ют 5 мл воды, фильтруют, фильтрат после извлечени эфиром размешивают с 5 г угл . Уголь отфильтровывают, промывают 100,ил воды и элюируют 2%-ным спиртовым раствором триэтиламина. Элюаты упаривают в вакууме досуха, остаток раствор ют в 1 мл метанола и добавл ют раствор 0,06 г (0,5 ммоль) перхлората натри в 1 мл метанола . Вьшавший осадок отфильтровывают , промывают спиртом и выдел ют целевой продукт препаративпым электрофорезом на бумаге ФН-18 в буфере 0,05 М ацетат натри , рН 4,1 при напр жении 4000 В. Полосу с лодвиЖНОстью -f 0,76 относительно АМФ элюируют при +4 -4,5° С, элюат лиофилизуют, остаток промывают абсолютным метанолом, эфиром и сушат в вакууме над РгОз. Выход натриевой соли а-аминоу - (метилтио) - проииЛфосфонил-5 - аденилата 0,067 г (25%), А.МФ -fO,76, (s,i;o 13250, рН 7). На хроматогра.ммах и электрофореграммах поглошаюшее в УФ п тно окрашиваетс иингидрином, вещество окисл етс периодатом натри до соответствующего диальдегида (цыс-гликольиа группировка) и п,ри гидролизе 1н. сол -на кислота, 100° С, 10 мин} дает только аденозин-5-фосфат и а-амино-(7-метилтио)-пропилфосфоновую кислоту (наличие ангидридной св зи). Исследовалось вл.и иие а-амино-у-(метилтио ) -пропилфосфонил -5-аденилата на реакции, катализируемые валилфенилалатюл- и метион л-тРНК - синтетазами из Е. соИ В. В ходе этих реакций осиовными промежуточными соединени ми вл ютс соответственно валил-, феиилаланил-, метио-нил-5-адеиилаты . Фоофонатным аналогом последнего из иих вл етс целевой продукт , что подразумевало специфическое торможение только метиоиииового фермента . Результаты иредставлены в таблице. Иигибирование аминоацил-тРНК-синтетаз а-амино-7- (метилтио) -нропилфосфонил -5-аденилатом Как видно из данных таблицы {а-амино7- (метилтио) - пропилфосфонил -5-адени лат дейсгвует в случае метионил-тРНК,синтетазы на 3-4 -пор дка лучше, чем по отношению к другим ферментам. Пример 2. Ингибирование метионилтРПК-синтетазы натриевой солью а-амино - (метилтио) - иропилфосфоиил - 5 - адеиилата . Метионил-тРПК-синтетазу Е. соИ В иолучают , а мотиониновую тРНК из суммарной тРН Е. соН В очищают известными методами. При определении активности фермента использовали АТФ-Na соль, восстановленный глутатион C-L-метионин (56 К.) Р 2-пирофосфат натри (10 Ки1моль), активированный уголь Norit А трис НС1 и р-меркаптоэталол и остальные вещества коммерческой чистоты без предварительной очистки. Ингибирование реакций аминоацилироваии тРНК и АТФ-ФФ обмена провод т в стандартных услови х три 37-37,5° С в течение 15 мин. 50 мкл 9-ilO- -9- раствора а-амино-у- (метилтио)-иропилфосфонил -5-аде-нилата внос т в инкубадионную пробу непосредственно перед добавлением фермента. Инкубационна смесь содержит в пересчете на 0,5 мл: 0 мкмоль грмс НС1 (рН 7,4), 5 мкмоль хлористого магни , 5 мкмоль хлористого кали , 1 мкмоль восстановленного глутатиона, 1мкмоль АТФ, 10 нмоль C -L-метионина, 0,2 мг тРПК и 0,007 мг фермента. Выход С -метионил-тРИК определ ют по известному методу. Скорость АТФ-ФФг обмена определ ют в реакционной смеси, содержащей в 1 мл: 100 мкмоль грыс НС1 (рН 8,0), 5 мкмоль хлористого магии , 100 мкмоль фтористого кали , 10 мкмоль (З-меркаптоэтанола, 2мкмоль АТФ, 2 мкмоль Р -пирофосфата натри , 0,015 мк фермента. Пробы анализируют известным методом. Константа ,ингибировани метионил-тРНК синтетазы в реакции АТФ-ФФ,- обмена равна Кг(М) , 3 реакции а.миноацилироваии тРНК К,(М) 5. 10-S.5 ml of water are filtered, the filtrate, after extraction with ether, is stirred with 5 g of charcoal. The carbon is filtered off, washed with 100, sludge water and eluted with 2% alcoholic solution of triethylamine. The eluates are evaporated in vacuo to dryness, the residue is dissolved in 1 ml of methanol and a solution of 0.06 g (0.5 mmol) of sodium perchlorate in 1 ml of methanol is added. The precipitate is filtered off, washed with alcohol and the target product is isolated by preparative paper electrophoresis with FN-18 in 0.05 M sodium acetate buffer, pH 4.1, at a voltage of 4000 V. A strip with a δ 0.76 relative to AMF is eluted at + 4-4,5 ° C, the eluate is lyophilized, the residue is washed with absolute methanol, ether and dried in vacuum over PgOz. The output of the sodium salt of a-amino - (methylthio) - proi-L-phosphonyl-5 - adenylate 0.067 g (25%), A. MF -fO, 76, (s, i; o 13250, pH 7). On chromatograms and electrophograms, what is absorbed in a UV spot is stained with yinhydrin, the substance is oxidized with sodium periodate to the corresponding dialdehyde (cys-glycol group) and n, hydrolyzed to 1N. hydrochloric acid, 100 ° C, 10 min} gives only adenosine 5-phosphate and a-amino- (7-methylthio) -propylphosphonic acid (presence of anhydride bond). The potency of α-amino-y- (methylthio) -propylphosphonyl-5-adenylate in the reactions catalyzed by valylphenyl allyl and methion of l-tRNA synthetases from E. soI was investigated. In the course of these reactions, the axial intermediates are respectively Valyl, feiylalanyl-, methi-nyl-5-adeiylate. The phoofonate analogue of the latter of these is the target product, which implies the specific inhibition of only the methioii enzyme. The results are shown in the table. Inhibition of aminoacyl-tRNA synthetases of a-amino-7- (methylthio) -propylphosphonyl-5-adenylate 3-4 pores better than with other enzymes. Example 2. Inhibition of methionylTRP synthetase by sodium a-amino - (methylthio) - yropylphosphoyl - 5 - adeiilate. Methionyl-tRPK synthetase of E. coli B is obtained, and the motionin tRNA from the total tPH of E. coH B is purified by known methods. In determining the enzyme activity, ATP-Na salt, reduced glutathione C-L-methionine (56 K), P 2 sodium pyrophosphate (10 Ki1mol), Norit A tris HC1 activated carbon and p-mercaptoethalol and other substances of commercial purity without prior purification were used. The inhibition of the aminoacylation reactions of tRNA and ATP-FF metabolism is carried out under standard conditions of three 37-37.5 ° C for 15 minutes. 50 µl of 9-ilO-9-a solution of a-amino-y- (methylthio) -propylphosphonyl-5-adylate is added to the incubation sample immediately prior to the addition of the enzyme. The incubation mixture contains 0.5 ml: 0 μmol grms HC1 (pH 7.4), 5 μmol magnesium chloride, 5 μmol potassium chloride, 1 μmol reduced glutathione, 1 μmol ATP, 10 nmol C -L-methionine, 0, 2 mg tRPK and 0.007 mg of the enzyme. The yield of C-methionyl TRIC is determined by a known method. The rate of ATP-FGF metabolism is determined in a reaction mixture containing in 1 ml: 100 µmol HC1 rat (pH 8.0), 5 µmol chloride magic, 100 µmol potassium fluoride, 10 µm (3-mercaptoethanol, 2 µmol ATP, 2 µmol P sodium pyrophosphate, 0.015 microns of enzyme. Samples are analyzed by a known method. Constant, inhibition of methionyl-tRNA synthetase in the ATP-FF reaction, - exchange equals Kg (M), 3 reactions of aminoacylation and tRNA K, (M) 5. 10-S .
АТФ-аденозинтрифосфат; ФФ;-пипофосфатший обмеи. ATP-adenosine triphosphate; FF; -pipofosfaty obmei.