SU1689807A1

SU1689807A1 - Method for determining concentration of suspended ellipsoidal and rod-shaped cells

Info

Publication number: SU1689807A1
Application number: SU894702820A
Authority: SU
Inventors: Виктор Дмитриевич Бунин; Александр Григорьевич Волошин
Original assignee: Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии
Priority date: 1989-06-09
Filing date: 1989-06-09
Publication date: 1991-11-07

Abstract

Изобретение относитс к области определени концентрации клеток в суспензии и может использоватьс в микробиологии, медицине , биотехнологии. Цель изобретени - повышение точности измерени концентрации клеток по результатам измерени величины оптической плотности суспензии. Дл этого на суспензию клеток последовательно воздействуют перпендикул рным и параллельным направлению светового потока электрическим полем, определ ют стационарные значени изменени оптической плотности после выключени электрического пол и рассчитывают среднее значение показател экспоненты. Концентрацию клеток рассчитывают по среднему значению показател экспоненты и отношению стационарных изменений оптической плотности. 1 ил., 1 табл. сл сThe invention relates to the field of determining the concentration of cells in suspension and can be used in microbiology, medicine, biotechnology. The purpose of the invention is to improve the accuracy of measuring cell concentration according to the results of measuring the optical density of the suspension. To do this, the cell suspension is sequentially affected by an electric field perpendicular and parallel to the direction of the light flux, the stationary values of the change in optical density after switching off the electric field are determined and the average value of the exponent is calculated. The cell concentration is calculated by the average value of the exponent and the ratio of stationary changes in optical density. 1 ill., 1 tab. cl

Description

Изобретение относитс к области определени свойств дисперсных сред, а именно к определению концентрации клеток в суспензии , и может быть использовано в микробиологии , медицине и биотехнологии.The invention relates to the field of determining the properties of dispersed media, namely the determination of the concentration of cells in suspension, and can be used in microbiology, medicine and biotechnology.

Целью изобретени вл етс повышение точности измерений.The aim of the invention is to improve the measurement accuracy.

На чертеже изображена электрооптическа чейка, используема дл определени электрооптических сигналов,сечение.The drawing shows an electro-optical cell used to determine electro-optical signals, a cross section.

Ячейка имеет полость 1, заполн емую исследуемой суспензией, корпус 2, оптические окна 3 и 4, электродную систему изThe cell has a cavity 1 filled with the suspension under study, a housing 2, optical windows 3 and 4, an electrode system from

четырех параллельных равноудаленных проводов 5-8, которые подключены к генератору .four parallel equidistant wires 5-8 that are connected to the generator.

Способ осуществл ют следующим образом .The method is carried out as follows.

Исследуемую суспензию помещают в электрооптическую чейку. Провод т измерение оптической плотности суспензии без воздействи электрического пол . Измер ют стационарные значени Si и За электрооптического сигнала, представл ющего собой приращение оптической плотности суспензии воздействи на нее электричеоThe test suspension is placed in an electro-optical cell. The optical density of the suspension is measured without an electrical field. The stationary values of Si and the Optical signal, which is an increment of the optical density of the suspension, are measured by an electrical current.

0000

чэChe

0000

оabout

XIXi

ского пол частоты от 100 кГц до 5 кГц при напр женности 1000-5000 В/м. Значение Si определ ют при коллинеарности вектора электрического пол и направлени падени светового потока, а значение $2 при их перпендикул рности. Напр женность электрического пол в исследуемой суспензии при этих измерени х должна быть неиз- менной. Выбор направлени вектора электрического пол коллинеарно или перпендикул рно световому потоку соответственно достигаетс при соединении электродов 5 с 7 и б с 8 или 5 с 6 и 7 с 8 при подключении к этим группам электродов клемм генератора гармонического напр жени .frequency range from 100 kHz to 5 kHz with a voltage of 1000–5000 V / m. The value of Si is determined at the collinearity of the electric field vector and the direction of the light flux, and the value of $ 2 at their perpendicularity. The intensity of the electric field in the suspension under study in these measurements should be constant. The choice of the direction of the electric field vector is collinear or perpendicular to the luminous flux, respectively, when the 5 c 7 and b 8 or 5 c 6 and 7 c 8 electrodes are connected when the harmonic voltage generator terminals are connected to these electrode groups.

Сигнал 5зМ представл ет собой изменение оптической плотности суспензии при переходе клеток из ориентированного в дезориентированное состо ние и зависит or значени коэффициента R вращательной диффузии клеток:The 5 mM signal represents the change in the optical density of the suspension when cells move from an oriented to a disoriented state and depends on or the value of the rotational diffusion coefficient R of cells:

S3(t)-exp(-GR,), (1) R-KiFi(p)/rr , (2)S3 (t) -exp (-GR,), (1) R-KiFi (p) / rr, (2)

Вход ща в Mi константа К включает в себ константы L, Ki, «2. Кз и зависит от длины волны света, относительного коэффициента п преломлени клетки. Она рассчитываетс аналитически или определ етс при условии посто нства п опытным путем.The constant K entered in Mi includes the constants L, Ki, "2. Кз and depends on the wavelength of light, the relative coefficient n and the refraction of the cell. It is calculated analytically or determined under the condition of constant n empirically.

При расчете величины М2(р) неизвестный параметр р определ етс из соотношени Si/Sa: When calculating M2 (p), the unknown parameter p is determined from the ratio Si / Sa:

Si/S2 (Ui-Uo)/(Uo-U2),(7)Si / S2 (Ui-Uo) / (Uo-U2), (7)

гдеDo F2(p,u) sin (и) du,where Do F2 (p, u) sin (s) du,

Ui F2(p,u),Ui F2 (p, u),

Ug F2(p,u)|u 90.Ug F2 (p, u) | u 90.

Аналитические соотношени дл опре- делени Fi и F2 клеток эллиптической и палочкообразной форм следующие.The analytical ratios for determining the Fi and F2 cells of the elliptical and rod-shaped forms are as follows.

Fi n(p)-0,6621 + 1/р (эллипсоидальна форма)Fi n (p) -0.6621 + 1 / p (ellipsoidal shape)

FI п(2р)-0,5(пэлочкообразна форма); FI p (2p) -0.5 (pelochkoobrazna form);

F2 W (1 - 2sin и/и + 2(1 - cos u)/u2,F2 W (1 - 2sin and / and + 2 (1 - cos u) / u2,

где «1 - константа;where "1 is a constant;

b - продольный размер клетки:b - the longitudinal size of the cell:

Fi(p) - функци эксцентриситета клеток Fi (p) - cell eccentricity function

Р.R.

Вывод расчетной формулы дл нахождени корректирующего коэффициента М основан на определении усредненного сечени рассени клеток G по результатам электрооптических измерений с выделением сомножителей MI и М2. Соотношение дл определени концентрации N клеток по оптической плотности D имеет видThe derivation of the calculation formula for finding the correction coefficient M is based on determining the averaged cross-section of the scattering of G cells from the results of electro-optical measurements, highlighting the factors MI and M2. The ratio for determining the concentration of N cells by optical density D is

N LD/G - LDM- LDM1M2,(3)N LD / G - LDM-LDM1M2, (3)

где L - величина, обратно пропорциональна оптической толщине чейки.where L is the value inversely proportional to the optical thickness of the cell.

При этомWherein

G K2bT2{p,u),G K2bT2 (p, u),

(4)(four)

где К2 - константа;where K2 is a constant;

F2(p,u) - функци эксцентриситета р и 50 угла и между направлением падени светового потока и продольной осью клетки.F2 (p, u) is a function of the eccentricity p and 50 of the angle and between the direction of incidence of the light flux and the longitudinal axis of the cell.

Подстановка соотношений (2) и (4) в (3) . позвол ет выделить вход щие в (3) коэффициенты:55Substitution of relations (2) and (4) into (3). allows you to select the coefficients included in (3): 55

Mi(R)-- KR 1/3Mi (R) - KR 1/3

М; {рП р4/Г /(Г1(рУ/3Р2(р)1.M; {rp p4 / G / (G1 (rU / 3P2 (p) 1.

(5) (6)(5) (6)

W (1 -pp)cos u.W (1 -pp) cos u.

и 4тгг(п - 1)/Я , г 1/Р1/3,and 4gg (p - 1) / I, g 1 / P1 / 3,

где А - длина волны падающего света;where A is the wavelength of the incident light;

п - коэффициент преломлени частицы.n is the refractive index of the particle.

П р и м е р 1. Измерение концентрации бактерий различных типов.PRI me R 1. Measurement of the concentration of bacteria of various types.

Клетки Mc.luteus, Вес, pumills, Bac.globigil, Bac.subtilis выращивали на м - сопептонном бульоне в течение 4 ч в колбах. После выращивани клетки отдел ли от культуральной жидкости методом фильтрации . Осадок ресуспендировали в трис-цит- ратныйбуферсудельнойCells Mc.luteus, Weight, pumills, Bac.globigil, Bac.subtilis were grown on m - sapertone broth for 4 hours in flasks. After cultivation, the cells were separated from the culture fluid by filtration. The pellet was resuspended in a tris-citrate buffer.

электропроводностью 10 2 1/Ом-М. Оптическа плотность суспензии микроорганизмов , используемой дл определени оптических параметров и концентрации (титра) бактерий, равнаО,5(Я 540нм. мм).electrical conductivity of 10 2 1 / Ohm-M. The optical density of the suspension of microorganisms used to determine the optical parameters and the concentration (titer) of bacteria is O, 5 (I 540 nm. Mm).

Электрооптическую чейку с суспензией клеток помещали в спектрофотометр СФ-26. Определ ли изменение оптической плотности суспензии при воздействии на нее перпендикул рного и параллельного вектору светового потока электрического пол от генератора ГЗ-154. На самописце регистрировали форму кривой изменени An electro-optical cell with a cell suspension was placed in an SF-26 spectrophotometer. The change in the optical density of the suspension was determined when it was exposed to a perpendicular and parallel to the vector of the light flux of the electric field from the generator GZ-154. The recorder recorded the shape of the curve

оптической плотности после выключени электрического пол . Согласно формуле (1) по форме кривой определ ли величину R. Рассчитывали концентрацию микроорганизмов по формулам (2), (4), (5) и (6).optical density after switching off the electric field. According to formula (1), the value of R was determined from the shape of the curve. The concentration of microorganisms was calculated using formulas (2), (4), (5), and (6).

Дл сравнени концентрацию микроорганизмов определ ли с помощью камеры Го- р ева. Средний продольный размер и эксцентриситет бактериальных клеток определ ли по микрофотографи м 500 клеток. For comparison, the concentration of microorganisms was determined using a Gorev camera. The average longitudinal size and eccentricity of the bacterial cells was determined from micrographs of 500 cells.

Результаты сравнени измерений представлены в таблице.The results of the comparison of measurements are presented in the table.

Способ снижает погрешность при измерении концентрации в 5-8 раз. Достоверность измерений подтверждаетс сравнением с результатами, полученными на камере Гор ева.The method reduces the error in measuring the concentration of 5-8 times. The reliability of measurements is confirmed by comparison with the results obtained on the Gorev camera.

Способ может быть использован при контроле процессов культивировани клеток , дл производства биопрепаратов, пол- учени низкомолекул рных метаболитов и биологически активных веществ.The method can be used to control cell cultivation processes, for the production of biologics, with a variety of low molecular weight metabolites and biologically active substances.

Средний продоппнь. размер в (пикрсфс- тографии) гчн1,1 лAverage prodoppn. size in (pictorial) ghn1,1 l

Эксцентриситет р (микрофотографии)1, }БEccentricity p (micrographs) 1,} B

Концентрами клетом N на камере Горреве, , 1Concentrations cage N on the camera Gorreve, 1

Коэффициент К вращательной диффузии j 30 измерени ), 1Г3/J2K coefficient of rotational diffusion j 30 measurements), 1G3 / J2

fc-i,fc-i,

Множитель, ,38Multiplier, 38

Отношение электмоогти- чесних сигналов дл продольной и гогер -ч- ной ориентации клеток S.,/S21,07The ratio of electro-optical signals for the longitudinal and goog-th orientation of S. Cells, / S21.07

Расчетна вегичиссэ многошител MjMG52, ЬCalculated for the vegement of the MhMG52 multiplexer, b

Концентраци нл&тон N, рассчитанна по гптичес- кой плотности 1081,5Concentration Nl & T of N, calculated from 1081.5 gptic density

Концентраци кгетпк К по результттам злектоо- ОПТИЧЕСКИХ измерений23,The concentration of the kiln packer K is based on the results of electrical optical measurements23,

Claims

The method of determining the concentration of suspended cells of ellipsoidal and rod-shaped forms, which consists in directing a luminous flux to the suspension, measuring the optical density of the suspension when exposed to an electric field, in order to improve the accuracy of the measurement perpendicular and parallel to the direction of the light flux by the electric fields and determine the stationary values of the change in optical density, register the shape the curve of the change in optical density after turning off the electric field and calculate the average value of the exponent, and the cell concentration is calculated from the average value of the exponent and the ratio of stationary changes in optical density.

3.36

5, C

. J 4,1b

B, 35 13

1.1 4, 33

1 about, 3

,four

one

6

four

eight