[go: up one dir, main page]

TR201811128T4 - Bir hedef hücrenin tersinir şekilde boyama yöntemi. - Google Patents

Bir hedef hücrenin tersinir şekilde boyama yöntemi. Download PDF

Info

Publication number
TR201811128T4
TR201811128T4 TR2018/11128T TR201811128T TR201811128T4 TR 201811128 T4 TR201811128 T4 TR 201811128T4 TR 2018/11128 T TR2018/11128 T TR 2018/11128T TR 201811128 T TR201811128 T TR 201811128T TR 201811128 T4 TR201811128 T4 TR 201811128T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
binding
receptor
reagent
cells
cell
Prior art date
Application number
TR2018/11128T
Other languages
English (en)
Inventor
Schmidt Thomas
Stemberger Christian
Dirk Busch H
Germeroth Lothar
Original Assignee
Iba Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=46682800&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201811128(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Iba Gmbh filed Critical Iba Gmbh
Publication of TR201811128T4 publication Critical patent/TR201811128T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using kinetic measurement, i.e. time rate of progress of an antigen-antibody interaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

Bu buluş, bir hedef hücrenin tersinir şekilde boyama yöntemleri ile ilgilidir. Buluş aynı zamanda en azından bir yaygın spesifik reseptör molekülünün varlığı ile tanımlanan bir hedef hücre ya da bir hedef hücre popülasyonunun izole edilme yöntemleri ile de ilgilidir. Buluş aynı zamanda buluşun yöntemlerini yürütmek için kullanılabilen kitleri de sağlar.

Description

TARFNAME BIR HEDEF HUCRENIN TERSINIR SEKILDE BOYAMA Y'ONTEMI Bulusun Alani Bu bulus, bir hedef hücrenin tersinir sekilde boyama yöntemleri ile ilgilidir. Bulus ayni zamanda en azindan bir yaygin spesifik reseptör molekülünün varligi ile tanimlanan bir hedef hücre ya da bir hedef hücre popülasyonunun izole edilme yöntemleri ile de ilgilidir. Bulus ayni zamanda bulusun yöntemlerini yürütmek için kullanilabilen kitleri de Bulusun Arka Plani Hücre tedavisinin, birkaç hastaligin tedavisi için son derece efektif oldugu kanitlanmistir. Ornek olarak, primer immünyetmezlikler, hematopoetik kök hücre transplantasyonu (HSCT) ile kürlenebilirler ve bazi Iösemiler, allojeneik HSCT ve donör lenfosit infüzyonunun (DLI) birlestirilmesi ile tam remisyon haline getirilebilir (Kolb, H.J. et al., Donor leukocyte transfusions for treatment of recurrent chronic myelogenous Ieukemia virüse özgü T hücrelerinin adoptif transferi; sitomegalovirüs (CMV) reaktivasyonundan kaynaklanan hayati tehdit eden komplikasyonlara (Riddell, SR. et al., Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones. Science tarafindan aracilik edilen lenfoproliferatif hastaliklara (Rooney, CM. et al., Use of gene-modified virus- specific T Iymphocytes to control Epstein-Barr-virus-related lymphoproliferation. Lancet edlmesi için çok etkilidir. Benzer bir sekilde, ya otolog tümör infiltre edici Ienfositlerden türetilen ya da in vitroda kültürlenen ya da tasarlanan tümör antijen yönelimli T hücreleri, gelistirilmis tedaviler için ümit verici adaylardir. Bu ilginç klinik gözlemlere bakilmaksizin, hücre tedavisinin klinik uygulamalara daha genis aktarimi hala beklemektedir. Bu, çogunlukla immünoterapi için hücre preparasyonlarini üretmek için kullanilan çogu prosedürün çok yorucu, zaman alici ve pahali oldugu gerçeginden kaynaklanmaktadir. Buna ek olarak, klinik etkilere aracilik ettigi bilinen hücre popülasyonlarinin, 'istenmeyen, hücrelerin kontamine olmasinin zararli ve bazen hayati tehdit eden yan etkilere araci olabildiginden dolayi yüksek safliklara zenginlestirilmesi gerekmektedir (allojeneik kök hücre transplantasyonu üzerinde graft versus host hastaliklarina (GvHD) aracilik eden alloreaktif T hücreleri ve/veya DLl tedavisi gibi). Adoptif sekilde aktarilan T hücrelerinin çok düsük sayilarinin zaten faydali klinik etkilere katkida bulunabildigi gösterilmis oldugundan, benzer kurallar ayni zamanda negatif yan etkilere aracilik eden hücre popülasyonlari için de uygulanacaktir. Bu nedenle, tedavi için uygulanabilir olan iyi tanimlanmis yüksek saflikta hücre popülasyonlarinin saglanmasi, hem daha efektif ve tahmin edilebilir olan bu umut verici tedavilerin yapilmasi hem de potansiyel yan etkilerin riskini düsürmek için anahtar olacaktir. Yüzey mark'orü aracili klinik hücre purifikasyonu için mevcut yöntemler genel olarak tekli parametrelere (örnegin, CD34, MHC multimerleri) dayanir. Ancak, çogu hücre popülasyonlari için - ya dogrudan ex vivoda tgüretilen ya da in vitro hücre kültürü sonrasinda - farkli yüzey mark'orlerinin bir kombinasyonu, bu hücrelerin digerlerinden tamamen ayrilmasi için gereklidir. Ornek olarak, dogal olarak meydana gelen düzenleyici T hücreleri (Tregiler), allojeneik HSCT 4 ya da otoimmün hastaliklarinin gelisimi üzerindeki akut GvHD'yi önleyebilen bir umut verici hücre alt kümesini temsil eder (Riley, J.L., June, C.H., & Blazar, BR., Human T regulatory cell therapy: take a D.A. & Fathman, C.G., Cd4+Cd25+ regulatory T cells and their therapeutic potential. Çok sayida hücre tarafindan paylasilan CD4'ün ekspresyonuna nazaran, yüksek afiniteli lL-2 reseptörü a-zincirinin (CD25) konstitütif ekspresyonu gibi ilave mark'orler, heterojenligi daha da daraltmak için gereklidir. Ancak, CD25 ayni zamanda son zamanlarda aktive edilen efektor ve bellek T hücrelerini düzenleyici olmayan hücrelerin büyük bir fraksiyonunda da ifade edilir. Bu nedenle, CD4, CD25, CD127 ve CD45RA=nin kombinasyonlarina (Miyara, M. et al., Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor. lmmunity CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-ceII lines upon in vitro olarak ilgili bu T hücre alt kümesini daha kesin olarak tanimlanmasi için önerilmistir. Mevcut durumda tüm klinik markor tabanli hücre separasyon teknikleri, bir manyetik alan içerisindeki isaretli hücre popülasyonlarini elde tutan paramanyetik boncuklardan faydalanir. Dolayisiyla, dogrudan isaretlenmis hedef popülasyonlarini kullanan pozitif zenginlestirme stratejileri en yüksek safliklari verir. Ancak, birkaç farkli markör vasitasiyla purifikasyonlarin kombinasyonlari, en yüksek saflikta belirgin hücre popülasyonlarini izole etmesi gerekmesine ragmen yine de elde etmek zordur. Ek olarak, pozitif seleksiyon sonrasinda, hem etiketler hem de boncuklar genel olarak, izole edilmis hücre popülasyonunu potansiyel olarak manipüle eden ya da fonksiyonellige/viyabiliteye negatif olarak etki eden hücre ürününde, örnegin reseptör blokaji vasitasiyla kalir. Ozellikle klinik hücre siralama ile ilgili olarak, geri kalan hücre etiketleri, hücre ürünlerinin hastalara uygulanabilirligi için önemli düzenleyici engellere sebep olur. Pozitif seleksiyon problemlerinin üstesinden gelmek amaciyla, birçok klinik hücre isleme prosedürü, deplesyon ayarlari olarak degistirilmistir. Ne yazik ki, hedef hücre safliklari genellikle zayiftir ve deplesyon yöntemleri genellikle üretim ve uygulama çalismasi yapan ve pahali olan farkli antikorlarin komplike bir kokteylini gerektirir. Antijene özgü T hücreleri gibi hücrelerin fonksiyonel izolasyonu için bir yaklasim; teknolojisi olarak adlandirilan bu tür hücrelerin tersinir sekilde boyamasi ve fonksiyonel izolasyonu ya da karakterizasyonu için bir yöntem açiklanmaktadir. WO 02/054065, US patent 5,985,658 ve Knabel et al'da açiklanan metodoloji; CMViye özgü T hücrelerinin, allojeneik kök hücre transplantasyonu sonrasinda nükseden yüksek CMV antijenemili akut lösemi hastalarina adoptif transferi için iyi üretim uygulamalari (GMP) seviyesinde peptid/I-Ek ile kompleksinin disosiasyon hizi sabitlerini açiklar. Böylelikle, örnek olarak hücre siralama sonrasinda, reseptör baglama ve boyama reaktiflerinin tüm bilesenlerinin, saflastirilmis hücre popülasyonundan serbest birakilmasina ve tamamen uzaklastirilmasina olanak saglayan hücre purifikasyonu ya da izolasyonu için bir yöntem saglanmasina yine de bir ihtiyaç vardir. Bulusun Ozeti Bir bakis açisinda, bulus, bir hedef hücreyi tersinir sekilde bir in vitro boyama yöntemi saglar, bahsi geçen hedef hücre, bir algilanabilir etiket ile bunlarin yüzeyindeki bir reseptör molekülünü içerir, yöntem asagidakileri kapsar: bahsi geçen hedef hücreyi içeren hücreler ile asagidakilerin bir karisiminin temas (i) bir reseptör baglama reaktifi olup, reseptör baglama reaktifi en azindan bir (herhangi biri) baglayici alani B içerir, burada baglayici bölge B bahsi geçen reseptör molekülüne spesifik olarak baglanir, burada baglayici alan B vasitasiyla bahsi geçen reseptör baglanma ile bahsi geçen reseptör molekülü arasindaki baglanma için yüzey plazmon rezonansi ile belirlendigi sekilde disosiasyon hiz sabiti (koff) 0,5 x 10'4 sn'1 ya da daha büyük bir degere sahiptir, reseptör baglanma reaktifi ayrica en azindan bir baglanma partneri C içerir, burada baglayici partner C, bir multimerizasyon reaktifinin bir baglayici alan Zrye baglanabilir (tersini (ii) bir multimerizasyon reaktifi olup, multimerizasyon reaktifi, reseptör baglayici reaktifinin baglayici partneri C'nin tersinir olarak baglanmasi için en azindan iki baglayici alan 2 içerir, burada reseptör baglayici reaktifi (i) ve multimerizasyon reaktifi (ii), bahsi geçen hedef hücreye baglanan multivalent baglayici kompleksleri (çok sayida) olusturur, her multivalent baglayici kompleks, bahsi geçen bir multimerizasyon reaktifina baglanan bahsi geçen multivalent baglayici kompleks, bahsi geçen reseptör baglayici reaktifine nazaran aviditede artis saglar; ve (iii) bahsi geçen multivalent baglayici komplekse baglanan bahsi geçen algilanabilir etiket, burada bahsi geçen hedef hücre, bahsi geçen multivalent baglayici kompleksin bahsi geçen hedef hücreye baglanmasi ile boyanir ve burada bahsi geçen hedef hücrenin boyanmasi, bahsi geçen reseptör baglayici reaktifin bahsi geçen baglayici partneri C ile bahsi geçen multimerizasyon reaktifinin bahsi geçen baglayici alanlari 2 arasindaki baglanmanin bozulmasi üzerine geri çevrilebilir, burada bahsi geçen reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan bahsi geçen reseptör baglayici reaktif; bir antikor, bir divalent antikor fragmani, bir monovalent antikor fragmani, antikor benzeri baglanma özellikli bir proteinli baglayici molekül ve bir MHC molekülünden olusan gruptan seçilir, burada bahsi geçen hedef hücre bir memeli hücresidir. Burada ayni zamanda bir (en azindan bir ortak spesifik) reseptör molekülü mevcudiyeti ile tanimlanan bir hedef hücre popülasyonunun izolasyonu için bu tür bir boyama yönteminin kullanilmasi da açiklanmaktadir. Burada ayni zamanda bir hedef hücrenin tersinir sekilde boyanmasi (ya da bir hedef hücrenin izole edilmesi) için bir kit de açiklanmaktadir, bahsi geçen hedef hücre, algilanabilir bir etiketli yüzey üzerinde bir reseptör molekülü içerir. Bu tür bir kit asagidakileri içerir: (i) bahsi geçen reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan bir (herhangi bir) baglayici alan B içerir, burada baglayici alan B vasitasiyla bahsi geçen reseptör baglayici reaktif ile bahsi geçen reseptör baglayici molekül arasindaki baglanma Için disosiasyon hiz sabiti (koff) yaklasik 0,5 x 10'4 sn'1 ya da daha büyük bir degere sahiptir ve reseptör baglayici reaktif, ayrica en azindan bir baglayici partner C içerir, burada baglayici partner C, bir multimerizasyon ajaninin bir baglayici alani Z ile baglanabilir (tersinir sekilde), (ii) en azindan bir multimerizasyon reaktifi, reseptör baglayici reaktifin bahsi geçen baglayici partneri C için en azindan iki baglayici alan Z içerir, burada bahsi geçen multimerizasyon reaktifinin baglayici partneri C ve bahsi geçen baglayici alanlar Z tersinir bir bag olusturabilir, (iii) reseptör baglayici reaktife (i) ve/veya multimerizasyon reaktifine (ii) bagli ya da baglanabilen bir algilanabilir etiket. Burada ayni zamanda bir reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan bir reseptör baglayici reaktifin kullanilmasi da açiklanmaktadir, reseptör baglayici reaktif en azindan bir baglayici alan B içerir, burada baglayici alan B, bahsi geçen reseptör molekülüne spesifik olarak baglanir, burada baglayici alan B vasitasiyla bahsi geçen reseptör baglayici reaktif ile bahsi geçen reseptör molekülü arasindaki baglanma için disosiasyon hiz sabiti (koff), bir hedef hücreyi tersinir sekilde bir boyama yöntemi için yaklasik 0,5 x 10'4 sn_1 ya da daha büyük bir degere sahiptir. Burada ayni zamanda bir hedef hücreyi tersinir sekilde bir boyama yöntemi de açiklanmaktadir, bahsi geçen hedef hücre, bir algilanabilir etiketli bununla ilgili bir yüzey üzerinde bir (en azindan bir) reseptör molekülü içerir, yöntem asagidakileri içerir: bahsi geçen hedef hücreyi içeren hücreler ile asagidakilerin bir karisiminin temas (i) bir reseptör baglayici reaktifin en azindan iki türü olup, reseptör baglayici reaktifin her türü en azindan bir baglayici alan B içerir, burada reseptör baglayici reaktifin herbirinin baglayici alani B, bahsi geçen reseptör molekülüne spesifik olarak baglanir, burada baglayici alan B vasitasiyla bahsi geçen reseptör baglayici reaktifin her türü ile bahsi geçen reseptör molekülü arasindaki baglanma için disosiasyon hiz sabiti (koff) yaklasik 0,5 x 10'4 sn'1 ya da daha büyük bir degere sahiptir, reseptör baglayici reaktifin her türü ayrica en azindan bir baglayici partner C içerir, burada reseptör baglayici reaktifin her türünün baglayici partneri C, bir multimerizasyon reaktifinin bir baglayici alani Ziye tersinir sekilde baglanabilirler, (ii) bir multimerizasyon reaktifi olup, multimerizasyon reaktifi, reseptör baglayici reaktifin her türünün baglayici partneri Ctnin tersinir sekilde baglanmasi için en azindan bir baglayici alan Z içerir, burada reseptör baglayici reaktif (i) ile multimerizasyon reaktifin (ii) en azindan iki türü, bahsi geçen hedef hücreye baglanan (çok sayida) multivalent baglayici kompleks olusturur, her multivalent baglayici kompleks, bir bahsi geçen multimerizasyon reaktifine baglanan reseptör baglayici reaktifin her türünün en azindan birini içerir, bahsi geçen multivalent baglayici kompleks, bahsi geçen reseptör baglayici reaktifinin her türüne nazaran aviditede artis saglar; ve (iii) bahsi geçen algilanabilir etiket, bahsi geçen multivalent baglayici komplekse baglanir, burada bahsi geçen hedef hücre, bahsi geçen multivalent baglayici kompleksin bahsi geçen hedef hücreye baglanmasi ile boyanir ve burada bahsi geçen hedef hücrenin boyanmasi, bahsi geçen reseptör baglayici reaktifin her türünün bahsi geçen baglayici partneri C ile bahsi geçen multimerizasyon reaktifinin bahsi geçen baglayici alanlari Z arasindaki baglanmanin bozulmasi üzerine geri çevrilebilir. Burada ayni zamanda bir hedef hücrenin tersinir sekilde boyanmasi (ya da izole edilmesi) için bir reaktif kiti de açiklanmaktadir, bahsi geçen hedef hücre, bir algilanabilir etiketli bununla ilgili bir yüzey üzerinde bir reseptör molekülü içerir, yöntem asagidakileri (i) bahsi geçen reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan bir baglayici alan B içeren bir reseptör baglayici reaktifin en azindan iki türü olup, burada baglayici alan B vasitasiyla bahsi geçen reseptör baglayici reaktifin her türü ile bahsi geçen reseptör baglayici molekül arasindaki baglanma için disosiasyon hiz sabiti (koff) yaklasik 0,5 x 10'4 sn'1 ya da daha büyük bir degere sahiptir ve reseptör baglayici reaktifin her türü, ayrica en azindan bir baglayici partner C içerir, burada reseptör baglayici reaktifin her türünün baglayici partneri C, bir multimerizasyon reaktifinin bir baglayici alani Z ile baglanabilir (tersinir sekilde), (ii) en azindan bir multimerizasyon reaktifi, reseptör baglayici reaktifin her türünün bahsi geçen baglayici partneri C için en azindan bir baglayici alani Z'yi içerir, burada bahsi geçen multimerizasyon reaktifinin baglanma reaktifinin her türünün baglayici partneri C ve bahsi geçen baglayici alanlari Z tersinir bir bag olusturabilir, (iii) reseptör baglayici reaktife (i) ve/veya multimerizasyon reaktifine (ii) bagli ya da baglanabilen bir algilanabilir etiket. Sekillerin Kisa Açiklamasi Bulus, sinirlayici olmayan örnekler ve ekli çizimler ile birlikte dikkate alindiginda detayli açiklama ile ilgili olarak daha iyi anlasilacaktir, burada: Sekil 1, bir (en azindan bir) reseptör baglayici reaktif olarak bir Fab fragmani kullanilarak bulusun tersinir boyama yönteminin prensibini tarif eder (bir Fab fragmani durumunda ve ayni zamanda genel olarak bulusun somut bir örneginde, reseptör baglayici reaktif, reseptör molekülü için bir tek baglayici alana sahip olabilir). Sekil 1a, bir streptavidin baglayici peptidi oldugunda reseptör baglayici reaktif olarak kullanilan bir Fab fragmaninin tasvir edici bir örnegini gösterir, Strep-tag®, reseptör baglayici reaktifin baglayici partneri C'dir. Bu somut örnekte streptavidin baglayici peptidi, reseptör baglayici reaktif olusturmak üzere Fab fragmanina kaynastirilir ya da konjuge edilir. Bu örnekte Sekil 1a'da gösterildigi gibi, bahsi geçen en azindan bir baglayici partner C için en azindan iki baglayici alan 2 içeren multimerizasyon reaktifi, streptavidin muteindie ("Strep-Tactin®"). Sekil 1arnin örneginde, multimerizasyon reaktifi, fikoeritrin gibi bir floresan etiket tasir. Sekil 1binin örneginde, yine bir Fab fragmani, etiket islevi gören bir manyetik boncuga konjuge edilen bir multimerizasyon reaktifi ile birlikte gösterilmektedir. Streptavidin baglayici peptid vasitasiyla streptavidin- mutein ile bir Fab fragmani arasindaki multivalent baglayici kompleks formasyonu kullanilan tersinir boyama yöntemi ayni zamanda bundan böyle "Fab-multimer boyama" olarak anilacaktir. Sekil 1c, bu tersinir Fab-multimer boyama yönteminin sematik bir genel bakisini tarif eder. Bu örnekte, hedef hücreler, bir kan numunesinde mevcut olan hücrelerin bir karisimindan boyanir/izole edilir. Bir hedef hücrede mevcut olan bir hücre reseptör molekülüne baglanmasi için yaklasik 0,5 x 10-4 sn*1 ya da daha büyük bir koff hizinda Fab fragmanlari, Strep-tag®/Strep-Tactin® kompleks formasyonu ile tersiniz sekilde multimerizedir. Hedef hücreler, multivalent baglayici kompleks ile (Sekil 1c adim a)'da gösterildigi gibi multimerizasyon reaktifi ve reseptör baglayici reaktif ile hücrelerin temas etmesi yoluyla) boyanir ve opsiyonel olarak örnegin, floresan ile aktiflestirilen hücre siralama yoluyla ayni kökenli hücre yüzeyi reseptör molekülünden yoksun olan diger hücrelerden ayrilir (Sekil 1c adim b),de "FACSTM" ticari markasi altinda da bilinmektedir). Strep-tag® peptid ile rekabet eden Strep-Tactin® ligand D-biyotin ile izole edilmis boyali hedef hücrelerin sonraki tedavisi, Fab fragmanlarinin multimerizasyon reaktifinden deplasmanina, dolayisiyla multimerizasyon reaktifinin (Strep-Tactin®) hedef hücreden salinmasina sebep olur (Sekil 1c adim c)*de gösterildigi gibi). Strep-Tactin®'den (spontane olarak) kompleks olmayan kalan Fab fragmanlari, yüksek koff hizindan dolayi makul bir zaman araliginda birbirinden ayrilir ve yikama ile hedef hücre yüzeyinden tamamiyla kaldirilabilir (Sekil 1c adim d)). Yikama, Fab fragmani ile ayni kökenli hücre yüzeyi reseptör molekülü arasindaki baglanma için en azindan afinite dissiasyon sabitine (Kd) esit olan bir konsantrasyon için her yikama adimi süresince Fab fragmanlarini seyrelten bir hacimde yürütülebilir. Sekil 1d, multimerizasyon reaktifinin manyetik bir boncukta konjuge edildigi ve boyama/separasyon adiminin, boyanmis hücrelerin baglandigi manyetik bir kolon vasitasiyla boyanmis hücrelerin boyanmamis hücrelerden ayrilmasini kapsayan Sekil 1crdekine benzer bir boyama prosedürünü gösterir. Sekil 2, tersinir Fab-multimer boyama için gerekli olan baglanma karakteristiklerini gösterir. Sekil 2, Fab fragmanlarinin bir reseptör molekülü olarak CD4'e baglanmasi için koff hizlarinin arttirilmasi ile farkli anti-CD4 Fab mutantli anti-CD4 Fab-multimer boyamanin bir FACS analizini gösterir (Fab fragmanlarinin baglanma kinetiklerinin bir özeti Tablo 1rde listelenmektedir). Periferik Kari Mononükleer Hücreleri (PBMC'Ier); ardisik bir düzende iki Strep-tag® sekansina ("One-STrEP-tag" ticari markasi altinda ticari olarak temin edilebilir; baglayici partner C) kaynasan anti-CD4 Fab fragmanlari (reseptör baglayici reaktif) ile boyanmis ve fikoeritrin isaretli Strep-Tactin® (Strep-Tactin PE; IBA GmbH, Göttingen, Germany; baglayici partner C için en azindan 2 baglayici alan Z içeren multimerizasyon reaktifi) üzerinde multimerize edilmis ve ya D-biyotin ile tedavi öncesinde (ikinci kolon) ya da sonrasinda (üçüncü kolon) analiz edilmistir. Hedef hücre yüzeyi üzerinde kalan Fab-monomerleri (baska bir deyisle, reseptör baglayici reaktif olarak kullanilan Fab fragmanlari) daha sonra tek basina Strep-Tactin PE kullanilarak (Fab fragmanlarina baglanmadan) Fab monomerlerini kaldirmak için sonraki yikama adimlari sonrasinda tespit edilmistir (dördüncü kolon). Hücrelerin yukarida açiklanan tersinir boyanmasi sonrasindaki Fab-multimer boyanmasi, dördüncü kolona gösterildigi gibi tek basina Strep-Tactin PE (Fab fragmanlarina baglanmadan) ile kalan Fab-monomerlerinin boyanmasini aksi durumda engelleyen ve böylece deneyin yanlis bir sonuca yol açmasina sebep olan biyotin gidermenin tamamlanmasinin kontrol edilmesi için tekrar yapilmistir (besinci kolon). Alternatif olarak, hücreler; monomerik Fab fragmanlari ile inkübe edilmis, yikanmis ve akabinde Strep-Tactin® PE (birinci, baska bir deyisle len soldaki kolon) ile boyama sonrasinda analiz edilmistir. Canli CD3+ T hücreleri gösterilmektedir. Nokta çizimlerinin sayilari, kapak içerisindeki hücrelerin yüzdesini gösterir. Sekil 3, Sekil 2rnin FACS analizine alternatif olarak Fab-multimer boyamanin tersinirliginin bir Western blot analizini gösterir. CD4 Fab-multimerleri, Tablo 1ide listelenen ve ayrica Sekil 2'de belirtilen farkli anti-CD4 Fab-mutantlari ve Strep-Tactin® PE (IBA GmbH, Göttingen, Germany) ile üretilmistir. PBMC'ler farkli CD4 Fab- multimerleri ile inkübe edilmistir ve her numunedeki uygun hücre boyama, akis sitometrisi ile dogrulanmistir (boyanmamis hücreleri temsil eden hafif boyali histogram ile karsilastirildiginda düz çizgi). Daha sonra, hücreler, D-biyotin ile tedavi edilmis ve akabinde yikanmistir. En sonunda, yikanmis hücreler Iize edilmis ve çözünen (S) ve çözünmeyen (l) fraksiyonlar, son derece spesifik anti-Strep-tag® antikorlari (StrepMAB- Classic Horse Radish Peroxidase (HRP) conjugate; IBA GmbH, Göttingen, Germany) kullanilarak kalan Fab monomerleri için analiz edilmistir. Çözünmeyen hücre malzemesinin uygun miktarlarinin uygulanmasinin kontrol edilmesi için, ß-aktin, tavsandan elde edilen ß-aktin'e (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, USA) karsi bir primer antikor ve HRPtye (Sigma, St. Louis, USA) konjuge edilen tavsan lgrye (immunoglobulin) karsi bir sekonder antikor ile eszamanli olarak tespit edilmistir. Bulusun Detayli Açiklamasi Bu bulus, hücre yüzeyi üzerinde bir reseptör molekülüne sahip olan bir hedef hücre ya da bir hedef hücre popülasyonunun tersinir sekilde boyanmasi için bir yöntem saglar. açiklanan yöntemlerin aksine bulguya dayanmaktadir, düsük afiniteli bir baglanmanin, hedef hücrenin yüzeyi üzerinde bir reseptör baglayici reaktif ile bir reseptör molekülü arasinda verildigi bu tür bir yöntemin tersinirligi için esas degildir. Daha ziyade mevcut bulusta baglanma gücüne bakilmaksizin, reseptör baglayici reaktif ile reseptör molekülü arasindaki baglanma için disosiasyon sabitinin (Kd); örnek olarak, yaklasik 10'3 ila yaklasik 10_7 M araliginda düsük bir afiniteye ya da örnek olarak, yaklasik 10'7 ila yaklasik 1 x 10'1 0 M araliginda yüksek bir afiniteye sahip olup olmadigi anlasilmistir, bir hedef hücre, baglayici alan B vasitasiyla reseptör baglayici reaktifinin ve reseptör molekülünün baglanma disosiasyonunun yeterince hizli meydana gelmesi sartiyla tersinir sekilde boyanabilir. Reseptör baglayici reaktif (baglayici alan B vasitasiyla) ile reseptör molekülü arasindaki baglanma için koff hizi (disosiasyon hiz sabiti olarak da adlandirilir) açisindan ifade edilirse, koff hizi; yaklasik 0,5 x 10-4 sn'1 ya da daha büyük, ya da daha büyük, yaklasik 1 x 10'2 sn'1 ya da daha büyük ya da yaklasik 5 x 10'1 sn- 1 ya da daha büyüktür. Burada koff hizi, kon hizi ya da kd ile ilgili olarak kullanildiginda da ± %20,0'lik bir hata payi içerdigi anlamina gelmektedir. Bu baglamda, bir reseptör baglayici reaktif L ile kendi reseptör'u P, örnek olarak, bir hücre yüzey reseptör molekül'u arasindaki kompleksin (C) formasyonunun, iki durumlu bir proses ile tanimlanabildigi dikkate alinir Ilgili disosiasyon Kd sabiti asagida oldugu gibi tanimlanir 1\.d : burada [P], [L] ve [0]; reseptör, reseptör baglayici reaktif (Iigand) ve verilen bir sicaklik ve basinçtaki ilgili bir kompleksin denge molar konsantrasyonlaridir. Disosiasyon Kd sabiti ayni zamanda kompleksin asosiasyon/formasyon hizi için giris orani (kon) sabitinin (asosiasyon hiz sabiti olarak da adlandirilir) asagidaki denklem ile gösterilen kompleksin disosiasyonu için giris orani (koff) sabitinin orani olarak da ifade edilebilir Kd = koff/kon Bu uygulamada, termodinamik ve kinetik Ka, Ka, kon ve koff sabitlerinin degerleri, atmosferik basinçtaki kararliliklarini ifade eder. Bu bulusta, yukarida bahsedildigi sekilde, spesifik baglayici alan B vasitasiyla reseptör baglayici reaktifin reseptör molekül'une baglanmasi için koff hizinin [84], baska bir baglayici partner Crye sahip olan ilgili bir reseptör baglayici reaktif tarafindan bir hedef hücrenin baglanmasinin tersinirligi için belirleyici oldugu bulunmustur, burada baglayici partner C, burada tanimlandigi gibi bir multimerizasyon reaktifi vasitasiyla baglanabilir. koff araligi, örnek olarak boyanacak ve opsiyonel olarak saflastirilacak hedef hücreye ve ilgili deneysel kosula bagli olacak bir aralik dahilinde seçilebilir. Reseptör baglayici reaktifi L ile reseptör molekülü P arasindaki kompleksin (C) yarilanma ömrü Tiiz'nin, 0,5 x 10'4 sn'l'lik bir koff ile ln2/kori = 0,693/k0ff olarak ifade edilebildigi göz önüne alinacak olursa, farzi mahal dilüsyonun, disosiye reseptör baglayici reaktifin reseptör molekül'une yeniden baglanmasinin ihmal edilebildigi için yeterli oldugu durumda, reseptör baglayici reaktif ile reseptör molekül'u arasindaki kompleksin konsantrasyonunun yari yariya konsantrasyonundaki ayni azamlayi elde etmek 'üzere 1,0 x 10'4 sn'1'lik bir koff hizi için, hizi için 3465 saniye (ya da 57 dakika. Baska bir deyisle 1 saatten daha az) alir ve 4,0 x boyanmis hedef hücrelerin numunedeki diger hücrelerden ayrilmasi sonrasinda ve multimerizasyon reaktifi ile reseptör baglayici reaktif arasinda olusturulan multivalent kompleksin bozulmasin sonrasinda yürütülen yikama için, hücre reseptör baglayici reaktif, dis etkilere boyanacak olan hücrenin hassasiyetine bagli olarak seçilebilir. Ornek olarak, oldukça hassas bir hücre için, örnek olarak, 4,0 x 10-4 sn-1'den daha büyük oldukça yüksek bir koff hizinda bir reseptör baglayici reaktif, multivalent baglayici komplekslerin bozulmasi sonrasinda kullanilabilir, reseptör baglayici reaktifin çogu bir saat içerisinde giderilebilir (yukarida tasvir edildigi sekilde, 56 dakika içerisinde komplekslerin konsantrasyonu, yeniden baglanma etkilerinin yeterli dilüsyondan dolayi ihmal edilebilidigi farzedilerek orijinal konsantrasyonun %25'ine azaltilir). Daha dayanikli bir hücre için, buna uygun olarak disosiasyonu için daha fazla zamana ihtiyaç duyan, örnek olarak, 1,0 x 10'4 sn'l'lik daha düsük bir koff hizinda bir reseptör baglayici reaktif kullanilabilir (bu durumda, reseptör molekülü baglanma reaktifinin ayrismasi ve %75rinin giderilmesi için 212 dakika ya da yaklasik 3,5 saat gereklidir). Multimerizasyon reaktifinin disosiasyonu sonrasinda (örnek olarak, baglayici partner C ile multimerizasyon reaktifi arasindaki tersinir bagi bozabilen bir rakip vasitasiyla), yikama ayni zamanda disosiasyon sabitinin (Kd) altinda en azindan 10*Iuk bir faktörde bir konsantrasyon için kullanilan reseptör baglayici reaktifi seyrelten bir tampon hacminde yarilanma ömrü T1i2*nin en azindan 2 defa sabit hafif ajitasyon altinda da meydane gelebilir. Ayrismis reseptör baglayici reaktif daha sonra örnek olarak, hedef hücrelerin sedimentasyonu ve süpematantin atilmasi yoluyla giderilir. Alternatif bir somut örnekte, reseptör baglayici reaktifin tamamlanmaya yakin giderilmesi için bir defa ya da iki defa ya da birkaç defa yukarida açiklanan yikamanin tekrar edilmesi mümkündür. Bu baglamda, boyanmis hedef hücreler ile ilgili olarak burada kullanildigi haliyle "yikama" teriminin; boyanmis hedef hücrelerin yikama tamponunun yeterli bir miktari ile temas ettigi (multivalent baglayici komplekslerinin bozulmasi ile birlikte ya da multivalent baglayici komplekslerinin bozulmasi sonrasinda), reseptör baglayici reaktifin reseptör molekülünden disosiasyonu için uygun bir zaman periyodu boyunca yikama tamponu ile inkübe edildigi ve daha sonra uygun bir prosedür ile, örnek olarak, hedef hücrelerin sedimentasyonu ve süpematantin giderilmesi ya da örnek olarak yikama tamponunun filtrasyonuyoluyla yikama tamponundan ayrilmasi (böylelikle ayrismis reseptör baglayici reaktif giderilir) anlamina geldigi dikkate alinir. Yikama genellikle boyanacak ya da izole edilecek hücrelerin viyabilitesi ya da durumu üzerinde bir yan etkiye sahip olmayan tamponda yürütülür, baska bir deyisle yikama, fizyolojik olarak kabul edilebilir kosullar (örnegin, fizyolojik olarak kabul edilebilir tampon, uygun sicaklik, örnek olarak, 4"C, °C ya da 250, (ba ska bir deyisle oda sicakligi) vb.) altinda gerçeklestirilir. Uygun deneysel yikama kosullari, teknikte ortalama beceriye sahip bir kisi tarafindan ampirik olarak kolaylikla belirlenebilir. Ornek olarak, eger koff, 0,5 x 10'4 sn'1'e yakin nispeten yüksek bir degere sahipse ve boyanmis hücreler daha yüksek sicakliga (nispeten) duyarsiz ise, yikama, reseptör baglayici reaktifin boyanmis hücrelerden daha hizli disosiasyonuna olanak saglamak için oda sicakliginda yürütülebilir. Alternatif olarak, eger boyanmis hücreler daha yüksek sicakliga duyarli ise, yikama &C'de yürütülebilir, böylece reseptör baglayici reaktifin disosiasyonu/giderilmesi daha uzun zaman alir ancak hücrelerin fonksiyonel durumu ya da viyabilitesi etkilenmeyecektir. 4*C'lik ya da en azindan 15°Cfnin altinda bir sicaklik, hedef hüc relerin fizyolojik durumunda herhangi bir degisiklige engel olmak için bazi somut örneklerde tercih edilir. Bu baglamda, yaklasik 0,5 x 10'4 sn'1 ya da daha büyük bir toplam koff degerine sahip baglayici alan(lar) B,nin (her biri) vasitasiyla reseptör molekülünün baglanmasi sartiyla, reseptör baglayici reaktifin, reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan bir (herhangi bir) tek baglayici alan B*ye sahip olabildigi ya da reseptör baglayici reaktifin ayni zamanda bu tür iki ya da daha fazla baglayici alan Biye de sahip olabildigi dikkate alinir. Böylelikle, reseptör baglayici reaktif, monovalent (örnek olarak, bir monovalent antikor fragmani ya da Iipokalin familyasinin ("Anticalin®" olarak da bilinir) bir polipeptidine dayanan bir mutein gibi bir monovalent yapay baglayici molekül (proteinli ya da diger)) ya da F(ab')2 fragmani gibi tutulan her iki baglayici alandakibir antikor ya da bir fragman gibi bir bivalent molekül olabilir. Reseptör baglayici reaktif, IgM molekülünün 0,5 x 10'4 sn'1 ya da daha büyük oldugu bir koff hizini saglayan bir pentamerik lgM molekülü bile olabilir. Reseptör baglayici reaktifin reseptör molekülüne baglanmasi için koff hizi ve tabii ki ayrica kon hizi; örnek olarak, BIAcore technology (SPR; Jonsson, U. et al. (1991) Biotechniques, 11, gibi standart yöntemler vasitasiyla belirlenebilir. Bu saptama, teknikte becerikli bir kisinin ortalama bilgisi dahilindedir. Genel olarak, saptama, ilgili bir sensör çipinin yüzeyin üzerinde immobilize edilmis reseptör molekülü ile reseptör baglayici reaktifinin uygun bir konsantrasyonunda yüzey plazmon rezonans analizi ile 25 °Ode yürütülür. Ligand (baska bir deyisle, reseptör baglayici reaktif), örnek olarak, bir Fab fragmani, pI/dak araliginda akis hizlari kullanilarak farkli konsantrasyonlarda çip üzerine uygulanir (genel olarak baslangiç karakterizasyonlarindan belirlendigi sekilde tahmin edilen Kd degeri civarinda). Açiklayici bir örnek olarak, CD4'ün (bir reseptör molekülü olarak) monoklonal antikor 1388.2'den türetilen Fab fragmanlarina baglaniminin koff hizinin saptanmasi bu baglamda tercih edilmektedir. US patent 7,482,0001de ya da Bes, C., et al.. J Biol Chem parametreler, bir BIAcore 2000 instrument (BlAcore AB, Uppsala, Sweden) kullanilarak yüzey plazmon rezonans analizi ile 25 cC'de belirle nebilir. Rekombinant CD4, imalatçi talimatlarina göre amin akuple yöntemi kullanilarak bir CMS sensör çip yüzeyi üzerine kovalent olarak immobilize edilebilir. Bir kontrol referans yüzeyi, CD4iün enjeksiyonu olmadan akis hücresi yüzeyinin ayni kimyasal tedavisi kullanilarak hazirlanabilir. 10 mM (BlAcore AB) içeren tampondaki rekombinant Fab mutantlari daha sonra akis hücresi üzerine 5 ile 20 ug/ml arasindaki konsantrasyonlarda enjekte edilebilir ve disosiasyon fazi, 5 mM HCl çözeltisi ile bir rejenerasyon adimini takip edecektir. Akis hizi 30 ul/dak*ya ayarlanabilir. Tüm sensorgramlar, sinyalin kontrol referans yüzeyinden çikarilmasi ile düzeltilebilir. Veriler daha sonra BlAevaluation Version 3.2 yazilimi kullanilarak bir 1:1 Langmuir baglanma izotermine global olarak yerlestirilebilir. Baska bir açiklayici örnek olarak Schlapschy, M., et al. "Functional humanization of an anti-CD30 Fab fragment for the immunotherapy of Hodgkin's lymphoma using an in vitro rezonans ile ölçüldügü sekilde rekombinant CD30A antijen fragmani için anti-CD30 Fab fragmanlarinin koff hizinin saptanmasi tercih edilir. Bu saptama, bir BIAcore X sistemi (BlAcore, Uppsala, Sweden) üzerinde gerçeklestirilmistir. Jel filtrasyonu vasitasiyla 10 mM sodyum asetat pH 3,85ie tampon degisimi sonrasinda, saflastirilmis CD3OA, 50 ug/mliye seyreltilmis ve 1700 tepki birimlerinde (RU) immobilizasyona yol açan amin akuple kiti (BlAcore) kullanilarak bir 'arastirma sinifi' CMS sensör çipi üzerine immobilize edilmistir. Saflastirilmis rekombinant Fab fragmanlari, bir dizi uygun konsantrasyonda PBS/Piye (% uygulanmistir. Kompleks formasyonu, 5 ul/daktlik bir sürekli tampon akisi altinda gözlenmistir. Sensogramlar, sirali sekilde kullanilmis olan bos kanali kontrol etmek için ölçülen ilgili sinyallerin çikarilmasi ile düzeltilmistir. Çip, 25 uI/dak'lik bir akis hizinda 1 mM NaOHrin 2 ml'Iik bir darbesi uygulanarak rejenere edilmis, bunun ardindan da PBS/P ile dengelenmistir. Kinetik parametreler, sürüklenen referans hatti ile bir ile yeniden belirlenebilir. Yukarida bahsedildigi gibi, bulusun yöntemine geri dönülerek, hücre yüzeyi reseptör molekülü için reseptör baglayici reaktifin afinitesi, düsük afiniteye sahip olmak zorunda degildir. Daha ziyade (Deneysel Bölüme de bakiniz), bahsi geçen reseptör baglayici reaktif ile bahsi geçen reseptör molekülü arasindaki baglanma için disosiasyon sabiti (Kd); multivalent baglayici komplekslerin bozulmasi sonrasinda olmasi sartiyla, yaklasik olabilir, koff, bir zaman diliminde ve hücrenin lekelenmesi ya da izole edilmesi için kabul edilebilir olan yikama kosullari altinda reseptör baglayici reaktifin giderilmesine izin verir. Somut bir örnekte, bahsi geçen reseptör baglayici reaktif ile bahsi geçen reseptör molekülü arasindaki baglanmas için disosiasyon sabiti (Kd); yaklasik 10"7 M ila yaklasik olabilir. Bu baglamda yaklasik 5 x 106 M'1s'1*e kadar kon hizlarinin, antibokorlar ya da Fab fragmanlari gibi immünoglobulinlerin ilgili antijene (örnek olarak, bakiniz, Lee et al., 1s'1'lik kon degerlerini rapor eder (Kwong et al., supra'da Tablo 1'e bakiniz). Buna uygun olarak, bir Fab fragmani gibi bir reseptör baglayici reaktifin, reseptör moleküle oldugunu ve koff, 5 MG'4 M oldugunu farzedersek, bu tür antikor molekülleri (ya da genel olarak reseptör baglayici reaktifleri), bulusun tersinir boyama yönteminde bir Kd'li bir afiniteye ragmen, reseptör baglayici reaktif ile reseptör molekülü arasindaki kompleksin konsantrasyonunu yari yariya düsürmek sadece 1386 saniye ya da 23 dakika sürer). Ayni sekilde, baska bir açiklayici örnek olarak, eger reseptör baglayici reaktif, reseptör molekülünün baglanmasi için 5 x 105 M'1s'1'lik bir kon degerine ve 1 x '9'luk bir Kd degerine sahipse, koff da 5 x 10'4 M ise, multivalent baglayici komplekslerin bozulmasi sonrasinda, reseptör baglayici reaktifin hedef hücreden çok hizli disosiasyonuna da yol açar. Bu baglamda, antikor fragmanlari ya da örnek olarak, olarak, faj göstergesi gibi evrimsel yöntemlerin kullanilmasi yoluyla mümkün olur (bu bakimdan, Lee et al., supra ile karsilastirin). Böylelikle, eger istenirse, arzu edilen kinetik özelliklerde reseptör baglayici reaktifler, bu tür evrimsel yöntemler vasitasiyla amino asit sekansi bilinen bir baslangiç molekülünden elde edilebilir. Burada açiklanan yöntemde reseptör molekülü için düsük bir afiniteye sahip olan bir reseptör baglayici reaktifin kullanilmasi da mümkündür, reseptör baglayici reaktif ile reseptör molekülü arasindaki baglanma için disosiasyon sabiti (Kd) daha sonra 10-2 ila 10-7 M'Iik bir aralikta olabilir. Boyama yöntemi ayrica boyanmis hücrenin bir numune/hücre karisiminda mevcut olan hedef olmayan hücrelerden ayrilmasini kapsar. Separasyon, US patent 7,776,562 ya da Uluslararasi Patent basvurusu WO 021054065ite açiklandigi sekilde yürütülebilir ve ayrica reseptör baglayici reaktifin baglayici partneri C ile multimerizasyon reaktifinin baglayici alanlari Z arasindaki baglanmanin bozulmasi ile bahsi geçen hücreden bahsi geçen boyamanin kaldirilmasini da içerebilir. Bu bag tersinir olmalidir, baska bir deyisle bag, talep edilen yöntemi yürütmek için uygun kosullar altinda bozulabilmelidir. Bahsi geçen baglayici partner C ile bahsi geçen baglayici alanlar 2 arasindaki baglanma için disosiasyon sabiti (Kd); örnek olarak, yaklasik 10'2 M ila yaklasik 10-13 Mrlik bir aralikta olabilir. Böylelikle, bu tersinir bag; örnek olarak, yaklasik 10-2 M ile yaklasik 10-13 M arasinda ya da yaklasik 10'5 M ile yaklasik 10'3 M arasinda ya da yaklasik 10'6 M ile arasinda bir Ka degerine sahip olabilir. Ayni zamanda bu bagin Kd degeri; herhangi bir uygun araç vasitasiyla, örnek olarak, reseptör baglayici reaktif ile reseptör molekülü arasinda olusturulan bag için koff hizinin saptanmasi ile baglantili olarak yukarida açiklandigi sekilde floresan titrasyonu, denge diyalizi ya da yüzey plazmon rezonans vasitasiyla belirlenebilir. Hücrelerden multimerizasyon reaktifinin boyamasinin disosiasyonu/giderilmesi, ayrismis reseptör baglayici reaktifinin ve dolayisiyla daha önce boyanmis hücreden elde edilen algolanabilir etiketi içeren tüm multivalent baglayici kompleksin giderilmesine yol açar. Reseptör baglayici reaktiften giderilmesine olanak saglanmasi amaciyla, ilgili bir yikama tamponunun hacmi, ilave edilen reseptör baglayici reaktifin konsantrasyonunu ayni kökenli reseptör molekülü ile etkilesim için büyük ölçüde Kd'nin altinda bir konsantrasyona getirecek sekilde kullanilabilir. Alternatif olarak, yikama, düsük hacimlerde birkaç defa tekrar edilebilir ve hafif ajitasyonun hemen yeniden baglanmayi önlemesi arzu edilebilir. Somut bir örnekte, yikama tamponunun hacmi, reseptör baglayici reaktifin konsantrasyonunu Karnin altina ya da daha da tercih edilebilir olarak Kd'nin 1/10'unun altinda bir konsantrasyona düsürecek sekilde kullanilir, böylece reseptör baglayici reaktifin %90'dan daha fazlasi ayrismis formda (baska bir deyisle, reseptör molekülüne baglanmaz) ya da daha da tercih edilebilir olarak Kd*nin 1/100'ünün altinda bir konsantrasyonda mevcuttur, böylece reseptör baglayici reaktifin %997dan daha fazlasi ayrismis formda ya da daha da tercih edilebilir olarak Kdtnin 1/1000'inin altinda bir konsantrasyonda mevcuttur, böylece reseptör baglayici reaktifin %99,9idan daha fazlasi ayrismis formda mevcuttur. Bulusun bazi somut örneklerinde, reseptör baglayici reaktif; en azindan bir baglayici partner C içerecek sekilde ve multimerizasyon reaktifi, baglayici partner C için en azindan iki baglayici alan 2, en azindan üç ya da en azindan dört baglayici alan 2 içerecek sekilde seçilir. Alternatif somut örneklerde, iki farkli reseptör baglayici reaktifinin (türlerinin) kullanilmasi mümkündür. Bu iki reseptör baglayici reaktifin her biri, ayni ya da farkli bir baglayici alan B vasitasiyla ayni reseptör molekülüne baglanir (sonraki durum için, reseptör baglayici reaktifin ayirt edilmesi ve böylelikle ayni reseptör molekülü üzerindeki farkli epitoplara baglanmasi mümkün olur). Ek olarak, iki reseptör baglayici reaktifin her biri en azindan bir baglayici partner C'ye sahiptir ve multimerizasyon reaktifi, iki farkli reseptör baglayici reaktifin her birinin baglayici partneri C için en azindan bir baglayici alani Z'ye sahiptir. Ornek olarak, her biri ayni baglayici alan B vasitasiyla ayni reseptör molekülüne baglanan ancak farkli baglayici partner C1 ve C21ye sahip olan iki farkli reseptör baglayici reaktifin kullanilmasi mümkündür. Ornek olarak, bir reseptör baglayici reaktif, bir hekzahistidin etiketi gibi bir baglayici partner C1'e sahip olabilir ve diger reseptör baglayici reaktif, bir FLAG etiketi gibi bir baglayici partner C2'ye sahiptir. Bu gibi durumlarda, multimerizasyon reaktif, baglayici partner C1 için sadece bir baglayici alan (21) ve baglayici partner C2 için sadece bir baglayici alan içerebilir. Toplamda iki baglayici alan, multimerizasyon reaktifinde mevcut oldugundan dolayi, bir avidite etkisi yine de elde edilir. Bu tür bir multimerizasyon reaktifi; örnek olarak, bir anti-FLAG antikorunun bir Fab fragmaninin ve bir anti-hekzahistidin etiket antikorunun bir Fab fragmaninin konjuge edildigi bir biyouyumlu polimer (örnek olarak, dekstran ya da baska bir polisakkarit) olabilir (multimerizasyon reaktiflerinin detayli bir açiklamasi için asagiya bakiniz). Sadece bir ya da iki ya da daha fazla baglayici partner C ile bir ya da iki reseptör baglayici reaktifin bulusta kullanilip kullanilmadigina bakilmaksizin, baglayici partner C ile multimerizasyon reaktifinin herhangi bir kombinasyonu; US patent 7,776,562 ya da Uluslararasi Patent basvurusu W002/054065,te de açiklandigi gibi, multimerizasyon reaktifinin baglayici partneri C ile baglayici alani Z, bir avidite etkisine sebep olmasi için bir (multivalent) komplekste tersinir sekilde multimerize olabilmesi kosuluyla seçilebilir. Bazi açiklayici somut örneklerde, partnerler, asagidaki gruptan seçilebilir: (a) biyotin içeren baglayici partner C ve biyotine tersinir sekilde baglanan bir streptavidin analogu ya da bir avidin analogu içeren multimerizasyon reaktifi, (b) streptavidin ya da avidine tersinir sekilde baglanan bir biyotin analogu içeren baglayici partner C ve streptavidin, avidin, bir streptavidin analogu ya da bahsi geçen biyotin analoguna tersinir sekilde baglanan bir avidin analogu içeren multimerizasyon reaktifi, ya da (0) streptavidin ya da avidin baglayici peptit içeren baglayici partner C ve streptavidin, avidin, bir streptavidin analogu ya da bahsi geçen streptavidin ya da avidin baglayici peptidine tersinir sekilde baglanan bir avidin analogu içeren multimerizasyon reaktifi. Bu somut ornekserin bazilarinda, baglayici partner C, streptavidin-baglayici peptid Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-GIu-Lys içerebilir ve bahsi geçen multimerizasyon reaktifi, örnek olarak, streptavidin analogu Val44-Thr45- her ikisi de US patent 6,103,493'te açiklanmaktadir ve Strep-Tactin® ticari markasi altinda ticari olarak temin edilebilir. Streptavidin baglayici peptidler; örnek olarak, US patent 5,506,121'de açiklanan "Strep-tag®" gibi tek peptitler olabilir ya da örnek olarak, Uluslararasi Patent Basvurusu WO 02/077018tde açiklandigi gibi iki ya da daha fazla bireysel baglanma modüllerinin ardisik bir düzenlemesine sahip olan streptavidin baglayici peptidler olabilir. Sadece bir baglayici partner Cinin kullanildigi diger somut örneklerde, baglayici partner C ile bahsi geçen multimerizasyon reaktifinin bahsi geçen en azindan 2 baglayici alani 2 arasindaki baglanma, bir divalent kayton varliginda meydana gelir. Bu tür bir somut örnegin açiklayici bir örneginde, baglayici partner C bir kalmodulin baglayici peptid içerir ve multimerizasyon reaktifi, örnek olarak, US Patent 5,985,658'de açiklandigi sekilde multimerik kalmodulin içerir. Alternatif olarak, baglayici partner C bir FLAG peptid içerebilir ve bahsi geçen multimerizasyon reaktifi; bir FLAG peptide, örnegin US peptide baglanan bir antikor içerebilir. Yine baska bir açiklayici örnekte, baglayici partner C, bir oligohistidin etiketi içerir ve multimerizasyon reaktifi, oligohistidin etiketine baglanan bir antikor ya da bir geçis metali iyonu içerir. Bu baglanma komplekslerinin tümünün bozulmasi; metal iyon selasyonu, örnegin kalsiyum selasyonu vasitasiyla, örnegin EDTA ya da EGTA'nin ilave edilmesi ile tamamlanabilir. Kalmodulin, 4E11 gibi antikorlar ya da selatli metal iyonlari ya da serbest selatörler; geleneksel yöntemler ile, örnegin, streptavidin ya da avidin ya da bunlarin multimerleri ile biyotinilasyon ve kompleksleme yoluyla ya da karboksil kalintilarinin bir polisakkaride, örnegin, dekstrana yerlestirilmesi yoluyla, birinci adimda esasen Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H. (1992). "Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3, 132-137"de açiklandigi sekilde ve ikinci adimda polisakkariddeki, örnegin dekstrandaki karboksil gruplari için primer amino gruplari vasitasiyla birincil geleneksel karbodiimid kimyasi kullanilarak omurga için kalmodulin ya da antikorlar ya da selatli metal iyonlari ya da serbest selatörlerin akuple edilmesi yoluyla multimerize edilebilirler. Bu tür somut örneklerde, bahsi geçen multimerizasyon reaktifinin bahsi geçen baglayici partneri C ile bahsi geçen en azindan iki baglayici alan Z arasindaki baglanma, metal iyon selasyonu vasitasiyla bozulabilir. Metal iyon selasyonu; örnek olarak, EDTAinin ilave edilmesi ile tamamlanabilir. Bulusun bir yönteminde, multimerizasyon reaktifinin; bir oligomer ya da bir streptavidin ya da avidin polimeri ya da streptavidin ya da avidinin herhangi bir analogu olmasi da mümkündür. Oligomer ya da polimer, bir polisakkarit tarafindan çapraz baglanabilir. Somut bir örnekte, streptavidinin ya da avidinin poligomerleri ya da polimerleri ya da streptavidinin ya da avidinin analoglari; esasen birinci adimda "Noguchi, A., Takahashi, T., Yamaguchi, T., Kitamura, K., Takakura, Y., Hashida, M. & Sezaki, H. (1992). Preparation and properties of the immunoconjugate composed of anti-human colon cancer monoclonal antibody and mitomycin C dextran conjugate. Bioconjugate Chemistry 3,132-137"de açiklandigi sekilde karboksil kalintilarinin bir polisakkaride, örnegin dekstrana yerlestirilmesi ile hazirlanir. Daha sonra streptavidin ya da avidin ya da bunlarin analoglari, ikinci adimda geleneksel karbodiimid kimyasi kullanilarak iç Iizin kalintisinin ve/veya serbest N-ucunun primer amino gruplarinin dekstran omurgasindaki karboksil gruplarina akuple hale getirilirler. Ancak, streptavidin ya da avidinin ya da streptavidin ya da avidinin herhangi bir analogunun çapraz bagli oligomerleri ya da baglanma ile ya da literatürde açiklanan diger yöntemler ile de elde edilebilir. Bulusun boyama yönteminin baska bir somut örneginde, baglayici partner C bir antijen içerir ve multimerizasyon reaktifi, bahsi geçen antijene karsi bir antikor ya da antikor fragmani içerir. Antijen; örnek olarak, bir epitop etiketi olabilir. Uygun epitop etiketlerinin örnekleri; sadece birkaç isim için, Myc-tag (sekans: EQKLISEEDL), HA-tag (sekans: YPYDVPDYA), VSV-G-tag (sekans: YTDIEMNRLGK), HSV-tag (sekans: QPELAPEDPED), V5-tag (sekans: GKPIPNPLLGLDST) ya da glutatyon-S-transferaz (GST) içerir ama bunlarla sinirli degildir. Baska bir somut örnekte, baglayici partner C; maltoz baglayici protein (MBP), kitin baglayici protein (CBP) ya da bir antijen olarak tiyoredoksin içerir. Bu durumlarda, multimerizasyon reaktifinin (antikor) en azindan iki baglayici alani 2 ile bir antijen arasinda olusturulan kompleks; serbest antijenin, baska bir deyisle bir Myc-tag ya da HA-tagiin (epitop tag) ya da serbest proteinin (MBP ya da CBP) ilave edilmesi ile bozulabilir. Bu baglamda, FLAG-tag (sekans: DYKDDDDK) durumunda baglayici partner C olarak kullanildigi ve multimerizasyon reaktifinin, FLAG etiketine baglanan bir antikor ya da antikor fragmani içerdigi dikkate alinir, bu tersinir bagin serbest FLAG peptidinin ilave edilmesi ile bozulmasi da mümkündür. Bulusun bir yönteminde, bahsi geçen reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan reseptör baglayici reaktifin en azindan bir baglayici alani B, örnek olarak, bir antikor ya da bir (Fab)2'- fragmani gibi bir divalent antikor fragmani, divalent tek zincirli Fv fragmani olabilir. "Duokalin" olarak da bilinen bir dimerik Iipokalin mutein gibi bir bivalent proteinli yapay baglayici molekül de olabilir. Diger somut örneklerde, reseptör baglayici reaktif bir tek baglayici alan B olabilir, baska bir deyisle, monovalent olabilir. Monovalent reseptör baglayici reaktiflerin örnekleri; bir monovalent antikor fragmani, antikor benzeri baglanma özellikli bir proteinli baglayici molekül ya da bir MHC molekülünü içerir. Monovalent antikor fragmanlarinin örnekleri; bir Fab fragmani, bir Fv fragmani ve birtek zincirli Fv fragmani (scFv) içerir ama bunlarla sinirli degildir. Reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan reseptör baglayici reaktif olarak kullanilabilen antikor benzeri baglanma özellikli proteinli baglayici moleküllerin örnekleri; bir aptamer, Iipokalin familyasinin bir polipeptidie dayali bir mutein, bir glubody, ankirin iskelesine dayali bir protein, kristslli iskeleye dayali bir protein, bir adnektin, bir avimer, bir EGF benzeri alan, bir Kringle alani, bir fibronektin tip I alani, bir fibronektin tip lI alani, bir fibronectin tip I" alani, bir PAN alani, bir G1a alani, bir SRCR alani, bir Kunitz/Bovin pankreatik tripsin Inhibitör alani, tendamistat, bir Kazal tipi serin proteaz inhibitör alani, bir Trefoil (P tipi) alani, bir von Willebrand faktör tip C alani, bir Anafilatoksin benzeri alan, bir CUB alani, bir tiroglobulin tip I tekrari, LDL reseptör sinif A alani, bir Sushi alani, bir Link alani, bir Trombospondin tip l alani, bir immünoglobulin alani ya da bir immünoglobulin benzeri alan (örnek olarak, alan antikorlari ya da deve agir zincir antikorlari), bir C tipi Iektin alani, bir MAM alani, bir von Willebrand faktör tip A alani, bir Somatomedin B alani, bir WAP tipi dört disülfür çekirdek alani, bir F5/8 tip C alani, bir Hemopeksin alani, bir SH2 alani, bir SH3 alani, bir Laminin tipi EGF benzeri alan, bir 02 alani, "Kappabodies" (Ill. et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Traunecker et al. "Janusinz new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer bir affibadi ya da bir ankirin, bir kristalin, bir knottin, ubikuitin, bir çinko-parmak proteini, bir otofloresan protein, bir ankirin ya da ankirin tekrar proteini ya da bir lösince zengin tekrar proteini, bir avimer (Silverman, Lu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth V, Vogt M, Biotech. 2005 Nov 20 edition); ilaveten Silverman J, Lu Q, Bakker A, To W, Duguay A, Alba BM, Smith R, Rivas A, Li P, Le H, Whitehorn E, Moore KW, Swimmer C, Perlroth Nat. Biotechnology. 2005 Nov 20 edition)'da açiklandigi sekilde insan reseptör alanlarinin bir familyasinin ekson karilma ile evrimlesen multivalent avimer proteinleri içerir ama bunlarla sinirli degildir. Bulusun yönteminde, reseptör baglayici reaktif ve multimerizasyon reaktifli hedef hücre(ler)i içeren karisimin temas etmesi, örnek olarak, US patent 7,776,562 ya da Uluslararasi Patent basvurusu WO 02/054065°de açiklandigi sekilde herhangi bir uygun sicaklikta yürütülebilir. Tipik olarak, reseptör baglayici reaktif ve multimerizasyon reaktifli hedef hücreleri içeren karisimin temas etmesi ve ayni zamanda daha sonra bahsi geçen reaktiflerin giderilmesi bu sicakliklarda yürütülebilir, burada hedef hücrede, örnegin T hücre fenotipinde bir degisiklige sebep olarak meydana gelen herhangi bir aktivasyon ve/veya sinyallesme olayi yoktur, bir T hücre durumunda boyanacak ya da izole edilecektir. Tercih edilen bazi somut örneklerde, temas, Sl l15"C,Iik bir sicaklikta yürütülür ya da SD4CC'lik bir sicaklikta yürütülür. Bulusun yönteminde, sanal olarak bahsi geçen herhangi bir hedef hücre, hedef hücrenin boyanmasi ya da izolasyonu için kullanilan en azindan bir yaygin reseptör molekülü olarak kullanilabilir. Bir avidite etkisini elde etmek amaciyla, reseptör molekülü tipik olarak hedef hücrenin yüzeyi üzerinde iki ya da daha fazla kopyada mevcuttur. Tipik somut örneklerde, hedef hücre; bir memeli hücre ya da bir ökaryotik ya da prokaryotik hücredir. Ayni sekilde, hedef hücre popülasyonunu belirleyen en azindan bir yaygin (spesifik) reseptör, yukarida açiklandigi gibi yönlendirilebildigi bir reseptöre baglayici reaktife karsi herhangi bir reseptör olabilir. `Ornek olarak, reseptör; bir hücre popülasyonu ya da alt popülasyonunu, örnegin kan hücrelerinin, örnegin Ienfositler (örnegin T hücreleri, T yardimci hücreleri, örnek olarak, CD4+ T yardimci hücreleri, B hücreleri ya da dogal öldürücü hücreler), monositler ya da kök hücrelerin, örnegin, CD34 pozitif periferik kök hücreleri ya da kök hücreleri ifade eden Nanog ya da Oct-4'ün bir popülasyonu ya da alt popülasyonunu tanimlayan bir antijen olabilir. T hücrelerin örnekleri; CMV*ye özgü CD8+ T Ienfositleri, sitotoksik T hücreleri, bellek T hücreleri ve düzenleyici T hücreler (Treg) gibi hücreleri içerir. Tregrin açiklayici bir örnegi, CD4+CD25+CD45RA Treg hücreleridir ve bellek T hücrelerinin açiklayici bir örnegi, CD62L+CD8+'e özgü merkezi bellek T hücreleridir. Reseptör ayni zamanda tümör hücreleri için bir markör olabilir. Bu baglamda, burada kullanildigi haliyle "hedef hücreler" teriminin, iç ortami dis çevreden ayiran (bir Iipid çift katmani da olabilen) bir membrandaki tüm biyolojik entitileri/vezikülleri çevreledigi ve biyolojik entitinin yüzeyi üzerinde spesifik reseptör moleküllerini içerdigi dikkate alinir. Bu tür entitilerin örnekleri; virüsleri, Iipozomlari ve mitokondri, kloroplastlar, hücre çekirdegi ya da Iizozomlar gibi organellerri içerir ama bunlarla sinirli degildir. Bir defa izole edildiginde, hedef hücre popülasyonu; reseptör baglayici reaktifin, bahsi geçen reseptörden tamamen giderilmis olmasi (tipik olarak tespit limitinin altinda, örnek olarak FACS ile tespit edilmis olarak) ile karakterize edilir. Reseptör baglayici reaktifin tamamiyla giderilmesi, yukarida açiklandigi sekilde yüksek bir koff hizina sahip olan tersinir sekilde multimerize reseptör baglayici reaktif kullanilarak tamamlanir. Böyle yapilarak, bir hedef hücre popülasyonu (yaygin spesifik reseptör vasitasiyla tanimlanan), purifikasyon yöntemi ile degistirilmemis olan fonksiyonel bir duruma sahip olma kosuluyla saglanabilir. Gerçek su ki, hedef hücre popülasyonu ya da iç ortami dis çevreden ayiran ve yüzey üzerine yaygin bir spesifik reseptör molekülünü içermesi için ayrica karakterize edilen bir membrandaki (bir Iipid çift katmanli da olabilir) bir biyolojik entitinin diger herhangi bir popülasyonu, saflastirma reaktiflerinin ilaçlar olarak bu tür saflastirilmis biyolojik entitilerin kullanimi süresince hastaya tatbik edilmedigi düzenleyici avantajini sunan - eger hedef bir hücre ya da organel ise, fizyolojik durumun degismedigi bir avantaj haricinde - kullanilan herhangi bir purifikasyon reaktifinin (reseptör baglayici reaktif; multimerizasyon reaktifi, etiket) daha sonra giderilmesi geregince bulusun yöntemleri ile saflastirilabilir. Bu tür durumlarda, FDA (USA) ya da EMEA (Europe) gibi düzenleyici kurullar; bahsi geçen purifikasyon reaktifi için üretim proseslerine göre kisitlamalarin, purifikasyon reaktifinin bir hücre ya da bir Iipozom olan ilaç ile birlikte tatbik edildigi durumlardakinden daha az pahali olmasini talep eder. Bu nedenle, fizyolojik durumu olmayan entitilerin purifikasyonu için bulusun yöntemlerine göre var olan net bir teknik avantaj, örnek olarak eger lipozomlar saflastirilacaksa ve ilaç olarak kullanilacaksa lipozomlar için benzer sekilde manipüle edilebilmeleridir. Boyanmis hücrelerin yespiti için kullanilan etiket, tanisal ve analitik yöntemlerde kullanilan herhangi bir etiket olabilir. Tercihen etiket, boyanacak ya da izole edilecek olan hücrelerin karakteristiklerini olumsuz yönde etkilemez. Etiketlerin örnekleri; floresan etiketler (örnegin, sadece birkaç isim olarak fikoeritrin, allofikosiyanin, kumarin ya da rodaminler), manyetik etiketler, kromoforik etiketler, elektron spin rezonans/elektron paramanyetik rezonans (EPR) için uygun spin etiket ya da radyoaktif etiketlerdir. Etiket, reseptör baglayici reaktife ve/veya multimerizasyon reaktifine bagli olabilir. Etiket; dogrudan bir etiket, baska bir deyisle, yukarida belirtildigi gibi multivalent baglayici kompleksin ütelerinden birine bagli bir etiket olabilir. Bu tür bir durumda, etiket; örnek olarak, ya reseptör baglayici reaktife ya da multimerizasyon reaktifine kovalent olarak akuple (konjuge) olabilir (Sekil 11de gösterilen fikoeritrin gibi bir floresan etiketini tasiyan multimerizasyon reaktifi ile karsilastirin). Alternatif olarak, etiket; dolayli bir etiket, baska bir deyisle, yukarida belirtildigi gibi multivalent baglayici kompleksin üyelerinden birine sirayla baglanabilen baska bir reaktife bagli bir etiket olabilir. Bu tür bir etiket, multivalent baglayici kompleks olusturulmadan önce, olusturulma süresince ya da sonrasinda ilave edilebilir. Bu tür bir dolayli etiket için bir örnek; Lata et al., J. Am. 1592-1600 tarafindan açiklandigi sekilde floresan boya içeren bir bis-, tris- ya da tetrakis-NTA'dir. Bahsi geçen etiket, bir oligohistidin etiketine kovalent olmayan sekilde (metal selasyonu vasitasiyla) baglanabilir. Böylelikle, bu örnekte, reseptör baglayici reaktif ve/veya multimerizasyon reaktifi bir oligohistidin etiketini tasiyabilir (örnek olarak, CH1 ya da CL- alaninin C-ucuna kaynasmis bir hekzahistidin etiketi gibi bir oligohistidin etiketine sahip olan reseptör baglayici reaktif olarak bir Fab fragmani ya da alt birimlerinden birinin N- ya da C- ucuna kaynasmis bir oligohistidin etiketine sahip olan multimerizasyon reaktifi olarak Strep-Tactin® gibi bir streptavidin mutein kullanilabilir), dolayisiyla Lata et al, supra ya da Huang et al, supra ile açiklanan bu tür bir NTA bazli floresan boya bilesigine kovalent olmayan sekilde baglanmasina olanak saglanir. Bu tür bir kovalent olmayan sekilde baglanma etiketinin; multivalent baglayici kompleks olusturulmadan ayni zamanda multivalent baglayici kompleksi olustugunda numuneye de ilave edilmeden önce ya da multivalent baglayici kompleks olusturulduktan sonra hedefine (reseptör baglayici reaktif ve/veya multimerizasyon reaktifi) baglanma zorunlulugu yoktur. Bu tür bir kovalent olmayan sekilde baglanma etiketi, multivalent baglayici kompleks hedef hücrelere baglandiktan sonra ilave edilebilir. Yukarida açiklanan floresan boyazoligohistidin etiketi baglayici çiftini içeren NTA yerine, ayni zamanda örnek olarak, digoksigenin ve bir anti digoksigenin antikoru gibi diger herhangi bir speasifik baglayici çifti ya da floresan ya da baska bir etiketi tasiyan antikor fragmani dolayli etiketleme için kullanilabilir. Bu tür bir durumda, reseptör baglayici reaktif ve/veya multimerizasyon reaktifi; digoksigenin ve bir anti digoksigenin antikoru ya da multimerizasyon reaktifine ya da reseptör baglayici reaktife baglanan (digoksigenin vasitasiyla) seçilen etiketi tasiyan antikor fragmani ile konjuge/akupledir. Bulusun yönteminin somut örneklerinde, bir hedef hücre, en azindan iki farkli (önceden seçilmis) reseptör molekülünün bir grubu vasitasiyla boyanir ve opsiyonel olarak izole edilir. Birden fazla yaygin reseptör adina hedef hücre izolasyonu, her çevrimde uygun reseptör baglayici reaktiflerinin kullanilmasi ile ardisik bir biçimde bulusun bir yönteminin gerçeklestirilmesi yoluyla tamamlanabilir. Bu durumda, ayni etiket her çevrim için kullanilabilir. Alternatif olarak, hedef hücrelerin eszamanli etiketlemesi, farkli etiketler her reseptör molekülü için kullanildiginda mümkün olur. Bu tür bir ardisik hücre zenginlestirme ve/veya (eszamanli) çok parametreli boyama, en azindan iki farkli reseptör baglayici reaktifi kullanir, her reseptör baglayici reaktif, en azindan iki farkli reseptör molekülünün bir grubunun önceden seçilmis bir reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan en azindan bir baglayici alan B içerir. Ornekleyerek söyleirse, en azindan iki farkli reseptör molekülü, CD4+CD25+ T düzenleyici hücreleri ya da CD62L+CD8+ spesifik merkezi bellek T hücreleri gibi farkli CD markörleri olabilir. Hücreler; örnegin, ilk olarak CD8+ T hücrelerinin seçilmesi, bunu takiben HLA- B8/IE1K199-207'ye özgü CD8+ T hücreleri gibi CMV'ye özgü hedef popüasyonu için ikinci bir boyama ve izolasyon ile izole edilebilen CMV'ye özgü CD8+ T hücreleri gibi antijene özgü T hücreleri olabilir. Bu tür somut örneklerde, en azindan iki farkli reseptör molekülü grubunun ikinci ya da diger herhangi bir reseptör molekülüne baglanan reseptör baglayici reaktifi ayrica en azindan bir baglayici partner Oyi de içerebilir. Bu ikinci reseptör molekülünün boyanmasi için, baglayici alan B vasitasiyla spesifik olarak baglanan reseptör baglayici reaktif ile bahsi geçen ikinci ya da diger herhangi bir reseptör molekülü arasindaki baglanma için disosiasyon hiz sabiti koff ayni zamanda 0,5 x 10-4 sn'1 ya da daha büyük bir koff hizina da sahip olabilir (birinci reseptör molekülüne baglanan reseptör baglayici reaktif gibi). Alternatif olarak, US patent 7,776,562 ya da Uluslararasi Patent basvurusu WO 02/054065 dogrultusunda, bahsi geçen ikinci ya da diger herhangi bir reseptör molekülü ile bahsi geçen ikinci ya da diger herhangi bir reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan bahsi geçen reseptör baglayici reaktif arasindaki baglanma için disosiasyon sabiti (Ku) 10"2 ila 10*7 M araliginda olabilir. Yukarida açiklandigi gibi, bulusun boyama yöntemi, en azindan bir yaygin spesifik reseptör molekülünün mevcudiyeti ile tanimlanan bir hücre popülasyonunun izolasyonu için kullanilabilir. Yaygin bir spesifik reseptör molekülünün mevcudiyeti ile tanimlanan hücre popülasyonu; örnek olarak, bir antijene özgü T hücre popülasyonunu içeren örnek olarak, bir T-hücre popülasyonu olabilir. Bu saflastirilmis hücre popülasyonu örnek olarak adoptif transfer ya da immünoterapi için kullanilabilir. Bulusun yöntemi ayni zamanda bir T hücre popülasyonunun fonksiyonel durumunun belirlenmesi için ya da in vitro genisleme için bir T hücre popülasyonunun purifikasyonu için de kullanilabilir. Daha detayli olarak ve US patent 7,776,562fnin açiklamasina uygun olarak, bu bulusun yöntemi; hedef hücre popülasyonlarinin, örnegin, tersinir bir boyama prosedürü bazinda T hücre popülasyonlarinin fonksiyonel bir izolasyonuna olanak saglar. Hedef hücrelerin, örnegin T hücrelerinin orijinal fonksiyonel durumu, tanimlama ve purifikasyon sonrasinda büyük ölçüde korunabilir. Böylelikle, bulusun yöntemi, temel arastirma ve klinik uygulamalar için büyük bir fayda saglar. Tercih edilen uygulamalarin örnekleri asagida belirtildigi gibidir: Temel arastirma: Ornek olarak, antijene özgü T hücre popülasyonlarini içeren T hücreleri gibi Ienfositlerin fonksiyonel durumunun dogrudan ex vivo incelemesi. In vivo T hücre popülasyonlarinin fonksiyonel durumu, son derece çesitli olmasi ve in vivoya bagli olmasi önerilmektedir, ancak uygun arastirma araçlarinin yoklugundan dolayi, bu bakis açilari sadece marjinal olarak anlasilmaktadir. Ornek olarak, burada açiklandigi gibi Fab multimerleri ile, epitopa özgü T hücre popülasyonlari, fonksiyonel durumlarindan bagimsiz olarak tanimlanabilir ve saflastirilabilir. Ancak, tersinir olmayan reaktiflerin baglanmasi, daha sonraki fonksiyonel deneyler ile çakisir. Örnegin bir streptavidin baglayici peptidi/Strep- Tactin® rektifleri ile donatilmis Fab fragmanlari kullanilarak tersinir T hücre boyama, degistirilmemis çesitli T hücre popülasyonlarinin dogrudan fonksiyonel ex vivo arastirmasina olanak saglar. Son derece etkili in vitro genisleme için T hücre popülasyonlarinin purifikasyonu. Ex vivoda elde edilen T hücre popülasyonlarinin karakterizasyonu siklikla T hücre dizileri ya da T hücre klonlarina in vitro genislemeyi de gerektirir. Fab multimer teknikleri ile, kapsamli bir T hücre popülasyonu içerisindeki tek hücreler ya da belirgin fenotipik alt popülasyonlar izole edilebilir, ancak reaktiflerin TCR'ye baglanmasi, in vitro genislemesinin verimliligine engel olur. Bu deneysel problem, bulusun reaktifleri, örnegin Fab-Strep-tag®/Strep-Tactin® reaktifleri kullanilarak tersinir T hücre boyama ile çözülür. Bu tür Fab fragmanlari; baglayici partner C olarak, Uluslararasi Patent Basvurusu WO 02/077018'da açiklandigi sekilde iki ya da daha fazla özgün baglayici modülün ardisik bir düzenlemesine sahip olan bir streptavidin baglayici peptidini tasiyabilir. Adoptif transfer deneyleri için T hücre popülasyonlarinin purifikasyonu. Immünolojik arastirmadaki birçok in vivo deneyi, saflastirilmis T hücrelerinin alici hayvanlarin bünyesine adoptif transferini gerektirir. Hem transfer edilen T hücre popülasyonlarinin hem de izolasyon prosedürü süresince meydana gelen hücrelerdeki olasi degisiklikler, bu deneysel sistemleri ilgilendirir. Hücre popülasyonlarinin en yüksek safligi pozitif seleksiyon yöntemleri ile elde edilir, ancak tanimlama için kullanilan markörlerin (genellikle antikorlar), izole edilmis hücrelerin yüzeyinden giderilmesi zordur ve daha sonraki in vivo deneylerinin sonucu ile çakisabilir. Bulusun reaktifleri, örnegin Fab-Strep-tag®/Strep-Tactin® reaktifleri kullanilarak tersinir T hücre boyama, seleksiyon markörünün daha sonra giderilmesi ile pozitif seleksiyon yöntemlerinin kombinasyonuna olanak saglar ve adoptif transfer deneylerini büyük ölçüde gelistirebilir. Klinik uygulamalar: Sonderece verimli in vitro genisleme için T hücre popülasyonlarinin purifikasyonu. Insan T hücre dizilerin ya da klonlarinin (örnegin, patojene/tümöre özgü ya da otoreaktif T hücreleri) üretimi; klinik arastirma, tanilama ve immünoterapinin birçok alaninda gereklidir. In vitro kültürü siklikla antijene özgü stimulasyon için standardize edilmis kosullardaki zorluklar ile sinirlanmaktadir. T hücre popülasyonlarinin purifikasyonu için gelistirilen stratejiler; mitojenler ve anti-CD3 gibi antijenden bagimsiz stimülasyonun kullanilmasina olanak saglayan in vitro genislemenin verimliligini büyük oranda gelistirebilir. Bulus ile, örnegin MHC-Strep-tag® ya da Fab-Strep-tag® reaktifleri (reseptör baglayici reaktif olarak) ve bir Strep-Tactin® multimerizasyon reaktifi ile, T hücre popülasyonlari, reaktiflerin disosiasyonu sonrasinda dogrudan ex vivo ve in vitro genislemesi ile izole edilebilir. Bu yaklasim; in vitro T hücre genislemesinin verimliligi ile olumsuz yönde çakisan reaktiflerin baglanmasi seklinde, örnek olarak, geleneksel tersinir olmayan MHC multimer reaktifleri kullanilarak purifikasyondan çok daha fazla verim saglanmasini beklemektedir. Daha ileri fonksiyonel analizler ya da tedavi için in vitro genisletilmis hücre dizilerinden ya da klonlarindan elde edilen T hücre popülasyonlarinin purifikasyonu. T hücrelerinin in vitro genislemesi, antijen sunucu hücrelerin ya da besleyici hücrelerin kültüre ilave edilmesini gerektirir. Daha ileri fonksiyonel analiz için ve özellikle terapötik uygulamalar (örnegin adoptif transfer) için, bu kontamine gücrelerin giderilmesine yardimci olacaktir. Pozitif seleksiyon prosedürleri (genellikle en yüksek saflik derecesine yol açan) için, seleksiyon markörü, fonksiyonel deneyler ya da adoptif transfer ile çakisabilecegi gibi T hücre yüzeyinden giderilebilmelidir. Eger T hücreleri in vivo uygulamalari için kullaniliyorsa, seleksiyon markörü, alerjik reaksiyonlar gibi klinik semptomlara sebep olabilen maddeleri de içeriyorsa ayrica giderilmelidir. Bulusun reaktifleri, örnegin MHC- Strep-tag®/Strep-Tactin® reaktifleri kullanilarak tersinir T hücre boyama, tüm bu kriterleri yerine getirir. T hücre popülasyonlarinin dogrudan ex vivo izolasyonunu takiben hücrelerin alicilarin bünyesine acil transferi (ayrica herhangi bir in vitro propagasyonu olmadan) özel klinik ilgi alanindadir. Dogrudan izole edilen hücre popülasyonlarinin, in vivo uygulamalari Için kültürlenmis hücrelerden çok daha fazla verimli oldugu beklenmektedir. Son derece yüksek sayida in vitro genisletilmis T hücresi, efektif adoptif transferler için gereklidir, büyük bir olasilikla T hücrelerinin in vitro kültür kosullarina adaptasyonundan kaynaklanan bir olgudur. Bu prosedür için önemli bir klinik uygulama için bir örnek, T hücresi tüenmis kök hücre transplantasyonlari süresince [aksi durumda] EBV ve/veya CMV'ye Özgü T hücre popülasyonlarinin paralel purifikasyon ve adoptif transferi olup, nakil hastalarindaki EBV ve/veya CMV baglantili malignitelerin insidansini dramatik olarak azaltmasi muhtemel olan bir protokoldür. Ornegin reseptör baglayici reaktifler olarak MHC-Strep-tag® ya da Fab-Strep-tag® ve multimerizasyon reaktifi olarak Strep- Tactin® kullanilarak tersinir T hücre boyama ve izolasyonu, bu klinik uygulamalar için çok uygun bir yöntemdir. `Ornek olarak, MHC I molekülleri (bir streptavidin baglayici peptidine kaynasmis), yüksek saflikta CMviye özgü CD8+ T hücrelerinin donör kan tehdit eden CMV hastaligindan muzdarip olan bagisiklik yetersizligi olan hastalara dogrudan transfer edilebilir (örnegin allojeneik kök hücre transplantasyonuna göre). Bu örnekler; graft versus host hastaligi (GvHD) ya da graft reddi ya da Tip 1 diyabet, kolit ya da alerji gibi otoimmün hastaliklarinin tedavi edilmesi amaciyla adoptif transferde kullanilmasi için saflastirilmis Treg hücre popülasyonunu içerir. Bu amaçla, Treg hedef hücre popülasyonu; CD4 reseptör molekülü, CD25 reseptör molekülü ya da CD45RA reseptör molekülüne spesifik olarak baglanan Fab fragmanlari gibi üç reseptör baglayici reaktif kullanilarak ardisik bir biçimde boyanan/izole ediien co4+co25+co45RA+ Treg hücreleri olabilir. Diger örnekler; CD56 reseptör molekülü (Nöral Hücre Adhezyon Molekülü (NCAM) olarak da bilinmektedir) vasitasiyla dogal öldürücü hücrelerin ya da ilgili hücre yüzeyi reseptör molekülü vasitasiyla CD34+, CD59+, Thy1/CD90+, CD38'O/', CD133+ ya da Ckit/CD117+ hematopoietik kök hücreler gibi hematopoietik kök hücrelerin izolasyonunu içerir. Fonksiyonel T hücre teshisi. MHC multimer teknikleri, dogrudan ex vivo ile antijene özgü T hücrelerinin miktarlandirmasi ve fenotipik karakterizasyonuna olanak saglar. Ancak, multimer reaktiflerinin TCR'ye baglanmasi, fonksiyonel deneylerdeki saflastirilmis hücrelerin kullanilmasini karmasik hale getirir (örnegin, kronik virüs enfeksiyonlari [HlV, CMV, EBV, HBV, HCV], tümöre özgü T hücre popülasyonlari). Ornegin Fab-Strep-tag®/Strep-Tactin® reaktifleri kullanilarak tersinir T hücre boyama ve izolasyonu, birçok klinik durumda bu tür T hücre durumunun güçlü degerlendirmesi için kapi açar. Bulus ayrica asagidaki deneysel Ornekler vasitasiyla tasvir edilecektir. Malzemeler ve Yöntemler Kan numuneleri Taze PBMC'ler, Biocoll ayirma çözeltisi boyunca santrifüjleme ile ya periferik kan ya da beyaz kari hücre katmanlarindan üretilmistir. Periferik kan, Institute of Medikal Mikrobiyoloji, Immünoloji ve Hijyen Enstitüsü'ndeki (Münih Teknik Universitesi) saglikli yetiskin donörlerden elde edilmistir ve beyaz kan hücre katmanlari, Anesteziyoloji, Alman Saglik Merkezi Münih Enstitüsü'ndeki (Bavyera Eyaleti ve Münih Teknik Üniversitesi) otolog kan donörlerinden elde edilmistir. Yazili bilgilendirilmis onam donörlerden elde edilmistir ve kan numunelerinin kullanimi, yerel Kurumsal Inceleme Kurulu (Ethikkommission der Medizinischen Fakultat der Technischen Universit'at München) tarafindan ulusal hukuga göre onaylanmistir. Resept'or baglayici reaktifler olarak Fab fragmanlarinin üretilmesi (Klonlama, Ekspresyon, Purifikasyon) kullanilarak gen sentezi yoluyla üretilmistir. Elde edilen degisken sekanslari akabinde agir zincir için insan sabit bölgesi Ch1 tip III1 ve hafif zincir için kappa için kodlanan sekanslar ile birlestirilmistir ve agir zincir, One-STrEP-tag afinite etiketi olarak lBA GmbH, Gbttingen, Almanyatdan ticari olarak temin edilebilen iki streptavidin baglayici modülün (SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK) ardisik bir düzenleme ile karboksi terminal olarak kaynasmistir. Tüm klonlamalar, açiklanan Fab ekspresyonu için adapte edilen füzyon vektörleri ile StarGate® klonlama sistemi (IBA GmbH, Göttingen, Germany) kullanilarak tamamlanmistir. Mutajenez PCR, amino asit substitüsyonlarina yerlestirmek üzere ilave edilmistir. Asagidaki klonlamada, Fab-One- STrEP-tag füzyon proteinleri, E. coli strain JM83'de ifade edilmistir (Plückthun, A. & Skerra, A. Expression of functional antibody Fv and Fab fragments in Escherichia coli. fragmanlari; ilgili Fab*in dializ yoluyla kolondan elüsyonu için kullanilan destiyobiotinden kasitli olarak bir Strep-Tactin® Süper akis kolonu (lBA) vasitasiyla One-STrEP- tag/Strep-Tactin® afinite kromatografisi (Schmidt, T.G. & Skerra, A. The Strep- tag® system for one-step purification and high-affinity detection or capturing of proteins. Nat edildi ve kullanilincaya dek 4°C'de ya da donmus halde (-20`C) PBS pH 7,4,de saklandi. Multimerizasyon, Boyama ve FACS Analizi Hücrelerin bir karisimindaki bir CD4 reseptör molekülüne `özgü hedef hücre popülasyonunun boyanmasi için, bir floresan etiketi olarak fikoeritrin ile etiketlenen Strep-Tactin® (lBA GmbH, Gbttingen, Germany), asagida açiklandigi sekilde antikor 1388.2,nin (reseptör baglayici reaktif olarak islev gören) varyantlarinin monomerik CD4 baglanma Fab-One-STrEP fragmani ile birlikte multimerizasyon reaktifi olarak kullanilmistir. FACS analizi için, 5 x 106 PBMC'Ier; asagidaki protokol kullanilarak, reseptör baglayici reaktif olarak One-STrEP-tag (baglayici partner C) ile donatilmis 0,2 ug Fab fragmani (baglayici alan B içeren) ve multimerizasyon reaktifi olarak 0,75 ug Strep-Tactin® PE'den (IBA GmbH, Göttingen, Germany) olusan Fab multimerleri ile inkübe edilmistir. Ek olarak, FACS separasyonu sonrasinda, multivalent kompleksler, asagida açiklandigi sekilde biyotinin ilave edilmesi ile boyanmis hücrelerin her birinin bir kisminda dagilmistir. Kontrol antikor boyamalari, ilgili antikorun konkominant uygulamasi ile gerçeklestirilmistir: anti-CD4 (OKT4) (eBiosciences, San Diego, CA, USA,dan temin edilen). Bu bulusun boyama prosedürü sonrasinda, hücreler, canli/ölü ayrimi için propidyum iyodür ile daha sonra boyanmistir. Reseptör baglayici reaktif ve multimerizasyon reaktifi ile 5x106 hücrenin boyanmasi için protokol 1. 0,75 üg Strep-Tactin PE, karanlikta at 4"Cde 30 dakika süresince 0,2 pg monomerik CD4 baglayici Fab-One-STrEP fragmani ile inkübe edildi. 2. 5x106 önceden sogutulmus hücre; sonraki prosedürü engelleyen örnegin, D- biyotin gibi potansiyel olarak mevcut olan katki maddelerini gidermek için 15 mM KH2PO4, pH 7.4ideki %0,5 BSA (agirlik/hacim» ile yikandi. 3. Hücreler, 50 pl Tampon lS'de yeniden süspanse edildi ve boyama için uygun bir reaksiyon kabina, örnegin 96 hazneli yuvarlak dipli bir mikrotitre plakasina transfer edildi. 4. Adim lideri elde edilen önceden inkübe edilmis Fab-Streptamer preparasyonu, hücrelere ilave edildi ve hafif pipetleme ile iyice karistirildi. . Karisim, karanlikta 4°C'de 20 dakika süresince inkübe edildi. 6. Hücreler, 200 pl Tampon IS'deki santrifüjleme (400xg, 2 dak) ile üç defa yikandi. 7. Hücreler, FACS analizi ya da FACS siralama için simdi hazir oldu, FACS analizi, bir CyAn ADP Lx (Beckman Coulter) üzerinde gerçeklestirildi ve FlowJo yazilimi (TreeStar) ile analiz edildi. Multivalent komplekslerinin disosiasyonu ve akabinde Reseptör baglayici reaktifin D-biyotinli 5x105 hücreden giderilmesi için protokol 1. 5x106 boyanmis hücre (yukariya bakiniz), santrifüjleme (400xg) ile toplandi ve 1 mM D-biyotin içeren 3 ml Tampon Isrde yeniden süspanse edildi ve 4°C'de 10 dakika süresince inkübe edildi. 2. Hücreler, santrifüjleme ile çöktürüldü ve süpernatant atildi. 3. Adim 1 ve 2 tekrar edildi. 4. Hücreler, 10 ml Tampon IS'de yeniden süspanse edildi ve 25cCrde 10 dakika süresince inkübe edildi (reseptör baglayici reaktif olarak kullanilan CD4 baglayici Fab fragmaninin disosiasyonu için). . Hücreler, santrifüjleme ile çöktürüldü ve süpernatant atildi. 6. Adim 4 ve 5 üç defa tekrar edildi. Sonuçlar Tersinir Fab-multimer boyamanin prensibi Bu bulusun prensibi; Kd < 10'7'den 10'10 M'a kadar ile hücre reseptörü için yüksek afinitelere sahip olan monomerik Fab molekülleri gibi reseptör baglayici reaktiflerin, hedef hücrelere kararli baglanma için bir multimerizasyon reaktifi ile multimerize edilmesine ihtiyaci oldugunun ve multimerizasyon reaktifinin partneri C ile baglayici alanlari Z arasindaki etkilesimin hedeflenen dagilimi üzerine hücre yüzeyinden tamamiyla giderilebildiginin kesfedilmesi sasirtici olmustur (Sekil 1). Ayrica bu tür tersinir boyama için anahtar moleküler temelin, hücre yüzeyi reseptör molekülü ile reseptör baglayici reaktifteki baglayici alan B arasindaki etkilesim için afinite sabiti Kd olmadigi, ancak reseptör baglayici reaktifin reseptör molekülünden disosiasyonu için off hizi oldugu da kesfedilmistir. Off hizi; bir reseptör molekülü baglayici reaktifinin, bir makul zaman penceresi içerisinde hedef hücreden tamamiyla giderilmesi için 0,5 x 10'4 sn"I ya da daha yüksek olmalidir. Tersinir Fab multimer boyamanin gerçeklestirilmesi için esas parametrenin afinite degil off hizi oldugu temel bulgunun ispat edilmesi amaciyla, hücre yüzeyi reseptör molekül'u CD4'e karsi yönlendirilen asagidaki rekombinant Fab fragmanlari (reseptör baglayici reaktifleri islevi gören) 'üretilmistirz 1) Bir Fab fragmani; US Patent 7,482,000'de açiklandigi gibi, CD4 baglayici murin antikoru 1388.21nin degisken alanindan ve agir zincir için tip gama 1iin sabit insan CH1 alanindan ve tip kappanin sabit insan hafif zincir alanindan olusur. Bu Fab, asagidaki 13882 Fab fragmaninda gösterilmektedir. 2) Agir zincirin 100 pozisyonunda yer alan Phe kalintisindaki bir mutant 13882 Fab fragmani, Alarya dönüstürülm'ustür (burada CD4 mutant 1 (F100A) olarak da ifade edilir ve US Patent 7,482,000, Tablo Ilide F1OOK-H olarak ifade edilmektedir) 3) Hafif zincirin 92 pozisyonunda yer alan Tyr kalintisindaki bir mutant 13882 Fab fragmani, Alatya dönüstürülmüst'ür (burada CD4 mutant 2 (Y92A) olarak da ifade edilir ve US Patent 7,482,000, Tablo llide Y92-L olarak ifade edilmektedir) 4) Agir zincirin 35 pozisyonunda yer alan His kalintisindaki bir mutant 13882 Fab fragmani, Ala7ya dönüstürülmüstur (burada CD4 mutant 3 (H35A) olarak da ifade edilir ve US Patent ) Hafif zincirin 91 pozisyonunda yer alan His kalintisindaki bir mutant 13882 Fab fragmani, Alarya dönüstürülmüstür (burada CD4 mutant 4 (H91A) olarak da ifade edilir ve US Patent 7,482,000, Tablo Iltde H91-L olarak ifade edilmektedir) Bu Fab fragmanlari, afinitelerin genis bir spektrumuna (12,5 nM ila 16,9 uM'lik aralikta Kd degerleri) ve artan koff hizlarina sahiptir; BlAcore tarafindan belirlenen baglanma kinetiklerinin bir özeti asagidaki Tablo 1'de listelenmektedir. Tablo 1: immobilize CD4 ve CD4 baglayici antikoru 1388.2'nin Fab fragmani ile US edilen mutantlar Fab fragmanlari arasindaki baglanma kinetikleri Fab fragmani kon (104 s-1M-1) karma-4 s-1) Kd (nM) Fab fragmani ko,, (104 s-1M-1) kanun-4 s-1) Kd (nM) 1) Bu deger, Bes, et al.'da verilen 3 ölçümün aritmetik ortalamasidir, 2) Bes, et aI3da verildigi sekilde tek ölçümün degeri, 3) Deger, Bes, et alxda verilen 2 ölçümün aritmetik ortalamasidir, Bir baglayici partner Cinin yerlestirilmesi amaciyla, CD4 baglayici Fab fragmanlarinin agir zincirleri, iki Strep-tag®|| sekansinin (lBA GmbH, Göttingen, Germanyyden OneSTrEP-tag temin edilen SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK) bir tandem düzenlemesine genetik olarak sekansi olarak ticari olarak kaynasmistir ve her iki zincir de E. koli=nin periplazmasinda eszamanli olarak ifade edilmistir. Reseptör baglayici reaktif islevi gören fonksiyonel olarak birlestirilen Fab fragmanlari daha sonra bir Strep-Tactin® reçinesinde afinite kromatografisi vasitasiyla saflastirildi ve diyaliz yoluyla destiyobiyotin giderildikten sonra akabinde suda çözünen fikoeritrin etiketli Strep-Tactin® varliginda multimerize edilmistir (bir (floresan) etiket islevi gören fikoeritrin ile One-STrEP-tag sekansi için en azindan 2 (yaklasik 12) baglayici alan Z'yi saglayan multimerizasyon reaktifi islevi gören Strep-Tactin® PE). Streptavidin baglayici peptidi ile streptavidin mutein "Strep-Tactin®" arasindaki etkilesim, rekabet eden bir ligand olarak D-biyotin'in (ya da örnek olarak, diaminobiyotin ya da destiyobiyotin gibi türevleri) ilavesi boyunca tersinirdir. Boyama ve disosiasyon deneyleri için, 5 x 106 PBIVIC, ilgili anti-CD4 Fab- multimer- Strep-Tactin® PE kompleksleri ile ve karsilik gelen Fab monomerleri ile inkübe edilmistir (ikincisi, Strep-Tactin® PE ile komplekslesmemistir). Oysa ki 13882 dogal sus (wt) Fab fragmani ve tüm mutantlar, multimerized edildiklerinde esasen esit olarak iyi boyama 13B8.2 dogal sus Fab fragmani ve mutant (1), bir monomerik durumda kendi antijenine baglanabilir (Sekil 2, birinci ve ikinci kolonlar). Multimerik komplekslerin D-biyotin aracili dagilimi (Sekil 2, üçüncü kolon) ve sonrasindaki yikama sonrasinda, hücreler, tek basina Strep-Tactin® PE'nin ilave edilmesi ile artan yüzeye bagli Fab fragmanlari için problanmistir (Bagli Fab olmadan) (Sekil 2, dördüncü kolon). Monomer boyama deneylerinden beklendigi gibi, mutant (2, 3 ve 4) için geriye kalan herhangi bir Fab monomeri tespit edilememistir, oysa ki dogal sus ve mutant (1) varyantlarinin Fab'a bagli önemli kalinti hücre yüzeyi gözlenmistir. Mutant (2, 3 ve 4) hücreleri, hücre yüzeyindeki kalinti Fab fragmanlarinin tespit edilmesi süresince uygun biyotin gidermeyi bir defa daha gösteren Fab multimer etiketleme kullanilarak ikinci defa etkili bir sekilde yeniden boyanabilir (Sekil 2, besinci kolon). Akis sitometrisi temelli analize (Sekil 2) ilave olarak, Fab multimerlerinin tamamen giderilmesi ayni zamanda bagimsiz baska bir analiz yöntemi, baska bir deyisle Western blot analizi yoluyla da degerlendirilmistir (Sekil 3). Sekil 2'de gösterilen son derece hassas FACS sonuçlarinin onaylanmasinda, dogal suç Fab fragmani çözünen fraksiyonda kolaylikla tespit edilirken, mutant (2, 3 ve 4) için hücre lizisi sonrasinda ya çözünen ya da çözünmeyen hücre fraksiyonunda tespit edilebilen herhangi bir Fab monomeri tespit edilememistir. Bu deney ayni zamanda FACS ile tespit edilmemis olan içsellestirilmis Fab fragmanlarini da tespit edecek olmasina ragmen, boyama ve salim prosedürü süresince yüzeye bagli reseptör baglayici reaktiflerin herhangi bir önemli internalizasyonu göz ardi edilebilir, dolayisiyla Sekil 2îde gösterilen sonuçlarin dogru yorumlandigi onaylanir. Kullanilan yikama kosullari altinda mutantin (1) giderilmesinin tamamlanmadigini ispat eden FACS deneyinin aksine, arta kalan mutant (1), büyük ihtimalle Western blot yönteminin düsük hassasiyetnden dolayi Western blot deneyi ile benzer sekilde tedavi edilen hücrelerde tespit edilemeyebilir. Asil sasirtici sonuç asagidakilerdir: düsük afiniteden (yaklasik dolayi, ilgili Fab fragmani ve multimerizasyon reaktifi olarak Strep-Tactin® PEinin multivalent kompleksinin dagilmasi sonrasinda Fab mutanti (3) ve (4) için tam salim, US dogrultuda olmustur, monomerik dogal sus Fab moleküllerinin (ve mutant (3) ve (4) Fab fragmanlarina benzer) aksine mutant (2)inin tam salimi, mutant (2)=nin afinitesi (Ka = 14,75 ± ve diger tüm mutantlar için olandan önemli ölçüde daha yüksek oldugundan dolayi tamamen beklenmedik olmustur. Ancak, mutant (2), dogal sus Fab fragmani ve Fab mutant (1)rden çok daha edilir, bu da disosiasyon hizinin, yüzeye bagli, monomerik Fab fragmanlarinin baglanma stabilitesi üzerine baskin bir etkiye sahip oldugunu ve afinite sabitine etkisi olmadigini gösterir. Bu yorum dogrultusunda, tam olarak tersinir tüm Fab fragmanlari (mutant (2-4)) (burada tanimlandigi sekilde reseptör baglayici reaktifleri), 0,5 x 104 5' 1*den daha büyük bir koff hizini paylasir. Ancak, burada belirtilmesi gerekir ki, multivalent baglayici komplekslerinin dagilimi süresince, D-biyotin içeren çözelti ile daha uzun yikama/inkübasyon ile, - ayni zamanda 0,5 x 10'4 s'1'den daha büyük bir kotf hizina da sahip olan - dogal sus Fab fragmani ve Fab mutanti (1 )in baglanmasinin tam tersi, makul zaman penceresi içerisinde mümkündür ve böylelikle bulusa uygun sekilde reseptör baglayici reaktifler olarak kullanilabilir. Ozet olarak, bu veriler; baglayici alan B vasitasiyla bir reseptör molekülünün baglanmasi için 0,5 x 10'4 s'1'den daha büyük bir koff hizinda multimerize reseptör baglayici reaktiflerinin (örnek olarak Fab fragmanlari), kararli bir biçimde leke hücreleri için kullanilabildigini ve bu reaktiflerin, fizyolojik kosullar altinda etiketlenen hücrelerin yüzeyinden tamamiyla ayrilabildigini ve giderilebildigini ispat eder. TR

Claims (1)

1.
TR2018/11128T 2011-07-18 2012-07-17 Bir hedef hücrenin tersinir şekilde boyama yöntemi. TR201811128T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161508943P 2011-07-18 2011-07-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201811128T4 true TR201811128T4 (tr) 2018-08-27

Family

ID=46682800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/11128T TR201811128T4 (tr) 2011-07-18 2012-07-17 Bir hedef hücrenin tersinir şekilde boyama yöntemi.

Country Status (11)

Country Link
US (2) US9023604B2 (tr)
EP (2) EP3418295B1 (tr)
JP (2) JP6310388B2 (tr)
CN (2) CN107843730B (tr)
ES (1) ES2682750T5 (tr)
HK (1) HK1258907A1 (tr)
PL (1) PL2734538T3 (tr)
PT (1) PT2734538T (tr)
SI (1) SI2734538T2 (tr)
TR (1) TR201811128T4 (tr)
WO (1) WO2013011011A2 (tr)

Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR201811128T4 (tr) * 2011-07-18 2018-08-27 Iba Gmbh Bir hedef hücrenin tersinir şekilde boyama yöntemi.
CN106940268B (zh) * 2012-02-23 2021-09-21 朱诺治疗有限公司 细胞和其它复杂生物材料的色谱分离
JP6471385B2 (ja) 2013-03-15 2019-02-20 グラディエーター・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 標的化剤としてのＧｌａドメイン
HUE056852T2 (hu) * 2014-04-16 2022-03-28 Juno Therapeutics Gmbh Sejtpopuláció felszaporítására szolgáló eljárások, készletek és berendezés
KR102447958B1 (ko) 2014-04-23 2022-09-27 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 입양 치료용 면역 세포 집단의 단리, 배양 및 유전자 조작 방법
JP6661544B2 (ja) * 2014-04-24 2020-03-11 ミルテニイ バイオテック ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 遺伝子改変したｔ細胞の自動生成法
AU2015254588B2 (en) 2014-04-30 2020-05-21 Iba Gmbh Method of isolating a target cell
EP3037820A1 (en) 2014-12-27 2016-06-29 Miltenyi Biotec GmbH Cell detection methods and reagents having a releasable labelling moiety
WO2016127149A2 (en) 2015-02-06 2016-08-11 Cell Idx, Inc. Antigen-coupled immunoreagents
WO2016166568A1 (en) 2015-04-16 2016-10-20 Juno Therapeutics Gmbh Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
MA45489A (fr) * 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés
MA45488A (fr) * 2015-10-22 2018-08-29 Juno Therapeutics Gmbh Procédés, kits et appareil de culture de cellules
CN108474002B (zh) 2015-10-22 2023-05-23 朱诺治疗学有限公司 用于转导的方法、反应剂盒、反应剂和设备
CA3028265A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Technische Universitaet Muenchen Combination of reversible and irreversible cell labeling for analyzing receptor-ligand koff rate
US10294454B2 (en) 2016-08-24 2019-05-21 General Electric Company Methods and kits for cell activation
EP3336545A1 (en) 2016-12-13 2018-06-20 Miltenyi Biotec GmbH Reversible labeling of antigens in biological specimens
EP3336546B1 (en) 2016-12-13 2020-07-01 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Reversible cell labelling with conjugates having two releasable binding sites
WO2018112262A2 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Diagnologix, Llc Buoyancy enabled separation method and system
EP3571221A2 (en) 2017-01-20 2019-11-27 Juno Therapeutics GmbH Cell surface conjugates and related cell compositions and methods
AR111625A1 (es) 2017-04-27 2019-07-31 Juno Therapeutics Gmbh Reactivos de partículas oligoméricas y métodos de uso de los mismos
ES3009018T3 (en) 2017-07-29 2025-03-25 Juno Therapeutics Inc Reagents for expanding cells expressing recombinant receptors
MX2020001490A (es) 2017-08-09 2020-08-06 Juno Therapeutics Inc Metodos para producir composiciones de celulas geneticamente modificadas y composiciones relacionadas.
PE20201462A1 (es) * 2017-09-05 2020-12-17 Gladiator Biosciences Inc Metodo de direccionamiento de exosomas
CA3084514A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
CA3084445A1 (en) 2017-12-08 2019-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Process for producing a composition of engineered t cells
CN109917120B (zh) * 2017-12-12 2022-10-28 清华大学 检测翻译后修饰蛋白质与其配体间相互作用的成套试剂
CA3108657A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Juno Therapeutics, Inc. Processes for generating engineered cells and compositions thereof
US20210246189A1 (en) 2018-09-03 2021-08-12 Technische Universitaet Muenchen A double peptide tag combining reversibility and flexible functionalization
WO2020056047A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Juno Therapeutics, Inc. Methods for mass spectrometry analysis of engineered cell compositions
JP7582940B2 (ja) 2018-10-31 2024-11-13 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 細胞の選択および刺激のための方法ならびにそのための装置
MX2021005021A (es) 2018-11-06 2021-08-11 Juno Therapeutics Inc Proceso para producir celulas t geneticamente modificadas.
US20220252580A1 (en) 2019-04-23 2022-08-11 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Reversible cell detection with conjugates having a linker for increased fluorescent brightness and an enzymmatically releasable fluorescent moiety
US20220220504A1 (en) 2019-05-28 2022-07-14 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for Generation of Genetically Modified T Cells
EP3980530A1 (en) 2019-06-07 2022-04-13 Juno Therapeutics, Inc. Automated t cell culture
CN114600172A (zh) 2019-08-30 2022-06-07 朱诺治疗学股份有限公司 用于将细胞分类的机器学习方法
EP4028049A1 (en) 2019-09-11 2022-07-20 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG In vitro method for transduction of t cells in the presence of malignant cells
JP2023500318A (ja) 2019-10-30 2023-01-05 ジュノ セラピューティクス ゲーエムベーハー 細胞選択および／または細胞刺激デバイスならびに使用方法
US20230090117A1 (en) 2020-01-28 2023-03-23 Juno Therapeutics, Inc. Methods for t cell transduction
CA3170153A1 (en) 2020-02-12 2021-08-19 Juno Therapeutics, Inc. Bcma-directed chimeric antigen receptor t cell compositions and methods and uses thereof
IL295384A (en) 2020-02-12 2022-10-01 Juno Therapeutics Inc Cd19-directed chimeric antigen receptor t cell compositions and methods and uses thereof
KR20230022868A (ko) 2020-05-13 2023-02-16 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 재조합 수용체를 발현하는 공여자-배치 세포의 제조 방법
WO2022043023A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Releasable reagents for cell separation
CN112285083B (zh) * 2020-10-28 2022-01-07 上海睿钰生物科技有限公司 一种细胞杀伤效力的评价方法
EP4334341A2 (en) 2021-05-06 2024-03-13 Juno Therapeutics GmbH Methods for stimulating and transducing t cells
WO2023147510A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Juno Therapeutics, Inc. Chromatography arrays and related methods and kits
EP4227423A1 (en) 2022-02-09 2023-08-16 Technische Universität München Means and methods for identifying high affinity t-cells
WO2023209175A1 (en) 2022-04-28 2023-11-02 Bio-Recell Ltd. Method for separating target cells
WO2023213969A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024124132A1 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Juno Therapeutics, Inc. Machine learning methods for predicting cell phenotype using holographic imaging
WO2024161021A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Juno Therapeutics Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
US20240285762A1 (en) 2023-02-28 2024-08-29 Juno Therapeutics, Inc. Cell therapy for treating systemic autoimmune diseases
WO2025049253A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Juno Therapeutics, Inc. Bridged cycle‑based inhibitors of dna‑dependent protein kinase and compositions and application in gene editing
WO2025049250A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Juno Therapeutics, Inc. 6,6-core silacycle based inhibitors of dna-dependent protein kinase and compositions and application in gene editing
WO2025049247A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Juno Therapeutics, Inc. 5,6-core silacycle based inhibitors of dna-dependent protein kinase and compositions and application in gene editing
WO2025049254A1 (en) 2023-08-25 2025-03-06 Juno Therapeutics, Inc. Pyrazolopyridine based inhibitors of dna-dependent protein kinase and compositions and application in gene editing

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4851341A (en) 1986-12-19 1989-07-25 Immunex Corporation Immunoaffinity purification system
DE4237113B4 (de) 1992-11-03 2006-10-12 "Iba Gmbh" Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins
DE19641876B4 (de) 1996-10-10 2011-09-29 Iba Gmbh Streptavidinmuteine
US5985658A (en) 1997-11-14 1999-11-16 Health Research Incorporated Calmodulin-based cell separation technique
EP1227321A1 (en) 2000-12-28 2002-07-31 Institut für Bioanalytik GmbH Reversible MHC multimer staining for functional purification of antigen-specific T cells
DE10113776B4 (de) 2001-03-21 2012-08-09 "Iba Gmbh" Isoliertes streptavidinbindendes, kompetitiv eluierbares Peptid, dieses umfassendes Fusionspeptid, dafür codierende Nukleinsäure, Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fusionsproteins und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Gewinnung des Fusionsproteins
SI1425389T1 (sl) * 2001-08-23 2012-02-29 Genmab As Humana protitelesa, specifična za interlevkin 15 (IL-15)
FR2841905B1 (fr) 2002-07-05 2004-09-03 Centre Nat Rech Scient Fragments fab mutants de l'anticorps anti-cd4 chimere 13b8.2 et leurs applications
JP4517081B2 (ja) * 2005-12-22 2010-08-04 独立行政法人産業技術総合研究所 免疫センサ用デバイス
WO2008054030A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-08 Kagoshima University IgG-BINDING PEPTIDE
CN101587043B (zh) * 2008-05-20 2013-10-02 北京莱尔生物医药科技有限公司 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法
US9273136B2 (en) 2008-08-04 2016-03-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fully human anti-human NKG2D monoclonal antibodies
TR201811128T4 (tr) * 2011-07-18 2018-08-27 Iba Gmbh Bir hedef hücrenin tersinir şekilde boyama yöntemi.

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018119982A (ja) 2018-08-02
US20150301046A1 (en) 2015-10-22
HK1258907A1 (zh) 2019-11-22
EP2734538A2 (en) 2014-05-28
US9188589B2 (en) 2015-11-17
EP2734538B1 (en) 2018-05-02
US20140295458A1 (en) 2014-10-02
SI2734538T1 (sl) 2018-09-28
EP3418295A1 (en) 2018-12-26
WO2013011011A3 (en) 2013-05-02
PL2734538T3 (pl) 2018-10-31
JP2014529361A (ja) 2014-11-06
CN103797028A (zh) 2014-05-14
SI2734538T2 (sl) 2024-10-30
ES2682750T3 (es) 2018-09-21
ES2682750T5 (en) 2025-02-04
EP3418295B1 (en) 2020-09-02
CN103797028B (zh) 2017-08-25
CN107843730A (zh) 2018-03-27
CN107843730B (zh) 2021-08-20
PT2734538T (pt) 2018-08-02
EP2734538B2 (en) 2024-07-03
WO2013011011A2 (en) 2013-01-24
US9023604B2 (en) 2015-05-05
JP6770989B2 (ja) 2020-10-21
JP6310388B2 (ja) 2018-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6770989B2 (ja) 標的細胞を可逆的に染色する方法
AU2022200527B2 (en) Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells
JP6678593B2 (ja) 標的細胞を単離する方法
NZ763585B2 (en) Methods, kits and apparatus for expanding a population of cells