Изобретение, относитс к новёвм хи мическим соединени м 1-oU и/Э-дезок . си-В-рубофуранозидам 5-триметилсили урацила формулы I и li S 51(сн «о 1 1н ( CH3)5Si-V но н о I про вл ющим противовирусную активность .. Известно применение 5-иод-2-деэ оксиуридина дл лечени вирусных заболеваний герпетической этиологии Г1 3. Цель изобретени - новыехимичес кие соединени : 1-о6- и -дезокси-D-рибофуранозиды 5-триметилсилилурац ла, про вл кхцие противовирусную активность и рас1аир ющие арсенал средств воздействи на живой организм - достигаетс путем -синтеза да ных соединений основанного на извествой реакции конденсации тримети сцлильных производных урацила с ацилгалогенозой.. f2 J. Способ получени 1-о6- и /5-дезокс . -0-рибофуранозидов 5-триметилсилилурсщила обычно осуществл ют превращением 5 триметилсилилурацила в бис-О-триметилсилильное производное дейст вием гексаметилдисилазана, с последу щей конденсацией полученного бис-о-триметилсилильного производного 5-триметиЛсилилурацила с 2-дезокси-3 -ди-О-п-толу.ил-о -О-рибофураноэилхло ридом в присутствии SnC ц , сн тием защитных групп метилатбм натри и разделением изомеров тонкослойной хрс 4атографией обычными приемами. П р и м е р. 1-oL- и /З-дезокси-D:-рибофуранозиды 5-триметилсйлилурацила . Смесь,состо щую из 3 г (16,3 ммоль ) 5-триметилсилилурацила, 3 мг сульфата аммони и 12 мл гекСаметилдисилазан г кип т т в течение 11 ч. Избыток гексаметилдисилазана отгон ют в вакууме, остаток раствор ют в 12 мл безводного дихлорэтана и прибавл ют к суспензии 5 .г (12,9 ммоль) 2-дезок си-3 f З-ди-О-п-толуил-оС-В-рибофурано .зилхлорида и 0,5 мл (4,2 ммоль) SnCl В 12 мл безводного дихлорэтана,Реакционную массу перемешивают 4 -ч при 20-22с, затем промывают последовательно насыщенным раствором бикарбоната натри (2x5 мл) и водой. Растворитель отгон ют в вакууме, остаток хроматографируют на пластинах (2Ох х20 см) с силикагелем мкм /Chemapol, ЧССР) в системе хлороформ метанол (10:1), собира фракцию с R|. 0,6. Получают 3,5 г (50,7%) 2-дезокси-З , 5-ди-о-п-толуйл-В-рибс фуранозил-5-триметилсилилурацила . К полученному веществу прибавл ют 100 мл 0,1 н раствора метилата натри в метаноле, через 2 ч реакционную массу нейтрализуют ионообменной смолой Дауэкс-50 х8 (Н) до рН 7 по универсальному индикатору, смолу отдел ют , растворитель отгон ют в вакууме , остаток (2,56 г) хроматографируют на пластинах с силикагелем в системе этилацетат-метанол (9:1) при двухкратном пропускании систекы растворителей через пластину. Из зоны с большей подвижностью выдел ют 0,87 г (44,4%) 1-0-Б-дезоксирибозида 5г-тримеТилсилилурацила с т.пл. (,Щ°+9,9°(с 1, спирт). УФ-спектр (96%-ный спирт): Л д 265 нм, 9060. ПМР (CDjOD, ТМС): 7,84 м.д. (Н), 6,31 м.д. (Н.,, J-,2 6,6 Гц), 4,42 м.д. (Н(),- 3,96 м.д. (HJ, J453rO Гц, J.fj 3,3,Гц), 3,76 м,д. (2Н(, JHH12 Гц), 2,27 м.д. (2ti,i), 0,21 м.д. (MeaSi). Найдено, %: С 47,20; Н 6,59; N 9,48; Si 8,97. /3 2° Вычислено, %i-C 47,03f Н 6,80; И 9,14; Si 9,1.7. Из зоны с меньшей хроматографической подвижностью выдел ют 0,79 г (40,3%) 1-о1 Б-дезоксирибозида 5-триметилсилилурацила с т.пл. 64-66°С, 25,7° (с 1, спирт). УФ-спектр (96%-НЫЙ спирт) ,с 265 нм, f 1010. ПМР (CDjOD, ТМС): 7,95 м.д. (Н), 6,29 м.д. (Н , J,2(8,1 Гц,. J-f2 2,1 Гц), 4,37 м.д. (H,t), 4,28 м.Д. (), 3,57 м.д. -(2Hjf), 2,7 и 2,04 м.д. (Н2( и JZB Гц, , 15 Гц), 0,23 м.д. (MejSi ). Найдено, %: С 46,6; Н 6,50; Ы 9,47; Si 8,98. ., С. / 20Вычислено , %: С 47,03; Н 6,80; N 9,14; Si 9,17. Определение противовирусной активности . Противовирусна активность ин витро -дезокси-рибофуранозидов 5-триметилсилилурацила i определ ют по следующей методике КуЛьтуры куриных фибробластов в дозе 10 мл внос ; в 100-граммовые матрицы. Повицкой. Через 48 ч при образовании сплошного моносло культуры инфицируют вирусом герпеса простого типа 1 или осповакцины с множественностью от 0,01 до 1 на клетку. После одночасовой инкубации монослой трижды промывают средой . 199 и внос т препараг в дозах от 32 до 250 мкг/мл, матрицы помещают при З7с.на 18-20 ч. Каждую дозу препарата и каждую дозу вируса испытывают в двух матрицах. В качестве контрол служат: а) два матраца с клеточными культурами, инфицированными вирусом, но не обработанные препаратом, б) два матраца, в которые внос т препарат, Но культуры не инфицируют вирусом (контроль токсичности препарата). Через 18-20 ч после инфицировани культуры просматривают подмикроскопом и трижды замораживают на сухом льду. После последнего оттаивани материал центрифугируют при 1000 об/мин в те ,чение 20 мин,- Затем методом титровани на однослойных культурах куриных фибробластов определ ют в надосадочНой жидкости урожай вируса в опытных и контрольных культурах. Из испытуемых материалов готов т дес тикратные разведени на среде 199 и внос т по 1 мл в пробирки с куриными фибробластами . Пробирки инкубируют при З7с в течение 5 дней и учитывают результаты по цитопатическому действию. При описанных услови х постановки эксперимента урожай вируса герпеса в контрольных культурах составл ет 10 -10 ЦПДд-о/мл. а вируса осповакцины - 10 i-10 . При ,внесении за вленных препаратов урожай вируса в зависимости от дозы препарата и инфицирующей дозы вируса снижаетс на 2.-5 лг Щ1Д g(j , Препараты оказывают не только профилактическое, но и лечебное действие. Выраженной профилактической и лечебной эффективностью обладают дозы 62 мкг/мл и более. Тимидин снимал ингибирующее действие описанных соединений при внесении в клеточные культуры в эквимол рных концентраци х, что приводило к полному восстановлению репродукции вируса герпеса. Описанные соединени не вл ютс токсичными дл клеток, поскольку они не вызывали видимых цитопатических изменений в неинфицированных клетках при 7-дневном наблюдении. При внутри брюшинной инъекции мышам ДЦ рПрепара та составл ла более 400 мг/кг веса животного. Данные о противовирусной активнос ти за вл емых препаратов приведены в табл. 1, 2 и 3.The invention relates to the novel chemical compounds 1-oU and / E-dezok. 5-trimethylsilyl uracil C-B-ruby-furanosides of formula I and li S 51 (see about 1 1n (CH3) 5Si-V but N about I exhibiting antiviral activity. It is known to use 5-iodine-2-de-oxyuridine for the treatment of viral diseases of herpetic etiology G1 3. Purpose of the invention —New chemical compounds: 1-о6-and-deoxy-D-ribofuranosides 5-trimethylsilylurale, exhibiting antiviral activity and disseminating the arsenal of effects on a living organism — is achieved by —synthesis and compounds based on the reaction of condensation trimeti scyliline derivatives of uracil with acylhalogenose .. f2 J. The method for preparing 1-o6- and 5-deoisis. of the obtained bis-o-trimethylsilyl derivative of 5-trimethyl-lsilyl-uracil with 2-deoxy-3-di-O-p-tolu.yl-o-O-ribofuranoyl chloride in the presence of SnC c, removal of the protective groups of sodium methylate, and separation of the isomers of thin-layer xp 4 chromatography ordinary pr emami. PRI me R. 1-oL- and / 3-deoxy-D: 5-trimethylsilyl-luracil 5-trifluoro-furanosides. A mixture consisting of 3 g (16.3 mmol) of 5-trimethylsilyl uracil, 3 mg of ammonium sulfate and 12 ml of hexamethyldisilazane g is boiled for 11 hours. Excess hexamethyldisilazane is distilled off in vacuo, the residue is dissolved in 12 ml of anhydrous dichloroethane and 5 .g (12.9 mmol) of 2-deoc Si-3 f C-di-O-p-toluyl-oC-B-ribofuranosyl chloride and 0.5 ml (4.2 mmol) SnCl B are added to the suspension. 12 ml of anhydrous dichloroethane, the reaction mass is stirred 4-h at 20-22 s, then washed successively with a saturated solution of sodium bicarbonate (2 x 5 ml) and water. The solvent is distilled off in vacuum, the residue is chromatographed on plates (2Ox x 20 cm) with silica gel (µm / Chemapol, Czechoslovakia) in chloroform-methanol (10: 1), collecting the fraction with R |. 0.6. 3.5 g (50.7%) of 2-deoxy-3, 5-di-o-p-toluyl-B-rybs, furanosyl-5-trimethylsilyl-uracil are obtained. 100 ml of a 0.1 N solution of sodium methylate in methanol was added to the obtained material, after 2 hours the reaction mass was neutralized with a Dowex-50x8 (H) ion exchange resin to pH 7 using a universal indicator, the resin was removed, the solvent was distilled off in vacuo, the residue (2.56 g) chromatographic on plates with silica gel in the system ethyl acetate-methanol (9: 1) with twice passing the sytemc solvent through the plate. From a zone with greater mobility, 0.87 g (44.4%) of 1-0-B-deoxyriboside 5g-trimeTylsilyl-uracil with m.p. (, W ° + 9.9 ° (c 1, alcohol). UV spectrum (96% alcohol): L d 265 nm, 9060. PMR (CDjOD, TMS): 7.84 ppm (H ), 6.31 ppm (H., J-, 2 6.6 Hz), 4.42 ppm (H (), - 3.96 ppm (HJ, J453rO Hz, J.fj 3.3, Hz), 3.76 m, d (2H (, JHH12 Hz), 2.27 ppm (2ti, i), 0.21 ppm (MeaSi). Found ,%: C, 7.80; H, 6.59; N, 9.48; Si, 8.97; / 3 2 °; Calculated,% iC 47.03f, H, 6.80; And 9.14; Si, 9.1.7. 0.79 g (40.3%) of 1-o1 B-deoxyriboside 5-trimethylsilyl-uracil with mp 64-66 ° C, 25.7 ° (c 1, alcohol) were isolated with less chromatographic mobility. spectrum (96% alcohol), with 265 nm, f 1010. PMR (CDjOD, TMS): 7.95 ppm (H), 6.29 ppm (H, J, 2 (8, 1 Hz, J-f2 2.1 Hz), 4.37 ppm (H, t), 4.28 ppm (), 3.57 ppm - (2Hjf), 2, 7 and 2.04 ppm (H2 (and JZB Hz, 15 Hz), 0.23 ppm (MejSi). Found o%: C 46.6; H 6.50; Y 9.47; Si 8.98., C. / 20 Calculated,%: C 47.03; H 6.80; N 9.14; Si 9 , 17. Determination of antiviral activity The antiviral activity of in vitro-deoxy-ribofuranoside 5-trimethylsilyl-uracil i is determined according to the following procedure: Contribute 10 ml of chicken fibroblasts; in 100-gram matrices. Povitskoy. After 48 h, when a continuous monolayer is formed, cultures are infected with herpes simplex virus type 1 or vaccinia with a multiplicity of 0.01 to 1 per cell. After one hour of incubation, the monolayer is washed three times with medium. 199 and make preparations in doses from 32 to 250 µg / ml, the matrix is placed at 3.7. For 18-20 hours. Each dose of the drug and each dose of virus are tested in two matrices. The controls are: a) two mattresses with cell cultures infected with the virus, but not treated with the preparation, b) two mattresses into which the preparation is applied, But cultures do not infect with the virus (control of the toxicity of the preparation). After 18-20 hours after infection, the cultures are examined with a microscope and frozen three times on dry ice. After the last thawing, the material is centrifuged at 1000 rpm for 20 minutes. Then, the virus yield in the test and control cultures was determined by titration on single-layer cultures of chicken fibroblasts in a supernatant liquid. Ten-fold dilutions on medium 199 were prepared from the tested materials and introduced into 1 ml tubes with chicken fibroblasts. The tubes are incubated at 3-7s for 5 days and take into account the results on the cytopathic effect. Under the experimental conditions described, the herpes virus harvest in control cultures is 10 -10 CPDd-o / ml. vaccinia virus - 10 i-10. With the introduction of the claimed preparations, the yield of the virus, depending on the dose of the preparation and the infectious dose of the virus, is reduced by 2. -5 l Shch1D g (j, The preparations have not only a preventive, but also a therapeutic effect. The pronounced preventive and therapeutic efficacy is given by doses of 62 µg / ml and more. Thymidine removed the inhibitory effect of the compounds described when introduced into cell cultures at equimolar concentrations, which led to the complete restoration of the herpes virus reproduction. The compounds described are not toxic to cells OK, since they did not cause visible cytopathic changes in uninfected cells during a 7-day observation. When intraperitoneally injected into mice of DCs, the preparation was more than 400 mg / kg of animal weight. The antiviral data of the claimed drugs are shown in Table 1. , 2 and 3.
Таблица 1 Ингибирующее действие 1-о1-дезокси-В-рибофуранозида 5-триметилсилилурацила (ot-дезоксирибозида) на вирус герпеса при внесении в клеточные кул ,туры через 1 ч после инфицировани . Доза пре-I Число ЦПД Множественность парата, ингибируинфицировани мкг/мл прев тЯ о/клетI паратом Лечебную эффективность oi-дезоксирибозида ин витро определ ли по следующей методике. Культуры куриных фибробластов инфицируют вирусом простого герпеса с множественностью . 0,1 ЦПДуд на клетку. -Через 4 ч инкубации культуры трижды промывают средой 199 и внос т препарат в дозе 250 мкг/мл. Далее опыт провод т по описанной вьойЁ методике. Урожай вируса в контрольных культурах составл ет lOC ЦПД50/МЛ, а в культурах, обработанных препаратом,он равен 10 ЦПД5о/мл т.е. препарат ингибировал -урожай вируса на 4 лг . Способность тимидина снимать ингибирующее действие ot-дезоксирибозида о,предел 1ст по следующей методике. Клеточные культуры заражают вырусом герпеса с множественностью 0,1 ЦПД на клетку, после одночасовой инкубации моаослой триж н промьшают раство ром Хенкса и внос т в клеточную куль fTypy последовательно сС-дезоксирибоЦи и Т1йиидин в эквимолЩЖых концентра1ЩЯХ (по 250 мкг/мл), Эквимол рные. концентрации тимидина практически полностг ю снимают ин.гибируквдий эффект препарата, что приводи т к полному восстановлению репродукции вируса rejMieca до 10 , ; . Учитыва высокую противовирусную активность ci-дезок.сирибозида ин витро, была исследована его терапевтическа эффективность ин йитро.при экспериментальном герептическом кератите кроликов. Препарат примен лс в виде инстил л ций б раз в сутки водного раствор в 0,5%-ной концентрации. Предвари-. тельно в течение Ю дней изучалась переносимость 0,5%-ного раствора препарата ткан ми глаз кроликов. Токсикоаллергических осложнений не наблюдалось . Изуче«ие терапевтической -эффективности препарата проведено на 10 кро-. ликах. Из них 5 были контрольными, которыми б раз в сутки проводилась инстилл ци дистиллированной воды.. Заражение осуществл ют по общеприн той методике путем скарификации роговицы и внесени в конъюктивальную полость глаз кроликов. Лечение начиналось на 5 сутки от момента заражени , когда развивалась типична картина герпетического точечного кератита . Об эффективности препарата судили по степени снижени индекса т жести герпетического кератита в баллах в опытной группе по сравнению с контрольной. На чертеже представлены результаты исследовани . Как видно из чертежа , уже на вторые сутки от началалечени отмечаетс задержка процесса в опытной группе и прогрессирование в контрольной, В последующие сутки разница между леченньми и контрольными глазами возрастает. Таким образом, экспериментальные данные указывают на выраженное противовирусное действие сС-и /1-дезоксирибозидов , при сравнительно низкой токсичности.Table 1 The inhibitory effect of 1-o1-deoxy-B-ribofuranoside 5-trimethylsilyl-uracil (ot-deoxyriboside) on the herpes virus when introduced into cellular clues, tours after 1 h after infection. Pre-I dose CPD number Parate multiplicity, infection inhibition µg / ml pre v / cell per parat The therapeutic efficacy of oi-deoxyriboside in vitro was determined by the following method. Chicken fibroblast cultures are infected with a herpes simplex virus with a multiplicity. 0.1 CPDud per cell. After 4 hours of incubation, the cultures are washed three times with medium 199 and the preparation is administered at a dose of 250 µg / ml. Next, the experiment was carried out according to the described method. The virus yield in the control cultures is lOC CPD50 / ML, and in cultures treated with the preparation, it is equal to 10 CPD5o / ml, i.e. The drug was inhibited - virus yield by 4 lg. The ability of thymidine to remove the inhibitory effect of ot-deoxyriboside o, the limit is 1 st according to the following procedure. Cell cultures are infected with a herpes virus cut with a multiplicity of 0.1 CPD per cell, after one hour of incubation with a Mo-layer for three times and Hanks solution, and introduced into cell culture fTypy successively with C-deoxyribobi and T1Iidine in equimololux concentration (250 µg / ml /)) /) / person) / /)) / /)) / /)) / /) /)) / /) /))) / /) /))) / y / y /) /) /) /))) / y / x) / y / y /)) / /) /)) / person) for a cell. . concentrations of thymidine almost completely eliminate the effect of the drug in gibirucdia, which leads to the complete restoration of the reproduction of the rejMieca virus to 10; . Taking into account the high antiviral activity of ci-desox. Syriboside in vitro, its therapeutic efficacy was studied in vitro. In experimental hepatitis keratitis of rabbits. The preparation was applied in instillation form once a day with an aqueous solution in 0.5% concentration. Preliminary The tolerability of a 0.5% solution of the preparation with rabbit eye tissue was studied for 10 days. Toxicoallergic complications were observed. The study of the therapeutic efficacy of the drug was carried out at 10 CRO. faces. Of these, 5 were controls, which were instilled with distilled water once a day. Infection was carried out according to the generally accepted method by scarifying the cornea and introducing rabbits into the conjunctival cavity. The treatment started on the 5th day from the moment of infection, when the typical pattern of herpetic keratitis developed. The efficacy of the drug was judged by the degree of decrease in the herpetic keratitis her body weight index in points in the experimental group compared to the control group. The drawing shows the results of the study. As can be seen from the drawing, already on the second day from the start of treatment, there is a delay in the process in the experimental group and progression in the control group. On the next day the difference between the treatment and control eyes increases. Thus, experimental data indicate a pronounced antiviral effect of cC- and / 1-deoxyribosides, with relatively low toxicity.