler ve dozaj formlari, susuz veya düsük nem içeren terkip maddeleri ve düsük nem veya düsük rutubetli sartlar altinda hazirlanabilir. Laktoz ve bir primer veya sekonder amin ihtiva eden en az bir etkin maddeyi içeren farmasötik bilesimlerin ve dozaj formlarinin üretim, ambalajlama ve /veya saklama esnasinda nem ve / veya rutubet ile esasli temas öngörülmekte ise, susuz olmalari tercih edilir. Susuz bilesimler, tercihen suya maruz kalmayi önleyecek materyaller ile ambalajlanir ve böylece uygun formülasyon kitlerine dahil edilmeleri saglanir. Uygun ambalajlara dair örnekler, bunlarla sinirli olmamak üzere hava geçirmez sekilde kapatilan folyolar, plastikler, nem çekici bulunan veya bulunmayan birim doz kaplari (mesela viyaller), blister paketleri ve serit paketleri içerir. Aerosol formülasyonlari. Bir ROBO-2 inhibitörü, uygun itici gazlar, Örnegin propan, bütan, ya da izobütan gibi hidrokarbon itici gazlari ve konvansiyonel adjuvanlar ile birlikte basinçli bir aerosol kabinda ambalajlanabilir. Bir ROBO-2 inhibitörü, 'Örnegin bir nebulizbr veya atomiz'or gibi basinçli olmayan bir formda da uygulanabilir. Bir ROBO-2 inhibitorü, 'örnegin bir inhaler kullanilarak bir kuru toz formunda solunum yollarina direkt olarak da uygulanabilir. Uygun olan toz bilesimleri, örnek olarak bir ROB-2 inhibitbrünün, laktoz, ya da intrabronsiyal uygulama için kabul edilebilir baska inert tozlar ile iyice karistirilan toz preparatlarini içerir. Toz bilesimleri, bir aerosol uygulama aleti ile uygulanabilir veya bireyin, kapsülü delen ve inhalasyon için tozu uygun bir kararli akimda disari üfleyen bir aletin içerisine sokulabilen, delinebilir bir kapsül içerisine kapatilabilir. Söz konusu bilesimler; iticiler, sürfaktanlar ve ko- solventler ihtiva edebilir ve uygun bir dozaj valfi ile kapatilan konvansiyonel aerosol kaplarina doldurulabilir. Solunum sistemine uygulamaya yönelik aerosoller ilgili teknikte bilinmektedir. Bkz. örnegin agents to the respiratory tract," Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6273- peptitlerin ve proteinlerin sistemik olarak uygulanma potansiyeline sahiptir (Patton ve Platz, Burada tarif edilen ROBO-2 inhibitörlerinin formülasyonlari, burada açiklanan bilesikleri etkin maddeler olarak içeren susuz farmasötik bilesimleri ve dozaj formlarini da kapsar, çünkü su, bazi bilesiklerin yikimini kolaylastirabilir. Ornegin su (mesela %5 oraninda) katilmasi, farmas'otik tekniginde, formülasyonlarin zamana göre raf 'ömrü veya stabilitesi gibi karakteristiklerini belirlemek amaciyla uzun dönemli saklamayi simüle etmenin bir araci olarak yaygin sekilde kabul edilir. Bkz. örnegin Jens T. Carstensen, Drug Stabilitszrinciples & bilesimler ve dozaj formlari, susuz veya düsük nem içeren terkip maddeleri ve düsük nem veya düsük rutubetli sartlar altinda hazirlanabilir. Laktoz ve bir primer veya sekonder amin ihtiva eden en az bir etkin maddeyi içeren farmas'otik bilesimlerin ve dozaj formlarinin üretim, ambalajlama ve / veya saklama esnasinda nem ve / veya rutubet ile esasli temas öngörülmekte ise, susuz olmalari tercih edilir. Susuz bilesimler, tercihen suya maruz kalmayi saglanir. Uygun ambalajlara dair örnekler, bunlarla sinirli olmamak üzere hava geçirmez sekilde kapatilan folyolar, plastikler, nem çekici bulunan veya bulunmayan birim doz kaplari (mesela viyaller), blister paketleri ve serit paketleri içerir. Kontrollü ve Gecikmeli Salim Saglayan Dozai Formlari. Burada tarif edilen yönlerin bazi yapilanmalarina göre bir bireye, bir ROBO-2 inhibitörü, kontrollü veya gecikmeli salim saglayan araçlar ile uygulanabilir. Ideal anlamda, istege göre dizayn edilmis bir kontrollü salim preparatinin tibbi tedavide kullanimi, durumu minimum sürede tedavi veya kontrol etmek için kullanilan ilaç maddesinin minimumu ile karakterize edilir. Kontrollü salim formülasyonlarinin avantajlari, asagida sayilanlari içerir: 1) ilaç aktivitesinin uzatilmasi; 2) doz frekansinin azaltilmasi; 3) hasta uyuncunun artirilmasi; 4) daha az toplam ilaç kullanimi; 5) lokal veya sistemik yan etkilerde düsüs; 6) ilaç akümülasyonunun minimize edilmesi; 7) kan düzeyi dalgalanmalarinda azalma; 8) tedavi etkinliginin iyilestirilmesi; 9) güç veya ilaç aktivite kaybinin azaltilmasi; ve 10) hastalik veya durumlarin kontrol altina alma hizinin iyilestirilmesi. (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa. 2000)). Kontrollü salimli formülasyonlar, bir formül (I) bilesiginin etki baslangicinin, etki süresinin, terapötik pencere içerisindeki plazma düzeylerinin ve pik kan düzeylerinin kontrol altina alinmasinda kullanilabilir. Daha özel bir anlatimla, hem bir ilacin gerekli dozunun altinda olmasindan (yani minimum terap'otik düzeylerin altina inilmesi) ve ilacin toksisite düzeyinin asilmasi durumlarinda meydana gelebildigi üzere, potansiyel advers etkiler ve güvenilirlik kaygilari minimize edilirken bir formül (I) bilesiginin maksimum etkinliginin güvence altina alinmasi için kontrollü veya uzatilmis salimli dozaj formlari veya formülasyonlari kullanilabilir. Bilinen kontrollü veya uzatilmis salimli dozaj formlari, formülasyonlari ve aletleri, burada tarif edilen ROBO-2 inhibitörleri ile kullanilmak üzere adapte edilebilir. Bunlarin `Örnekleri, bunlarla sinirli olmamak üzere, asagidaki yayinlarda tarif edilenleri içerir: U.S. Patentleri No. 3,845,770; profilini degisken oranlarda saglamak amaciyla, `Örnegin hidroksipropilmetil selüloz, baska polimer matrisleri, jeller, geçirgen membranlar, ozmotik sistemler (örnegin OROS® (Alza Corporation, Mountain View, Calif. ABD)), çok tabakali kaplamalar, mikropartiküller, lipozomlar, ya da mikro kürecikler veya bunlarin bir kombinasyonu kullanilarak, bir veya daha fazla etkin maddenin yavas veya kontrollü sekilde salinmasini saglamak için kullanilabilir. Dahasi, açiklanan bilesiklerin sabitlenmis, adzorbe tuz formlarini hazirlamak ve dolayisiyla ilacin kontrollü olarak uygulanmasini saglamak üzere iyon degistirme materyalleri kullanilabilir. Spesifik anyon degistiricilerinin örnekleri, bunlar ile sinirli olmamak üzere DUOLITE® A568 ve DUOLITE® AP içerir. Burada tarif edilen metotlarin bazi yapilanmalarina göre burada tarif edilen metotlarda kullanilmaya yönelik bir ROBO-2 inhibitörü, bir hastaya sürekli salim veya darbeli salim yoluyla uygulanir. Darbeli terapi, bir bilesimin ayni miktarinin zaman içerisinde fasilali olarak uygulandigi bir form degildir, aksine bilesimin ayni dozunun azaltilmis bir frekansta uygulanmasini veya azaltilmis dozlarinin uygulanmasini ihtiva eder. Örnegin, bireyde kronik böbrek hastaligi bulunmasi gibi bozukluk, bireyde sürekli olarak meydana geldiginde sürekli salim veya darbe uygulamalar özellikle tercih edilir. Her bir darbe dozu azaltilabilir ve burada tarif edilen bir ROBO-2 inhibitörünün tedavi süreci boyunca uygulanan toplam miktari minimize Darbeler arasindaki zaman, gerektiginde, ilgili teknikte uzman kisilerce belirlenebilir. Tipik oldugu üzere darbelerin arasindaki aralik, bilesim veya bilesiminin etkin bileseni bir sonraki darbenin uygulanmasindan önce bireyde artik saptanamaz hale geldiginde bilesimin bir baska dozu verilerek hesaplanabilir. Söz konusu araliklar, bilesimin in vivo yari ömründen de hesaplanabilir. Söz konusu araliklar, in vivo yari ömürden daha büyük olarak, ya da bilesimin yari ömrünün 2, 3, 4, 5 ve hatta 10 misli daha fazla sekilde hesaplanabilir. Bilesimleri, hastaya infüzyon yoluyla veya baska uygulama biçimleriyle darbeli sekilde uygulamaya yönelik çesitli ,403,590. Bazi yapilanmalara göre ROBO-2 inhibitörünü içeren sürekli salim preparatlari hazirlanabilir. Sürekli salim preparatlarina yönelik uygun örnekler, inhibitörü içeren kati hidrofobik polimerlerden olusan yari geçirgen matrisleri içerir ve matrisler ise sekillendirilmis ürünler, mesela filmler veya mikrokapsüller halinde bulunur. Sürekli salimli matrislere dair örneklerin arasinda polyesterler, hidrojeller (mesela poli(2-hidroksietiI-metakrilat) ya da poli(vinilalkol)), polilaktitler (U.S. Pat. No. 3,773,919), L-glutamik asit ve etil-L-glutamat kopolimerleri, yikima ugramayan etilen-vinil asetat, yikima ugrayabilen laktik asit-glikolik asit kopolimerleri, mesela LUPRON DEPOT (laktik asit-glikolik asit kopolimeri ve Ieuprolid asetattan olusan enjekte edilebilir mikro-kürecikler) ve poIi-D-(-)-3-hidr0ksibütirik asit bulunur. steril olur. Bu husus, örnegin steril filtreleme membranlari içerisinden filtreleme ve ilgili teknikte uzman kisilerce bilinen baska metotlar ile kolaylikla gerçeklestirilebilir. Gene burada, bazi yönlerine göre, bir kronik böbrek hastaliginin veya bir kronik böbrek hastaligina veya proteinüriye yatkinligin bir biyo-belirteci olarak, ROBO2'nin ekspresyon profilleri veya dizi bilgileri esasinda bir bireyin bir kronik böbrek hastaligi olup olmadigini veya bir kronik böbrek hastaligina veya proteinüriye yatkinligi bulunup bulunmadigini belirlemeye yönelik testler, metotlar ve sistemler saglanmaktadir. Burada gösterildigi üzere ROBOZ; kronik böbrek hastaligi olan veya kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan yüksek risk tasiyan bir bireyi teshis etmeye veya tedavinin, kronik böbrek hastaligi veya proteinürinin ilerlemesi üzerindeki etkilerini izlemeye yönelik bir biyo-belirteç olarak faydalidir. Burada kullanildigi haliyle bir "biyo-belirteç", bir fenotipik durumdaki (mesela bir hastaliga sahip) bir bireyden alinan bir örnekte, bir baska fenotipik duruma (örnegin hastaligin olmamasi) kiyasla farkli sekilde bulunan bir organik biyomolekül anlamina gelir. Eger ki biyo-belirtecin farkli gruplardaki ortalama veya medyan ekspresyon düzeyi, istatistiksel olarak anlamli oldugu hesaplanir ise bir biyo-belirteç, farkli fenotipik durumlar arasinda farkli sekilde bulunur. Istatistiksel anlamliliga yönelik yaygin testler, digerlerinin yani sira t-test, ANOVA, Kruskal- Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney ve odds ratio testlerini ihtiva eder. Tek basina veya birlikte olabilen biyo-belirteçler, bir bireyin bir fenotipik duruma veya bir baskasina ait olduguna dair göreli risk hakkinda ölçümler saglar. Dolayisiyla bunlar, hastaliga yönelik (tanilama), bir ilacin terapötik etkinligi (teranostik) ve ilaç toksisitesine yönelik belirteçler olarak faydalidir. Burada tarif edilen testlerde kullanilmak üzere ROBO2 ekspresyonu, protein düzeylerinin deteksiyonu veya mRNA ekspresyon düzeylerinin deteksiyonu da dahil olmak üzere uygun olan her metot ile saptanabilir. ROBOZ polipeptidi, bir bireyden elde edilen bir biyolojik örnekte bulunabilen herhangi bir formda, ya da biyolojik örnegin manipülasyonundan (örnegin bir numuneyi islemenin bir sonucu olarak) kaynaklanan herhangi bir formda saptanabilir. ROBOZ'nin degismis (modifiye olmus) formlari; allelik varyantlar, splays varyantlari, post- translasyonel modifikasyonlar (örnegin glikozilasyon, proteolitik yarilma (örnegin bir ana proteinin fragmanlari), glikozilasyon, fosforilasyon, Iipidasyon, oksidasyon, metilasyon, sisteinilasyon, sülfonasyon, asetilasyon ve benzeri), oligomerizasyon, de-oligomerizasyon (monomerlerin, proteinin multimerik bir formundan ayrilmasi), denatürasyon ve benzerlerinin bir ürünü olan degismis proteinleri içerebilir. Burada tarif edilen testler, ROBO2'nin tüm formlarini veya belirli formlarini saptamak üzere dizayn edilebilir. Arzu edildigi durumlarda, formlar arasinda farklilik gösteren fiziksel karakteristiklere, örnegin farkli molekül agirligi, farkli molekül boyutu, farkli epitoplarin varligi / yoklugu ve benzerlerine bagli deteksiyon metotlarinin kullanimi ile, örnegin farkli izoformlar gibi ROBOZ'nin farkli formlari arasinda ayrim yapilabilir. Dolayisiyla burada, bazi yönlerine göre, kronik böbrek hastaligina sahip olan veya kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan riski bulunan bir bireyin tanilanmasina yönelik olarak, bir bireyden alinan bir biyolojik örnekte bulunan ROBO2 protein veya nükleik asit düzeyinin ölçülmesini içeren testler saglanmakta olup, burada bireyden alinan biyolojik örnekteki ROBOZ düzeyi, ROBOZ'ye yönelik bir esik referans deger ile ayni veya bu degerin üzerinde olmasi durumunda (örnegin istatistiksel olarak anlamli bir miktarda üzerinde olmasi durumunda), birey kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan muhtemelen riskli olmakta veya bireyin kronik böbrek hastaligi bulunmaktadir. Ornegin, ROBOZ düzeyindeki artis, ROBO2'nin bir referans esik düzeyi ile karsilastirildiginda yaklasik %10'dan daha fazla, ya da yaklasik %20'den daha fazla, ya da yaklasik %30'dan daha fazla, ya da yaklasik %40'tan daha fazla, ya da yaklasik %50'den daha fazla, ya da yaklasik 60'tan daha fazla veya bunlarin da üzerinde olmaktadir. Bazi yapilanmalara göre ROBOZ düzeyindeki artis, bir medyan veya ortalama ROBO2 referans esigi seviyesinden en az bir standart sapma kadar daha fazla, ya da en az iki standart sapma kadar daha fazla, ya da bunlardan da daha fazla olmaktadir. Bu tip medyan veya ortalama ROBOZ referansi düzeyleri, örnegin kronik böbrek hastaligi veya proteinürisi olmayan bireylerden alinan bes veya daha fazla örnekten, ya da ayni bireyden farkli saat zaman noktalarinda alinan bes veya daha fazla örnekten elde edilebilir. Bu testlerin bazi yapilanmalarina göre bir biyolojik örnek içerisinde ölçülen ROBOZ miktari, bir referans esik düzeyi ile, ya da örnegin yasa göre eslemeli bir normal kontrolden (örnegin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan riski olmayan, yasa göre eslenmis bir bireyden), ya da saglikli bir bireyden elde edilen biyolojik örnek gibi bir referans biyolojik örnegi ile karsilastirilir. Bazi yapilanmalara göre burada açiklanan testler, sistemler ve kitler, bir bireye verilen tedavi seyrinin izlenmesi için de faydalidir. Ornegin bireyin bir biyolojik örnegindeki ROBOZ düzeyi bir birinci zaman noktasinda (örnegin T1) ölçebilir ve ROBOZ biyo-belirteç referansi esik seviyesi ile karsilastirabilir ve eger ki ROBO2'nin ölçülen düzeyi, referans esik seviyesi ile ayni veya daha yüksek olur ise bireye, buradaki metotlarda açiklandigi üzere örnegin egzersizin artirilmasi, kalp basincinin azaltmasi, diyetin ayarlanmasi gibi kronik böbrek hastaligi veya proteinürinin meydana gelmesini geciktirmek veya daha az meydana gelmesini saglamak üzere uygun bir terapötik tedavi veya rejim uygulanabilir ve daha sonra ROBO2 biyo-belirteç proteininin panel düzeyi, bir ikinci (örnegin t2) ve takip eden zaman noktalarinda (örnegin t3, t4, t5, t5 vs.) ölçülebilir ve terapötik tedavinin veya tibbi tedavinin veya rejimin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riskini azaltmaya, geciktirmeye veya olusunu azaltmaya yönelik tedavi için etkili olup olmadiginin belirlenmesi için tROBOZ düzeyleri ile bir veya daha fazla zaman noktasinda (örnegin t1 'de veya sonraki bir zaman noktasinda) veya ROBOZ'nin referans esigi seviyeleri ile karsilastirilabilir. Bu tip yapilanmalarin bazilarina göre burada açiklanan testler, sistemler ve kitler, semptomatik bir bireyde (örnegin kronik böbrek hastaligi veya proteinürisi oldugu bilinen bir bireyde) bir terapötik tedaviyi izlemek üzere kullanilabilir ve bu çerçevede etkin bir tedavi, bireyde ROBOZ'deki bir düsüse karsilik gelir, ya da alternatif olarak burada açiklanan testler, sistemler ve kitler, asemptomatik bir bireyde (örnegin bir bireyde kronik böbrek hastaligi veya proteinüri meydana gelmesini önlemek üzere) profilaktik tedavinin etkisini izlemek üzere kullanilabilir ve bu çerçevede birey, burada açiklanan metotlara göre, ya da ilgili teknikte bilinen baska metotlara göre, ya da mesela kalitsal sebeplerle kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan riskli oldugu belirlenmis olur. Burada kullanildigi haliyle "örnek / numune" terimi, gerek DNA gerekse RNA gibi nükleik asit, ya da amino asitler içeren her materyali ifade eder. Genel itibariyla bu tip bir materyal; bir kan örnegi, gaita örnegi, doku örnegi, hücreler, bakteriler, histoloji seksiyonu veya bukkal svab formunda olacaktir. Ornekler hazirlanabilir, örnegin örnekler taze olabilir, fikse edilebilir, dondurulabilir veya parafin içine gömülebilir. Burada kullanildigi haliyle "biyolojik örnek / numune" terimi, bir bireyin bir hücresine veya hücrelerin bir popülasyonuna veya dokusu veya sivisinin bir miktarina karsilik gelir. Söz konusu örnek, çogunlukla bir bireyden çikarilmis olur, ancak "biyolojik örnek" terimi, in vivo olarak, yani bireyden çikarilmadan analiz edilen hücreleri veya dokulari da ifade edebilir. Siklikla karsilasildigi üzere bir "biyolojik örnek", hayvanin hücrelerini kapsayacaktir, ancak bu terim, örnegin gen ekspresyon seviyelerini ölçmek için kullanilabilen, kan, tükürük veya idrarin hücresel olmayan fraksiyonlari gibi hücresel olmayan biyolojik materyali de ifade edebilir. Biyolojik örneklerin arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere doku biyopsileri, skraplar, tam kan, plazma, serum, idrar, tükürük, hücre kültürü, ya da serebrospinal sivi bulunur. Biyolojik örnekler ayrica doku biyopsileri, hücre kültürü de ihtiva eder. Bir biyolojik örnek veya doku örnegi, bunlarla sinirli olmamak üzere örnegin idrar, kan, plazma, serum, böbrek biyopsisi, gaita, balgam, spinal sivi, plevral sivi, meme ucu aspiratlari, lenf sivisi, cildin harici kisimlari, solunum, bagirsak ve ürogenital sistemler, gözyasi, tükürük, süt, hücreler (bunlarla sinirli olmamak üzere kan hücreleri), tümörler, organlar ve ayrica bir In vitro hücre kültürü bileseninin örnekleri gibi bir bireyden izole edilen bir doku veya sivi örnegini ifade edebilir. Bazi yapilanmalara göre bir idrar örnegi alindiginda idrar örnegi, burada tarif edilen testlerin ve metotlarin üzerinde gerçeklestirilebildigi böbrek hücrelerini peletlemek üzere santrifüjlenir. Bazi yapilanmalara göre örnek, örnegin bir podosit örnegi gibi bir böbregin veya böbregin bir kisminin bir çekirdek igne biyopsisi gibi bir böbrek biyopsisine ait olur. Dahasi ince igne aspirasyon örnekleri de kullanilir. Bazi yapilanmalara göre örnekler hazirlanabilir, örnegin örnekler taze olabilir, fikse edilebilir, dondurulabilir veya parafin içine gömülebilir. Söz konusu örnek, bir bireyden alinan bir hücreler örneginin uzaklastirilmasi yoluyla elde edilebilir, ancak daha önce izole edilmis hücreler kullanilarak (örnegin bir baska kisi tarafindan izole edilir), ya da burada tarif edilen metotlar in vivo sekilde gerçeklestirilerek de basarilabilir. Burada kullanildigi haliyle "ekspresyon" terimi, birbirlerinin yerine kullanilacak sekilde bir polipeptidin veya bir proteinin ekspresyonuna veya bir polinükleotit ekspresyonuna veya bir genin ekspresyonuna isaret eder. Ekspresyon ayrica pre-translasyonel olarak degistirilmis ve post-translasyonel olarak degistirilmis proteinlerin ekspresyonunu ve ayrica pre-mRNA moleküllerinin, alternatif olarak uçbirlestirmeden geçirilmis ve matür mRNA moleküllerinin ekspresyonunu ifade eder. Bir polinükleotidin ekspresyonu, örnegin RNA transkript moleküllerinin üretimi, mesela haberci RNA (mRNA) transkript düzeyleri ölçülerek belirlenebilir. Bir protein veya polipeptidin ekspresyonu, örnegin polipeptit ile baglanan bir antikor/ antikorlar kullanilan bir immün testi ile belirlenebilir. "Kodlayici" terimi, polinükleotitler ile baglantili olarak kullanildigi haliyle, eger ki kendi dogal durumunda veya ilgili teknikte uzman kisilerce iyi bilinen metotlar ile manipüle edildiginde, polipeptidi veya polipeptidin bir fragmanini üretmek üzere bir amino asit dizisi halinde çevrilebilen RNA'yi üretecek sekilde kopyalanabiliyor ise, bir polipeptidi veya proteini "kodladigi" söylenen bir polinükleotidi ifade eder. Antisens iplik, böylesi bir nükleik asidin tamamlayicisidir ve kodlayici dizi ise bundan çikarsanabilir. "Endojen olarak ifade edilir" veya "endojen ekspresyon" ifadesiyle kasit, bir gen ürününün o hücre tipi için normal düzeylerde ve normal hücre regülasyonu altinda ekspresyonu anlamina gelir. Bir örnek veya biyolojik örnekteki ROBOZ proteini veya nükleik asit düzeylerini ölçmek üzere burada tarif edilen testler, metotlar ve sistemlerle kullanilabilecek deteksiyon metotlarinin arasinda; Optik metotlar, elektrokimyasal metotlar (voltametri ve amperometri teknikleri), atomik kuvvet mikroskopi ve radyo frekans metotlari, örnegin çok kutuplu rezonans spektroskopi bulunur. Optik metotlarin arasinda, hem konfokal olan hem de konfokal olmayan mikroskopi, flüoresans, Iüminesans, kemilüminesans, abzorbans, reflektans, transmitans ve çift kirilim veya refraktif indeks deteksiyonu (örnegin yüzey plazmon rezonansi, ellipsometri, bir rezonant ayna metodu, bir grating coupler dalga kilavuzu metodu veya interferometri) Burada tarif edilen ve ROBOZ proteini düzeyinin belirlendigi testlerin, metotlarin ve sistemlerin yapilanmalarina göre, örnek olarak SEQ ID NO: 1 veya SEO ID NO: 3'e sahip bir proteininin düzeyi belirlenebilir ve bir biyolojik örnekteki biyo-belirteç proteinlerinin düzeyini ölçmek için, ilgili teknikte uzman kisilerce yaygin olarak bilinen her proteomik yaklasim kullanilabilir. Olçüm, biyolojik örnekteki ROBO2 proteini düzeyinin, ROBO2 proteininin bir referans esigi degeri ile ayni veya bu esik degerin üzerinde veya altinda olup olmadigini belirleyebildigi veya gösterebildigi sürece, nicel veya nitel olabilir. Olçülen ROBOZ proteini düzeyi, bazi yapilanmalara göre, ROBOZ proteininin kendi miktarini, mesela örnekteki ROBOZ protein moleküllerinin sayisi saptanarak ölçen, ROBOZ proteini düzeyinin bir primer ölçümü olabilir, ya da bazi yapilanmalara göre bir ROBOZ proteininin bir sekonder ölçümü olabilir (ROBOZ proteini miktarinin, sart olmamakla birlikte çikarsanabildigi bir ölçüm, örnegin fonksiyonel aktivitenin bir ölçümü, ya da mesela ROBOZ proteinini kodlayan mRNA gibi bir nükleik asidin bir ölçümü). Kalitatif veriler, primer ölçümlerden de türetilebilir veya elde edilebilir. Burada tarif edilen testlerin ve metotlarin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ protein düzeyleri, afinite tabanli bir ölçüm teknolojisi kullanilarak ölçülebilir. Bir antikor ile ilgili olarak "afinite" terimi, ilgili teknikte iyi anlasilan bir terimdir ve antikorun, örnegin burada tarif edilen bir biyo- belirteç (ya da bunun bir epitopu) gibi bir baglayici partnere baglanma derecesi veya kuvvetini ifade eder. Afinite, bunlarla sinirli olmamak üzere denge ayrisma sabiti (KD veya Kd), görünür denge ayrisma sabiti (KD veya Kd) ve ICSO (bir rekabet testinde %50 inhibisyonu gerçeklestirmek için gereken miktar; burada "150" ile birbirlerinin yerine kullanilir) de dahil olmak üzere ilgili teknikte bilinen bir dizi sekilde ölçülebilir ve / veya ifade edilebilir. Mevcut bulusun amaçlari bakimindan bir afinitenin, bir epitopa baglanan belirli bir antikor popülasyonu için bir ortalama afinite oldugu anlasilacaktir. Afinite tabanli ölçüm teknolojisi, ölçülmekte olan biyo-belirteç proteinine spesifik olarak baglanan bir molekülden faydalanir (bir "afinite reaktifi, örnegin bir antikor veya aptamer), ancak baska teknolojiler, örnegin spektroskopi tabanli teknolojiler (örnegin matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight, MALDl-TOF spektrosk0pi) veya biyoaktiviteyi ölçen testler (örnegin büyüme faktörlerinin mitojenitesini ölçen testler) de kullanilabilir. Burada tarif edilen testler ve metotlar ile kullanilmaya yönelik afinite tabanli teknolojiler, antikor tabanli testleri (immün testler) ve ELONA gibi, aptamerler (baska moleküllere spesifik olarak baglanan nükleik asit molekülleri) kullanilan testleri ihtiva edebilir. ilaveten, hem antikorlar hem de aptamerler kullanilan testler de öngörülmektedir (örnegin yakalama için bir antikor ve saptama için bir aptamer kullanilan bir sandviç format testi). Ilgili teknikte çok çesitli afinite tabanli testler de bilinmektedir. Afinite tabanli testlerde, tipik olarak, biyo-belirteç proteinden (yani ROBOZ) türetilen en az bir epitop kullanilir ve pek çok afinite tabanli test formatinda birden fazla epitop kullanilir (örnegin yakalamak için en az bir epitop ve belirteci saptamak için en az bir farkli epit0p kullanilir). Afinite tabanli testler, rekabetçi veya direkt reaksiyon formatlarinda olabilir, sandviç tipi formatlar kullanabilir ve ayrica heterojen (örnegin kati süportlar kullanilir) veya homojen (örnegin tek bir fazda gerçeklesir) ve /veya immün presipitasyon da kullanabilir. Pek çok testte, isaretli afinite reaktifinin (örnegin antikor, polipeptit, ya da aptamer) kullanimina yer verilir; bu isaretler, örnegin enzimatik, flüoresans, kemilüminesans, radyoaktif, ya da boya molekülleri olabilir. Probdan gelen sinyalleri amplifiye eden analizler de bilinmektedir; bunlarin örnekleri arasinda biotin ve avidin kullanilan testler ve ELISA ve ELONA testleri gibi enzim isaretli ve aracili immün testler bulunur. Ornegin biyolojik sivi örneklerindeki biyo-belirteç konsantrasyonlari, LUMINEX® testi veya ELISA ile ölçülebilir. Gerek biyo-belirteç, gerekse biyo-belirteç için spesifik olan reaktif, bir yüzeye baglanabilir ve seviyeler direkt veya indirekt olarak ölçülebilir. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ protein düzeyleri, immün testi afinite tabanli bir ölçüm teknolojisi kullanilarak ölçülebilir. immün testi teknolojileri, bir biyolojik numunedeki ROBOZ proteini düzeyini kantitatif veya kalitatif sekilde ölçebilen her immün testi teknolojisini içerebilir. Uygun immün testi teknolojilerinin arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere radyo immün testi, ELISA (enzime bagli immünosorban testi), "sandviç" immün testleri, immünoradyometrik testler, immünodifüzyon testleri, in situ immün testleri (örnegin koloidal altin, enzim veya radyoizotop isaretler kullanilan), Western blot analizi, immünopresipitasyonlar, immünoflüoresans testleri, immün elektroforez testleri, floroimmün testi (FiA), immünoradyometrik test (IRMA), immünoenzimometrik test (IEMA), immünolüminesans testi ve immünoflüoresans testi kemilüminesans testi, immuno-PCR ve Western blot testi bulunur. Benzer sekilde, bir biyolojik numunedeki bir biyo-belirtecin düzeyini kantitatif veya kalitatif olarak ölçebilen aptamer tabanli testler, burada tarif edilen testlerde, metotlarda ve sistemlerde kullanilabilir. Genel itibariyla aptamerler, immün testinin neredeyse tüm formatlarinda antikorlarin yerine kullanilabilir, ancak aptamerler baska test formatlarina (örnegin bagli aptamerlerin PCR gibi nükleik asit amplifikasyon teknolojisi kullanilarak amplifikasyonu (US Pat. No. 4,683,202) veya kompozit Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ proteini düzeylerinin bir immün testi afinite tabanli ölçüm teknolojisi kullanilarak ölçüldügü durumlarda immün testi, biyo-belirteç / antikor etkilesiminin protein / antikor etkilesim derecesi ölçülerek gerçeklestirilir. Bilinen her immün testi metodu kullanilabilir. Bazi yapilanmalara göre, örnegin baglanma testinde ROBO2 proteinine baglanan bir antikor veya bir Iigant gibi bir baglayici partner, tercihen isaretli spesifik bir baglayici partneridir, ancak bir antikor olmasi sart degildir. Baglayici partner genellikle kendi basina isaretlenir, ancak alternatif olarak, örnegin bir baska isaretli bir maddeden, içerisinde bir sinyalin üretildigi bir sekonder reaksiyon ile de saptanabilir. Dolayisiyla, ROBOZ proteinine spesifik olarak baglanan antikor, ROBOZ proteininin bir biyolojik numunedeki varligini ve / veya miktarini belirlemek üzere burada tarif edilen testlerde, metotlarda ve sistemlerde kullanilabilir ve bu sonuçlar ise, bir diyagnostik örnekte bulunan ROBO2 proteininin artmis veya azalmis konsantrasyonunu saptamak 'üzere kullanilabilir. Bu tip antikorlar, immün diyagnostik alanindaki iyi bilinen metotlarin herhangi biri ile üretilebilir. Söz konusu antikorlar, proteinin biyolojik olarak uygun her durumuna karsi etkili anti-ROBOZ protein antikorlari olabilir. Dolayisiyla bunlar, vücutta glikozillenmis bir formda bulunan ROBOZ proteininin glikozillenmemis bir formuna karsi, ya da ROBOZ proteininin ilgili bir epitopunu tasiyan bir peptide karsi üretilebilir. Bu testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre amplifiye edilmis birtest formu kullanilabilir ve bu çerçevede, saptanacak olan göreli olarak düsük bir protein düzeyinden bir artirilmis "sinyal" üretilir. Bir amplifiye immün testinin özel bir formu, artmis kemilüminesans testidir. Ornek olmasi bakimindan antikor, yaban turpu peroksidaz ile isaretlenir ve yaban tu rpu peroksidaz ise; Iuminol, bir peroksit substrati ve tipik olarak 4-iyodofen0l veya 4- hidroksisinamik asit gibi yayilan isigin yogunlugunu ve süresini artiran bir bilesik ile bir kemilüminesans reaksiyonuna katilir. Bu testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre, immün-PCR içeren bir amplifiye immün testi kullanilabilir. Bu teknige göre antikor, PCR primerleri içeren bir arbitrer DNA molekül'une kovalent sekilde baglanir ve burada, kendisine bagli antikor ile DNA, polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye olur. Bkz. E. R. Hendrickson ve ark., Nucleic Acids Dolayisiyla burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin tüm yapilanmalarina göre ROBO2 proteini düzeyi, burada "protein baglayici antite" olarak da anilan bir protein baglayici madde kullanilarak belirlenebilir, veya bir "afinite reaktifi", özellikle de antikorlar kullanilabilir. Ornegin afinite reaktifleri, özellikle anti-biyo-belirteç antikorlari gibi antikorlar bir immün testinde, özellikle bir ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) testinde kullanilabilir. Bir biyo-belirteç proteini düzeyinin, bunlarla sinirli olmamak üzere örnegin izoform proteinlerinin izoform-spesifik kimyasal veya enzimatik bölünmesi, immün blotlama, immünhistokimya analiz, ELISA ve kütle spektrometri de dahil olmak üzere, ilgili teknikte yaygin sekilde bilinen metotlar kullanilarak bir biyolojik numunede ölçülebildigi yapilanmalarda. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 proteini düzeyleri, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" kullanilarak ölçülür. ELISA, antikorun isaretli (örnegin enzime bagli) bir formu kullanilarak bir antijenin konsantrasyonunu saptamaya ve ölçmeye yönelik bir tekniktir. Teknikte uzman kisilerce iyi bilinen farkli ELISA formlari bulunur. Teknikte, ELISA çalismasi için bilinen standart teknikler için bkz. "Methods iri Immunodiagnosis", 2. Baski, Rose ve Bigazzi, ed. John Wiley & Sons, 1980; Campbell ve ark., "Methods and Immunology", W. A. Benjamin, Inc., 1964; ve Oellerich, Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 proteini düzeyleri, bir sandviç ELISA testi kullanilarak ölçülür. Bir "sandviç ELISA" testi kapsaminda bir antikor (örnegin anti-enzim), bir kati faza (yani bir mikrotitre plagina) baglanir ve antijeni (örnegin enzim) içeren bir biyolojik örnege maruz birakilir. Kati faz daha sonra baglanmamis antijenleri uzaklastirmak üzere yikanir. Isaretli bir antikor (örnegin enzime bagli) daha sonra bir antikor-antijen-antikor sandviçi olusturmak üzere bagli antijene (mevcut ise) baglanir. Buna göre bu metot ile ROBOZ proteinine yönelik bir birinci antikor, örnegin bir plastik mikrotitre plagin bir gözü gibi bir kati faza baglanir ve örnek ile ve test edilecek olan ROBOZ proteinine spesifik bir isaretli ikinci antikor ile inkübe edilir. Antikora baglanabilen enzimlerin örnekleri; alkalin fosfataz, yaban turpu peroksidaz, Iusiferaz, üreaz ve B-galaktosidaz olmaktadir. Enzime bagli antikor, ölçülebilen bir renkli reaksiyon ürününü üretmek üzere bir substrat ile reaksiyon verir. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ proteini düzeyleri, bir antikor yakalama testi veya rekabetçi ELISA kullanilarak ölçülür. Bir Antijen-antikor karisimi daha sonra antijen (yani enzim) ile kaplanmis bir kati faz (örnegin bir mikrotitre plak) ile temas ettirilir. Ornekteki antijen ne kadar fazla olur ise, kati faza baglanmak için mevcut olacak serbest antikor daha az olur. Daha sonra, kati faza bagli primer antikorun miktarini belirlemek üzere, isaretli (örnegin enzime bagli) bir sekonder antikor kati faza eklenir. Dolayisiyla bazi yapilanmalara göre bir biyolojik test örnegi, bir kati faza baglanmaya birakilir ve anti-ROBOZ protein antikoru (örnegin ROBOZ proteinine spesifik olarak baglanan antikorlar) eklenebilir ve baglanmalarina imkan verilebilir. Baglanmamis materyalin yikanarak uzaklastirilmasindan sonra, kati faza baglanan antikor miktari, birinciye anti olan bir isaretli ikinci antikor kullanilarak belirlenir. Bu testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre bir isaret, tercihen bir enzim olmaktadir. Enzime yönelik substrat, örnegin renk Olusturucu, flüoresans veya kemilüminesans olabilir. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 proteini düzeyleri, immünhistokimya kullanilarak ölçülür. Bir "immünhistokimya testi" kapsaminda dokunun bir seksiyonu, dokuyu, tahlil edilen proteine spesifik olan antikorlara maruz birakarak spesifik proteinler için test edilir. Söz konusu antikorlar daha sonra mevcut proteinin varligini ve miktarini belirlemek üzere, bir dizi metot ile görüntülenir. Antikorlari görüntülemek için kullanilan metotlarin örnekleri, mesela antikorlara bagli enzimler (örnegin kimyasal metotlar (örnegin DAB / substrat kromajen) olmaktadir. Ornek, daha sonra mikroskobik olarak ve en fazla tercih edildigi haliyle, ilgili teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen çesitli boyanma metotlarinin ve reaktiflerinin herhangi biri kullanilarak, görünür spektrumda saptanan bir boya ile boyanan bir örnek isik mikroskobu ile analiz edilir. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ proteini düzeyleri, radyoimmün testleri kullanilarak ölçülür. radyoimmün testi, antijenin isaretli (örnegin radyoaktif veya flüoresans ile isaretli) bir formu kullanilarak, antijeni (yani ROBOZ) saptamaya ve konsantrasyonunu ölçmeye yönelik bir tekniktir. Antijenlere yönelik radyoaktif isaretlerin örnekleri arasinda 3H, MC ve 1251 bulunur. Bir biyolojik örnekteki ROBOZ konsantrasyonu, ROBOZ'nin, biyolojik örnekte, ROBOZ'ye yönelik bir antikora baglanmada isaretli (örnegin radyoaktif olarak) ROBOZ ile yarismasi yoluyla ölçülür. Isaretli ROBO2 ve isaretsiz ROBO2 arasinda rekabetçi baglanma saglamak için isaretli ROBOZ, antikorun baglayici pozisyonlarini doygun hale getirmede yeterli bir konsantrasyonda bulunur. Ornekte ROBO2 konsantrasyonu ne kadar yüksek olur ise, antikora baglanacak olan isaretli ROBOZ konsantrasyonu o kadar düsük olur. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ proteini düzeyleri, bir immünradyometrik test (IRMA) kullanilarak ölçülür. IRMA, antikor reaktifinin radyoaktif olarak isaretlendigi bir immün testtir. Bir IRMA, örnegin bir tavsan serum albümin (RSA) gibi bir proteine konjügasyon gibi, çok degerlikli bir antijen konjügati üretilmesini gerektirir. Çok degerlikli antijen konjügati, birim molekülde en az 2 antijen rezidüsüne sahip olmali ve antijen rezidüleri, antijene en az iki antikorun baglanmasi için yeterli mesafe olmalidir. Örnegin bir IRMA kapsamindaki çok degerlikli antijen konjügati, örnegin bir plastik kürecik gibi bir kati yüzeye baglanabilir. Isaretlenmemis "örnek" antijen ve radyoaktif olarak isaretlenmis olan antijene yönelik antikor, çok degerlikli antijene konjügat ile kapli kürecigi içeren bir test tüpüne eklenir. Ornek içerisindeki antijen, antijen antikor baglanma yerleri için çok degerlikli antijen konjügati ile yarisir. Uygun bir inkübasyon periyodundan sonra baglanmamis reaktifler, yikama yoluyla uzaklastirilir ve kati faz üzerindeki radyoaktif miktari belirlenir. Baglanan radyoaktif antikorun miktari, örnek içerisindeki antijen konsantrasyonu ile ters orantilidir. Bir biyolojik örnekte bulunan ROBOZ proteini düzeyini saptamak üzere kullanilabilen baska teknikler, bir pratisyen hekimin tercihine göre ve burada açiklananlar esasinda ve biyolojik örnegin (mesela plazma, idrar, doku örnegi vs.) tipine göre gerçeklestirilebilir. Böylesi tekniklerden biri Western blotlama teknigidir (Towbin ve ark., Proc. Nat. Acad. Sci. 76:4350 (1979)) ve bu çerçevede uygun olarak muamele edilen bir örnek, örnegin nitroselüloz filtre gibi bir kati süporta aktarilmadan önce bir SDS-PAGE jel üzerinde yürütülür. Saptanabilir sekilde isaretli anti-ROBOZ antikorlari veya protein baglayici moleküller, daha sonra ROBOZ proteini düzeyini degerlendirmek için kullanilabilir ve burada saptanabilir isaretin sinyaline ait yeginlik, ROBOZ proteininin miktarina karsilik gelir. Mevcut olan ROBO2 proteininin miktarina ait düzeyler, örnegin dansitometri yoluyla da kantifiye edilebilir. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 protein düzeyleri kütle spektrometri, örnegin MALDI / TOF (time-of-flight), SELDI / TOF, sivi kromatografi-kütle spektrometri (LC-MS), gaz kromatografi-kütle spektrometri (GC-MS), yüksek performansli sivi kromatografi-kütle spektrometri (HPLC-MS), kapiler elektroforez- kütle spektrometri, nükleer manyetik rezonans Spektrometri, ya da tandem kütle Spektrometri (örnegin MS/MS, MS/MS/MS, ESI-MS/MS vs.) kullanilarak ölçülür. Bkz. Örnegin U.S. Patent Bu tip bazi yapilanmalara göre bu metodolojiler, bir biyolojik örnekteki ROBOZ proteini düzeyini gösteren, basilabilir bir rapor üretmek üzere bir biyolojik örnekteki ROBOZ proteini düzeyini belirlemeye yönelik otomatik bir sistem üretmek için makineler ile, bilgisayar sistemleri ve ortamlar ile birlestirilebilir. Bazi durumlarda ROBOZ düzeyinin ölçümü, tayin ve karsilastirma Kütle spektrometri metotlari ilgili teknikte iyi bilinir ve proteinler gibi biyomoleküllerin kantifiye edilmesi ve / veya tanimlanmasi için kullanilmistir (bkz. örnegin Li ve ark. (2000) Tibtech Structural Biol. 8:393-400). Dahasi, izole edilen proteinlere ait dizilerin hiç degilse kismi olarak de novo sekilde belirlenmesine imkan veren kütle Spektrometri teknikleri gelistirilmistir. Chait Belirli yapilanmalara göre bir gaz fazi iyon spektrofotometre kullanilir. Baska yapilanmalara göre örnegi analiz etmek için lazer-dezorpsiyon I iyonizasyon kütle spektrometri kullanilir. Modern lazer dezorpsiyon / iyonizasyon kütle spektrometrisi ("LDl-MS"), iki ana varyasyonda uygulanabilir: matris destekli lazer dezorpsiyon I iyonizasyon ("MALDI") kütle spektrometri ve yüzeyi artirilmis lazer dezorpsiyon / iyonizasyon ("SELDl"). MALDI kapsaminda analit, bir matris içeren bir çözelti ile karistirilir ve sivinin bir damlasi, bir substratin yüzeyi üzerine birakilir. Matris çözeltisi daha sonra biyolojik moleküller ile birlikte kristallestirilir. Substrat, kütle spektrometrenin içerisine sokulur. Lazer enerjisi, substrat yüzeyi üzerine yönlendirilir ve burada dezorbe olarak, biyolojik molekülleri, önemli ölçüde parçalamadan iyonize eder. Bkz. örnegin U.S. Pat. No. 5, ve U.S. Pat. No. 5,045,694 (Beavis ve SELDI kapsaminda substrat yüzeyi, dezorpsiyon prosedüründe aktif bir katilimci olacagi sekilde modifiye edilir. Bir varyanta göre yüzey, ilgi dahilindeki proteini selektif sekilde baglayan adzorban ve / veya yakalama reaktifleri ile türetilir. Bir baska varyanta göre yüzey, lazerle vuruldugunda dezorbe olmayan enerji emici moleküller ile türetilir. Bir baska varyanta göre yüzey, ilgi dahilindeki proteini baglayan ve Iazerin uygulanmasi üzerine kopan bir fotolitik bag içeren moleküller ile türetilir. Bu metotlarin her birinde türetme ajan genellikle, örnegin uygulandigi substrat yüzeyi üzerinde spesifik bir Iokasyonda lokalize olur. Bkz. örnegin U.S. materyali saglamak üzere yakalanan analite matris içeren sivi eklenerek bir bir SELDI afinite yüzeyi ile birlestirilebilir. Kütle spektrometreleri hakkinda ilave bilgi için bkz. örnegin Principles of Instrumental Analysis, 3. Baski, Skoog, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1985; ve Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4. Baski, Cilt 15 (John Wiley & Sons, New York 1995), . 1071-1094. ROBOZ proteini düzeyinin saptanmasi tipik olarak sinyal yeginliginin deteksiyonuna bagli olacaktir. Bu durum ise, substrata bagli bir polipeptidin miktarini ve karakterini yansitabilir. Ornegin, belirli yapilanmalara göre bir birinci örnegin ve bir ikinci örnegin spektrumlarina ait pik degerlerinin sinyal kuvveti, belirli biyomoleküllerin göreli miktarlarini belirlemek üzere (örnegin görsel olarak, bilgisayar analizi yoluyla vs.) karsilastirilabilir. Ornegin Biomarker Wizard programi (Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, Calif.) gibi yazilim programlari, kütle spektrumlarini analiz etmede yardimci olarak kullanilabilir. Kütle Spektrometreleri ve bunlarin teknikleri, ilgili teknikte uzman kisiler tarafindan iyi bilinir. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ protein düzeyleri jel elektroforez teknikleri, daha özel olarak SDS-PAGE (Sodyum Dodesilsülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez), bilhassa iki boyutlu PAGE (2D-PAGE), tercihen iki boyutlu SDS-PAGE (2D-SDS-PAGE) kullanilarak ölçülür. Özel bir örnege göre test, özellikle tercihen pH kullanilarak 2D- Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBOZ proteini düzeyleri, özellikle jel elektroforez teknikleri kullanilarak, daha özel olarak, yukarida bahsedilen teknikler ile baska protein ayirma metotlari, bilhassa ilgili teknikte uzman kisilerce bilinen metotlar, özellikle de kromatografi ve / veya boyuta göre ayirma metotlari birlestirilerek Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROB02 proteini düzeyleri, özellikle plazma yüzey rezonansi gibi rezonans teknikleri kullanilarak Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre ROBO2 proteini düzeyleri, bir protein biyo-çip kullanilarak ölçülür. Bir biyo-çip genellikle büyük ölçüde düzlemsel bir yüzeye sahip bir kati substrat içerir ve bir yakalama reaktifi (örnegin bir adzorban veya afinite reaktifi) bu yüzeye baglanir. Siklikla karsilasildigi haliyle bir biyo-çipin yüzeyi, bagli yakalama reaktifine sahip çok sayida adreslenebilir lokasyon içerir. Biyo-çip, bir kontrol olarak islev gösteren bagli yakalama reaktifi de içerebilir. Protein biyo-çipleri, polipeptitlerin yakalanmasi için adapte edilen biyo-çiplerdir. Çogu protein biyo-çipler, ilgili teknikte tarif edilir. Bunlarin arasinda, örnegin Ciphergen Biosystems, lnc. (Fremont, Calif.), Zyomyx (Hayward, Calif.), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), Biacore (Uppsala, Sweden) ve Procognia (Berkshire, UK) tarafindan üretilen protein biyo-çipleri bulunur. Bu tip protein biyo-çiplerinin örnekleri, asagidaki patentlerde veya yayinlanmis patent basvurularinda tarif edilir: U.S. Pat. No. 6,; U.S. Pat. No. 6,; PCT Uluslararasi Yayin No. WO ve U.S. Pat. No. 5,242,828 (Bergstrom Bir bireyden alinan ROB02 proteini düzeyi ile karsilastirma için kullanilan ROBOZ proteini düzeylerinin referans esigi seviyeleri veya degerleri, burada tarif edilen ve uygulanan yön veya yapilanmaya göre, bu tarifname boyunca ve asagida anlasilacagi gibi degisiklik gösterebilir. Bir referans esik degeri, örnegin test edilen bir bireyden, ancak önceki bir zaman noktasinda (mesela bir birinci zaman noktasinda (t1), örnegin ölçülen bir birinci biyo-belirteç düzeyi, ya da bir ikinci zaman noktasinda (t2) vs.) alinan bir biyolojik örnekten elde edilen bir deger gibi bir münferit örnek degerine dayandirilabilir. Bir referans esik degeri, örnegin test edilen bireylerin bir havuzundan alinan örneklerden elde edilen deger(ler) gibi, örneklerin bir havuzuna da dayandirilabilir. Ornegin bazi yapilanmalara göre ROBOZ proteinine yönelik referans esik degerleri, kronik böbrek hastaligi veya proteinürisi oldugu bilinen bireylerde ölçülen ROBOZ proteininin ölçülen %50 degerine (örnegin medyan) dayandirilir. Ornegin, ROBO2 proteini bakimindan en üst %50'de (örnegin medyan seviyede veya üzerinde) bulunan bireyler, kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riski tasidiklari yönünde seçilebilir. Referans degeri / degerleri, test edilecek olan örnegi / örnekleri içeren veya hariç tutan bir örnekler havuzuna da dayandirilabilir. Referans degeri, örnegin kronolojik yas eslemeli grubun saglikli bireylerinin popülasyonundan, ya da kronik böbrek hastaligi veya proteinüri olmayan veya riski tasimayan bireylerin popülasyonundan gelen çok sayida örnege dayandirilabilir. Bazi yapilanmalara göre referans degeri, bu testlerin herhangi birinin ortalamasi veya medyanin veya önceden belirlenmis bir ortalama veya medyanin en az bir, daha tipik olarak en az iki standart sapma üzerinde olabilir. Burada açiklanan testler, metotlar ve sistemlere göre bir bireyin muhtemel olarak kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirme riskini degerlendirmek 'üzere bir "referans esik degeri", örnegin test edilen bireyin kronolojik yasi ile eslenmis olarak, kronolojik yas grubunda bulunan saglikli bireylerin bir popülasyonundan elde edilen medyan idrar, serum veya kan ROBO2 proteini gibi, tipik olarak önceden belirlenmis bir referans esik seviyesi olmaktadir. Daha önce belirtildigi üzere bazi durumlarda referans numuneleri cinsiyete göre eslendirilebilir ve / veya etnisite esasinda eslendirilebilir. Bazi yapilanmalara göre ROBO2 proteinine yönelik referans esik degeri, örnegin Kafkas, Siyahi, Hispanik, Asya ve Asya-Hindistan, Pakistan, Orta Dogu ve / veya Pasifik Adali gibi ayni etnisiteye ait bir bireyler panelinde, örnegin idrar, kan, serum gibi bir biyolojik örnek tipinde o biyo-belirtece yönelik medyan seviye olmaktadir. Burada açiklanan testler, metotlar ve sistemlere göre bir bireyin muhtemel olarak kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirme riskini degerlendirmek üzere, ROBOZ proteinine yönelik referans esik degeri, örnegin test edilen bireyin kronolojik yasi ile eslenmis olarak, kronolojik yas grubunda bulunan saglikli bireylerin bir popülasyonundan elde edilen seviyelerin ortalamasi veya medyani gibi önceden belirlenmis bir seviye olabilir. Alternatif olarak, ROBOZ proteinine yönelik referans esik seviyesi, belirli bir bireye yönelik olarak, o bireyden daha önceki ve I veya birey bir kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riski tasimadigindaki bir zaman noktasinda türetilen bir örnekten elde edilen bir tarihi referans seviyesi olabilir. Bazi durumlarda ROBOZ proteinine yönelik referans esik seviyesi, örnegin diyabet sebebiyle tamami kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirmis olan bireylerin belirli bir birey grubuna yönelik olarak, ROBOZ proteininin tarihsel bir referans seviyesi olabilir. Bazi yapilanmalara göre saglikli bireyler, kontrol bireyleri olarak seçilir. Bazi yapilanmalara göre kontroller, yasa göre eslenen kontrollerdir. Saglikli birey, örnegin bir idrar veya serum örneginde bir referans ROBOZ proteini esik seviyesi elde etmek üzere kullanilabilir. Burada kullanildigi haliyle "saglikli" bir birey veya "saglikli" bir bireyin örnegi, ilgili teknikte uzman kisiler tarafindan yaygin olarak bilindigi gibidir. Ornegin, kontrol bireylerini burada tarif edilen teshis ve tedavi metotlari için saglikli bireyler olarak seçmek üzere, burada tarif edildigi gibi böbrek fonksiyonunu degerlendirmek üzere yaygin olarak bilinen metotlar kullanilabilir. Bazi yapilanmalara göre, saglik bakimindan iyi durumda olan ve kronik böbrek hastaligi oldugunu gösteren herhangi bir belirti veya semptom göstermeyen bireyler, saglikli kontrol bireyleri olarak kullanilabilir. Bireyler, klinisyenler tarafindan tibbi öykü, aile öyküsü, fiziksel ve renal muayeneler ve laboratuvar testlerinden olusan kapsamli degerlendirmeler esasinda degerlendirilir. Kronik böbrek hastaligi ve / veya proteinüri analizinin örnekleri arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere örnegin idrar, kan veya serum örneginde spesifik proteinlere veya moleküllere ait düzeylerin, örnegin albümin, kalsiyum, kolesterol, tam kan sayimi (CBC), elektrolitler, magnezyum, fosfor, potasyum, sodyum, ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonuna ait düzeylerin saptanmasi; örnegin kreatinin klirensi, Kreatinin düzeyleri, BUN (kan üre azot) tayinine yönelik tahliller; abdominal CT taramasi, abdominal MR, abdominal ultrason, böbrek biyopsisi, böbrek taramasi, böbrek ultrasonu; eritropoietin, PTH testlerinin sonuçlarindaki degisimlerin saptanmasi; kemik yogunlugu, ya da D vitamini testi; veya bu tip deteksiyon metotlarinin ve testlerin herhangi bir kombinasyonu bulunur. Yas eslemeli popülasyonlar (referans degerlerin elde edilebildigi popülasyonlar), test edilen hasta veya birey ile ideal olarak ayni kronolojik yasta olur, ancak yaslarin yaklasik olarak eslendigi popülasyonlar da kabul edilebilir. Yaslarin yaklasik olarak eslendigi popülasyonlar, test edilen bireyin kronolojik yasindan 1, 2, 3, 4 veya 5 yas farkli olabilir, ya da test edilen bireyin kronolojik yasini kapsayan farkli kronolojik yaslardaki gruplar olabilir. araligindaki kronolojik yas eslemesi ile karsilastirilmasina isaret eder. Yaslarin yaklasik olarak (örnegin bir "5 yillik artis" grubu, 62 yasindaki bir birey için referans degerleri kaynagi olarak 61-65 yasindaki bireyleri, ya da 62-66 yasindaki bireyleri içerebilir). Daha genis bir tanimiyla, farkli kronolojik yas gruplari arasinda daha büyük farklar söz konusu oldugunda, örnegin referans degerleri için az sayida farkli kronolojik yas gruplari mevcut oldugunda ve farkli ya da 20 yillik artislara ulastiginda "kronolojik yas eslemeli grup", bireyin kronolojik yasina daha yakin olarak eslesen yas grubuna karsilik gelebilir (örnegin daha yasli bir yas grubu (örnegin 80-90 yas) ve daha genç bir yas grubu (örnegin 20-30 yas) için referans degerleri mevcut oldugunda, 51 yas için kronolojik olarak yas eslemeli bir grup için, daha genç olan yas grubu (20-30 yas) referans seviyesi olarak kullanabilir, çünkü bu grup, test edilen bireyin kronolojik yasina daha yakindir. Kontrol bireylerini seçerken dikkate alinacak olan baska faktörler, bunlar ile sinirli olmamak üzere türler, cinsiyetler, etnik kökenler ve benzerlerini ihtiva eder. Dolayisiyla bazi yapilanmalara göre bir referans seviyesi, örnegin test edilen bireyin cinsiyeti ile cinsiyet anlaminda eslesen saglikli kontrol bireyleri popülasyonundan elde edilen seviyelerin Ortalamasi veya medyan degeri gibi, önceden belirlenmis bir referans seviyesi olabilir. Bazi yapilanmalara göre bir referans seviyesi, örnegin test edilen bireyin etnisitesi (örnegin Kafkas, Siyahi, Hispanik, Asya ve Asya-Hindistan, Pakistan, Orta Dogu ve Pasifik Adali) ile etnisite esasinda eslesen saglikli kontrol bireylerinin bir popülasyonundan elde edilen seviyelerin ortalamasi veya medyan degeri gibi, önceden belirlenmis bir referans seviyesi olabilir. Baska yapilanmalara göre, saglikli bireyler popülasyonunun hem kronolojik yasi hem de cinsiyeti, test edilen bireyin sirasiyla kronolojik yasi ve cinsiyeti ile eslestirilir. Baska yapilanmalara göre, saglikli bireyler popülasyonunun hem kronolojik yasi hem de cinsiyeti, test edilen bireyin sirasiyla kronolojik yasi ve etnisitesi ile eslestirilir. Baska yapilanmalara göre, saglikli kontrol bireyleri popülasyonunun kronolojik yasi, cinsiyeti ve etnisitesi, test edilen bireyin sirasiyla kronolojik yasi, cinsiyeti ve etnisitesi ile eslestirilir. Bir bireyden alinan bir biyolojik örnekteki bir ROBOZ proteini düzeyini ve ROBOZ proteinine yönelik bir referans esik düzeyini karsilastirmaya yönelik prosedür, ilgili teknikte uzman kisilere uygun olan her elverisli sekilde gerçeklestirilebilir. Genel itibariyla, burada tarif edilen testler, metotlar ve sistemler kullanilarak belirlenen ROBOZ proteini düzeylerinin degerleri, kantitatif degerler olabilir (örnegin kantitatif konsantrasyon degerleri, örnek olarak bir örnegin birim olabilir). Alternatif olarak, ROBO2 protein düzeylerinin degerleri, ölçüm tekniklerine bagli olarak kalitatif olabilir ve dolayisiyla bir bireyin bir degerinin ve bir referans degerinin karsilastirilmasi usulü, kullanilan ölçüm teknolojisine bagli olarak degisiklik gösterebilir. Ornegin karsilastirma, sayisal veriler incelenerek, verilerin sunumlari incelenerek (örnegin sütun veya çizgisel grafikler gibi grafiksel sunumlar incelenerek) ve örnegin en az birlik standart sapmalar, ya da en az iki standart sapma kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bir örnege göre, ROBOZ proteini düzeylerini ölçmek üzere bir kalitatif test kullanildiginda bu düzeyler, renklenen reaksiyon ürününün yeginligi görsel olarak karsilastirarak, ya da renklenen reaksiyon ürününün dansitometrik veya spektrometrik ölçümlerinden elde edilen veriler karsilastirilarak (örnegin ölçüm cihazindan elde edilen sütun grafikleri gibi sayisal veriler veya grafiksel veriler karsilastirilarak) kiyaslanabilir. Burada tarif edildigi üzere ROBOZ proteini düzeyleri, kantitatif olarak (mutlak degerler) veya kalitatif olarak (göreli degerler) ölçülebilir. Bazi yapilanmalara göre biyolojik örneklerde bulunan ROBO2 proteini düzeylerinin kantitatif degerleri, kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan belirli bir risk seviyesi (veya derecesi) gösterebilir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma, bir bireyden elde edilen degerler ve referans degerleri arasindaki farkin büyüklügünü belirlemek için gerçeklestirilir (örnegin bir bireyden elde edilen, ölçülen ROBOZ proteini düzeyleri ve referans esik ROBOZ proteini degeri arasindaki "misli" veya fark yüzdesi karsilastirilir). Bir misli fark, ROBOZ proteini düzeylerinin mutlak konsantrasyonu ölçülerek ve bu mutlak deger ile referans esik ROBOZ protein seviyesi ile karsilastirilarak belirlenebilir, ya da bir misli fark, bir referans degeri ve bir örnek degeri arasindaki göreli fark ile ölçülebilir ve bu durumda iki deger de mutlak konsantrasyonun bir ölçüsü olmaz ve / veya her iki deger de es zamanli olarak ölçülür. Örnegin bir ELISA ile, bir proteinin mutlak içerigi veya konsantrasyonu ölçülür ve bundan da referansta bulunan ayni proteinin mutlak konsantrasyonu ile karsilastirilarak bir misli degisim belirlenir. Bir baska örnek olarak bir antikor dizisi ile bir göreli konsantrasyon ölçülür ve bundan da bir misli degisim belirlenir. Buna göre, ölçülen deger ve referans degeri arasinda, belirli bir taniyi öneren veya gösteren bir farkin büyüklügü, uygulanan metoda bagli olacaktir. Ilgili teknikte uzman kisilerce anlasilacagi üzere ROBOZ proteini düzeylerinin ölçülmesi için tekrarli ölçümler yapildiginda bireylerin ölçülen degerleri, referans esik ROBOZ protein düzeyleri ile karsilastirilabilir ve tekrarli ölçümler hesaba katilir. Tekrarli ölçümler, ölçülen degerlerin gerek ortalamasi gerekse medyani kullanilarak hesaba katilabilir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma prosedürü manüel olabilir, ya da tercihen otomatik olabilir. Örnegin bir test aleti (örnegin kemilüminesans sinyalleri ölçmeye yönelik bir luminometre), bir bireyin bir degerinin ROBO2 proteinine yönelik bir referans degeri ile karsilastirmasini saglayan devreler ve yazilim ihtiva edebilir. Alternatif olarak, birey(ler)den ölçülen ROBOZ proteini düzeylerinin ve ROBO2 proteinine yönelik referans esik düzeylerinin karsilastirilmasi için, ayri bir alet (örnegin bir dijital bilgisayar) kullanilabilir. Karsilastirmaya yönelik otomatik cihazlar, ROBOZ proteini için kaydedilmis referans degerleri içerebilir, ya da bireyden / bireylerden ölçülmüs olan ROBOZ proteini düzeylerinin, es zamanli olarak ölçülen referans örneklerinden türetilen ROBOZ proteini referans esik düzeyleri ile karsilastirilabilir. Bazi yapilanmalara göre, ROBO2 proteini düzeyleri için test edilen bir birey, burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin sonuçlari esasinda iki veya daha fazla gruptan (durumdan) birine atanabilir. Burada tarif edilen diyagnostik testler, metotlar ve sistemler, bir dizi farkli durum arasinda siniflandirmak için kullanilabilir. Dolayisiyla bazi yapilanmalara göre bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri (durum, düsük riske karsi yüksek risk) sergileme riskinin yüksek olup olmadiginin belirlenmesi (durum, düsük riske karsi yüksek risk), burada tarif edilen diyagnostik testler, metotlar ve sistemlerin kullanilmasi ile gerçeklestirilir. Ornegin, yüksek, orta veya düsük gibi çesitli risk durumlarinin bir karakteristigi olarak belirlendigi üzere, ROBO2 proteininin biyo-belirteç miktarlari veya örüntüleri belirlenir. Kronik böbrek hastaligi veya proteinüri gelistirme riski, ROBOZ proteini tek basina veya bilinen baska biyo-belirteçler ile birlikte ölçerek belirlenir ve daha sonra bunlar bir siniflandirma algoritmasina gönderilir veya bunlar, belirli bir risk seviyesi ile iliskili bir referans miktari (örnegin burada açiklandigi üzere bir cut off referans miktari) ile karsilastirilir. Bazi yapilanmalara göre burada, bir bireydeki kronik böbrek hastaligi veya proteinüri hastaliginin siddetini veya evresini veya bu hastaligin bulunma riskini belirlemeye yönelik diyagnostik testler, metotlar ve sistemler saglanmaktadir. Ornegin kronik böbrek hastaliginin her bir evresi, karakteristik miktarda ROBOZ proteinine veya göreli miktarlarda ROBOZ proteinine sahiptir. Bir hastaligin evresi, ROBOZ proteininin tek basina veya baska biyo- belirteçler ile birlikte ölçülmesi yoluyla belirlenir ve daha sonra bunlar bir siniflandirma algoritmasina tabi tutulur veya bunlar, belirli bir evre ile iliskili biyo-belirteç referans miktari ve hastaligini muhtemelen ne kadar yakinda gelistirecegi bakimindan). 'Ornegin bir yil içerisinde kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirmesi muhtemel bir birey (örnegin kötü prognoz) veya sonraki 5 yil içerisinde kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirmesi muhtemel bir birey arasinda siniflandirma yapilabilir. Diyagnostik testlerin, metotlarin ve sistemlerin ilave yapilanmalari, sonuçlarin veya tanilarin veya her ikisinin örnegin teknisyenlere, doktorlara veya hastalara iletilmesi ile ilgilidir. Belirli yapilanmalara göre test sonuçlarini veya tanilarini veya her ikisini, örnegin hekimler ve kendi hastalari gibi ilgili taraflara göndermek üzere bilgisayarlar kullanilir. Bazi yapilanmalara göre, örnegin sonuçlarin veya tanilarin iletildigi ülkeden veya yetki bölgesinden farkli olan bir ülkede veya yetki bölgesinde testler gerçeklestirilir veya test sonuçlari analiz edilir. Bazi yapilanmalara göre bireyden alinan bir biyolojik örnekteki ROBO2 proteini düzeylerine göre kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirme riski, seviyeler veya prognoz elde edildikten sonra bireye bildirilir. Prognoz veya tani, bireye, bireyi tedavi eden hekim tarafindan teblig edilebilir. Alternatif olarak prognoz veya tani, bireye e-posta yoluyla gönderilebilir veya telefonla bildirilebilir. Bir bilgisayar, prognozu veya taniyi e-posta veya telefon yoluyla, ya da internet üzerinden güvenli bir ag geçitli hasta giris hizmeti yoluyla bildirmek için kullanilabilir. Belirli yapilanmalara göre prognoz veya diyagnostik test sonuçlarini içeren mesaj üretilebilir ve telekomünikasyonda uzman kisiler tarafindan bilinecek olan bilgisayar donanimi ve yazilimi kombinasyonu kullanilarak bireye otomatik olarak ulastirilabilir. Burada tarif edilen testlerin, metotlarin ve sistemlerin belirli yapilanmalarina göre örneklerin test edilmesi, hastaliklarin tanilanmasi ve test sonuçlari veya tanilarinin bildirilmesi de dahil olmak üzere metot adimlarinin tamami veya bir kismi, çesitli (örnegin yabanci) yetki bölgelerinde gerçeklestirilebilir. Burada tarif edildigi üzere, kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riskini nitelendirmeye veya degerlendirmeye yönelik diyagnostik testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre testler, metotlar veya sistemler; bir kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirme riskinin belirlenmesi esasinda hasta tedavisinin yönetilmesini de içerir. Böylesi bir yönetim, bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirme riskinin belirlenmesinden sonra, hekimin veya klinisyenin atacagi adimlari ihtiva eder. Örnegin bir hekim, bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riski altinda bulunduguna dair bir tani koymasi halinde bunu belirli bir tedavi rejimi takip edebilir. Uygun bir tedavi rejimi, bunlarla sinirli olmaksizin, denetimli bir egzersiz programi; kan basinci, seker alimi ve / veya Iipit düzeylerinin kontrolü; ve ilaç tedavilerini içerebilir. Bazi yapilanmalara göre kronik böbrek hastaligi veya proteinüri sergileme riskinin bir tanisi, bir hastanin kronik bir böbrek hastaligindan mustarip olup olmadiginin veya hastanin ilgili bir hastaliktan mustarip olup olmadiginin belirlenmesi için yapilacak baska testler ile takip edilebilir. Ayrica eger ki tanisal test, majör advers olay durumuna yönelik riskler bakimindan bir sonuca ulasamaz ise, baska testler de istenebilir. Burada tarif edildigi üzere, kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riskini nitelemeye veya degerlendirmeye yönelik diyagnostik testlerin, metotlarin ve sistemlerin bazi yapilanmalarina göre eger ki bir hekim, bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan riskte olmadigini dair bir tani koyar ise, bu durumda bir tedavi uygulanmaz. Burada tarif edilen test ve ROBOZ deteksiyon metotlari, robotik ve bilgisayar yönlendirmeli sistemler kullanilarak otomatize edilebilir. Örnegin bir idrar, plazma, ya da kan örnegi gibi bir biyolojik örnek, örnegin bir robotik istasyon tarafindan, örnek girisinden sonuç çikisina kadar tamamiyla çalistirilan bir mikro akiskan alet gibi bir sisteme enjekte edilebilir. Dolayisiyla burada, bazi yönlerine göre, ekspresyon profilleri veya dizi bilgisi esasinda bir bireyin bir kronik böbrek hastaligi veya bir proteinüri geçiriyor olup olmadiginin veya bir kronik böbrek hastaligina veya proteinüriye yatkinligi olup olmadiginin belirlenmesine yönelik bir metodu gerçeklestirmek üzere sistemler (bilgisayar sistemlerinin bunu gerçeklestirmesi için bilgisayar tarafindan okunabilir bir ortam) saglanmaktadir. Bazi yönlerine göre burada, bir bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri hastaligi bulunup bulunmadiginin veya bunlar bakimindan artmis risk altinda olup olmadiginin degerlendirilmesine yönelik olarak, asagida sayilanlari içeren sistemler saglanmaktadir: (a) en az bir biyolojik örnegi alacagi ve önceden belirlenmis veya bir esik referans seviyesine göreli olarak bahsedilen biyolojik örnekteki bir ROBO2 düzeyini ölçmek veya ROBO2 ekspresyon oranini belirlemek üzere bahsedilen biyolojik örnek üzerinde en az bir analiz gerçeklestirecegi ve bahsedilen ölçüm düzeyini veya ekspresyon oranini çikacagi sekilde düzenlenen bir tayin modülü; (b) bahsedilen tayin modülünden gelen veri çikis bilgisini saklayacagi sekilde düzenlenen bir depolama aygiti; ve (o) depolama aygitindan gelen girdiyi alacagi ve depolama aygitinda saklanan veriyi en az bir referans esik ROBOZ düzeyi ile karsilastiracagi sekilde düzenlenen bir karsilastirma modülü, burada eger ki ölçülen ROBOZ protein düzeyi, referans esik düzeyi ile en azindan ayni veya daha yüksek olur ise karsilastirma modülü, biyolojik örnegin, referans esik biyo-belirteç düzeyinden sapan bir birey ile iliskili oldugu bilgisini bir çikis modülüne saglar; ve (d) bilgiyi kullaniciya göstermeye yönelik bir çikis modülü. Mevcut bulusun tüm yönlerine göre, ROBOZ proteininin düzeylerini belirlemeye yönelik metotlar, bir otomatik makine veya sistem kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bu tip makineler ve sistemler, örnegin bir raporun bir görünür ekran üzerinde gösterilmesi gibi bir rapor veya ROBOZ proteininin düzeylerini gösteren basilabilir bir rapor ve / veya ROBOZ proteinine yönelik bir referans esik seviyesine göre bir artis veya ayni olduguna dair bir rapor ve / veya örnegin elde edilmis oldugu bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riski altinda bulunduguna dair bir rapor üretir. Dolayisiyla burada tarif edilen bazi yapilanmalar, (i) ROBOZ proteini düzeylerini belirleme ve (ii) bir bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riskinde bulunup bulunmadigini gösterme veya raporlama adimlarini gerçeklestirmek üzere bir makine, bilgisayar sistemleri ve bilgisayar tarafindan okunabilir ortamlar da saglamaktadir. Bu yönlerin yapilanmalari, bilgisayar tarafindan okunabilir bir ortam üzerine kaydedilmis olan ve çalistirildiginda, bir bilgisayarin metot adimlarini gerçeklestirmesini saglayan, bilgisayar tarafindan yürütülebilir komutlar ile tanimlanan fonksiyonel modüller ile tarif edilir. Söz konusu modüller, anlasilirlik saglamak amaciyla fonksiyonlarina göre ayrilir. Ancak modüllerin, ayrik kod bloklarina karsilik gelmesi gerekmedigi ve tarif edilen fonksiyonlarin, çesitli ortamlarda saklanan ve çesitli zamanlarda çalistirilan çesitli kod kisimlarinin çalistirilmasi yoluyla gerçeklestirilebildigi anlasilmalidir. Dahasi modüllerin, baska fonksiyonlar gerçeklestirebildigi de takdir edilecektir, dolayisiyla modüller, herhangi özel bir fonksiyona veya fonksiyonlar kümesine sahip olmakla sinirli degildir. Bilgisayar tarafindan okunabilir ortam, bir bilgisayardan erisilebilen, maddi her ortam olabilir. Bilgisayartarafindan okunabilir ortamlar, örnegin bilgisayarda okunabilir komutlar, veri yapilari, program modülleri veya baska veriler gibi bilgilerin depolanmasi için herhangi bir metotta veya teknolojide uygulanan, uçucu ve uçucu olmayan, çikarilabilir ve çikarilabilir olmayan elle tutulabilir ortamlari içerir. Bilgisayar tarafindan okunabilir ortamlar, bunlarla sinirli olmamak üzere RAM (rastgele erisim bellegi), ROM (salt okunur bellek), EPROM (silinebilir programlanabilir salt okunur bellek), EEPROM (elektriksel olarak silinebilir, programlanabilir salt okunur bellek), flas bellek veya baska bir bellek teknolojisi, CD-ROM (kompakt disk salt okunur bellek), DVD'ler (dijital çok yönlü diskler) veya baska optik depolama ortamlari, manyetik kasetler, manyetik bant, manyetik disk deposu veya baska manyetik depolama ortamlari, diger tiplerde uçucu ve uçucu olmayan bellekler ve istenen bilgiyi saklamak için kullanilabilen ve yukarida bahsedilenleri içeren bir bilgisayar ile erisilebilen herhangi bir baska maddi ortami içerir. Bilgisayar tarafindan okunabilir bir veya daha fazla ortam üzerinde yapilandirilan, bilgisayar tarafindan okunabilen veriler, örnegin bir veya daha fazla programin bir parçasi olarak, bir bilgisayar tarafindan çalistirilmasinin bir sonucu olarak bilgisayari, burada (bir sistem veya bilgisayar tarafindan okunabilir bir ortam ile ilgili olarak) tarif edilen fonksiyonlarin bir veya daha fazlasini ve / veya bunlarin çesitli yapilanmalarini, varyasyonlarini ve kombinasyonlarini icra etmesini saglayan komutlar tanimlayabilir. Bu tip komutlar, örnegin Java, J#, Visual Basic, C, C#, C++, Fortran, Pascal, Eiffel, Basic, COBOL assembly dili ve benzerleri, ya da bunlarin çesitli kombinasyonlarinin herhangi biri gibi çok sayidaki programlama dillerinin herhangi birinde yazilabilir. Bahsedilen komutlarin üzerinde yapilandirildigi, bilgisayar tarafindan okunabilir ortam, burada tarif edilen sistemin bir veya daha fazla bileseni veya bilgisayar tarafindan okunabilir ortamin üzerinde tutulabilir, bu tip bir veya daha fazla bilesen arasinda dagitilabilir ve bunlarin arasinda geçis yapabilir. Bilgisayar tarafindan okunabilir ortam, üzerinde depolanan komutlarin, mevcut bulusun burada ele alinan yönlerini uygulamak üzere herhangi bir bilgisayar kaynagina yüklenebilecegi sekilde tasinabilir. Dahasi, yukarida tarif edildigi üzere bilgisayar tarafindan okunabilir ortam üzerinde saklanan komutlarin, ya da bilgisayar tarafindan okunabilir ortamin, bir ana bilgisayar üzerinde çalisan bir uygulama programinin bir parçasi olarak yapilandirilan komutlar ile sinirli olmadigi takdir edilmelidir. Dahasi bu komutlar, mevcut bulusun yönlerini uygulamak üzere bir bilgisayari programlamak üzere kullanilabilen herhangi tipteki bir bilgisayar kodu (örnegin yazilim veya mikro kod) olarak da yapilandirilabilir. Bilgisayar tarafindan yürütülebilen komutlar, uygun olan bir bilgisayar dilinde veya birkaç dilin bir kombinasyonu halinde yazilabilir. Bilgisayar tabanli temel biyoloji metotlari ilgili teknikte uzman kisiler tarafindan bilinir, bkz. örnegin Setubal ve Meidanis ve ark., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg, Searles, Kasif, (Ed), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi ve Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, Londra, 2000) ve Ouelette and Bzevanis Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2. Baski, 2001). Burada tarif edilen yönlerin belirli yapilanmalari kapsamindaki fonksiyonel modüller bir tayin modülü, bir depolama aygiti, bir karsilastirma modülü ve bir ekran modülü içerir. Fonksiyon modülleri bir, ya da çoklu bilgisayarlarda, ya da bir, ya da çoklu bilgisayar aglari veya bilgisayar sistemleri kullanilarak yürütülebilir. Bazi yönlerine göre burada, bir bireyin bir kronik böbrek hastaligi veya proteinürisi olup olmadigini veya bu bakimdan riskte bulunup bulunmadigini belirlemek için kullanilabilen bilgisayar sistemleri saglanmaktadir. Bazi yapilanmalara göre bir bilgisayar sistemi, bir tayin modülüne baglanir ve bir biyolojik örnek ile ilgili olarak bir tayin modülünden çikis verileri elde edecegi sekilde düzenlenir, burada bahsedilen tayin modülü, bireyden alinan bir biyolojik örnekteki ROBOZ protein düzeylerini saptayacagi sekilde düzenlenir; ve burada bilgisayar sistemi, (a) tayin modülünden gelen veri çikisini ve ayrica referans verilerini depolayacak sekilde düzenlenen bir depolama aygiti ve bu depolama aygitinin bagli oldugu (b) ve bazi yapilanmalara göre, depolama aygitinda saklanan çikis verilerini, sakli tutulan referans verileri ile karsilastiracagi sekilde düzenlenen ve alternatif yapilanmalara göre, çikis verilerini kendi ile karsilastirilacagi sekilde düzenlenen ve rapor verileri üreten bir karsilastirma modülü ve bu karsilastirma modülünün bagli oldugu (o) ve erisilen bir sayfayi (yani karsilastirma modülünden gelen rapor verilerini) bir istemci bilgisayar üzerinde kullaniciya göstermeye yönelik bir ekran modülü içerir ve bahsedilen içerik ise, ROBOZ düzeylerini ve / veya bireyin gelecekte kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirme olasiligini gösterir. Bazi yapilanmalara göre tayin modülü; ekspresyon verileri, dizi bilgileri, diziler ile ilgili bilgileri bilgisayar tarafindan okunabilir bir formda saglamak üzere bilgisayar tarafindan yürütülebilen komutlara sahiptir. Burada kullanildigi haliyle "dizi bilgisi", bunlarla sinirli olmamak üzere tam uzunluklu nükleotit ve / veya amino asit dizileri, kismi nükleotit ve / veya amino asit dizileri, ya da mutasyon geçirmis diziler gibi herhangi bir nükleotit ve I veya amino asit dizisini ifade eder. Dahasi dizi bilgisi "ile ilgili" bilgiler, bir dizinin varliginin veya yoklugunun saptanmasini (örnegin bir mutasyon veya delesyonun saptanmasini), örnek içerisindeki bir dizinin konsantrasyonunun belirlenmesini (örnegin amino asit dizisi ekspresyon seviyeleri, ya da nükleotit (RNA veya DNA) ekspresyon seviyeleri) ve benzerlerini içerir. "Dizi bilgisi" terimi ile, post-translasyonel modifikasyonlarin (örnegin fosforilasyon, glikozilasyon, summilasyon, farnesilasyon ve benzeri) varligi veya yoklugu ifade edilir. Bir örnek olarak, ROBOZ dizisini veya nükleik asit ekspresyon bilgisini belirlemeye yönelik tayin modülleri, otomatik dizi analizine yönelik olarak, bunlarla sinirli olmamak üzere asagida sayilan, bilinen sistemleri içerebilir: Hitachi FMBIO® ve Hitachi FMBIO® Il flüoresans tarayicilari (tedarikçi Hitachi Genetic Systems, Alameda, California); SPECTRUMEDIX® SCE 9610 tam otomatik 96-kapilerli elektroforez genetik analiz sistemleri (tedarikçi SpectruMedix LLC, State College, Pennsylvania); ABI PRISM® 377 DNA sekanslayici, ABI® 373 DNA sekanslayici, ABl PRlSM® 310 genetik analizör, ABI PRISM® 3100 genetik analizör ve ABI PRISM® ; Molecular Dynamics FLUORIMAGERT'VI 575, Sl flüoresans tarayicilari ve Molecular Dynamics FLUORIMAGERTM 595 flüoresans tarayicilari (tedarikçi Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, Ingiltere); GENOMYXSCTM DNA sekanslayici sistem (tedarikçi Genomyx Corporation (Foster City, California); ve PHARMACIA ALFTM DNA sekanslayici ve Pharmacia ALFEXPRESST'V' (tedarikçi Amersham Biosciences UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, Ingiltere). Dizisi veya protein bilgisini belirlemeye yönelik bazi yapilanmalara göre tayin modülleri, protein ve DNA analizine yönelik sistemler içerir. Ornegin kütle spektrometri sistemleri, mesela Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight (MALDI-TOF) sistemleri; SELDI-TOF-MS ProteinChip dizi profili belirleme sistemleri, örnegin CIPHERGEN PROTEIN BIOLOGY SYSTEM llTM yazilimi bulunan sistemler; gen ekspresyon verilerini analiz sistemleri (bkz. sistemleri ve kartuslu array sistemleri, tedarikçi Affymetrix (Santa Clara, CA 95051) AutoLoader, COMPLETE GENECHIP® lnstrument System, Fluidics Station 450, Hybridization Genotyping System, Scanner 3000 7G Whole-Genome Association System, GENETITANTM veya D82®, Dynax, Chantilly, VA veya ENEASYSTEM lll®, TRITURUS®, THE MAGO® Plus); dansitometreler (örnegin X-Rite-; otomatik flüoresansli in situ hibridizasyon sistemleri (bkz. örnegin US Patenti 6,136,540); 2-D görüntüleme yazilimi ile bagli 2D jel görüntüleme sistemleri; mikro plak okuyucular; flüoresans ile aktiflesen hücre siniflandiricilari (FACS) (örnegin Flow Cytometer FACSVantage SE, Becton Dickinson); radyo izotop analizörleri (mesela sintilasyon sayaçlari), ya da bunlarin bir kombinasyonu. Mevcut bulusun bu yönünün ve diger tüm yönlerinin bazi yapilanmalarina göre, biyo-belirteç protein düzeyi bilgisini depolama aygiti üzerinde saklamak üzere çesitli yazilim programlari ve formatlari kullanilabilir. Üzerinde dizi bilgisi veya ekspresyon seviyesi bilgileri kaydedilmis olan bir ortami elde etmek veya olusturmak üzere, istenen sayida veri islemci yapilandirma formatlari (örnegin metin dosyasi veya veri tabani) kullanilabilir. ROBOZ ekspresyon bilgisi veya tayin modülünde belirlenen ROBOZ ekspresyon bilgisi ile ilgili bilgiler, depolama aygiti tarafindan okunabilir. Burada kullanildigi haliyle "depolama aygiti'i teriminin, veri veya bilginin depolanmasi için düzenlenen veya uyarlanan uygun her bilgisayar veya veri isleme aparati veya baska aletleri içermesi amaçlanmaktadir. Mevcut bulus ile kullanilmaya uygun elektronik aparatlarin örnekleri arasinda bagimsiz bilgisayar aparatlari, veri iletisim aglari, örnegin yerel alan aglari (LAN), genis alan aglari (WAN), bulut depolama sistemleri, internet, intranet ve ekstranet ve lokal ve daginik bilgisayar isleme sistemleri bulunur. Depolama aygitlari, bunlar ile sinirli olmamak üzere ayrica manyetik depolama ortami, örnegin disketler, sabit disk depolama ortamlari, manyetik bant, CD-ROM, DVD gibi optik depolama ortamlari, RAM, ROM, EPROM, EEPROM ve benzerleri gibi elektronik depolama ortamlari, bulut depolama sistemleri, genel sabit diskler ve bu kategorilerin, mesela manyetik / optik depolama ortamlari gibi hibritlerini de içerir. Depolama aygiti, üzerinde dizi bilgisine veya ekspresyon seviyesi bilgilerine sahip olacagi sekilde uyarlanir veya düzenlenir. Bu tip bilgiler, örnegin internet üzerinden, bulut sistemi üzerinden, disket üzerinde, USB (üniversal seri veri yolu) üzerinden, ya da uygun baska iletisim sekilleri üzerinden elektronik olarak gönderilebilen ve okunabilen dijital formda saglanabilir. Burada kullanildigi haliyle "ekspresyon seviyesi bilgisi", bunlarla sinirli olmamak üzere tam uzunluklu nükleotit ve / veya amino asit dizileri, kismi nükleotit ve / veya amino asit dizileri, ya da mutasyon geçirmis diziler gibi herhangi bir nükleotit ve I veya amino asit ekspresyon seviyesi bilgisi anlamina gelir. Dahasi ekspresyon seviyesi bilgisi "ile ilgili" bilgi; bir dizinin varliginin veya yoklugunun (örnegin bir amino asit dizisinin, nükleotit dizisinin, ya da post translasyonel modifikasyonun varligi veya yoklugunun) saptanmasini, örnekteki bir diziye ait konsantrasyonun (örnegin amino asit dizisi seviyeleri, ya da nükleotit (RNA veya DNA) ekspresyon seviyeleri, ya da post-translasyonel modifikasyon seviyesinin) belirlenmesini ve benzerlerini içerir. Burada kullanildigi haliyle "sakli I kayitli" terimi, bilginin depolama aygiti üzerinde kodlanmasina yönelik bir islemi ifade eder. Ilgili teknikte uzman kisiler, dizi bilgilerini veya ekspresyon seviyesi bilgisini içeren ürünler üretmek üzere, bilginin bilinen ortamlar üzerinde kaydedilmesine yönelik halihazirda bilinen metotlari kolaylikla anlayabilir. Dizi bilgilerini veya ekspresyon seviyesi bilgilerini depolama aygiti üzerinde saklamak üzere çesitli yazilim programlari ve formatlari kullanilabilir. Üzerinde dizi bilgileri veya ekspresyon seviyesi bilgileri kaydedilmis olan bir ortami elde etmek veya olusturmak üzere, istenen sayida veri islemci yapilandirma formatlari (örnegin metin dosyasi veya veri tabani) kullanilabilir. Dizi bilgileri veya ekspresyon seviyesi bilgileri, bilgisayar tarafindan okunabilir bir formda saglanarak, spesifik bir diziyi veya ekspresyon profilini depolama aygiti içerisindeki referans verileri ile karsilastirmak üzere, dizi bilgileri veya ekspresyon seviyesi bilgileri karsilastirma modülünde okunabilir bir formda kullanilabilir. Ornegin, belirli bir diziyle (referans verileri, örnegin bir kontrol örneginden elde edilen dizi bilgileri) eslesen dizilerin fragmanlarini veya bölgelerini belirlemek üzere arama programlari kullanilabilir veya belirlenen ekspresyon seviyesi direkt olarak referans verileri ekspresyon seviyesi (örnegin bir kontrol örneginden elde edilen ekspresyon seviyesi bilgileri) ile karsilastirilabilir. Bilgisayar tarafindan okunabilirformda yapilan karsilastirma, çesitli yollarla islenebilen, bilgisayar tarafindan okunabilir bir karsilastirma sonucu saglar. Karsilastirma sonucuna göre içerige, örnegin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri gibi spesifik bir hastaligi veya bozuklugu göstermek üzere karsilastirma modülünden erisilebilir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma modülü tarafindan okunacak olan ve depolama aygitinda saklanan referans verileri, test edilecek olan biyolojik örnekle ayni tipteki bir kontrol biyolojik örneginden elde edilen ROBOZ dizisi veya ekspresyon bilgisi verileri olmaktadir. Alternatif olarak referans verileri, bir veri tabani, mesela bir organizmanin tüm genom dizisinin bir kismi, ya da dizilerin bir protein ailesi, ya da bir ekspresyon seviyesi profili (RNA, protein veya peptit) olmaktadir. Bazi yapilanmalara göre referans verileri, örnek olmasi bakimindan kronik böbrek hastaligi veya proteinüri gibi spesifik bir hastaliga veya bozukluga isaret eden dizi bilgileri veya ekspresyon seviyesi profilleri olmaktadir. Bazi yapilanmalara göre referans verileri, bunlarla sinirli olmamak üzere GenBank (NCBI) protein ve DNA veri tabanlari, örnegin genom, EST, SNPS, Traces, Celara, Ventor Reads, Watson reads, HGTS ve benzeri veritabanlari; Isviçre Biyoinformatik Enstitüsü veri tabanlari, örnegin ENZYME, PROSITE, SWISS-ZDPAGE, Swiss-Prot ve TrEMBL veri tabanlari; Melanie yazilim paketi veya EXPASy WWW sunucusu ve benzerleri; SWISS-MODEL, Swiss-Shop ve diger ag tabanli hesaplama gereçleri; Kapsamli Mikrobiyal Kaynak veri tabani (Genomik Arastirma Enstitüsü tarafindan erisime açilir) üzerinde elektronik veya dijital olarak kaydedilebilir ve tutulabilir. Meydana gelen bilgiler, genomlarin içinde ve arasinda bulunan referans verileri veya genler veya proteinler arasindaki homolojileri belirlemek üzere kullanilabilen bir iliskisel veri tabaninda saklanabilir. ROBOZ düzeyleri, karsilastirma modülünde okunabilir bir formda saglayarak, depolama aygitindaki ROBOZ referans esik düzeyleri ile karsilastirmak üzere kullanilabilir. Bilgisayar tarafindan okunabilir formda yapilan karsilastirma, çesitli yollarla islenebilen, bilgisayar tarafindan okunabilir içerikler saglar. verilerini, referans ROBOZ dizisi veya ekspresyon seviyesi verileri ile karsilastirmak üzere karsilastirma fonksiyonu için çesitli mevcut yazilim programlari ve formatlari kullanabilir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma modülü, bir veya daha fazla kayda ait ROBOZ dizisini veya ekspresyon seviyesi verilerini bir veya daha fazla referans veri modeli ile karsilastirmak üzere model tanima tekniklerini kullanacagi sekilde düzenlenir. Karsilastirma modülü, modelleri karsilastirmak üzere piyasadan temin edilebilen veya ücretsiz olarak saglanabilen mevcut yazilimlar kullanilarak konfigüre edilebilir ve yürütülen özel veri karsilastirmalari için optimize edilebilir. Karsilastirma modülü, dizi bilgisi ile ilgili olarak, bilgisayar tarafindan okunabilir bilgileri saglar ve bunlar, örnegin bir dizinin varliginin veya yoklugunun saptanmasi (örnegin bir mutasyon veya delesyonun (protein veya DNA) saptanmasi, farkli alleller ile ilgili bilgiler, post-translasyonel modifikasyonun saptanmasi, ya da dizilerin ihmali veya tekrari); örnekteki bir diziye ait konsantrasyonun belirlenmesi (örnegin amino asit dizisi / protein ekspresyon seviyeleri, ya da nükleotit (RNA veya DNA) ekspresyon seviyeleri, ya da post-translasyonel modifikasyon seviyeleri belirlenmesi), ya da bir ekspresyon profilinin belirlenmesini içerebilir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma modülü, tayin modülüne ait çikis verilerinden ROBOZ düzeylerinin, her bir ROBOZ için referans esik düzeyi verileri ile karsilastirilmasina imkan verir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma modülü, kütle-spektrometri Spektrumlari ile karsilastirmalar gerçeklestirir, mesela peptit fragman dizisi bilgilerinin karsilastirilmasi, içerisinde islenmis olan spektrumlar kullanilarak gerçeklestirilebilir. islemden geçirilen spektrumlar daha sonra bazala göre düzeltilmis veriler alinarak minimum entropi algoritmasi ile örnek verileri kontrol verileri ile hizalayan hizalama algoritmalari kullanilarak hizalanabilir baskaca islenebilir. Protein ekspresyon profilleri ayirt edilebilir. Bunlarla sinirli olmamak üzere, Ciphergen Express (CE) ve Biomarker Patterns Software (BPS) paketi, Ciphergen Biosystems, Inc., CA, ABD de dahil olmak üzere mevcut olan karsilastirma yazilimlari kullanilabilir. Karsilastirma analizi, protein çip sistemi yazilimi ile yapilabilir (örnegin Bio-Rad Iaboratuvarlarina yönelik The Proteinchip paketi). Burada tarif edilen karsilastirma modülü, ya da diger modüller, üzerinde bir iliskisel veri tabani yönetim sistemi, bir World Wide Web uygulamasi ve bir World Wide Web sunucusu çalisan bir isletim sistemi (örnegin UNIX) bulunabilir. World Wide Web uygulamasi, veri tabani dil deyimlerinin (örnegin Structured Query Language (SQL) deyimleri) üretilmesi için gerekli olan yürütülebilir kodu içerir. Genel itibariyla yürütülebilir dosyalar, gömülü SQL deyimleri içerecektir. Dahasi World Wide Web uygulamasi, sunucuyu ve ayrica ve servis kullanici isteklerine erisilmesi gereken çesitli harici ve dahili veri tabanlarini içeren çesitli yazilim birimlerine isaretçi ve adresler içeren bir konfigürasyon dosyasi ihtiva edebilir. Konfigürasyon dosyasi, sunucunun iki veya daha fazla ayri bilgisayara dagitilmasi durumunda sunucu kaynaklarina yönelik istekleri de uygun donanima yönlendirir. Bazi yapilanmalara göre, World Wide Web sunucusu bir TCP / IP protokolünü desteklemektedir. Bunun gibi yerel aglara kimi zaman "intranet" denilir. Bu tür intranetlerin bir avantaji, bunlarin World Wide Web üzerinde bulunan kamusal alan veri tabanlari (örnegin GenBank veya Swiss Pro World Wide Web sitesi) ile kolay iletisime izin vermesidir. Dolayisiyla tercih edilen bazi yapilanmalara göre kullanicilar, Web tarayicilari ve Web sunuculari tarafindan saglanan bir HTML arayüzü kullanarak, internet veri tabanlarinda bulunan verilere (örnegin Hypertext baglantilari üzerinden) direkt olarak erisebilir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma modülü, gen ekspresyon profillerini karsilastirmaktadir. Ornegin gen ekspresyon profillerinin saptanmasi, bir genin veya genlerin göreli bollugunu, prob setlerinden gelen sinyalin yeginligi esasinda analiz etmek üzere Affymetrix Microarray Suite yazilimi versiyon belirlenebilir ve MAS 5.0 veri dosyalari bir veri tabanina aktarilabilir ve Microsoft Excel ve GeneSpring 6.0 yazilimi (Agilent Technologies, Santa Ciara, California) ile analiz edilebilir. MAS 5.0 yaziliminin deteksiyon algoritmasi, belirli örneklerde adet kaç transkript saptandigi hakkinda kapsamli bir genel bakis elde etmek üzere kullanilabilir ve 2 veya daha fazla mikro dizi veri kümesinin karsilastirmali bir analizine imkan verir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma modülü, protein ekspresyon profillerini karsilastirmaktadir. Bunlarla sinirli olmamak üzere Ciphergen Express (CE) ve Biomarker Patterns Software (BPS) paketi (Ciphergen Biosystems, Inc., Freemont, California) da dahil olmak üzere mevcut olan karsilastirma yazilimlari kullanilabilir. Karsilastirma analizi, protein çip sistemi yazilimi ile gerçeklestirilebilir (örnegin The Proteinchip Suite (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). Ekspresyon profillerini belirlemeye yönelik algoritmalar, örnegin ortalama varyans algoritmasi (örnegin JMP Genomics algoritmasi, JMP Software Cary, North Carolina) gibi optimizasyon algoritmalarinin kullanimina yer verebilir. Karsilastirma modülü, önceden tanimlanmis kriterler veya bir kullanici tarafindan tanimlanan kriterler ile bilgisayar tarafindan okunabilir formda islenebilen, bilgisayar tarafindan okunabilir karsilastirma sonucunu saglar ve böylece bir kullanici tarafindan bir ekran modülü kullanilarak istenebildigi üzere, saklanabilen ve çikilabilen karsilastirma sonucunun bir kismina dayali bir içerik saglanir. Ekran modülü, karsilastirma sonucuna kismen dayanan bir içerigin kullaniciya gösterilmesine imkan verir ve bu çerçevede bahsedilen içerik, bir kronik böbrek hastaligina veya proteinüriye isaret eden bir sinyal olmaktadir. Bu tip sinyaller, örnegin bir kronik böbrek hastaligi veya proteinüri varligina veya yokluguna isaret eden bir içerigin bir bilgisayar ekraninda gösterilmesi, bir kronik böbrek hastaligi veya proteinüri varligina veya yokluguna isaret eden bir basili sayfanin bir yazicidan basilmasi, ya da bir kronik böbrek hastaligi veya proteinüri varligina veya yokluguna isaret eden bir isik veya ses olabilir. Karsilastirma sonucuna dayali içerik, bir veya daha fazla proteinin bir ekspresyon profilini veya bir veya daha fazla genin bir ekspresyon profilini ihtiva edebilir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma sonucuna dayali içerik, sadece ROBOZ protein düzeyleri esasinda bir kronik böbrek hastaligi veya proteinüri varligina veya yokluguna isaret eden bir sinyal olmaktadir. Bazi yapilanmalara göre karsilastirma sonucuna dayali içerik, bir bilgisayar monitöründe gösterilmektedir. Mevcut bulusun bir yapilanmasina göre karsilastirma sonucuna dayali içerik, basilabilir ortamlar ile gösterilmektedir. Mevcut bulusun bir yapilanmasina göre karsilastirma sonucuna dayali içerik, bir gösterge isigi veya sesi olarak gösterilmektedir. Görüntü modülü, bilgisayar tarafindan okunabilir bir bilgiyi, bir bilgisayardan alacagi ve bir kullaniciya gösterecegi sekilde düzenlenen uygun her alet olabilir. Bunlarin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda, mesela Intel PENTIUM tipi islemciye dayali genel amaçli bilgisayarlar, Apple bilgisayar ve tablet cihazlari, Motorola PowerPC, Sun UItraSPARC, Hewlett-Packard PA-RISC islemcileri, California, Sunnyvale Advanced Micro Devices (AMD) firmasindan temin edilebilen çesitli islemcilerin herhangi biri, ya da herhangi tipten bir islemci, görsel ekran aygitlari, örnegin tablet cihazlari, akilli telefon mobil cihazlari, yassi panel ekranlari, katot isinli tüpler ve benzerleri ve ayrica çesitli tipteki bilgisayar yazici türleri bulunur. Bazi yapilanmalara göre bir World Wide Web tarayicisi, karsilastirma sonucuna dayali içerigin görüntülenmesi için bir kullanici arayüzü saglamak amaciyla kullanilir. Mevcut bulusun diger modüllerinin, bir web tarayici arayüzüne sahip olacaklari sekilde uyarlanabildigi anlasilmalidir. Web tarayicisi üzerinden bir kullanici, karsilastirma modülünden veri almak için istekte bulunabilir. Dolayisiyla kullanici, grafiksel kullanici arayüzlerinde tipik olarak kullanilan dügmeler, asagi açilir menüler, kaydirma çubuklari ve benzerleri gibi kullanici arayüzü unsurlarini tipik olarak seçecek ve üzerilerine tiklayacaktir. Kullanicinin Web tarayicisi ile bu sekilde formüle ettigi istekler, örnegin mutasyonun veya delesyonun (DNA veya protein) varligi veya yokluguna isaret eden bir göstergenin gösterilmesi, bir amino asit dizisinin (protein) ekspresyon düzeylerinin gösterilmesi; nükleotit (RNA veya DNA) ekspresyon seviyelerinin gösterilmesi; ekspresyon, SNP, ya da mutasyon profillerinin, ya da haplotiplerin gösterilmesi, ya da bunlara dayali bilgilerin gösterilmesi gibi, dizi bilgisi ile ilgili gerekli bilgilerin alinmasi için kullanilabilen bir sorguyu üretmek üzere bunlari formatlayan bir Web uygulamasina aktarilir. Bir yapilanmaya göre referans örnegi verilerinin dizi bilgisi de gösterilir. Bazi yapilanmalara göre ekran modülü, karsilastirma sonucunu ve karsilastirma sonucunun bir hastaligin göstergesi olup olmadigini, mesela ROBO2'nin ekspresyon profilinin, kronik böbrek hastaligi veya proteinürinin göstergesi olup olmadigini gösterir. Bazi yapilanmalara göre gösterilen ve karsilastirma sonucuna dayanan içerik, bir kronik böbrek hastaligi veya proteinüri varligi veya yokluguna isaret eden bir sinyal (örnegin pozitif veya negatif sinyal) olur ve dolayisiyla sadece pozitif veya negatif bir isaret gösterilebilir. Dolayisiyla burada, ekspresyon profilleri veya dizi bilgileri esasinda bir bireyin bir kronik böbrek hastaligi veya proteinüri geçirmekte olup olmadigini veya bir kronik böbrek hastaligina veya proteinüriye yatkinligi bulunup bulunmadigini belirlemeye yönelik testleri ve metotlari gerçeklestirmeye yönelik sistemler (ve bilgisayar sistemlerinin bunu saglamasina yönelik bilgisayarda okunabilir ortamlar) saglanmaktadir. Söz konusu sistemler ve bilgisayar tarafindan okunabilir ortamlar, ekspresyon profilleri veya dizi bilgileri esasinda bir bireyin spesifik bir hastaligi veya bozuklugu geçirmekte olup olmadigini veya spesifik bir hastaliga veya bozukluga yatkinligi bulunup bulunmadigini belirlemeye yönelik testleri ve metotlari gerçeklestirmenin sadece aydinlatici yapilanmalari olmaktadir ve mevcut bulusun kapsamini sinirlandirmalari amaçlanmamaktadir. Sistemlerin ve bilgisayar tarafindan okunabilir ortamin varyasyonlari mümkündür ve mevcut bulusun kapsamina girmeleri amaçlanmaktadir. Sisteme ait olan veya bilgisayar tarafindan okunabilir ortamda kullanilan modüller, çesitli konfigürasyonlara sahip olabilir. Örnegin fonksiyon, tek bir makine üzerinde saglanabilir veya çoklu makinelere dagitilabilir. Rob02, Fare Podositinin Bazal Hücre Yüzeyine Lokalize bir Podosit Proteinidir Böbrek gelisimi esnasinda Rob02 mRNA'si, primordial podositlerin Iokasyonu olarak, dallanan üreterik tomurcuklari çevreleyen metanefrik mezensimde ve daha sonralari, S seklindeki gövdenin proksimal ucunda ifade edilir (Piper ve ark., 2000). R0b02`nin, erken böbrek indüksiyonundaki rolüne ilave olarak, podosit olgunlasmasinda da rol oynayip oynamadigini arastirmak üzere in situ hibridizasyon gerçeklestirdik ve Rob02 mRNA'nin, embriyonik gün 16.5'te (E165) fare embriyonlarinin gelisen glomerüllerinin kapiler döngü evresinde ifade edildigini bulduk (Sekiller 5A ve 5B). R0bo2 proteini, E14.5 civarinda gelisen glomerülde immün flüoresans boyamasi ile saptanabilir hale geldi ve E16.5'te pik ekspresyonuna ulasti (Sekiller 5C-5E). Ekspresyon, gelisimi esnasinda E17.5 sonrasinda azalmasina ragmen (Sekil 5F) spesifik R0b02 ekspresyonu, glomerüller içerisinde dogumdan sonra korundu ve eriskin farelerde 5 haftalik olduklarinda saptanabildi (Sekiller SG, 5H, 5L-5M). Gelismekte olan glomerülde R0b02'nin hücresel lokalizasyonunu belirlemek üzere, glomerüler hücre tipi spesifik belirteçler ile ikili isaretli immünhistokimya çalismasi gerçeklestirdik. R0bo2 proteininin; iki adet podosit slit-diyaframla birlesik proteinler olarak nefrin (Sekiller 1A-1 C) ve podosin (Sekiller 1D-1 F) ile birlikte lokalize oldugunu bulduk. R0bo2, glomerüllerde nefrin ile etkilesime giren adaptör protein ch ile (Sekiller 1G, 1l) ve podosit çekirdeklerinin bir bileseni olan WT1 ile (Sekiller 5H-5K) birlikte de ifade edildi. Bir bazal membran belirteci olarak nidojen (Sekiller 1J-1L ve 1P) ve bir endotel hücre belirteci olarak Pecam1 (Sekiller 1M-10, 5M) karsisinda etkili antikorlar ile yapilan ikili isaretleme, R0b02'nin glomerüler bazal membranin dis yüzeyine bitisik olarak lokalize oldugunu ve endotel hücrelerden temiz oldugunu gösterdi. Yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi, ayrica hücre alti R0b02'nin, podositlerin bazal yüzeyi üzerinde en bol oldugunu gösterdi (Sekil 1Q). Sitoplazmik domene karsi etkili bir antikor ile, postnatal fare böbreklerinin immünogold elektron mikroskopi çalismasi, R0b02'nin slit diyaframlarin sitoplazmik yüzüne yakin podosit ayaksi çikintilara lokalize oldugunu ortaya koydu (Sekil 1R). Bu sonuçlar, R0b02'nin bir podosit proteini oldugunu ve ayaksi çikintilardaki bazal alt hücresel lokalizasyonunun, podosit ayaksi çikinti yapisinin düzenlenmesinde bir rol oynadigini gösterir. Rob02 Intraselülar Domeni, Adaptör Protein ch 'nin SH3 Domenleri ile Direkt Etki/esime Nefrin ekstraselüler domen birlesmesi, kendi intraselüler domeninin Src kinazlar tarafindan tirozin fosforilasyonuna ve adaptör protein ch'nin SH2 domeninin rekrutmanina yol açar, ki bu ise aktin polimerizasyonuna sebep olur (Jones ve ark., 2006; Verma ve ark., 2006). ch, C-terminusunda bir adet SH2 domeni ve N-terminusuna yakin olarak üç adet SH3 domeni tasir. Aktin polimerizasyonuna, ch'nin SH3 domenleri aracilik eder (Rivera ve ark., 2004) ve bu durum, N-WASP ve Pak da dahil olmak üzere çesitli sitoskeleton regülatörlerini toplar (Jones ve ark., 2006). Onceki çalismalar, Drosophila ch homologu Dreadlock (Dock) SH3 domenlerinin, aktin polimerizasyonunu inhibe etmek üzere Robo'nun intraselüler domeni ile de direkt olarak etkilesime girdigini göstermistir (Fan ve ark., 2003; Yang ve Bashaw, 2006). Memeli kökenli ch'nin, F-aktin hücre iskeletini regüle etmek üzere podositte Rob02 ile direkt olarak etkilesip girip girmedigini de test ettik. Bu soruyu cevaplandirmak için, Rob02'nin ch ile etkilesime girip girmedigini incelemek üzere bir maya iki-hibritli test kullandik. Iki adet memeli kökenli ch (yani chl, ch2), benzer yapiyi paylastigindan ve böbrek gelisimlerinde islev gösterdiginden (Jones ve ark., 2006), bu çalismada chl kullandik ve Rob02'nin intraselüler domenin chI ile direkt olarak etkilesime girdigini gözlemledik (Sekiller 2A-2C). Rock2'de chl için baglayici pozisyon haritalama çalismasi, 4 prolin zengini motif içeren, 1085 ila 1301. amino asit dizisinin, etkilesim bakimindan hayati öneme sahip oldugunu gösterdi (Sekiller 2A ve 2C). Prolin zengini bu bölgenin yoklugu, chI ile etkilesimini önledi (Sekil 2A). chl'de Rob02 için baglayici pozisyon haritalama çalismasi, ilk iki SH3 domeninin, Rob02 ile etkilesimi için gerekli oldugunu gösterdi, çünkü bu ikisinden biri veya ikisinin silinmesi, etkilesimi ortadan kaldirdi (Sekil ZB). Buna göre Rob02 ve chI etkilesimine, iyi sekilde karakterize edilen iki protein domeni olarak SH3 domenleri ve prolin zengini motifler aracilik etti (Sekil 20). Bir baska podosit adaptör proteini olan CD2AP de kendi N-terminusunda üç adet SH3 domenine sahiptir (Shih ve ark., 2001), ancak maya çift hibrit veya ko-presipitasyon testlerinde CD2AP ve Rob02 arasinda herhangi bir etkilesim saptamadik. Bu gözlemler, Rob02 ve chl arasinda podositteki baglanmanin spesifik bir etkilesim oldugunu gösterir. Tam Uzunluklu Rob02, Nefrin ile ch üzerinden bir Kompleks Olusturur Rob02 ve ch arasindaki etkilesimi, puIl-down ve ko-presipitasyon testleri ile dogruladik. chl baglayici domeni silinmis olan, his- ve myo-isaretli insan kökenli Rob02 (His-myc-R0b02- ANBD) ve His- ve myo-isaretli insan kökenli tam uzunluklu Rob02 (His-myc-Rob02), HEK hücrelerinde ifade edildi. Transfekte HEK hücreleri, Rob02'yi aktive etmek ve ch baglanmasini artirmak üzere (Fan ve ark., 2003) Slit2 ile sartlandirilan ortam (Slit2 ile stabil sekilde transfekte edilen hücrelerden hazirlanir) ile uyarildi. ch, His-mycR0b02 ile HEK hücre ANBD ile gerçeklesmedi (Sekil 2B). ch'nin nefrin ile ch üzerinden bir kompleks olusturup olusturmadigini bir ko-presipitasyon testi kullanarak inceledik. Prensibi ispatlamak amaciyla nefron fosforilasyonunu artirmak üzere, Rob02 ve nefrini Fyn ile HEK hücrelerinde birlikte ifade ettik (Verma ve ark., 2006). Fyn ifade edildiginde, His-myc-Rob02'nin Ni-NTA kürecikleri ile HEK hücre Iizatlarindan puII-down edilmesi, ch ve nefrini birlikte çökeltti (Sekil 2E). Tersi siralamada, His-myc-nefrinin puII down edilmesi, Fyn kinazi ifade edildiginde, ch ve Robo2'yi ile birlikte çökeltti (Sekil 2F). Dahasi anti-ch antikoru ile hazirlanan çökeltiler, Fyn asiri sekilde ifade edildiginde hem Rob02 hem de nefrin içerdi (Sekil 6A). Bu veriler, nefrin, ch ve Rob02'nin bir in vitro kompleks olusturdugunu gösterir. Bu bulgulari in vivo olarak dogrulamak üzere, yeni dogan fare böbrek bulduk (Sekil 2G). Bunun aksine, anti-nefrin antikoru ile hazirlanan çokeltiler de ch ve Rob02 içerdi (Sekil 2H). Nefrin, podositlerde benzersiz olarak ifade edildiginden ve ch ve Rob02 de böbrekte bu hücrelerde lokalize oldugundan bu sonuçlar, nefrin, ch ve Rob02'nin podositlerde bir kompleks olusturabildigini gösterir. Slit2'nin, RoboZ-ch-nefrin protein kompleksinin olusumundaki rolünü belirlemek üzere His- myc-Rob02, nefrin ve Fyn, Slit2 ile sartlandirilan ortam veya Slit2 olmaksizin sartlandirilan ortam ile ko-presipitasyondan önce uyarilan HEK hücrelerinde birlikte ifade edildi (Sekil 2l). Slit2 stimülasyonunun, Rob02'nin ch'ye baglanmasini ve nefrin ile kompleks olusumunu artirdigini gözlemledik. Slit2 stimülasyonundan sonra hem Rob02'ye karsi chl hem de Rob02'ye karsi nefrin oranlari artti (Sekil 2J). Bu bulgu ile uyumlu olarak, Slit2'nin yeni dogan fare glomerüllerinde güçlü sekilde ifade edildigini gözlemledik (Sekiller GB, GC). SlitZ-Rob02 Sinyal iletimi, Nefrin ile Uyarilan Aktin Polimerizasyonunu inhibe eder Slit, aktin polimerizasyonunu inhibe etmek üzere Dock'u ve srGAP'Ieri Robo ile bagladigindan (Fan ve ark., 2003), nefrinin aktin polimerizasyonunu destekleyen rolüne karsi, Rob02'nin memeli hücrelerinde aktin polimerizasyonunu inhibe etmek üzere ch'i de toplayip toplamadigini (rekrutman) test etmek istedik. Bu sorunu ele almak üzere, önceden tarif edildigi üzere CD16/7-NCD kimerik proteinini ifade eden hücrelerde F-aktin kuyruklarini analiz ederek aktin polimerizasyonu inceledik (Jones ve ark., 2006; Verma ve ark., 2006). Bu modelde, nefrin sitoplazmik domenine (NCD) kaynasik olan insan immünoglobulin Fc reseptörleri CD16 ve CD7'nin ekstraselüler ve transmembran domenlerini kullanilir. NCD'nin bir HA isareti ile ikame edildigi CD16l7-HA, bir negatif kontrol olarak kullanildi. Bu kimerik proteinler, HEK hücrelerinde Rob02 ile birlikte ifade edildi ve anti-CD16 antikoru ve rodamine konjüge olan bir sekonder antikor ile muamele edilerek kümelendi. Ilk olarak, nefrin sitoplazmik domeni kümelenmesinin Rob02'yi toplayip toplamadigini inceledik. CD16l7-NCD'nin birlesmesinin, Rob02'yi, Rob02'nin çogu CD16/7-NCD kümeleri ile birlikte lokalize oldugundan Rob02'yi kümelerin içine getirdigini gözlemledik (Sekil 6D-6F). Ancak, ne CD16/7-HA kontrolü ile (Sekil 6D'), ne de içerisindeki Rob02 ch baglayici domeninin (NBD) silindigi bir Rob02-AMED konstrakti ile (Sekil 6E') bir Rob02 ko-Iokalizasyonu gözlemledik. Ilginç bir husus olarak, Slit2 yoklugunda, CD. Bu veriler, nefrin sitoplazmik domeninin, Slit2 varliginda Rob02 intraselüler domeni ile kompleks yapabildigini ayrica destekler ve bir R0b02-ch-nefrin kompleksi olusmasinin aktin polimerizasyonunu etkileyip etkilemedigini belirlemek üzere bu modeli dogrular. CD16/7-NCD ve Robo2'yi ifade eden HEK hücreleri, anti-CD 16 antikoru tarafindan kümelenmis iken, Slit2 ile veya Slit2 içermeyen, kontrol ile sartlandirilan bir ortam ile stimüle edildi. Aktin polimerizasyonu, görünür F-aktin kuyruklarina sahip HEK hücreleri sayisi kantifiye edilerek degerlendirildi (Rivera ve ark., 2004). CD16/7-NCD kümelenmis hücrelerin ~%80'inin, daha önce bildirildigi üzere falloidin boyamasi ile ortaya çikarilan F-aktin kuyruklarini olusturdugunu gözlemledik (Jones ve ark., 2006; Verma ve ark., 2006). Ancak Slit2 stimülasyonu üzerine, F-aktin kuyruklarina sahip hücre sayisi, yaklasik olarak %40'a anlamli ölçüde azaltildi (Sekiller 3A ve SC). Kontrol CD16/7-HA proteinleri kümelendiginde sadece birkaç hücrenin daha kisa F-aktin kuyruklari içerdigi gözlendi (Sekiller 38 ve 3C). Aktin polimerizasyonunun bu inhibisyonunun ch gerektirip gerektirmedigini baskaca arastirmak amaciyla, bu testi, NBC baglayici domen olmaksizin R kullanarak bu testi tekrar ettik ve böylece R0b02'ye ch baglanmasinin bloke edilmesinin, nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonu üzerine SIit2-Robo2 inhibisyonunu önleyip önlemedigini belirlemek istedik. CD ile, ya da tam uzunlukta R0b02 (Sekil 7A) ile birlikte ifade edildi. R0b02 içerisinde ch baglayici domeninin silinmesinin, nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonu üzerinde SIit2-R0b02 inhibisyonunu anlamli ölçüde tehlikeye soktugunu gözlemledik (Sekil 7C). Onceki çalisma, nefrinin, F-aktin hücre iskeleti ile baglantili oldugunu göstermistir (Yuan ve ark., 2002). SIit2-Robo2 sinyal iletiminin, nefrin ile bagli F-aktini inhibe edip edemedigini belirlemek üzere, CD16/7-NCD ve CD16/7-HA ile anti-CD16 antikoru ile immün presipitasyona tabi tuttuk ve çökeltilerdeki F-aktin miktarini Western blot ile inceledik. Nefrin ile birlesik F-aktin bollugunun, Slit2 stimülasyonu üzerine anlamli ölçüde azaldigini gözlemledik (Sekiller 3D ve 3E). Bunun tam tersi olarak in vivo immün presipitasyon testi, R0b02 yeni dogan null far böbreklerine ait bir anti-nefrin antikoru tarafindan immün presipitasyona ugratilan nefrin ile birlesik F-aktininin, yabanil tip veya R0b02 heterozigot fare böbreklerine ait olanlarla kiyasla, anlamli ölçüde arttigini gösterdi (Sekiller 3F ve 36). Birlikte ele alindiklarinda bu sonuçlar, SIit2-R0b02 sinyal iletiminin nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonunu inhibe ettigini gösterir. Podositlerde R0b02 kaybi, Farelerde Degismis Ayaksi Çikinti Yapisma Sebeptir Biz ve digerleri, karma genetik arka plana sahip neredeyse tüm R0b02 homozigot null farelerin, agir bir CAKUT fenotipi sebebiyle dogumdan hemen sonra öldügünü göstermistik sahip farelerin bes kusagi C57BL/6 genetik arka plan üzerinde yetistirildikten sonra, R0b02de'5" heterozigot ana babalarin çiftlestirilmesi, (sütten kesilme noktasinda analiz edilen toplam 160 fare arasindan) 3 haftaya kadar hayatta kalabilen üç adet Rob02de'5/de'5 homozigot null fareler ortaya çikardi. Gelisim esnasinda podosit ayaksi çikinti olusumu için Rob02 gerekip gerekmedigini belirlemek üzere, dogumda ve 3 haftalik olduklarinda, Rob02 null farelerinde glomerüllerin ultra yapisini inceledik. Her ne kadar podosit gövdesi, ayaksi çikintilar ve slit- diyafram dogumda olusmus olsa da, transmisyon elektron mikroskopi ile yeni dogan Rob02de'5/de'5 homozigot null farelerde fokal ayaksi çikinti efasmani görüldü (Sekiller 8A-8F). Taramali elektron mikroskobu ile, dogumda ve 3 haftalik olduklarinda Robo2de'5'dels homozigot null farelerinde düzensiz, birbirine geçen ayaksi çikintilar gözlemledik (Sekiller 4A-4H). Bu bulgular, böbrek gelisimi esnasinda normal podosit ayaksi çikinti örüntüsü için Rob02 gerektigini gösterir. R0bo2'nin matür glomerüllerdeki ayaksi çikinti yapisinin korunmasindaki rolünü incelemek üzere, sartlandirilan Rob02"°""'0x fareleri, Rob02de'5'*; bir podosin-Cre transgeni tasiyan TgNphsz c'e" heterozigot fareleri ile çaprazlayarak, podosit-spesifik Rob02 nakavt fareleri ürettik. Rob02de'5/"°X; TgNWSZ'C'E/+ genotipine sahip yirmi adet podosit-spesifik Rob02 mutanti ve 20 adet es batin yavrusu kontrol faresi, bir yasina gelene kadar analiz edildi. Podosit-spesifik Rob02 nakavt fareleri, yasayabildi ve dogurgandi. Ancak bunlar, bir aylik olduklarinda sira disi genis podosit ayaksi çikintilar ve fokal kismi ayaksi çikinti efasmani sergiledi (Sekiller 4l-4M). 6 haftalik olduklarinda mutant fareler, hem ELISA hem de Western blot analizleri ile saptanan anlamli mikroalbuminüri gelistirdi (Sekiller 4N ve 40). Dahasi taramali elektron mikroskobu ile, Rob02 podosit-spesifik nakavt farelerinde ayaksi çikinti örüntü kusurlari ortaya çikarildi. Yabanil tipte, düzenli fermuar benzeri birbirine geçen sekonder ayaksi çikintilarin yerine, Rob02 podosit-spesifik nakavt fareleri, bir aylik olduklarinda düzensiz ve daginik sekilde birbirine geçen ayaksi çikinti örüntüleri sergiledi (Sekiller 8G-8J). Bu kusurlar zamanla daha belirgin hale geldi. Yedi aylik olduklarinda, üç haftalik Rob02 null farelerin fenotipine benzer olarak, Rob02 podosit-spesifik nakavt farelerinde (Sekiller 8K-8N), açikça disorganize, daha kisa ve kivrimli ayaksi çikintilar gözlendi. Her ne kadar Rob02 podosit-spesifik nakavt fareleri, normal podosit sayisi göstermis olsa da, glomerüllerde matris birikimi anlamli ölçüde artti (Sekiller 80-8T, Tablolar 1 ve 2). Bu morfolojik degisimler, glomerüler podosit ayaksi çikinti yapisini düzenlemede ve muhafaza etmede R0bo2'nin rol oynadigini gösterir. Rob02 Kaybi, Nefrin Null Farlerinde Podosit Yapisal Kusuru Azaltir Nefrin homozigot fareleri, Bowman boslugunun genislemesi, anormal ölçüde genis ayaksi çikintilar, glomerüler slit-diyaframlarin yoklugu ve anlamli proteinüri ile karakteristik bir fenotip getirdiginden ve SIit2-Rob02 sinyal iletimi nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonunu inhibe ettiginden, Rob02 kaybinin, nefrin null farelerinde podosit fenotipi degistirip degistirmeyecegini merak ettik. Rob02 ve nefrin arasinda olasi bir genetik etkilesim hakkindaki bu hipotezi test etmek için, hem germ hatti R0b02'l';Nphs1"/' hem de podosit-spesifik Rob02"°X/"°x;TgNph52* Cre/*;Nphs1"' ikili Rob02-nefrin nakavt fareler ürettik. Nphs1"' tekli homozit durumunda oldugu nakavt fareler, dogumdan sonra 10 içinde öldü. Ancak histolojik analizde, Rob02'/';Nphsi'/' ikili homozigotfarelerdeki glomerül morfolojisinin, genislemis bir Bowman boslugu bulunan Nphsi' /' tekli nefrin homozigot farelerdeki fenotip ile karsilastirildiginda, göreli olarak normal göründügü ortaya koyuldu (Sekiller 8U-8X). Genislemis Bowman boslugu bulunan Dahasi, taramali elektron mikroskobu ile yapilan glomerül ultra yapi analizinde, Rob02* tekli homozigot (Sekiller 4T ve 4U) ve yabanil tip kontrollerde (Sekiller 4V ve 4W) %100 olmasi ile karsilastirildiginda, nefrin tekli homozigot farelerde 15 glomerülün sadece 1'inde (%667), birbirine geçen podosit ayaksi çikinti yapisi gözlendigini gösterildi. Dikkat çekici bir husus olarak, podosit ayaksi çikintilarin birbirine geçme örüntüsü, Rob02'I-;Nphs14- ikili homozigot yeni dogan fare böbreklerinde bulunan 16 glomerülün 12'sinde (%75) iyileserek (Sekiller 4R ve 48, Tablo 4), Rob02 ve nefrinin birlikte kaybinin, bu farelerde podosit ayaksi çikinti yapisal fenotipini azalttigini gösterir. Bu bulgular, yukarida tarif edilen RoboZ-ch-nefrin fiziksel etkilesimlerinin, Rob02 ve nefrin ekspresyon seviyeleri genetik olarak degistirildigi zaman in vivo podosit ayaksi çikinti morfolojisi üzerinde önemli bir etkiye sahip oldugunu gösterir. Podositler, kayda deger derecede plastisite sergiler. Bunlar, gelisim esnasinda basit küboit epitel hücrelerinden, olgun podositler olarak tanidigimiz, ayrintili çikintilar tasiyan hücreler halinde farklilasirlar (Reeves ve ark., 1978). Bu plastisite, olgunlasma sonrasinda muhafaza edilir. Protamin sülfat ile deneysel yüzey yükü nötralizasyonu ve heparin ile restorasyon sonrasinda geri çevrilebilir ayaksi çikinti efasmani olarak (Seiler ve ark., 1975) ve minimal degisiklik hastaligi olan çocuklarda proteinüri relapsi ve remisyonu esnasinda (Nachman ve ark., 2008) grafik olarak en iyi sekilde görülür. Ayaksi çikintilarda daha hafif degisiklikler; muhtemelen hemodinamik, hormonal veya parakrin uyaranlari formundaki pozitif ve negatif sinyallere yanit olarak fizyolojik sartlar altinda meydana gelir. Ayaksi çikintilarda f-aktin bollugu göz önüne alindiginda, teori ile baglanmak veya sinirlanmak istenmemekle birlikte, böylesi uyaranlarin, F-aktin hücre iskeletine aktarilan pozitif ve negatif sinyallere yanit olarak bu hafif degisimleri getirmesi olasidir. Çok fazla ve dengesiz pozitif sinyaller, hastalik fenotipine sebep olabilir. Gerçekten de, bir fizyolojik Iigant hala saptanacak olmakla birlikte, nefrinin ekstraselüler domenine yönelik bir nefritojenik monoklonal antikor ile siçanlarda uyarilan proteinüri sürecinde rol oynayabilen bir mekanizma olarak (Topham ve ark., 1999) ve böbrek nakli sonrasinda anti-nefrin allo-antikorlari gelistiren konjenital nefrotik sendrom vakalarinda (Patrakka ve ark., 2002), nefrin kümelesmesinin ve fosforilasyonunun, ch rekrutmani ile aktin polimerizasyonunu uyardigi açiktir. Burada tarif edilen çalismalarimiz, R0b02'nin Slit tarafindan baglandigi zaman, nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonunu inhibe ettigi podosit aktin polimerizasyonunun negatif regülasyonunun bir baska düzeyini ortaya koymaktadir. Teori ile bagli kalmak veya sinirlanmak istemeksizin, SIit-Rob02 sinyal iletiminin, nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonunu inhibe edebildigi ve böylece normal podosit ayaksi çikinti yapisini asagidaki gibi muhafaza ettigini öneriyoruz: Fizyolojik sartlar altinda (Örnegin ayaksi çikinti gelisimi esnasinda) nefrin angajmani, ch SH2 domeninin baglandigi intraselüler ch ise, podosit ayaksi çikinti uzamasi veya yayilmasi için aktin polimerizasyonunu desteklemek üzere kendi SH3 domenleri üzerinden N-WASP gibi hücre iskelet regülatbrlerini toplar (Sekil 82). Slit'in lokal sekresyonu ve baglanmasi, R0b02'nin ch ile kendi prolin zengini bölgesi ve ch'nin ilk iki SH3 domeni üzerinden etkilesimini artirir. ch'nin ilk iki SH3 domeninin R0b02 tarafindan tecrit edilmesi, dinamik ve dengeli bir F-aktin hücre iskeletini ve normal podosit ayaksi çikinti yapisini muhafaza etmek üzere nefrin-ch aracili aktin polimerizasyonunu inhibe edecek ve nefrin ile birlesik F-aktini azaltacaktir (Sekil 82). Nefrin ile uyarilan aktin polimerizasyonunun ch üzerinden direkt olarak inhibisyonuna ilave olarak Slit-R0b02 sinyali, daha önce bildirildigi gibi F-aktin hücre iskeletini negatif olarak regüle etmek üzere Ena, AbI, srGAP'Ieri toplamak gibi baska yolaklar üzerinden aktin polimerizasyonunu olmaksizin (örnegin R0b02 nakavt edildiginde), R0b02'nin, nefrin ile uyarilan polimerizasyon üzerindeki inhibitbr etkileri kaybolur. ch'nin SH3 domenleri, aktive polimerizasyonunu artirmak üzere akis asagi sitoskeletal regülatörler ile etkilesime girebilir (Sekil 82) ve bu durum, R0b02 mutant farelerde tanimlanan degismis podosit ayaksi çikinti yapisini açiklayabilir. Dolayisiyla burada tarif edilen sonuçlarimiz, SIit-Robo sinyal iletiminin, akson büyüme konisi yolunun bulunmasi (pathfinding) üzerindeki rolüne benzer olarak, SIit-Robo sinyal iletiminin, F-aktin hücre iskeletinin negatif olarak regüle edilmesi yoluyla podosit plastisitesini regüle edebildigi bir mekanizmayi desteklemektedir (Guan ve Rao, 2003). R0b02 mutant fare glomerüllerinde artmis matris birikiminin patolojik bulgusu, muhtemelen bir sekonder yaniti temsil eder. R0b02'nin podositlerin bazal yüzeyine lokalize oldugu ve kendi intraselüler domeni üzerinden baska bilinen ayaksi çikinti slit-diyafram proteinleri ile bir kompleks olusturduguna yönelik olarak burada tarif edilen çalismalarimizdan açikça anlasilsa da, slit-diyaframin gerçekten de bir parçasini olusturup olusturmadigi belirsizligini korumaktadir. ilginçtir ki, R0b02'nin ekstraselüler domeni, sekiz adet immünoglobulin (lg) benzeri motife ve bir adet fibronektin domenine sahip olan nefrin ile benzer olurken, R0b02, bes adet lg benzeri motife ve üç adet fibronektin domenine sahiptir (Sekil 8Z) (Tryggvason ve ark., 2006). R0b02 intraselüler domeni ve nefrinin sitoplazmik domeni arasindaki etkilesimi maya çift hibrit testinde test ettik. Biyokimyasal verilerimiz (Sekiller 2E ve 2F), bu iki reseptör arasinda in vitro olarak bir direkt etkilesimi desteklemedi. Ancak R0b02'nin ekstraselüler domeninin, nefrinin ekstraselüler domeni ile, in vivo olarak, bitisik ayaksi çikintilarin hücre zarlari üzerinde, slit-diyafram içerisindeki bir trans-etkilesim yoluyla birlesebilmesi mümkündür. R0b02 homozigot null ve podosit-spesifik nakavt farelerin, nefrin null farelerinkinden farkli bir fenotip olarak, degismis bir birbirine geçen ayaksi çikinti örüntüsü gelistirdigini bulduk iskeletini regüle etmede zit rol oynadigindan sasirtici degildir. Nefrin sinyal iletimi, lokalize aktin polimerizasyonunu uyarsa da, Slit2-Rob02 sinyal iletimi podosit ayaksi çikinti plastisitesi ve dinamigini muhafaza etmek üzere aktin polimerizasyonu üzerinde bir negatif regülatör olarak davranir. Podositlerde F-aktin hücre iskeletinin bir baska negatif regülatörü olan aktin- depolimerizasyon faktörü Cofilin-1'in nakavt edildigi farelerde, benzer bir ayaksi çikinti organizasyon kusurunun gözlenmesi dikkat çekicidir (Garg ve ark., 2010). Bu durum, ya bir nefrin sinyal iletimi gibi bir aktin polimerizasyonunu destekleyici faktörün, ya da R0b02 sinyal iletimi gibi bir inhibitör faktörünün yoklugunun, podositlerin normal yapisini etkileyebildigini gösterir. Dolayisiyla, podositlerde pozitif ve negatif F-aktin hücre iskeleti regülatörleri arasindaki denge, normal ayaksi çikinti yapisini muhafaza etmek için önemlidir. Bu dengenin, hem pozitif (nefrit) hem de negatif (R0b02) sinyallerin nakavt edilerek geri kazanilmasi, R0b02- nefrin ikili nakavt farelerinde podosit ayaksi çikinti birbirine geçmesinin ve daha hafif glomerüler fenotipin düzelmesini açiklayabilir. Burada tarif edilen çalismalarimiz, nefrinin, bir taraftan glomerüler permselektivitesini kontrol altina almak üzere slit-diyaframin zaruri bir bileseni olarak (Tryggvason ve ark., 2006) ve aktin hücre iskeleti ile etkilesimi yoluyla ayaksi çikinti morfolojisinin bir regülatörü olarak (Jones ve ark., 2006; Verma ve ark., 2006) ikili rolünü ortaya koymaktadir. R0b02 sinyal iletimi, nefrinin ayaksi çikintilar üzerindeki pozitif sinyal iletim etkilerini açikça karsilasa da, slit-diyafram bütünlügünü de etkileyip etkilemedigi belirlenmelidir. Buna göre burada tarif edildigi üzere, R0b02'yi, böbrekte podosit interselüler bileskenin yeni bir bileseni olarak belirlemis bulunuyoruz. R0b02 ve nefrin arasindaki etkilesimleri, biyokimyasal, fonksiyonel ve genetik teknikleri kullanarak göstermis ve SIit2-Rob02 sinyal iletiminin, nefrinle uyarilan aktin dinamiklerini inhibe ettigini göstermis bulunuyoruz. Bizim sonuçlarimiz, R0b02 sinyal iletiminin, podosit ayaksi çikinti mimarisini degistirmek üzere nefrin üzerinde bir negatif regülatör seklinde davrandigini gösterir. Bu çalisma, Slit-Robo sinyal iletiminin rolünü anlamamiza imkan verir ve kilavuz isareti reseptörü Robo'nun F-aktin hücre iskeleti dinamigini etkileyebildigi yeni bir parazitlenme mekanizmasini tanimlar. Aksi belirtilmedikçe burada mevcut basvuru ile baglantili olarak kullanilan bilimsel ve teknik terimler, burada açiklananlarin sahasindaki teknigin uzmanlarinca yaygin olarak anlasildiklari anlamlari tasiyacaklardir. Bu bulusun, burada tarif edilen belirli metodoloji, protokoller ve reaktifler ile sinirli olmadigi ve dolayisiyla degiskenlik gösterebilecegi anlasilmalidir. Burada kullanilan terminoloji, sadece Özel yapilanmalari tarif etme amacina yöneliktir ve mevcut bulusun sadece istemlerde tanimlanan kapsamini sinirlandirmasi amaçlanmamaktadir. Immünoloji ve moleküler biyolojinin yayin terimlerinin tanimlari için bkz. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 18. Baski, yayinlayan Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0- 911910-18-2); Robert S. Porter ve ark. (ed), The EncycIOpedia of Molecular Biology, yayinlayan Blackwell Science Ltd., , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, yayinlayan VCH Publishers, Inc., ; Immunology by Werner Luttmann, yayinlayan Elsevier, 2006. Moleküler biyolojinin yaygin terimlerinin tanimlari için bkz. Benjamin Lewin, Genes IX, yayinlayan Jones & Bartlett Publishing, : Kendrew ve ark. (ed), The Encyclopedia of Molecular Biology, yayinlayan Blackwell Science Ltd., , Maniatis ve ark., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., ABD (1982); Sambrook ve ark., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. baski), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., ABD (1989); Davis ve ark., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, ABD (1986); veya Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Cilt152, S. L. Berger ve A. R. Kimmerl Eds., Academic Press Inc., San Diego, ABD (1987); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB) (Fred M. Ausubel ve ark., ed., John Wiley and Sons, Inc.). Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, ve ark., ed., John Wiley and Sons, Inc.) ve Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ve ark., ed. John Wiley and Sons, Inc.). Burada kullanildigi haliyle "içerir" terimi, sunulan tanimli elemanlara ilave olarak baska elemanlarin da bulunabilecegi anlamina gelir. "Içeren" teriminin kullanimi, kisitlamadan ziyade katilim olduguna isaret eder. Burada kullanildigi haliyle "büyük ölçüde olusur" terimi, belirli bir yapilanma için gerekli olan unsurlari ifade eder. Bu terim, mevcut bulusun o yapilanmasinin temel ve yeni veya fonksiyonel karakteristigini / karakteristiklerini maddi olarak etkilemeyen ilave elemanlarin varligina imkan verir. unsurundan ayri olan bilesimlere, metotlara ve bunlarin kendi bilesenlerine isarete eder. Diger taraftan, baglamin aksini gerektirmemesi halinde, tekil kullanimlar çogullari ve çogul kullanimlar tekilleri de içerecektir. Bu tarifname boyunca ve ekli istemler bölümünde kullanilan Dolayisiyla, 'örnegin "metot" için yapilan bir atif, burada tarif edilen ve burada açiklananlari Okumalari üzerine ilgili teknikte uzman kisilerce anlasilacak olan tipteki bir veya daha fazla metodu ve / veya adimlari da kapsar. Çalisma örneklerinden baska, ya da aksi belirtilen yerlerde, burada kullanilan bilesenlerin miktarlarini veya reaksiyon sartlarini ifade eden tüm sayilar, her durumda "yaklasik olarak" terimi ile degistirilmis olarak anlasilmalidir. Yüzdeler ile baglantili olarak kullanildiginda Bu bulusun, burada tarif edilen belirli metodoloji, protokoller ve reaktifler ile sinirli olmadigi ve dolayisiyla degiskenlik gösterebilecegi anlasilmalidir. Burada kullanilan terminoloji, sadece özel yapilanmalari tarif etme amacina yöneliktir ve mevcut bulusun sadece istemlerde tanimlanan kapsamini sinirlandirmasi amaçlanmamaktadir. Burada tarif edilen çesitli yönlerin yapilanmalari, asagida numaralandirilan paragraflar ile gösterilebilir: 2. Ihtiyaç halindeki bir bireyde kronik böbrek hastaliginin tedavisine yönelik bir metot olup, bir kronik böbrek hastaligi olan veya bu bakimdan riski bulunan bir bireye, bir ROBOZ inhibitörü içeren bir bilesimin terapotik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini 3. Ihtiyaç halindeki bir bireyde proteinüriyi azaltmaya yönelik bir metot olup, proteinürisi olan veya bu bakimdan riski bulunan bir bireye, bir ROBO2 inhibitörü içeren bir bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini içerir. 4. Paragraf 1 veya 2'nin herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada ROBOZ inhibitörü; ROBOZ için spesifik olan bir bloke edici antikor veya bu antikorun bir antijen baglayici fragmani, ROBOZ için spesifik olan bir antisens molekülü, ROBOZ için spesifik olan bir kisa enterferans RNA (siRNA), ROBOZ'nin bir küçük moleküllü inhibitörü, bir ROBO2 inhibitör polipeptidi, ya da bir ROBOZ yapisal analogu olmaktadir. . Paragraflar 1-3'ün herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada ROBOZ inhibitörü, ROBOZ'nin SLIT'e, ch'ye veya her ikisine baglanmasini bloke etmekte veya azaltmaktadir. 6. Paragraflar1-4'ün herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada ROBO2 inhibitörü; lgl SLIT baglayici domen için, Igl ve IgZ SLIT baglayici domenler için, ch intraselüler baglanma domeni için, ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonu için spesifik olmaktadir. 7. Paragraf 3'te tanimlanan metot olup, burada ROBOZ inhibitör polipeptidi; bir dominant negatif ROBO2 füzyon proteini, intraselüler domen olmaksizin bir ROBOZ ekstraselüler domeni içeren bir polipeptit, ya da ekstraselüler domen olmaksizin bir ROBO2 intraselüler domeni içeren bir polipeptit olmaktadir. 8. Paragraflar 1-6'nin herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada bir kronik böbrek hastaligi olan veya bu bakimdan riski bulunan bireyde, diyabetik nefropati veya yüksek kan basinci bulunmaktadir. 9. Paragraflar 1-7'nin herhangi birinde tanimlanan metot olup, ayrica bireye bir ilave terapötik ajan uygulanmasini ihtiva etmektedir. . Paragraf 8'de tanimlanan metot olup, burada ilave terapötik ajan, bir anjiyotensin dönüstürücü enzim (ACE) inhibitörü veya bir anjiyotensin ll reseptör blokeri (ARB) olmaktadir. 11. Bir metot olup, asagida belirtilenleri içerir: a. ROBOZ polipeptidinin veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan bir RNA'nin bir ekspresyon seviyesini belirlemek üzere bir bireyden alinan bir biyolojik test örneginin test edilmesi; b. biyolojik test örneginde, ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesinin veya ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinin, bir referans esik düzeyin üzerinde olup olmadiginin belirlenmesi; ve c. bireyin, kronik böbrek hastaligi tedavisine veya teshisine ihtiyaci oldugunun tanilanmasi. 12. Paragraf 10'da tanimlanan metot olup, burada ROBO2 polipeptidinin ekspresyon seviyesinin test edilmesi, ROBOZ polipeptidi için spesifik bir antikor veya bunun bir antijen baglayici fragmani kullanilarak gerçeklestirilir. 13. Paragraf 10'da tanimlanan metot olup, burada bir ROBO2 polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinin test edilmesi, PCR veya bir hibridizasyon testi kullanilarak gerçeklestirilir. 14. Paragraflar 10-12`nin herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada biyolojik test örnegi; bir böbrek biyopsisi, idrar, kan, serum örnegi, ya da bir idrar örneginden peletlenmis hücreler olmaktadir. . Paragraflar 10-13'ün herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesi veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesi, referans esik düzeyinin en az %20 üzerinde olmaktadir. 16. Paragraflar 10-13'ün herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesi veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesi, referans esik düzeyinin en az iki standart sapma kadar üzerinde olmaktadir. 17. Asagida belirtilenleri içeren bir test: a. bir bireyden izole edilen bir biyolojik test örneginin, ROBOZ polipeptidini veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan bir RNA'yi saptayan bir reaktif ile temas ettirilmesi; ve b. ROBOZ polipeptidinin, ya da bir ROBOZ polipeptidini kodlayan bir RNA'nin düzeyinin ölçülmesi c. burada bahsedilen ROBO2 polipeptidinin veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan bahsedilen RNA'nin, bir normal biyolojik örnege göreli artmis bir seviyesi, bir bireyi, kronik böbrek hastaligina sahip oldugu ve / veya kronik böbrek hastaligi veya proteinüri hastaliginin ilerledigi yönünde tanilamaktadir. 18. Paragraf 16'da tanimlanan test olup, burada ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesinin saptanmasi, ROBOZ polipeptidi için spesifik bir antikor veya bunun bir antijen baglayici fragmani kullanilarak gerçeklestirilir. 19. Paragraf 16'da tanimlanan test olup, burada bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinin saptanmasi, PCR veya bir hibridizasyon testi kullanilarak gerçeklestirilir. . Paragraflar 16-18'nin herhangi birinde tanimlanan test olup, burada biyolojik test örnegi; bir böbrek biyopsisi, idrar, kan, serum örnegi, ya da bir idrar örneginden peletlenmis hücreler olmaktadir. 21. Paragraflar 16-19`un herhangi birinde tanimlanan test olup, burada ROBO2 polipeptidinin ekspresyon seviyesi veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesi, referans esik düzeyinin en az %20 üzerinde olmaktadir. 22. Paragraflar 16-19'un herhangi birinde tanimlanan test olup, burada ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesi veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesi, referans esik düzeyinin en az iki standart sapma kadar üzerinde olmaktadir. 23. Paragraflar 16-21'in herhangi birinde tanimlanan test olup, burada birey, diyabet veya yüksek kan basinci ile tanilanmis olmaktadir. 24. Bir bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan risk altinda olup olmadiginin, ya da kronik böbrek hastaligi bulunup bulunmadiginin belirlenmesine yönelik olarak, asagida sayilanlari içeren bir sistem: a. bir bireyden elde edilen bir biyolojik örnekte, ROBOZ polipeptidinin ekspresyon seviyesini veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesini belirleyecek sekilde düzenlenen bir ölçüm modülü; b. ölçüm modülü tarafindan belirlendigi üzere, ROBOZ polipeptidinin bahsedilen ekspresyon seviyesini veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinini alacagi ve ROBOZ polipeptidinin eKSpresyon seviyesinin veya bir ROBOZ polipeptidini kodlayan RNA'nin ekspresyon seviyesinin, önceden belirlenmis bir referans seviyenin veya oranin üzerinde olup olmadigini belirleyecegi ve bir inceleme sonucu saglayacagi sekilde düzenlenen bir karsilastirma modülü; ve c. bahsedilen karsilastirma modülünden gelen veri çikisi esasinda bir içerigi ekranda göstermek üzere bir ekran modülü, burada bahsedilen içerik, ROBOZ polipeptidinin veya RNA'nin ekspresyon seviyesinin veya oraninin, önceden belirlenmis referans seviyesi veya oranindan daha büyük oldugunu gösteren bir sinyali, ya da ROBO2 seviyesinin veya ekspresyon oraninin, referans seviyesi veya önceden belirlenmis orandan daha büyük olmadigini gösteren bir sinyali içermektedir. . Paragraf 23'te tanimlanan sistem olup, burada bahsedilen ekran modülü üzerinde gösterilen içerik, ayrica, bireyin belirli bir tedavi rejimi almasini öneren bir sinyali içermektedir. 26. Bir bireyin kronik böbrek hastaligi veya proteinüri bakimindan risk altinda olup olmadiginin, ya da kronik böbrek hastaligi bulunup bulunmadiginin belirlenmesine yönelik olarak, asagida sayilanlari içeren bir sistem: a. bir bireyden elde edilen en az birtest örnegini alacagi ve asagidaki durumlardan herhangi birinin varligini veya yoklugunu belirlemek üzere bahsedilen en az bir test örnegi üzerinde en az bir analiz gerçeklestirecegi sekilde düzenlenen bir tayin i. ROBOZ'nin, önceden belirlenmis bir orandan daha büyük bir ekspresyon orani, ya da ii. ROBO2'nin, önceden belirlenmis bir seviyeden daha büyük bir ekspresyon b. bahsedilen tayin modülünden gelen veri çikisini saklayacagi sekilde düzenlenen bir depolama aygiti; ve c. bir Içerigin, bahsedilen tayin modülünden gelen veri çikisi esasinda görüntülenmesine yönelik bir ekran modülü, burada bahsedilen içerik, ROBOZ'nin ekspresyon oraninin önceden belirlenmis orandan veya önceden belirlenmis seviyeden daha büyük oldugunu gösteren bir sinyali, ya da ROBOZ ekspresyon oraninin, önceden belirlenmis orandan daha büyük olmadigini veya önceden belirlenmis seviyeden daha büyük olmadigini gösteren bir sinyali içermektedir. 27. Paragraf 25'te tanimlanan sistem olup, burada bahsedilen ekran modülü üzerinde gösterilen içerik, ayrica, bireyin belirli bir tedavi rejimi almasini öneren bir sinyali içermektedir. 28. Kronik böbrek hastaligi veya proteinüri riski tasiyan bir insan bireyin tedavi edilmesine yönelik olarak, bir referans esik seviyenin üzerinde bir ROBOZ protein seviyesi oldugu belirlenen bir insan bireye, kronik böbrek hastaligi veya proteinüri olusunu önlemek üzere bir tedavi veya terapi uygulanmasini içeren bir metot. 29. Paragraf 27'de tanimlanan metot olup, burada ROBOZ proteini seviyesi, referans seviyenin en az %20 üzerinde olmaktadir. . Paragraf 27'de tanimlanan metot olup, burada ROBOZ proteini seviyesi, referans seviyenin en az iki standart sapma üzerinde olmaktadir. 31. Paragraflar 27-29'un herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada kronik böbrek hastaligi veya proteinüri olusunu önlemeye yönelik tedavi veya terapi, bir ROBOZ inhibitörünü ihtiva etmektedir. 32. Paragraf 30`da tanimlanan metot olup, burada ROBO2 inhibitörü; ROBO2 için spesifik olan bir bloke edici antikor veya bu antikorun bir antijen baglayici fragmani, ROBOZ için spesifik olan bir antisens molekülü, ROBO2 için spesifik olan bir kisa enterferans RNA (siRNA), ROBO2'nin bir küçük moleküllü inhibitörü, bir ROBO2 inhibitör polipeptidi, ya da bir ROBOZ yapisal analogu olmaktadir. 33. Paragraflar 30-31'in herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada ROBOZ inhibitörü, ROBOZ'nin SLIT'e, ch'ye veya her ikisine baglanmasini bloke etmekte veya azaltmaktad i r. 34. Paragraflar 30-32'nin herhangi birinde tanimlanan metot olup, burada ROBOZ inhibitörü; Ig1 SLIT baglayici domen için, Ig1 ve IgZ SLIT baglayici domenler için, ch intraselüler baglanma domeni için, ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonu için spesifik olmaktadir. . Paragraf 31'de tanimlanan metot olup, burada ROBOZ inhibitör polipeptidi; bir dominant negatif ROBO2 füzyon proteini, intraselüler domen olmaksizin bir ROBOZ ekstraselüler domeni içeren bir polipeptit, ya da ekstraselüler domen olmaksizin bir ROBO2 intraselüler domeni içeren bir polipeptit olmaktadir. 36. Bir kronik böbrek hastaligini tedavi etmede kullanilmaya yönelik bir ROBO2 inhibitörü. 37. Proteinüri tedavisinde kullanilmaya yönelik bir ROBOZ inhibitörü. 38. Paragraf 35 veya 36'nin herhangi birinde tanimlanan kullanim olup, burada ROBOZ inhibitörü; ROBO2 için spesifik olan bir bloke edici antikor veya bu antikorun bir antijen baglayici fragmani, ROBO2 için spesifik olan bir antisens molekülü, ROBOZ için spesifik olan bir kisa enterferans RNA (siRNA), ROBOZ'nin bir küçük moleküllü inhibitörü, bir ROBOZ inhibitör polipeptidi, ya da bir ROBOZ yapisal analogu olmaktadir. 39. Paragraflar 35-37'nin herhangi birinde tanimlanan kullanim olup, burada ROBOZ inhibitörü, ROBOZ'nin SLIT'e, ch'ye veya her ikisine baglanmasini bloke etmekte veya azaltmaktad i r. 40. Paragraflar 35-38'in herhangi birinde tanimlanan kullanim olup, burada ROBOZ inhibitörü; Ig1 SLIT baglayici domen için, lg1 ve lgZ SLIT baglayici domenler için, ch intraselüler baglanma domeni için, ya da bunlarin herhangi bir kombinasyonu için spesifik olmaktadir. 41. Paragraf 37'de tanimlanan kullanim olup, burada ROBOZ inhibitör polipeptidi; bir dominant negatif ROBO2 füzyon proteini, intraselüler domen olmaksizin bir ROBO2 ekstraselüler domeni içeren bir polipeptit, ya da ekstraselüler domen olmaksizin bir ROBOZ intraselüler domeni içeren bir polipeptit olmaktadir. 42. Paragraflar 35-40'in herhangi birinde tanimlanan kullanim olup, burada kronik böbrek hastaligi veya proteinürinin sebebi, diyabetik nefropati veya yüksek kan basinci olmaktadir. Bu bulus, sinirlayici olduklari yönünde yorumlanmamasi gereken asagidaki örnekler üzerinden baskaca tarif edilecektir. ORNEKLER Doku In Situ Hibridizasyonu, Immünhistokimya ve Immünogold Elektron Mikroskobu gibi gerçeklestirildi (Grieshammer ve ark., 2004). Immünhistokimya çalismasi, %4 paraformaldehid içinde fikse edilen fare embriyonik böbrek dokularinda ve metanol içinde fikse edilen eriskin fare böbrek dokularinda gerçeklestirildi. Immünogold elektron mikroskobu için yabanil tip fare böbrekleri parçalara ayrildi ve paraformaldehid-Iizin-periodat (PLP) içinde fikse edildi. Fare böbreginin ultra incelikte kesitleri hazirlandi ve 10 nm koloidal altlina (Ted Pella) bagli bir sekonder antikor ve goat anti-R ile inkübe edildi. Maya Iki-Hibrit, Ko-Presipitasyon ve Aktin Polimerizasyon Analizleri DUPLEX-ATM maya iki-hibrit sistemi (OriGene Tech), üretici talimatlarina uygun olarak R0b02 ve chI etkilesimini karakterize etmek üzere kullanildi. Hücre kültürü, His-isaretli protein ko- presipitasyonu ve immün presipitasyon, önceden bildirildigi gibi gerçeklestirildi (Fan ve ark., 2003). Endojen immün presipitasyonu için fare yeni dogan böbrekleri kullanildi. CD16/7 füzyon proteinlerinin CD16 antikor aracili çapraz baglanmasi ve aktin polimerizasyon testi, önceden tarif edildigi gibi gerçeklestirildi (Jones ve ark., 2006; Rivera ve ark., 2004; Verma ve ark., 2006) Nakavt Fare çalismasi, Transmisyon ve Taramali Elektron Mikroskobu ve Böbrek Glomer'üler Analizi Fare protokolleri, Boston Üniversitesi Tip Merkezi'nde (# 14388) bulunan Kurumsal Hayvan Bakim ve Kullanim Komitesi (IACUC) tarafindan onaylandi. R0b02fiox sartli alleli, R0b02d'3'5 (bu yazida R0b02' ile birbirlerinin yerine kullanilir) germ hatti mutant alleli ve R0b02+ yabanil tip allelinin üretimi ve genotiplemesi önceden tarif edilmistir (Lu ve ark., 2007; Wang ve ark., Nphs1"' fareleri ile çaprazlandi (Hamano ve ark., 2002). Trans transmisyon elektron mikroskobu için böbrekler fikse edildi, 0.15 M sodyum kakodilat içinde bulunan %0.1'Iik glutaraldehid içinde inkübe edildi, dereceli etanol içinde dehidratlandi, Epon içerisine gömüldü, kesitlere ayrildi ve uranil asetat ve kursun sitrat ile boyandi. Ultra incelikte böbrek kesitleri, bir JEM-1011 elektron mikroskobu ile incelendi. Taramali elektron mikroskobu için böbrekler standart protokole göre hazirlandi. Böbrek patolojisi çalismalari için böbrekler, %4'Iük paraformaldehid ile fikse edildi, parafin içine gömüldü, kesitlere ayrildi ve standart Periyodik asit-Schiff (PAS) veya eozin hematoksilin (H&E) yöntemleri kullanilarak boyandi. Podosit sayisinin kantifikasyonu için WT1, bir podosit nükleer belirteci olarak kullanildi ve standart protokole uygun olarak böbrek kesitlerinde immün peroksidaz boyama yapildi. Her bir glomerüler kesitte bulunan WT1 pozitif podosit çekirdekleri sayildi. Proteinüri analizi için 6 haftalik farelerden alinan "spot" idrar örnekleri, üretici talimatlarina göre bir murin albuminüri ELISA kantitasyon kiti (Exocell) ve bir tarama yöntemi olarak idrar çubugu (Multistix, Bayer, Doku In Situ Hibridizasyon ve Immünhistokimya Çalismasi gibi gerçeklestirildi (Grieshammer ve ark., 2004). R0b02 cDNA, Notl ile linearize edildi ve problar, DIG DNA isaretleme ve deteksiyon kiti (Roche Applied Science) kullanilarak üretildi. Hibridizasyon, %4 paraformaldehid ile fikse edilen OCT'ye gömülü fare embriyonik böbreklerinin dondurulmus kisimlari üzerinde gerçeklestirildi. Immünhistokimya çalismasi, %4 paraformaldehid içinde fikse edilen ve akabinde %30 sakaroz kriyo korumasi yapilan (Mugford ve ark.., 2008) fare embriyonik böbrek dokularinda ve metanol içinde fikse edilen eriskin fare böbrek dokularinda gerçeklestirildi. OCT bilesigine gömülü fare böbrekleri donduruldu ve 8-10 pm sicaklikta Cryostat kullanilarak kesitlere kesildi. Kesitler, primer antikorlar ile boyandi ve daha sonra uygun bir FITC veya Cy3 konjüge sekonder antikorlar uygulandi. Bu çalismada kullanilan primer antikorlar, asagida sayilanlari hedefleyen antikorlardir: ROBOZ (R&D System, Abnova, Santa Cruz Biotechnology), nefrin (özel sentezlenmis) (Topham ve ark., 1999), ch (Upstate/Millipore), podosin (Sigma), nidojen (Santa Cruz Biotechnology), Pecam1 (BD Biosciences), WT1 (Santa Cruz Biotechnology), SLIT2 (Santa Cruz Biotechnology), PDGFR beta (Cell Signaling), Synaptopodin (Santa Cruz Biotechnology). Görüntüler, bir Perkin Elmer UltraView LCI çok noktali spinning disk lazer-tarama konfokal mikroskobu ve 60x yag daldirma tipi objektifli bir Zeiss LSM 510 konfokal lazer tarama mikroskonu kullanilarak Immünogold Elektron Mikroskopi Çalismasi Yabanil tip fare böbrekleri seksiyonlara ayrildi ve gece boyu 4"C'de paraformaldehid-"zin- periodat (PLP) içinde fikse edildi. Dokular, 1x PBS içinde yikandi ve dereceli etanol içinde dehidratlandi ve LR White reçine (Elektron Mikroskopi Bilimleri) içerisine gömüldü. Fare böbreginin ultra incelikte kesitleri hazirlandi ve Formvar ile kapli altin izgaralara aktarildi ve 1x PBS içinde %1 bovin serum albümin ve %5 normal keçi serumu ile bloke edildi. Kesitler daha sonra DATO (DAKO Corporation) içinde gece boyu 4°C sicaklikta bir keçi anti-R0b02 antikoru ile 1:50 oraninda seyreltilerek inkübe edildi. immün olmayan serum, bir kontrol olarak kullanildi. 1x PBS ile üç kere yikandiktan sonra seksiyonlar oda sicakliginda 2 saat süresince nm koloidal altina (Ted Pella) bagli bir IgG sekonder antikor ile inkübe edildi. Seksiyonlar son olarak %1 glutaraldehid ile fikse edildi ve uranil asetat ile kontrast çalismasi yapildi. Seksiyonlar, bir JEM- ile 80 kV'da incelendi ve görüntüler bir AMT dijital görüntüleme sistemi (Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA) kullanilarak elde edildi ve Adobe PhotoshOp'a aktarildi. Glomerüllerde altin partikülleri ile boyanmis olan R0b02'nin hücre alti Iokalizasyonu, immün olmayan serum ile boyanan kontrol mikrograflari ile kiyasli olarak dijital elektron mikrograflari üzerinde tanindi. Maya Iki-Hibrit Testi DUPLEX-ATM maya iki-hibrit sistemi (OriGene Tech, Rockville, MD), R0b02 ve chl etkilesimini karakterize etmek üzere kullanildi. Insan Robo2'nin hücre içi domeni ve bunun budanmis formlarini kodlayan cDNA'lar, EcoRI/Xhol pozisyonlarinda pJG4-5 vektörüne sokuldu ve bunlar, B42'nin transkripsiyon aktivasyon domeniyle birlestirildi. Insan chl've bunun budanmis formlarinin cDNA'lari, EcoRI/Xhol pozisyonlarinda pEG202 vektörüne sokuldu ve bunlar, LexA'nin DNA baglayici domeniyle birlestirildi. PSH18-34 konstraktindaki lacZ geni ve EGY48 susu maya genomundaki LEU2 geni raportör genler olarak kullanildi. PEGZO2, pSH18-34 ve pJG4-5 konstraktlari, maya EGY48 hücrelerine birlikte transforme edildi. Bu etkilesim, maya hücrelerinin X-gal varliginda mavi renge dönmesi ve Iözin yoklugunda büyümesi durumunda pozitif kabul edildi. Hücre Kültürü, DNA Konstraktlari, Transfeksiyon, Ko-Presipitasyon ve Western BIot Analizleri HEK (293T) hücreleri, kalsiyum fosfat transfeksiyonu kullanilarak %60'lik konfluens seviyesinde transfekte edildi. C-terminal His- ve myo-isaretli füzyon proteinlerini yapmak için tam uzunluklu insan kökenli nefrin ve R0b02; Hind III/EcoR1 ve EcoRl/Xh01 restriksiyon bölgelerinde sirasiyla pSecTag B vektörü (Invitrogen) içerisine sokuldu. RoboZ-ANBD, üretici talimatlarina uygun olarak QUIKCHANGE yönlendirilmis mutagenez kiti (Strategene) kullanilarak ch baglayici domeni (Sekil 20) silinerek elde edildi. Isaretlenmemis R0b02 ve chl, EcoR1/Xho1 pozisyonlarinda pCS2 vektörüne (Addgene), HindlII/EcoR1 pozisyonlarinda nefrin içerisine sokuldu. Insan Fyn ve myo-isaretli Slit2 konstraktlari daha önce da önceden bildirilmistir (Verma ve ark., 2006). R0b02 ve chI etkilesimini saptamak üzere C- terminal His ve myo-isaretli insan R0b02 veya RoboZ-ANBD, HEK hücrelerinde ifade edildi. Transfeksiyondan kirk sekiz saat sonra hücreler Iiziz tamponunda lize edildi (50 mM NaHzPO4, . Hücre lizatlari, 4*C sicaklikta 10 dakika santrifüjlendi; süpernatanlar, His-Robo2'yi çökeltmek üzere 4°C sicaklikta 2 saat süresince Ni-NTA reçinesi (Qiagen) ile inkübe edildi ve bir kontrol olarak Ni içermeyen NTA reçinesi kullanildi. Reçine, yikama tamponu (50 mM NaH2P04, 300 mM NaCI, mM imidazol, % sicaklikta 10 dakika isitildi. Çökeltiler, SDS-PAGE jelleri üzerinde çözümlendi ve 1:1000'Iik seyreltideki tavsan anti-myo, tavsan monoklonal anti-chl (Cell Signaling) antikorlari ile blotlandi. R0b02, chI ve nefrin arasinda üçlü etkilesimi incelemek üzere His-myc-Robo2 veya His-myc-Rob02-ANBD, insan nefrin ve insan Fyn ile HEK hücrelerinde birlikte ifade edildi. His-myc-Robo2, yukarida tarif edildigi gibi Ni-NTA kürecikleri ile çökeltildi. Uçlü etkilesimin dogrulanmasi amaciyla His-myc- nefrin, R0b02 ile birlikte ifade edildi ve HEK hücrelerindeki Fyn ve His-myc-nefrin ise Ni-NTA kürecikleri ile puIl-down edildi. Çökeltiler, 1:1000'Iik bir seyreltide tavsan poliklonal anti-myo, tavsan monoklonal anti-chl, tavsan poliklonal anti-nefrin, fare monoklonal anti-R0b02 (R&D systems) ve tavsan poliklonal anti-Fyn (Santa Cruz Biotechnology) antikorlari ile blotlandi. Endojen proteinlerin ko-immün presipitasyonu için yeni dogan farelerin böbrekleri, buz üzerinde RIPA tamponunda homojen hale getirildi (50 mM Tris [pH 7.41, 150 mM NaCI, %. Ornekler 10 dakika süresince 4% sicaklikta santrif üjden geçirildi ve süpernatan, 1 ug fare monoklonal anti-R0b02 antikoru (R&D Systems) ile 1 saat süresince 4"C'de inkübe edildi. Kontrol amaçli keçi IgG (Santa Cruz Biotechnology) bir kontrol olarak kullanildi. Ornekler daha sonra 30 pl protein A/G Plus agaroz kürecik bulamaci (Santa Cruz Biotechnology) ile karistirildi ve ayrica 4iC sicaklikta 12 saat inkübe edildi. Kür ecikler daha sonra RIPA tamponunda üç kere yikandi ve proteinler 10 dakika süresince 95°C sicaklikta isitilarak 1x protein yükleme tamponunda elüe edildi. Çökeltiler, SDS-PAGE jelleri üzerinde çözümlendi ve yukarida tarif edildigi üzere fare anti-R0b02, tavsan anti-nefrin ve tavsan anti-chl antikorlari ile blotlandi. Aktin, Sigma firmasindan temin edilen anti-beta-aktin fare antikoru ile blotlandi. Bantlarin yeginligi, Image.] ile ölçüldü. Proteinüri deteksiyonu için farelerin spot idrarlari toplandi ve 1 kere protein yükleme tamponu ile 1:100 oraninda seyreltildi. Daha sonra idrar proteinleri SDS- PAGE jelleri üzerinde çözümlendi ve bir kontrol olarak saflastirilmis albümin kullanildi (MP Biomedicals). Jeller, tavsan anti-albümin poliklonal antikoru (MP Biomedicals) ile blotlandi. CD16/7-NCD Çapraz Baglama ve Aktin Polimerizasyon Testi CD16/7 füzyon proteinlerinin CD16 antikor aracili çapraz baglanmasi 'önceden tarif edilmistir CD16/7-HA, HEK hücrelerinde R0b02 ile birlikte ifade edildi. 24 saat sonra hücreler aktarildi ve polilizin ile kapli cam Iamellere 24 saat daha ekildi. Hücreler daha sonra 37°C'de 30 dakika süresince 1 ug/ml fare monoklonal anti-CD16 (Beckman Coulter) ile inkübe edildi, bir kere DMEM ile yikandi, Slit2 ile sartlandirilan ortamda veya kontrol ile sartlandirilan bir ortamda seyreltilen rodamin-konjüge sekonder antikor (Thermo Scientific) ile 30 dakika süresince inkübe edildi (Wong ve ark., 2001) ve %4 paraformaldehid / 1x PBS içinde fikse edildi. F-aktin, üreticinin talimatlarina uygun olarak FITC-konjüge falloidin (Invitrogen) ile boyandi. Yeni olusturulan F-aktin demetleri, kümelenmis nefrine (CD16 / 7-NCD) yapisir ve flüoresans mikroskopi altinda kuyruklu yildizlarin kuyruklarina benzer (ana metinde aktin kuyruklari olarak anilir). Bu deneyde, sadece CD16/7-NCD kümelenmesi ile kümelenen ve kümelere baglanan F-aktin demetlerini analiz ettik. F-aktin kuyruklarina sahip hücreler sayildi ve total CD16/7- NCD ile transfekte hücreler ile karsilastirildi. Kantifikasyon formülü: Yüzde % = (F-aktin kuyruklari ile transfekte olan hücre sayisi / transfekte olan toplam hücre sayisi) X 100. Görüntüler, 60X yag daldirma tipi objektife sahip bir LSM510 konfokal mikroskop kullanilarak Rob02 Podosit-Spesifik Nakavt Farelerin ve RoboZ-Nefrin Ikili Nakkavt Farelerin Uretilmesi ve Karakterizasyonu Rob02"OX sartli alleli, Rob02"5 (bu yazida Rob02' ile birbirlerinin yerine kullanilir) germ hatti mutant aIIeIi ve Rob02+ yabanil tip allelinin 'üretimi ve genotiplemesi önceden tarif edilmistir (Lu podosit-spesifik bir Rob02d9'5/"°X; TgNphSZ'Cre/+ nakavt farelerini üretmek üzere standart bir yetistirme semasi izlendi. Bu mutant bilesikte, podosin promotör'u tarafindan uyarilan podosit- spesifik Cre rekombinaz, bir fenotipin penetrasyonunu kolaylastirmak için sadece bir Rob02fIOX allelini siler, çünkü diger aIIeI olarak Rob02de'5, germ hatti ekspresyonundan ubikuitöz sekilde silinmistir. RoboZde'S/ng""Dhszcre'+ farelerinin orijinalligi, Robo2de'5 ve R0b02"°X allellerinin ve ayrica TgNphsz*Cre transgeninin varligi bakimindan kuyruk DNA genotiplemesi ile belirlendi. Rob02"5 alleli ve TgNphszcre transgeni bulunmayan F2 es batin yavrulari Rob02"°X/+ fareleri, kontrol olarak kullanildi. Rob02-nefrin ikili nakavt fareler 'üretmek üzere, Rob02** heterozigot fareler, önceden üretilen Nphs1*" heterozigot fareler ile çaprazlandi (Hamano ve ark., 2002). Rob02 +/-; Nphsi +/- çift heterozigot farelerin 'üretilmesinden sonra, ikili heterozigot farelerin çaprazi, Rob02 - l -; Nphs1 - / - ikili homozigot farelerin yani sira R0b01 - / -tek homozigot, Rob02- üretmek 'üzere gerçeklestirilmistir - tek homozigot ve Rob02 + / +; Nphs1 + / + wild-tip kontroller. Fare protokolleri, Boston Universitesi Tip Merkezi'nde (# 14388) bulunan Kurumsal Hayvan Bakim ve Kullanim Komitesi (IACUC) tarafindan onaylandi. Transmisyon ve Taramali Elektron Mikroskobu Transmisyon elektron mikroskobu için böbrekler, Rob02 homozigot null farelerden ve podosit- spesifik nakavt farelerden dissekte edilerek, gece boyu 4°C sicaklikta PLP içerisinde fikse edildi ve daha sonra 0.15 M sodyum kakodilat içinde bulunan %2'Iik glutaraldehid içinde 6 saat ink'übe edildi. 1x PBS içinde yikandiktan sonra, fikse edilen böbrekler, dereceli etanol içinde dehidratlandi, Epon içerisine gömüld'ü, kesitlere ayrildi ve uranil asetat ve kursun sitrat ile boyandi. Ultra incelikte böbrek kesitleri hazirlandi ve bir JEM-1011 elektron mikroskobu ile incelendi. Yabani tip es batin yavrulari kontrol olarak kullanildi. Taramali elektron mikroskobu için Rob02 homozigot null farelerin, podosit-spesifik nakavt farelerin, nefrin homozigot null farelerin ve Rob02-nefrin ikili homozigot farelerin böbrek örnekleri, önceden tarif edilen (Friedman ve Ellisman, 1981) protokole göre küçük degisiklikler yapilarak hazirlandi. Ozetle böbrekler, 0.1M kakodilat tamponundaki %2.5 glutaraldehid ve %2 paraformaldehid çözeltisi ile (Karnovsky fiksatifi, Electron Microscopy Sciences) perfüze edildi ve daha sonra Karnovsky fiksatifi içerisinde 24 saat fikse edildi, akabinde %2 ozmiyum tetraoksit çözeltisi (Electron Microscopy Sciences) ile muamele edildi. Böbrek örnekleri dondurularak kirildi, dehidratandi ve heksametildisilazan (Electron Microscopy Sciences) kullanilarak kurutuldu. Böbrek örnekleri, Amray 1000A ve Jeol 6340F taramali elektron mikroskoplari kullanilarak görüntülendi. Temsili görüntüleri saglamak üzere her bir hayvandan üç glomerül incelendi. Farelerin Böbrek Patoloji ,Çalismalari, Podosit Sayisinin Kantifikasyonu ve Protein'i'iri Analizi Böbrek patoloji çalismalari için böbrekler dissekte edildi ve gece boyu %4 paraformaldehid ile fikse edildi ve daha sonra, parafine gömülmesi için dereceli bir etanol dizisi ile muamele edildi. Böbrek parafin bloklari, bir MT- kullanilarak 4 um boyutunda seksiyonlara ayrildi ve standart Periyodik asit-Schiff (PAS) veya eozin hematoksilin (H&E) metotlari kullanilarak boyandi. Glomerüller, bir SPOT dijital kamera sistemi ile donatili bir Olympus BHT isik mikroskobu kullanilarak, matris depozisyonu, segmental glomerüloskleroz ve Bowman boslugunun dilatasyonlari bakimindan incelendi. Podosit sayisinin kantifikasyonu için WT1, bir podosit nükleer belirteci olarak kullanildi ve önceden tarif edilen protokole uygun olarak böbrek kesitlerinde immün peroksidaz boyama yapildi (Sanden ve ark., 2003). Ozetle, 4 adet bir yasinda RoboZdeß/fmx;TgNpm'C"E+ podosit-spesifik nakavt farelerine ve yasa göre esli yabanil tip kontrol farelerine ait parafine gömülü böbrek kesitleri; 4 pm seviyesinde boyutunda seksiyonlara ayrildi ve mikro dalga antijen islemi sonrasinda WT1 antikoru (Santa Cruz Biotechnology) ile boyandi. Biotinlenen sekonder antikor ve Vectastain ABC kiti (Vector Laboratories), WT1 sinyalini saptamak üzere kullanildi. Her bir glomerüler kesitteki WT1 pozitif podosit çekirdekleri, dört adet mutant farenin toplam 165 glomerülünde ve dört adet kontrol faresinin 166 glomerülünde sayildi. Proteinüri analizi için 6 haftalik farelerden alinan "spot" idrar örnekleri, üretici talimatlarina göre bir hassas murin albuminüri ELISA kantitasyon kiti (Exocell) ve bir tarama yöntemi olarak idrar çubugu (Multistix, Bayer, IN) kullanilarak incelendi. Idrar albümin, bir albümin/kreatinin orani saglamak üzere kreatinin ile normalize edildi. Idrardaki kreatinin, üretici talimatlarina uygun olarak kreatinin deteksiyon kiti (Sigma) kullanilarak belirlendi. Idrar albümin ayrica %12 SDS-PAGE ile incelendi ve anti-albümin antikoru (MP Biomedicals) ile blotlandi. Mutantlarin ve kontrollerin verileri, tek yönlü ANOVA, Student t-testi ve Ki-kare testi ile analiz edildi. TR TR TR TR

Claims (1)

1.
TR2018/21294T 2012-01-05 2013-01-04 Böbrek Hastalığının Teşhisi Ve Tedavisine Yönelik Slit-robo Sinyal İletimi TR201821294T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261583379P 2012-01-05 2012-01-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201821294T4 true TR201821294T4 (tr) 2019-01-21

Family

ID=48745540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/21294T TR201821294T4 (tr) 2012-01-05 2013-01-04 Böbrek Hastalığının Teşhisi Ve Tedavisine Yönelik Slit-robo Sinyal İletimi

Country Status (30)

Country Link
US (2) US9572879B2 (tr)
EP (1) EP2800578B1 (tr)
JP (2) JP6153946B2 (tr)
KR (1) KR102103323B1 (tr)
CN (2) CN106390118B (tr)
AU (2) AU2013207484B2 (tr)
BR (1) BR112014016493A2 (tr)
CA (1) CA2860558C (tr)
CO (1) CO7020918A2 (tr)
CY (1) CY1121529T1 (tr)
DK (1) DK2800578T3 (tr)
ES (1) ES2714700T3 (tr)
HK (1) HK1202085A1 (tr)
HR (1) HRP20190116T1 (tr)
HU (1) HUE041779T2 (tr)
IL (1) IL233462B (tr)
LT (1) LT2800578T (tr)
MX (1) MX351313B (tr)
MY (1) MY170143A (tr)
PE (1) PE20141473A1 (tr)
PH (2) PH12014501538B1 (tr)
PL (1) PL2800578T3 (tr)
PT (1) PT2800578T (tr)
RS (1) RS58517B1 (tr)
RU (1) RU2674153C2 (tr)
SG (2) SG11201403746SA (tr)
SI (1) SI2800578T1 (tr)
SM (1) SMT201900116T1 (tr)
TR (1) TR201821294T4 (tr)
WO (1) WO2013103811A2 (tr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9700593B2 (en) * 2013-06-04 2017-07-11 The Hospital For Sick Children Methods and uses of slit for treating fibrosis
US11101021B2 (en) * 2014-08-08 2021-08-24 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Electronic phenotyping technique for diagnosing chronic kidney disease
WO2017213435A1 (ko) * 2016-06-08 2017-12-14 재단법인 아산사회복지재단 Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
KR102011957B1 (ko) 2016-06-08 2019-08-19 재단법인 아산사회복지재단 Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
JP7011832B2 (ja) 2016-10-11 2022-01-27 国立大学法人徳島大学 腎臓様組織の製造方法
CN110506206A (zh) * 2017-03-25 2019-11-26 柏林夏瑞蒂医科大学 作为肾脏疾病的生物标志物的尿液流式细胞术
CN108929383B (zh) 2017-05-26 2021-10-15 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 重组Slit2D2(C386S)-HSA融合蛋白及其在预防和/或治疗肺部炎症中的应用
SG10201913194WA (en) 2017-06-02 2020-03-30 Pfizer Recombinant robo2 proteins, compositions, methods and uses thereof
JP7270557B2 (ja) * 2017-06-09 2023-05-10 ファイザー・インク 抗ｒｏｂｏ２抗体、組成物、方法、およびその使用
US11406682B2 (en) 2017-08-24 2022-08-09 Bar-Ilan University Roundabout (Robo) receptor inhibitors and uses thereof
CN108753818B (zh) * 2018-04-24 2022-01-28 深圳市第二人民医院 RNA信号连接器、靶mRNA翻译调控方法、逻辑门及应用
US20210189455A1 (en) * 2018-06-15 2021-06-24 Microba Ip Pty Limited Methods for sample preparation and microbiome characterisation
WO2020219592A1 (en) * 2019-04-23 2020-10-29 The Regents Of The University Of California Compositions and methods useful in promoting milk production
EP3998090A4 (en) 2020-05-29 2023-08-02 Rokit Healthcare Inc. KIDNEY TREATMENT COMPOSITION USING OMENTUM, MEDICAL TREATMENT KIT THEREOF AND KIDNEY TREATMENT FILM WITH CURED PRODUCT THEREOF
CN115068480B (zh) * 2022-08-09 2023-10-20 郑州大学第一附属医院 细胞分裂周期蛋白42小分子抑制剂在制备治疗慢性肾脏病药物中的应用
CN120152711A (zh) * 2022-09-20 2025-06-13 云顶新耀医药科技有限公司 Slit2相关组合物和方法

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3536809A (en) 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3845770A (en) 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
IE58110B1 (en) 1984-10-30 1993-07-14 Elan Corp Plc Controlled release powder and process for its preparation
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5118937A (en) 1989-08-22 1992-06-02 Finnigan Mat Gmbh Process and device for the laser desorption of an analyte molecular ions, especially of biomolecules
US5045694A (en) 1989-09-27 1991-09-03 The Rockefeller University Instrument and method for the laser desorption of ions in mass spectrometry
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5591767A (en) 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
DK0700521T3 (da) 1993-05-28 2003-09-29 Baylor College Medicine Fremgangsmåde og massespektrometer til desorption og ionisering af analysander
IT1270594B (it) 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
AU729496B2 (en) * 1997-10-20 2001-02-01 Regents Of The University Of California, The Robo: a novel family of polypeptides and nucleic acids
US6365185B1 (en) 1998-03-26 2002-04-02 University Of Cincinnati Self-destructing, controlled release peroral drug delivery system
KR20030031911A (ko) 2001-04-19 2003-04-23 싸이퍼젠 바이오시스템즈, 인코포레이티드 질량 분석법과 친화성 태그를 이용한 생물분자 특성화
WO2003017177A2 (en) 2001-08-13 2003-02-27 Beyong Genomics, Inc. Method and system for profiling biological systems
EP2316853A3 (en) * 2002-03-08 2011-10-05 Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS Detection and modulation of slit and roundabout (robo) mediated angiogenesis and uses thereof
US20030199001A1 (en) 2002-04-23 2003-10-23 Pitt Aldo M. Sample preparation of biological fluids for proteomic applications
WO2007022248A2 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Methods of detection of cancer using peptide profiles
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
EA201390955A1 (ru) 2010-12-23 2013-11-29 Санофи Слитый белок robo1-fc для применения в лечении гепатокарциномы

Also Published As

Publication number Publication date
CN106390118A (zh) 2017-02-15
WO2013103811A2 (en) 2013-07-11
PT2800578T (pt) 2019-03-18
MY170143A (en) 2019-07-08
PH12014501538B1 (en) 2019-02-22
CY1121529T1 (el) 2020-05-29
IL233462A0 (en) 2014-08-31
LT2800578T (lt) 2019-02-11
CN104271197A (zh) 2015-01-07
MX2014008088A (es) 2014-09-25
DK2800578T3 (en) 2019-03-25
CO7020918A2 (es) 2014-08-11
HRP20190116T1 (hr) 2019-03-08
KR20140123516A (ko) 2014-10-22
WO2013103811A3 (en) 2014-08-28
HUE041779T2 (hu) 2019-05-28
EP2800578A2 (en) 2014-11-12
AU2018200105A1 (en) 2018-01-25
HK1202085A1 (en) 2015-09-18
MX351313B (es) 2017-10-10
EP2800578B1 (en) 2018-12-05
AU2013207484A1 (en) 2014-07-24
RS58517B1 (sr) 2019-04-30
SI2800578T1 (sl) 2019-03-29
US20150037325A1 (en) 2015-02-05
JP6153946B2 (ja) 2017-06-28
PH12018502577A1 (en) 2020-03-02
JP2015510500A (ja) 2015-04-09
IL233462B (en) 2020-05-31
RU2014132108A (ru) 2016-02-20
ES2714700T3 (es) 2019-05-29
BR112014016493A8 (pt) 2017-07-04
US10358677B2 (en) 2019-07-23
CN106390118B (zh) 2021-05-11
JP2017193559A (ja) 2017-10-26
SMT201900116T1 (it) 2019-02-28
KR102103323B1 (ko) 2020-05-29
SG11201403746SA (en) 2014-07-30
AU2013207484B2 (en) 2017-10-12
RU2674153C2 (ru) 2018-12-05
CA2860558A1 (en) 2013-07-11
CA2860558C (en) 2021-03-02
BR112014016493A2 (pt) 2021-08-10
PH12018502577B1 (en) 2021-03-26
US9572879B2 (en) 2017-02-21
US20170114412A1 (en) 2017-04-27
EP2800578A4 (en) 2015-07-15
PH12014501538A1 (en) 2014-10-08
SG10201605361RA (en) 2016-08-30
PE20141473A1 (es) 2014-11-05
PL2800578T3 (pl) 2019-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10358677B2 (en) Method for treating kidney disease with a SLIT2-binding extracellular domain of ROBO2
Hu et al. Cisplatin-mediated upregulation of APE2 binding to MYH9 provokes mitochondrial fragmentation and acute kidney injury
US11402372B2 (en) Methods for screening cereblon modifying compounds
US9541546B2 (en) Method of promoting excitatory synapse formation with an anti-Ephexin5 phospho-Y361 antibody
TW200831898A (en) Treatment of insulin resistance
JP2014095643A (ja) 炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法、並びに炎症性疾患の治療及び検査
US8492106B2 (en) Identification methods for ergothioneine transporter modulators and therapeutic uses thereof
AU2009297425A1 (en) Biomarker for microdomain disorder
CN120131968B (en) Application of Trim3 gene and/or expression product thereof in preparation of medicament for treating osteoporosis
US20230357430A1 (en) Rnf167 and castor1 as novel mtor targets
US20220307034A1 (en) Inhibiting ape2 expression in a subject treated with a drug agent that causes increased ape2 expression
JP5830329B2 (ja) 腎障害の新規マーカー
WO2024254596A1 (en) Compositions and methods for detection of aberrant cdk5 expression
JP2022500382A (ja) 膵炎を処置するための方法
WO2008153790A2 (en) Methods of modulating inflammation and compositions therefore