SU551339A1 - Способ очистки ферментных препаратов - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ФЕРМЕНТН ЫХ ПРЕПАРАТОВ

Изббретенне относитс  к способу получени ; высокоочищенных ферментных препаратов, которые могут найти применение в пищевой, медицинской и микробиологической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике. Эти ферментные препараты могут быть использованы, в частности, в таким процессах, как производство сыров, соков, вин или медицинских сывороток.

В литературе описано большое количество способов очистки ферментов 1. Наиболее распространенным и удобным методом очистки ферментов  вл етс  метод жидкостной хроматографии , заключающийс  в адсорйдии растворенных ферментов на носителе, отделени  от носител  с применением солевых буферных растворов, с последующим обессоливанием раствора очищенного фермента, например, диализом. При этом в общем случае прочность св зывани  фермента с носителем определ етс  многими физико-химическими особенност ми фермента, характером и расположением зар женных групп, степенью диссоциации при данных услови х, размером молекул и т.д. и степень очистки фермента зависит не только от условий разделени , но и от типа примен емого носител  - адсорбента.

Наиболее широко при таком способе очистки ферментов используютс  ионнообменные носители на основе целлюлозы, такие, как диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-Ц) и карбоксиметилцеллюлоза (КМ-Ц). Известны и другие ионнообменные материалы такие, как, например, ионнообменные смолы типа Абмерлит, Дауэкс, примен емые дл  очистки некоторых белков, однако, менее эффективные дл  большинства белков, чем производные целлюлозы .

Известен, в частности, способ очистки ферментов с применением в качестве носител  ДЭАЭ-Ц 2 2. Однако этот способ обладает р дом существенных недостатков. Во-первьк, материал носител  часто оказьшаетс  нестоек к отдельным компонентам исходного ферментного препарата и загр зн ет очищенный фермент прюдуктами распада. Во-вторых , материал носител  легко подвергаетс  действию микроорганизмов. В-третьих, все известные материалы на основе целлюлозы при работе в колоночном варианте обладают высоким гидродинамическим сопротивлением. Это обсто тельсрзс приводит к длительным операци м с растворами ферментов, снижа  выход активного фермента.

Предиагаетс  способ очистки ферментных пре паратов путем ионообменной хроматографии на широкопористых адсорбентах на основе двуокиси кремни , например силохромах, которые дан избирательного действи  на ферменты и сопутствующие им примеси и белки модифицируют разлитаыми реагентами, содержащими ионогенные группы.

В случае способ осуществл ют следующим образом.

Раствор неочищенного фермента ввод т в кон такт с адсорбентом на основе двуокиси кремни , которому шриданы необходимые свойства путем обработки его химическими реагентами. Выбор реагентов дл  модификащш адсорбентов на основе двуокиси кремни  провод т, исход  из известных или предполагаемых физико-химических свойств биологического объекта, подлежащего выделению, и сопутствующих ему примесей (изоэлектрическа  точка, пол рность и т.п.).

Установлено, что модифицированный силохром, содержащий анионогенную аминогруппу (аминосилохром ), способен избирательно св зывать кислые протеиназы такие, как пепсины и химозш1ы, причем оптимальное св зывание указанных ферментов про вл етс  при рН исходной среде выще изоточки фермента, например дл  пепсина при рН 2,4-6,0, дл  химозина при 4,6-6,0.

Модифидированньш силохром, имеющий катионогенную сульфогруппу алкил/арил/ сульфокислоты , обладают избирательным дествием на нейтральные и щелевые протеиназы, оптимум действи  при рН 6,0-8,0.

Таким образом, использу  избирательность взаимодействи  модифшшрованного силохрома на билологически активные вещества, можно производить разделение ферментов и их отделение от примесей.

В качестве злюентов используют растворы солей , кислот и т.д., в воде или органических растворител х .

Установлено, что оптимальные услови  дл  элюции кислых протеиназ создаютс  при применении буферов с рН ниже изозлектрической точки ферментов - дл  пепсина с рН 1,5-2,4 и дл  химозина с рН 2,0-4,5.

Использу  буферы с различным рН в пределах 1,5-6,0, можно произвести разделение различных видов кислых протеиназ. Данный способ позвол ет

не только очищать ферменты от сопутствующих им примесей, но и в р де случаев позвол ет раздел ть родственные ферменты, например пепсины и химозины субтилизины.

Пепсины и химозины относ тс  к кислым протеиназам , поэтому при обработке их смеси аминосилохромом адсорбируютс  оба фермента. Дл  их разделени  примен ют последователыю элюзию 5 мм (рИ2,4) и 50мм (рН 1,5) растворами сол ной кислоты. Перва  фракци  злюата (рН 2,4-4,5) содержит фермент химозин; втора  фракци  злюата (рН 1,5-2,4) - фермент пепсин.

Дл  разделени  таких протеиназ, как трипсин и субтилизины, их сорбируют iia сульфосилохроме при рН 6,0-8,0, а элюцию ведут, использу  буферы: дл  трипсина с рН 3,0-5,0; суЬтилизина - с рН 8,0-12.

Таким образом, создава  оптимальные услови  дл  адсорбировани  и злюции того или иного фермента, можно обеспечить высокий выход продукта высокой степени чистоты при сохранении его высокой активности.

Очищенный фермент можно использовать в виде раствора или высущенным. Высущивают фермент лиофильно. Дл  сохранени  активности фермента при лиофильной сушке раствор очищенного фермента обрабатьшают анионитом дл  удале1т  из раствора кислоты.

На фиг. 1 и 2 приведены хроматограммы двух процессов - очистки коммерческого препарата свиного пепсина на ами.носш1охроме и очистки и разделени  на аминосилохроме пепсина и химозина из коммерческого препарата, полученного из желудков тел т (сплощна  лини  - оптическа  плотность элюата с хроматографической колонки с аминосилохромом , измеренна  детектирующим устройством при длине волны света 280 нм; пунктирна  лини  - изменение рН элюата; точки - измерение удельной активности, измеренной по скорости гидролиза гемоглобина в фракци х элюата; стрелки последовательность смены элюентов: 1 - промьтка колонки с адсорбированными на ней ферментами исходным буфером, 2 и 3 - начало пропускани  через колонку 5 мм и 50 мм соответственно растворов кислот. Максимумы оптической плотности на фиг. 1, обозначенные буквами, соответствуют: А примес м , не адсорбированным колонкой и смытым исходным буфером; Б - примесным пигментам и белкам, десорбируемым;. с колонки буфером 2 и В - ферменту пепсину, десорбируемому с колонки буфером 3 и обладающему высокой протеолитической активностью (Д). Максиму мы оптической плотности на фиг.2 соответствуют:А - примесным белкам и пигментам, не адсорбированным на колонке и смытым исходным буфером; Б ферменту химозину, десорбируемому с колонки буфером 2, и В - ферменту пепсину, десорбируемому с колонки буфером 3. Максимумы плотности Г соответствуют примес м, которые десорбируютс  с колонки при ее регенерации 1 М раствором сол ной кислоты. Участки хроматограммы на фиг. 2, выделенные вертикальной штриховкой, показывают удельную активность фракций :шюата, определенную по створаживанию молока, и соответствуют максимумам оптической плотности. Наибольша  удельна  активность (Е) соответствует максимуму (Б), т.е. фракции, содержащей фермент химозин. В указанных услови х достигаетс  высока  очистка и четкое разделение ферментов, обладающих соответствующими нм высокими активност ми (Д и Е).

В примере 1 приведен способ очистки свиного оепсынь на немо шфицировашюм си юкроме марки

С-80. Из сравнени  уде ыжж акт ввосга фермен тов, ошщенных по способам,  р аеашным в иримерах 1 и 2 (примере 2 дл  очистки свиного пепсина использован аминосилохроа модафицированньш силохром, содержапдай ио геиные аминогруппы), видно, что модификаци  приводит

к избирательному действию носител  на очищаемый фермент (см. фиг. 1).

Пример. Очистка пепсина на силохроме. Буферный раствор с рН 3,0-6,0 (целесообразно 3,5-5 5)j со держащий неочищенный свиной пепсин с удельной активностью около 19. единиц активности .(оптическую единицу (е.а./о.е.) пропускают через роматографическую колонку, заполненную силохромом марки С-80. Затем адсорбент промьшают последовательно исходным буфером 5мм и 50 мм растворами сол ной кислоты (НС1). Собирают фракцию элюата с колонки с рН 1,. Удельна  активность пепсина в указанной фракции составл ет 25-30 е.а./о.е.

П р и м е р 2. Очистка пепсина на аминосилохроме . Хроматограмма процесса очистки представлена на фиг. 1.

Буферньш раствор с рН 3,0-6,0 (целесообразно 5,4), содержащий неочищенный свиной пепсин с удельной активностью около 15-30 е.а./о.е. пропускают через хроматографическую колонку, заполненную аминосилохромом (модифицированным силохромом , имеющим анионогенную аминогруппу). Затем адсорбент промьшают последовательно исходным буфером (1) 5 мМ (2) и 50 мМ (З) растворами НС 1. Собирают фракцию элюата с колонки с рН 1,5-2,4. Удельна  активность пепсина в указанной фракции, определенна  по методу Ансона, составл ет 60-75 е.а./о.е. Перед лиофилизадаей раствор фермента обрабатывают ионитом марки АВ 17-8/АВ 16 ГС, Дауэкс 1 х 16 и т.п./ в ОН - или СНзСОО-форме, увеличива  рН раствора до 2,5-5,0, целесообразно 3,5-5,5. Выход фермента по активности после лиофилизации составл ет около 70-80%.

Примерз. Очистка и разделение пепсина и химозина.

Хроматограмма процесса представлена на 1ФИГ.2.

Буферный раствор с рН 4,5-6,0 (целесообразно 5,4), содержащий ферментный препарат, полученный из желудков тел т, пропуска ют через хроматографическую колонку, заполненную аминосилохромом . Затем адсорбент промывают последовательно исходным буфером (1) 5 мМ (2) и 50 мМ (3) растворами ПС. Собирают фракции элюата с рН 2,4- 4,5 и 1,5 - 2,4. |1ерва  фракци  содержит фермент химозин (молокоствораживающий фермент) с удельной актииностью, определ емой по створаживанию молока, равной 30000 ед. активности на миллиграмм фермента (е.а./мг). Втора  фракци  содержит пепсин желудка тел т и обладает претеолитической активностью, определ емой по расщеп лению гемоглобина (метод Лнсона), равной 20-30

а.е./о.е. 11роф шь кривой зтскзкк с колонки приведен на фиг. 3. Перед лиофилизацней указанные фракции обрабатывают ионитами марки АВ 17 -8/АВ 16 ГС, Дауэкс х 16 и т.п./ в ОН- или

СНзСХЭО-форме. Выход химозина по активности составл ет около 80%.

П р и м е р 4. Очистка субтилизина на аминосило хроме.

Буферный раствор, рН 6,0 - 11,0, целесообразно 6,0 - 8,0, содержащий фермент субтилизин,пропускают через колонку, заполненную аминосилохромом . Элюат с колонки содержит свободный от сопутствующих пигментов и других примесей субтилиз1Ш с активностью в 8-15 раз выше исходной,

определ емой по расщеплению синтетического Субстрата п-т1троа1шлида карбобензоксиглищш - глицил - л - лейцина.

П р и м е р 5. Очистка и.разделение субтилизинов на сульфосилохроме.

Буферный раствор с рН 6,0 - 1 ,0, целесообразно 6,0 - 8,0, содержащий субтилизин, пропускают через хроматографическую колонку, заполненную сульфосилохромом - модифицированным силохромом , имеющим катионогенную сульфогрутшу алкил (арют сульфокислоты. Затем адсорбент промывают последовательно исходным буфером с рН 6,0-8,0 и буферами с рН 8,1 - 9,0 и 0- 1. Собирают фракции элюата с колонки с рН в пределах 8,0 - 11,0, содержащие практически чистый субтилиЗИН , свободньш от примесных белков и пигментов. П р и м е р 6. Очистка трипсина на сульфосилохроме .

Буферный раствор с рН 6,0-8,0, содержащий трипсин, пропускают через хроматографическую

колонку, заполненную сульфосилохромом. Затем адсорбент промывают последовательно исходным буфером и 1 мМ раствором НС срН 3,0. Собирают фракции элюата с колонки с рН 3,0 - 5,0, содержащие высокоактивный трипсин, по данным злектрофореза , свободный от сопутствующих примесей и белков. Примеси элюируютс  с колонки при последующей ее промывке 10 мМ раствором шелочи И-пи 1,0 М раствором НС1.

П р и м е р 7, Очистка иммуноглобулинов.

Буферный раствор, рН 6,0-9,С целесообразно,

0,05 М фосфатный буфер с рН 7,0-8,0, содержащий препарат ачацентарного человеческого иммуноглобулина , пропускают через колонку, заполненную аминосилохромом. Элюат с колонки при промывке

ее исходным буфером содержит практически чистый плацентарный иммуноглобулин. Примеси элюируютс  с колонки при последующей ее промывке 10мМ раствором щелочи или 1,0 М раствором . сол ной кислоты.

Claims (9)

1. Способ очистки ферментных препаратов пу60 тем адсорбции растворенных ферментов на несете-;

ле с последующим отделением от носител  с приме .нением солевых буферов, отличающийс  тем, что с целью получени  ферментов высокой степени чистоты при сохранении их высокой активности , обеспечени  высокого выхода продуктаИ сокращени  в жмени очистки, в качестве носител  используют вещества на основе двуокиси кремни , например с.шохромы, модифиДйрованные реагентами и содержащие ионогенные группы дл  избирательного св зывани  ферментов и сопутствующих им примесей.

2.Способ по н. 1, о 1 ли . ющий с  тем, Что дл  избирательного св зьшанй  ферментов и сопутствующих им примесей примен ют однокргсгное или последовательное адсорбирование на силохромах , модифицированных реагентами и содержа щих различные или одинаковые ионогенные группы , а отделение от носител  производ т путем применени  одного или нескольких буферов.

3.Способ но пп. 1 и 2, отличающийс  тем, что дл  избирательного св зьшани  таких ферментов, как кислые протеиназы, например пепсины и химозины, из веществ на ооюве двуокиси кремни , используют вещества, содержащие анионогенные группы, например аминосилохромы.

4.Способ по П.Ч. I и 2, отл и ча ющий-са тем, что дл  избирательного св зьтани  таких ферментов, как щелочные и нейтральные протеиназы , например субтилизины, из веществ на основе двуокиси кремни  используют вещества, содержащие катионогенные группы, например сульфосилохромы .

5.Способ по пп. 1-3, отличающийс  тем, что, кислые протеиназы, такие, как различные 1000

пепсины, адсорбируют на носителе при рН исходного раствора 2,4-6,0, а отдел ют от носител , примен   буферы с рН 1,5-2,4.

6.Способ по Ш1. 1-3, о т л и ч а ю щи и с   тем, что кислые протеиназы, такие как различные химозины , адсорбируют при рН исходного раствора 4,5-6,0, а отдел ют от носител , примен   буферы с рН 2,0-4.5.

7.Способ по пп. 1,2,3,5,6, отличающимс  тем, что дл : очистки и разделени  кислых протеиназ , например, таких,как пепсины и химозины, их адсорбируют на носителе и затем отдел ют от Носител  последовательно путем применени  нес .кольких буферов с рН 1,5-4,5.

SfCnoco6 по пп. 1и 4, отличающийс  тем, что нейтральные и щелочные протеиназы, такие, как трипсин и субтилизин, адсорбир)тот на сульфосилохроме при рН исходного раствора 6,0-8,0, а отдел ют он носител , примен   буферы дл  субтилизина с рН 8,0-12,0 а дл  трипсина с рН 3,0- 5,0.

9.Способ но пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и и с   тем, что дл  избирательного св зывани  пигментов и , сопутствующих таким протеиназам, как субтилизины, последние адсорбируют, примен   вещества на основе двуокиси кремни  такие, как например, аминосилохром.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе:

1.Степанов В. Н., Грейль Т. И. Биохими , том 28, стр. 540, 1963г. (прототип).

2.Циперович А. С . Ферменты, Техника, Киев, 1971 г. Объем . 1500 ЭЛИ} а та мл.