SU968036A1 - Способ получени меченого белка - Google Patents

Description

(З) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕ ННОГО БЕЛКА

Изобретение относитс  к улучшенному способу получени  меченного белка , биологически активного соединени , которое южет найти применение в биологии и медицине дл  радиационной диагностики различных заболеваний .

Известны меченные.белки, которые различаютс  природой изотопа, обуславливающего радиоактивность, и методами введени  данного изотопа в молекулу белка. Наиболее широко известны способы промемивани  белков изотопами иода - 125) и ,131J  вл ющимис  у-источниками .11 и 2.

При этом введение радиоактивного иода осуществл ют либо непосредственно в аминокислотные остатки белка, содержащие ароматические группы, либо химической модификацией различных реакционных центров белка специальными реагентами, содержащими изотопы иода.

Несмотр  на то, что техника регистрации -излучени  проста, работа с изотопами иода неудобна из-за их малого периода полуспада. Кроме того, включение иода в белковую молекулу часто приводит к нарушени м структуры молекулы белка, в частности к изненению антигенной специфичности.

Известны способы введени  в белок долгоживуцих изотопов трити  и углеро10 да- Т, обладающих м гким 5-излучением .

Например, описан способ получени  радиоактивного препарата белка реакцией восстановительного алкилировани 

15 с использованием .С-Лормальдегида. По этому способу на первой стадии реакции происходит взаи -юдейстпие формальдегида с Е-аминогруппами, лизина ° белка с образованием лабильных оснований Шиффй. Втора  стади реакции заключаетс  в восстановлении лабильных оснований Пиффа до стабильных метиль396803 ных групп при помощи боргидрида натри . Обработка белков данным способом осуществл етс  при рН близком к в температуре около 3. Недостатком метода  Ъл етс  узкий j диапазон значений рН и температуры обработки белка, св занный с неустойчивостью боргидрида натри . При помо-. щи метода восстановительного алкилиро-г вани  с использованием боргидрида нат-Ю ри  можно променивать только ограниченный круг белков, стабильных именно при данных строгих параметрах обработ ки. . . , . . Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  апр(соб получени  меченных тритием или углеродог- -1 белков, который состоит в обработке белка радио Ьктивным формальдегидом с последующи) восстановлением образующихс  лабильных оснований Юиффа до стабильных соединений цианоборгидридом натри  ,, NotBHjCN . 6N Этот способ позвол ет проводить реакцию восстановлени  при нейтральных значени х рН и иироком температурном интервале (от , до 37°С), что позво:Л ет расширить номенклатуру белков, способных к промачиванию при указанных режимах обработки t. Известные способы обработки белков реакцией восстановительного алкилировани  с использованием в качестве восстанавливающих агентов боргидрида и цианборгидрида натри  дают возможность получать меченные белки, сохран ющие антигенную специйичность, с удельной радиоактивностью 0,,0 мкК /г белка, котора ,однако,часто недостаточна дл  тестировани  микроколичеств белка, с которыми приходитс  иметь дело в биохимических исследовани х . Вследствие того, что радиоактив ность меченного препарата определ етс  количеством С-формальдегида, необратимо св занного с аминогруппами белка, данный метод не позвол ет получать препараты с большей удельной радиоактивностью, чем указано выше, без наруиени  антигенной специфичности белка. Изменени  в структуре белка при использовании значительных количеств формальдегида и, особенно, .восстанавливающих агентов, обусловле4 |ны,во-первых, блокированием большого числа -аминогрупп белка, а во-вторых способностью боргидрида и цианборгидрида натри  восстанавливать не только основани  (Ьфа, но и карбоксильные группы, сульфидные св зи, определ ющие стабильность конформации белка. Целью изобретени   вл етс  повышение удельной радиоактивности промечиваемого белка при сохранении.его антигенной специфичности. . Поставленна  цель достигаетс  тем, что со| ласно способу получени  меченного белка с помощью формальдегида, заключающемус  в том, что формальдегид подвергают взаимодействию с алифатической аминокислотой, меченной тритием или углеродом-1, и образующимс  при этом производным общей формулы R- СН-СОО-Н I N CHij где Г ал кил или С-алкил, обрабатывают белок в водном буферном растворе при рН 5,5-10,0 и температуре , при мол рном соотношении компонентов формальдегида, аминсжислоты и белка О, ,ОбО:1 ,9x10 . . Предпочтительными вариантами, проведени  процесса  вл ютс  использование в качестве водного буферного раствора фосфатного и боратного буферов; в качестве алифатической аминокислоты используют Н-лизин, И-глицин %-лейцин. . Предлагаемый способ позвол ет получить белок с удельной радиоактивностью 120-909 мкК/мг белка. Антигенна  специфичность белка, промеченных путем восстановительного алкилиррвани  в указанных концентрационных параметрах формальдегида и восстановител , также практически не измен етс . Однако нельз  получить более высокопромеченные препараты белков методом восстановительного алкилировани  формальдегида без серьезного нарушени  антигенной специфичности. Дл  экономного расходовани  радиоактивных аминокислот, белков и прочих материалов важное значение имеет возможность получени  высокопромеченных белков с заданной удельной радиоактивностью путем варьировани  удельной радиоактивности или концентрации аминокислот (.фиг. 1и пример 2,3). Из табл, 2 также видно, что с увеличением температуры возрастает удель на  радиоактивность промечюваемого белка. Однако дл  конкретного белка имеетс  верхний предел температурного режима обработки, св занный с дeнatypaциoнными процессами,. Установлено, что существует определенное значение рН, завис щее от .природы конкретного белка, при котором удельна  радиоактивность промечиваемого предлагаемым способом белка достигает максимального значени  (фиг. 2К. . На фиг. 1 представлена зависимость величины удельной радиоактивности миоглобина, промеченного предлагаемым способом, от концентрации используемой радиоактивной аминокислоты, в частности моногидрохлорида И-лизина на фиг. 2 - зависимость величины удельной радиоактивности (а ) миоглобина и (б ) бычьего сывороточного альбумина , меченных предлагаемым способом , от величины рН среды. ; -Совокупность отмеченных преимущест способа промечивани  белков обеспечивает возможность создани  р да отеЧественных комплектов препаратов дл  радио.изотопного анализа в биохимических ив медицинских исследовани х, например дл  диагностики инфаркта миокарда и т.д. Обща  схема получени  меченного белка., К 0,1 мл раствора радиоактивной коммерческой алифатической аминокислоты требуемой удельной радиоактивности или концентраций добавл ют последовательно 0,01 мл 0,9-1,2 М раст эора формальдегида (оптимально 1,12 d 0,1 мл раствора белка концентрации 0,08-0,20 мг/мл. Реакцию белка с лабильными производными формальдегид и алифатической аминокислоты, образующимс  практически мгновенно при их смешении, провод т в течение су так как за это времч, согласно кинетическим измерени м, взаимодействие практически заканчиваетс . Процесс промечивани  провод т при соответствующем значении рН от 5,5 до 10,0 задаваемым в области рН 8,0-10,0 боратным буфером, а в области 5,5-8,0 фосфатным буфером, и температуре 20-48°С Режим обработки р(Г и температура огра ничиваютс  областью устойчивости каждого конкретного белка. Меченный белок отдел ют от низкомолекул рных компонентов элюированием через хроматографическую колонку с сет фадексом или посредством диализа. Удельную радиоактивность белка опре- ; дел ют нанесением пробы объемом 0,02 МЛ наг мембранный фильтр Сынпор с последующим просчитыванием (Ь-излучени  и толуольном ацинтилл торе на сцинтилл ционном счетчике. Пример 1. Дл  получени  меченного тритием человеческого миогло;бина вз то на 1 мг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности kQ,0 К/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/мл. Режим обработки: рН 10,0 и температура 20С. В результате промечивани  полу1иен белок с удельной радиоактивностью 50,0 мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электроосмофорезе составл л 1:25б, титр нативного белка 1:25б. Примеры 2 и 3. Дл  получени  сравнительных данных по вли нию на удельную радиоактивность человеческого миогло(5ина удельной радиоактивности и концентрации используемой аминокислоты , вз то на 1 мг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности соответственно ,0 К/мН и (0,25 К/мМ с радиоактивной концентрацией в обоих случа х 1,0 мК/мл. Режим обработки: pfl 7,9и температура . В результате промечивани  получены белки с удельной радиоактивностью соответственно 617,0 мкК/мг и 175,0 мкК/мг. Титры меченных белков в обоих случа х во встречном электроосмофорезе. составл в Ьи 1:256, титр исходного белка также 1:256. Пример 4. Дл  получени  меченного тритием бычьего сывороточного альбумина вз то на 1 мг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 0,0 К/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/ /мл. Режим обработки: рН 5,5 и температура 25®С. В результате промечивани  получен белок с удельной радиоактивностью 273«0 мкК/мг.Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител составл л 1:f096, титр исходного белка . Пример 5. Дл  получени  меченного углеродом-1 бычьего сыаороточного альбумина вз то на 1 мг белка 10,0 мК С-лейцина удельной радио активности 5«0 K/м и радиоактивной концентрации 1,0 . Режим обработки: рН 9,0 и температура . В результате промечивани  получен белок с удельной радиоактивностью 291,0 мкК/мг. Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител состав л л 1:409б, титр нативного белка . Пример 6. Дл  получени  меченного по тритию бычьего сывороточного альбумина вз то на 1 мг белка

Челове25 7,0 ческий миоглобин

0,058 0,2П 10,0 мК моногидрохлорида Эн-лизина удельной радиоактивности kQ,Q к/мМ и радиоактивной концентрации 1,0 мК/ /мл. Режим обработки: рН 9,0 и температура 8°С. В результате промечивани  получен белок с удельной радиоактивностью 909,0 мкК/мл. Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител составл л 1:409б, титр исходного белка 1 . В приведенных табл. 1 и . даны конкретные примеры составлени  реакционн }1х смесей дл  получени  меченного белка. Таблица 1

1

То же

10,0 20

37 7,9

37 7,9

Бычий

25 7,0 сывороточный альбумин

То же

25

5,5

II

37 9,0

Примечание. Числитель - удельна  радиоактивность , К/мМ.

Знаменатель - радиоактивна  проба, мК/мг белка.

0,058 0,20

НатиоТо же ный белок Пример 7. Получение меченного человеческого миоглобина при исполь зовании формальдегида с концентрацией меньшей нижнего предела. Дл  получени  меченного тритием человеческого миоглобина вз то на 1 кг белка 10,0 мК моногидрохлорида Н-лизина удельной радиоактивности 0,0 К/ /мМ и радиоактивной концентрации 1,0 , при этом концентраци  белка в пробе составл ла 10,0 мкг. Режим обработки: рН 10,0 и температура 20°С Концентраци  используемого формальдегида 0, М. В результате промечивани  в течение 4 сут получен белок с удельной радиоактивностью 280 мкК/мг, в течение 8 сут мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электроocMO (bope3e составл л 1,25б, титр нативного белка - .i Пр и м е р 8. Получение меченно- го бычьего сывороточного альбумина при

Таблица 2

Claims (3)

1:256 использовании формальдегида с концентрацией большей верхнего предела.. Дл  получени  меченного тритием бычьего сывороточного альбумина вз то н.э Гкгбелка 10,0 мК моногидрохлорида К-лизина удельной радиоактивности 0,0 К/мМ .и радиоактивной концентрации 1,0 мК/mi, при этом концентраци  белка в пробе составл ла 10,0 мкг. Режим обработки: рН 5,6, температура 25°С. Концентраци  используемого формальдегида 0,08 М. В результате промечивани  в течение 2 сут получен белок с удельной радиоактивностью 120 мкК/мг, в течение V сут 70 мкК/мг. Титр меченного белка в реакции нейтрализации антител составл ет: через 2 сут ийкубации 1: , через Л сут - 1:102. Титр нативного белка - 1: +096. Пример 9. Использование Н-глицина в качестве меченной аминокислоты. Дл  полумени  меченного тритием человеческого миоглобина вз то на 1 мг.белка 12,5 мК, Н-глицина удельной радиоактивности 19,0 К/мМ и радиоактипной концентрации 1,0 мК/мл, при i этом концентраци  белка в пробе составл ла 8,0 мкг. Режим обработки: рН 8,0 и температура 37°С. В результате промечивани  получен белок с удельной радиоактивностью 310 мкК/мг Титр меченного белка во встречном электроосмофорезе составл л 1:256, Титр нативного белка: 1:25б. Пример 10, Использование Н-глицина в качестве меченной амино- 15 кислоты. Дл  получени  меченного тритием человеческого миоглобина вз то на 1 мг. белка 5,0 мМ Н-глицина удельной радиоактивности 19,0 К/мМ и радиоактив- 20 ной концентрации Т 1,0 мК/мл,,при этом концентраци  белка составл ла 20,0 мкг в пробе,. Режим обработки: рН 8,0 и температуре . В результате промечивани  получен белок с удельной 25 радиоактивностью 130 мкК/мг. Титр меченного белка во встречном электроосмофорезе составл л 1:526, титр нативного белка - 1:256. Сохранность антигенной спёцифич- до ности человеческого миоглобина проверена во встречном электроосмофорезе, сохранность антигенной специфичности бычьего .сывороточного альбумина проверена в реакции нейтрализации анти- jj тел. Данные табл. 2 показывают, что по сравнению с известным способом значительно увеличиваетс  удельна  радиоактивность белков, промеченных пред- о лагаемым способом, что позвол ет npo-t водить биохимические и медицинские исследовани  с меньшими концентраци ми белков. Так получен Н-миоглобин высокой удельной радиоактивности без нарушени  его антиге+нной специфичности. На основе этого препарата метод радиоиммунологического определени  уровн  миоглобина в ыворо,тках позвол ет определ тьмиоглобин в концентрации не менее 15 х 1(. В результате параллельного определени  уровн  миоглобина в сыворотках больных и здоровых людей с помощью импортного набора (Sorin Biomedica , Итали ) и с помощью описываемой петодики, где меченным антигеном  вл етс  Н-миоглобин, оказалось. что ны рал опр рот пол гло Нмым ка ча пов бел спе ют нок лер про , где полученные результаты сопоставле (табл. 3). В табл. 3 приведены результаты палельного радиоиммунологического еделени  уровн  миоглобина в сывоках больных инфарктом миокарда, ученные при использовании J-миобина (Sorin Biomedica, Итали ) и миоглобина, .промеченного предлагаеспособом . Таблица 3 Формула изобретени  1. Способ получени  меченного бел с помощью формальдегида, отлиющийс  тем, что, с целью ышени  удельной радиоактивности ка при сохранении его антигенной цифичности, формальдегид подвергавзаимодействию с алифатической амиислотой , меченной тритием, или. одрм-Н и образую1цимс  при этом изводным общей формулы |-сн-соои Н-СН е - . И - алмил илис-алкил,

13

оОрае)атывают белок в водном буферном pacTUope при рН 5, и температуре при мол рном соотношении формальдегида, аминокислоты и белка 0,,0(0:1,9x10 -4x10 :

2.Способ по п. Г, отличающий с   тем, что в качестве водно буферного раствора используют фосфатный и боратный буферы.

3.Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что в качестве алифатической аминокислоты используют Н-лизин , Н-глицин и С-лейцин.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1. Во Eton Л.Р.., Hunter W.M. The FabeB.ing of proteins to highspecific radioactivities by conjugation

И

to a 125J-containinq acylatinq agent. AppFication to the radToimmunoassay. Biochem. J. 1973 , U3, 3, 529.

2.Greenwood F.C., Hunter A/.M, The preparation of ISU-tabetFed hunan growth hornone of high specific radioactivitg , Biochen. J. 1963, 89,N 1, lU.

3.RTce R.H., fTenns G.E. Radioactive rabcFPinq of protein In vjtrP j.Biof.Chen,1971, , N 3, 331.

t. Dottarlo-Martln D., Ravet J.Mj Radiotabefting of proteins by reductive aFkytation with € -formaМёhyde and sodium cyanoborohydride AnaP. Biochen. 1978, 87, N 2, c. 5б2 (прототип).

s

678

10 рН

Фнг.1