SU927853A1 - Способ непрерывного культивировани свет щихс бактерий рнотовастеRIUм рноSрноRеUм - Google Patents

Description

Изобретение относится к микробио' логин и может быть использойано для тестирования ряда биологически активных веществ. Постоянное свечение получаемого урожая бактерий позволяет создать биолюминесцентный датчик неп- ⁵ рерывного действия. Использование бактерий с постоянным уровнем люминесценции удобно и при обычном применении светящихся бактерий для тестирования загрязнения окружающей среды, ¹⁰ ядов и наркотиков в медицине и т.д. Оно может быть использовано и в.мик-> робиологической промышленности для непрерывного получения биомассы бак-?· терий с высокой производительностью ¹⁵ и большим содержанием люциферазы. Высокое содержание люциферазы упрощает методику очистки этого фермента. Может быть использовано в научных __ исследованиях при изучении связи между люминесценцией и процессами метаболизма в бактериях.

Известен способ непрерывного культивирования светящихся бактерий Photobacterium belarerskii в турбидостате, где поддерживается на постоянном уровне оптическая плотность суспензии til·

Однако в процессе культивирования биолюминисценция изменяется на два порядка, т.е. активность люциферазы в клетке варьируют в 100 раз. Исполь зование такой биомассы для тестирования биологически активных веществ крайне затруднительно, а биомасса непригодна для получения, очищенных препаратов люциферазы.

Известен также способ культивирования Ph. phosphoreum (СМВ 844), где подачей питательной среды и вы- . водом готового продукта на постоянном уровне поддерживают совмещенный си< нал, который складывается из проходящего через культуру света от излучателя (оптическая плотность) и биолюминесценции бактерий. Соотношение з 9271 между интенсивностью прошедшего че~ ^: рез культуру света и интенсивностью биолюминесценции выбирают приблизительно равным 1:1. Питательная среда, применяемая для культивирования в момент ее добавления в культуру светящихся бактерий, должна ингибировать биолюминесценцию. Для этого используют сложную питательную среду Oxoid Nutrient Broth (СМ1), к кото- ι рой добавляют глицерина 1% об./об. и 2,5% вес./об. NaCl [2].

Недостатком этого способа является низкая стабильность биолюминесценции, которая составляет+ 8%. Био- ι масса получаемая при этом более

4 люминесценции бактерий 2, самописца с позиционным регулятором 3» насосадозатора, подающего питательную среду в культиватор 4, резервуара с питательной средой 5 и сборника урожая 6.

Термостатируемый при температуре оптимальной для роста и люминесценции бактерий культиватор заполняется питательной средой. Туда же вводится инокулят бактерий. Культивирование ведут при интенсивном перемешивании и барботаже. Интенсивность биолюминесценции и количество клеток увеличивается. После достижения заданного уровня люминесценции с поудовлетворительна для получения люциферазы, но не пригодна для использования ее в качестве биолюминесцентного датчика непрерывного действия, когда требуется фиксировать изменение свечения меньше ±8%. Кроме того, способ требует применения сложной аппаратуры управления процессом куль мощью позиционного регулятора включа ется насос-дозатор, подающий питательную среду в культиватор. Одновре2о менно эквивалентный объем культураль ной жидкости со светящимися бактерия ми сливается в сборник урожая. После разбавления культуры и уменьшения интенсивности биолюминесценции, контивирования.

Цель изобретения - повышение стабильности биолюминесценции бактерий.

Поставленная цель достигается тем что питательную среду добавляют, когда биолюминесценция превышает заданный уровень, причем питательная среда содержит хлористый натрий фосфорнокислый натрий двузамёщенный, фосфорнокислый калий однозамещенный, фосфорнокислый аммоний двузамещенный, сернокислый магний, пеп тон и глицерин, при ношении компонентов

Хлористый натрий Фосфорнокислый натрий двузамещенный Фосфорнокислый калий однозамещенный Фосфорнокислый аммоний двузамещенный Сернокислый магний .Глицерин

Пептон

Вода следующем соот, г/л:

28-30

8-10

1,0-1,1

0,50-0,55

0,08-0,12

1-2,5 5,0-5,1 До 1000 мл

На чертеже изображено устройство, применяемое для реализации предлагаемого способа.

Устройство состоит из термостатируемого культиватора 1, датчика био, такты позиционного регулятора возвращаются в исходное положение и подача питательной среды прекращается. Затем процесс повторяется.Интенсивность люминесценции записывается непрерыв30 но с помощью самописца. Скорость подачи питательной среды насосом-дозатором выбирается так, чтобы проток (отношение объема среды, прокаченного насосом за определенный промежуток ₃₅ времени к объему культиватора) был больше максимальной скорости роста бактерий.

Пример. Готовят 2 л среды, содержащей, г/л:_

NaCE 28-30

Nai^HPO^· 1 2HqO 8,0-10

KHqPO₄ 1,0-1,1 (NH₄)q_HPO₄ 0,50-0,55

MgS0₄ 7Н<20 0,08-0,12

Глицерин 1,0-2,5

Пептон 5,0-5,1

Эта среда заливается в термостатируемый при 20±0,1°С культиватор ₅₀ емкостью 150 мл. После инокуляции бактерий исходная концентрация клеток ^ζ0,65· 10¹ кл/мл, а интенсивность биолюминесценции 2,5 отн.ед. Барботаж осуществляют из расчета, чтобы количество подаваемого в 1 мин воздуха ⁵⁵ было равно объему культиватора, т.е.

150 мл/мин,после достижения заданного уровня, равнбго 40 отн.ед., замыкается позиционный регулятор и включается насос-дозатор подачи питательной среды, обеспечивающий скорость протока 1,5 4^-1. Максимальная удельная скорость роста Ph. phosphoreum на данной среде равна 0,4 ч\ После установления стационарного режима удельная скорость роста бактерий 0,3-0,35 ч*¹ , а число клеток 0,4 х х1(Г® г/мл.

Использование предлагаемого способа культивирования позволяет стабилизировать биолюминесценцию Ph phosphoreum с точностью+0,6%. При этом не требуется сложная аппаратура. Вся установка собрана из широко распространенных приборов и узлов. Производительность предлагаемого способа культивирования в 2,5 раза выше, чем в периодическом режиме.

Claims (3)

1. Изобретение относитс  к микробиологии и может быть использойано дл  тестировани  р да биологически актив ных веществ. Посто нное свечение по лучаемого урожа  бактерий позвол ет создать биолюминесцентный датчик неп рерывного действи . Использование бактерий с посто нным уровнем люмине ценции удобно и при обычном применении свет щихс  бактерий дл  тестировани  загр знени  окружающей среды,  дов и наркотиков в медицине и т.д. Оно может быть использовано и в.иикробиологической промышленности дл  непрерывного получени  биомассы бактерий с высокой производительностью и большим содержанием люциферазы. Высокое содержание люциферазы упрощает методику очистки этого фермента . Может быть использовано в научны исследовани х при изучении св зи между люминесценцией и процессами метаболизма в бактери х . Известен способ непрерывного культивировани  свет щихс  бактерий Photobacterium belarerskii в турбидостате , где поддерживаетс  на пос- I то нном уровне оптическа  плотность суспензии tilОднако в процессе культивировани  биолюминисценци  измен етс  на два порйдка, т.е. активность люциферазы в клетке варьируют в 100 раз. Исполь зование такой биомассы дл  тестировани  биологически активных веществ крайне затруднительно, а биомасса непригодна дл  получени , очищенных препаратов люциферазы. Известен также способ культивировани  Ph. phosphoreum (СМВ 8), где подачей питательной среды и вы- водом готового продукта на посто нном уровне поддерживают совмещенный сигнал , который складываетс  из проход щего через культуру света от излучател  (оптическа  плотность) и биолюминесценции бактерий. Соотношение между интенсивностью прошедшего через культуру света и интенсивностью биолюминесценции выбирают приблизительно равным 1:1. Питательна  среда , примен ема  дл  культивировани  в момент ее добавлени  в культуру свет щихс  бактерий, должна инги бировать биолюминесценцию. Дл  этог используют сложную питательную сред Oxoid Nutrient Broth (СМ1), к которой добавл ют глицерина 1% об./об. и 2,5% вес./об. NaCI {21, Недостатком этого способа  вл етс  низка  стабильность биолюминес ценции, котора  составл етt 8. Био масса получаема  при этом более удовлетворительна дл  получени  люц феразы, но не пригодна дл  использовани  ее в качестве биолюминесцен ного датчика непрерывного действи  когда требуетс  фиксировать изменение свечени  меньше ±8%. Кроме того способ требует применени  сложной аппаратуры управлени  процессом кул тивировани .. Цель изобретени  - повышение ста бильности биолюминесценции бактерий Поставленна  цель достигаетс  те что питательную среду добавл ют, когда биолюминесценци  превышает за данный уровень, причем питательна  среда содержит хлористый натрий фосфорнокислый натрий двузамёщенный , фосфорнокислый калий однозамещенный , фосфорнокислый аммоний двузамещенный , сернокислый магний, пеп тон и глицерин, при следующем соотношении компонентов, г/л: Хлористый натрий Фосфорнокислый натрий двузамещенный Фосфорнокислый калий однозамещенный 1,0-1,1 Фосфорнокислый аммоний двузамещенный 0,50-0,55 Сернокислый 0,08-0,12 магний Глицерин 1-2,5 5,0-5,1 Пептон До 1000 мл На чертеже изображено устройство примен емое дл  реализации предлага емого способа. Устройство состоит из термостати руемого культиватора 1, датчика био люминесценции бактерий 2, самописца с позиционным регул тором 3, насоса дозатора, подающего питательную среду в культиватор 4, резервуара с питательной средой 5 и сборника урожа  6. Термостатируемый при температуре оптимальной дл  роста и люминесценции бактерий культиватор заполн етс  питательной средой. Туда же вводитс  инокул т бактерий. Культивирование ведут при интенсивном перемешивании и барботаже. Интенсивность биолюминесценции и количество клеток увеличиваетс . После достижени  заданного уровн  люминесценции с помощью позиционного регул тора включаетс  насос-дозатор, подающий питательную среду в культиватор. Одновременно эквивалентный объем культуральной жидкости со свет щимис  бактери ми сливаетс  в сборник урожа . После разбавлени  культуры и уменьшени  интенсивности биолюминесценции, контакты позиционного регул тора возвращаютс  в исходное положение и подача питательной среды прекращаетс . Затем процесс повтор етс .Интенсивность люминесценции записываетс  непрерывно с помощью самописца. Скорость подачи питательной среды насосом-дозатором выбираетс  так, чтобы проток (отношение объема среды, прокаченного насосом за определенный промежуток времени к объему культиватора) был больше максимальной скорости роста бактерий. Пример. Готов т 2 л среды, содержащей, г/л: NaCE28-30 .12H|jO 8,0-10 КН(Р041,0-1,1 ( NH4)LHP040,50-0,55 МдЗОд 7H(ip0,08-0,12 Глицерин1,0-2 ,5 Пептон5,0-5,1 Эта среда заливаетс  в термостатируемый при 20t 0, культиватор емкостью 150 мл. После инокул ции бактерий исходна  концентраци  клеток 0,65 10 кл/мл, а интенсивность биолюминесценции 2,5 отн.ед. Барботаж осуществл ют из расчета, чтобы количество подаваемого в 1 мин воздуха было равно объему культиватора, т.е. 150 мл/мин,после достижени  заданного уровн , равного 40 отн.ед., замыкаетс  позиционный регул тор и включаетс  насос-дозатор подачи питательной среды, обеспечивающий скорость протока 1,5 ч-. Максимальна  удельна  скорость роста Ph. phosphoreum на данной среде равна 0, ч . После установлени  стационарного режима удельна  скорость роста бактерий 0,3-0,35 ч , а число клеток 0,| х х1(Гв г/мл. Использование предлагаемого способа культивировани  позвол ет стаби лизировать биолюминесценцию РК phos phoreum с точностью t0,6%. При этом не требуетс  сложна  аппаратура. Вс  установка собрана из широко распространенных приборов и узлов. Произво дительность предлагаемого способа ку льтивировани  в 2,5 раза выше, чем в периодическом режиме. Формула изобретени  Способ непрерывного культивирова ни  свет щихс  бактерий Photobacterium phosphoreum на питательной сре де, содержащей источник углерода и минеральные соли, отличающийс  тем, что, с целью повышени  стабильности биолюминесценции питательную среду добавл ют, когда биолюминесценци  превышает заданный уровень, причем питательна  среда содержит хлористый натрий, фосфорно ислый натрий двузамещенный, фосорнокислый калий однозамещенный, осфорнокислый аммоний двузамещеный , сернокислый магний, пептон и гЛи ерин при следующем соотношении омпонентов, г/л: Хлористый натрий Фосфорнокислый натрий двузаме8-tO щенный Фосфорнокислый калий однозаме1 ,0-1,1 щенный Фосфорнокислый аммоний двуза0 ,50-0,55 мещенный Сернокислый Mai- 0,08-0,12 Глицерин 1.0-2,5 Пептон 5,0-5,1 До 1000 мл Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Фиш A.M. Исследование некоорых сторон метаболизма свет щихс  бактерий в непрерывной культуре. Азтореф .канд.диссертации, Красно рск, 1969.
2. 2.Wardley-Smlth В. et all. The continous culture of luminous bacteria .
3. 3. Appl. Bact., 1975, 39, p.337-3 3 (прототип).