SU1739856A3 - Способ конструировани рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей фермент деацетоксицефалоспорин С синтетазу/деацетилцефалоспорин С синтетазу - Google Patents

Abstract

Изобретение касаетс  получени  плазмид, кодирующих фермент с активностью деаДектосицефалоспорин С син- тетазы и деацетилцефалоспориа.С син- тетазы. Сконструированы рекомбинант- ные плазмидные ДНК , рТТ507, pLT511, pPS58, pPS359, pPSbO, pPS61, pPS62, pIL502, обеспечивающие экспрессию DAOCS/DACS в клетках Escherichia co- li, Penicillium chrysogenum и Cepha- losporum acremonium.

Description

Изобретение относитс  к генетической инженерии, касаетс  получени  плазмидных ДНК, кодирующих фермент -с активностью деацетоксицефалоспорин С синтетазы (DAOSC) и деацетилцефало- спорин С синтетазы (DACS)„

DAOCS катализирует реакцию, в которой из пенициллина N образуетс  (DAOS), и  вл етс  экспандазой,- UACS катализирует образование деацетилце- фалоспорина (DAS) и DACS по реакции гидроксилировани . Эти реакции  вл ютс  основными этапами биосинтеза важных антибиотиков, таких как цефа- лоспорины из Cephalosporium acremo- ,niuffl и 7 ot-метоксицефалоспорины из Streptomyces clavuligerus.

Фрагмент ДНК, кодирующий активность DACS/DAOCS, ввдел ют из геномной ДНК Cephalosporium acremonium и

используют дл  построени  векторов экспрессии, которыми трансформируют штаммы Escherichia coli.

Сырые клеточные экстракты из трансформированных E.coli про вл ют активность DAOCS/DACS без какой-либо предварительной активации. Сконструированные векторы и трансформанты обеспечивают эффективное получение больших количеств активного фермента DAOCS/DACS. Фермент DAOCS/DACS можно примен ть дл  продуцировани  DAOCS и DACS и дл  гидроксилировани  цефалоспоринов дл  образовани  новых антибиотиков.

Рекомбинантные плазмидные ДНК могут быть использованы дл  создани  штаммов Penicillium, fCephalosporium, продуцирующих пенициллиновыё и цефа- tлоспориновые антибиотики.

«

Ё

XI

СО

ч

00

ел

Оч

GJ

В предлагаемом описан усовершенст вованный способ трансформации Peni- cillium рекомбинантными ДНК. Эта нова система трансформации использует amds ген Aspergillus nidulans. Использу  ацетамид (CHjCONH2), как единственный источник углерода или азота на пластинах трансформации, можно отобрать клетки хоз ина Penicillium, трансформированные вектором, содержащим ген amds, от нетрансформированных, которые не в состо нии расти на данных пластинах ввиду того, что клетки хоз ина PeniciIlium дикого типа не выражают -активность ацетамидазы

Предлагаемые рекомбинантные плаз- мидные ДНК могут быть использованы дл  получени  штаммов Paecilomyces и Streptomyces, в частности S.clavuli- gerus, которые экспрессируют DAOCS/ /DACS. Хот  ДНК, кодирующую DACS/ /DAOCS, выдел ют из Cephalosporium acremoniura, плазмидна  ДНК, содержаща  этот ген, может быть использована дл  построени  векторов экспрессии DACS/DAOCS в широкой разновидности клеток хоз ев. Большинство организмов которые продуцируют пенициллины и це- фалоспорины, используют .общий пред шествующий пенициллин N, субстрат дл  DAOCS. Фрагменты ДНК, кодирующие DACS/DAOCS, могут использоватьс  в

способах построени  векторов экспрессии при трансформации широкой разновидности организмов, продуцирующих пенициллиновые и цефалоспориновые антибиотики .

ДНК, кодирующие DACS/DAOCS, выдел ют с регул торными последовательност ми , которые контролируют транскрипцию . Описаны новые регул торн ые последовательности, которые могут использоватьс  в новых способах дл  обеспечени  трансл ции и транскрипции любого генного продукта в Cephalospo- rium Эти регул торные последовательности особенно эффективны в C.acremo- nium.

Описаны регул торные сигналы гена DACS/DAOCS, расположенные у 3 -конца кодирующего гена DACS/DAOCS Cephalosporium acremonium. Эти 3 -регул торные последовательности кодируют термина- цию транскрипции и полиапенилирование РНК, а также сигналы обработки гена DACS/DAOCS. Помещение этих сигналов в 3 -конце гена усиливает экспрессию гена в Cephalosporiumо

5

5

Последовательность ДНК штамма Brotzu Cephalosporium acremonium, кодирующа  как активность DACS, так и активность DAOCS, представлена в виде:

Ю20 30 40

. 5 -A AGC TTG TAG GGA GAA ТТА AGG CTT GCA CGA TTC CAT GGC GGT СТС

50 60 7080 90

GAC GAT GAG GGA CCA TGC ACG ATA CAT ATT CTC CTG CGA ACC AAG AAC

„А„ 10° no 120 . 130 GAG AAG AGA ACT CGA TGG CTT CTT ATG ATT CGT TGA CAA AAC TTC АСА

160 170 iftn ion AGA CAC TCG TGG GTT TAG AAT GCT АСА TTG ACG TGT GCG GCC AAG GCT

200 210 220 9чп GAG™ МО САСИС GIC ACT TAC OGC IAA GIA GCA GIT TAA AAA

GCA GIT CCT COG CGT AAG СТА CGA GGT GOG ОЙ°ТОА GAT ATA

CCO с тЦСА САА СсГтТС GIT СтЛсТ «CO АТС % IOA AIC ™ш С CTC TTO CAG AAC ITT CCT CCA CGC°TAC TCC TcfL GIC «Jg

CAA AAC AIC ACT ICC MO GTC CCC GTc V COT

№T THR SER tYS VAl PRO S Ј5 Ш SS

517398566

5 10

440 450 460 470

GAC GAC CTC AAG AGO GGC AAG GTC CTC ACC GAG CTC GCC GAG GCC GTC ASP ASP LEU LYS SER GLY LYS VAL LEU THR GLU LEU ALA GLU ALA VAL

152025

480 490 500 510 520 ACC ACC AAG GGT АТС TTC TAC TTG ACC GAG AGC GGC CTG GTC GAC GAC THR THR LYS GLY ILE PHE TYR LEU THR GLU SEЈ GLY LEU VAL ASP ASP 303540

530 540 550 560 570 GAC CAC ACC TCG GCG CGT GAG ACG TGC GTT GAC TTT TTC AAG AAC GGA ASP HIS THR SER ALA ARC GLU THR CYS VAL ASP PHE PHE LYS ASN GLY

455055

580 590 600 610 620 AGC GAG GAG GAG AAG AGG GCC GTG ACG CTC GCC GAC CGT AAC GCC CGC SER GLU GLU GLU LYS ARC ALA,VAL THR LEU ALA-ASP ARC ASN ALA ARC

606570

630 640 650 660 670 CGC GGC TTC TCT GCC CTC GAG TGG GAG AGC ACC GCC GTC GTC ACC GAG ARG GLY PHE SER ALA LEU GLU TRP GLU SER THR ALA VAL VAL THR GLU 75808590

680 690 700 710

ACG GGC AAG TAC TCG GAC TAC TCG ACG TGC TAC TCC ATG GGC АТС GGC THR GLY LYS TYR SER ASP TYR SER THR CYS TYR SER MET GLY ILE GLY 95100105

720 730 740 750 760 GGC AAC CTG TTC CCG AAC CGG GGC TTC GAG GAC GTC TGG CAG GAC TAC GLY ASN LEU PHE PRO ASN ARG GLY PHE GLU ASP VAL TRP GLN ASP TYR

110115120

770 780 790 800 810 TTC GAC CGC ATG TAC GGC GCA GCC AAG GAT GTC GCG CGC GCC GTT CTC PHE ASP ARG MET TYR GLY ALA ALA LYS ASP VAL ALA ARG ALA VAL LEU 125130135

820 830 840 850 860 AAC TCT GTG GGC GCC CCG CTC GCC GGG GAG GAC ATT GAT GAC TTC GTC ASN SER VAL GLY ALA PRO LEU ALA GLY GLU ASP ILE ASP ASP PHE VAL 140145150

870 880 890 900 910 GAC TGC GAT CCC CTC CTC CGC СТА CGG TAC TTC CCC GAA GTG CCG GAG GLU CYS ASP PRO LEU LEU ARG LEU ARG TYR PHE PRO GLU VAL PRO GLU 155160165170

920 930 940 950

GAC CGC GTC GCC GAA GAG GAA CCC CTC CGC ATG GGA CCC CAC TAC GAC ASP ARG VAL ALA GLU GLU GLU PRO LEU ARG MET GLY PRO HIS TYR ASP

175180185

960 970 980 990 1000 СТА TCG ACC АТС ACG CTC GTG CAC CAG АСА GCC TGC GCC AAC GGC TTC LEU SER THR ILE THR LEU VAL HIS GLN THR ALA CYS ALA ASN GLY PHE 190195200

-7 7398568

1010 1020 1030 1040 1050

GTG AGC CTG CAG TGC GAG GTG GAG GGA GAATTC GTC GAC CTC CCG ACG

VAL SER LEU GLN CYS GLU VAL ASP GLY GLUPHE VAL ASP LEU PRO THR

205210215

1060 1070 1080 1090 1100

CTC CCC GGC GCC ATG GTC GTC TTC TGC GGCGCG GTC GGC ACC CTG GCC LEU PRO GLY ALA MET VAL VAL PHE CYS GLY ALA VAL GLY THR LEU ALA 220 225230

1110 1120 1130 1140115C

ACG GGC GGC AAG GTC.AAG GCG CCC AAG CAC CGG GTC AAG TCT CCCGGG

THR GLY GLY LYS VAL LYS ALA PRO LYS HIS ARG VAL LYS SER PROGLY

235 240 245250

1160 . 1170 1180 1190

CGC GAC CAG CGC GTC GGC AGC AGC CGC ACG TCG AGC GTC TTC TTCCTG

ARG ASP GLN ARG VAL GLY SER SER ARG THR SER SER VAL PHE PHELEU 255 260 265

1200 1210 1220 1230 1240

CGG CCG AAG CCC GAC TTCAGC TTC AAC GTG CAG CAG TCG AGO GAG TGG

ARG PRO LYS PRO ASP PHESER PHE ASN VAL GLN GLN SER ARG GLU TRP

270275280

1250 1260 1270 - 1280 1290

GGT TTC AAC GTC CGC АТСCCG TCG GAG CGC ACG ACG TTC AGG GAG TGG

JLY PHE ASN VAL ARG ILEPRO SER GLU ARG THR THR PHE ARG GLU TRP 285290295

1300 1310 1320 1330 1340

CTT GGC GGG AACTAT GTC AAC ATG CGG AGG GAT AAG CCG GCG GCA GCG

LEU GLY GLY ASNTYR VAL ASN MET ARG ARG ASP LYS PRO ALA. ALA ALA 300305310

1350 1360 1370 1380 1390

GAG GCG GCT GTCCCC GCG GCT GCC CCT GTC TCT ACC GCA GCT CCT ATA

GLU ALA ALA VALPRO ALA ALA ALA PRO VAL SER THR ALA ALA PRO ILE 315320325330

1400 1410 1420 1430

GCC ACT TAG GGA ACC CGC CGA TCG ACT AAT AAA TCT ACG GGA GTT TAA ALA THR

1440 1450 1460 1470 1480 GAA GAA AAA TTG CCC TAT AAA TTG СТА ДАТ ТТТ TAA AAC АСА AAG CAT

1490 1500 1510 .. GAG TGT CAA GAG TTT CAA GTT TCA A-3

Фрагменты ДНК, кодирующие фермент с активностью DACS/DAOCS, выдел ют из штамма Cephalosporium acremonium, известного как штамм Brotzu, который содержитс  в коллекции культур американского типа, Роквилл, Мэрилэнд (хранитс  под номером АТСС 11550). Геномную библиотеку ДНК штамма Brotzu стро т в бифункциональном космидном векторе рКС462А (существующим в Е.со- li K12 под номером NRRLB-15973) и исследуют на наличие последовательностей , гомологичных р ду 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов. Этот р д деоксирибоолигонуклеотидов был построен на основании информации о частичной аминокислотной последовательности фермента С. acremonium DACS/ /DAOCS и знании генетического кода. Были отобраны клоны, гомологичные одному или нескольким из 32 различных деоксирибоолигонуклеотидов.

Идентифицируют плазмидные ДНК, кодирующие фермент DACS/DAOCS, из которых выдел ют фрагмент л/7 кВ Bam HI, включающий ген DACS/DAOCS, и встраивают его в коммерчески доступную плазмиду риС8. Получают плазмиду , которой трансформируют E.coli Kt2 JA 221. Трансформанты E.coli K12 JA 221/pIT508 депонируют в коллекции культуры Северной региональной научно-исследовательской лаборатории (NRRu), Пеори , IL 61604, под номером NRR LB-18170.

Плазмида р1Т503 служит в качестве исходного материала дл  построени  ругих векторов экспрессии. Эти вектоы , пригодны дл  получени  фер.мента DACS/DAOCS в рекомбинантной клетке хоз ина. Дл  этого осуществл ют трансформацию клеток хоз ина рекомбинантной плазмидной ДНК, котора  включает: промотор и последовательность, активирующую процесс трансл ции; последовательность ДНК, котора  кодирует DACS/ /DAOCS и операбельно св зана с ука- занным промотором; культивирование трансформированной клетки-реципиента, трансформированной в услови х, обеспечивающих синтез фермента.

Плазмиду выдел ют из E.coli К12 JA 221, используют дл  построени  векторов экспрессии DACS/DAOCS. Плазмида используетс  в качестве исходного материала дл  построени  плазмиды , котора  обеспечивает высокую степень

0

0

5

экспрессии фермента DACS/DAOCS в E.coli.

Построение плазмиды включает сшивку Sst I - Bam HI фрагмента размером 2,2 кв, кодирующего DACS/ /DAOCS плазмиды с 5,8 кв Nde I - Ban HI фрагментом плазмиды pCZR336, и синтезированным фрагмен- п.о. Sst I - Nde I.

Плазмида pCZR336 включает образованный от ДрЬ промотор, последовательность , активирующую трансл цию, оператор гена , первую функциональную единицу наследственности

5 (Цистрон), кодирующую небольшой

пептид, и последовательность ДНК, кодирующую производное hGH0 При низкой температуре, составл ющей 30 С,.белок , копированный на плазмидах pCZR33C и ,  вл етс  активным и способен подавл ть активность промотора ДрЬ, но при повышении температуры до1 42°С белок инактиви- руетс  и промотор ускор ет транскрипцию большого количества мРНК, кодирующей hGH (pCZR336) или DACS/DAOCS (pIT507).

I Плазмида включает тот же -|лервый цистрон, ген, промотор

О и последовательность, активирующую трансл цию, что и плазмида pCZR336, но включает кодирующую последовательность гена DACS/DOACS от плазмиды вместо кодирующей

5 последовательности hGH. Ограничительный фрагмент 2,2 п.о. Sst I - Бага HI плазмиды включает большую часть кодирующей последовательности DACS/DAOCS, остальна  часть этой ко0 дирующей последовательности содержитс  в синтезированном фрагменте 60 п.о. Nde I - Sst I с небольшой модификацией по сравнению с последовательностью ДНК дикого типа, что об5 (легчает последующую работу. Последовательность 5I-CATATG-3I

, ШМ1 ,

3 -GTATAC-5 0 включает

5-ATG-3 HI , З-ТАС-5 ,

котора  кодирует аминотерминальную метионильную группу DACS/DAOCS. Плазмида построена так, что промотор рЬ и последовательности, активирующие трансл цию, расположены,

беспечива  экспрессию ДНК, кодирую- ей DACS/DAOCSс,

При.температуре 42tfC E.coli K12 I ii 109/pIT507. экспрессируетс  DACS/ j /DAOCS (15% от общего клеточного елка). Сырые клеточные экстракты т этих E.coli K12 JM 109/pI507 (трансформант) способны катализироать конверсию пенициллина N в DAOS DAS, в то врем  как клеточные экстракты от нетрансформированных клеток E.coli K12 JM 109 не могут катализировать эту конверсию.

Многие штаммы E.coli К 1.2.обладают активностью эндогенной цефалоспори- назьц кодированной локусом ampC При этом осуществл ют частичную очистку полипептида DAOCS/DACS так, что достигаетс  оптимальна  активность DAOCS/DACSо Дл  этой цели достаточна очистка фермента посредством ДЕАЕ- тривакрила дл  отделени  эндогенной E.coli цефалоспориназы от фермента DAOCS/DACS. Дл  исключени  вредных вли ний цефалоспориназы используют штамм, дефектный по данному ферменту. Один такой штамм E.coli K12 А85 892 находитс  на хранении в Северном региональном научно-исследовательском центре под номером NRRLB-18096.

Плазмиды и эффективно продуцируют большие количества DACS/DAOCS в E.coli. E.coli pIT507 продуцирует DACS/DAOCS в количестве, приб лижающемс  к 15% от общего клеточного белкаv Ввиду того что культивирование E.coli менее сложно,, трансформан ты E.coli рИ507 могут быть использованы в способе продуцировани  DACS/DAOCS более эффективно и более экономично, чем естественные продуценты DACS/DAOCS.

DAOCS может быть использована дл  продуцировани  DAOCS из пенициллина N в свободной от клеток системе. DAOS  вл етс  не только полезным антибиотиком , но также может быть использован в качестве исходного материала дл  продуцировани  таких важных антибиотиков как цефалексин и другие цефалоспорины. DACS/DAOCS используют дл  трансформации пенициллинов иных, чем пенициллин N, в новые цефалоспо-4- риновые производные.

Свободные от клеток экстракты пенициллина и образующих цефалоспорин организмов могут использоватьс  дл  синтеза не имеющих природного происхождени  |3-лактамов. Предлагаемые

5

векторы экспрессии E.coli могут быть использованы в способе получени  DACS/DAOCS дл  трансформации пенициллинов , которые в естественном виде в природе не встречаютс , дл  образовани  новых антибиотиков или структур с антибиотическим  дром.

Плаэмида пригодна дл  получени  DACS/DAOCS в Eccoli не только из-за высоких уровней экспрессии фермента в этих клетках и из-за наличи  маркера, присутствующего на данной плазмиде. Многие векторы кодируют/5- лактамаэу и клетки, содержащие этот вектор, и могут расти в присутствии некоторых /3-лактамовых антибиотиков, таких как ампициллин. Однако, если желательно использовать свободный

Q от клеток экстракт, содержащий DACS/ /DAOCS дл  целей построени  /3-лакта- мов, то нежелателен экстракт, который содержат активность К-лактамазы. Так, плазмида не кодирует -лакта5 мазу, а использует стойкий к тетрациклину ген, который кодирует белок, не реагирующий с й-лактамами. Осуществл ют замену цистеиновой группы в положении 100 на серии в кодирующей зоне DACS/DAOCS плазмиды данного вектора экспрессии. Этот обычный способ может использоватьс  дл  замены любой группы на любую из других 19 естественно кодированных ами0

5

0

нокислот-

5

Сращивание в услови х in

vitro мутантных генов, создаваемых таким образом, позвол ет продуцировать белки с комбинаци ми мутаций. Такой мутант DACS/DAOCS получен с помощью .

Изменение количества генетической информации (вызывающее таким образом вставку или делецию аминокислот в полученном белке) в кодирующей последовательности DACS/DAOCS ДНК измен ет соответственно кодированную аминокислотную последовательность.

Существует целый р д плазмид, который увеличивает внутриклеточную концентрацию фермента DACS/DAOCS транс0 формированной клетки, содержащих: ДНК, кодирующую фермент DACS/DAOCS; промотор и последовательность, активирующую трансл цию, оперативно св занную с геном DAOC/DAOS. Стойкие

5 трансформанты могут быть получены лишь, если данный вектор воспроизводитс  либо как внехромосомный элемент, либо как интегрированный в геномную ДНК в клетке хоз ина. Описанные плазмиды включают также ген, придающий тойкость к антибиотику, либо какой- ибо другой элемент, который обеспеивает средство отбора клеток хоз ев, которые содержат данный вектор, но такие отбираемые элементы могут от- сутствовать, когда вектор интегриуетс  в хромосомную ДНК клетки хоз ина .

Векторы экспрессии в Penicillium и Cephalosporium описаны следующим образом .

Плазмида pPS56 представл ет собой вектор экспрессии Cephalosporiunu лазмида pPS55 представл ет собой промежуточный продукт в построении плазмиды pPS56. Плазмида pPS55 постоена из Hind III фрагмента плазмиды MLC12 ,3 т.п.о. Hind III фрагента плазмиды pPS34, который включает промотор C,acremonium IPS, слитый с кодирующей последовательностью гид- ромицин В фосфотрансферазы. Фрагмент Bam HI 7 кв, содержащий ген DACS/ /DAOCS плазмиды , слит с частич- но обработанной Bam HI пл змидой pPS 55, образу  плазмиду pPS 56.

Промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующа  трансл цию на плазмиде , расположены так, чо вызывают экспрессию ДНК, кодирующей фермент с активностью синтетазы DACS/DAOCS, ввиду того, что при построении плазмиды никаких делеций или вставок, действующих на промотор непоследовательность, активирующую трансл цию, не вводитс  в ДНК, граничащую с 51 -концом.

Ген Penicillium IPS может быть встроен в высоко продуцирующие штаммы Penicillium с целью увеличени  титра пенициллинов, продуцируемых при ферментации.

Плазмиды p3SR2, pPS51, pPS52, pPS54 и pPS61 содержат ген amds и клетки Penicillium, заключающие эти плазмиды, и могут быть отобраны с использованием ацетамида„ Плазмиды PPS57 и pPS62 содержат гибридный ген, придающий стойкость к гидромицину, который использует плазмиды pPS59, в результате чего получают плазмиду pPS61. Плазмида pPS61 предназначена дл  экспрессии фермента DACS/DAOCS Penicillium, особенно P.chrysogenum

Плазмиду pPS51 используют в качестве источника ацетамидного гена в других плазмидных построени х. Плаз- мида pPS52 содержит ген DACS/DAOCS

o

5

0

5

0

5

0

5

0

S

на фрагменте л/7 т.п„о. Bam HI (от плазмиды pPS51) и синтезированную св зывающую молекулу. Плазмида pPS52 обеспечивает экспрессию фермента DACS/DAOCS. Плазмиду pPS52 используют дл  экспрессии фермента Cephalosporium либо в Penicilliunio

Отбираемый маркер amds может быть введен в любой вектор экспрессии. Вектор pPS54 включает ген amds от плазмиды pPS51 и ген Penicillium IPS. Штаммы Penicill-ium обладают некоторой стойкостью к гидромицину. Оптимальные услови  трансформации дл  использовани  HmR как отбираемого маркера требуют добавлени  чувствительных к гидромицину агентов Способ отбора трансформантов Penicillium предлагает трансформацию рекомбинант- ной ДНК, включающей ацетамидный ген, клетки хоз ина Penicillium, а также культивирование трансформированной клетки в среде роста., котора  содержит ацетамид как единственный источник углерода или азота.

Источником ацетамидазного гена (amds) от Aspergillus nidulans может быть плазмида p3SR(NRELB-18182),

Создан промежуточный вектор, обозначенный как пла-змида pPS51, который состоит из гена amds от плазмиды p3S2, слитой с плазмидой pMLC12. Плазмиду pPS51 гидролизуют рестриктазой Hind III, обрабатывают фрагментом Кленова и сшивают с фрагментом 2,13 т.п.о., предварительно с затупленными концами , содержащим гибридный ген DACS/ /DAOCS, в результате чего получают плазмиду pPS60. Плазмида pPS60 содержит промотор Penicillium IPS, расположенный р дом, дл  экспрессии кодирующей последовательности DACS/DAOCS. Осуществл ют делецию двух небольших ограничительных фрагментов Xbal из плазмиды рРЬбО, создающей плазмиду рРЬ58, Синтезированный св зывающий фрагмент встраивают в Xbal; что обеспе- чивает операбельное св зывание промото-, pa Penici Ilium I IPS и кодирующей посАе-- довательности DACS/DAOCS, в результате получа  плазмиду ppS59. Плазмиду pPS59 используют дл  выражени  активности DACS/DAOCS в клетках в Penicillium и других клетках, в которых функционирует промотор Penicillium IPS.

Плазмида pPS59  вл етс  промежуточным продуктом дл  построени  векторов экспрессии. Penicillium DACS/DAOCS

pPS 62 и pFS61. Б обоих случа х фрагмент 2,1 т.п.о. Bam HI - Nru I плаз- мйды pPS59 с затупленными концами посредством фермента Кленова используетс  как источник кодирующей последовательности DACS/DAOCS, слитой с промотором Penicillium IPS. Плазмиды pPS61 и pPS62 содержат отбираемые маркеры на Penicillium,. Осуществл ют сли ние фрагмента 2,13 кв плазмиды pPS59 с расщепленной Hind III и обра ботанной фрагментом Кленова плазми- дой pPS57 и получают плазмиду pPS62. Плазмида pPS62  вл етс  вектором экспрессии .

Промотор DACS/DAOCS Cephalospori- um acremonium также может функционировать в Penicillium (обсуждение плазмида pPS52 приведено), но оптимальные векторы выражени  Penicillium используют промотор от гена Peni- cniiura. Промотор Penicillium IPS от плазмиды pLCI (NKRLB-181 81) св зан со скелетом плазмиды pMLC12 с помощью синтезированной св зующей молекулы, в результате чего продуцируетс  плазмида ppS53. Плазмида pPS53  вл етс  промежуточным продуктом в построении некоторых других клонирующих векторов и плазмид экспрессии. Содержащий промотор фрагмент Bam ,0 кв плазмиды pPS53 слит с фрагментом, кодирующим последовательность ,3 т.п0о. Bam HI плазмиды pPS55, в результате чего образуетс  плазмида pPS57.

Плазмида pPS57  вл етс  промежуточным продуктом в построении вектора экспрессии Penicillium pPS62. Плазмида pPS62 содержит отбираемый маркер (HmR) и гибридньй DACS/DAOCS ген с кодирующими последовательност ми как DACS/DAOCS, так и HmR под контролем промотора (2 копии) гена Penicillium

IPS.

Вектор экспрессии Penicillium DACS/DAOCS без отбираемого маркера построен путем вставки содержащего промотор фрагмента 1,0 т„п.о. Bam HI плазмиды pPS53 в точку Bgl II вектора

t

выражени  pIT511 E,coli ДНК, кодирующей фермент DACS/DAOCS. Плазмида и производные, которые содержат цельй ген DACS/DAOCS, используютс  дл  повышени  способности к продуцированию антибиотика Cephalosporium ъ родственных им клеток реципиентов, в которых функционируют промотор C Jac

5

remonium и последовательность, активирующа  трансл цию Плазмида pPS56 включает также придающий стойкость к гидромицину ген, который функционирует в С.acremonium и позвол ет осуществл ть отбор трансформантов С.acremonium pPS56.

После отбора трансформант Cepha- losporium acremonium pPS56 нет необходимости в поддержании давлени  отбора гидромицина В в среде роста. Отборочное давление не требуетс , поскольку трансформанты С.acremonium pPS56 очень стойки. Эта стабильность  вл етс  результатом трансформации плазмидой pPS56, С о acremonium через хромосомную интеграцию.

Трансформированные клетки Penicillium могут быть отобраны с использованием гидромицина В0

Предлагаетс  способ конверсии пенициллина G и пенициллина V в соответствующие цефалоспоримы с использованием DACS/DAOCS в Penicillium, который включает трансформацию клетки хоз ина Penicillium вектором реком- бинантной ДНК, который содержит ген, кодирующий выражение активности DAOCSo

Плазмида включает геномную ДНК, составл ющую более чем 3 кв, котора  расположена ниже ДНК, кодирую- щей DACS/DAOCS в геноме Cephalospo- rium acremonium. Плазмида pIT503 включает промотор и последователь- ность, активирующую трансл цию гена DACS/DAOCSс

Плазмиды pIT503, pPS52 и pPS56 включают- промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующую трансл цию гена DACS/ /DAOCSo -Промотор С.acremonium и последовательность , активирующа  трансл цию , расположенные на плазмидах PIT503, pPS52 и pPS56, могут быть использованы дл  экспрессии целого р да последовательностей ДНК. Последовательность промотора С.acremonium и последовательность,активирующа  трансл цию, закодирована на фрагменте 440 вр Sst I - Hind III, расположены непосредственно над и в непосредственном соседстве с кодирующей последовательностью DACS/DAOCS. Фраг- мент, который включает указанный ограничительный фрагмент/v440 п.о. Sst I - Hind III, включает промотор С.acremonium и последовательность, активирующую трансл цию.

0

5

0

S

0

Последовательность промотора Сер- halosporium acremonium и последова- те льность, активирующа  трансл цию, закодированы на плазмиде . Плаз мида содержит фрагмент 440 п.о. Ssc I -. Hind III,

Промотор Cephalosporium acremonium и последовательность, активирующа  трансл цию, могут быть использованы дл  экспрессии гетерологичной последовательности ДНК. Вли ние промотора DACS/DAOCS с геном, стойким к бактериальному гидромицину В, позвол ет использовать отбор с использованием гидромицина В в Cephalosporium . Описана последовательность окончани  транскрипции и другие ре- гул торные сигналы в 3 -конце гена DACS/DAOCS. Плазмида и ее производные, такие как плазмида /pPS56, содержат дополнительно ДНК более чем 1 т.п.о. ниже точки начала транскрипции гена DACS/DAOCS в геноме Cephalosporium acremonium.

Часть этой З -регул торной ДНК последовательности известна и описана следующим образом.

З -ТАС-З .  вл етс  трансл ционной концевой последовательностью:

GGA АСС CGC ССА ТОП AGT ААТ ААА ТСТ ACG GGA GTT TAA GAA GAA AAA TTG CCC TAT AAA TTG СТА ААТ TIT TAA AAC АСА AAG CAT GAG TGT CAA GAG TTT CAA GTT TCA A-3 Данна  последовательность и последовательности , включающие З -регу- л торные последовательности гена DACS/DAOCS, могут быть введены в векторы экспрессии рекомбинантной ДНК

Осуществлено впервые клонирование последовательности, котора  кодирует фермент DAOCS. Кроме того, как аминокислотна , так и ДНК последовательность фермента экспандазы, особенно DAOCS синтетазы Cephalosporium acremo- , nium, могут быть использованы дл  отделени  ДНК, кодирующей экспандазу от про дуцирующих --лактам организмов, Данна  последовательность ДНК может быть использована дл  приготовлени  меченых проб, предназначенных дл  обнаружени  кодирующих экспандазу последовательностей ДНК в продуцирующих лактам организмах. Содержание G и С в кодирующих DAOCS ДНК, составл ющие примерно 63%, приводит к тому, что данные ДНК пригодны дл  выделени  ДНК Sfcreptomyces, кодирующей DAOCS, в основном S. clavaligerus. ДНК

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Streptomyces имеет высокое содержание G и С и достигает 70% Такое высокое содержание G и С в ДНК позвол ет использовать их дл  выделени  гомологичных S.slavaligerus или других последовательностей ДНК, кодирующих DAOCS.

Пример 1. Культура Е„соН К12 JA 221/р1Т508 и выделение плаз- миды .

1 л питательного бульона L (10 п триптона, 10 г NaCl и 5 г дрожжевого экстракта на 1 л), содержащего 50 мкг/мл ампициллина, инокулируют культурой E.coli K12 JA 221/pIT503 и инкубируют в инкубаторе при 37 С до тех пор, пока оптическа  плотность при 590 нм не составит 1 ед. поглощени . В течение этого времени в культуру ввод т 150 мг хлорамфени- кола Инкубацию продолжают в течение 16 ч. Введение хлорамфеникола инги- бирует синтез белка л, таким образом , ингибирует дальнейшее деление клеток, но обеспечивает дальнейшую репликацию плазмиды.

Данную культуру центрифугируют при скорости вращени  6000 об/мин в течение 5 мин при 4 С. Полученный по- 1 верхностный слой удал ют и клеточную гранулу промывают в 40 мл TES буферного раствора (10 мМ трис-HCl; рН 7,5; 10 мМ NaCl и 1 мМ этилендиамин- тетрауксусна  кислота (ЕДТА) и затем снова гранулируют. Поверхностный слой удал ют и клеточную гранулу замора- жив ают в баке со смесью сухой лед - этанол, а затем оттаивают. Отта нную клеточную гранулу снова суспендируют в 10 мл раствора 25%-ной сахарозы и 50 мМ ЕДТА. В данный раствор ввод т и перемешивают с ним 1 мл лизо- цимного раствора концентрацией 5 мг/мл; 3 мл 0,,25 М ЕДТА, рН 8,0 и 100 мкл рибонуклеазы А концентрацией 10 мг/мл. Затем эту смесь инкубируют на льду в течение 15 мин.

В обработанные лизоцимом клетки ввод т 3 мл лизирующего раствора (приготовленного смешиванием 3 мл 10%-ного тритон-Х 100,75 мл 0,25 М ЕДТА, рН 8,0, 15 мл 1 М трис-HCl, рН 8,0 и 7 мл воды), перемешивают и полученный раствор инкубируют на льду в течение еще 15 мин. Лизированные клетки замораживают в бане со смесью сухой лед - этанол, а затем оттаивают .

Клеточные осколки удал ют из раствора путем центрифугировани  при вращении центрифуги со скоростью 25000 об/мин в течение 40 мин0 Поверхностный слой экстрагируют буферным фенолом. В этот раствор ввод т 30,44 CsCl и 1 мл раствора этилбро- мида концентрацией 5 мг/мл. Затем i этот раствор довод т до объема 40 мл и декантируют в ультрацентробежную трубку. Эту трубку герметически Запаивают и раствор центрифугируют в роторной центрифуге при скорости центрифуги 42000 об/мин в течение 16 ч. Полученную плазмиду, визуализированную ультрафиолетовым светом, выдел ют а затем помещают в трубку и роторную центрифугу, где осуществл ют центрифугирование1 со скоростью 50000 об/мин в течение 16 ч. Любое необходимое регулирование объема осуществл ют с использованием раствора ТЕЗ, содержащего 0,761 мг/мл CsCl. Затем плаз- мидную полосу выдел ют, экстрагируют насыщенной солью изопропанолом с целью удалени  этилбромида, и разбавл ют (1:3) буферным раствором ТЕЗ, В раствор ввод т два объема этанола и затем его инкубируют при -20е7 С в течение ночи. Плазмидную ДНК гранулируют путем центрифугировани  данного раствора в роторной центрифуге в течение 15 мин при скорости центрифуги 10000 об/мин.

ДНК плазмиды р 1Т503, полученную таким путем (1 мг), суспендируют в 1 мл буферного раствора TES (10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА) и хран т при -20°С.

Последовательности концевого ко- дона, кодирующей последовательности 1рр, замещают на Bam HI путем ввода синтезированной св зующей молекулы ДНК (5 -CCGGATCCGG-3). Кодирующа  последовательность последних тридцати п ти аминокислот липопротеина, трансл ционный концевой сигнал и последовательность,- соответствующа  3 -нетранслированной зоне информационой РНК, следует за точкой Ват Н1„ Плазмида рКЕ N021 включает также некоторые независимые последовательности на 850 т0Поо., расположенные ниже гена 1рр в хромосоме Е.соН.

Примерно 50 мкг плазмиды pKENIII обрабатывают с 25 рестриктазами Hpal в 300 мкл буферного раствора IX Нра

0

5

(10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ MgCl2, 1 мМ КС1; и 6 мМ |3-меркаптоэтанола) при 37°С в течение 2 ч. Смесь экстрагируют двукратно 300 мл смеси фенола с хлороформом в соотношении 50:50 и извлеченную водную фазу повторно осаждают 2,5 об. этанола и 0,1 об 3 М NaOAc. Гранулу ДНК раствор ют в 100 мкл электрофорезного буферного раствора и фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле.

П р и м е р 2. Построение плазмиды рГГ507.

Построение плазмиды pKEN021 и выделение фрагмента 5,1 т.п„о. Xba I - Bam HI осуществл ют следующим образом .

Плазмиду pKEN021 получают из 0 плазмиды pKENIIIo Плазмиду pKENIII получают из Северного регионального научно-исследовательского центра (NRRL), служба исследований в области сельского хоз йства, Перори , Илли- 5 нойс, 61604, EoColi СС620, пор дковьй номер NRRL 1501 К

Плазмида pKENIII имеет фрагмент л-2,8 к EcoRI, которьй включает ген E.coli 1pp.

В плазмиде pKEN021 фрагмент 650 bp EcoRI - Sal I плазмиды pBR322 замещают генной последовательностью E.coli 1pp. Эти генные последователь- ности 1рр включают фрагмент 462 п„о. Alu I, расположенный кверху от первого триплета кодирующей последовательности 1рро Этот фрагмент л/462 Ьр содержит промотор 5 -нетранслированную зону и точку рибосомного св зывани . 0 Уникальный сайт рестрикции Xbal расположен в пределах точки рибосомного св зывани  16 то перед метионином, инициирующим трансл ции. Сайт рестрикции Pvu, наход щийс  выше бис, составл ет 29:1 во всех полиакрил- амидных гел х,за исключением особых случаев. Этот гель окрашивают в растворе , содержащем 0,5 мкг/мл этилбромида , и визуализируют полосу ДНК в длинноволновом ультрафиолетовом свете Фрагмент 950 п.о. Hpall изолируют и извлекают из гел  путем электро- элюнровани  в диализный мешок. После экстракции смесью фенол/СНСЦ и осаждени  этанолом, ДНК (2,5 мкг) раствор ют в 25 мкл TEN (10 мМ NaCl; 10-мМ трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА).

Примерно 2 мкг фрагмента 950 п.о. .Hpall обрабатывают ферментом Alu I

0

5

5

0

5

21

в 200 мкл раствора IXAlu I (50 мМ NaCl, 6 мМ трис-HCl, рН 7,6, 6 мМ MgCl и 6 мМ /3-меркаптоэтанол) в течение 2 ч при 37°С. ДНК фракционируют в 6%-ном полиакрипамидном геле, фрагмент 462 По о. Alu I извлекают, (A/I мкг) .раствор ют в 10 мл раствора (66 мМ трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl,, 10 мМ дитиотреитол, 0,4 мМ АТР), содержащего 150 пмоль фосфорилированно- го св зующего звена EcoRI р -ССААТТСС-З ) и 2 ед. Т4 ДНК-лига- ъзы. После инкубации при 4°С в течение 16 ч смесь прогревают при 65°С в течение 10 мин и разбавл ют до состава раствора: 100 мМ трис-HCl, рН 7,2, 50 мМ NaCl, 10 мМ 6 мМ/3-мер- каптоэтанол, содержащего 40 ед„ фермента EcoRI. Через 2 ч выдержки при 37°С образец экстрагируют смесь фе- нол/СНС1 и осаждают этанолом. Затем ДНК раствор ют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего Т.4 ДНК-лигазу и 0,1 мкг обработанной щелочной фосфатазой и ферментом EcoRI плазмиды pBR3220 После сшивки при 4 С в течение 16 ч ДНК используют дл  трансформации E.coli K12 НВ101 (NRRLB-15626). Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина и плазмид, выделенных из стойких колоний путем быстрой щелочной экстракции. Плазми- да, содержаща  фрагмент 466 п.о. Xba I - Bam HI, использована в качестве исходного материала дл  следующего этапа.

Примерно 2 мкг этой плазмиды, обработанной 2 ед. фермента Hind III в 50 мкл буферного раствора IX Hind III (60 мМ NaCl; 10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 10 мМ MgClgH 6 мМр-меркап- тоэтанол) в течение 1 ч при 37°С, экстрагируют смесью фенол/СШЛ осаждают этанолом, раствор ют в 200 мкл буферного раствора нуклеазы IX SI (300 мМ NaCl; 30 мМ NaOAc, рН 4,25, 3 мМ ZnCLj) и обрабатывают 200 ед. иуклеазы S1 в течение 1 ч при 15°С. Реакцию прекращают путем экстракции смесью фенол/СНС1з, ДНК осаждают этанолом. Обрабатывают ферментом Hind III, раствор ют в 10 мл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего 20 пмоль фосфорилирован- ных св зующих звеньев Bam HI (S -CCGGATCCGG-S) и 2 ед. Т4 ДНК- лигазы. После 16 ч инкубации при

10

15

20

65°С в течение 10 мин и затем раз бавл ют до 100 мл до получени  бу ферного раствора IX Bam HI (150 м NaCl; 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 6 мМ /$-меркаптоэтанол), со держащего 20 ед. фермента Ват Н1„ После 2 ч инкубации при 37°С смес подвергают очистке в 1%-ном агаро ном геле. Этот гель окрашиваютс  этилбромидом, и более крупный фра мент (4,5 т.п.о.) извлекают из г л .

Фрагмент имеет когезионно св з ные концы Bam HI. Его раствор ют 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК- лигазы, содержащего лигазу Т4.ДНК Через 16 ч выдержки при 4°С ДНК и пользуют дл  трансформации Е„со1г К12 НВ101 (NRRLB-15626)о Трансфор ты отбирают на устойчивость к амп циллину при 100 мг/мл и на чувств тельность к тетрациклину при 10 м /мл. Плазмиды отобранных колоний следуют на отсутствие точки Hind и на присутствие единственной точ Ват Н1 Последовательный гидролиз EcoRI, Sail приводит к образовани двух фрагментов размером 46b и 3X п.о. и значительно более длинного фрагмента. Плазмиду с такими хара теристиками модифицируют дл  прев щени  точки EcoRI, расположенной ше промотора 1рр, в ограничительн точку Hind III.

Модификацию провод т путем час тичного гидролиза 2 мкл плазмиды 100 мкл буферного раствора IX Eco с ограничительным ферментом EcoRI Реакцию прекращают нагреванием пр 40 651. ДНК экстрагируют смесью фен /СНС1 и осаждают этанолом. ДНК р вор ют в 200 мл буферного раствор нуклеазы IX S1, содержащего 1000 /мл нуклеазы S1, и инкубируют при

25

30

35

45 120С в течение 1 ч. Реакцию прекр щают экстракцией смесью фенол/CHC ДНК осаждают этанолом и суспендир в 10 мкл буферного раствора Т4 ДН лигазы, содержащего 20 пмоль фосф

50 рилированного св зующего звена Hin III (5 -CCAAGCTTGG-3 H 2 ед. Т4 Д лигазы. После 16 ч инкубации при смесь нагревают в течение 10 мин п 65°С, разбавл ют до 150 мкл с полу

55 чением композиции буфера IX Hind I |содержащего 10 ед. ограничительног фермента Hind III, инкубируют в те чение 2 ч при 37°С и затем фракцио

.4 С реакционную смесь нагревают при -ч . руют в 1%-ном агарозном геле. ДНК

10

15

20

73985622

65°С в течение 10 мин и затем разбавл ют до 100 мл до получени  буферного раствора IX Bam HI (150 мМ NaCl; 20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ 6 мМ /$-меркаптоэтанол), содержащего 20 ед. фермента Ват Н1„ После 2 ч инкубации при 37°С смесь подвергают очистке в 1%-ном агароз- ном геле. Этот гель окрашиваютс  этилбромидом, и более крупный фрагмент (4,5 т.п.о.) извлекают из гел .

Фрагмент имеет когезионно св занные концы Bam HI. Его раствор ют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК- лигазы, содержащего лигазу Т4.ДНК. Через 16 ч выдержки при 4°С ДНК используют дл  трансформации Е„со1г К12 НВ101 (NRRLB-15626)о Трансформанты отбирают на устойчивость к ампициллину при 100 мг/мл и на чувствительность к тетрациклину при 10 мкг/ /мл. Плазмиды отобранных колоний исследуют на отсутствие точки Hind III и на присутствие единственной точки Ват Н1 Последовательный гидролиз EcoRI, Sail приводит к образованию двух фрагментов размером 46b и 3X15 п.о. и значительно более длинного фрагмента. Плазмиду с такими характеристиками модифицируют дл  превращени  точки EcoRI, расположенной выше промотора 1рр, в ограничительную точку Hind III.

Модификацию провод т путем частичного гидролиза 2 мкл плазмиды в 100 мкл буферного раствора IX EcoRI с ограничительным ферментом EcoRI. Реакцию прекращают нагреванием при 40 651. ДНК экстрагируют смесью фенол/ /СНС1 и осаждают этанолом. ДНК раствор ют в 200 мл буферного раствора нуклеазы IX S1, содержащего 1000 ед/ /мл нуклеазы S1, и инкубируют при

25

30

35

45 120С в течение 1 ч. Реакцию прекращают экстракцией смесью фенол/CHCl-jo ДНК осаждают этанолом и суспендируют в 10 мкл буферного раствора Т4 ДНК- лигазы, содержащего 20 пмоль фосфо50 рилированного св зующего звена Hind III (5 -CCAAGCTTGG-3 H 2 ед. Т4 ДНК- лигазы. После 16 ч инкубации при 4°С смесь нагревают в течение 10 мин при 65°С, разбавл ют до 150 мкл с полу55 чением композиции буфера IX Hind III, |содержащего 10 ед. ограничительного фермента Hind III, инкубируют в течение 2 ч при 37°С и затем фракциони23;

извлекают, очищают, раствор ют в 20 мкл буферного раствора Т4-лигазы, содержащего Т4-лигаэу, инкубируют в течение 16 ч при 4°С и используют дл  трансформации HB101 (NRRL В-15626). Плазмиду ДНК трансформант ApR анализируют , Отбирают плазмиду с фрагментом 500 п.о. EcoRI - Hind III. Эту плазмиду затем используют как вектор дл  клонировани  3 -зоны гена 1рр 2 мкг этой плазмиды гид- ролизуют в 50 мкл буферного раствора IX Sal I (150 мМ NaCl, 6 мМ трис-НС1 рН 7,9, 6-мМ MgCl2H 6 мМ/3-меркапто- этанрла) с 2 ед. фермента Sal I в тече ние 1 ч при 37°С„ Реакционную смесь разбавл ют до 150 мкл с получением композиции буферного раствора Bam HI, содержащего 2 ед. фермента Bam HI. После инкубации 1 ч при 37 С добавл ют примерно 2,5 ед. щелочной фос- фатазы и инкубируют при 65 С в течение 1 ч„ ДНК экстрагируют смесью фе- нол/СНС1з, осаждают этанолом, раствор ют в TEN и используют как вектор клонировани  дл  фрагмента 3 -1рр.

Дл  получени  фрагмента 1ррЗ 10 мкг плазмиды pKENIII гидролизуют в 200 мкл буферного раствора IX Hpal содержащего 10 ед. фермента Hpal, в течение 2 ч при 37 С. После экстракции смесью фенол/СНС и осаждени  этанолом ДНК раствор ют в 10 мкл буферного раствора Т4-лигазы ДНК, содержащего 20 пмоль фосфорилирован- ного св зующего звена Sal I (5 -GGTCGACC-37) и Т4 ДНК-лигазу. Инкубируют в течение 16 ч При 4° С. Ли- газу инактивируют путем нагревани  при 63°С в течение 10 мин. Полученны материал разбавл ют до объема 100 мкл получают композицию буферного раствора IX Sal I, содержащего 10 ед. фермента Sal I, и инкубируют в течение 1 ч при 370С. Реакционную смесь разбавл ют -До 300 мкл, получают; композицию буферного раствора IX Pvu II (60 мМ NaCl, 6 мМ трис-HCl, рН 7,5, 6 мМ 6 мМ уЗ-меркаптоэтанол), содержащего 10 ед. фермента Pvu II Через 1 ч инкубации при 37°С ДНК фракционируют в 5%-ном полиакриламид ном геле. 0,5 мкг фрагмента 950 п.о„ извлекают, очищают и-раствор ют в TEN.

0,2 мг этого фрагмента разбавл ют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК- лигачы, содержащего 20 пмоль фосфори

1

,

10

15

20

739856

лированного св зующего звена Bam HI (5 -CCGGATCCGG-37) и 2 ед. Т4 ДНК- лигазы, и инкубируют в течение 16 ч при 4°С. Полученную ДНК нагревают в течение 10 мин при 65°С, разбавл ют до объема 100 мкл с образованием композиции буферного раствора IX Bam HI, содержащего 20 ед. фермента Bam HI, инкубируют при 37flC в течение 2 ч и затем фракционируют в 5%-ном полиак- риламидном геле с целью удалени  избытка св зующих молекул

Полученный в результате фрагмент 950 п.о. с когезионно св занными концами Bam HI и Sal I очищают и раство р ют в 20 мкл буферного раствора Т4 ДНК-лигазы, содержащего 0,2 мкг гид- ролизованной Bam HI - Sal I плазмиды 105 и Т4 ДНК-лигазы После инкубации в течение 16 ч при 4 С ДНК используют дл  трансформации E,coli K12 НВ101 (NRRL B-15626)p Плазмиды клонов анализируют на наличие фрагмента Sal I - 25 Bam HI, и отбирают плазмиду (5,2 т п.о.), которую обозначают pKEN021.

10 мг плазмиды pKEN021 гидролизуют в 200 мл буферного раствора Bam HI, содержащего 10 ед. каждого из ферментов Bam Hi и ХЬа I в течение 1 ч при 37 Сс Затем обрабатывают 2,5 ед« щелочной фосфатазы в течение 1,5ч при 65°С, экстрагируют смесью фенол/СНС осаждают этанолом и раствор ют в 50 мл TEN дл  последующего использовани 

Построение плазмиды pNM575 ведут следующим образом.

Плазмиду ptrEDSOch GH 800 исполь- д0 зуют в качестве источника ДНК, со- держащей части кодирующей последовательности hGH, котора  содержит уни- кальную ограничительную точку, на 6 п.оо ниже трансл ционного концевого , кодона данной кодирующей последовательности . Эту точку замен ют на точку Bam HI по описанной методике. 6 мкг плазмиды ptzpEDSOch GH 800 гидролизуют 6 ел Sma I в 200 мл раствот- ра IX Sma I (15 мМ трис-HCl, рН 8,0, 6 мМ MgCl2, 15 мМ КС1 и 6 мМуЭ-мер- - каптоэтанол) в течение 15 ч при 37°С, экстрагируют смесью фенол/СНСЦ, осаждают этанолом и раствор ют в 24 мкл TEN, содержащего 40 пмоль фос- форилированного св зующего звена Вайи Смесь инкубируют в течение 2 ч при 22°С, в течение 16 ч при 4°С, а затем в течение 10 мин при 65°С.

30

35

45

50

55

Когезионно св занные концевые звень  Bam HI образовываютс  путем гидроли- за с ограничительным ферментом Bam HI Гидролиз приводит к образованию фрагмента 691 п.о. с когезионно св зан- ными концами Bam HI.

Фрагмент ДНК сшивают с 0,2 мкг - гидролизованной Bam HI и обработанной щелочной фосфатазой ДНК плазмиды pBR322o Через 16 ч инкубации при 4°С данный материал используют дл  трансформации E.coli K12 JA 221 (NRRL В-15014)о Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллинао Плазмиды выдел ют и идентифицируют путем анализа ограничительного фермента и методом гель-электрофореза о Желаемые плазмиды, обозначенные как pNM575, содержат фрагмент 700 п„о. Bam HI.

Построение плазмиды рИ01 ведут следующим образом.

Кодирующа  последовательность зрелого hGH содержит одну точку Fnu PII, составл ющую 47 п.о. от первого нуклеотида трансл ционной

5 -CTAGAGGGTATTACATATGGATTTCCCAACCATTCCCCTCTCGAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG-3

И I I t I II l| l I 1 1 II И I И I М I I И I I И I П М II И I И I I I I I 111 1 И П I U | t 3 -TCCCATAATGTATACCTAAAGGGT tGGTAAGGGGAGAGCTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC-5)

Данный фрагмент получают фосфо- триэфирным способом, посредством которого готов т следующие фрагменты:

1)5 -CTAGAGGGTA-3 ;

2)5 -TTACATATGGATTTCC-3 ;

3)5 -CAACCATTCCCCTCTCGAGGC-З ;

4)5 -TTTTTGACAACG-3 ;

5)5 -CTATGCTCCG-3 ;

6)5 -CGGAGCATAGCGTT-3 ;

7)5 -GTCAAAAACCCT-3 ;

8)5 -CGAGAGGGGAAT-3 ;

9)5 -GGTTGGCAAATC-3;;

10)Ь -CATATGTAATACCCT-3 . Использу  их осуществл ют ступенчатую реакцию катализированного св зывани  Т4-лигазы:

b - нефосфорилированный сегмент 1 смешивают с фосфорилированными сегментами 2,. 9 и 10 и подвергают воздействию Т4-лигазы с образованием дуплекса 1 ДНК; этот дуплекс извлекают методом препаративного гель- элактрофореза в 15%-ном полиакрилами де;

5 -нефосфорилированный сегмент 6 смешивают с фосфорилированными сегментами 3, 4, 5, 7и8и подвергают воздействию Т4-лигазы ДНК с образованием дуплексной формы ДНК 2; этот

5

5

инициирующей точки. 25 мкг плазмиды рШ575 гидролиэуют в 250 мкл раствора Bam HI с 25 ед„ фермента Bam HI при 37° С в течение 1 ч. Фрагмент 691 п.о. Bam HI извлекают из 6%-ного полиакрил анидного гел  и очищают Одну треть этого фрагмента (эквивалентно 8 мкг плазмиды) гидролизуют в 100 мкл раствора Fnu PII (6 мМ NaCl; 6 мМ трис-HCl, рН 7,4, 6 мМ MgCl и 6 мМ |3-меркаптоэтанол) с 2,5 ед. фермента Fnu PII в течение 1,5 ч при 37вС. Электрофорез в 6%-ном полиакриламид- ном геле и стандартные процедуры извлечени  используют дл  извлечени  фрагмента ДНК 538 п.о., содержащего кодирующую последовательность послед- , них 175 аминокислот hGH, после чего осуществл ют трансл цию стоп-сигнала.

Двунитевой фрагмент ДНК синтезируют юсфотриэфирным способом, соедин   зону промотора 1рр с кодирующей зоной hGH. Этот двунитевой фрагмент ДНК имеет следующую последовательность:

дуплекс очищают электрофорезом в 15%-ном полиакриламидном геле;

ДНК дуплексы 1 и 2 соедин ют вместе посредством Т4-лигазы, образу  ДНК

дуплекс 1100, который очищают электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле; этот ДНК дуплекс ферментно фос- форилируют с использованием Т4-поли- нуклеотидкиназы и Ј-32 Р-АТР, посредством описанной процедуры.

Плазмиду стро т путем сшивани  0,1 пмоль (0,4 мкг) фрагмента Xba I - Bam HI плазмиды pKEN021, 0,025 пмоль синтезированного фрагмента ДНК и 0,3 пмоль (0,08 мкг) фрагмента 538 п„ о „ плазмиды pNM575 в 24 мкл раствора с использованием Т4-лйгазы ДНК. После инкубации в течение 1Ь ч при 4°С смесью трансформируют E.coli JA 221 (NRRL B-15014) Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 110 мкг/мл ампициллина , и культивируют.

Построение плазмиды рИОЗ ведут

следующим образом.

Последовательность гена hGH в плазмиде содержит точку Xho I на 24 основани  ниже трансл ционной инициирующей точки и точки vXba I в

некодирующей зоне 5. 25 мкг плазмиды гидролизуют в 250 мкл раствора Bam HI с 25 ед. ХЬа I и 25 ед. Xho I при 37°С в течение 1 ч. Больший фрагмент очищают от агарозного гел  по описанной методике,

Двунитевой фрагмент ДНК синтезируют фосфотриэфирным способом с вводом короткой открытой рамки считывани  (цистрон) в переднюю часть коди5 -CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAATCATATGGATTTCCCA a -TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCCTCCTTAGTATACCTAAAGGGT

1)5 -CTAGAGGGTATTAATAATGCATATTGATTTTAATAAGGAG-З ;

2)5 -GAATAATCATATGGATTTCCCAACCATTCCCCTC-3 ;

3)5 -TCGAGAGGGGAATGGTTGGGAAATCCATATGATTATTCCTCCTT-3

4)5. -АТТААААТСААТАТАСАТТАТТААТАСССТ-3

Использу  приготовленные сегменты, осуществл ют соединение путем смешивани  5 - нефосфорилированных сегментов 1 и 3 с 5 -фосфорилированными i сегментами 2 и 4 и воздействи  на данную смесь Т4-лигазой. Полученный дуплекс очищают путем электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле. ДНК дуплекс затем ферментно фосфорилируют с использованием Т4-полинуклеаотидосмесь инкубируют при 16°С в течение 1 ч, реакцию завершают путем экстрак ции фенолом и ДНК очищают. Гидроли- зованную Nde I и обработанную фрагментом Кленова ДНК сшивают Т4-лигазо 25 ДНК при 4°С в течение 16 ч. Полученную ДНК используют дл  трансформации RV308 штамма E.coli K12 (NRKL В-15624). Трансформанты отбирают на L-агаровых пластинах, содержащих

. ...™.L™a3 ЗО Юо мкг/мл ампициллинаГплазмвды отмиду LGH рПОЗ стро т путем сшивки 0,1 пмоль (0,4 мкг) фрагмента Xba I - Xho I плазмиды с 0,025 пмоль синтезированного фрагмента ДНК в 24 мкл раствора, с использованием Т4- лигазы ДНК. После инкубации в течение 1Ь ч при 4° С смесь используют дл  трансформации E.coli JA 221 (NRRL B-1S014). Трансформанты отбирают на агаровых пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, и обычным образом культивируют.

Построение E.coli К1 2 RV 308/ /pL 110 А ведут следующим образом.

1 мкг плазмиды pL110 ДНК гидроли- зуют 3 ед. фермента Nde I в объеме 20 мкл раствора 1,0 М NaCl, 0,50 М трис-HCl, рН 7,5, 0,10 мМ MgCl2 и 10 мМ дитиотритиола в течение 1 ч при 37°С, экстрагируют смесью фенол/хлороформом и осаждают этанолом. ДНК плазмиды pLIlO раствор ют в 50 мкл раствора Кленова IX (40 мМ КРОи, рН 7,5, 6,6 мМ MgCl2, 1,0 мМ 2-меркапто- этанол, 33 мкМ d-ATP 33 мкМ d CTP; 33 мкМ d-GTP и 33 мкМ ТТР). Два мкл ( 10 ед.) крупного фрагмента ДНК по гюлимеразы 1 E.coli, известного как фрагмент Кленова, ввод т в данную ДНК и смешивают с ней. Реакционную

35

40

45

дел ют от полученных колоний путем быстрой щелочной экстракции. Так отбирают плаэмиду рЫЮА, не содержащую точку Nde It

Построение фага pLMOB путем точечно-специфического мутагенеза провод т следующим образом.

Дл  построени  фага М13ТсЗ 50 мкг плазмиды рЫЮВ в 50 мкл раствора TEN ввод т в 25 мкл раствора 10Х Hind III и 170 мкл воды, добавл ют 5 мкл (V50 еде) фермента Hind III и инкубируют при 37°С в течение 2 ч„ Добавл ют 13 мкл 2 М трис-HCl, рН 7,4 и 5 мкл (50 ед) фермента EcoRI и инкубируют в течение более 2 ч при 37°С. Реакцию прекращают экстракцией

фенолом, насыщенным TEN, фенол удал ют путем экстракции хлороформом. ДНК плазмиды рЫЮ осаждают, центрифугируют , провод т электрофорез в 1%-ном агарозном геле и выдел ют фрагмент EcoRI - Hind III 4,3 т.п.о

Примерно 5 мкг ДНК фага m13mp18 55 раствор ют в 50 мкл раствора ТЕ, гид- ролизуют Hind III и EcoRI ферментами как описано, обреза  Hind III - EcoR и очищают фрагмент размером ,25 т. п.о.

рующей последовательности hGH. Этот двунитевой ДНК фрагмент имеет указанную последовательность:

АССАТТССССТС-3 TGGTAAGGGGAGAGCT-5

(О

Данный фрагмент получают методом распознавательного фосфотриэфирного способа, посредством которого получают следующие сегменты:

смесь инкубируют при 16°С в течение 1 ч, реакцию завершают путем экстракции фенолом и ДНК очищают. Гидроли- зованную Nde I и обработанную фрагментом Кленова ДНК сшивают Т4-лигазой ДНК при 4°С в течение 16 ч. Полученную ДНК используют дл  трансформации RV308 штамма E.coli K12 (NRKL В-15624). Трансформанты отбирают на L-агаровых пластинах, содержащих

Юо мкг/мл ампициллинаГплазмвды от5

0

5

дел ют от полученных колоний путем быстрой щелочной экстракции. Так отбирают плаэмиду рЫЮА, не содержащую точку Nde It

Построение фага pLMOB путем точечно-специфического мутагенеза провод т следующим образом.

Дл  построени  фага М13ТсЗ 50 мкг плазмиды рЫЮВ в 50 мкл раствора TEN ввод т в 25 мкл раствора 10Х Hind III и 170 мкл воды, добавл ют 5 мкл (V50 еде) фермента Hind III и инкубируют при 37°С в течение 2 ч„ Добавл ют 13 мкл 2 М трис-HCl, рН 7,4 и 5 мкл (50 ед) фермента EcoRI и инкубируют в течение более 2 ч при 37°С. Реакцию прекращают экстракцией

фенолом, насыщенным TEN, фенол удал ют путем экстракции хлороформом. ДНК плазмиды рЫЮ осаждают, центрифугируют , провод т электрофорез в 1%-ном агарозном геле и выдел ют фрагмент EcoRI - Hind III 4,3 т.п.о.

Примерно 5 мкг ДНК фага m13mp18 5 раствор ют в 50 мкл раствора ТЕ, гид- ролизуют Hind III и EcoRI ферментами, как описано, обреза  Hind III - EcoRI, и очищают фрагмент размером ,25 т. п.о.

29

100 нг фрагмента ,3 т0п,о. Hind III - EcoRI плазмиды рЫЮ смешивают с 100 нг фрагмента/ 7,25 т.п, о. Hind III - EcoRI фага М13 mp18, 2 мкл буферного раствора лигазы 10Х,

1мкл ед„) Т4-лигазы ДНК и 1А мкл . Смесь инкубируют при 15°С в течение 1,5 чо

1 мл. ночной культуры E.coli K12 jM 109 E.coli K12 jM 101 используют дл  инокул ции 50 мл питательного бульона L, полученную культуру инкубируют при 37°С с аэрацией до тех пор, пока O.D.gg0, не достигает значени  от 0,3 до 0,4. Клетки повторно суспендируют в 25 мл 10 мМ NaCl, инкубируют на льду в течение 10 мин, собирают центрифугированием, снова суспензируют в 1,25 мл 75 мМ CaClg, аликвоту (200 мкл) этих клеток удал ют , ввод т в 10 мкл сшитой ДНК, приготовленной как указано, и инкубируют на льду в течение 40 мин. Затем инкубируют при 42°С в течение

2мин, аликвоты (1, 10 и 100 мкл) удал ют и ввод т в 3 мл верхнего агара (L питательный бульон с 0,5%- ным агаром, поддерживаемом в расплав1 ленном состо нии при 45°С), который также содержит 50 мкл 2%-ного X-Gal, 50 мкл 100 мМ IPTG и 200 мкм E.coli К12 jM 109 в. логарифмической фазе роста). Смесь клетки - верхний агар помещают на пластины с L агаром, содержащим 40 мкг/мл X-Gal (5-бромо-4- хлоро-37Индолил-|5-В-тиогалактозид)

и 0,1 мМ IPTG (изопропил-В-В-тиога- лактозид). Пластины инкубируют при 37 С в течение ночи.

Прозрачные колонии используют дл  инокул ции 2 мл питательного бульона L, полученные в результате культуры инкубируют при 37°С с аэрацией в течение 2 ч (отсутствие синего цвета говорит о том, что произошла желаема  вставка ДНК). Затем культуры . центрифугируют и 200 мкл полученного поверхностного сло  ввод т в 10 мл культуры (0oD,S5D 0,5). E.coli K12 jM 109, выращенной при 37°С с аэрацией . Эти культуры инкубируют еще в течение 30 мин при 37°С, а затем клетки гранулируют путем центрифугировани  и используют дл  получени  репликативной формы рекомбинантного фага, -который они содержат. Двуни- тевую репликативную форму ДНК фага выдел ют из клеток с использованием процедуры, описанной в примере 1.

10

15

25

3985630

Трансформанты, содержащие ДНК фага пИЗТсЗ, идентифицируют путем анализа ограничительного фермента их фаговой ДНК о

5 Дл  получени  однониточной ДНК фага т13ТсЗ 1,5 мл ночной культуры E.coli К 12 jM 109/m13Tc3 подвергают центрифугированию и 100 мкл поверхностного сло , содержащего фаг т13ТсЗ, используют дл  инокул ции 25 мл культуры E.coli jM 109 при О.Р.6бо 0,4- 0,5. Культуру инокулируют в течение 6 ч при 37°С с аэрированием В течение этого времени культуру центрифугируют и полученный поверхностный слой (20 мл) перенос т в новую трубку . 2 мл раствора, содержащего 20% полиэтиленгликол  (PEG) 6000 и 14,6%

2Q NaCl, ввод т в этот поверхностный

слой центрифугировани , который затем инкубируют на льду в течедие 20 мин Полученньй поверхностный слой центрифугируют в течение 25 мин. Осадок снова суспензируют в 500 мкл буферного раствора ТЕ Раствор ДНК двукратно экстрагируют насыщенным фенолом ТЕ и двукратно хлороформом. Затем осаждают однонитевую ДНК с использованием NaOAC и этанола, и подвергают центрифугированию Осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и раствор ют в 60 мкл Н20.

Мутагенез провод т следующим образом .

35 Фрагмент однонитевой ДНК, используемый в мутагенезе, синтезируют в автоматическом синтезаторе ДНК. Этот фрагмент имеет указанную последовательность:

40 5 -CCCGTCCTGIGGATACTCTACGCCGA-3 Он гомологичен зоне,окружающей точку Bam HI (57-GGATCC-3}) в придающем стойкость к тетрациклину гене плазмиды pBR322, с той разницей, что груп45 па А, втора  от 5 конца (или треть  от 31-конца), представл ет собой С в плазмиде рВК322 Така  замена не измен ет аминокислотный достав придающего стойкость к тетрациклину бел50 ка, но устран ет точку Bam HI.

Примерно 10 пМ мутантной затравки и универсальной затравки М13 обрабатывают отдельно 10 ед. (BRL) Т4-по- 55 линуклеотидоксиназы в 20 мкл раствора киназы IX (60 мМ трие-HCl, рН 7,8, 15 мМ 2-меркаптоэтанола, 10 мМ MgCl. |И 0,41 мкМ ш-АТР) в течение 30 мин при 37 С. Обработанную киназой ДНК

30

зп

используют в операции мутагенеза, дл  чего смешивают 300 нг 0,2 мкл) одно- нитевого фага т13ТсЗ, 1 пМ (2 мкл) универсальной затравки, 1 пМ (2 мкл) мутагенной затравки, 2 мкл 10Х ана- нел ционного буферного раствора (100 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЕДТА и 500 мМ NaCl), и 12,8 мкл Н20, инкубируют при 80°С в течение 2 мин, при 50°С в течение 5 мин и охлаждают до комнатной температуры.

5 мкл раствора 10Х (500 мМ трис- HCl, рН 8, 1 мМ ЕДТА. 120 мМ MgCl), 5 мкл 2 мМ d ATP, 1 мкл 6 мМ раствора в каждом из ТТР и d CTP, 1 мкл ( ед.) фермента Кленова, 1 мкл (100 ед.) Т4-лигазы ДНК и 17 мкл ана- нелированной ДНК инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, при 37°С в течение 2,5 ч и затем в течение ночи при 4°С.

Реакцию останавливают посредством двух экстракций насыщенным ТЕ фенолом и двух экстракций ДНК осаждают этанолом и NaOAc, осаждают центрифугированием, повторно суспензируют в 50 мкл НгО и 6 мкл буферног раствора 10Х 1 добавл ют к раствору ДНК.

Раствор ДНК распредел ют поровну в три трубки. В две из них ввод т примерно 200 ед. SI нуклеазьь Одну реакционную смесь SI инкубируют при комнатной температуре в течение 5 ми а другую - в течение 10 мин. Реакцию прекращают путем экстракции реакционной смеси насыщенным ТЕ фенолом, экст- ракцией хлороформом и осаждением этано лом. Не подвергнутьй обработке образец ДНК служит в качестве негативного контрольного образца.

Осадок ДНК повторно суспензируют в 20 мкл . 10 мкл полученного раствора используют дл  трансформации E.coli.

Двунитевую репликативную форму ДНК выдел ют примерно из 48 колоний как описано и отбирают на присутствие точки Bam HI (pLUOB). Изол ты .без точки Bam HI отбирают описанным путем получени  однонитевой ДНК.

Дл  построени  плазмиды рЫЮС 50 мкг репликативной формы ДНК фага рЫЮВ гидролиз уют в 250 мкл буферного раствора IX Nhe I (50 мМ NaCl, 6 мМ трис-HCl, рН 7,5, 6 мМ М§С12и 6 мМ В-меркаптоэтанол), содержащего л/50 ед. фермента Nhe I при 37 °С в тчение 2 чо Добавл ют 5 мкл 5 М NaCl,

,

, |

е

10

20

25

7398563

а затем 5 мкл (50 ед.) фермента Sal I и гидролизуют в течение 2 ч при 37°С. Фрагмент 422 п.о. Nhe I - Sal I, содержащий зону, придающую стойкость тетрациклину, выдел ют из акриламидного гел ,

ДНК плазмиды рЫЮА гидролизуют ферментами Nhe I - Sal I в аналогичных- услови х, получа  Nhe I - Sal I фрагмент размером 6,1 т„п.о„

100 нг каждого из полученных фрагментов сшивают с использованием обыч ной процедуры Плазмида pL110C при- . с дает устойчивость E.coli к тетрациклину , но не имеет точки Bam HI в тет- рациклиновом гене.

Дл  построени  плазмиды pCZRIII сшивают фрагмент/ 3,5 т.п.о. EcoRI - Psс I плазмиды pL110 С (содержащей неповрежденную кодирующую последовательность ) с фрагментом размером 3 т.Поо. EcoRI - Pst I плазмиды pIT160. Плазмида содержит фрагмент 3 т.п.о. EcoRI - Pst I, образе - ванный от плазмиды рЫЮС, вставленной в гидролизованную EcoR I - I плазмиду PUC18. Фрагмент содержит ген устойчивости к тетрациклину с той разницей, что точка С1а I исключена Плазмида несет устойчивость к 10 мкг/мл тетрациклина и в ней отсутствует ограничительна  точка С1а I. 50 мкг ДНК плазмиды pL110C инкубируют в объеме 250 мкл IX EcoRI раствора, содержащего 10 мкл ( ед,) EcoRI, в течение 2 ч при 37°С. Затем ввод т 1 мкл (5 ед„) фермента Rst I и инкубацию продолжают при 37°С. Аликвоты удал ют примерно каждые 5 мин и экстрагируют смесь фенол/СНС Эти аликвоты собирают и смесь подвергают электрофорезу на агарозном геле. Желаемый EcoRI - Pst I фрагмент А/3,5 т„п.о. содержит неподвергнутый воздействию ген bGII и включает внутреннюю точку Pst I. Фрагмент очищают и сшивают с фрагментом Pst I - EcoRI размером 3 т.п.о. плазмиды рГПбО. Полученной 50 ДНК трансформируют E.coli K12 jM 109 и желаемую плазмиду обозначают pCZRIII, характеризу  с помощью известных методик.

30

35

40

45

Дл  построени  плазмиды pCZR336 50 мкг плазмиды рИОЗ инкубируют в 250 мкл высокосолевого буферного раствора IX, содержащего полх50 ед. фермента Bam HI и ХЬа I в течение

33

2 ч при 37°С. Фрагмент 650 п.о ХЬа I - Bam UI, содержащий первый цистерон и ген кодирующей последовательности LGH, отдел ют и очищают в акриламидном геле. 50 мкг плазмиды pCZBIII гидролизуют ферментами Xba I и Bam HI и большой фрагмент очищают Фрагменты сшивают друг с другом и трансформируют E.coli K12 RV308, Плазмиду pCZR33S идентифицируют. Построение плазмиды .

1

b -TATGACTTCCAAGCTTCCCGTCTTTCGTCTAGACGACCTCAAGAGCGGCAAGGTCCTCACCGAGCT-S

I I I I М I I I III И I It I 1 Н I И М I И М 1111 I I I I И IН I 1 1 И I I H I HI И I 3 -ACTGAAGGTTCCAAGGGCAGAAAGCAGATCTGCTGGAGTTCTCGCCGTTCCAGGAGTGGC-5

Эта св зующа  молекула синтезирована в автоматическом синтезаторе ДИК в виде двух одиночных нитей. Молекула имеет несколько изменений; об разование точки Nde I, включающей трансл ционную инициирующую точку; замена С на А в третьем положении кодона 10 (лейциновый кодон), поскольку СТС и СТА эквивалентны, образу  точку ХЪа I; замена С на Т в третьем положении четвертого кодона (валиновый кодон), поскольку GTC и GTT эквивалентны.

5 мкг плазмиды pUC 19 раствор ют в 50 мкл раствора IX Sst I (50 мМ NaCl, 50 Mil, трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl), содержащего л/10 ед„ фермента Sst I, и инкубируют 2 ч при 37°С Концентрацию NaCl увеличивают до 150 мМ путем добавлени  1 мкл 5 М NaCl, добавл ют 2 мкл (Ю-ед„) фермента Nde I и инкубируют еще 2 ч при 37°С. ДНК осаждают центрифугироваг нием.,

Примерно 100 нг гидролизованной плазмиды pUCl9 смешивают с 1 пмоль синтезированного св зующего звена и Т4-лигазой ДНК. Лигазной смесью - трансформируют клетки Е„со11 К12 JM 109, аликвоты высевают на чашки i с L-агаром, содержащим 100 мкг/мл

ампициллина, 40 мкг/мл Х-gal и

40 мкг/мл IPTG

Чашки инкубируют при 37°С в тече- ние ночи. Колонии, содержащие плаз- миду без вставки, имеют синий цвет, а колонии, которые содержат плазмиду со вставкой, - белыйо Отбирают несколько белых колоний и осуществл ют их отбор методом рестрикционного анализа на присутствие фрагмента 60 ПоО. Nde I - Sst I с той же

1739856

34

Плазмида pCZR336 представл ет со- бой вектор, несущий промоторflpL. Дл  соединени  DACS/DAOCS с промотором 1( pL в плазмиде pCZR336 необходимо использовать синтезированное св зующее звено ДНК. Это св зующее звено соедин ет точку Nde плазмиды PCZR336 с точкой Sst I в кодирующей последовательности DACS/DAOCS и имеет приведенную структуру:

20

5

0

последовательностью, что и синтезированный фрагмент.

Окончательное построение плазмиды провод т следующим образом .

Плазмиду получают путем сшивки фрагмента Sst I - Ваш HI плазмиды со вставкой Nde I - Sst I плазмиды р 104 и Nde I - Bam HI фрагментом плазмиды pCZR336« Фраг- мент/ч/2,2 т0ПоОо Sst I - Bam HI плазмиды получен путем полного гидролиза Bam HI и частичного гидролиза Sst I. Дл  этого плазмиду в количестве 50 мкг раствор ют в 250 мкл раствора IX Sst I, содержащего 50 ед. Bam HI,и инкубируют при 37°С в течение 2 ч„ Затем ввод т 1 мкл (10 ед) фермента Sst I 5 и инкубируют при 37°С.

50 мкг ДНК плазмиды pCZR336 cyc-i пендируют в 250 мкл высокосолевого раствора, содержащего по 50 ед. ферментов Nde I или и выдерживают при 37 С в течение 2 ч«

Фрагмент А/5,8 т.п. о. Nde I - Bam HI плазмиды pCZR336, который не имеет кодирующей последовательности LGU, выдел ют из агарозного гел .

100 мкг плазмиды суспензируют в 500 мкл раствора IX Sst I, содержащего 100 ед. фермента Sst I, инкубируют при 37°С в течение 2 ч, концентрацию NaCl увеличивают до . 150 мМ путем добавлени  10 мкл 5 М NaCl, ввод т 20 мкл (/400 еда) фермента Nde I и инкубируют 2 ч при 37°С. Фрагмент размером /60 п.о очищают в 15%-ном агарозном геле.

100 нг фрагмента Nde I - Bam HI 5,8 т.п.о. плазмиды рСгкЗЗб.ЮО нг фрагмента 2,2 т.п.о. Sst I - Bam HI плазмиды pIT.503 нг фрагмента 60 п.о. Sst I - Nde I плазмиды0

5

0

pit 04 сшивают Т4- пигазой и используют дл  трансформации клеток Eccoli. Клетки выращивают при 30°С, Трансформанты идентифицируют путем анализа их ДНК.

Приме р 3. Определение продуцированной E.coli активности DACS/ /DAOCS.

Культура E.coli K12 jM 109/pIT507 дл  выражени  активности DACS/DAOCS

Трансформанты E.coli K12 JM109/ выращивают при 30°С в течение ночи в 500 мл питательного бульона (содержащего 10 мкг/мл тетрациклина ) в роторном инкубаторе, вращающемс  со скоростью 250 об/мин. Клетки разбавл ют (1:10) и дополнительно инкубируют в течение 1 ч при 30°С в тех же услови х выращивани t Температуру воздуха затем повышают до 42°С и инкубацию продолжают дополнительно в течение 6,5 ч Чувствительный к температуре с 1857 flpL-промотор , установленный так, что обеспечивает выражение DACS/DAOCS на плазмиде , инактивируетс  при 42°С и, таким образом, допускает экспрессию DACS/DAOCS. После инкубации клетки собирают путем центрифу- гировани  и используют как предпочтительный источник продуцированной E.coli активности DACS/DAOCS,,

Активность экспандазы и гидрокси- лазы в клетках Eocoli K12 JM109/ , выращенных при

Примерно 14 г клеток Eccoli K12 jM109/pIT507, приготовленных по примеру 3, повторно суспензируют в трис- GEDA растворе (15 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10%-ный глицерин; 10%-ный этанол; 10 мМ дитиотреитол и 10 мМ ас- корбат) в общем объеме 20 мл. Клет- ки разрушают ультразвуком при 4°С. В ходе пропускани  звука осуществл ют многократный ввод фенилметилсуль- фонилфторида (pMSF) до тех пор, пока окончательна  концентраци  не достигает 2 мМо Добавл ют дезоксирибонуклеазу и сульфат магни  до концентрации соответственно 1 мкг/мл и 2 мМ. Суспензию центрифугируют со скоростью 40000 g в течение 30 мин. Поверхностный слой заключает в себе сырой экстракт фермента DACS/DAOCS,,

Этот экстрак,т объемом 13 мл ввод т в 50 мл колонку ДЕАЕ-трисакрил, предварительно уравновешенную с 15 мМ трис-GDEA (рН 7,5). Колонку промы0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

вают четырьм  объемами 15 мМ буферного раствора трис-GEDA и затем линейным градиентом от 0,015 мМ трис- GEDA до 0,3 мМ трис-GEDA,, Фракции по 5 мл собирают; фермент элюируетс  как один основной пик активности,,

Ферментную активность определ ют, осуществл   анализ, основанный на жидкостной хроматографии высокого давлени  Катализированную экспанда- зой реакцию осуществл ют в течение 15 мин при 30° С с использованием 0,28 мМ пенициллина N 60 мМсхЈ-кето- глутарата (L-KG), 0,06 мМ сульфата железа (двухвалентного), 0,67 мМ аскорбата, 1,00 мМ дитиотреитола, 0,05 мМ АТР и 0,0008 - 0,008 ед„ фермента в 1 мл 50 мМ трис-HCl (рН 7,5. Катализированна  гидроксилазой реакци  осуществл етс  при 36°С в той же среде с DAOC с концентрацией 0,05 мМ вместо пенициллина N.

Реакции останавливают путем добавлени  1 мл этилового спирта. Осажденный продукт отдел ют центрифугированием при 4000flg в течение 5 мин. Поверхностный слой, содержащий ферментные продукты реакции, анализи- руют методом жидкостной хроматографии высокого давлени  следующим образом . Активность эксплантазы определ ют путем измерени  образовани  как DAOC, так и DAC из пенициллина Н ввиду  вной бифункциональности ферментао Активность гидроксилазы определ ют путем измерени  образовани  DAC из DAOC.

; Аликвоты (от 20 до 100 мкл) по- .верхностных растворов анализируют на DAOC и DAC посредством жидкостной хроматографии высокого давлени  (HPLC) с использованием внешних стандартов , DAC и DAOC раздел ют с помощью колонки с радиально упакованными спрессованными микроБондпэк NH/j. (0,8x10 см) с подвижной фазой 2% уксусной кислоты, 0,4% метилового спирта , 6-7% ацетонитрила и 87 - 92% воды (рН 5,8)о Скорость потока составл ет 1,5 - 2,0 мл/мин, детектирование осуществл ют при 260 нм (це- фалоспоринхромофор). Результаты анализа воспроизводимы с 2%-ным отклонением при дубликатных анализах, катализированных как экснандазой, так и гидроксилазой.

П р и м е р 4 мйды .

Построение плазПлазмида (пример 2) содер- жит геномную ,4 п.о., расположенную ниже трансл ционной конце- вой точки кодирующей последовательности DACS/DAOCS. Дл  того, чтобы уменьшить длину этой ДНК все, кроме 120 , удал ют путем использовани ограничительной точки ХЬа I, расположенной ниже трансл ционного стоп- кодона в конце кодирующей последовательности DACS/DAOCS„

10 мкг плазмиды расщепл ют в 50 мкл раствора IX Sst I, содержащего лМ 0 ед„ ограничительного фермента ХЬа I при 37°С в течение 2 ч.

10 мкг плазмиды суспензируют в 50 мкл раствора IX Sst I с

10ел, каждого(из ферментов Sst Bam HI, и инкубируют в течение 2 ч при 37°С. конец Bam HI дополн ют ферментом Кленова.

100 нг фрагмента ХЬа I (дополненного ) - Sst I плазмиды смешивают с 100 нг плазмиды , вываренной с Bam HI (дополненного) - Sst I, и трансформируют в K12 jMl 09. Плазмиду идентифицируют методом анализа ограничительного фермента. Плазмида ценна, поскольку сли ние дополненных концов ХЬа I и Bam HI, достигаемое при построении плазмиды , реконструирует точку Bam HI (хот  точка ХЬа I разрушаетс ).

50 мкг плазмиды раствор ют в 250 мкл высокосолевого раствора ЗХ, содержащего 50 ед. каждого из .ограничительных ферментов Nde I и Ват III, к инкубируют 2 ч при 37°Со Фрагмент л/191 т.п.о. Nde I - Bam HI очищают в акриламидном геле 100 нг фрагмента смешивают с 100 нг большого фрагмента Nde I - Bam HI плазмиды pCZR336, лигируют и трансформируют в E.coli K12 JM109 Трансформанты Е.со11K2 jM109/piI 511 идентифицируют путем анализа ограничительного фер мента их ДНК Клетки Eocoli K12 JM109 могут быть использованы как источни активности DACS/DAOCS согласно про- иедуре, описанной в примере 3.

П р и м е р 5. Построение плазмиды рТГ513,

Кроме мутаций вставки и делеции .аминокислотный состав и последова- тельность генного продукта DACS/DAOC могут быть изменены путем замены основной пары в кодирующей белок зоне.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

Известный способ точечно напра в- ленной мутации описан в примере 2, Представл ющий интерес ген сначала клонируют в , создава  под- ход щий источник однонитевой ДНК. 5 мкл М13т18 ДНК инкубируют в 50 мкл раствора IX Sst I, содержащего -10 ед. фермента Bam HI, 2 ч при 37°С„

50 мкг плазмиды инкубируют в 250 мкл буферного раствора IX Sst I, содержащего 50 ед, каждого из ферментов Bam HI и Bgl II, в течение 2 ч при 37°С. ТЪчка Bgl II находитс  в 5Г-некодирующей зоне выше начального трансл ционного кодона кодирующей последовательности DACS/ DAOCS вектора , а точка. Bam HI находитс  примерно на 100 п,о„ ниже трансл ционного стоп-кодона„ Фрагмент ,1 ТоП.о. Bam HI - Bgl II плазмиды очищают обычным разом в акриламиде.

100 нг гидролизованной с Bant HI ДНК фага М13тр18 ввод т в 100 нг очищенного фрагмента Bam HI - Bgl II плазмиды Смесь лигируют и трансформируют в Е„соН К12 JM109 Плазмида, полученна  в результате желаемой вставки, имеет фрагмент, ориентированный так, что 5 -конец кодирующей последовательности DACS/ /DAOCS (точка BglII) находитс  около гена lac Z, а 3 -конец данной кодирующей последовательности (точка Bam HI) находитс  около гена lac I на векторе М13, Соответствующий изо- л т обозначен как mIT113

Синтезируют мутагенную затравку, используемую дл  данного эксперимента , котора  имеет следующую последовательность: ,5 -TCGGACTACTOGCACCTACTCCATGGCATC-3

Производное от tnIT113, содержащее указанную последовательность вместо последовательности дикого типа, идентифицировано, охарактеризовано в примере 2 и обозначено как rnIT114. Идентификаци  желаемого изо- л та облегчаетс  путем создани  новой ограничительной точки Alu I

10 мкг ДНК фага mIT114 раствор ют в 50 мкл раствора IX, содержащего 10 ед. каждого из ферментов Ват I и Nbe I, инкубируют при 37°С 2 ч. Фрагмент 1,1 топ.о. выдел ют в акриламидном геле, смещают с расщепленной Nbe I - Bam HI плазмидой pCZR336, сшивают и трансформируют в Eocoli,

Трансформанты E.coll K12 jM109/pIT51 идентифицируют путем анализа. Плаз- мида приводит к выражению му- тантного производного DACS/DAOCS, которое содержит группу серина, замен ющую группу цистеина в положении 100 в последовательности дикого типа E.coli K12 jM109/p T513, и  вл етс  предпочтительным источником данного мутантного белка,

П р и м е р 6. Построение мид pPS56 и pPS55c

Плазмида pPS56 представл ет собой вектор выражени  Cephalosporium acremonium ,. который придает устойчивость гидромицину В и содержит ген Cc.acremoni.urii DACS/DAOCS с Плазмида pPS56 построена с использованием плазмиды рМЬС12 (NRR В 18097), плаз- миды (пример 1) и плазмиды pPS34,

Дл  построени  промежуточной плаз- миды pPS55 5 мкг плазмиды pMLClZ раствор ют в 5 мкл раствора 1СХ Hind III и 40 мкл воды. В раствор ДИК ввод т 5 мкл (50 едЛ фермента. Hind III, инкубируют при 37°С 2ч, экстрагируют фенолом и хлороформом Hind III, гидролизованную ДНК плазмиды pMLC12, осаждают путем доведени  концентрации NaCl до 0,25 М и двух объемов холодного этанола, охлаждают при - 70°С в течение 10 мин, центрифугируют и повторно суспензируют в 5 мкл воды о

Фрагмент 2,3 т.п.о. Hind III плазмиды pPS34 содержит промотор синте- тазы изопенициллина N Cephalosporium acremonium, св занный с кодирующей последовательностью гена гидромицина В фосфотрансферазы, который придает устойчивость к гидромицину В

10 мкг плазмиды pPS34 гидролизуют ограничительным ферментом Hind III, раздел ют в 0,8%-ном агарозном геле и выдел ют 2,3 т.п.о, фрагмент который включает промотор гена Cephalosporium acremonium 1 pS, присоединенный и включенный в рамку устойчивости к гидромицину. 1 мкг фрагмента выдел ют и суспензируют в 5 мкл воды 1 мкл гидролизованной G Hind III ДНК плазмиды pMLC12 лигируют с 4 мкл фрамента 2,3 т.п.о. Hind III плазмиды pPS34 и получают плазмиду pPS53.

Клетки выращивают до оптической плотности O.D. 5ф0 0,5, охлаждают на льду 10 мин, центрифугируют. Оса

5

5

0

5

0

док клеток суспензируют в 25 мл холодного 100 мМ СаС1ь, инкубируют на льду 25 мин, центрифугируют, осадок повторно суспензируют в 2,5 мл холодного 100 мМ и инкубируют на льду в течение ночи. 200 мкл этой клеточной суспензии смешивают с ДНК, приготовленной как указано, и инкубируют на льду в течение 20 мин, при 42°С 2 мин и на льду 10 мин. Клетки центрифугируют, суспензируют в 1 мл питательного L бульона и инкубируют при 37 С в течение 2 ч.

Аликвоты этой клеточной смеси высевают на чашках с L-агаром, содержащим 25 мкг/мл хлорамфеникола, 40 мкг/ /мл X- и 40 мкг/мл IPTG. Чашки инкубируют при 37°С в течение ночи. Колонии , содержащие плазмиду без вставки, такие как E.coli K12 JM 109/pMLC12, про вл ют синий цвет. Колонии, которые содержат плазмиду с вставкой, такие как E.coli K12 jM 109/pPS55, про вл ют белый цвет с Из нескольких белых колоний посредством рестрикционного анализа их ДНК плазмиды отбирают кло ны, содержащие фрагмент - 2,3 т.п.о., включающий промотор Cephalosporium acremonium IPS.

Дл  конечного построени  плазмиды pPS56 20 мкг плазмиды рГГЬОЗ гидролизуют ферментом Bam HI и выдел ют фрагмент размером 7,0 т.п.о., включающий ген DACS/DAOCSс 15 мкг плазмиды pPS55 гидролизуют ферментом Bam HI и выде- I л ют фрагмент размером 5,0 т.п.о.

Фрагменты лигируют и используют дл  трансформации E.coli. Идентифицируют несколько плазмид на присутствие фрагмента т.п.о., с од ержаще го ген Cephalosporium acremonium DACS/ /DAOCS, вставленный в подход щую точку Lam HI дл  образовани  плазмиды pPSbb.

Пример 7. Построение плазмиды 5 PPSS1.

15 мкг ДНК плазмиды ,С12 гидролизуют ферментом и выдел ют фрагмент размером 2,7 т.п.о. Полученный фрагмент гидролизуют ферментом Eco RI и получают четыре фрагмента ДНК: один , фрагмент - желаема  молекула Л/2,7 т. п.о., другой - длиной 24 п.о„; третий - длиной/vO,6 т.п.о., и четвертый - длиной А/1,9 т „п.о.

0

Ацетамидазный ген Aspergillus ni- dulas выдел ют в виде ограничительного фрагмента 5,0 т,п.о. EcoRI - Sal I плазмиды p3SR2

с киназсй реакционные смеси инкубируют при 70 С в течение 15 ми зател обе реакционные смеси сливают инкубируют при 65°С 10 мин, а затем при комнатной температуре 2 ч и при 4°С в течение ночи.

Hind III - Hind III фрагмент ДНК плазмиды pPS51, Bam HI - Hind III - плазмиды pIT503 (пример 6); св зующ молекулы сшивают Т4 ДНК-лигазой, трансформируют клетки E.coli и получают плазмиду pPS52 путем анализа н присутствие ограничительного фрагмента/4 7, О т.п.оо Bam HI, содержащего ген Cephalosporiutn acremonium DACS/DAOCS, вставленный в точку Hind III, расположенную между генами CAT и amdS плазмиды pPS51«

П р и м е р 9. Построение плазмиды pPS53.

Плазмиду рМЬС12 (NRRL В-18097) гидролизуют ферментом Вага HI. Промотор гена изопенициллин N синтетазы Penicillium chrysogenum выдел ют в виде Nco I - Nco I фрагмента (1,0 т.п.о.) плазмиды pLC1°

Синтезируют одиночные нити следующих св зующих молекул:

41

Фрагмент размером л/4,3 т.п.о. за лючает ДНК плазмиды pBR322, а фрагмент размером ч 5,0 т.п.о. - ген аце тамидазы (amdS).

Фрагмент EcoRI - Sal I плаэмиды pMLC12 лигируют с фрагментом л/5,0 т п,о. EcoRI - Sal I плазмиды p3SR2 плученной смесью. Трансформируют E.cli .

Идентифицируют колонию на присутствие фрагмента, содержащего ген Aspergillus nidulaus и имеющего точную структуру желаемой плазмиды.

П р и м е р 8. Построение плазмиды рРВ52.

5 мкг ДНК плазмиды pPS51 гидролизуют рестриктазой Hind III,

Синтезируют одиночные нити следующих св зующих молекул с использованием автоматического синтезатора ДНК:

5 -GATCCCCGGG-3

ИМИ 3 -GGGCCCTCGA-3r

75 пмоль каждой нити данной св - зующей молекулы раствор ют индивидуально в 22,5 мкл воды и 2,5 мкл раствора лигазы, добавл ют 1 мкл (10 ед.) Т4 ДНК-киназы, инкубируют при 37°С в течение 30 мин. После реакции

856

5

42 .

S -CATGAACAAG-S 1

, If|Ml 3 -TTCTTCCTAG-5

Каждую одиночную нить св зующей молекулы обрабатывают Т4 ДНК-кинаэой и затем аннелируют с образованием неповрежденной св зующей молекулы. 1 мкл гидролизованной Bam HI ДНК плазмиды pMLC12 лигируют с 4 мкл Nco I - Nco I фрагмента плазмиды pLCI и 10 мкл аннелированной св зующей молекулы.

Лигазной смесью трансформируют E.coli. Аликвоты трансформированной клеточной смеси высевают на чашках с L-агаром, содержащим 25 мкг/мл хлорамфеникола, 40 мкг/мл X-gal. и 40 мкг/мл IPTG0 Чашки инкубируют при 37°С в течение ночи. Колонии, которые содержат плазмиду без вставки , такие как E.coli K12 jM 109/ /pMLC12, про вл ют синий цвет на

5

этих чашках. Колонииt которые содержат плазмиду с вставкой, такие как E.coli K12 jM 109/pPS53, про вл ют белый цвет на этих чашках. Колонии отбирают путем анализа их ДНК на присутствие ограничительного фрагмен- та, содержащего промотор гена изопе-

0 |нициллин N синтетазы Penicillium ichrysogenum (плазмида pPS53) .

Пример 10. Построение плазмиды pPS54.

Ген изапенициллин N синтетазы Ре-

5 nicillium chrysogenum выдел ют в виде Hind III - Hind III фрагмента (Л 3,3 т.п.Оо) из плазмиды pLC2. 1 мкл гидролизованной Hind III ДНК плазмиды pPS51 лигируют с 4 мкл ограничитель0 ного фрагмента (3,3 т„п„о.) Hind III

плазмиды pLC2, получа  плазмиду pPS54.

Р 11. Построение плаз5

0

5

Приме миды pPS57

Плазмиду pPS55 расщепл ют ферментом Bam HI и выдел ют фрагмент размером 4,3 т.п.о,, включающий кодирующую последовательность гена HmR.

Bam HI - Bam HI - фрагмент плазмиды pPS53 (размером 1 т.п.о.), содержащий промотор гена изопенициллин N синтетазы Penicillium chrysogenum - лигируют с Bam HI - Ват HI - фрагментом плазмиды pPS55, и трансформируют в E.coli K12 С600 (АТСС 33524). Идентифицируют колонии, которые содержат плазмиды со вставками. Эти плазмиды отбирают путем рестрикцион- ного анализа на присутствие фрагмента л/0,1 т.п.о. Bam HI, включающего промотор гена PeniciIlium chrysoge- nura IpS (плазмида pPS57).

Пример 12. Построение плаз- миды pPS60.

Плазмиду (пример 4) гидро- лизуют ферментом Bgl II и лигируют с фрагментом /И,0 т.п.о. плаэмиды pPS5 ( пример 9), трансформируют E.coli К12 0600 (АТСС 33524). Аликво.ты этой трансформированной клеточной смеси высевают на чашках с L-агаром, содержащим 15 мкг/мл тетрациклина. Чашки инкубируют при 30°С в течение ночи . Колонии, которые содержат плаз- миду без вставки, такие E.coli K12 0600/pIT511 отделены от колоний, которые содержат плазмиду с вставкой, таких как E.coli C600/pPS60, в основном согласно способу Eckardt Идентифицированы колонии на присутствие ограничительного фрагмента, содержащего промотор гена Penicillium chry- sogenum IPS в желаемой ориентации (плазмида рРЬбО).

структуры:

5 -CTAGACACCATGACTTCCAAGGTCCCCGTCTTTCGC-3

3 -TGTGGTACTGAAGGTTCCAGGGGCAGAAAGTGGATC-5

Каждую одиночную нить индивидуально обрабатывают Т4 ДНК-киназой и затем аннелируют с образованием неповрежденной св зующей молекулы. Сшита  ДНК составл ет желаемую плазмиду pPS59. Ее используют дл  трансформации E.coli K12 С600 (АТСС 33524), Колонии , которые содержат плазмиду со вставкой, такие E.coli K12 С600/ /pPS59, анализируют на присутствие св зующей молекулы.

Пример 15„ Построение плаэмиды pPS61,

ДНК плазмиды pPS51 (пример 8) гидролизуют ферментом Hind III и обрабатывают фрагментом Кленова в присутствии четырех dNTPS (dATP, TIP, dGTP и dCTP), осаждают, извлекают путем центрифугировани  и повторно суспензируют в 5 мкл воды

ДНК плазмиды pPS59 гидролизуют ферментом Bam HI и выдел ют фрагмент размером 8,0 т,.ПоОв

Полученный фрагмент плазмиды pPS59 обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы в присутствии четырех dNTpS (dATP, TTP, dGTP и dCTP) и гидролизуют ферментом Nru I, что приводит к образованию двух ограничи

Пример 13. Построение плаз- миды pPS58,

Плазмиду pPS60 гидролизуют ферментом ХЬа I, что приводит к образованию трех фрагментов ДНК; одного фрагмента 7,9 т.п.о. и двух меньших фрагментов ниже 300 п,о. Выдел ют фрагмент-v7,9 т.п.о. и примерно 3 мкг фрагмента извлекают и суспензируют в 5 мкл воды. 0,5 мкг этого фрагмента раствор ют в 10 мкл буферного раствора лигазы, (4 мкл) Т4 ДНК-лигазы и 86 мкл воды, инкубиру  при 15°С в течение ночи. Эта сшита  ДНК составл ет плазмиду pPS58, которой трансформируют Eccoli K12 С600 (АТСС 33524). Вы вл ют колонии TcR, которые анализируют на отсутствие двух небольших фрагментов ХЬа I, характеризующих плазмиду pPS60s

П р и м е р 14. Построение плазми- ды pPS59c

ДНК плазмиды pPS58 гидролизуют ферментом ХЬа I и лигируют с синтезированной одиночной нитью следующей

5

5

тельных фрагментов: фрагмента- 2,1 т.п.о. и фрагмента 5,9 т.п.ос Фрагмент 2,1 т.ПсО. содержит кодирующую последовательность DACS/DAOCS под

контролем промотора гена изопеницил- лин N синтетазы Penicillium chryso- genum и трансл ционную активирующую последовательность. Этот фрагмент лигируют. с.фрагментом плазмиды pPS51

дл  получени  плазмиды pPS61,.

Пример 16. Построение плазмиды рР362ь

ДНК плазмиды pPS57 (пример 11) гидролизуют ферментом Hind III, что приводит к образованию одиночного линейного фрагмента 5,3 т.п.о., который обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 в присутствии четы- рех dNTpS (dATP, TTP, dGTP и dCTP). 1 мкл такого фрагмента плазмиды pPS57 ввод т в 5 мкл фрагмента л/ 2,1 т.п.о., выделенного из pPS59, как описано в примере 15.

ДНК используют дл  трансформации. E.coli K12 С600 (АТСС 33524). Идентифицируют колонии, которые содержат плазмиды со вставками, с анализом на присутствие ограничительного фрагмента , содержащего вставку 2,1 т.п.о. (плазмида pPS62).

Пример 17, Генетическа  трансформаци  Penicillium chrysoge- num плазмидами p3SR2, pPS52 и pPS54o

Штаммы Penicillium chrysogenum или любые промышленные штаммы, полученные из штамма АТСС 9480 путем мутации , селекции или генетического размножени  с целью улучшенного продуцировани  пенициллина G или пени- циллины V, пригодны дл  использовани при получении трансформантов с векторами и плазмидами, отвечающими предлагаемому изобретению.

Приготовление однородного инокулу ма дл  клеточной культуры ведут следующим образом.

Дл  эффективной трансформации клеток Penicillium chrysogenum необходимо удал ть стенки клеток с целью образовани  устойчивых протопластов. При получении таких протопластов желательно начинать с однородного ино- кулюма. В противном случае, получе- ние клеток в культуре будет невоспроизводимым , и будет происходить потер  времени при попытке получить протопласты P.chrysogenum из неподход щих или недостаточных количеств клеток о

Ампулу вегетативных клеток ( Ч 09 о. к. ед. в 1,0 мл предохран ющей среды: лактоза 5%, глицерин 10%, и Твин-80 0,1%) либо лиофилизированных либо вз тых из системы хранени  в жидком азоте и отта вших при комнатной температуре, разбавл ют в 1,0 мл стерильного солевого раствора. 0,1 мл этой суспензии используют дл  инокул ции каждого из 10 скошенных агаров среди спорул ции, г/л: лактоза 15,0; кукурузньй экстракт 2,5; пептон 5,0; NaCl 4,0; MgS047HaO 0,5; KHZPO«}.0,6; F«Clg;6HeO 0,005; Си804.-5НгО агар 30,0 (рН 7,0) и выдерживают в автоклаве в течение 20 мин при давлении 120 psi (8,4 кг/см2)о

Каждый скошенный агар (,5 см) содержит 25 мл отвержденной среды. Инокулюм, равномерно распределенный по поверхности скошенного агара, выращивают при 25°С до тех пор, пока не .образуютс  и не спорулируютс  сливша с  сетка мицели  (дл  большинства штаммов 1 нед). Продукт выращивают из скошенного агара 1 суспендируют в 10 мл стерильной водной

0

5

0

-среды культивировани , и суспензию перенос т в 106 мл водной среды культивировани . Колбу, содержащую суспендированные клетки, помещают в роторный встр хивающий аппарат, и осуществл ют инкубацию при 25°С в течение 18 ч при 285 об./мин при вертикальном ходе 25,4 мм.

Водную среду культивировани  готов т следующим образом: 100 мл раствора А, г/л: сахароза 36; L-acnapa- гин 7,5; КНгР04 15; K-jHPO 21; 0,75; MgS04-7Hz.O 0,18; СаС12 0,06; солевой раствор 1 мл/л (рН естествен1 ной среды) ввод т во встр хиваемую колбу объемом 500 мл. Колбу закрывают и выдерживают в автоклаве при 121°С в течение 20 мин. Затем 2 мл раствора В (глюкоза 108 г/л) и мл раствора С (сахароза 25 г/л; кукурузный экстракт - 4 мас.%/об„азота) - 12,5 мл; ацетат аммони  5,5 г/л; СаСО, 5 г/л; рН довод т до 6,5 посредством КОН; выдерживают в автокла- ве при 121°С в течение 20 мин) ввод т в раствор А дл  получени  водной среды культивировани .

Дл  приготовлени  протопластов penicilliun клетки от 24-часовой |культуры собирают посредством фильт- рации с всасыванием (бумага Ватмана 1 с использованием воронки Бюхнера) и суспензируют в буферном растворе (0,01 М (оксиметил)аминометан- 5 хлоргидрат; 0,01 М MgS04; 0,01 М ди- тиотреитол; 1,00 М КС1 и рН 7,0 с НС1).

5

0

Ввод т достаточное количество буферного раствора до конечной концентрации клеток 1 г клеточной массы на 50 мл буферного раствора. Эту клеточную суспензию помещают во встр хиваемую роторную вод ную баню в 250- миллилитровой встр хиваемой колбе и инкубируют при 29 - 30°С в течение 10 мин при 140 об/мин. Обработанные дитиотрейталом клетки центрифугируют, повторно суспензируют в 50 мл фер- ментного раствора (Ю мг/мл Novozym, Novoinduscri А/В Bagsvaerd, Дани ): 0,1 М трис(оксиметил)аминометанхлор- гидрат; 0,01 М MgS04, 0,01 М дитио- трентол; 1,00 М КС1 и рН 5,8, во встр хиваемой колбе на 250 мл Эту кислотную суспензию высевают в роторном встр хивателе с вод ной баней и инкубируют при 29 - 30 С в течение 15 мин при 140 об./мин с вертикальным

ходом 25,4 мм. Обработанные ферментные клетки центрифугируют при 1240 Xg в течение 6 мин, осадок повторно суспензируют в растворе (0,01 М трис-ок- симетил, 0,01 М MgS04, 1,00 М КС1, рН 7,0). Суспензию центрифугируют при 950 Xg в течение 6 мин, осадок суспензируют в том же буферном растворе, центрифугируют при 700 Xg в течение 6 мин, осадок снова суспендируют в 5 мл того же буферного раствора Суспензи  содержит большие протопласты и разрушающиес  при осмосе клетки, которые сохран ют некоторую структуру клеточной стенки. По сравнению с небольшими протопластами, удаленными согласно описанной процедуре, про- цент протопластов, способных к регенерации клеточных стенок, и процент жизнеспособных осмотически стойких клеток выше дл  крупных протопластов и сомотически разрушаемых клеток в клеточной суспензии. Суспензию клеток разбавл ют раствором до концентрации 2х1О8 клс/мл.

Процедура трансформации следующа .

0,1 мл суспензии осмотически разрушенных клеток penicillium chryso- genum (примерно кл.) дополн ют 10 мкл 50 мМ СаС1г, 25 мкг ДНК плаз- миды в 5 - 15 мкл буферного раствора ТЕ и 0,9 мл раствора свежерастворенного полиэтиленгликол  4000. Смесь перемешивают , выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре, центрифугируют при 700 Xg в течение 2 мин и снова перемешивают. По 0,5 мл суспензии нанос т на поверхность осмотически стойкой стабилизированной ацетамидной среды (1,7 г/л дрожжевого азотистого основани  без аминокислот и сульфата аммони ; 125 г/л сахарозы, 0,738 г/л ацетамида; 1,27 г/л СаСЦ и 22 г/л агара Noble). Дл  измерени  суммарного количества жизнеспособных клеток, присутствующих в смеси трансформации, аликвоты от этой смеси трансформации высевают в чашки со средой, в которой ацетамид заменен равномол рным количеством сульфата аммони ,, Спуст  7 «- 10 дн после трансформации в ацетамидной среде присутствуют колонии трансфер - мантов дл  пересева. Абортивные трансформанты легко отдел ютс  от стойких трансформантов, поскольку абортивные трансформанты не растут при пересеве в свежеприготовленную

0

5

0

5

ацетамидную среду. Клетки трансформи - руют плазмидой, содержащей ацетами - дазный ген от видимых колоний, через 4 - 5 дн после трансформации,

Анализ трансформант Penicillium chrysogenum/p3SR2, P,. chrysogenum/ /pPS52 и P,chrysogt:num/pPS54.

Трансформанты P°chrysogenim/p3SK2, Pt chrysogenum/pPS52 и Р. chry sogenum/ /pPS54 про вл ют активность ацета - мидазы, не обнаруженную в экстрактах нетрансформированного штамма - пиента Р chrysogenum (например, АТСС 9480). Эта активность  вл етс  ре зультатом способности трансформиро - ванных штаммов расти с использованием аммиака, выдел емого при ацетамидном гидролизе, когда не имеетс  никако - го другого источника азота. Стойкость трансформантов расти на ацетамиде как единственном источнике азота казьшает функциональность ацетами- дазного гена Aspergillus nidulans в P. chrysogenunu

Трансформирующий фенотип (способ -1 ность расти на ацетамиде как единст венном источнике азота) сохран етс  трансформантами после пропускани  через неселективную среду

Пример 18С Генетическа  трансформаци  Penicillium chrysoge- num плазмидами pPS55 и pPS57t

Получение протопластов Penicillium chrysogenum осуществл етс  аналогич-1 но примеру 1 7,

Процедуру трансформации осуществ - л ют по примеру 17с использованием ДНК плазмид pPS55 и pPS57. Клетки, трансформированные плазмидой, содер - 0 жащей гибридный ген HmR, образовьр- вают видимые колонии через 7 - 10 дн после трансформации. Присутствие трифторперизина в хлориде кадми  в основной среде приводит к увеличению 5 чувствительности клеток Ptchrysogenum к гидромицину В,

Анализ трансформантов P.chryso- genum/pPS55 и P.c.hrysogenum/pPS57,

Q P,chrysogenum/pPS55 и Р chrysogenum/ /PS57 про вл ет активность гидроми - цин В фосфотрансферазы, не обнаруживаемую в экстрактах нетрансформш- рованного P.chrysogenum (например,

- АТСС 9480)„ Эта активность приводит в результате к способности трансфер - мированных штаммов расти в присутствии токсичных концентраций гидромицина В (с вводом гидромицина В в грибковые

0

5

49

клетки, ускор емым при экспонирова - нии кадмиевым ионом и трифторперази - ном (TFP). Способность трансформант расти в присутствии токсичных кон центраций гидромицина В (усиленна  кадмиевым и TFP) показывает, что гиб ридный ген HmR функционирует в Р„ chrysogenum Более высокие частоты трансформации, получаемые с плазми - Дои pPS57, по сравнению с плазмидой pPS55, показывают, что промотор и 5 г-регул торные последовательности P. chrysogenum IPS функционируют лучше в P.chrysogenum, чем промотор и 51 -ре- гул торные последовательности гена Cephalosporium acremonium IPS, сутствунмцего в гибридных генах, торые несет плазмида рР555„

Производные плазмид pPS55 и pPS57 содержащие ген Р chrysogenum, могут использоватьс  дл  образовани  мов с титрами пенициллина V, пре вышающими титр их нетрансформирован -4 ных родителей, благодар  более высо«- кому продуцированию IPS в трансфер - мантах.

Пример 19 о Генетическа  трансформаци  Penicillium chrysogenum с плазмидами pPS62 и pPS61.

Приготовление инокулюма дл  кле«- точной культуры, приготовление прото гшастов Penicillium chrysogenum и процедуры трансформации дл  исполы-, зовани  плазмиды pPS62 или pPS61 дл  трансформации P.chrysogenum ана«- логичны, описанным в примерах 17 и 18. Плазмида pPS62 содержит ген HmR как селективный маркер, плазмида PPS61 «- ген amdS как селективный мар« кер.

Анализ трансформантов Pochrysoge- num/pPS62 и P.chrysogenum/pPS61.

Стойкие трансформанты P,chrysoge- num/pPS62 и Pochrysogenum pPS61 сут трансформирующую высокомол екул р ную ДНК о Данный трансформирующий нотип сохран етс  после прохождени  через неселективную среду

Плазмиды pPS62 и pPS61 содержат гибридный ген DACS/DAOCS, построенный путем сращивани  промотора гена P.chrysogenum IPS с кодирующей после довательностью гена Cephalosporium acremonium DACS/DAOCS« Естественный и гибридный гены кодируют синтез как деацетоксицефалоспорин С синтетазы (экспандаза), так и деацетилцефалос«- порин С синтетазы (гидроксилаза).

10

15

20

25

73985650

Активности фермента определ ют соот«- ветственно путем катализа пеницилл№- на N до деацетоксицефалоспорина С (экспандазы) и деацетоксицефалоспори - на С до деацетилцефалоспорина С (гид«- роксилазы) о Экстракты трансформантов P.chrysogenum pPS61 и P.chrysogenum pPS62 про вл ют активности экспанда - зы и гидроксилазьь Эти активности не обнаружены в экстрактах нетрансфор - мированных штаммов P.chrysogenum. Промотор и трансл ционна  активирую ща  последовательность от гена Р„ chrysogenum IPS, присутствующие в гибридном гене DACS/DAOCS плазмиды pPS61 и pPS62, функционируют в Р. chrysogenum, что позвол ет вы вить активности экспандазы и гидроксилаз мы

Приме . Генетическа  трансформаци  Cephalosporium acremonium плазмидой pPS56o

Штаммы Cephalosporium или любые коммерческие штаммы, полученные из АТСС 11550 путем мутации, селекции или генетического размножени  с целью улучшенного продуцировани  i цефалоспорина С пригодны дл  получе« ни  трансформантов векторами и мидами, отвечающими предлагаемому изобретению ,

Получение инокулюма дл  клеточной культуры ведут следующим образом

Дл  эффективной трансформации кле ток Cephalosporium acremonium ходимо удал ть клеточные стенки дл  образовани  стойких протопластов. При приготовлении таких протопластов желательно начинать с однородного инокулюма„ В других случа х приготовь ление клеток в культуре будет невос«- производимым и будет потер но врем  при попытке получени  протопластов С «acremonium из неподход щих или достаточных количеств клеток,

Дл  получени  однородного инокулнг ма дл  клеточной культуры ампулу со спорами разбавл ют 5 мл стерильного солевого раствора. О,1 мл данной суспензии используют дл  инокул ции 50 скошенных агаров, содержащих 20 мл среды соевого агара триптиказы (BBL)„ Перед инокулированием среду подвергают высушиванию досуха. Инокулирова- иные скошенные агары инкубируют в

30

35

40

45

50

55

течение 4 дн при 25°С, 10-нл предбх- ранительной среды ввод т в среду роста мицели , котора  покрывает поверхность среды в каждом скошенном

э1

агаре. Скошенные агары перемешивают с целью суспензировани  конидий. Суспензии конидий от каждого скошенного агара объедин ют и 10-миллилитровые аликвоты замораживают при -80°С. Замороженна  суспензи  конидий медленно тер ет жизнеспособность и ее нельз  использовать после 3 мес хранени  при -80°Со

Рост клеток дл  приготовлени  про топластов ведут следующим образом. 106 мл водной среды в 500-миллилит- ровой встр хиваемой колбе инокули- руют клетками от 10 мл замороженной суспензии конидийо Клетки получают путем центрифугировани  (10 мин 2600 об./мин) и суспензировани  в вод- ной среде культивации„ До суспензиро- вани  необходима декантаци  поверхностного сло , поскольку лактоза и глицерин отрицательно вли ют на рост клетоКо Колбу, содержащую суспензированные клетки, помещают в роторный встр хиватель с вод ной баней и инкуби-i руют при 29-30 С в течение 24 ч при 285 обс/мин с вертикальным ходом 25,4 мм при 29 - 30&Со Необходимо от- метить, что температура 29 « ЗОаС отлична от температуры (25°С), предг- почтительной дл  культивации Cepha- losporium acremonium дл  целей дуцировани  антибиотика.

Дл  получени  протопластов клетки от 24 -часовой культуры собирают пу тем фильтрации с всасыванием (Бума га Ватмана $1 в воронке Бюхнера) и суспендируют в осмотически стабили -4 зированном буферном растворе (0,8 М NaCl 0,1 М MgS04 и. 10 MM. рН 7,0), в который ввод т восставав - ливаюший реагент дитиотрентол до концентрации 0,05 М при конечной концентрации клеток 1 г (после фильтра -1 ции с всасыванием) клеточной массы на 20 мл буферного раствора. Cycnew- зию помещают JB роторный встр хива- тель с вод ной баней и инкубируют при 29 г- 30°С в течение 10 мин 2пмер« каптоэтанол при конечной концентрации 40 мМ может быть использован в ка«-. честве восстанавливающего реагента. Обработанные дитиотреитолом клетки собирают путем центрифугировани  и повторно суспензируют в растворе (t O мг/мл Novorvm 234 из Novo Bio- labs, Bagsvaerd, Дани ; 0,8 М NaCl, Т), 1 М MgSO 10 ИМ и рН 5,8) в 250«-миллилитровой колбе Эрленмейе - ра Конечна  концентраци  обработан

985652

ной клеточной массы составл ет 1 г массы на 10 мл раствора. Клеточную суспензию помещают в роторный встр «- хиватель с вод ной баней при 29 «- 30°С на 15 «- 30 мин с Суспензию про«- топластов подвергают вихревому мешиванию в течение 2 «- 3 с дл  освог- бондени  протопластов, пока еще занных с фрагментами мицели . Эта процедура приводит к образованию терогенной в отношении их размеров попул ции протопластов,

Дл  процедуры трансформации дл  , каждой плазмиды используют О,1 мл суспензии, содержащей (1 f 5) X 10 протопластов Cephalosporium в 0,8 М

10

15

5

NaCl и 80 М CaClg„ 20 мкг плазмиды и полиэтиленгликол  4000 ввод т по примеру 17 в суспензию протопластов дл  получени  смеси трансформации объемом 1,1 мл, Эту смесь инкубируют в течение 10 мин при комнатной пературе и центрифугируют0 Затем про топласты подвергают вихревому переме шиванию в той же жидкости. Аликвоты (0,1 мл) нанос т на поверхность сиказо соевой агаровой среды (BBL), обогащенной 10, сахарозой дл  осмотической стабилизации протоплас-

0 тов„ После инкубации чашек Петри при 15°С в течение 24 ч в каждую чашку Петри добавл ют 4 мл сжиженного агара (0,41 масс%/об. при 42 °С), содержа - щего 0,8 11 NaCl, и гидромицин В до

5 конечной концентрации 100 мкг/мл.

Штаммы С,асгетоп1ит, про вл ющие низ«- кую скорость роста в результате мерного мутагенеза, подвергают воз действию пониженного количества гид

0 ромицина в ходе операции отбора (например, конечной концентрации 10 мкл/мл)о После удалени  верхнего сло  чашки Петри инкубируют при 25°С в увлажненной камере.

5 Анализ трансформант Cephalospo- rium acretnonium pPS56 провод т дующим образом„

Плазмида pPS56 особенно эффектив - на в отношении вставки множественных

0 копий гена DACS/DAOCS в высокомоле - кул рную ДНК CephalosptDrium acremo- niuni, поскольку она содержит гибрид ный ген HmR, который функционирует как преобладающий маркер в С .асге5 moniura.

Плазмида pPS56 может быть использована дл  создани  штаммов Cepha- 1 osporium acremonium с цефалоспори -1 ном С с титрами более высокими, чем

у нетрансформированных штаммов, за счет копий внехромосомного гена DACS/DAOCSo Копии внехромосомного ге на вызывают более высокие активности DAOCS/DACS, которые способствуют пси вышенному синтезу цефалоспорина, Со Штаммы С асгепюп1шп, продуцирумЬще большие количества цефалоспорина С

и антибиотического продуцировани , так что имеет место лишь вли ние вышеиных активностей DAOCS и: DACS на синтез цефалоспорина С.

Трансформанты C.acremonium pPS56 с повышенным продуцированием цефалоспорина С  вл ютс  ценными продуктами дл  изготовлени  клинически важных

- - W- .-,-,- -s.± «4l Vx v f AllM. ПЛ - A UftJl Hnfl «

и значительные количества пенициллина .« цефалоспориновых антибиотиков, таких N,  вл ютс  ценными родительскими как цефалотиннатрий, цефамандолнафат штаммами дл  трансформаций с исполь и цефазолиннатрий,

Claims (1)

1. зованием плазмиды pPS56 с целью Формула изобретени  лучени  трансформантов, которые более Способ конструировани  рекомби эффективно превращают пенициллиЪ N t, нантной плазмидной ДНК,.кодирующей в цефалоспорин С Желаемые трансфер - фермент деацетоксицефалоспорин С

   синтетазу/деацетшщефалоспорин С синтетазу со следующей аминокислот- , ной последовательностью:

   манты Ccacrtsnonium/pPS56 несут транс формирующие ДНК в качестве вставок в нейтральных зонах в отношении роЪта

   H2N-MET.THR SER LYS VAL PHO VAL PHE ARC LEU

   ASP ASP LEU LYS SER GLY LYS- VAL LEU TIIR GLU LEU ALA GLU ALA VAL THR TIIR LYS GLY ILE PHE TYR LEU THR GLU SER GLY LEU VAL ASP ASP ASP HIS TJIR SER ALA ARC GLU THR CYS VAL ASP PHE PHE LYS ASN GLY SER GLU GLU GLU LYS ARC ALA VAL THR LEU ALA ASP ARC ASN ALA ARC ARC GLY PHE SER ALA LEU GLU TRP GLU SER THR ALA VAL VAL THR GLU THR GLY LYS TYR SER ASP TYR SER THR CYS TYR SER MET GLY ILE GLY GLY ASN LEU PHE PRO ASN ARC GLY PHE GLU ASP VAL TRP GLN ASP TYR . PHE ASP ARC MET TYR GLY ALA ALA LYS ASP VAL ALA ARC ALA VAL LEU ASN SER VAL GLY ALA PRO LEU MA GLY -GLU ASP ILE ASP ASP PHE VAL GLU CYS ASP PRO LEU LEU ARC LEU ARC TYR PHE PRO GLU VAL PRO GLU ASP ARC VAL ALA GLU GLU GLU PRO LEU ARC MET GLY PRO HIS TYR ASP

   i

   LEU SER THR ILE THR LEU VAL HIS GLN THR ALA CYS ALA ASN GLY PHE VAL SER LEU GLN CYS GLU VAL ASP GLY GLU PHE VAL ASP LEU PRO TIIR LEU PRO GLY ALA MET VAL VAL PHE CYS GLY ALA VAL GLY THR LEU ALA THR GLY GLY LYS VAL LYS ALA PRO LYS HIS ARG VAL LYS SER PRO GLY ARC ASP GLN-ARG VAL GLY SER SER ARG THR SER SER VAL PHE PHE LEU ARG PRO LYS PRO ASP PHE SER PHE ASN VAL GLN GLN SER ARG GLU TRP GLY P.fE ASN VAL ARG ILE PRO SER GLU ARG TliR THR PHE ARG GLU TRP GLY GLY ASN I YR VAL ASN MET ARG ARG ASP LYS PRO ALA ALA ALA GLU ALA ALA VAL PRO ALA ALA ALA PRO VAL SER THR ALA ALA PRO ILE ALA THR-COOH.

   заключающийс  в том, что осуществл ютnium или Penicillium с фрагментом лидирование фрагмента ДНК, кодирующего,55ДНК, кодирующим DAOCS/DACS со сле- 5 регул торные последовательностидующей нуклеотидной последователь- промотора или гена изопенициллин ностью: N-синтетазы Cephalosporium acremoи антибиотического продуцировани , так что имеет место лишь вли ние вышеиных активностей DAOCS и: DACS на синтез цефалоспорина С.

   Трансформанты C.acremonium pPS56 с повышенным продуцированием цефалоспорина С  вл ютс  ценными продуктами дл  изготовлени  клинически важных

   ПЛ - A UftJl Hnfl «

   цефалоспориновых антибиотиков, таких как цефалотиннатрий, цефамандолнафат и цефазолиннатрий,

   &

   ACT ТСС АЛС- ОТО ССС G-TC TTT CGT СТО,

   ОАО СЛС СТО ЛАС ЛСС GGC ЛАС- ОТО СТО АСС GAG СТО GCC GAG- GCC GTC АСС АСС AAG- GGT АТС ТТС TAG ТТО- ЛСС GAG- AGC GЈC СТО G-TC GAC ОАО1

   GAC; САС АСС тсс- GCC- CGT GAG ACG TGC GTT GAC ттт ттс AAG мс GGA

   АСС GAG- GAG- GAG AAG- ACG GCC GTG ACG- CTC GCCGAC CGT AAC GCC COG

   CGC GGC TTC TOT GCC CTC .GAG TGG GAG AGC ЛССGCC GTC GTC ACC GA&

   ACG- GGC AAG TAG TCG GAC TAG TOO AGO TGC TAGTOO ATG GGC АТС GGC

   GGC AAC CTG .ТГС CCG AAC CGG CCC TTC GAG GACG2C TGG GAG GAC TAG

   TTC GAC CGC ATG TAG GGC GCA GCC AAG GAT GTCGC0 CGC GCC GTT CTC

   AAC TCT GTG GGC GCC CCG CTC.GCC G€G GAG GACATT GAT GAC TTC GTC

   GAG- TGC CAT GCC CTC CTC CGC СТА CGG TAG TTCCCC GAA GTG CCC GAG- GAG CGC GTC GCC GAA GAG GAA CCC C.TC CGC ATG GGA CCC СЛС TAG GAC

   t

   СТА. TCG-ЛСС АТС ACG CTC GTG GAG GAG AGA.GCC TOG 6CC AAC GOG TTC GTG AGC CTG- GAG TGG GAG G-TG GAC GGA GAA TTC GTC GAC CTC CCG ACG- CTC CCC CCC GCC ATG- GTC CTC TTC TGC GGC GCG GTC GGC ЛСС СТО 0СС ACG-GGC GGC AAG- GTC АЛ6- GCG CCC AAG- GAG CGG GTC AAG TCT CCC GGO CGC GAC СЛ0-.ССС GTC GGC AGC AGC CGC ACG TCG-AGC GTC TTC .TTC CTG- CCC. CCG АЛС CCG GAC TTC AGC TTC АЛС GTG CAG-. GAG TCG AGG- ОАО TGG- GCT TTC AAC GTC CGC АТС CCG TCG GAG CGC AGO. ACG- TTC AGG- ОАО T09- CTT GGC GGG- AAC TAT G-TC AAC ATG CGG- AGG GAT AAG- CCG GCG GCA GCG- CAC. GCG CCT GTC CCC GCG GCT GCC CGT GTC TCT ACC GCA GCT CCT ATA

   Г5сЈГАСТ З с фрагментом ДНК, кодирующим 3 -тер-Penicillium chrysogenum или Cephaминальные последовательности генаlosporium acremonium с последующим

   изопенициллин N-синтетазы Cephalos-45 отбором клонов, содержащих плазмиды

   porium acremoniutn или Penicillium . рТТ507 или PLT511, или PPS58, или

   и фрагментом с генетическим марке-pPS359, или pPS60, или pPSol, или

   ром Тсг, или amds, или Hmr, трансфор pPS62, или рЦ,502, или pPS52, или

   мацию полученными рекомбинантнымиpPS56.

   ДНК штаммов Escherichia coli или

   Составитель Т.Забойкина Редактор И.ДербакТехред М.Дидык Корректор Л.Патай

   /.

   Заказ 2013 ТиражПодписное

   РЧИИПИ Государственногокомитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР

   113035,Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

   ..- ™ ™ ™-вв МИ - . - - (((в - - ГГ -ПГв-в «в 11 П11 ПГ ЯИТИПроизводственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101