SU841351A1

SU841351A1 - Process for preparing alpha-amylase

Info

Publication number: SU841351A1
Application number: SU792711504A
Authority: SU
Inventors: Л.М. Ермакова; Н.П. Шурупова; Т.И. Иванова; Г.В. Ставинская; В.А. Удовченко; Н.С. Дерканосова; В.М. Степанов
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Priority date: 1979-01-10
Filing date: 1979-01-10
Publication date: 1983-11-23

Description

Изобретение относитсз к .микробиологической промышленности, а именно к способам получени ot -амилазы Препараты, содержащие 46-аАилазу используютс в животноводстве, пище вой, текстильной, бумажной промышленности и других област х народного хоз йства. , Известен способ получени амилбл тических ферментных препаратов с ис пользованием штампа Вас.1 Низ subtil ВНИИгенетика-42 вьфащиванием посе ного материала на ломтиках картофел с последующей ферментацией, в ус лови х аэрации на среде, содержащей крахмал, кукурузный экстракт, нитра аммони и мел. Штамм Bacillus subti lis ВНИИгенетика-42 в лабораторных услови х в колбах имеет активность 360-450 ед/мл за 48 ч ферментации JY Однако штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42 не дает оптимальнр высоких активностей в производствен ных услови х в ферментерах емкостью 20 м. Кроме того, ферментационна среда, используема дл такого штам ма, на производстве не позвол ет получать стабильный препарат. Известен способ получени об -амилазы , предусматривак ций культивирование продуцента Bacillus subtilis G-43 В аэробных услови х на ферментационной питательнойсреде, содержащей .источники углерода - крахмал и лактозу, источник азота и фосфооа - (NH jHPOJ, ростовые факторы белково-йитаминный концентрат и кукурузный экстракт, минеральные соли NaCi, СаСО, ,, MgSO,, И воду 2 Амилолитическа активность культуральной жидкости, полученной в лабораторных услови х, в колбах составл ет 303 ед/мл. В промышленных услови х этот штамм при культивировании на ферментерах по сравнению со штаммом Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42 не про вл ет вышеотмеченной активности. В св зи с тем, что штамм Bacillus subtilisВНИИгенетика-42 в производственных услови х вл етс более .активным продуцентом, сопоставительный айализ активностей провод т с учетом этого факта. Целью изобретени Явл етс повышение выхода целевого продукта и его стабильности. . Поставленна цель достигаетс тем,- что в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44, в состав питательной среды дополнительно ввод т, % от ее объема, минер&льные соли: CaCl 0,08-0,15, КеС1тбН,.0 0,0050 ,02, ZnSO 0,001-0,003, а количество крахмала устанавливают ..равным 16-24, (NH)-, НРОи |0,9-2,0, NaCl . 0,08-0,3. Сущность способа состоит в том, что в услови х производства на ферментационной питательной среде .нового состава, содержащей крахмал, лактозу , кукурузный &кмтракт, амилолитичёска активность Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44 на 15% выше , чем у штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42о Так, актийность штамма ВНИИ-генетика-44 в этих услови х через 64 ч ферментации достигает 309 ед/мл, в то врем как активность ВНИИгенетика-42 232 ед/мл. В таблице приведены сравнительные данные трех параллельных ферментации с использованием штаммов Bacillus subtilis ВНИИгенетика-42 и ВНИИгенетика-44 в производственных услови х в ферментерах емкостью 20 и . Продолуштельность ферментации 60-64 ч.The invention relates to the microbiological industry, in particular to methods for producing ot-amylase. Preparations containing 46-a-alase are used in animal husbandry, food, textile, paper industry and other national households. A known method for the preparation of amylbltic enzyme preparations using the Bash.1 punch. Bottom subtil VNIIgenetika-42 by fusing seed material on potato slices followed by fermentation, under aeration conditions on a medium containing starch, corn extract, ammonium nitrate and chalk. The Bacillus subti lis strain VNIIgenetika-42 in flasks has an activity of 360-450 units / ml for 48 hours of JY fermentation. However, the Bacillus subtilis strain VNIIgenetika-42 does not give optimally high activities under production conditions in fermenters of 20 m. Except Moreover, the fermentation medium used for such a strain in production does not allow obtaining a stable preparation. A method is known for producing about-amylase, including the cultivation of the producer of Bacillus subtilis G-43. In an aerobic condition on a fermentation nutrient medium containing carbon sources - starch and lactose, a source of nitrogen and phospho-oa - (NH jHPOJ, growth factors, protein yitamine concentrate and corn extract, mineral salts of NaCi, CaCO2, MgSO, and water 2 The amylolytic activity of the culture fluid obtained under laboratory conditions in flasks is 303 units / ml. Under industrial conditions, this strain is cultivated on a fermenter x compared to the Bacillus subtilis strain, the URIIgenetica-42 does not exhibit the above-mentioned activity. Due to the fact that the Bacillus subtilis strain, the UNIIgeneticic-42 is more active under production conditions, a comparative analysis of the activities is carried out taking this fact into account. The aim of the invention is to increase the yield of the target product and its stability .. The goal is achieved by the fact that the Bacillus subtilis VNIIgenetika-44 strain is used as a producer, a% of its volume is added to the nutrient medium, miner and flax e salts: CaCl 0.08-0.15, KeS1tbN, .0 0.0050, 02, ZnSO 0.001-0.003, and the amount of starch is set equal to 16-24, (NH) -, NROi | 0.9-2 , 0, NaCl. 0.08-0.3. The essence of the method consists in the fact that under conditions of production on a fermentation nutrient medium of a new composition containing starch, lactose, corn & tract, amylolytic activity of Bacillus subtilis VNIIgenetika-44 is 15% higher than that of Bacillus subtilis strain VNIIgenetika-42o , the actuality of the VNII genetics-44 strain under these conditions after 64 h of fermentation reaches 309 units / ml, while the activity of the Institute of Genetics is 42 232 units / ml. The table shows the comparative data of three parallel fermentation with the use of Bacillus subtilis strains VNIIgenetik-42 and VNIIgenetik-44 under production conditions in fermenters with a capacity of 20 and. The duration of fermentation 60-64 h.

Средн амилолитическа активность по трем ферментаци м Штамм Baolllus suttilis ВНИИгенетика-44 вл етс мутантом исходного штамма Bacillus aubtelis В-340, полученного из Музе живых культур Й1нститута ВНИИгенетика. Штам полу304 чен в результате применени генетиRO-сёлекционных методов и в промышленных услови х вл етс более продуктивным , чем прототип - штамм 5 Bacillus sibtilis ВНИИгенетика-42.The average amylolytic activity of the three fermentations. The strain Baolllus suttilis VNIIgenetica-44 is a mutant of the original strain Bacillus aubtelis B-340, obtained from the Museum of Living Cultures Institute VNIIgenetica. The strains obtained as a result of the use of genetic selection methods and under industrial conditions are more productive than the prototype — Bacillus sibtilis strain VNIIgenetic-42.

Ниже приведена биологическа характеристика штамма Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44.Below is the biological characteristics of the strain Bacillus subtilis VNIIgenetika-44.

Культурально-морфологические признаки Штамма Bacillus sibtilis ВНИИгенетика-44.Cultural and morphological features of the Strain of Bacillus sibtilis ARIIgenetics-44.

Морфологи . Штам представл ет собой грамположительную, спорообразукидую палочку, размером 2,5-4,5 х X 0,5-0,7(4 . Размер спор: 1,0-1,.2 X 0,6-0,7(й .Morphology. Strains is a gram-positive, spore-forming stick, 2.5-4.5 x X 0.5-0.7 in size (4. Spore size: 1.0-1, .2 X 0.6-0.7 (th .

Культуральные и физиологические признаки.Cultural and physiological signs.

М со-пептонный агар (МПА). Через 48 ч и,нкубации при образует желторато-серые плоские, круглые, «олонии, диаметром 2,5-3,5 мм и с лопастными кра ми: колонии не врас тают в агар. Поверхность гладка , матова . .M co-peptone agar (MPA). After 48 hours, the incubations form yellow-gray flat, round, oloniums, 2.5-3.5 mm in diameter and with lobed edges: the colonies do not grow into agar. The surface is smooth, dull. .

Посев штрихом на м со-пептонном агаре. При инкубации в течение 24 ч при З7с рост хороший. Штрих нитевидный с лопастным краем и гладкой, матовой поверхностью. Sowing the stroke on the m with-peptone agar. When incubated for 24 hours at 37 ° C, growth is good. Stroke filiform with a blade edge and a smooth, matte surface.

Посев уколомо Рост на поверхност Культура аэробна .Sowing injections Growth on the surface Culture is aerobic.

М со-пептонный бульон (МПВ) При инкубации в течение 24 ч при . без встр хивани рост без помутнени среды, на поверхности образуетс суха пленка. При встр хивании на качалке - сильное помутнение среды. При сто ник образуетс пленка.M co-peptone broth (MPV) When incubated for 24 h at. without shaking the growth without clouding the medium, a dry film is formed on the surface. When shaking on the rocking chair, there is a strong turbidity of the medium. When standing, a film is formed.

Агаризованна среда Хоттингера. При инкубации в течение 48 ч при образует желтовато-серые, круглые , плоские колонии с белым лопастным краем, диаметром 3,5-5 мм. Поверхность шероховата , матова . На синтетической среде с минеральньом азотом (среза Спицайзена) растет в виде мелких круглых колоний диаметром 1-2 мм серовато-белого цвета. Поверхность матова . Колонии срастаютс с .субстратом.Agarized environment Hottinger. When incubated for 48 hours, it forms yellowish-gray, round, flat colonies with a white lobed margin, 3.5–5 mm in diameter. The surface is rough, dull. On synthetic medium with mineral nitrogen (Spitsizen cut) grows in the form of small round colonies with a diameter of 1-2 mm grayish white. Matt surface. Colonies grow together with substrate.

На ломтиках картофел пигмента не образует, имеет матовую, сухую, морщинистую поверхность.The potato does not form pigment on slices; it has a matte, dry, wrinkled surface.

Желатину разжижает на вторые сутки .Thins gelatine on the second day.

Крахмал гидролизует.Starch hydrolyzes.

Молоко пептониэирует и подщелачивает .Peptonetized milk and alkalinized.

Отношение к источникам углербда. Глюкозу, лактозу, фруктозу, сахарозу ассимилирует..Attitude to carbon sources. Glucose, lactose, fructose, sucrose assimilates ..

Штамм хран т в лиофильно высушенном состо нии в стекл нных ампулах.The strain is stored in a lyophilized state in glass ampoules.

В отличие от прототипа, обладающго сниженной активностью щелочной протеинаоы, штайм Bacillus sibtilis ВНИИгенетика-44 имеет нормальный урвень синтеза щелочной протеиназы.Unlike the prototype, which has a reduced alkaline proteinaceous activity, the Bacillus sibtilis stem of the All-Russian Scientific Research Institute of Epidemiology-44 has a normal level of alkaline proteinase synthesis.

Штамм Bacillus subtilis, ВНИИгенетика-44 хранитс в Музее живых The strain Bacillus subtilis, VNIIgenetika-44 is stored in the Museum of the Living

культур института ВНИИгенетика под регистрационным номером ЦМПМ В-1737.cultures of the Institute VNIIgenetika under registration number CMPM B-1737.

Штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-44 выращивают поверхностным способом в колбах в виде пленки на жидкой питательной среде, содержащей следующие компоненты: крахмал, (КН) CgHjOr, КНуРО,, , CaSOjj , FeSD, , CuSO, п-аминобензойна кислота, водау рН среды 6,0-6,3. Полученным таким образом посевным материалом в-количестве 0,01-0,02% от объема ферментационной среды засевают аппарат емкостью 20 м , содержащий 10 м ферментационной питательной среды состава, % крахмал 16-24, лактоза 0,2-0,3, .кукурузный экстракт 0,8-1,2, БВК 0,2-0,4, (НН)2НР04 0,9-2,0, NaCl 0,08-0,3., Caeiy 0,08-0,15, CaCO-j 0,02-0,03, 0,05-0,25, 0,02-0,09, FeCl 6HjO 0,050 ,02, ZnSQ4 0,001-0,003, CuSO 0,00025-0,00040, MnS04 0,0001-0,0002 вода ,72,2-81,7. ,The strain Bacillus subtilis VNIIgenetika-44 is grown superficially in flasks in the form of a film on a liquid nutrient medium containing the following components: starch, (KN) CgHjOr, KNURO ,,, CaSOjj, FeSD,, CuSO, p-aminobenzoic acid, water pH 6 0-6.3. The inoculum thus obtained in an amount of 0.01-0.02% of the volume of the fermentation medium is seeded with an apparatus with a capacity of 20 m, containing 10 m of fermentation nutrient medium of the composition,% starch 16-24, lactose 0.2-0.3,. corn extract 0.8-1.2, BVK 0.2-0.4, (HH) 2HP04 0.9-2.0, NaCl 0.08-0.3., Caeiy 0.08-0.15, CaCO-j 0.02-0.03, 0.05-0.25, 0.02-0.09, FeCl 6HjO 0.050, 02, ZnSQ4 0.001-0.003, CuSO 0.00025-0,00040, MnS04 0, 0001-0,0002 water, 72.2-81.7. ,

Содержание крахмала в ферментационной питательной среде 8-10%, остальное количество крахмала добавл ют в виде подпитки в ферментер во врем культивировани .The starch content in the fermentation broth of 8-10%, the rest of the starch is added as a feed to the fermenter during the culture.

Согласно предлагаемому способу не провод т полного гидролиза крахмала , вxoд щe o в состав ферментационной среды (в том числе и добавл емого в виде лодпитки). Достаточно провести разжижение крахмала, т.е. осуществить его неполный гидролиз только до амилодекстринов (син окраска при реакции с йодом). В производстве по лицензии, приобретенной Советс,ким Союзом {Главмикробиопром ) у французской фирмы Рапидаз, в составе ферментационной среды используют глубоко осахаренный крахмал , получаемый после полного гидролиза его до декстринов (бура окраска при реакции с йодом)According to the proposed method, the complete hydrolysis of starch, inlet o into the composition of the fermentation medium (including that added in the form of hydrate), is not performed. It is enough to dilute the starch, i.e. carry out its incomplete hydrolysis only to amylodextrins (blue color by reaction with iodine). In production under a license acquired by Sovets, by the KimUnion {Glavmikrobioprom) from the French company Rapidaz, deeply saccharified starch obtained after complete hydrolysis of it to dextrins is used as part of the fermentation medium (borax color upon reaction with iodine)

Пример 1. Посевной материал получают выращиванием штамма Bacillu subtilis ВНИИгенетика-44 в колбах в виде пленки в жидкой питательной среде состава, %: крахмал 10, (NH4) 3, РО 0,03, MgSOjTH O 0,15, КНдРО 0,2, СаЗОц 0,15., FeS04 0;002, MnSQ4 0,000125, GuS04 0,00075, п-аминобензойна кислота 0,001, вода 86,2, , рН 6,0-6,3, температура 35-3б С.Example 1. The seed material is obtained by growing the strain Bacillu subtilis VNIIgenetika-44 in flasks in the form of a film in a liquid nutrient medium composition,%: starch 10, (NH4) 3, PO 0.03, MgSOjTH O 0.15, KNDRO 0.2, SALT 0.15., FeS04 0; 002, MnSQ4 0.000125, GuS04 0.00075, p-aminobenzoic acid 0.001, water 86.2, pH 6.0-6.3, temperature 35-3b C.

Пoлyчeнньfй посевной материал в количестве 0,01% от объема среды в ферментере внос т в аппарат объемом 20 м, содержащий 10 м ферментационной среды состава, %: крахмал 24 (в среду внос т 8%, остальное добавл ют в виде подпитки в ходе ферментации ), лактоза 0,2, кукурузный экстракт 0,9, БВК 0,2, (NH),lf РО, 1, 0,08, CaCljg 0,08, CaCOf 0,02, Rf. 0,07, 0,02, Fed,бН,,0 0,005, ZnSO 0,001, 0,00035, MnSO..j 0,0002, вода 73,3. pH 6,5. Пеногаситель 0,05%„ Процесс ферментации ведут при с аэрацией в течение 64 ч„ Культуральную жидкость, имек аую активность 309 ед/мл oi гамилазы, высушивают на распылительной сушилке . Выход готового продукта 73%. П р и м е р 2. Штамм-продуцент, приготовление йосевного материала те же, что в примере 1. Отличие состоит в составе ферментационной сре ды и температуре культивировани . Культивирование провод т в ферменте ре объемом 20 м, заполненном 10 м ферментационной питательной среды следук цего состава, %: крахмал 16 (в среду внос т 10%, остальное доба л ют в виде подпитки в ходе ферментации ), лактоза 0,3, кукурузный экс тракт 1,1, БВК 0,4, (NH/) Р04 1,7 NaCl 0,2, CaCl/2 0,12, СаСОз 0,03, Мк3.04-7Н О 0,2, KfO 0,9, 0,015, ZnS04 0,002, CuSO 0,00025, MnSO 0,0001, вода 80,0. pK 6,6. Пенбгаситель 0,05%. Процесс ферментации ведут при с аэрацией в течение 60 ч. Культуральную жидкост имеющую амилолитическую активность 301 ед/мл, высушивают на распылител ной сушилке. Выход сухого продукта 71%. Преиму1цес±во способа состоит в том, что значительно сокращаетс врем приготовлени ферментационной питательной среды (2-3 ч вместо 8-10). За счет этого увеличиваетс оборачиваемость оборудовани , что позволит получить дополнительный экономический эффект. Температуру ферментации поддерживают в пределах 34-37 С, рН 6-8. Дл получени высокого выхода tf -амилазы рН поддерживаетс в кислой зоне . После завершени ферментации культуральную жидкость,высушивают, стандартизуют сол ми и используют в качестве неочищенного ферментного препарата . Лл - получени очищенного препарата oi -амиЛазы клетки после завершени фермента11ии отдел ют фильтрованием или центрифугированием. После отделени клеток очищенный препарат ОС, -амилазы получают из жидкости одним из известных методов, например осаждением с помощью растворител , высаливанием,, сг5пцением раствора и т.д. По предварительным расчетам экономи от использовани способа в промышленности составит 250 тыс.руб./год.An amount of 0.01% of the volume of the medium in the fermenter is introduced into a 20 m apparatus containing 10 m of fermentation medium of the composition,%: starch 24 (8% is added to the medium, the rest is added as feed during the fermentation ), lactose 0.2, corn extract 0.9, BVK 0.2, (NH), lf PO, 1, 0.08, CaCljg 0.08, CaCOf 0.02, Rf. 0.07, 0.02, Fed, bN ,, 0 0.005, ZnSO 0.001, 0.00035, MnSO..j 0.0002, water 73.3. pH 6.5. 0.05% defoamer “The fermentation process is carried out with aeration for 64 hours.” The culture fluid, the activity of which is 309 units / ml oi gamylase, is dried in a spray dryer. The yield of the finished product is 73%. PRI mme R 2. The strain producing, preparation of the yosevic material is the same as in example 1. The difference consists in the composition of the fermentation medium and the cultivation temperature. Cultivation is carried out in an enzyme with a volume of 20 m, filled with 10 m of fermentation nutrient medium following the composition,%: starch 16 (10% is added to the medium, the rest is added as feed during fermentation), lactose 0.3 exhaust section 1.1, BVK 0.4, (NH /) Р04 1.7 NaCl 0.2, CaCl / 2 0.12, CAS02 0.03, Mk3.04-7H 0 0.2, KfO 0.9 , 0.015, ZnS04 0.002, CuSO 0.00025, MnSO 0.0001, water 80.0. pK 6.6. Penbgasitel 0.05%. The fermentation process is carried out with aeration for 60 hours. The culture fluid having amylolytic activity of 301 units / ml is dried on a spray dryer. The yield of dry product 71%. The advantage of the process is that the preparation time of the fermentation broth is significantly reduced (2-3 hours instead of 8-10). Due to this, the turnover of equipment is increased, which will provide an additional economic effect. The temperature of fermentation is maintained within 34-37 C, pH 6-8. To obtain a high yield of tf-amylase, the pH is maintained in the acidic zone. After the fermentation is complete, the culture fluid is dried, standardized with salts and used as a crude enzyme preparation. LL - obtaining a purified preparation of oi-lazy cells after the completion of the enzyme 11 is separated by filtration or centrifugation. After cell separation, the purified OS preparation, α-amylases, is obtained from a liquid by one of the known methods, for example, by solvent precipitation, salting out, by reducing the solution, etc. According to preliminary estimates, the savings from using the method in industry will be 250 thousand rubles / year.

Claims

1. METHOD FOR PRODUCING ', -AMILASES, which provides for the cultivation of the producer of Bacillus subtilis under aerobic conditions on a fermentation nutrient medium containing. carbon sources - starch and lactose, a source of nitrogen and phosphorus (ΝΗ ^ ΗΡΟ ^, growth factors - protein-vitamin concentrate and corn extract, mineral salts NaCl, CaCO ^, K _? S0 ₄ , MgSO4'7H _? O, CuSO ₄ and water This is due to the fact that, in order to increase the yield of the target product and its stability, the Bacillus subtilis strain VNIIgenetika-44 is used as a producer.

2. The method according to π. 1, because of the fact that the composition of the nutrient medium is additionally introduced,% of its volume, mineral _with salt: CaCl? 0.08-0.15, FeCl _? -6H „O Sg 0.005-0.02, ZnSOf 0.001-0.003, and the amount of starch I is set equal to 16-24, (NH ₄ ) ₂ H Roc 0.9-2.0 NaCl 0.08- 0.3. C s